CN105483083A - 双阴性t细胞的转化扩增方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种双阴性T细胞的转化扩增方法，包括如下步骤：(1)提取起始样品中的单个核细胞，去除该单个核细胞中的CD8+T细胞和NK细胞；(2)将步骤(1)得到的样品在体外用包含T细胞刺激剂及细胞因子的培养基中培养；在培养过程中同时加入OX40的激活抗体或OX40的配体；(3)培养5～7天后，提纯双阴性T细胞。本发明无需提纯CD4+T细胞或天然DN？T细胞即可实施，降低了操作难度，增加了操作效率。培养周期短。本发明可有效降低DN？T细胞在扩增中的凋亡率，同时增强其免疫抑制功能。DN？T细胞的收获率较之现有技术有极大的提升。本发明获得的DN？T细胞具有显著的免疫抑制功能，分裂增殖的CD4T细胞的百分比较之现有技术下降到2.94％，抑制率可达到93％。

Description

双阴性T细胞的转化扩增方法
技术领域
本发明涉及一种双阴性T细胞的转化扩增方法，具体地说是一种可以有效降低扩增过程中双阴性T细胞细胞凋亡并促进双阴性T细胞免疫抑制功能的双阴性T细胞体外转化扩增方法。
背景技术
自体免疫细胞治疗，是将患者自身的免疫细胞在体外进行各种处理后，再回输给病人，以达到治疗疾病的目的。免疫学者已经发现了多种免疫抑制性细胞，包括经典的CD4+CD25+细胞，NKT细胞以及CD4-CD8-T细胞(DoubleNegativeTRegulatoryCells，简写为双阴性T细胞或DNT细胞)等,其中DNT细胞在小鼠和人的研究中已经证实了此类免疫抑制型细胞具有下调免疫反应、抑制移植排斥、防止移植物抗宿主病(GVHD)以及预防和治疗自身免疫性疾病等作用。但由于此类细胞在人体内含量极少、提取困难；体外扩增难度高、难以达到治疗数量级；缺乏特异的细胞表面标志物而遭遇瓶颈，难以成功地推广到临床应用。如何获得足够量的DNT细胞，降低特定的机体免疫反应，是目前重要的技术难题。
目前已知涉及体外扩增DNT细胞的方法，主要是体外对天然存在的少量DNT细胞进行扩增。该方法首先在体外去除外周血中的CD4和CD8T细胞，剩余的含DNT细胞的外周血利用T细胞刺激剂刺激增殖，从而获取扩增的DNT细胞。该方法的缺陷是：1.起始DNT细胞数量少(只占外周中T细胞总数的1～5％)；2.培养时间长，培养20天最终收获的细胞局限于107；3.样本只针对天然存在的DNT细胞。发明人在本申请之前还申请过一项名称为“新型调节性T细胞及其应用”，授权公告号为CN101631851B的发明专利，主要是体外使CD4+T细胞转化为DNT细胞。该技术的缺陷为：1.首先要提纯CD4T细胞(即去除了CD8、NK、B、单核巨噬细胞以及天然的DNT细胞等其他类型细胞，CD4T细胞占T细胞总数的50～60％)，使得起始样本数少且技术手段复杂，提纯效果不理想；2.对DNT细胞的表型做了界定(如CD44+等)。发明人发现在上述现有技术中存在一个共同的技术问题，即扩增或转化的DNT细胞的凋亡率非常高。T细胞凋亡是T细胞活化增殖后的转归之一，是机体防止T细胞过度增殖活化、维持免疫自稳平衡状态的自我调节机制。同样，在体外扩增DNT细胞时，随着DNT的活化增殖，伴随着DNT凋亡的增加。而凋亡的发生必然影响到扩增或转化的DNT细胞的数目、活力及功能，直接关系到后续的过继治疗效果。所以确切地评价DNT细胞的凋亡以及在维持DNT细胞良好扩增时采用干预手段降低或阻止DNT凋亡的发生，对DNT细胞的收获率以及细胞质量有关键作用。但是在阻止凋亡的同时，可能会对DNT细胞的免疫功能产生影响。如何在高效获取DNT细胞的同时，提高其免疫调节功能仍然是本领域技术人员亟待解决的一个问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种培养时间短、收获率高，同时可以增强获得的DNT细胞的免疫抑制功能的DNT细胞转化扩增方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下具体技术方案：
一种双阴性T细胞的转化扩增方法，其中，所述方法包括如下步骤：
(1)提取起始样品中的单个核细胞，去除该单个核细胞中的CD8+T细胞和NK细胞；
(2)将步骤(1)得到的样品在体外用包含T细胞刺激剂及细胞因子的培养基中培养；同时加入OX40的激活抗体或OX40的配体；
(3)培养5～7天后，提纯双阴性T细胞。
所述步骤(1)中起始样品为小鼠源或人源的含有DNT细胞或者其前体的生物学样品；优选小鼠或人的外周血、骨髓、淋巴组织、胸腺、肝或脾，可以是新鲜或冷藏保存的样品，不影响最终培养效果。
所述步骤(1)中去除该单个核细胞中的CD8+T细胞和NK细胞；可以使用本领域技术人员已知的去除方法，如可以添加特异性结合CD8+T细胞和NK细胞，但不结合CD4T细胞和DNT细胞的抗体；优选免疫磁珠阴性选择的方法，根据本领域技术人员需要也可以使用其他公知技术实现此步骤的目的。
所述步骤(2)中的T细胞刺激剂的添加目的是用于刺激DNT细胞增殖和转化，因此选用的试剂可以为本领域技术人员已知的能够刺激DNT细胞增殖的任意试剂，如树突状细胞(mDCs)、B细胞、刀豆球蛋白A(ConA)、植物凝集素(PHA)、PMA、钙离子载体(ionomycin)、IPP、帕米膦酸(Pamidronate)、唑来膦酸(Zoledronate)、CD3抗体和CD28抗体中的一种或多种的混合。多种混合的情况下可以任意比例复配试剂。
当使用树突状细胞和/或B细胞作为T细胞刺激剂时，其与样品细胞的较佳比率为1：1～1：4。
当使用刀豆蛋白A、植物凝集素、PMA、钙离子载体、IPP、帕米膦酸和唑来膦酸中的一种或多种作为T细胞刺激剂时，较佳用量为2～10ug/ml。
当使用CD3抗体作为T细胞刺激剂时，较佳用量为1～5ug/ml。
当使CD28抗体作为T细胞刺激剂时，较佳用量为0.5～2ug/ml。
所述步骤(2)中使用的细胞因子优选为IL-2、IL-15、IFN-r和TNF-a中的一种或多种的混合，多种混合的情况下可以任意比例复配试剂，所述细胞因子的总用量为20～200ng/ml。目的是用于促进DNT细胞增殖及CD4T细胞的转化。本领域技术人员也可以使用其他可以实现该目的的细胞因子。
所述步骤(2)中OX40的激活抗体包括但不局限于OX86，因为OX40的抗体目前分为激活抗体和阻断抗体，只有激活抗体可以起到活化OX40分子、并启动下游分子的作用。OX40激活抗体按照种属来源不同，包括多个亚型，均能起到特异性的结合T细胞表面的OX40分子、活化OX40通路的作用。其中最常用的OX40的激活抗体包括抗小鼠OX40抗体OX86，抗人OX40抗体为MOXR0916、MEDI646等。由于种属差异，人与小鼠OX40抗体之间无明显交叉反应，即小鼠活化OX40用OX86,活化人OX40用人的OX40的激活抗体。OX40的配体为OX40L。所述OX86的用量为10～100ug/ml，OX40L的用量为20～200ug/ml。
所述步骤(3)中优选的提纯方法为：收获培养的细胞，利用免疫磁珠阴性选择的方法获得双阴性T细胞。该提纯方法也可以是本领域技术人员已知的其他提纯方法。
当起始样品为小鼠源时，上述方法得到的DNT细胞的表型为CD3+CD4-CD8-NK1.1-；当起始样品为人源时，上述方法得到的DNT细胞的表型为或CD3+CD4-CD8-CD56-。
上述方法获双阴性T细胞群在制备用于移植排斥、自体免疫紊乱、移植物抗宿主病、对肿瘤细胞的应答、对感染的应答或对变态反应原的应答药物中的用途。
上述方法获得双阴性T细胞群优选在制备用于免疫性肝损伤的预防及治疗中的应用。
本发明着重研究如何在体外培养中降低DNT细胞的凋亡率同时高效获取DNT细胞，并增强DNT细胞的免疫调节功能，继而用于抑制过度的免疫反应，重建免疫平衡，从而预防和治疗自身免疫性疾病，预防移植排斥反应和GVHD的发生等。具体的有益效果如下：
1.本发明无需提纯CD4+T细胞或天然DNT细胞即可实施，降低了操作难度，增加了操作效率，且起始样本数量多。
2.本发明的培养周期短，5至7天即可完成。获得的DNT细胞可以继续用于扩增或直接用于治疗。
3.本发明可有效降低DNT细胞在扩增中的凋亡率同时还可增强其免疫抑制功能。
4.本发明DNT细胞的收获率较之现有技术有极大的提升，以一只小鼠脾脏可以获得单个核细胞5×107计算，其中DNT细胞仅有0.1×106，利用本发明所述方法扩增转化6天后最终收获具有活性的DNT细胞为4.28×106。
5.本发明获得的DNT细胞具有显著的免疫抑制功能，分裂增殖的CD4T细胞的百分比较之现有技术下降到2.94％，抑制率可达到93％。
附图说明
图1为阴性选择方法去除CD8与NK细胞前后的细胞比例的比较图；
图2为WTDNT细胞在加入IL-2或OX86后对抗凋亡基因BCL-2、BCL-xL以及Survivin的表达影响比较图；
图3为加入OX40的活化抗体OX86和抗原提呈细胞共培养对DNT细胞凋亡比例的影响；
图4为敲除CD4T细胞的OX40表达对DNT的转化效率影响的图示；
图5为根据本发明所述方法，加OX40的激活剂以及T细胞刺激剂和IL-2后对DNT细胞增殖、转化及抗凋亡的影响图示；
图6为现有方法对CD4T细胞加T细胞刺激剂和IL-2后转化为DNT细胞的比率及凋亡的结果；
图7为根据本发明所述方法获得的DNT细胞收获率图；
图8对比例1扩增天然DNT细胞技术培养获得的DNT细胞收获率图；
图9为对比例2转化CD4T细胞技术培养获得的DNT细胞收获率图；
图10为本发明所述培养体系对CD4T细胞增殖比例的影响图示(图中数字显示为增殖CD4T细胞占总CD4T细胞的百分比)；
图11为本发明所述培养体系对DNT的免疫抑制率的影响图示；
图12为不同组DNT细胞中穿孔素(Peforin)的表达情况；
图13为本发明获得的DNT细胞明显抑制淋巴细胞对肝脏的免疫损伤图示；
图14为本发明获得的DNT细胞可显著减轻肝脏损伤坏死的病理图示；
图15为本发明获得的DNT细胞可显著降低转氨酶水平图示；
图16为本发明获得的人DNT细胞对CD3T细胞的增殖抑制图示。
具体实施方式
下述具体实施例发明人仅列举优选案例并不局限于下述案例所应用试剂，凡是可以起到相同目的发明内容部分所述其他试剂均可应用于本发明并起到相同的技术效果。
实施例1本发明所述DNT细胞的扩增转化方法
(1)获取C57BL/6小鼠EDTA抗凝全血，淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMC)。分离C57BL/6小鼠淋巴结和脾脏，经70um滤网研磨过滤后，用红细胞裂解液溶解红细胞，从而获得单个核细胞(脾细胞，Splenocytes)。利用免疫磁珠阴性选择的方法，去除单个核细胞中的CD8+T细胞(抗CD8抗体-磁珠分选，去除CD8阳性细胞)和NK细胞(抗NK1.1抗体-磁珠分选，去除NK细胞)，但无需分离CD4+T细胞，亦无需分离天然DNT细胞。如图1所示，左列图为初始T淋巴细胞组成，右列图为阴性选择去除CD8和NK细胞后的T淋巴细胞组成。Q1象限为CD8，Q3象限为CD4，Q4象限为天然DNT细胞。可见经阴性选择后剩余的淋巴细胞主要为DNT和CD4T细胞。PBMC组CD4T细胞比率由55％增至90.8％，而DNT比率由0.96％增至8.24％；脾脏单个核细胞组CD4T细胞比率由41.2％增至89％，而DNT比率由2.87％增至11％。清除经过CD8和NK细胞后，剩余的T淋巴细胞为CD4T细胞以及DNT细胞。
(2)将步骤(1)阴性选择分离的混合细胞在体外用T细胞刺激剂刀豆球蛋白A(ConA，3ug/ml)刺激增殖，在另一实施例中使用用量为2ug/ml，在再一实施例中使用用量为10ug/ml。同时加入OX40的激活抗体OX86，50ug/ml，IL-1550ng/ml。培养选择1640培养基+10％胎牛血清+长效谷氨酰胺+青链霉素。
(3)培养刺激5天后，提纯DNT细胞，提纯方法具体为：收获培养的细胞，利用免疫磁珠阴性选择的方法获得DNT细胞。即应用GR1、CD19、CD11b、CD11c、CD4、CD8、NK1.1的Biotin抗体标记细胞后、用抗Biotin磁珠去除上述抗体标记的细胞，从而获得DNT细胞。上述方法获得的DNT细胞表型为CD3+CD4-CD8-NK1.1-，收获细胞纯度>95％。
实施例2本发明所述DNT细胞的扩增转化方法
(1)分离C57BL/6小鼠淋巴结和脾脏，经70um滤网研磨过滤后，用红细胞裂解液溶解红细胞，从而获得单个核细胞。利用免疫磁珠阴性选择的方法，去除单个核细胞中的CD8+T细胞(抗CD8抗体-磁珠分选，去除CD8阳性细胞)和NK细胞(抗NK1.1抗体-磁珠分选，去除NK细胞)，但无需分离CD4+T细胞，亦无需分离天然DNT细胞。
(2)将步骤(1)阴性选择分离的混合细胞在体外用成熟的树突状细胞刺激增殖(成熟的树突状细胞与步骤(1)混合细胞的比率为1:4，同时加入OX40的激活抗体OX86，100ug/ml和IL-220ng/ml。培养选择1640培养基+10％胎牛血清+长效谷氨酰胺+青链霉素。
(3)培养刺激6天后，提纯DNT细胞，提纯方法具体为：收获培养的细胞，利用免疫磁珠阴性选择的方法获得DNT细胞。即应用GR1、CD19、CD11b、CD11c、CD4、CD8、NK1.1的Biotin抗体标记细胞后、用抗Biotin磁珠去除上述抗体标记的细胞，从而获得DNT细胞。上述方法获得的DNT细胞表型为CD3+CD4-CD8-NK1.1-，收获细胞纯度>95％。
实施例3本发明所述DNT细胞的扩增转化方法
(1)分离C57BL/6小鼠淋巴结和脾脏，经70um滤网研磨过滤后，用红细胞裂解液溶解红细胞，从而获得单个核细胞。利用免疫磁珠阴性选择的方法，去除单个核细胞中的CD8+T细胞(抗CD8抗体-磁珠分选，去除CD8阳性细胞)和NK细胞(抗NK1.1抗体-磁珠分选，去除NK细胞)，但无需分离CD4+T细胞，亦无需分离天然DNT细胞。
(2)将步骤(1)阴性选择分离的混合细胞在体外用CD3/CD28抗体刺激增殖(CD3抗体用量为5ug/ml，在另一实施例中使用量为1ug/ml；CD28抗体用量为2ug/ml，在另一实施例中使用量为0.5ug/ml；)，同时加入OX40的激活抗体OX86，10ug/ml，IL-250ng/ml和IFN-r20ng/ml。培养选择1640培养基+10％胎牛血清+长效谷氨酰胺+青链霉素。培养3天后，加入2倍量培养基(包含同样浓度的CD3/CD28抗体、OX86和IL-2)。
(3)再培养刺激3天后(共6天)，提纯DNT细胞，提纯方法具体为：收获培养的细胞，利用免疫磁珠阴性选择的方法获得DNT细胞。即应用GR1、CD19、CD11b、CD11c、CD4、CD8、NK1.1的Biotin抗体标记细胞后、用抗Biotin磁珠去除上述抗体标记的细胞，从而获得DNT细胞。上述方法获得的DNT细胞表型为CD3+CD4-CD8-NK1.1-，收获细胞纯度>95％。
实施例4DNT细胞的扩增转化方法
(1)抽取人外周静脉血，经淋巴细胞分离液进行梯度离心，分离外周血单个核细胞。利用免疫磁珠阴性选择的方法，去除单个核细胞中的CD8+T细胞(抗CD8抗体-磁珠分选，去除CD8阳性细胞)和NK细胞(抗CD56抗体-磁珠分选，去除NK细胞)，但无需分离CD4+T细胞，亦无需分离天然DNT细胞。
(2)将步骤(1)阴性选择分离的混合细胞在体外与CD19阳性的B细胞共同培养刺激增殖，同时加入OX40的配体OX40L50ug/ml、IL-250ng/ml、IL-15100ng/ml和TNF-a50ng/ml。培养选择XVIVO无血清培养基+长效谷氨酰胺+庆大霉素。
(3)培养刺激7天后，提纯DNT细胞，提纯方法具体为：收获培养的细胞，利用免疫磁珠阴性选择的方法获得DNT细胞。即应用CD14、CD16、CD19、CD20、CD11b、CD11c、CD4、CD8、CD56的Biotin抗体标记细胞后、用抗Biotin磁珠去除上述抗体标记的细胞，从而获得DNT细胞。上述方法获得的DNT细胞表型为CD3+CD4-CD8-CD56-，收获细胞纯度>95％。
实施例5本发明所述培养体系可以显著诱导DNT细胞抗凋亡基因的上调表达
本发明所述培养体系可以显著增加DNT细胞的抗凋亡基因的表达，如BCL-2、BCL-xL以及Survivin的表达(附图2)。
提取野生型C57BL/6小鼠(WT)以及OX40基因敲除小鼠(OX40-KO)的天然DNT细胞。实验方法为分离小鼠淋巴结和脾脏，经70um滤网研磨过滤后，用红细胞裂解液溶解红细胞，从而获得单个核细胞。利用免疫磁珠阴性选择的方法，利用免疫磁珠阴性选择的方法获得DNT细胞。即应用GR1、CD19、CD11b、CD11c、CD4、CD8、NK1.1和TER119的Biotin抗体标记细胞后、用抗Biotin磁珠去除上述抗体标记的细胞，从而获得天然的DNT细胞。
WT小鼠与OX40敲除小鼠的天然DNT细胞分别在体外与T细胞激活剂(5ug/ml抗CD3和2ug/ml抗CD28抗体，1640培养基+10％胎牛血清+长效谷氨酰胺+青链霉素)。在培养过程中，分别加入IL-2(20ng/ml)或OX40分子的激活抗体(OX86，50ug/ml)，48小时后收获DNT细胞，应用Qiagen公司的RNeasy试剂盒提取总RNA，荧光PCR检测凋亡相关基因的表达。
结果显示，如图2所示：WTDNT细胞在加入IL-2或OX86后均可以显著上调抗凋亡基因BCL-2、BCL-xL以及Survivin的表达，提高DNT细胞的抗凋亡性。而OX40激活剂的抗凋亡诱导效果要明显高于IL-2。
实施例6DNT细胞在体外培养中，具有较高的凋亡比例，本发明所述培养体系可以显著降低DNT体外培养中的凋亡比例
提取C57BL/6小鼠的天然DNT细胞。实验方法为分离小鼠淋巴结和脾脏，经70um滤网研磨过滤后，用红细胞裂解液溶解红细胞，从而获得单个核细胞。利用免疫磁珠阴性选择的方法获得DNT细胞，即应用GR1、CD19、CD11b、CD11c、CD4、CD8、NK1.1和TER119的Biotin抗体标记细胞后、用抗Biotin磁珠去除上述抗体标记的细胞，从而获得天然的DNT细胞。
提纯的DNT细胞，分别在体外与常用T细胞激活剂，包括CD3和CD28抗体(分别为5ug/ml和2ug/ml)、成熟的树突状细胞(mDCs，与DNT细胞的比率为1:4)或刀豆蛋白A(ConA:5ug/ml)培养72小时后(1640培养基+10％胎牛血清+长效谷氨酰胺+青链霉素)，收集培养扩增的细胞，对CD3+CD4-CD8-的细胞进行AnnexinV染色,用流式细胞仪分析凋亡情况。如图3所示，可以发现不同培养体系中、凋亡发生率不同，但均明显超过60％，而在T细胞强刺激剂ConA组，凋亡细胞数可以高达90％。而加入CD4T细胞后，尽管CD4T细胞在上述T细胞激活剂的存在下也发生明显增殖，但并没有增加DNT的凋亡比率，反而由于活化的CD4T细胞可以分泌众多细胞因子，降低了DNT细胞的凋亡发生(DNT的凋亡率下降了10％)。而在此基础上，OX40的激活抗体的加入，可以进一步降低DNT细胞的凋亡(进一步降低10％)，使DNT细胞在增殖扩增时保证较高的存活比率，其中DNT+CD4T细胞+mDCS+OX86组，可以显著降低凋亡发生率到34％。
实施例7本发明所述培养体系可增加CD4转化为DNT的转化效率
提取野生型C57BL/6小鼠(WT)以及OX40基因敲除小鼠(OX40-KO)的CD4T细胞。实验方法为分离小鼠淋巴结和脾脏，经70um滤网研磨过滤后，用红细胞裂解液溶解红细胞，从而获得单个核细胞。利用免疫磁珠阴性选择的方法，利用免疫磁珠阴性选择的方法获得CD4T细胞。即应用GR1、CD19、CD11b、CD11c、CD25、CD8、NK1.1和TER119的Biotin抗体标记细胞后、用抗Biotin磁珠去除上述抗体标记的细胞，从而获得天然的CD4T细胞。
两组纯化的CD4T细胞与成熟的树突状细胞(mDCs，与CD4T细胞的比率为1:4)共培养6天后(1640培养基+10％胎牛血清+长效谷氨酰胺+青链霉素)，收集培养的细胞，用CD3、CD4、CD8和NK1.1荧光标记抗体染色后流式细胞仪检测，分析其中CD3+CD4-CD8-NK1.1-细胞所占比率。如图4所示，可以发现OX40-KO的CD4T细胞仅有12.6％转化为DNT，远远低于WT组的25.5％。
实施例8本发明所述方法与现有方法在DNT细胞收获率方面的比较
(1)采用实施例2所述方法，最终达到促进DNT细胞增殖、转化(DNT细胞比率可以达到46％。并降低凋亡(AnnexinV染色阳性细胞为23.5％)的作用，如图5所示。
(2)现有技术对比例1：首先纯化DNT细胞，实验方法为分离小鼠淋巴结和脾脏，经70um滤网研磨过滤后，用红细胞裂解液溶解红细胞，从而获得单个核细胞。利用免疫磁珠阴性选择的方法，去除CD4和CD8细胞(即抗CD4、CD8的Biotin抗体标记细胞后、用抗Biotin磁珠去除上述抗体标记的细胞)，从而获得富含天然的DNT细胞的混合细胞。按现有方法，剩余的DNT细胞富集群在CD3抗体预包被的24孔板中培养3天后，洗涤活化的T细胞，在IL-2和IL-4存在的条件下再培养4天。第7天，分离活细胞，在添加IL-2、IL-4和可溶性抗-CD3抗体的新鲜培养基中再培养3天。第10天收集活细胞，等份用CD3-PE、CD4-FTTC、CD8-FTTC和CD56-FITC染色。利用抗FTTC磁珠去除剩余的CD4+、CD8+T细胞以及CD56+NK细胞。(培养选择1640培养基+10％胎牛血清+长效谷氨酰胺+青链霉素)。
(3)现有技术对比例2：同时采用现有方法利用CD4T细胞转化DNT。首先纯化CD4T细胞，实验方法为分离小鼠淋巴结和脾脏，经70um滤网研磨过滤后，用红细胞裂解液溶解红细胞，从而获得单个核细胞。利用免疫磁珠阴性选择的方法，利用免疫磁珠阴性选择的方法获得CD4T细胞。即应用GR1、CD19、CD11b、CD11c、CD8、CD25、NK1.1和TER119的Biotin抗体标记细胞后、用抗Biotin磁珠去除上述抗体标记的细胞，从而获得CD4T细胞。将上述提纯的CD4T细胞进行体外培养6天(培养选择1640培养基+10％胎牛血清+长效谷氨酰胺+青链霉素)，加入成熟的树突状细胞和IL-2(50ng/ml)培养6天，促进CD4T细胞体外转化为DNT细胞，如图6所示。
(4)对比三种培养方法：一只小鼠脾脏可以获得单个核细胞5×107，其中CD4T细胞约为5×106，而初始天然的DNT细胞仅为0.1×106个，通过本发明所述方法体外培养6天，收获的DNT细胞总数为5.6×106，去除其中的早期凋亡的细胞，最终收获的具有活力的DNT细胞为4.28×106。将此收获的DNT细胞在本发明所述培养体系中继续扩增4天，10天时可以收获具有活力的DNT细胞9.7×106，如图7所示。发明人利用实施例1、3及4重复上述实验，DNT细胞收获率与上述相似。
现有技术对比例1，以起始0.1×106个DNT细胞进行培养，4天后可收获DNT细胞0.3×106个，6天后可收获DNT细胞0.6×106个,10天后可收获DNT细胞总数为2.1×106个，去除其中的早期凋亡细胞，最终收获的有活力的DNT细胞为1.5×106个。如图8所示。
现有技术对比例2，6天后可以收获DNT细胞数目为3.1×106，如图9所示，去除其中的早期凋亡细胞，6天培养收获的有活力DNT细胞为2×106个。将此收获的DNT细胞在抗CD3/CD28抗体以及IL-2存在的培养环境中继续扩增4天，10天时可以收获具有活力的DNT细胞3.9×106，如图9所示。
实施例9本发明所述方法可以明显增强DNT细胞的免疫抑制功能
(1)首先纯化体外扩增或转化的DNT细胞：分离野生型C57BL/6小鼠和OX40敲除小鼠的淋巴结和脾脏，获得单个核细胞。纯化的DNT细胞按不同培养条件分为3组：a组：利用现有技术扩增的野生型小鼠的DNT细胞(具体方法同实施例8中对比例1)；b组：利用现有技术将CD4T细胞转化的野生型小鼠的DNT细胞(具体方法同实施例8中对比例2)；
c组：采用实施例2的方法，体外扩增转化的野生型小鼠的DNT细胞；
(2)功能抑制实验：体外用CFSE标记CD4T细胞(纯化自表达CD45.1抗原的C57BL/6转基因小鼠的脾脏)，与成熟的树突状细胞共培养，4天后流式细胞检测观察CD45.1阳性的CD4T细胞分裂增殖情况。如图10(图中数字显示为增殖CD4T细胞占总CD4T细胞的百分比)及图11所示，图10中左图为CD4T细胞对照组，中上为a组，中下为c组，右图为b组。4天后分裂增殖分裂的CD4T细胞占CD4T细胞总数的46.4％。如果培养中加入a组体外扩增的WT小鼠的DNT细胞(DNT细胞数量为起始CD4T细胞数量的1/4)，可以明显抑制CD4T细胞的分裂增殖，分裂CD4T细胞的百分比下降到11.6(对CD4T细胞的抑制率为75％)。加入b组体外转化的WT小鼠的DNT细胞，可以明显抑制CD4T细胞的分裂增殖，分裂CD4T细胞的百分比下降到13.4(对CD4T细胞的抑制率为71％)。而如果DNT细胞来源于加入OX40激活剂OX86的培养环境(c组)，可以进一步加强DNT的免疫抑制功能，分裂CD4T细胞的百分比下降到2.94(抑制率达到93％)。发明人利用实施例1、3及4重复上述实验，对CD4T细胞的抑制率与实施例2相似，在此不赘述。
(3)由于穿孔素(Perforin)的表达对DNT的免疫调节功能至关重要，所以对不同条件扩增的DNT细胞的Perforin表达进行了分析。首先提取上述4种不同培养条件下获得的DNT细胞，提取总RNA，进行荧光PCR检测Perforin表达。实验证实，在培养转化DNT的体系中，激活OX40(加入OX86)可以上调DNT的Perforin的表达，从而导致DNT的免疫抑制功能进一步加强，如图12所示。发明人利用实施例1、3及4重复上述实验，对Perforin表达结论与实施例2相似，在此不赘述。
实施例10实施例2方法体外获得的DNT细胞对肝脏免疫损伤具有保护作用。
(1)实施例2方法培养DNT细胞对肝脏免疫损伤的体外保护实验：提取C57BL/6小鼠的肝脏细胞以及脾脏细胞，将两种细胞按1:1混合培养，并应用ConA(10ug/ml)刺激4小时(培养选择1640培养基+10％胎牛血清+长效谷氨酰胺+青链霉素)后，收集培养的肝细胞进行AnnexinV染色，评价肝细胞的免疫损伤情况。如图13所示，ConA可以诱导淋巴细胞对肝细胞的免疫损伤，肝细胞的凋亡由17％上升到54.6％，而加入上述方法扩增转化后的DNT细胞后可以明显抑制淋巴细胞对肝脏的免疫损伤，肝细胞凋亡率下降至34.8％。发明人利用实施例1、3重复上述实验，实验结果与实施例2相似，在此不赘述。
(2)实施例2方法培养DNT细胞对肝脏免疫损伤的体内保护实验：肝脏免疫损伤涉及多种肝脏疾病(如病毒性肝炎、自身免疫性肝脏疾病等)。利用ConA静脉注射(10mg/kg)可以造成小鼠免疫性肝脏损伤坏死，是模拟人免疫性肝损伤的经典模型。在给小鼠注射ConA之前，给予上述方法体外扩增转化的DNT细胞1×106，即可显著减轻肝脏的免疫损伤和坏死，如图14所示，左图为正常小鼠肝脏组，中图为ConA静脉注射组(可见明显的桥接坏死灶)，右图为DNT细胞预防+ConA静脉注射(无明显肝脏坏死表现)。如图15所示，DNT细胞可以显著降低转氨酶水平。发明人利用实施例1、3重复上述实验，实验结果与实施例2相似，在此不赘述。
实施例11实施例4方法获得的DNT细胞体外实验证实其可以明显的抑制CD3T细胞的分裂增殖，从而达到抑制免疫反应的作用
(1)按照实施例4的方法获得DNT细胞。上述方法获得的DNT细胞表型为CD3+CD4-CD8-CD56-，收获细胞纯度>95％。
(2)体外抑制实验：抽取人外周静脉血，经淋巴细胞分离液进行梯度离心，分离外周血单个核细胞(PBMC)。将PBMC进行CFSE染色标记，利用CD3抗体(5ug/ml)与CD28抗体(5ug/ml)体外刺激增殖，培养选择XVIVO无血清培养基+长效谷氨酰胺+庆大霉素。培养同时加入相同数量的DNT细胞，共同培养3天后，收集细胞，进行CD3染色，分析CFSE标记的CD3T细胞的体外分裂增生能力。图16可见，体外扩增转化的DNT细胞可以将CFSE标记的CD3T细胞的增殖比率由80.7％降至14.6％，达到很好的免疫抑制功能。

Claims (16)

1.一种双阴性T细胞的转化扩增方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)提取起始样品中的单个核细胞，去除该单个核细胞中的CD8+T细胞和NK细胞；
(2)将步骤(1)得到的样品在体外用包含T细胞刺激剂及细胞因子的培养基中培养；在培养过程中同时加入OX40的激活抗体或OX40的配体；
(3)培养5～7天后，提纯双阴性T细胞。
2.如权利要求1所述的双阴性T细胞的转化扩增方法，其特征在于，所述步骤(1)中起始样品为小鼠源或人源的含有双阴性T细胞或者其前体的生物学样品。
3.如权利要求2所述的双阴性T细胞的转化扩增方法，其特征在于，所述生物学样品为外周血、骨髓、淋巴组织、胸腺、肝或脾。
4.如权利要求1所述的双阴性T细胞的转化扩增方法，其特征在于，所述步骤(2)中的T细胞刺激剂为树突状细胞、B细胞、刀豆球蛋白A、植物凝集素、PMA、钙离子载体、IPP、帕米膦酸、唑来膦酸、CD3抗体和CD28抗体中的一种或多种。
5.如权利要求4所述的双阴性T细胞的转化扩增方法，其特征在于，当使用树突状细胞和/或B细胞作为T细胞刺激剂时，其与样品细胞的比率为1：1～1：4。
6.如权利要求4所述的双阴性T细胞的转化扩增方法，其特征在于，当使用刀豆蛋白A、植物凝集素、PMA、钙离子载体、IPP、帕米膦酸和唑来膦酸中的一种或多种作为T细胞刺激剂时，用量为2～10ug/ml。
7.如权利要求4所述的双阴性T细胞的转化扩增方法，其特征在于，当使用CD3抗体作为T细胞刺激剂时，用量为1～5ug/ml。
8.如权利要求4所述的双阴性T细胞的转化扩增方法，其特征在于，当使用CD28抗体作为T细胞刺激剂时，用量为0.5～2ug/ml。
9.如权利要求1所述的双阴性T细胞的转化扩增方法，其特征在于，所述步骤(2)中的细胞因子为IL-2、IL-15、IFN-r和TNF-a中的一种或多种。
10.如权利要求9所述的双阴性T细胞的转化扩增方法，其特征在于，所述细胞因子的用量为20～200ng/ml。
11.如权利要求1所述的双阴性T细胞的转化扩增方法，其特征在于，所述步骤(2)中的OX40的激活抗体为OX86，OX40的配体为OX40L。
12.如权利要求11所述的双阴性T细胞的扩增方法，其特征在于，所述OX40激活抗体OX86的用量为10～100ug/ml，OX40L的用量为20～200ug/ml。
13.如权利要求1所述的双阴性T细胞的扩增方法，其特征在于，所述步骤(3)中提纯方法为：收获培养的细胞，利用免疫磁珠阴性选择的方法获得双阴性T细胞。
14.如权利要求1至13中任意一项所述的双阴性T细胞的转化扩增方法，其特征在于，起始样品为小鼠源时得到的双阴性T细胞的表型为CD3+CD4-CD8-NK1.1-；起始样品为人源时得到的双阴性T细胞的表型为CD3+CD4-CD8-CD56-。
15.权利要求1至13中任意一项所述方法获得的双阴性T细胞群在制备用于移植排斥、自体免疫紊乱、移植物抗宿主病、对肿瘤细胞的应答、对感染的应答或对变态反应原的应答药物中的用途。
16.权利要求1至13中任意一项所述方法获得的双阴性T细胞群在制备用于免疫性肝损伤的预防及治疗药物中的应用。
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