CN112029719B - 纯化的双阴性t细胞及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种去除了IL‑17分泌细胞的DNT细胞群。本发明还提供了该DNT细胞群的制备方法和应用，其具有显著的抑制T细胞增殖、诱导凋亡的作用，还可以抑制脂肪组织炎症、改善胰岛素抵抗、减轻糖尿病、缓解脂肪性肝炎，也可以用于抗原特异性的过敏性哮喘的预防和治疗。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，更具体地涉及一种纯化的双阴性T细胞及其制备和应用。
背景技术
双阴性T细胞(Double negative T cells，DNT细胞)是一种表型独特的TCRαβ+T淋巴细胞，不表达CD4、CD8、NK等细胞的特征表面标志。虽然DNT细胞在人、小鼠外周血和淋巴器官中仅占总T淋巴细胞的1％-3％，但越来越多的研究证明这种罕见的T细胞群在免疫系统中起着关键和多样化的调节作用。
多数研究表明DNT细胞对于维持机体抗原特异性的免疫稳态具有至关重要的作用。DNT细胞高表达穿孔素、颗粒酶B和FasL，对CD4和CD8T细胞、B细胞、树突状细胞和NK细胞等均表现出很强的免疫抑制活性，从而可以下调机体过度的免疫反应，从而达到抑制移植排斥反应、避免移植物抗宿主病的发生以及有效控制自身免疫性疾病的发生和发展。由于DNT细胞高表达颗粒酶和穿孔素等细胞杀伤相关蛋白，也可用于肿瘤细胞的杀伤治疗。基于这些发现，将DNT细胞体外扩增，用于器官移植排斥反应、移植物抗宿主病、自身免疫性疾病，乃至肿瘤预防和治疗的研究不在少数，这些研究主要提取人外周血或小鼠脾细胞中的单个核细胞，去除CD4、CD8和CD56(人)/NK1.1(小鼠)后进行扩增，将扩增后的细胞进一步除去CD4、CD8和CD56(人)/NK1.1(小鼠)后用于过继转移治疗。
尽管研究发现DNT细胞具有抗原特异性的免疫抑制，例如可以针对性的预防和治疗移植排斥反应和自身免疫性糖尿病，但由于DNT细胞缺乏CD4分子这一辅助T细胞识别MHC-II分子的关键分子，对于DNT细胞如何保留对MHC-II抗原的特异性识别仍不清楚。因此，本领域迫切需要对DNT细胞及其应用进行进一步的深入研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种纯化的双阴性T细胞及其制备和应用。
在本发明的第一方面，提供了一种细胞制剂，所述的细胞制剂包含DNT细胞群，并且所述的DNT细胞群中，占总细胞数量95％以上的细胞不分泌表达IL-17，较佳地，98％以上，更佳地，99％以上，最佳地，99.9％以上。
在另一优选例中，所述的DNT细胞群中，占总细胞数量95％以上的细胞具有表面抗原CD3+和TCRαβ。
在另一优选例中，所述的DNT细胞群中的细胞CD3正常或低表达、TCRαβ正常或低表达。
在另一优选例中，所述的DNT细胞群中，占总细胞数量95％以上的细胞不表达选自下组的表面标志物：CD4、CD8、NK1.1(小鼠)/CD56(人)、或其组合。
在另一优选例中，所述的DNT细胞群中，占总细胞数量95％以上的细胞表达选自下组的基因：CCR5、CXCR3、B220、FasL、NKG2D、Perforin、Granzyme B、或其组合。
在另一优选例中，所述的DNT细胞群中，占总细胞数量50％以上,较佳地70％以上,更佳地90％以上的细胞高表达LAG3基因。
在另一优选例中，所述的高表达指所述细胞LAG3基因的表达量G1与正常CD4T细胞LAG3基因的表达量G0的比值，即G1/G0≥1.2，较佳地≥1.5，更佳地≥2。
在另一优选例中，所述的低表达指所述细胞中特定基因的表达量R1与正常CD4T细胞中相应基因的表达量R0的比值，即R1/R0≤1，较佳地≤0.8，更佳地≤0.5。
在另一优选例中，所述的DNT细胞群中的细胞具有抗原特异性。
在另一优选例中,所述的细胞制剂由所述的DNT细胞群和药学上可接受的载体组成。
在本发明的第二方面，提供了一种制备本发明第一方面所述细胞制剂的方法，所述的方法包括步骤：
(a)提供单个核细胞群(PBMCs)，通过分选获得DNT细胞为主的第一细胞亚群；
(b)从第一细胞亚群中去除分泌IL-17的DNT细胞后对其进行扩增培养，从而获得第二细胞亚群；或者
对第一细胞亚群进行扩增培养后去除分泌IL-17的DNT细胞，从而获得第二细胞亚群；
(c)任选地，对第二细胞亚群中的DNT细胞进行进一步分选，从而获得第三细胞亚群；
(d)将第二或第三细胞亚群与合适的载体混合，从而得到本发明第一方面所述细胞制剂。
在另一优选例中，在步骤(a)中，去除单个核细胞群中的B细胞、CD4和CD8T细胞、γδT细胞、1型NKT和2型NKT细胞，从而获得DNT细胞为主的第一细胞亚群。
在另一优选例中，在步骤(a)中，利用CD19、CD4、CD8、TCR-γδ、NK1.1(小鼠)/CD56(人)、aGalcer-CD1d和LPC-CD1d四聚体抗体(或TCRVα24-Jα18抗体)对PBMC进行标记，随后对其进行阴性分选，从而获得DNT细胞为主的第一细胞亚群。
在另一优选例中，所述的阴性分选选自下组：磁珠分选、流式分选和密度梯度离心。
在另一优选例中，在步骤(b)中，利用选自针对组A表达蛋白的一种或多种抗体，在培养前去除分泌IL-17的DNT细胞，其中组A包括：S100a6、Tmem176b、CXCR6、Ramp1、Tmem176a、Lgals1、Lgals3、ACTN2、ICOS、CCR2、CD82、CD127(IL7r)、Ltb4r1、Hk2、TNFRSF25、Ly6a、BLK、Lsp1、Ly6e、Itgb7、Itm2b、S100a10、Ly6g5b、Thy1、CD40Ig、Ramp3、Gm2a或其组合；
较佳地，组A为：S100a6、CXCR6、ICOS、CCR2、CD82、CD127、Ltb4r或其组合。
在另一优选例中，在步骤(b)中，选自针对组B表达蛋白的一种或多种抗体，在培养后体系中去除分泌IL-17的DNT细胞，其中组B包括：IL-17a、Lgals1、Ly6a、CXCR6、S100a6、Lgals3、Lta、IL-4、IL-3、ICOS、S100a10、Ramp1、Tmem176b、Tnfrsf4、AA467197、Itm2b、Thy1、Igtp、Arl6ip1、Serpine2、Ltb、Tnfrsf25、Furin、Tmem176a、Ifi27l2a、Gbp2、Emp3、Ltb4r1、Tspo、Cst3、Vim、CD200或其组合；
较佳地，组B为：Lgals1、Ly6a、CXCR6、S100a6、Lgals3、Lta、ICOS、S100a10、Tnfrsf4、或其组合。
在另一优选例中，在步骤(b)中，在T细胞刺激剂存在的条件下进行扩增培养，所述的T细胞刺激剂选自下组：
刀豆球蛋白A(ConA)、植物凝集素(PHA)、PMA、钙离子载体(ionomycin)、IPP、帕米膦酸(Pamidronate)、唑来膦酸(Zoledronate)、CD2抗体或磁珠标记抗体、CD3抗体或磁珠标记抗体、CD28抗体或磁珠标记抗体、或其组合。
在另一优选例中，在步骤(b)中，在进行扩增培养时加入选自下组的细胞因子：IL-2、IL-15、或其组合。
在另一优选例中，在步骤(b)中，在抗原呈递细胞和/或抗原肽存在的条件下进行扩增培养。
在另一优选例中，所述的抗原呈递细胞包括巨噬细胞、树突状细胞、和/或B细胞。
在另一优选例中，所述的抗原肽包括涉及过敏原的抗原多肽，如尘螨抗原肽、花粉抗原肽、树粉抗原肽。
在另一优选例中，所述的抗原肽包括涉及自身免疫性疾病的自身抗原肽。
在另一优选例中，所述的抗原肽选自下组：
(i)涉及哮喘的过敏原多肽；
(ii)涉及1型糖尿病的GAD65抗原肽、胰岛素抗原肽；
(iii)涉及风湿免疫疾病的ENA多肽、核蛋白抗原多肽、胞浆蛋白抗原多肽；和
(iv)涉及自身免疫性肝脏疾病的线粒体抗原肽、肝抗原肽。
在另一优选例中，在步骤(b)中，所述的扩增培养的时间为14-21天。
在另一优选例中，在步骤(b)中，所述的扩增培养在体外进行
在另一优选例中，在步骤(c)中，去除第二细胞亚群中的CD4和CD8T细胞、NK细胞，从而获得第三细胞亚群。
在另一优选例中，在步骤(c)中，利用CD4、CD8、NK1.1(小鼠)/CD56(人)抗体对第二细胞亚群中的DNT细胞进行标记，随后对其进行阴性分选，从而获得第三细胞亚群。
在另一优选例中，在步骤(d)中，所述的载体为等渗溶液。
在另一优选例中，在步骤(d)中，所述的载体选自下组：
PBS、HBSS、生理盐水、乳酸钠林格氏液、血浆、含血清白蛋白的等渗溶液、无血清细胞保存液、或其组合。
在另一优选例中，所述单个核细胞(PBMCs)来源于哺乳动物，更优选地来源于人。
在另一优选例中，所述步骤(a)中，所述的单个核细胞群是外周血或脾脏中分离出的单个核细胞。
在本发明的第三方面，提供了一种本发明第一方面所述细胞制剂的用途，用于制备一药物组合物，所述的药物组合物用于治疗选自下组的疾病：
肿瘤、感染性疾病、移植排斥反应、移植物抗宿主病、过敏性哮喘、自身免疫病、代谢综合征、脑卒中、或其组合。
在另一优选例中，所述的代谢综合征包括：肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病、脂肪性肝炎、冠状动脉粥样硬化心脏病、或其组合。
在另一优选例中，所述的自身免疫病包括：1型糖尿病、红斑狼疮、类风湿性关节炎、干燥综合征、银屑病、多发性硬化、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、桥本氏甲状腺炎、自身免疫性肾病、或其组合。
在本发明的第四方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有本发明第二方面所述方法制备的细胞制剂，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物为液态制剂。
在本发明的第四方面，提供了一种抑制T细胞增殖和/或诱导T细胞凋亡的方法，所述的方法包括步骤：
给需要的对象施用本发明第一方面所述的组合物，或含所述组合物作为活性成分的药物。
在另一优选例中，所述方法还可以抑制脂肪组织炎症、改善胰岛素抵抗。
在另一优选例中，所述方法还可以具有抗原特异性的预防和治疗哮喘。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了双阴性T细胞的纯化以及流式细胞检测图示(常规方法只去除TCR-γδ、CD4、CD8及NK1.1阳性细胞的情况下，剩余的TCRαβ+CD4-CD8-NK1.1-的DNT细胞中，仍混有接近6％的NKT细胞)。
图2显示了对DNT细胞的单细胞亚群分析(有分泌表达IL-17的亚群的存在，约占初始DNT细胞总数的5.8％)。
图3显示了纯化的DNT细胞体外刺激活化增殖后的单细胞亚群分析(有IL-17分泌亚群的存在，比率可达扩增细胞总数的15.5％)。
图4显示了分泌IL-17的DNT细胞亚群的细胞膜蛋白基因表达水平
图5显示了分泌IL-17的活化的DNT细胞亚群的细胞膜蛋白基因表达水平。
图6显示了各组细胞的体外刺激实验结果。具体地，对纯化的总DNT细胞、分泌IL-17的DNT细胞以及去除分泌IL-17的DNT细胞后的其他DNT细胞分别应用CD3/CD28抗体进行体外刺激扩增。经过3天后进行PCR验证发现：总DNT(Total DNT)活化扩增后有IL-17表达，分泌IL-17的DNT细胞(IL-17producing DNT)在扩增后，IL-17的分泌明显高于总DNT组，而预先去除了分泌IL-17的DNT细胞(Purified DNT)，在经过活化增殖后，检测不到IL-17的分泌表达。
图7显示了各组细胞的体外刺激实验结果。具体地，对总DNT先进行CD3/28抗体刺激3天，然后利用分泌IL-17的活化DNT亚群的细胞表面标志物对其进行流式分选纯化。研究发现，分泌IL-17的活化DNT亚群有明显的IL-17表达，而去除了分泌IL-17的活化DNT亚群后，剩余的DNT细胞不再有IL-17这一炎性细胞因子的表达。
图8显示基于优化的小鼠DNT细胞体外扩增培养体系获得的DNT细胞具有显著的抑制T细胞增殖、诱导T细胞凋亡的能力。
图9显示基于优化的小鼠DNT细胞体外扩增培养体系获得的DNT细胞具有显著的体内免疫抑制功能，可以对饮食诱导的肥胖、胰岛素抵抗和脂肪性肝炎起到很好的预防和治疗效果。其中，图9A显示了实验流程。具体地，8周高脂饮食后，给与小鼠单次DNT细胞输注，继续喂食高脂饮食8周。图9B显示DNT注射后，小鼠体重增加较单纯高脂喂养组显著下降。图9C显示DNT细胞治疗组小鼠肝脏脂肪空泡变性、炎症细胞积聚显著改善。图9D显示DNT细胞治疗组小鼠空腹的血糖较单纯高脂饲料喂养组明显降低。
图10显示注射总DNT细胞(未预先去除分泌IL-17的DNT细胞)治疗组小鼠的肝脏脂肪空泡变性、炎症细胞积聚较对照组改善不显著，仍有脂肪空泡和炎性细胞浸润现象存在。
图11显示OVA323-339肽刺激增殖的DNT细胞对OVA抗原诱导的哮喘具有明显的保护作用，过敏性气道炎症和肺嗜酸性粒细胞、淋巴细胞积聚显著减轻。而OVA不相关的多肽(MOG35-55)诱导的DNT细胞，对OVA诱导的小鼠哮喘没有保护作用。
图12显示和CD4T细胞相比，DNT细胞高表达LAG3分子。
图13显示与野生型DNT细胞相比，LAG3敲除的DNT细胞对OVA诱导的哮喘的预防和治疗效果显著下降。
图14显示在OVA刺激的DNT细胞中，I-Ab OVA323-339四聚体阳性细胞出现的频率明显高于OVA刺激的Lag3敲除的DNT细胞或OVA未刺激的野生型DNT细胞。
图15显示注射DNT细胞(去除分泌IL-17的DNT后的纯化的DNT细胞)，可以完全缓解肺淋巴细胞浸润症状。然而如果注射同样剂量的总DNT细胞(没有去除分泌IL-17的DNT细胞)，仍可见肺泡周围有明显的淋巴细胞浸润，达不到完全缓解哮喘的作用。
图16显示基于优化的人DNT细胞体外扩增培养体系获得的DNT细胞具有显著的抑制T细胞增殖的能力。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现去除DNT细胞群中分泌IL-17的DNT细胞后,可以显著的抑制T细胞增殖、诱导凋亡，还可以抑制脂肪组织炎症、改善胰岛素抵抗，并且具有抗原特异性的预防和治疗哮喘的作用。
DNT细胞
DNT细胞，即双阴性T细胞(Double negative T cells)，是一种表型独特的TCRαβ+T淋巴细胞，不表达CD4、CD8、NK等细胞的特征表面标志，在免疫系统中起着关键和多样化的调节作用。
本发明提供了一种去除了分泌IL-17的DNT细胞的DNT细胞群，其具有显著的抑制T细胞增殖、诱导凋亡的作用，还可以抑制脂肪组织炎症、改善胰岛素抵抗相关。
如本文所用,术语DNT细胞是指天然的DNT细胞
DNT细胞的纯化与扩增
在本申请中，DNT细胞的纯化可以在培养扩增前进行，也可以在培养扩增后进行，由于前者使用抗体的量明显少于后者，优选在培养扩增DNT细胞之前，预先去除IL-17分泌DNT细胞。具体地，两种纯化方法如下所示。
1.先纯化再扩增：即扩增DNT之前预先去除分泌IL-17的DNT亚群。
无菌条件下获取小鼠脾脏或人的外周血PBMC，梯度离心的方法获得单个核细胞的悬液。利用CD19、CD4、CD8、TCR-γδ、NK1.1(小鼠)/CD56(人)、aGalcer-CD1d和LPC-CD1d四聚体抗体(或者TCRVα24-Jα18抗体)标记单个核细胞(分别去除B细胞、CD4和CD8T细胞、γδT细胞、1型NKT和2型NKT细胞)，阴性分选(磁珠分选、流式分选或者密度梯度离心等分离方式)获得DNT细胞为主的细胞亚群，同时使用S100a6、CXCR6、ICOS、CCR2、CD82、CD127、Ltb4r等抗体中的任一种或组合，去除分泌IL-17的DNT细胞亚群，然后体外刺激扩增DNT细胞(能够刺激DNT细胞增殖的任意试剂，如刀豆球蛋白A(ConA)、植物凝集素(PHA)、PMA、钙离子载体(ionomycin)、IPP、帕米膦酸(Pamidronate)、唑来膦酸(Zoledronate)、CD2、CD3和CD28抗体或磁珠标记抗体中的一种或多种的混合。多种混合的情况下可以任意比例复配试剂)，为了增加DNT细胞的增殖比率，可以加入IL-2和或IL-15等多种细胞因子或组合。培养时间为14-21天，期间视培养基情况和细胞密度进行换液换板培养。培养结束后利用CD4、CD8、NK1.1(小鼠)/CD56(人)抗体磁珠阴性选择进一步去除培养中可能存在的CD4、CD8和NK细胞，获得扩增培养的DNT细胞用于后续治疗。培养扩增后的DNT细胞表型为CD3+TCRαβ±CD4-CD8-NK1.1-(小鼠)/CD56-(人)CD19-TCRγδ±。
2.先扩增再纯化：即先扩增DNT细胞亚群后再除去分泌IL-17的活化的DNT细胞。无菌条件下获取小鼠脾脏或人的外周血PBMC，梯度离心的方法获得单个核细胞的悬液。利用CD19、CD4、CD8、TCR-γδ、NK1.1(小鼠)/CD56(人)、aGalcer-CD1d和LPC-CD1d四聚体抗体(或者TCRVα24-Jα18抗体)标记单个核细胞，磁珠阴性分选获得DNT细胞。随后体外刺激扩增DNT细胞(能够刺激DNT细胞增殖的任意试剂，如刀豆球蛋白A(ConA)、植物凝集素(PHA)、PMA、钙离子载体(ionomycin)、IPP、帕米膦酸(Pamidronate)、唑来膦酸(Zoledronate)、CD2、CD3和CD28抗体或磁珠标记抗体中的一种或多种的混合。多种混合的情况下可以任意比例复配试剂)，为了增加DNT细胞的增殖比率，可以加入IL-2和或IL-15等多种细胞因子或组合。经过培养扩增后，收集扩增的总DNT细胞，使用Lgals1、Ly6a、CXCR6、S100a6、Lgals3、Lta、ICOS、S100a10等抗体中的任一种或组合，去除分泌IL-17的DNT细胞亚群。同时利用CD4、CD8、NK1.1(小鼠)/CD56(人)抗体磁珠阴性选择进一步去除培养中可能存在的CD4、CD8和NK细胞，获得扩增培养的DNT细胞用于后续治疗。培养扩增后的DNT细胞表型为CD3+TCRαβ±CD4-CD8-NK1.1-(小鼠)/CD56-(人)CD19-TCRγδ±。
3.抗原特异性的DNT细胞的扩增培养方法如下所示。
无菌条件下获取小鼠脾脏或人的外周血PBMC，梯度离心的方法获得单个细胞的悬液。利用CD19、CD4、CD8、TCR-γδ、NK1.1(小鼠)/CD56(人)、aGalcer-CD1d和LPC-CD1d四聚体抗体(或者TCRVα24-Jα18抗体)标记小鼠的脾细胞(分别去除B细胞、CD4和CD8T细胞、γδT细胞、1型NKT和2型NKT细胞)，阴性分选(磁珠分选、流式分选或者密度梯度离心等分离方式)获得DNT细胞为主的细胞亚群，同时使用S100a6、CXCR6、ICOS、CCR2、CD82、CD127、Ltb4r等抗体中的任一种或组合，去除分泌IL-17的DNT细胞亚群，然后在体外与巨噬细胞、树突状细胞以及B细胞等可作为抗原呈递细胞的细胞共同培养，同时为了增强抗原特异性，可以加入特定的抗原肽。培养中可以加入IL-2、IL-15等多种细胞因子或组合。为了增强体外扩增能力，可以同时加入CD3抗体。培养7-10天后，收集培养的细胞利用CD4、CD8、NK1.1(小鼠)/CD56(人)抗体磁珠阴性选择进一步去除培养中可能存在的CD4、CD8和NK细胞。同时利用CD19、CD11b和/或CD11c磁珠抗体去除共培养体系中的B细胞、树突状细胞等抗原提呈细胞。纯化获得的DNT细胞用于后续治疗。培养扩增后的DNT细胞表型为CD3+TCRαβ±CD4-CD8-NK1.1-(小鼠)/CD56-(人)CD19-TCRγδ±。
药物组合物和施用方法
本发明还提供了一种含有本发明第一方面所述细胞制剂或本发明第四所述药物组合物，通过抑制T细胞增殖和/或诱导T细胞凋亡，可以用于治疗选自下组的疾病：
肿瘤、感染性疾病、代谢综合征(肥胖、胰岛素抵抗、糖尿病、脂肪性肝炎、冠状动脉粥样硬化心脏病)、脑卒中、或其组合。所述疾病还包括过敏性哮喘、1型糖尿病、红斑狼疮、类风湿性关节炎、干燥综合征、银屑病、多发性硬化、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化和硬化性胆管炎、桥本氏甲状腺炎、自身免疫性肾病、器官移植排斥反应、移植物抗宿主病、或其组合。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明的细胞制剂，以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、粉剂、二甲基亚砜(DMSO)及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。活性成分的给药量是治疗有效量。此外，本发明的细胞制剂还可与其他治疗剂一起使用。
对于本发明的药物组合物，可通过常规的方式施用于所需的对象(如人和非人哺乳动物)。代表性的施用方式包括(但并不限于)：静脉注射、动脉注射、胸腔、腹盆腔、蛛网膜下腔、鼻窦、颅内、不同组织(如肿瘤组织、炎症病变组织)等不同部位的注射，等。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明扩增和纯化DNT细胞的体系。
(b)IL-17是重要的炎症因子，可以诱发机体的自身免疫反应和炎症反应。由于本发明纯化的DNT细胞不具有分泌IL-17的能力，避免了IL-17引发细胞治疗受体的自身免疫反应和炎症反应的副作用。
(c)本发明纯化的DNT细胞的免疫抑制功能强于未纯化的DNT，可以用于多种自身免疫性疾病、过敏性哮喘以及炎症相关性疾病的治疗。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1
单细胞测序
通过单细胞转录组测序技术，对小鼠脾脏的DNT细胞进行的单细胞水平的分析。首先利用流式分选的技术(见图1)，获得TCRαβ+CD4-CD8-NK1.1-的双阴性T细胞，利用CD1d四聚体抗体染色技术，进一步去除1型NKT(αGalcer-CD1d四聚体抗体阳性)和2型NKT(LPC-CD1d四聚体抗体阳性)细胞，随后对纯化的DNT进行单细胞转录组测序分析，检测是否有分泌IL-17的DNT细胞亚群存在。
单细胞测序及PCR验证结果显示，纯化的DNT细胞中的确有部分细胞亚群IL-17的mRNA表达水平明显高于其他DNT细胞，这一DNT细胞亚群占总DNT细胞的5.8％左右(见图2)。将纯化的总DNT细胞在体外用CD3/28抗体刺激3天后，分泌IL-17的DNT细胞亚群增殖扩增明显，此时高表达IL-17mRNA的DNT细胞可以达到总DNT细胞的15.5％(见图3)，证明在体外刺激活化增殖中，分泌IL-17的DNT细胞较其他DNT细胞增殖明显旺盛。如果将这些DNT细胞进行回输治疗，有可能会造成受体免疫活化乃至自身免疫反应的发生。
为了去除这一分泌IL-17的DNT细胞，对总DNT细胞进行进一步分析。结果显示，这些分泌IL-17的/>DNT细胞超高表达多种跨膜蛋白，其中S100a6、Tmem176b、CXCR6、Ramp1、Tmem176a、Lgals1、Lgals3、ACTN2、ICOS、CCR2、CD82、CD127(IL7r)、Ltb4r1、Hk2、TNFRSF25、Ly6a、BLK、Lsp1、Ly6e、Itgb7、Itm2b、S100a10、Ly6g5b、Thy1、CD40Ig、Ramp3、Gm2a等的表达较其他DNT细胞有0.5倍以上的表达增加，尤其是S100a6、Tmem176b、CXCR6、Ramp1、Tmem176a、Lgals1、Lgals3、ACTN2、ICOS、CCR2、CD82、CD127(IL7r)等蛋白，表达较其他DNT细胞有1倍以上的表达增加(见图4)。因此，上述差异蛋白的抗体(包括但不限于S100a6、CXCR6、ICOS、CCR2、CD82、CD127、Ltb4r等)可以用于分泌IL-17的/>DNT细胞亚群的纯化和分离。
进而对总DNT先进行CD3/28抗体刺激3天，再利用单细胞测序对活化增殖的DNT细胞进行检测。结果如图5所示，分泌IL-17的活化的DNT细胞亚群高表达分泌型及跨膜蛋白如IL-17a、Lgals1、Ly6a、CXCR6、S100a6、Lgals3、Lta、IL-4、IL-3、ICOS、S100a10、Ramp1、Tmem176b、Tnfrsf4、AA467197、Itm2b、Thy1、Igtp、Arl6ip1、Serpine2、Ltb、Tnfrsf25、Furin、Tmem176a、Ifi27l2a、Gbp2、Emp3、Ltb4r1、Tspo、Cst3、Vim、CD200等，应用这些蛋白的抗体可以用于分泌IL-17的活化的DNT细胞亚群的分选。
实施例2
DNT细胞的纯化及有效性验证
为了进一步证明上述发现，首先纯化小鼠DNT，即无菌条件下获取小鼠脾脏、研磨并裂解红细胞后，获得单个脾细胞的悬液。利用CD19、CD4、CD8、TCR-γδ、NK1.1、aGalcer-CD1d和LPC-CD1d四聚体抗体(或者TCRVα24-Jα18抗体)标记小鼠的脾细胞，磁珠阴性分选获得DNT细胞为主的细胞亚群，同时使用S100a6、CXCR6、ICOS、CCR2、CD82、CD127、Ltb4r等抗体中的任一种，标记分泌IL-17的DNT细胞亚群。
随后取相同数目的总DNT细胞、分泌IL-17的DNT细胞以及去除分泌IL-17的DNT细胞的其他DNT细胞分别应用CD3/CD28抗体进行体外刺激扩增。
结果如图6所示，经过3天刺激后，总DNT活化扩增组有IL-17表达；分泌IL-17的DNT细胞在扩增后，IL-17的分泌明显高于总DNT组；而预先去除了IL-17分泌细胞的DNT细胞，在经过体外CD3/28刺激后，活化增殖的DNT细胞中并没有出现IL-17的分泌表达(前去除的有效性得以证实)。上述结果表明，预先去除S100a6、CXCR6、ICOS、CCR2、CD82、CD127或Ltb4r阳性的DNT细胞，可以有效去除分泌IL-17的DNT细胞亚群，避免其进一步扩增。
进而对总DNT先进行CD3/28抗体刺激3天，再利用Lgals1、Ly6a、CXCR6、S100a6、Lgals3、Lta、ICOS、S100a10或Tnfrsf4等抗体分离纯化这一群细胞，并进行PCR验证发现，这一群抗体分离纯化的活化DNT亚群的确有明显的IL-17表达，而去除了这一分泌IL-17的活化DNT亚群后，剩余的DNT细胞不再有IL-17这一炎性细胞因子的表达(见图7)。
对比培养扩增前以及培养扩增后纯化DNT细胞的两种方法，第一种使用抗体的量明显少于第二种，之后的功能验证均利用第一种条件，即在培养前扩增DNT细胞之前，预先去除IL-17分泌DNT细胞的方法。
实施例3
纯化后的DNT细胞的功能验证
为了验证纯化后的DNT细胞的体外免疫抑制功能。将纯化并增殖后的DNT细胞与树突状细胞刺激增殖的同种小鼠的T淋巴细胞进行混合培养。
结果如图8所示，纯化后的DNT细胞具有显著的抑制T细胞增殖、诱导凋亡的作用。
随后利用高脂饮食16周诱导小鼠肥胖、糖尿病和脂肪性肝炎模型，进行DNT细胞的体内抑制炎症的作用效果研究。于小鼠高脂饮食8周后，单次输注3-5×106DNT细胞，之后继续高脂喂养8周(全程16周)。
结果如图9所示，DNT细胞治疗组小鼠的体重、空腹血糖以及脂肪肝的情况均显著改善，这与DNT细胞抑制脂肪组织炎症、改善胰岛素抵抗相关。
然而如果注射总DNT细胞(未预先去除分泌IL-17的DNT细胞)，治疗组小鼠的肝脏脂肪空泡变性、炎症细胞积聚较对照组改善不显著，仍有脂肪空泡和炎性细胞浸润现象存在(图10)。
实施例4
培养具有抗原特异性的DNT细胞
为了探究DNT的抗原特异性免疫抑制，首先建立了OVA诱导的小鼠过敏性哮喘模型。随后利用小鼠成熟的树突状细胞与纯化的DNT细胞进行体外混合培养。培养中加入OVA特异的OVA323-339抗原肽，或者加入与OVA无关的MOG33-55抗原肽，观察刺激增殖后的DNT细胞的抗原特异性抑制效果。
结果如图11所示，经过2次OVA致敏后，OVA蛋白激发过敏性哮喘后输注OVA323-339多肽刺激增殖的DNT细胞对哮喘发作有很好的控制作用，
而无关肽段MOG33-55体外刺激的DNT细胞对OVA蛋白诱发的哮喘没有很好的预防和治疗效果，证明了体外培养扩增的DNT具有显著的抗原特异性的免疫抑制作用。
与CD4T细胞对比发现，DNT表达更高水平的分子LAG3(见图12)。Lag3分子可以与MHC-II分子结合，其与MHC-II分子的亲和力远远高于CD4分子。
利用OVA323-339多肽分别在体外刺激野生型DNT细胞和LAG3敲除的DNT细胞。之后观察二者对OVA诱导的过敏性哮喘的预防和治疗作用。结果如图13和图14所示，LAG3敲除的DNT细胞的免疫保护作用明显下降。利用OVA特异的MHC-II分子的Tetramer(I-Ab OVA323- 339tetramers)染色发现，LAG3敲除的DNT细胞识别I-Ab OVA323-339tetramers的能力明显下降，造成了DNT细胞的抗原特异性的免疫抑制能力下降。从而证明了LAG3分子对于DNT细胞保持抗原特异性的重要作用。
然而如果注射同样剂量的总DNT细胞(没有去除分泌IL-17的DNT细胞)，仍可见肺泡周围有明显的淋巴细胞浸润，达不到完全缓解哮喘的作用(图15)。
实施例5
人DNT细胞的功能验证
为了进一步验证纯化后的人DNT细胞的体外免疫抑制功能，利用实施例2中的方法纯化并扩增人DNT细胞，并将其与树突状细胞(DC)刺激增殖的T淋巴细胞进行混合培养。
结果如图16所示，纯化后的DNT细胞具有显著的抑制T细胞增殖的作用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种制备细胞制剂的方法，其特征在于，所述的细胞制剂包含DNT细胞群，并且所述的DNT细胞群中，占总细胞数量95％以上的细胞不分泌表达IL-17，
所述的方法包括步骤：
(a)提供单个核细胞群(PBMCs)，去除所述单个核细胞群中的B细胞、CD4和CD8T细胞、γδT细胞、1型NKT和2型NKT细胞，从而获得DNT细胞为主的第一细胞亚群；
(b)从第一细胞亚群中去除分泌IL-17的DNT细胞后对其进行扩增培养，从而获得第二细胞亚群；或者
对第一细胞亚群进行扩增培养后去除分泌IL-17的DNT细胞，从而获得第二细胞亚群；
(c)任选地，对第二细胞亚群中的DNT细胞进行进一步分选，从而获得第三细胞亚群；
(d)将第二或第三细胞亚群与合适的载体混合，从而得到所述细胞制剂，
在步骤(b)中，利用选自针对组A表达蛋白的一种或多种抗体，在培养前去除分泌IL-17的DNT细胞，其中组A为：S100a6、CXCR6、ICOS、CCR2、CD82、CD127、Ltb4r或其组合；或
利用选自针对组B表达蛋白的一种或多种抗体，在培养后体系中去除分泌IL-17的DNT细胞，其中组B为：Lgals1、Ly6a、CXCR6、S100a6、Lgals3、Lta、ICOS、S100a10、Tnfrsf4或其组合。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，在抗原呈递细胞和/或抗原肽存在的条件下进行扩增培养。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的抗原肽选自下组：
(i)涉及哮喘的过敏原多肽；
(ii)涉及1型糖尿病的GAD65抗原肽、胰岛素抗原肽；
(iii)涉及风湿免疫疾病的ENA多肽、核蛋白抗原多肽、胞浆蛋白抗原多肽；和
(iv)涉及自身免疫性肝脏疾病的线粒体抗原肽、肝抗原肽。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中，利用CD4、CD8、NK1.1(小鼠)/CD56(人)抗体对第二细胞亚群中的DNT细胞进行标记，随后对其进行阴性分选，从而获得第三细胞亚群。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)中，所述的单个核细胞群是外周血或脾脏中分离出的单个核细胞。
6.一种细胞制剂，其特征在于，所述细胞制剂使用如权利要求1所述的方法制备得到，所述的细胞制剂包含DNT细胞群，并且所述的DNT细胞群中，占总细胞数量95％以上的细胞不分泌表达IL-17，占总细胞数量95％以上的细胞具有表面抗原CD3+和TCRαβ，占总细胞数量50％以上的细胞高表达LAG3基因。
7.如权利要求6所述的细胞制剂，其特征在于，所述的DNT细胞群中，占总细胞数量95％以上的细胞不表达选自下组的表面标志物：CD4、CD8、小鼠NK1.1、人CD56、或其组合。
8.如权利要求6所述的细胞制剂，其特征在于，所述的DNT细胞群中，占总细胞数量95％以上的细胞表达选自下组的基因：CCR5、CXCR3、B220、FasL、NKG2D、Perforin、Granzyme B、或其组合。
9.一种权利要求6所述细胞制剂用于制备药物组合物的用途，其特征在于，用于，所述的药物组合物用于治疗选自下组的疾病：
过敏性哮喘、代谢综合征、或其组合。
10.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有权利要求6所述的细胞制剂，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
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