KR20220024422A

KR20220024422A - 정제된 이중 음성 t 세포 및 이의 제조와 응용

Info

Publication number: KR20220024422A
Application number: KR1020227000262A
Authority: KR
Inventors: 동 장; 옌빙 주; 루 양; 단 티안; 송 왕; 광융 순
Original assignee: 베이징 이뮤테크 엘엘씨
Priority date: 2019-06-04
Filing date: 2020-04-28
Publication date: 2022-03-03
Also published as: CN112029719A; EP3981872A4; JP2022535881A; WO2020244345A1; CN112029719B; US20220331359A1; EP3981872A1; JP7338903B2

Abstract

본 발명은 IL-17 분비 세포가 제거된 DNT 세포 집단 및 이의 제조 방법과 응용을 제공하고, 상기 DNT 세포 집단은 T 세포 증식을 억제하고 세포 사멸을 유도하는 작용을 가지며, 지방 조직 염증을 억제하고 인슐린 저항성을 개선하며 당뇨병을 경감하고 지방간염을 완화할 수 있으며, 항원 특이적 알레르기성 천식의 예방 및 치료에도 사용될 수 있다.

Description

정제된 이중 음성 T 세포 및 이의 제조와 응용

본 발명은 생물의약 분야에 관한 것으로, 더 구체적으로 정제된 이중 음성 T 세포 및 이의 제조와 응용에 관한 것이다.

이중 음성 T 세포(Double negative T cells, DNT 세포)는 표현형이 독특한 TCRαβ+T 림프구로, CD4, CD8, NK 등 세포의 특징적 표면 마커를 발현하지 않는다. DNT 세포는 인간과 마우스의 말초 혈액과 림프 기관에서 전체 T 림프구의 1% ~ 3% 밖에 차지하지 않지만, 점점 더 많은 연구에서 이 희귀한 T 세포 집단이 면역 시스템에서 핵심적이고 다양한 조절 역할을 한다는 것이 입증되었다.

대부분의 연구에 따르면 DNT 세포는 신체의 항원 특이적 면역 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 한다고 한다. DNT 세포는 퍼포린(perforin), 그란자임 B(granzyme B) 및 FasL을 고발현하고, CD4 및 CD8 T 세포, B 세포, 수지상 세포 및 NK 세포 등에 대해 매우 강한 면역 억제 활성을 나타내어, 신체의 과도한 면역 반응을 하향 조절함으로써, 이식거부반응을 억제하고 이식편대숙주병의 발생을 방지하며 자가면역질환의 발생과 발달을 효과적으로 억제할 수 있는 것을 달성할 수 . DNT 세포는 그란자임과 퍼포린 등 세포 살상 관련 단백질을 고발현하기 때문에 종양 세포의 살상 치료에도 사용할 수 있다. 이러한 발견을 기반으로, DNT 세포를 시험관 내에서 증폭시켜 장기이식거부반응, 이식편대숙주병, 자가면역질환에 사용하고, 심지어 종양의 예방 및 치료의 연구에서도 적지 않게 사용하는데, 이러한 연구에서, 주로 인간 말초 혈액 또는 마우스 비장 세포 중의 단핵 세포를 추출하여 CD4, CD8 및 CD56(인간)/NK1.1(마우스)을 제거한 후 증폭시키며, 증폭된 세포는 CD4, CD8 및 CD56(인간)/NK1.1(마우스)를 추가로 제거한 후 입양 전이 치료에 사용된다.

연구에서 DNT 세포는 이식거부반응 및 자가면역당뇨병의 표적 예방 및 치료와 같은 항원 특이적 면역 억제를 가진다는 것을 발견하였지만, DNT 세포는 T 세포를 보조하여 MHC-II 분자를 인식하는 핵심 분자인 CD4 분자가 부족하기 때문에, DNT 세포가 MHC-II 항원에 대한 특이적 인식을 유지하는 방법은 여전히 불명확하다. 따라서, 본 분야에서는 DNT 세포 및 그 응용에 대한 심층적인 연구가 시급한 실정이다.

본 발명의 목적은 정제된 이중 음성 T 세포 및 이의 제조와 응용을 제공하는 것이다.

본 발명의 제1 양태에서, 세포 제제를 제공하며, 상기 세포 제제는 DNT 세포 집단을 포함하고, 상기 DNT 세포 집단에서 전체 세포수의 95% 이상, 바람직하게 98% 이상, 더 바람직하게 99% 이상, 가장 바람직하게 99.9% 이상을 차지하는 세포는 IL-17을 분비 및 발현하지 않는다.

다른 바람직한 예에서, 상기 DNT 세포 집단에서, 전체 세포수의 95% 이상을 차지하는 세포는 표면 항원 CD3+ 및 TCRαβ를 가진다.

다른 바람직한 예에서, 상기 DNT 세포 집단 중의 세포의 CD3은 정상이거나 저발현이고, TCRαβ는 정상이거나 저발현이다.

다른 바람직한 예에서, 상기 DNT 세포 집단에서, 전체 세포수의 95% 이상을 차지하는 세포는 CD4, CD8, NK1.1(마우스)/CD56(인간) 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 표면 마커를 발현하지 않는다.

다른 바람직한 예에서, 상기 DNT 세포 집단에서, 전체 세포수의 95% 이상을 차지하는 세포는 CCR5, CXCR3, B220, FasL, NKG2D, Perforin, Granzyme B 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자를 발현한다.

다른 바람직한 예에서, 상기 DNT 세포 집단에서, 전체 세포수의 50% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상을 차지하는 세포는 LAG3 유전자를 고발현한다.

다른 바람직한 예에서, 상기 고발현은 상기 세포의 LAG3 유전자의 발현량 G1과 정상 CD4 T 세포의 LAG3 유전자의 발현량 G0의 비율을 의미하고, 즉 G1/G0≥1.2, 보다 바람직하게 ≥1.5, 더 바람직하게 ≥2이다.

다른 바람직한 예에서, 상기 저발현은 상기 세포에서 특정 유전자의 발현량 R1과 정상 CD4 T 세포에서 상응한 유전자의 발현량 R0의 비율을 의미하고, 즉 R1/R0≤1, 보다 바람직하게 ≤0.8, 더 바람직하게 ≤0.5이다.

다른 바람직한 예에서, 상기 DNT 세포 집단 중의 세포는 항원 특이성을 가진다.

다른 바람직한 예에서, 상기 세포 제제는 상기 DNT 세포 집단과 약학적으로 허용 가능한 담체로 구성된다.

본 발명의 제2 양태에서, 본 발명의 제1 양태에 따른 세포 제제의 제조 방법을 제공하고, 상기 방법은,

(a) 단핵 세포 집단(PBMCs)을 제공하고, 분리를 통해 DNT 세포 위주의 제1 세포 하위 집단을 획득하는 단계;

(b) 제1 세포 하위 집단에서 IL-17을 분비하는 DNT 세포를 제거한 후 증폭 배양하여, 제2 세포 하위 집단을 획득하거나; 또는

제1 세포 하위 집단을 증폭 배양한 후 IL-17을 분비하는 DNT 세포를 제거하여, 제2 세포 하위 집단을 획득하는 단계;

(c) 선택적으로, 제2 세포 하위 집단 중의 DNT 세포를 추가로 분리하여, 제3 세포 하위 집단을 획득하는 단계; 및

(d) 제2 또는 제3 세포 하위 집단을 적합한 담체와 혼합하여, 본 발명의 제1 양태에 따른 세포 제제를 획득하는 단계를 포함한다.

다른 바람직한 예에서, 단계 (a)에서, 단핵 세포 집단 중의 B 세포, CD4 및 CD8 T 세포, γδ T 세포, 1형 NKT 및 2형 NKT 세포를 제거하여, DNT 세포 위주의 제1 세포 하위 집단을 획득한다.

다른 바람직한 예에서, 단계 (a)에서, CD19, CD4, CD8, TCR-γδ, NK1.1(마우스)/CD56(인간), aGalcer-CD1d 및 LPC-CD1d 사량체 항체(또는 TCRVα24-Jα18 항체)를 사용하여 PBMC를 표지한 다음, 음성 분리를 진행하여, DNT 세포 위주의 제1 세포 하위 집단을 획득한다.

다른 바람직한 예에서, 상기 음성 분리는 자기 비드 분리, 형광 활성화 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting, FACS) 및 밀도 구배 원심분리로 이루어진 군으로부터 선택된다.

다른 바람직한 예에서, 단계 (b)에서, 그룹 A 발현 단백질로부터 선택된 하나 이상의 항체를 사용하여, 배양 전에 IL-17을 분비하는 DNT 세포를 제거하되, 그룹 A는 S100a6, Tmem176b, CXCR6, Ramp1, Tmem176a, Lgals1, Lgals3, ACTN2, ICOS, CCR2, CD82, CD127(IL7r), Ltb4r1, Hk2, TNFRSF25, Ly6a, BLK, Lsp1, Ly6e, Itgb7, Itm2b, S100a10, Ly6g5b, Thy1, CD40Ig, Ramp3, Gm2a 또는 이들의 조합을 포함하고;

보다 바람직하게, 그룹 A는 S100a6, CXCR6, ICOS, CCR2, CD82, CD127, Ltb4r 또는 이들의 조합이다.

다른 바람직한 예에서, 단계 (b)에서, 그룹 B 발현 단백질로부터 선택되는 하나 이상의 항체를 사용하여, 배양 후 시스템에서 IL-17을 분비하는 DNT 세포를 제거하되, 그룹 B는 IL-17a, Lgals1, Ly6a, CXCR6, S100a6, Lgals3, Lta, IL-4, IL-3, ICOS, S100a10, Ramp1, Tmem176b, Tnfrsf4, AA467197, Itm2b, Thy1, Igtp, Arl6ip1, Serpine2, Ltb, Tnfrsf25, Furin, Tmem176a, Ifi27l2a, Gbp2, Emp3, Ltb4r1, Tspo, Cst3, Vim, CD200 또는 이들의 조합을 포함하고;

보다 바람직하게, 그룹 B는 Lgals1, Ly6a, CXCR6, S100a6, Lgals3, Lta, ICOS, S100a10, Tnfrsf4 또는 이들의 조합이다.

다른 바람직한 예에서, 단계 (b)에서, T 세포 자극제의 존재 하에 증폭 배양하고, 상기 T 세포 자극제는 콘카나발린 A(ConA), 피토헤마글루티닌(PHA), PMA, 이오노마이신(ionomycin), IPP, 파미드론산(Pamidronate), 졸레드론산(Zoledronate), CD2 항체 또는 자기 비드 표지 항체, CD3 항체 또는 자기 비드 표지 항체, CD28 항체 또는 자기 비드 표지 항체 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

다른 바람직한 예에서, 단계 (b)에서, 증폭 배양시 IL-2, IL-15 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 시토카인을 첨가한다.

다른 바람직한 예에서, 단계 (b)에서, 항원 제시 세포 및/또는 항원 펩티드가 존재하는 조건 하에 증폭 배양한다.

다른 바람직한 예에서, 상기 항원 제시 세포는 대식 세포, 수지상 세포 및/또는 B 세포를 포함한다.

다른 바람직한 예에서, 상기 항원 펩티드는 먼지 진드기 항원 펩티드, 꽃가루 항원 펩티드, 나무가루 항원 펩티드와 같은 알레르겐에 관한 항원 폴리펩티드를 포함한다.

다른 바람직한 예에서, 상기 항원 펩티드는 자가면역질환에 관한 자가항원 펩티드를 포함한다.

다른 바람직한 예에서, 상기 항원 펩티드는,

(i) 천식에 관한 알레르겐 폴리펩티드;

(ii) 1형 당뇨병에 관한 GAD65 항원 펩티드, 인슐린 항원 펩티드;

(iii) 류마티드 면역 질환에 관한 ENA 폴리펩티드, 핵단백질 항원 폴리펩티드, 세포질 단백질 항원 폴리펩티드; 및

(iv) 자가면역 간 질환에 관한 미토콘드리아 항원 펩티드, 간 항원 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다.

다른 바람직한 예에서, 단계 (b)에서, 상기 증폭 배양의 시간은 14 ~ 21일이다.

다른 바람직한 예에서, 단계 (b)에서, 상기 증폭 배양은 시험관 내에서 진행된다.

다른 바람직한 예에서, 단계 (c)에서, 제2 세포 하위 집단 중의 CD4 및 CD8 T 세포, NK 세포를 제거하여, 제3 세포 하위 집단을 획득한다.

다른 바람직한 예에서, 단계 (c)에서, CD4, CD8, NK1.1(마우스)/CD56(인간) 항체를 사용하여 제2 세포 하위 집단 중의 DNT 세포를 표지한 다음, 음성 분리를 진행하여, 제3 세포 하위 집단을 획득한다.

다른 바람직한 예에서, 단계 (d)에서, 상기 담체는 등장액이다.

다른 바람직한 예에서, 단계 (d)에서, 상기 담체는 PBS, HBSS, 생리식염수, 젖산나트륨 링거액, 혈장, 혈청알부민 함유 등장액, 무혈청 세포 보존액 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

다른 바람직한 예에서, 상기 단핵 세포(PBMCs)는 포유동물에서 유래되고, 더 바람직하게는 인간에서 유래된다.

다른 바람직한 예에서, 상기 단계 (a)에서, 상기 단핵 세포 집단은 말초 혈액 또는 비장에서 분리된 단핵 세포이다.

본 발명의 제3 양태에서, 종양, 감염성질환, 이식거부반응, 이식편대숙주병, 알레르기성 천식, 자가면역질환, 대사증후군, 뇌졸중 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환을 치료하는 약학적 조성물의 제조에서 본 발명의 제1 양태에 따른 세포 제제의 용도를 제공한다.

다른 바람직한 예에서, 상기 대사증후군은 비만, 인슐린 저항성, 2형 당뇨병, 지방간염, 관상동맥경화성 심장병 또는 이들의 조합을 포함한다.

다른 바람직한 예에서, 상기 자가면역질환은 1형 당뇨병, 홍반루푸스, 류마티스 관절염, 쇼그렌 증후군, 건선, 다발성 경화증, 자가면역 간염, 원발성 담즙성 간경변증, 원발성 경화성 담관염, 하시모토 갑상선염, 자가면역 신장병 또는 이들의 조합을 포함한다.

본 발명의 제4 양태에서, 약학적 조성물을 제공하고, 상기 약학적 조성물은 본 발명의 제2 양태에 따른 방법에 의해 제조된 세포 제제, 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한다.

다른 바람직한 예에서, 상기 약학적 조성물은 액상 제제이다.

본 발명의 제5 양태에서, T 세포 증식 억제 및/또는 T 세포 사멸 유도 방법을 제공하고, 상기 방법은,

필요한 개체에게 본 발명의 제1 양태에 따른 조성물 또는 상기 조성물을 활성 성분으로 포함하는 약물을 투여하는 단계를 포함한다.

다른 바람직한 예에서, 상기 방법은 또한 지방 조직 염증을 억제하고 인슐린 저항성을 개선할 수 있다.

다른 바람직한 예에서, 상기 방법은 또한 천식을 항원 특이적으로 예방 및 치료할 수 있다.

이해해야 할 것은, 본 발명의 범위 내에서 본 발명의 상기 언급된 각 기술특징과 하기(예를 들어, 실시예)에서 구체적으로 설명되는 각 기술특징을 서로 결합하여 새로운 또는 바람직한 기술적 해결수단을 구성할 수 있다. 편폭에 한하여 여기서 더 이상 반복하여 설명하지 않는다.

도 1은 이중 음성 T 세포의 정제 및 유세포 검출 다이어그램을 보여준다(통상적인 방법으로 TCR-γδ, CD4, CD8 및 NK1.1 양성 세포만 제거한 경우, 나머지 TCRαβ+CD4-CD8-NK1.1-의 DNT 세포에는 여전히 약 6%의 NKT 세포가 있음).
도 2는 na

ve DNT 세포의 단일 세포 하위 집단에 대한 분석을 보여준다(약 초기 DNT 세포 전체 수의 5.8%를 차지하는 IL-17을 분비 및 발현하는 하위 집단이 존재함).
도 3은 정제된 DNT 세포가 시험관 내에서 자극, 활성화, 증식된 후의 단일 세포 하위 집단 분석을 보여준다(IL-17 분비 하위 집단이 존재하고, 그 비율은 증식 세포 전체 수의 15.5%에 도달할 수 있음).
도 4는 IL-17을 분비하는 na

ve DNT 세포 하위 집단의 세포막 단백질 유전자의 발현 수준을 보여준다.
도 5는 IL-17을 분비하는 활성화된 DNT 세포 하위 집단의 세포막 단백질 유전자의 발현 수준을 보여준다.
도 6은 각 세포군의 시험관 내 자극 실험 결과를 보여준다. 구체적으로, 정제된 전체 na

ve DNT 세포, IL-17을 분비하는 DNT 세포 및 IL-17을 분비하는 DNT 세포가 제거된 다른 DNT 세포는 각각 CD3/CD28 항체를 사용하여 시험관 내에서 자극 및 증폭시켰다. 3일 후 PCR 검증에 따르면, 전체 DNT(Total DNT)는 활성화 및 증폭 후 IL-17이 발현되었고, IL-17을 분비하는 DNT 세포(IL-17 producing DNT)는 증폭 후 IL-17의 분비가 전체 DNT군보다 현저히 높았으나, IL-17을 분비하는 DNT 세포가 사전 제거된 DNT 세포(Purified DNT)는 활성화 및 증식 후 IL-17의 분비 및 발현이 검출되지 않았다.
도 7은 각 세포군의 시험관 내 자극 실험 결과를 보여준다. 구체적으로, 전체 na

ve DNT에 대해 먼저 3일 동안 CD3/28 항체로 자극한 다음, IL-17을 분비하는 활성화 DNT 하위 집단의 세포 표면 마커를 사용하여 형광 활성화 세포 분류 및 정제를 진행하였다. 연구에 따르면, IL-17을 분비하는 활성화 DNT 하위 집단은 IL-17 발현이 뚜렷하지만, IL-17을 분비하는 활성화 DNT 하위 집단을 제거한 후, 나머지 DNT 세포는 염증성 시토카인인 IL-17이 더 이상 발현되지 않았다.
도 8은 최적화된 마우스 DNT 세포의 시험관 내 증폭 배양 시스템을 기반으로 획득된 DNT 세포가 T 세포 증식을 억제하고 T 세포 사멸을 유도하는 상당한 능력을 가짐을 보여준다.
도 9는 최적화된 마우스 DNT 세포의 시험관 내 증폭 배양 시스템을 기반으로 획득된 DNT 세포가 상당한 체내 면역 억제 능력을 가지고, 식이 유발 비만, 인슐린 저항성 및 지방간염에 대해 우수한 예방 및 치료 효과를 가짐을 보여준다. 여기서, 도 9 중 A 부분은 실험 흐름을 보여준다. 구체적으로, 8주간의 고지방 식이 후, 마우스에 단일 DNT 세포를 주입하고, 계속하여 8주간의 고지방 식이를 제공한다. 도 9 중 B 부분은 DNT 주입 후 마우스의 체중 증가가 단순 고지방 식이 섭취군보다 현저히 낮음을 보여준다. 도 9 중 C 부분은 DNT 세포 치료군의 마우스 간 지방 액포 변성 및 염증 세포 축적이 현저히 개선됨을 보여준다. 도 9 중 D 부분은 DNT 세포 치료군의 마우스 공복 혈당이 단순 고지방 식이 섭취군보다 현저히 낮음을 보여준다.
도 10은 전체 DNT 세포(IL-17을 분비하는 DNT 세포를 사전 제거하지 않음)를 주입한 치료군의 마우스 간 지방 액포 변성 및 염증 세포 축적이 대조군에 비해 현저히 개선되지 않고, 여전히 지방 액포 및 염증 세포 침윤 현상이 존재함을 보여준다.
도 11은 OVA323-339 펩티드로 증식이 자극된 DNT 세포가 OVA 항원 유도 천식에 대해 뚜렷한 보호 작용을 가지고, 알레르기성 기도 염증 및 폐 호산구 및 림프구 축적이 현저히 경감됨을 보여준다. OVA와 관련이 없는 폴리펩티드(MOG35-55) 유도 DNT 세포는 OVA 유도 마우스 천식에 대해 보호 작용이 없다.
도 12는 CD4 T 세포와 비교하여 DNT 세포가 LAG3 분자를 고발현함을 보여준다.
도 13은 야생형 DNT 세포와 비교하여 LAG3 녹아웃 DNT 세포가 OVA 유도 천식에 대한 예방 및 치료 효과가 현저히 감소됨을 보여준다.
도 14는 OVA 자극 DNT 세포에서 I-Ab OVA323-339 사량체 양성 세포가 나타나는 빈도가 OVA 자극 LAG3 녹아웃 DNT 세포 또는 OVA 비자극 야생형 DNT 세포보다 현저히 높음을 보여준다.
도 15는 DNT 세포(IL-17을 분비하는 DNT가 제거된 후의 정제된 DNT 세포)를 주입하면 폐 림프구 침윤 증상을 완전히 완화할 수 있음을 보여준다. 그러나, 동일한 사용량의 전체 DNT 세포(IL-17을 분비하는 DNT 세포를 제거하지 않음)를 주입하면 폐포 주변에 림프구 침윤이 여전히 뚜렷하여 천식을 완전히 완화할 수 없다.
도 16은 최적화된 인간 DNT 세포 시험관 내 증폭 배양 시스템을 기반으로 획득된 DNT 세포가 상당한 T 세포 증식 억제 능력을 가짐을 보여준다.

본 발명자는 광범위하고 심층적인 연구 끝에, 처음으로 DNT 세포 집단에서 IL-17을 분비하는 DNT 세포의 제거가 T 세포 증식을 억제하고 세포 사멸을 유도할 수 있으며, 지방 조직 염증을 억제하고 인슐린 저항성을 개선할 수도 있으며, 천식의 항원 특이적 예방 및 치료 작용을 가질 수 있음을 예기치 않게 발견하였다.

DNT 세포

DNT 세포, 즉 이중 음성 T 세포(Double negative T cells)는 표현형이 독특한 TCRαβ+T 림프구로, CD4, CD8, NK 등 세포의 특징적 표면 마커를 발현하지 않고, 면역 시스템에서 핵심적이고 다양한 조절 역할을 한다.

본 발명은 T 세포 증식을 억제하고 세포 사멸을 유도하는 현저한 작용을 가지며, 또한 지방 조직 염증을 억제하고 인슐린 저항성을 개선할 수 있는 IL-17을 분비하는 DNT 세포가 제거된 DNT 세포 집단을 제공한다.

본문에 사용된 바와 같이, 용어 na

ve DNT 세포는 천연적인 DNT 세포를 의미한다.

DNT 세포의 정제 및 증폭

본 발명에서, DNT 세포의 정제는 증폭 배양 전에 진행할 수 있거나 증폭 배양 후에 진행할 수 있으며, 전자는 후자에 비해 항체의 사용량이 현저히 적으므로, 바람직하게 DNT 세포의 증폭 배양 전에 IL-17 분비 DNT 세포를 사전 제거한다. 구체적으로, 두 가지 정제 방법은 하기와 같다.

1. 정제 후 증폭: 즉 DNT 증폭 전에 IL-17을 분비하는 na

ve DNT 하위 집단을 사전 제거한다.

무균 조건 하에 마우스 비장 또는 인간 말초 혈액 PBMC를 획득하고, 구배 원심분리 방법으로 단핵 세포의 현탁액을 획득한다. CD19, CD4, CD8, TCR-γδ, NK1.1(마우스)/CD56(인간), aGalcer-CD1d 및 LPC-CD1d 사량체 항체(또는 TCRVα24-Jα18 항체) 표지 단핵 세포(각각 B 세포, CD4 및 CD8 T 세포, γδ T 세포, 1형 NKT 및 2형 NKT 세포를 제거함)를 사용하여, 음성 분리(자기 비드 분리, 형광 활성화 세포 분류 또는 밀도 구배 원심분리 등 분리 방식)로 DNT 세포 위주의 세포 하위 집단을 획득하고, 아울러 S100a6, CXCR6, ICOS, CCR2, CD82, CD127, Ltb4r 등 항체 중 어느 하나 또는 조합을 사용하여, IL-17을 분비하는 DNT 세포 하위 집단을 제거한 후, 시험관 내에서 DNT 세포를 자극 및 증폭시키며(DNT 세포 증식을 자극할 수 있는 임의의 시약, 예를 들어 콘카나발린 A(ConA), 피토헤마글루티닌(PHA), PMA, 이오노마이신(ionomycin), IPP, 파미드론산(Pamidronate), 졸레드론산(Zoledronate), CD2, CD3 및 CD28 항체 또는 자기 비드 표지 항체 중 하나 또는 하나 이상의 혼합. 하나 이상의 혼합의 경우 임의의 비율로 시약을 배합할 수 있음), DNT 세포의 증식율을 증가시키기 위해, IL-2 및/또는 IL-15 등 다양한 시토카인 또는 조합을 첨가할 수 있다. 배양 시간은 14 ~ 21일이며, 이 기간 동안 배지 상태와 세포 밀도에 따라 배지와 플레이트를 교체하여 배양한다. 배양이 완료된 후, CD4, CD8, NK1.1(마우스)/CD56(인간) 항체 자기 비드 음성 선택 방식을 사용하여 배양 과정에서 존재할 수 있는 CD4, CD8 및 NK 세포를 추가로 제거하고, 증폭 배양된 DNT 세포를 획득하여 후속 치료에 사용한다. 증폭 배양된 DNT 세포의 표현형은 CD3+TCRαβ±CD4-CD8-NK1.1-(마우스)/CD56-(인간)CD19-TCRγδ±이다.

2. 증폭 후 정제: 즉 먼저 DNT 세포 하위 집단을 증폭시킨 다음 IL-17을 분비하는 활성화된 DNT 세포를 제거한다. 무균 조건 하에 마우스 비장 또는 인간 말초 혈액 PBMC를 획득하고, 구배 원심분리 방법으로 단핵 세포의 현탁액을 획득한다. CD19, CD4, CD8, TCR-γδ, NK1.1(마우스)/CD56(인간), aGalcer-CD1d 및 LPC-CD1d 사량체 항체(또는 TCRVα24-Jα18 항체) 표지 단핵 세포를 사용하여, 자기 비드 음성 분리로 DNT 세포를 획득한다. 그 다음 시험관 내에서 DNT 세포를 자극 및 증폭시키며(DNT 세포 증식을 자극할 수 있는 임의의 시약, 예를 들어 콘카나발린 A(ConA), 피토헤마글루티닌(PHA), PMA, 이오노마이신(ionomycin), IPP, 파미드론산(Pamidronate), 졸레드론산(Zoledronate), CD2, CD3 및 CD28 항체 또는 자기 비드 표지 항체 중 하나 또는 하나 이상의 혼합. 하나 이상의 혼합의 경우 임의의 비율로 시약을 배합할 수 있음), DNT 세포의 증식율을 증가시키기 위해, IL-2 및/또는 IL-15 등 다양한 시토카인 또는 조합을 첨가할 수 있다. 증폭 배양 후, 증폭된 전체 DNT 세포를 수집하고, Lgals1, Ly6a, CXCR6, S100a6, Lgals3, Lta, ICOS, S100a10 등 항체 중 어느 하나 또는 조합을 사용하여, IL-17을 분비하는 DNT 세포 하위 집단을 제거한다. 아울러, CD4, CD8, NK1.1(마우스)/CD56(인간) 항체 자기 비드 음성 선택 방식을 사용하여 배양 과정에서 존재할 수 있는 CD4, CD8 및 NK 세포를 추가로 제거하고, 증폭 배양된 DNT 세포를 획득하여 후속 치료에 사용한다. 증폭 배양된 DNT 세포의 표현형은 CD3+TCRαβ±CD4-CD8-NK1.1-(마우스)/CD56-(인간)CD19-TCRγδ±이다.

3. 항원 특이적 DNT 세포의 증폭 배양 방법은 하기와 같다.

무균 조건 하에 마우스 비장 또는 인간 말초 혈액 PBMC를 획득하고, 구배 원심분리 방법으로 단일 세포의 현탁액을 획득한다. CD19, CD4, CD8, TCR-γδ, NK1.1(마우스)/CD56(인간), aGalcer-CD1d 및 LPC-CD1d 사량체 항체(또는 TCRVα24-Jα18 항체) 표지 마우스 비장 세포(각각 B 세포, CD4 및 CD8 T 세포, γδ T 세포, 1형 NKT 및 2형 NKT 세포를 제거함)를 사용하여, 음성 분리(자기 비드 분리, 형광 활성화 세포 분류 또는 밀도 구배 원심분리 등 분리 방식)로 DNT 세포 위주의 세포 하위 집단을 획득하고, 아울러 S100a6, CXCR6, ICOS, CCR2, CD82, CD127, Ltb4r 등 항체 중 어느 하나 또는 조합을 사용하여, IL-17을 분비하는 DNT 세포 하위 집단을 제거한 후, 시험관 내에서 대식 세포, 수지상 세포 및 B 세포와 같은 항원 제시 세포인 세포와 공동 배양함과 동시에, 항원 특이성을 향상시키기 위해 특정된 항원 펩티드를 첨가할 수 있다. 배양 과정에서 IL-2, IL-15 등 다양한 시토카인 또는 조합을 첨가할 수 있다. 시험관 내 증폭 능력을 향상시키기 위해, CD3 항체를 동시에 첨가할 수 있다. 배양 7 ~ 10일 후, 배양된 세포를 수집하고 CD4, CD8, NK1.1(마우스)/CD56(인간) 항체 자기 비드 음성 선택 방식을 사용하여 배양 과정에서 존재할 수 있는 CD4, CD8 및 NK 세포를 추가로 제거한다. 아울러, CD19, CD11b 및/또는 CD11c 자기 비드 항체를 사용하여 공동 배양 시스템 중의 B 세포, 수지상 세포 등 항원 제시 세포를 제거한다. 정제하여 획득된 DNT 세포는 후속 치료에 사용한다. 증폭 배양된 DNT 세포의 표현형은 CD3+TCRαβ±CD4-CD8-NK1.1-(마우스)/CD56-(인간)CD19-TCRγδ±이다.

약학적 조성물 및 투여 방법

본 발명은 또한 본 발명의 제1 양태에 따른 세포 제제를 포함하는 본 발명의 제4 양태에 따른 약학적 조성물을 제공하고, 이는 T 세포 증식 억제 및/또는 T 세포 사멸 유도를 통해, 종양, 감염성질환, 대사증후군(비만, 인슐린 저항성, 당뇨병, 지방간염, 관상동맥경화성 심장병), 뇌졸중 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환의 치료에 사용될 수 있다. 상기 질환은 알레르기성 천식, 1형 당뇨병, 홍반루푸스, 류마티스 관절염, 쇼그렌 증후군, 건선, 다발성 경화증, 자가면역 간염, 원발성 담즙성 간경변증 및 경화성 담관염, 하시모토 갑상선염, 자가면역 신장병, 장기 이식거부반응, 이식편대숙주병 또는 이들의 조합을 더 포함한다.

본 발명은 또한 안전 유효량의 본 발명의 세포 제제 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 이러한 담체는 염수, 버퍼, 포도당, 물, 글리세린, 에탄올, 분말제, 디메틸설폭사이드(DMSO) 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 약물 제제는 투여 방식과 일치해야 한다. 본 발명의 약학적 조성물은 주사제 형태로 제조할 수 있으며, 예를 들어 생리식염수 또는 포도당 및 다른 보조제를 포함하는 수용액을 사용하여 통상적인 방법을 통해 제조할 수 있다. 활성 성분의 투여량은 치료 유효량이다. 이 밖에, 본 발명의 세포 제제는 또한 다른 치료제와 함께 사용할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 통상적인 방식으로 필요한 대상(인간 또는 비인간 포유동물)에게 투여할 수 있다. 대표적인 투여 방식은 정맥 주사, 동맥 주사, 흉강, 복강, 지주막하강, 부비강, 두개내, 상이한 조직(예를 들어 종양 조직, 염증성 병변 조직)과 같은 상이한 부위에 주사하는 방식을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 주요 장점은 하기와 같다.

(a) 본 발명은 DNT 세포를 증폭 및 정제하는 시스템이다.

(b) IL-17은 중요한 염증 인자로, 신체의 자가면역 반응 및 염증 반응을 유발할 수 있다. 본 발명의 정제된 DNT 세포는 IL-17을 분비하는 능력이 없기 때문에 세포 치료 수용체의 자가면역 반응 및 염증 반응을 유발하는 IL-17의 부작용을 피할 수 있다.

(c) 본 발명의 정제된 DNT 세포의 면역 억제 기능은 정제되지 않은 DNT보다 강하여 다양한 자가면역질환, 알레르기성 천식 및 염증 관련 질환의 치료에 사용될 수 있다.

이하, 구체적인 실시예를 결부하여 본 발명을 더 설명한다. 이러한 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 한정하려는 것이 아니다. 하기 실시예에서 구체적인 조건을 제시하지 않은 실험 방법은 통상적으로 일반적인 조건, 예를 들어 Sambrook 등, 분자 클로닝: 실험실 매뉴얼(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)에서 설명된 조건을 따르거나, 또는 제조업체가 권장하는 조건을 따른다. 다른 설명이 없는 한, 백분율 및 부는 중량에 따라 계산된다.

실시예 1

단일 세포 시퀀싱

단일 세포 전사군 시퀀싱 기술을 통해 마우스 비장의 DNT 세포에 대해 단일 세포 수준 분석을 진행하였다. 먼저 형광 활성화 세포 분류 기술(도 1 참조)을 이용하여 TCRαβ+CD4-CD8-NK1.1-의 이중 음성 T 세포를 획득하고, CD1d 사량체 항체 염색 기술을 이용하여 1형 NKT(αGalcer-CD1d 사량체 항체 양성) 및 2형 NKT(LPC-CD1d 사량체 항체 양성) 세포를 추가로 제거한 다음, 정제된 na

ve DNT에 대해 단일 세포 전사군 시퀀싱 분석을 진행하여, IL-17을 분비하는 DNT 세포 하위 집단이 존재하는지 여부를 검출하였다.

단일 세포 시퀀싱 및 PCR 검증 결과에 따르면, 정제된 DNT 세포 중 일부 세포 하위 집단의 IL-17의 mRNA 발현 수준이 다른 DNT 세포보다 현저히 높고, 이러한 DNT 세포 하위 집단은 전체 DNT 세포의 약 5.8%를 차지하였다(도 2 참조). 정제된 전체 DNT 세포를 시험관 내에서 CD3/28 항체로 3일 동안 자극한 후, IL-17을 분비하는 DNT 세포 하위 집단의 증식이 크게 증폭되고, 이때 IL-17 mRNA을 고발현하는 DNT 세포는 전체 DNT 세포의 15.5%에 도달할 수 있으며(도 3 참조), 이는 시험관 내의 자극, 활성화, 증식에서 IL-17을 분비하는 DNT 세포가 다른 DNT 세포에 비해 증식이 더 뚜렷하다는 것을 증명한다. 이러한 DNT 세포를 재주입하여 치료하면 수용체 면역 활성화, 심지어는 자가면역 반응을 일으킬 수 있다.

이러한 IL-17을 분비하는 DNT 세포를 제거하기 위해, 전체 na

ve DNT 세포를 추가로 분석하였다. 결과에서, 이러한 IL-17을 분비하는 na

ve DNT 세포가 다양한 막관통 단백질을 고도로 발현한다는 것을 보여주며, 여기서 S100a6, Tmem176b, CXCR6, Ramp1, Tmem176a, Lgals1, Lgals3, ACTN2, ICOS, CCR2, CD82, CD127(IL7r), Ltb4r1, Hk2, TNFRSF25, Ly6a, BLK, Lsp1, Ly6e, Itgb7, Itm2b, S100a10, Ly6g5b, Thy1, CD40Ig, Ramp3, Gm2a 등의 발현은 다른 DNT 세포에 비해 발현이 0.5배 이상 증가하였고, 특히 S100a6, Tmem176b, CXCR6, Ramp1, Tmem176a, Lgals1, Lgals3, ACTN2, ICOS, CCR2, CD82, CD127(IL7r) 등 단백질의 발현은 다른 DNT 세포에 비해 발현이 1배 이상 증가하였다(도 4 참조). 따라서, 상기 차등 단백질의 항체(S100a6, CXCR6, ICOS, CCR2, CD82, CD127, Ltb4r 등을 포함하지만 이에 한정되지 않음)는 IL-17을 분비하는 na

ve DNT 세포 하위 집단의 정제 및 분리에 사용될 수 있다.

나아가, 전체 na

ve DNT를 CD3/28 항체로 3일 동안 자극한 다음, 단일 세포 시퀀싱을 이용하여 활성화 및 증식된 DNT 세포를 검출하였다. 결과는 도 5에 도시된 바와 같이, IL-17을 분비하는 활성화된 DNT 세포 하위 집단은 IL-17a, Lgals1, Ly6a, CXCR6, S100a6, Lgals3, Lta, IL-4, IL-3, ICOS, S100a10, Ramp1, Tmem176b, Tnfrsf4, AA467197, Itm2b, Thy1, Igtp, Arl6ip1, Serpine2, Ltb, Tnfrsf25, Furin, Tmem176a, Ifi27l2a, Gbp2, Emp3, Ltb4r1, Tspo, Cst3, Vim, CD200과 같은 분비형 및 막관통 단백질을 고발현하며, 이러한 단백질을 응용하는 항체는 IL-17을 분비하는 활성화된 DNT 세포 하위 집단의 분리에 사용될 수 있다.

실시예 2

DNT 세포의 정제 및 효율성 검증

상기 발견을 추가로 증명하기 위해, 먼저 마우스 na

ve DNT를 정제하고, 즉 무균 조건 하에 마우스 비장을 획득하며, 적혈구를 분쇄하고 용해한 후, 단일 비장 세포 현탁액을 획득하였다. CD19, CD4, CD8, TCR-γδ, NK1.1, aGalcer-CD1d 및 LPC-CD1d 사량체 항체(또는 TCRVα24-Jα18 항체) 표지 마우스 비장 세포를 사용하여, 자기 비드 음성 분리로 DNT 세포 위주의 세포 하위 집단을 획득하고, 아울러 S100a6, CXCR6, ICOS, CCR2, CD82, CD127, Ltb4r 등 항체 중 어느 하나를 사용하여, IL-17을 분비하는 DNT 세포 하위 집단을 표지하였다.

그 다음 동일한 개수의 전체 na

ve DNT 세포, IL-17을 분비하는 DNT 세포 및 IL-17을 분비하는 DNT 세포가 제거된 다른 DNT 세포를 취한 후 CD3/CD28 항체를 각각 응용하여 시험관 내에서 자극 및 증폭시켰다.

결과는 도 6에 도시된 바와 같이, 자극 3일 후, 전체 DNT 활성화 및 증폭군은 IL-17이 발현되었고; IL-17을 분비하는 DNT 세포는 증폭 후 IL-17의 분비가 전체 DNT군보다 현저히 높았으나; IL-17 분비 세포가 사전 제거된 DNT 세포는 시험관 내에서 CD3/28 자극 후 활성화 및 증식된 DNT 세포에서 IL-17의 분비 및 발현이 나타나지 않았다(사전 제거의 효율성이 실증됨). 상기 결과는 S100a6, CXCR6, ICOS, CCR2, CD82, CD127 또는 Ltb4r 양성 DNT 세포의 사전 제거가 IL-17을 분비하는 DNT 세포 하위 집단을 효과적으로 제거하여 추가 증폭을 피할 수 있음을 나타낸다.

나아가, 전체 na

ve DNT를 CD3/28 항체로 3일 동안 자극한 다음, Lgals1, Ly6a, CXCR6, S100a6, Lgals3, Lta, ICOS, S100a10 또는 Tnfrsf4 등 항체를 사용하여 이러한 세포군을 분리 및 정제하고, PCR 검증을 진행한 결과, 이러한 항체군에 의해 분리 및 정제된 활성화 DNT 하위 집단은 IL-17 발현이 뚜렷하지만, 이러한 IL-17을 분비하는 활성화 DNT 하위 집단이 제거된 후 나머지 DNT 세포는 염증성 시토카인인 IL-17이 더 이상 발현되지 않았다(도 7 참조).

증폭 배양 전과 증폭 배양 후 DNT 세포를 정제하는 두 가지 방법을 비교하면, 첫 번째 방법의 항체 사용량은 두 번째 방법의 사용량보다 훨씬 적고, 후속 기능의 검증은 첫 번째 방법의 조건을 사용하며, 즉 배양 전 DNT 세포를 증폭시키 전에 IL-17 분비 DNT 세포를 사전 제거하는 방법을 사용하였다.

실시예 3

정제된 DNT 세포의 기능 검증

정제된 DNT 세포의 시험관 내 면역 억제 기능을 검증하기 위해, 정제하여 증식된 DNT 세포를 수지상 세포에 의해 자극 및 증식된 동종 마우스의 T 림프구와 혼합 배양하였다.

결과는 도 8에 도시된 바와 같이, 정제된 DNT 세포는 T 세포 증식을 억제하고 세포 사멸을 유도하는 현저한 작용을 가진다.

그 다음, 16주간의 고지방 식이를 통해 마우스의 비만, 당뇨병 및 지방간염을 유도한 모델을 이용하여 DNT 세포의 체내 염증 억제의 작용 효과를 연구하였다. 8주간의 고지방 식이 후, 마우스에 3-5×10⁶ DNT 세포를 단 번에 주입한 후, 계속하여 8주간의 고지방 식이를 제공하였다(총 16주).

결과는 도 9에 도시된 바와 같이, DNT 세포 치료군의 마우스 체중, 공복 혈당 및 지방간의 상태는 현저히 개선되었고, 이는 DNT 세포에 의한 지방 조직 염증 억제 및 인슐린 저항성 개선과 관련이 있다.

그러나, 전체 DNT 세포(IL-17을 분비하는 DNT 세포를 사전 제거하지 않음)를 주입한 경우, 치료군의 마우스 간 지방 액포 변성 및 염증 세포 축적은 대조군에 비해 현저히 개선되지 않고, 여전히 지방 액포 및 염증 세포 침윤 현상이 존재하였다(도 10).

실시예 4

항원 특이적 DNT 세포 배양

DNT의 항원 특이적 면역 억제를 탐구하기 위해, 먼저 OVA 유도 마우스 알레르기성 천식 모델을 구축하였다. 그 다음, 마우스의 성숙된 수지상 세포와 정제된 na

ve DNT 세포를 이용하여 시험관 내에서 혼합 배양하였다. 배양 과정에서 OVA 특이적 OVA323-339 항원 펩티드를 첨가하거나 OVA와 관련이 없는 MOG33-55 항원 펩티드를 첨가하여, 자극 및 증식된 DNT 세포의 항원 특이적 억제 효과를 관찰하였다.

결과는 도 11에 도시된 바와 같이, 2회의 OVA 감작 후, OVA 단백질이 알레르기성 천식을 자극한 후 OVA323-339 폴리펩티드를 주입하여 증식된 세포를 자극하면 천식 발작에 대해 우수한 제어 작용이 있으나, 관련이 없는 펩티드 MOG33-55에 의해 시험관 내에서 자극된 DNT 세포는 OVA 단백질 유발 천식에 대해 예방 및 치료 효과가 좋지 않으므로, 시험관 내에서 증폭 배양된 DNT가 현저한 항원 특이적 면역 억제 작용을 가짐을 입증하였다.

CD4 T 세포와 비교한 결과 DNT는 더 높은 수준의 분자 LAG3을 발현하는 것을 발견하였다(도 12 참조). Lag3 분자는 MHC-II 분자와 결합할 수 있고, MHC-II 분자와의 친화도는 CD4 분자보다 훨씬 높다.

OVA323-339 폴리펩티드를 이용하여 시험관 내에서 각각 야생형 DNT 세포와 LAG3 녹아웃 DNT 세포를 자극하였다. 그 후, OVA 유도 알레르기성 천식에 대한 양자의 예방 및 치료 작용을 관찰하였다. 결과는 도 13 및 도 14에 도시된 바와 같이, LAG3 녹아웃 DNT 세포의 면역 보호 작용은 현저히 감소하였다. OVA 특이적 MHC-II 분자를 이용한 Tetramer(I-A^b OVA₃₂₃ _-339 tetramers) 염색 결과, LAG3 녹아웃 DNT 세포의 I-A^b OVA_323-339 tetramers를 인식하는 능력이 현저히 감소되어, DNT 세포의 항원 특이적 면역 억제 능력의 감소를 초래한다는 것을 발견하였다. 이로써, LAG3 분자가 DNT 세포의 항원 특이성을 유지하는 데 중요한 작용을 한다는 것이 증명되었다.

그러나, 동일한 사용량의 전체 DNT 세포(IL-17을 분비하는 DNT 세포를 제거하지 않음)를 주입하면 폐포 주변에 림프구 침윤이 여전히 뚜렷하여 천식을 완전히 완화할 수 없다(도 15 참조).

실시예 5

인간 DNT 세포의 기능 검증

정제된 인간 DNT 세포의 시험관 내 면역 억제 기능을 추가로 검증하기 위해, 실시예 2 중의 방법을 사용하여 인간 DNT 세포를 정제 및 증폭시키고, 이를 수지상 세포(DC)에 의해 자극 및 증식된 T 림프구와 혼합 배양하였다.

결과는 도 16에 도시된 바와 같이, 정제된 DNT 세포는 현저한 T 세포 증식 억제 작용을 가진다.

본 발명에서 언급된 모든 문헌은 각 문헌이 개별적으로 참고로서 인용되는 것처럼 참조로서 본 발명에 인용된다. 이 밖에, 본 발명의 상기 교시 내용을 열독한 후, 당업자는 본 발명에 대해 다양한 변경 또는 수정을 진행할 수 있으며, 이러한 등가 형태도 본 발명에 첨부된 특허청구범위에 의해 한정된 범위에 속한다는 것을 이해해야 한다.

Claims

세포 제제로서,
상기 세포 제제는 DNT 세포 집단을 포함하고, 상기 DNT 세포 집단에서 전체 세포수의 95% 이상, 바람직하게 98% 이상, 더 바람직하게 99% 이상, 가장 바람직하게 99.9% 이상을 차지하는 세포는 IL-17을 분비 및 발현하지 않는 것을 특징으로 하는 세포 제제.
제1항에 있어서,
상기 DNT 세포 집단에서, 전체 세포수의 95% 이상을 차지하는 세포는 표면 항원 CD3+ 및 TCRαβ를 가지는 것을 특징으로 하는 세포 제제.
제1항에 있어서,
상기 DNT 세포 집단에서, 전체 세포수의 50% 이상을 차지하는 세포는 LAG3 유전자를 고발현하는 것을 특징으로 하는 세포 제제.
제1항에 따른 세포 제제의 제조 방법으로서,
(a) 단핵 세포 집단(PBMCs)을 제공하고, 분리를 통해 DNT 세포 위주의 제1 세포 하위 집단을 획득하는 단계;
(b) 제1 세포 하위 집단에서 IL-17을 분비하는 DNT 세포를 제거한 후 증폭 배양하여, 제2 세포 하위 집단을 획득하거나; 또는
제1 세포 하위 집단을 증폭 배양한 후 IL-17을 분비하는 DNT 세포를 제거하여, 제2 세포 하위 집단을 획득하는 단계;
(c) 선택적으로, 제2 세포 하위 집단 중의 DNT 세포를 추가로 분리하여, 제3 세포 하위 집단을 획득하는 단계; 및
(d) 제2 또는 제3 세포 하위 집단을 적합한 담체와 혼합하여, 제1항에 따른 세포 제제를 획득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서,
단계 (a)에서, 단핵 세포 집단 중의 B 세포, CD4 및 CD8 T 세포, γδ T 세포, 1형 NKT 및 2형 NKT 세포를 제거하여, DNT 세포 위주의 제1 세포 하위 집단을 획득하는 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서,
단계 (b)에서, 그룹 A 발현 단백질로부터 선택된 하나 이상의 항체를 사용하여, 배양 전에 IL-17을 분비하는 DNT 세포를 제거하되, 그룹 A는 S100a6, Tmem176b, CXCR6, Ramp1, Tmem176a, Lgals1, Lgals3, ACTN2, ICOS, CCR2, CD82, CD127(IL7r), Ltb4r1, Hk2, TNFRSF25, Ly6a, BLK, Lsp1, Ly6e, Itgb7, Itm2b, S100a10, Ly6g5b, Thy1, CD40Ig, Ramp3, Gm2a 또는 이들의 조합을 포함하고;
보다 바람직하게, 그룹 A는 S100a6, CXCR6, ICOS, CCR2, CD82, CD127, Ltb4r 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서,
단계 (b)에서, 그룹 B 발현 단백질로부터 선택되는 하나 이상의 항체를 사용하여, 배양 후 시스템에서 IL-17을 분비하는 DNT 세포를 제거하되, 그룹 B는 IL-17a, Lgals1, Ly6a, CXCR6, S100a6, Lgals3, Lta, IL-4, IL-3, ICOS, S100a10, Ramp1, Tmem176b, Tnfrsf4, AA467197, Itm2b, Thy1, Igtp, Arl6ip1, Serpine2, Ltb, Tnfrsf25, Furin, Tmem176a, Ifi27l2a, Gbp2, Emp3, Ltb4r1, Tspo, Cst3, Vim, CD200 또는 이들의 조합을 포함하고;
바람직하게, 그룹 B는 Lgals1, Ly6a, CXCR6, S100a6, Lgals3, Lta, ICOS, S100a10, Tnfrsf4 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서,
단계 (b)에서, 항원 제시 세포 및/또는 항원 펩티드가 존재하는 조건 하에 증폭 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
종양, 감염성질환, 이식거부반응, 이식편대숙주병, 알레르기성 천식, 자가면역질환, 대사증후군, 뇌졸중 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환을 치료하는 약학적 조성물의 제조에서 제1항에 따른 세포 제제의 용도.
약학적 조성물로서,
상기 약학적 조성물은 제4항에 따른 방법에 의해 제조된 세포 제제, 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.