CN101331150A - 人单克隆抗体人cd134(ox40)及其制备方法和应用 - Google Patents

人单克隆抗体人cd134(ox40)及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了特异性结合OX40(CD134)的抗体，称为OX40抗体、抗－OX40或抗－OX40抗体。本发明特异性结合OX40的抗体包括哺乳动物(人、灵长类动物等)、人源化或嵌合的抗－OX40抗体。本发明特异性结合OX40的抗体和抗体子序列(片段)包括用于多种方法包括治疗、筛选和检测方法的纯化和分离的抗体，及其药物配方。

Description

人单克隆抗体人CD134(OX40)及其制备方法和应用
相关申请的交叉引用
[0001]本申请要求2005年11月25日提交的申请序列号60/739,659的优先权，在此特别并入作为参考。
引言
[0002]免疫系统由多种起作用以使身体免于感染性疾病的细胞类型组成。其取决于对外来抗原的识别以及区分自身抗原和非自身抗原的能力。有时自身抗原和非自身抗原之间的屏障会被破坏，造成由我们自身免疫系统所导致的组织破坏。这些自身免疫应答能引起使人虚弱的疾病如糖尿病、多发性硬化和炎性肠病。一种这些自身免疫应答的主要介质是T淋巴细胞或T细胞。一般地，T细胞耐受自身抗原，但在某些自身免疫性疾病中，该耐受消失并且T细胞发动针对健康组织的免疫应答。除去自身免疫T细胞或阻断它们的活化或生存改善了疾病症状。然而，该T细胞的一般耗竭或阻止它们的活化引起了免疫抑制，由此患者变得对传染物高度易感。因此，需要能特异性靶向效应T细胞并只减少自身反应性T细胞的新疗法。
发明概述
[0003]本发明提供了特异性结合OX40胞外域氨基酸序列(如SEQ IDNO：50)中的表位的分离或纯化的抗体。抗体包括结合哺乳动物(如灵长类动物或人)OX40序列(如SEQ ID NO：49)的人、人源化和嵌合抗体。抗体还包括具有OX40拮抗活性的那些抗体。抗体进一步包括具有OX40激动活性的那些抗体。
[0004]在具体的实施方案中，一种抗体具有OX40拮抗活性并减少或增加细胞因子或干扰素的产生，活化、效应、记忆或调节T细胞的生存或增殖，抗凋亡蛋白或凋亡前体蛋白的表达。在具体的非限制性方面中，细胞因子选自IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-14、IL-16、IL-17、IL-23、IL-26、TNF-α、干扰素γ和GM-CSF；以及抗凋亡蛋白或凋亡前体蛋白选自Bcl-xL、Bcl-2、Bad和Bim。
[0005]在其他具体的实施方案中，OX40抗体由称为112F32(ATCC编号PTA-7217，2005年11月17日保藏的)、112V8(ATCC编号PTA-7219，2005年11月17日保藏的)、112Y55(ATCC编号PTA-7220，2005年11月17日保藏的)、112Y131(ATCC编号PTA-7218，2005年11月17日保藏的)和112Z5(ATCC编号PTA-7216，2005年11月17日保藏的)杂交瘤细胞系所产生。在另外的实施方案中，OX40抗体结合由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体结合的氨基酸序列；具有在由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体的约1-5000倍范围内的OX40结合亲和力；具有与由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体相比更大或更小的OX40结合亲和力；具有在由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体的约KD 10-6M-约KD 10-13M范围内的OX40结合亲和力；具有由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体的结合特异性；与由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体竞争与OX40结合；如在ELISA测定法中所测定的，抑制或阻止由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体与OX40结合(如抑制至少50％的由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体与OX40结合)；或结合与112V8、112Y55和Y131所结合的表位相同的表位，以及抑制或阻止OX40与OX40配体(OX40L)结合(如85％或更多)。
[0006]抗体额外包括特异性结合细胞上表达的OX40的那些抗体。在具体的实施方案中，抗体特异性结合非T细胞(如自然杀伤细胞、粒细胞、单核细胞、B细胞)，或用OX40转染的细胞系(如CHO细胞、L929细胞或HELA细胞)上表达的OX40。在具体的方面中，抗体特异性结合活化的人T细胞，而非静息的T细胞。
[0007]抗体包括如SEQ ID NO：7-10和SEQ ID NO：44-49所示的成熟的重链或轻链可变区序列。抗体还包括如SEQ ID NO：7-10和SEQ IDNO：44-49所示的抗体成熟的重链或轻链可变区序列的修饰和可变形式，如在恒定区、互补决定区(CDR)或构架区(FR)之内或之外的取代。在具体的方面中，取代包括保守氨基酸取代。在另外的具体方面中，取代包括1-3个、3-5个、5-10个或更多个氨基酸残基的氨基酸取代。在另外的具体方面中，抗体与如SEQ ID NO：7-10和SEQ ID NO：44-49所示的成熟的重链或轻链可变区序列的序列具有80％-85％、85％-90％、90％-95％、96％、97％、98％、99％或更多的同一性。
[0008]抗体还包括如SEQ ID NO：7-10和SEQ ID NO：44-49所示的成熟的重链或轻链可变区序列的子序列。在具体的方面中，子序列选自Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、Fd、单链Fvs(scFv)、二硫键连接的Fvs(sdFv)和VL或VH。
[0009]抗体还包括异源结构域。在具体的方面中，异源结构域包括标签、可检测的标记或细胞毒素剂。
[0010]诸如取代、子序列和添加的修饰和可变的抗体能保留可检测的如本文中所述的OX40抗体的活性。在一个实施方案中，修饰的抗体保留可检测的由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体的活性。在另一个实施方案中，修饰的抗体调节T细胞增殖或生存，或调节活化、效应、记忆或调节T细胞的数量，或耗竭活化、效应、记忆或调节T细胞。在具体的方面中，修饰的抗体抑制OX40信号传导或减少或耗竭特异性针对自身抗原(如诸如髓磷脂碱蛋白、髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白、含蛋白脂质蛋白、胶原、滑膜关节组织抗原、胰岛素、谷氨酸脱羧酶、肠抗原、甲状腺抗原、组蛋白、肌肉抗原和皮肤抗原的自身抗原)的自身反应性T细胞的数量。
[0011]抗体还包括与抗体L106竞争或不与其竞争与OX40结合的那些抗体。在一个具体的实施方案中，如在ELISA测定法中所测定的，抗体不抑制或阻止抗体L106与OX40结合。
[0012]抗体进一步包括影响OX40功能或活性的那些抗体。在具体的实施方案中，抗体抑制或阻止OX40配体与OX40结合；抑制或阻止OX40配体与活化T细胞结合；调节OX40介导的细胞信号传导(如抑制或阻止)；调节OX40介导的细胞应答；或OX40介导的细胞信号传导(如抑制或阻止)。在具体的方面中，OX40介导的细胞应答包括淋巴细胞增殖、细胞因子表达、淋巴细胞生存、NF-κB活化、PKB(Akt)活性的维持或存活蛋白的增量调节。在另外的实施方案中，抗体通过自然杀伤细胞、巨噬细胞或嗜中性白细胞介导，诱导EL4-人OX40表达细胞或活化的人T细胞溶解，例如，在10μg/ml抗体下诱导的特异性细胞溶解百分率(％)为约15-75％、25-65％、或30-60％、或50-100％。
[0013]抗体进一步包括具有体内功能或活性的那些抗体。在具体的实施方案中，抗体减轻、减少或预防急性或慢性异种移植物宿主病模型中的移植物抗宿主病的症状，或使急性或慢性异种移植物宿主疾病模型(如在给予抗-IL2Rβ链抗体和亚致死剂量辐射后接受人外周血单核细胞(PBMC)的免疫缺陷型(SCID)小鼠)中的移植物抗宿主病缓解或消退。在具体的方面中，移植物抗宿主病的症状是体重减轻，脱发，皮疹，血尿，腹水和肝、肠道、肺、皮肤中炎性细胞浸润或死亡。
[0014]在另外的实施方案中，抗体减轻、减少或预防肺、皮肤或肠中的炎症，或减轻、减少或预防自身免疫性疾病的症状。在具体的方面中，抗体缓解或预防类风湿性关节炎、多发性硬化、糖尿病、克罗恩氏病、炎性肠病、溃疡性结肠炎、乳糜泻、银屑病、增生性狼疮性肾炎、肉芽肿性肌病、或多发性肌炎的症状。
[0015]抗体包括单克隆和多克隆抗体，其的任何同种型或亚类。在具体的方面中，抗体是IgG(如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、IgA、IgM、IgE或IgD同种型。
[0016]抗体可包含在药物组合物中。在一个实施方案中，抗体包括药学上可接受的载体或赋形剂。
[0017]抗体可由核酸序列编码。在一个实施方案中，核酸编码如SEQID NO：7-10和SEQ ID NO：44-49所示的成熟的重链或轻链可变区序列的序列或其子序列。在具体的方面中，核酸序列包括SEQ ID NO：3-6和SEQ ID NO：38-43，或SEQ ID NO：3-6和SEQ ID NO：38-43的简并序列。在另外的具体方面中，核酸编码具有如SEQ ID NO：7-10和SEQ ID NO：44-49所示的重链或轻链可变区序列经一个或多个氨基酸残基取代、添加或缺失的氨基酸序列。在另外的具体方面中，核酸编码具有如SEQ ID NO：7-10和SEQ ID NO：44-49所示的重链或轻链可变区序列经一个或多个氨基酸残基取代、添加或缺失的氨基酸序列，所属氨基酸序列具有由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体的活性(如具有针对OX40胞外域表位的结合亲和力)。在更进一步的具体实施方案，核酸序列包括表达控制序列或载体。
[0018]抗体可由宿主细胞和分离的细胞所产生。在具体的实施方案中，宿主或分离的细胞是杂交瘤细胞或CHO细胞。在另外的具体实施方案中，分离的细胞表达具有与由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体一样的结合特异性的抗体。
[0019]本发明提供了试剂盒。在具体的实施方案中，试剂盒包括由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体，和用于将抗体给予需要用该抗体治疗的个体的说明书。
[0020]本发明提供了包括处理和治疗方法的体内方法。在具体的实施方案中，一种用于治疗需要治疗的个体中慢性或急性免疫性疾病或病症、或慢性或急性免疫性疾病或病症的症状的方法包括给予个体能有效治疗个体中慢性或急性免疫性疾病或病症、或慢性或急性免疫性疾病或病症的症状的抗体或药物组合物。在具体的方面中，治疗导致缓解或改善一种或多种与慢性或急性免疫性疾病或病症相关的不利症状或身体后果。
[0021]在另外的具体实施方案中，一种用于治疗移植物抗宿主病的方法包括给予需要治疗的个体能有效治疗移植物抗宿主病的抗体或药物组合物。在具体的方面中，治疗减轻、减少或预防一种或多种与移植物抗宿主病相关的不利症状或身体后果(如体重减轻、脱发、皮疹、血尿、腹水、肝、肠道、肺中炎性细胞浸润或死亡)的发作、频率、持续时间或严重性，引起移植物抗宿主病的缓解或消退，或造成预防移植物抗宿主病。在另外的方面中，移植物可包括骨髓、造血干细胞、外周血干细胞或脐带血干细胞。
[0022]在另外的具体实施方案中，一种用于治疗移植排斥的方法包括给予需要治疗的个体能有效治疗移植排斥的抗体或药物组合物。在具体的方面中，治疗减轻、减少或预防一种或多种与移植排斥(如针对移植物或移植细胞的免疫应答或组织破坏)相关的不利症状或身体后果(如体重减轻、脱发、皮疹、血尿、腹水、肝、肠道、肺中炎性细胞浸润或死亡)的发作、频率、持续时间或严重性，引起移植排斥的缓解或消退，或造成预防移植排斥。在另外的方面中，移植物可包括肾、心、肺、皮肤、肝或胰脏细胞、组织或器官。
[0023]在更进一步的具体实施方案中，一种用于减轻、减少或预防炎症的方法包括给予需要治疗的个体能有效减轻、减少或预防炎症的发作、频率、持续时间或严重性的抗体或药物组合物。在具体的方面中，炎症存在于肺、关节、肌肉、皮肤、中枢或末梢神经系统或肠中。在另外的方面中，治疗导致减轻一种或多种与炎症相关的不利症状或身体后果的发作、频率、持续时间或严重性。
[0024]还在另外的具体实施方案中，一种用于治疗自身免疫性疾病的方法包括给予需要治疗的个体能有效减轻、减少或预防自身免疫性疾病的症状的发作、频率、持续时间或严重性的抗体或药物组合物。在具体的方面中，自身免疫性疾病包括类风湿性关节炎、多发性硬化、糖尿病、克罗恩氏病、炎性肠病、溃疡性结肠炎、乳糜泻、银屑病、增生性狼疮性肾炎、肉芽肿性肌病或多发性肌炎。在另外的方面中，治疗导致减轻、减少或预防一种或多种与自身免疫性疾病相关的不利症状或身体后果的发作、频率、持续时间或严重性。
[0025]当在体内实施时，能导致处理或治疗的另外的方法包括调节OX40活性或功能。在具体的实施方案中，一种用于抑制或阻止OX40-介导的细胞应答的方法包括给予需要抑制或阻止OX40-介导的细胞应答的个体能有效抑制或阻止OX40-介导的细胞应答(如淋巴细胞增殖、细胞因子表达或淋巴细胞生存)的抗体或药物组合物。在另外的实施方案中，一种用于抑制或封闭OX40配体与活化T细胞结合的方法包括给予需要封闭、抑制或阻止OX40配体与活化T细胞结合的个体能有效抑制或阻止OX40配体与活化T细胞结合的抗体或药物组合物。在另外的实施方案中，一种用于抑制或封闭OX40配体与OX40结合的方法包括给予需要封闭、抑制或阻止OX40配体与OX40结合的个体能有效抑制或阻止OX40配体与OX40结合的抗体或药物组合物。在更进一步的具体实施方案中，一种用于调节OX40-介导的细胞信号传导的方法包括给予需要调节OX40-介导的细胞信号传导的个体能有效调节OX40-介导的细胞信号传导的抗体或药物组合物。还在另外的具体实施方案中，一种用于减少活化、效应、记忆或调节T细胞数量的方法包括给予需要减少活化、效应、记忆或调节T细胞数量的个体足以减少活化、效应、记忆或调节T细胞数量的量的抗体。
[0026]还在另外的具体实施方案中，一种用于减少急性或慢性异种移植物宿主疾病模型的血、脾、淋巴结、肠、肝、肺或皮肤中活化T细胞数量的方法包括将足以减少血、脾、淋巴结、肠、肝、肺或皮肤中活化T细胞数量的量的抗体给予急性或慢性异种移植物宿主疾病模型。
[0027]还在另外的具体实施方案中，一种用于治疗由活化、效应、记忆或调节T细胞所引起的疾病或病症的方法包括给予个体足以减轻、减少或预防由活化、效应、记忆或调节T细胞所引起的疾病或病症的进展或耗竭活化、效应、记忆或调节T细胞的量的抗体。在具体的方面中，疾病或病症包括移植物抗宿主病、炎症或自身免疫性疾病。
[0028]根据本发明可治疗的个体包括哺乳动物(如人)。在具体的实施方案中，个体是慢性或急性免疫性疾病或病症的候选人或已进行慢性或急性免疫性疾病或病症治疗；个体是移植物抗宿主病的候选人或已进行移植物抗宿主病治疗；个体是移植排斥的候选人或已进行移植排斥治疗；个体是炎症的候选人或已进行炎症治疗；或个体是自身免疫性疾病的候选人或已进行自身免疫性疾病治疗；个体是OX40-介导的细胞应答的候选人或已进行OX40-介导的细胞应答治疗。
[0029]可通过任何可接受的方法实施包括给予或递送OX40抗体的本发明的方法。在具体的实施方案中，OX40抗体局部、区域或全身性给予个体。
[0030]本发明还提供了用于产生具有OX40拮抗活性的人OX40抗体的方法。在一个实施方案中，一种方法包括将缀合有人Fc重组蛋白的人OX40胞外域或活化的人T细胞给予能表达人免疫球蛋白的动物(如转基因小鼠或转基因牛)；筛选表达人OX40抗体的动物；选择产生人OX40抗体的动物；从所选择的动物中分离抗体；以及确定人OX40抗体是否具有OX40拮抗活性。
[0031]本发明进一步提供了用于产生抑制或阻止OX40与OX40配体(OX40L)结合的人OX40抗体的方法。在一个实施方案中，一种方法包括将缀合有人Fc重组蛋白的人OX40胞外域或活化的人T细胞给予能表达人免疫球蛋白的动物(如转基因小鼠或转基因牛)；筛选表达人OX40抗体的动物；选择产生人OX40抗体的动物；从所选择的动物中分离抗体；以及确定人OX40抗体是否抑制或阻止OC40与OX40配体(OX40L)结合。
[0032]此外，本发明提供了表达OX40抗体的非人转基因动物。在多个实施方案中，所表达的OX40抗体与由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体相同；结合由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体所结合的OX40胞外域氨基酸序列中的表位；具有在由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体的约1-5000倍范围内的OX40结合亲和力；具有在由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体的约KD 10-6M-约KD 10-12M范围内的OX40结合亲和力；具有由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体的结合特异性；或与由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体竞争与OX40结合。
附图简述
[0033]图1A-F：用人抗-人OX40抗体进行的流式细胞检测分析。A.在用PHA和IL2刺激3天后，人CD4T细胞的前向散射对侧向散射分布图。B-F.用人抗-人OX40抗体或对照标记的活化的人T细胞。粗线表示在活化的门限中染色的细胞，而细线表示在静息门限中的细胞。在频率分布图中同种型对照IgG抗体标记的活化细胞以点线表示。B.112F32、C.112V8、D.112Y55、E.112Y131和F.112Z5。
[0034]图2：活化的人T细胞的人抗-人OX40单克隆抗体染色。所呈现的几何平均荧光强度数据来源于类似于图1A中所描述的活化T细胞门限。这些数据用于测定示于表3中的KD和BMAX。
[0035]图3A-B：5种OX40抗体竞争结合OX40。A.用抗-小鼠IgG-HRP检测hOX40:mFc与包被的抗体结合的抑制百分数。B.用绵羊抗-人IgG-HRP检测hOX40:hFc与小鼠抗体结合的抑制百分数。阴性数量未显示。
[0036]图4A-B：5种OX40抗体竞争结合OX40。A.用SA-PE检测的用封闭抗体和生物素化的抗-OX40抗体染色的活化T细胞的抑制百分数。B.用SA-PE检测用小鼠抗-人OX40抗体和生物素化的抗-OX40抗体标记的活化的人T细胞的抑制百分数。阴性数量未显示。
[0037]图5A-B：通过ELISA和流式细胞术测定的人抗-人OX40单克隆抗体对OX40L与OX40结合的封闭。A.通过ELISA用抗-FLAG-HRP第二抗体检测配体结合的抑制百分数。B.通过流式细胞术用抗-FLAG-PE抗体检测OX40L结合的抑制百分数。
[0038]图6A-C：图A-C代表使用三种不同的供体对的三个研究，并描述了抗-OX40抗体对T细胞增殖的效应。
[0039]图7A-C：抗体112V8G1重组抗体改善了急性异种移植物抗宿主病。A.总宏观病理学评分。B.通过流式细胞仪分析脾的单一细胞悬浮液中人T细胞的存在。显示了T细胞的平均数和每一处理组中每个群体的标准偏差。C.测定了小鼠血清中的人干扰素γ。显示了每组小鼠以pg/ml计的干扰素γ的平均数量加标准偏差。
[0040]图8A-C：抗体112V8G1改善了慢性异种移植物抗宿主病。A.小鼠个体的总的宏观病理学评分。B.通过流式细胞仪测定的小鼠脾中人T细胞的平均数加标准偏差。C.在CD4T细胞移植后第48天，SCID小鼠外周淋巴节中人T细胞的平均数量。
[0041]图9A-C：当在第0、3或6天给予时，抗体112V8G4PE改善了急性异种移植物抗宿主病。A.在第0天处理的小鼠个体的总宏观病理学评分。B.在第0天处理的小鼠中第12天脾中人T细胞的平均数加组平均偏差。C.在第3天或第6天处理的小鼠个体的总宏观病理学评分。
[0042]图10：抗-人OX40人IgG1抗体的特异性溶解百分数。抗-人OX40人IgG1抗体介导EL4-人OX40靶的ADCC。
发明详述
[0043]本发明至少部分基于特异性结合OX40(CD134)的抗体，其例如可称为OX40抗体、抗-OX40或抗-OX40抗体。特异性结合OX40的本发明的抗体包括哺乳动物(人、灵长类动物等)、人源化和嵌合的抗-OX40抗体。特异性结合OX40的本发明的抗体和抗体子序列(片段)包括纯化和分离的抗体及其药物配方。
[0044]OX40是一种50千道尔顿(KDa)的糖蛋白和肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)成员。已报道了在内皮细胞、活化的抗原呈递细胞包括巨噬细胞、树突细胞、B细胞和自然杀伤细胞上表达OX40的配体-OX40L(也称为TNFSF4、CD252)。尽管不希望受理论约束，但如同对脂多糖(LPS)一样，抗原呈递细胞上CD40之间的结合增加了OX40L的表达。在通过T细胞抗原受体传导信号之后，可诱导T细胞上OX40表达。例如，在炎症部位处OX40在新近活化的T细胞上表达。在炎性环境下CD4和CD8T细胞可上调节OX40。
[0045]OX40也称为CD 134、TNFRSF4、ACT35和TXGP 1L。OX40包括哺乳动物(如灵长类动物、人)形式的OX40。因此，本发明的OX40抗体包括特异性结合哺乳动物OX40序列如人OX40的抗体。OX40序列如人OX40包括多态变体。全长人OX40的一个非限制性例子是如下所示的序列：
MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTG LHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCSRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI(SEQ ID NO：49).
[0046]OX40抗体、抗-OX40和抗-OX40抗体指特异性结合OX40的抗体。特异性结合是抗体对OX40上所存在表位的选择。使用本领域已知的测定法(如免疫沉淀、ELISA、流式细胞术、蛋白质印迹)可区分特异性结合和非特异性结合。
[0047]当抗体特异性结合的所有或部分抗原表位存在于不同的蛋白之上时，OX40抗体可结合不同的蛋白。因此，取决于OX40表位序列或结构同源性的程度，OX40抗体可特异性结合另一种与该OX40表位具有高序列或结构同源性的蛋白。因此，当足够的序列或结构同源性表位存在于不同的蛋白之上时，OX40抗体可结合不同的蛋白。
[0048]本发明的OX40抗体包括分离的和纯化的抗体。因此，包括分离或纯化的OX40抗体的本发明的抗体不包括人类抗体。
[0049]用作组合物修饰词的术语“分离的”意指该组合物为人工制备或与一种或多种天然存在于体内环境中的其他成分分离，通常通过一步或多步操纵的步骤或过程。一般而言，这样分离的组合物基本上不含有一种或多种在自然界中与它们通常相关的物质，例如一种或多种蛋白、核酸、脂类、碳水化合物、细胞膜。因此，分离的组合物与该组合物天然存在的生物体细胞中其他生物成分分离，或与产生其(如合成或通过细胞培养)的人工培养基分离。例如，分离的OX40抗体可获得自其中产生该抗体的动物(如非转基因哺乳动物或转基因哺乳动物，例如啮齿类动物(小鼠)或有蹄类动物(牛))并与其他多肽和核酸分离。因此，含有获得自该动物的抗体的血清被认为是分离的。术语“分离的”并不排除可选的物质形式，例如，分离的抗体可包括抗体子序列、嵌合体、多聚体或衍生形式。
[0050]用作为组合物修饰语的术语“纯化的”指组合物几乎或基本上不含有在自然界中所有与之通常相关的物质。纯化的抗体通常除去了抗体环境中一般存在的成分。因此，与产生抗体的杂交瘤细胞培养物分离的抗体上清液被认为是纯化的。因此，纯化的无需绝对的纯度且该纯度是处于特定的范围中。此外，“纯化的”组合物可与一种或多种其他分子结合。因此，术语“纯化的”并不排除组合物的结合。可通过任何适当的方法测定纯度，包括例如UV光谱法、层析法(如HPLC，气相)、凝胶电泳(如银或考马斯染色)以及序列分析(肽和核酸)。
[0051]“纯化的”蛋白和核酸包括通过标准的纯化方法产生的蛋白和核酸。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达以及化学合成产生的蛋白和核酸。“纯化的”还可指其中污染物水平低于管理机构例如美国食品和药物管理局(FDA)对于人或非人动物用药的可接受的水平的组合物。
[0052]本发明的OX40抗体包括特异性结合OX40胞外域氨基酸序列中表位的抗体。在具体的实施方案中，如通过交叉封闭测定法所测定的，例证性的OX40抗体特异性结合OX40上三个“表位”。例证性的非限制性人OX40胞外域序列如下所示：
MCVGARRLGR GPCAALLLLG LGLSTVTGLH CVGDTYPSNDRCCHECRPGN GMVSRCSRSQ NTVCRPCGPG FYNDVVSSKP CKPCTWCNLRSGSERKQLCT ATQDTVCRCR AGTQPLDSYK PGVDCAPCPP GHFSPGDNQACKPWTNCTLA GKHTLQPASN SSDAICEDRD PPATQPQETQ GPPARPITVQPTEAWPRTSQ GPS(SEQ ID NO：50).
[0053]肽表位通常是短的氨基酸序列，如长度为约5-15个氨基酸的氨基酸序列。用于鉴定表位的技术是本领域熟知的并描述于例如美国专利号4,708,871中。简言之，可合成来源于OX40多肽的一组重叠寡肽并将其结合在固相阵列的引脚上，每个引脚上的寡肽都是不同的。引脚阵列可包含96孔微量滴定板，使得一次可同时测定96种寡肽。同样地，可利用以高密度固定在膜载体上的不同长度(如6-15个单体)的高度重叠肽扫描鉴定不连续表位。使用高抗体浓度，并且通过间接的免疫测定检测结合。如果多条结合序列被鉴定并为间隔序列所分隔，但单条肽不被识别，则已鉴定出不连续表位。分隔的表位将预计能在靶蛋白表面上形成连续区域并代表着一种构象表位(Reineke，等Protein Sci.7：951(1998))。可选地，商业上可获得的噬菌体展示肽文库试剂盒(New England BioLabs)能用于表位作图。这些方法和其他方法可用于测定对可能的每一亚组相邻氨基酸的结合亲和力，以便鉴定特定抗体结合的表位。当表位长度肽序列被用于免疫接种动物，由该动物获得结合该肽序列的抗体时，还可通过推断鉴定表位。还可使用计算机程序如BEPITOPE预测连续表位(Odorico等，J.Mol.Recognit.16：20(2003))。
[0054]本发明的抗体是属于任何抗体类型如IgM、IgG、IgA、IgE、IgD及其任何亚类的单克隆或多克隆免疫球蛋白分子。例证性的IgG亚类是IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。“单克隆”抗体指一种基于、获得自或来源于单一克隆包括任何真核、原核或噬菌体克隆的抗体。因此，“单克隆”抗体在结构上得到了定义，而非通过产生其的方法进行定义。
[0055]具体例证性的与OX40特异性结合的抗体称为112F32(ATCC编号PTA-7217，2005年11月17日保藏的)、112V8(ATCC编号PTA-7219，2005年11月17日保藏的)、112Y55(ATCC编号PTA-7220，2005年11月17日保藏的)、112Y131(ATCC编号PTA-7218，2005年11月17日保藏的)和112Z5(ATCC编号PTA-7216。2005年11月17日保藏的)，其是人单克隆抗-人OX40抗体(结合人OX40的人抗体)。例证性的本发明的OX40抗体112F32、112V8、112Y55、112Y131和112Z5具有如SEQ ID NO：7-10和SEQ ID NO：44-49所示的成熟的重链或轻链可变区序列。112F32、112V8、112Y55、112Y131和112Z5的名称可指抗体或产生该OX40抗体的细胞系(如杂交瘤、CHO细胞或其他宿主细胞)。
[0056]使用经不同类型的可溶性重组人OX40(OX40-hIgG1)、融合蛋白(hOX40:hFc或表达OX40的活化的人T细胞免疫接种的转染色体(trans-chromosomic)小鼠(KM miceTM)(WO 02/43478，WO 02/092812和Ishida，等，IBC’s 11th Antibody Engineering Meeting.Abstract(2000))产生例证性的本发明的人抗-人OX40抗体。鉴定了特异性标记活化的人T细胞而非静息的T细胞的例证性的抗体。例证性的抗体可检测地染色了人OX40稳定转染的细胞系(EL4-OX40和CHO-OX40)，但不染色非转化的亲本细胞系，表明该抗体特异性结合人OX40。例证性的抗体还结合猕猴OX40和短尾猴OX40，但并不可检测地结合鼠OX40。
[0057]本发明的抗体可具有κ和λ轻链序列，或如天然存在的抗体一样是全长序列，或是它们的混合物(即κ和λ链序列的融合体)、以及它们的子序列/片段。天然存在的抗体分子含有两条κ或两条λ轻链。
[0058]本发明的OX40抗体还包括，例如特异性结合由称为112F32(ATCC编号PTA-7217，2005年11月17日保藏的)、112V8(ATCC编号PTA-7219，2005年11月17日保藏的)、112Y131(ATCC编号PTA-7218，2005年11月17日保藏的)、112Y55(ATCC编号PTA-7220，2005年11月17日保藏的)或112Z5(ATCC编号PTA-7216，2005年11月17日保藏的)的杂交瘤细胞系所产生的抗体所结合的氨基酸序列的抗体。本发明的OX40抗体进一步包括，例如特异性结合由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体所结合的OX40胞外域的抗体。本发明的OX40抗体额外地包括，例如具有由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体的结合特异性的抗体。上述OX40抗体通常显示部分或完全封闭、降低或抑制112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5抗体与OX40结合。
[0059]可使用竞争结合测定法鉴定特异性结合由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体所结合的氨基酸序列的OX40抗体，以及具有112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5抗体结合特异性的抗体。可基于与112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5抗体竞争结合OX40的能力选择抗体。可通过包括酶联免疫吸附测定(ELISA)在内的本领域中已知的多种测定法测定抗体与112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5抗体竞争结合OX40的能力，或抑制、降低、减少、阻止或封闭112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5抗体与OX40的结合的能力。在具体的方面中，如在ELISA测定法中所测定的，本发明的抗体抑制或阻止由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体与OX40结合。在更进一步的方面中，如在ELISA测定法中所测定的，本发明的抗体抑制至少50％的由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体与OX40结合。
[0060]本发明的OX40抗体还包括特异性结合OX40且不阻止或封闭小鼠抗-人OX40抗体L106(Becton Dickinson，目录号340420)与OX40结合的抗体。进一步包括的是特异性结合OX40且不抑制、降低或减少抗体L106与OX40结合的OX40抗体。抗体L106描述于例如美国专利号6,277,962，WO 95/12673和Schlossman等，编(Leukocyte Typing V：White Cell Differentiation Antigens，Oxford：Oxford University Press(1995)pp 1157-60)中。
[0061]本发明的OX40抗体包括与由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体相比，具有更大或更小的对OX40亲和力的特异性结合OX40的抗体。例如，提供了具有由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体的约1-10,000倍(如2-5、5-10、10-100、100-1000或1000-10,000倍更大或更小的亲和力，或位于上述数值之内或包含上述数值的任何数值或范围)范围内的OX40结合亲和力的抗体。因此，本发明的OX40抗体还包括与由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体相比，具有更大或更小的OX40结合亲和力的抗体。在具体的实施方案中，本发明的OX40抗体具有由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体的在约KD 10-6M-约KD 10-13M范围内，或位于上述数值之内或包含上述数值的任何数值或范围的OX40结合亲和力。
[0062]可通过缔合速率(Ka)和离解速率(Kd)测定结合亲和力。平衡亲和常数KD是Ka/Kd的比率。可使用表面等离振子共振法(SPR)测定缔合速率(Ka)和离解速率(Kd)(Rich和Myszka，Curr.Opin.Biotechnol 11：54(2000)；Englebienne，Analyst.123：1599(1998))。已知用于实时检测以及监测结合速率的装置和方法并可从商业渠道获得(BiaCore2000，Biacore AB，Upsala，Sweden；和Malmqvist，Biochem.Soc.Trans.27：335(1999))。KD值可定义为饱和一半(50％)的OX40上结合位点所需要的OX40抗体浓度。
[0063]本发明的OX40抗体包括能结合存在于体内一种或多种细胞上，原代细胞分离物、传代细胞、培养细胞和无限增殖化细胞中的OX40的抗体。能表达OX40的具体的非限制性细胞类型包括活化的和其他T细胞(如活化、效应、记忆或调节T细胞)以及非T细胞。非T细胞的例子包括自然杀伤(NK)细胞、粒细胞(嗜中性白细胞)、单核细胞和B细胞。例如，通过用OX40编码核酸转染或转化细胞，可将不天然表达OX40的细胞制备为表达OX40的细胞。能结合OX40的OX40抗体可结合一种或多种表达或产生OX40的转染的或转化的细胞。
[0064]本发明的抗体包括结合OX40并在体内或体外(如在个体中)调节OX40功能或活性的抗体。如本文所使用的，当涉及OX40活性或功能使用术语“调节”及其语法变化时，意指OX40活性或功能被可检测地影响、改变或变化了。因此，调节OX40活性或功能的OX40抗体是一种可检测地影响、改变或变化一种或多种OX40活性或功能的抗体，所述OX40活性或功能可包括例如OX40与OX40配体的结合、OX40介导的信号传导或OX40介导的或OX40可调节的细胞应答，或如本文中所列的或其他已知或可知的另外的OX40活性或功能。
[0065]可被调节的多种非限制性的OX40活性和功能包括例如OX40介导的信号传导或OX40介导的或OX40可调节的细胞应答、细胞增殖或扩增(如淋巴细胞例如活化、效应、记忆或调节T细胞)、细胞生存或凋亡(如淋巴细胞例如活化、效应、记忆或调节T细胞)，细胞因子(如Th1、Th2和非Th1/Th2细胞因子)和干扰素表达或产生，抗凋亡蛋白或凋亡前体蛋白表达或产生，以及治疗、预防或改善病症、疾病、它们的生理状态、病理和症状。特异性细胞因子调节包括但不限于IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-14、IL-16、IL-17、IL-23、IL-26、TNF-α、干扰素γ和GM-CSF(在体内或体外)。特异性抗凋亡蛋白或凋亡前体蛋白表达包括但不限于Bcl-xL、Bcl-2、Bad和Bim。其他非限制性的可被调节的OX40活性和功能包括例如NF-κB激活、PKB(Akt)活性维持以及存活蛋白的增量调节(Ambrosini等，Nat.Med.3：917(1997)和Song等，Immunity 22：621(2005))。
[0066]因此，如本文所示的例证性的抗体包括调节一种或多种OX40调节的信号传导或OX40调节的或诱导的细胞应答、细胞增殖(如活化、效应、记忆或调节T细胞)、细胞生存或凋亡(如活化、效应、记忆或调节T细胞)，细胞因子(如Th1、Th2和其他非Th1/Th2细胞因子，如IL-17、IL-23和IL-26)和干扰素表达或产生如Th1、Th2、非Th1/Th2、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-14、IL-16、IL-17、IL-23、IL-26、TNF-α、干扰素γ和GM-CSF(在体内或体外)，抗凋亡蛋白或凋亡前体蛋白表达(如Bcl-xL、Bcl-2、Bad或Bim)，和治疗、预防或改善病症、疾病、它们的病理和症状的抗体。在具体的方面中，本发明的抗体调节T细胞增殖或生存，调节活化、效应、记忆或调节T细胞的数量，或耗竭活化、效应、记忆或调节T细胞。在另外的具体方面中，本发明的抗体减少或耗竭特异于自身抗原(如髓磷脂碱蛋白(MBP)、髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、含蛋白脂质蛋白(PLP)、胶原、滑膜关节组织抗原、胰岛素、谷氨酸脱羧酶、肠抗原、甲状腺抗原、组蛋白、肌肉抗原或皮肤抗原的自身反应性T细胞的数量。
[0067]涉及OX40抗体使用的术语“拮抗”及其语法变化意指OX40抗体减少、减弱、抑制、推延、阻止或封闭OX40与OX40配体结合，或减少、减弱、抑制、推延、阻止或封闭OX40活性或功能。涉及OX40抗体使用的术语“激动”及其语法变化意指OX40抗体刺激、增加、增强、促进或诱导OX40与OX40配体结合，或刺激、增加、增强、促进或诱导通过OX40所诱导的活性或功能。因此，本发明的OX40抗体包括拮抗抗体和激动抗体。
[0068]例如，本发明的OX40拮抗抗体在体外或体内封闭、减少、减弱、抑制或阻止一种或多种OX40活性或功能。在具体的实施方案中，提供了能封闭、减少、减弱、抑制或阻止OX40配体(OX40L)与可溶形式的OX40(CD134)或在活化T细胞表面上表达的OX40结合的OX40抗体。在另外的实施方案中，在溶解效应细胞(如自然杀伤细胞、巨噬细胞或嗜中性白细胞)存在下，OX40抗体诱导EL4-人OX40表达细胞或活化的人T细胞溶解。在具体的方面中，取决于研究中的背景水平，在10μg/ml抗体下诱导的特异性细胞溶解百分率(％)为约15-75％、25-65％或30-60％，并可高达100％。此外，温育例证性的OX40抗体和与来自同种异体供体PBMC共培养的人外周血单核细胞(PBMC)能通过抑制同种异体反应性的CD4和/或CD8T细胞从而减少细胞增殖。
[0069]本发明的OX40抗体包括修饰形式，如取代(如氨基酸取代)、添加或缺失(如子序列或片段)，其可称为“变体”。上述修饰的抗体形式和变体保留了参照OX40抗体如称为112F32、112V8、112Y55、112Y131和112Z5的OX40抗体的至少部分的功能或活性，如与OX40结合、或调节OX40的活性或功能(如OX40信号传导)。因此，修饰的OX40抗体例如可保留至少部分的OX40结合或调节一种或多种OX40功能或活性(如信号传导、细胞应答等)的能力。
[0070]如本文所使用的，术语“修饰”及其语法变化意指组合物背离了参照组合物。与参照的未修饰蛋白、核酸或其他组合物相比，修饰的蛋白、核酸和其他组合物可具有更大或更小的活性或不同的功能。
[0071]在具体的方面中，本发明修饰的抗体保留一种或多种调节T细胞增殖或生存，调节活化、效应、记忆或调节T细胞的数量，或耗竭活化、效应、记忆或调节T细胞的能力。在更进一步的具体方面中，本发明修饰的抗体保留一种或多种减少或耗竭特异于自身抗原的自身反应性T细胞或特异于自身抗原(如髓磷脂碱蛋白(MBP)、髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、含蛋白脂质蛋白(PLP)、胶原、滑膜关节组织抗原、胰岛素、谷氨酸脱羧酶、肠抗原、甲状腺抗原、组蛋白、肌肉抗原或皮肤抗原的B细胞产生抗体的数量的能力。
[0072]在多个实施方案中，如SEQ ID NOs：7-10和SEQ ID NOs：44-49所示的抗体成熟的重链或轻链可变区序列在恒定区、互补决定区(CDR)或构架区(FR)之内或之外具有一个或多个氨基酸取代。在具体的方面中，氨基酸取代是在恒定区、互补决定区(CDR)或构架区(FR)之内或之外的保守取代。在另外的多个实施方案中，本发明的抗体与由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体的重链或轻链序列(SEQ ID NOs：7-10或SEQ ID NOs：44-49)具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性，或任何位于上述百分值之内或包含上述百分值的数值或范围。取代的残基的典型数目包括1-3、3-5、5-10个氨基酸残基，或任何位于上述值之内或包含上述值的数值或范围，或更多的氨基酸残基。
[0073]这样的包括氨基酸取代的抗体可为核酸所编码。因此，还提供了编码包括氨基酸取代的抗体的核酸序列。
[0074]术语“同一性”或“同一的”意指两个或更多个参照实体是相同的。因此，当两条蛋白序列(如OX40抗体)是同一时，它们至少在参照区域或部分中具有相同的氨基酸序列。“同一性区域”指相同的两个或更多个参照实体的一部分。因此，当两条蛋白序列在一个或多个序列区域范围内是同一时，它们在该区域内享有同一性。“实质的同一性”意指分子是在结构上或功能上保守的，使得其具有或预计具有一种或多种参照分子功能或活性的至少部分的功能或活性、或其享有同一性的参照分子的相关的/相应的区域或部分的至少部分的功能或活性。因此，具有实质的同一性的多肽(如OX40抗体)具有或预计具有参照多肽(如OX40抗体)的至少部分的活性或功能。例如，在一个具体的实施方案中，保留未修饰的OX40抗体的至少部分的活性或功能的具有一个或多个修饰(如氨基酸取代、缺失或添加)的OX40抗体被认为具有与参照OX40抗体的实质的同一性。
[0075]由于结构上和功能上相关的蛋白之间的差异，保留功能或活性所需要的序列同一性的值取决于该蛋白、区域和该区域的功能或活性。尽管对于蛋白而言，少至30％的氨基酸序列同一性能保留给定的活性或功能，但通常需要与参照序列更多的同一性如50％、60％、75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％的同一性。可使用本领域已知的计算机程序和数学算法确定两条序列之间的同一性程度。上述计算序列同一性(同源性)百分数的算法通常能解决在整个比对范围内的序列缺口和错配。例如，BLAST(如BLAST 2.0)搜索算法(参见如Altschul等，J.MoI.Biol.215：403(1990)，公众可通过NCBI获得)具有如下的例证性搜索参数：错配-2；缺口打开5；缺口延伸2。对于多肽序列比对，BLASTP算法通常与评分矩阵如PAM100、PAM 250、BLOSUM 62或BLOSUM50结合使用。FASTA(如FASTA2和FASTA3)和SSEARCH序列比对程序也用于定量同一性的程度(Pearson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：2444(1988)；Pearson，Methods MoI Biol.132：185(2000)；和Smith等，J.MoI.Biol.147：195(1981))。还已开发了利用基于德洛内(Delaunay)拓扑映射的用于定量蛋白结构相似性的程序(Bostick等，BiochemBiophys Res Commun.304：320(2003))。
[0076]“保守取代”是一个氨基酸为生物学上、化学上或结构上相似的残基所取代。生物学上相似的意指该取代不破坏生物活性如OX40结合活性。结构上相似的意指氨基酸具有相似长度的侧链，如丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸，或具有相似大小的侧链。化学相似性意指残基具有相同的荷电或都是亲水或疏水的。具体的例子包括用一种疏水残基如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸取代另一种，或用一种极性残基取代另一种，如用精氨酸取代赖氨酸，用谷氨酸取代天冬氨酸，或用谷氨酰胺取代天冬酰胺，用丝氨酸取代苏氨酸等等。
[0077]修饰的抗体还包括用一个或多个D-氨基酸取代L-氨基酸(及其混合物)，结构和功能类似物，例如，具有合成或非天然的氨基酸或氨基酸类似物及衍生形式的肽模拟物。修饰包括环状结构如在分子的氨基和羧基末端之间的端对端的酰胺键或分子内和分子间二硫键。
[0078]氨基酸修饰的额外的具体的非限制性例子包括OX40子序列和片段。例证性的OX40子序列和片段包含本发明的例证性的OX40抗体与之结合的OX40序列的一部分。例证性的OX40子序列和片段还包括免疫原性部分，例如包括本发明的例证性的OX40抗体所结合的序列的OX40的一部分。
[0079]根据本发明，提供了OX40抗体和编码保留未修饰的或参照的OX40抗体的至少部分的功能或活性的OX40抗体子序列或片段的核酸。如本文所使用的，术语“子序列”或“片段”意指全长分子的一部分。与全长OX40相比，编码OX40抗体的OX40抗体的子序列至少少一个氨基酸(如一个或多个内部氨基酸或氨基或羧基末端的末端氨基酸缺失)。与全长OX40抗体相比，OX40抗体的子序列至少少一个氨基酸。与全长对照核酸序列相比，核酸子序列至少少一个核苷酸。因此，子序列可具有任何直至全长天然OX40的长度。
[0080]本发明的OX40抗体子序列和片段包括如SEQ ID NOs：7-10和SEQ ED NOs：44-49所示的成熟的重链或轻链可变区序列。本发明的OX40抗体子序列和片段还包括Fab、Fab′和F(ab′)2、Fv、Fd、单链Fv(scFv)、二硫键连接的Fvs(sdFv)、VL和VH结构域片段。
[0081]OX40抗体子序列和片段可具有与全长抗体一样的结合亲和力，与全长抗体一样的结合特异性，或与全长抗体一样的一种或多种活性或功能，如0X40拮抗或激动抗体的功能或活性。当涉及抗体时，术语“功能性子序列”和“功能性片段”意指保留至少一部分的与全长参照抗体一样的一种或多种功能或活性如OX40抗体的功能或活性的抗体部分。例如，与OX40或OX40的片段结合的抗体子序列或片段被认为是功能性子序列。
[0082]可组合抗体子序列和片段。例如，可通过接头序列连接VL或VH子序列，从而形成VL-VH嵌合体。可通过接头序列连接单链Fvs(scFv)子序列的组合，从而形成scFv-scFv嵌合体。OX40抗体子序列和片段，包括单链抗体或单独的可变区或可变区与其他OX40抗体子序列的全部或一部分的组合。
[0083]可通过蛋白水解抗体制备抗体子序列和片段，例如，通过胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化全抗体。通过胃蛋白酶酶切割产生的抗体子序列和片段提供了称为F(ab′)2的5S片段。使用硫醇还原剂可进一步切割该片段以产生3.5S Fab′单价片段。可选地，使用胃蛋白酶切割直接产生了两条单价的Fab′片段和Fc片段(参见如美国专利号4,036,945和4,331,647；以及Edelman等，Methods Enymol.1：422(1967))。其他切割抗体的方法如分离重链以形成单价轻链-重链片段，进一步切割片段，或还可使用其他酶或化学方法。
[0084]可通过遗传方法产生蛋白和抗体及其子序列和片段。技术包括在宿主细胞如Cos细胞或大肠杆菌中表达所有或部分的编码蛋白或抗体的基因。重组宿主细胞合成了全长序列或子序列，例如scFv(参见如Whitlow等，在Methods：A Companion to Methods in Enzymology 2：97(1991)中，Bird等，Science 242：423(1988)；和美国专利号4,946,778)。可如美国专利号4,946,778和5,258,498；Huston等，MethodsEnzymol 203：46(1991)；Shu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：7995(1993)；以及Skerra等，Science 240：1038(1988)中所述的产生单链Fvs和抗体。
[0085]修饰的形式包括衍生的序列，例如氨基酸中游离氨基形成胺盐酸化物、对甲苯磺酰基、苄氧羰基；游离的羧基形成盐、甲酯或乙酯；有理的羟基形成O-酰基或O-烷基衍生物，以及天然存在的氨基酸衍生物，例如对于脯氨酸的4-羟基脯氨酸、对于赖氨酸的5-羟基赖氨酸、对于丝氨酸的高丝氨酸、对于赖氨酸的鸟氨酸等。可使用本领域已知的方法来产生修饰(如基于PCR的位点定向、缺失和插入诱变，化学修饰和诱变，交联等)。
[0086]蛋白(如抗体)、核酸和其他组合物的修饰形式包括添加和插入。例如，添加可以是任何类型的分子与蛋白(如抗体)、核酸或其他组合物的共价或非共价连接。添加和插入通常赋予不同的功能或活性。
[0087]添加和插入包括融合(嵌合)多肽或核酸序列，其是一种具有一个或多个与参照的天然(野生型)序列共价连接且不通常存在于该序列中的分子的序列。具体的例子是用于产生多功能蛋白(如多特异性抗体)的另一种蛋白(如抗体)的氨基酸序列。
[0088]本发明的抗体还包括具有与其共价连接以赋予截然不同或互补的功能或活性的一个或多个额外的结构域的嵌合体和融合体。抗体包括在自然界中非天然存在的其中两条或多条氨基酸序列连接在一起的嵌合体或融合体。
[0089]根据本发明，提供了OX40抗体和编码包括异源结构域的OX40抗体的核酸。异源结构域可以是氨基酸添加或插入，但不限于氨基酸残基。因此，异源结构域可由多种不同类型的小的或大的功能部分的任何一种组成。上述部分包括核酸、肽、碳水化合物、脂类或小的有机化合物如药物、金属(金、银)等。
[0090]异源结构域的具体的非限制例子包括例如标签、可检测的标记和细胞毒素剂。标签和可检测的标记的具体例子包括T7-、His-、myc-、HA-和FLAG-标签；酶(辣根过氧化物酶、脲酶、过氧化氢酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素转移酶)；酶底物；配体(如生物素)；受体(抗生物素蛋白)；放射性核素(如C14、S35、P32、P33、H3、I125和I131)；高电子密度试剂；能量传递分子；顺磁标记；荧光团(荧光素、若丹明、藻红蛋白)；发色团；化学发光剂(咪唑、荧光素酶)和生物发光剂。细胞毒素剂的具体例子包括白喉毒素、霍乱毒素和蓖麻毒素。
[0091]接头序列可插入蛋白(如抗体)、核酸或其他组分之间，该添加或插入(如异源结构域)使得这两个实体至少部分保持各自的功能或活性。接头序列克具有一种或多种特性，包括柔性结构、不能形成有序的二级结构或疏水或荷电特性，其能促进或影响任何一个结构域。典型地见于柔性蛋白区中氨基酸包括甘氨酸、天冬酰胺和丝氨酸。其他接近中性的氨基酸如苏氨酸和丙氨酸也可用于接头序列中。接头序列的长度可以改变(参见如美国专利号6,087,329)。接头进一步包括化学交联剂和缀合剂，例如磺基琥珀酰亚胺衍生物(磺基-SMCC、磺基-SMPB)、二琥珀酰亚胺基辛二酸酯(DSS)、二琥珀酰亚胺基戊二酸酯(DSG)和二琥珀酰亚胺基酒石酸酯(DST)。
[0092]更多的添加的例子包括糖基化、脂肪酸、脂类、乙酰化、磷酸化、酰胺化、甲酰化、遍在蛋白化和通过保护或封端基团以及诸多化学修饰中任何一种的衍生化。其他转变和可能性对于本领域技术人员而言是显而易见的，并被认为处于本发明的范围内。
[0093]可使用重组DNA技术通过细胞表达或体外翻译制备上述修饰的序列。还可使用本领域已知方法通过化学合成产生多肽和核酸序列，例如自动化肽合成装置(参见如Applied Biosystems，Foster City，CA)。
[0094]可通过多种标准的蛋白纯化或重组表达技术的任何一种产生适于产生抗体的OX40蛋白。例如，可通过标准的肽合成技术如固相合成产生OX40序列。蛋白的一部分可含有诸如T7标签或多组氨酸序列的氨基酸序列以利于纯化表达或合成的蛋白。蛋白可在细胞中被表达并纯化。蛋白可通过重组方法作为更大的蛋白(如融合或嵌合蛋白)的一部分被表达。
[0095]产生多克隆和单克隆抗体的方法是本领域已知的。例如，OX40或其免疫原性片段，任选地缀合有载体如匙孔血蓝蛋白(KLH)或卵白蛋白(如BSA)或与佐剂如弗氏完全或不完全佐剂混合，并用于免疫接种动物。使用杂交瘤技术，可分离来自应答OX40的经免疫动物的脾细胞并与骨髓瘤细胞融合。可根据与OX40或其免疫原性片段的反应性筛选通过杂交瘤产生的单克隆抗体。
[0096]可免疫接种的动物包括灵长类动物、小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、牛或豚鼠。可通过静脉内、腹膜内、肌内或皮下途径进行初次免疫接种和任何可选的后继免疫接种。此外，为增强免疫应答，可将抗原与另一种蛋白如卵白蛋白或匙孔血蓝蛋白(KLH)、甲状腺球蛋白和破伤风类毒素偶联，或与佐剂如弗氏完全或不完全佐剂混合。可通过腹膜内、肌内、眼内或皮下途径进行初次免疫接种和任何可选的后继免疫接种。可用相同或不同浓度的OX40制品进行后继免疫接种，间隔可以是定期或不定期的。
[0097]动物包括那些经遗传修饰以包括人基因座位，可用于产生人抗体的动物。具有一个或多个人免疫球蛋白基因的转基因动物描述于例如美国专利号5,939,598、WO 02/43478和WO 02/092812中。使用常规的杂交瘤技术，可分离来自抗原高应答个体的免疫接种小鼠的脾细胞并与骨髓瘤细胞融。可获得与OX40结合的单克隆抗体。
[0098]描述了用于产生人多克隆抗体和人单克隆抗体的其他方法(参见如Kuroiwa等，Nat.Biotechnol.20：889(2002)；WO 98/24893；WO92/01047；WO 96/34096；WO 96/33735；美国专利号5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771和5,939,598)。
[0099]当涉及抗体使用术语“人”时，意指该抗体的氨基酸序列完全是人的，即人重链和人轻链可变区和人恒定区。因此，所有的氨基酸都是人的或存在于人抗体中。通过用人抗体中存在的氨基酸残基取代非人氨基酸残基，可将非人抗体制备位全人抗体。本领域已知存在于人抗体中氨基酸残基、CDR区作图和人抗体共有残基(参见如Kabat，Sequences of Proteins of Immunological Interest.第4版，US Departmentof Health and Human Services.Public Health Service(1987)；Chothia和Lesk(1987))。基于调查22种已知的人VH III序列的人VH亚组III的共有序列以及基于调查30种已知的人κI序列的人VLκ-链亚组I的共有序列描述于Padlan Mol.Immunol.31：169(1994)以及Padlan Mol.Immunol.28：489(1991)中。因此，人抗体包括其中一个或多个氨基酸残基已被一个或多个存在于任何其他人抗体中的氨基酸取代的抗体。
[00100]OX40抗体包括可使用本领域已知技术产生的人源化抗体，所述技术包括例如CDR-嫁接(EP 239,400；W091/09967；美国专利号5,225,539；5,530,101和5,585,089)、镶嵌或重建(EP 592,106；EP 519,596；Padlan，Molecular Immunol.28：489(1991)；Studnicka等，ProteinEngineering 7：805(1994)；Roguska.等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 91：969(1994))和链改组(美国专利号5,565,332)。之前人共有序列(Padlan，MoI.Immunol.31：169(1994)；和Padlan，Mol.Immunol.28：489(1991))已被用于产生人源化抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4285(1992)；和Presta等，J.Immunol.151：2623(1993))。
[00101]当涉及抗体使用术语“人源化的”时，意指抗体的氨基酸序列具有在受体人免疫球蛋白分子中特异性结合期望抗原的一个或多个互补决定区(CDRs)的非人氨基酸残基(如小鼠、大鼠、山羊、兔等)，以及Fv构架区(FR)中的一个或多个人氨基酸残基，所述人氨基酸残基是侧接CDR的氨基酸残基。除受体人免疫球蛋白分子和构架区氨基酸残基可以是除任何人残基之外的任何灵长类动物的氨基酸残基(如类人猿、长臂猿、大猩猩、黑猩猩、猩猩、猕猴)之外，称为“灵长类化的”抗体处于“人源化的”抗体的含义中。免疫球蛋白的人FR残基可为相应的非人残基所取代。因此，例如CDR或人构架区中的残基可为来自供体抗体的非人CDR或构架区的相应残基所取代以改变，通常是改善抗原亲和力或特异性。人源化抗体可包括既不见于人抗体也不见于供体CDR或构架序列的残基。例如，并不见于人抗体或供体非人抗体的特定位置的FR取代可预计能改善在该位置人抗体的结合亲和力或特异性。基于分子模建的抗体构架和CDR取代是本领域众所周知的，如通过模建CDR和构架残基的相互作用以鉴定对于抗原结合起重要作用的构架残基以及进行序列比较以鉴定在特定位置稀有的构架残基(参见如美国专利号5,585,089和Riechmann等.Nature 332：323(1988))。
[00102]OX40抗体包括嵌合抗体。如本文中所使用的，当涉及抗体使用术语“嵌合”及其语法变化时，意指抗体的氨基酸序列含有一个或多个来源于、获得或分离自、或基于两种或更多种不同物种的部分。例如，抗体的一部分可以来自人(如恒定区)以及抗体的另一部分可以来自非人(如鼠重链或鼠轻链可变区)。因此，嵌合抗体的一个例子是一种其中抗体的不同部分为不同物种来源的抗体。不同于人源化或灵长类化抗体，嵌合抗体在抗体的任何区域中可具有不同的物种序列。
[00103]用于产生嵌合抗体的方法是本领域已知的(如Morrison，Science 229：1202(1985)；Oi等，BioTechniques 4：214(1986)；Gillies等，J.Immunol.Methods 125：191(1989)；以及美国专利号5,807,715；4,816,567和4,816,397)。例如在Munro，Nature 312：597(1984)；Neuberger等，Nature 312：604(1984)；Sharon等，Nature 309：364(1984)；Morrison等，Proc.Nat′l. Acad.Sci USA 81：6851(1984)；Boulianne等，Nature 312：643(1984)；Capon等，Nature 337：525(1989)；和Traunecker等，Nature 339：68(1989)中描述了其中来自一种物种抗体的可变区被另一种物种的可变区所取代的嵌合抗体。
[00104]还可使用杂交瘤技术、重组技术和噬菌体展示技术或它们的组合产生OX40抗体(参见美国专利号4,902,614，4,543,439和4,411,993；还参见Monclonal Antibodies.Hvbridomas：A New Dimension in Biological Analyses.Plenum Press，Kennett，McKearn和Bechtol(编)，1980，以及Harlow等，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版，1988)。
[00105]可额外用于抗体方法中的合适的技术包括基于OX40的亲和纯化、非变性凝胶纯化、HPLC或RP-HPLC、大小排阻、在蛋白A柱上纯化、或这些技术的任何组合。可使用ELISA测定法测定OX40抗体同种型，例如可使用鼠Ig-吸附的抗-人Ig鉴定人Ig。
[00106]可通过本领域已知的多种标准的蛋白纯化或重组表达技术中的任何一种来产生适于产生抗体的OX40。适于产生免疫应答的OX40的形式包括OX40子序列如免疫原性片段。另外的OX40的形式包括OX40表达细胞、含有OX40的制品或细胞提取物或级分、部分纯化的OX40。
[00107]根据本发明，提供了表达OX40抗体、其子序列和片段以及编码本发明的OX40抗体、子序列和片段的核酸的分离或纯化的细胞。在一个实施方案中，分离的细胞表达具有称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的抗体的可变区氨基酸序列的抗体。在另一个实施方案中，分离的细胞表达具有与由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体相同的结合特异性的抗体。在一个更进一步的施方案中，分离的抗体表达与由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体竞争结合OX40的抗体。在一个另外的实施方案中，分离的细胞表达与由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体相比，具有更大或更小的对OX40结合亲和力的抗体。在具体的方面中，对OX40的结合亲和力在由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体的约1-5000倍范围内。在另外的具体方面中，对OX40的结合亲和力在由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体的约KD 10-6M-约KD 10-13M范围内。本发明的表达OX40抗体、其子序列和片段，以及编码OX40抗体、其子序列和片段的核酸的分离或纯化的细胞的具体的非限制性例子包括脾细胞、杂交瘤细胞和CHO细胞。分离或纯化的细胞可以是来自原代细胞分离物(如脾细胞)、次级细胞或传代细胞分离物、或已建立的或无限增殖化的细胞培养物(杂交瘤或CHO细胞)的多个细胞或一群细胞。
[00108]根据本发明，进一步提供了产生特异性结合OX40的抗体的方法。在一个实施方案中，一种用于产生OX40抗体的方法包括给予能表达人免疫球蛋白的动物(如转基因小鼠或转基因牛)任选地缀合有人Fc重组蛋白的人OX40、子序列或片段(如OX40胞外域)，筛选表达人OX40抗体的动物，以及选择产生人OX40抗体的动物，从所选择的动物中分离抗体。在一方面中，该方法确定人OX40抗体是否具有OX40拮抗或激动活性。
[00109]根据本发明，额外提供的是产生抑制或阻止OX40结合OX40配体(OX40L)的人OX40抗体的方法。在一个实施方案中，一种用于产生人OX40抗体的方法包括给予能表达人免疫球蛋白的动物(如转基因小鼠或转基因牛)任选地缀合有人Fc重组蛋白的OX40、子序列或片段(如OX40胞外域)，筛选表达人OX40抗体的动物，选择产生人OX40抗体的动物，以及从所选择的产生人OX40抗体的动物中分离抗体。在一方面中，该方法确定人OX40抗体是否抑制或阻止OX40结合OX40配体(OX40L)。
[00110]根据本发明，提供了表达OX40抗体的非人转基因动物，所述OX40抗体具有一种或多种下列特征：a)相同于由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体；b)结合由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体所针对的OX40胞外域氨基酸序列中的表位；c)具有在由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体的约1-5000倍范围内的OX40结合亲和力；d)具有在由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体的约KD 10-6M-约KD 10-12M范围内的OX40结合亲和力；e)具有由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体的结合特异性；或f)与由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体竞争结合OX40。
[00111]根据本发明，还提供了编码OX40抗体、其子序列和片段的分离或纯化的核酸。在多个实施方案中，核酸序列编码如SEQ ID NOs：7-10和SEQ ID NOs：44-49所示的成熟的重链或轻链可变区序列的序列，或其子序列。在另外的实施方案中，核酸序列包含SEQ ID NOs：3-6和SEQ ID NOs：38-43及其子序列的任一。在另外的实施方案中，核酸序列包含SEQ ID NOs：3-6和SEQ ID NOs：38-43及其子序列任一的简并序列。
[00112]核酸可以具有不同的长度。编码本发明的OX40抗体或其子序列的核酸的长度通常为约100-600个核苷酸、或在上述长度之内或包含上述长度的任何数值或范围，100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、或约550-600个核苷酸、或在上述长度之内或包含上述长度的任何数值或范围。与编码本发明的OX40抗体或其子序列的核酸特异性杂交的核酸的长度通常为约10-20、20-30、30-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-400、400-500、500-600个核苷酸，或在上述长度之内或包含上述长度的任何数值或范围。
[00113]术语“核酸”和“多核苷酸”指通过磷酸酯键连接的至少两个或更多个核糖核酸或脱氧核糖核酸碱基对(核苷酸)或等价物。核酸包括多核苷酸和多核苷。核酸包括单链、双链或三链、环形或线性分子。例证性的核酸包括但不限于：RNA、DNA、cDNA、基因组核酸、天然存在或非天然存在的核酸，如合成的核酸。短的核酸和多核苷酸(如10-20个、20-30个、30-50个、50-100个核苷酸)通常称为“寡核苷酸”或单链或双链DNA的“探针”。
[00114]提供了编码具有如SEQ ID NOs：7-10和SEQ ID NOs：44-49任一所示的重链或轻链可变区序列经一个或多个氨基酸残基取代、添加或缺失的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，经取代、添加或缺失的重链或轻链可变区序列具有针对OX40胞外域表位的结合亲和力。在另一个实施方案中，经取代、添加或缺失的重链或轻链可变区序列具有由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体的活性，例如调节OX40的功能或活性。
[00115]本发明提供了与编码由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的OX40抗体的全部或子序列的核酸杂交的核酸，其至少80-90％互补或同源于编码由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体的全部或子序列或片段的核酸序列。在一个实施方案中，该核酸序列具有约10-20、20-30、30-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-400、400-500、500-600个核苷酸的长度，或在上述长度之内或包含上述长度的任何数值或范围。在具体的方面中，核酸序列与由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体的重链或轻链可变区序列或其部分(如CDR、FR等)杂交。
[00116]术语“杂交”及其语法变化指在核酸序列之间的结合。杂交序列通常与编码参照(如OX40抗体)序列的氨基酸序列的核酸会具有大于约50％的同源性。在杂交序列之间的杂交区通常为至少约12-15个核苷酸、15-20个核苷酸、20-30个核苷酸、30-50个核苷酸、50-100个核苷酸、100-200个、300-400个核苷酸或更多，或在上述长度之内或包含上述长度的任何数值或范围。
[00117]核酸序列进一步包括核苷酸和核苷取代、添加和缺失，以及衍生形式和融合/嵌合序列(如编码与异源结构域融合的OX40抗体)。例如，由于遗传密码的简并性，核酸包括对于编码由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55和112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体的核酸简并的序列和子序列。其他的例子是与编码由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体、其子序列和片段的序列互补的核酸。
[00118]可使用多种标准的克隆和化学合成技术产生核酸。技术包括但不限于核酸扩增，如利用能退火至抗体编码序列的引物(如简并引物混合物)，采用基因组DNA或cDNA靶的聚合酶链反应(PCR)。还可通过化学合成(如固相亚磷酰胺合成)或由基因转录产生核酸。然后，可在体外翻译所产生的序列，或将所产生的序列克隆入质粒中并增殖，接着在细胞中(如宿主细胞例如酵母或细菌、真核细胞例如动物或哺乳动物细胞或在植物中)表达。
[00119]根据本发明，进一步提供了包括载体的本发明的核酸序列。在一个实施方案中，载体包括编码OX40抗体、其子序列或片段的核酸序列。在具体的实施方案中，载体包括编码由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55和112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体，其子序列或片段任一的核酸序列。
[00120]载体是通过插入或掺入核酸能被操作的媒介物。载体包括质粒、病毒、原核(细菌)和真核(植物、真菌、哺乳动物)载体。载体可用于体外或体内表达核酸。这样的载体被称为“表达载体”，可用于导入核酸，包括编码OX40抗体、其子序列和片段的核酸，并在体外(如在溶液中或在固相中)、细胞中或个体体内表达所编码的蛋白。
[00121]载体还可用于核酸操作。对于遗传操作而言，可使用“克隆载体”，并在体外(如在溶液中或在固相中)、细胞中或个体体内转录或翻译所插入的核酸。
[00122]载体通常含有用于在细胞中进行体外或体内增殖的复制起点。适当时，包括存在于载体中的表达控制元件在内的控制元件可包含于载体中以利于转录和翻译。
[00123]载体可包括选择标记。“选择标记”是一种容许对含有该基因细胞进行选择的基因。“正选择”指在暴露于正选择条件下选择含有选择标记的细胞的过程。药物抗性是含有该标记的正选择标记细胞在含有药物的培养基中将生存而缺少该标记的细胞将死亡的一个例子。选择标记包括药物抗性基因如neo，其赋予对G418的抗性；hygr，其赋予对潮霉素的抗性；和puro，其赋予对嘌呤霉素的抗性。其他正选择标记基因包括容许鉴定或筛选含有该标记的细胞的基因。这些基因包括编码荧光蛋白(GFP和GFP-样发色团、荧光素酶)的基因、lacZ基因、碱性磷酸酶基因和表面标志如CD8等。“负选择”指在暴露于适合的负选择剂下其中含有负选择标记的细胞被杀死的过程。例如，含有单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因的细胞(Wigler等，Cell 11：223(1977))对药物更昔洛韦(GANC)敏感。同样地，gpt基因使细胞对6-硫代黄嘌呤敏感。
[00124]病毒载体包括基于逆转录病毒的那些载体(用于感染分裂和不分裂的细胞的慢病毒)、泡沫病毒(美国专利号5,624,820，5,693,508，5,665,577，6,013,516和5,674,703；WO92/05266和WO92/14829)、腺病毒(美国专利号5,700,470，5,731,172和5,928,944)、腺伴随病毒(AAV)(美国专利号5,604,090)、单纯疱疹病毒载体(美国专利号5,501,979)、基于巨细胞病毒(CMV)的载体(美国专利号5,561,063)、呼肠孤病毒、轮状病毒基因组、猿猴病毒40(SV40)或乳头状瘤病毒(Cone等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6349(1984)；Eukaryotic Viral Vectors.，Cold SpringHarbor Laboratory，Gluzman编，1982；Sarver等，MoI.Cell.Biol.1：486(1981)；美国专利号5,719,054)。腺病毒能有效地感染缓慢复制的细胞和/或终末分化细胞并可用于靶向缓慢复制的细胞和/或终末分化细胞。其他用于表达的病毒载体包括细小病毒、诺瓦克病毒、冠状病毒、副粘病毒和杆状病毒、披膜病毒(如辛德比斯病毒和塞姆利基森林病毒)以及水泡性口膜炎病毒(VSV)。
[00125]当核酸与表达控制元件可操作连接时，包含该核酸的载体可被表达。术语“可操作连接”指在所提及的元件之间一种容许它们能以它们所预期的方式进行操作的物理或功能上的关系。因此，核酸“可操作连接”表达控制元件意指该控制元件调节核酸转录以及适当时调节转录物的翻译。
[00126]“表达控制元件”或“表达控制序列”是影响可操作连接的核酸表达的多核苷酸。启动子和增强子是表达控制元件和序列的具体的非限制性例子。“启动子”是一种能启动下游(3′方向)核酸序列转录的顺式作用DNA调节区。启动子序列包括促进转录启动的核苷酸。增强子也调节核酸表达，但能在远离其可操作连接的核酸的转录起始位点处起作用。无论位于核酸的5′或3′末端，还是在核酸内部(如内含子或编码序列)，增强子都能起作用。额外的表达控制元件包括前导序列和融合配偶体序列，用于创建多基因的内部核糖体结合位点(IRES)元件，或用于内含子、维持正确基因读框以使mRNA进行符合读框的翻译的多顺反子、信使、剪接信号，提供给目标转录物适当的多腺苷酸的多腺苷酸化信号和终止密码子。
[00127]表达控制元件包括其中可操作连接的核酸的转录发生无需信号或刺激物的“组成型”元件。赋予表达响应于增加或减少可操作连接的核酸表达的信号或刺激物的表达控制元件是“可调节的”。增加响应于信号或刺激物的可操作连接的核酸表达的可调节的元件称为“诱导型元件”。减少响应于信号或刺激物的可操作连接的核酸表达的可调节的元件称为“阻遏型元件”(即该信号减少表达；当除去信号或不存在信号时，表达增加)。
[00128]对于细菌表达，组成型启动子包括T7，以及诱导型启动子如噬菌体λ的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac杂合启动子)。在昆虫细胞系统中，可使用组成型或诱导型启动子(如蜕皮激素)。在酵母中，组成型启动子包括例如ADH或LEU2，以及诱导型启动子如GAL(参见如Ausubel等，在Current Protocols in Molecular Biology，Vol.2，Ch.13，编辑，Greene Publish.Assoc.& Wiley Interscience，1988中；Grant等，在Methods in Enzvmology.153：516-544(1987)，编辑.Wu & Grossman，1987，Acad.Press，N.Y.中；Glover，DNA Cloning.Vol.II，Ch.3，IRLPress，Wash.，D.C.，1986；Bitter，在Methods in Enzvmology，152：673-684(1987)，编辑.Berger & Kimmel，Acad.Press，N.Y.中；和Strathern等，The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces编辑.Cold Spring Harbor Press，VoIs.I和II(1982))。
[00129]对于哺乳动物表达，可使用病毒或其他来源的组成型启动子。例如CMV、SV40或病毒长末端重复(LTRs)等等，或使用来源于哺乳动物细胞基因组(如金属硫蛋白IIA启动子；热休克启动子、类固醇/甲状腺激素/视黄酸应答元件)或乳动物病毒(如腺病毒晚期启动子；小鼠乳腺瘤病毒LTR)的诱导型启动子。
[00130]表达控制元件包括在特定组织或细胞类型中具有活性的元件，称为“组织特异性表达控制元件”。在特定细胞或组织类型中组织特异性表达控制元件通常是更具活性，这是因为与其他细胞或组织类型相比，它们为在特定细胞或组织类型中的转录激活因子蛋白或其他具有活性的转录调节物所识别。上述表达控制元件的具体的非限制性例子是启动子如己糖激酶II、COX-2、甲胎蛋白、癌胚抗原、DE3/MUC1、前列腺特异性抗原、C-erB2/neu、依赖于葡萄糖的促胰岛素多肽(GIP)、端粒末端转移酶逆转录酶和低氧反应性启动子。
[00131]根据本发明，提供了用本发明的OX40核酸或载体转化或转染的宿主细胞。宿主细胞包括但不限于原核和真核细胞如细菌、真菌(酵母)、植物、昆虫和动物(如哺乳动物，包括灵长类动物和人)细胞。转化细胞的非限制性例子包括用重组噬菌体核酸、质粒核酸或粘粒核酸表达载体转化的细菌；用重组酵母表达载体转化的酵母；用重组病毒表达载体(如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染的或用重组质粒表达载体(如Ti质粒)转化的植物细胞；用重组病毒表达载体(如杆状病毒)感染的昆虫细胞；以及用重组病毒表达载体(如逆转录病毒、腺病毒、痘苗病毒)感染的动物细胞或工程化以稳定表达的转化的动物细胞。表达OX40抗体及其子序列和片段的哺乳动物宿主细胞的非限制性例子包括CHO细胞。宿主细胞可以是来自原代细胞分离物、次级细胞或传代细胞分离物、或已建立的或无限增殖化的细胞培养物的多个细胞或一群细胞。
[00132]当涉及细胞(如宿主细胞)或生物体使用术语“转化的”或“转染的”时，意指在将异源分子如蛋白或核酸(如转基因)整合入细胞后细胞中的遗传改变。因此，“转染的”或“转化的”细胞是一种异源分子业已经由操纵如通过重组DNA技术导入其中或其后代中的细胞。
[00133]核酸或蛋白可在细胞及其后代中稳定地或瞬时地转染或转化(表达)。细胞可被增殖并表达所导入的蛋白或转录核酸。由于在复制过程中可能发生突变，因此转染或转化细胞的后代可以不同于亲本细胞。
[00134]典型地，细胞转染或转化使用了载体。载体可包含于病毒颗粒或小泡中并任选地通过结合靶细胞配体或受体的在颗粒或小泡表面上所包含的蛋白从而靶向特定细胞类型。因此，病毒颗粒或小泡自身或病毒表面上的蛋白可使靶细胞能用于体外、离体或体内转染或转化。因此，包括了在体外、体内和离体递送至细胞、组织或器官中的病毒和非病毒载体工具。
[00135]还可通过本领域已知的方法如渗透压休克(如磷酸钙)、电穿孔、显微注射、细胞融合等将核酸导入靶细胞(如宿主细胞)中。还可使用其他技术完成核酸和多肽的体外、离体和体内导入。例如，使用聚合物如聚酯、聚氨基酸、水凝胶、聚烯吡酮、乙烯乙酸乙烯酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素、硫酸精蛋白或丙交酯/乙交酯共聚物、聚交酯/乙交酯共聚物或乙烯乙酸乙烯酯共聚物。例如分别或在胶体体系中通过利用羟甲基纤维素或明胶-微胶囊，或聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，可将核酸包埋在通过凝聚技术或界面聚合制备的微胶囊中。胶体分散体系包括大分子络合物、纳米胶囊、微球、珠子和基于脂质的体系，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。
[00136]用于将多种组合物导入细胞中的脂质体是本领域已知的，并包括例如磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、脂质转染试剂(lipofectin)和DOTAP(如美国专利号4,844,904，5,000,959，4,863,740和4,975,282；以及GIBCO-BRL，Gaithersburg，Md)。还已知用于基因治疗的基于的两亲阳离子脂质的哌嗪(参见如美国专利号5,861,397)。阳离子脂质体系也是已知的(参见如美国专利号5,459,127)。聚合物、微胶囊和胶体分散体系如脂质体在此一并称为“囊泡(vesicles)”。
[00137]本发明的OX40抗体在包括临床和诊断方法的处理、治疗和诊断应用中是有用的。例如，在急性或慢性移植物抗宿主病(GVHD)的小鼠模型中，当人PBMC转移到受辐射的严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠中时，当人抗-人OX40拮抗抗体在疾病发作前或发作后给予时减少了人T细胞数量和疾病病理。因此，本发明的OX40抗体能减轻、减少或预防急性或慢性异种移植物宿主疾病模型中的移植物抗宿主病(GVHD)症状；并使急性或慢性异种移植物宿主疾病模型(如免疫缺陷型(SCID)小鼠)中的移植物抗宿主病缓解或消退。本发明的抗体还能通过自然杀伤细胞诱导OX40表达细胞的溶解。尽管并不希望受任何理论约束，但OX40表达细胞的溶解可能是由于抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)。
[00138]因此，本发明的OX40抗体在能服从或可顺利地应答于通过调节OX40活性或功能的病症和疾病的处理或治疗中是有用的。因而，OX40拮抗抗体可用于治疗能服从或可能顺利地应答于减少、减弱、抑制、阻止或阻断OX40活性或功能的病症、疾病、它们的生理状态、病理和症状，而OX40激动抗体则可用于治疗能服从或可能顺利地应答于刺激、增加、增强、促进或诱导OX40活性或功能的病症、疾病、它们的生理状态、病理和症状。
[00139]根据本发明，提供了治疗与不合需要的或异常的免疫应答相关的病症、疾病、症像、病理和不利症状或异常的方法。如本文所使用的，“不合需要的免疫应答”或“异常的免疫应答”指任何大于或小于所需要的或生理学上正常的免疫应答、活性或功能。不合需要的免疫应答、功能或活性可以是正常的应答、功能或活性。因此，正常的免疫应答只要它们是不合需要的，即使不被认为是异常的，都包括在这些术语的含义中。不合需要的免疫应答、功能或活性也可以是异常的应答、功能或活性。异常的(反常的)免疫应答、功能或活性背离了正常的免疫应答、功能或活性。不合需要的和异常的免疫应答可以是慢性或急性的体液应答、细胞介导的应答或它们的组合。
[00140]不合需要的和异常的免疫应答的一个例子是高应答性的免疫应答，如在自身免疫性病症或疾病(如自身免疫性)情况下的免疫应答。不合需要的和异常的免疫应答的另一个例子是其中导致任何组织或器官中急性或慢性炎症的免疫应答。不合需要的和异常的免疫应答的又一个例子是其中导致细胞、组织或器官破坏的免疫应答，如移植排斥、移植物抗宿主病(GVHD)、自身免疫性病症或疾病或炎症。不合需要的和异常的免疫应答的还一个例子是低应答性的免疫应答，如对抗原的应答低于所需要的，如出现耐受性。
[00141]因此，不合需要的和异常的免疫应答包括取决于病症或疾病的特征在于生理状态、病理和不利症状或异常的慢性和急性免疫病症和疾病。本发明适用的免疫病症和疾病的具体的非限制性例子包括移植物抗宿主病(GVHD)、移植排斥、自身免疫性疾病和炎症。
[00142]根据本发明，提供了至少部分基于OX40抗体调节OX40活性或功能的能力的体内处理和治疗方法。在具体的治疗方法的实施方案中，能服从于或可响应于用本发明的OX40抗体处理或治疗的病症、疾病、生理状态、病理和症状包括例如慢性或急性免疫性疾病或病症。在更多的治疗方法的实施方案中，能服从于用本发明的OX40抗体处理或治疗的病症、疾病、生理状态、病理和症状包括例如炎症、移植排斥、移植物抗宿主病(GVHD)、自身免疫性病症或疾病如类风湿性关节炎、多发性硬化、糖尿病(如胰岛素依赖型糖尿病、IDDM、I型糖尿病)、克罗恩氏病(CD)、炎性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎(UC)、乳糜泻、银屑病、全身性红斑狼疮(SLE)、增生性狼疮性肾炎、肉芽肿性肌病、多发性肌炎和不合需要的或异常的OX40-介导的细胞应答。
[00143]因此，本发明提供了其中OX40抗体、子序列或片段用于减轻、减少、抑制、预防和阻断慢性或急性免疫性疾病或病症、炎症、移植排斥、移植物抗宿主病(GVHD)或自身免疫性疾病如类风湿性关节炎、多发性硬化、糖尿病(如胰岛素依赖型糖尿病、IDDM、I型糖尿病)、克罗恩氏病(CD)、炎性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎(UC)、乳糜泻、银屑病、全身性红斑狼疮(SLE)、增生性狼疮性肾炎、肉芽肿性肌病、多发性肌炎或不合需要的或异常的OX40-介导的细胞应答，治疗和减轻、减少、抑制、预防和阻断气道高反应性/超敏反应(如哮喘、变应性哮喘)以及其他组织和器官中的肺部炎症的方法。根据本发明可治疗的移植物抗宿主病症状的具体的非限制性的例子是体重减轻、脱发、皮疹、血尿、腹水和肝、肠道、肺、皮肤中炎性细胞浸润和死亡。
[00144]OX40抗体还可用于减轻、减少、抑制、预防和阻断出现在肺、关节、肌肉、皮肤、中枢或末梢神经系统或肠中的炎症。OX40抗体能额外地用于减轻、减少、抑制、预防和阻断因个体对传染物(如细菌、病毒或寄生性传染物)的反应所引起的炎症。
[00145]能用OX40抗体处理或治疗的额外的病症包括例如骨关节炎、银屑病关节炎、脑脊髓炎、重症肌无力、自身免疫性甲状腺炎，特应性皮炎、湿疹性皮炎、银屑病、斯耶格伦氏综合征、口疮性溃疡、虹膜炎、结膜炎、角膜结膜炎、皮肤红斑狼疮、硬皮病、阴道炎、直肠炎、麻风结节性红斑、自身免疫性葡萄膜炎、变应性脑脊髓炎、急性坏死性出血性脑病、特发性两侧进行性感觉神经性失聪、再生障碍性贫血，真性红细胞性贫血，特发性血小板减少症(ITP)，多软骨炎、韦格纳氏肉芽肿病、慢性活动性肝炎，斯-约二氏综合征、特发性口炎性腹泻(idiopathic sprue)、扁平苔癣，格雷夫斯氏病，肉样瘤病、原发性胆汁性肝硬变、后葡萄膜炎、间质性肺纤维化、桥本甲状腺炎、自身免疫性多腺体综合征、免疫介导的不育症、自身免疫性阿狄森氏病、寻常天疱疮、落叶性天疱疮、疱疹样皮炎、自身免疫性脱发、白癜风、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少性紫癜、恶性贫血、格-巴二氏综合征、硬汉综合征、急性风湿热、交感性眼炎、古德帕斯彻氏综合征、系统性坏死性血管炎、抗磷脂综合征、哮喘(如过敏性哮喘)和变态反应。
[00146]如本文所使用的，术语“移植”、“移植术”及其语法变化意指将来自身体一部分的细胞、组织或器官嫁接、植入或移植到另一部分，或将来自一个个体或动物的细胞、组织或器官嫁接、植入或移植到另一个体或动物。因此，所移植的细胞、组织或器官可以是同种异体移植物或异种移植物。例证性的移植细胞包括骨髓干细胞、造血干细胞、外周血干细胞和脐带血干细胞、同种异体或非同种异体细胞以及神经细胞。例证性的移植组织包括皮肤、血管、眼睛和骨髓。例证性的移植器官包括肾、心、肺、胰和肝。该术语还包括遗传修饰的细胞、组织和器官，如通过离体基因治疗而遗传修饰的细胞、组织和器官，其中被转化的细胞、组织和器官获得自或来源于之后从不同的个体(如人或动物)接受移植物的个体(如人或动物)。
[00147]根据本发明可治疗的炎症包括OX40介导的炎症反应或由于调节OX40而能服从于用OX40抗体治疗，而又能调节一种或多种淋巴细胞(如活化、效应、记忆或调节T细胞)的细胞增殖、生存、死亡或活性等的炎症反应。方法(如治疗)可引起炎症发生、频率、严重性、进展或持续时间的减少。例证性的炎症症状包括肿胀、疼痛、皮疹、头痛、发热、恶心、骨关节僵直或组织或细胞损伤的一种或多种。
[00148]炎症可直接或间接导致对多种细胞、组织或器官或对单一细胞类型、组织类型或器官的细胞、组织或器官损害。可显示出损害的例证性的组织和器官包括表皮或粘膜组织、消化道、肠、胰腺、胸腺、肝、肾、脾、皮肤或骨骼关节(如膝、踝、髋、肩、腕、指、趾或肘关节)。根据本发明的治疗可引起组织损害的缓解、抑制或阻止其进展或恶化，或导致受损的器官或组织如皮肤、粘膜(mucosum)、肝的再生。
[00149]如本文所使用的，术语“治疗”及其语法变化意指对个体个体或患者所进行的其中期望在患者中获得生理效应或结果的治疗方案、用药法、处理或治疗法。因此，本发明的方法尤其包括在给定个体的病症、疾病、生理状态、病理或症状中提供可测量的改善或有益效果的处理和治疗方法。可测量的改善或有益结果是病症、疾病、生理状态、病理或症状中任何客观或主观的、短暂的、临时的或长期的改善，或减少与病症、疾病、生理状态、病理或症像相关的或由病症、疾病、生理状态、病理或症像所引起的不利症状发生、严重性、持续时间或频率。本发明的方法无需即刻见效，可以有一些延迟，但随时间的过去，在给定的个体中会出现最终的改善或有益效果、稳定作用或改进作用。
[00150]例如，当增量或部分降低或减少一种或多种与病症、疾病、病理或症像相关的病理、不利症状或并发症严重性、持续时间或频率，或抑制、减少、预防或逆转一种或多种病症、疾病、生理状态、病理或症状(如慢性或急性免疫性疾病或病症、GVHD、移植排斥、炎症或自身免疫性疾病)的生理学、病理学、生物化学或细胞表现或特征时，就达到了根据本发明的治疗方法的令人满意的临床终末点。因此，治疗益处或改善可以不需要治愈，或消除大多数或全部的与病症、疾病、生理状态、病理或症状(如慢性或急性免疫性疾病或病症、GVHD、移植排斥、炎症或自身免疫性疾病)相关或由之所引起的病理、不利症状或并发症。因此，治疗益处或改善无需产生任何或全部的与病症、疾病、生理状态、或病理(如慢性或急性免疫性疾病或病症、GVHD、移植排斥、炎症或自身免疫性疾病)相关或由之所引起的病理、不利症状或并发症的完全治愈。例如，部分减少、降低或抑制，或稳定或减缓与病症、疾病、生理状态或病理(如慢性或急性免疫性疾病或病症、GVHD、移植排斥、炎症或自身免疫性疾病)相关或由之所引起的病理、不利症状或并发症的进展或恶化，即使只持续几天、几周或几个月，或即使一种或多种与疾病、病症、病理或症像(如慢性或急性免疫性疾病或病症、GVHD、移植排斥、炎症或自身免疫性疾病)相关或由之所引起的病理、不利症状或并发症仍然保留，也是令人满意的临床结果。
[00151]在多个具体的实施方案中，治疗方法包括缓解或改善一种或多种与慢性或急性免疫病症或疾病相关的不利(身体)症状或后果。在多个另外的具体实施方案中，治疗方法包括减轻、减少或预防一种或多种与移植物抗宿主病相关的不利症状或身体后果(如体重减轻、脱发、皮疹、血尿、腹水、肝、肠道、肺中炎性细胞浸润和死亡)的发作、频率、持续时间或严重性，或导致移植物抗宿主病的缓解或消退，或导致预防移植物抗宿主病。在多个更进一步的具体实施方案中，治疗方法包括减轻、减少或预防一种或多种与移植物或移植排斥相关的不利症状或身体后果(如针对移植体或移植物的免疫应答，或移植体或移植物细胞破坏)的发作、频率、持续时间或严重性，或导致移植物或移植排斥的缓解或消退，或导致预防移植物或移植排斥。在多个更进一步具体的实施方案中，治疗方法包括减轻、减少或预防一种或多种与类风湿性关节炎、多发性硬化、糖尿病(如胰岛素依赖性糖尿病、IDDM、I型糖尿病)、克罗恩氏病(CD)、炎性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎(UC)、乳糜泻、银屑病、全身性红斑狼疮(SLE)、增生性狼疮性肾炎、肉芽肿性肌病、多发性肌炎或不合需要的或异常的OX40-介导的细胞应答相关的不利症状或身体后果的发作、频率、持续时间或严重性。在更进一步的多个具体实施方案中，治疗方法包括减少自身反应性细胞或产生抗自身蛋白抗体的细胞的数量或增殖，抑制或阻止自身反应性细胞或产生抗自身蛋白抗体的细胞的数量、增殖或生存的增加。
[00152]就免疫病症或疾病而言，可测量的改善或有益效果包括朝着被认为是成功的治疗结果的生理学正常的基线水平调节淋巴细胞(如活化、效应、记忆或调节T细胞)的数量、增殖或活性。对于免疫病症或疾病而言，可测量的改善或有益效果的一个额外的例子是由该免疫病症或疾病所引起的或与之相关的组织病理学改变的改善。例如，进一步阻止或缓解骨骼关节浸润或组织破坏，或胰腺、胸腺、肾、肝、脾、表皮(皮肤)或粘膜组织、消化道或肠浸润或组织破坏。
[00153]根据本发明，提供了封闭、抑制、阻止、减少或减弱OX40配体(OX40L)在体外或体内与活化T细胞或OX40结合的方法。在一个实施方案中，一种方法包括将活化T细胞与能有效地抑制或阻止OX40配体与活化T细胞结合的OX40抗体接触。在另一个实施方案中，一种方法包括将OX40与能有效地抑制或阻止OX40配体与OX40结合的OX40抗体接触。在具体的方面中，任选地用OX40药物组合物对需要封闭、减少、减弱、抑制或阻止OX40配体(OX40L)与活化T细胞结合的个体执行一种方法。
[00154]根据本发明，提供了在体外或体内调节OX40-介导的细胞信号传导的方法。在一个实施方案中，一种方法包括给予需要调节OX40-介导的细胞信号传导的个体能有效调节OX40-介导的细胞信号传导的OX40抗体。
[00155]根据本发明，提供了在体外或体内减少活化、效应、记忆或调节T细胞数量的方法。在一个实施方案中，一种方法包括给予需要减少活化、效应、记忆或调节T细胞数量的个体足以减少活化、效应、记忆或调节T细胞数量的量的OX40抗体。
[00156]根据本发明，提供了治疗由活化、效应、记忆或调节T细胞所引起的疾病或病症的方法。在一个实施方案中，一种方法包括给予个体足以减轻、减少或预防由活化、效应、记忆或调节T细胞所引起的疾病或病症进展或耗竭活化、效应、记忆或调节T细胞的量的OX40抗体。在具体的方面中，疾病或病症包括：移植物抗宿主病、炎症或自身免疫性疾病。
[00157]根据本发明，提供了减少个体血液、脾、淋巴结、肠、肝、肺或皮肤中活化T细胞数量的方法。在一个实施方案中，一种方法包括给予个体足以减少血液、脾、淋巴结、肠、肝、肺或皮肤中活化T细胞数量的量的OX40抗体。在一个方面中，一种减少血液、脾、淋巴结、肠、肝、肺或皮肤中活化T细胞数量的方法是在急性或慢性异种移植物宿主疾病模型中进行的。
[00158]本发明的组合物和方法可与任何其他提供所需效果的处理或治疗相组合。具体来说，特征在于具有补充或协同效应的处理和治疗是可采用的。例证性的处理和治疗包括免疫抑制剂或药物。可在本发明的任何其他方法如治疗或处理之前、基本上同时进行上述免疫抑制处理和治疗。
[00159]因此，本发明提供了其中本发明的方法与任何治疗方案、处理方案或组合物如本文中所列的或本领域已知的免疫抑制治疗方案、试剂或药物组合使用的联合方法。在一个实施方案中，一种方法包括给予OX40抗体、其子序列或片段以及免疫抑制处理、试剂或药物。该免疫抑制处理、试剂或药物可在给予个体OX40抗体、其子序列或片段之前、基本上同时或之后给予。
[00160]如本文所使用的，当涉及处理、治疗、试剂或药物使用术语“免疫抑制”或其语法变化时，意指该处理、治疗、试剂或药物提供了对体液或细胞介导的免疫应答的减弱、减少、抑制或阻止。上述治疗可一般或全身性地抑制免疫应答，或抑制特定区域或位置中的免疫应答。
[00161]免疫抑制试剂和药物的具体非限制性的类别包括烷化剂、抗代谢物、植物提取物、植物生物碱，亚硝脲、激素(类固醇如糖皮质激素)、核苷和核苷酸类似物。免疫抑制药物的具体例子包括环磷酰胺、硫唑嘌呤、环孢霉素A、他克莫司(FK506)、雷帕霉素、甲氨喋呤、FTY720、cox-2抑制剂和白细胞介素(如IL-12)。
[00162]多克隆和单克隆抗体是免疫抑制处理或治疗的具体例子。免疫抑制抗体包括例如英夫利昔单抗
Figure A20068004408500501
和
Figure A20068004408500502
以及
Figure A20068004408500503
(OKT3)。
[00163]本发明的方法尤其还包括导致减少对另一种处理方案或治疗方案、处理或治疗法的需要或利用的方法。例如，对于炎症、GVHD或              自身免疫性疾病而言，如果在给定的个体中本发明的一种方法具有治疗益处，则导致较不常用免疫抑制处理或治疗或减少免疫抑制处理或治疗的剂量或除去免疫抑制处理或治疗。
[00164]因此，根据本发明，提供了减少对免疫抑制处理或治疗需要或利用的方法。在一个实施方案中，一种方法包括给予正在经历或已经历免疫抑制治疗的个体OX40抗体、其片段或子序列。在一方面中，一种方法包括以能有效地减少炎症、GVHD或自身免疫性疾病的免疫抑制处理或治疗的剂量、频率或持续时间或消除对该处理或治疗需要的量给予OX40抗体、其片段或子序列。该方法可在免疫抑制处理或治疗给予之前、基本上同时或之后进行。
[00165]在其中期望获得治疗益处或改善的处理或治疗法中的剂量或“有效量”或“足够量”包括，例如任何客观或主观的缓解或改善一种、几种或所有的与目标疾病、病症、病理或不利症状或并发症相关或由之引起的病理、不利症状或并发症至可测量的或可检测的程度的量。阻止、抑制或推延目标疾病、病症、病理或不利症状或并发症的进展或恶化也是令人满意的结果。足够量或有效量意指在特定的个体而非一组个体或一般人群中足够或有效的量。因此。“有效量”或“足够量”应当足以提供治疗益处给所给定的个体。
[00166]可以但无需在单次给药中，以及可以但无需单独或与另外的处理、治疗或治疗方案联合给予以提供足够量或有效量。例如，量可如个体的需要，所治疗的病症、疾病或症像的状况或治疗的副作用所指示的按比例增加。此外，如果以单次或多剂量给予而无第二处理、治疗或治疗方案，则足够量或有效量无需足够或有效，这是因为在所给定的个体中可包括额外的多于上述剂量的剂量、量或持续时间或额外的处理、治疗或治疗方案以致有效或足够。视为有效或足够的量还包括导致减少使用另外的处理、治疗方法或方案的量。
[00167]例证性的非限制性的量(剂量)为约0.1mg/kg-约100mg/kg，以及任何位于上述范围之内的数值或范围或值。可给予更多或更少的量(剂量)，例如0.01-500mg/kg，以及任何位于上述范围之内的数值或范围或值。另外的例证性的非限制性的量(剂量)为约0.5-50mg/kg、1.0-25mg/kg、1.0-10mg/kg，以及任何位于上述范围之内的数值或范围或值。
[00168]本发明的方法可通过任何给药或递送方式，或通过任何途径、全身性、区域或局部给药或递送实施。例证性的给药和递送途径包括静脉内、子宫内、真皮内、肌内、皮下、胸膜内、经皮(局部)、转化粘液质、颅内、脊柱内、眼内、直肠、经口(饮食)和粘膜途径。
[00169]可每天、每周、每月或每年实施本发明的方法一次或多次(如1-10次、1-5次或1-3次)。本领域技术人员应当知道什么时候适合于推迟或中断给药。非限制性的剂量日程表是每周1-7次，持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多周，以及任何位于上述范围之内的数值或范围或值。
[00170]当然，与任何处理或治疗所常见的一样，不同的个体对于处理会显示不同的响应，某些个体可能不响应或对特定的处理方案、方法或程序响应不充分。因此，有效量或足够量将至少部分取决于所治疗的疾病、病症、病理(如炎症、GVHD、移植排斥或自身免疫性疾病，以及如果其是晚期、后期或早期的话)、期望的疗效以及个体个体(如在个体中的生物利用度、性别、年龄等)，个体对该处理或治疗的响应将部分基于遗传和外遗传变异性(如药物基因组学)。此外，由于所有治疗的个体或患者可能都不响应于特定的处理或治疗方法、草案、方案、程序或药物，因此在每个或所有的个体或患者或如此治疗的给定的人群中该处理或治疗法无需达到特定的可测量的改善或有益效果、临床终末点或所需的结果。因此，给定的个体或患者或人群对本发明的处理或治疗方法可能无法响应、响应不充分或可能显示不合需要的响应如副作用。
[00171]在本文中术语“个体”和“患者”可交换使用，并指动物，典型地是哺乳动物如人、非人灵长类动物(大猩猩、黑猩猩、猩猩、猕猴、长臂猿)、家畜(狗和猫)、农场和大牧场动物(马、牛、山羊、绵羊、猪)、实验室和实验动物(小鼠、大鼠、兔、豚鼠)。个体包括用于体内疗效研究疾病模型动物(如小鼠、大鼠和非人灵长类动物)(如GVHD动物模型)。人个体包括儿童，例如新生儿、婴儿、刚学步的小孩和青少年，1-5岁、5-10岁和10-18岁儿童，18-60岁成人，以及老年人如60-65岁、65-70岁和70-100岁老年人。
[00172]个体包括需要治疗的哺乳动物(如人)，更确切地说，他们具有服从于或可响应于用OX40抗体、子序列或片段处理或治疗的疾病、病症、其病理或症状。个体包括那些具有或处于具有慢性或急性免疫病症或疾病、炎症、GVHD、移植排斥、炎症、自身免疫性疾病或OX40-介导的细胞应答的危险中的个体。个体还包括那些为慢性或急性免疫病症或疾病、GVHD、移植排斥、炎症、自身免疫性疾病或OX40-介导的细胞应答的一种或多种的候选人或已对之进行治疗的个体。因此，作为细胞、组织或器官移植或嫁接如肾、心、肺、皮肤、眼睛、血管、肝或胰移植或骨髓、造血干细胞、外周血干细胞或脐带血干细胞、同种异体或非同种异体细胞、神经细胞的候选人或已接受该移植或嫁接的个体是使用OX40抗体进行治疗的候选人。
[00173]个体进一步包括那些由于实验室或临床诊断使有理由需要这样的处理的需要免疫抑制处理或治疗的个体、正在经历免疫抑制处理或治疗(如由于移植)的个体和已经历免疫抑制处理或治疗的个体，以及处于再发或复发危险中的个体。处于危险中的个体包括那些具有慢性或急性免疫性疾病或病症、炎症、GVHD、移植排斥、炎症、自身免疫性疾病或OX40-介导的细胞应答家族史、遗传倾向性或之前患有上述疾病的个体。可利用筛选如自身反应性T细胞或抗自身蛋白抗体来鉴定上述处于危险中的个体。例如，表达类风湿因子的个体处于类风湿性关节炎的危险中。表达针对MBP、MOG或PLP的抗体的个体处于多发性硬化的危险中。
[00174]因此，为了抑制或降低发展为或遭受再发或复发为慢性或急性免疫性疾病或病症、炎症、GVHD、移植排斥、炎症、自身免疫性疾病或OX40-介导的细胞应答的可能性，可对处于危险中的个体进行处理。上述处理的结果可减少发展为慢性或急性免疫性疾病或病症、炎症、GVHD、移植排斥、炎症、自身免疫性疾病或OX40-介导的细胞应答的危险。
[00175]本发明的抗体、核酸和其他组合物及方法可包括于或使用药物配方。这样的药物配方能用于体内局部、区域或全身性或离体治疗个体或给药或递送至个体。
[00176]药物配方包括“药学上可接受的”和“生理学上可接受的”载体、稀释剂或赋形剂。术语“药学上可接受的”和“生理学上可接受的”包括与药物施用相容的溶剂(水溶剂或非水溶剂)、溶液、乳剂、分散介质、包衣、等渗和吸收促进或延迟剂。这样的配方可包含于液体；乳剂、混悬剂、糖浆剂或酏剂中，或包含于固体剂型；片剂(包衣或未包衣的片剂、直接释放、延迟释放、连续释放或脉冲式释放的片剂)、胶囊剂(硬胶囊剂或软胶囊剂、直接释放、延迟释放、连续释放或脉冲式释放的胶囊剂)、粉剂、颗粒剂、晶体或微珠中。补充的化合物(如防腐剂、抗细菌剂、抗病毒剂和抗真菌剂)还可掺入配方中。
[00177]可制备适合于特定的局部、区域或全身性给药或递送途径的药物配方。因此，药物配方包括适于通过特定途径给药的载体、稀释剂或赋形剂。对于本发明的组合物，给药途径的具体的非限制性例子是肠胃外如静脉内、动脉内、皮内、肌内、皮下、胸膜内、经皮(局部)、转化粘液质、颅内、脊柱内、眼内、直肠、经口(饮食)、粘膜给药，以及任何其他适于处理方法或给药方案的配方。
[00178]用于肠胃外施用的溶液或混悬剂可包括：无菌稀释剂如注射用水、盐水溶液、固定油类、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂如苯甲醇或尼泊金甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲剂如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐以及用于调节张度的试剂如氯化钠或葡萄糖。可用酸或碱如盐酸或氢氧化钠调节pH。
[00179]用于注射的药物配方包括无菌水溶液(水溶的)或分散剂以及用于临时制备无菌可注射的溶液或分散剂的无菌粉剂。对于静脉内给药，适合的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇)以及适合的它们的混合物的溶剂或分散介质。可例如通过使用诸如卵磷脂的被覆层、通过保持就分散而言所要求的颗粒大小以及通过使用表面活性剂从而维持流动性。抗细菌剂和抗真菌剂包括例如对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸和硫柳汞。等渗剂例如糖类、多元醇如甘露糖醇、山梨糖醇，氯化钠可包括在组合物中。所包括的延迟吸收的试剂如单硬脂酸铝或明胶可延长可注射组合物的吸收。
[00180]可通过将需要量的活性组合物掺入具有一种上述成分或上述成分组合的适合的溶剂中制备无菌可注射的配方。一般来说，通过将活性组合物掺入含有基础分散介质和任何其他成分的无菌载体中制备分散剂。就用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂而言，制备方法包括例如真空干燥和冷冻干燥，其由之前所制备的溶液生产出了活性成分外加任何额外的所需成分的粉剂。
[00181]对于转化粘液质或经皮给药，在配方中使用适合于要被透过的屏障的渗透剂。上述渗透剂是本领域已知的，包括例如，对于转化粘液质给药，为去垢剂、胆汁盐类和梭链孢酸衍生物。可通过使用鼻腔喷雾、吸入装置(如吸气器)或栓剂实现转化粘液质给药。对于经皮给药，活性化合物可配制为软膏剂、油膏剂、凝胶剂、霜剂或贴剂。
[00182]可用免于从体内快速排除的载体制备药物配方，例如控制释放配方或时间延迟材料如单硬脂酸甘油酯或硬脂酸甘油酯。还可使用加工产品如植入物和微囊密封的递送体系递送配方以达到局部、区域或全身性递送或控制或持续释放。
[00183]可使用生物可降解的、生物相容的聚合物，如乙二醇二乙酸酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、多正酯类和聚乳酸。用于制备上述配方的方法是本领域技术人员所知道的。材料还可通过商业渠道获得自AlzaCorporation(Palo Alto，CA)。脂质体混悬剂(包括使用抗体或病毒外壳蛋白靶向细胞或组织的脂质体)也可用作药学上可接受的载体。可根据已知的方法如在美国专利号4,522,811中所描述的方法制备这些载体。
[00184]其他适于给药的药物配方是本领域已知的(参见如Gennaro(编)，Remington：The Science and Practice of Pharmacy.第20版，Lippincott，Williams & Wilkins(2000)；Ansel等，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems.第7版，Lippincott Williams &Wilkins Publishers(1999)；Kibbe(编)，Handbook of Pharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association，第3版.(2000)和Remington′s Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms，TechnonicPublishing Co.，Inc.，Lancaster，Pa.，(1993))。
[00185]包括OX40抗体、核酸、处理、治疗、试剂、药物和药物配方在内的根据本发明所使用的组合物可包装为易于给药和统一剂量的剂量单位形式。如本文所使用的，“剂量单位形式”指适合于单位剂量处理的物理上分离的单位；每单位含有被计算能产生所需处理或治疗(如有益)效果的量的与载体、赋形剂、稀释剂或媒介物结合的组合物。单位剂量形式取决于多种因素包括但无需受限于所使用的特定组合物、所要达到的效果以及待治疗的个体的药效动力学和药物基因组学。
[00186]本发明进一步提供了试剂盒，包括包装于适合的包装材料中的OX40抗体、核酸、药剂、药物和药物配方，任选地包括用于使用试剂盒组分的说明书如用于执行本发明的方法的说明书。在一个实施方案中，试剂盒包括OX40抗体、子序列或片段以及用于检测OX40的说明书。在另一个实施方案中，试剂盒包括OX40抗体、子序列或片段以及用于用OX40抗体、子序列或片段治疗需要该治疗的个体(如具有能改善的或可响应于处理或治疗的疾病、病症、病理或状况的个体)的说明书。在一方面中，该说明书用于慢性或急性免疫性疾病或病症、炎症、GVHD、移植排斥、炎症、自身免疫性疾病或OX40-介导的细胞应答的治疗。在更进一步的方面中，试剂盒包括免疫抑制处理、治疗或药剂。
[00187]术语“包装材料“指包覆试剂盒组分的物理结构。包装材料可保持组分无菌，并可由常用于这样目的的材料(如纸、瓦楞纸板、玻璃、塑料、金属箔、安瓿等)制成。标签或包装嵌入物可包括适当的书面说明书，如本发明的诊断或治疗方法。因此，该说明书可包括用于实施本文中所述的本发明任一方法的说明书。因此，在多个实施方案中，试剂盒包括标签或包装插入物包括用于在溶液中、体外、体内或离体实施本发明方法的说明书。在一个方面中，该说明书包括在本发明的处理或治疗方法中局部、区域或全身性给予或递送OX40抗体、子序列或片段至个体中。
[00188]说明书可额外地包括令人满意的临床终末点或任何可能出现的不利症状或并发症的指示。说明书可进一步包括贮藏信息、失效期或管理机构如美国食品和药物管理局对于在人个体中使用所要求的任何信息。
[00189]说明书可印在“印刷品”上，如印在试剂盒中的纸或纸板上，印在贴在试剂盒或包装材料的标签上、或印在贴在含有试剂盒组分的管形瓶或试管的标签上。说明书可包含声频或视频媒介并可额外地包括在计算机可读介质如磁盘(软盘或硬盘)、光学CD如CD-或DVD-ROM/RAM、磁带、电存储介质如RAM和ROM以及这些的混合物如磁性/光学存储介质上。
[00190]本发明的试剂盒可额外地包含缓冲剂、防腐剂或稳定剂。该试剂盒还可包含用于活性测定的对照组分，如对照样品或标准。该试剂盒的每一组分可包装在单独的容器中或以混合物的形式存在，所有的各种容器可以单一包装或多重包装。
[00191]根据本发明，进一步提供了无细胞(如在溶液中、在固相中)和基于细胞(如体外或体内)的筛选、检测和鉴定OX40的方法。可在溶液中、在体外使用生物材料或样品，以及在体内例如使用来自动物的细胞(如淋巴细胞)样品进行该方法。在一个实施方案中，一种方法包括在容许抗体与OX40结合的条件下，将生物材料或样品与结合OX40的抗体接触；并测定抗体与OX40的结合。抗体与OX40的结合检测出OX40的存在。在一个方面中，OX40存在于细胞或组织上。在另一个方面中，生物材料或样品获得自哺乳动物个体。
[00192]当涉及组分如蛋白(如OX40抗体)、材料、样品或处理使用术语“接触”时，意指组分(如OX40抗体)和其他参照实体之间直接或间接的相互作用。直接的相互作用的一个具体例子是结合。间接的相互作用的一个具体例子是其中组分作用于中间产物分子，该中间产物分子又依次作用于参照实体。因此，例如将细胞(如淋巴细胞)与OX40抗体接触包括使抗体与细胞结合(如通过与OX40结合)，或使抗体作用于中间产物，该中间产物又依次作用于细胞。
[00193]术语“测定”和“测量”及其语法变化在本文中可交换地使用并指定性或定量测定，或同时定性及定量测定。当涉及结合使用该术语时，任何评估结合的相对量、亲和力或特异性的方法皆被考虑，包括本文中所列的和本领域已知的多种方法。例如，可通过ELISA测定法测定或测量OX40抗体与OX40的结合。
[00194]除非另有规定，本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本发明相关领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管在本发明的实施或测试中可使用类似于或等价于本文中所描述的那些的方法和材料，但合适的方法和材料是本文中所描述的。
[00195]所有本文引用的出版物、专利、Genbank登录号以及其他参考文献以其全文并入作为参考。如有冲突，以包括定义在内的本说明书为准。
[00196]除非上下文另有清楚指示，如本文所使用的单数形式“一种”、“和”和“该”包括复数对象。因此，例如就“一种抗体”而言，包括多种抗体，以及就“一种处理或治疗”而言，可包括多种、连续的或同时发生的处理或治疗等等。
[00197]除非上下文另有清楚指示，如本文所使用的任何数值或数值范围包括处于这样的范围之中或包含这样的范围的全部整数和处于范围之中或包含范围的值或整数的分数。因此，例如就90-100％的范围而言，包括91％、92％、93％、94％、95％、95％、97％等，以及91.1％、91.2％、91.3％、91.4％、91.5％等，92.1％、92.2％、92.3％、92.4％、92.5％等。在另一个例子中，就1-5,000倍的范围而言，包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20倍等，以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5倍等，2.1、2.2、2.3、2.4、2.5倍等。
[00198]本发明被一般地披露于使用肯定的语言来描述诸多实施方案的本文中。本发明还明确地包括其中具体的主题如物质或材料、方法步骤和条件、实验方案、程序、测定法或分析被完全或部分排除的实施方案。因此，虽然在本发明没有包括的方面本发明一般不表达在本文中，但没有确切地包括于本发明中的方面仍然被披露了。
[00199]业已描述了多个本发明的实施方案。尽管如此，很清楚可以进行多种修饰而不背离本发明的精神和范围。因此，下列实施例旨在举例说明而不限制权利要求中所描述的本发明的范围。
实施例
[00200]实施例1
[00201]该实施例描述了多种原料和方法。
[00202]抗原制备：使用Tri试剂(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)，由用植物血球凝集素(PHA，Remel，Lenexa，KS)活化两天的人外周血单核细胞分离RNA。通过逆转录聚合酶链反应扩增编码人OX40胞外域的序列。对扩增产物测序并确认与所公布的人OX40序列(WO95/12673，SEQ NO：1)相同。将产物按读框亚克隆入pfastbac-hFc杆状病毒供体质粒中。该载体产生自pfastbac质粒(Invitrogen Corp.)和人IgG1(“hlgG1”)的Fc部分。从pV11392.fc载体上切下hlgG1序列。产生编码人OX40:hIgG1融合蛋白(hOX40:hFc)的重组杆状病毒。用hOX40:hFc重组杆状病毒感染粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)High-FiveBT1-TN-5b1-4(“Tn5”)昆虫细胞(Invitrogen Corp.)用于蛋白产生。扩增全长OX40序列并克隆入pCDNA3.1载体(Invitrogen Corp.)中用于在真核细胞中进行表达。用脂质转染胺(lipofectamine)2000(Invitrogen Corp.)转染EL-4(ATCC TIB-39)和CHO-K1(ATCC CCL-61)细胞并用潮霉素B(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)或遗传霉素(Invitrogen Corp.)分别选择稳定的转染子。通过戊二醛偶联将hOX40:hFc与卵白蛋白缀合。在1ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)中混合1mg的hOX40:hFc和0.5mg的卵白蛋白(Pierce，Rockford，EL)。缓慢添加50μl的1％EM级戊二醛(Sigma，St.Louis，MO)并轻轻摇动5分钟混合溶液。在室温下3小时后，添加50μl的1M乙醇胺(pH 7)并温育溶液2小时，之后在NAP10柱(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)上用磷酸盐缓冲盐水进行缓冲液交换。
[00203]由起始密码子(ATG)经人OX40胞外域至人Fc序列(下划线的)末端的人OX40:人IgG1融合蛋白的核苷酸序列SEQ ID NO：1
ATGTGCGTGG GGGCTCGGCG GCTGGGCCGC GGGCCGTGTG CGGCTCTGCT CCTCCTGGGC             60
CTGGGGCTGA GCACCGTGAC GGGGCTCCAC TGTGTCGGGG ACACCTACCC CAGCAACGAC            120
CGGTGCTGCC ACGAGTGCAG GCCAGGCAAC GGGATGGTGA GCCGCTGCAG CCGCTCCCAG            180
AACACGGTGT GCCGTCCGTG CGGGCCGGGC TTCTACAACG ACGTGGTCAG CTCCAAGCCG            240
TGCAAGCCCT GCACGTGGTG TAACCTCAGA AGTGGGAGTG AGCGGAAGCA GCTGTGCACG            300
GCCACACAGG ACACAGTCTG CCGCTGCCGG GCGGGCACCC AGCCCCTGGA CAGCTACAAG            360
CCTGGAGTTG ACTGTGCCCC CTGCCCTCCA GGGCACTTCT CCCCAGGCGA CAACCAGGCC            420
TGCAAGCCCT GGACCAACTG CACCTTGGCT GGGAAGCACA CCCTGCAGCC GGCCAGCAAT            480
AGCTCGGACG CAATCTGTGA GGACAGGGAC CCCCCAGCCA CGCAGCCCCA GGAGACCCAG            540
GGCCCCCCGG CCAGGCCCAT CACTGTCCAG CCCACTGAAG CCTGGCCCAG AACCTCACAG            600
GGACCCTCCAGATCTTGTGA CAAAACTCAC ACATGCCCAC CGTGCCCAGC ACCTGAACTC            660
CTGGGGGGAC CGTCAGTCTT CCTCTTCCCC CCAAAACCCA AGGACACCCT CATGATCTCC            720
CGGACCCCTG AGGTCACATG CGTGGTGGTG GACGTGAGCC ACGAAGACCC TGAGGTCAAG            780
TTCAACTGGT ACGTGGACGG CGTGGAGGTG CATAATGCCA AGACAAAGCC GCGGGAGGAG   840
CAGTACAACA GCACGTACCG TGTGGTCAGC GTCCTCACCG TCCTGCACCA GGACTGGCTG   900
AATGGCAAGG AGTACAAGTG CAAGGTCTCC AACAAAGCCC TCCCAGCCCC CATCGAGAAA   960
ACCATCTCCA AAGCCAAAGG GCAGCCCCGA GAACCACAGG TGTACACCCT GCCCCCATCC  1020
CGGGATGAGC TGACCAAGAA CCAGGTCAGC CTGACCTGCC TGGTCAAAGG CTTCTATCCC  1080
AGCGACATCG CCGTGGAGTG GGAGAGCAAT GGGCAGCCGG AGAACAACTA CAAGACCACG  1140
CCTCCCGTGC TGGACTCCGA CGGCTCCTTC TTCCTCTACA GCAAGCTCAC CGTGGACAAG  1200
AGCAGGTGGC AGCAGGGGAA CGTCTTCTCA TGCTCCGTGA TGCATGAGGC TCTGCACAAC  1260
CACTACACGC AGAAGAGCCT CTCCCTGTCT CCGGGTAAAT GA                     1320
[00204]与人IgG1的Fc部分(下划线的)融合的人OX40-胞外域的氨基酸序列SEQ ID NO：2
MCVGARRLGR GPCAALLLLG LGLSTVTGLH CVGDTYPSND RCCHECRPGN GMVSRCSRSQ                60
NTVCRPCGPG FYNDVVSSKP CKPCTWCNLR SGSERKQLCT ATQDTVCRCR AGTQPLDSYK               120
PGVDCAPCPP GHFSPGDNQA CKPWTNCTLA GKHTLQPASN SSDAICEDRD PPATQPQETQ               180
GPPARPITVQ PTEAWPRTSQ GPSRSCDKTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS               240
RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE OYNSTYRVVS VLTVLHODWL               300
NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGOPR EPOVYTLPPS RDELTKNOVS LTCLVKGFYP               360
SDIAVEWESN GOPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWOOGNVFS CSVMHEALHN               420
HYTOKSLSLS PGK                                                                  433
[00205]小鼠：含有编码人免疫球蛋白区域的人染色体片段的人转染色体KM miceTM(WO 02/43478，WO 02/092812，Ishida，等，IBC’s 11thAntibody Engineering Meeting.Abstract(2000)；Kataoka，S.IBC’s 13thAntibody Engineering Meeting.Abstract(2002))获得自Kirin BreweryCo.，Ltd.，Japan，并安置在La Jolla变态反应和免疫学研究所(La JollaInstitute for Allergy and Immunology)的动物实验室内。产生人抗体的技术综述描述于Lonberg(Lonberg，等，Int Rev Immunol 13(1)：65-93(1995))中。不表达内源性免疫球蛋白的带有一种或多种人免疫球蛋白基因(κ或λ)的转基因动物描述于例如美国专利号5,939,598中。描述了用于产生人抗体和人单克隆抗体的其他方法(参见如WO 98/24893；WO92/01047；WO 96/34096；WO 96/33735；美国专利号5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771和5,939,598)。携带人免疫球蛋白基因的牛-TC母牛的开发描述于(Kuroiwa，等，Nat Biotechnol 20(9)：889-94(2002)；Kuroiwa，等，Nat Genet 36(7)：775-80(2004))中。
免疫接种：将hOX40:hFc重组蛋白与等体积的完全弗氏佐剂(CFA，Sigma)混合并制备乳剂。用10-25μg蛋白向腹膜内免疫接种小鼠，并用在不完全弗氏佐剂(IFA，Sigma)中乳化的5-10μg蛋白向腹膜内加强免疫，间隔2周进行2-4次加强免疫。最后在融合前5天向腹腔内注射不含有佐剂的5-10μg可溶性hOX40:hFc。另一组小鼠用通过在PBS中于80℃温育10分钟热变性，然后以1∶1与RIBI佐剂(Sigma)混合的hOX40:hFc免疫接种。对小鼠免疫接种描述如上。第三组小鼠用缀合有卵白蛋白的hOX40:hFc免疫接种。用30μg的hOX40:hFc-OVA单独接种或用处于RIBI中的10μg和20μg的hOX40:hFc的混合物分别接种小鼠。前者接受处于RIBI中的30μghOX40:hFc-OVA的加强免疫，之后以2周间隔接受处于RIBI中的10μg的hOX40:hFc。在5周后，进行处于PBS中的20μghOX40:hFc-OVA的最终加强免疫。后者组的两次加强免疫以2周间隔由处于RIBI中的5μghOX40:hFc-OVA+10μghOX40:hFc组成，最后的加强免疫为处于PBS中的10μghOX40:hFc。所有的注射都是在腹膜内进行的。最后一组小鼠用已用PHA(1μg/ml)和重组人白细胞介素2(IL2，10ng/ml，BD Pharmingen，San Diego，CA)刺激2天的CD4+人T细胞免疫接种。在注射前，细胞接受25Gy的铯源辐射并在RIBI佐剂中1∶1稀释。
杂交瘤产生：选择在它们的血清中具有最高的抗-OX40IgG特异性抗体效价的小鼠用于产生单克隆抗体。收集脾脏并使用50％聚乙二醇(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)将单细胞悬液以3∶1的比例与骨髓瘤细胞系(SP2/O-Ag14)(ATCC，Rockville，MD)融合。将融合物以最佳密度铺在96孔平底平板中并于10％CO2，37℃保温箱中，在完全DMEM-10培养基(含有10％胎牛血清的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(FBS，Invitrogen Corp.))、1％非必需氨基酸、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml硫酸链霉素(所有的都来自BioWhittaker，Walkersville，MD)、HAT补充物(Sigma)和10％杂交瘤克隆因子(HCF，Biovaris，San Diego，CA)中培养。通过ELISA对来自四个融合物的大约4000孔筛选含有人κ的OX40特异性抗体。通过流式细胞检测分析确认人抗-人OX40IgG抗体。增殖阳性孔并对其进行3-4轮有限稀释克隆以获得单克隆抗体。
抗体和蛋白纯化：对于抗体纯化，在2升滚瓶中以350毫升-1升/瓶或在具有补充有超低IgG胎牛血清(Tnvitrogen Corp.)的杂交瘤-SFM培养基(Invitrogen Corp.)的1升Integra系统(INTEGRA Bioscience，Inc.Ijamsville，MD)中培养杂交瘤。通过用1升的Tn5细胞感染4天产生人OX40:hFc重组蛋白。使用重组蛋白A-Sepharose Fast FloW凝胶(Amersham Biosciences)从培养基中纯化人单克隆抗体和OX40:hFc。首先用Ultrasette切向流系统(Pall Corp.，East Hills，NY)浓缩滚瓶中所产生的条件培养基。接着用0.22μm真空过滤装置(Millipore，Bedford，MA)过滤条件培养基并加载到对于培养基中人抗体的量而言是适当尺寸的蛋白A-Sepharose Fast FloW柱(Amersham Biosciences)上。用20柱体积的PBS充分地洗涤柱子，然后用0.1M GIy-HCl，pH 3.6，0.15MNaCl洗脱抗体，接着用1M Tris-HCl，pH 8.0中和抗体。通过SDS-PAGE分析级分，汇集阳性级分并用离心浓缩机(Vivaspin，50,000MWCO：Sartorius，Gettingen，Germany)浓缩。Sephadex G-25脱盐柱(NAP，Amersham Biosciences)用于对PBS，pH 7.4的缓冲液交换。最后，使用具有0.22μm孔径的注射器式滤器对抗体进行过滤消毒，并通过Lowry法测定抗体浓度。使用鲎阿米巴样细胞溶解物(“LAL”)测定法(Associates of Cape Cod，Falmouth，MA)测定热原含量。该测定法的检测极限为0.06EU/mg。如果该测试是阴性的，则样品被认为是无内毒素的。
人IgG定量ELISA：为测定存在于上清液和纯化的贮存物中人抗体的量，使用了下列实验方案。将处于碳酸盐缓冲液中的山羊抗-人Fcγ特异性抗体(Jackson Immunoresearch Laboratories，West Grove，PA)以0.5μg/孔包被96孔平板(Nunc，Denmark)上，在37℃下温育1小时。然后用Superblock (Pierce，Rockford，IL)封闭平板30分钟，接着添加样品到平板中。使用总人IgG(Sigma)或纯化的人IgG1或IgG4(KirinBrewery Co.，Ltd)产生标准曲线。在37℃下温育平板1小时，在PBS/1％BSA/0.1％Tween20(Sigma)中洗涤，并用缀合有辣根过氧化物酶(HRP，Jackson Immunoresearch)的山羊抗-人Fcγ特异性抗体检测结合的抗体，在37℃下温育1小时。添加TMB底物(Sigma)，温育10分钟，并用H2SO4(LabChem Inc.，Pittsburgh，PA)停止反应。在酶标仪上测定450nm处的光密度(OD)。
OX40特异性抗体检测ELISA：通过ELISA测定抗体效价、特异性以及杂交瘤产量。简单地说，用处于碳酸盐缓冲液(pH 9.4)中的50μl的hOX40:hFc以5μg/ml包被96孔平底平板，在4℃下温育过夜或在37℃下温育1小时。在用PBS/0.1％Tween 20洗涤两次后，用PBS/1％BS A/0.1％Tween20封闭平板，在37℃下温育1小时。在封闭缓冲液中稀释血清、上清液体或纯化的抗体，添加到孔中，然后在37℃下温育平板1小时。用PBS/0.1％Tween 20洗涤平板4次，添加1∶2000稀释的过氧化物酶缀合的绵羊抗-人κ检测抗体(The Binding Site，Birmigham，UK)。在37℃下温育1小时后，洗涤平板并添加TMB(Sigma)底物，在室温下温育10-30分钟。用H2SO4(LabChem)停止反应，并通过酶标仪测定450nm处的光密度。
流式细胞术：通过使用人OX40稳定的CHO-K1转染子或三天PHA+IL2活化的人PBMC的流式细胞检测分析测定抗体效价、特异性和相对结合亲和力。在染色缓冲液：PBS+2％FBS+0.1％NaN3+10mMEDTA中洗涤细胞一次，然后重悬于50μl体积的血清、上清液或纯化的抗体中。在冰上细胞与抗体温育20分钟，在染色缓冲液中洗涤两次，然后重悬于抗-人IgG-藻红蛋白标记的第二抗体中。使用了两种不同的抗体：(1)山羊抗-人IgG(Southern Biotechnology Associates，Birmingham，AL)或(2)小鼠抗-人IgG(BD Pharmingen，San Diego，CA)。在冰上温育20分钟后，洗涤细胞一次并1％多聚甲醛用固定10分钟。在最后一次洗涤后，将细胞重悬于染色缓冲液中并使用FACScan或FACS Calibur流式细胞仪(Becton Dickinson Biosciences，Palo Alto，CA)获取样品，使用Cellquest(Becton Dickinson Biosciences)或FloWJo(TreeStar，Inc.，San Carlos，CA)软件分析数据。还用小鼠抗-人OX40抗体L106(Becton Dickinson)染色活化T细胞，该抗体直接缀合有藻红蛋白或用抗-小鼠IgG-PE(Southern Biotechnology Associates.)检测其结合。
OX40L封闭测定法：为测定抗-人OX40抗体是否能封闭OX40L与可溶性OX40的结合，使用了ELISA和流式细胞术实验方案。在ELISA中，用处于碳酸盐缓冲液(pH9.4)中的重组的可溶性hOX40:hFc以2μg/ml包被96孔Nunc平底平板，在37℃下温育1小时。用PBS/0.1％Tween 20洗涤平板，并添加Superblock(Pierce)到孔中以封闭非特异性结合。在PBS/Tween中将测试抗体稀释到1μg/ml并添加到平板中。在37℃下温育1小时后，添加FLAG标记的重组的可溶性人OX40L(Alexis Biochemicals，San Diego，CA)到没有洗去抗-OX40抗体的适当的孔中。在1小时温育后，洗涤平板并添加抗-FLAG-过氧化物酶缀合的抗体(Sigma)到孔中，在37℃下温育1小时。添加TMB底物，10分钟后用H2SO4停止反应，使用酶标仪阅读450nm处的结果。在流式细胞计数测定中，纯化人CD4+T细胞并用PHA+IL2活化2天。洗涤细胞并重悬于染色缓冲液中，然后在冰上与0.005-50μg/ml增加量的人抗-人OX40抗体温育20分钟。接着，添加可溶性的重组OX40L-FLAG到细胞中。洗涤细胞并与缀合PE的抗-FLAG(Sigma)温育。在另一次洗涤后，用1％多聚甲醛固定细胞并在FACScan或FACScalibur上进行分析。在下列公式中使用OD或阳性百分数测定抑制百分数：％抑制＝100-((样品/最大结合)×100)。
抗-OX40抗体交叉封闭测定法：为了测定抗体是否结合相同的人OX40“表位”，使用了ELISA实验方案。用处于碳酸盐缓冲液中的人抗-人OX40抗体以2μg/ml包被Nunc 96孔平底ELISA平板，在37℃下温育1小时。洗涤平板，然后用PBS/1％BSA/Tween 20封闭。接着，2-20μg/ml的人抗-人OX40抗体和小鼠抗人-OX40抗体L106(BDBiosciences，San Jose，CA)、克隆315(Nichirei Biosciences，Tokyo，Japan)或ACT35(BD Pharmingen)与2μg/ml重组人OX40:mFc融合蛋白(Alexis Corporation，San Diego，CA)在室温下预温育30分钟。添加抗体-OX40:mFc蛋白的组合到平板中并在37℃下温育1小时。在3次洗涤后，用过氧化物酶缀合的绵羊抗-小鼠Ig(Amersham Biosciences)检测结合的OX40:mFc。如上所述完成ELISA。在下列公式中使用每个样品的OD测定抑制百分数：％抑制＝100-((样品/最大结合)×100)。为确定这些人抗-人OX40抗体是否封闭小鼠抗-人OX40抗体，进行了该ELISA的变型。除小鼠抗-人OX40抗体包被在平板上以及112V8、112F32、112Y131和112Z5与人OX40:hFc蛋白预温育之外，该方法与上述方法相同。用绵羊抗-人IgG-辣根过氧化物酶第二抗体(AmershamBisociences)检测OX40蛋白与包被的抗体的结合。
流式细胞计数测定也用于确定抗体是否彼此交叉封闭。如下所述由外周血单核细胞中纯化人CD4T细胞，并用1μg/ml植物血球凝集素(Remel，Lenexa，KS)和10ng/ml重组人白细胞介素2(BD Pharmingen)活化2-3天。洗涤细胞并在补充有2％胎牛血清和0.1％叠氮化钠的PBS中用10μg/ml的测试抗体标记，在冰上温育30分钟。无需洗涤，添加10μg/ml的相同抗体的生物素化形式到孔中，并在冰上再温育细胞30分钟。接着，通过添加缓冲液洗涤细胞并在4℃下以1200RPM离心3分钟。通过与抗生物素蛋白链菌素-藻红蛋白(SA-PE，BD Pharmingen)温育20分钟，继之以如所述的另一次洗涤来检测生物素化的抗体的结合。在1％多聚甲醛中固定细胞10分钟。在最后一次洗涤后，将细胞重悬于染色缓冲液中，并使用FACS Calibur流式细胞仪(BectonDickinson Biosciences，Palo Alto，CA)获取样品。使用Cellquest(BectonDickinson Biosciences)或FloW Jo(TreeStar，Inc.，San Carlos，CA)软件分析数据。所测试的抗体包括112F32、112V8、112Y55、112Y131、112Z5、抗-DNP(人IgG1阴性对照)、小鼠抗-人OX40抗体、克隆L106、克隆315和克隆ACT35。使用下列公式确定抑制百分数：100-(测试抗体的几何平均值/最大的几何平均值)×100。对抗体测试自身以及彼此结合的抑制。
由全血纯化人PBMC：通过Scripps Green医院(La Jolla，CA)正常的供血者程序，从18-50岁健康供体收集全血。添加肝素以防止血液凝结。没有具体标明人种、种族性或性别。在PBS中稀释血液，然后用Ficoll-Plaque Plus(Amersham Biosciences)铺在下面。从血清中分离单核细胞并通过没有制动的1800RPM离心沉淀。收集含有PBMC的界面并用PBS洗涤两次。
纯化CD4+T细胞：使用来自Miltenyi Biotec.(Auburn，CA)的阴性分离试剂盒纯化人CD4+T细胞。于PBS/0.5％BSA/2mM EDTA中用特异于CD8、CD11b、CD 16、CD 19、CD36和CD56的半抗原缀合的抗体混合物标记PBMC，在4℃下温育15分钟。在洗涤两次后，将细胞重悬于抗-半抗原磁珠(MACS珠子)中，并在4℃下温育细胞15分钟。接着洗涤细胞并施加到已预洗涤并嵌入磁体的LS/VS+柱上。用缓冲液洗涤柱子3次。“未接触的”CD4+细胞包含在穿过柱子的缓冲液流中。通过流式细胞检测分析确定纯度，使用了特异于人CD3和人CD4的抗体，两者都直接缀合有荧光染料(BD Pharmingen)。可选地，用CD4微珠(Miltenyi Biotec.)选择的CD4+细胞是阳性的。该操作类似于上述操作，不同之处在于通过除去柱子中的磁体并用活塞加压输送5ml缓冲液通过柱子，洗脱附着于柱子上的细胞。
混合的淋巴细胞反应测定法：纯化来自两位供体的PBMC，并将来自每位供体的1×105细胞添加到存在或不存在人抗-人OX40抗体或阴性对照人IgG4(抗-人血清白蛋白，Kirin Brewery Co.，Ltd.)的96孔U底平板中(Ukyo，等，Immunology 109(2)：226(2003))。取决于该研究，由0.005-100μg/ml测试抗体。测试多个供体对。所使用的培养基为补充有10％人AB血清(MP Biomedical，Irvine，CA)、青霉素/链霉素、L-谷氨酰胺和2-巯基乙醇的RPMI-1640。在第6天，添加1μCi氚化胸腺嘧啶(3HTdR)到每个孔中，进行最后的18小时培养。溶解细胞并转移到玻璃滤垫上，使用闪烁计数器(Wallac，Turku，Finland)计数。
急性移植物抗宿主病体内模型：用20μg大鼠抗-小鼠IL2受体β链抗体(TMβ1，Tanaka，等，J Exp Med 178(3)：1103-7(1993))注射5-10周龄的严重联合免疫缺陷(SCID)雄性小鼠以耗竭内源性自然杀伤细胞。第二天，使用铯源让小鼠接受2.5Gy辐射。4小时后，通过腹膜内注射让小鼠接受处于PBS中的总共107个的人PBMC，接着马上静脉注射处于100μl PBS中的2、20、100或200μg的人抗-人OX40或阴性对照hTgG1(抗-二硝基酚(抗-DNP)，Ki rin Brewery Co.Ltd.)抗体。可选地，抗体处理延迟至第3-6天以测试抗-OX40抗体的治疗潜能。每3-4天对小鼠称重，每周接受抗-IL2Rβ抗体一次。在第12天，处死小鼠并评估宏观病理学。切下脾用于流式细胞检测分析，肝和肠用于组织学分析，并收集血清用于人细胞因子和抗体分析(Watanabe，等，Clin Immunol.120：247(2006))。
慢性移植物抗宿主病体内模型：慢性GVHD的模型由急性异种GVHD模型(Watanabe，等，Clin.Immunol.120：247(2006))改造而来。通过转移正选择的人CD4T细胞到使用与上述方法相同的方法制备的SCID小鼠中诱发疾病。通过在第0天腹膜内注射让小鼠接受106个正选择的CD4T细胞，在第0天开始每周静脉注射一次2、20或100μg的抗-OX40或对照抗体。到第30天疾病明显，并在第48天评估小鼠。切下脾和淋巴结用于流式细胞检测分析，皮肤和肺用于组织学分析，以及血清用于人细胞因子分析。
人细胞因子分析：根据厂商说明书(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)，使用多路传输技术测定小鼠血清中一组8种人细胞因子。
纯化人自然杀伤细胞：使用来自Miltenyi Biotec.(Auburn，CA)的阴性分离试剂盒纯化人自然杀伤(“NK”)细胞。于PBS/0.5％BSA/2mM EDTA中用特异于T细胞、B细胞、干细胞、树突细胞、单核细胞、粒细胞和红系细胞的生物素缀合的抗体混合物标记PBMC，在4℃下温育15分钟。接着添加抗生物素磁珠(“MACS珠子”)。细胞在4℃下温育15分钟，然后洗涤并施加到已预洗涤并嵌入磁体的LS/VS+柱上。用缓冲液洗涤柱子3次。“未接触的”CD56+NK细胞包含在穿过柱子的缓冲液流中。通过流式细胞检测分析确定纯度，使用了特异于人CD56和人CD3的抗体，两者都直接缀合有荧光染料(BD Pharmingen)。
抗体依赖性细胞毒作用测定法(ADCC)：由人PBMC纯化NK细胞并与处于补充有10％人AB血清(MP Biomedical，Irvine，CA)、青霉素/链霉素、L-谷氨酰胺和2-巯基乙醇的RPMI-1640中的20ng/ml重组人白细胞介素2(BD Pharmingen)培养48小时。在Cytotox 96非放射性细胞毒性测定(Promega Corp.，Madison，WI)中将这些细胞用作效应细胞。靶细胞是亲本或人OX40转染的EL-4细胞。在圆底96孔组织培养平板中，于冰上将5000个靶细胞与0.005-10μg/ml的抗-人OX40抗体或对照抗体温育30分钟。添加20倍数量的效应NK细胞到孔中，最终体积为100μl，并在37℃下与5％CO2温育4小时前以200x g离心平板3分钟。以250×g离心平板5分钟并将50μl的上清液转移到ELISA平板中。添加50μl体积的测定缓冲液到平板中。在室温下温育30分钟后，添加50μl的停止溶液到孔中并测定490nm处的吸光度。所必需的对照包括单独的靶细胞(天然的)、在温育的最后45分钟用溶解缓冲液处理的单独的靶细胞(最大值)、单独的效应细胞、仅含有培养基(添加(体积校正)及不添加溶解缓冲液)的孔。在从所有孔中扣除培养基背景以及从靶细胞最大值中扣除体积校正值后，使用下列公式确定特异性溶解百分数：细胞毒性百分数＝((实验值-天然的效应细胞值-天然的靶细胞值)/(靶细胞最大值-天然的靶细胞值))×100。
分离人抗-OX40抗体基因：通过离心收集产生112V8抗体(IgG4)的培养的杂交瘤细胞(112V8(ATCC编号PTA-7219，2005年11月17日保藏的))。根据厂商说明书，使用Rneasy试剂盒(QIAGEN Inc.，Valencia，CA)从这些细胞中纯化总RNA。SMART RACETM cDNA扩增试剂盒(Clontech Co.，Ltd.，Palo Alto，CA)用于从杂交瘤细胞总RNA克隆编码免疫球蛋白基因可变区的cDNA。简言之，通过逆转录酶由2μg的RNA制备第一链cDNA。该cDNA用作模板用于聚合酶链反应(“PCR”)来扩增重链和轻链可变区和恒定区的一部分(分别为“HV”和“LV”)。所扩增的序列还含有前导序列。反应如下：2.5U Pfu Ultra DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)；0.2μM 3′引物(用于重链：IgG1p，用于轻链：hk5，表1)；1X通用引物混合物A，用于5′末端(包括在SMART RACE试剂盒中的UMP引物混合物A)；200μM dNTP混合物；1mM MgCl2；Pfu Ultra缓冲液(终浓度为1×)；和cDNA模板。
[00206]热循环程序为94℃×30秒、72℃×3分钟的5个循环。94℃×30秒、70℃×30秒、72℃×3分钟的5个循环。94℃×30秒、68℃×30秒、72℃×3分钟的25个循环，之后在72℃下延伸7分钟。通过琼脂糖凝胶电泳收集并通过QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen Co.，Ltd.，Germany)纯化扩增的DNA片段。使用Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒(Invitrogen Corp.)将纯化的HV和LV的DNA片段整合入pCR4Blunt-TOPO载体中，并将每个构建质粒转化入大肠杆菌中，然后进行克隆。使用特异性引物(M13F、M13R，表1)分析构建质粒中每个插入物(HV和LV)的核苷酸序列。基于获得自HV和LV的序列，设计寡核苷酸引物用于扩增VH(V8H38、V8H39)和VL(V8L42、V8L43)(表1)。
[00207]将112V8VH和VL克隆入IgG1表达载体中。简言之，设计含有5′-SalI和3′-NheI限制性内切酶识别位点的寡核苷酸引物用于通过PCR扩增HV的可变区。使用pTopoV8VH miniprep DNA作为模板、V8H38和V8H39作为引物(表1)以及Pfu Ultra DNA聚合酶进行PCR。在用NheI和SalI消化PCR产物后，将410bp片段亚克隆入用NheI和SalI预消化的IgG1表达载体(IDEC Pharmaceuticals，San Diego，CA，N5KG1-Val Lark(一种N5KG1的改良载体，美国专利号6,001,358))(8.9kb DNA片段)中。通过限制性内切酶酶切消化分析HV的可变区的存在。
[00208]作为第二步，如下将LV插入N5KG1-Val Lark-VH载体中：通过两种DNA限制性内切酶BglII和BsiWI消化DNA载体。分离9.1-kbDNA片段。类似于重链构建体，设计用于PCR LV的一组引物以包含针对5′BglI和3′BsiWi的识别位点。这些引物V8L42和V8L43用于从pTopo V8VL miniprep质粒DNA扩增VL。用BglII和BsiWI消化PCR产物，并通过琼脂糖凝胶电泳和凝胶纯化分离。用T4DNA连接酶将该含有V8VL的片段与已制备的9.1kb载体连接，并用于转化Top10细胞(Invitrogen Corp.)。选择阳性的大肠杆菌转化体。纯化表达载体pG1K112V8，并通过限制性分析确认存在112V8LV和112V8HV区。
[002091分离112Y55(ATCC编号PTA-7220，2005年11月17日保藏的)、112Y131(ATCC编号PTA-7218，2005年11月17日保藏的)和112Z5(ATCC编号PTA-7216，2005年11月17日保藏的)HV和LV可变区，并使用相同的实验方案进行测序。用于扩增特异性HV和LV的引物列于表1中。
[00210]抗体亚类部分决定了第二种效应子作用，如补体激活或Fc受体(FcR)结合以及抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)(Huber，等，Nature229(5284)：419-20(1971)；Brunhouse，等，MoI Immunol 16(11)：907-17(1979))。在鉴定最佳类型的用于特定应用的抗体中，可考虑抗体的效应子作用。例如，hlgG1抗体具有相对长的半衰期，在固定补体中是非常有效的，并且它们能结合FcRI和FcRII。与此相反，人IgG4抗体具有较短的半衰期，无法固定补体且对FcR具有较低的亲和力。在IgG4的Fc区中用脯氨酸取代第228位丝氨酸(S228P)减少了使用hIgG4所观察到的异质性并增加了血清半衰期(Kabat，等，Sequences of proteins of immunologicalinterest第5版(1991).；Angal，等，MoI Immunol 30(1)：105-8(1993))。用谷氨酸取代第235位亮氨酸(L235E)的另-突变消除了残留的FcR结合和补体结合活性(Alegre，等，J Immunol 148(11)：3461-8(1992))。所得到的具有这两种突变的抗体称为IgG4PE。hIgG4氨基酸的编号方式来源于Kabat(Kabat，等，Sequences of proteins of immunological interest第5版(1991))。
[00211]通过用NheI和BglII消化pG1K112V8以释放含有112V8VH和112V8VL的片段，从而产生表达重组112V8IgG4PE的载体。将该载体与使用相同的酶切割的IgG4PE表达载体(pN5KG4PE-Lark，IDECPharmaceuticals，美国专利号6,001,358)连接。通过限制性内切酶酶切消化确认所得到的质粒pG4PEK112V8。
[00212]以相同的方法，将来自112F32杂交瘤(ATCC编号PTA-7217，保藏日期2005年11月17日)的RNA用于生成产生重组112F32G1和112F32G4抗体的载体，在RACE反应中分别用于扩增重链和轻链基因的3′引物是HH-2和HK-2。使用H725′和M2H3′进行112F32HV的扩增。112F32LV扩增引物是F32K5′和K52D3′(表1)。IgG4表达载体pN5KG4获得自IDEC Pharmaceuticals(美国专利号6,001,358.)。通过限制性内切酶酶切消化和测序确认所得到的载体pKLG1/F32K3H和pKLG4/F32K3H。
112F32HV的cDNA的核苷酸序列(从起始密码子(ATG)到可变区末端)SEQ ID NO：3
ATGGAGTGGG GGCCGTGCTG GGTTTTCCTT GTTGTTATTT TAGAAGGTGT CCAGTGTGGG     60
GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCTTG GTACAGCCTG GGGGGTCCCT GAGACTCTCC    120
TGTGCAGCCT CTGGATTCAC CTTCAGTAGC TATAGCATGA ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA    180
GGGAAGGGGC TGGAGTGGGT TTCATACATT AGTAGTAGTA GTAGTACCAT ATACTATGCA    240
GACTCTGTGA AGGGCCGATT CACCATCTCC AGAGACAATG CCAAGAACTC ACTGTATCTG    300
CAAATGAACA GCCTGAGAGA CGAGGACACG GCTGTGTATT ACTGTGCGAG AGGAGTGTAT    360
CACAATGGCT GGTCCTTCTT TGACTACTGG GGCCAGGGAA CCCTACTCAC CGTCTCCTCA    420
[00213]112F32LV的cDNA的核苷酸序列(从起始密码子(ATG)到可变区末端)SEQ ID NO：4
ATGGACATGA GGGTCCTCGC TCAGCTCCTG GGGCTCCTGC TGCTCTGTTT CCCAGGTGCC     60
AGATGTGACA TCCAGATGAC CCAGTCCCCA TCCTCACTGT CTGCATCTGT AGGAAACAGA    120
GTCACCATTA CTTGTCGGGC GAGTCAGGAT ATTAGCAGCT GGTTAGCCTG GTATCAGCAG    180
AAACCAGAGA AAGCCCCTAA GTCCCTGATC TATGCTGCAT CCAGTTTGCA AAGTGGGGTC    240
CCATCAAGGT TCAGCGGCAG TGGATCTGGG ACAGATTTCA CTCTCACCAT CAGCAGCCTG    300
CAGCCTGAAG ATTTTGCAAC TTATTACTGC CAACAGTATA ATAGTTACCC CCTCACCTTC    360
GGCCAAGGGA CACGACTGGA GATTAAACGA                                     390
[00214]112V8HV的cDNA的核苷酸序列(从起始密码子(ATG)到可变区末端)SEQ ID NO：5
ATGGACACAC TTTGCTCCAC GCTCCTGCTG CTGACCATCC CTTCATGGGT CTTGTCCCAG     60
ATCACCTTGA AGGAGTCTGG TCCTACGCTA GTGAAGCCCA AACAGACGCT CACGCTGACC    120
TGCACCTTCT CTGGATTCTC ACTCAGCACT AGTGGAATGG GTGTGGGCTG GATCCGTCAG    180
CCCCCAGGAA AGGCCCTGGA GTGGCTTGCA GTCATTTATT GGGATGATCA TCAACTCTAC    240
AGTCCATCTC TGAAGAGCAG GCTCACCATC ACCAAGGACA CCTCCAAAAA CCAGGTGGTC    300
CTTACAATGA CCAACATGGA CCCTGTGGAC ACAGCCACAT ATTACTGTGC ACACAGACGA    360
GGGGCCTTCC AGCACTGGGG CCAGGGCACC CTGGTCACCG TCTCCTCAGC TTCCACCAA     419
GGGC                                                                 423
[00215]112V8LV的cDNA的核苷酸序列(从起始密码子(ATG)到可变区末端)SEQ ID NO：6
ATGGAAACCC CAGCGCAGCT TCTCTTCCTC CTGCTACTCT GGCTCCCAGA TACCACCGGA    60
GAAATTGTGT TGACGCAGTC TCCAGGCACC CTGTCTTTGT CTCCAGGGGA AAGAGCCACC   120
CTCTCCTGCA GGGCCAGTCA GAGTGTTAGC AGCAGCTACT TAGCCTGGTA CCAGCAGAAA   180
CCTGGCCAGG CTGCCAGGCT CCTCATCTAT GGTGCATCCA GCAGGGCCAC TGGCATCCCA   240
GACAGGTTCA GTGGCAGTGG GTCTGGGACA GACTTCACTC TCACCATCAG CAGACTGGAG   300
CCTGAAGATT TTGCAGTGTA TTACTGTCAG CAGTATGATA GCTCGCTCAC TTTCGGCGGA   360
GGGACCAAGG TGGAGATCAA ACGAACT                                       387
[00216]112F32HV的cDNA的氨基酸序列(前导序列(粗体)和可变区)SEQ ID NO：7
MEWGPCWVFL VVILEGVQCG VQLVESGGGL VQPGGSLRLS CAASGFTFSS YSMNWVRQAP    60
GKGLEWVSYI SSSSSTTYYA DSVKGRFTIS RDNAKNSLYL QMNSLRDEDT AVYYCARGVY   120
HNGWSFFDYW GQGTLLTVSS                                               140
[00217]112F32κLV的cDNA的氨基酸序列(前导序列(粗体)和可变区)SEQ ID NO：8
MDMRVLAQLL GLLLLCFPGA RCDIQMTQSP SSLSASVGNR VTTTCRASQD ISSWLAWYQQ     60
KPEKAPKSLI YAASSLQSGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC QQYNSYPLTF    120
GQGTRLEIKR                                                           130
[00218]112V8HV的cDNA的氨基酸序列(前导序列(粗体)和可变区)SEQ ID NO：9
MDTLCSTLLL LTIPSWVLSQ ITLKESGPTL VKPKQTLTLT CTFSGFSLST SGMGVGWIRQ     60
PPGKALEWLA VIYWDDHQLY SPSLKSRLTI TKDTSKNQVV LTMTNMDPVD TATYYCAHRR    120
GAFQHWGQGT LVTVSSASTKG                                               141
[00219]112V8LV的cDNA的氨基酸序列(前导序列(粗体)和可变区)SEQ ID NO：10
METPAQLLFL LLLWLPDTTG EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SSYLAWYQQK     60
PGQAPRLLIY GASSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QYDSSLTFGG    120
GTKVEIKRT                                                            129
[00220]表1：合成的DNA引物(SEO ID NOS：11-37)
  编号   名称   序列5’→3’   长度
  11   RACEUPS5’   CTAATACGACTCACTATAGGGC   22-单体
  12   IgG1p   TCTTGTCCACCTTGGTGTTGCTGGGCTTGTG   31-单体
  13   HK5   AGGCACACAACAGAGGCAGTTCCAGATTTC   30-单体
  14   M13F   GTAAAACGACGGCCAGTG   18-单体
  15   M13R   CAGGAAACAGCTATGAC   17-单体
  16   V8H38   GAGAGAGAGAGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGT   37-单体
  17   V8H39   AGAGAGAGAGGTCGACCACCATGGACACACTTTGCTCCACG   41-单体
  18   V8L42   AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGGAAACCCCAGCGCAGCTTC   42-单体
  19   V8L43   AGAGAGAGAGCGTACGTTTGATCTCCACCTTGGTCCCTCC   40-单体
  20   HH-2   GCTGGAGGGCACGGTCACCACGCTG   25-单体
  21   HK-2   GTTGAAGCTCTTTGTGACGGGCGAGC   26-单体
  22   F725’   ACCGTGTCGACTGGATTCCAAGGCATTTCCAC   32-单体
  23   M2H3’   GGTGCTAGCTGAGGAGACGGTGAC   24-单体
  24   F32K5’   AATCAAGATCTGTCAGGACACA   22-单体
  25   K52D3’   TATCCCGTACGTTTAATCTCCAGTCGTGTC   30-单体
  26   Y131HF   AGAGAGAGAGGTCGACCACCATGGACACACTTTGCTCCACG   41-单体
  27   Y131HR   AGAGAGAGA GGCTAGCTG AAGAGA CGGTGA CCATTGT   37-单体
  28   Y131LF5   AGAGAGAGA GGTCGACCACCATGG AAACCGCAG CGCAGCTT   41-单体
  29   Y131LR   AGAGAGAGA GCGTACGT TTGATTTCCA CCTTGGTCCCTTG   40-单体
  30   Y55HF   AGAGAGAGAGGTCGACCACCATGGACACACTTTGCTCCACG   41-单体
  31   Y55HR   AGAGAGAGAGGCTAGCTGAAGAGACGGTGACCATTGT   37-单体
  32   Y55LF   AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGGAAACCCCAGCGCAGCTTC   42-单体
  33   Y55LR   AGAGAGAGAGCGTACGTTTGATTTCCACCTTGGTCCCCTG   40-单体
  34   Z5HF   AGA GAGAGAGGTCGACCACCATGACCATGATTACGCCAAGC   41-单体
  编号   名称   序列5’→3’   长度
  35   Z5HR   GAGAGAGAGAGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGT   37-单体
  36   Z5LF   AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTC   42-单体
  37   Z5LR   AGAGAGAGAGCGTACGTTTAATCTCCAGTCGTGTCCCTTG   40-单体
[00221]112Y55 HV的cDNA的核苷酸序列(从起始密码子(ATG)到可变区末端)SEQ ID NO：38
ATGGACACAC TTTGCTCCAC GCTCCTGCTG CTGACCATCC CTTCATGGGT CTTGTCCCAG
60
ATCACCTTGA AGGAGTCTGG TCCTACGCTG GTGAAACCCA CACAGACCCT CACGCTGTCC
120
TGCACCTTCT CTGGGTTCTC ACTCAGCACT AGTGGAGTGG GTGTGGGCTG GATCCGTCAG
180
CCCCCAGGAA AGGCCCTGGA ATGGCTTGCA CTCATTCATT GGGATGATGC TGAGCGCTAC
240
AGTCCATCTC TGAAGAGCAG GCTCACCATC ACCAAGGACA CCTCCAAAAA CCAGGTGGTC
300
CTTACAATGA CCAACATGGA CCTTGTGGAC ACAGCCACAT ATTACTGTGC ACACACCCGG
360
GGGGCTTTTG ATATCTGGGG CCAAGGGACA ATGGTCACCG TCTCTTCA
408
[00222]112Y55LV的cDNA的核苷酸序列(从起始密码子(ATG)到可变区末端)SEQ ID NO：39
ATGGAAACCC CAGCGCAGCT TCTCTTCCTC CTGCTACTCT GGCTCCCAGA TACCACCGGA
60
GAAATTGTGT TGACGCAGTC TCCAGGCACC CTGTCTTTGT CTCCAGGGGA AAGAGCCATC
120
CTCTCCTGCA GGGCCAGTCA GAGTGTTAGC AGCAGCTTCT TAGCCTGGTA CCAACAGAAA
180
CCTGGCCAGG CTCCCAGGCT CCTCATCTAT GGTGCATTTA GCAGGGCCAC TGGCATCCCA
240
GACAGGTTCA GTGGCAGTGG GTCTGGGACA GACTTCACTC TCACCATCAG CAGACTGGAG
300
CCTGAAGATT TTGCAGTGTA TTACTGTCAG CAGTATGATA GCTCACGGAC GTTCGGCCAG
360
GGGACCAAGG TGGAAATCAA A
381
[00223]112Y131HV的cDNA的核苷酸序列(从起始密码子(ATG)到可变区末端)SEQ ID NO：40
ATGGACACAC TTTGCTCCAC GCTCCTGCTG CTGACCATCC CTTCATGGGT CTTGTCCCAG
60
ATCACCTTGA AGGAGTCTGG TCCTACGCTG GTGAAACCCA CACAGACCCT CACGCTGACC
120
TGCACCTTCT CTGGATTCTC ACTCAGCACT AGTGGAGTGG GTGTGGGCTG GATCCGTCAG
180
CCCCCAGGAA AGGCCCTGGA GTGGCTTGCA CTCATTTATT GGGATGATCA TAGCCCCTAC
240
AGCCCATCTC TGAAGAGCAG GCTCACCATC ACCAAGGACA CCTCCAAAAA CCAGGTGGTC
300
CTTACAATGA CCAACATGGA CCCTGTGGAC ACAGCCACAT ATTACTGTGC ACGCACCCGG
360
GGGGCTTTTG ATATCTGGGG CCAAGGGACA ATGGTCACCG TCTCTTCA
408
[00224]112Y131LV的cDNA的核苷酸序列(从起始密码子(ATG)到可变区末端)SEQ ID NO：41
ATGGAAGCCC CAGCGCAGCT TCTCTTCCTC CTGCTACTCT GGCTCCCAGA TACCACCGGA
60
GAAATTGTGT TGACACAGTC TCCAGCCACC CTGTCTTTGT CTCCAGGGGA AAGAGCCACC
120
CTCTCCTGCA GGGCCAGTCA GGGTGTTAGC AGCTACTTAG CCTGGTACCA GCAGAAACCT
180
GGCCAGGCTC CCAGGCTCCT CATCTATGAT GCATCCAACA GGGCCACTGG CATCCCAGCC
240
AGGTTCAGTG GCAGTGGGCC TGGGACAGAC TTCACTCTCA CCATCAGCAG CCTAGAGCCT
300
GAAGATTTTG CAGTTTATTA CTGTCAGCAG CGTAGCAACT GGCATCCGAC GTTCGGCCAA
360
GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGAACTGTG GCTGCACCAT C
381
[00225]112Z5 LV的cDNA的核苷酸序列(从起始密码子(ATG)到可变区末端)SEQ ID NO：42
ATGACCATGA TTACGCCAAG CTTGGTACCG AGCTCGGATC CACTAGTAAC GGCCGCCAGT
60
GTGCTGGAAT TCGCCCTTCT AATACGACTC ACTATAGGGC AAGCAGTGGT ATCAACGCAG
120
AGTACGGGGG GAGGCTTGGT ACAGCCTGGC AGGTCCCTGA GACTCTCCTG TGCAGCCTCT
180
GGATTCACCC TTGATGATTA TGGCATGCAC TGGGTCCGGC AAGCTCCAGG GAAGGGCCTG
240
GAGTGGGTCT CAGGTATTAG TTGGAATAGT GATAGTATAG GCTATGTGGA CTCTGTGAAG
300
GGCCGATTCA CCATCTCCAG AGACAACGCC AAGAACTCCC TGTATCTGCA AATGAACAGT
360
CTGAGAGTTG AGGACACGGC CTTGTATTAC TGTGTAAAAG ATATTAGTGG CTGGTACAGC
420
TTTGACTACT GGGGCCAGGG AACCCTGGTC ACCGTCTCCT CA
462
[00226]112Z5LV的cDNA的核苷酸序列(从起始密码子(ATG)到可变区末端)SEQ ID NO：43
ATGGAAGCCC CAGCTCAGCT TCTCTTCCTC CTGCTACTCT GGCTCCCAGA TACCACCGGA
60
GAAATTGTGT TGACACAGTC TCCAGCCACC CTGTCTTTGT CTCCAGGGGA AAGAGCCACC
120
CTCTCCTGCA GGGCCAGTCA GAGTGTTAGC AGCTACTTAG CCTGGTACCA ACAGAAACCT
180
GGCCAGGCTC CCAGGCTCCT CATCTATGAT GCATCCAACA GGGCCACTGG CATCCCAGCC
240
AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC TGGGACAGAC TTCACTCTCA CCATCAGCAG CCTAGAGCCT
300
GAAGATTTTG CAGTTTATTA CTGTCAGCAG CGTAGCAACT GGCCGATCAC CTTCGGCCAA
360
GGGACACGAC TGGAGATTAA A
381
[00227]112Y55HV的cDNA的氨基酸序列(前导序列(粗体)和可变区)SEQ ID NO：44
MDTLCSTLLL LTIPSWVLSQ ITLKESGPTL VKPTQTLTLS CTFSGFSLST SGVGVGWIRQ
60
PPGKALEWLA LIHWDDAERY SPSLKSRLTI TKDTSKNQVV LTMTNMDLVD TATYYCAHTR
120
GAFDIWGQGT MVTVSS
136
[00228]112Y55LV的cDNA的氨基酸序列(前导序列(粗体)和可变区)SEQ ID NO：45
METPAQLLFL LLLWLPDTTG EIVLTQSPGT LSLSPGERAI LSCRASQSVS SSFLAWYQQK
60
PGQAPRLLIY GAFSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QYDSSRTFGQ
120
GTKVEIK
127
[00229]112Y131HV的cDNA的氨基酸序列(前导序列(粗体)和可变区)SEQ ID NO：46
MDTLCSTLLL LTIPSWVLSQ ITLKESGPTL VKPTQTLTLT CTFSGFSLST SGVGVGWIRQ
60
PPGKALEWLA LIYWDDHSPY SPSLKSRLTI TKDTSKNQVV LTMTNMDPVD TATYYCARTR
120
GAFDINGQGT MVTVSS
136
[00230]112Y131LV的cDNA的氨基酸序列(前导序列(粗体)和可变区)SEQ ID NO：47
MEAPAQLLFL LLLWLPDTTG EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQGVS SYLAWYQQKP
60
GQAPRLLIYD ASNRATGIPA RFSGSGPGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWHPTFGQ
120
GTKVEIK
127
[00231]112Z5HV的cDNA的氨基酸序列(前导序列(粗体)和可变区)SEQ ID NO：48
MTMITPSLVP SSDPLVTAAS VLEFALLIRL TIGQAVVSTQ STGGGLVQPG RSLRLSCAAS
60
GFTLDDYGMH WVRQAPGKGL EWVSGISWNS DSIGYVDSVK GRFTISRDNA KNSLYLQMNS
120
LRVEDTALYY CVKDISGWYS FDYWGQGTLV TVSS
154
[00232]112Z5LV的cDNA的氨基酸序列(前导序列(粗体)和可变区)SEQ ID NO：49
MEAPAQLLFL LLLWLPDTTG EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP
60
GQAPRLLIYD ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPITFGQ
120
GTRLEIK
127
[00233]由CHO细胞产生重组人抗-OX40抗体：为了产生重组抗体，将含有抗-OX40抗体的单个抗体载体电穿孔入宿主细胞-中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞，ATCC#CRL-9096)的dhfr-缺陷型细胞株中，并从转染细胞的上清液中分离重组抗体。简言之，通过DNA限制酶NruI线性化10μg纯化的DNA表达载体，并使用Bio Rad电穿孔仪(0.8kV，25uF)将DNA转染入3×106个CHO细胞中。将转染细胞接种在96孔培养平板中，在补充有青霉素/链霉(Bio Whitaker)、HT(Sigma)和遗传霉素(Invitrogen Corp.)的含有谷氨酰胺的EX-CELL 325PF CHO无血清培养基(JRH Bioscience，Lenexa，KS)中选择含有该DNA载体的CHO细胞。在选择出几株稳定的转染细胞系后，通过ELISA鉴定高的人IgG产生细胞系，并用于产生重组抗体。
[00234]实施例2
[00235]该实施例描述了针对人OX40的人单克隆抗体的多个特征。
[00236]用处于CFA/BFA中的可溶性的重组hOX40:hFc、处于RIBI中的hOX40:hFC+hOX40:hFc-ova缀合物、处于RIBI中的热变性的hOX40:hFc或处于RIBI中的经辐射的、活化的人T细胞免疫接种KMmiceTM。一些小鼠产生在人IgG OX40特异性效价范围内的抗-人OX40特异性抗体。将来自最高应答者的脾细胞与骨髓瘤细胞融合以生成产生人抗-人OX40的杂交瘤。通过ELISA和流式细胞术测定抗-OX40抗体的产生，分别使用了重组的可溶性hOX40:hFc和CHO-OX40转染子。通过有限稀释克隆阳性杂交瘤以产生单克隆杂交瘤(表2)。
[00237]表2：用于产生抗体的抗原
  抗体   抗原
  112F32   hOX40:hFc
  112V8   活化的人T细胞
  112Y55   hOX40:hFc+hOX40:hFc-卵白蛋白
  112Y131   hOX40:hFc+hOX40:hFc-卵白蛋白
  112Z5   热变性的hOX40:hFc
[00238]对一些抗体进一步鉴定对人OX40的相对结合亲和力、体外封闭人OX40配体结合的能力、彼此交叉封闭的能力、体外阻断增殖的能力、体内阻断炎症的能力以及介导ADCC的能力(表3)。
[00239]112F32、112V8、112Y131、112Y55和112Z5全都特异性结合活化的人T细胞，但不特异性结合静息的人T细胞(图1)。用不同浓度的人抗-人OX40抗体标记活化3天的人T细胞并用抗-人IgG-PE检测。这些人抗-人OX40抗体的结合是可饱和的。通过滴定标记的活化人T细胞需要的抗体量测定每种抗体的最大结合(图2)。获得相对结合亲和力的变化范围(KD和BMAX，表3)。还测定了纯化的小鼠抗-人OX40抗体L106的结合，与L106相比，112F32、112V8、112Y55、112Y131和112Z5全都具有对活化T细胞更高的BMAX。
[00240]表3：人抗-人OX40单克隆抗体的特性
Figure A20068004408500831
*：ni；在50μg/ml下不抑制
Λ：+：在体外抑制增殖或在体内抑制疾病，未定量
#：NT；未测试
@：使用10μg/ml不相关抗体的溶解百分数为14％
[00241]通过ELISA分析OX40抗体以确定是否彼此竞争结合可溶性OX40。将单种人抗体包被在96孔平板的孔中。将hOX40:mFc与可溶性抗-OX40抗体(封闭抗体)预温育，然后添加到包被的孔中。用抗-小鼠IgG-HRP检测hOX40:mFc与包被的抗体的结合。使用下列公式确定抑制百分数：(100-(OD样品/OD最大结合样品))*100(图3A)。
[00242]此外，将小鼠抗体包被在96孔平板的孔中(L106、315、ACT35湖小鼠IgG)，并让hOX40:hFc与封闭抗体预温育。用绵羊抗-人IgG-HRP检测hOX40:hFc的结合(图3B)。
[00243]对于这些人抗-人OX40抗体，已鉴定了三组“表位”。112V8、112Y55和112Y131都彼此交叉封闭，而112F32和112Z5则各自具有独特的结合位点。112V8、112Y131和112Y55部分降低112Z5的结合，但反过来却不这样，112Z5仅封闭其自身。这暗示与112V8、112Y55和112Y131相比，112Z5识别不同的表位，结合的任何降低可能是由于空间位阻之故。这些人抗-OX40抗体并不封闭L106、315或ACT35结合OX40(图3A和3B)，而L106封闭其自身和ACT35，与不结合O40的对照抗体(实线)相比，其仅降低10％的112V8和112Y131结合。这表明在此所述的抗体识别不同于L106的表位。克隆315降低112V8和112Y131结合，但由于后两种抗体并不封闭315结合，因此它们必定结合不同的表位。
[00244]还使用流式细胞计数测定来评估抗体封闭结合活化人T细胞表面表达的OX40的能力。用封闭抗体染色活化T细胞，然后添加生物素化的抗-OX40抗体。此外，用小鼠抗-人OX40抗体标记活化的人T细胞以封闭OX40结合。用SA-PE检测生物素化的抗-OX40抗体与这些细胞的结合。通过流式细胞仪分析细胞。使用相同的公式，将阳性SA-PE染色的几何平均值用于计算抑制百分数，即(100-(OD样品/OD最大结合样品))*100。将这些数据(图4A和4B)与ELISA分析相关联。
[00245]人抗-人OX40抗体识别3个表位，112F32识别第1个，112Z5识别第2个，112V8和112Y131识别第3个。照ELISA数据的情况看，112Z5仅封闭其自身，但其结合为112V8和112Y131所降低。对于112V8和112Y131的L106封闭同样如此。如果L106首先结合细胞，则112V8和112Y131仍能有效结合人OX40。无论如何，112V8和112Y131抑制了L106的结合。这些数据一并考虑暗示抗体在空间上阻碍了L106的结合，但不识别相同的表位。112F32和112Z5并不封闭L106的结合。ACT35并不抑制112F32、112V8、112Y131或112Z5的结合，但克隆315降低50％的112V8和112Y131的结合。对活细胞的抗体结合和检测可包括内在化表面分子，使得单种抗体的结合水平可由于OX40的表面表达整体上降低而被降低，但不封闭抗体的结合。与较低亲和力抗体相比，更高亲和力抗体可导致更多的内在化。这就可以解释在ELISA和流式细胞计数数据之间的差异以及取决于用于封闭的抗体而导致的结果差异。
[00246]使用ELISA实验方案测试112F32、112V8、112Y131、112Y55和112Z5封闭可溶性hOX40L结合包被的hOX40:hFc融合蛋白的能力(图5A，表3)。用hOX40:hFc包被平板，并在封闭非特异性位点后，让抗-OX40抗体进行结合。不洗涤就添加OX40L-FLAG到孔中。用抗-FLAG-HRP第二抗体检测结合的配体。使用下列公式确定抑制百分数：(100-(OD样品/OD最大OX40L结合))*100。112V8、112Y55和112Y131阻止了85％的可溶性OX40L与hOX40:hFc的结合。112F32阻止了大约70％的可溶性hOX40L与hOX40:hFc的结合，以及112Z5封闭了67％的最大结合。这些数据暗示这些人抗-人OX40抗体与涉及配体结合的OX40的一部分结合。
[00247]当基于流式细胞计数的测定被用于监测封闭可溶性OX40L与表达OX40的活化的人T细胞结合时，获得了稍有不同的结果(图5B)。先用抗-OX40抗体再用可溶性flag标记的-人OX40L标记活化的人T细胞。用抗-FLAG-PE抗体检测OX40L的结合。使用相同的公式确定抑制百分数，即(100-(样品/最大结合))*100。在该研究中，112F32不能阻止OX40L结合，112Z5的封闭降低了，而其他抗体112V8、112Y55和112Y131则持续不断地具有类似的封闭能力。结果差异可取决于112F32和112Z5对OX40的亲和力。还可取决于与可溶性OX40:mFc融合蛋白的二聚化相反的细胞表面上OX40蛋白的三聚化。
[00248]可选地，在活化T细胞表面上表达的OX40可与阻止112F32或降低112Z5结合OX40、但不封闭OX40L结合OX40的4-1BB(Ma，等，Blood 106(6)：2002-10(2005))或类似于BTLA的抑制分子(Cheung，等，Proc Natl Acad Sci U S A102(37)：13218-23(2005)；Compaan，等，J Biol Chem280(47)：39533-6(2005)；Croft，Trends Immunol 26(6)：292-4(2005)；Gonzalez，等，Proc Natl Acad Sci U S A 102(4)：1116-21(2005)；Sedy，等，Nat Immunol 6(1)：90-8(2005))形成复合物。最后三种可能性可指向单种抗体的特异性表位结合。L106(一种小鼠抗-人OX40抗体)所识别的表位也依赖于OX40配体和OX40的确定，如L106封闭了95％的OX40L与重组OX40蛋白的结合，但仅封闭60％的活化T细胞结合。这些数据表明在OX40上有多个表位，某些表位完全干扰了与OX40L的结合，而其他表位仅部分封闭该相互作用。这些抗体与不同表位的结合可能或不可能具有独特的功能结果。
[00249]通过任何一种不需要支配OX40信号传导的方法对配体结合的封闭将为给定的抗体所削弱。为确定人抗-人OX40抗体是否能阻止经由OX40的信号传导，由同种异体供体使用总PBMC建立双向混合的淋巴细胞培养物。在不同剂量的抗-OX40抗体或对照抗体存在或不存在下，在96孔U底平板中共培养来自同种异体供体的外周血单核细胞7天，重复三次。将1×105个细胞/供体添加到每个孔中。在培养的最后18小时用1μCi/孔3HtdR使平板受脉冲作用。收获细胞并在闪烁计数器上计数。在对照或抗-OX40抗体存在或不存在下测定增殖(图6)。112V8(图6A)、112Y55和112Z5(图6B)以及112Y55、112Y131和112F32(图6C)全都能以剂量依赖性方式减少由同种异体细胞诱导的增殖的量，而阴性对照hIgG4、抗-人血清白蛋白则对增殖没有影响(图6A)。进行多次研究，应答量值、CPM掺入的最大值取决于用于每次测定的供体PBMC的组合。在混合的淋巴细胞培养物中，CD4和CD8T细胞应答于同种异体抗原。由于人抗-人OX40抗体而减少的增殖响应可能归因于对CD4和CD8T细胞的直接抑制。
[00250]实施例3
该实施例描述了用人OX40的线性肽进行人抗-人OX40抗体的表位作图。
[00251]选择人OX40胞外域中的三种肽(表4)用于开始进行为112F32、112V8、112Y55、112Y131和112Z5所识别的表位作图。
[00252]表4：人OX40肽
Figure A20068004408500861
[00253]根据厂商说明书(Pierce)，通过A&A Lab，LLC产生肽并用马来酰亚胺接头缀合匙孔血蓝蛋白(“KLH”)。将处于碳酸盐缓冲液中的肽以10μg/ml包被96孔Maxisorp ELISA平板(Nunc)，在4℃下温育过夜。用PBS/0.1％Tween 20洗涤平板，然后在室温下用酪蛋白缓冲液(Pierce)封闭3小时。添加10μg/ml的在处于PBS/0.1％Tween 20中的10％酪蛋白中稀释的候选抗体。如对OX40特异性抗体检测ELISA所述的，进行其余的ELISA。
[00254]没有一种人抗-人OX40抗体能可检测地与这些人OX40肽反应，而来自用这些肽免疫接种的小鼠的血清结合了适当的肽。这些结果表明在所使用的检测条件下，112F32、112V8、112Y55、112Y131和112Z5不能可检测地结合这些来自人OX40胞外序列的短的线性表位。如果这些序列包括在更长的肽序列中，则这些数据并不排除这些序列来自于为人抗-人OX40抗体所识别的序列。
[00255]实施例4
该实施例描述了人抗-人OX40单克隆抗体的体内功能分析。
[00256]将急性异种移植物抗宿主病(XGVHD)模型用于测试112V8G1人抗-人OX40抗体的体内治疗潜能(Watanabe，等，Clin Immunol 120：247-259(2006))。在该模型中，将人外周血单核细胞转移到严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠中。在转移到小鼠之前，用抗-IL2Rβ链抗体处理小鼠以耗竭内源性鼠自然杀伤细胞，然后对它们进行亚致死量的辐射以使人细胞迁移到肠道中。人T细胞增殖并诱导移植物抗宿主样病，导致体重减轻、血尿、腹水、肝和肠道中炎性细胞浸润以及最终的死亡。与纯化的T细胞转移诱导类似的症状一样，该疾病主要由人T细胞所介导的。
[00257]SCID小鼠按如上所述进行处理，外加在第0天给予112V8G1或人IgG1同种型对照(抗-DNP)重组抗体以测试OX40封闭的预防性潜能。在第0天，通过静脉注射让小鼠接受100、20或2μg的112V8G1抗体或100μg抗-DNP。每3-4天测定体重一次。在第12天，杀死小鼠并分析疾病症状，收集脾进行流式细胞检测分析。对第12天所观察到的宏观病理学评分如下，腹泻(0-1)、肠和腹膜腔中出血以及腹膜炎(各自为0-5)，具有更高的分数表明疾病更严重。所有疾病症状之和被用于确定总宏观病理学评分。接受对照抗体的小鼠全都显示有XGVHD症状，与接受112V8G1的小鼠相比具有更高的病理学评分。所有测试剂量的112V8G都缓解或预防了这些症状(图7A)。
[00258]脾的分析结果与该观察结果一致。通过流式细胞仪分析脾的单细胞悬液中人T细胞的存在。人T细胞存在于用对照抗体处理的小鼠脾中，但与对照动物中T细胞的数量相比，在112V8G1处理的动物中人T细胞的数量明显更低(图7B)。此外，使用多路传输技术测定血清中的炎性人细胞因子(干扰素-γ、肿瘤坏死因子和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)。与对照相比，在112V8G 1处理的动物中炎性人细胞因子减少。最具戏剧性的影响是针对干扰素γ水平的(图7C)。已使在同种异体骨髓移植患者的外周血中OX40+T细胞的出现与慢性GVHD发病相关(Gadisseur，等，Bone Marrow Transplant 23(10)：1013-7(1999)；Kotani，等，Blood 98(10)：3162-4(2001)；Sanchez，等，Br J Haematol126(5)：697-703(2004))。
[00259]为了在慢性GVHD的治疗中评估OX40封闭的有效性，建立慢性异种GVHD的动物模型系统。该模型类似于急性异种GVHD模型，不同之处在于将106个纯化的CD4+细胞而非PBMC注射入SCID小鼠中。辐射剂量也降低到2.12Gy以减少肠损伤的程度。该疾病最初的迹象是脱发和体重减轻，之后是死亡，其部分归因于在肺中T细胞浸润。在约第30天疾病症状变得明显。5只一组的小鼠分别用100、20或2μg的112V8G1重组抗体每周处理一次，持续5周，或用100μg的抗-DNPhlgG1对照抗体每周处理一次，持续5周。在第7周分析生存下来的小鼠。通过脱发、出血和腹膜炎(各自为0-5)和腹泻(0-1)的程度确定宏观病理学评分。
[00260]最初观察到的病理是脱发，与对照处理的小鼠相比所有这三种剂量的112V8G1都缓解了该疾病症状(图8A)。该观察结果与转移CD4T细胞后第48天112V8G1处理的小鼠脾中人T细胞的减少相一致(图8B)。在该模型中，人T细胞迁移到淋巴结中，其在对照动物中容易检测到，但在抗-OX40处理的动物中则人T细胞明显减少或没有发现(图8C)。注意，在用20或100μg的112V8G1处理的动物中没有发现淋巴结。
[00261]此外，不同于急性模型，在对照处理的小鼠脾和淋巴结中可容易地检测到OX40阳性细胞，而在112V8G1处理的动物中OX40+细胞的数量则减少(图8B和8C)。在接受人CD4T细胞的小鼠血清中检测到炎性细胞因子，与用对照人IgG1相比，在用112V8G1抗-人OX40处理的小鼠中被检测到的细胞因子的量减少。在该疾病模型中产生的细胞因子包括但不限于白细胞介素2、白细胞介素4、白细胞介素6、白细胞介素8、白细胞介素10、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、干扰素γ和肿瘤坏死因子α。通过用112V8G1处理，除白细胞介素6之外的所有细胞因子都明显地减少了，证实了通过耗竭和/或封闭的OX40信号传导抑制的抗炎活性。
[00262]利用预防性用药法在急性XGVHD模型中研究112V8G4PE。该抗体不具有耗竭活性，这是因为其无法固定补体或结合Fc受体，因此疾病预防应当依赖于阻断OX40信号传导或下行性调节OX40。在第0天，向每组5只小鼠单次注射200、20或2μg的112V8G4PE。在第0、3或6天，让对照处理的小鼠接受200μg抗-DNP人IgG4抗体。在第12天分析小鼠的宏观病理学和脾中人T细胞的数量(图9A和9B，表5)。在第12天，按0-3分对腹泻、腹膜出血或血性腹水以及肠出血的宏观病理学评分，0分代表没有观察到病理，3分代表严重的疾病。200和20μg的112V8G4PE阻止了明显病理的发展，而2μg剂量并不足以预防疾病。在第12天宏观病理学的量与脾中人T细胞的数量相关。与对照处理的动物相比，200或20μg的112V8G4PE显著减少了人T细胞在脾中的蓄积，而2μg剂量则无效。在112V8G4PE(图9A和9B)和112V8G1(图7)滴定中所观察到的差异可归因于112V8G4PE抗体的耗竭活性缺乏。
[00263]迟至第3或6天给予112V8G4PE以测试阻断OX40信号传导的治疗效能。在转移人PBMC后第3或6天用200μg的112V8G4PE或对照人IgG4抗体处理小鼠。在第14天评估宏观病理学。与对照抗体处理的动物中观察到疾病程度相比，当在第3或6天给予112V8G4PE抗-人OX40抗体时，OX40信号传导的阻断改善了疾病(图9C)。与对照处理的小鼠相比，抗-OX40处理的小鼠脾中人T细胞的数量也明显减少。如果在第6天给予，112V8G1也缓解了疾病。这些数据证实了作为治疗方法用于缓解疾病病理的通过OX40特异性抗体封闭OX40的有效性。
[00264]在急性和慢性异种移植物抗宿主病模型中，与对照处理的动物相比，112V8(一种人抗-人OX40抗体)显著地缓解了疾病病理，减少了炎性细胞因子的产生以及脾和淋巴结中人T细胞的数量。这些数据证实了直接靶向OX40阳性细胞是适合于预防(预防性)和改善(治疗)T细胞介导的疾病的疗法。在使用112F32、112Y55、112Y131和112Z5的一种或两种模型中获得了类似的结果(表3)。
[00265]在急性GVHD模型中，CD4和CD8人T细胞都是疾病所需要的。CD4T细胞对于诱导是必需的，而CD8T细胞则介导大多数的发病机理。通过给予一种所述的人抗-人OX40抗体对疾病的预防和改善可能是由于直接拮抗了CD4和CD8T细胞，或可能是由于通过减少CD4帮助功能从而直接封闭了具有对CD8T细胞间接影响的CD4T细胞。此外，OX40抗体可促进一些调节T细胞产生或增加其数量。尽管不希望受任何理论约束，有可能这些机制的一种或全部可介导疾病改善。
[00266]尽管不希望受任何理论约束，这些抗-人OX40抗体可能的作用机制是通过自然杀伤细胞或嗜中性效应细胞诱导抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)。该过程依赖于效应细胞表达的Fc受体与结合活化T细胞上表达的OX40的抗-OX40抗体结合的能力。免疫球蛋白结合Fc受体的能力取决于抗体亚类以及Fc受体类型。人IgG1抗体结合自然杀伤细胞和嗜中性白细胞上的Fc受体，而人IgG4抗体并不结合(Huber，等，Nature 229(5284)：419-20(1971)；Brunhouse，等，MoI Immuno116(11)：907-17(1979))。测试人抗-人OX40抗体112F32(IgG1)、112V8(IgG1和IgG4PE)、112Y55(IgG1)、112Y131(IgG4)和112Z5(IgG1)通过人自然杀伤细胞介导OX40表达靶细胞的ADCC的能力。
在与人抗-人OX40抗体以及以20个效应细胞：1个靶细胞的比例的人自然杀伤细胞温育4小时后，将非放射性细胞毒性测定用于测定靶细胞特异性溶解百分数(图10)。用0.001-10μg/ml抗-OX40或阴性对照抗体标记EL4-人OX40靶细胞，然后与人自然杀伤细胞温育。通过在非放射性细胞毒性测定中乳糖脱氢酶的释放测定靶细胞的溶解。如该方法中所述的测定特异性溶解百分数。人IgG1抗-人OX40抗体以剂量依赖性方式诱导了EL4-人OX40靶细胞的ADCC。人IgG4抗-OX40抗体和对照人IgG1抗体无法诱导靶细胞的特异性溶解。ADCC活性水平与相对结合亲和力和表位组相关，如与组A(112F32)和C(112Z5)中的抗体相比，那些在表位组B中的抗体(112V8和112Y55)具有更高的ADCC活性抗体。
[00267]在此描述的分析结果鉴定了具有结合亲和力变化范围的抗体、三种不同的表位并证实了它们在阻断OX40配体结合和预防或改善T细胞介导的炎症反应中的有效性。这些人抗-人OX40抗体(112F32、112V8、112Y55、112Y131和112Z5)减少增殖、减缓疾病进展以及减少炎性细胞因子产生的能力证实了直接封闭OX40作为一种用于治疗T细胞介导的炎性或自身免疫性疾病，包括但不限于类风湿性关节炎、多发性硬化、银屑病、克罗恩氏病、移植物抗宿主病和移植排斥的方法的潜力。对于减少增殖或改善疾病，抗-OX40抗体的耗竭活性是不需要的，这样能减少由于T细胞耗竭所致的潜在不利影响。
[00268]文献目录
[00269]Akiba，H.，Y.Miyahira，et al.(2000).“Critical contribution of OX40 ligand toT helper cell type 2 differentiation in experimental leishmaniasis.”J Exp Med 191(2)：375-80.
[00270]Al-Shamkhani，A.，S.Mallett，et al.(1997).“Affinity and kinetics of theinteraction between soluble trimeric OX40 ligand，a member of thetumor necrosis factor superfamily，and its receptor OX40on activatedT cells.”J Biol Chem 272(8)：5275-82.
[00271]Alegre，M.L.，A.M.Collins，et al.(1992).“Effect of a single amino acidmutation on the activating and immunosuppressive properties of a“humanized”OKT3 monoclonal antibody.”J Immunol 148(11)：3461-8.
[00272]Angal，S.，D.J.King，et al.(1993).“A single amino acid substitution abolishesthe heterogeneity of chimeric mouse/human(IgG4)antibody.”Mol Immunol30(1)：105-8.
[00273]Bachmann，M.F.，M.Barner，et al.1999)“CD2 sets quantitative thresholdsin T cell activation.”J Exp Med190(10)：1383-92.
[00274]Bansal-Pakala，P.，A.G.Jember，et al.(2001).“Signaling through OX40(CD 134)breaks peripheral T-cell tolerance.”Nat Med 7(8)：907-12.
[00275]Baum，P.R.，R.B.Gayle，3rd，et al.(1994).“Molecular characterization ofmurine and human OX40/OX40 ligand systems：identification of ahuman OX40 ligand as the HTLV-1-regulated protein gp34.”Embo J13(17)：3992-4001.
[00276]Baum，P.R.，R.B.Gayle，3rd，et al.(1994).“Identification of OX40 ligandand preliminary characterization of its activities on OX40 receptor.”Circ Shock44(1)：30-4.
[00277]Blazar，B.R.，A.H.Sharpe，et al.(2003).“Ligation of OX40(CD134)regulates graft-versus-host disease(GVHD)and graft rejection inallogeneic-bone marrow-transplant recipients.”Blood 101(9)：3741-8.
[00278]Brocker，T.，A.Gulbranson-Judge，et al.(1999).“CD4 T cell traffic control：invivo evidence that ligation of OX40 on CD4 T cells by OX40-ligandexpressed on dendritic cells leads to the accumulation of CD4T cellsin B follicles.”Eur JImmunol29(5)：1610-6.
[00279]Brugnoni，D.，A.Bettinardi，et al.(1998).“CD134/OX40 expression bysynovial fluid CD4+ T lymphocytes in chronic synovitis.”Br J Rheumatol37(5)：584-5.
[00280]Brunhouse，R.and J.J.Cebra(1979).“Isotypes of IgG：comparison of theprimary structures of three pairs of isotypes which differ in their abilityto activate complement.”Mol Immunol 16(11)：907-17.
[00281]Calderhead，D.M.，J.E.Buhlmann，et al.(1993).“Cloning of mouse Ox40：aT cell activation marker that may mediate T-B cell interactions.”J Immunol 151(10)：5261-71.
[00282]Cheu ng，T.C.，I.R.Humphreys，et al.(2005).“Evolutionarily divergenther pesviruses modulate T cell activation by targeting the herpesvirusentry mediator cosignaling pathway.”Proc Natl Acad Sci U S A102(37)：13218-23.
[00283]Compaan，D.M.，L.C.Gonzalez，et al.(2005).“Attenuating lymphocyteactivity：The crystal structure of the btla-hvem complex.”J Biol Chem.
[00284]Croft，M.(2003).“Costimulation of T cells by OX40，4-1BB，and CD27.”Cytokine Growth Factor Rev14(3-4)：265-73.
[00285]Croft，M.(2005).“The evolving crosstalk between co-stimulatory and co-inhibitory receptors：HVEM-BTLA.”Trends Immunol 26(6)：292-4.
[00286]Evans，D.E.，R.A.Prell，et al.(2001).“Engagement of OX40 enhancesantigen-specific CD4(+)T cell mobilization/memory development andhumoralimmunity：comparison of alphaOX-40 with alphaCTLA-4.”J Immunol 167(12)：6804-11.
[00287]Gadisseur，A.P.，J.W.Gratama，et al.(1999).“Expression of T cell activationantigen CD134(0X40)has no predictive value for the occurrence orresponse to therapy of acute graft-versus-host disease in partial T cell-depleted bone marrow transplantation.”Bore Marrow Transplant23(1o)：1013-7.
[00288]Gonzalez，L.C.，K.M.Loyet，et al.(2005).“A coreceptor interaction betweenthe CD28and TNF receptor family members B and Tlymphocyteattenuator and herpesvirus entry mediator.”Proc Natl Acad Sci U S A102(4)：1116-21.
[00289]Gramaglia，I.，A.Jember，et al.(2000).“The OX40 costimulatory receptordetermines the development of CD4memory by regulating primaryclonal expansion ”J Immunol 165(6)：3043-50.
[00290]Gramaglia，I.，A.D.Weinberg，et al.(1998).“Ox-40 ligand：a potentcostimulatory molecule for sustaining primary CD4T cell responses.”J Immunol 161(12)：6510-7.
[00291]Grewal，I.S.and R.A.Flavell(1998).“CD40and CD154 in cell-mediatedimmunity.”Annu Rev Immunol 16：111-35.
[00292]Higgins，L.M.，S.A.McDonald，et al.(1999).“Regulation of T cell activationin vitro andin vivo by targeting the OX40-OX40 ligand interaction：amelioration of ongoing inflammatory boWel disease with an OX40-IgG fusion protein，but not with an OX40ligand-IgG fusion protein.”J Immunol162(1)：486-93.
[00293]Huber，H.，S.D.Douglas，et al.(1971).“IgG subclass specificity of humanmonocyte receptor sites.”Nature 229(5284)：419-20.
[00294]Humphreys，I.R.，G.Walzl，et al.(2003).“A critica1 role for OX40in T cell-mediated immunopathology during lung viral infection.”JExp Med198(8)：1237-42.
[00295]Imura，A.，T：Hori，et al.(1996).“Thehuman OX40/gp34system directlymediates adhesion of activated T cells to vascular endothelial cells.”J Exp Med 183(5)：2185-95.
[00296]Imura，A.，T.Hori，et al.(1997).“OX40 expressed on fresh leukemic cellsfrom adult T-cell leukemia patients mediates cell adhesion to vascularendothelial cells：implication for the possible involvement of OX40 inleukemic cell in filtration.”Blood 89(8)：2951-8.
[00297]Ishida and Lonberg(2000).11 th Antibody Engineering Meeting.
[00298]Kabat，e.a.(1991).Sequences of proteins of immunological interest.Fifth Edition.
[00299]Kaleeba，J.A.，H.Offner，et al.(1998).“The OX-40receptor provides a potentco-stimulatory signal capable of inducing encephalitogenicity inmyelin-specific CD4+T cells.”Int Immunol10(4)：453-61.
[00300]Kjaergaard，J.，J.Tanaka，et al.(2000).“Therapeutic efficacy of OX-40receptor antibody depends on tumor immunogenicity and anatomic siteof tumor growth.”Cancer Res 60(19)：5514-21.
[00301]Kotani，A.，T.Ishjkawa，et al.(2001).“Correlation of peripheral bloodOX40+(CD 134+)T cells with chronic graft-versus-host djsease inpatients who underwent allogeneic hematopoietic stem celltransplantation.”Blood 98(10)：3162-4.
[00302]Kurojwa，Y.，P.Kasjnathan，et al.(2002).，“Cloned transchromosomic calvesproducing human immunoglobulin.”Nat Biotechnol20(9)：889-94.
[00303]Kurojwa，Y.，P.Kasinathan，et al.(2004).“Sequential targeting of the genesencoding immunoglobulin-mu and prion protein in cattle.”Nat Genet36(7)：775-80.
[00304]Lane，P.(2000).“Role of OX40 signals in coordinating CD4T cell selection，migration，and cytokine differentiation in T helper(Th)1 and Th2ceiis.”J Exp Med 191(2)：201-6.
[00305]Latza，U.，H.Durkop，et al.(1994).“The human OX40 homolog：cDNAstructure，expression and chromosomal assignment of the ACT35antigen.”Eur J Immunol 24(3)：677-83.
[00306]Linsley，P.S.，W.Brady，et al.(1991).“Binding of the B cell activationantigen B7 to CD28 costimulates T cell proliferation and interleukin 2mRNA accumulation.”J Exp Med 173(3)：721-30.
[00307]Linton，P.J.，B.Bautista，et al.(2003).“Costimulation via OX40L expressedby B cells is sufficient to determine the extent of primary CD4 cellexpansion and Th2 cytokine secretion in vivo.”J Exp Med 197(7)：875-83.
[00308]Locksley，R.M.，N.Killeen，et al.(2001).“The TNF and TNF receptorsuperfamilies：integrating mammalian biology.”Cell 104(4)：487-501.
[00309]Lonberg，N.and D.Huszar(1995).“Human antibodies from transgenic mice.”Int Rev Immunol 13(1)：65-93.
[00310]Ma，B.Y.，S.A.Mikolajczak，et al.(2005).“The expression and theregulatory role of OX40 and 4-1BB heterodimer in activated human Tcells.”Blood 106(6)：2002-10.
[00311]Mallett，S.，S.Fossum，et al.(1990).“Characterization of the MRC OX40antigen of activated CD4 positive T lymphocytes--a molecule relatedto nerve growth factor receptor.”Embo J 9(4)：1063-8.
[00312]Maxwell，J.R.，C.Ruby，et al.(2002).“Contrasting the roles of costimulationand the natural adjuvant lipopolysaccharide during the induction of Tcell immunity.”J Immunol 168(9)：4372-81.
[00313]Maxwell，J.R.，A.Weinberg，et al.(2000).“Danger and OX40receptorsignaling synergize to enhance memory T cell survival by inhibjtingperipheral deletion.”J Immunol 164(1)：107-12.
[00314]Pakala，S.V.，P.Bansal-Pakala，et al.(2004).“Prevention of diabetes in NODmice at a late stage by targeting OX40/OX40 ligand interactions.”Eur J Immunol34(11)：3039-46.
[00315]Paterson，D.J.，W.A.Jefferjes，et al.(1987).“Antigens of activated rat Tlymphocytes including a molecule of 50,000Mr detected only on CD4positive T blasts.”Mol Immunol 24(12)：1281-90.
[00316]Rogers，P.R.and M.Croft(2000).“CD28，Ox-40，LFA-1，and CD4modu lation of Th1/Th2 differentiation is directly dependent on thedose of antigen.”J Immunol 164(6)：2955-63.
[00317]Rogers，P.R.，J.Song，et al.(2001).“OX40 promotes Bcl-xL and Bcl-2expression and is essential for long-term survival of CD4T cells.”Immunity 15(3)：445-55.
[00318]Salek-Ardakani，S.and M.Croft(2005).“Regulation of CD4 T cell memoryby OX40(CD134).”Vaccine.
[00319]Sanchez，J.，J.Casano，et al.(2004).“Kinetic of regulatory CD25high andactivated CD 134+(OX40)T lymphocytes during acute and chronicgraft-versus-host disease after allogeneic bone.marrow.transplantation.”Br J Haematol 126(5)：697-703.
[00320]Sedy，J.R.，M.Gavrieli，et al.(2005).“B and T lymphocyte attenuatorregulates T cell activation through interaction with herpesvirus entrymediator.”Nat Immunol 6(1)：90-8.
[00321]Seko，Y.，N.Takahashi，et.al.(1999).“Expression of tumour necrosis factor(TNF)receptor/ligand superfamily co-stimulatory molecules CD40，CD30L，CD27L，and OX40L in mu rine hearts with chronic ongoingmyocarditis caused by coxsackie virus B3.”J Pathol188(4)：423-30.
[00322]
[00323]Sharpe，A.H.and G.J.Freeman(2002).“The B7-CD28 superfamily.”Nat Rev Immunol 2(2)：116-26.
[00324]Stuber，E.，M.Neurath，et al.(1995).“Cross-linking of OX40 ligand，amember of the TNF/NGF cytokine family，induces proliferation anddifferentiation in murine splenic B cells.”Immunity2(5)：507-21.
[00325]Sugamura，K.，N.Ishii，et al.(2004).“Therapeutic targeting of the effector T-cell co-stimulatory molecule OX40.”Nat Rev Immunol4(6)：420-31.
[00326]Takasawa，N.，N.Ishii，et al.(2001).“Expression of gp34(OX40 ligand)andOX40 on human T cell clones.”Jpn J Cancer Res 92(4)：377-82.
[00327]Tanaka，T.，F.Kitamura，et al.(1993).“Selective long-term elimination ofnatural killer cells in vivo by an anti-interleukin 2 receptor beta chainmonoclonal antibody in mice.”J Exp Med178(3)：1103-7.
[00328]Taylor，L.，M.Bachler，et al.(2002).“In vitro and in vivo activities of OX40(CD134)-IgG fusion protein isoforms with different levels of immune-effector functions.”J Leukoc Biol 72(3)：522-9.
[00329]Thompson，C.B.，T.Lindsten，et al.(1989).“CD28activation pathwayregulates the production of multiple T-cell-derivedlymphokines/cytokines.”Proc Natl Acad Sci U S A86(4)：1333-7.
[00330]Tittle，T.V.，A.D.Weinberg，et al.(1997).“Expression of the T-cellactivation antigen，OX-40，identifies alloreactive T cells in acute graft-versus-host disease.”Blood 89(12)：4652-8.
[00331]Totsuka，T.，T.Kanai，et al.(2003).“Therapeutic effect of anti-OX40L andanti-TNF-alpha MAbs in a murine model of chronic colitis.”Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 284(4)：G595-603.
[00332]Tsukada，N.，H.Akiba，et al.(2000).“Blockade of CD134(OX40)-CD134Linteraction ameliorates lethal acute graft-versus-host disease in amurine model of allogeneic bone marrow transplantation.”Blood95(7)：2434-9.
[00333]Ukyo，N.，T.Hori，et al.(2003).“Costimulation through OX40 is crucial forinduction of an alloreactive human T-cell response.”Immunology109(2)：226-31.
[00334]Walker，L.S.，A.Gulbranson-Judge，et al.(1999).“Compromised OX40function in CD28-deficient mice is linked with failure to develop CXCchemo kine receptor 5-positive CD4 cells and germinal centers.”J Exp Med190(8)：1115-22.
[00335]Watanabe，T.，J.Masuyama，et al.(2006).“CD52is a novel costimulatorymolecule for induction of CD4+ regulatory T cells.”Clin lmmunol120：247-259.
[00336]Weatherill，A.R.，J.R.Maxwell，et al.(2001).“OX40 ligation enhances cellcycle turnover of Ag-activated CD4T cells in vivo.”Cell Immunol209(1)：63-75.
[00337]Weinberg，A.D.(2002).“OX40：targeted immunotherapy--implications fortempering autoimmunity and enhancing vaccines.”Trends Immunol23(2)：102-9.
[00338]Weinberg，A.D.，M.Lemon，et al.(1996).“OX-40 antibody enhances forautoantigen specific V beta 8.2+T cells within the spinal cord ofLewis rats with autoimmune encephalomyelitis.”J Neurosci Res43(1)：42-9.
[00339]Weinberg，A.D.，K.W.Wegmann，et al.(1999).“Blocking OX-40/OX-40ligand interaction in vitro and in vivo leads to decreased T cell functionand amelioration of experimental allergic encephalomyelitis.”J     Immunol 162(3)：1818-26.
[00340]Zingoni，A.，T.Sornasse，et al.(2004).“Cross-talk between activated humanNK cells and CD4+T cells via OX40-OX40ligand interactions.”J Immunol 173(6)：3716-24.
[00341]WO 95/12673
       WO 95/21251

Claims (93)

1.一种特异性结合OX40胞外域氨基酸序列中的表位的分离或纯化的抗体，其中抗体包括人、人源化或嵌合抗体，并且其中抗体具有OX40拮抗活性。
2.权利要求1的抗体，其中OX40拮抗活性减少或增加了细胞因子或干扰素的产生，活化、效应、记忆或调节T细胞的生存或增殖，抗凋亡蛋白或凋亡前体蛋白的表达。
3.权利要求2的抗体，其中细胞因子选自IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-14、IL-16、IL-17、IL-23、IL-26、TNF-α、干扰素γ和GM-CSF。
4.权利要求2的抗体，其中抗凋亡蛋白或凋亡前体蛋白选自Bcl-xL、Bcl-2、Bad和Bim。
5.权利要求1的抗体，其中OX40胞外域氨基酸序列中的表位在下列序列之内：
MCVGARRLGR GPCAALLLLG LGLSTVTGLH CVGDTYPSND RCCHECRPGN
GMVSRCSRSQ NTVCRPCGPG FYNDVVSSKP CKPCTWCNLR SGSERKQLCT
ATQDTVCRCR AGTQPLDSYK PGVDCAPCPP GHFSPGDNQA CKPWTNCTLA
GKHTLQPASN SSDAICEDRD PPATQPQETQ GPPARPITVQ PTEAWPRTSQ
GPS
(SEQ ID NO：50).
6.一种特异性结合OX40胞外域氨基酸序列中的表位的分离或纯化的抗体，其中抗体包含结合由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体结合的氨基酸序列的人、人源化或嵌合抗体。
7.一种具有由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体的约1-5000倍范围内的OX40结合亲和力的分离或纯化的抗体。
8.权利要求7的抗体，其中与由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体相比，该抗体具有更大或更小的OX40结合亲和力。
9.权利要求1、6、7或8任一项的抗体，其中抗体具有由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体的约KD 10-6M-约KD 10-13M范围内的OX40结合亲和力。
10.权利要求1、6、7或8任一项的抗体，其中抗体具有由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体的结合特异性；或与由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体竞争与OX40结合。
11.权利要求1的抗体，其中抗体结合与112V8、112Y55和Y131所结合的表位相同的表位，并抑制或阻止85％或更多的OX40与OX40配体(OX40L)结合。
12.权利要求1的抗体，其中抗体由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生。
13.权利要求1、6、7或8任一项的抗体，其中如在ELISA测定法中所测定的，抗体抑制或阻止由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体与OX40结合。
14.权利要求1、6、7或8任一项的抗体，其中如在ELISA测定法中所测定的，抗体抑制至少50％的由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体与OX40结合。
15.权利要求1、6、7或8任一项的抗体，其中抗体特异性结合非T细胞上表达的OX40，任选地其中所述非T细胞选自用OX40转染的自然杀伤细胞、粒细胞、单核细胞、B细胞或非T细胞系，任选地其中所述用OX40转染的非T细胞系选自CHO细胞、L929细胞和HELA细胞。
16.权利要求1的抗体，其中抗体包含如SEQ ID NO：7-10和SEQID NO：44-49所示的成熟的重链或轻链可变区序列，或如SEQ ID NO：7-10和SEQ ID NO：44-49所示的成熟的重链或轻链可变区序列的子序列。
17.权利要求16的抗体，其中子序列选自Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、Fd、单链Fvs(scFv)、二硫键连接的Fvs(sdFv)和VL或VH。
18.权利要求16的抗体，其中如SEQ ID NO：7-10和SEQ ID NO：44-49所示的抗体成熟的重链或轻链可变区序列在恒定区、互补决定区(CDR)或构架区(FR)之内或之外具有一个或多个氨基酸取代。
19.权利要求18的抗体，其中氨基酸取代是在恒定区、互补决定区(CDR)或构架区(FR)之内或之外的保守氨基酸取代。
20.权利要求18的抗体，其中氨基酸取代包含1-3个、3-5个、5-10个或更多个氨基酸残基的氨基酸取代。
21.权利要求1、6、7或8任一项的抗体，其中抗体保留由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体的可检测活性。
22.权利要求21的抗体，其中活性包括调节T细胞增殖或生存、活化、效应、记忆或调节T细胞的数量或耗竭活化、效应、记忆或调节T细胞。
23.权利要求21的抗体，其中活性包括抑制OX40信号传导。
24.权利要求21的抗体，其中活性包括减少或耗竭特异性针对自身抗原的自身反应性T细胞的数量，任选地其中自身抗原选自髓磷脂碱蛋白、髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白、含蛋白脂质蛋白、胶原、滑膜关节组织抗原、胰岛素、谷氨酸脱羧酶、肠抗原、甲状腺抗原、组蛋白、肌肉抗原和皮肤抗原。
25.一种特异性结合OX40胞外域氨基酸序列中的表位的分离或纯化的抗体，其中抗体与如SEQ ID NO：7-10和SEQ ID NO：44-49所示的成熟的重链或轻链可变区序列的序列具有80％-85％、85％-90％、90％-95％、96％、97％、98％、99％或更多的同一性。
26.权利要求1、6、7、8或25任一项的抗体，其中抗体特异性结合活化的人T细胞，而非静息的T细胞。
27.权利要求1的抗体，其中如在ELISA测定法中所测定的，抗体并不抑制或阻止抗体L106与OX40结合。
28.权利要求1、6、7、8或25任一项的抗体，其中抗体抑制或阻止OX40配体与OX40结合。
29.权利要求1、6、7、8或25任一项的抗体，其中抗体抑制或阻止OX40配体与活化T细胞结合。
30.权利要求1、6、7、8或25任一项的抗体，其中抗体调节OX40-介导的细胞信号传导或调节OX40-介导的细胞应答。
31.权利要求1、6、7、8或25任一项的抗体，其中抗体抑制或阻止OX40-介导的细胞信号传导。
32.权利要求1、6、7、8或25任一项的抗体，其中抗体抑制或阻止OX40-介导的细胞应答。
33.权利要求32的抗体，其中OX40-介导的细胞应答包括淋巴细胞增殖、细胞因子表达、淋巴细胞生存、NF-κB活化、PKB(Akt)活性的维持或存活蛋白的增量调节。
34.权利要求1、6、7、8或25任一项的抗体，其中抗体通过自然杀伤细胞、巨噬细胞或嗜中性白细胞介导，诱导EL4-人OX40表达细胞或活化的人T细胞的溶解，其中在10μg/ml抗体下诱导的特异性细胞溶解百分数(％)为约15-75％、25-65％、或30-60％或50-100％。
35.权利要求1、6、7、8或25任一项的抗体，其中抗体减轻、减少或预防急性或慢性异种移植物宿主疾病模型中移植物抗宿主病的症状，或其中抗体使急性或慢性异种移植物宿主疾病模型中的移植物抗宿主病缓解或消退。
36.权利要求35的抗体，其中异种移植物宿主疾病模型包括在给予抗-IL2Rβ链抗体和亚致死剂量的辐射后接受人外周血单核细胞(PBMC)的免疫缺陷型(SCID)小鼠。
37.权利要求35的抗体，其中移植物抗宿主病的症状选自体重减轻，脱发，皮疹，血尿，腹水和肝、肠道、肺、皮肤中炎性细胞浸润以及死亡。
38.权利要求1、6、7、8或25任一项的抗体，其中抗体减轻、减少或预防肺、皮肤或肠中的炎症。
39.权利要求1、6、7、8或25任一项的抗体，其中抗体减轻、减少或预防自身免疫性疾病的症状。
40.权利要求39的抗体，其中自身免疫性疾病选自：类风湿性关节炎、多发性硬化、糖尿病、克罗恩氏病、炎性肠病、溃疡性结肠炎、乳糜泻、银屑病、增生性狼疮性肾炎、肉芽肿性肌病和多发性肌炎。
41.权利要求1、6、7、8或25任一项的抗体，其中OX40是人OX40。
42.权利要求1、6、7、8或25任一项的抗体，其中OX40包含序列：
MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGM
VSRCSRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDT
VCRCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQP
ASNSSDAICEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGG
RAVAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQ
ADAHSTLAKI(SEQ ID NO：49).
43.权利要求1、6、7、8或25任一项的抗体，其中抗体是单克隆或多克隆抗体。
44.权利要求1、6、7、8或25任一项的抗体，其中抗体是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD同种型。
45.权利要求1、6、7、8或25任一项的抗体，其中抗体进一步包含异源结构域。
46.一种包含权利要求1、6、7、8或25任一项的抗体和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。
47.一种编码如SEQ ID NO：7-10和SEQ ID NO：44-49所示的成熟的重链或轻链可变区序列的序列或其子序列的分离的核酸。
48.权利要求47的分离的核酸，其中序列包含SEQ ID NO：3-6和SEQ ID NO：38-43，或SEQ ID NO：3-6和SEQ ID NO：38-43的简并序列。
49.权利要求47的分离的核酸，其进一步包含表达控制序列。
50.权利要求47的分离的核酸，其进一步包含载体。
51.权利要求47的分离的核酸，其进一步包含宿主细胞。
52.一种编码具有如SEQ ID NO：7-10和SEQ ID NO：44-49所示的重链或轻链可变区序列经一个或多个氨基酸残基取代、添加或缺失的氨基酸序列的核酸，其中氨基酸序列具有针对OX40胞外域表位的结合亲和力。
53.一种编码具有如SEQ ID NO：7-10和SEQ ID NO：44-49所示的重链或轻链可变区序列经一个或多个氨基酸残基取代、添加或缺失的氨基酸序列的核酸，其中氨基酸序列具有由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体的活性。
54.一种包含由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体和有关用于将抗体给予需要用该抗体治疗的个体的说明书的试剂盒。
55.一种表达具有与由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体一样的结合特异性的抗体的分离的细胞。
56.一种用于治疗需要治疗的个体中慢性或急性免疫性疾病或病症或慢性或急性免疫性疾病或病症的症状的方法，所述方法包括给予个体能有效治疗个体中慢性或急性免疫性疾病或病症或慢性或急性免疫性疾病或病症的症状的权利要求1、6、7、8或25任一项的抗体或权利要求46的药物组合物。
57.权利要求56的方法，其中个体是慢性或急性免疫性疾病或病症的候选人或已进行慢性或急性免疫性疾病或病症治疗。
58.权利要求56的方法，其中治疗导致缓解或改善一种或多种与慢性或急性免疫性疾病或病症相关的不利症状或身体后果。
59.一种治疗移植物抗宿主病的方法，所述方法包括给予需要治疗的个体能有效治疗移植物抗宿主病的权利要求1、6、7、8或25任一项的抗体或权利要求47的药物组合物。
60.权利要求59的方法，其中个体是移植物抗宿主病的候选人或已进行移植物抗宿主病治疗。
61.权利要求59的方法，其中治疗减轻、减少或预防一种或多种与移植物抗宿主病相关的不利症状或身体后果的发作、频率、持续时间或严重性，或其中该治疗引起移植物抗宿主病的缓解或消退，或其中该治疗造成预防移植物抗宿主病。
62.权利要求61的方法，其中移植物抗宿主病的症状选自体重减轻，脱发，皮疹，血尿，腹水，肝、肠道、肺中炎性细胞浸润和死亡。
63.权利要求59的方法，其中移植物包括骨髓、造血干细胞、外周血干细胞或脐带血干细胞。
64.一种治疗移植排斥的方法，所述方法包括给予需要治疗的个体能有效治疗移植排斥的权利要求1、6、7、8或25任一项的抗体或权利要求46的药物组合物。
65.权利要求64的方法，其中个体是移植排斥的候选人或已进行移植排斥治疗。
66.权利要求64的方法，其中治疗减轻、减少或预防一种或多种与移植排斥相关的不利症状或身体后果的发作、频率、持续时间或严重性，或其中该治疗引起移植排斥的缓解或消退，或其中该治疗造成预防移植排斥。
67.权利要求66的方法，其中移植排斥的症状包括针对移植物或移植细胞的免疫应答或组织破坏。
68.权利要求64的方法，其中移植物包括肾、心、肺、皮肤、肝或胰。
69.一种减轻、减少或预防炎症的方法，所述方法包括给予需要治疗的个体能有效减轻、减少或预防炎症的发作、频率、持续时间或严重性的权利要求1、6、7、8或25任一项的抗体或权利要求46的药物组合物。
70.权利要求69的方法，其中炎症存在于肺、关节、肌肉、皮肤、中枢或末梢神经系统或肠中。
71.权利要求69的方法，其中个体是炎症的候选人或已进行炎症治疗。
72.权利要求69的方法，其中治疗导致减轻一种或多种与炎症相关的不利症状或身体后果的发作、频率、持续时间或严重性。
73.一种治疗自身免疫性疾病的方法，所述方法包括给予需要治疗的个体能有效减轻、减少或预防自身免疫性疾病症状的发作、频率、持续时间或严重性的权利要求1、6、7、8或25任一项的抗体或权利要求46的药物组合物。
74.权利要求73的方法，其中自身免疫性疾病选自：类风湿性关节炎、多发性硬化、糖尿病、克罗恩氏病、炎性肠病、溃疡性结肠炎、乳糜泻、银屑病、增生性狼疮性肾炎、肉芽肿性肌病和多发性肌炎。
75.权利要求73的方法，其中个体是自身免疫性疾病的候选人或已进行自身免疫性疾病治疗。
76.权利要求73的方法，其中治疗导致减轻、减少或预防一种或多种与自身免疫性疾病相关的不利症状或身体后果的发作、频率、持续时间或严重性。
77.一种抑制或阻止OX40-介导的细胞应答的方法，所述方法包括给予需要抑制或阻止OX40-介导的细胞应答的个体能有效抑制或阻止OX40-介导的细胞应答的权利要求1、6、7、8或25任一项的抗体或权利要求46的药物组合物。
78.权利要求77的方法，其中细胞应答包括淋巴细胞增殖、细胞因子表达或淋巴细胞生存。
79.权利要求77的方法，其中个体是OX40-介导的细胞应答的候选人或已进行OX40-介导的细胞应答治疗。
80.一种抑制或封闭OX40配体与活化T细胞结合的方法，所述方法包括给予需要封闭、抑制或阻止OX40配体与活化T细胞结合的个体能有效抑制或阻止OX40配体与活化T细胞结合的权利要求1、6、7、8或25任一项的抗体或权利要求46的药物组合物。
81.一种抑制或封闭OX40配体与OX40结合的方法，所述方法包括给予需要封闭、抑制或阻止OX40配体与OX40结合的个体能有效抑制或阻止OX40配体与OX40结合的权利要求1、6、7、8或25任一项的抗体或权利要求46的药物组合物。
82.一种调节OX40-介导的细胞信号传导的方法，所述方法包括给予需要调节OX40-介导的细胞信号传导的个体能有效调节OX40-介导的细胞信号传导的权利要求1、6、7、8或25任一项的抗体或权利要求46的药物组合物。
83.一种减少活化、效应、记忆或调节T细胞数量的方法，所述方法包括给予需要减少活化、效应、记忆或调节T细胞数量的个体足以减少活化、效应、记忆或调节T细胞数量的量的权利要求1、6、7、8或25任一项的抗体。
84.一种治疗由活化、效应、记忆或调节T细胞所引起的疾病或病症的方法，所述方法包括给予个体足以减轻、减少或预防由活化、效应、记忆或调节T细胞所引起的疾病或病症的进展，或耗竭活化、效应、记忆或调节T细胞的量的权利要求1、6、7、8或25任一项的抗体。
85.权利要求84的方法，其中疾病或病症包括：移植物抗宿主病、炎症或自身免疫性疾病。
86.权利要求56-85任一项的方法，其中个体为哺乳动物。
87.权利要求56-85任一项的方法，其中哺乳动物为人。
88.权利要求56-85任一项的方法，其中抗体局部、区域或全身性给予个体。
89.一种在异种移植物宿主疾病模型中减少血液、脾、淋巴结、肝、肺或皮肤中活化T细胞数量的方法，所述方法包括给予异种移植物宿主疾病模型足以减少血液、脾、淋巴结、肝、肺或皮肤中活化T细胞数量的量的权利要求1、6、7、8或25任一项的抗体。
90.一种产生具有OX40拮抗活性的人OX40抗体的方法，所述方法包括：
a)给予能表达人免疫球蛋白的动物缀合有人Fc重组蛋白的人OX40胞外域或活化的人T细胞；
b)筛选表达人OX40抗体的动物；
c)选择产生人OX40抗体的动物；
d)从所选择的动物中分离抗体；和
e)确定人OX40抗体是否具有OX40拮抗活性。
91.一种产生抑制或阻止OX40与OX40配体(OX40L)结合的人OX40抗体的方法，所述方法包括：
a)给予能表达人免疫球蛋白的动物缀合有人Fc重组蛋白的人OX40胞外域或活化的人T细胞；
b)筛选表达人OX40抗体的动物；
c)选择产生人OX40抗体的动物；
d)从所选择的动物中分离抗体；和
e)确定人OX40抗体是否抑制或阻止OX40与OX40配体(OX40L)结合。
92.权利要求90或91任一项的方法，其中能表达人免疫球蛋白的动物包括转基因小鼠或转基因牛。
93.一种表达下列抗体的非人转基因动物：
a)与由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体相同的抗体；
b)结合由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体所结合的OX40胞外域氨基酸序列中的表位的抗体；
c)具有由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体的约1-5000倍范围内的OX40结合亲和力的抗体；
d)具有由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体的约KD 10-6M-约KD 10-12M范围内的OX40结合亲和力的抗体；
e)具有由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体的结合特异性的抗体；或
f)与由称为112F32、112V8、112Y131、112Y55或112Z5的杂交瘤细胞系所产生的抗体竞争与OX40结合的抗体。
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Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103717263A (zh) * 2011-07-11 2014-04-09 格兰马克药品股份有限公司 结合ox40的抗体及其用途
TWI476281B (zh) * 2009-02-17 2015-03-11 Ucb Pharma Sa 具有人ｏｘ４０專一性之抗體分子
CN105483083A (zh) * 2016-01-20 2016-04-13 首都医科大学附属北京友谊医院 双阴性t细胞的转化扩增方法
CN106103486A (zh) * 2014-03-31 2016-11-09 豪夫迈·罗氏有限公司 抗ox40抗体和使用方法
CN107922912A (zh) * 2015-08-10 2018-04-17 国立大学法人富山大学 抗原特异性单克隆抗体制作方法
CN108137687A (zh) * 2015-05-29 2018-06-08 百时美施贵宝公司 抗ox40抗体及其用途
CN108623685A (zh) * 2017-03-25 2018-10-09 信达生物制药(苏州)有限公司 抗ox40抗体及其用途
CN108892726A (zh) * 2011-06-13 2018-11-27 艾比吉诺米克斯合作公司 抗psgl-1抗体及其用途
CN110078825A (zh) * 2019-01-23 2019-08-02 北京天广实生物技术股份有限公司 结合ox40的抗体及其用途
CN110467674A (zh) * 2018-05-11 2019-11-19 上海药明生物技术有限公司 抗ox40的全人抗体及其制备方法和用途
CN110573527A (zh) * 2016-12-15 2019-12-13 艾伯维生物制药股份有限公司 抗ox40抗体及其用途
WO2021238932A1 (zh) * 2020-05-26 2021-12-02 百奥泰生物制药股份有限公司 多特异性抗体及其应用
CN114380908A (zh) * 2015-10-15 2022-04-22 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 抗ox40抗体及其应用

Families Citing this family (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI461436B (zh) 2005-11-25 2014-11-21 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd 人類ｃｄ１３４（ｏｘ４０）之人類單株抗體及其製造及使用方法
RU2009135824A (ru) * 2007-02-27 2011-04-10 Дженентек, Инк. (Us) Антитела-антагонисты против ох40 и их применение в лечении воспалительных и аутоиммунных заболеваний
AR067584A1 (es) * 2007-07-20 2009-10-14 Hoffmann La Roche Un conjugado de un anticuerpo contra la cd4 y peptidos antifusogenicos
AU2014202213B2 (en) * 2007-12-14 2016-05-12 Bristol-Myers Squibb Company Binding Molecules to the Human OX40 Receptor
BRPI0820875B1 (pt) * 2007-12-14 2021-10-19 Bristol-Myers Squibb Company Molécula de ligação isolada, anticorpo monoclonal humano, composição, molécula de ácido nucleico, vetor e célula hospedeira
AU2016203429B2 (en) * 2007-12-14 2018-01-25 Bristol-Myers Squibb Company Binding Molecules to the Human OX40 Receptor
NZ629913A (en) * 2010-08-23 2016-01-29 Univ Texas Anti-ox40 antibodies and methods of using the same
JP6147670B2 (ja) * 2010-12-22 2017-06-14 テバ・ファーマシューティカルズ・オーストラリア・ピーティワイ・リミテッド 改善された半減期を有する修飾された抗体
KR101685262B1 (ko) * 2011-08-23 2016-12-21 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 항-ｏｘ４０ 항체 및 이의 사용 방법
GB201116092D0 (en) * 2011-09-16 2011-11-02 Bioceros B V Antibodies and uses thereof
UA112203C2 (uk) 2011-11-11 2016-08-10 Юсб Фарма С.А. Злитий білок біоспецифічного антитіла, який зв'язується з ox40 людини та сироватковим альбуміном людини
US10259626B2 (en) 2012-03-08 2019-04-16 Selig Sealing Products, Inc. Container sealing member with protected security component and removal tab
EP2822592B1 (en) 2012-03-08 2018-08-15 Ludwig Institute for Cancer Research Limited Tgf- 1 specific antibodies and methods and uses thereof
US9650411B2 (en) 2012-08-07 2017-05-16 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method of purifying protein
CN104968364A (zh) 2012-12-03 2015-10-07 百时美施贵宝公司 强化免疫调变性Fc融合蛋白的抗癌活性
WO2014121099A1 (en) 2013-01-31 2014-08-07 Thomas Jefferson University Agonist fusion protein for cd40 ox40 and uses thereof
RS57840B1 (sr) * 2013-03-18 2018-12-31 Biocerox Prod Bv Humanizovana anti-cd 134 (ox40) antitela i njihove upotrebe
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
RU2016142476A (ru) * 2014-03-31 2018-05-07 Дженентек, Инк. Комбинированная терапия, включающая антиангиогенезные агенты и агонисты, связывающие ох40
IL293212B2 (en) 2014-05-28 2023-12-01 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Anti-GITR antibodies and methods of using them
JP6666267B2 (ja) * 2014-05-29 2020-03-13 メディミューン，エルエルシー Ｏｘ４０ｌ融合タンパク質およびその使用
CA2957314A1 (en) 2014-08-04 2016-02-11 Baylor Research Institute Antagonistic anti-ox40l antibodies and methods of their use
TW201619200A (zh) * 2014-10-10 2016-06-01 麥迪紐有限責任公司 人類化抗－ｏｘ４０抗體及其用途
CN107207601A (zh) 2015-01-20 2017-09-26 Igm生物科学股份有限公司 肿瘤坏死因子(tnf)超家族受体结合分子及其应用
CN114504652A (zh) 2015-03-03 2022-05-17 科马布有限公司 抗体、用途和方法
US9512229B2 (en) 2015-03-03 2016-12-06 Kymab Limited Synergistic combinations of OX40L antibodies for the treatment of GVHD
CA2984794A1 (en) 2015-05-07 2016-11-10 Agenus Inc. Anti-ox40 antibodies and methods of use thereof
CN106699888B (zh) * 2015-07-28 2020-11-06 上海昀怡健康科技发展有限公司 一种pd-1抗体及其制备方法和应用
AU2016328357B2 (en) * 2015-09-22 2023-03-02 Ventana Medical Systems, Inc. Anti-OX40 antibodies and diagnostic uses thereof
CA2992863A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies specific for a costimulatory tnf receptor
MA45488A (fr) 2015-10-22 2018-08-29 Juno Therapeutics Gmbh Procédés, kits et appareil de culture de cellules
CA3007233A1 (en) 2015-12-02 2017-06-08 Agenus Inc. Antibodies and methods of use thereof
SG10201601719RA (en) 2016-03-04 2017-10-30 Agency Science Tech & Res Anti-LAG-3 Antibodies
SG10201603721TA (en) 2016-05-10 2017-12-28 Agency Science Tech & Res Anti-CTLA-4 Antibodies
WO2017220988A1 (en) 2016-06-20 2017-12-28 Kymab Limited Multispecific antibodies for immuno-oncology
CN109963871A (zh) 2016-08-05 2019-07-02 豪夫迈·罗氏有限公司 具有激动活性的多价及多表位抗体以及使用方法
WO2018041119A1 (en) 2016-08-31 2018-03-08 Beijing Biocytogen Co., Ltd Genetically modified non-human animal with human or chimeric ox40
CN107815465B (zh) 2016-08-31 2021-03-16 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用
EP3534947A1 (en) 2016-11-03 2019-09-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
MA46770A (fr) 2016-11-09 2019-09-18 Agenus Inc Anticorps anti-ox40, anticorps anti-gitr, et leurs procédés d'utilisation
CN108623686A (zh) * 2017-03-25 2018-10-09 信达生物制药(苏州)有限公司 抗ox40抗体及其用途
CN112292397B (zh) * 2017-11-24 2023-01-31 祐和医药科技(北京)有限公司 抗ox40抗体及其用途
WO2019156566A1 (en) 2018-02-12 2019-08-15 Umc Utrecht Holding B.V. Bispecific molecules comprising gamma-delta tcr and t-cell or nk cell binding domain
WO2019241730A2 (en) 2018-06-15 2019-12-19 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Increasing immune activity through modulation of postcellular signaling factors
US20210355216A1 (en) 2018-10-05 2021-11-18 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and systems for controlling the agonistic properties of antibody variable domains by light
MA55805A (fr) 2019-05-03 2022-03-09 Flagship Pioneering Innovations V Inc Métodes de modulation de l'activité immunitaire
WO2021007276A1 (en) * 2019-07-08 2021-01-14 New York University Tumor immunotherapy using sindbis viral vectors and agonist monoclonal antibodies
EP4006047A1 (en) 2019-07-31 2022-06-01 Kyowa Kirin Co., Ltd. Method for purifying antibody using adsorbent
US20230040604A1 (en) 2019-12-17 2023-02-09 Amgen Inc. Interleukin-2 in combination with tnf receptor family members for the expansion of t-regulatory cells
EP4076434A1 (en) 2019-12-17 2022-10-26 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Combination anti-cancer therapies with inducers of iron-dependent cellular disassembly
CN116096906A (zh) 2020-06-29 2023-05-09 旗舰创业创新五公司 工程化以促进萨诺传递的病毒及其在治疗癌症中的用途
US20230365709A1 (en) 2020-10-08 2023-11-16 Affimed Gmbh Trispecific binders
CN116437955A (zh) 2020-10-09 2023-07-14 协和麒麟株式会社 用于治疗ox40相关疾病的方法
JP2024508207A (ja) 2020-12-02 2024-02-26 ブイアイビー ブイゼットダブリュ がんに対する組み合わせ治療におけるｌｔｂｒアゴニスト
JP2024500847A (ja) 2020-12-18 2024-01-10 センチュリー セラピューティクス，インコーポレイテッド 適合可能な受容体特異性を有するキメラ抗原受容体システム
US20240101673A1 (en) 2021-02-03 2024-03-28 Mozart Therapeutics, Inc. Binding agents and methods of using the same
US20220325287A1 (en) 2021-03-31 2022-10-13 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Thanotransmission polypeptides and their use in treating cancer
WO2022250502A1 (en) * 2021-05-27 2022-12-01 Yuhan Corporation Ox40 agonist and use thereof
WO2022258606A1 (en) 2021-06-07 2022-12-15 Gadeta B.V. Delta T-cell or Gamma T-cell receptor chains or parts thereof that mediate an anti-tumour or anti-infective response
WO2023278641A1 (en) 2021-06-29 2023-01-05 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Immune cells engineered to promote thanotransmission and uses thereof
AU2022320948A1 (en) 2021-07-30 2024-01-18 Affimed Gmbh Duplexbodies
WO2023076876A1 (en) 2021-10-26 2023-05-04 Mozart Therapeutics, Inc. Modulation of immune responses to viral vectors
WO2023198851A1 (en) 2022-04-14 2023-10-19 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for controlling the tumor cell killing by light
WO2023227594A1 (en) 2022-05-24 2023-11-30 Gadeta Bv Novel deltat-cell receptor chains, gammat-cell receptor chains, or parts thereof
WO2023237541A1 (en) 2022-06-07 2023-12-14 Gadeta B.V. Delta t-cell or gamma t-cell receptor chains or parts thereof that mediate an anti-tumour or anti-infective response
WO2024013401A1 (en) 2022-07-15 2024-01-18 Gadeta B.V. Novel method for identifying gamma t-cell (or delta t-cell) receptor chains (or gammadelta t-cell receptors) or fragments thereof that mediate an anti-tumour or an anti-infective response
WO2024056862A1 (en) 2022-09-15 2024-03-21 Avidicure Ip B.V. Multispecific antigen binding proteins for tumor-targeting of nk cells and use thereof
WO2024077191A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Nucleic acid molecules encoding trif and additionalpolypeptides and their use in treating cancer

Family Cites Families (66)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4036945A (en) 1976-05-03 1977-07-19 The Massachusetts General Hospital Composition and method for determining the size and location of myocardial infarcts
US4331647A (en) 1980-03-03 1982-05-25 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibody fragments specific to tumor-associated markers
US4411993A (en) 1981-04-29 1983-10-25 Steven Gillis Hybridoma antibody which inhibits interleukin 2 activity
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4543439A (en) 1982-12-13 1985-09-24 Massachusetts Institute Of Technology Production and use of monoclonal antibodies to phosphotyrosine-containing proteins
EP0138854B1 (en) 1983-03-08 1992-11-04 Chiron Mimotopes Pty. Ltd. Antigenically active amino acid sequences
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
FR2562421B1 (fr) 1984-04-09 1989-02-17 Sandoz Sa Perfectionnements a la therapie par l'interleukine
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US4902614A (en) 1984-12-03 1990-02-20 Teijin Limited Monoclonal antibody to human protein C
US4975282A (en) 1985-06-26 1990-12-04 The Liposome Company, Inc. Multilamellar liposomes having improved trapping efficiencies
EP0225130B1 (en) 1985-11-22 1991-10-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Liposome composition
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
JP2666345B2 (ja) 1987-04-16 1997-10-22 武田薬品工業株式会社 リポソーム製剤およびその製造法
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5273876A (en) 1987-06-26 1993-12-28 Syntro Corporation Recombinant human cytomegalovirus containing foreign gene
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
JPH04503306A (ja) 1989-02-01 1992-06-18 ザ・ジェネラル・ホスピタル・コーポレーション 単純ヘルペスウイルス１型発現ベクター
US5665577A (en) 1989-02-06 1997-09-09 Dana-Farber Cancer Institute Vectors containing HIV packaging sequences, packaging defective HIV vectors, and uses thereof
US5413923A (en) 1989-07-25 1995-05-09 Cell Genesys, Inc. Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
ATE356869T1 (de) 1990-01-12 2007-04-15 Amgen Fremont Inc Bildung von xenogenen antikörpern
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
EP1285967A3 (en) 1990-09-21 2005-03-02 Chiron Corporation Human retroviral packaging cell line
JP3547129B2 (ja) 1991-02-19 2004-07-28 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 変更宿主域を有するウィルス粒子
GB9105383D0 (en) 1991-03-14 1991-05-01 Immunology Ltd An immunotherapeutic for cervical cancer
EP0519596B1 (en) 1991-05-17 2005-02-23 Merck & Co. Inc. A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5962406A (en) 1991-10-25 1999-10-05 Immunex Corporation Recombinant soluble CD40 ligand polypeptide and pharmaceutical composition containing the same
WO1993011236A1 (en) 1991-12-02 1993-06-10 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
WO1994012629A1 (en) 1992-12-02 1994-06-09 Baylor College Of Medicine Episomal vectors for gene therapy
US5821332A (en) 1993-11-03 1998-10-13 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Receptor on the surface of activated CD4+ T-cells: ACT-4
WO1995013377A1 (en) 1993-11-12 1995-05-18 Case Western Reserve University Episomal expression vector for human gene therapy
US5759546A (en) 1994-02-04 1998-06-02 Weinberg; Andrew D. Treatment of CD4 T-cell mediated conditions
US5928944A (en) 1994-02-04 1999-07-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of adenoviral-medicated cell transfection
US6242566B1 (en) * 1994-02-10 2001-06-05 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Ligand (ACT-4-L) to a receptor on the surface of activated CD4+ T-cells
US5731172A (en) 1994-03-09 1998-03-24 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Ltd. Recombinant adenovirus and process for producing the same
US5604090A (en) 1994-06-06 1997-02-18 Fred Hutchinson Cancer Research Center Method for increasing transduction of cells by adeno-associated virus vectors
US5693508A (en) 1994-11-08 1997-12-02 Chang; Lung-Ji Retroviral expression vectors containing MoMLV/CMV-IE/HIV-TAR chimeric long terminal repeats
JP3770333B2 (ja) 1995-03-15 2006-04-26 大日本住友製薬株式会社 組換えｄｎａウイルスおよびその製造方法
AU5632296A (en) 1995-04-27 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
WO1996034096A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
US6001358A (en) 1995-11-07 1999-12-14 Idec Pharmaceuticals Corporation Humanized antibodies to human gp39, compositions containing thereof
US5861397A (en) 1996-10-03 1999-01-19 Vical Incorporated Piperazine based cytofectins
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
WO1998024893A2 (en) 1996-12-03 1998-06-11 Abgenix, Inc. TRANSGENIC MAMMALS HAVING HUMAN IG LOCI INCLUDING PLURAL VH AND Vλ REGIONS AND ANTIBODIES PRODUCED THEREFROM
US6312700B1 (en) * 1998-02-24 2001-11-06 Andrew D. Weinberg Method for enhancing an antigen specific immune response with OX-40L
GB9809951D0 (en) * 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
KR100857943B1 (ko) 2000-11-30 2008-09-09 메다렉스, 인코포레이티드 인간 항체의 제조를 위한 형질전환 트랜스염색체 설치류
CA2508763C (en) 2001-05-11 2012-01-24 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Human antibody producing mouse and method for producing human antibody using the same
PL376536A1 (pl) * 2002-08-28 2006-01-09 Immunex Corporation Kompozycje i sposoby leczenia chorób układu sercowo-naczyniowego
NZ581541A (en) * 2002-10-17 2011-07-29 Genmab As Human monoclonal antibodies against CD20
US20060002929A1 (en) * 2004-03-23 2006-01-05 Khare Sanjay D Monoclonal antibodies
TWI461436B (zh) * 2005-11-25 2014-11-21 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd 人類ｃｄ１３４（ｏｘ４０）之人類單株抗體及其製造及使用方法

Cited By (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI476281B (zh) * 2009-02-17 2015-03-11 Ucb Pharma Sa 具有人ｏｘ４０專一性之抗體分子
US11897964B2 (en) 2011-06-13 2024-02-13 Altrubio Inc. Anti-PSGL-1 antibodies and uses thereof
CN108892726A (zh) * 2011-06-13 2018-11-27 艾比吉诺米克斯合作公司 抗psgl-1抗体及其用途
CN107915775A (zh) * 2011-07-11 2018-04-17 格兰马克药品股份有限公司 结合ox40的抗体及其用途
CN107915775B (zh) * 2011-07-11 2022-07-12 伊克诺斯科学公司 结合ox40的抗体及其用途
CN103717263A (zh) * 2011-07-11 2014-04-09 格兰马克药品股份有限公司 结合ox40的抗体及其用途
CN106103486B (zh) * 2014-03-31 2020-04-21 豪夫迈·罗氏有限公司 抗ox40抗体和使用方法
CN106103486A (zh) * 2014-03-31 2016-11-09 豪夫迈·罗氏有限公司 抗ox40抗体和使用方法
CN108137687A (zh) * 2015-05-29 2018-06-08 百时美施贵宝公司 抗ox40抗体及其用途
CN108137687B (zh) * 2015-05-29 2021-10-29 百时美施贵宝公司 抗ox40抗体及其用途
CN107922912A (zh) * 2015-08-10 2018-04-17 国立大学法人富山大学 抗原特异性单克隆抗体制作方法
CN114380908A (zh) * 2015-10-15 2022-04-22 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 抗ox40抗体及其应用
CN105483083B (zh) * 2016-01-20 2018-10-23 北京医明佳和生物科技有限公司 双阴性t细胞的转化扩增方法
CN105483083A (zh) * 2016-01-20 2016-04-13 首都医科大学附属北京友谊医院 双阴性t细胞的转化扩增方法
CN110573527A (zh) * 2016-12-15 2019-12-13 艾伯维生物制药股份有限公司 抗ox40抗体及其用途
CN108623685A (zh) * 2017-03-25 2018-10-09 信达生物制药(苏州)有限公司 抗ox40抗体及其用途
CN108623685B (zh) * 2017-03-25 2022-07-01 信达生物制药(苏州)有限公司 抗ox40抗体及其用途
CN110467674A (zh) * 2018-05-11 2019-11-19 上海药明生物技术有限公司 抗ox40的全人抗体及其制备方法和用途
CN110078825A (zh) * 2019-01-23 2019-08-02 北京天广实生物技术股份有限公司 结合ox40的抗体及其用途
WO2021238932A1 (zh) * 2020-05-26 2021-12-02 百奥泰生物制药股份有限公司 多特异性抗体及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
HUE037642T2 (hu) 2018-09-28
WO2007062245A3 (en) 2007-12-06
EP3345927B9 (en) 2023-04-12
DK3345927T3 (da) 2023-03-27
KR101340699B1 (ko) 2013-12-12
PL1951760T3 (pl) 2017-02-28
EP3345927A1 (en) 2018-07-11
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