ES2602263T3 - Anticuerpo monoclonal humano para CD134 (OX40) humana y procedimientos de preparación y utilización del mismo - Google Patents

Anticuerpo monoclonal humano para CD134 (OX40) humana y procedimientos de preparación y utilización del mismo Download PDF

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Abstract

Anticuerpo aislado o purificado que se une específicamente a un epítopo en una secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de OX40, en el que el anticuerpo es producido por una estirpe celular de hibridoma indicada como: 112V8, depositada como ATCC nº PTA-7219, o 112Y131, depositada como ATCC nº PTA-7218, o 112Y55, depositada como ATCC nº PTA-7220, o un fragmento del mismo seleccionado de entre Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, Fvs monocatenarios (scFv), Fvs unidos por disulfuro (sdFv).

Description

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DESCRIPCION
Anticuerpo monoclonal humano para CD134 (OX40) humana y procedimientos de preparacion y utilizacion del mismo.
Introduccion
El sistema inmunitario esta compuesto por multiples tipos celulares que funcionan protegiendo al cuerpo frente a las enfermedades infecciosas. Esto depende del reconocimiento de los antfgenos foraneos y de la capacidad de distinguir los propios de los extranos. En algunos casos, se rompe la barrera entre propios y extranos, conduciendo a la destruccion por el propio sistema inmunitario. Estas respuestas autoinmunitarias pueden conducir a enfermedades debilitantes, tales como la diabetes, la esclerosis multiple y la enfermedad intestinal inflamatoria. Uno de los principales mediadores de estas respuestas autoinmunitarias es el linfocito T o celula T. Normalmente las celulas T son tolerantes a los autoantfgenos pero en varios trastornos autoinmunitarias se pierde esta tolerancia y las celulas T elicitan respuestas inmunitarias contra los tejidos sanos. La eliminacion de las celulas T autoinmunitarias o el bloqueo de la activacion o supervivencia de las mismas mejora los sfntomas de la enfermedad. Sin embargo, esta eliminacion generica de las celulas T o del bloqueo de la activacion de las mismas conduce a inmunosupresion en la que el paciente resulta altamente susceptible a los agentes infecciosos. Se requieren nuevas terapias con diana especfficamente en las celulas T efectoras y que reduzcan exclusivamente las celulas T autorreactivas.
Sumario
La presente invencion proporciona:
[1] Un anticuerpo aislado o purificado que se une especfficamente a un epftopo en una secuencia de aminoacidos del dominio extracelular de OX40, en el que el anticuerpo es producido por una estirpe celular de hibridoma denominada:
112V8, depositada como ATCC n° PTA-7219, o 112Y131, depositada como ATCC n° PTA-7218, o 112Y55, depositada como ATCC n° PTA-7220,
o un fragmento de las mismas seleccionado de entre Fab, Fab', F(ab') 2, Fv, Fd, Fv de cadena sencilla (scFv) o Fv unidos por disulfuro (sdFv).
[2] Un anticuerpo aislado o purificado que se une especfficamente a un epftopo en una secuencia de aminoacidos del dominio extracelular de OX40, en el que el anticuerpo comprende:
(a) la secuencia de region variable de cadena pesada madura mostrada en SEC ID n° 9 y la secuencia de region variable de cadena ligera madura mostrada en SEC ID n° 10, o
(b) la secuencia de region variable de cadena pesada madura mostrada en la SEC ID n° 44 y la secuencia de region variable de cadena ligera madura mostrada en la SEC ID n° 45, o
(c) la secuencia de region variable de cadena pesada madura mostrada en la SEC ID n° 46 y la secuencia de region variable de cadena ligera madura mostrada en la SEC ID n° 47,
o un fragmento de la misma seleccionado de entre Fab, Fab', F(ab') 2, Fv, Fd, Fv de cadena sencilla (scFv) o Fv unido por disulfuro (sdFv).
[3] Un anticuerpo aislado o purificado que se une especfficamente a un epftopo en una secuencia de aminoacidos del dominio extracelular de OX40, en el que el anticuerpo comprende una region variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos entre el aminoacido en la posicion 20 de SEC ID n° 9 y el aminoacido en la posicion 141 de SEC ID n° 9 y una region variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos entre el aminoacido en la posicion 21 de SEC ID n° 10 y el aminoacido en la posicion 129 de SEC ID n° 10,
o un fragmento de la misma seleccionado de entre Fab, Fab', F(ab') 2, Fv, Fd, Fv de cadena sencilla (scFv) o Fv unido por disulfuro (sdFv).
[4] Un anticuerpo aislado o purificado que se une especfficamente a un epftopo en una secuencia de aminoacido del dominio extracelular de OX40, en el que el anticuerpo comprende una region variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos entre el aminoacido en la posicion 20 de SEC ID n° 44 y el
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aminoacido en la posicion 136 de SEC ID n° 44 y una region variable de cadena ligera que comprende una
secuencia de aminoacidos entre el aminoacido en la posicion 21 de SEC ID n° 45 y el aminoacido en la posicion
127 de SEC ID n° 45,
o un fragmento de la misma seleccionado de entre Fab, Fab', F(ab') 2, Fv, Fd, Fv de cadena sencilla (scFv) o Fv unido por disulfuro (sdFv).
[5] Un anticuerpo aislado o purificado que se une especfficamente a un epftopo en una secuencia de aminoacido
del dominio extracelular de OX40, en el que el anticuerpo comprende una region variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos entre el aminoacido en la posicion 21 de SEC ID n° 46 y el aminoacido en la posicion 136 de SEC ID n° 46 y una region variable de cadena ligera que comprende una
secuencia de aminoacidos entre el aminoacido en la posicion 21 de SEC ID n° 47 y el aminoacido en la posicion
127 de SEC ID n° 47,
o un fragmento de la misma seleccionado de entre Fab, Fab', F(ab') 2, Fv, Fd, Fv de cadena sencilla (scFv) o Fv unido por disulfuro (sdFv).
[6] Un anticuerpo aislado o purificado que se une especfficamente a un epftopo en una secuencia de aminoacido del dominio extracelular de OX40, en el que el anticuerpo comprende un anticuerpo humano, humanizado o hfbrido y en el que el anticuerpo presenta actividad de antagonista de OX40, y en el que el anticuerpo compite con un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112V8, depositada como ATCC n° PTA-7219, 112Y131, depositada como ATCC n° PTA-7218, o 112Y55 depositada como ATCC n° PTA-7220, para la union a OX40,
o un fragmento de la misma seleccionado de entre Fab, Fab', F(ab') 2, Fv, Fd, Fv de cadena sencilla (scFv) o Fv unido por disulfuro (sdFv).
[7] Un anticuerpo aislado o purificado que se une especfficamente a un epftopo en una secuencia de aminoacido del dominio extracelular de OX40, en el que el anticuerpo se une al epftopo de la secuencia de aminoacidos del dominio extracelular de OX40 al que se une el anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112V8, depositada como ATCC n° PTA-7219, 112Y131, depositada como ATCC n° PTA-7218, o 112Y55 depositada como ATCC n° PTA-7220,
o un fragmento de la misma seleccionado de entre Fab, Fab', F(ab') 2, Fv, Fd, Fv de cadena sencilla (scFv) o Fv unido por disulfuro (sdFv).
[8] Una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo segun cualquiera de entre [1] a [7] y un portador o excipiente farmaceuticamente aceptable.
[9] Un acido nucleico aislado que codifica una secuencia de region variable de cadena pesada madura tal como se muestra en cualquiera de entre SEC ID n° 9, n° 44 o n° 46 y una secuencia de region variable de cadena ligera madura tal como se muestra en cualquiera de entre SEC ID n° 10, n° 45 o n° 47, en la que la secuencia comprende:
(a) SEC ID n° 5 y SEC ID n° 6 o una secuencia degenerada de las mismas, o
(b) SEC ID n° 38 y SEC ID n° 39 o una secuencia degenerada de las mismas, o
(c) SECID n° 40 y SEC ID n° 41 o una secuencia degenerada de las mismas.
[10] Un acido nucleico aislado que codifica el anticuerpo o fragmento de cualquiera de entre [1] y [7].
[11] El acido nucleico aislado de [10], en el que el acido nucleico codifica una secuencia de una region variable de cadena pesada madura o una region variable de cadena ligera madura tal como se muestra en cualquier de entre SEC ID n° 7 a n° 10 o n° 44 a n° 49.
[12] El acido nucleico aislado segun cualquiera de entre [9] y [11], que comprende ademas una secuencia de control de la expresion.
[13] Un vector que comprende el acido nucleico segun cualquiera de entre [9] y [12].
[14] Una celula hospedadora que comprende los acidos nucleicos aislados segun cualquiera de entre [9] y [12] o el vector segun la reivindicacion 13.
[15] Un kit que comprende el anticuerpo o fragmento segun cualquiera de entre [1] y [7], e instrucciones para administrar el anticuerpo en un sujeto que necesita de tratamiento con el anticuerpo.
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[16] Un procedimiento para producir un anticuerpo anti-OX40 mediante la utilizacion de la celula hospedadora de [14].
La invencion proporciona anticuerpos aislados o purificados que se unen espedficamente a un epttopo en una secuencia de aminoacidos del dominio extracelular de OX40 (por ejemplo la SEC ID n° 51). Entre los anticuerpos se incluyen anticuerpos humanos, humanizados e dbridos que se unen a una secuencia de OX40 de mairnfero (por ejemplo de primate o de ser humano) (por ejemplo la SEC ID n° 50). Entre los anticuerpos se incluyen ademas aquellos que presentan actividad antagonista de OX40. Entre los anticuerpos se incluyen ademas aquellos que presentan actividad agonista de OX40.
Un anticuerpo indicado en la presente memoria puede presentar actividad antagonista de OX40 y reduce o incrementa la produccion de una citocina o un interferon, la supervivencia o la proliferacion de celulas T efectoras, de memoria o reguladoras activadas, la expresion de una protema antiapoptotica o proapoptotica. en aspectos no limitativos particulares, se selecciona una citocina de entre IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-14, IL-16, IL-17, IL-23, IL-26, FNT-a, interferon y y GM-CSF y una protema antiapoptotica o proapoptotica se selecciona de entre Bcl- xL, Bcl-2, Bad y Bim.
En otras formas de realizacion particulares, los anticuerpos de OX40 son producidos por una estirpe celular de hibridoma denominada como 11 2f32 (ATCC n° PTA-7217, depositada el 17 de noviembre de 2005), 112V8 (ATCC n° PTA-7219, depositada el 17 de noviembre de 2005), 112Y55 (ATCC n° PTA-7220, depositada el 17 de noviembre de 2005), 112Y131 (ATCC n° PTA-7218, depositada el 17 de noviembre de 2005) y 112Z5 (ATCC n° PTA-7216, depositado el 17 de noviembre de 2005). Los anticuerpos de OX40 indicados en la presente memoria pueden unirse a una secuencia de aminoacidos a la que se une el anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5, presentan una afinidad de union a OX40 comprendida entre aproximadamente 1 y 5.000 veces la de un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 11 2v8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5, presenta una afinidad de union para OX40 superior o inferior que un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5, presenta una afinidad de union a OX40 comprendida entre aproximadamente KD 10-6 M y aproximadamente KD 10-13 M de un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5, presenta la especificidad de union de un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5, compite con un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5 para la union a OX40, inhibe o evita la union de un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5 a OX40, segun se determino en un ensayo ELISA (por ejemplo inhibe por lo menos 50% de la union de un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5 a OX40) o se une al mismo epftopo que 112V8, 112Y55 e Y131, e inhibe o evita la union de OX40 a ligandos de OX40 (OX40L) (por ejemplo en 85% o mas).
Entre los anticuerpos adicionalmente se incluyen los que se unen espedficamente a OX40 expresado sobre las celulas. En formas de realizacion particulares, el anticuerpo se une espedficamente a OX40 expresado sobre celulas no T (por ejemplo celulas asesinas naturales, granulocitos, monocitos o celulas B), o lmeas celulares transfectadas con OX40 (por ejemplo celulas CHO, celulas L929 o celulas HeLa). En un aspecto particular, el anticuerpo se une espedficamente a celulas T humanas activadas, no celulas T en reposo.
Entre los anticuerpos se incluyen secuencias de region variable de cadena pesada o ligera madura, por ejemplo tal como se muestra en SEC ID n° 7 a n° 10 y SEC ID n° 44 a n° 49. Entre los anticuerpos se incluyen ademas formas modificadas y variantes, tales como sustituciones dentro o fuera de una region constante, una region determinante de complementariedad (RDC) o un anticuerpo de region de marco (RM) de una secuencia de region variable de cadena pesada o ligera madura, por ejemplo tal como se muestra en SEC ID n° 7 a n° 10 y SEC ID n° 44 a n° 49. Entre las sustituciones se incluyen sustituciones conservadoras de aminoacidos. Entre las sustituciones se incluyen sustituciones de aminoacidos de entre 1 y 3, de entre 3 y 5, de entre 5 y 10 o mas residuos aminoacidos. Un anticuerpo puede presentar una identidad de 80% a 85%, de 85% a 90%, de 90% a 95%, de 96%, de 97%, 98%, de 99% o mas respecto a una secuencia de una region variable de cadena pesada o ligera madura tal como se muestra en SEC ID n° 7 a n° 10 y SEC ID n° 44 a n° 49.
Los anticuerpos incluyen ademas subsecuencias de una secuencia de region variable de cadena pesada o ligera madura, por ejemplo tal como se muestra en SEC ID n° 7 a n° 10 y SEC ID n° 44 a n° 49. En aspectos particulares, se selecciona una subsecuencia de entre Fab, Fab', F(ab') 2, Fv, Fd, Fv de cadena sencilla (scFv), Fv unido por disulfuro (sdFv) y Vl o Vh.
Los anticuerpos incluyen ademas dominios heterologos. En aspectos particulares, entre los dominios heterologos se incluyen una etiqueta, un marcaje detectable o un agente citotoxico.
Los anticuerpos modificados y variantes, tales como sustituciones, subsecuencias y adiciones pueden conservar una actividad detectable de n anticuerpo OX40 tal como se indica en la presente memoria. Un anticuerpo modificado
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puede conservar una actividad detectable de un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5. Un anticuerpo modificado puede modular la expansion o supervivencia de las celulas T, o el numero de celulas T efectoras, de memoria o reguladoras activadas, o eliminar las celulas T efectoras, de memoria o reguladoras activadas. Un anticuerpo modificado puede inhibir la senalizacion de OX40 o reducir o eliminar el numero de celulas T autorreactivas especfficas para un autoantfgeno (por ejemplo un autoantfgeno tal como la protefna basica de mielina, la glucoprotefna de mielina del oligodendrocito, la protefna del proteolfpido, el colageno, antfgenos del tejido articular sinovial, la insulina, acido glutamico descarboxilasa, antfgenos intestinales, antfgenos del tiroides, protefnas histonas, antfgenos musculares y antfgenos de la piel).
Entre los anticuerpos se incluyen ademas aquellos que compiten o no compiten con la union de un anticuerpo L106 a OX40. Algunos anticuerpos no inhiben o evitan la union del anticuerpo L106 a OX40, determinada mediante un ensayo ELISA.
Entre los anticuerpos se incluyen ademas los que afectan a una funcion o actividad de OX40. En formas de realizacion particulares, un anticuerpo puede inhibir o evitar la union de ligando de OX40 a OX40, inhibe o evita la union de ligando de OX40 a celulas T activadas, modula una respuesta celular mediada por OX40 o la senalizacion celular mediada por OX40 (por ejemplo inhibe o bloquea). En aspectos particulares, una respuesta celular mediada por OX40 puede comprende la proliferacion de linfocitos, la expresion de citocinas, la supervivencia de linfocitos, la activacion de NF-kB, el mantenimiento de actividad de PKB (Akt) o la regulacion positiva de la survivina. En formas de realizacion adicionales, un anticuerpo puede inducir la lisis de celulas EL4 expresantes de OX40 humano o celulas T humanas activadas mediadas por celulas asesinas naturales, macrofagos o neutrofilos, por ejemplo el porcentaje (%) de lisis celular especffica inducida con una concentracion de 10 pg/ml de anticuerpo es de aproximadamente 15% a 75%, de 25% a 65%, o de 30% a 60%, o de 50% a 100%.
Entre los anticuerpos se incluyen ademas aquellos que presentan una funcion o actividad in vivo. En formas de realizacion particulares, un anticuerpo puede reducir, disminuir o bloquear un sfntoma de enfermedad de injerto contra huesped en un modelo de enfermedad de xenoinjerto-huesped aguda o cronica (por ejemplo ratones inmunodeficientes (SCID) que han recibido celulas mononucleares de sangre periferica (CMSP) humanas tras la administracion de anticuerpo anti-IL2R cadena beta y una dosis subletal de irradiacion). En aspectos particulares, un sfntoma de enfermedad de injerto contra huesped puede ser la perdida de peso, la perdida de pelo, erupciones en la piel, hematuria, hidroperitoneo e infiltrados celulares inflamatorios en el hfgado, tracto intestinal, pulmon o la piel, o la muerte.
En formas de realizacion adicionales, un anticuerpo puede reducir, disminuir o evita la inflamacion en el pulmon, la piel o el intestino, o reduce, disminuye o evita un sfntoma de un trastorno autoinmunitario. En aspectos particulares, un anticuerpo puede reducir o evitar un sfntoma de la artritis reumatoide, la esclerosis multiple, la diabetes, la enfermedad de Crohn, la enfermedad intestinal inflamatoria, la colitis ulcerosa, la enfermedad celiaca, la soriasis, la nefritis del lupus proliferativa, la miopatfa granulomatosa o la polimiositis.
Entre los anticuerpos se incluyen anticuerpos monoclonales y policlonales, cualesquiera isotipos o subclases de los mismos. En aspectos particulares, el anticuerpo puede ser de isotipo IgG (por ejemplo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4), IgA, IgM, IgE o IgD.
Tambien pueden incluirse anticuerpos en composiciones farmaceuticas. En una forma de realizacion, un anticuerpo incluye un portador o excipiente farmaceuticamente aceptable.
Los anticuerpos pueden estar codificados por secuencias de acidos nucleicos. En una forma de realizacion, un acido nucleico codifica una secuencia de region variable de cadena pesada o ligera madura, por ejemplo tal como se muestra en SEC ID n° 7 a n° 10 y SEC ID n° 44 a n° 49, o una subsecuencia de la misma. En aspectos particulares, entre las secuencias de acidos nucleicos se incluyen SEC ID n° 3 a n° 6 y SEC ID n° 38 a n° 43, o secuencias degeneradas con respecto a SEC ID n° 3 a n° 6 y SEC ID n° 38 a n° 43. Un acido nucleico indicado en la presente memoria puede codificar una secuencia de aminoacidos que presenta uno o mas residuos aminoacidos sustituidos, anadidos o delecionados de secuencia de region variable de cadena pesada o aligera, tal como se muestra en SEC ID n° 7 a n° 10 y SEC ID n° 44 a n° 49. Un acido nucleico que codifica una secuencia de aminoacidos que presenta uno o mas residuos aminoacidos sustituidos, anadidos o delecionados de secuencia de region variable de cadena pesada o ligera, tal como se muestra en SEC ID n° 7 a n° 10 y SEC ID n° 44 a n° 49, puede presentar una actividad de un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5 (por ejemplo presenta afinidad de union para un epftopo del dominio extracelular de OX40). En aspectos particulares todavfa adicionales, la secuencia de acidos nucleicos incluye una secuencia de control de la expresion o un vector.
Los anticuerpos pueden ser producidos por celulas hospedadoras y celulas aisladas. En formas de realizacion particulares, una celula hospedadora o aislada es una celula de hibridoma o una celula CHO. En una forma de realizacion particular adicional, una celula aislada expresa un anticuerpo que presenta especificidad de union como anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 11 2y 131, 112Y55 o 112Z5.
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La exposicion proporciona kits. En formas de realizacion particulares, un kit incluye un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5, e instrucciones para administrar el anticuerpo en un sujeto que requiere tratamiento con el anticuerpo.
La exposicion proporciona procedimientos in vivo, incluyendo procedimientos de tratamiento y terapeuticos. Un procedimiento para tratar una enfermedad o trastorno inmunitario cronico o agudo, o un sfntoma de una enfermedad o trastorno inmunitario cronico o agudo en un sujeto que requiere tratamiento puede incluir la administracion en el sujeto de un anticuerpo o de una composicion farmaceutica eficaz para tratar la enfermedad o trastorno inmunitario cronico o agudo, o un sfntoma de la enfermedad o trastorno inmunitario cronico o agudo en el sujeto. El tratamiento resulta en el alivio o mejora de uno o mas sfntomas adversos o consecuencias ffsicas asociadas a una enfermedad o trastorno inmunitario cronico o agudo.
Un procedimiento para tratar una enfermedad de injerto contra el huesped puede incluir la administracion en el sujeto que requiere de tratamiento de un anticuerpo o una composicion farmaceutica eficaz para tratar la enfermedad del injerto contra el huesped. El tratamiento puede reducir, disminuir o impedir la aparicion, frecuencia, duracion o gravedad de uno o mas sfntomas o consecuencias ffsicas adversas asociadas a la enfermedad del injerto contra el huesped (por ejemplo la perdida de peso, la perdida de pelo, erupciones cutaneas, hematuria, hidroperitoneo, infiltrados celulares inflamatorios en el hfgado, tracto intestinal o pulmon, o la muerte), resulta en una remision o regresion de la enfermedad del injerto contra el huesped, o resulta en que se evita la enfermedad del injerto contra el huesped. En aspectos adicionales, un injerto puede incluir medula osea, celulas madre hematopoyeticas, celulas madre de sangre periferica o celulas madre de sangre del cordon.
Un procedimiento para tratar el rechazo del trasplante puede incluir la administracion en un sujeto que requiere de tratamiento de un anticuerpo o composicion farmaceutica eficaz para tratar el rechazo del trasplante. El tratamiento puede reducir o impedir la aparicion, frecuencia, duracion o gravedad de uno o mas sfntomas o consecuencias ffsicas adversos asociadas al rechazo del trasplante (por ejemplo una respuesta inmunitaria contra el trasplante o la destruccion de celulas o tejido del trasplante), resulta en una remision o regresion del rechazo del trasplante, o resulta en el bloqueo del rechazo del trasplante. Un trasplante puede incluir celulas, tejido u organo de rinon, corazon o pancreas.
Un procedimiento para reducir, disminuir o bloquear la inflamacion puede incluir la administracion en un sujeto que requiere del tratamiento de un anticuerpo o composicion farmaceutica eficaz para reducir, disminuir o impedir la aparicion, frecuencia, duracion o gravedad de la inflamacion. La inflamacion puede encontrarse presente en el pulmon, articulaciones, musculos, piel, sistema nervioso central o periferico, o intestino. Un tratamiento puede resultar en la reduccion de la aparicion, frecuencia, duracion o gravedad de uno o mas sfntomas o consecuencias ffsicas adversos asociados a inflamacion.
Un procedimiento para tratar un trastorno autoinmunitario puede incluir administrar en el sujeto que requiere de un tratamiento un anticuerpo o composicion farmaceutica eficaz para reducir, disminuir o impedir la aparicion, frecuencia, duracion o gravedad de un sfntoma de un trastorno autoinmunitario. El trastorno autoinmunitario puede incluir artritis reumatoide, esclerosis multiple, diabetes, enfermedad de Crohn, enfermedad intestinal inflamatoria, colitis ulcerosa, enfermedad celfaca, soriasis, nefritis lupica proliferativa, miopatfa granulomatosa o polimiositis. Un tratamiento puede resultar en la reduccion, disminucion o bloqueo de la aparicion, frecuencia, duracion o gravedad de uno o mas sfntomas o consecuencias ffsicas adversos asociados a un trastorno autoinmunitario.
Entre los procedimientos adicionales que pueden resultar en el tratamiento o la terapia, al ponerlos en practica in vivo, se incluyen la modulacion de la actividad o funcion de OX40. Un procedimiento para inhibir o bloquear una respuesta celular mediada por OX40 puede incluir la administracion en un sujeto que requiere de la inhibicion o bloqueo de una respuesta celular mediada por OX40 de un anticuerpo o composicion farmaceutica eficaz para inhibir o bloquear una respuesta celular mediada por OX40 (por ejemplo la proliferacion de linfocitos, la expresion de citocinas o la supervivencia de los linfocitos). Un procedimiento para inhibir o bloquear la union de un ligando de OX40 a celulas T activadas incluye la administracion en el sujeto que requiere el bloqueo, inhibicion o prevencion de la union de un ligando de OX40 a celulas T activadas de un anticuerpo o composicion farmaceutica eficaz para inhibir o impedir la union de un ligando de OX40 a las celulas T activadas.
Un procedimiento para inhibir o bloquear la union de un ligando de OX40 a OX40 puede incluir la administracion en un sujeto que requiere el bloqueo, la inhibicion o la prevencion de la union de n ligando de OX40 a OX40 de un anticuerpo o composicion farmaceutica eficaz para inhibir o evitar la union de un ligando de OX40 a OX40. Un procedimiento para modular la senalizacion celular mediada por OX40 puede incluir la administracion en un sujeto que requiere la modulacion de la senalizacion celular mediada por OX40 de un anticuerpo o composicion farmaceutica eficaz para modular la senalizacion celular mediada por OX40.
Un procedimiento para reducir el numero de celulas T efectoras, de memoria o reguladoras activadas puede incluir la administracion en un sujeto que requiere la reduccion del numero de celulas T efectoras, de memoria o reguladoras activadas de una cantidad de anticuerpo suficiente para reducir el numero de celulas T efectoras, de memoria o reguladoras activadas.
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Un procedimiento para reducir el numero de celulas T activadas en la sangre, bazo, nodulos linfaticos, intestinos, hfgado, pulmon o piel en un modelo de enfermedad de injerto contra huesped aguda o cronica puede incluir la administracion de una cantidad de anticuerpo en el modelo de enfermedad de xenoinjerto contra huesped aguda o cronica suficiente para reducir el numero de celulas T activadas en la sangre, bazo, nodulos linfaticos, intestinos, hfgado, pulmon o piel.
Un procedimiento para tratar una enfermedad o trastorno causado por las celulas T activadas, efectoras, de memoria o reguladoras puede incluir la administracion en un sujeto de una cantidad de anticuerpo suficiente para reducir, disminuir o impedir la progresion de la enfermedad o trastorno causado por celulas T efectoras, de memoria o reguladoras activadas, o para reducir el numero de celulas T efectoras, de memoria o reguladoras activadas. Entre las enfermedades o trastornos pueden incluirse la enfermedad del injerto contra el huesped, la inflamacion o un trastorno autoinmunitario.
Entre los sujetos tratables tal como se ha indicado en la presente memoria se incluyen mamfferos (por ejemplo seres humanos). Un sujeto que es un candidato para el tratamiento o que ha sido tratado para una enfermedad o trastorno inmunitario cronico o agudo; un sujeto que es un candidato para un tratamiento o que ha sido tratado para
enfermedad del injerto contra el huesped; un sujeto que es un candidato para un tratamiento o que ha sido tratado
para rechazo del trasplante; un sujeto que es un candidato para un tratamiento o que ha sido tratado para
inflamacion, o un sujeto que es un candidato para el tratamiento o que ha sido tratado para un trastorno
autoinmunitario; un sujeto es un candidato para el tratamiento o que ha sido tratado para una respuesta celular mediada por OX40.
Entre los procedimientos indicados en la presente memoria que incluyen la administracion o dosificacion de anticuerpos de OX40 pueden ponerse en practica mediante cualquier procedimiento aceptable. Un anticuerpo de OX40 puede administrarse en el sujeto por via local, regional o sistemica.
La invencion proporciona procedimientos para producir anticuerpos de OX40 humanos que presentan actividad antagonista de OX40. Un procedimiento indicado en la presente memoria incluye administrar un dominio extracelular de OX40 humano conjugado con protefna Fc recombinante humana o celulas T humanas activadas en un animal capaz de expresar la inmunoglobulina humana (por ejemplo un raton transgenico o una vaca transgenica); cribar el animal para la expresion del anticuerpo de OX40 humano; seleccionar un animal que produce un anticuerpo de OX40 humano; aislar un anticuerpo a partir del animal seleccionado, y determinar si el anticuerpo de OX40 humano presenta actividad antagonista de OX40.
En la presente memoria se describen procedimientos para producir anticuerpos de OX40 humanos que inhiben o impiden la union de OX40 a ligando de OX40 (OX40L). Un procedimiento puede incluir administrar un dominio extracelular de OX40 humano conjugado con protefna Fc recombinante humana o celulas T humanas activadas en un animal capaz de expresar inmunoglobulinas humanas (por ejemplo un raton transgenico o una vaca transgenica); cribar el animal para la expresion de anticuerpo de OX40 humano; seleccionar un animal que produce un anticuerpo de OX40 humano; aislar un anticuerpo a partir del animal seleccionado, y determinar si el anticuerpo de OX40 humano inhibe o impide la union de OX40 a ligando de OX40 (OX40L).
La exposicion proporciona ademas animales transgenicos no humanos que expresan un anticuerpo de OX40. El anticuerpo de Ox40 expresado puede ser identico a un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 1I2V8, 11 2y 131, 112Y55 o 112Z5; se une a un epftopo en una secuencia de aminoacidos del dominio extracelular de OX40 del anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5; presenta una afinidad de union de OX40 de entre aproximadamente 1 y 5.000 veces la de un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5; presenta una afinidad de union de OX40 de entre aproximadamente KD 10"6 M y aproximadamente KD 10"12 M de un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5; presenta la especificidad de union de un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5, o compite con un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5 para la union a OX40.
Descripciones de los dibujos
figuras 1A-F: analisis de citometrfa de flujo con anticuerpos humanos anti-OX40 humano. A. Perfil de dispersion directa frente al de dispersion lateral de celulas T CD4 humanas tras tres dfas de estimulacion con PHA e IL2. B-F. Celulas T humanas activadas marcadas con anticuerpos humanos anti-OX40 humano o controles. La lfnea gruesa representa la tincion sobre las celulas en el canal activado, mientras que la lfnea delgada representa las celulas en el canal de en reposo. El marcaje de las celulas activadas con los anticuerpos IgG de isotipo de control se muestra mediante la lfnea de puntos en los histogramas. B. 112F32, C. 112V8, D. 112Y55, E. 112Y131, y F. 112Z5.
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figura 2: tincion de celulas T humanas activadas por anticuerpos monoclonales humanos anti-OX40 humano. Los datos de media geometrica de intensidad de fluorescencia presentados se han obtenido de un canal de celulas T activadas similar al ilustrado en la figura 1A. Estos datos se utilizaron para determinar la KD y BMAX mostradas en la tabla 3.
figuras 3A-B: cinco anticuerpos de OX40 compiten para la union a OX40. A. Porcentaje de inhibicion de Fc_m:OX40_h a anticuerpo recubierto detectado con anticuerpo anti-IgG de raton-HRP. B. Porcentaje de inhibicion de OX40_h:Fc_h unido a anticuerpo de raton detectado con anticuerpo de oveja anti-IgG humano- HRP. No se muestran los numeros negativos.
figuras 4A-B: cinco anticuerpos de OX40 compiten para la union a OX40. A. Porcentaje de inhibicion de celulas T activadas tenidas con anticuerpos bloqueantes y anticuerpos anti-OX40 biotinilados detectados con SA-PE. B. Porcentaje de inhibicion de celulas T humanas activadas marcadas con anticuerpos de raton anti-OX40 humano y anticuerpos anti-OX40 biotinilados detectados con SA-PE. No se muestran los numeros negativos.
figura 5A-B: bloqueo de la union de OX40L a OX40 por anticuerpos monoclonales humanos anti-OX40 humano medido mediante ELISA y citometrfa de flujo. A. El porcentaje de inhibicion del ligando unido se detecto con anticuerpo secundario anti-FLAG-HRP mediante ELISA. B. El porcentaje de union de OX40L unido se detecto con anticuerpo anti-FLAG-PE mediante citometrfa de flujo.
figuras 6A-C: los paneles A-C representan tres estudios con tres diferentes parejas de donantes e ilustran el efecto de los anticuerpos anti-OX40 sobre la proliferacion de las celulas T.
figuras 7A-C: el anticuerpo recombinante 112V8G1 mejoro la enfermedad del injerto contra el huesped xenogenica aguda. A. Puntuacion total de patologfa macroscopica. B. Suspensiones de celulas individuales de los bazos analizados mediante citometrfa de flujo para la presencia de celulas T humanas. Se muestra el numero medio de celulas T y la desviacion estandar de cada poblacion en cada grupo de tratamiento. C. Se midio el interferon gamma humana en el suero de los ratones. Se muestra la cantidad media de interferon gamma en pg/ml para cada grupo de ratones mas la desviacion estandar.
figuras 8A-C: el anticuerpo 112V8G1 mejora la enfermedad del injerto contra el huesped xenogenica cronica. A. Puntuaciones totales de patologfa macroscopica de ratones individuales. B. Numero medio de celulas T humanas en los bazos de ratones mas la desviacion estandar determinados mediante citometrfa de flujo. C. Numero medio de celulas T humanas en los nodulos linfaticos perifericos de ratones SCID el dfa cuarenta y ocho despues de la transferencia de las celulas T CD4.
figuras 9A-C: el anticuerpo 112V8G4PE mejora la enfermedad del injerto contra el huesped xenogenica aguda al administrarlo el dfa 0, 3 o 6. A. Puntuaciones totales de patologfa macroscopica de ratones individuales tratados el dfa 0. B. Numero medio de celulas T humanas en los bazos el dfa 12 de ratones tratados el dfa 0 mas la desviacion estandar del grupo. C. Puntuaciones totales de patologfa macroscopica de ratones individuales tratados el dfa 3 o el dfa 6.
figura 10: porcentaje de lisis especffica por anticuerpos IgG1 humanos anti-OX40 humano. Los anticuerpos IgG1 humanos anti-OX40 humanos median en la ADCC de dianas OX40 humana de EL4.
Descripcion detallada
La invencion se basa por lo menos en parte en anticuerpos que se unen especfficamente a OX40 (CD134), que pueden denominarse, por ejemplo, anticuerpos de OX40, anti-OX40 o anticuerpos anti-OX40. Entre los anticuerpos que se unen especfficamente a OX40 se incluyen los anticuerpos anti-OX40 de mamffero (humanos, de primate, etc.), humanizados e hfbridos. Entre los anticuerpos de la invencion y subsecuencias (fragmentos) de anticuerpo que se unen especfficamente a OX40 se incluyen anticuerpos purificados y aislados, asf como formulaciones farmaceuticas de los mismos.
La OX40 es una glucoprotefna de 50 kilodaltons (KDa) y un elemento de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (SFRFNT). El ligando de OX40, OX40L (tambien denominado SFFNT4, CD252) se ha informado que se expresa sobre las celulas endoteliales, las celulas presentadoras de antfgeno activadas, entre ellas macrofagos, celulas dendrfticas, celulas B y celulas asesinas naturales. Aunque sin respaldo teorico, la union entre CD40 sobre las celulas presentadoras de antfgeno incrementa la expresion de OX40L al igual que los lipopolisacaridos (LPS). La expresion de OX40 sobre las celulas T puede inducirse tras la senalizacion mediante el receptor de antfgeno de celulas T. Por ejemplo, OX40 se expresa sobre celulas T recientemente activadas en el sitio de inflamacion. Las celulas T CD4 y CD8 puede regular positivamente OX40 bajo condiciones inflamatorias.
La OX40 tambien se denomina CD134, SFRFNT4, ACT35 y TXGP1L. El termino OX40 tambien incluye las formas de mamffero (por ejemplo de primate y humanas) de OX40. Por lo tanto, entre los anticuerpos de OX40 de la invencion se incluyen anticuerpos que se unen especfficamente a secuencias de OX40 de mamffero, tales como
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OX40 humano. Entre las secuencias de OX40 tales como OX40 humano se incluyen las variantes polimorficas. Un ejemplo no limitativo de un OX40 humano de longitud completa es la secuencia siguiente:
MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNG MVSRCSRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDTVC RCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKFWTNCTLAGKHTLQPASNSSD AICEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAILGL GLVLGIXGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI (SEC ID n° 50)
Los anticuerpos de OX40, anti-OX40 y anticuerpos anti-OX40 se refieren a anticuerpos que se unen especfficamente a OX40. La union especffica es aquella union que es selectiva para un epftopo presente en OX40. la union especffica puede distinguirse de la union no especffica utilizando ensayos conocidos de la tecnica (por ejemplo la inmunoprecipitacion, ELISA, citometrfa de flujo y transferencia western).
Los anticuerpos de OX40 pueden unirse a diferentes protefnas en el caso de que la totalidad o una parte de un epftopo antigenico al que se une especfficamente el anticuerpo se encuentre presente en una protefna diferente. De esta manera, dependiendo del grado de homologfa de secuencia o estructural del epftopo de OX40, un anticuerpo de OX40 puede unirse especfficamente a otra protefna que presenta una homologfa de secuencia o estructural elevada respecto al epftopo de OX40. De acuerdo con lo anterior, los anticuerpos de OX40 pueden unirse a diferentes protefnas en el caso de que un epftopo de suficiente homologfa de secuencia o estructural se encuentra presente en una protefna diferente.
Entre los anticuerpos de OX40 de la invencion se incluyen anticuerpos aislados y purificados. Los anticuerpos de la invencion, incluyendo los anticuerpos de OX40 aislados o purificados, por lo tanto, no incluyen los de seres humanos.
El termino "aislado" utilizado como modificador de una composicion se refiere a que la composicion se prepara mediante la mano del hombre o se separa de otro u otros componentes en un medio in vivo natural, tfpicamente mediante una o mas etapas o procedimientos de manipulacion. Generalmente, las composiciones separadas de esta manera se encuentra sustancialmente libres de uno o mas materiales con los que se encuentran asociados normalmente de manera natural, por ejemplo uno o mas de entre protefnas, acidos nucleicos, lfpidos, carbohidratos y membranas celulares. De esta manera, una composicion aislada se separa de otros componentes biologicos en la celula del organismo en el que la composicion se encuentra presente naturalmente, o del medio artificial en el que se produce (por ejemplo sinteticamente o mediante cultivo celular). Por ejemplo, puede obtenerse un anticuerpo de OX40 aislado de un animal en el que se produce el anticuerpo (por ejemplo un mamffero no transgenico o un mamffero transgenico, tal como un roedor (raton) o un animal ungulado (bovino)) y se separa de otros polipeptidos y acidos nucleicos. De esta manera, el suero que contiene el anticuerpo obtenido del animal se considera aislado. El termino "aislado" no excluye formas ffsicas alternativas, por ejemplo un anticuerpo aislado podrfa incluir subsecuencias, quimeras, multfmeros o formas derivatizadas de anticuerpos.
El termino "purificado" utilizado como modificador de una composicion se refiere a una composicion libre de la mayorfa o sustancialmente la totalidad de los materiales con los que se encuentra asociado tfpicamente de manera natural. Los anticuerpos purificados tfpicamente se separan de los componentes presentes naturalmente en el medio de los anticuerpos. De esta manera, un sobrenadante de anticuerpos separado del cultivo celular de hibridoma productor de anticuerpos se considera purificado. Por lo tanto, purificado no requiere la pureza absoluta y es especffico del contexto. Ademas, una composicion "purificada" puede combinarse con otra u otras moleculas. De esta manera, el termino "purificado" no excluye las combinaciones de composiciones. La pureza puede determinarse mediante cualquier procedimiento apropiado, incluyendo, por ejemplo, la espectroscopfa de UV, la cromatograffa (por ejemplo la HPLC, la fase gaseosa), la electroforesis en gel (por ejemplo la tincion de plata o de Coomassie) y el analisis de secuencias (peptfdicas y de acidos nucleicos).
Entre las protefnas y acidos nucleicos "purificados" se incluyen las protefnas y acidos nucleicos producidos mediante procedimientos de purificacion estandares. El termino incluye ademas las protefnas y acidos nucleicos producidos mediante expresion recombinante en una celula hospedadora, asf como mediante sfntesis qufmica. El termino "purificado" puede referirse ademas a una composicion en la que el nivel de contaminantes es inferior a un nivel que es considerado aceptable para una agencia reguladora para la administracion en un ser humano o animal no humano, por ejemplo la Food and Drug Administration (FDA).
Entre los anticuerpos de OX40 de la invencion se incluyen anticuerpos que se unen especfficamente a un epftopo en una secuencia de aminoacidos del dominio extracelular de OX40. En formas de realizacion particulares, los anticuerpos de OX40 ejemplificativos se unen especfficamente a tres "epftopos" sobre OX40, tal como se determina
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en un ensayo de bloqueo cruzado. Una secuencia ejemplificativa no limitativa del dominio extracelular de la OX40 humano es:
MCVGARRLGR GPCAALLLLG LGLSTVTGLH CVGDTYPSND RCCHECRPGN GMVSRCSRSQ NTVCRPCGPG FYNDVVSSKP CKPCTWCNLR SGSERKQLCT ATQDTVCRCR AGTQPLDSYK PGVDCAPCPP GHFSPGDNQA CKPWTNCTLA GKHTLQPASN SSDAICEDRD PPATQPQETQ GPPARPITVQ PTEAWPRTSQ GPS (SEC ID n° 51).
Los epftopos de peptidos tfpicamente son secuencias cortas de aminoacidos, por ejemplo de una longitud de entre aproximadamente cinco y 15 aminoacidos. Las tecnicas para identificar los epftopos son conocidas de la tecnica y se describen en, por ejemplo, la patente US n° 4.708.871. Brevemente, puede sintetizarse un conjunto de oligopeptidos solapantes derivados del polipeptido OX40 y unirse a una matriz fase solida de puntas, con un oligopeptido unico en cada punta. La matriz de puntas puede comprende una placa de microtitulacion de 96 pocillos, permitiendo someter a ensayo 96 oligopeptidos simultaneamente. Pueden identificarse epftopos discontinuos de manera similar utilizando escaneos de peptidos altamente solapantes de diferentes longitudes (por ejemplo 6-meros a 15-meros) inmovilizados a alta densidad sobre una membrana de soporte. Se utilizan concentraciones de anticuerpos elevadas y la union se detecta mediante inmunodeteccion indirecta. En el caso de que se identifiquen multiples secuencias de union y se encuentran separadas por secuencias intermedias pero no se reconocen los peptidos individuales, en ese caso se ha identificado un epftopo discontinuo. Las secuencias separadas se esperarfa que formasen un area continua sobre la superficie de la protefna diana y representan un epftopo conformacional (Reineke et al., Protein Sci. 7:951, 1998). Alternativamente, los kits de biblioteca de peptidos de expresion fagica (New England BioLabs) se encuentran disponibles comercialmente para el mapeado de epftopos. Estos procedimientos y otros pueden utilizarse para determinar la afinidad de union de cada posible subgrupo de aminoacidos consecutivos con el fin de identificar el epftopo al que se une un anticuerpo particular. Los epftopos tambien pueden identificarse mediante inferencia en el caso de que se utilicen secuencias peptfdicas de longitud de epftopo para inmunizar animales a partir de los que se obtienen los anticuerpos que se unen a la secuencia peptfdica. Tambien pueden predecirse los epftopos continuos utilizando programas informaticos tales como BEPITOPE (Odorico et al., J. Mol. Recognit. 16:20, 2003).
Los anticuerpos de la invencion con moleculas de inmunoglobulina monoclonal o policlonal que pertenecen a cualquier clase de anticuerpo, tal como IgM, IgG, IgA, IgE, IgD y cualquier subclase de las mismas. Son subclases ejemplificativas de IgG, IgG-i, IgG2, IgG3 e IgG4. Un anticuerpo "monoclonal" se refiere a un anticuerpo que se basa en, se ha obtenido de o se deriva de un unico clon, incluyendo cualquier clon eucariotico, procariotico o fagico. Por lo tanto, un anticuerpo "monoclonal" se define estructuralmente y no por el procedimiento mediante el que se produce.
Los anticuerpos ejemplificativos particulares que se unen especfficamente a OX40 se denominan 112F32 (ATCC n° PTA-7217, depositado el 17 de noviembre de 2005), 11 2v8 (ATCC n° PTA-7219, depositado el 17 de noviembre de 2005), 112Y55 (ATCC n° PTA-7220, depositado el 17 de noviembre de 2005), 112Y131 (ATCC n° PTA-7218, depositado el 17 de noviembre de 2005), y 112Z5 (ATCC n° PTA-7216, depositado el 17 de noviembre de 2005), que son anticuerpo monoclonales anti-OX40 humano (anticuerpos humanos que se unen a OX40 humano). Los anticuerpos de Ox40 de la invencion ejemplificativos 112F32, 112V8, 112Y55, 112Y131 y 112Z5 presentan secuencias de region variable de cadena pesada o ligera madura tal como se muestran en SEC ID n° 7 a n° 10 y SEC ID n° 44 a n° 49. La denominacion de 112F32, 112V8, 112Y55, 112Y131 y 112Z5 puede referirse al anticuerpo o a la estirpe celular (por ejemplo el hibridoma, celula CHO u otra celula hospedadora) que produce el anticuerpo de OX40.
Se produjeron anticuerpo humanos anti-OX40 humano ejemplificativos utilizando ratones trans-cromosomicos (KM mice™) (documentos n° WO 02/43478, n° WO 02/092812 e Ishida et al., IBC's 11th Antibody Engineering Meeting, resumen (2000)) inmunizados con diversas formas de OX40 humano recombinante soluble (IgG1_h-OX40), protefna de fusion (OX40_h:Fc_h) o celulas T humanas activadas que expresan OX40. Se identificaron anticuerpos ejemplificativos que marcaban especfficamente celulas T humanas activadas y no celulas T en reposo. Los anticuerpos ejemplificativos tineron detectablemente las lfneas celulares establemente transfectadas con OX40, EL4-OX40 y ChO-OX40, y no las lfneas celulares parentales no transformadas, indicando que los anticuerpos se unen especfficamente a OX40 humano. Los anticuerpos ejemplificativos tambien se unen a OX40 de macaco rhesus y a OX40 de macaco Cynomolgus, pero no se unen detectablemente a OX40 murino.
Los anticuerpos de la invencion pueden presentar secuencias de cadena ligera kappa o lambda, de longitud completa como en los anticuerpos naturales, mezclas de los mismos (es decir, fusiones de secuencias de cadena kappa y lambda) y subsecuencias/fragmentos de los mismos. Las moleculas de anticuerpo naturales contiene dos cadenas ligeras kappa o dos cadenas ligera lambda.
Entre los anticuerpos de OX40 indicados en la presente memoria tambien pueden incluirse, por ejemplo, anticuerpos que se unen especfficamente a una secuencia de aminoacidos a la que se une el anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32 (ATCC n° PTA-7217, depositada el 17 de noviembre de 2005), 112V8 (ATCC n° PTA-7219, depositada el 17 de noviembre de 2005), 112Y131 (ATCC n° PTA-7218, depositada el 17 de noviembre de 2005), 112Y55 (ATCC n° PTA-7220, depositada el 17 de noviembre de 2005) o 112Z5 (ATCC n° PTA-7216, depositada el 17 de noviembre de 2005).
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Entre los anticuerpos de OX40 indicados en la presente memoria se incluyen ademas, por ejemplo, anticuerpos que se unen espedficamente a un dominio extracelular de OX40 al que se une un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5. Entre los anticuerpos de OX40 indicados en la presente memoria se incluyen adicionalmente, por ejemplo, anticuerpos que presentan la especificidad de union de un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5. Dichos anticuerpos de OX40 tipicamente muestran un bloqueo, reduccion o inhibicion parcial o completa de la union del anticuerpo 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5 a OX40.
Los anticuerpos de OX40 que se unen espedficamente a una secuencia de aminoacidos a la que se une el anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5, y los anticuerpos con la especificidad de union del anticuerpo 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5 pueden identificarse utilizando ensayos de union competitiva. Pueden seleccionarse los anticuerpos basandose en la capacidad de competir para la union del anticuerpo 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5 a OX40. La capacidad de un anticuerpo de competir para la union del anticuerpo 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5 a oX40, o de inhibir, reducir, disminuir, impedir o bloquear la union del anticuerpo 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5 a OX40 puede determinarse mediante diversos ensayos conocidos de la tecnica, incluyendo el ensayo de inmunosorcion ligada a enzima (ELISA). Un anticuerpo indicado en la presente memoria puede impedir la union de un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominado 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5 a OX40, tal como se determina en un ensayo de ELISA. Un anticuerpo indicado en la presente memoria puede inhibir por lo menos 50% de la union de un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5 a OX40, tal como se determina en un ensayo ELISA.
Entre los anticuerpos de OX40 indicados en la presente memoria tambien se incluyen los anticuerpos que se unen espedficamente a OX40 y que no impiden o bloquean la union del anticuerpo de raton anti-OX40 humano L106 (Becton Dickinson, numero de catalogo 340420) a OX40. Se incluyen ademas los anticuerpos de OX40 que se unen espedficamente a oX40 y que no inhiben, reducen o disminuyen la union del anticuerpo L106 a OX40. El anticuerpo L106 se describe en, por ejemplo, la patente US n° 6.277.962, el documento n° WO 95/12673 y Schlossman et al., editores (Leukocyte typing VWhite Cell Differentiation Antigens, Oxford: Oxford University Press, paginas 1157-60, 1995).
Entre los anticuerpos de OX40 indicados en la presente memoria se incluyen los anticuerpos que se unen espedficamente a OX40 que presentan una afinidad una mayor o menor afinidad para OX40 que el anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5. Por ejemplo, se proporcionan anticuerpos con una afinidad de union a OX40 comprendida entre aproximadamente 1 y 10.000 veces (por ejemplo con una afinidad 2 a 5, 5 a 10, 10 a 100, 100 a 1.000 o 1.000 a 10.000 veces superior o inferior, o cualquier valor o intervalo numerico comprendido dentro o que incluye dichos valores) la de un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5. Por lo tanto, los anticuerpos de OX40 indicados en la presente memoria tambien incluyen anticuerpos con una afinidad de union a OX40 superior o inferior a la de un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 12F32, 112V8, 112Y55 o 112Z5. Un anticuerpo de OX40 puede presentar una afinidad de union a OX40 con una KD de entre 10"6 M y aproximadamente 10"13 M, o cualquier valor o intervalo numerico comprendido dentro o que incluye dichos valores, de un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o112Z5.
La afinidad de union puede determinarse mediante las tasas de asociacion (Ka) y de disociacion (Kd). La constante de afinidad en el equilibrio, KD, es el cociente Ka/Kd. Las tasas de asociacion (Ka) y de disociacion (Kd) pueden medirse utilizando la resonancia del plasmon superficial (RPS) (Rich y Myszka, Curr. Opin. Biotechnol. 11:54, 2000; Englebienne, Analyst. 123:1599, 1998). La instrumentacion y procedimientos para la deteccion en tiempo real y la monitorizacion de las tasa de union son conocidos y se encuentran disponibles comercialmente (BiaCore 2000, Biacore AB, Upsala, Suecia, y Malmqvist, Biochem. Soc. Trans. 27:335, 1999). Los valores de KD pueden definirse como la concentracion de anticuerpo de OX40 requerida para saturar a la mitad (50%) los sitios de union de OX40.
Entre los anticuerpos de OX40 de la invencion se incluyen los anticuerpos que pueden unirse a OX40 presentes en una o mas celulas in vivo, en aislados celulares primarios, celulas subcultivadas, celulas en cultivo y celulas inmortalizadas. Entre los tipos celulares no limitativos espedficos que pueden expresar OX40 se incluyen las celulas T activadas y otras celulas T (por ejemplo celulas T efectoras, de memoria o reguladoras activadas) y las celulas no T. Entre los ejemplos de celulas no T se incluyen las celulas asesinas naturales (NK), los granulocitos (neutrofilos), los monocitos y las celulas B. Las celulas que no expresan naturalmente OX40 puede hacerse que expresen OX40, por ejemplo mediante transfeccion o transformacion de celulas con un acido nucleico codificante de OX40. Los anticuerpos de OX40 capaces de union a OX40 pueden unirse a una o mas celulas transfectadas o transformadas que expresan o producen OX40.
Entre los anticuerpos indicados en la presente memoria se incluyen anticuerpos que se unen a OX40 y modulan una funcion o actividad de OX40 in vivo o in vitro (por ejemplo en un sujeto). Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "modular" y variaciones gramaticales del mismo, utilizado en referencia a una actividad o funcion de
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OX40, se refiere a que la actividad o funcion de OX40 resulta detectablemente afectada, alterada o modificada. De esta manera, un anticuerpo de OX40 que modula una actividad o funcion de OX40 es un anticuerpo que afecta, altera o modifica detectablemente una o mas actividades o funciones de OX40, entre las que pueden incluirse, por ejemplo, la union de OX40 a un ligando de OX40, la senalizacion mediada por OX40 o una respuesta celular mediada por OX40 o modulable por OX40, u otra actividad o funcion de OX40 tal como se indica en la presente memoria o de otro modo conocida o conocible.
Entre las diversas actividades y funciones de OX40 no limitativas que pueden modularse se incluyen, por ejemplo, la senalizacion mediada por OX40 o una respuesta celular mediada por OX40 o modulable por OX40, la proliferacion o expansion celular (por ejemplo linfocitos, tales como celulas T efectoras, de memoria o reguladoras activadas), la supervivencia o apoptosis celular (por ejemplo linfocitos tales como celulas T efectoras, de memoria o reguladoras activadas), citocinas (por ejemplo citocinas Th1, Th2 y no Th1/Th2) y la expresion o produccion de interferon, la expresion o produccion de protefnas antiapoptoticas o proapoptoticas, y el tratamiento, prevencion o mejora de trastornos, enfermedades, condiciones fisiologicas, patologfas y sfntomas de los mismos. Entre los citocinas especfficas moduladas se incluyen, aunque sin limitacion, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-14, IL-16, IL-17, IL-23, IL-26, FNT-a, interferon-Y y GM-CSF (in vivo o in vitro). La expresion de protefnas antiapoptoticas o proapoptoticas especfficas incluye, aunque sin limitacion, Bcl-xL, Bcl-2, Bad y Bim. Entre otras actividades o funciones no limitativas de OX40 que pueden modularse se incluyen, por ejemplo, la activacion de NF-kB, el mantenimiento de la actividad de PKB (Akt) y la regulacion positiva de la survivina (Ambrosini et al., Nat. Med. 3:917, 1997, y Song et al., Immunity 22:621, 2005).
Por lo tanto, entre los anticuerpos ejemplificativos indicados en la presente memoria se incluyen anticuerpos que modulan una o mas de entre la senalizacion mediada por OX40 o una respuesta celular mediada o inducida por OX40, la proliferacion celular (por ejemplo de celulas T efectoras, de memoria o reguladoras activadas), la supervivencia o apoptosis celular (por ejemplo de celulas T efectoras, de memoria o reguladoras activadas), citocinas (por ejemplo las citocinas Th1, Th2 y otras no Th1/Th2, por ejemplo IL-17, IL-23 e IL-26) y la expresion o produccion de interferon, tal como Th1, Th2, no Th1/Th2, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-14, IL-16, IL-17, IL-23, IL-26, FNT-a, interferon-Y y GM-CSF (in vivo o in vitro), la expresion de protefnas antiapoptoticas o proapoptoticas (por ejemplo Bcl-xL, Bcl-2, Bad o Sim) y el tratamiento, prevencion o mejora de trastornos, enfermedades, patologfas y sfntomas de los mismos. En aspectos particulares, los anticuerpos de la invencion modulan la expansion o supervivencia de las celulas T, modulan el numero de celulas T efectoras, de memoria o reguladoras activadas, o reducen el numero de celulas efectoras, de memoria o reguladoras activadas. En aspectos particulares adicionales, los anticuerpos de la invencion reducen o eliminan el numero de celulas T autorreactivas especfficas para un autoantfgeno (por ejemplo la protefna basica de mielina (PBM), la glucoprotefna oligodendrocftica de la mielina (GOM), la protefna del proteolfpido (PPL), el colageno, los antfgenos de tejido articular sinovial, la insulina, la acido glutamico descarboxilasa, los antfgenos intestinales, los antfgenos tiroideos, las protefnas histonas, los antfgenos musculares o los antfgenos de la piel).
El termino "antagonista" y variaciones gramaticales del mismo utilizadas en referencia a un anticuerpo de OX40 se refieren a un anticuerpo de OX40 que reduce, disminuye, inhibe, retrasa, impide o bloquea la union d eOX40 a ligando de OX40, o reduce, disminuye, inhibe, retrasa, impide o bloquea una actividad o funcion de OX40. El termino "agonista" y variaciones gramaticales del mismo utilizadas en referencia a un anticuerpo de OX40 se refieren a un anticuerpo de OX40 que estimula, incrementa, potencia, estimula o induce una actividad o funcion inducida por OX40. Por lo tanto, entre los anticuerpos de OX40 indicados en la presente memoria se incluyen los anticuerpos antagonistas y agonistas.
Los anticuerpos antagonistas de OX40 indicados en la presente memoria bloquean, reducen, disminuyen, inhiben o impiden una o mas actividades o funciones de OX40 in vitro o in vivo, por ejemplo. Se proporcionan anticuerpos de OX40 indicados en la presente memoria que pueden bloquear, reducir, disminuir, inhibir o impedir la union de ligando de OX40 (OX40L) a OX40 (CD134) en la forma soluble u OX40 expresado sobre la superficie de las celulas T activadas. Un anticuerpo de OX40 indicado en la presente memoria puede inducir la lisis de celulas EL4 expresantes de OX40 humano o celulas T humanas activadas en presencia de celulas efectoras lfticas (por ejemplo celulas asesinas naturales, macrofagos o neutrofilos). En aspectos particulares, el porcentaje (%) de lisis celular especffica inducia a una concentracion de 10 pg/ml de anticuerpo es de entre aproximadamente 15% y 75%, de entre 25% y 65%, o de entre 30% y 60%, y puede ser de hasta 100%, dependiendo de los niveles de fondo en los estudios. Ademas, la incubacion de anticuerpos de OX40 ejemplificativos con celulas mononucleares de sangre periferica (CMSP) humana cocultivados con CMSP de un donante alogenico reducen la proliferacion celular mediante la inhibicion de las celulas T CD4 y/o CD8 alorreactivas.
Entre los anticuerpos de OX40 indicados en la presente memoria se incluyen formas modificadas, tales como sustituciones (por ejemplo sustituciones de aminoacidos), adiciones y deleciones (por ejemplo subsecuencias o fragmentos), que pueden denominarse "variantes". Dichas formas de anticuerpo modificadas y variantes conservan por lo menos una funcion o actividad parcial de n anticuerpo de OX40 de referencia, por ejemplo un anticuerpo de OX40 denominado 112F32, 112V8, 112Y55, 112Y131 y 11 2z5, tal como la union a Ox40, o modulan una actividad o funcion de OX40 (por ejemplo la senalizacion de OX40). De esta manera, por ejemplo un anticuerpo de OX40
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modificado puede conservar por lo menos una union parcial a OX40 o la capacidad de modular una o mas funciones o actividades de OX40 (por ejemplo la senalizacion, una respuesta celular, etc.).
Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "modificar" y variaciones gramaticales del mismo, se refiere a que la composicion se aparta de una composicion de referencia. Las protefnas y acidos nucleicos modificados y otras composiciones pueden presentar una actividad mayor o menor o una funcion diferente de las de una protefna o acido nucleico no modificado u otra composicion de referencia.
Los anticuerpos modificados indicados en la presente memoria pueden conservar una o mas de entre una capacidad de modular la expansion o supervivencia de las celulas T, de modular el numero de celulas T efectoras, de memoria o reguladoras activadas, o de reducir el numero de celulas T efectoras, de memoria o reguladoras activadas. Los anticuerpos modificados indicados en la presente memoria pueden conservar una o mas de entre una capacidad de reducir o rebajar el numero de celulas T autorreactivas especfficas para un autoantfgeno o de celulas B productoras de anticuerpos especfficos para un autoantfgeno (por ejemplo la protefna basica de mielina (PBM), la glucoprotefna oligodendrocftica de la mielina (GOM), la protefna del proteolfpido (PPL), el colageno, los antfgenos de tejido articular sinovial, la insulina, la acido glutamico descarboxilasa, los antfgenos intestinales, los antfgenos tiroideos, las protefnas histonas, los antfgenos musculares o los antfgenos de la piel).
La secuencia de region variable de cadena pesada o ligera madura del anticuerpo tal como se muestra en SEC ID n° 7 a n° 10 y en SEC ID n° 44 a n° 49 puede presentar una o mas sustituciones de aminoacidos dentro o fuera de una region constante, una region determinante de complementariedad (RDC) o una region de marco (RM). Una sustitucion de aminoacido puede ser una sustitucion conservadora dentro o fuera de una region constante, una region determinante de complementariedad (RDC) o una region de marco (RM). Los anticuerpos indicados en la presente memoria pueden presentar una identidad de por lo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o superior, o cualquier valor o intervalo numerico comprendido dentro o que incluye dichos valores de porcentaje, respecto a una secuencia de cadena pesada o ligera de un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5, SEC ID n° 7 a n° 10 o SEC ID n° 44 a n° 49. Entre los numeros tfpicos de residuos sustituidos se incluyen 1 a 3, 3 a 5, 5 a 10 residuos aminoacidos o cualquier valor o intervalo numerico comprendido dentro o que incluye dichos valores, o mas residuos aminoacidos.
Dichos anticuerpos que incluyen sustituciones de aminoacidos pueden estar codificados por un acido nucleico. En consecuencia, tambien se proporcionan las secuencias de acidos nucleicos codificantes de anticuerpos que incluyen sustituciones de aminoacidos.
Los terminos "identidad" o "identico" se refieren a que dos o mas entidades referenciadas son iguales. De esta manera, en el caso de que dos secuencias de protefnas (por ejemplo anticuerpos de OX40) sean identicas, presentan la misma secuencia de aminoacidos, por lo menos dentro de la region o parte referenciada. Un "area de identidad" se refiere a una parte de dos o mas entidades referenciadas que es igual en todas ellas. De esta manera, en el caso de que dos secuencias de protefnas sean identicas en una o mas regiones de secuencia, compartiran identidad dentro de dicha region. La expresion "identidad sustancial" se refiere a que una molecula se encuentra estructural o funcionalmente conservada, de manera que presenta, o se predice que presenta, por lo menos una funcion o actividad parcial de una o mas de las funciones o actividades de la molecula de referencia, o region o parte relevante/correspondiente de la molecula de referencia con la que comparte identidad. De esta manera, un polipeptido (por ejemplo el anticuerpo de OX40) con identidad sustancial presenta, o se predice que presenta, una actividad o funcion por lo menos parcial del polipeptido de referencia (por ejemplo el anticuerpo de OX40). Por ejemplo, en una forma de realizacion particular, un anticuerpo de OX40 que presenta una o mas modificaciones (por ejemplo sustituciones, deleciones o adiciones de aminoacidos) que conserva una actividad o funcion por lo menos parcial del anticuerpo de OX40 no modificado se considera que presenta una identidad sustancial respecto al anticuerpo de OX40 de referencia.
Debido a la variacion entre protefnas estructural y funcionalmente relacionadas, el nivel de identidad de secuencia requerido para conservar una funcion o actividad depende de la protefna, la region y la funcion o actividad de dicha region. Aunque la identidad de secuencia de aminoacidos puede ser de tan solo 30% para protefnas que conservan una actividad o funcion dada, tfpicamente es superior, por ejemplo una identidad de 50%, 60%, 75%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% o 98% respecto a una secuencia de referencia. El grado de identidad entre dos secuencias puede determinarse utilizando un programa informatico y un algoritmo matematico conocido de la tecnica. Dichos algoritmos que calculan el porcentaje de identidad de secuencia (homologfa) generalmente explican los huecos de secuencia y los apareamientos incorrectos a lo largo de las regiones de comparacion. Por ejemplo, el algoritmo de busqueda BLAST (por ejemplo BLAST 2.0) (ver, por ejemplo, Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403, 1990, disponible publicamente a traves del NCBI) presenta los parametros de busqueda ejemplificativos siguientes: apareamiento incorrecto -2; apertura de hueco 5; extension de hueco 2. Para las comparaciones de secuencias de polipeptidos, tfpicamente se utiliza un algoritmo BLASTP en combinacion con una matriz de puntuaciones, tal como PAM100, PAM250, BLOSUM62 o BLOSUM50. Los programas de comparacion de secuencias FASTA (por ejemplo FASTA2 y FASTA3) y SSEARCH tambien se utilizan para cuantificar el grado de identidad (Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185, 2000, y Smith et al., J. Mol. Biol. 147:195, 1981).
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Tambien se han desarrollado programas para cuantificar la similitud estructural de las protefnas utilizando el mapeado topologico de Delaunay (Bostick et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 304:320, 2003).
Una "sustitucion conservadora" es la sustitucion de un aminoacido por un residuo biologica, qufmica o estructuralmente similar. La expresion biologicamente similar se refiere a que la sustitucion no destruye una actividad biologica, por ejemplo la actividad de union de OX40. La expresion estructuralmente similar se refiere a que los aminoacidos presentan cadenas laterales de longitud similar, tales como alanina, glicina y serina, o un tamano similar. La expresion similitud qufmica se refiere a que los residuos presentan la misma carga o que ambos son hidrofilos o hidrofobos. Entre los ejemplos particulares se incluyen la sustitucion de un residuo hidrofobo, tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro, o la sustitucion de un residuo polar por otro, tal como la sustitucion de arginina por lisina, acido glutamico por acido aspartico, glutamina por asparagina, o serina por treonina, y similares.
Entre los anticuerpos modificados se incluyen ademas uno o mas D-aminoacidos sustituidos por L-aminoacidos (y mezclas de los mismos), analogos estructurales y funcionales, por ejemplo peptidomimeticos que presentan aminoacidos sinteticos o no naturales o analogos y formas derivatizadas de aminoacidos. Entre las modificaciones se incluyen estructuras cfclicas, tales como un enlace amida extremo-a-extremo entre los extremos amino-terminal y carboxi-terminal de la molecula o un enlace disulfuro intra-molecular o inter-molecular.
Entre los ejemplos no limitativos especfficos adicionales de modificaciones de aminoacidos se incluyen subsecuencias y fragmentos de OX40. Las subsecuencias y fragmentos de OX40 ejemplificativos comprenden una parte de una secuencia de OX40 a la que se une un anticuerpo de OX40 ejemplificativo indicado en la presente memoria. Entre las subsecuencias y fragmentos de OX40 ejemplificativos se incluyen ademas una parte inmunogenica, por ejemplo una parte de OX40 que incluye una secuencia a la que se une un anticuerpo de OX40 ejemplificativo indicado en la presente memoria.
En la presente memoria se indican anticuerpo de OX40 y acidos nucleicos codificantes de subsecuencias o fragmentos de anticuerpo de OX40 que conservan por lo menos en parte una funcion o actividad de un anticuerpo de OX40 no modificado o de referencia. Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "subsecuencia" o "fragmento" se refiere a una parte de la molecula de longitud completa. Una subsecuencia de un anticuerpo de OX40 codificante de un anticuerpo de OX40 presenta por lo menos un aminoacido menos que un OX40 de longitud completa (por ejemplo una o mas deleciones de aminoacido internas o terminales del extremo amino-terminal o carboxi-terminal). Una subsecuencia de anticuerpo de OX40 presenta por lo menos un aminoacido menos que un anticuerpo de OX40 de longitud completa. Una subsecuencia de acidos nucleicos presenta por lo menos un nucleotido menos que una secuencia de acidos nucleicos de comparacion de longitud completa. Por lo tanto, las subsecuencias pueden presentar cualquier longitud hasta la de OX40 nativo de longitud completa.
Entre las subsecuencias y fragmentos de anticuerpo de OX40 de la invencion se incluyen una secuencia de region variable de cadena pesada o ligera madura tal como se muestra en SEC ID n° 7 a n° 10 y SEC ID n° 44 a n° 49. Entre las subsecuencias y fragmentos de anticuerpo de OX40 de la invencion se incluyen ademas Fab, Fab' y F(ab')2, Fv, Fd, Fv de cadena sencilla (scFv), Fv unidos por disulfuro (sdFv) y fragmentos de dominio Vl y Vh.
Las subsecuencias y fragmentos de anticuerpo de OX40 pueden presentar la afinidad de union del anticuerpo de longitud completa, la especificidad de union del anticuerpo de longitud completa, o una o mas actividades o funciones del anticuerpo de longitud completa, por ejemplo una funcion o actividad del anticuerpo antagonista o agonista de OX40. Las expresiones "subsecuencia funcional" y "fragmento funcional" en referencia a un anticuerpo se refieren a una parte de anticuerpo que conserva por lo menos una parte de una o mas funciones o actividades del anticuerpo de referencia de longitud completa, por ejemplo una funcion o actividad del anticuerpo de OX40. Por ejemplo, una subsecuencia o fragmento de anticuerpo que se une a OX40 o a un fragmento de OX40 se considera una subsecuencia funcional.
Las subsecuencias y fragmentos de anticuerpo pueden combinarse. Por ejemplo, las subsecuencias de Vl o Vh pueden unirse mediante una secuencia conectora, formando de esta manera una quimera Vl-Vh. Una combinacion de subsecuencias de Fv de cadena sencilla (scFv) pueden unirse mediante una secuencia conectora, formando de esta manera una quimera scFv-scFv. Entre las subsecuencias y fragmentos de anticuerpo de OX40 se incluyen anticuerpos de cadena sencilla o una o mas regiones variables solas o en combinacion con la totalidad o una parte de otras subsecuencias de anticuerpo de OX40.
Pueden prepararse subsecuencias y fragmentos de anticuerpo mediante hidrolisis proteolftica del anticuerpo, por ejemplo mediante digestion con pepsina o papafna de anticuerpos completos. Las subsecuencias y fragmentos de anticuerpo producidos mediante corte enzimatico con pepsina proporcionan un fragmento 5S denominado F(ab')2. Este fragmento puede cortarse adicionalmente utilizando un agente reductor tiol para producir fragmentos monovalentes Fab' 3.5S. Alternativamente, un corte enzimatico con pepsina produce dos fragmentos Fab' monovalentes y el fragmento Fc directamente (ver, por ejemplo, las patentes US n° 4.036.945 y n° 4.331.647, y Edelman et al., Methods Enzymol. 1:422, 1967). Tambien pueden utilizarse otros procedimientos de corte de
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anticuerpos, tales como la separacion de cadenas pesadas para formar fragmentos monovalentes de cadena ligera- pesada, el corte adicional de fragmentos u otros procedimientos enzimaticos o qufmicos.
Pueden producirse protefnas y anticuerpos, asf como subsecuencias y fragmentos de los mismos, mediante metodologfa genetica. Entre las tecnicas se incluyen la expresion de la totalidad o una parte del gen codificante de la protefna o anticuerpo en una celula hospedadora, tal como celulas Cos o de E. coli. Las celulas hospedadoras recombinantes sintetizan la longitud completa o una subsecuencia, por ejemplo un scFv (ver, por ejemplo, Whitlow et al., en: Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:97, 1991; Bird et al., Science 242:423, 1988, y la patente US n° 4.946.778). Los Fv de cadena sencilla y los anticuerpos pueden producirse tal como se indica en las patentes US n° 4.946.778 y n° 5.258.498; Huston et al., Methods Enzymol. 203:46, 1991; Shu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7995, 1993, y Skerra et al., Science 240:1038, 1988.
Entre las formas modificadas se incluyen secuencias derivatizadas, por ejemplo aminoacidos en los que los grupos amino libres forman hidrocloruros de amina, grupos de p-tolueno-sulfonilo, grupos carbobenzoxi; los grupos carboxi libres de sales, esteres de metilo y de etilo; grupos hidroxilo libres que forman derivados O-acilo o O-alquilo, asf como derivados de aminoacidos naturales, por ejemplo 4-hidroxiprolina, para la prolina, 5-hidroxilisina para lisina, homoserina para serina, ornitina para lisina, etc. Pueden producirse modificaciones utilizando procedimientos conocidos de la tecnica (por ejemplo la mutagenesis por delecion e insercion dirigida a sitio basada en PCR, la modificacion y mutagenesis qufmicas, el entrecruzamiento, etc.).
Las formas modificadas de protefna (por ejemplo un anticuerpo), los acidos nucleicos y otras composiciones incluyen adiciones e inserciones. Por ejemplo, una adicion puede ser la union covalente o no covalente de cualquier tipo de molecula a una protefna (por ejemplo un anticuerpo), acido nucleico u otra composicion. Tfpicamente las adiciones e inserciones confieren una funcion o actividad clara.
Entre las adiciones e inserciones se incluyen secuencias de polipeptido o de acido nucleico de fusion (quimericas), que son una secuencia que presenta una o mas moleculas no presentes normalmente en una secuencia nativa (de tipo salvaje) de referencia unida covalentemente a la secuencia. Un ejemplo particular es una secuencia de aminoacidos de otra protefna (por ejemplo un anticuerpo) para producir una protefna multifuncional (por ejemplo un anticuerpo multiespecffico).
Entre los anticuerpos indicados en la presente memoria se incluyen ademas quimeras o fusiones con uno o mas dominios adicionales unidos covalentemente a los mismos que proporcionan una funcion o actividad diferente o complementaria. Entre los anticuerpos se incluyen quimeras o fusiones en las que se encuentran unidas dos o mas secuencias de aminoacidos que no existen de manera natural en la naturaleza.
Segun la invencion se proporcionan anticuerpos de OX40 y acidos nucleicos codificantes de anticuerpos de OX40 que incluyen un dominio heterologo. Los dominios heterologos pueden ser una adicion o insercion de aminoacido, aunque no se limitan a los residuos aminoacidos. De esta manera, un dominio heterologo puede consistir de cualquier de entre una diversidad de tipos diferentes de fracciones funcionales pequenas o grandes. Entre dichas fracciones se incluyen acidos nucleicos, peptidos, carbohidratos, compuestos lipfdicos u organicos pequenos, tales como un farmaco, metales (oro, plata), etc.
Entre los ejemplos no limitativos particulares de dominios heterologos se incluyen, por ejemplo, etiquetas, marcajes detectables y agentes citotoxicos. Entre los ejemplos especfficos de etiquetas y marcajes detectables se incluyen etiquetas de T7, de His, myc, HA y FLAG; enzimas (peroxidasa de rabano picante, ureasa, catalasa, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, cloranfenicol transferasa), sustratos enzimaticos, ligandos (por ejemplo biotina), receptores (avidina), radionucleidos (por ejemplo C, S, P, P, H, I e I ), reactivos electrodensos, moleculas de transferencia de energfa, marcajes paramagneticos, fluoroforos (fluorescefna, rodamina y ficoeritrina), cromoforos, agentes quimioluminiscentes (imidazol y luciferasa) y bioluminiscentes. Entre los ejemplos especfficos de agentes citotoxicos se incluyen la toxina difterica, la toxina del colera y la ricina.
Pueden insertarse secuencias conectoras entre la protefna (por ejemplo el anticuerpo), el acido nucleico u otra composicion y la adicion o insercion (por ejemplo el dominio heterologo) de manera que las dos entidades mantengan, por lo menos en parte, una funcion o actividad diferente. Las secuencias conectoras pueden presentar una o mas propiedades que incluyan una estructura flexible, una incapacidad para formar una estructura secundaria ordenada o un caracter hidrofobo o cargado, que podrfa estimular o interactuar con otro dominio. Entre los aminoacidos tfpicamente presentes en regiones de protefna flexibles se incluyen la glicina, la asparagina y la serina. Tambien pueden utilizarse otros aminoacidos practicamente neutros, tales como la treonina y la alanina, en la secuencia conectora. La longitud de la secuencia conectora puede variar (ver, por ejemplo, la patente US n° 6.087.329). Entre los conectores se incluyen ademas agentes de entrecruzamiento y conjugacion qufmicos, tales como los derivados sulfo-succinimidilo (sulfo-SMCC, sulfo-SMPB), el suberato de disuccinimidilo (DSS), el glutarato de disuccinimidilo (DSG) y el tartrato de disuccinimidilo (DST).
Entre los ejemplos adicionales de adiciones se incluyen la glucosilacion, los acidos grasos, los lfpidos, la acetilacion, la fosforilacion, la amidacion, la formilacion, la ubiquitinacion y la derivatizacion con grupos protectores o
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bloqueantes y cualquiera de entre numerosas modificaciones qufmicas. Otras permutaciones y posibilidades resultaran evidentes para el experto ordinario en la materia y se consideran comprendidas dentro del alcance de la invencion.
Pueden prepararse dichas secuencias modificadas utilizando tecnologfa de ADN recombinante mediante la expresion celular o la traduccion in vitro. Tambien pueden producirse secuencias de polipeptido y de acidos nucleicos mediante sfntesis qufmica utilizando procedimientos conocidos de la tecnica, por ejemplo un aparato de sfntesis peptfdica automatica (ver, por ejemplo Applied Biosystems, Foster City, CA).
Puede producirse protefna OX40 adecuada para generar anticuerpos mediante cualquiera de entre una diversidad de tecnicas estandares de purificacion de protefnas o de expresion recombinante. Por ejemplo, puede producirse una secuencia de OX40 mediante tecnicas estandares de sfntesis peptfdica, tales como la sfntesis en fase solida. Una parte de la protefna puede contener una secuencia de aminoacidos, tales como una etiqueta de T7 o una secuencia polihistidina, para facilitar la purificacion de la protefna expresada o sintetizada.
La protefna puede expresarse en una celula y purificarse. La protefna puede expresarse como parte de una protefna de mayor tamano (por ejemplo una fusion o quimera) mediante procedimientos recombinantes.
Los procedimientos para producir anticuerpos policlonales y monoclonales son conocidos de la tecnica. Por ejemplo, OX40 o un fragmento inmunogenico del mismo, conjugado opcionalmente con un portador, tal como hemocianina de lapa americana (KLH) u ovoalbumina (por ejemplo BSA) o mezclado con un adyuvante, tal como adyuvante completo o incompleto de Freund, y utilizarse para inmunizar un animal. Utilizando la tecnologfa del hibridoma, pueden aislarse esplenocitos a partir de animales inmunizados que responden a OX40 y fusionarse con celulas de mieloma. Pueden cribarse los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas, para reactividad con OX40 o un fragmento inmunogenico del mismo.
Entre los animales que pueden inmunizarse se incluyen primates, ratones, ratas, conejos, cabras, ovejas, vacas o cobayas. La inmunizacion inicial y cualquier inmunizacion posterior opcional puede realizarse por las vfas intravenosa, intraperitoneal, intramuscular o subcutanea. Ademas, para incrementar la respuesta inmunitaria, el antfgeno puede acoplarse a otra protefna, tal como la ovoalbumina o la hemocianina de lapa americana (KLH), la tiroglobulina y el toxoide tetanico, o mezclarse con un adyuvante tal como el adyuvante completo o incompleto de Freund. La inmunizacion inicial y cualquier inmunizacion posterior opcional puede realizarse por via intraperitoneal, intramuscular, intraocular o subcutanea. Las inmunizaciones posteriores pueden llevarse a cabo a la misma concentracion o a concentraciones diferentes de las preparaciones de OX40, y pueden realizarse a intervalos regulares o irregulares.
Entre los animales se incluyen los modificados geneticamente para incluir loci genicos humanos, que pueden utilizarse para producir anticuerpos humanos. Los animales transgenicos con uno o mas genes humanos de inmunoglobulina se describen en, por ejemplo, la patente US n° 5.939.598, y en los documentos n° WO 02/43478 y n° WO 02/092812. Utilizando la tecnologfa convencional del hibridoma, los esplenocitos de ratones inmunizados que son altamente sensibles al antfgeno pueden aislarse y fusionarse con celulas de mieloma. Puede obtenerse un anticuerpo monoclonal que se une a OX40.
Los procedimientos adicionales para producir anticuerpos policlonales humanos y anticuerpos monoclonales humanos han sido descritos (ver, por ejemplo, Kuroiwa et al., Nat. Biotechnol. 20:889, 2002; documentos n° WO 98/24893, n° WO 92/01047, n° WO 96/34096, n° WO 96/33735; patentes US n° 5.413.923, n° 5.625.126, n° 5.633.425, n° 5.569.825, n° 5.661.016, n° 5.545.806, n° 5.814.318, n° 5.885.793, n° 5.916.771 y n° 5.939.598).
El termino "humano" en caso de utilizarse en referencia a un anticuerpo, se refiere a que la secuencia de aminoacidos del anticuerpo es totalmente humana, es decir, regiones constantes y variables de cadena pesada humana y de cadena ligera humana. De esta manera, la totalidad de los aminoacidos son humanos o existen en un anticuerpo humano. Un anticuerpo que es no humano puede convertirse en totalmente humano mediante sustitucion de los residuos aminoacidos no humanos por residuos aminoacidos que existen en un anticuerpo humano. Los residuos aminoacidos presentes en los anticuerpos humanos, mapas de region de RDC y residuos de consenso de anticuerpo humano son conocidos de la tecnica (ver, por ejemplo, Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4a ed., US Department of Health and Human Services, Public Health Sevice, 1987; Chothia y Lesk, 1987. Una secuencia de consenso de Vh humano subgrupo III, basada en un estudio de 22 secuencias humanas de Vh III, y una secuencia de consenso de Vl humana cadena kappa subgrupo I, basada en un estudio de 30 secuencias humanas de kappa I, se describe en Padlan, Mol. Immunol. 31:169, 1994, y Padlan, Mol. Immunol. 28:489, 1991. Por lo tanto, entre los anticuerpos humanos se incluyen anticuerpos en los que se han sustituido uno o mas residuos aminoacidos por uno o mas aminoacidos presentes en cualquier otro anticuerpo humano.
Entre los anticuerpos de OX40 se incluyen anticuerpos humanizados que pueden producirse utilizando tecnicas conocidas de la tecnica, incluyendo, por ejemplo, la injertacion de RDC (patente EP 0 239 400, documento n° WO91/09967; patentes US n° 5.225.539, n° 5.530.101 y n° 5.585.089), "veneering" o la resuperficializacion (patentes EP 0 592 106 y EP 0 519 596; Padlan, Molecular Immunol. 28:489, 1991; Studnicka et al., Protein Engineering 7:805, 1994; Roguska et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 91:969, 1994) y reorganizacion de cadenas
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(patente US n° 5.565.332). Las secuencias de consenso humanas (Padlan, Mol. Immunol. 31:169, 1994, y Padlan, Mol. Immunol. 28:489, 1991) han sido utilizadas anteriormente para producir anticuerpos humanizados (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285, 1992, y Presta et al., J. Immunol. 151:2623, 1993).
El termino "humanizado" tal como se utiliza en referencia a un anticuerpo se refiere a que la secuencia de aminoacidos del anticuerpo presenta residuos aminoacidos no humanos (por ejemplo de raton, de rata, de cabra, de conejo, etc.) de una o mas regiones determinantes de complementariedad (RDC) que se unen especfficamente al antfgeno deseado en una molecula de inmunoglobulina humana aceptora, y uno o mas residuos aminoacidos humanos en la region marco (RM) de Fv, que son residuos aminoacidos que flanquean las RDC. Los anticuerpos denominados "primatizados" se encuentran comprendidos dentro del significado de "humanizado", excepto en que la molecula de inmunoglobulina humana aceptora y los residuos aminoacidos de la region marco pueden ser cualquier residuo aminoacido de primate (por ejemplo de simio, de gibon, de gorila, de chimpance, de orangutan o de macaco), ademas de cualquier residuo humano. Los residuos de RM humanos de la inmunoglobulina pueden sustituirse por residuos no humanos correspondientes. Por lo tanto, los residuos en las regiones de RDC o de marco humanas pueden sustituirse por un residuo correspondiente del anticuerpo donante de RDC o de region marco no humano para alterar, generalmente para mejorar, la afinidad o especificidad para antfgeno, por ejemplo. Un anticuerpo humanizado puede incluir residuos no presentes en el anticuerpo humano ni en las secuencias de RDC o de marco donantes. Por ejemplo, una sustitucion de RM en una posicion particular no presente en un anticuerpo humano o en el anticuerpo no humano donante puede predecirse que mejorara la afinidad o especificidad de union del anticuerpo humano en esa posicion. Las sustituciones de marco y de RDC de anticuerpo basadas en el modelaje molecular son bien conocidas de la tecnica, por ejemplo mediante modelaje de las interacciones de los residuos de RDC y de marco para identificar los residuos de marco importantes para la union de antfgeno y la comparacion entre secuencias para identificar residuos de marco no habituales en posiciones particulares (ver, por ejemplo, la patente US n° 5.585.089 y Riechmann et al., Nature 332:323, 1988).
Entre los anticuerpos de OX40 se incluyen anticuerpos hfbridos. Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "hfbrido" y variaciones gramaticales del mismo, utilizado en referencia a un anticuerpo, se refiere a que la secuencia de aminoacidos del anticuerpo contiene una o mas partes que se derivan, se obtienen o se afslan o estan basadas en dos o mas especies diferentes. Por ejemplo, una parte del anticuerpo puede ser humana (por ejemplo una region constante) y otra parte del anticuerpo puede ser no humana (por ejemplo una region variable de cadena ligera pesada murina o ligera murina). De esta manera, un ejemplo de un anticuerpo hfbrido es un anticuerpo en el que diferentes partes del anticuerpo son de orfgenes especfficos diferentes. Al contrario que un anticuerpo humanizado o primatizado, un anticuerpo hfbrido puede presentar las diferentes secuencias especfficas en cualquier region del anticuerpo.
Los procedimientos para producir anticuerpos hfbridos son conocidos de la tecnica (por ejemplo, Morrison, Science 229:1202, 1985; Oi et al., BioTechniques 4:214, 1986; Gillies et al., J. Immunol. Methods 125:191, 1989, y patentes US n° 5.807.715, n° 4.816.567 y n° 4.816.397). Los anticuerpos hfbridos en los que un dominio variable de un anticuerpo de una especie se sustituye por el dominio variable de otra especie se describen en, por ejemplo, Munro, Nature 312:597, 1984; Neuberger et al., Nature 312:604, 1984; Sharon et al., Nature 309:364, 1984; Morrison et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 81:6851, 1984; Boulianne et al., Nature 312:643, 1984; Capon et al., Nature 337:525, 1989, y Traunecker et al., Nature 339:68, 1989.
Tambien pueden generarse anticuerpos de OX40 utilizando tecnologfas de hibridoma, de recombinacion y de expresion fagica, o una combinacion de las mismas (ver las patentes US n° 4.902.614, n° 4.543.439 y n° 4.411.933; ver tambien Monoclonal Antibodies. Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn y Bechtol (editores), 1980, y Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed., 1988).
Entre las tecnicas adecuadas que pueden utilizarse adicionalmente en procedimientos de anticuerpos se incluyen la purificacion de afinidad basada en OX40, la purificacion en gel no desnaturalizante, la HPLC o la RP-HPLc, la exclusion por tamano, la purificacion en columna de protefna A, o cualquier combinacion de dichas tecnicas. El isotipo del anticuerpo de OX40 puede determinarse utilizando un ensayo ELISA, por ejemplo puede identificarse una Ig humana utilizando anticuerpo anti-Ig humana adsorbida en Ig de raton.
La OX40 adecuada para generar anticuerpos puede producirse mediante cualquiera de entre una diversidad de tecnicas estandares de purificacion de protefnas o de expresion recombinante conocidas de la tecnica. Entre las formas de OX40 adecuadas para generar una respuesta inmunitaria se incluyen subsecuencias de OX40 tales como un fragmento inmunogenico. entre las formas adicionales de OX40 se incluyen celulas expresantes de OX40, preparaciones o extractos celulares o fracciones que contienen OX40, y OX40 parcialmente purificado.
En la presente memoria se describen celulas aisladas o purificadas que expresan anticuerpos de OX40, subsecuencias y fragmentos de los mismos, y acidos nucleicos codificantes de anticuerpos de OX40, y subsecuencias y fragmentos de los mismos. En una forma de realizacion, una celula aislada expresa un anticuerpo que presenta las secuencias de aminoacidos de la region variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo denominado 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5. Una celula aislada puede expresar un anticuerpo que
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presenta la especificidad de union de un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5. Una celula aislada puede expresar un anticuerpo que compite con el anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominado 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5 para la union de OX40. Una celula aislada puede expresar un anticuerpo que presenta una afinidad de union mayor o menos para OX40 que el anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5. La afinidad de union para OX40 puede se de entre aproximadamente 1 y 5.000 veces la de un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominado 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5. La afinidad de union para OX40 puede ser de entre aproximadamente KD 10'6 M y aproximadamente KD 10' 13 M la de un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5. Entre los ejemplos no limitativos especfficos de celulas aisladas o purificadas que expresan anticuerpos de OX40, subsecuencias y fragmentos de los mismos, y acidos nucleicos codificantes de anticuerpos de OX40, subsecuencias ya fragmentos de los mismos, se incluyen celulas de bazo, celulas de hibridoma y celulas CHO. Las celulas aisladas o purificadas pueden ser una pluralidad o poblacion de celulas de un aislado celular primario (por ejemplo esplenocitos), un aislado celular secundario o subcultivado, o un cultivo celular establecido o inmortalizado (hibridoma o celulas CHO)
En la presente memoria se proporcionan ademas procedimientos para producir anticuerpos que se unen especfficamente a OX40. Un procedimiento para producir un anticuerpo de OX40 puede incluir la administracion de OX40 humano, subsecuencia o fragmento (por ejemplo un dominio extracelular de OX40), opcionalmente conjugado con protefna recombinante Fc humana, en un animal capaz de expresar inmunoglobulina humana (por ejemplo un raton transgenico o una vaca transgenica), cribar el animal para la expresion de anticuerpo de OX40 humano y seleccionar un animal que produzca un anticuerpo de OX40 humano y aislar el anticuerpo a partir del animal seleccionado. El procedimiento puede determinar si el anticuerpo de OX40 humano presenta actividad antagonista o agonista de OX40.
En la presente memoria se indican procedimientos para producir anticuerpos de OX40 humanos que inhiben o impiden la union de OX40 a ligando de OX40 (OX40L). Un procedimiento para producir un anticuerpo de OX40 humano puede incluir administrar OX40, subsecuencia o fragmento (por ejemplo un dominio extracelular de OX40), opcionalmente conjugado con protefna recombinante Fc humana en un animal capaz de expresar inmunoglobulina humana (por ejemplo un raton transgenico o una vaca transgenica), cribar el animal para la expresion de anticuerpo de OX40 humano, seleccionar un animal que produce un anticuerpo de OX40 humano y aislar un anticuerpo a partir del animal seleccionado que produce anticuerpo de OX40 humano. El procedimiento puede determinar si el anticuerpo de OX40 humano inhibe o impide la union de OX40 a ligando de OX40 (OX40L).
En la presente memoria se describen animales transgenicos no humanos que expresan un anticuerpo de OX40 que presenta una o mas de las caracterfsticas siguientes: a) es identica a un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5, b) se une a un epftopo en una secuencia de aminoacido del dominio extracelular de OX40 al que se un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5, c) presenta una afinidad de union de OX40 de entre aproximadamente 1 y 5.000 veces la de un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominado 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5, d) presenta una afinidad de union a OX40 de entre aproximadamente KD 10'6 M y aproximadamente KD 10'12 de un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5, e) presenta la especificidad de union de un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5, o f) compite con un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5 para la union a OX40.
En la presente memoria se proporcionan ademas acidos nucleicos aislados o purificados codificantes de anticuerpos de OX40, o subsecuencias y fragmentos de los mismos. Una secuencia de acidos nucleicos puede codificar una secuencia de region variable de cadena pesada o ligera madura tal como se muestra en SEC ID n° 7 a n° 10 y SEC ID n° 44 a n° 49, o una subsecuencia de la misma. Una secuencia de acidos nucleicos puede comprender cualquiera de entre SEC ID n° 3 a n° 6 y SEC ID n° 38 a n° 43, y subsecuencias de las mismas. Una secuencia de acidos nucleicos puede comprender una secuencia degenerada con respecto a cualquiera de entre SEC ID n° 3 a n° 6 y SEC ID n° 38 a n° 43, y subsecuencias de las mismas.
Los acidos nucleicos pueden ser de diversas longitudes. Las longitudes de los acidos nucleicos codificantes de anticuerpos de OX40 indicados en la presente memoria o subsecuencias de los mismos tfpicamente presentan entre aproximadamente 100 y 600 nucleotidos, o cualquier valor o intervalo numerico comprendido dentro o que incluye dichas longitudes, 150 a 150, 150 a 200, 200 a 250, 250 a 300, 300 a 350, 350 a 400, 400 a 450, 450 a 500, 500 a 550 o aproximadamente 550 a 600 nucleotidos de longitud, o cualquier valor o intervalo numerico o valor comprendido dentro o que incluye dichas longitudes. Las longitudes de los acidos nucleicos que se hibridan especfficamente con los acidos nucleicos codificantes de los anticuerpos de OX40 indicados en la presente memoria o subsecuencias de los mismos tfpicamente se encuentran comprendidas entre aproximadamente 10 y 20, 20 y 30, 30 y 50, 50 y 100, 100 y 150, 150 y 200, 200 y 250, 250 y 300, 300 y 400, 400 y 500 o 500 y 600 nucleotidos, o cualquier valor o intervalo numerico comprendido dentro o que incluye dichas longitudes.
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Las expresiones "acido nucleico" y "polinucleotido" se refiere a por lo menos dos o mas pares de bases (nucleotidos) de acido ribo o desoxi-ribonucleico que se unen mediante un enlace fosfoester o equivalente. Entre los acidos nucleicos se incluyen polinucleotidos y polinucleosidos. Entre los acidos nucleicos se incluyen moleculas individuales, dobles o triplex, circulares o lineales. Entre los acidos nucleicos ejemplificativos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, ARN, ADN, ADNc, acidos nucleicos genomicos, acidos nucleicos naturales y no naturales, por ejemplo acidos nucleicos sinteticos. Los acidos nucleicos cortos y polinucleotidos (por ejemplo de 10 a 20, 20 a 30, 30 a 50 o 50 a 100 nucleotidos) se denominan comunmente "oligonucleotidos" o "sondas" del ADN de cadena sencilla o de doble cadena.
Se proporcionan acidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoacidos que presenta una o mas sustituciones, adiciones o deleciones de residuos aminoacidos de la secuencia de region variable de cadena pesada o ligera tal como se muestra en cualquiera de entre SEC ID n° 7 a n° 10 y SEC ID n° 44 a n° 49. En una forma de realizacion, la secuencia de region variable de cadena pesada o ligera sustituida, anadida o delecionada presenta una afinidad de union para un epftopo del dominio extracelular de OX40. La secuencia de region variable de cadena pesada o ligera sustituida, anadida o delecionada puede presentar una actividad de un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5, por ejemplo la modulacion de una funcion o actividad de OX40.
En la presente memoria se describen acidos nucleicos que se hibridan con un acido nucleico que codifica la totalidad o una subsecuencia de un anticuerpo de OX40 producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5 que presenta una complementariedad de por lo menos 80% a 90% o es homologa respecto a la secuencia de acidos nucleicos que codifica la totalidad o una subsecuencia o fragmento del anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5. La secuencia de acidos nucleicos puede presentar una longitud de entre aproximadamente 10 y 20, 20 y 30, 30 y 50, 50 y 100, 100 y 150, 150 y 200, 200 y 250, 250 y 300, 300 y 400, 400 y 500, 500 y 600 nucleotidos, o cualquier valor o intervalo numerico comprendido dentro o que incluye dichas longitudes. La secuencia de acidos nucleicos puede hibridarse con una secuencia de region variable de cadena pesada o ligera, o una parte de la misma (por ejemplo una RDC, una RM, etc.) de un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55o112Z5.
El termino "hibridar" y variaciones gramaticales del mismo se refiere a la union entre secuencias de acidos nucleicos. Las secuencias hibridantes generalmente presenta una homologfa superior a aproximadamente el 50% respecto a un acido nucleico que codifica una secuencia de aminoacidos de una secuencia de referencia (por ejemplo el anticuerpo de OX40). La region de hibridacion entre las secuencias hibridantes tfpicamente presenta por lo menos aproximadamente 12 a 15 nucleotidos, 15 a 20 nucleotidos, 20 a 30 nucleotidos, 30 a 50 nucleotidos, 50 a 100 nucleotidos, 100 a 200 nucleotidos, 300 a 400 nucleotidos o mas, o cualquier valor o intervalo numerico comprendido dentro o que incluye dichas longitudes.
Entre las secuencias de acidos nucleicos se incluyen ademas sustituciones, adiciones y deleciones de nucleotidos y nucleosidos, asf como formas derivatizadas y secuencias de fusion/quimericas (por ejemplo codificantes de anticuerpo de OX40 fusionado con un dominio heterologo). Por ejemplo, debido a la degeneracion del codigo genetico, entre los acidos nucleicos se incluyen secuencias y subsecuencias degeneradas con respecto a los acidos nucleicos que codifican el anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5. Otros ejemplos son acidos nucleicos complementarios a una secuencia que codifica un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5, subsecuencias y fragmentos de la misma.
Pueden producirse acidos nucleicos utilizando diversas tecnicas estandares de clonacion y sintesis quimica. Entre las tecnicas se incluyen, aunque sin limitacion, la amplificacion de acidos nucleicos, por ejemplo la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), con dianas de ADN genomico o ADNc utilizando cebadores (por ejemplo una mezcla de cebadores degenerados) capaces de hibridarse con una secuencia codificante del anticuerpo. Tambien pueden producirse acidos nucleicos mediante sintesis quimica (por ejemplo sintesis de fosforamidita en fase solida) o la transcripcion a partir de un gen. A continuacion, las secuencias producidas pueden traducirse in vitro o clonarse en un plasmido y propagarse y despues expresarse en una celula (por ejemplo una celula hospedadora tal como una levadura o bacteria, un eucariota tal como una celula animal o de mamffero, o en una planta).
Segun la invencion, se proporcionan ademas secuencias de acidos nucleicos de la invencion que incluyen vectores. Un vector puede incluir una secuencia de acidos nucleicos codificante de un anticuerpo de OX40, subsecuencia o fragmento del mismo. En formas de realizacion particulares, un vector incluye una secuencia de acidos nucleicos codificante de cualquier anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5, subsecuencia o fragmento de la misma.
Los vectores son vehfculos que pueden manipularse mediante insercion o incorporacion de un acido nucleico. Entre los vectores se incluyen vectores plasmfdicos, vfricos, procarioticos (bacterianos) y eucarioticos (vegetales, fungicos y de mamffero). Los vectores pueden utilizarse para la expresion de acidos nucleicos in vitro o in vivo. Dichos vectores, denominados "vectores de expresion" resultan utiles para introducir acidos nucleicos, incluyendo acidos
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Los vectores tambien pueden utilizarse para la manipulacion de los acidos nucleicos. Para la manipulacion genetica, pueden utilizarse "vectores de clonacion", y para transcribir o traducir el acido nucleico insertado, in vitro (por ejemplo en solucion o en fase solida), en celulas o en un sujeto in vivo.
Un vector generalmente contiene un origen de replicacion para la propagacion en una celula in vitro o in vivo. Pueden incluirse elementos de control, incluyendo elementos de control de la expresion, presentes dentro de un vector, para facilitar la transcripcion y traduccion, segun resulte apropiado.
Los vectores pueden incluir un marcador de seleccion. Un "marcador de seleccion" es un gen que permite la seleccion de las celulas que contienen el gen. La expresion "seleccion positiva" se refiere a un procedimiento de seleccion de las celulas que contienen el marcador de seleccion con la exposicion a la seleccion positiva. La resistencia a farmaco es un ejemplo de una seleccion positiva; las celulas-marcador, que contiene el marcador, sobreviven en un medio de cultivo que contiene el farmaco y las celulas que no presentan el marcador, moriran. Entre los marcadores de seleccion se incluyen genes de resistencia a farmaco tales como neo, que confiere resistencia a G418; hygr, que confiere resistencia a la higromicina, y puro, que confiere resistencia a la puromicina. Entre otros genes de marcador de seleccion positiva se incluyen genes que permiten la identificacion o cribado de celulas que contienen el marcador. Entre estos genes se incluyen genes para protefnas fluorescentes (GFP y cromoforos similares a CGP, luciferasa), el gen lacZ, el gen de la fosfatasa alcalina y marcadores de superficie tales como CD8, entre otros. La expresion "seleccion negativa" se refiere a un procedimiento en el que las celulas que contienen un marcador de seleccion negativa resultan eliminadas con la exposicion a un agente de seleccion negativa apropiado. Por ejemplo, las celulas que contienen el gen de la timidina cinasa del virus del herpes simplex (HSV-tk) (Wigler et al., Cell 11:223, 1977) son sensibles al farmaco ganciclovir (GANC). De manera similar, el gen gpt provoca que las celulas sean sensibles a la 6-tioxantina.
Entre los vectores vfricos se incluyen los basados en virus retrovirus (lentivirus para la infeccion de celulas en division, asf como las celulas no en division), los virus espumosos (patentes US n° 5.624.820, n° 5.693.508, n° 5.665.577, n° 6.013.516 y n° 5.674.703; documentos n° WO92/05266 y n° WO92/14829), adenovirus (patentes US n° 5.700.470, n° 5.731.172 y n° 5.928.944), virus adenoasociados (VAA) (patente US n° 5.604.090), vectores de virus herpes simplex (patente US n° 5.501.979), vectores basados en el citomegalovirus (CMV) (patente US n° 5.561.063), reovirus, genomas de rotavirus, virus 40 del simio (SV40) o virus del papiloma (Cone et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6349, 1984; Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman ed., 1982; Sarver et al., Mol. Cell. Biol. 1:486, 1981; patente US n° 5.719.054). Los adenovirus infecta eficientemente celulas de replicacion lenta y/o terminalmente diferenciadas y puede utilizarse para reconocer celulas de replicacion lenta y/o terminalmente diferenciadas. Entre los vectores vfricos adicionales utiles para la expresion se incluyen parvovirus, virus Norwalk, coronavirus, paramixovirus y rabdovirus, togavirus (por ejemplo virus sindbis y virus del bosque de Semliki) y el virus de la estomatitis vesicular (VEV).
Los vectores que incluyen un acido nucleico pueden expresarse al ligar operablemente el acido nucleico a un elemento de control de la expresion. La expresion "operablemente ligado" se refiere a una relacion ffsica o funcional entre los elementos referenciados que les permite funcionan de la manera pretendida. De esta manera, un acido "operablemente ligado" a un elemento de control de la expresion se refiere a que el elemento de control modula la transcripcion del acido nucleico y, segun resulte apropiado, la traduccion del transcrito.
Un "elemento de control de la expresion" o "secuencia de control de la expresion" es un polinucleotido que influye sobre la expresion de un acido nucleico operablemente ligado. Los promotores e intensificadores son ejemplos no limitativos particulares de elementos y secuencias de control de la expresion. Un "promotor" es una region reguladora del ADN de accion en cis capaz de iniciar la transcripcion de una secuencia de acidos nucleicos posterior (en direccion 3'). La secuencia promotora incluye nucleotidos que facilitan el inicio de la transcripcion. Los intensificadores tambien regulan la expresion de los acidos nucleicos pero pueden funcionar a distancia del sitio de inicio de la transcripcion del acido nucleico al que se encuentran operablemente ligados. Los intensificadores funcionan en el caso de que se encuentren situados en el extremo 5' o 3' del acido nucleico, asf como dentro del acido nucleico (por ejemplo intrones o secuencias codificantes). Entre los elementos de control de la expresion adicionales se incluyen secuencias lfder y secuencias de pareja de fusion, elementos de sitio de union ribosomica interna (IRES) para la creacion de mensajes multigenicos, o policistronicos, senal de procesamiento para intrones, el mantenimiento del marco de lectura correcto del gen para permitir la traduccion dentro del marco del ARNm, senal de poliadenilacion para proporcionar la poliadenilacion correcta del transcrito de interes, y codones de parada.
Entre los elementos de control de la expresion se incluyen elementos "constitutivos" en los que se produce la transcripcion de un acido nucleico operablemente ligado sin la presencia de una senal o estfmulos. Los elementos de control de la expresion que confieren expresion en respuesta a una senal o estfmulos, que incrementan o reducen la expresion del acido nucleico operablemente ligado, son "regulables". Un elemento regulable que incrementa la expresion de un acido nucleico operablemente ligado en respuesta a una senal o estfmulos se denomina "elemento inducible". Un elemento regulable que reduce la expresion del acido nucleico operablemente
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ligado en respuesta a una senal o estfmulos denominado "elemento reprimible" (es decir, la senal reduce la expresion; en el caso de que se elimine la senal o se encuentre ausente, se incrementa la expresion).
Para la expresion bacteriana, entre los promotores constitutivos se incluyen T7, asf como promotores inducibles tales como pL del bacteriofago A, plac, ptrp, ptac (promotor de hfbrido ptrp-lac). En sistemas de celulas de insecto, pueden utilizarse promotores constitutivos o inducibles (por ejemplo ecdisona). En la levadura, entre los promotores constitutivos se incluyen, por ejemplo, ADH o LEU2 y promotores inducibles tales como GAL (ver, por ejemplo, Ausubel et al., en: Current Protocols in Molecular Biology, vol. 2, cap. 13, ed., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, 1988; Grant et al., en: Methods in Enzymology 153:516-544, 1987, editores Wu & Grossman, 1987, Acad. Press, N.Y.; Glover, DNA Cloning, vol. II, cap. 3, IRL Press, Wash., D.C., 1986; Bitter, en: Methods in Enzymology 152:673-684, 1987, editores Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y., y Strathern et al., The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, editores, Cold Spring Harbor Press, vols. I y II, 1982).
Para la expresion en mamfferos, pueden utilizarse promotores constitutivos de origen vfrico o de otros orfgenes. Por ejemplo, el CMV, el SV40 o las repeticiones terminales largas (RTL) vfricas y similares, o los promotores inducibles derivados del genoma de las celulas de mamffero (por ejemplo el promotor IIA de la metalotionefna, el promotor de choque termico, los elementos de respuesta de esteroide/hormona tiroidea/acido retinoico) o de virus de mamffero (por ejemplo el promotor tardfo adenovfrico, las RTL de virus tumoral mamario de raton).
Entre los elementos de control de la expresion se incluyen elementos activos en un tipo particular de tejido o celula, denominados "elementos de control de la expresion especfficos de tejido". Los elementos de control de la expresion especfficos de tejido tfpicamente son mas activos en tipos celulares o de tejido especfficos debido a que son reconocidos por protefnas activadoras de la transcripcion u otros reguladores de la transcripcion activos en el tipo especffico de celula o tejido, en comparacion con otros tipos de celula o tejido. Son ejemplos no limitativos particulares de dichos elementos de control de la expresion, promotores tales como la hexocinasa II, COX-2, la alfa- protefna, el antfgeno carcinoembrionario, DE3/MUC1, el antfgeno prostatico especffico, C-erB2/neu, el polipeptido insulinotropico dependiente de glucosa (PIG), la telomerasa transcriptasa inversa y el promotor sensible a la hipoxia.
Segun la invencion, se proporcionan celulas hospedadoras transformadas o transfectadas con acido nucleico o vector de OX40 de la invencion. Entre las celulas hospedadoras se incluyen, aunque sin limitacion, celulas procarioticas y eucarioticas tales como bacterias, hongos (levaduras), vegetales, de insecto y animales (por ejemplo de mamffero, incluyendo de primate y humanas). Entre los ejemplos no limitativos de celulas transformadas se incluyen bacterias transformadas con acidos nucleicos de bacteriofago recombinantes, acidos nucleicos plasmfdicos o vectores de expresion cosmidos de acidos nucleicos; levaduras transformadas con vectores de expresion de levadura recombinantes; celulas vegetales infectadas por vectores de expresion vfricos recombinantes (por ejemplo virus del mosaico de la coliflor, VMCa; virus del mosaico del tabaco, VMT) o transformadas con vectores de expresion plasmfdicos recombinantes (por ejemplo el plasmido Ti); celulas de insecto infectadas por vectores de expresion vfricos recombinantes (por ejemplo baculovirus) y celulas animales infectadas por vectores de expresion vfricos recombinantes (por ejemplo retrovirus, adenovirus o virus Vaccinia), o celulas animales transformadas manipuladas para la expresion estable. Un ejemplo no limitativo de una celula hospedadora de mamffero que expresa anticuerpos de OX40, subsecuencias y fragmentos de la misma incluye una celula CHO. Las celulas hospedadoras pueden ser una pluralidad o poblacion de celulas de un aislado celular primario, una celula secundaria o subcultivada aislada, o un cultivo celular establecido o inmortalizado.
El termino "transformada" o "transfectada" utilizado en referencia a una celula (por ejemplo una celula hospedadora) u organismo se refiere a un cambio genetico en una celula tras la incorporacion de una molecula exogena, por ejemplo una protefna o acido nucleico (por ejemplo un transgen) en la celula. De esta manera, una celula "transfectada" o "transformada" es una celula, o progenie de la misma, en la que se ha introducido una molecula exogena de manera artificial, por ejemplo mediante tecnicas de ADN recombinante.
El acido nucleico o protefna puede transfectarse o transformarse (expresarse) estable o transitoriamente en la celula o progenie de la misma. La celula o celulas pueden propagarse y la protefna introducida expresarse, o transcribirse el acido nucleico. La progenie de una celula transfectada o transformada puede no ser identica a la celula parental, ya que pueden producirse mutaciones durante la replicacion.
Tfpicamente, la transfeccion o transformacion celular utiliza un vector. Un vector puede encontrarse comprendido dentro de una partfcula vfrica o vesfcula y opcionalmente dirigirse a tipos celulares particulares mediante inclusion de una protefna sobre la superficie de la partfcula o vesfcula que se une a un ligando o receptor de la celula diana. De esta manera, la partfcula vfrica o vesfcula misma, o una protefna sobre la superficie vfrica, puede hacerse que reconozca celulas para la transfeccion o transformacion in vitro, ex vivo o in vivo. De acuerdo con lo anterior, se encuentran incluidos los medios de vector vfrico y no vfrico de administracion en celulas, tejidos u organos, in vitro, in vivo y ex vivo.
La introduccion de acidos nucleicos en las celulas diana (por ejemplo celulas hospedadoras) tambien puede llevarse acabo mediante procedimientos conocidos de la tecnica, tales como el choque osmotico (por ejemplo el fosfato de calcio), la electroporacion, la microinyeccion, la fusion celular, etc. La introduccion del acido nucleico y el polipeptido
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in vitro, ex vivo e in vivo tambien puede llevarse a cabo utilizando otras tecnicas. Por ejemplo, una sustancia polimerica, tal como poliesteres, acidos poliamina, hidrogel, polivnilpirrolidona, etileno-acetato de vinilo, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, sulfato de protamina o copolfmeros de lactido/glicolido, copolfmeros de polilactico/glicolido o copolfmeros de etileno-acetato de vinilo. Un acido nucleico puede atraparse en microcapsulas preparadas mediante tecnicas de coacervado o mediante polimerizacion interfacial, por ejemplo mediante la utilizacion de mcirocapsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina, o microcapsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, o en un sistema coloidal. Entre los sistemas de dispersion coloidal se incluyen complejos de macromoleculas, nanocapsulas, microesferas, perlas y sistemas basados en lfpidos, incluyendo emulsiones de aceite-en-agua, micelas, micelas mixtas y liposomas.
Los liposomas para introducir diversas composiciones en las celulas son conocidos de la tecnica y entre ellos se incluyen, por ejemplo, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, lipofectina y DOTAP (por ejemplo las patentes US n° 4.844.904, n° 5.000.959, n° 4.863.740 y n° 4.975.282, y GIBCO-BRL, Gaithersburg, Md). Los lfpidos cationicos anfifflicos basados en piperazinas utiles para la terapia genica tambien son conocidos (ver, por ejemplo, la patente US n° 5.861.397). Los sistemas de lfpidos cationicos tambien son conocidos (ver, por ejemplo, la patente US n° 5.459.127). Las sustancias polimericas, microcapsulas y sistemas de dispersion coloidal, tales como liposomas, se denominan colectivamente en la presente memoria "vesfculas".
Los anticuerpos de OX40 de la invencion resultan utiles en aplicaciones de tratamiento, terapeuticas y diagnosticas, incluyendo en procedimientos clfnicos y diagnosticos. Por ejemplo, en un modelo de raton de enfermedad del injerto contra el huesped (EICH) aguda y cronica en el que se transfieren CMSP humanas a ratones inmunodeficientes combinados severos (SCID) irradiados, los anticuerpos antagonistas humanos anti-OX40 humano redujeron el numero de celulas T humanas y la patologfa de la enfermedad al administrarse antes o despues de la aparicion de la enfermedad. De esta manera, los anticuerpos de OX40 de la invencion son capaces de reducir, disminuir o bloquear un sfntoma de la enfermedad del injerto contra el huesped (EICH) en un modelo de enfermedad del injerto contra el huesped aguda o cronica y causar la remision o la regresion de la enfermedad del injerto contra el huesped en un modelo de enfermedad del injerto contra el huesped aguda o cronica (por ejemplo un raton inmunodeficiente (SCID)). Los anticuerpos de la invencion tambien fueron capaces de inducir la lisis de las celulas expresantes de OX40 por las celulas asesinas naturales. Aunque sin deseo de restringirse a ninguna teorfa en particular, la lisis de las celulas expresantes de OX40 podrfa deberse a la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).
Por lo tanto, los anticuerpos de OX40 de la invencion resultan utiles en el tratamiento o la terapia de trastornos y enfermedades que son susceptibles de modulacion o pueden responder favorablemente a la modulacion de una actividad o funcion de OX40. De esta manera, puede utilizarse un anticuerpo antagonista de OX40 para tratar trastornos, enfermedades, condiciones fisiologicas, patologfas y sfntomas de los mismos que son susceptibles o es probable que respondan favorablemente a la reduccion, disminucion, inhibicion, prevencion o bloqueo de la actividad o funcion de OX40, mientras que puede utilizarse un anticuerpo agonista de OX40 para tratar trastornos, enfermedades, condiciones fisiologicas, patologfas y sfntomas de los mismos que son susceptibles es probable que respondan favorablemente a la estimulacion, incremento, potenciacion, estimulacion o induccion de la actividad o funcion de OX40.
En la presente memoria se describen procedimientos de tratamiento de trastornos, enfermedades, condiciones, patologfas y sfntomas adversos o anormalidades asociados a respuestas inmunitarias no deseables o aberrantes. Tal como se utiliza en la presente memoria, una "respuesta inmunitaria no deseable" o "respuesta inmunitaria aberrante" se refiere a cualquier respuesta inmunitaria, actividad o funcion que sea superior o inferior de lo deseado o de lo fisiologicamente normal. Una respuesta inmunitaria, funcion o actividad no deseable puede ser una respuesta, funcion o actividad normal. De esta manera, las respuestas inmunitarias normales, la condicion de que resulten no deseables, aunque no se consideren aberrantes, se encuentran incluidas dentro del significado de dichas expresiones. Una respuesta inmunitaria, funcion o actividad no deseable tambien puede ser una respuesta, funcion o actividad anormal. Una respuesta inmunitaria, funcion o actividad anormal (aberrante) se desvfa de la normalidad. Las respuestas inmunitarias no deseables y aberrantes pueden ser humorales, celulares o una combinacion de las mismas, siendo cronicas o agudas.
Un ejemplo de una respuesta inmunitaria no deseable o aberrante es una respuesta inmunitaria que es excesiva, tal como en el caso de un trastorno o enfermedad autoinmunitaria (por ejemplo la autoinmunidad). Otro eejemplo de una respuesta inmunitaria no deseable o aberrante es una en la que la respuesta inmunitaria conduce a la inflamacion aguda o cronica en cualquier tejido u organo. Todavfa otro ejemplo de una respuesta inmunitaria no deseable o aberrante es una en la que la respuesta inmunitaria conduce a la destruccion de celulas, tejidos u organos, tal como un rechazo de trasplante, la enfermedad del injerto contra el huesped (EICH), un trastorno o enfermedad autoinmunitario, o la inflamacion. Todavfa otro ejemplo de una respuesta inmunitaria no deseable o aberrante es una en la que la respuesta inmunitaria es deficiente, tal como en donde la respuesta a un antfgeno es inferior a la deseada, por ejemplo se ha producido tolerancia.
Por lo tanto, entre las respuestas inmunitarias no deseables y aberrantes se incluyen los trastornos y enfermedades inmunitarios cronicos y agudos, caracterizados por condiciones y patologfas fisiologicos, y sfntomas adversos de anormalidades, dependiendo del trastorno o enfermedad. Entre los ejemplos no limitativos particulares de trastornos
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En la presente memoria se proporciona el tratamiento in vivo y procedimientos terapeuticos basados, por lo menos en parte, en la capacidad de los anticuerpos de OX40 de modular una actividad o funcion de OX40. Entre los trastornos, enfermedades, condiciones fisiologicas, patologfas y sfntomas susceptibles de responder o que podrfan responder al tratamiento o terapia con anticuerpos de OX40 de la invencion se incluyen, por ejemplo, una enfermedad o trastorno inmunitario cronico o agudo. En procedimientos adicionales de tratamiento, entre los trastornos, enfermedades, condiciones fisiologicas, patologfas y sfntomas susceptibles de tratamiento o terapia con anticuerpos de OX40 de la invencion se incluyen, por ejemplo, inflamacion, rechazo del trasplante, enfermedad del injerto contra el huesped (EICH), un trastorno o enfermedad autoinmunitario, tal como artritis reumatoide, esclerosis multiple, diabetes (por ejemplo diabetes mellitus insulino-dependiente, DMID, diabetes de tipo I), enfermedad de Crohn (EC), enfermedad intestinal inflamatoria (EII), colitis ulcerosa (CU), enfermedad celfaca, soriasis, lupus eritematoso sistemico (LES), nefritis del lupus proliferativo, miopatfa granulomatosa, polimiositis y una respuesta celular mediada por OX40 que resulta no deseable o aberrante, por ejemplo.
En la presente memoria se describen procedimientos en los que se utilizan anticuerpos de OX40, o subsecuencias o fragmentos de los mismos, para reducir, disminuir, inhibir, impedir o bloquear una enfermedad o trastorno inmunitario cronico o agudo, inflamacion, rechazo del trasplante, enfermedad del injerto contra el huesped (EICH), o trastorno autoinmunitario, tal como la artritis reumatoide, la esclerosis multiple, la diabetes (por ejemplo la diabetes mellitus insulino-dependiente, DMID, diabetes de tipo I), la enfermedad de Crohn (EC), la enfermedad intestinal inflamatoria (EII), la colitis ulcerosa (CU), la enfermedad celfaca, la soriasis, el lupus eritematoso sistemico (LES), la nefritis del lupus proliferativa, la miopatfa granulomatosa, la polimiositis o una respuesta celular mediada por OX40 que resulta no deseable o aberrante, tratamiento y reduciendo, disminuyendo, inhibiendo, impidiendo y bloqueando la inflamacion pulmonar en la hiperreactividad/hipersensibilidad de las vfas respiratorias (por ejemplo el asma o el asma alergica) y en otros tejidos y organos. Son ejemplos no limitativos especfficos de un sfntoma de la enfermedad del injerto contra el huesped tratable segun la invencion, la perdida de peso, la perdida de pelo, las erupciones cutaneas, la hematuria, el hidroperitoneo y los infiltrados celulares inflamatorios en el hfgado, el tracto intestinal, el pulmon, la piel y la muerte.
Los anticuerpos de OX40 tambien resultan utiles para reducir, disminuir, inhibir, impedir y bloquear la inflamacion presente en pulmon, articulaciones, musculos, piel, sistema nervioso central o periferico o intestino. Los anticuerpos de OX40 resultan adicionalmente utiles para reducir, disminuir, inhibir, impedir y bloquear la inflamacion que resulta de la respuesta de un sujeto a agentes infecciosos (por ejemplo agentes infecciosos bacterianos, vfricos o parasitarios).
Entre las afecciones adicionales susceptibles de tratamiento o terapia con anticuerpos de OX40 se incluyen, por ejemplo, osteoartritis, artritis soriatica, encefalomielitis, miastenia grave, tiroiditis autoinmunitaria, dermatitis atopica, dermatitis eccematosa, soriasis, sfndrome de Sjogren, ulcera aftosa, iritis, conjuntivitis, queratoconjuntivitis, lupus eritematoso cutaneo, escleroderma, vaginitis, proctitis, eritema nodoso leproso, uveitis autoinmunitaria, encefalomielitis alergica, encefalopatfa hemorragica necrotizante aguda, perdida de audicion sensorineural progresiva bilateral idiopatica, anemia aplasica, anemia pura de globulos rojos, trombocitopenia idiopatica (TPI), policondritis, granulomatosis de Wegener, hepatitis activa cronica, sfndrome de Stevens-Johnson, esprue idiopatico, lfquen plano, enfermedad de Graves, sarcoidosis, cirrosis biliar primaria, uveitis posterior, fibrosis pulmonar intersticial, tiroiditis de Hashimoto, sfndrome poliglandular autoinmunitario, infertilidad mediada inmunitariamente, enfermedad de Addison autoinmunitaria, penfigo vulgar, penfigo foliaceo, dermatitis herpetiforme, alopecia autoinmunitaria, vitiligo, anemia hemolftica autoinmunitaria, purpura trombocitopenica autoinmunitaria, anemia perniciosa, sfndrome de Guillain-Barre, sfndrome del hombre rfgido, fiebre reumatica aguda, fiebre, oftalmia simpatica, sfndrome de Goodpasture, vasculitis necrotizante sistemica, sfndrome antifosfolfpido, asma (por ejemplo asma alergico) y alergias.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "trasplante" y variaciones gramaticales del mismo se refieren a la injertacion, implantacion o trasplante de una celula, tejido u organo de una parte del cuerpo en otra parte, o de un individuo o animal en otro individuo o animal. Por lo tanto, la celula, tejido u organo trasplantado puede ser un aloinjerto o xenoinjerto. Entre las celulas trasplantadas ejemplificativas se incluyen celulas de medula osea, celulas madre hematopoyeticas, celulas madre de sangre periferica o celulas madre de sangre umbilical, celulas alogenicas o no alogenicas y celulas neurales. Entre los tejidos para trasplante ejemplificativos se incluyen la piel, vasos sangufneos, ojos y medula osea. Entre los organos de trasplante ejemplificativos se incluyen rinon, corazon, pulmon, pancreas e hfgado. El termino incluye ademas celulas, tejidos y organos modificados geneticamente, por ejemplo mediante terapia genica ex vivo en la que las celulas, tejidos u organos transformados se obtienen o se derivan de un sujeto (por ejemplo un ser humano o animal) que seguidamente recibe el trasplante de un sujeto diferente (por ejemplo ser humano o animal).
La inflamacion tratable segun la invencion incluye respuestas inflamatorias mediadas por OX40 o susceptibles de tratamiento con anticuerpo de OX40 debido a la modulacion de OX40, que a su vez pueden modular uno o mas de entre proliferacion, supervivencia o muerte celular, o la actividad de los linfocitos (por ejemplo celulas T efectoras, de
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memoria o reguladoras activadas), etc. Los procedimientos (por ejemplo el tratamiento) pueden resultar en una reduccion de la incidencia, frecuencia, gravedad, progresion o duracion de la inflamacion. Entre los sfntomas ejemplificativos de inflamacion se incluyen uno o mas de entre hinchazon, dolor, erupcion cutanea, cefalea, fiebre, nausea, rigidez de las articulaciones esqueleticas, o danos en los tejidos o celulas.
La inflamacion puede provocar, directa o indirectamente, danos en las celulas, tejidos u organos, en multiples celulas, tejidos u organos, o en un unico tipo celular, o tipo de tejido u organo.
Entre los tejidos y organos ejemplificativos que pueden mostrar danos se incluyen el tejido epidermico o mucoso, tracto gastrointestinal, intestino, pancreas, timo, hfgado, rinon, bazo, piel o una articulacion esqueletica (por ejemplo rodilla, tobillo, cadera, hombro, muneca, dedo de la mano o del piel, o codo). El tratamiento segun la invencion puede resultar en la reduccion, inhibicion o bloqueo de la progresion o agravamiento del dano a los tejidos, o conducir a la regeneracion de un organo o tejido danado, por ejemplo la piel, una mucosa o el hfgado.
Tal como se utiliza en la presente memoria, los terminos "tratar", "tratando" y "tratamiento", y variaciones gramaticales de los mismos, se refieren a un protocolo, regimen, procedimiento o remedio realizado en un sujeto o paciente individual, en el que se desea obtener un efecto o resultado fisiologico en dicho paciente. Por lo tanto, entre los procedimientos indicados en la presente memoria se incluyen, entre otros, los procedimientos de tratamiento y terapeuticos que proporcionan una mejora o efecto beneficioso medible en un trastorno, enfermedad, condicion fisiologica, patologfa o en un sfntoma en un sujeto dado. Una mejora o efecto beneficioso medible es cualquier mejora objetiva o subjetiva, transitoria, temporal o duradera e el trastorno, enfermedad, condicion fisiologica, patologfa o sfntoma, o una reduccion de la aparicion, gravedad, duracion o frecuencia de un sfntoma adverso asociado o causado por el trastorno, enfermedad, condicion fisiologica, patologfa o condicion. Un procedimiento indicado en la presente memoria no es necesario que tenga efecto de manera inmediata y puede producirse cierto retraso, aunque con el tiempo en un sujeto dado se producira una mejora o efecto beneficioso, estabilizacion o alivio.
Un resultado clfnico satisfactorio de un tratamiento tal como se indica en la presente memoria se consigue, por ejemplo, en el caso de que se produzca una disminucion o reduccion progresiva o parcial de la gravedad, duracion o frecuencia de una o mas patologfas, sfntomas adversos o complicaciones, asociadas al trastorno, enfermedad, patologfa o condicion, o la inhibicion, reduccion, bloqueo o reversion de una o mas de las manifestaciones o caracterfsticas fisiologicas, patologicas, bioqufmicas o celulares del trastorno, enfermedad, condicion fisiologica, patologfa o sfntoma (por ejemplo una enfermedad o trastorno inmunitario cronico o agudo, EICH, rechazo del trasplante, inflamacion o un trastorno autoinmunitario). Por lo tanto, un beneficio o mejora terapeutico podrfa ser pero no es necesariamente una curacion o anulacion de la mayorfa o de la totalidad de las patologfas, sfntomas adversos o complicaciones asociados o causados por el trastorno, enfermedad, condicion fisiologica, patologfa o sfntoma (por ejemplo una enfermedad o trastorno inmunitario cronico o agudo, EICH, rechazo del trasplante, inflamacion o un trastorno autoinmunitario). De esta manera, un beneficio o mejora terapeutico no resultara necesariamente en una curacion completa de cualquiera o de todas las patologfas, sfntomas adversos o complicaciones asociadas o causadas por el trastorno, enfermedad, condicion fisiologica o patologfa (por ejemplo una enfermedad o trastorno inmunitario cronico o agudo, EICH, rechazo del trasplante, inflamacion o un trastorno autoinmunitario).
Por ejemplo, la reduccion parcial, disminucion o inhibicion, o una estabilizacion o el enlentecimiento de la progresion o el agravamiento de una patologfa, sfntoma adverso o complicacion asociada o causada por el trastorno, enfermedad, condicion fisiologica o patologfa (por ejemplo una enfermedad o trastorno inmunitario cronico o agudo, EICH, rechazo del trasplante, inflamacion o un trastorno autoinmunitario), aunque sea solo durante unos cuantos dfas, semanas o meses, o incluso si persiste una o mas patologfas, sfntomas adversos o complicaciones asociadas o causadas por la enfermedad, trastorno, patologfa o condicion (por ejemplo una enfermedad o trastorno inmunitario cronico o agudo, EICH, rechazo del trasplante, inflamacion o un trastorno autoinmunitario) es un resultado clfnico satisfactorio.
En diversas formas de realizacion particulares, entre los procedimientos de tratamiento se incluyen el alivio o mejora de uno o mas sfntomas o consecuencias (ffsicos) adversos asociados a un trastorno o enfermedad inmunitario cronico o agudo. En diversas formas de realizacion particulares adicionales, entre los procedimientos de tratamiento se incluyen reducir, disminuir o impedir la aparicion, frecuencia, duracion o gravedad de uno o mas sfntomas o consecuencias ffsicas adversos asociados a la enfermedad del injerto contra el huesped (por ejemplo perdida de peso, perdida de pelo, erupciones cutaneas, hematuria, hidroperitoneo, infiltrados de celulas inflamatorias en el hfgado, tracto intestinal o pulmon, y la muerte), o resultan en una remision o regresion de la enfermedad del injerto contra el huesped, o resultan en la prevencion de la enfermedad del injerto contra el huesped. En diversas formas de realizacion particulares adicionales, entre los procedimientos de tratamiento se incluyen reducir, disminuir o impedir la aparicion, frecuencia, duracion o gravedad de uno o mas sfntomas o consecuencias ffsicas adversos asociados al trasplante o rechazo del injerto (por ejemplo una respuesta inmunitaria contra el trasplante o injerto, o la destruccion del trasplante o celulas del injerto), o resultan en una remision o regresion del trasplante o rechazo del injerto, o resultan en la prevencion del rechazo del trasplante o injerto. En diversas formas de realizacion particulares todavfa adicionales, entre los procedimientos de tratamiento se incluyen reducir, disminuir o impedir la aparicion, frecuencia, duracion o gravedad de uno o mas sfntomas o consecuencias ffsicas adversas asociadas a la artritis reumatoide,
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esclerosis multiple, diabetes (por ejemplo la diabetes mellitus insulino-dependiente, DMID, diabetes de tipo I), la enfermedad de Crohn (EC), la enfermedad intestinal inflamatoria (EII), la colitis ulcerosa (CU), la enfermedad celfaca, la soriasis, el lupus eritematoso sistemico (LES), la nefritis del lupus proliferativa, la miopatfa granulomatosa, la polimiositis, o una respuesta celular mediada por OX40 que no resulta deseable o es aberrante. En diversas formas de realizacion particulares todavfa adicionales, entre los procedimientos de tratamiento se incluyen reducir el numero o proliferacion de las celulas autorreactivas o de las celulas productoras de anticuerpos antiautoprotefnas, inhibiendo o bloqueando un incremento del numero, proliferacion o supervivencia de las celulas autorreactivas o de las celulas productoras de anticuerpos anti-autoprotefnas.
En el caso de un trastorno o enfermedad inmunitaria, una mejora o efecto beneficioso medible incluye modular el numero, la proliferacion o una actividad de los linfocitos (por ejemplo las celulas T efectoras, de memoria o reguladoras activadas) hacia niveles de lfnea base fisiologicamente normales y se considera un resultado de tratamiento satisfactorio. Un ejemplo adicional de una mejora o efecto beneficioso medible para un trastorno inmunitario o una enfermedad inmunitaria es una mejora en un cambio histopatologico causado o asociado al trastorno o enfermedad inmunitaria. Por ejemplo, bloquear la progresion o reducir la infiltracion en articulaciones esqueleticas o destruccion de tejidos, o la infiltracion o destruccion de tejido en pancreas, timo, rinon, hfgado, bazo, tejido epidermico (piel) o mucoso, tracto digestivo o intestino.
En la presente memoria se describen procedimientos de bloqueo, inhibicion, prevencion, reduccion o disminucion de la union de un ligando de OX40 (OX40L) a celulas T activadas o a OX40, in vitro o in vivo. En una forma de realizacion, un procedimiento incluye poner en contacto celulas T activadas con un anticuerpo de OX40 eficaz para inhibir o impedir la union de un ligando de OX40 a las celulas T activadas. En otra forma de realizacion, un procedimiento incluye poner en contacto OX40 con un anticuerpo de OX40 eficaz para inhibir o impedir la union de un ligando de OX40 a OX40. En aspectos particulares, se lleva a cabo un procedimiento en un sujeto que requiere el bloqueo, reduccion, disminucion, inhibicion o prevencion de la union de un ligando de OX40 (OX40L) a celulas T activadas, opcionalmente con una composicion farmaceutica de OX40.
En la presente memoria se describen procedimientos para modular la senalizacion celular mediada por OX40, in vitro o in vivo. Un procedimiento puede incluir administrar en un sujeto que necesita modular la senalizacion celular mediada por OX40, un anticuerpo de OX40 eficaz para modular la senalizacion celular mediada por OX40.
En la presente memoria se describen procedimientos para reducir el numero de celulas T efectoras, de memoria o reguladoras activadas, in vitro o in vivo. Un procedimiento puede incluir la administracion en el sujeto que requiere un numero reducido de celulas T efectoras, de memoria o reguladoras activadas, de una cantidad de anticuerpo de OX40 suficiente para reducir el numero de celulas T efectoras, de memoria o reguladoras activadas.
En la presente memoria se describen procedimientos de tratamiento de una enfermedad o trastorno causada por celulas T efectoras, de memoria o reguladoras activadas. Un procedimiento puede incluir la administracion en un sujeto de una cantidad de un anticuerpo de OX40 suficiente para reducir, disminuir o bloquear la progresion de la enfermedad o trastorno causado por celulas T efectoras, de memoria o reguladoras activadas, o para reducir el numero de celulas T efectoras, de memoria o reguladoras activadas. La enfermedad o trastorno puede comprender la enfermedad del injerto contra el huesped, inflamacion o un trastorno autoinmunitario.
En la presente memoria se describen procedimientos para reducir el numero de celulas T activadas en la sangre, bazo, nodulos linfaticos, intestinos, hfgado, pulmon o piel en un sujeto. Un procedimiento puede incluir la administracion en el sujeto de una cantidad de un anticuerpo de OX40 suficiente para reducir el numero de celulas T activadas en la sangre, bazo, nodulos linfaticos, intestinos, hfgado, pulmon o piel. Un procedimiento para reducir el numero de celulas T activadas en la sangre, bazo, nodulos linfaticos, intestinos, hfgado, pulmon o piel puede ser en un modelo de enfermedad de injerto contra huesped aguda o cronica.
Las composiciones y procedimientos indicados en la presente memoria pueden combinarse con cualquier otro tratamiento o terapia que proporcione un efecto deseado. En particular, son aplicables tratamientos y terapias que se han caracterizado como que presentan un efecto complementario o sinergico. Entre los tratamientos y terapias ejemplificativos se incluyen agentes o farmacos inmunosupresores. Dichos tratamientos y terapias inmunosupresores pueden llevarse a cabo antes o de manera sustancialmente contemporanea con otros procedimientos indicados en la presente memoria de la invencion, por ejemplo un tratamiento o terapia.
En la presente memoria se describen procedimientos de combinacion en los que los procedimientos de la presente exposicion se utilizan en una combinacion con cualquier regimen terapeutico, protocolo de tratamiento o composicion, tal como un protocolo, agente o farmaco inmunosupresor indicado en la presente memoria o conocido de la tecnica. Un procedimiento puede incluir administrar un anticuerpo de OX40, subsecuencia o fragmento del mismo, y un tratamiento, agente o farmaco inmunosupresor. El tratamiento, agente o farmaco inmunosupresor puede administrarse antes, de manera sustancialmente contemporanea o tras la administracion de anticuerpo de OX40, o subsecuencia o fragmento del mismo en un sujeto.
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Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "inmunosupresor" o variaciones gramaticales del mismo, utilizado en referencia a un tratamiento, terapia, agente o farmaco se refiere a que el tratamiento, terapia, agente o farmaco proporciona una reduccion, disminucion, inhibicion o bloqueo de una respuesta inmunitaria, humoral o celular. Dichas terapias pueden suprimir la respuesta inmunitaria, generalmente o sistemicamente, o suprimir la respuesta inmunitaria en una region o localizacion especffica.
Entre las clases no limitativas especfficas de agentes y farmacos inmunosupresores se incluyen agentes alquilantes, antimetabolitos, extractos vegetales, alcaloides vegetales, nitrosoureas, hormonas (esteroides, tales como glucocorticoides), nucleosidos y analogos de nucleotido. Entre los ejemplos especfficos de farmacos inmunosupresores se incluyen ciclofosfamida, azatioprina, ciclosporina A, tacrolimus (FK506), rapamicina, metotrexato, FTY720, inhibidores de cox-2 e itnerleucinas (por ejemplo IL-12).
Los anticuerpos policlonales y monoclonales son un ejemplo particular de un tratamiento o terapia inmunosupresor. Entre los anticuerpos inmunosupresores se incluyen, por ejemplo, infliximab (Remicade®), Rituxan®, Atgam® y Thymoglobuline®, Xenapax®, Simulect®, Humira®, Raptiva® , Tysabri® y Orthoclone® (OKT3).
Entre los procedimientos de la presente exposicion se incluyen ademas, entre otros, procedimientos que resultan en una menor necesidad o uso de otro protocolo de tratamiento o regimen terapeutico, procedimiento o remedio. Por ejemplo, para la inflamacion, la EICH o un trastorno autoinmunitario, un procedimiento de la presente exposicion presenta un beneficio terapeutico en el caso de que en un sujeto dado resulte una dosis menos frecuente o reducida o la eliminacion de un tratamiento o terapia inmunosupresor.
De esta manera, en la presente memoria se proporcionan procedimientos para reducir la necesidad o uso de un tratamiento o terapia inmunosupresor. Un procedimiento puede incluir administrar un anticuerpo de OX40, fragmento o subsecuencia del mismo en un sujeto que esta sometido o ha sido sometido a terapia inmunosupresora. Un procedimiento puede incluir administrar un anticuerpo de OX40, fragmento o subsecuencia del mismo en una cantidad eficaz para reducir la dosis, frecuencia o duracion o que elimine la necesidad de un tratamiento o terapia inmunosupresor de la inflamacion, la EICH o un trastorno autoinmunitario. Los procedimientos pueden llevarse a cabo antes, de manera sustancialmente contemporanea o despues de la administracion de un tratamiento o terapia inmunosupresor.
Las dosis o "cantidad eficaz" o "cantidad suficiente" en un procedimiento de tratamiento o terapia en el que se dese conseguir un beneficio o mejora terapeutico incluye, por ejemplo, cualquier alivio o mejora objetivo o subjetivo de una, varias o todas las patologfas, sfntomas adversos o complicaciones asociados o causados por la enfermedad, trastorno o patologfa diana, o un sfntoma adverso o complicacion, en un grado medible o detectable. La prevencion, inhibicion o retraso de una progresion o del agravamiento de la enfermedad, trastorno o patologfa diana, o de un sfntoma adverso o complicacion tambien es un resultado satisfactorio. Una cantidad suficiente o una cantidad eficaz se refiere a suficiencia o eficacia en un sujeto particular, no un grupo de sujetos o la poblacion general. De esta manera, la "cantidad eficaz" o "cantidad suficiente" sera suficiente para proporcionar un efecto terapeutico en un sujeto dado.
Una cantidad suficiente o una cantidad eficaz puede proporcionarse aunque no necesariamente en una unica administracion y puede, aunque no necesariamente, administrarse sola o en combinacion con otro tratamiento, protocolo o regimen terapeutico. Por ejemplo, la cantidad puede incrementarse proporcionalmente tal como indique la necesidad del sujeto, el estado del trastorno, la enfermedad o condicion tratada o los efectos secundarios del tratamiento. Ademas, una cantidad suficiente o una cantidad eficaz no es necesario que resulte suficiente o eficaz en caso de administrarse en una unica dosis o en multiples dosis sin un segundo tratamiento, protocolo o regimen terapeutico, ya que pueden incluirse dosis o cantidades adicionales, o una duracion superior y posterior a dichas dosis, o tratamientos, protocolos o regfmenes terapeuticos adicionales para que resulten eficaces o suficientes en un sujeto dado. Las cantidades consideradas eficaces o suficientes incluyen ademas cantidades que resultan en una reduccion dela utilizacion de otro tratamiento, regimen terapeutico o protocolo.
Las cantidades (dosis) no limitativas ejemplificativas se encuentran comprendidas en un intervalo de entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 100 mg/kg y cualquier valor o intervalo numerico o valor comprendido dentro de dichos intervalos. Pueden administrarse cantidades (dosis) superiores o inferiores, por ejemplo 0,01 a 500 mg/kg, y cualquier valor o intervalo numerico o valor comprendido dentro de dichos intervalos. Las cantidades (dosis) no limitativas ejemplificativas adicionales se encuentran comprendidas entre aproximadamente 0,5 y 50 mg/kg, entre 1,0 y 25 mg/kg, entre 1,0 y 10 mg/kg, y cualquier valor o rango numerico o valor comprendido dentro de dichos intervalos.
Los procedimientos indicados en la presente memoria pueden ponerse en practica mediante cualquier modo de administracion o dosificacion, o por cualquier via, administracion o dosificacion sistemica, regional y local. Entre las vfas ejemplificativas de administracion y dosificacion se incluyen las vfas intravenosa, intraarterial, intradermica, intramuscular, subcutanea, intrapleural, transdermica (topica), transmucosa, intracraneal, intraespinal, intraocular, rectal, oral (alimentaria) y mucosa.
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Los procedimientos indicados en la presente memoria pueden ponerse en practica una o mas veces (por ejemplo 1 a 10, 1 a 5 o 1 a 3 veces) al dfa, semana, mes o ano. El experto en la materia conocera en que momento resulta apropiado retrasar o interrumpir la administracion. Un programa de administracion no limitativo es 1 a 7 veces a la semana, durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 o mas semanas, y cualquier valor o intervalo numerico, o valor comprendido dentro de dichos intervalos.
Evidentemente, tal como resulta tfpico para cualquier tratamiento o terapia, diferentes sujetos mostraran diferentes respuestas al tratamiento y algunos podnan no responder o responder inadecuadamente a un protocolo, regimen o procedimiento de tratamiento particular, Por lo tanto, las cantidades eficaces o suficientes dependeran por lo menos en parte de la enfermedad, trastorno, patologfa tratada (por ejemplo inflamacion, EICH, rechazo del trasplante o un trastorno autoinmunitario, y si esta en estadio avanzado, tardm o temprano), el efecto terapeutico deseado, asf como el sujeto individual (por ejemplo la biodisponibilidad en el sujeto, el genero, la edad, etc.) y la respuesta del sujeto al tratamiento o terapia, que se basara, en parte, en la variabilidad genetica y epigenetica (por ejemplo la farmacogenomica). Ademas, debido a cada sujeto o paciente tratado puede no responder a un tratamiento o procedimiento terapeutico, protocolo, regimen, procedimiento o remedio particular, los procedimientos de tratamiento o terapeuticos no resultan necesarios para conseguir una mejora o efecto beneficioso, resultado clmico o resultado deseado medible particular, en todos y cada uno de los sujetos o pacientes o en una poblacion dada tratada de esta manera. De acuerdo con lo anterior, un sujeto o paciente, o poblacion dado puede no responder, responder inadecuadamente o puede mostrar respuestas no deseables, tales como un efecto secundario, a un procedimiento de tratamiento o terapeutico indicado en la presente memoria.
Los terminos "sujeto" y "paciente" se utilizan intercambiablemente en la presente memoria y se refieren a animales, tfpicamente marnfferos, tales como seres humanos, primates no humanos (gorila, chimpance, orangutan, macaco, gibon), animales domesticos (perro y gato), animales de granja y ganadena (caballo, vaca, cabra, oveja, cerdo), animales de laboratorio y experimentales (raton, rata, conejo, cobaya). Entre los sujetos se incluyen animales modelo de enfermedad (por ejemplo tales como ratones, ratas y primates no humanos) para el estudio de la eficacia in vivo (por ejemplo un modelo animal de EICH). Entre los sujetos humanos se incluyen ninos, por ejemplo, neonatos, bebes, ninos pequenos y adolescentes, entre las edades de 1 y 5, 5 y 10, y 10 y 18 anos, adultos de edades comprendidas entre 18 y 60 anos, y personas de edad avanzada, por ejemplo de edades comprendidas entre 60 y 65, entre 65 y 70, y entre 70 y 100 anos.
Entre los sujetos se incluyen marnfferos (por ejemplo seres humanos) que requieren tratamiento, es decir, que presentan una enfermedad, trastorno, patologfa o smtoma de los mismos que es susceptible o que podna responder al tratamiento o terapia con un anticuerpo de OX40, subsecuencia o fragmento. Entre los sujetos se incluyen los que presentan o estan en riesgo de presentar un trastorno o enfermedad inmunitaria cronica o aguda, inflamacion, ElCH, rechazo del trasplante, inflamacion, una enfermedad autoinmunitaria o una respuesta celular mediada por OX40. Entre los sujetos se incluyen ademas aquellos que son candidatos para el tratamiento o que han sido tratados para uno o mas de entre: un trastorno o enfermedad inmunitaria cronica o aguda, EICH, rechazo del trasplante, inflamacion, una enfermedad autoinmunitaria o una respuesta celular mediada por OX40. De esta manera, un sujeto que es un candidato o que ha recibido un trasplante o injerto celular, de tejidos u organos, o de medula osea, celulas madre hematopoyeticas, celulas madre de sangre periferica o celulas madre de sangre umbilical, celulas alogenicas o no alogenicas, o celulas neurales, es un candidato para el tratamiento con un anticuerpo de OX40.
Entre los sujetos se incluyen ademas aquellos que requieren tratamiento o terapia inmunosupresor debido a un diagnostico de laboratorio o clmico que justifique dicho tratamiento, sujetos sometidos a tratamiento o terapia inmunosupresor (por ejemplo debido a un trasplante) y sujetos que han sido sometidos a un tratamiento o terapia inmunosupresor, y que estan en riesgo de recafda o recurrencia. Entre los sujetos de riesgo se incluyen aquellos con una historia familiar, predisposicion genetica o que han sufrido anteriormente de una enfermedad o trastorno inmunitario cronico o agudo, inflamacion, EICH, rechazo del trasplante, inflamacion, una enfermedad autoinmunitaria o una respuesta celular mediada por OX40. Dichos sujetos de riesgo pueden ser identificados utilizando cribados, tales como celulas T autorreactivas o anticuerpos anti-autoprotemas. Por ejemplo, los sujetos que expresan factor reumatoide estan en riesgo de artritis reumatoide. Los sujetos que expresan anticuerpos contra PBM, GOM o PPL estan en riesgo de esclerosis multiple.
Por lo tanto, los sujetos de riesgo pueden tratarse con el fin de inhibir o reducir la probabilidad de desarrollar una enfermedad o trastorno inmunitario cronico o agudo, inflamacion, EICH, rechazo del trasplante, inflamacion, una enfermedad autoinmunitaria, o una respuesta celular mediada por OX40, o que sufren de una recafda o recurrencia de una enfermedad o trastorno inmunitario cronico o agudo, inflamacion, EICh, rechazo del trasplante, inflamacion, una enfermedad autoinmunitario o una respuesta celular mediada por OX40. El resultado de dicho tratamiento puede ser reducir el riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno inmunitario cronico o agudo, inflamacion, EICH, rechazo del trasplante, inflamacion, una enfermedad autoinmunitaria, o una respuesta celular mediada por OX40.
Los anticuerpos, acidos nucleicos y otras composiciones y procedimientos indicados en la presente memoria pueden incluirse dentro de formulaciones farmaceuticas o utilizarlas. Dichas formulaciones farmaceuticas resultan utiles para el tratamiento, administracion o dosificacion en un sujeto in vivo local, regional o sistemicamente, o ex vivo.
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Entre las formulaciones farmaceuticas se incluyen portadores, diluyentes o excipientes "farmaceuticamente aceptables" y "fisiologicamente aceptables". Entre las expresiones "farmaceuticamente aceptable" y "fisiologicamente aceptable" se incluyen solventes (acuosos o no acuosos), soluciones, emulsiones, medios de dispersion, recubrimientos, isotonicos y estimuladores de la absorcion o agentes retardantes, compatibles con la administracion farmaceutica. Dichas formulaciones pueden estar contenidas en un lfquido, emulsion, suspension, jarabe o elixir, o forma solida, tableta (recubierta o no recubierta, de liberacion inmediata, retardada, continua o pulsatil), capsula (dura o blanda, de liberacion inmediata, retardada, continua o pulsatil), polvos, granulos, cristales o microperlas. Tambien pueden incorporarse en las formulaciones compuestos complementarios (por ejemplo conservantes, agentes antibacterianos, antivfricos y antifungicos).
Las formulaciones farmaceuticas pueden prepararse para ser compatibles con una via de administracion o dosificacion local, regional o sistemica particular. De esta manera, entre las formulaciones farmaceuticas se incluyen portadores, diluyentes o excipientes adecuados para la administracion por vfas particulares. son ejemplos no limitativos especfficos de vfas de administracion para composiciones de la invencion, las vfas parenteral, por ejemplo intravenosa, intraarterial, intradermica, intramuscular, subcutanea, intrapleural, transdermica (topica), transmucosa, intracraneal, intraespinal, intraocular, rectal, oral (alimentaria), administracion mucosa, y cualquier otra formulacion adecuada para el procedimiento de tratamiento o el protocolo de administracion.
Entre las soluciones o suspensiones utilizadas par ala aplicacion parenteral pueden incluirse: un diluyente esteril, tal como agua para inyeccion, solucion salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros solventes sinteticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencflico o metilparabenos; antioxidantes tales como acido ascorbico o bisulfito sodico; agentes quelantes tales como acido etilen-diamina-tetraacetico; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos, y agentes para el ajuste de la tonicidad, tales como cloruro sodico o dextrosa. El pH puede ajustarse con acidos o bases, tales como acido clorhfdrico o hidroxido sodico.
Entre las formulaciones farmaceuticas para inyeccion se incluyen soluciones acuosas esteriles (en caso de ser solubles en agua) o dispersiones y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de soluciones o dispersiones inyectables esteriles. Para la administracion intravenosa, entre los portadores adecuados se incluyen solucion salina fisiologica, agua bacteriostatica, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, NJ) o solucion salina tamponada con fosfato (PBS). El portador puede ser un solvente o medio de dispersion que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo glicerol, propilenglicol y polietilenglicol lfquido, y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez puede mantenerse, por ejemplo, mediante la utilizacion de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partfcula requerido en el caso de una dispersion y mediante la utilizacion de surfactantes. Entre los agentes antibacterianos y antifungicos se incluyen, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, acido ascorbico y timerosal. Pueden incluirse en la composicion agentes isotonicos, por ejemplo azucares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol y cloruro sodico. La inclusion de un agente que retrasa la absorcion, por ejemplo monoestearato de aluminio o gelatina, puede prolongar la absorcion de las composiciones inyectables.
Pueden prepararse formulaciones inyectables esteriles mediante la incorporacion de la composicion activa en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinacion de los ingredientes anteriormente indicados. Generalmente, se preparan dispersiones mediante la incorporacion dela composicion activa en un vehfculo esteril que contiene un medio de dispersion basico y cualquier otro ingrediente. En el caso de los polvos esteriles para la preparacion de soluciones inyectables esteriles, entre los procedimientos de preparacion se incluyen, por ejemplo, el secado al vacfo y la liofilizacion, que rinde unos polvos del ingrediente activo 'mas cualquier ingrediente deseado adicional de una solucion previamente preparada de los mismos.
Para la administracion transmucosa o transdermica, se utilizan en la formulacion penetrantes apropiados a la barrera que debe permearse. Dichos penetrantes son conocidos de la tecnica, y entre ellos se incluyen, por ejemplo, para la administracion mucosa, detergentes, sales biliares y derivados del acido fusfdico. La administracion transmucosa puede llevarse a cabo mediante la utilizacion de sprays nasales, dispositivos de inhalacion (por ejemplo aspiradores) o supositorios. Para la administracion transdermica, los compuestos activos se formulan en pomadas, unguentos, geles, cremas o parches.
Las formulaciones farmaceuticas pueden prepararse con portadores que protegen frente a la rapida eliminacion del cuerpo, tal como una formulacion de liberacion controlada o un material de retardo temporal, tal como monoestearato de glicerilo o estearato de glicerilo. Las formulaciones tambien pueden administrarse utilizando artfculos fabricados, tales como implantes y sistemas de administracion microencapsulados para conseguir la administracion local, regional o sistemica o la liberacion controlada o sostenida.
Pueden utilizarse polfmeros biocompatibles biodegradables, tales como etileno-acetato de vinilo, polianhfdridos, acido poliglicolico, colageno, poliortoesteres y acido polilactico. Los procedimientos de preparacion de dichas formulaciones son conocidos por el experto en la materia. Los materiales tambien pueden obtenerse comercialmente de Alza Corporation (Palo Alto, CA). Tambien pueden utilizarse suspensiones liposomicas (incluyendo liposomas con diana en celulas o tejidos utilizando anticuerpos o protefnas de cubierta vfrica) como portadores
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Las formulaciones farmaceuticas adicionales apropiadas para la administracion son conocidas de la tecnica (ver, por ejemplo, Gennaro (ed.), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 2000; Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7a ed., Lippincott, Williams & Wilkins Publishers, 1999; Kibbe (ed.), Handbook of Pharmaceutical Excipients, American Pharmaceutical Association, 3a ed., 2000, y Remington's Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms, Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa., 1993).
Las composiciones utilizadas tales como las indicadas en la presente memoria, incluyendo anticuerpos de OX40, acidos nucleicos, tratamientos, terapias, agentes, farmacos y formulaciones farmaceuticas, pueden empaquetarse en una forma de administracion unitaria para facilitar la administracion y la uniformidad de la dosis. La expresion "forma de administracion unitaria" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a unidades ffsicamente discretas adecuadas como tratamiento de dosis unitarias; cada unidad contiene una cantidad de la composicion asociada con el portador, excipiente, diluyente o vehfculo calculado para producir el tratamiento o efecto terapeutico (por ejemplo beneficioso) deseado. Las formas de administracion unitarias dependeran de una diversidad de factores, incluyendo, aunque no necesariamente limitadas a, la composicion particular utilizada, el efecto que debe conseguirse y la farmacodinamica y farmacogenomica del sujeto que debe tratarse.
La exposicion proporciona ademas kits, incluyendo anticuerpos de OX40, acidos nucleicos, agentes, farmacos y formulaciones farmaceuticas, empaquetadas en material de envasado adecuado, opcionalmente en combinacion con instrucciones para utilizar los componentes del kit, por ejemplo instrucciones para llevar a cabo el procedimiento indicado en la presente memoria. Un kit puede incluir un anticuerpo de OX40, subsecuencia o fragmento, e instrucciones para detectar OX40. Un kit puede incluir un anticuerpo de OX40, subsecuencia o fragmento, e instrucciones para tratar un sujeto que requiere tratamiento (por ejemplo un sujeto que presenta una enfermedad, trastorno, patologfa o condiciones susceptibles de responder o que pueden responder al tratamiento o terapia) con el anticuerpo de OX40, subsecuencia o fragmento. Las instrucciones pueden ser para tratar una enfermedad o trastorno inmunitario cronico o agudo, inflamacion, EICH, rechazo del trasplante, inflamacion, una enfermedad autoinmunitario o una respuesta celular mediada por OX40. Un kit puede incluir un tratamiento, terapia o agente inmunosupresor.
La expresion "material de envasado" se refiere a una estructura ffsica que aloja los componentes del kit. El material de envasado puede mantener los componentes bajo condiciones esteriles y puede estar realizado en material utilizado comunmente para dichos fines (por ejemplo papel, fibra corrugada, vidrio, plastico, papel de aluminio, ampollas, etc.). La etiqueta o instrucciones en el envase pueden incluir instrucciones escritas apropiadas, por ejemplo un procedimiento diagnostico o de tratamiento de la invencion. Por lo tanto, las instrucciones pueden incluir instrucciones para la puesta en practica de cualquiera de los procedimientos indicados en la presente memoria. De esta manera, en diversas formas de realizacion, un kit incluye una etiqueta o unas instrucciones en el paquete que incluyen instrucciones para poner en practica un procedimiento indicado en la presente memoria en solucion, in vitro, in vivo o ex vivo. En un aspecto, las instrucciones incluyen administrar o dosificar el anticuerpo de OX40, subsecuencia o fragmento, en un sujeto local, regional o sistemicamente, en el procedimiento de tratamiento o terapeutico de la invencion.
Las instrucciones pueden incluir adicionalmente indicaciones de un resultado clfnico satisfactorio o cualesquiera sfntomas adversos o complicaciones que pueden producirse. Las instrucciones pueden incluir ademas informacion para el almacenamiento, data de caducidad, o cualquier informacion requerida por las agencias reguladoras, tal como la Food and Drug Administration, para la utilizacion en un sujeto humano.
Las instrucciones pueden encontrarse sobre "material impreso", por ejemplo sobre papel o carton dentro del kit, sobre una etiqueta fijada al kit o material de envasado, o adherida a un vial o tubo que contiene un componente del kit. Las instrucciones pueden comprender un medio de audio o video y adicionalmente estar incluidas en un medio legible por ordenador, tal como un disco (disco extraible o disco duro), CD optico, tal como CD- o DVD-ROM/RAM, cinta magnetica, medio de almacenamiento electronico, tal como RAM y ROM, e hibridos de los mismos, tales como medios de almacenamiento magnetico/optico.
Los kits de la invencion pueden incluir adicionalmente un agente tamponador, un conservante o un agente estabilizador. El kit puede incluir ademas componentes de control para someter a ensayo la actividad, por ejemplo una muestra de control o un estandar. Cada componente del kit puede estar incluido dentro de un envase individual o en una mezcla, y todos los diversos envases pueden encontrarse dentro de un unico paquete o en multiples paquetes.
En la presente memoria se describen procedimientos de cribado, deteccion e identificacion de OX40 sin celulas (por ejemplo en solucion o en fase solida) y celulares (por ejemplo in vitro o in vivo). Los procedimientos pueden llevarse a cabo en solucion, in vitro utilizando un material o muestra biologico, e in vivo, por ejemplo un amuestra de celulas (por ejemplo linfocitos) procedentes de un animal. Un procedimiento puede incluir poner en contacto un material o
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muestra biologico con un anticuerpo que se une a OX40 bajo condiciones que permiten la union del anticuerpo de OX40, y someter a ensayo para la union del anticuerpo a OX40. La union del anticuerpo a OX40 detecta la presencia de OX40. En un aspecto, OX40 se encuentra presente sobre una celula o tejido. En otro aspecto, el material o muestra biologico se obtiene de un sujeto mamffero.
La expresion "poner en contacto" utilizada en referencia a una composicion, tal como una protefna (por ejemplo el anticuerpo de OX40), material, muestra o tratamiento, se refiere a una interaccion directa o indirecta entre la composicion (por ejemplo el anticuerpo de OX40) y la otra entidad referenciada. Un ejemplo particular de interaccion directa es la union. Un ejemplo particular de una interaccion indirecta es aquella en la que la composicion actua sobre una molecula intermediaria, que a su vez actua sobre la entidad referenciada. De esta manera, por ejemplo, poner en contacto una celula (por ejemplo un linfocito) con un anticuerpo de OX40 incluye permitir que el anticuerpo se una a la celula (por ejemplo mediante la union a OX40) o permitir que el anticuerpo actue sobre un intermediario que a su vez actua sobre la celula.
Las expresiones "someter a ensayo" y "medir" y variaciones gramaticales de las mismas se utilizan intercambiablemente en la presente memoria y se refieren a determinaciones cualitativas o cuantitativas, o a determinaciones tanto cualitativas como cuantitativas. En el caso de que las expresiones se utilicen en referencia a la union, se encuentran contemplados cualesquiera medios de evaluacion de la cantidad relativa, afinidad o especificidad de la union, incluyendo los diversos procedimientos indicados en la presente memoria y conocidos de la tecnica. Por ejemplo, la union del anticuerpo de OX40 a OX40 pueden someterse a ensayo o medirse mediante un ensayo ELISA.
A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientfficos utilizados en la presente memoria presentan el mismo significado que el entendido por el experto ordinario en la materia a la que se refiere la invencion. Aunque pueden utilizarse procedimientos y materiales similares o equivalentes a los indicados en la presente memoria en la practica o ensayo de la invencion, en la presente memoria se indican los procedimientos y materiales adecuados.
Todas las publicaciones, patentes, numeros de acceso de GenBank y otras referencias citadas en la presente memoria se incorporan como referencia en su totalidad. En caso de conflicto, prevalecera la presente memoria, incluyendo la definiciones.
Tal como se utiliza en la presente memoria, las formas singulares "un" o "una" y "el" o "la" incluyendo los referentes plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De esta manera, por ejemplo, las referencias a "un anticuerpo" incluyen una pluralidad e anticuerpos y las referencias a "un tratamiento o terapia" pueden incluir los tratamientos o terapias multiples, secuenciales o simultaneos, etc.
Tal como se utiliza en la presente memoria, todos los valores numericos o intervalos numericos incluyen los numeros enteros comprendidos dentro o incluidos en dichos intervalos y las fracciones de los valores o los numeros enteros comprendidos dentro o incluidos en los intervalos, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De esta manera, por ejemplo, la referencia a un intervalo de 90% a 100%, incluye 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, etc., asf como 91,1%, 91,2%, 91,3%, 91,4%, 91,5%, etc., 92,1%, 92,2%, 92,3%, 92,4%, 92,5%, etc., y de esta manera sucesivamente. En otro ejemplo, la referencia a un intervalo de 1 a 5.000 veces incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 veces, etc., asf como 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5 veces, etc., 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5 veces, etc., y de esta manera sucesivamente.
La invencion se da a conocer de manera general en la presente memoria utilizando oraciones afirmativas para describir las numerosas formas de realizacion.
Se han descrito varias formas de realizacion de la invencion. Los ejemplos a continuacion se proporcionan a tftulo ilustrativo pero no limitativo del alcance de la invencion tal como se describe en las reivindicaciones.
Ejemplos
Ejemplo 1
El presente ejemplo describe diversos materiales y metodos.
Preparacion de antfgenos: se aislo ARN a partir de celulas mononucleares de sangre periferica humana activadas durante dos dfas con fitohemaglutinina (PHA, Remel, Lenexa, KS) utilizando reactivo Tri (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). La secuencia codificante del dominio extracelular de OX40 humano se amplifico mediante reacciones en cadena de la polimerasa-transcripcion inversa. El producto amplificado se secuencio y se confirmo que era identico a la secuencia publicada de la OX40 humana (documento n° WO95/12673, SEC ID n° 1). El producto se subclono en el mismo marco dentro del plasmido baculovfrico donante pfastbac-hFc. Este vector se genero a partir del plasmido pfastbac (Invitrogen Corp.) y la parte Fc de la IgG1 humana ("IgG1_h"). La secuencia de la IgG1_h se extrajo del vector pV11392.fc. Se generaron baculovirus recombinantes que codifican la protefna de fusion OX40
humano:IgG1_h (OX40_h:Fc_h). Se infectaron celulas de insecto High-Five BTI-TN-5b1-4 ("Tn5") de Trichoplusia ni (Invitrogen Corp.) con el baculovirus recombinante OX40_h:Fc_h para la produccion de protefnas. La secuencia de OX40 de longitud completa se amplifico y se clono en el vector pCDNA3.1 (Invitrogen Corp.) para la expresion en celulas eucarioticas. Las celulas EL-4 (ATCC n° TIB-39) y CHO-K1 (ATCC n° CCL-61) se transfectaron utilizando 5 lipofectamina 2000 (Invitrogen Corp.) y se seleccionaron los transfectantes estables utilizando higromicina B (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) o geneticina (Invitrogen Corp.), respectivamente. Se conjugo OX40_h:Fc_h con ovoalbumina mediante acoplamiento con glutaraldehfdo. Se mezclo un mg de OX40_h:Fc_h con 0,5 mg de ovoalbumina (Pierce, Rockford, IL) en 1 ml de solucion salina tamponada con fosfato (PBS). Se anadieron lentamente 50 pl de glutaraldehfdo de grado EM al 1% (Sigma, St. Louis, MO) y se sometieron a agitacion suave 10 durante cinco minutos para mezclar la solucion. Tras tres horas a temperatura ambiente, se anadieron 50 pl de etanolamina 1 M (pH 7) y la solucion se incubo durante dos horas adicionales seguido de intercambio del tampon en una columna NAP10 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) por solucion salina tamponada con fosfato.
Secuencia de nucleotidos de la protefna de fusion OX40 humana:IgG1 humana entre el codon de inicio (ATG) 15 pasando por el dominio extracelular de la OX40 humana hasta el final de la secuencia de Fc humana (subrayada), SEC ID n° 1:

ATGTGCGTOG CCGCTCGGCG GCTGGGCCCC GGGCCGTGTG CGGCTCTOCT CCTCCTGGGC 60

CTGGOGCTGA' G CACCGTGAC GGGGCTCCAC TGTGTCGGGG ACACCTACCC CAGCAACGAC 120

CGGTGCTGCC ACGAGTGCAG GCCAGGCAAC GGGATGGTGA GCCGCTGCAG CCGCTCCCAG 1 SO
A'ACACGGrGT GCCGTCCGTG CCGGCCGGGC TTCTACAACG ACGTGGTCAG CTCCAAGCCG 240

TGCAAGCCCT GCACGTGGTG TAACCTCAGA AGTGGGAGTG AGCGGAAGCA GCTGTGCACG 300
GCCACACAGG ACACAGTCTG CCGCTGCCGG GCGGGCACCC AOCCCCTGGA CAGCTACAAG 360
CCTGGAGTTG ACTGTGCCCC CTGCCCTCCA GGGCACTTCT CCCCAGGCGA CAACCAGGCC 420

TGCAAGCCCT GGACCAACTG CACCTTGGCT GGGAAGCACA CCCTGCAGCC GGCCAGCAAT 4SO

AGCTCGGACG CAATCTGTGA GGACAGGGAC CCCCCAGCCA CGCAGCCCCA GGAGACCCAG 540
GGCCCCCCGG CCAGGCCCAT CACTGTCCAG CCCACTGAAG CCTGGCCCAG AACCTCACAG 600

GGACCCTCCA GATCTTGTGA CAAAACTCAC ACATGCCCAC CGTGCCCAGC ACCTGAACTC 660

CTGGGGGGAC CGTCAGTCTT CCTCTTCCCC CCAAAACGCA AGGACACCCT CATGATCTCC 720

CGGACCCCTG AGGTCACATG CGTGGTGGTG CACCTOACCC ACGAAGACCC TGAGGTCAAG 780 TTCAACTGGT ACGTQGACGG CGTGGAGGTG CATAATGCCA AGACAAAGCC GCQGGAGGAG 840

CAGTACAACA GCACGTACCG TGTGGTCAGC OTCCTCACCG TCCTGCACCA GGACTGGCTG 900

AATGGCAAGG AGTACAACTG CAAGGTCTCC AACAAAGCCC TCCCAGGCCC CATCGAGAAA 960
ACCATCTCCA AAGCCAAAGG GCAGCCCCGA GAACCACAGG TGTACACCC.T GCCCCCATCC 1020
CGGGATGAGC TGACCAAGAA CCAGGTCAGC CTGACCTGCC TGGTCAAAGG CTTCTATCCC 1080

ACCGACATCG CCGTGGAGTG GGAGAOCAAT GGOCAGCCGG AG AACAACTA CAAGACCACQ 1140

CCTCCCCTGC TG GACTCCG A CGGCTCCTTC TTCCTCTACA GCAAGCTCAC CQTQGACAAG 1200

AGCACGTOOC AGCAGGGGAA CGTCTTCTCA TGCTCCGTC-A TGCATGAGCC TCTGCACAAG 1260

CACTACACGC AGAAGAGCCT CTCCCTGTCT CCGGGTAAAT GA 1320
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Secuencia de aminoacidos del dominio extracelular de OX40 humano fusionado con la parte Fc de la IgG1 humana (subrayada), SEC ID n° 2:

1WCVCARRLGR GPCAALLLLG LGLSTVTGLH CVGDTYPSNI> RCCHECRPGN GMVSRCSRSQ 60

NTVCRPCGPG FYNDVVSSKP CKPCTWCNLR SGSERKQJLCT ATQDTVCRCR AGTQPLDSYK 120

PGVDCAPCPP GHFSPGDNQA CKPWTNCTLA GKHTLQPASN SSDA1CEDRD PPATQPQETQ 180

CPPARP1TVQ PTEAWPRTSQ GPSRSCDKTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS 240

RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE OYNSTYRVVS VLTVLHODWL 300

NGKEYKCKVS NKALPAPIEK T1SKAKGQPR EPQVYTL.PPS RDELTKNOVS LTCLYKGEYE 360

SDIAVEWESN COPENNYKTT PPVLDSDG5F FLYSKLTVDK SRWOOGNVFS CSVMWEAEHN 420

HYTOKSLSLS_EGK 433
Ratones: se obtuvieron ratones KM mice™ transcromosomicos humanos (documento n° WO 02/43478 y n° WO 02/092812, Ishida et al., IBC's 11th Antibody Engineering Meeting, resumen, 2000; Kataoka S., IBC's 13th Antibody Engineering Meeting, resumen, 2002) que alojaban fragmentos cromosomicos humanos codificantes de la region de inmunoglobulina humana, de Kirin Brewery Co., Ltd., Japon, y se alojaron en las instalaciones animales de La Jolla Institute for Allergy and Immunology. Se proporciona una vista general de la tecnologfa de produccion de anticuerpos humanos en Lonberg (Lonberg et al., Int. Rev. Immunol. 13(1):65-93, 1995). Se describen animales transgenicos con uno o mas genes de inmunoglobulina humana (kappa o lambda) que no expresan inmunoglobulinas endogenas en, por ejemplo, la patente US n° 5.939.598. Se describen procedimientos adicionales para producir anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos (ver, por ejemplo, los documentos n° WO 98/24893, n° WO 92/01047, n° WO 96/34096, n° WO 96/33735; patentes US n° 5.413.923, n° 5.625.126, n° 5.633.425, n° 5.569.825, n° 5.661.016, n° 5.545.806, n° 5.814.318, n° 5.885.793, n° 5.916.771 y n° 5.939.598). El desarrollo de bovinos portadores de genes de inmunoglobulina humana, vacas TC, se describe en Kuroiwa et al., Nat. Biotechnol. 20(9):889-94, 2002; Kuroiwa et al., Nat. Genet. 36(7):775-80, 2004).
Inmunizacion: se mezclo protefna recombinante OX40_h:Fc_h con un volumen igual de adyuvante completo de Freund (CFA, Sigma) y se preparo una emulsion. Los ratones se inmunizaron con 10 a 25 pg de protefna por via intraperitoneal y recibieron un refuerzo intraperitoneal con 5 a 10 pg de protefna emulsificada en adyuvante incompleto de Freund (IFA, Sigma) a intervalos de dos semanas durante 2 a 4 refuerzos. Se administro una inyeccion intraperitoneal final de 5 a 10 pg de OX40_h:Fc_h soluble sin adyuvante cinco dfas antes de la fusion. Otro grupo de ratones fue inmunizado con OX40_h:Fc_h que se desnaturalizo por calor mediante incubacion a 80°C durante diez minutos en PBS y despues se mezclo 1:1 con adyuvante RIBI (Sigma). Los ratones se inmunizaron tal como se ha indicado anteriormente. Un tercer grupo de ratones fue inmunizado con OX40_h:Fc_h conjugado con ovoalbumina. Los ratones fueron sensibilizados con 30 pg de OX40_h:Fc_h-OVA solo o en una mezcla con
OX40_h:Fc_h, 10 pg y 20 pg, respectivamente, en RIBI. El primer recibio un refuerzo de 30 pg de
OX40_h:Fc_h-OVA en RIBI, seguido de 10 pg de OX40_h:Fc_h en RIBi a intervalos de dos semanas. Se administro un refuerzo final de 20 pg de OX40_h:Fc_h-OVA en PBS cinco semanas despues. Los dos refuerzos del ultimo
grupo consistieron de 5 pg de OX40_h:Fc_h-OVA + 10 pg de OX40_h:Fc_h en RIBI a intervalos de dos semanas,
con un refuerzo final de 10 pg de OX40_h:Fc_h en PBS. Todas las inyecciones fueron intraperitoneales. Un grupo final de ratones se inmunizo con celulas T humanas CD4+ que habfan sido estimuladas durante dos dfas con PHA (1 pg/ml) y una interleucina-2 humana recombinante (IL2, 10 ng/ml, BD Pharmingen, San Diego, CA). Antes de la inyeccion las celulas recibieron 25 Gy de irradiacion de una fuente de cesio y se diluyeron 1:1 en adyuvante RIBI.
Produccion de hibridoma: los ratones con el tftulo mas alto de anticuerpo IgG especffico anti-OX40 en su suero se seleccionaron para la produccion de anticuerpos monoclonales. Se recolectaron los bazos y se fusionaron suspensiones de celulas individuales con una estirpe celular de mieloma (SP2/O-Ag14) (ATCC, Rockville, MD) en una proporcion de 3:1 con polietilenglicol al 50% (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Las fusiones se sembraron en placas de fondo plano de 96 pocillos a una densidad optima y se cultivaron en medio DMEM-10 completo (medio Eagle modificado por Dulbecco con suero de feto bovino al 10% (FBS, Invitrogen Corp.)), aminoacidos no esenciales al 1%, L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de sulfato de estreptomicina (todos de BioWhittaker, Walkersville, MD), complemento HAT (Sigma) y factor de clonacion de hibridoma al 10% (HCF, Biovaris, San Diego, CA) en un incubador a 37% con 10% de CO2. Se cribaron aproximadamente 4.000 pocillos de cuatro fusiones mediante ELISA para anticuerpos especfficos de OX40 que contenfan kappa humano. Los anticuerpos IgG humanos anti-OX40 humano se confirmaron mediante analisis de citometrfa de flujo. Los
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pocillos positivos se expandieron y se sometieron a tres a cuatro rondas de clonacion por dilucion limitante con el fin de obtener anticuerpos monoclonales.
Purificacion de anticuerpos y protefnas: para la purificacion de anticuerpos, los hibridomas se cultivaron en botellas de cultivo rotatorias de 2 litros en una proporcion de 350 mililitros por cada botella de 1 litro o en 1 litro de Integra system (INTEGRA Bioscience, Inc., Ijamsville, MD) con hibridoma-medio SFM (Invitrogen Corp.) complementado con suero fetal bovino con contenido ultrabajo de IgG (Invitrogen Corp.). Se genero protefna recombinante OX40 humano:Fc_h mediante la infeccion de 1 litro de celulas Tn5 durante cuatro dfas. Se purificaron anticuerpos monoclonales humanos y OX40:Fc_h a partir del medio de cultivo utilizando gel de protefna A-sefarosa Fast Flow recombinante (Amersham Biosciences). El medio condicionado generado en las botellas de cultivo rotatorias en primer lugar se concentro utilizando un sistema de flujo tangencial Ultrasette (Pall Corp., East Hills, NY). El medio condicionado se filtro con una unidad de filtracion de vacfo de 0,22 pm (Amersham Biosciences) de tamano apropiado para la cantidad de anticuerpo humano en el medio. La columna se lavo por completo con 20 volumenes de columna de PBS y el anticuerpo se eluyo con Gly-HCl 0,1 M, pH 3,6, NaCl 0,15 M y se neutralizo con Tris-HCl 1 M, pH 8,0. Las fracciones se analizaron mediante SDS-PAGE y se agruparon las fracciones positivas y se concentraron con un concentrador centrffugo (Vivaspin, 50.000 PMCO, Sartorius, Gettingen, Alemania). Se utilizaron columnas de desalado Sephadex G-25 (NAP, Amersham Biosciences) para el intercambio de tampon a PBS, pH 7,4. Finalmente, el anticuerpo se esterilizo mediante filtracion utilizando filtros de jeringa con diametro de poro de 0,22 pm y se determino la concentracion de anticuerpo mediante el procedimiento de Lowry. Se determino el contenido de pirogenos utilizando un ensayo de lisado de amebocitos Limulus ("LAL") (Associates of Cape Cod, Falmouth, MA). Los lfmites de deteccion de este ensayo eran 0,06 EU/mg. En el caso de que el ensayo fuese negativo, las muestras se consideraron libres de endotoxinas.
ELISA de cuantificacion de IgG humana: para determinar la cantidad de anticuerpo humano presente en los sobrenadantes y soluciones madre purificadas, se utilizo el protocolo siguiente. Se utilizo anticuerpo de cabra especffico anti-FcY humano (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA) para recubrir placas de 96 pocillos (Nunc, Dinamarca) en tampon de carbonato a razon de 0,5 pg/pocillo durante una hora a 37°C. A continuacion, se bloquearon las placas con Superblock (Pierce, Rockford, IL) durante 30 minutos seguido de la adicion de las muestras a las placas. Se generaron curvas estandares utilizando IgG humana total (Sigma) o IgG1 o IgG4 humana purificada (Kirin Brewery Co., Ltd.). Las placas se incubaron durante una hora a 37°C, se lavaron en PBS/BSA al 1%/Tween20 al 0,1% (Sigma) y el anticuerpo unido se detecto con anticuerpo de cabra especffico anti- FcY humano conjugado con peroxidasa de rabano picante (HRP, Jackson Immunoresearch) durante una hora a 37°C. El sustrato de TMB (Sigma) se anadio durante 10 minutos y la reaccion se detuvo con H2SO4 (LabChem Inc., Pittsburgh, PA). Se midio la densidad optica (DO) a 450 nm en un lector de microplacas.
ELISA de deteccion de anticuerpos especfficos de OX40: se determinaron mediante ELISA los tftulos de anticuerpos, especificidad y produccion mediante hibridomas. En breve, se recubrieron placas de fondo redondo de 96 pocillos con 50 pl de OX40_h:Fc_h a una concentracion de 5 pg/ml en tampon de carbonato (pH 9,4) durante la noche a 4°C o a 37°C durante una hora. Tras el lavado dos veces con PBS/Tween-20 al 0,1%, las placas se bloquearon con PBS/BSA al 1%/Tween-20 al 0,1% a 37°C durante una hora. Se diluyo el suero, el sobrenadante o el anticuerpo purificado, en tampon de bloqueo, se anadio a los pocillos y las placas se incubaron durante una hora a 37°C. Las placas se lavaron cuatro veces con PBS/Tween-20 al 0,1% y el anticuerpo de deteccion de oveja anti-kappa humano conjugado con peroxidasa (The Binding Site, Birmingham, Reino Unido) se anadio a una dilucion de 1:2.000. Tras una hora de incubacion a 37°C, las placas se lavaron y se anadio el sustrato TMB (Sigma) y se incubo a temperatura ambiente durante diez a treinta minutos. La reaccion se detuvo con H2SO4 (LabChem) y se midio la densidad optica a 450 nm con un lector de microplacas.
Citometrfa de flujo: se determinaron los tftulos de anticuerpos, especificidad y afinidades de union relativa mediante analisis de citometrfa de flujo utilizando transfectantes CHO-K1 de OX40 humano estables o CMSP humanas activadas con PHA + IL2 durante tres dfas. Las celulas se lavaron una vez en tampon de tincion: PBS + FBS al 2% + NaN3 al 0,1% + EDTA 10 mM, despues se resuspendio en suero, sobrenadante o anticuerpos purificados en un volumen de 50 pl. Las celulas se incubaron con los anticuerpos sobre hielo durante veinte minutos, se lavaron dos veces en tampon de tincion y despues se resuspendieron en un anticuerpo secundario anti-IgG humana marcado con ficoeritrina. Se utilizaron dos anticuerpos diferentes: (1) IgG de cabra antihumano (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL) o (2) anticuerpo de raton anti-IgG humana (BD Pharmingen, San Diego, CA). Tras una incubacion durante veinte minutos sobre hielo, las celulas se lavaron una vez y se fijaron diez minutos con paraformaldehfdo al 1%. Tras un lavado final, las celulas se resuspendieron en tampon de tincion y las muestras se adquirieron utilizando citometros de flujo FACScan o FACS Calibur (Becton Dickinson Biosciences, Palo Alto, CA) y los datos se analizaron utilizando el software Cellquest (Becton Dickinson Biosciences) o Flow Jo (TreeStar, Inc., San Carlos, CA). Las celulas T activadas tambien se tineron con el anticuerpo L106 de raton anti-OX40 humano (Becton Dickinson), que se conjugo directamente con ficoeritrina o la union del cual se detecto con anticuerpo anti- IgG de raton-PE (Southern Biotechnology Associates).
Ensayos de bloqueo de OX40L: para determinar si los anticuerpos anti-OX40 humanos podfan bloquear la union de OX40L a OX40 soluble, se utilizaron protocolos tanto de ELISA como de citometrfa de flujo. En el ELISA, se recubrieron placas Nunc de fondo redondo de 96 pocillos con OX40_h:Fc_h soluble recombinante a una
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concentracion de 2 pg/ml en tampon de carbonato (pH 9,4) durante una hora a 37°C. Las placas se lavaron con PBS/Tween-20 al 0,1% y se anadio Superblock (Pierce) a los pocillos para bloquear la union no especffica. Los anticuerpos de ensayo se diluyeron a 1 pg/ml en PBS/Tween y se anadieron a las placas. Tras una incubacion de una hora a 37°C, se anadio OX40L humano soluble recombinante etiquetado con FLAG (Alexis Biochemicals, San Diego, CA) a los pocillos apropiados sin eliminar mediante lavado los anticuerpos anti-OX40. Tras una incubacion de una hora, las placas se lavaron y se anadio a los pocillos un anticuerpo anti-FLAG conjugado con peroxidasa (Sigma), durante una hora a 37°C. Se anadio el sustrato TMB, tras diez minutos se detuvo la reaccion con H2SO4 y se leyeron los resultados a 450 nm utilizando un lector de microplacas. En el ensayo de citometrfa de flujo, se purificaron celulas T CD4+ humanas y se activaron con PHA+IL2 durante dos dfas. Las celulas se lavaron y se resuspendieron en tampon de tincion y despues se incubaron con cantidades crecientes de anticuerpos humanos anti-OX40 humano durante veinte minutos sobre hielo, de entre 0,005 y 50 pg/ml. A continuacion, se anadio a las celulas OX40L-FLAG recombinante soluble. las celulas se lavaron y se incubaron con anti-FLAG conjugado con PE (Sigma). Tras otro lavado, las celulas se fijaron con paraformaldehfdo al 1% y se analizaron en un FACScan o FACScalibur. Se determino el porcentaje de inhibicion utilizando la DO o el porcentaje de positivos en la formula siguiente: % de inhibicion=100-((muestra/union maxima)*100).
Ensayos de bloqueo cruzado de anticuerpo anti-OX40: con el fin de determinar si los anticuerpos se unfan al mismo "epftopo" de OX40 humano, se utilizo un protocolo de ELISA. Se recubrieron placas Nunc de ELISA de fondo redondo de 96 pocillos con los anticuerpos humanos anti-OX40 humano en tampon de carbonato a una concentracion de 2 pg/ml durante una hora a 37°C. Las placas se lavaron y despues se bloquearon con PBS/BSA al 1%/Tween-20. A continuacion, se preincubaron dos a 20 pg/ml de los anticuerpos humanos anti-OX40 humano y los anticuerpos L106 de raton anti-OX40 humano (BD Biosciences, San Jose, CA), clon 315 (Nichirei Biosciences, Tokyo, Japon) o ACT35 (BD Pharmingen), con 2 pg/ml de protefna de fusion recombinante OX40 humano:Fc_m (Alexis Corporation, San Diego, CA) durante treinta minutos a temperatura ambiente. Se anadieron las combinaciones de anticuerpo-OX40:protefna Fc_m a la placa y se incubaron durante una hora a 37°C. Tras tres lavados, se detecto OX40:Fc_m unido con anticuerpo de oveja anti-Ig de raton conjugado con peroxidasa (Amersham Biosciences). El ELISA se completo tal como se ha indicado anteriormente. El porcentaje de inhibicion se determino utilizando la DO de cada muestra en la formula siguiente: % de inhibicion=100-((muestra/union maxima)*100). Para determinar si dichos anticuerpos humanos anti-OX40 humano bloqueaban los anticuerpos de raton anti-OX40 humano, se llevo a cabo una variacion de dicho ELISA. El procedimiento era igual excepto en que los anticuerpos de raton anti-OX40 humano se utilizaron para recubrir las placas y se preincubo 112V8, 112F32, 112Y131 y 112Z5 con OX40 humano:protefna Fc_h. La union de la protefna OX40 a los anticuerpos recubiertos se detecto con un anticuerpo secundario de oveja anti-IgG humana-peroxidasa de rabano picante (Amersham Biosciences).
Tambien se utilizo un ensayo de citometrfa de flujo para determinar si los anticuerpos se bloquean cruzadamente entre sf. Se purificaron celulas T CD4 humanas a partir de celulas mononucleares de sangre periferica tal como se ha indicado posteriormente y se activaron con 1 pg/ml de fitohemaglutinina (Remel, Lenexa, KS) y 10 ng/ml de interleucina-2 humana recombinante (BD Pharmingen) durante dos a tres dfas. Las celulas se lavaron y se marcaron con 10 pg/ml de los anticuerpos de ensayo durante treinta minutos sobre hielo en PBS complementado con suero de feto bovino al 2% y azida sodica al 0,1%. Sin lavado, se anadieron a los pocillos las versiones biotiniladas de los mismos anticuerpos a una concentracion de 10 pg/ml y las celulas se incubaron durante otros treinta minutos sobre hielo. A continuacion, las celulas se lavaron mediante la adicion de tampon y se centrifugaron a 1.200 rpm durante tres minutos a 4°C. Se detecto la union de los anticuerpos biotinilados mediante incubacion con estreptavidina- ficoeritrina (SA-PE, BD Pharmingen) durante veinte minutos seguido de otro lavado tal como se ha indicado. Las celulas se fijaron durante diez minutos en paraformaldehfdo al 1%. Tras un lavado final, las celulas se resuspendieron en tampon de tincion y las muestras se adquirieron utilizando un citometro de flujo FACS Calibur (Becton Dickinson Biosciences, Palo Alto, CA). Los datos se analizaron utilizando el software Cellquest (Becton Dickinson Biosciences) o Flow Jo (TreeStar, Inc., San Carlos, CA). Los anticuerpos sometidos a ensayo inclufan 112F32, 112V8, 112Y55, 112Y131, 112Z5, anti-DNP (control negativo para IgG1 humana), anticuerpos de raton anti- OX40 humano, clon L106, clon 315 y clon ACT35. Se determino el porcentaje de inhibicion utilizando la formula siguiente: 100-(media geometrica de anticuerpo de ensayo/max. de medio geometrica)*100. Los anticuerpos se sometieron a ensayo para la inhibicion de la union de ellos mismos, asf como de la union entre ellos.
Purificacion de CMSP humanas a partir de sangre completa: se recolecto sangre completa de donantes anos de entre 18 y 50 anos de edad en el programa habitual de donantes de sangre del Scripps Green Hospital (La Jolla, CA). Se anadio heparina para evitar la coagulacion. No se especifico la raza, etnicidad o genero. La sangre se diluyo en PBS y despues se aplico una capa inferior de Ficoll-Plaque Plus (Amersham Biosciences). Se separaron las celulas mononucleares del suero y las plaquetas mediante centrifugacion a 1.800 rpm sin freno. La interfaz que contenfa las CMSP se recolecto y se lavo dos veces con PBS.
Purificacion de las celulas T CD4+: se purificaron celulas T CD4+ humanas utilizando un kit de aislamiento negativo de Miltenyi Biotec. (Auburn, CA). Las CMSP se marcaron con la mezcla de anticuerpos conjugados con hapteno especffica para CD8, CD11b, cD16, CD19, CD36 y CD56 durante quince minutos a 4°C en PBS/BSA al 0,5%/EdTA 2 mM. Tras lavar dos veces, las celulas se resuspendieron en las perlas magneticas anti-hapteno (perlas MACS) y las celulas se incubaron a 4°C durante quince minutos. A continuacion, las celulas se lavaron y se aplicaron a una
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columna LS/VS+ que habfa sido prelavada e insertada en el iman. La columna se lavo tres veces con tampon. Las celulas CD4+ "intactas" estaban contenidas en el eluido de la columna. Se confirmo la pureza mediante analisis de citometrfa de flujo utilizando anticuerpos especfficos para CD3 humana y CD4 humana, ambos directamente conjugados con fluorocromos (BD Pharmingen). Alternativamente, se seleccionaron positivamente las celulas T CD4+ con microperlas de CD4 (Miltenyi Biotec.). El procedimiento fue similar al descrito anteriormente, excepto en que las celulas que se adherfan a la columna fueron eluidas retirando la columna del iman y forzando 5 ml de tampon a traves de la columna con un embolo.
Ensayo de reaccion de linfocitos mixtos: se purificaron CMSP de dos donantes y se anadieron 1x105 celulas de cada donante a una placa con fondo en U de 96 pocillos en presencia o en ausencia de anticuerpos humanos anti-OX40 humano o IgG4 humano de control negativo (anticuerpo anti-albumina serica humana, Kirin Brewery Co., Ltd.) (Ukyo et al., Immunology 109(2):226, 2003). Se sometieron a ensayo anticuerpos a una concentracion de entre 0,005 y 100 pg/ml, dependiendo del estudio. Se sometieron a ensayo multiples parejas de donantes. Los medios utilizados fueron RPMI-1640 complementado con suero AB humano al 10% (MP Biomedical, Irvine, CA), penicilina/estreptomicina, L-glutamina y 2-mercaptoetanol. El dfa seis, se anadio 1 pCi de timidina tritiada (3HTdR) a cada pocillo durante las ultimas dieciocho horas de cultivo. Se lisaron las celulas y se transfirieron a filtros de fibra de vidrio, y se realizaron mediciones con un contador de centelleo (Wallac, Turku, Finlandia).
Modelo in vivo de enfermedad de injerto contra huesped aguda: en ratones macho con inmunodeficiencia combinada severa (SCID) de cinco a diez semanas de edad se inyectaron 20 pg de anticuerpo de rata anti-cadena p de receptor de IL2 de raton (TMp1, Tanaka et al., J. Exp. Med. 178(3): 1103-7, 1993) para reducir el numero de celulas asesinas naturales endogenas. Al dfa siguiente, los ratones recibieron 2,5 Gy de irradiacion utilizando una fuente de cesio. Cuatro horas despues, los ratones recibieron 10 millones de CMSP humanas totales en PBS mediante inyeccion intraperitoneal seguido inmediatamente de la inyeccion intravenosa de anticuerpos humanos anti-OX40 humano o IgG1_h de control negativo (anti-dinitrofenol (anti-DNP), Kirin Brewery Co., Ltd.) a una concentracion de 2, 20, 100 o 200 pg en 100 pl de PBS. Alternativamente, se retraso el tratamiento con anticuerpos hasta el dfa tres o seis para someter a ensayo el potencial terapeutico de los anticuerpos anti-OX40. Se pesaron los ratones cada tres a cuatro dfas y recibieron anticuerpos anti-IL2Rp semanalmente. El dfa doce, se sacrificaron los ratones y se evaluo la patologfa macroscopica. Se extirparon los bazos para el analisis de citometrfa de flujo, los hfgados y los intestinos para la histologfa, y se recolecto suero para el analisis de las citocinas y anticuerpos humanos (Watanabe et al., Clin. Immunol. 120:247, 2006).
Modelo in vivo de enfermedad del injerto contra el huesped cronica: se adapto un modelo de EICH cronica a partir del modelo de EICH xenogenica aguda (Watanabe et al., Clin. Immunol. 120:247, 2006). Se indujo la enfermedad mediante la transferencia de celulas T CD4 humanas seleccionadas positivamente en ratones SCID que habfan sido preparados de la manera indicada anteriormente. Los ratones recibieron un millon de celulas T CD4 seleccionadas positivamente, mediante inyeccion intraperitoneal los dfas 0 y 2; 20 o 100 pg de anticuerpos anti-OX40 o de control mediante inyeccion intravenosa semanal desde el dfa 0. La enfermedad era manifiesta para el dfa treinta y los ratones fueron evaluados el dfa cuarenta y ocho. Se extirparon los bazos y nodulos linfaticos para la citometrfa de flujo, la piel y pulmones para la histologfa, y el suero para el analisis de las citocinas humanas.
Analisis de citocinas humanas: se midio un panel de ocho citocinas humanas en el suero de raton utilizando tecnologfa multiplex y siguiendo las instrucciones del fabricante (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).
Purificacion de celulas asesinas naturales humanas: se purificaron celulas asesinas naturales ("NK") humanas utilizando un kit de aislamiento negativo de Miltenyi Biotec. (Auburn, CA). Las CMSP se marcaron con mezcla e anticuerpos conjugados con biotina especffico para celulas T, celulas B, celulas madre, celulas dendrfticas, monocitos, granulocitos y celulas eritroides durante quince minutos a 4°C en PBS/BSA al 0,5%/EDTA 2 mM. Tras lo anterior se llevo a cabo la adicion de perlas magneticas anti-biotina ("perlas MACS"). Las celulas se incubaron a 4°C durante quince minutos y despues se lavaron y aplicaron a una columna LS/VS+ que habfa sido prelavada e insertada en el iman. La columna se lavo tres veces con tampon. Las celulas NK CD56+ "intactas" se encontraban contenidas en el eluido de la columna. Se confirmo la pureza mediante analisis de citometrfa de flujo utilizando anticuerpos especfficos para CD56 humano y CD3 humano, ambos conjugados directamente con fluorocromos (BD Pharmingen).
Ensayo de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC): se purificaron celulas NK a partir de CMSP humanas y se cultivaron durante cuarenta y ocho horas con 20 ng/ml de interleucina-2 humana recombinante (BD Pharmingen) en RPMI-1640 complementado con suero AB humano al 10% (MP Biomedical, Irvine, CA), penicilina/estreptomicina, L-glutamina y 2-mercaptoetanol. Estas celulas se utilizaron como celulas efectoras en el ensayo citotoxico no radioactivo Cytotox 96 (Promega Corp., Madison, WI). Las celulas diana eran celulas EL-4 transfectadas con OX40 humano o parentales. Se incubaron cinco mil celulas diana con 0,005 a 10 pg/ml de los anticuerpos anti-OX40 humano o los anticuerpos de control durante treinta minutos sobre hielo en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos de fondo redondo. Se anadieron veinte veces mas celulas NK efectoras a los pocillos en un volumen final de 100 pl y las placas se centrifugaron a 200 x g durante tres minutos antes de incubar a 37°C con 5% de CO2 durante cuatro horas. Las placas se centrifugaron a 250 x g durante cinco minutos y se transfirieron 50 pl de los sobrenadantes a una placa ELISA. Se anadio tampon de ensayo a las placas en un volumen de 50 pl.
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Tras una incubacion de treinta minutos a temperatura ambiente, se anadieron 50 pi de la solucion de parada a los pocillos y se determino la absorbancia a 490 nm. Los controies requeridos fueron celulas diana solas (espontaneas), celulas diana solas tratadas con tampon de lisis durante los ultimos cuarenta y cinco minutos de la incubacion (maximo), celulas efectoras solas, pocillos que contenfan medio solo con (correccion de volumen) y sin la adicion del tampon de lisis. Se determino el porcentaje de lisis especffica utilizando la formula siguiente, tras restar el fondo del medio de todos los pocillos y restar el valor de correccion del volumen del valor maximo diana. Porcentaje de citotoxicidad=((experimental - efecto espontaneo - diana espontaneo)/(diana maximo - diana espontaneo))*100.
Aislamiento de genes de anticuerpo humano anti-OX40: se recolectaron mediante centrifugacion celulas de hibridoma en cultivo (112V8 (ATCC n° PTA-7219, depositadas el 17 de noviembre de 2005)), que producen anticuerpo 112V8 (IgG4). Se purifico el ARN total a partir de dichas celulas utilizando el kit RNeasy (QIAGEN Inc., Valencia, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se utilizo el kit de amplificacion de ADNc SMART-RACE™ (Clontech Co., Ltd., Palo Alto, CA) para la clonacion del ADNc que codifica la region variable de los genes de inmunoglobulina a partir del ARN total de las celulas del hibridoma. Brevemente, se preparo ADNc de primera cadena con una transcriptasa inversa a partir de dos microgramos de ARN. Este ADNc se utilizo como molde para la reaccion en cadena de la polimerasa ("PCR") para amplificar la region variable y una parte de la region constante de las cadenas pesada y ligera ("HV" y "LV", respectivamente). Las secuencias amplificadas contenfan ademas las secuencias lfder. La reaccion fue la siguiente: 2,5 U de ADN polimerasa Ultra Pfu (Stratagene, La Jolla, CA); 0,2 pM de cebador 3' (para la cadena pesada: IgG1 p, para la cadena ligera: hk5, tabla 1); 1X mezcla A de cebador universal para el extremo 5' (cebador UMP mezcla A incluida en el kit SMART RACE); 200 pM de mezcla de dNTP; MgCh 1 mM; tampon Ultra Pfu (concentracion final: 1x) y molde de ADNc.
El programa de termociclado fue de cinco ciclos de: 94°C x 30 segundos, 72°C x 3 minutos. Cinco ciclos de: 94°C x 30 segundos, 70°C x 30 segundos, 72°C x 3 minutos. Veinticinco ciclos de: 94°C x 30 segundos, 68°C x 30 segundos, 72°C x 3 minutos, seguido de una extension a 72°C x 7 minutos. Los fragmentos de ADN amplificados se recolectaron mediante electroforesis en gel de agarosa y se purificaron con el kit de extraccion en gel QIAquick (Qiagen Co., Ltd., Alemania). Los fragmentos de ADN purificados de HV y LV se integraron en el vector pCR4 Blunt- TOPO utilizando el kit de clonacion mediante PCR Zero Blunt TOPO (Invitrogen Corp.) y cada plasmido constructo se transformo en E. coli y despues se clono. Se analizaron las secuencias de nucleotidos de cada insercion (HV y LV) en los plasmidos constructos utilizando cebadores especfficos (M13F, M13R, tabla 1). Basandose en la secuencia obtenida de HV y LV, se disenaron los cebadores oligonucleotidos para amplificar la VH (V8H38, V8H39) y la VL (V8L42, V8L43) (tabla 1).
Se clonaron VH y VL de 112V8 en el vector de expresion de IgG1. Brevemente, se disenaron cebadores oligonucleotidos que contenfan los sitios de reconocimiento de enzima de restriccion 5'-SalI y 3'-NheI con el fin de amplificar la region variable de la HV mediante PCR. Se llevo a cabo la PCR utilizando el ADN miniprep pTopoV8VH como molde, V8H38 y V8H39 como cebadores (tabla 1) con ADN polimerasa Ultra Pfu. Tras la digestion del producto de PCR con NheI y SalI, se subclono un fragmento de 410 pb en el vector de expresion de IgG1 (IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA, N5KG1-Val Lark (un vector modificado de N5KG1, patente US n° 6.001.358)) que se predigirio con NheI y SalI (fragmento de ADN de 8,9 kilobases). La existencia de region variable de la HV se analizo mediante digestion de restriccion.
Como segunda etapa se inserto LV en el vector N5KG1-Val Lark de la manera siguiente: se digirio el vector de ADN con dos enzimas de restriccion de ADN: BglII y BsiWI. Se aislo el fragmento de ADN de 9,1 kb. De manera similar al constructo de la cadena pesada, se diseno un juego de cebadores de PCR para LV que contuviese los sitios de reconocimiento para 5'BglII y 3'BsiWi. Estos cebadores, V8L42 y V8L43, se utilizaron para amplificar VL a partir del ADN plasmfdico miniprep pTopoV8VL. El producto de PCR se digirio con BglII y BsiWI y se aislo mediante electroforesis en gel de agarosa y purificacion del gel. Este fragmento, que contenfa V8VL, se ligo al vector de 9,1 kb preparado con ADN ligasa de T4 y se utilizo para transformar celulas Top10 (Invitrogen Corp.). Se seleccionaron los transformantes positivos de E. coli. Dicho vector de expresion, pG1K112V8, se purifico y se confirmo la presencia de ambas regiones, 112V8LV y 112V8HV, mediante analisis de restriccion.
Se aislaron las regiones variables HV y LV 112Y55 (ATCC n° PTA-7220, depositado el 17 de noviembre de 2005), 112Y131 (ATCC n° PTA-7218, depositado el 17 de noviembre de 2005) y 112Z5 (ATCC n° PTA-7216, depositado el 17 de noviembre de 2005) y se secuenciaron utilizando el mismo protocolo. Los cebadores utilizado para la amplificacion de las HV y LV especfficas se listan en la tabla 1.
La subclase de un anticuerpo determina en parte las funciones efectoras secundarias, tales como la activacion del complemento o la union de receptor de Fc (FcR) y la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (Huber et al., Nature 229(5284):419-20, 1971; Brunhouse et al., Mol. Immunol. 16(11):907-17, 1979). Para identificar el tipo optimo de anticuerpo para una aplicacion particular, deben considerarse las funciones efectoras de los anticuerpos. Por ejemplo, los anticuerpos IgG1_h presentan una semivida relativamente larga, resultan muy eficaces en la fijacion del complemento y se unen tanto a FcRI como a FcRII. Por el contrario, los anticuerpos IgG4 humanos presentan una semivida mas corta, no fijan el complemento y presentan una menor afinidad para FcR. La sustitucion de la serina 228 por una prolina (S228P) en la region Fc de IgG4 reduce la heterogeneidad observada con IgG4_h y extiende la semivida en suero (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5a edicion, 1991; Angal
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et al., Mol. Immunol. 30( 1):105-8, 1993). Una segunda mutacion que sustituya la leucina 235 por un acido glutamico (L235E) elimina las actividades residuales de union a FcR y de union al complemento (Alegre et al., J. Immunol. 148(11):3461-8, 1992). El anticuerpo resultante con ambas mutaciones se denomina IgG4PE. La numeracion de los aminoacidos de IgG4_h se derivo de Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edicion, 1991).
Se genero un vector que expresaba IgG4PE 112V8 recombinante mediante la digestion de pG1K112V8 con NheI y BglII para liberar el fragmento que contenfa 112V8VH y 112V8VL. Lo anterior se ligo al vector de expresion IgG4PE (pN5KG4PE-Lark, IDEC Pharmaceuticals, patente US n° 6.001.358) cortado con los mismos enzimas. El plasmido resultante, pG4P3K112V8, se confirmo mediante digestion de restriccion.
Se utilizo el ARN del hibridoma 112F32 (ATCC n° PTA-7217, depositado en fecha de 17 de noviembre de 2005) para generar vectores para producir los anticuerpos recombinantes 112F32G1 y 112F32G4 de la misma manera, los cebadores 3' utilizados para la amplificacion de los genes de cadena pesada y ligera en las reaccion RACE eran HH- 2 y HK-2, respectivamente. La amplificacion de 112F32HV se llevo a cabo utilizando H725' y M2H3'. Los cebadores de amplificacion 112F32LV eran F32K5' y K52D3' (tabla 1). El vector de expresion de IgG4 pN5KG4 se obtuvo de IDEC Pharmaceuticals (patente US n° 6.001.358). Los vectores resultantes, pKLG1/F32K3H y pKLG4/F32K3H se confirmaron mediante digestion con enzimas de restriccion y secuenciacion.
Secuencia de nucleotidos de ADNc de 112F32HV (entre el codon de inicio (ATG) hasta el extremo de la region variable), SEC ID n° 3:

ATGGACTGGG GGCCGTGCTG GGTTTTCCTT GTTGTTATTf TAGAAGGTGT CCAGTGTGGG 60

GTGCAGCTGO TGGAGTCTGG GGGAGGCTTG GTACAGCCTG GOGGGTCCCT GAGACTCTCC 120

TGTGCAGCCT CTGGATTCAC CTTCAGTAGC TATACCATGA ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA 180

GGGAAGGGGC TGGAGTGGGT TTCATACATT AGTAGTAGTA GTAGTACCAT ATACTATGCA 240

GACTCTGTOA AGGGCCG ATT CACCATCTCC AGAG ACAATG CC A AG AACTC ACTGT ATCTG 300

CAAATGAACA CCCTGAGAGA CGAGGACACG GCTGTGTATT ACTGTGCGAG AGGAGTGTAT 360

CACAATGGCT GGTCCTTCTT TGACTACTGG GGCCAGGGAA CCCTACTCAC CGTCTCCTCA 420
Secuencia de nucleotidos del ADNc de 112F32 LV (entre el codon de inicio (ATG) y el final de la region variable), SEC ID n° 4:

ATGGACATG A GGGTCCTCGC TCACCTCCTG GGGCTCCTGC TGCTCTGTTT CCCAGGTGCC 60

AGATGTGACA TCCAGATGAC CCAGTCCCCA TCCTCACTGT CTGCATCTGT AGGAAACAGA 120

GTC ACC ATT A CTTGTCGG G C GAGTCAOGAT ATTAGCAGCT GGTTAGCCTG GTATCAGCAG 180

AA ACC AGAG A AAGCCCCTAA GTCCCTGATC T ATGCTGCAT CCAGTTTGCA AAGTGGGGTC 240

CCATCAAGGT TCAGCGGCAG TGGATCTGGG ACAGATTTCA CTCTCACCAT CAGCAGCCTG 300

CAGCCTGAAG ATTTTGCAAC TTATTACTGC CAACAGTATA ATAGTTACCC CCTCACCTTC 360

GGCCAAGGGA CACOACTGGA GATTAAACGA 390
ATGGACACAC TTTGCTCCAC GCTCCTGCTG CTGACCATCC CTTCATGGGT CTTGTCCCAG
60
ATCACCTTGA AGOAGTCTGG TCCTACGCTA GTQAAGCCCA AACAGACCCT CACGCTGACC
120
TGCACCTTCT CTGGATTCTC ACTCAGCACT AGTGGAATGG GTGTGGGCTG GATCCGTCAO
ISO
CCCCCAGGAA AGGCCCTOGA GTGGCTTGCA GTCATTTATT GGGATGATCA TCAACTCTAC
240
AGTCCATCTC TGAAGAGCAG GCTCACCATC ACCAAGGACA CCTCCAAAAA CCAGGTGGTC
300
CTTACAATGA CCAACATGGA CCCTGTGGAC ACAGCCACAT ATTACTGTGC ACACAGACGA
360
GGGGCCTTCC AGCACTGGGG CCAGGGCACC CTGGTCACCG TCTCCTCAGC TTCCACCAA
419
GGGC
423
5
Secuencia de nucleotidos del ADNc de 112V8 LV (entre el codon de inicio (ATG) y el final de la region variable) SEC ID n° 6:
ATGGAAACCC CAGCGCAGCT TCTCTTCCTC CTGCTACTCT GGCTCCCAGA TACCACCGGA
60
GAAATTGTGT TGACGCAGTC TCCACGCACC CTGTCTTTGT CTCCAGGGGA AAGAGCCACC
120
CTCTCCTGCA GGGCCAGTCA GAGTGTTAGC AGCAGCTACT TAGCCTGGTA CCAGCAGAAA
ISO
CCTGGCCAGG CTCCCAGGCT CCTCATCTAT GGTGCATCCA GCAGGGCCAC TGGCATCCCA
240
GACAGGTTCA GTGGCAGTGG GTCTGGGACA GACTTCACTC TCACCATCAG CAGACTGGAG
300
CCTGAAGATT TTGCAGTGTA TTACTGTCAG CAGTATOATA GCTCGCTCAC TTTCGGCGGA
360
GGGACCAAGG TGGAGATCAA ACGAACT
387
10
Secuencia de nucleotidos del ADNc de 112F32 HV (secuencia lfder (en negrita) y region variable), SEC ID n° 7:
MEWGPCWVFL WILEGVQCG VQLVESGGGL VQPGGSLRLS CAASGFTFSS YSMNWVRQAP
60
GKGLEWVSYI SSSSSTIYYA DSVKGRFTIS RDNAKNSLYL QMNSLRDEDT AVYYCARGVY
120
HNGWSFFDYW GQGTLLTVSS
140
15 Secuencia de aminoacidos del ADNc de 112F32 kappa LV (secuencia lfder (en negrita) y region variable) SEC ID n° 8:
MDMRVLAQLL GLLLLCFPGA RCDIQMTQSP SSLSASVGNR VTITCRASQD ISSWLAWYQQ
60
KPEKAPKSL1 YAASSLQSGV PSRFSCSGSC TDFTLTISSL QPEDFATYYC QQYNSYPLTF
120
GQGTRI F.IKR
130

Secuencia de aminoacidos del ADNc de 112V8 HV (secuencia lider (en negrita) y region variable), SEC ID n° 9: MDTLCSTLLL LTIPSWVLSQITLKBSGPTL VKPKQTLTLT CTFSGFSLST SGMGVGWIRQ 60

PPGKALEWLA V1YWDDHQLY SPSLKSRLTITKDTSKNQVV LTMTNMDPVD TATYYCAHRR 120

GAFQHWGQGT LVTVSSASTK G 141
5 Secuencia de aminoacidos del ADNc de 112V8 LV (secuencia lider (en negrita) y region variable), SEC ID n° 10:

METPA QLLFL LLLWLPDTTG EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SSYLAWYQQK 60

PGQAPRLL1Y GASSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QYDSSLTFGG 120

GTKVEIKRT 129
10
Tabla 1: cebadores de ADN sintetizados (SEC ID n° 11 a n° 37)
N°
Nombre Secuencia 5' a 3' Longitud
11
RACEUPS5' CT AAT ACGACT CACT AT AGGGC 22-mero
12
IgG1p T CTT GTCCACCTT GGT GTTGCTGGGCTT GT G 31-mero
13
HK5 AGGCACACAACAGAGGCAGTTCCAGATTT C 30-mero
14
M13F GT AAAACGACGGCCAGT G 18-mero
15
M13R CAGGAAACAGCT AT GAC 17-mero
16
V8H38 GAGAGAGAGAGCT AGCT GAGGAGACGGT GACCAGGGT 37-mero
17
V8H39 AGAGAGAGAGGT CGACCACCAT GGACACACTTTGCTCCACG 41-mero
18
V8LA2 AGAGAGAGAGAT CT CT CACCAT GGAAACCCCAGCGCAGCTT C 42-mero
19
V8L43 AGAGAGAGAGCGT ACGTTT GAT CTCCACCTT GGTCCCTCC 40-mero
20
HH-2 GCT GGAGGGCACGGT CACCACGCT G 25-mero
21
HK-2 GTT GAAGCT CTTT GT GACGGGCGAGC 26-mero
22
F725' ACCGT GTCGACT GGATTCCAAGGCATTTCCAC 32-mero
23
M2H3' GGTGCT AGCT GAGGAGACGGT GAC 24-mero
24
F32K5' AAT CAAGAT CT GT CAGGACACA 22-mero
25
K52D3' TATCCCGT ACGTTT AAT CTCCAGT CGT GT C 30-mero
26
Y131HF AGAGAGAGAGGT CGACCACCAT GGACACACTTTGCTCCACG 41-mero
27
Y131HR AGAGAGAGA GGCTAGCTG AAGAGA CGGTGA CCATTGT 37-mero
28
Y131LF5 AGAGAGAGA GGTCGACCACCATGG AAACCCCAG CGCAGCTT 41-mero
29
Y131LR AGAGAGAGA GCGTACGTTTGA TTT CCA CCTTGGTCCCTTG 40-mero
30
Y55HF AGAGAGAGAGGT CGACCACCAT GGACACACTTTGCTCCACG 41-mero
31
Y55HR AGAGAGAGAGGCT AGCT GAAGAGACGGT GACCATT GT 37-mero
32
Y55LF AGAGAGAGAGAT CT CT CACCAT GGAAACCCCAGCGCAGCTT C 42-mero
33
Y55LR AGAGAGAGAGCGT ACGTTT GATTTCCACCTT GGTCCCCT G 40-mero
34
Z5HF AGA GAGAGAGGTCGACCACCAT GACCAT GATT ACGCCAAGC 41-mero
35
Z5HR GAGAGAGAGAGCT AGCT GAGGAGACGGT GACCAGGGT 37-mero
36
Z5LF AGAGAGAGAGAT CT CT CACCAT GGAAGCCCCAGCT CAGCTT C 42-mero
37
Z5LR AGAGAGAGAGCGT ACGTTT AAT CTCCAGT CGT GTCCCTT G 40-mero
ATGGACACAC TTTGCTCCAC GCTCCTGCTG CTGACCATCC CTTCATGGGT CTTGTCCCAG 60
ATCACCTTGA AGGAGTCTGG TCCTACGCTG GTGAAACCCA CACAGACCCT CACGCTGTCC 120
■ TGCACCTTCT CTGGGTTCTC ACTCAGCACT AGTGGAGTGG GTGTGGGCTG GATCCGTCAG 180
CCCCCAGGAA AGGCCCTGGA ATGGCTTGCA CTCATTCATT GGGATGATGC TGAGCGCTAC 240
AGTCCATCTC TGAAGAGCAG GCTCACCATC ACCAAGGACA CCTCCAAAAA CCAGGTGGTC 300
CTTACAATGA CCAACATGGA CCTTGTGOAC ACAGCCACAT ATTACTGTGC ACACACCCGG 360
GGGGCTTTTG ATATOTGGGC CCAAGGGACA ATGGTCACCG TCTCTTCA 408
5
Secuencia de nucleotidos del ADNc de 112Y55 LV (entre el codon de inicio (ATG) y el final de la region variable), SEC ID n° 39:
ATGGAAACCC CAGCGCAGCT TCTCTTCCTC CTGCTACTCT GGCTCCCAGA TACCACCGGA 60
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc CTGTCTCTGT CTCCAGGGGA AAG AGCCATC 120
CTCTCCTGCA GGGCCAGTCA GAGTGTTAGC AGCAGCTTCT tagcctggta CCAACAGAAA 180
CCTCGCCAGG CTCCCAGGCT CCTCATCTAT GGTGCATTTA GCAGGGCCAC TGGCATCCCA 240
GACAGGTTCA GTGGCAGTGG GTCTGGGACA CACTTCACTC TCACCATCAG CAGACTGGAG 300
CCTGAAGATTTTGCA'GTGTA.TTACTGTCAG CAGTATGATA GCTCACGGAC GTTCGGCCAG 360
10
GGGACCAAGG TGGAAATCAA A 381
5
10
ATGGACACAC TTTCCTCCAC CCTCCTGCTG CTCACCATCC CTTCATGGGT CTTGTCCCAG 60
ATCACCTTGA aggagtctgg tcctacgctg gtgaaaccca cacagaccctcacgctgacc 120
tgcaccttct ctggattctc actcagcact agtggagtgg gtgtgggctg gatccgtcag
ISO
cccccaggaa aggccctgga gtggcttgca ctcatttatt gggatgatca Tagcccctac
240
agcccatctc tgaagagcag gctcaccatc accaaggaca cctccaaaaa ccaggtggtc
300
cttacaatga ccaacatoga ccctgtggac acagccacat attactgtgc acgcacccgg 360
ggggcttttg atatctgggg ccaagggaca atggtcaccg tctcttca
40S
Secuencia de nucleotidos del ADNc de 112Y131 LV (entre el codon de inicio (ATG) y el final de la region variable), SEC ID n° 41:
atggaagccc cagcgcagcttctcttcctc ctgctactct gcctcccaga taccaccgga 60
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120
ctctcctgca gggccagtca gggtgttagc agctacttag cctggtacca gcagaaacct 180
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc
240
aggttcagtg gcagtgggcc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct
300
gaagattitg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcatccgac gttcggccaa
360
gggaccaagg tggaaatcaa acgaactgtg gctgcaccat c
381
ATOACCATGA TTACGCCAAG CTTGGTACCG AGCTCGGATC CACTAGTAAC GGCCGCCAGT 60
GTGCTGGAAT TCGCCCTTCT AATACGACTC ACTATAGGGC AAGCAGTGGT ATCAACGCAG 1-20
AGTACGGGGG GAGGCTTGGT ACAGCCTGGC AGGTCCCTGA GACTCTCCTG TGCAGCCTCT 180
GGATTCACCC TTGATGATTA TGGCATGCAC TGGGTCCGGC AAGCTCCAGG GAAOOGCCTG
240
gagtggGtct CAGGTATTAG TTGGAATAGT GATAGTATAG GCTATGTGGA ctctgtgaag 300
GGCCGATTCA ccatctccag agacaacocc AAGAACTCCCTGTATCTGCA AATGAACAGT 360
CTGAGAGTTG AOGACACGGC CTTGTATTAC TGTGTAAAAG ATATTAGTGG CTGGTACAGC 420
TTTGACTACT GGGGCCAGGG AACCCTGOTC ACCGTCTCCT CA
462
5
Secuencia de nucleotidos del ADNc de 112Z5 LV (entre el codon de inicio (ATG) y el final de la region variable), SEC ID n° 43:
ATGGAAGCCC CAGCTCAGCT TCTCTTCCTC CTGCTACTCT GGCTCCCAGA TACCACCGGA 60
GAAATTGTGT TGACACAGTC TCCAGCCACC CTGTCTTTGT CTCCAGGGGA AAGAGCCACC 120
CTCTCCTGCA GGGCCAGTCA GAGTGTTAGC AGCTACTTAG CCTGGTACCA ACAGAAACCT 180
GGCCAGGCTC CCAGGCTCCT CATCTATGAT GCATCCAACA GGGCCACTGG CATCCCAGCC 240
AGGTTCAGTG GCAGTGGOTC TOGGACAGAC TTCACTCTCA CCATCAGCAG CCTAGAGCCT 300
GAAGATTTTG CAGTTTATTA CTGTCAGCAG CGTAGCAACT GGCCGATCAC CTTCGGCCAA 360
GGGACACGAC TGGAGATTAA A 381
MDTLCSTLLL LTIPSWVLSQ ITLKESGPTL VKPTQTLTLS CTFSGFSLST SGVGVGWIRQ 60
PPGKALEWLA L1HWDDAERY SPSLKSRLTITKDTSKNQVV LTMTNMDLVD TATYYCAHTR 120
GAFDIWGQGT MVTVSS 136
5 Secuencia de aminoacidos del ADNc de 112Y55 LV (secuencia lider (en negrita) y region variable), SEC ID n° 45:
METPAQLLFL LLLWLPDTTG EIVLTQSPGT LSLSPGERA1LSCRASQSVS SSFLAWYQQK 60
PGQAPRLLIY GAFSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QYDSSRTFGQ
120
GTKVEIK
127
Secuencia de aminoacidos del ADNc de 112Y131 HV (secuencia lider (en negrita) y region variable), SEC ID n° 46:
10
MDTLCSTLLL LTIPSWVLSQ ITLKESGPTL VKPTQTLTLT CTFSGFSLST SGVGVGWIRQ 60
PPGKALEWLA LIYWDDHSPY SPSLKSRLTI TKDTSKNQVV LTMTNMDPVD TATYYCARTR 120
GAFDIWGQGT MVTVSS 136
Secuencia de aminoacidos del ADNc de 112Y131 LV (secuencia lider (en negrita) y region variable), SEC ID n° 47:
MEAPAQLLFL LLLWLPDTTG EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQGVS SYLAWYQQKP 60
GQAPRLUYD ASNRATGIPA RFSGSGPGTD FTLT1SSLEP EDFAVYYCQQ RSNWHPTFGQ 120
GTKVEIK
15 127
5
10
15
20
25
30
35
MTMITPSLVP.SSDPLVTAAS VLEFALLIRL TIGQAVVSTQ STGGGLVQPG RSLRLSCAAS 60
GFTLDDYGMH WVRQAPGKGL EWVSGISWNS DSIG YVDSVK GRFT1SRDNA KNSLYLQMNS 120
LRVEDTALYY C VKDISGWYS FDYWGQGTLV TVSS 154
Secuencia de aminoacidos del ADNc de 112Z5 LV (secuencia lider (en negrita) y region variable), SEC ID n° 49:
MJEAPAQLLFL LLLWLPDTTG EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP 60
GQAPRLLIYD ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVY YCQQ RSNWP1TFGQ 120
GTRLEIK
127
Produccion de anticuerpo humano anti-OX40 recombinante a partir de celulas CHO:
Para la produccion de anticuerpo recombinante, los vectores de anticuerpo individuales que contenian el anticuerpo anti-OX40 se electroporaron en la cepa defectiva para dhfr de celula hospedadora de celula de ovario de hamster chino (celulas CHO, ATCC n° CRL-9096) y se aislo el anticuerpo recombinante del sobrenadante de las celulas transfectadas. Brevemente, se linearizaron diez microgramos del vector de expresion de ADN purificado mediante un enzima de restriccion del ADN, Nrul, y el ADN se transfecto en 3x106 celulas CHO utilizando un electroporador Bio Rad (0,8 kV, 25 pF). Las celulas transfectadas se sembraron en placas de cultivo de 96 pocillos, en medio libre de suero para CHO EX-CELL 325 PF con glutamina (JRH Bioscience, Lenexa, KS) complementado con penicilina/estreptomicina (BioWhitaker), HT (Sigma) y geneticina (Invitrogen Corp.) para seleccionar las celulas CHO que contenian el vector de ADN. Tras la seleccion de varias lfneas de transfectante estables, se identificaron mediante ELISA productores de un nivel elevado de IgG humana y se utilizaron para la produccion de anticuerpo recombinante.
Ejemplo 2
El ejemplo describe diversas caracterfsticas de los anticuerpos monoclonales humanos contra OX40 humano.
Se inmunizaron ratones KM mice™ con OX40_h:Fc_h recombinante soluble en CIFA/IFA, conjugado de OX40_h:Fc_h+OX40_h:Fc_h+ova en RIBI, OX40_h:Fc_h desnaturalizado por calor en RIBI, o celulas T humanas activadas irradiadas en RIBI. Varios ratones indujeron anticuerpos especfficos anti-OX40 humano, con un abanico de tftulos especfficos de IgG humana de OX40. Los esplenocitos de los respondedores mas altos se fusionaron con celulas de mieloma para generar hibridomas productores de anticuerpos humanos anti-OX40 humano. La produccion de anticuerpos anti-OX40 se determino tanto mediante ELISA como citometrfa de flujo utilizando transfectantes recombinantes de OX40_h:Fc soluble y CHO-OX40, respetivamente. Se clonaron los hibridomas positivos mediante dilucion limitante, rindiendo hibridomas monoclonales (tabla 2).
Tabla 2: antfgenos utilizados para la generacion de anticuerpos
Anticuerpo
Antfgeno
112F32
OX40 h:Fc h
112V8
Celulas T humanas activadas
112Y55
OX40 h:Fc h mas OX40 h:Fc h-ovoalbumina
112Y131
OX40 h:Fc h mas OX40 h:Fc h-ovoalbumina
112Z5
OX40 h:Fc h desnaturalizado por calor
5
10
15
20
25
30
35
40
Se caracterizaron adicionalmente varios anticuerpos para la afinidad de union relativa para OX40 humana, la capacidad de bloquear la union de ligando de OX40 humano in vitro, el bloqueo cruzado entre sf, el bloqueo de la proliferacion in vitro, la capacidad de bloquear la inflamacion in vivo y la capacidad de mediar en la ADCC (tabla 3).
La totalidad de 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 y 112Z5 se unio espedficamente a las celulas T humanas activadas, pero no a las celulas T humanas en reposo (figura 1). Las celulas T humanas activadas durante tres dfas se marcaron con anticuerpo humanos anti-OX40 humano a diversas concentraciones y se detectaron con anti-IgG humana-PE. La union de estos anticuerpos humanos anti-OX40 humano era saturable. La union maxima de cada anticuerpo se determino titulando la cantidad de anticuerpo necesaria para marcar las celulas T humanas activadas (figura 2). Se obtuvo un abanico de afinidades de union relativas (KD y BMAX, tabla 3). La union del anticuerpo de raton anti-OX40 humano purificado L106 tambien se determino y la totalidad de 112F32, 112V8, 112Y55, 112Y131 y 112Z5 presentaba una BMAX mas alta que L106 sobre las celulas T activadas.
Tabla 3: caractensticas de los anticuerpos monoclonales humanos anti-OX40 humano
Anticuerpo
Subclase original Epttopo Marcaje de celulas T activadas Bloqueo de OX40L mediante ELISA, IC50 (pg/ml) Bloqueo de OX40L mediante FACS sobre las celulas T, IC50 (pg/ml) Eficacia in vitro Eficacia in vivo ADCC (% de lisis a 10 pg/ml)
Kd (pM)
BMAX media geom.
12F32
IgG4 A 0,013 103,5 0,650 ni* +A IgG1 +a IgG4 + IgG1 37% IgG4 NT
112V8
IgG4 B 0,036 180,8 0,051 0,62 + IgG1 + IgG4 + IgG1 55,6% IgG4 18%
112Y55
IgG1 B 0,014 161,8 0,073 0,90 + + 54,2%
112Y131
IgG4 B 0,025 170,7 0,069 0,91 + + 18%
112Z5
IgG1 C 0,011 118,2 0,081 14,65 + + 35%
L106
IgG1 de raton L 0,001 52,0 0,982 60,91 NT NT NT
*: ni, no inhibidor a 50 pg/ml
A: +: proliferacion inhibida in vitro o enfermedad in vivo, no cuantitativa #: nA, no analizado
@: porcentaje de lisis con anticuerpo irrelevante a 10 pg/ml era de 14%
Se analizaron los anticuerpos de OX40 mediante ELISA para determinar si competfan con otro para la union a OX40 soluble. Los anticuerpos humanos individuales se utilizaron para recubrir los pocillos de una placa de 96 pocillos. Se preincubo OX40_h:Fc_m con anticuerpos anti-OX40 solubles (anticuerpos bloqueantes) y despues se anadieron a los pocillos recubiertos. La union de OX40_h:Fc_m al anticuerpo recubierto se detecto con anticuerpo anti-IgG de raton-HRP. Se determino el porcentaje de inhibicion utilizando la formula siguiente: (100-(DO muestra/DO muestra de union maxima)) * 100 (figura 3A).
Ademas, se utilizaron anticuerpos de raton para recubrir los pocillos de una placa de 96 pocillos (L106, 315, ACT35 o IgG de raton) y se preincubo OX40_h:Fc_h con los anticuerpos bloqueantes. La union de OX40_h:Fc_h se detecto con anticuerpo de oveja anti-IgG humana-HRP (figura 3B).
Se identificaron tres grupos de "epttopos" para dichos anticuerpos anti-OX40 humano. La totalidad de 112V8, 112Y55 y 112Y131 se bloquearon cruzadamente, mientras que cada uno de 112F32 y 112Z5 presentaba sitios de union unicos. 112V8, 112Y131 y 112Y55 redujeron parcialmente la union de 112Z5 pero no el inverso no era cierto; 112Z5 solo se bloqueaba a sf mismo. Lo anterior sugiere que 112Z5 reconoce un epttopo diferente que 112V8, 112Y55 y 112Y131 y cualquier reduccion de la union puede deberse a impedimentos estericos. Estos anticuerpos humanos anti-OX40 no bloquean la union de L106, 315 o ACT35 a OX40 (figuras 3A y 3B), mientras que L106 se bloquea a sf mismo y ACT35 solo redujo la union de 112V8 y 112Y131 en 10% en comparacion con anticuerpos de control (lmea continua) que no se unen a OX40. Lo anterior indica que los anticuerpos indicados en la presente memoria reconocen un epttopo diferente que L106. El clon 315 no redujo la union de 112V8 y 112Y131; sin embargo, debido a que estos ultimos anticuerpos no bloqueaban la union de 315, deben de unirse a epttopos diferentes.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Tambien se utilizo un ensayo de citometrfa de flujo para evaluar la capacidad de los anticuerpos de bloquear la union a OX40 expresado en superficie sobre las celulas T humanas activadas. Se tineron las celulas T activadas con los anticuerpos bloqueantes, seguido de la adicion de anticuerpos anti-OX40 biotinilados. Ademas, se marcaron celulas T humanas activadas con anticuerpos de raton anti-OX40 humano para bloquear la union de OX40. La union de los anticuerpos anti-OX40 biotinilados a dichas celulas se detecto con SA-PE. Las celulas se analizaron mediante citometrfa de flujo. La media geometrica de la tincion de SA-PE positiva se utilizo para calcular el porcentaje de inhibicion utilizando la misma formula, es decir: (100-(DO muestra/DO muestra de union maxima))*100. Estos datos (figuras 4A y 4B) se correlacionan con el analisis de ELISA.
Tres epftopos son reconocidos por los anticuerpos humanos anti-OX40 humano, uno por 112F32, un segundo por 112Z5, y un tercero por 112V8 y 112Y131. Al igual que con los datos de ELISA, 112Z5 solo se bloqueo a si mismo, pero su union resulto reducida por 112V8 y 112Y131. Lo mismo es cierto para el bloqueo por L106 de 112V8 y 112Y131. En el caso de que L106 se encuentre unido en primer lugar a las celulas, 112V8 y 112Y131 todavfa pueden unirse eficientemente a OX40 humano. Sin embargo, 112V8 y 112Y131 inhibieron la union de L106. Estos datos conjuntamente sugieren que los anticuerpos impiden estericamente la union de L106, pero no reconocen el mismo epftopo. 112F32 y 112Z5 no bloquean la union de L106. ACT35 no inhibio la union de 112F32, 112V8, 112Y131 o 112Z5, pero el clon 315 si redujo la union de 112V8 y 112Y131 en un 50%. La union y deteccion de anticuerpos a celulas vivas puede inducir la internalizacion de la molecula superficial de manera que el nivel de union de un anticuerpo individual puede reducirse debido a la expresion superficial mas baja global de OX40 y no al bloqueo de la union de los anticuerpos. Los anticuerpos de afinidad mas alta pueden provocar mas internalizacion que los anticuerpos de afinidad mas baja. Lo anterior podrfa explicar las diferencias entre los datos de ELISA y de la citometrfa de flujo, asf como la diferencia en los resultados dependiente de que anticuerpo se utiliza para el bloqueo.
La capacidad de 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 y 112Z5 de bloquear la union de OX40L_h soluble a la protefna de fusion OX40_h:Fc_h se sometio a ensayo utilizando un protocolo de ELISA (figura 5A, tabla 3). Las placas se recubrieron con OX40_h:Fc_h y tras el bloqueo de sitios no especfficos, se dejo que se uniesen los anticuerpos anti- OX40. Sin lavado se anadio OX40L-FLAG a los pocillos. Se detecto el ligando unido con anticuerpo secundario anti- FLAG-HRP. Se determino el porcentaje de inhibicion utilizando la formula siguiente: (100-(DO muestra/DO maxima union de OX40L))*100. Tanto 112V8, como 112Y55 y 112Y131 impidieron el 85% de la union de OX40L soluble a OX40_h:Fc_h. 112F32 impidio aproximadamente 70% de la union de OX40L_h soluble a OX40_h:Fc_h y 112Z5 bloqueo el 67% de la union maxima. Estos datos sugieren que estos anticuerpos humanos anti-OX40 humano se unen a la parte de OX40 que participa en la union de ligando.
Se obtuvieron resultados ligeramente diferentes al utilizar un ensayo basado en la citometrfa de flujo para monitorizar el bloqueo de la union de OX40L soluble a celulas T humanas activadas que expresaban OX40 (figura 5B). Las celulas T humanas activadas se marcaron con anticuerpos anti-OX40 seguido de OX40L humano etiquetado con Flag soluble. Se detecto la union de OX40L con el anticuerpo anti-FLAG-PE. Se determino el porcentaje de inhibicion utilizando la misma formula, es decir, (100-(muestra/union maxima))*100. En el presente estudio, 112F32 no pudo impedir la union de OX40L y se redujo el bloqueo por 112Z5, mientras que los otros anticuerpos, 112V8, 112Y55 y 112Y131 continuaron presentaron capacidades de bloqueo similares. La diferencia en los resultados podrfa depender de la afinidad de 112F32 y 112Z5 para OX40. Tambien podrfa deberse a la trimerizacion de la protefna OX40 sobre la superficie celular, a diferencia de la dimerizacion de la protefna de fusion soluble OX40:Fc_m.
Alternativamente, OX40 expresado sobre la superficie de las celulas T activadas podrfa encontrarse en un complejo con 4-1BB (Ma et al., Blood 106(6):2002-10, 2005) o una molecula inhibidora similar a BTLA (Cheung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102(37):13218-23, 2005; Compaan et al., J. Biol. Chem. 280(47):39533-6, 2005; Croft, Trends Immunol. 26(6):292-4, 2005; Gonzalez et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102(4): 1116-21, 2005; Sedy et al., Nat. Immunol. 6(1):90-8, 2005) que impide la union de 112F32 o reduce la union de 112Z5 pero no bloquea la union de OX40L a OX40. Las tres ultimas posibilidades podrfan apuntar al epftopo especffico al que se unen los anticuerpos individuales. El epftopo reconocido por L106, un anticuerpo de raton anti-OX40 humano, tambien depende de la confirmacion del ligando de OX40 y OX40, ya que L106 bloqueo el 95% de la union de OX40L a la protefna OX40 recombinante, pero solo el 60% de la union a las celulas T activadas. Estos datos indican que existen multiples epftopos sobre OX40, algunos de los cuales interfieren por completo con la union de OX40L, mientras que otros solo bloquean parcialmente la interaccion. La union de dichos anticuerpos a los diferentes epftopos podrfa presentar o no consecuencias funcionales unicas.
El bloqueo de la union de ligando mediante cualquiera de los procedimientos no implica necesariamente que la senalizacion de OX40 resulte alterada negativamente por un anticuerpo dado. Para determinar si los anticuerpos humanos anti-OX40 humano pueden bloquear la senalizacion a traves de OX40, se prepararon cultivos de linfocitos mezclados por pares utilizando CMSP totales procedentes de donantes alogenicos. Las celulas mononucleares de sangre periferica de donantes alogenicos se cocultivaron en placas de fondo en U de 96 pocillos durante siete dfas en presencia o en ausencia de diversas dosis de anticuerpos anti-OX40 o anticuerpo de control por triplicado. Se anadieron a cada pocillo 1x105 celulas/donante. Las placas se pulsaron durante las ultimas dieciocho horas de cultivo con 1 pCi/pocillo de 3HTdR. Se recolectaron las celulas y se contaron en un contador de centelleo. Se midio la proliferacion en presencia o en ausencia de anticuerpos de control o anti-OX40 (figura 6). La totalidad de 112V8
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(figura 6A), 112Y55 y 112Z5 (figura 6B) y 112Y55, 112Y131 y 112F32 (figura 6C) fueron capaces de reducir la cantidad de proliferacion inducida por las celulas alogenicas de una manera dependiente de la dosis, mientras que una IgG4_h de control negativo, anti-albumina de suero humano, no presento ningun efecto sobre la proliferacion (figura 6A). Se llevaron a cabo multiples estudios y la magnitud de las respuestas, CPM maximas incorporadas, era dependiente de la combinacion de CMSP donantes utilizadas para cada ensayo. En cultivos de linfocitos mixtos, tanto las celulas T CD4 como CD8 respondieron a los antfgenos alogenicos. La reduccion de la respuesta proliferativa por los anticuerpos humanos anti-OX40 humanos podrfa deberse a la inhibicion directa de tanto las celulas T CD4 como CD8.
Ejemplo 3
El presente ejemplo describe el mapeado de epftopos de anticuerpos humanos anti-OX40 humano con peptidos lineales de OX40 humano.
Se seleccionaron tres peptidos dentro del dominio extracelular de la OX40 humano (tabla 4) para iniciar el mapeado del epftopo o epftopos reconocidos por 112F32, 112V8, 112Y55, 112Y131 y 112Z5.
Tabla 4: peptidos OX40 humanos
Anticuerpo
Nombre de peptido
Sec. de peptido 112F32 112V8 112Y55 112Y131 112Z5
112A
RPAGPGFYNDVVSSKPC - - - - -
112B
RAGTQPLDSYKPGVDC - - - - -
112C
LAGKHTLQPASNSSDAIC - - - - -
Los peptidos se generaron mediante A y A Lab, LLC y se conjugaron con hemocianina de lapa americana ("KLH") con un conector maleimida siguiendo las instrucciones del fabricante (Pierce). Los peptidos se utilizaron para el recubrimiento a una concentracion de 10 pg/ml en tampon de carbonato a placas de ELISA Maxisorp de 96 pocillos (Nunc) a 4°C durante la noche. La placa se lavo con PBS/Tween-20 al 0,1% y despues se bloqueo con tampon de casefna (Pierce) durante tres horas a temperatura ambiente. Se anadieron anticuerpos candidatos a una concentracion de 10 pg/ml diluidos en casefna al 10% en PBS/Tween-20 al 0,1%. El resto del ELISA se llevo a cabo tal como se ha indicado para el ELISA de deteccion de anticuerpo especffico de OX40.
Ninguno de los anticuerpos humanos anti-OX40 humano reaccionen detectablemente con dichos peptidos OX40 humanos, mientras que el suero de ratones inmunizados con los peptidos se unio al peptido apropiado. Estos resultados indican que 112F32, 112V8, 112Y55, 112Y131 y 112Z5 no se unen detectablemente a dichos epftopos lineales cortos de la secuencia extracelular de OX40 humano bajo las condiciones de ensayo utilizadas. Estos datos no impiden que dichas secuencias sean reconocidas por los anticuerpos humanos anti-OX40 humano en caso de incluirse en secuencias peptfdicas mas largas.
Ejemplo 4
El presente ejemplo describe el analisis funcional in vivo de anticuerpos monoclonales humanos anti-OX40 humano
Se utilizo un modelo de enfermedad del injerto contra el huesped (EICH) xenogenico agudo para someter a ensayo el potencial terapeutico del anticuerpo humano anti-OX40 humano 112V8G1 in vivo (Watanabe et al., Clin. Immunol. 120:247-259, 2006). En este modelo, se transfirieron celulas mononucleares de sangre periferica humana a ratones con inmunodeficiencia combinada severa (SCID). Antes de la transferencia, los ratones fueron tratados con un anticuerpo anti-cadena IL2Rp para reducir el numero de celulas asesinas naturales murinas endogenas y despues se irradiaron subletalmente para permitir la migracion de las celulas humanas al tracto intestinal. Las celulas T humanas se expanden e inducen una enfermedad de tipo injerto contra el huesped, resultando en la perdida de peso, hematuria, hidroperitoneo, infiltrados de celulas inflamatorias en el hfgado y en el tracto intestinal, y finalmente, la muerte. La enfermedad esta mediada principalmente por celulas T humanas ya que la transferencia de las celulas T purificadas induce sfntomas similares.
Los ratones SCID se trataron tal como se ha indicado anteriormente mas anticuerpos recombinantes 112V8G1 o IgG1 humana de isotipo de control (anti-DNP) administrados el dfa 0 para someter a ensayo el potencial profilactico del bloqueo de OX40. Los ratones recibieron 100, 20 o 2 pg de anticuerpo 112V8G1 o 100 pg de anti-DNP mediante inyeccion intravenosa el dfa 0. Se determino el peso corporal cada tres a cuatro dfas. El dfa doce, los ratones se sacrificaron y se analizaron para sfntomas de enfermedad y se recolectaron los bazos para el analisis de citometrfa de flujo. La patologfa macroscopica observada el dfa doce se puntuo de la manera siguiente: diarrea (0-1), hemorragias en el intestino y en la cavidad peritoneal y peritonitis (cada uno, 0-5), indicando el numero mas alto, mas gravedad de la enfermedad. Se utilizo la suma de todos los sfntomas de enfermedad para determinar la puntuacion total de patologfa macroscopica. Todos los ratones que habfan recibido el anticuerpo de control
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Los analisis de los bazos concordaron con dicha observacion. Se analizaron las suspensiones de celulas individuales mediante citometrfa de flujo para la presencia de celulas T humanas. Las celulas T humanas se encontraban presentes en los bazos de los ratones tratados con los anticuerpos de control, pero el numero de celulas T humanas en los animales tratados con 112V8G1 eran significativamente mas bajos que el numero de celulas T en los animales de control (figura 7B). Ademas, se midieron las citocinas humanas inflamatorias (interferon-gamma, factor de necrosis tumoral y factor estimulantes de colonias de granulocitos-macrofagos) en el susero utilizando tecnologfa multiplex. Las citocinas humanas inflamatorias se redujeron en los animales tratados con 112V8G1 en comparacion con los controles. El efecto mas drastico se observo en los niveles de interferon gamma (figura 7C). La apariencia de las celulas T OX40+ en la sangre periferica de los pacientes de trasplante de medula osea alogenica se ha correlacionado con la aparicion de EICH cronica (Gadisseur et al., Bone Marrow Transplant 23(10):1013-7, 1999; Kotani et al., Blood 98(10):3162-4, 2001; Sanchez et al., Br. J. Haematol. 126(5):697-703, 2004).
Con el fin de evaluar la eficacia del bloqueo de OX40 en el tratamiento de la EICH cronica, se establecio un sistema modelo animal de EICH xenogenica cronica. El modelo era similar al modelo de EICH xenogenica aguda, excepto en que se inyecto un millon de celulas CD4+ purificadas en los ratones SCID en lugar de CMSP totales. Tambien se redujo la dosis de irradiacion a 2,12Gy para reducir el nivel de dano intestinal. La primera prueba de enfermedad es la perdida de peso y la perdida de peso, seguido de la muerte, que se debe en parte a la infiltracion de celulas T en los pulmones. Los sfntomas de la enfermedad resultan evidentes en torno al dfa treinta. Se trato cada grupo de cinco ratones con anticuerpo recombinante 112V8G1 a dosis de 100, 20 o 2 pg semanalmente durante cinco semanas o con anticuerpo de control IgG1_h anti-DNP a una dosis de 100 pg semanalmente durante cinco semanas. Los ratones supervivientes se analizaron en la semana siete. Se determinaron las puntuaciones de patologfa macroscopica a partir del grado de perdida de pelo, hemorragias y peritonitis (cada uno, 0-5) y diarrea (0-1).
La patologfa macroscopica primaria observada fue perdida de peso y las tres dosis de 112V8G1 redujeron dicho sfntoma de enfermedad en comparacion con los ratones tratados con control (figura 8A). Esta observacion concuerda con la reduccion de las celulas T humanas en los bazos de ratones tratados con 112V8G1 el dfa 48 despues de la transferencia de celulas T CD4 (figura 8B). En este modelo, las celulas T humanas migran a los nodulos linfaticos, los cuales se detectan facilmente en los animales de control, pero estan significativamente reducidos o no se encuentran en los animales tratados con anti-OX40 (figura 8C). Observacion: no se observaron nodulos linfaticos en los animales tratados con 112V8G1, ni a 20 ni a 100 pg.
Ademas, al contrario que el modelo agudo, las celulas positivas para OX40 pueden detectarse facilmente en los bazos y nodulos linfaticos de los ratones tratados con control y se redujo el numero de celulas OX40+ en los animales tratados con 112V8G1 (figuras 8B y 8C). Se detectaron citocinas inflamatorias en el suero de los ratones que habfan recibido celulas T CD4 humanas y se redujo la cantidad de citocinas detectadas en los ratones tratados con anticuerpo anti-OX40 humano 112V8G1 en comparacion con IgG1 humana de control. Entre las citocinas producidas en este modelo de enfermedad se incluyen, aunque sin limitacion, interleucina-2, interleucina-4, interleucina-6, interleucina-8, interleucina-10, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrofagos, interferon- gamma y factor alfa de necrosis tumoral. Todas las citocinas excepto la interleucina 6 se redujeron significativamente mediante el tratamiento con 112V8G1, demostrando la actividad antiinflamatoria de la inhibicion de la senalizacion de OX40 mediante reduccion del numero y/o el bloqueo.
Se estudio 112V8G4PE en el modelo de EICH aguda utilizando un regimen profilactico. Este anticuerpo no presenta actividad de reduccion debido a su incapacidad para fijar el complemento o para unirse a receptores de Fc y, por lo tanto, la prevencion de la enfermedad dependerfa del bloqueo de la senalizacion de OX40 o de la modulacion negativa de OX40. Se administro una unica inyeccion de 112V8G4P3 a una dosis de 200, 20 o 2 pg el dfa 0 en cinco ratones por grupo. Los ratones tratados con control recibieron 200 pg de anticuerpo humano IgG4 anti-DNP el dfa 0, 3 o 6. Se analizaron los ratones el dfa doce para patologfa macroscopica y el numero de celulas T humanas en los bazos (figuras 9A y 9B, tabla 5). Se puntuo la patologfa macroscopica el dfa doce en una escala de 0 a 3 para diarrea, hemorragias peritoneales o ascites, y hemorragias intestinales, siendo 0 la no observacion de patologfa y representando 3 una enfermedad grave. Tanto 200 como 20 pg de 112V8G4PE evitaron el desarrollo de patologfa evidente, mientras que la dosis de 2 pg no resulto suficiente para evitar la enfermedad. La magnitud de la patologfa macroscopica se correlaciono con el numero de celulas T humanas en el bazo el dfa doce. En comparacion con los animales tratados con control, 200 o 20 pg de 112V8G4PE redujeron significativamente la acumulacion de celulas T humanas en el bazo, mientras que una dosis de 2 pg resulto ineficaz. Las diferencias observadas en las titulaciones de 112V8G4PE (figuras 9A y 9B) y 112V8G1 (figura 7) se atribuyeron a la falta de actividad de reduccion del nivel de anticuerpo 112V8G4PE.
Se retraso la administracion de 112V8G4PE hasta el dfa tres o el dfa seis para someter a ensayo la eficacia terapeutica del bloqueo de la senalizacion de OX40. Los ratones fueron tratados con 200 pg de 112V8G4PE o anticuerpo IgG4 humano de control el dfa tres o el dfa seis despues de la transferencia de CMSP humanas. Se evaluo la patologfa macroscopica el dfa catorce. El bloqueo de la senalizacion de OX40 mejoro la enfermedad al
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administrar el anticuerpo 112V8G4PE anti-OX40 humano el dfa tres o el dfa seis en comparacion con el nivel de la enfermedad observado en los animales tratados con anticuerpo de control (figura 9C). El numero de celulas T humanas en los bazos de los ratones tratados con anti-OX40 tambien se redujo significativamente en comparacion con los ratones tratados con control. El anticuerpo 112V8G1 tambien redujo la enfermedad al administrarlo el dfa seis. Estos datos demuestran la eficacia del bloqueo de OX40 por anticuerpos especfficos de OX40 como enfoque terapeutico a la reduccion de la patologfa de la enfermedad.
En modelos xenogenicos tanto agudos como cronicos de enfermedad del injerto contra el huesped, el anticuerpo 112V8, un anticuerpo humano anti-OX40 humano, redujo significativamente la patologfa macroscopica, la produccion de citocinas inflamatorias y el numero de celulas T humanas en los bazos y nodulos linfaticos en comparacion con los animales tratados con control. Estos datos demuestran que el tratamiento dirigido directamente a celulas positivas para OX40 es una terapia adecuada para la prevencion (profilaxis) y la mejora (terapeutica) de las enfermedades mediadas por celulas T. Se obtuvieron resultados similares en uno o ambos modelos con 112F32, 112Y55, 112Y131 y 112Z5 (tabla 3).
En el modelo de EICH aguda, resultan necesarias las celulas T humanas tanto CD4 como CD8 para la enfermedad. las celulas T CD4 resultan necesarias par ala induccion, mientras que las celulas T CD8 median en la mayor parte de la patogenesis. La prevencion y mejora de la enfermedad mediante la administracion de uno de los anticuerpos humanos anti-OX40 humano descritos podrfa deberse al antagonismo directo de las celulas T tanto CD4 como CD8, o podrfa deberse al bloqueo directo de las celulas T CD4 con un efecto indirecto sobre las celulas T CD8 mediante la reduccion de la ayuda de CD4. Ademas, los anticuerpos de OX40 podrfan estimular la generacion o incrementar el numero de celulas T reguladoras. Aunque sin deseo de restringirse a ninguna teorfa en particular, serfa posible que uno o todos los mecanismos indicados mediaran en la mejora de la enfermedad.
Aunque sin deseo de limitarse a ninguna teorfa en particular, un mecanismo potencial de accion de dichos anticuerpos anti-OX40 humano podrfa ser la induccion de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) por celulas asesinas naturales o celulas neutrofilas efectoras. Este proceso es dependiente de la capacidad de los receptores de Fc expresados por las celulas efectoras de unirse a los anticuerpos anti-OX40 unidos a OX40 expresado sobre las celulas T activadas. La capacidad de las inmunoglobulinas de unirse a los receptores de Fc esta determinada por la subclase del anticuerpo y por el tipo de receptor de Fc. Los anticuerpos IgG1 humanos se unen a receptores de Fc sobre las celulas asesinas naturales y los neutrofilos, mientras que los anticuerpos IgG4 humanos no lo hacen (Huber et al., Nature 229(5284):419-420, 1971; Brunhouse et al., Mol. Immunol. 16(11 ):907-17, 1979). Los anticuerpos humanos anti-OX40 humano 112F32 (IgG1), 112V8 (IgG1 e IgG4PE), 112Y55 (IgG1), 112Y131 (IgG4) y 112Z5 (IgG1) se sometieron a ensayo para su capacidad de mediar en la ADCC de las celulas diana expresantes de OX40 por parte de celulas asesinas naturales humanas.
Se utilizo un ensayo de citotoxicidad no radioactivo para determinar el porcentaje de lisis especffica de las celulas diana tras una incubacion de cuatro horas con los anticuerpos humanos anti-OX40 humano y celulas asesinas naturales humanas en una proporcion de veinte celulas efectoras por cada celula diana (figura 10). Las celulas diana EL4-OX40 humano se marcaron con 0,001 a 10 pg/ml de anticuerpos anti-OX40 o de control negativo y despues se incubaron con celulas asesinas naturales humanas. Se determino la lisis de las celulas diana a partir de la liberacion de lactosa deshidrogenasa en un ensayo de citotoxicidad no radioactivo. Se determino el porcentaje de lisis especffica tal como se indica en los procedimientos. Los anticuerpos IgG1 humanos anti-OX40 humano indujeron ADCC de las celulas diana EL4-OX40 humano de una manera dependiente de la dosis. Los anticuerpos IgG4 humanos anti-OX40 y un anticuerpo IgG1 humano de control no indujeron lisis especffica de las celulas diana. El nivel de actividad de ADCC se correlaciona con la afinidad de union relativa y el grupo de epftopo, ya que aquellos anticuerpos en el grupo de epftopo B (112V8 y 112Y55) mostraron ambos una actividad de ADCc mas alta que los anticuerpos en los grupos A (112F32) y C (112Z5).
Los resultados de los analisis descritos en la presente memoria identifican anticuerpos con un abanico de afinidades de union, tres epftopos diferentes y la demostracion de su eficacia en el bloqueo de la union del ligando de OX40 y la prevencion o mejora de las reacciones inflamatorias mediadas por las celulas T. La capacidad de dichos anticuerpos humanos anti-OX40 humano (112F32, 112V8, 112Y55, 112Y131 y 112Z5) de reducir la proliferacion, progresion de la enfermedad y produccion de citocinas inflamatorias demuestra el potencial del bloqueo directo de OX40 como enfoque para el tratamiento de las enfermedades inflamatorias o autoinmunitarias mediadas por las celulas T, incluyendo, aunque sin limitacion, la artritis reumatoide, la esclerosis multiple, la soriasis, la enfermedad de Crohn, la enfermedad del injerto contra el huesped y el rechazo del trasplante. La reduccion de la actividad de los anticuerpos anti-OX40 no resulta necesaria para la reduccion de la proliferacion o la mejora de enfermedades, reduciendo los potenciales efectos adversos debidos a la reduccion del numero de celulas T.
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WO 95/12673
WO 95/21251
La solicitud incluye ademas los puntos siguientes:
1. Un anticuerpo aislado o purificado que se une especfficamente a un epftopo en una secuencia de aminoacidos del dominio extracelular de OX40, en el que el anticuerpo comprende un anticuerpo humano, humanizado o hfbrido, y en el que el anticuerpo presenta actividad antagonista de OX40.
2. El anticuerpo segun el punto 1, en el que la actividad antagonista de OX40 reduce o incrementa la produccion de una citocina o un interferon, la supervivencia o la proliferacion de celulas T efectoras, de memoria o reguladoras activadas, la expresion de una protefna antiapoptotica o proapoptotica.
3. El anticuerpo segun el punto 2, en el que la citocina se selecciona de entre IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-14, IL-16, IL-17, IL-23, IL-26, FNT-a, interferon-Y y GM-CSF.
4. El anticuerpo segun el punto 2, en el que la protefna antiapoptotica o proapoptotica se selecciona de entre Bcl-xL, Bcl-2, Bad y Bim.
5. El anticuerpo segun el punto 1, en el que el epftopo en una secuencia de aminoacidos del dominio extracelular de OX40 se encuentra dentro de una secuencia indicada como:
MCVGARRLGR GPCAALLLLG LGLSTVTGLH CVGDTYPSND RCCHECRPGN GMVSRCSRSQ NTVCRPCGPG FYNDVVSSKP CKPCTWCNLR SGSERKQLCT ATQDTVCRCR AGTQPLDSYK PGVDCAPCPP GHFSPGDNQA CKPWTNCTLA GKHTLQPASN SSDA1CEDRD PPATQPQETQ GPPARP1TVQ PTEAWPRTSQ GPS
(SEC ID n° 51).
6. Un anticuerpo aislado o purificado que se une especfficamente a un epftopo en una secuencia de aminoacidos del dominio extracelular de OX40, en el que el anticuerpo comprende un anticuerpo humano, humanizado o hfbrido que se une a una secuencia de aminoacidos a la que se une el anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5.
7. Un anticuerpo aislado o purificado que presenta una afinidad de union para OX40 comprendida en el intervalo de entre 1 y 5.000 veces la de un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o112Z5.
8. El anticuerpo segun el punto 7, en el que el anticuerpo presenta una afinidad de union para OX40 superior o inferior a la de un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55o112Z5.
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9. El anticuerpo segun cualquiera de los puntos 1, 6, 7 u 8, en el que el anticuerpo presenta una afinidad de union para OX40 de entre aproximadamente KD 10-6 M y aproximadamente kD 10-13 M de un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5.
10. El anticuerpo segun cualquiera de los puntos 1, 6, 7 o 8, en el que el anticuerpo presenta la especificidad de union de un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5, o compite con un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5 para la union a OX40.
11. El anticuerpo segun el punto 1, en el que el anticuerpo se une al mismo epftopo que 112V8, 112Y55 y Y131, e inhibe o evita la union de OX40 al ligando de OX40 (OX40L) en un 85% o mas.
12. El anticuerpo segun el punto 1, en el que el anticuerpo es producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5.
13. El anticuerpo segun cualquiera de los puntos 1, 6, 7 u 8, en el que el anticuerpo inhibe o impide la union de un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5 a OX40, tal como se determina en un ensayo ELISA.
14. El anticuerpo segun cualquiera de los puntos 1, 6, 7 u 8, en el que el anticuerpo inhibe por lo menos 50% de la union de un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5 a OX40, tal como se determina en un ensayo ELISA.
15. El anticuerpo segun cualquiera de los puntos 1, 6, 7 u 8, en el que el anticuerpo se une especfficamente a OX40 expresado sobre celulas no T, opcionalmente en el que dichas celulas no T se seleccionan de entre celulas asesinas naturales, granulocitos, monocitos, celulas B o la estirpe celular no T transfectada con OX40, opcionalmente en la que dicha estirpe celular no T transfectada con OX40 se selecciona de entre celulas CHO, celulas L929 y celulas HELA.
16. El anticuerpo segun el punto 1, en el que el anticuerpo comprende la secuencia de region variable de cadena pesada o ligera madura mostradas en las SEC ID n° 7 a n° 10 y SEC ID n° 44 a n° 49, o una subsecuencia de secuencia de region variable de cadena pesada o ligera madura mostrada en la SEC ID n° 7 a n° 10 y en la SEC ID n° 44 a n° 49.
17. El anticuerpo segun el punto 16, en el que la subsecuencia se selecciona de entre Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, Fv de cadena sencilla (scFv), Fv unidos por disulfuro (sdFv) y Vl o Vh.
18. El anticuerpo segun el punto 16, en el que el anticuerpo comprende la secuencia de region variable de cadena pesada o ligera madura mostrada en las SEC ID n° 7 a n° 10 y SEC ID n° 44 a n° 49 presenta una o mas sustituciones de aminoacidos dentro o fuera de una region constante, una region determinante de complementariedad (RDC) o una region marco (RM).
19. El anticuerpo segun el punto 18, en el que la sustitucion de aminoacido es una sustitucion de aminoacido conservadora dentro o fuera de una region constante, una region determinante de complementariedad (RDC) o una region marco (RM).
20. El anticuerpo segun el punto 18, en el que la sustitucion de aminoacido comprende 1 a 3, 3 a 5, 5 a 10 o mas residuos aminoacidos.
21. El anticuerpo segun cualquiera de los puntos 1, 6, 7 u 8, en el que el anticuerpo conserva una actividad detectable de un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o112Z5.
22. El anticuerpo segun el punto 21, en el que la actividad comprende modular la expansion o supervivencia de las celulas T, o el numero de celulas T efectoras, de memoria o reguladoras activadas, o reducir el numero de celulas T efectoras, de memoria o reguladoras activadas.
23. El anticuerpo segun el punto 21, en el que la actividad comprende inhibir la senalizacion de OX40.
24. El anticuerpo segun el punto 21, en el que la actividad comprende reducir o eliminar el numero de celulas T autorreactivas especfficas para un autoantfgeno, opcionalmente en el que el autoantfgeno se selecciona de entre la protefna basica de mielina, la glucoprotefna de mielina del oligodendrocito, la protefna del proteolfpido, el colageno, antfgenos del tejido articular sinovial, la insulina, acido glutamico descarboxilasa, antfgenos intestinales, antfgenos del tiroides, protefnas histonas, antfgenos musculares y antfgenos de la piel.
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25. Un anticuerpo aislado o purificado que se une especfficamente a un epftopo en una secuencia de aminoacidos del dominio extracelular de OX40, en el que el anticuerpo presenta una identidad de 80% a 85%, de 85% a 90%, de 90% a 95%, de 96%, de 97%, de 98%, de 99% o superior respecto a una secuencia de region variable de cadena pesada o ligera madura en SEC ID n° 7 a n° 10 y SEC ID n° 44 a n° 49.
26. El anticuerpo segun cualquiera de los puntos 1, 6, 7, 8 o 25, en el que el anticuerpo se une especfficamente a celulas T humanas activadas, no a celulas T en reposo.
27. El anticuerpo segun el punto 1, en el que el anticuerpo no inhibe o impide la union del anticuerpo L106 a OX40 segun se determina en un ensayo ELISA.
28. El anticuerpo segun cualquiera de los puntos 1, 6, 7, 8 o 25, en el que el anticuerpo inhibe o impide la union del ligando de OX40 a OX40.
29. El anticuerpo segun cualquiera de los puntos 1, 6, 7, 8 o 25, en el que el anticuerpo inhibe o impide la union del ligando de OX40 a las celulas T activadas.
30. El anticuerpo segun cualquiera de los puntos 1, 6, 7, 8 o 25, en el que el anticuerpo modula la senalizacion celular mediada por OX40 o modula la respuesta celular mediada por OX40.
31. El anticuerpo segun cualquiera de los puntos 1, 6, 7, 8 o 25, en el que el anticuerpo inhibe o impide la senalizacion celular mediada por OX40.
32. El anticuerpo segun cualquiera de los puntos 1, 6, 7, 8 o 25, en el que el anticuerpo inhibe o impide la respuesta celular mediada por OX40.
33. El anticuerpo segun el punto 32, en el que la respuesta celular mediada por OX40 comprende la proliferacion de linfocitos, la expresion de citocinas, la supervivencia de los linfocitos, la activacion de NF-kB, el mantenimiento de la actividad de PKB (Akt) o la regulacion positiva de la survivina.
34. El anticuerpo segun cualquiera de los puntos 1, 6, 7, 8 o 25, en el que el anticuerpo induce la lisis de las celulas EL4 expresantes de OX40 humano o las celulas T humanas activadas mediada por celulas asesinas naturales, macrofagos o neutrofilos, en el que el porcentaje (%) de lisis celular especffica inducida a una dosis de 10 pg/ml de anticuerpo es de entre aproximadamente 15% y 75%, de entre 25% y 65%, de entre 30% y 60% o de entre 50% y 100%.
35. El anticuerpo segun cualquiera de los puntos 1, 6, 7, 8 o 25, en el que el anticuerpo reduce, disminuye o bloquea un sfntoma de la enfermedad del injerto contra el huesped en un modelo de enfermedad del injerto contra el huesped aguda o cronica, o en el que el anticuerpo provoca la remision o regresion de la enfermedad del injerto contra el huesped en un modelo de enfermedad de injerto contra el huesped aguda o cronica.
36. El anticuerpo segun el punto 35, en el que el modelo de enfermedad del xenoinjerto contra el huesped comprende ratones inmunodeficientes (SCID) que han recibido celulas mononucleares de sangre periferica (CMSP) humanas tras la administracion de anticuerpo anti-IL2R cadena beta y una dosis subletal de irradiacion.
37. El anticuerpo segun el punto 35, en el que el sfntoma de la enfermedad del injerto contra el huesped se selecciona de entre perdida de peso, perdida de pelo, erupcion en la piel, hematuria, hidroperitoneo e infiltrados celulares inflamatorios en el hfgado, en el tracto intestinal, en el pulmon, en la piel y la muerte.
38. El anticuerpo segun cualquiera de los puntos 1, 6, 7, 8 o 25, en el que el anticuerpo reduce, disminuye o impide la inflamacion en el pulmon, la piel o el intestino.
39. El anticuerpo segun cualquiera de los puntos 1, 6, 7, 8 o 25, en el que el anticuerpo reduce, disminuye o previene un sfntoma de un trastorno autoinmunitario.
40. El anticuerpo segun la reivindicacion 39, en el que el trastorno autoinmunitario se selecciona de entre:
artritis reumatoide, esclerosis multiple, diabetes, enfermedad de Crohn, enfermedad intestinal inflamatoria, colitis ulcerosa, enfermedad celfaca, soriasis, nefritis lupica proliferativa,
miopatfa granulomatosa y polimiositis.
41. El anticuerpo segun cualquiera de los puntos 1, 6, 7, 8 o 25, en el que la OX40 es humana.
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42. El anticuerpo segun cualquiera de los puntos 1, 6, 7, 8 o 25, en el que la OX40 comprende una secuencia:
MC VG ARRLGRG PCAA LLLLGLGLSTVTGLHCVGDT YPSNDBCCHECRPGNGM VSRCSRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDT
vcrcragtqpldsykpgvdcapcppghfspgdnqackpwtnctlagkhtlqp
asnssdaicedrdppatqpqetqgpparpitvqpteawprtsqgpstrpvevpgg
RAVAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLJLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTP1QEEQ ADAHSTLAKI (SEC ID n° 50)
43. El anticuerpo segun cualquiera de los puntos 1, 6, 7, 8 o 25, en el que el anticuerpo es monoclonal o policlonal.
44. El anticuerpo segun cualquiera de los puntos 1, 6, 7, 8 o 25, en el que el anticuerpo es de isotipo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE o IgD.
45. El anticuerpo segun cualquiera de los puntos 1, 6, 7, 8 o 25, en el que el anticuerpo comprende ademas un dominio heterologo.
46. Una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo segun cualquiera de los puntos 1, 6, 7, 8 o 25, y un portador o excipiente farmaceuticamente aceptable.
47. Un acido nucleico aislado que codifica una secuencia de region variable de cadena pesada o ligera madura mostrada en SEC ID n° 7 a n° 10 y SEC ID n° 44 a n° 49, o una subsecuencia de la misma.
48. El acido nucleico aislado segun el punto 47, en el que la secuencia comprende la SEC ID n° 3 a n° 6 y la SEC ID n° 38 a n° 43, o secuencias degeneradas con respecto a la SEC ID n° 3 a n° 6 y la SEC ID n° 38 a n° 43.
49. El acido nucleico aislado segun el punto 47, que comprende ademas una secuencia de control de la expresion.
50. El acido nucleico aislado segun el punto 47, que comprende ademas un vector.
51. El acido nucleico aislado segun el punto 47, que comprende ademas una celula hospedadora.
52. Un acido nucleico que codifica una secuencia de aminoacidos que presenta uno o mas residuos aminoacidos sustituidos, anadidos o delecionados de secuencia de region variable de cadena pesada o ligera mostrada en la SEC ID n° 7 a n° 10 y en la SEC ID n° 44 a n° 49, en la que la secuencia de aminoacidos presenta una afinidad de union para un epftopo del dominio extracelular de OX40.
53. Un acido nucleico que codifica una secuencia de aminoacidos que presenta uno o mas residuos aminoacidos sustituidos, anadidos o delecionados de secuencia de region variable de cadena pesada o ligera mostrada en la SEC ID n° 7 a n° 10 y en la SEC ID n° 44 a n° 49, en la que la secuencia de aminoacidos presenta una actividad de un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55o112Z5.
54. Un kit que comprende un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5, e instrucciones para administrar el anticuerpo en un sujeto que requiere de tratamiento con el anticuerpo.
55. Una celula aislada que expresa un anticuerpo que presenta la especificidad de union como anticuerpo producida por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5.
56. Un procedimiento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno inmunitario cronico o agudo, o un sfntoma de una enfermedad o trastorno inmunitario cronico o agudo en un sujeto que requiere tratamiento, que comprende administrar en el sujeto el anticuerpo segun cualquiera de los puntos 1, 6, 7, 8 o 25 o la composicion farmaceutica segun la reivindicacion 46, eficaz para tratar la enfermedad o trastorno inmunitario cronico o agudo, o un sfntoma de la enfermedad o trastorno inmunitario cronico o agudo en el sujeto.
57. El procedimiento segun el punto 56, en el que el sujeto es un candidato para el tratamiento, o ha sido tratado, para una enfermedad o trastorno inmunitario cronico o agudo.
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58. El procedimiento segun el punto 56, en el que el tratamiento resulta en el alivio o mejora de uno o mas sfntomas adversos o consecuencias ffsicas asociadas a una enfermedad o trastorno inmunitario cronico o agudo.
59. Un procedimiento de tratamiento de la enfermedad del injerto contra el huesped, que comprende administrar en un sujeto que requiere tratamiento de un anticuerpo segun cualquiera de los puntos 1, 6, 7, 8 o 25 o la composicion farmaceutica segun el punto 47, eficaz para tratar la enfermedad del injerto contra el huesped.
60. El procedimiento segun el punto 59, en el que el sujeto es un candidato para el tratamiento, o ha sido tratado, para la enfermedad del injerto contra el huesped.
61. El procedimiento segun el punto 59, en el que el tratamiento reduce, disminuye o impide la aparicion, la frecuencia, la duracion o la gravedad de uno o mas sfntomas o consecuencias ffsicas adversos asociados a la enfermedad del injerto contra el huesped, o en el que el tratamiento resulta en una remision o regresion de la enfermedad del injerto contra el huesped, o en el que el tratamiento resulta en la prevencion de la enfermedad del injerto contra el huesped.
62. El procedimiento segun el punto 61, en el que el sfntoma de la enfermedad del injerto contra el huesped se selecciona de entre perdida de peso, perdida de pelo, erupcion en la piel, hematuria, hidroperitoneo e infiltrados celulares inflamatorios en el hfgado, en el tracto intestinal, en el pulmon, y la muerte.
63. El procedimiento segun el punto 59, en el que el injerto comprende celulas de medula osea, celulas madre hematopoyeticas, celulas madre de sangre periferica o celulas madre de sangre umbilical.
64. Un procedimiento de tratamiento del rechazo del trasplante, que comprende administrar en un sujeto que requiere tratamiento de un anticuerpo segun cualquiera de los puntos 1, 6, 7, 8 o 25 o la composicion farmaceutica segun el punto 46, eficaz para tratar el rechazo del trasplante.
65. El procedimiento segun el punto 64, en el que el sujeto es un candidato para el tratamiento, o ha sido tratado, para el rechazo del trasplante.
66. El procedimiento segun el punto 64, en el que el tratamiento reduce, disminuye o impide la aparicion, la frecuencia, la duracion o la gravedad de uno o mas sfntomas o consecuencias ffsicas adversos asociados al rechazo del trasplante, o en el que el tratamiento resulta en una remision o regresion del rechazo del trasplante, o en el que el tratamiento resulta en la prevencion del rechazo del trasplante.
67. El procedimiento segun el punto 66, en el que el sfntoma del rechazo del trasplante comprende una respuesta inmunitaria contra el trasplante o las celulas trasplantadas o la destruccion de tejido.
68. El procedimiento segun el punto 64, en el que el trasplante comprende rinon, corazon, pulmon, piel, hfgado o pancreas.
69. Un procedimiento para reducir, disminuir o impedir la inflamacion, que comprende administrar en un sujeto que requiere tratamiento de un anticuerpo segun cualquiera de los puntos 1, 6, 7, 8 o 25 o la composicion farmaceutica segun el punto 46, eficaz para reducir, disminuir o impedir la aparicion, la frecuencia, la duracion o la gravedad de la inflamacion.
70. El procedimiento segun el punto 69, en el que la inflamacion se encuentra presente en el pulmon, las articulaciones, musculos, piel, sistema nervioso central o periferico, o intestino.
71. El procedimiento segun el punto 69, en el que el sujeto es un candidato para el tratamiento, o ha sido tratado, para inflamacion.
72. El procedimiento segun el punto 69, en el que el tratamiento resulta en la reduccion de la aparicion, frecuencia, duracion o gravedad de uno o mas sfntomas o consecuencias ffsicas adversos asociados a la inflamacion.
73. Un procedimiento de tratamiento de un trastorno autoinmunitario, que comprende administrar en un sujeto que requiere tratamiento de un anticuerpo segun cualquiera de los puntos 1, 6, 7, 8 o 25 o la composicion farmaceutica segun el punto 46, eficaz para reducir, disminuir o impedir la aparicion, la frecuencia, la duracion o la gravedad de un sfntoma de un trastorno autoinmunitario.
74. El procedimiento segun el punto 73, en el que el trastorno autoinmunitario se selecciona de entre:
artritis reumatoide, esclerosis multiple, diabetes, enfermedad de Crohn, enfermedad intestinal inflamatoria, colitis ulcerosa, enfermedad celfaca, soriasis, nefritis lupica proliferativa, miopatfa granulomatosa y polimiositis.
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75. El procedimiento segun el punto 73, en el que el sujeto es un candidato para el tratamiento, o ha sido tratado, para un trastorno autoinmunitario.
76. El procedimiento segun el punto 73, en el que el tratamiento resulta en la reduccion, la disminucion o la prevencion de la aparicion, frecuencia, duracion o gravedad de uno o mas sfntomas o consecuencias ffsicas adversos asociados a un trastorno autoinmunitario.
77. Un procedimiento para inhibir o impedir una respuesta celular mediada por OX40, que comprende administrar en un sujeto que necesita inhibir o bloquear una respuesta celular mediada por OX40, un anticuerpo segun cualquiera de los puntos 1, 6, 7, 8 o 25 o la composicion farmaceutica segun el punto 46 eficaz para inhibir o bloquear una respuesta celular mediada por OX40.
78. El procedimiento segun el punto 77, en el que la respuesta celular comprende la proliferacion de linfocitos, la expresion de citocinas o la supervivencia de linfocitos.
79. El procedimiento segun el punto 77, en el que el sujeto es un candidato para el tratamiento, o ha sido tratado, para una respuesta celular mediada por OX40.
80. Un procedimiento para inhibir o bloquear la union de un ligando a OX40 a celulas T activadas, que comprende administrar en un sujeto que necesita bloquear, inhibir o prevenir la union de un ligando de OX40 a celulas T activadas, un anticuerpo segun cualquiera de los puntos 1, 6, 7, 8 o 25 o la composicion farmaceutica segun el punto 46 eficaz para inhibir o bloquear la union de OX40 a celulas T activadas.
81. Un procedimiento para inhibir o bloquear la union de un ligando a OX40 a OX40, que comprende administrar en un sujeto que necesita bloquear, inhibir o prevenir la union de un ligando de OX40 a OX40, un anticuerpo segun cualquiera de los puntos 1, 6, 7, 8 o 25 o la composicion farmaceutica segun el punto 46 eficaz para inhibir o bloquear la union de ligando de OX40 a OX40.
82. Un procedimiento para modular la senalizacion celular mediada por OX40, que comprende administrar en un sujeto que necesita modular la senalizacion celular mediada por OX40, un anticuerpo segun cualquiera de los puntos 1, 6, 7, 8 o 25 o la composicion farmaceutica segun la reivindicacion 46 eficaz para modular la senalizacion mediada por OX40.
83. Un procedimiento para reducir el numero de celulas T efectoras, de memoria o reguladoras activadas, que comprende administrar en un sujeto que necesita reducir el numero de celulas T efectoras, de memoria o reguladoras activadas, una cantidad de anticuerpo segun cualquiera de los puntos 1, 6, 7, 8 o 25 suficiente para reducir el numero de celulas T efectoras, de memoria o reguladoras activadas.
84. Un procedimiento para tratar una enfermedad o trastorno causado por celulas T efectoras, de memoria o reguladoras activadas, que comprende administrar en un sujeto una cantidad de anticuerpo segun cualquiera de los puntos 1, 6, 7, 8 o 25 suficiente para reducir, disminuir o impedir la progresion de la enfermedad o trastorno causado por celulas T efectoras, de memoria o reguladoras activadas, o para reducir el numero de celulas T efectoras, de memoria o reguladoras activadas.
85. El procedimiento segun el punto 84, en el que la enfermedad o trastorno comprende: la enfermedad del injerto contra el huesped, inflamacion o un trastorno autoinmunitario.
86. El procedimiento segun cualquiera de los puntos 56 a 85, en el que el sujeto es un mamffero.
87. El procedimiento segun cualquiera de los puntos 56 a 85, en el que el mamffero es un ser humano.
88. El procedimiento segun cualquiera de los puntos 56 a 85, en el que el anticuerpo se administra en el sujeto por via local, regional o sistemica.
89. Un procedimiento para reducir el numero de celulas T activadas en la sangre, bazo, nodulos linfaticos, intestinos, hfgado, pulmon o piel en un modelo de enfermedad del injerto contra el huesped aguda o cronica, que comprende administrar una cantidad de anticuerpo segun cualquiera de los puntos 1, 6, 7, 8 o 25 en el modelo de enfermedad del injerto contra el huesped aguda o cronica suficiente para reducir el numero de celulas T activadas en la sangre, bazo, nodulos linfaticos, intestinos, hfgado, pulmon o piel.
90. Un procedimiento para producir un anticuerpo de OX40 humano que presenta una actividad antagonista de OX40, que comprende:
a) administrar un dominio extracelular de OX40 humano conjugado con protefna Fc recombinante humana o celulas T humanas activadas en un animal capaz de expresar inmunoglobulinas humanas,
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b) cribar el animal para la expresion de anticuerpo de OX40 humano,
c) seleccionar un animal que produce un anticuerpo de OX40 humano,
d) aislar un anticuerpo a partir del animal seleccionado, y
e) determinar si el anticuerpo de OX40 humano presenta actividad antagonista de OX40.
91. Un procedimiento para producir un anticuerpo de OX40 humano que inhibe o bloquea la union de OX40 al ligando de OX40 (OX40L), que comprende:
a) administrar un dominio extracelular de OX40 humano conjugado con protefna Fc recombinante humana o celulas T humanas activadas en un animal capaz de expresar inmunoglobulina humana,
b) cribar el animal para la expresion de anticuerpo de OX40 humano,
c) seleccionar un animal que produce un anticuerpo de OX40 humano,
d) aislar un anticuerpo a partir del animal seleccionado, y
e) determinar si el anticuerpo de OX40 humano inhibe o bloquea la union de OX40 al ligando de OX40 (OX40L).
92. El procedimiento segun el punto 90 o 91, en el que el animal capaz de expresar inmunoglobulina humana comprende un raton transgenico o una vaca transgenica.
93. Un animal transgenico no humano que expresa un anticuerpo que:
a) es identico a un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55o112Z5,
b) se une a un epftopo en una secuencia de aminoacidos del dominio extracelular de OX40 a la que se une un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5,
c) presenta una afinidad de union para OX40 comprendida en el intervalo de entre 1 y 5.000 veces la de un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5,
d) presenta una afinidad de union para OX40 comprendida entre aproximadamente KD 10'6 M y aproximadamente KD 10-12 M de un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o112Z5,
e) presenta la especificidad de union de un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5, o
f) compite con un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma denominada 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 o 112Z5, para la union a OX40.

Claims (16)

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    REIVINDICACIONES
    1. Anticuerpo aislado o purificado que se une especfficamente a un epftopo en una secuencia de aminoacidos del dominio extracelular de OX40, en el que el anticuerpo es producido por una estirpe celular de hibridoma indicada como:
    112V8, depositada como ATCC n° PTA-7219, o 112Y131, depositada como ATCC n° PTA-7218, o 112Y55, depositada como ATCC n° PTA-7220,
    o un fragmento del mismo seleccionado de entre Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, Fvs monocatenarios (scFv), Fvs unidos por disulfuro (sdFv).
  2. 2. Anticuerpo aislado o purificado que se une especfficamente a un epftopo en una secuencia de aminoacidos del dominio extracelular de OX40, en el que el anticuerpo comprende:
    (a) la secuencia de region variable pesada madura como se muestra en SEC ID n° 9 y la secuencia de region variable de cadena ligera madura como se muestra en SEC ID n° 10, o
    (b) la secuencia de region variable pesada madura como se muestra en SEC ID n° 44 y la secuencia de region variable de cadena ligera madura como se muestra en SEC ID n° 45, o
    (c) la secuencia de region variable pesada madura como se muestra en SEC ID n° 46 y la secuencia de region variable de cadena ligera madura como se muestra en SEC ID n° 47,
    o un fragmento del mismo seleccionado de entre Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, Fvs monocatenarios (scFv), Fvs unidos por disulfuro (sdFv).
  3. 3. Anticuerpo aislado o purificado que se une especfficamente a un epftopo en una secuencia de aminoacidos del dominio extracelular de OX40, en el que el anticuerpo comprende una region variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos desde el aminoacido en la posicion 20 de SEC ID n° 9 al aminoacido en la posicion 141 de SEC ID n° 9 y una region variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos desde el aminoacido en la posicion 21 de SEC ID n° 10 al aminoacido en la posicion 129 de SEC ID n° 10, o un fragmento del mismo seleccionado de entre Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, Fvs monocatenarios (scFv), Fvs unidos por disulfuro (sdFv).
  4. 4. Anticuerpo aislado o purificado que se une especfficamente a un epftopo en una secuencia de aminoacidos del dominio extracelular de OX40, en el que el anticuerpo comprende una region variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos desde el aminoacido en la posicion 20 de SEC ID n° 44 al aminoacido en la posicion 136 de SEC ID n° 44 y una region variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos desde el aminoacido en la posicion 21 de SEC ID n° 45 al aminoacido en la posicion 127 de SEC ID n° 45, o un fragmento del mismo seleccionado de entre Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, Fvs monocatenarios (scFv), Fvs unidos por disulfuro (sdFv).
  5. 5. Anticuerpo aislado o purificado que se une especfficamente a un epftopo en una secuencia de aminoacidos del dominio extracelular de OX40, en el que el anticuerpo comprende una region variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos desde el aminoacido en la posicion 21 de SEC ID n° 46 al aminoacido en la posicion 136 de SEC ID n° 46 y una region variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos desde el aminoacido en la posicion 21 de SEC ID n° 47 al aminoacido en la posicion 127 de SEC ID n° 47, o un fragmento del mismo seleccionado de entre Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, Fvs monocatenarios (scFv), Fvs unidos por disulfuro (sdFv).
  6. 6. Anticuerpo aislado o purificado que se une especfficamente a un epftopo en una secuencia de aminoacidos del dominio extracelular de OX40, en el que el anticuerpo comprende un anticuerpo humano, humanizado o hfbrido y en el que el anticuerpo presenta una actividad antagonista de OX40, y en el que el anticuerpo compite con un anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma indicada como 112V8, depositada como ATCC n° PTA- 7219, 112Y131, depositada como ATCC n° PTA-7218, o 112Y55 depositada como ATCC n° PTA-7220, para la union a OX40, o un fragmento del mismo seleccionado de entre Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, Fvs monocatenarios (scFv) o Fvs unidos por disulfuro (sdFv).
  7. 7. Anticuerpo aislado o purificado que se une especfficamente a un epftopo en una secuencia de aminoacidos del dominio extracelular de OX40, en el que el anticuerpo se une al epftopo de la secuencia de aminoacidos del dominio extracelular de OX40 al que se une el anticuerpo producido por una estirpe celular de hibridoma indicada como 112V8, depositada como ATCC n° PTA-7219, 112Y131, depositada como ATCC n° PTA-7128, o 112Y55 depositada
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    como ATCC n° PTA-7220, o un fragmento del mismo seleccionado de entre Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, Fvs monocatenarios (scFv) o Fvs unidos por disulfuro (sdFv).
  8. 8. Composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, y un portador o excipiente farmaceuticamente aceptable.
  9. 9. Acido nucleico aislado que codifica una secuencia de region variable de cadena pesada madura como se muestra en cualquiera de las SEC ID n° 9, 44 o 46, y una secuencia de region variable de cadena ligera madura como se muestra en cualquiera de las SEC ID n° 10, 45 o 47, en el que las secuencias comprenden:
    (a) la SEC ID n° 5 y la SEC ID n° 6, o una secuencia degenerada de las mismas, o
    (b) la SEC ID n° 38 y la SEC ID n° 39, o una secuencia degenerada de las mismas, o
    (c) la SEC ID n° 40 y la SEC ID n° 41, o una secuencia degenerada de las mismas.
  10. 10. Acido nucleico aislado que codifica el anticuerpo o fragmento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
  11. 11. Acido nucleico aislado segun la reivindicacion 10, en el que el acido nucleico codifica una secuencia de una secuencia variable de cadena pesada madura o una secuencia variable de cadena ligera madura como se muestra en cualquiera de las SEC ID n° 7 a 10 o 44 a 49.
  12. 12. Acido nucleico aislado segun cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, que comprende ademas una secuencia de control de la expresion.
  13. 13. Vector que comprende el acido nucleico segun cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12.
  14. 14. Celula hospedadora que comprende los acidos nucleicos aislados segun cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 o el vector segun la reivindicacion 13.
  15. 15. Kit que comprende el anticuerpo o fragmento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, e instrucciones para administrar el anticuerpo a un sujeto que necesita el tratamiento con el anticuerpo.
  16. 16. Procedimiento para producir un anticuerpo anti-OX40 utilizando la celula hospedadora segun la reivindicacion 14.
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