CN108137687B - 抗ox40抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文提供结合OX40的抗体或其抗原结合部分。还提供此类蛋白质在治疗应用，如在癌症的治疗中的用途。进一步提供产生此类抗体的细胞、编码此类抗体的重链及/或轻链可变区的多核苷酸、及包含编码此类抗体的重链及/或轻链可变区的多核苷酸的载体。

Description

抗OX40抗体及其用途
对相关申请的援引
本申请请求62/333,556、62/327,140、62/264,691、62/239,574和62/168,377的优先权，它们分别于2016年5月9日、2016年4月25日、2015年12月8日、2015年10月9日和2015年5月29日提交。在此通过提述并入前述申请的内容。
序列表
本申请包含以ASCII格式电子提交的序列表，在此通过提述并入其全部内容。所述ASCII拷贝于2016年5月26日生成，名称为MXI_543PC_Sequence_Listing.txt，大小为417,528个字节。
背景
OX40(TNFRSF4)(亦称作ACT35、IMD16、TXGP1L及CD134)是在活化CD4+ T细胞上表达的共刺激受体的TNFSFR家族中的一种50-kD I型跨膜糖蛋白。在癌症中，在肿瘤浸润淋巴细胞中发现表达OX40的活化T细胞。OX40及其配体OX40-L在诱导及维持T细胞反应中起关键作用。最近研究已证明，增强抗肿瘤T细胞功能可以用于抵抗癌症，其中有效反应的关键组分包括活化CD4+T细胞及经由记忆T细胞及效应物T细胞促进存活信号。鉴于人们一直期望改进通过(例如)增强免疫反应(例如T细胞反应)来治疗疾病(例如癌症)的策略，调节T细胞反应的新颖药剂(例如靶向OX40者)以及使用此类药剂的疗法(例如，组合疗法)可能会有治疗学上的效益。
概述
本文提供特异性结合OX40且具有期望的功能性质的抗体，例如人类单克隆抗体。此类性质包括：与人OX40及食蟹猴OX40结合的高亲和力，以及刺激抗原特异性T细胞反应的能力(例如在带有肿瘤的受试者中)。本文还提供检测样品中的OX40的方法。
在一个方面，本文提供抗体或其抗原结合部分，其特异性结合OX40，且展现以下性质中的至少一种：
(1)结合可溶性人OX40，例如以10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)的KD结合，例如如Biacore测定的；
(2)结合膜结合的人OX40，例如以1nM或更小(例如，0.01nM至1nM)的EC50结合，例如如通过FACS测量的；
(3)结合食蟹猴OX40，例如膜结合的食蟹猴OX40，例如以10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)的EC50结合，例如如通过FACS测量的；
(4)诱导或增强T细胞活化，如通过以下所证明：(i)表达OX40的T细胞中增加的IL-2及/或IFN-γ产生及/或(ii)增强的T细胞增殖；
(5)抑制OX40配体与OX40结合，例如如FACS测量的以1nM或更小的EC50结合，例如在利用hOX40-293细胞的测定中；
(6)结合成熟人OX40的细胞外部分(SEQ ID NO:2)上的表位，例如，在区域DVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO:178)或DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGK(SEQ IDNO:179)内的表位；
(7)与3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、18E9、8B11、20B3及20C1竞争结合人OX40；
(8)与6E1-1、6E1-2、14A2-1及14A2-2竞争结合人OX40。
在某些实施方案中，本文所述抗OX40抗体或其抗原结合部分刺激抗肿瘤免疫反应，例如抗原特异性T细胞反应。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合部分增加表达OX40的T细胞中的细胞因子(例如，IL-2及/或IFN-γ)产生及/或增加T细胞增殖。在某些实施方案中，抗体结合人类补体的C1q组分。在某些实施方案中，抗体诱导NK细胞介导的活化CD4+T细胞溶解。在某些实施方案中，抗体促进巨噬细胞介导的表达OX40的细胞的吞噬作用。在某些实施方案中，抗体抑制调控性T细胞介导的CD4+ T细胞增殖的阻遏。
在某些实施方案中，抗OX40抗体或其抗原结合部分结合Fc受体，例如一种或多种活化FcγR。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合部分经由多价交联诱导或增强T细胞活化。
本文提供分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特异性结合OX40且包含在选自以下的可变重链及可变轻链对中的三个可变重链CDR及三个可变轻链CDR：SEQ ID NO:318及94；SEQ ID NO:17及18；28及29；28及30；37及38；48及49；48及50；57及58；65及66；73及74；84及85；84及86；93及94。
本文亦提供单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合OX40且包含：
(a)分别包含SEQ ID NO:87、317及89的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和分别包含SEQ ID NO:90-92的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(b)分别包含SEQ ID NO:11-13的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和分别包含SEQ IDNO:14-16的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(c)分别包含SEQ ID NO:19-21的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和分别包含SEQ IDNO:22-24的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(d)分别包含SEQ ID NO:19-21的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和分别包含SEQ IDNO:25-27的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(e)分别包含SEQ ID NO:31-33的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和分别包含SEQ IDNO:34-36的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(f)分别包含SEQ ID NO:39-41的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和分别包含SEQ IDNO:42-44的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(g)分别包含SEQ ID NO:39-41的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和分别包含SEQ IDNO:45-47的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(h)分别包含SEQ ID NO:51-53的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和分别包含SEQ IDNO:54-56的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(i)分别包含SEQ ID NO:59-61的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和分别包含SEQ IDNO:62-64的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(j)分别包含SEQ ID NO:67-69的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和分别包含SEQ IDNO:70-72的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(k)分别包含SEQ ID NO:75-77的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和分别包含SEQ IDNO:78-80的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(l)分别包含SEQ ID NO:75-77的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和分别包含SEQ IDNO:81-83的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；或
(m)分别包含SEQ ID NO:87-89的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和分别包含SEQ IDNO:90-92的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列。
本文提供结合OX40且包含重链及轻链可变区的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该重链可变区包含与选自下组的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列：SEQ ID NO:318、17、28、37、48、57、65、73、84及93。
本文提供结合OX40且包含重链及轻链可变区的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该轻链可变区包含与选自下组的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列：SEQ ID NO:94、18、29、30、38、49、50、58、66、74、85、86及94。
本文提供分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合OX40且包含与选自下组的氨基酸序列至少85％同一、例如90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的重链及轻链可变区序列：SEQ ID NO:318及94；17及18；28及29；28及30；37及38；48及49；48及50；57及58；65及66；73及74；84及85；84及86；93及94。
本文提供分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合OX40且包含与选自下组的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％99％或100％同一的重链及轻链序列：SEQ ID NO:124及116；95及96；97及98；99及100；101及102；103及104；105及106；107及108；109及110；111及112；113及114；115及116；117及118；119及120；121及122；123及116；124及116；及125及116。
在某些实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合部分(a)与3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、18E9、8B11、20B3或20C1结合OX40上相同的表位，或与6E1-1、6E1-2、14A2-1或14A2-2结合OX40上相同的表位，及(b)将3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及/或20C1与活化T细胞上OX40的结合抑制至少50％、60％、70％、80％或90％，例如如通过FACS所测量的。
在某些实施方案中，抗OX40抗体或其抗原结合部分在人OX40的成熟细胞外部分(SEQ ID NO:2)的区域DVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO:178)或DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGK(SEQ ID NO:179)内结合。在一些实施方案中，本文所述抗OX40抗体或其抗原结合部分结合人OX40及食蟹猴OX40二者。在一些实施方案中，本文所述抗OX40抗体或其抗原结合部分不结合小鼠及/或大鼠OX40。
在某些实施方案中，抗OX40抗体或其抗原结合部分是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体或其变体。在某些实施方案中，抗OX40抗体或其抗原结合部分的CDR区中的甲硫氨酸残基被取代为不会经受氧化的氨基酸残基。在某些实施方案中，抗OX40抗体或其抗原结合部分系人抗体或人源化抗体。在某些实施方案中，抗OX40抗体包含具有与增强的活化FcγR的结合的Fc。
本文提供分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合OX40且包括修饰的重链恒定区，所述修饰的重链恒定区包含IgG2铰链和下列至少之一：非IgG2同型的CH1、非IgG2同型的CH2、非IgG2同型的CH3。
在某些实施方案中，重链包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、124及125，或与SEQ ID NO:95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、124及125的氨基酸序列有至多10个氨基酸不同或至少95％、96％、97％、98％或99％同一的重链。
在某些实施方案中，轻链包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120及122，或与SEQ ID NO:96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120及122的氨基酸序列有至多10个氨基酸不同或至少95％、96％、97％、98％或99％同一的轻链。
在某些实施方案中，抗OX40抗体或其抗原结合部分是非免疫原性的。
在某些实施方案中，抗OX40抗体或其抗原结合部分缺少可异构化的氨基酸序列。例如，若抗体的重链及/或轻链CDR序列中存在氨基酸序列Asp-Gly，则该序列被替代为不会异构化的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:76中所述的重链可变区CDR2序列，但其中Asp-Gly序列(LISYDGSRKHYADSVKG；SEQ ID NO:76)中的Asp或Gly被替换为不会异构化的氨基酸序列，例如Asp-Ser或Ser-Gly序列。在另一实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:88中所述的重链可变区CDR2序列，但其中Asp-Gly序列(AIDTDGGTFYADSVRG；SEQID NO:88)中的Asp或Gly被替换为不会异构化的氨基酸序列，例如Ser-Gly、Asp-Ala或Ser-Thr序列。
本文提供结合OX40且包含选自由SEQ ID NO:282-296组成的群的氨基酸的抗体。在一个实施方案中，抗体包含由选自由SEQ ID NO:282-296组成的群的氨基酸序列组成的重链。
本文提供包含连接至具有第二结合特异性的分子的抗OX40抗体的双特异性分子。
本文提供编码抗OX40抗体或其抗原结合部分的重链及/或轻链可变区的核酸、包含核酸分子的表达载体及经表达载体转化的细胞。
本文提供包含连接至药剂的本文所述抗OX40抗体的免疫偶联物。
本文提供包含抗OX40抗体或其抗原结合部分及载体的组合物。
本文提供包含抗OX40抗体或其抗原结合部分及使用说明书的试剂盒。在某些实施方案中，试剂盒进一步包含抗CTLA4抗体、抗PD-1或抗PD-L1抗体。
本文提供制备抗OX40抗体的方法，其包含使抗OX40抗体在细胞中表达并自细胞分离该抗体。
本文提供刺激抗原特异性T细胞反应的方法，其包含使T细胞与抗OX40抗体或其抗原结合部分接触，使得刺激抗原特异性T细胞反应。
本文提供活化或共刺激T细胞(例如效应物T细胞)的方法，其包含使细胞(例如效应物T细胞)与抗OX40抗体或其抗原结合部分及CD3接触，其中活化或共刺激效应物T细胞。
本文提供增加T细胞中的IL-2及/或IFN-γ产生及/或T细胞的增殖的方法，其包含使T细胞与有效量的抗OX40抗体或其抗原结合部分接触。
本文提供增加受试者中T细胞中的IL-2及/或IFN-γ产生的方法，其包含施用有效量的抗OX40抗体或其抗原结合部分、包含抗OX40抗体的双特异性分子或偶联物或包含抗OX40抗体的组合物，以增加来自T细胞的IL-2及/或IFN-γ产生。
本文提供减少或耗竭有需要的受试者的肿瘤中T调控性细胞的数目的方法，其包含施用有效量的抗OX40抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或偶联物以减少肿瘤中T调控性细胞的数目，其中抗体或其抗原结合部分具有效应物或增强效应物功能。
本文提供刺激受试者中免疫反应的方法，其包括向受试者施用有效量的抗OX40抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或偶联物，使得受试者中的免疫反应被刺激。在某些实施方案中，受试者具有肿瘤且抵抗肿瘤的免疫反应被刺激。
本文提供抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，其包括向受试者施用抗OX40抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或偶联物，使得受试者中肿瘤的生长被抑制。
本文提供治疗癌症，例如通过免疫疗法治疗癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的抗OX40抗体或其抗原结合部分、包含抗OX40抗体的双特异性分子或偶联物或包含抗OX40抗体的组合物以治疗癌症。在某些实施方案中，癌症选自下组：膀胱癌、乳腺癌、子宫/子宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、食道癌、胃肠癌、胰脏癌、结肠直肠癌、结肠癌、肾癌、头颈癌、肺癌、胃癌、生殖细胞癌、骨癌、肝癌、甲状腺癌、皮肤癌、中枢神经系统的新生物、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤及病毒相关癌症。在某些实施方案中，癌症为转移性癌症、难治性癌症或复发性癌症。
在某些实施方案中，本文所述方法进一步包括与抗OX40抗体一起施用一种或多种其他治疗剂(例如抗PD1抗体、LAG-3抗体、CTLA-4抗体及/或PD-L1抗体)。
本文提供检测样品中OX40的存在的方法，其包括在容许在抗体或其抗原结合部分与OX40之间形成复合物的条件下使样品与抗OX40抗体或其抗原结合部分接触，并检测复合物的形成。
本文提供本文所述抗OX40抗体用于治疗癌症、刺激受试者中的免疫反应、刺激抗原特异性T细胞反应、活化或共刺激T细胞、增加T细胞中的细胞因子(例如IL-2及/或IFN-γ)产生及/或T细胞的增殖、减少或耗竭肿瘤中T调控性细胞的数目及/或抑制肿瘤细胞生长的用途。本文亦提供本文所述抗OX40抗体用于制备用于刺激受试者中的免疫反应、刺激抗原特异性T细胞反应、活化或共刺激T细胞、增加T细胞中的IL-2及/或IFN-γ产生及/或T细胞的增殖、减少或耗竭肿瘤中T调控性细胞的数目及/或抑制肿瘤细胞生长的药剂的用途。
本文提供治疗人类受试者的实体肿瘤的方法，该方法包括向受试者施用有效量的抗OX40抗体，该抗体包含具有SEQ ID NO:318中所述的序列的重链可变区的CDR1、CDR2及CDR3结构域及具有SEQ ID NO:94中所述的序列的轻链可变区的CDR1、CDR2及CDR3结构域，其中该方法包含至少一个施用周期，其中该周期为2周的时段，其中对于所述至少一个周期中的每一周期，以下述剂量施用一剂抗OX40抗体：1mg/kg体重的剂量；20mg、40mg、80mg、160mg或320mg的固定剂量；约1mg/kg体重的剂量；或约20mg、40mg、80mg、160mg或320mg的固定剂量。
在一个实施方案中，该方法进一步包括施用抗PD-1抗体，该抗体包含具有SEQ IDNO:301中所述的序列的重链可变区的CDR1、CDR2及CDR3结构域及具有SEQ ID NO:302中所述的序列的轻链可变区的CDR1、CDR2及CDR3结构域，其中该方法包括至少一个施用周期，其中该周期为2、3或4周的时段，其中对于所述至少一个周期中的每一周期，以下述剂量施用一剂抗OX40抗体：1mg/kg体重的剂量；20mg、40mg、80mg、160mg或320mg的固定剂量；约1mg/kg体重的剂量；或约20mg、40mg、80mg、160mg或320mg的固定剂量，并且以240mg、360mg或480mg的剂量或约240mg、360mg或480mg的剂量施用一剂抗PD-1抗体。
在另一实施方案中，该方法进一步包括施用抗CTLA-4抗体，该抗体包含具有SEQID NO:309中所述的序列的重链可变区的CDR1、CDR2及CDR3结构域及具有SEQ ID NO:310中所述的序列的轻链可变区的CDR1、CDR2及CDR3结构域，其中该方法包含至少一个施用周期，其中该周期为3周的时段，其中对于至少一个周期中的每一周期，以下述剂量施用一剂抗OX40抗体：1mg/kg体重的剂量；20mg、40mg、80mg、160mg或320mg的固定剂量；约1mg/kg体重的剂量；或约20mg、40mg、80mg、160mg或320mg的固定剂量，并且以1mg/kg的剂量或约1mg/kg的剂量施用一剂抗CTLA-4抗体。
其中抗OX40抗体与抗CTLA-4抗体一起施用至少一个周期，而后施用抗OX40抗体单一疗法至少一个周期。在一些实施方案中，治疗由8个周期组成。在一个实施方案中，前4个周期抗OX40抗体与抗CTLA-4抗体一起施用，接下来后4个周期施用抗OX40抗体单一疗法。
在一些实施方案中，抗OX40抗体包含分别SEQ ID NO:124及116中所述的重链及轻链序列。
在某些实施方案中，抗OX40抗体、或抗OX40抗体与抗PD-1或抗CTLA-4抗体配制用于静脉内施用。在一些实施方案中，抗OX40与抗PD-1或抗CTLA-4抗体配制在一起。在其他实施方案中，单独配制抗OX40及抗PD-1或抗CTLA-4抗体。
在一些实施方案中，治疗由8个周期组成。在一个实施方案中，在每一周期的第1天施用抗OX40抗体或抗OX40抗体及抗PD-1或抗CTLA-4抗体。
在某些实施方案中，在施用抗PD-1或抗CTLA-4抗体之前施用抗OX40抗体。在一个实施方案中，在施用抗PD-1或抗CTLA-4抗体之前的约30分钟内施用抗OX40抗体。在其他实施方案中，在施用抗PD-1或抗CTLA-4抗体之后施用抗OX40抗体。在其他实施方案中，抗OX40抗体与抗PD-1或抗CTLA-4抗体同时施用。
在某些实施方案中，治疗产生至少一个选自以下的治疗效应：肿瘤大小减小、转移性病灶的数目随时间减少、完全反应、部分反应及稳定疾病。在一些实施方案中，肿瘤与选自下组的癌症相关：子宫颈癌、膀胱癌、结肠直肠癌及卵巢癌。
自以下详细说明及实例(其不应理解为具有限制性)将明了本发明的其他特征及优点。
附图简要说明
图1A显示3F4人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:126)及氨基酸序列(SEQ ID NO:17)。绘出了CDR1(SEQ ID NO:11)、CDR2(SEQ ID NO:12)及CDR3(SEQID NO:13)区且标明了V、D及J种系来源。
图1B显示3F4人类单克隆抗体的κ轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:127)及氨基酸序列(SEQ ID NO:18)。绘出了CDR1(SEQ ID NO:14)、CDR2(SEQ ID NO:15)及CDR3(SEQID NO:16)区且标明了V及J种系来源。
图2A显示14B6(14B6-1及14B6-2)人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:128)及氨基酸序列(SEQ ID NO:28)。绘出了CDR1(SEQ ID NO:19)、CDR2(SEQID NO:20)及CDR3(SEQ ID NO:21)区且标明了V、D及J种系来源。
图2B显示14B6-1人类单克隆抗体的κ轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:129)及氨基酸序列(SEQ ID NO:29)。绘出了CDR1(SEQ ID NO:22)、CDR2(SEQ ID NO:23)及CDR3(SEQ ID NO:24)区且标明了V及J种系来源。
图2C显示14B6-2人类单克隆抗体的κ轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:130)及氨基酸序列(SEQ ID NO:30)。绘出了CDR1(SEQ ID NO:26)、CDR2(SEQ ID NO:27)及CDR3(SEQ ID NO:28)区且标明了V及J种系来源。
图3A显示23H3人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:131)及氨基酸序列(SEQ ID NO:37)。绘出了CDR1(SEQ ID NO:31)、CDR2(SEQ ID NO:32)及CDR3(SEQID NO:33)区且标明了V、D及J种系来源。
图3B显示23H3人类单克隆抗体的κ轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:132)及氨基酸序列(SEQ ID NO:38)。绘出了CDR1(SEQ ID NO:34)、CDR2(SEQ ID NO:35)及CDR3(SEQ ID NO:36)区且标明了V及J种系来源。
图4A显示6E1(6E1-1及6E1-2)人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQID NO:133)及氨基酸序列(SEQ ID NO:48)。绘出了CDR1(SEQ ID NO:39)、CDR2(SEQ ID NO:40)及CDR3(SEQ ID NO:41)区且标明了V、D及J种系来源。
图4B显示6E1-1人类单克隆抗体的κ轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:134)及氨基酸序列(SEQ ID NO:49)。绘出了CDR1(SEQ ID NO:42)、CDR2(SEQ ID NO:43)及CDR3(SEQ ID NO:44)区且标明了V及J种系来源。
图4C显示6E1-2人类单克隆抗体的κ轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:135)及氨基酸序列(SEQ ID NO:50)。绘出了CDR1(SEQ ID NO:45)、CDR2(SEQ ID NO:46)及CDR3(SEQ ID NO:47)区且标明了V及J种系来源。
图5A显示18E9人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:136)及氨基酸序列(SEQ ID NO:57)。绘出了CDR1(SEQ ID NO:51)、CDR2(SEQ ID NO:52)及CDR3(SEQID NO:53)区且标明了V、D及J种系来源。
图5B显示18E9人类单克隆抗体的κ轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:137)及氨基酸序列(SEQ ID NO:58)。绘出了CDR1(SEQ ID NO:54)、CDR2(SEQ ID NO:55)及CDR3(SEQ ID NO:56)区且标明了V及J种系来源。
图6A显示8B11人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:138)及氨基酸序列(SEQ ID NO:65)。绘出了CDR1(SEQ ID NO:59)、CDR2(SEQ ID NO:60)及CDR3(SEQID NO:61)区且标明了V、D及J种系来源。
图6B显示8B11人类单克隆抗体的κ轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:139)及氨基酸序列(SEQ ID NO:66)。绘出了CDR1(SEQ ID NO:62)、CDR2(SEQ ID NO:63)及CDR3(SEQ ID NO:64)区且标明了V及J种系来源。
图7A显示20B3人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:140)及氨基酸序列(SEQ ID NO:73)。绘出了CDR1(SEQ ID NO:67)、CDR2(SEQ ID NO:68)及CDR3(SEQID NO:69)区且标明了V、D及J种系来源。
图7B显示20B3人类单克隆抗体的κ轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:141)及氨基酸序列(SEQ ID NO:74)。绘出了CDR1(SEQ ID NO:70)、CDR2(SEQ ID NO:71)及CDR3(SEQ ID NO:72)区且标明了V及J种系来源。
图8A显示14A2(14A2-1及14A2-2)人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:142)及氨基酸序列(SEQ ID NO:84)。绘出了CDR1(SEQ ID NO:75)、CDR2(SEQID NO:76)及CDR3(SEQ ID NO:77)区且标明了V、D及J种系来源。
图8B显示14A2-1人类单克隆抗体的κ轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:143)及氨基酸序列(SEQ ID NO:85)。绘出了CDR1(SEQ ID NO:78)、CDR2(SEQ ID NO:79)及CDR3(SEQ ID NO:80)区且标明了V及J种系来源。
图8C显示14A2-2人类单克隆抗体的κ轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:144)及氨基酸序列(SEQ ID NO:86)。绘出了CDR1(SEQ ID NO:81)、CDR2(SEQ ID NO:82)及CDR3(SEQ ID NO:83)区且标明了V及J种系来源。
图9A显示20C1人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:145)及氨基酸序列(SEQ ID NO:93)。绘出了CDR1(SEQ ID NO:87)、CDR2(SEQ ID NO:88)及CDR3(SEQID NO:89)区且标明了V、D及J种系来源。
图9B显示20C1人类单克隆抗体的κ轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:146)及氨基酸序列(SEQ ID NO:94)。绘出了CDR1(SEQ ID NO:90)、CDR2(SEQ ID NO:91)及CDR3(SEQ ID NO:92)区且标明了V及J种系来源。
图10A显示OX40.21人类单克隆抗体的重链的核苷酸序列(SEQ ID NO:176)及氨基酸序列(SEQ ID NO:124)。轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO:168)及氨基酸序列(SEQ ID NO:116)示于图10B中。
图11A-11D显示各种抗OX40抗体对于活化人类T细胞的结合曲线及EC50(单位nM)，其中用hIgG1及第二抗体作为对照，通过FACS评估。
图12A-12C显示各种抗OX40抗体对于活化食蟹猴T细胞的结合曲线及EC50(单位nM)，其中用hIgG1及第二抗体作为对照，通过FACS评估。
图13A-13C显示抗OX40抗体OX40.21对于活化人类T细胞、过表达人OX40的HEK293细胞及过表达食蟹猴OX40的CHO细胞的结合曲线及KD，通过Scatchard分析评估。
图14A显示各种丙酮固定的冷冻人类组织切片利用抗OX40抗体OX40.8、OX40.6及OX40.16的免疫组织学染色。影像显示了增生性扁桃体在1μg/ml的抗体浓度下的代表性染色，其他组织于5μg/ml的抗体浓度下的代表性染色，例外的是OX40.16在心内膜及瓣膜中为10μg/ml。所有三种抗体对于扁桃体中的一小部分淋巴细胞染色呈阳性，但OX40.8还染色心脏中的肌丝样结构，而OX40.6染色心肌、扁桃体的小动脉中的内皮/内皮下膜基质、以及心脏中的心内膜及瓣膜。GC，生发中心；MZ，外套层。
图14B显示利用抗OX40抗体OX40.21(OX40.16的变体)对各种丙酮固定的冷冻人类组织切片的免疫染色。影像显示5μg/ml的抗体浓度下的代表性染色。抗体对于扁桃体及胸腺中的一小部分淋巴细胞染色呈阳性。扁桃体中的阳性细胞分布在生发中心、外套层及滤泡间细胞区中，而胸腺中的阳性细胞主要定位于髓质中。在心脏、肝、肾及肺中未观察到特异性染色。GC，生发中心；Me，髓质；MZ，外套层。
图15A显示肝细胞癌(HCC)、结肠直肠癌(CRC)、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)及黑色素瘤(Mel)中的OX40+肿瘤浸润淋巴细胞的分布。每一肿瘤类型对12至20个病例实施人工评分，评分通过在显微镜的20倍物镜下估计阳性细胞的数目来进行。最小值，<1个细胞/20倍物镜视场；轻度，1至<10个细胞/20倍物镜视场；中等，10至<50个细胞/20倍物镜视场；显著，50至<200个细胞/20倍物镜；强烈，>200个细胞/20倍物镜视场。
图15B及15C显示来自结肠直肠癌(CRC)及头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)样品的毗邻的FFPE切片上的CD3、FoxP3及OX40的免疫组织学染色。图15B是低倍视图，其显示OX40+TIL与FoxP3+TIL都是CD3+TIL的一小部分，且均主要分布于肿瘤间质中。图15C是更高倍数的视图，其显示OX40+TIL与FoxP3+(Treg)TIL在CRC中的潜在部分共定位。
图16显示各种抗OX40抗体抑制OX40配体(OX40-L)与人OX40转染的293细胞(“hOX40-293细胞”)结合的能力，其中hIgG1作为对照。
图17概述各种抗OX40抗体之间的OX40-L阻断关系。
图18显示各种抗OX40抗体抑制抗OX40抗体克隆L106与hOX40-293细胞结合的能力，通过FACS进行评估，其中使用仅PE标记的L106、PE标记的mIgG1及未染色的细胞作为对照。
图19A-19C显示各种抗OX40抗体抑制别藻蓝蛋白(APC)偶联的OX40.1抗体与hOX40-293(图19A及19B)或hOX40-HT1080细胞(图19C)结合的能力，通过FACS评估。使用hIgG1及/或hIgG4作为对照。
图19D-19G显示各种抗OX40抗体抑制生物素偶联的OX40.4或OX40.5抗体与hOX40-293细胞结合的能力。使用hIgG1及链霉抗生物素蛋白-APC作为对照。
图19H基于图19A-19C中所示的结果概述关于OX40.1的表位箱(bin)。
图19I基于图19D-19G中所示的结果概述关于OX40.5或OX40.4的表位箱。
图20A显示OX40.21仅结合非还原人OX40，而与N-连接糖的存在无关。
图20B及20C显示在去糖基化后通过肽定位鉴别的两种N-糖肽：对于AspN118(图20B)及AspN12(图20C)二者皆为60％占据率。
图20D显示OX40中被OX40.16、OX40.21及OX40.8结合的区域。
图20E显示通过LC-MS鉴别由OX40.16、OX40.21及OX40.8识别的肽。
图21A-21D显示各种抗OX40抗体在与CHO-CD3-CD32A细胞共培养时对人类原代CD4+ T细胞增殖的效应。使用仅CHO细胞、仅T细胞、仅与T细胞共培养的CHO细胞、及hIgG1作为对照。
图22A-22D显示各种抗OX40抗体对与CHO-CD3-CD32A细胞共培养的人类原代CD4+T细胞的干扰素γ(IFN-γ)分泌的效应。使用仅CHO细胞、仅T细胞、仅与T细胞共培养的CHO细胞、及hIgG1作为对照。
图23A-23F显示各种抗OX40抗体对从自不同供体分离的葡萄球菌肠毒素B(SEB)活化的人类外周血单个核细胞(PBMC)的培养物中原代T细胞的IL-2分泌的刺激的效应。
图24显示各种抗OX40抗体对NK92细胞诱导的活化CD4+细胞的溶解的效应。
图25A及25B显示各种抗OX40抗体对原代NK细胞介导的活化CD4+ T细胞(分离自两名供体)溶解的效应，按NK:靶细胞比率区分。
图26显示各种抗OX40抗体对原代人类巨噬细胞吞噬hOX40-293细胞的作用的效应。
图27显示人类补体C1q组分与OX40.21的结合水平，使用IgG1及IgG1.l(无效应物(effectorless))作为对照。
图28A-28C显示OX40在肿瘤浸润淋巴细胞中表达，且表达模式大体限于CD4+细胞，在CD8+细胞上表达极少。
图28D显示OX40被小鼠Sa1N肿瘤中的CD4+ T细胞及调控性T细胞表达。
图28E显示OX40被小鼠MC38肿瘤中的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞及调控性T细胞表达。
图29显示各种抗OX40抗体逆转调控性T(Treg)细胞介导的人类CD4+ T细胞的抑制的能力。在Treg细胞存在及不存在二者下，与IgG1同型对照相比，抗OX40抗体增加了T反应(Tresp)细胞的增殖。
图30A及30B显示静脉内施用的来自猴的OX40.6抗体的清除速率。两只猴显示了清除加速，其与抗药物抗体的形成相关。
图31是描绘各种抗OX40抗体、以及质量对照样品QC-1、QC-2及QC-3的抗原性百分比的T细胞增殖结果的图。
图32A-32C显示MC38结肠腺癌模型中嵌合OX86抗体(具有OX86的大鼠可变区及小鼠恒定区且不阻断OX40与OX40-L之间的相互作用的抗体，即非阻断性抗体)的不同同型对抗肿瘤活性的效应，抗肿瘤活性通过用此类同型(mIgG1及mIgG2同型)治疗的小鼠个体中的肿瘤体积变化来量度：(图32A)对照小鼠IgG1抗体(“对照”)、(图32B)OX86mIgG1抗体(“OX-40mIgG1”)、(图32C)OX86mIgG2抗体(“OX-40mIgG2a”)。
图33A-33C显示OX86抗体的不同同型(mIgG1及mIgG2a)对肿瘤及外周中CD4+调控性T细胞的数目及脾中的细胞数目的效应。
图34A-34C显示MC38结肠腺癌模型中具有人类IgG1的嵌合OX86抗体对抗肿瘤活性的效应，该抗肿瘤活性通过用标示的抗体治疗的小鼠个体中的肿瘤体积变化来量度：(图34A)人类IgG1同型对照(“同型”)、(图34B)OX86-hIgG1嵌合抗体(“OX86-hG1”)、(图34C)OX86-hIgG1-S267E抗体(“OX86-hG1-S267E”)。hIgG1中的S267E取代通过增加与FcR(CD32A及CD32B)的结合而增加其效应物功能。OX86-hIgG1展现了强的抗肿瘤活性。
图35A-35D显示嵌合OX86hIgG1抗体对调控性T细胞耗竭的效应。
图36A-36E显示在皮下小鼠CT-26肿瘤模型中，一种阻断性(即，阻断OX40与OX40配体之间的相互作用)仓鼠抗小鼠OX40抗体(8E5)在不同剂量下对抗肿瘤活性的效应，该抗肿瘤活性通过用标示的抗体治疗的小鼠个体中的肿瘤体积变化来量度。(图36A)仓鼠Ig对照、(图36B)8E5于10mg/kg下、(图36C)8E5于3mg/kg下、(图36D)8E5于1mg/kg下、(图36E)8E5于0.3mg/kg下。
图37A-37D显示在MC38结肠腺癌模型中，OX86-rG1抗体与抗PD1抗体的组合疗法对抗肿瘤活性的效应，该抗肿瘤活性通过用指示抗体及组合治疗的小鼠个体中的肿瘤体积变化来量度：(图37A)同型对照、(图37B)抗PD1抗体、(图37C)OX86-rG1(“抗OX40”)、(图36D)OX86-rG1+抗PD1抗体(“抗OX40+抗PD1”)。
图38A及38B分别显示表达CD69+的CD4+CD8- T细胞在第22及41天时对KLH的离体记忆反应。在研究第1天时利用KLH对动物进行免疫。数据点代表动物个体(雄性及雌性)结果，以CD4+CD8- T细胞的百分比标示。水平条代表组平均值。
图39显示抗体与被抗his Fab捕获的FcγR-his蛋白质的结合。假定mAb:FcγR结合化学计量为1:1，将结合反应绘制为理论Rmax的百分比。各种抗体的条形以幻灯片底部彩色代号提供的顺序显示。
图40显示抗体与被抗his Fab捕获的FcγR-his蛋白质的结合。假定mAb:FcγR结合化学计量为1:1，将结合反应绘制为理论Rmax的百分比。各种抗体的条形以幻灯片底部彩色代号提供的顺序显示。。
图41A-41D显示CT26结肠腺癌模型中激动性抗OX40抗体(OX86-rG1)与抗CTLA-4抗体(9D9-mG2b)的组合疗法对抗肿瘤活性的效应，该抗肿瘤活性通过用标示的抗体及组合治疗的小鼠个体中的肿瘤体积变化来量度：(图41A)同型对照、(图41B)抗CTLA-4抗体、(图41C)OX86-rG1、(图41D)OX86-rG1+抗CTLA-4抗体。
图42系1/2a期临床试验方案的示意图。
图43系1/2a期临床试验的研究访视排程表的示意图。
详述
本文阐述特异性结合OX40且藉此活化下游OX40信号传导的分离的抗体，具体而言单克隆抗体，例如人类单克隆抗体(“激动剂抗OX40抗体”)。在某些实施方案中，本文所述抗体以特定功能特征及/或包含特定结构特征，例如包含具体氨基酸序列的CDR区来表征。本文提供分离的抗体、制备此类抗OX40抗体的方法、包含此类抗体的免疫偶联物及双特异性分子及经配制以含有此类抗体的医药组合物。本文亦提供单独使用、或与其他免疫刺激剂(例如，抗体)及/或癌症疗法组合使用此类抗体用于增强免疫反应的方法。因此，本文所述抗OX40抗体可用于多种治疗应用中的治疗，包括(例如)抑制肿瘤生长及治疗病毒感染。
定义
为了更容易了解本说明，首先定义某些术语。其他定义在贯穿详细说明全文中给出。
如本文所用术语“OX40”系指一种结合OX40配体(OX40-L)的受体，它是TNF-受体超家族的成员。OX40亦称作肿瘤坏死因子受体超家族成员4(TNFRSF4)、ACT35、IMD16、TXGP1L及CD 134。术语“OX40”包括OX40的任何由细胞天然表达的变体或同种型。因此，本文所述抗体可与来自除人类外的物种的OX40(例如，食蟹猴OX40)交叉反应。或者，抗体可对人OX40具有特异性且可不展现任何与其他物种的交叉反应性。OX40或其任何变体及同种型可自其天然表达的细胞或组织分离，或使用本领域熟知的技术及/或本文所述的技术以重组方式产生。
人OX40前体(登录号NP_003318.1)的氨基酸序列阐述于SEQ ID NO:1中。成熟人OX40的细胞外结构域的氨基酸序列阐述于SEQ ID NO:2中。食蟹猴OX40的氨基酸序列阐述于SEQ ID NO:3中。人OX40-L的氨基酸序列阐述于SEQ ID NO:4中。
如本文所用术语“程序死亡1”、“程序细胞死亡1”、“蛋白质PD-1”、“PD-1”、“PD1”、“PDCD1”、“hPD-1”及“hPD-I”可互换使用，包括人类PD-1的变体、同种型、物种同系物及与PD-1具有至少一个共用表位的类似物。PD-1全序列可见于基因库登录号U64863。
术语“细胞毒性T淋巴细胞相关的抗原-4”、“CTLA-4”、“CTLA4”、“CTLA-4抗原”及“CD152”(参见例如Murata(1999)Am.J.Pathol.155:453-460)可互换使用，包括人类CTLA-4的变体、同种型、物种同系物及与CTLA-4具有至少一个共用表位的类似物。(参见例如Balzano(1992)Int.J.Cancer Suppl.7:28-32)。人类CTLA-4的全序列阐述于基因库登录号L1 5006中。
如本文所用术语“抗体”可包括完整抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。在一个实施方案中，“抗体”指包含由二硫键互连的至少两条重(H)链及两条轻(L)链的糖蛋白或其抗原结合部分。每一重链包括重链可变区(在本文中缩写为VH)及重链恒定区。在某些天然IgG、IgD及IgA抗体中，重链恒定区包括三个结构域：CH1、CH2及CH3。在某些天然抗体中，每一轻链包括轻链可变区(在本文中缩写为VL)及轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域CL。可将VH及VL区进一步细分成超变区(称为互补决定区(CDR))及较之更保守的区(称为框架区(FR))，二者间杂排列。每一VH及VL由三个CDR及四个FR构成，其自氨基末端至羧基末端按下列顺序布置：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链及轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如效应物细胞)及经典补体系统的第一组分(C1q))的结合。
抗体通常以高亲和力(由10-7M至10-11M或更小的解离常数(KD)反映)特异性结合其同源抗原。通常将任何大于约10-6M的KD视为指示非特异性结合。如本文所用的，“特异性结合”至抗原的抗体，是指以高亲和力(这意味着KD为10-7M或更小、优选10-8M或更小、更优选5×10-9M或更小、且最优选介于10-8M与10-10M之间或更小)结合抗原和基本上同一的抗原，但不以高亲和力结合无关抗原的抗体。若抗原展现与给定抗原的高度的序列同一性，例如，若其展现与给定抗原的序列的至少80％、至少90％、优选至少95％、更佳至少97％或更优选至少99％序列同一性，则该抗原与给定抗原“基本上同一”。举例而言，特异性结合人OX40的抗体亦可与来自某些非人类灵长类动物物种(例如，食蟹猴)的OX40交叉反应，但可不与来自其他物种的OX40(例如，鼠类OX40)或OX40以外的抗原交叉反应。
免疫球蛋白可来自普遍已知的同型中的任一种同型，包括但不限于IgA、分泌型IgA、IgG及IgM。IgG同型在某些物种中分成亚类：在人类中为IgG1、IgG2、IgG3及IgG4，且在小鼠中为IgG1、IgG2a、IgG2b及IgG3。在某些实施方案中，本文所述抗OX40抗体属IgG1或IgG2亚型。免疫球蛋白(例如IgG1)存在若干异型，这些异型彼此至多有数个氨基酸不同。“抗体”可包括(例如)天然及非天然抗体；单克隆及多克隆抗体；嵌合及人源化抗体；人类及非人抗体；全合成抗体；及单链抗体。
如本文所用术语抗体的“抗原结合部分”指抗体的保留特异性结合抗原(例如，人OX40)的能力的一个或多个片段。已证明，抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段来实施。抗体(例如本文所述抗OX40抗体)的“抗原结合部分”这一术语所涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL及CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，即包含两个在铰链区由二硫桥键连接的Fab片段的二价片段；(iii)由VH及CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL及VH结构域组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341:544-546)，其由VH结构域组成；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)，或(vii)两个或更多个分离的CDR的组合，它们任选可由合成接头接合。此外，尽管Fv片段的两个结构域(VL及VH)是由单独的基因编码的，但可使用重组方法通过合成接头将它们接合在一起，合成接头使得二者可被制成单一蛋白链(称作单链Fv(scFv))，该链中VL及VH区配对形成单价分子；例如，参见Bird等人，(1988)Science 242:423-426；及Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。抗体的“抗原结合部分”这一术语亦意欲涵盖这些单链抗体。此类构建体及其他可能的构建体在Chan及Carter(2010)Nat.Rev.Immunol.10:301中阐述。此类抗体片段使用本领域技术人员已知的常规技术获得，且以与完整抗体相同的方式针对筛选有效用的片段。抗原结合部分可通过重组DNA技术、或通过酶或化学裂解完整免疫球蛋白来产生。
“双特异性”或“双功能性抗体”是具有两个不同重链/轻链对及两个不同结合位点的人工杂合抗体。双特异性抗体可通过多种方法(包括杂交瘤融合或连接Fab'片段)产生。参见例如Songsivilai及Lachmann,Clin.Exp.Immunol.79:315-321(1990)；Kostelny等人，J.Immunol.148,1547-1553(1992)。
如本文所用的，术语“单克隆抗体”是指：抗体，其对特定表位展示单一结合特异性及亲和力；或者抗体的组合物，其中所有抗体均展示对特定表位的单一结合特异性及亲和力。通常，此类单克隆抗体将源自编码该抗体的单一细胞或核酸，且将在不有意引入任何序列变化的情况下扩增。因此，术语“人类单克隆抗体”是指具有源自人类种系免疫球蛋白序列的可变区、以及任选的恒定区的单克隆抗体。在一个实施方案中，人类单克隆抗体由杂交瘤产生，该杂交瘤通过，例如，将自转基因或转染色体非人动物(例如具有包含人类重链转基因及人类轻链的基因组的转基因小鼠)获得的B细胞与永生化细胞融合来获得。
如本文所用的，术语“重组人抗体”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如(a)自对人类免疫球蛋白基因转基因或转染色体的动物(例如小鼠)或自其制备的杂交瘤分离的抗体；(b)自经转化以表达抗体的宿主细胞、例如自转染瘤分离的抗体；(c)自重组、组合人抗体文库分离的抗体；及(d)通过涉及将人类免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他方式制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体包含这样的可变区及恒定区：其利用由种系基因编码的特定人类种系免疫球蛋白序列，但包括后续的重排及突变，例如在抗体成熟期间发生的重排及突变。如本领域已知的(例如参见Lonberg(2005)Nature Biotech.23(9):1117-1125)，可变区含有抗原结合结构域，抗原结合结构域由多个基因编码，这些基因重排而形成对外来抗原具有特异性的抗体。除重排外，可变区还可通过多个单一氨基酸变化而被进一步修饰(称作体细胞突变或超突变)，以增加抗体对外来抗原的亲和力。恒定区将进一步响应于抗原而发生变化(即，同型转换)。因此，经过重排和体细胞突变、响应于抗原而编码轻链及重链免疫球蛋白多肽的核酸序列，可能与初始种系序列不同一，而是与其基本同一或类似(即，具有至少80％同一性)。
“人”抗体(HuMAb)指具有这样的可变区的抗体：可变区中框架区及CDR区二者均源自人类种系免疫球蛋白序列。此外，若抗体含有恒定区，则恒定区亦系源自人类种系免疫球蛋白序列。本文所述抗体可包括不由人类种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机诱变或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用的，术语“人抗体”并不意欲包括源自另一哺乳动物物种(例如小鼠)种系的CDR序列已移植至人类框架序列上的抗体。术语“人”抗体及“完全人”抗体同义使用。
“人源化”抗体指非人抗体的CDR结构域以外的一些、大部分或所有氨基酸被替换为源自人类免疫球蛋白的相应氨基酸的抗体。在抗体的人源化形式的一个实施方案中，CDR结构域以外的一些、大部分或所有氨基酸被替换为人类免疫球蛋白的氨基酸，而一个或多个CDR区内的一些、大部分或所有氨基酸未改变。可允许存在氨基酸的小的添加、缺失、插入、取代或修饰，只要其不消除抗体结合特定抗原的能力即可。“人源化”抗体保留类似于初始抗体的抗原特异性的抗原特异性。
“嵌合抗体”指可变区源自一个物种、且恒定区源自另一物种的抗体，例如可变区源自小鼠抗体且恒定区源自人抗体的抗体。
如本文所用，“同型”指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD及IgE抗体)。
“异型”指某一特定同型类群内的天然出现的变体，此类变体有少数个氨基酸不同(例如，参见Jefferis等人(2009)mAbs 1:1)。本文所述抗体可属于任何异型。如本文所用的，称作“IgG1f”或“IgG1.1f”同型的抗体分别是IgG1抗体与无效应物IgG1.l抗体，它们属于异型“f”，即根据如Kabat中的EU索引具有214R、356E及358M，如(例如)SEQ ID NO:5中所示(参见表23的SEQ ID NO:5中的加下划线的残基)。
片语“识别抗原的抗体”及“对抗原具有特异性的抗体”在本文中可与术语“特异性结合抗原的抗体”互换使用。
如本文所用的，“分离的抗体”欲指实质上不含其他具有不同抗原特异性的抗体的抗体(例如，特异性结合OX40的分离的抗体实质上不含特异性结合除OX40以外的抗原的抗体)。然而，特异性结合OX40的表位的分离的抗体可能与来自不同物种的其他OX40蛋白具有交叉反应性。
如本文所用，“抑制OX40-L与OX40结合”的抗体是指抑制OX40-L与OX40的结合，例如在使用hOX40-293细胞的结合测定中抑制OX40-L与OX40的结合的抗体，在本领域公认的方法(例如本文所述基于FACS的结合测定)中，其EC50为约1μg/mL或更小，例如约0.9μg/mL或更小、约0.85μg/mL或更小、约0.8μg/mL或更小、约0.75μg/mL或更小、约0.7μg/mL或更小、约0.65μg/mL或更小、约0.6μg/mL或更小、约0.55μg/mL或更小、约0.5μg/mL或更小、约0.45μg/mL或更小、约0.4μg/mL或更小、约0.35μg/mL或更小、约0.3μg/mL或更小、约0.25μg/mL或更小、约0.2μg/mL或更小、约0.15μg/mL或更小、或约0.1μg/mL或更小。
“效应物功能”指抗体Fc区与Fc受体或配体的相互作用或自其产生的生物化学事件。示例性“效应物功能”包括C1q结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、FcγR介导的效应物功能(例如ADCC及抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP))及细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)的下调。此类效应物功能通常需要Fc区与结合结构域(例如，抗体可变结构域)组合。
“Fc受体”或“FcR”是结合免疫球蛋白的Fc区的受体。结合IgG抗体的FcR包含FcγR家族的受体，包括此类受体的等位基因变体及选择性剪接形式。FcγR家族由三种活化受体(小鼠中为FcγRI、FcγRIII及FcγRIV；人类中为FcγRIA、FcγRIIA及FcγRIIIA)及一种抑制受体(FcγRIIB)组成。人类FcγR的各种性质概述于表1中。大多数先天效应细胞类型共表达一种或多种活化FcγR及抑制FcγRIIB，而天然杀伤(NK)细胞选择性表达一种活化Fc受体(小鼠中为FcγRIII且人类中为FcγRIIIA)而不表达小鼠及人类中的抑制FcγRIIB。人类IgG1结合大部分人类Fc受体且关于其结合的活化Fc受体的类型认为其等效于鼠类IgG2a。
表1.人类FcγR的性质
Figure BDA0001559815020000201
Figure BDA0001559815020000211
“Fc区”(片段可结晶区)或“Fc结构域”或“Fc”系指介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合(包括结合位于免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)上的Fc受体或经典补体系统的第一组分(C1q))的抗体的重链的C-末端区。因此，Fc区包含排除第一恒定区免疫球蛋白结构域(例如，CH1或CL)的抗体的恒定区。在IgG、IgA及IgD抗体同型中，Fc区在抗体的两条重链的每一者中包含CH2及CH3恒定结构域；IgM及IgE Fc区在每一多肽链中包含三个重链恒定结构域(CH结构域2-4)。对于IgG，Fc区包含免疫球蛋白结构域Cγ2及Cγ3及Cγ1与Cγ2之间的铰链。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可变，但通常将人类IgG重链Fc区定义为自位置C226或P230处的氨基酸残基(或该两个氨基酸之间的氨基酸)延伸至重链的羧基-末端，其中编号系根据如Kabat中的EU索引。Kabat等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,National Institutes of Health,Bethesda,MD；亦参见美国专利申请公开案第2008/0248028号的图3C-3F。人类IgG Fc区的CH2结构域自约氨基酸231延伸至约氨基酸340，而CH3结构域位于Fc区中的CH2结构域的C-末端侧上，即其自IgG的约氨基酸341延伸至约氨基酸447。如本文所用，Fc区可为天然序列Fc(包括任何异型变体)或变体Fc(例如，非天然Fc)。Fc亦可指与包含Fc的蛋白多肽(例如“包含Fc区的结合蛋白”(亦称作“Fc融合蛋白”(例如，抗体或免疫粘附素)))分离或在其背景下的此区。
“铰链”、“铰链结构域”或“铰链区”或“抗体铰链区”系指重链恒定区中将CH1结构域接合至CH2结构域的结构域且包括铰链的上、中间及下部分(Roux等人，J.Immunol.1998161:4083)。铰链在抗体的结合区与效应物区之间提供不同程度的柔性且亦提供用于两个重链恒定区之间的分子间二硫键结的位点。如本文所用的，对于所有IgG同型而言，铰链始于Glu216且结束于Gly237(Roux等人，1998J Immunol 161:4083)。野生型IgG1、IgG2、IgG3及IgG4铰链的序列示于表2及23中。
表2.铰链区氨基酸
Figure BDA0001559815020000221
Figure BDA0001559815020000231
*CH1结构域的C-末端氨基酸序列.
术语“铰链”包括野生型铰链(例如阐述于表23中的那些)以及其变体(例如，非天然铰链或经修饰铰链)。举例而言，术语“IgG2铰链”包括如表23中所示的野生型IgG2铰链及具有1、2、3、4、5、1-3、1-5、3-5及/或至多5、4、3、2或1个突变(例如取代、缺失或添加)的变体。示例性IgG2铰链变体包括1、2、3或全部4个半胱氨酸(C219、C220、C226及C229)变为另一氨基酸的IgG2铰链。在具体实施方案中，IgG2包含C219S取代。在某些实施方案中，铰链系包含来自至少两个同型的序列的杂合铰链。举例而言，铰链可包含来自一个同型的上、中间或下铰链且铰链的其余部分来自一个或多个其他同型。举例而言，铰链可为IgG2/IgG1铰链，且可包含(例如)IgG2的上及中间铰链及IgG1的下铰链。铰链可具有效应物功能或丧失效应物功能。举例而言，野生型IgG1的下铰链提供效应物功能。
术语“CH1结构域”系指重链恒定结构域中将可变结构域连接至铰链的重链恒定区。如本文所用，CH1结构域始于A118且结束于V215。术语“CH1结构域”包括野生型CH1结构域(例如对于IgG1具有SEQ ID NO:202且对于IgG2具有SEQ ID NO:203；表23)以及其变体(例如，非天然CH1结构域或经修饰CH1结构域)。举例而言，术语“CH1结构域”包括野生型CH1结构域及具有1、2、3、4、5、1-3、1-5、3-5及/或至多5、4、3、2或1个突变(例如取代、缺失或添加)的变体。示例性CH1结构域包括具有改善抗体的生物活性(例如ADCC、CDC或半衰期)的突变的CH1结构域。本文提供影响抗体的生物活性的CH1结构域的修饰形式。
术语“CH2结构域”系指重链恒定结构域中将铰链连接至CH3结构域的重链恒定区。如本文所用的，CH2结构域始于P238且结束于K340。术语“CH2结构域”包括野生型CH2结构域(例如对于IgG1具有SEQ ID NO:204且对于IgG2具有SEQ ID NO:205；表23)以及其变体(例如，非天然CH2结构域或经修饰CH2结构域)。举例而言，术语“CH2结构域”包括野生型CH2结构域及具有1、2、3、4、5、1-3、1-5、3-5及/或至多5、4、3、2或1个突变(例如取代、缺失或添加)的变体。示例性CH2结构域包括具有改善抗体的生物活性(例如ADCC、CDC或半衰期)的突变的CH2结构域。在某些实施方案中，CH2结构域包含降低效应物功能的取代A330S/P331S。本文提供影响抗体的生物活性的CH2结构域的其他修饰形式。
术语“CH3结构域”系指重链恒定结构域中将C-末端连接至CH2结构域的重链恒定区。如本文所用，CH3结构域始于G341且结束于K447。术语“CH3结构域”包括野生型CH3结构域(例如对于IgG1具有SEQ ID NO:206且对于IgG2具有SEQ ID NO:207；表23)以及其变体(例如，非天然CH3结构域或经修饰CH3结构域)。举例而言，术语“CH3结构域”包括野生型CH3结构域及具有1、2、3、4、5、1-3、1-5、3-5及/或至多5、4、3、2或1个突变(例如取代、缺失或添加)的变体。示例性CH3结构域包括具有改善抗体的生物活性(例如ADCC、CDC或半衰期)的突变的CH3结构域。本文提供影响抗体的生物活性的CH3结构域的修饰形式。
“天然序列Fc区”或“天然序列Fc”包含与自然界中发现的Fc区的氨基酸序列同一的氨基酸序列。天然序列人类Fc区包括天然序列人类IgG1 Fc区；天然序列人类IgG2 Fc区；天然序列人类IgG3 Fc区；及天然序列人类IgG4 Fc区以及其天然变体。天然序列Fc包括Fc的各种异型(例如，参见Jefferis等人(2009)mAbs 1:1)。
术语“表位”或“抗原决定簇”系指免疫球蛋白或抗体特异性结合抗原(例如，OX40)上的位点。蛋白质抗原内的表位可自通过蛋白质的三级折叠(通常构象表位)并置的邻接氨基酸(通常线性表位)或非邻接氨基酸形成。在暴露于变性溶剂时，通常但不总是保留自邻接氨基酸形成的表位，而在用变性溶剂处理时通常损失通过三级折叠形成的表位。在独特空间构象中，表位通常包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。确定由给定抗体结合表位的方法(即表位定位)已为业内熟知且包括(例如)免疫印迹及免疫沉淀分析，其中测试(例如来自OX40)的重叠或邻接肽与给定抗体(例如抗OX40抗体)的反应性。确定表位的空间构象的方法包括业内的技术及本文所述那些，例如，x射线结晶学及2维核磁共振及HDX-MS(例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris编辑，(1996))。
术语“表位定位”系指参与抗体-抗原识别的抗原上的分子决定簇的鉴别方法。
术语“结合相同表位”在提及两种或更多种抗体时，意指各抗体结合相同的氨基酸残基群，如通过给定方法所测定的。确定抗体与本文所述抗体是否结合“OX40上的相同表位”的技术包括本领域公认的表位定位方法，例如抗原:抗体复合物的晶体的x射线分析，其提供表位的原子拆分及氢/氘交换质谱(HDX-MS)。其他方法监测抗体与抗原片段(例如蛋白水解片段)或抗原的突变变化形式的结合，其中由于抗原序列内氨基酸残基的修饰所致的结合损失经常被视为可指示表位组分(例如，丙氨酸扫描诱变-Cunningham及Wells(1985)Science 244:1081)。另外，亦可使用表位定位的计算组合方法。此类方法取决于目标抗体自组合噬菌体展示肽文库亲和分离特异性短肽的能力。预计具有相同或密切相关VH及VL或相同CDR1、2及3序列的抗体结合相同表位。
“与另一抗体竞争结合靶标”的抗体系指抑制(部分或完全)另一抗体与靶标结合的抗体。可使用已知竞争实验确定两个抗体是否彼此竞争结合靶标，即一个抗体是否抑制另一抗体与靶标结合及其抑制程度。在某些实施方案中，抗体与另一抗体竞争靶标结合且将该结合抑制至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。取决于哪个抗体是“阻断抗体”(即，首先与靶标一起培育的冷抗体)，抑制或竞争的程度可能不同。竞争分析可如以下中所述地进行：例如，Ed Harlow及David Lane,Cold Spring HarbProtoc；2006；doi:10.1101/pdb.prot4277，或“Using Antibodies”的第11章，Ed Harlow及David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,USA1999。竞争抗体结合相同表位、重叠表位或毗邻表位(例如，如由立体阻碍所证明的)。
其他本领域公认的竞争性结合测定包括：固相直接或间接放射免疫分析(RIA)、固相直接或间接酶免疫分析(EIA)、夹心式竞争分析(参见Stahli等人，Methods inEnzymology 9:242(1983))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见Kirkland等人，J.Immunol.137:3614(1986))；固相直接标记的测定、固相直接标记的夹心式分析(参见Harlow及Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press(1988))；使用I-125标记的固相直接标记RIA(参见Morel等人，Mol.Immunol.25(1):7(1988))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung等人，Virology 176:546(1990))；及直接标记的RIA。(Moldenhauer等人，Scand.J.Immunol.32:77(1990))。
如本文所用术语“特异性结合”(“specific binding”)、“选择性结合”(“selective binding”)、“选择性结合”(“selectively binds”)及“特异性结合”(“specifically binds”)系指结合预定抗原而非其他抗原上的表位的抗体。通常，抗体(i)在通过(例如)在BIACORE 2000表面等离子共振(SPR)仪器中使用预定抗原(例如重组人OX40)作为分析物及抗体作为配体的表面等离子共振(SPR)技术测定时，以约小于10-7M、例如约小于10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低的平衡解离常数(KD)结合，及(ii)较其与除预定抗原或密切相关抗原以外的非特异性抗原(例如，BSA、酪蛋白)的结合亲和力大至少两倍的亲和力结合预定抗原。因此，“特异性结合人OX40”的抗体系指以10-7M或更小、例如约小于10- 8M、10-9M或10-10M或甚至更低的KD结合可溶性或细胞结合的人OX40的抗体。“与食蟹猴OX40交叉反应”的抗体系指以10-7M或更小、例如约小于10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低的KD结合食蟹猴OX40的抗体。在某些实施方案中，在标准结合分析中，不与非人类物种的OX40(例如鼠类OX40)交叉反应的抗体展现针对此类蛋白质的基本上不可检测的结合。
如本文所用的术语“k缔合”或“ka”欲指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率常数，而如本文所用的术语“k解离”或“kd”欲指特定抗体-抗原相互作用的解离速率常数。本文所用术语“KD”欲指平衡解离常数，其系自kd对ka的比率(亦即kd/ka)获得且以摩尔浓度(M)表示。可使用业内充分确立的方法测定抗体的KD值。测定抗体的KD的优选方法系通过使用表面等离子共振、优选使用生物传感器系统(例如
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SPR系统)或流式细胞术及Scatchard分析。
如本文所用术语对IgG抗体的“高亲和力”系指抗体对于靶抗原具有10-8M或更小、更佳10-9M或更小且更优选10-10M或更小的KD。然而，对于其他抗体同型，“高亲和力”结合可能是变化的。举例而言，对于IgM同型的“高亲和力”结合系指抗体具有10-7M或更小、优选10-8M或更小的KD。
术语“EC50”在使用抗体或其抗原结合片段的体外或体内分析的上下文中指诱导系最大反应的50％的反应、即介于最大反应与基线之间的一半的抗体或其抗原结合部分的浓度。
术语“结合固定OX40”指本文所述抗体结合(例如)细胞表面上表达或附接至固体载体的OX40的能力。
如本文所用术语“交叉反应”系指本文所述抗体结合不同物种的OX40的能力。举例而言，结合人OX40的本文所述抗体亦可结合另一物种的OX40(例如，食蟹猴OX40)。如本文所用，交叉反应性可通过在结合测定(例如，SPR、ELISA)中检测与纯化抗原的特定反应性、或检测与生理表达OX40的细胞的结合或其他方式的功能互作来测量。用于测定交叉反应性的方法包括如本文所述的标准结合测定，例如通过使用
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2000SPR仪器(BiacoreAB,Uppsala,Sweden)的
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表面等离子共振(SPR)分析或流式细胞技术。
本文所用的术语“天然(存在的)”在适用于某物体时，指自然界中可发现某物体的事实。举例而言，存在于生物体(包括病毒)中、可自自然界中的来源分离、且尚未在实验室中由人有意修饰的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。
“多肽”指包含至少两个连续连接的氨基酸残基的链，其中链的长度无上限。蛋白质中的一个或多个氨基酸残基可含有例如但不限于糖基化、磷酸化或二硫键等修饰。“蛋白质”可包含一种或多种多肽。
如本文所用术语“核酸分子”意欲包括DNA分子及RNA分子。核酸分子可为单链或双链，且可为cDNA。
亦提供本文中(例如)表23中所述的序列的“保守序列修饰”，即，不消除由核苷酸序列编码或含有氨基酸序列的抗体与抗原的结合的核苷酸及氨基酸序列修饰。此类保守序列修饰包括保守核苷酸及氨基酸取代、以及核苷酸及氨基酸添加及缺失。举例而言，可通过本领域已知的标准技术(例如定点诱变及PCR介导的诱变)向表23中的序列中引入修饰。保守序列修饰包括保守氨基酸取代，其中氨基酸残基经具有类似侧链的氨基酸残基置换者。本领域已定义具有类似侧链的氨基酸残基的家族。此类家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)及具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，抗OX40抗体中预测的非必需氨基酸残基优选被来自同一侧链家族的另一氨基酸残基置换。鉴别不消除抗原结合的核苷酸及氨基酸保守取代的方法为本领域所熟知(例如，参见Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；及Burks等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:412-417(1997))。或者，在另一实施方案中，可通过(例如)饱和诱变沿抗OX40抗体编码序列的全部或一部分随机引入突变，且可针对所得的修饰的抗OX40抗体筛选改善的结合活性。
对于核酸而言，术语“实质同源性”指示，两个核酸或其指定序列在最优选比对及比较(其中适当插入或缺失核苷酸)时有至少约80％的核苷酸、通常至少约90％至95％且更佳至少约98％至99.5％的核苷酸同一。或者，当区段将在选择性杂交条件下与链的互补物杂交时存在实质同源性。
对于多肽而言，术语“实质同源性”指示，两个多肽或其指定序列在最优选比对及比较(其中适当插入或缺失氨基酸)时有至少约80％的氨基酸、通常至少约90％至95％且更优选至少约98％至99.5％的氨基酸同一。
两个序列之间的同一性百分比是该两个序列被最佳比对时享有的相同位置数的函(即同源性％＝同一位置数/总位置数乘以100)，其中确定最佳比对时考虑为达成两个序列最佳比对而需要引入的空位数及各空位长度。两个序列之间的序列比较及同一性百分比测定可使用数学算法来完成，如下文非限制性实例中所述的。
两个核苷酸序列之间的同一性百分比可使用GCG软件包(可于http://www.gcg.com获得)中的GAP程序使用NWSgapdna.CMP矩阵及40、50、60、70或80的空位权重及1、2、3、4、5或6的长度权重来测定。两个核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分比亦可使用E.Meyers及W.Miller的算法(CABIOS,4:11-17(1989))使用PAM120权重残基表来测定，该算法已纳入ALIGN程序(2.0版)中，空位长度罚分为12且空位罚分为4。另外，两个氨基酸序列之间的同一性百分比可使用Needleman及Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))算法使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵来确定，该算法已纳入GCG软件包(可于http://www.gcg.com获得)中的GAP程序中，且空位权重为16、14、12、10、8、6或4且长度权重为1、2、3、4、5或6。
本文所述核酸及蛋白序列可进一步用作“查询序列”以针对公开数据库实施搜索以(例如)鉴定相关序列。此类搜索可使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的NBLAST及XBLAST程序(2.0版)实施。BLAST核苷酸搜索可利用NBLAST程序实施(评分＝100，字长＝12)以获得与本文所述核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可利用XBLAST程序实施(评分＝50，字长＝3)以获得与本文所述蛋白质分子同源的氨基酸序列。出于比较目的，为获得加空位比对，可如Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中所述来利用Gapped BLAST。在利用BLAST及GappedBLAST程序时，可使用各自程序(例如，XBLAST及NBLAST)的缺省参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。
此类核酸可存在于全细胞中，存在于细胞溶解物中，或以部分纯化或实质上纯的形式存在。当通过标准技术实施纯化以清除其他细胞组分或其他污染物(例如其他细胞核酸(例如染色体的其他部分)或蛋白质)时，核酸是“分离的”或“实质上纯化的”，此类标准技术包括碱/SDS处理、CsCl显带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳及本领域熟知的其他方法。参见F.Ausubel等人编辑，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishingand Wiley Interscience,New York(1987)。
可根据标准技术使核酸(例如cDNA)突变以提供基因序列。对于编码序列而言，此类突变可如期望的那样影响氨基酸序列。具体而言，涵盖与本文所述的天然V、D、J序列、恒定序列、转换序列及其他此类序列实质上同源或自它们衍生的DNA序列。
如本文所用术语“载体”指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。一类载体为“质粒”，其指额外DNA区段可连接至其中的环形双链DNA环。另一类载体为病毒载体，其中额外DNA区段可连接至病毒基因组中。某些载体能够在已将其引入其中的宿主细胞中进行自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体及游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)可在引入宿主细胞中时整合至该宿主细胞的基因组中，并藉此随宿主基因组一同复制。此外，某些载体能够引导与其可操作连接的基因的表达。此类载体在本文中称作“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。一般而言，用于重组DNA技术中的表达载体经常呈质粒形式。在本说明书中，“质粒”与“载体”可互换使用，因为质粒是载体的最常用形式。然而，亦包括可起等效功能的其他形式的表达载体，例如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒及腺伴随病毒)。
如本文所用术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)欲指包含在细胞中非天然存在的核酸的细胞，且可以是其中已经引入了重组表达载体的细胞。应了解，这些术语不仅欲指特定主题细胞，而且亦指此细胞的后代。由于突变或环境影响可使后续各代发生某些改变，因此，此后代实际上可能与亲本细胞不同但仍包括于本文所用术语“宿主细胞”的范畴内。
如本文所用术语“抗原”指任何天然或合成免疫原性物质，例如蛋白质、肽或半抗原。抗原可为OX40或其片段。抗原亦可为肿瘤抗原，针对其期望保护或治疗性免疫反应，例如由肿瘤细胞表达的抗原，例如，与抗OX40抗体组合用作欲施用的肿瘤疫苗。抗原包括用于预防或治疗癌症的肿瘤相关的抗原。肿瘤相关的抗原的实例包括(但不限于)包含以下的序列的全部或一部分的序列：βhCG、gp100或Pme117、HER2/neu、WT1、间皮素、CEA、gp100、MART1、TRP-2、Melan-A、NY-ESO-1、NY-BR-1、NY-CO-58、MN(gp250)、独特型(idiotype)、MAGE-1、MAGE-3、MAGE-A3、酪氨酸酶、端粒酶、SSX2及MUC-1抗原及生殖细胞源肿瘤抗原。肿瘤相关的抗原亦包括血型抗原，例如Lea、Leb、LeX、LeY、H-2、B-1、B-2抗原。或者，构建体中可包括一种以上抗原。举例而言，可将MAGE抗原与其他抗原(例如黑色素A、酪氨酸酶及gp100)以及佐剂(例如GM-CSF或IL-12)组合，并连接至抗APC抗体。
上述抗原的序列为本领域熟知。举例而言，MAGE-3cDNA序列的实例提供于US 6,235,525(Ludwig Institute for Cancer Research)中；NY-ESO-1核酸及蛋白序列的实例提供于US 5,804,381及US 6,069,233(Ludwig Institute for Cancer Research)中；Melan-A核酸及蛋白序列的实例提供于US 5,620,886及US 5,854,203(Ludwig Institutefor Cancer Research)中；NY-BR-1核酸及蛋白序列的实例提供于US 6,774,226及US 6,911,529(Ludwig Institute for Cancer Research)中且NY-CO-58核酸及蛋白序列的实例提供于WO 02/90986(Ludwig Institute for Cancer Research)中；HER-2/neu蛋白的氨基酸序列的实例可以
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登录号AAA58637获得；且人类癌胚抗原-样1(CEA-1)的核苷酸序列(mRNA)可以
Figure BDA0001559815020000312
登录号NM020219获得。
“免疫反应”指脊椎动物内针对外来作用剂的生物反应，该反应保护生物体抵抗此类作用剂及由其引起的疾病。免疫反应系由免疫系统的细胞(例如，T淋巴细胞、B淋巴细胞、天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突细胞或嗜中性粒细胞)及由此类细胞中的任一者或由肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子及补体)的作用介导，其导致选择性靶向、结合、损害、破坏及/或自脊椎动物身体消除侵入病原体、经病原体感染的细胞或组织、癌性或其他异常细胞或在自体免疫或病理炎症的情形下正常人类细胞或组织。免疫反应包括(例如)T细胞(例如效应物T细胞)或Th细胞(例如CD4+或CD8+ T细胞)的活化或抑制或Treg细胞的抑制。
“免疫调节剂”或“免疫调控剂”系指可参与调节、调控或改善免疫反应的试剂，例如信号传导路径的组分。“调节”、“调控”或“改善”免疫反应系指免疫系统的细胞或此类细胞(例如，效应物T细胞)的活性的任何改变。该调节包括免疫系统的刺激或抑制，其可表达为各种细胞类型的数目的增加或减少、此类细胞的活性的增加或减少或可在免疫系统内发生的任何其他变化。抑制性及刺激性免疫调节剂均已得到鉴定，其中的一些在肿瘤微环境中可具有增强的功能。在优选实施方案中，免疫调节剂位于T细胞表面上。“免疫调节性靶标”或“免疫调控性靶标”是这样的免疫调节剂，其被某种物质、试剂、部分、化合物或分子靶向结合，且其活性被该物质、试剂、部分、化合物或分子的结合所改变的。免疫调节性靶标包括例如细胞表面上的受体(“免疫调节性受体”)及受体配体(“免疫调节性配体”)。
“免疫疗法”系指通过包含诱导、增强、抑制或以其他方式改善免疫反应的方法治疗罹患疾病或处于感染疾病或具有疾病的复发的风险的受试者。
“免疫刺激疗法”或“免疫刺激性疗法”系指引起增加(诱导或增强)受试者中的免疫反应以便例如治疗癌症的疗法。
“增强内源免疫反应”意指增加受试者中的现有的免疫反应的有效性或功效。有效性及功效的增加可通过例如克服抑制内源宿主免疫反应的机制或通过刺激增强内源宿主免疫反应的机制来达成。
“T效应物”(“Teff”)细胞指具有细胞溶解活性的T细胞(例如，CD4+及CD8+ T细胞)以及T辅助(Th)细胞，其分泌细胞因子且活化并引导其他免疫细胞，但不包括调控性T细胞(Treg细胞)。本文所述抗OX40抗体活化Teff细胞，例如CD4+及CD8+ Teff细胞。
刺激免疫反应或免疫系统的能力增加可以是针对T细胞共刺激受体的激动剂活性增强、及/或针对抑制性受体的拮抗剂活性增强的结果。刺激免疫反应或免疫系统的能力增加可以反映在测量免疫反应的测定、例如测量细胞因子或趋化因子释放、细胞溶解活性(在靶细胞上直接测定、或介由检测CD107a或颗粒酶间接测定)及增殖变化的测定中EC50或最大活性值的倍数增加。刺激免疫反应或免疫系统活性的能力可增强至少10％、30％、50％、75％、2倍、3倍、5倍或更多。
如本文所用术语“连接”系指两个或更多个分子的缔合。连接可为共价或非共价链接。连接亦可是基因性的(即，重组融合)。此类连接可使用多种本领域公认的技术(例如化学偶联及重组蛋白产生)来达成。
如本文所用，“施用”指使用本领域普通技术人员已知的各种方法及递送系统中的任一者向受试者物理引入包含治疗剂的组合物。本文所述抗体的优选施用途径包括静脉内、腹膜内、肌内、皮下、脊柱或其他非经肠施用途径(例如通过注射或输注)。如本文所用片语“非经肠施用”意指除经肠及局部施用以外的施用模式，通常通过注射，且包括(但不限于)静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴管内、病灶内、囊内、眶内、心内、皮内、经气管、皮下、表皮下、关节内、经囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外及胸骨内注射及输注、以及体内电穿孔。或者，本文所述抗体可经由非经肠途径施用，例如局部、表皮或粘膜施用途径，例如经鼻内、经口、经阴道、经直肠、经舌下或经局部。施用亦可(例如)实施一次、复数次及/或在一个或多个延长时段内实施。
如本文所用术语“T细胞介导的反应”系指由T细胞(包括效应物T细胞(例如，CD8+细胞)及辅助T细胞(例如，CD4+细胞))介导的反应。T细胞介导的反应包括(例如)T细胞细胞毒性及增殖。
如本文所用术语“细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应”系指由细胞毒性T细胞诱导的免疫反应。CTL反应主要由CD8+ T细胞介导。
如本文所用术语“抑制”或“阻断”(例如，在提及细胞上OX40-L与OX40的结合的抑制/阻断时)可互换使用，且涵盖部分的和完全的抑制/阻断。在某些实施方案中，抗OX40抗体将OX40-L与OX40的结合抑制至少约50％、例如约60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％，如(例如)本文中进一步所述所测定的。在某些实施方案中，抗OX40抗体将OX40-L与OX40的结合抑制不超过50％、例如约40％、30％、20％、10％、5％或1％，如(例如)本文中进一步所述所测定的。
如本文所用术语“抑制肿瘤的生长”包括肿瘤生长的任何可测量的减少，例如肿瘤生长抑制至少约10％、例如至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约99％或100％。
如本文所用“癌症”指以体内异常细胞不受控生长为特点的一大类疾病。失调的细胞分裂可形成侵袭相邻组织且可经由淋巴系统或血流转移至身体的远处部分的恶性肿瘤或细胞。
如本文所用术语“治疗”(“treat”、“treating”及“treatment”)指对受试者实施的任何类型的介入或方法或向其施用活性剂，其中目的是逆转、缓和、改善、抑制或缓解或预防症状、并发症、病况或与疾病相关的生物化学标记的进展、发展、严重程度或复发。预防指对未患疾病的受试者施用，以防止疾病发生或使其影响(若存在)最小化。
“血液恶性病”包括淋巴瘤、白血病、骨髓瘤或淋巴恶性病以及脾及淋巴结的癌症。示例性淋巴瘤包括B细胞淋巴瘤(B细胞血液癌)及T细胞淋巴瘤。B细胞淋巴瘤包括霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphomas)及大部分非霍奇金氏淋巴瘤。B细胞淋巴瘤的非限制性实例包括弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、粘膜下相关的淋巴组织淋巴瘤、小细胞淋巴细胞性淋巴瘤(与慢性淋巴细胞性白血病重叠)、外套细胞淋巴瘤(MCL)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、纵膈大B细胞淋巴瘤、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrommacroglobulinemia)、结节边缘区B细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性积液淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病。T细胞淋巴瘤的非限制性实例包括结节外T细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、退行性大细胞淋巴瘤及血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤。血液恶性病亦包括白血病，例如但不限于继发性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病及急性淋巴母细胞性白血病。血液恶性病进一步包括骨髓瘤，例如但不限于多发性骨髓瘤及焖燃型多发性骨髓瘤。术语血液恶性病涵盖其他血液及/或B细胞-或T细胞相关的癌症。
术语“有效剂量”(“effective dose”或“effective dosage”)定义为足以达成或至少部分达成期望效应的量。药物或治疗剂的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是药物在单独使用或与另一治疗剂组合使用时促进疾病消退的任何量，该疾病消退由疾病症状的严重程度降低、无疾病症状的时段的频率及持续时间增加、或防止因患病所致的损害或失能来证明。
在提及实体肿瘤时，“有效量”包含足以引起肿瘤收缩及/或减小肿瘤生长速率(例如抑制肿瘤生长)或预防或延迟其他不期望细胞增殖的量。在某些实施方案中，有效量是足以延迟肿瘤发生的量。在一些实施方案中，有效量是足以预防或延迟肿瘤复发的量。有效量可以一或多次施用来施用。药物或组合物的有效量可：(i)减少癌细胞数目；(ii)减小肿瘤大小；(iii)抑制、延缓、减缓至一定程度且可停止癌细胞浸润至周边器官中；(iv)抑制、即减缓至一定程度且停止肿瘤转移；(v)抑制肿瘤生长；(vi)预防或延迟肿瘤发生及/或复发；及/或(vii)将与癌症相关的症状中的一种或多种减轻至一定程度。在一个实例中，“有效量”是在临床上证明影响癌症显著减少或减缓癌症(例如晚期实体肿瘤)进展的抗OX40抗体的量及抗PD-1抗体(例如，纳武单抗(nivolumab))或抗CTLA-4抗体(例如，伊匹单抗(ipilimumab))组合的量。如本文所用的术语“固定剂量”、“不变剂量”及“不变-固定剂量”可互换使用且系指施用给患者而与患者的体重或体表面积(BSA)无关的剂量。因此，固定或不变剂量不提供为mg/kg剂量，而是提供为试剂的绝对量。
如本文所用“基于体表面积(BSA)的剂量”指根据受试者患者的体表面积(BSA)调节的剂量。基于BSA的剂量可提供为mg/kg体重。已公开各种计算以在不直接测量下获得BSA，最广泛使用的计算是Du Bois公式(参见Du Bois D,Du Bois EF(Jun 1916)Archivesof Internal Medicine 17(6):863-71；及Verbraecken,J.等人(2006年4月).Metabolism—Clinical and Experimental 55(4):515-24)。其他示例性BSA公式包括Mosteller公式(Mosteller RD.N Engl J Med.,1987；317:1098)、Haycock公式(HaycockGB等人，J Pediatr 1978,93:62-66)、Gehan及George公式(Gehan EA,George SL,CancerChemother Rep 1970,54:225-235)、Boyd公式(Current,JD(1998),The Internet Journalof Anesthesiology 2(2)；及Boyd,Edith(1935),University of Minnesota.TheInstitute of Child Welfare,Monograph Series,No.x.London:Oxford UniversityPress)、Fujimoto公式(Fujimoto S等人，Nippon Eiseigaku Zasshi 1968；5:443-50)、Takahira公式(Fujimoto S等人，Nippon Eiseigaku Zasshi 1968；5:443-50)及Schlich公式(Schlich E等人，
Figure BDA0001559815020000351
Umschau 2010；57:178-183)。
药物的“预防有效量”或“预防有效剂量”是在向处于发生疾病或患有疾病的复发的风险中的受试者单独施用或与另一治疗剂组合施用时抑制疾病发展或复发的药物的量。可使用多种本领域技术人员已知的方法、例如在临床试验期间在人类受试者中、在预测于人类中的效能的动物模型系统中或通过在体外分析中分析试剂的活性评估治疗或预防剂促进疾病消退或抑制疾病发展或复发的能力。
举例而言，抗癌剂系在受试者中减缓癌症进展或促进癌症消退的药物。在优选实施方案中，药物的治疗有效量促进癌症消退至消除癌症的程度。“促进癌症消退”意指单独或与抗肿瘤剂组合施用有效量的药物可减少肿瘤生长或大小、使肿瘤坏死、减少至少一种疾病症状的严重程度、增加无疾病症状的时段的频率及持续时间、防止因患病所致的损害或失能或以其他方式改善患者的疾病症状。药理学有效性是指药物促进患者中癌症消退的能力。生理安全性是指因药物施用引起的细胞、器官及/或生物体水平(不利效应)的毒性或其他不利生理效应的可接受的低程度。
举例而言，对于肿瘤的治疗，药物的治疗有效量或剂量优选相对于未治疗受试者将细胞生长或肿瘤生长抑制至少约20％、更佳至少约40％、更优选至少约60％，且进一步更优选至少约80％。在最优选实施方案中，药物的治疗有效量或剂量完全抑制细胞生长或肿瘤生长，即优选将细胞生长或肿瘤生长抑制100％。可使用下文所述的分析评估化合物抑制肿瘤生长的能力。或者，可通过检验化合物抑制细胞生长的能力评估组合物的此性质，该抑制可通过本领域技术人员已知的分析在体外测量。在本文所述的其他优选实施方案中，可观察到肿瘤消退且其可持续至少约20天、更优选至少约40天或更优选至少约60天的时段。
术语“患者”及“受试者”指接受预防性或治疗性治疗的任何人类或非人类动物。举例而言，本文所述方法及组合物可用于治疗患有癌症(例如晚期实体肿瘤)的受试者或患者。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物及非哺乳动物，例如非人类灵长类动物、羊、狗、牛、鸡、两栖动物、爬行类等。
在以下子部分中进一步详细阐述本文所述的各个实施方案。
I.抗OX40抗体
本文阐述了具有特定功能特征或性质的抗体，例如完全人抗体。举例而言，抗体特异性结合人OX40。另外，抗体可与来自一种或多种非人类灵长类动物的OX40(例如食蟹猴OX40)交叉反应。在用作单一疗法时或在与免疫-肿瘤药剂(例如抗PD-1抗体(例如，纳武单抗)或抗CTLA-4抗体(例如，伊匹单抗))组合使用时，此类抗体可用于治疗癌症。
本文所述抗OX40抗体展现以下功能性质中的一或多者或全部：
(1)结合可溶性人OX40，例如以10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)的KD结合，例如如通过
Figure BDA0001559815020000361
SPR分析所测量的；
(2)结合膜结合的人OX40，例如以1nM或更小(例如，0.01nM至1nM)的EC50结合，例如如通过FACS测量的；
(3)结合食蟹猴OX40，例如膜结合的食蟹猴OX40，例如以10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)的EC50结合，例如如通过FACS测量的；
(4)诱导或增强T细胞活化，如通过以下所证明：(i)表达OX40的T细胞中增加的IL-2及/或IFN-γ产生及/或(ii)增强的T细胞增殖；
(5)抑制OX40配体与OX40结合，例如如FACS测量的以1nM或更小的EC50结合，例如在利用hOX40-293细胞的测定中；
(6)结合成熟人OX40的细胞外部分上的表位(SEQ ID NO:2)，例如，在区域DVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO:178)或DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGK(SEQ IDNO:179)内的表位；
(7)与3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、18E9、8B11、20B3及20C1竞争结合人OX40；
(8)与6E1-1、6E1-2、14A2-1及14A2-2竞争结合人OX40。
优选地，抗体以高亲和力、例如以10-7M或更小、10-8M或更小、10-9M或更小、10-10M或更小、10-11M或更小、10-12M或更小、10-12M至10-7M、10-11M至10-7M、10-10M至10-7M或10-9M至10- 7M的KD结合OX40。在某些实施方案中，抗OX40抗体以(例如)如通过
Figure BDA0001559815020000371
SPR分析测定的10-7M或更小、10-8M或更小、10-9M(1nM)或更小、10-10M或更小、10-12M至10-7M、10-11M至10-7M、10-10M至10-7M、10-9M至10-7M或10-8M至10-7M的KD结合可溶性人OX40。在某些实施方案中，抗OX40抗体以(例如)如通过流式细胞术测定的10-7M或更小、10-8M或更小、10-9M(1nM)或更小、10-10M或更小、10-12M至10-7M、10-11M至10-8M、10-10M至10-8M、10-9M至10-8M、10-11M至10-9M或10-10M至10-9M的KD结合(例如)活化人类T细胞上的结合(例如，细胞膜结合)人OX40。在某些实施方案中，抗OX40抗体以(例如)如通过FACS测定的10-7M或更小、10-8M或更小、10-9M(1nM)或更小、10-10M或更小、10-12M至10-7M、10-11M至10-8M、10-10M至10-8M、10-9M至10-8M、10-11M至10-9M或10-10M至10-9M的EC50结合(例如)活化人类T细胞上的结合(例如，细胞膜结合)人OX40。在某些实施方案中，抗OX40抗体以10-7M或更小、10-8M或更小、10-9M(1nM)或更小、10-10M或更小、10-12M至10-7M、10-11M至10-7M、10-10M至10-7M、10-9M至10-7M或10-8M至10-7M的KD结合可溶性人OX40，且以10-7M或更小、10-8M或更小、10-9M(1nM)或更小、10-10M或更小、10-12M至10-7M、10-11M至10-8M、10-10M至10-8M、10-9M至10-8M、10-11M至10-9M或10-10M至10-9M的KD或EC50结合细胞膜结合的人OX40。
本文所述抗OX40抗体可例如如通过FACS所测量的(例如，如实施例中所述)以(例如)100nM或更小、10nM或更小、100nM至0.01nM、100nM至0.1nM、100nM至1nM或10nM至1nM的EC50结合食蟹猴OX40，例如结合膜结合的食蟹猴OX40。
本文所述抗OX40抗体可通过(例如)活化Teff细胞、限制T效应细胞由Treg细胞抑制、耗竭及/或抑制肿瘤Treg细胞及/或活化(例如)肿瘤中的NK细胞刺激或增强免疫反应。举例而言，抗OX40抗体可活化或共刺激Teff细胞，如通过(例如)增强的细胞因子(例如，IL-2及IFN-γ)分泌及/或增强的增殖所证明的。在某些实施方案中，亦提供CD3刺激。在某些实施方案中，OX40抗体将IL-2分泌增加50％、100％(即，2倍)、3倍、4倍、5倍或更大的倍数，视情况最大值为至多10倍、30倍、100倍，如(例如)原代人类T细胞或表达人OX40的T细胞上所测量(例如，如实施例中进一步阐述)。在某些实施方案中，OX40抗体将IFN-γ分泌增加50％、100％(即，2倍)、3倍、4倍、5倍或更大的倍数，视情况最大值为至多10倍、30倍、100倍，如(例如)原代人类T细胞或表达人OX40的T细胞上所测量(例如，如实施例中进一步阐述的)。
本文所述抗OX40抗体可以(例如)10nM或更小、1nM或更小、0.01nM至10nM、0.1nM至10nM或0.1nM至1nM的EC50抑制细胞(例如表达人OX40的293细胞(即，hOX40-293细胞))上人OX40L与人OX40的结合(参见实施例6)。
本文所述抗OX40抗体结合OX40上的表位，如(例如)通过结合人OX40的片段所测定的。举例而言，在某些实施方案中，抗体结合人OX40(SEQ ID NO:2)的序列DVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO:178)的全部或一部分，如(例如)通过HDX或通过抗体与人OX40的片段的结合、而后酶裂解所测定的(参见实施例11)。在其他实施方案中，抗体结合人OX40(SEQ ID NO:2)的序列DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGK(SEQ ID NO:179)的全部或一部分。
在某些实施方案中，本文所述的抗OX40抗体结合序列SQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO:182)的全部或一部分。
在其他实施方案中，本文所述的抗OX40抗体结合序列PCKPCTWCNLR(SEQ ID NO:183)的全部或一部分。
在其他实施方案中，结合序列DVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO:178)的全部或一部分的抗OX40抗体进一步结合序列QLCTATQDTVCR(SEQ ID NO:184)的全部或一部分。
在其他实施方案中，本文所述抗OX40抗体结合序列SQNTVCRPCGPGFYN(SEQ ID NO:185)的全部或一部分。
本文所述的抗OX40抗体与包含本文所述CDR或可变区的抗OX40抗体(例如3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及/或20C1)竞争结合OX40(或抑制此类抗OX40抗体的结合)。在某些实施方案中，抗OX40抗体将3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及/或20C1与人OX40的结合抑制至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在某些实施方案中，3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及20C1将抗OX40抗体与人OX40的结合抑制至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
在某些实施方案中，抗体经由(例如)FcR结合利用多价交联诱导或增强T细胞活化。在某些实施方案中，抗体是多价的，例如二价的。在某些实施方案中，抗体不是单价的。
在某些实施方案中，抗体具有1、2、3、4、5或6个以下特征：
(1)结合可溶性人OX40，例如以10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)的KD结合，例如如通过
Figure BDA0001559815020000391
SPR分析所测量的；
(2)结合膜结合的人OX40，例如以1nM或更小(例如，0.01nM至1nM)的EC50结合，例如如通过FACS测量的；
(3)结合食蟹猴OX40，例如膜结合的食蟹猴OX40，例如以10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)的EC50结合，例如如通过FACS测量的；
(4)诱导或增强T细胞活化，如通过以下所证明：(i)表达OX40的T细胞中增加的IL-2及/或IFN-γ产生及/或(ii)增强的T细胞增殖；
(5)抑制OX40配体与OX40结合，例如如FACS测量的以1nM或更小的EC50结合，例如在利用hOX40-293细胞的测定中；
(6)结合成熟人OX40的细胞外部分上的表位(SEQ ID NO:2)，例如，在区域DVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO:178)或DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGK(SEQ IDNO:179)内的表位；
(7)与3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、18E9、8B11、20B3及20C1竞争结合人OX40；
(8)与6E1-1、6E1-2、14A2-1及14A2-2竞争结合人OX40。
因此，如根据本领域已知的方法学测定并在本文中阐述的展现上述一种或多种功能性质(例如，生物化学、免疫化学、细胞、生理学或其他生物活性等)的抗体，应理解为指该特定活性相对于在抗体不存在下(或在存在不相关特异性的对照抗体时)观察到的活性的统计学上显著的差异。优选地，抗OX40抗体将所测量的参数(例如，T细胞增殖、细胞因子产生)增加所测量参数的至少10％、更佳至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％(即2倍)、3倍、5倍或10倍。相反，抗体可将所测量参数(例如，肿瘤体积、OX40-L与OX40的结合、肿瘤中调控性T细胞的量)减少所测量参数的至少10％、更佳至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％、95％或99％。
本领域已知用于评估抗体对不同物种的OX40的结合亲和力的标准测定，包括(例如)ELISA、Western印迹及RIA。适宜分析详细阐述于实施例中。亦可通过本领域已知的标准测定(例如通过
Figure BDA0001559815020000401
SPR分析)评估抗体的结合动力学(例如，结合亲和力)。用于评估抗体对OX40的功能性质(例如，配体结合、T细胞增殖、细胞因子产生)的效应的测定更详细阐述于下文及实施例中。
在某些实施方案中，抗OX40抗体不是天然抗体或不是天然存在的抗体，例如，抗OX40抗体具有不同于那些天然存在的抗体的翻译后修饰，其不同之处在于(例如)具有更多、更少或不同类型的翻译后修饰。
II.示例性抗OX40抗体
本文所述特定抗体是具有抗体3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及20C1的CDR及/或可变区序列的如实施例1中所述分离的并在结构上表征的抗体(例如单克隆抗体)，以及与抗体3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及20C1的可变区或CDR序列具有至少80％同一性(例如，至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性)的抗体。3F4、14B6(14B6-1及14B6-2)、23H3、6E1(6E1-1及6E1-2)、18E9、8B11、20B3、14A2(14A2-1及14A2-2)及20C1的VH氨基酸序列分别阐述于SEQ ID NO:17、28、37、48、57、65、73、84及93中。3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及20C1的VL氨基酸序列分别阐述于SEQ IDNO:18、29、30、38、49、50、58、66、74、85、86及94中。
因此，本文提供包含重链及轻链可变区的抗体或其抗原结合部分，其中重链可变区包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:17、28、37、48、57、65、73、84及93。
亦提供包含重链及轻链可变区的抗体或其抗原结合部分，其中轻链可变区包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:18、29、30、38、49、50、58、66、74、85、86及94。
本文提供包含以下的抗体或其抗原结合部分：包含SEQ ID NO:17及18；28及29；28及30；37及38；48及49；48及50；57及58；65及66；73及74；84及85；84及86；93及94的重链及轻链可变区序列。
本文所述抗OX40抗体可包含3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及20C1或其组合的重链及轻链CDR1、CDR2及CDR3。3F4、14B6(14B6-1及14B6-2)、23H3、6E1(6E1-1及6E1-2)、18E9、8B11、20B3、14A2(14A2-1及14A2-2)及20C1的VHCDR1的氨基酸序列分别阐述于SEQ ID NO:11、19、31、39、51、59、67、75及87中。3F4、14B6(14B6-1及14B6-2)、23H3、6E1(6E1-1及6E1-2)、18E9、8B11、20B3、14A2(14A2-1及14A2-2)及20C1的VH CDR2的氨基酸序列分别阐述于SEQ ID NO:12、20、32、40、52、60、68、76及88中。3F4、14B6(14B6-1及14B6-2)、23H3、6E1(6E1-1及6E1-2)、18E9、8B11、20B3、14A2(14A2-1及14A2-2)及20C1的VH CDR3的氨基酸序列阐述于SEQ ID NO:13、21、33、41、53、61、69、77及89中。3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及20C1的VLCDR1的氨基酸序列分别阐述于SEQ ID NO:14、22、25、34、42、45、54、62、70、78、81及90中。3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及20C1的VLCDR2的氨基酸序列分别阐述于SEQ ID NO:15、23、26、35、43、46、55、63、71、79、82及91中。3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及20C1的VLCDR3的氨基酸序列分别阐述于SEQ ID NO:16、24、27、36、44、47、56、64、72、80、83及92中。CDR区系使用Kabat系统绘出了(Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第五版，美国卫生及公共服务部，NIH公开案第91-3242号)。
考虑到此类抗体中的每一者皆结合OX40，且抗原结合特异性主要由CDR1区、2区及3区提供，可“混合并匹配”VH CDR1、2及3序列及VL CDR1、2及3序列(即可混合并匹配来自不同抗体的CDR，但每一抗体必须含有VHCDR1、2及3及VL CDR1、2及3)以产生其他抗OX40结合抗体。可使用上文及实施例中所阐述的结合分析(例如ELISA)来测试此类“混合并匹配”抗体的OX40结合。优选地，在混合并匹配VH CDR序列时，来自特定VH序列的CDR1、CDR2及/或CDR3序列经结构上类似的CDR序列置换。同样，在混合并匹配VL CDR序列时，来自特定VL序列的CDR1、CDR2及/或CDR3序列经结构上类似的CDR序列置换。本领域普通技术人员将容易地明了，可通过用来自针对单克隆抗体3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及20C1的本文公开的CDR序列的结构上类似的序列取代一个或多个VH及/或VLCDR区序列来产生新颖VH及VL序列。具有等效于或优于本文所公开特异性抗体的结合亲和性、生物活性及/或其他性质的“混合并匹配”的抗体可经选择用于本发明方法中。
本文提供分离的抗体或其抗原结合部分，其包含：
(a)包含选自下组的氨基酸序列的重链可变区CDR1：SEQ ID NO:11、19、31、39、51、59、67、75及87；
(b)包含选自下组的氨基酸序列的重链可变区CDR2：SEQ ID NO:12、20、32、40、52、60、68、76及88；
(c)包含选自下组的氨基酸序列的重链可变区CDR3：SEQ ID NO:13、21、33、41、53、61、69、77及89；
(d)包含选自下组的氨基酸序列的轻链可变区CDR1：SEQ ID NO:14、22、25、34、42、45、54、62、70、78、81及90；
(e)包含选自下组的氨基酸序列的轻链可变区CDR2：SEQ ID NO:15、23、26、35、43、46、55、63、71、79、82及91；及
(f)包含选自下组的氨基酸序列的轻链可变区CDR3：SEQ ID NO:16、24、27、36、44、47、56、64、72、80、83及92；
其中抗体特异性结合人OX40。
在一个实施方案中，抗体包含重链及轻链可变区，其中重链可变区CDR1,CDR2及CDR3区分别包含：SEQ ID NO:11-13；19-21；31-33；39-41；51-53；59-61；67-69；74-77；87-89；及87、317及89；
其中抗体特异性结合人OX40。
在另一实施方案中，抗体包含重链及轻链可变区，其中轻链可变区CDR1,CDR2及CDR3区分别包含：SEQ ID NO:14-16；22-24；25-27；34-36；42-44；45-47；54-56；62-64；70-72；78-80；81-83；及90-92；
其中抗体特异性结合人OX40。
在具体实施方案中，抗体包含重链及轻链可变区，其中抗体包含：
(a)分别包含SEQ ID NO:87、317及89的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQ ID NO:90-92的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(b)分别包含SEQ ID NO:11-13的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQID NO:14-16的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(c)分别包含SEQ ID NO:19-21的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQID NO:22-24的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(d)分别包含SEQ ID NO:19-21的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQID NO:25-27的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(e)分别包含SEQ ID NO:31-33的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQID NO:34-36的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(f)分别包含SEQ ID NO:39-41的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQID NO:42-44的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(g)分别包含SEQ ID NO:39-41的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQID NO:45-47的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(h)分别包含SEQ ID NO:51-53的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQID NO:54-56的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(i)分别包含SEQ ID NO:59-61的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQID NO:62-64的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(j)分别包含SEQ ID NO:67-69的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQID NO:70-72的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(k)分别包含SEQ ID NO:75-77的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQID NO:78-80的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(l)分别包含SEQ ID NO:75-77的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQID NO:81-83的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；或
(m)分别包含SEQ ID NO:87-89的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQID NO:90-92的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
其中抗体特异性结合人OX40。
在另一实施方案中，抗体包含重链及轻链可变区，其中抗体包含：
(a)分别由SEQ ID NO:87、317及89组成的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别由SEQ ID NO:90-92组成的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(b)分别由SEQ ID NO:11-13组成的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别由SEQID NO:14-16组成的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(c)分别由SEQ ID NO:19-21组成的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别由SEQID NO:22-24组成的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(d)分别由SEQ ID NO:19-21组成的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别由SEQID NO:25-27组成的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(e)分别由SEQ ID NO:31-33组成的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别由SEQID NO:34-36组成的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(f)分别由SEQ ID NO:39-41组成的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别由SEQID NO:42-44组成的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(g)分别由SEQ ID NO:39-41组成的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别由SEQID NO:45-47组成的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(h)分别由SEQ ID NO:51-53组成的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别由SEQID NO:54-56组成的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(i)分别由SEQ ID NO:59-61组成的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别由SEQID NO:62-64组成的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(j)分别由SEQ ID NO:67-69组成的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别由SEQID NO:70-72组成的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(k)分别由SEQ ID NO:75-77组成的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别由SEQID NO:78-80组成的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(l)分别由SEQ ID NO:75-77组成的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别由SEQID NO:81-83组成的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；或
(m)分别由SEQ ID NO:87-89组成的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别由SEQID NO:90-92组成的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列。
本文所述的VH结构域或其一个或多个CDR可连接至恒定结构域用于形成重链，例如全长重链。类似地，本文所述的VL结构域或其一个或多个CDR可连接至恒定结构域用于形成轻链，例如全长轻链。全长重链(C-末端赖氨酸(K)除外或C-末端甘氨酸及赖氨酸(GK)除外，此二者可不存在)及全长轻链组合以形成全长抗体。N-末端谷氨酰胺及谷氨酸残基亦可在轻链及重链上转化成焦谷氨酸残基。
本文所述VH结构域可融合至人类IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，天然的或经修饰的，如本文所述的)的恒定结构域。举例而言，重链可包含：本文所述的任何VH结构域的氨基酸序列，与阐述于SEQ ID NO:5中的人类IgG1氨基酸序列融合。
人类IgG1恒定结构域亦可为异型变体的恒定结构域。举例而言，IgG1的异型变体包含R107K、E189D及M191L(在上文中加下划线，且编号系根据SEQ ID NO:6中的编号)。在全长重链区内，此类氨基酸取代编号为R214K、E356D及M358L。
本文所述VL结构域可融合至人类κ或λ轻链的恒定结构域。举例而言，轻链可包含：本文所述的任何VL结构域的氨基酸序列，与阐述于SEQ ID NO:7中的人类IgG1κ轻链氨基酸序列融合。
在某些实施方案中，重链恒定区在C-末端处包含赖氨酸或另一氨基酸，例如，其包含以下最终氨基酸：对于重链为LSPGK(SEQ ID NO:8)。在某些实施方案中，重链恒定区在C-末端处缺乏一个或多个氨基酸，且具有(例如)C-末端序列LSPG(SEQ ID NO:9)或LSP。
示例性重链及轻链的氨基酸序列阐述于表23中且对于重链对应于SEQ ID NO:95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、124及125且对于轻链对应于SEQ ID NO:96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120及122。
包含与阐述于表23中的重链或轻链中的任一者(或其可变区)至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％或70％同一的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:95及96；97及98；99及100；101及102；103及104；105及106；107及108；109及110；111及112；113及114；115及116；117及118；119及120；121及122；123及116；124及116；及125及116)的重链及轻链可用于形成具有期望特征(例如本文中进一步阐述的那些)的抗人OX40抗体。示例性的变体包含(例如)恒定结构域的异型变化及/或可变区或恒定区的突变(例如本文公开的突变)。包含与表23中阐述的重链或轻链中的任一者(或其可变区)至多1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2或1个氨基酸不同(通过取代、添加或缺失)的氨基酸序列的重链及轻链可用于形成具有期望特征(例如本文进一步阐述的那些)的抗人OX40抗体。
在各个实施方案中，上述抗体展现以下功能性质中的一或多者、两者或更多者、三者或更多者、四者或更多者、五者或更多者、六者或更多者或全部：
(1)结合可溶性人OX40，例如以10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)的KD结合，例如如Biacore测定的；
(2)结合膜结合的人OX40，例如以1nM或更小(例如，0.01nM至1nM)的EC50结合，例如如通过FACS测量的；
(3)结合食蟹猴OX40，例如膜结合的食蟹猴OX40，例如以10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)的EC50结合，例如如通过FACS测量的；
(4)诱导或增强T细胞活化，如通过以下所证明的：(i)表达OX40的T细胞中增加的IL-2及/或IFN-γ产生及/或(ii)增强的T细胞增殖；
(5)抑制OX40配体与OX40结合，例如如FACS测量的以1nM或更小的EC50结合，例如在利用hOX40-293细胞的测定中；
(6)结合成熟人OX40的细胞外部分上的表位(SEQ ID NO:2)，例如，在区域DVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO:178)或DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGK(SEQ IDNO:179)内的表位；
(7)与3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、18E9、8B11、20B3及20C1竞争结合人OX40；
(8)与6E1-1、6E1-2、14A2-1及14A2-2竞争结合人OX40。
此类抗体包括(例如)人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
在某些实施方案中，本文所述抗OX40抗体结合成熟人OX40(SEQ ID NO:2)的以下区内的氨基酸残基：
DVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO:178)，
对应于成熟人OX40(SEQ ID NO:2)的氨基酸残基46-62。
在某些实施方案中，本文所述抗OX40抗体结合成熟人OX40(SEQ ID NO:2)的以下区内的氨基酸残基：
DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGK(SEQ ID NO:179)，
对应于成熟人OX40(SEQ ID NO:2)的氨基酸残基89-124。
在某些实施方案中，结合序列DVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO:178)的全部或一部分的本文所述抗OX40抗体结合序列SQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO:182)的全部或一部分。
在其他实施方案中，结合序列DVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO:178)的全部或一部分的本文所述抗OX40抗体结合序列PCKPCTWCNLR(SEQ ID NO:183)的全部或一部分。
在其他实施方案中，结合序列DVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO:178)的全部或一部分的抗OX40抗体进一步结合序列QLCTATQDTVCR(SEQ ID NO:184)的全部或一部分。
在其他实施方案中，结合序列DVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO:178)的全部或一部分的本文所述抗OX40抗体进一步结合序列SQNTVCRPCGPGFYN(SEQ ID NO:185)的全部或一部分。
本文所述抗OX40抗体的重链恒定区可属任一同型，例如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4或其组合及/或其修饰形式。在某些实施方案中，抗OX40抗体包含改变抗体的性质的经修饰重链恒定区。
如本文及实施例中进一步论述的，抗OX40抗体与未经修饰的hIgG1恒定区(hIgG1同型抗体)的交联可诱导OX40信号传导并促进T细胞活化，并尤其促进T细胞增殖、IFN-γ分泌及IL-2分泌。交联可通过，例如，在利用CHO-CD3-CD32A细胞及人类原代CD4T细胞的共培养物的测定中结合在经转染的CHO细胞的表面上表达的人类CD32A Fcγ受体(FcγR)而发生。交联亦可通过，例如，在葡萄球菌肠毒素B(SEB)活化的人类外周血单个核细胞(PBMC)的培养物中添加可溶性多克隆抗人Fcγ抗体而发生。
具有经修饰的重链恒定区(例如，IgG1恒定区，其中CH1/铰链区被hIgG2CH1/铰链区置换)的抗OX40抗体相对于具有完全IgG1重链恒定区的抗体可具有改变抗体的活性的能力。可被改变的示例性活性包括，但不限于，(1)在交联存在或不存在下的T细胞活化，(2)在交联存在或不存在下的T细胞增殖，及/或(3)在交联存在或不存在下的细胞因子分泌(例如，IFN-γ、IL-2)。实施例中所述的方法可用于确定具有经修饰重链恒定区的抗OX40抗体是否展现此类改变的活性(例如，参见实施例27)。在优选实施方案中，此类改变活性不显著影响抗体的抗原结合性质，所述抗原结合性质可使用例如FACS、SPR评估。
因此，本文提供改变抗OX40抗体的活性的方法，所述方法包括：提供具有非IgG2铰链的抗OX40抗体、并用IgG2铰链置换非IgG2铰链。在某些实施方案中，经修饰的重链恒定区包含IgG2同型的铰链(“IgG2铰链”)及CH1、CH2及CH3结构域。在某些实施方案中，经修饰的重链恒定区包含IgG2铰链及CH1、CH2及CH3结构域，其中CH1、CH2及CH3结构域中的至少一者不属IgG2同型。IgG2铰链可为野生型IgG2铰链，例如野生型人类IgG2铰链(例如，ERKCCVECPPCPAPPVAG；SEQ ID NO:208)或其变体，条件是该IgG2铰链保留赋予抗体相对于包含非IgG2铰链的相同抗体改变的活性的能力。在某些实施方案中，IgG2铰链变体保留与野生型IgG2铰链类似的刚性(rigidity)或劲度(stiffness)。铰链的刚性可通过，例如，下述手段来测量：计算机建模、电子显微术、光谱(例如核磁共振(NMR))、X射线结晶照相术(B-因子)或测定或比较包含铰链的抗体的回转半径的沉降速度分析超离心(AUC)。若包含某一铰链的某一抗体在上一句中所述的任一种测试获得的值与具有不同铰链(例如IgG1铰链)的相同抗体的值相差小于5％、10％、25％、50％、75％或100％，则该铰链相对于另一铰链可能具有类似的或较高的刚性。本领域普通技术人员可以通过解释此类测试的结果来确定铰链是否具有与另一铰链至少类似的刚性。示例性的人类IgG2铰链变体在四个半胱氨酸残基(即，C219、C220、C226及C229)中的一个或多个上包含取代的IgG2铰链。半胱氨酸可被丝氨酸置换。示例性IgG2铰链是包含C219S突变的人类IgG2铰链(例如，ERKSCVECPPCPAPPVAG；SEQ ID NO:209)。可使用的其他IgG2铰链变体包括：包含C220、C226及/或C229取代(例如C220S、C226S或C229S突变(其可与C219S突变组合))的人类IgG2铰链。IgG2铰链亦可为这样的IgG2铰链，其一部分属于另一同型的铰链(即为嵌合铰链)，条件是嵌合铰链的刚性至少类似于野生型IgG2铰链的刚性。举例而言，IgG2铰链可为这样的IgG2铰链：其下铰链(如表2中所定义)属IgG1同型，而且是(例如)野生型IgG1下铰链。可用于IgG2铰链中的其他IgG2铰链突变包括SE(S267E)、SELF(S267E/L328F)、SDIE(S239D/I332E)、SEF及GASDALIE(G236A/S239D/A330L/I332E)突变。
若“杂合”或“嵌合”铰链的一半以上的连续氨基酸来自某种同型，则称该铰链属于该同型。举例而言，将具有IgG2的上铰链及中铰链、及IgG1的下铰链的铰链视为IgG2铰链。
在某些实施方案中，抗OX40抗体包含包括IgG2铰链的经修饰重链恒定区，该IgG2铰链包含以下序列中的一者：
ERKCCVECPPCPAPPVAG(SEQ ID NO:208)；
ERKSCVECPPCPAPPVAG(SEQ ID NO:209)；
ERKCSVECPPCPAPPVAG(SEQ ID NO:210)；
ERKXCVECPPCPAPPVAG(SEQ ID NO:211)；
ERKCXVECPPCPAPPVAG(SEQ ID NO:212)；
ERKCCVECPPCPAPPVAGX(SEQ ID NO:213)；
ERKSCVECPPCPAPPVAGX(SEQ ID NO:214)；
ERKCSVECPPCPAPPVAGX(SEQ ID NO:215)；
ERKXCVECPPCPAPPVAGX(SEQ ID NO:216)；
ERKCXVECPPCPAPPVAGX(SEQ ID NO:217)；
ERKCCVECPPCPAPELLGG(SEQ ID NO:218)；
ERKSCVECPPCPAPELLGG(SEQ ID NO:219)；
ERKCCSVECPPCPAPELLGG(SEQ ID NO:220)；
ERKXCVECPPCPAPELLGG(SEQ ID NO:221)；
ERKCXVECPPCPAPELLGG(SEQ ID NO:222)；
ERKCCVECPPCPAPELLG(SEQ ID NO:223)；
ERKSCVECPPCPAPELLG(SEQ ID NO:224)；
ERKCCSVECPPCPAPELLG(SEQ ID NO:225)；
ERKXCVECPPCPAPELLG(SEQ ID NO:226)；
ERKCXVECPPCPAPELLG(SEQ ID NO:227)；
ERKCCVECPPCPAP(SEQ ID NO:228)；
ERKSCVECPPCPAP(SEQ ID NO:229)；
ERKCSVECPPCPAP(SEQ ID NO:230)；
ERKXCVECPPCPAP(SEQ ID NO:231)；或
ERKCXVECPPCPAP(SEQ ID NO:232)，
其中X是除半胱氨酸外的任何氨基酸，
或上述序列中的任一者，其中1-5、1-3、1-2或1个氨基酸插入在氨基酸残基CVE与CPP之间。在某些实施方案中，插入THT或GGG。在某些实施方案中，1、1-2或1-3个氨基酸插入在铰链与CH2结构域之间。举例而言，甘氨酸可插在铰链与CH2结构域之间。
在某些实施方案中，铰链包含SEQ ID NO:208、209、210、211或212，其中1、2、3或所有4个氨基酸P233、V234、A235及G237(对应于C-末端4个氨基酸“PVAG”(SEQ ID NO:233)缺失或被另一氨基酸(例如，IgG1铰链(ELLG(SEQ ID NO:234)或ELLGG(SEQ ID NO:235)的C-末端的氨基酸)取代。在某些实施方案中，铰链包含SEQ ID NO:208、209、210、211或212，其中V234、A235及G237缺失或被另一氨基酸取代。在某些实施方案中，铰链包含SEQ ID NO:208、209、210、211或212，其中A235及G237缺失或被另一氨基酸取代。在某些实施方案中，铰链包含SEQ ID NO:208,209,210,211或212，其中G237缺失或被另一氨基酸取代。在某些实施方案中，铰链包含SEQ ID NO:447、448、449、450或451，其中V234及A235缺失或被另一氨基酸取代。IgG2中的PVAG(SEQ ID NO:233)被IgG1铰链的相应氨基酸(即ELLG(SEQ ID NO:234)或ELLGG(SEQ ID NO:235))取代以获得上文所示杂合铰链，其是具有IgG2铰链的优点及IgG1铰链的效应物功能的铰链。
在某些实施方案中，经修饰的重链恒定区包含由上文所示序列中的一者(例如SEQID NO:208-232中的任一者)组成或基本上由其组成的铰链，且在某些实施方案中，不包含其他铰链氨基酸残基。
在某些实施方案中，经修饰重链恒定区包含CH1结构域，其是IgG1或IgG2同型的野生型CH1结构域(分别是“IgG1 CH1结构域”或“IgG2 CH1结构域”)。亦可使用同型IgG3及IgG4的CH1结构域(分别是“IgG3 CH1结构域”及“IgG2 CH1结构域”)。CH1结构域亦可为野生型CH1结构域的变体，例如野生型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 CH1结构域的变体。CH1结构域的示例性变体包括A114C及T173C及/或C131，例如C131S。
在某些实施方案中，经修饰重链恒定区包含CH2结构域，其为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型的野生型CH2结构域(分别“IgG1 CH2结构域”、“IgG2 CH2结构域”、“IgG3 CH2结构域”或“IgG4 CH2结构域”)。CH2结构域亦可为野生型CH2结构域的变体，例如野生型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 CH2结构域的变体。CH2结构域的示例性变体包括调节抗体的Fc区的生物活性(例如ADCC或CDC)或调节抗体的半衰期或其稳定性的变体。在一个实施方案中，CH2结构域为具有A330S及P331S突变的人类IgG1 CH2结构域，其中CH2结构域相对于无突变的相同CH2结构域具有降低的效应物功能。本文别处进一步阐述了其他突变。
在某些实施方案中，经修饰重链恒定区包含CH3结构域，其为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型的野生型CH3结构域(分别“IgG1 CH3结构域”、“IgG2 CH3结构域”、“IgG3 CH3结构域”或“IgG4 CH3结构域”)。CH3结构域亦可为野生型CH3结构域的变体，例如野生型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 CH3结构域的变体。CH3结构域的示例性变体包括调节抗体的Fc区的生物活性(例如ADCC或CDC)或调节抗体的半衰期或其稳定性的变体。
通常，CH1、铰链、CH2或CH3结构域的变体可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个突变、及/或至多10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个突变、或1-10或1-5个突变，或包含与相应野生型结构域(分别CH1、铰链、CH2或CH3结构域)的氨基酸序列至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列，条件是包含特异性变体的重链恒定区保留必需的生物活性。
表3给出了包含人类CH1、铰链、CH2及/或CH3结构域的示例性人类重链恒定区，其中每一结构域是给重链恒定区提供期望的生物活性的野生型结构域或其变体。表3中的未填充单元指示结构域可存在或不存在，且若存在则可属任一同型，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。举例而言，包含表3中的重链恒定区1的抗体的重链恒定区至少包含IgG2铰链，亦可包含CH1、CH2及/或CH3结构域，而且如果该CH1、CH2及/或CH3结构域存在，则属于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型。作为用于理解表3的另一实例，包含重链恒定区8的抗体的重链恒定区包含IgG1 CH1结构域、及IgG2铰链、IgG1 CH2结构域，其亦可包含或不包含CH3结构域，若CH3结构域存在，可属于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型。
表3.人类重链恒定区的示例性构型
Figure BDA0001559815020000511
Figure BDA0001559815020000521
*经修饰的重链恒定区
在某些实施方案中，抗OX40抗体包含表3中所示的重链恒定区且可相对于包含不包含该特定重链恒定区的重链恒定区的相同抗体具有改变的活性。在某些实施方案中，包含表3或4中所示的重链恒定区的抗体可相对于包含不包含IgG2铰链或相同IgG2铰链的重链恒定区的相同抗体具有改变的活性。在某些实施方案中，包含表3或4中所示的重链恒定区的抗体可相对于包括包含非IgG2铰链且包含(例如)IgG1、IgG3或IgG4铰链的重链恒定区的相同抗体具有改变的活性。在某些实施方案中，包含表3或4中所示的重链恒定区的抗体可相对于包含不包含相同CH1、铰链、CH2或CH3结构域中的一或多者的重链恒定区的相同抗体具有改变的活性。举例而言，在某些实施方案中，包含表3或4中所示的重链恒定区的抗体可相对于包含不包含IgG2铰链及特定同型的CH1、CH2及/或CH3结构域的重链恒定区的相同抗体具有改变的活性。举例而言，包含表3中所示重链恒定区22的抗体可相对于以下抗体具有改变的活性：(i)包含不包含IgG2铰链且包含(例如)非IgG2铰链(例如，IgG1,IgG3或IgG4铰链)的重链恒定区的相同抗体；(ii)包含不包含IgG2铰链及IgG1CH1且包含(例如)非IgG2铰链及/或非IgG1 CH1的重链恒定区的相同抗体；(iii)包含不包含IgG2铰链及IgG2 CH2且包含(例如)非IgG2铰链及/或非IgG2 CH2的重链恒定区的相同抗体；(iv)包含不包含IgG2铰链及IgG1 CH3且包含(例如)非IgG2铰链及/或非IgG1 CH3的重链恒定区的相同抗体；(v)包含不包含IgG2铰链、IgG1 CH1及IgG2 CH2且包含(例如)非IgG2铰链及/或非IgG1 CH1及/或非IgG2 CH2的重链恒定区的相同抗体；(vi)包含不包含IgG2铰链、IgG1 CH1及IgG1 CH3且包含(例如)非IgG2铰链及/或非IgG1 CH1及/或非IgG1 CH3的重链恒定区的相同抗体；(vii)包含不包含IgG2铰链、IgG2 CH2及IgG1 CH3且包含(例如)非IgG2铰链及/或非IgG2CH及/或非IgG1 CH3的重链恒定区的相同抗体；(viii)或包含不包含IgG2铰链、IgG1 CH1、IgG2 CH2及IgG1 CH3且包含(例如)非IgG2铰链及/或非IgG1 CH1及/或非IgG2 CH2及/或非IgG1 CH3的重链恒定区的相同抗体。
可连接至抗OX40可变区(例如本文所述的可变区)的示例性经修饰重链恒定区提供于表4中，其阐述结构域中的每一者的身份。
表4：示例性经修饰重链恒定区
Figure BDA0001559815020000531
Figure BDA0001559815020000541
其他示例性的经修饰的重链恒定区提供于表5中。
表5.
Figure BDA0001559815020000542
在某些实施方案中，抗OX40抗体包含经修饰的重链恒定区，其包括包含SEQ IDNO:238、239、240、241及208-232中的任一者的IgG2铰链或其变体，例如包含如下氨基酸序列的IgG2铰链：(i)与SEQ ID NO:238、239、240、241及208-232中的任一者有1、2、3、4或5个氨基酸取代、添加或缺失不同；(ii)与238、239、240、241及208-232中的任一者有至多5、4、3、2或1个氨基酸取代、添加或缺失不同；(iii)与SEQ ID NO:238、239、240、241及208-232中的任一者有1-5、1-3、1-2、2-5或3-5个氨基酸取代、添加或缺失不同及/或(iv)包含与SEQID NO:238、239、240、241及208-232中的任一者至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列，其中在(i)-(iv)中的任一者中，氨基酸取代可为保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代；且其中经修饰重链恒定区为抗OX40抗体提供相对于另一重链恒定区(例如包含非IgG2铰链的重链恒定区)或相对于包含非IgG2铰链的相同经修饰重链恒定区改变的活性。
在某些实施方案中，抗OX40抗体包含经修饰的重链恒定区，其包括包含SEQ IDNO:202的IgG1 CH1结构域或包含SEQ ID NO:203或者SEQ ID NO:202或203的变体的IgG2CH1结构域，该变体(i)与SEQ ID NO:202或203有1、2、3、4或5个氨基酸取代、添加或缺失不同；(ii)与SEQ ID NO:202或203有至多5、4、3、2或1个氨基酸取代、添加或缺失不同；(iii)与SEQ ID NO:202或203有1-5、1-3、1-2、2-5或3-5个氨基酸取代、添加或缺失不同及/或(iv)包含与SEQ ID NO:202或203至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列，其中在(i)-(iv)中的任一者中，氨基酸取代可为保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代；且其中包含经修饰重链恒定区的抗OX40抗体可具有相对于具有另一重链恒定区(例如包含非IgG2铰链的重链恒定区)的抗OX40抗体或相对于包含非IgG2铰链的相同经修饰重链恒定区改变的活性。
在某些实施方案中，抗OX40抗体包含经修饰的重链恒定区，其包括包含SEQ IDNO:204或298或者SEQ ID NO:204或298的变体的IgG1 CH2结构域，该变体(i)与SEQ ID NO:204或298有1、2、3、4或5个氨基酸取代、添加或缺失不同；(ii)与SEQ ID NO:204或298有至多5、4、3、2或1个氨基酸取代、添加或缺失不同；(iii)与SEQ ID NO:204或298有1-5、1-3、1-2、2-5或3-5个氨基酸取代、添加或缺失不同及/或(iv)包含与SEQ ID NO:204或298至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列，其中在(i)-(iv)中的任一者中，氨基酸取代可为保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代；且其中经修饰重链恒定区可为抗OX40抗体提供相对于另一重链恒定区(例如包含非IgG2铰链的重链恒定区)或相对于包含非IgG2铰链的相同经修饰重链恒定区改变的活性。
在某些实施方案中，抗OX40抗体包含经修饰的重链恒定区，其包括包含SEQ IDNO:206或SEQ ID NO:206的变体的IgG1 CH3结构域，该变体(i)与SEQ ID NO:206有1、2、3、4或5个氨基酸取代、添加或缺失不同；(ii)与SEQ ID NO:206有至多5、4、3、2或1个氨基酸取代、添加或缺失不同；(iii)与SEQ ID NO:206有1-5、1-3、1-2、2-5或3-5个氨基酸取代、添加或缺失不同及/或(iv)包含与SEQ ID NO:206至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列，其中在(i)-(iv)中的任一者中，氨基酸取代可为保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代；且其中经修饰重链恒定区可提供相对于另一重链恒定区(例如包含非IgG2铰链的重链恒定区)或相对于包含非IgG2铰链的经修饰重链恒定区改变的活性。
经修饰重链恒定区亦可包含上述CH1、铰链、CH2及CH3结构域的组合。
在某些实施方案中，抗OX40抗体包含经修饰的重链恒定区，其包含SEQ ID NO:244-281中的任一者或SEQ ID NO:244-281中的任一者的变体，该变体(i)与SEQ ID NO:244-281中的任一者有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸取代、添加或缺失不同；(ii)与SEQ ID NO:244-281中的任一者有至多10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸取代、添加或缺失不同；(iii)与SEQ ID NO:244-281有1-5、1-3、1-2、2-5、3-5、1-10或5-10个氨基酸取代、添加或缺失不同及/或(iv)包含与SEQ ID NO:244-281中的任一者至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列，其中在(i)-(iv)中的任一者中，氨基酸取代可为保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代；且其中经修饰重链恒定区可提供相对于另一重链恒定区(例如包含非IgG2铰链的重链恒定区)或相对于包含非IgG2铰链的相同经修饰重链恒定区改变的活性。
经修饰的重链恒定区可具有(i)相对于野生型重链恒定区类似、降低或增加的效应物功能(例如，结合FcγR)及或(ii)相对于野生型重链恒定区类似、降低或增加的半衰期(或结合FcRn受体)。
III.具有特定种系序列的抗体
在某些实施方案中，本文所述的抗OX40抗体包含来自特定种系重链免疫球蛋白基因的重链可变区及/或来自特定种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。
如本发明的实施例中所论述的，已经制备了对OX40具有特异性的人抗体，其包含是下述基因的产物、或源自下述基因的重链可变区：人类种系VH 1-08基因、VH 6-6基因、VH5-51基因、VH 3-9基因、VH DP44基因、VH 3-30.3基因、VH 3-10基因及/或VH 3-13基因。因此，本文提供对人OX40具有特异性的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含是选自下组的人类VH种系基因的产物、或源自下述基因的重链可变区：VH 1-08基因、VH 6-6基因、VH 5-51基因、VH 3-9基因、VH DP44基因、VH 3-30.3基因、VH 3-10基因及VH 3-13基因。
已经制备了对OX40具有特异性的人抗体，其包含是下述基因的产物、或源自下述基因的轻链可变区：人类种系VK L5基因、VK L6基因、VK LI5基因、VK A27基因及/或VKO14/O4基因。因此，本文提供分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含是选自下组的人类VK种系基因的产物、或源自下述基因的轻链可变区：VK L5基因、VK L6基因、VK LI5基因、VK A27基因及VK O14/O4基因。
本文所述优选抗体包含是上文所列举人类种系VH基因中之一的产物或源自上文所列举人类种系VH基因中之一的重链可变区、且包含是上文所列举人类种系VK基因中之一的产物或源自上文所列举人类种系VK基因中之一的轻链可变区。
如本文所用的，若抗体的可变区自使用人类种系免疫球蛋白基因的系统获得，则人抗体包含系特定种系序列的“产物”或“源自”其的重链或轻链可变区。此类系统包括利用所关注的抗原对携带人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠实施免疫或利用所关注抗原筛选展示于噬菌体上的人类免疫球蛋白基因文库。为人类种系免疫球蛋白序列的“产物”或“源自”人类种系免疫球蛋白序列的人抗体可通过以下方式来鉴定：比较人抗体的氨基酸序列与人类种系免疫球蛋白的氨基酸序列，并选择序列最接近人抗体序列(即最大同一性％)的人类种系免疫球蛋白序列。为特定人类种系免疫球蛋白序列的“产物”或“源自”特定人类种系免疫球蛋白序列的人抗体与种系序列相比可含有氨基酸差异，这是由于存在(例如)天然体细胞突变或有意引入的定点突变。然而，所选定的人抗体的氨基酸序列通常与由人类种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少90％同一，且含有当与其他物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如鼠类种系序列)相比时将人抗体鉴定为人类的氨基酸残基。在某些情形下，人抗体的氨基酸序列可与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少95％、或甚至至少96％、97％、98％或99％同一。通常，源自特定人类种系序列的人抗体将展示与由人类种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不超过10个的氨基酸差异。在某些情形下，人抗体可展示与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不超过5个或甚至不超过4个、3个、2个或1个的氨基酸差异。
IV.同源抗体
本文提供具有重链及轻链可变区的抗体，此类重链及轻链可变区包含与本文所述优选抗体的氨基酸序列同源的氨基酸序列，且其中抗体保留本文所述抗OX40抗体的期望功能性质。
举例而言，分离的抗OX40抗体或其抗原结合部分可包含重链可变区及轻链可变区，其中：
(a)重链可变区包含与选自下组的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列：SEQ ID NO:318、17、28、37、48、57、65、73、84及93，或相对于选自下组的氨基酸序列包含1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4、1-5、1-10、1-15、1-20、1-25或1-50个氨基酸变化(即，氨基酸取代、添加或缺失)：SEQ ID NO:318、17、28、37、48、57、65、73、84及93；
(b)轻链可变区包含与选自下组的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列：SEQ ID NO:18、29、30、38、49、50、58、66、74、85、86及94，或相对于选自下组的氨基酸序列包含1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4、1-5、1-10、1-15、1-20、1-25或1-50个氨基酸变化(即，氨基酸取代、添加或缺失)：SEQ ID NO:18、29、30、38、49、50、58、66、74、85、86及94；
(c)抗体特异性结合OX40，且
(d)抗体展现以下功能性质中的1、2、3、4、5、6种或全部：
(1)结合可溶性人OX40，例如以10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)的KD结合，例如如Biacore测定的；
(2)结合膜结合的人OX40，例如以1nM或更小(例如，0.01nM至1nM)的EC50结合，例如如通过FACS测量的；
(3)结合食蟹猴OX40，例如膜结合的食蟹猴OX40，例如以10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)的EC50结合，例如如通过FACS测量的；
(4)诱导或增强T细胞活化，如通过以下所证明：(i)表达OX40的T细胞中增加的IL-2及/或IFN-γ产生及/或(ii)增强的T细胞增殖；
(5)抑制OX40配体与OX40结合，例如如FACS测量的以1nM或更小的EC50结合，例如在利用hOX40-293细胞的测定中；
(6)结合成熟人OX40的细胞外部分上的表位(SEQ ID NO:2)，例如，在区域DVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO:178)或DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGK(SEQ IDNO:179)内的表位；
(7)与3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、18E9、8B11、20B3及20C1竞争结合人OX40；
(8)与6E1-1、6E1-2、14A2-1及14A2-2竞争结合人OX40。
该抗体可系(例如)人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
在某些实施方案中，抗OX40抗体或其抗原结合部分可包含重链及轻链，其中：
(a)重链包含与选自下组的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列：SEQ ID NO:95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、124及125，或相对于选自下组的氨基酸序列包含1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4、1-5、1-10、1-15、1-20、1-25或1-50个氨基酸变化(即，氨基酸取代、添加或缺失)：SEQID NO:95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、124及125；
(b)轻链包含与选自下组的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列：SEQ ID NO:96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120及122，或相对于选自下组的氨基酸序列包含1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4、1-5、1-10、1-15、1-20、1-25或1-50个氨基酸变化(即，氨基酸取代、添加或缺失)：SEQ ID NO:96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120及122；
(c)抗体特异性结合OX40，且
(d)抗体展现以下功能性质中的1、2、3、4、5、6种或全部：
(1)结合可溶性人OX40，例如以10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)的KD结合，例如如Biacore测定的；
(2)结合膜结合的人OX40，例如以1nM或更小(例如，0.01nM至1nM)的EC50结合，例如如通过FACS测量的；
(3)结合食蟹猴OX40，例如膜结合的食蟹猴OX40，例如以10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)的EC50结合，例如如通过FACS测量的；
(4)诱导或增强T细胞活化，如通过以下所证明：(i)表达OX40的T细胞中增加的IL-2及/或IFN-γ产生及/或(ii)增强的T细胞增殖；
(5)抑制OX40配体与OX40结合，例如如FACS测量的以1nM或更小的EC50结合，例如在利用hOX40-293细胞的测定中；
(6)结合成熟人OX40的细胞外部分上的表位(SEQ ID NO:2)，例如，在区域DVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO:178)或DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGK(SEQ IDNO:179)内的表位；
(7)与3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、18E9、8B11、20B3及20C1竞争结合人OX40；
(8)与6E1-1、6E1-2、14A2-1及14A2-2竞争结合人OX40。
亦提供包含与3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及/或20C1的相应CDR有1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5个氨基酸变化(即，氨基酸取代、添加或缺失)差异的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2及/或VLCDR3的抗OX40抗体。在某些实施方案中，相对于3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及/或20C1中的相应序列，抗体包含1、2、3、4、5或6个CDR中的每一者的1-5个氨基酸变化。在某些实施方案中，相对于3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及/或20C1中的CDR，抗体在所有CDR中包含总共1-5个氨基酸变化。
具有与3F4、14B6(14B6-1及14B6-2)、23H3、6E1(6E1-1及6E1-2)、18E9、8B11、20B3、14A2(14A2-1及14A2-2)及20C1的那些序列同源的序列(例如分别SEQ ID NO:17及18；28及29；28及30；37及38；48及49；48及50；57及58；65及66；73及74；84及85；84及86；93及94的VH及VL区、或分别SEQ ID NO:95及96；97及98；99及100；101及102；103及104；105及106；107及108；109及110；111及112；113及114；115及116；117及118；119及120；121及122；123及116；124及116；及125及116的重链及轻链、或CDR)的抗体可通过以下方式获得：诱变(例如，定点或PCR介导的诱变)编码SEQ ID NO:17、28、37、48、57、65、73、84及93及/或SEQ ID NO:18、29、30、38、49、50、58、66、74、85、86及94或SEQ ID NO:95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、124及125及/或SEQ ID NO:96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120及122的核酸分子，之后使用本文所述功能分析测试经编码改变的抗体的保留功能(即，上文(1)至(7)中所述的功能)。
V.具有保守修饰的抗体
本文提供的抗OX40抗体可包括包含CDR1、CDR2及CDR3序列的重链可变区及包含CDR1、CDR2及CDR3序列的轻链可变区，其中此类CDR序列中的一或多者包含基于本文所述抗体(例如，3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及20C1)的指定氨基酸序列或其保守修饰形式，且其中抗体保留本文所述抗OX40抗体的期望功能性质。因此，抗OX40抗体或其抗原结合部分可包括包含CDR1、CDR2及CDR3序列的重链可变区及包含CDR1、CDR2及CDR3序列的轻链可变区，其中：
(a)重链可变区CDR3序列包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:13、21、33、41、53、61、69、77及89的氨基酸序列及其保守修饰形式，例如1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5个保守氨基酸取代；
(b)轻链可变区CDR3序列包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:16、24、27、36、44、47、56、64、72、80、83及92的氨基酸序列及其保守修饰形式，例如1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5个保守氨基酸取代；
(c)抗体特异性结合OX40，且
(d)抗体展现以下功能性质中的1、2、3、4、5、6种或全部：
(1)结合可溶性人OX40，例如以10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)的KD结合，例如如Biacore测定的；
(2)结合膜结合的人OX40，例如以1nM或更小(例如，0.01nM至1nM)的EC50结合，例如如通过FACS测量的；
(3)结合食蟹猴OX40，例如膜结合的食蟹猴OX40，例如以10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)的EC50结合，例如如通过FACS测量的；
(4)诱导或增强T细胞活化，如通过以下所证明：(i)表达OX40的T细胞中增加的IL-2及/或IFN-γ产生及/或(ii)增强的T细胞增殖；
(5)抑制OX40配体与OX40结合，例如如FACS测量的以1nM或更小的EC50结合，例如在利用hOX40-293细胞的测定中；
(6)结合成熟人OX40的细胞外部分上的表位(SEQ ID NO:2)，例如，在区域DVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO:178)或DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGK(SEQ IDNO:179)内的表位；
(7)与3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、18E9、8B11、20B3及20C1竞争结合人OX40；
(8)与6E1-1、6E1-2、14A2-1及14A2-2竞争结合人OX40。
在优选实施方案中，重链可变区CDR2序列包含选自下组的氨基酸序列：SEQ IDNO:12、20、32、40、52、60、68、76、88及317的氨基酸序列及其保守修饰形式，例如1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5个保守氨基酸取代；且轻链可变区CDR2序列包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:15、23、26、35、43、46、55、63、71、79、82及91的氨基酸序列及其保守修饰形式，例如1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5个保守氨基酸取代。在另一优选实施方案中，重链可变区CDR1序列包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:11、19、31、39、51、59、67、75及87的氨基酸序列及其保守修饰形式，例如1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5个保守氨基酸取代；且轻链可变区CDR1序列包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:14、22、25、34、42、45、54、62、70、78、81及90的氨基酸序列及其保守修饰形式，例如1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5个保守氨基酸取代。
在各个实施方案中，抗体可为(例如)人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
还可以在CDR以外(包括或不包括CDR)的抗体部分中进行保守氨基酸取代。举例而言，可在框架区或Fc区中进行保守氨基酸修饰。相对于本文提供的抗OX40抗体序列，可变区或重链或轻链可包含1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4、1-5、1-10、1-15、1-20、1-25或1-50个保守氨基酸取代、在某些实施方案中，抗OX40抗体包含保守及非保守氨基酸修饰的组合。
VI.竞争性抗体及结合相同表位的抗体
本文亦提供与本文所述抗OX40抗体(例如，抗体3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及20C1)竞争结合OX40的抗体。此类竞争抗体可在标准OX40结合测定中基于其竞争性抑制单克隆抗体3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及20C1中的一或多者结合OX40的能力来鉴定。举例而言，可使用标准ELISA分析或竞争性ELISA测定，其中将重组人OX40蛋白固定于板上，添加不同浓度的未标记的第一抗体，洗涤板，添加经标记的第二抗体，洗涤，且测量结合的标记的量。若增加浓度的未经标记(第一)抗体(亦称作“封阻抗体”)抑制经标记的(第二)抗体的结合，则称第一抗体抑制第二抗体与板上的靶标的结合，或称与第二抗体竞争结合。另外或或者，可使用
Figure BDA0001559815020000631
SPR分析以评估抗体竞争的能力。测试抗体抑制本文所述抗OX40抗体与OX40的结合的能力展示测试抗体可与抗体竞争结合OX40。
因此，本文提供通过使用(例如)如实施例中所述FACS将本文所述抗OX40抗体与OX40在细胞(例如活化T细胞)上的结合抑制至少10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的抗OX40抗体。
在其他实施方案中，本文提供与本文所述抗OX40抗体(例如，抗体3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及20C1)中的一或多者结合相同表位的抗OX40抗体，如使用本领域公认的表位定位技术(例如下文所述那些)所测定的。
本领域公认的表位定位技术包括(例如)结构方法(例如X射线晶体结构测定(例如，WO2005/044853))、分子建模及核磁共振(NMR)谱(包括在游离时及在与所关注抗体的以复合物结合时OX40中不稳定酰胺氢的H-D交换速率的NMR测定)(Zinn-Justin等人Biochemistry 1992；31:11335-47；Zinn-Justin等人Biochemistry 1993；32,6884-91)。
对于X射线结晶学，结晶可使用本领域任何已知方法来完成(例如Giege等人ActaCrystallogr 1994；D50:339-50；McPherson,Eur J Biochem 1990；189:1-23)，包括微配液(microbatch)(例如Chayen,Structure 19976；5:1269-74)、悬滴气相扩散(例如McPherson,J Biol Chem 1976；251:6300-3)、接种及透析。期望使用具有至少约1mg/mL且优选约10mg/mL至约20mg/mL的浓度的蛋白制剂。可在含有聚乙二醇1000-20,000(PEG；平均分子量介于约1000Da至约20,000Da的范围内，优选约5000Da至约7000Da，更佳约6000Da)的沉淀溶液中最大达成结晶，其中浓度介于约10％至约30％(w/v)的范围内。亦可期望包括蛋白稳定剂，例如甘油，浓度介于约0.5％至约20％范围内。适宜盐(例如氯化钠、氯化锂或柠檬酸钠)亦可在沉淀溶液中是期望的，浓度优选介于约1mM至约1000mM范围内。沉淀优选缓冲至约3.0至约5.0、优选约4.0的pH。可用于沉淀溶液中的具体缓冲液可变且为本领域所熟知(Scopes,Protein Purification:Principles and Practice，第三版，(1994)Springer-Verlag,New York)。此类缓冲液的实施例包括(但不限于)HEPES、Tris、MES及乙酸盐。晶体可在宽范围的温度(包括2℃、4℃、8℃及26℃)下生长。可使用熟知X射线绕射技术研究抗体:抗原晶体且可使用计算机软件(例如X-PLOR(Yale University,1992，由MolecularSimulations,Inc.分发；参见例如Blundell及Johnson,Meth.Enzymol 1985；114及115,H.W.Wyckoff等人编辑，Academic Press；美国专利申请公开案第2004/0014194号)、及BUSTER(Bricogne,Acta Cryst 1993；D49:37-60；Bricogne,Meth Enzymol 1997；276A:361-423；Carter及Sweet编辑；Roversi等人，Acta Cryst.2000；D56:1313-23)对其进行精修。
其他表位定位方法监测抗体与抗原片段或抗原的突变变化形式的结合，其中由于抗原序列内氨基酸残基的修饰所致的结合损失经常被视为可指示表位组分。一种此方法是丙氨酸扫描诱变，如(例如)Cunningham及Wells,Science 1989；244:1081-5所述。另一适宜方法是深突变扫描(参见例如Araya等人，Trends in Biotechnology 2011；29:435-42；Forsyth等人，mAbs 2013；5:523-32)。
另外/或者，可使用表位定位(包括构象中断表位的定位)的计算组合方法。
另外/或者，表位定位可通过测试抗体与包含OX40的片段(例如非变性或变性片段)的肽的结合来达成。可合成一系列涵盖OX40(例如，人OX40)的序列的重叠肽且在(例如)直接ELISA、竞争性ELISA(其中评估肽防止抗体与结合微量滴定板的孔的OX40的结合的能力)中或在计算机上针对结合进行筛选。其他方法依赖于所关注抗体自组合噬菌体展示肽文库亲和分离特异性短肽(呈天然三维形式或呈变性形式)的能力。随后将这样的肽视为线索，来界定由用于筛选肽文库的抗体识别的表位。
亦可通过基于MS的蛋白质足迹法(例如氢/氘交换质谱(HDX-MS)及蛋白质的快速光化学氧化(FPOP))鉴定表位。HDX-MS可如本文实施例及以下文献中所述来执行：Wei等人，Drug Discovery Today 2014；19:95。FPOP可如(例如)Hambley等人(J American Soc MassSpectrometry 2005；16:2057)中所述来执行。
可使用本领域已知的方法产生并鉴定与本文所述抗OX40抗体竞争结合的抗体。举例而言，可利用如本文所述人OX40对小鼠实施免疫，产生杂交瘤，且使用上述方法针对与本文所述抗体竞争结合OX40的能力筛选所得的单克隆抗体。
结合与本文所述抗OX40抗体相同的表位的抗体可通过用含有与抗体结合的表位的OX40的较小片段对小鼠实施免疫来产生。可使用上述方法鉴定表位或包含表位的区。或者，可使用Jespers等人(Biotechnology 1994；12:899)的方法以引导与本文所述抗OX40抗体识别相同表位、并因此展现类似性质的抗体的选择。举例而言，使用噬菌体展示，首先使抗OX40抗体的重链与(优选人类)轻链谱配对以选择OX40结合抗体，且随后使新轻链与(优选人类)重链谱配对以选择识别OX40上与本文所述抗OX40抗体相同的表位或表位区的(优选人类)OX40结合抗体。或者，可通过诱变编码抗体的重链及轻链的cDNA获得本文所述抗体的变体。
在一些实施方案中，本文提供结合对应于成熟人OX40(SEQ ID NO:2)的氨基酸残基46-62的序列DVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO:178)的全部或一部分的抗体，如实施例中的方法所测定。
在某些实施方案中，本文所述抗OX40抗体结合序列SQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO:182)的全部或一部分，如通过实施例中的方法所测定的。
在其他实施方案中，本文所述的抗OX40抗体结合序列PCKPCTWCNLR(SEQ ID NO:183)的全部或一部分，如通过实施例中的方法所测定的。
在其他实施方案中，结合序列DVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO:178)的全部或一部分的抗OX40抗体进一步结合序列QLCTATQDTVCR(SEQ ID NO:184)的全部或一部分，如通过实施例中的方法所测定的。
在其他实施方案中，本文所述抗的OX40抗体结合序列SQNTVCRPCGPGFYN(SEQ IDNO:185)的全部或一部分，如通过实施例中的方法所测定的。
在其他实施方案中，抗OX40抗体在对应于成熟人OX40(SEQ ID NO:2)的氨基酸残基89-124的区DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGK(SEQ ID NO:179)内结合，如通过实施例中的方法所测定的。
VII.经改造及经修饰的抗体
VH及VL区
本文亦提供经改造及经修饰的抗体，其可使用具有本文公开的VH及/或VL序列中的一或多者的抗体作为起始材料以改造经修饰抗体来制备，该经修饰抗体可具有自起始抗体改变的性质。抗体可通过修饰一个或两个可变区(即VH及/或VL)内、例如一个或多个CDR区内及/或一个或多个框架区内的一个或多个残基来改造。另外/或者，抗体可通过修饰恒定区内的残基以例如改变抗体的效应物功能来改造。
可实施的一种可变区改造类型是CDR移植。抗体与靶抗原主要经由位于六个重链及轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基相互作用。出于此原因，CDR内的氨基酸序列较CDR外的序列在各个抗体之间的变化更大。由于CDR序列负责大部分抗体-抗原相互作用，故可通过构建包括来自移植至具有不同性质的不同抗体的框架序列的特异性参照抗体的CDR序列的表达载体表达模拟特异性参照抗体的性质的重组抗体(例如参见Riechmann,L.等人(1998)Nature 332:323-327；Jones,P.等人(1986)Nature 321:522-525；Queen,C.等人(1989)Proc.Natl.Acad。参见U.S.A.86:10029-10033；颁予Winter的美国专利第5,225,539号、及颁予Queen等人的美国专利第5,530,101号；第5,585,089号；第5,693,762号及第6,180,370号)
因此，另一实施方案是关于单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括重链可变区及轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2及CDR3序列，所述CDR1、CDR2及CDR3序列分别包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID SEQ ID NO:11-13；19-21；31-33；39-41；51-53；59-61；67-69；74-77；及87-89；，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2及CDR3序列，所述CDR1、CDR2及CDR3序列分别包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:14-16；22-24；25-27；34-36；42-44；45-47；54-56；62-64；70-72；78-80；81-83；及90-92。因此，此类抗体含有单克隆抗体3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及20C1的VH及VL CDR序列，但可含有不同的框架序列。
此类框架序列可自包括种系抗体基因序列的公开DNA数据库或公开参考文献来获得。举例而言，人类重链及轻链可变区基因的种系DNA序列可参见“VBase”人类种系序列数据库(可在网际网路www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase上获得)以及Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美国卫生及公共服务部，NIH公开案第91-3242号；Tomlinson,I.M.等人(1992)“The Repertoire of HumanGermline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with DifferentHypervariable Loops”J,Mol.Biol.227:776-798；及Cox,J.P.L.等人(1994)“A Directoryof Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage”Eur.J.Immunol.24:827-836；每一者的内容皆以引用方式明确并入本文中。
优选用于本文所述抗体中的框架序列在结构上类似于本文所述的抗体所使用的框架序列。可将VH CDR1、2及3序列及VL CDR1、2及3序列移植至具有与发现于衍生出框架序列的种系免疫球蛋白基因中的序列同一的序列的框架区上，或可将CDR序列移植至与种系序列相比含有至多20个、优选保守氨基酸取代的框架区上。举例而言，已发现，在某些情况下，有益地突变框架区内的残基以维持或增强抗体的抗原结合能力(例如，参见颁予Queen等人的美国专利第5,530,101号、第5,585,089号、第5,693,762号及第6,180,370号)。
本文所述的经改造抗体包括已对VH及/或VL内的框架残基进行修饰以(例如)改善抗体的性质的那些。通常，进行此类框架修饰以降低抗体的免疫原性。举例而言，一种方式系将一个或多个框架残基“回复突变”成相应种系序列。更特定而言，已经受体细胞突变的抗体可含有与衍生出该抗体的种系序列不同的框架残基。此类残基可通过比较抗体框架序列与衍生出该抗体的种系序列来鉴定。为使框架区序列返回至其种系构形，可通过(例如)定点诱变或PCR介导的诱变将体细胞突变“回复突变”成种系序列。亦意欲涵盖此类“回复突变”抗体。另一类型的框架修饰涉及突变框架区或甚至一个或多个CDR区内的一个或多个残基，以去除T细胞表位，藉此降低抗体的潜在免疫原性。此方法亦称作“去免疫化”且进一步详细阐述于Carr等人的美国专利公开案第20030153043号中。
另一类型的可变区修饰系突变CDR区内的氨基酸残基以改善所关注抗体的一种或多种结合性质(例如亲和力)。可实施定点诱变或PCR介导的诱变以引入突变，且可在如本文所阐述且于实施例中提供的体外或体内测定中评估对所关注抗体结合或其他功能性质的效应。优选引入保守修饰(如上文所论述)。突变可为氨基酸添加、缺失或优选取代。此外，通常改变CDR区内不超过一个、两个、三个、四个或五个残基。
因此，本文亦提供包含重链可变区的抗OX40单克隆抗体或其抗原结合部分，该重链可变区包含：(a)VH CDR1区，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:11、19、31、39、51、59、67、75及87，或与SEQ ID NO:11、19、31、39、51、59、67、75及87相比具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；(b)VH CDR2区，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:12、20、32、40、52、60、68、76、88及317，或与SEQ ID NO:12、20、32、40、52、60、68、76及88相比具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；(c)VH CDR3区，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:13、21、33、41、53、61、69、77及89，或与SEQ ID NO:13、21、33、41、53、61、69、77及89相比具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；(d)VL CDR1区，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:14、22、25、34、42、45、54、62、70、78、81及90，或与SEQ ID NO:14、22、25、34、42、45、54、62、70、78、81及90相比具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；(e)VL CDR2区，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:15、23、26、35、43、46、55、63、71、79、82及91，或与SEQ ID NO:15、23、26、35、43、46、55、63、71、79、82及91相比具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；及(f)VL CDR3区，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:16、24、27、36、44、47、56、64、72、80、83及92，或与SEQ ID NO:16、24、27、36、44、47、56、64、72、80、83及92相比具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列。
抗体的CDR中的甲硫氨酸残基会被氧化，引起抗体的潜在化学降解及因此降低功效。因此，本文所述抗OX40抗体的重链及/或轻链CDR中的一个或多个甲硫氨酸残基可经不会经受氧化降解的氨基酸残基置换。
类似地，可自抗OX40抗体、具体而言于CDR中去除去酰胺位点。
优选消除抗原结合结构域内的潜在糖基化位点以防止可干扰抗原结合的糖基化。参见(例如)美国专利第5,714,350号。
靶向抗原结合
在各个实施方案中，本文所述抗体经修饰以选择性阻断抗原结合可有害的组织及环境中的抗原结合，但容许可有益的抗原结合。在一个实施方案中，生成特异性结合抗体的抗原结合表面并干扰抗原结合的阻断肽“遮蔽”，该遮蔽通过肽酶可裂解接头连接至抗体的结合臂的每一者。参见(例如)颁予CytomX的美国专利第8,518,404号。此类构建体可用于治疗癌症，其中与非肿瘤组织相比，在肿瘤微环境中蛋白酶含量大大增加。肿瘤微环境中可裂解接头的选择性裂解容许解离掩蔽/阻断肽，从而使得在肿瘤中而非在抗原结合可能引起不期望副作用的周边组织中选择性抗原结合。
或者，在相关实施方案中，研发包含两个抗原结合结构域的二价结合化合物(“掩蔽配体”)，其结合(二价)抗体的抗原结合表面且干扰抗原结合，其中两个结合结构域掩膜通过可裂解接头(例如可通过肽酶裂解)彼此连接(但非抗体)。参见(例如)颁予TegopharmCorp.的国际专利申请公开案第WO 2010/077643号。掩蔽配体可包含或源自抗体意欲结合的抗原，或可独立地生成。此类掩蔽配体可用于治疗癌症，其中与非肿瘤组织相比，在肿瘤微环境中蛋白酶含量大大增加。肿瘤微环境中可裂解接头的选择性裂解容许两个结合结构域彼此解离，从而降低对抗体的抗原结合表面的亲合力。掩蔽配体自抗体的所得解离使得在肿瘤中而非在抗原结合可能引起不期望副作用的周边组织中选择性抗原结合。
Fc及经修饰的Fc
除自抗原结合结构域与抗原的结合产生的治疗抗体的活性(例如在拮抗剂抗体的情形下阻断同源配体或受体蛋白质，或在激动剂抗体的情形下诱导的信号传导)外，抗体的Fc蛋白质与免疫系统通常以复杂方式相互作用以引发任何数量的生物效应。效应物功能(例如免疫球蛋白的Fc区)负责许多重要抗体功能，例如抗原依赖性细胞细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)及抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)，从而引起杀死靶细胞，但通过不同机制。存在重链恒定区的五种主要类别或同型(IgA、IgG、IgD、IgE、IgM)，各自具有特征性效应物功能。此类同型可进一步细分成亚类，例如，IgG分成四个亚类，称作IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。IgG分子与三类对抗体的IgG类别具有特异性的Fcγ受体(FcγR)(即FcγRI、FcγRII及FcγRIII)相互作用。已报导对于IgG与FcγR受体的结合重要的序列位于CH2及CH3结构域中。抗体的血清半衰期受该抗体结合新生Fc受体(FcRn)的能力影响。
本文所述的抗OX40抗体可包含与包含不同Fc区的恒定结构域组合的本发明的可变结构域，此类Fc区基于抗体预期用途的生物活性(若存在)选择。Salfeld(2007)Nat.Biotechnol.25:1369。举例而言，人类IgG可分类成四个亚类，IgG1、IgG2、IgG3及IgG4，且此类中的每一者包含对于结合一个或多个Fcγ受体(活化受体FcγRI(CD64)、FcγRIIA、FcγRIIC(CD32)；FcγRIIIA及FcγRIIIB(CD16)及抑制受体FcγRIIB)及对于补体的第一组分(C1q)具有独特特性的Fc区。人类IgG1及IgG3结合所有Fcγ受体；IgG2结合FcγRIIAH131，且以较低亲和力结合FcγRIIAR131 FcγRIIIAV158；IgG4结合FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIC及FcγRIIIAV158；且抑制性受体FcγRIIB对IgG1、IgG2及IgG3较所有其他Fcγ受体具有较低亲和力。Bruhns等人(2009)Blood 113:3716。研究已显示，FcγRI不结合IgG2，且FcγRIIIB不结合IgG2或IgG4。同前。一般而言，关于ADCC活性，人类IgG1≥IgG3>>IgG4≥IgG2。因此，例如，可选择IgG1恒定结构域而非IgG2或IgG4用于期望ADCC的药物中；若活化表达FcγRIIIA的NK细胞、单核细胞或巨噬细胞，则可选择IgG3；且若抗体欲用于使过敏患者脱敏，则可选择IgG4。若期望抗体无所有效应物功能，则亦可选择IgG4。
因此，本文所述抗OX40可变区可连接(例如，共价连接或融合)至Fc，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc，其可属任何异型或同种异型，例如对于IgG1：G1m、G1m1(a)、G1m2(x)、G1m3(f)、G1m17(z)；对于IgG2：G2m、G2m23(n)；对于IgG3：G3m、G3m21(g1)、G3m28(g5)、G3m11(b0)、G3m5(b1)、G3m13(b3)、G3m14(b4)、G3m10(b5)、G3m15(s)、G3m16(t)、G3m6(c3)、G3m24(c5)、G3m26(u)、G3m27(v)。参见(例如)Jefferis等人(2009)mAbs 1:1)。异型的选择可受潜在免疫原性问题影响，以(例如)最小化抗药物抗体的形成。
在某些实施方案中，本文所述抗OX40可变区连接至结合一种或多种活化Fc受体(FcγI/CD64、FcγIIa/CD32或FcγIIIa/CD16)的Fc，且藉此刺激ADCC且可引起T细胞耗竭。在特定实施方案中，本文所述抗OX40可变区连接至Fc，从而引起耗竭。在其他实施方案中，本文所述抗OX40可变区连接至人类IgG1或IgG3 Fc，即抗体属IgG1或IgG3同型。在其他实施方案中，抗OX40抗体系耗竭抗体。举例而言，其可耗竭处于肿瘤微环境中的Treg细胞(且藉此增强抗肿瘤活性)，但不显著耗竭处于肿瘤微环境中的Teff细胞并介导抗肿瘤效应，及/或不显著耗竭在肿瘤外(例如在外周中)的Treg及Teff细胞。在其他实施方案中，抗OX40抗体属刺激肿瘤位点处Treg细胞耗竭或消除及Teff细胞的伴随活化的同型(天然或非天然(例如，包括突变)同型)。在其他实施方案中，抗OX40抗体在肿瘤位点处产生升高的Teff对Treg比率，其指示有效力的抗肿瘤活性，且优选不显著耗竭在肿瘤外(例如在外周中)的Treg及Teff细胞。
在某些实施方案中，抗OX40抗体阻断Treg的免疫抑制性活性。在其他实施方案中，抗OX40抗体具有降低或消除的FcR结合(例如降低的与活化FcR的结合)的Fc受体。在某些实施方案中，抗OX40抗体具有结合FcRIIb或具有增强的与FcRIIb的结合的Fc，此可提供增强的激动作用。参见(例如)WO 2012/087928；Li及Ravetch(2011)Science 333:1030；Wilson等人(2011)Cancer Cell 19:101；White等人(2011)J.Immunol.187:1754。
本文所述抗OX40可变区可连接至非天然Fc区(例如无效应物功能或基本上无效应物功能的Fc(例如人类IgG2或IgG4)或具有增强的与一种或多种活化Fc受体(FcγI、FcγIIa或FcγIIIa)的结合的Fc)，例如以增强肿瘤环境中Treg耗竭。
本文所述可变区可连接至包含一个或多个修饰以通常改变抗体的一种或多种功能性质(例如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合及/或抗原依赖性细胞细胞毒性)的Fc。此外，本文所述抗体可经化学修饰(例如可将一个或多个化学部分附接至该抗体)或其可经修饰以改变其糖基化，以改变抗体的一种或多种功能性质。此类实施方案中的每一者进一步详细阐述于下文中。Fc区中残基的编号系Kabat的EU索引的编号。参照残基编号提供本文中公开的序列变体，而后代替天然氨基酸经取代的氨基酸，视情况之前有该位置处的天然残基。在给定位置处存在多个氨基酸的情况下，例如若序列在天然同型之间不同或若可在该位置处取代多个突变，则其由斜杠分开(例如“X/Y/Z”)。
举例而言，可在Fc区中进行修饰以生成具有如下性质的Fc变体：(a)增加或降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，(b)增加或降低的补体介导的细胞毒性(CDC)，(c)增加或降低的对C1q的亲和力及/或(d)相对于母体Fc增加或降低的对Fc受体的亲和力。此类Fc区变体通常将包含Fc区中的至少一个氨基酸修饰。据信组合氨基酸修饰尤其期望的。举例而言，变体Fc区可包括其中、(例如)本文中鉴定的具体Fc区位置的两个、三个、四个、五个等取代。示例性Fc序列变体公开于本文中，且亦提供于美国专利第5,624,821号、第6,277,375号、第6,737,056号、第6,194,551号、第7,317,091号、第8,101,720号、PCT专利公开案WO 00/42072、WO 01/58957、WO 04/016750、WO 04/029207、WO 04/035752、WO 04/074455、WO 04/099249、WO 04/063351、WO 05/070963、WO 05/040217、WO 05/092925及WO06/020114处。
降低效应物功能
ADCC活性可通过修饰Fc区而降低。在某些实施方案中，可去除影响与Fc受体的结合的位点，优选除补救受体结合位点外的位点。在其他实施方案中，Fc区可经修饰以去除ADCC位点。ADCC位点为本领域已知；关于IgG1中的ADCC位点，参见(例如)Sarmay等人(1992)Molec.Immunol.29(5):633-9。在一个实施方案中，人类IgG1的G236R及L328R变体有效地消除FcγR结合。Horton等人(2011)J.Immunol.186:4223及Chu等人(2008)Mol.Immunol.45:3926。在其他实施方案中，具有降低的与FcγR的结合的Fc包含氨基酸取代L234A、L235E及G237A。Gross等人(2001)Immunity 15:289。
CDC活性亦可通过修饰Fc区而降低。IgG1位置D270、K322、P329及P331处的突变、尤其丙氨酸突变D270A、K322A、P329A及P331A显著降低相应抗体结合C1q及活化补体的能力。Idusogie等人(2000)J.Immunol 164:4178；WO 99/51642。已显示IgG1的位置331的修饰(例如P331S)可降低补体结合。Tao等人(1993；J.Exp.Med.178:661及Canfield及Morrison(1991)J.Exp.Med.173:1483。在另一实施例中，改变氨基酸位置231至239内的一个或多个氨基酸残基以藉此降低抗体结合补体的能力。WO 94/29351。
在一些实施方案中，补体结合降低的Fc具有氨基酸取代A330S及P331S。Gross等人(2001)Immunity 15:289。
对于欲完全避免效应物功能的用途，例如在仅抗原结合即足以生成期望治疗益处且效应物功能仅导致不期望副作用(或增加其风险)时，可使用IgG4抗体，或可设计无Fc区或其大部分的抗体或片段，或可使Fc突变以完全消除糖基化(例如N297A)。或者，已生成人类IgG2(CH1结构域及铰链区)及人类IgG4(CH2及CH3结构域)的杂合构建体，其无效应物功能，缺乏结合FcγR的能力(如IgG2)且不能活化补体(如IgG4)。Rother等人(2007)Nat.Biotechnol.25:1256。亦参见Mueller等人(1997)Mol.Immunol.34:441；Labrijn等人(2008)Curr.Op.Immunol.20:479(通常论述Fc修饰以降低效应物功能)。
在其他实施方案中，通过用不同氨基酸残基置换至少一个氨基酸残基来改变Fc区以改变抗体的效应物功能。举例而言，一个或多个选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320及322的氨基酸可经不同氨基酸残基置换，使得抗体具有降低的对效应物配体的亲和力，但保留亲代抗体的抗原结合能力。改变亲和力的效应物配体可为(例如)Fc受体(残基234、235、236、237、297)或补体的C1组分(残基297、318、320、322)。美国专利第5,624,821号及第5,648,260号，二者皆由Winter等人提供。
一个早期专利申请案提出IgG Fc区的修饰以减少结合FcγRI以减少ADCC(234A；235E；236A；G237A)或阻断结合补体组分C1q以消除CDC(E318A或V/K320A及K322A/Q)。WO88/007089。亦参见Duncan及Winter(1988)Nature 332:563；Chappel等人(1991)Proc.Nat'l Acad.Sci.(USA)88:9036；及Sondermann等人(2000)Nature 406:267(论述此类突变对FcγRIII结合的效应)。
降低效应物功能的Fc修饰亦包括在位置234、235、236、237、267、269、325及328处取代、插入及缺失，例如234G、235G、236R、237K、267R、269R、325L及328R。Fc变体可包含236R/328R。用于降低FcγR及补体相互作用的其他修饰包括取代297A、234A、235A、237A、318A、228P、236E、268Q、309L、330S、331S、220S、226S、229S、238S、233P及234V。此类及其他修饰参阅Strohl(2009)Current Opinion in Biotechnology 20:685-691。可通过使位置233-236及327-331中的一或多处的IgG残基突变降低效应物功能(ADCC及补体活化二者)，同时维持新生FcR结合(维持半衰期)，例如IgG1中的E233P、L234V、L235A、任选地G236A、A327G、A330S及P331S；IgG4中的E233P、F234V、L235A、任选地G236A；及IgG2中的A330S及P331S。参见Armour等人(1999)Eur.J.Immunol 29:2613；WO 99/58572。降低效应物功能的其他突变包括IgG1中的L234A及L235A(Alegre等人(1994)Transplantation 57:1537)；IgG2中的V234A及G237A(Cole等人(1997)J.Immunol 159:3613；亦参见美国专利第5,834,597号)；及对于IgG4的S228P及L235E(Reddy等人(2000)J.Immunol.164:1925)。人类IgG1中用于降低效应物功能的突变的另一组合包括L234F、L235E及P331S。Oganesyan等人(2008)Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.64:700。通常参见Labrijn等人(2008)Curr.Op.Immunol.20:479。其他被发现在Fc(IgG1)融合蛋白(阿巴西普(abatacept))背景下降低效应物功能的突变是C226S、C229S及P238S(EU残基编号)。Davis等人(2007)J.Immunol.34:2204。
具有降低的ADCC及/或CDC的其他Fc变体公开于Glaesner等人(2010)DiabetesMetab.Res.Rev.26:287(IgG4中的F234A及L235A以降低ADCC及ADCP)；Hutchins等人(1995)Proc.Nat'l Acad.Sci.(USA)92:11980(IgG4中的F234A、G237A及E318A)；An等人(2009)MAbs 1:572及美国专利申请公开案2007/0148167(IgG2中的H268Q、V309L、A330S及P331S)；McEarchern等人(2007)Blood 109:1185(IgG1中的C226S、C229S、E233P、L234V、L235A)；Vafa等人(2014)Methods 65:114(IgG2中的V234V、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S、P331S)。
在某些实施方案中，选择实质上无效应物功能的Fc，即，其具有降低的与FcγR的结合及降低的补体结合。无效应物功能的示例性Fc(例如IgG1 Fc)包含以下五个突变：L234A、L235E、G237A、A330S及P331S。Gross等人(2001)Immunity 15:289。包含此类突变的示例性重链阐述于序列表中，如表23处所详述(例如SEQ ID NO:11)。该五个取代亦可与N297A组合以消除糖基化。
增强效应物功能
或者，ADCC活性可通过修饰Fc区来增加。关于ADCC活性，人类IgG1≥IgG3>>IgG4≥IgG2，因此，可选择IgG1恒定结构域而非IgG2或IgG4用于期望ADCC的药物中。或者，Fc区可通过修饰以下位置处的一个或多个氨基酸经修饰以增加抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)及/或增加对Fcγ受体的亲和力：234、235、236、238、239、240、241、243、244、245、247、248、249、252、254、255、256、258、262、263、264、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、299、301、303、305、307、309、312、313、315、320、322、324、325、326、327、329、330、331、332、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、433、434、435、436、437、438或439。参见WO 2012/142515；亦参见WO 00/42072。示例性取代包括236A、239D、239E、268D、267E、268E、268F、324T、332D及332E。示例性变体包括239D/332E、236A/332E、236A/239D/332E、268F/324T、267E/268F、267E/324T及267E/268F/324T。举例而言，已显示，包含G236A变体(可任选地与I332E组合)的人类IgG1 Fc将FcγIIA/FcγIIB结合亲和性比率增加约15倍。Richards等人(2008)Mol.Cancer Therap.7:2517；Moore等人(2010)mAbs 2:181。用于增强FcγR及补体相互作用的其他修饰包括但不限于取代298A、333A、334A、326A、2471、339D、339Q、280H、290S、298D、298V、243L、292P、300L、396L、3051及396L。此类及其他修饰参阅Strohl(2009)Current Opinion in Biotechnology 20:685-691。特定而言，可通过IgG1的位置E333处的变化(例如E333A)增强ADCC及CDC二者。Shields等人(2001)J.Biol.Chem.276:6591。在IgG1中使用P247I及A339D/Q突变以增强效应物功能公开于WO2006/020114中，且D280H、K290S±S298D/V公开于WO2004/074455中。已显示K326A/W及E333A/S变体增加人类IgG1中的效应物功能，且E333S增加IgG2中的效应物功能。Idusogie等人(2001)J.Immunol.166:2571。
具体而言，人类IgG1对于FcγR1、FcγRII、FcγRIII及FcRn的结合位点已得到定位，具有改善结合的变体也已得到阐述。Shields等人(2001)J.Biol Chem.276:6591-6604。已经显示位置256、290、298、333、334及339处的具体突变可改善与FcγRIII的结合，包括组合突变体T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A及S298A/E333A/K334A(具有增强的FcγRIIIa结合及ADCC活性)。已鉴定了具有强烈增强的与FcγRIIIa的结合的其他IgG1变体，包括具有S239D/I332E及S239D/I332E/A330L突变的变体，其在食蟹猴中显示对FcγRIIIa的亲和力最大增加、FcγRIIb结合减少及强的细胞毒性活性。Lazar等人(2006)Proc.Nat'lAcad Sci.(USA)103:4005；Awan等人(2010)Blood 115:1204；Desjarlais及Lazar(2011)Exp.Cell Res.317:1278。向抗体(例如阿伦单抗(alemtuzumab)(CD52特异性)、曲妥珠单抗(trastuzumab)(HER2/neu特异性)、利妥昔单抗(rituximab)(CD20特异性)及西妥昔单抗(cetuximab)(EGFR特异性))中引入三重突变导致体外ADCC活性大大增强，而S239D/I332E变体显示在猴中增强的耗竭B细胞的能力。Lazar等人(2006)Proc.Nat'l Acad Sci.(USA)103:4005。另外，已鉴定含有L235V、F243L、R292P、Y300L、V305I及P396L突变的IgG1突变体，其在B细胞恶性病及乳腺癌的模型中在表达人类FcγRIIIa的转基因小鼠中展现增强的与FcγRIIIa的结合及同时增强的ADCC活性。Stavenhagen等人(2007)Cancer Res.67:8882；美国专利第8,652,466号；Nordstrom等人(2011)Breast Cancer Res.13:R123。
不同IgG同型亦展现差异CDC活性(IgG3>IgG1>>IgG2≈IgG4)。Dangl等人(1988)EMBO J.7:1989。对于期望增强的CDC的用途，亦可引入增加与C1q的结合的突变。可通过IgG2中的K326及/或E333处的突变(例如K326W(其降低ADCC活性)及E333S)增强招募补体(CDC)的能力，以增加与C1q、即补体级联的第一组分的结合。Idusogie等人(2001)J.Immunol.166:2571。向人类IgG1中引入S267E/H268F/S324T(单独或以任一组合)可增强C1q结合。Moore等人(2010)mAbs 2:181。Natsume等人(2008)Cancer Res.68:3863(其中的图1)的IgG1/IgG3杂合同型抗体“113F”的Fc区亦赋予增强的CDC。亦参见Michaelsen等人(2009)Scand.J.Immunol.70:553及Redpath等人(1998)Immunology 93:595。
可增加或减少效应物功能的其他突变公开于Dall'Acqua等人(2006)J.Immunol.177:1129处。亦参见Carter(2006)Nat.Rev.Immunol.6:343；Presta(2008)Curr.Op.Immunol.20:460。
亦可使用增强对抑制性受体FcγRIIb的亲和力的Fc变体，以例如增强细胞凋亡诱导或佐剂活性。Li及Ravetch(2011)Science 333:1030；Li及Ravetch(2012)Proc.Nat'lAcad.Sci(USA)109:10966；美国专利申请公开案2014/0010812。此类变体可提供具有与FcγRIIb+细胞(包括例如B细胞及单核细胞)相关的免疫调节活性的抗体。在一个实施方案中，Fc变体相对于一种或多种活化受体提供选择性增强的对FcγRIIb的亲和力。根据EU索引，用于改变与FcγRIIb的结合的修饰包括选自下组的位置处的一个或多个修饰：234、235、236、237、239、266、267、268、325、326、327、328及332。用于增强FcγRIIb亲和力的示例性取代包括但不限于234D、234E、234F、234W、235D、235F、235R、235Y、236D、236N、237D、237N、239D、239E、266M、267D、267E、268D、268E、327D、327E、328F、328W、328Y及332E。示例性取代包括235Y、236D、239D、266M、267E、268D、268E、328F、328W及328Y。用于增强与FcγRIIb的结合的其他Fc变体包括235Y/267E、236D/267E、239D/268D、239D/267E、267E/268D、267E/268E及267E/328F。特定而言，人类IgG1的S267E、G236D、S239D、L328F及I332E变体(包括S267E+L328F双重变体)尤其在增强对抑制性FcγRIIb受体的亲和力中具有特定价值。Chu等人(2008)Mol.Immunol 45:3926；美国专利申请公开案2006/024298；WO 2012/087928。对FcγRIIb的增强特异性(如不同于FcγRIIaR131)可通过添加P238D取代来获得。Mimoto等人(2013)Protein.Eng.Des.&Selection 26:589；WO 2012/115241。
在某些实施方案中，抗体经修饰以延长其生物半衰期。各种方式是可行的。举例而言，这可以通过增加Fc区对FcRn的结合亲和力来进行。在一个实施方案中，在CH1或CL区内改变抗体，使其含有取自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环的补救受体结合表位，如Presta等人的美国专利第5,869,046号及第6,121,022号中所述。增加与FcRn的结合及/或改善药物动力学性质的其他示例性Fc变体包括位置259、308及434处的取代，包括(例如)259I、308F、428L、428M、434S、434H、434F、434Y及434M。增加与FcRn的Fc结合的其他变体包括：250E、250Q、428L、428F、250Q/428L(Hinton等人，2004,J.Biol.Chem.279(8):6213-6216,Hinton等人2006Journal of Immunology 176:346-356)、256A、272A、305A、307A、311A、312A、378Q、380A、382A、434A(Shields等人，Journal of Biological Chemistry,2001,276(9):6591-6604)、252F、252Y、252W、254T、256Q、256E、256D、433R、434F、434Y、252Y/254T/256E、433K/434F/436H(Dall Acqua等人Journal of Immunology,2002,169:5171-5180,Dall'Acqua等人，2006,Journal of Biological Chemistry 281:23514-23524)。参见美国专利第8,367,805号。
已提出IgG Fc中的某些保守残基的修饰形式(I253/H310/Q311/H433/N434)(例如N434A变体(Yeung等人(2009)J.Immunol 182:7663)作为增加FcRn亲和力的方式，由此延长循环中抗体的半衰期。WO 98/023289。已显示包含M428L及N434S的组合Fc变体可增加FcRn结合并将血清半衰期延长至多5倍。Zalevsky等人(2010)Nat.Biotechnol.28:157。包含T307A、E380A及N434A修饰的组合Fc变体亦延长IgG1抗体的半衰期。Petkova等人(2006)Int.Immunol.18:1759。另外，亦已显示包含M252Y/M428L、M428L/N434H、M428L/N434F、M428L/N434Y、M428L/N434A、M428L/N434M及M428L/N434S变体的组合Fc变体可延长半衰期。WO 2009/086320。
此外，包含M252Y、S254T及T256E的组合Fc变体将半衰期延长几乎4倍。Dall'Acqua等人(2006)J.Biol.Chem.281:23514。使用提供增加FcRn亲和力但降低的pH依赖性的相关IgG1修饰(M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F)以生成IgG1构建体(“MST-HN Abdeg”)用作竞争者以防止其他抗体与FcRn结合，从而产生该另一抗体、即内源性IgG(例如在自体免疫设定中)或另一外源性(治疗)mAb的增加清除率。Vaccaro等人(2005)Nat.Biotechnol.23:1283；WO 2006/130834。
用于增加FcRn结合的其他修饰阐述于Yeung等人(2010)J.Immunol.182:7663-7671；6,277,375；6,821,505；WO 97/34631；WO 2002/060919中。
在某些实施方案中，可使用杂合IgG同型以增加FcRn结合，且潜在地延长半衰期。举例而言，可通过用两种同型不同的位置处的IgG3的氨基酸取代CH2及/或CH3区中的IgG1位置构建IgG1/IgG3杂合变体。因此，可构建杂合变体IgG抗体，其包含一个或多个取代，例如274Q、276K、300F、339T、356E、358M、384S、392N、397M、422I、435R及436F。在本文所述其他实施方案中，可通过用两种同型不同的位置处的IgG1的氨基酸取代CH2及/或CH3区中的IgG2位置构建IgG1/IgG2杂合变体。因此，可构建杂合变体IgG抗体，其包含一个或多个取代，例如以下氨基酸取代中的一或多者：233E、234L、235L、-236G(称作在位置236处插入甘氨酸)及327A。参见美国专利第8,629,113号。生成IgG1/IgG2/IgG4序列的杂合体，其据称延长血清半衰期并改善表达。美国专利第7,867,491号(其中的序列编号18)。
亦可通过聚乙二醇化延长本发明抗体的血清半衰期。抗体可经聚乙二醇化以(例如)延长抗体的生物(例如血清)半衰期。为了抗体的聚乙二醇化，通常在一个或多个PEG基团附接至抗体或抗体片段的条件下使抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)试剂(例如PEG的反应性酯或醛衍生物)反应。优选地，聚乙二醇化系经由与反应性PEG分子(或类似反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应来实施。如本文所用术语“聚乙二醇”意欲涵盖PEG的用于衍生其他蛋白质的任一形式，例如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方案中，欲聚乙二醇化的抗体是无糖基化抗体。聚乙二醇化蛋白质的方法是本领域已知的，且可适用于本文所述抗体。参见(例如)Nishimura等人的EP 0154316及Ishikawa等人的EP 0401384。
或者，在一些情况下，可期望缩短抗体的半衰期，而非延长抗体的半衰期。人类IgG1的Fc中的修饰(例如1253A(Hornick等人(2000)J.Nucl.Med.41:355)及H435A/RI253A或H310A(Kim等人(2000)Eur.J.Immunol.29:2819))降低FcRn结合，由此缩短半衰期(增加清除率)，适用于期望快速清除的场合，例如医学成像。亦参见Kenanova等人(2005)CancerRes.65:622。增强清除率的其他方式包括将本发明的抗原结合结构域规整为无结合FcRn的能力的抗体片段(例如Fab片段)。这样的修饰可将抗体的循环半衰期自几周减少至几小时。若需要，随后可使用抗体片段的选择性聚乙二醇化以微调(延长)抗体片段的半衰期。Chapman等人(1999)Nat.Biotechnol.17:780。亦可在(例如)融合蛋白构建体中将抗体片段融合至人类血清白蛋白以延长半衰期。Yeh等人(1992)Proc.Nat'l Acad.Sci.89:1904。或者，可利用本发明的第一抗原结合结构域及结合人类血清白蛋白(HSA)的第二抗原结合结构域构建双特异性抗体。参见国际专利申请公开案WO 2009/127691及其中引用的专利参考文献。或者，可向抗体片段添加专门多肽序列以延长半衰期，例如“XTEN”多肽序列。Schellenberger等人(2009)Nat.Biotechnol.27:1186；国际专利申请公开案WO 2010/091122。
其他Fc变体
在使用IgG4恒定结构域时，优选纳入取代S228P，其模拟IgG1中的铰链序列，藉此稳定IgG4分子，例如减少所治疗患者中治疗抗体与内源性IgG4之间的Fab-臂交换。Labrijn等人(2009)Nat.Biotechnol.27:767；Reddy等人(2000)J.Immunol.164:1925。
可通过D221G及K222S修饰消除IgG1构建体的铰链中的潜在蛋白酶切割位点，从而增加抗体的稳定性。WO 2014/043344。
Fc变体对其配体(Fc受体)的亲和力及结合性质可通过本领域已知的多种体外测定方法(基于生物化学或免疫学的测定)来测定，此类方法包括(但不限于)平衡方法(例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射免疫测定(RIA))或动力学(例如，
Figure BDA0001559815020000791
SPR分析)及其他方法，例如间接结合测定、竞争抑制测定、荧光共振能量转移(FRET)、凝胶电泳及层析(例如，凝胶过滤)。此类及其他方法可在所检查组分的一或多者上利用标记及/或采用多种检测方法，其包括(但不限于)发色、荧光、发光或同位素标记。结合亲和力及动力学的详细说明可参见Paul,W.E.编辑，Fundamental Immunology,第4版，Lippincott-Raven,Philadelphia(1999)，其关注抗体-免疫原相互作用。
在其他实施方案中，修饰抗体的糖基化以增加或减少效应物功能。举例而言，可通过使位置297处的保守天冬酰胺残基(例如N297A)突变、由此取消补体及FcγRI结合，来制作缺少所有效应物功能的无糖基化抗体。Bolt等人(1993)Eur.J.Immunol.23:403。亦参见Tao及Morrison(1989)J.Immunol.143:2595(使用IgG1中的N297Q以消除位置297处的糖基化)。
尽管无糖基化抗体通常无效应物功能，但可引入突变以恢复该功能。可使无糖基化抗体(例如自N297A/C/D/或H突变产生或在未糖基化蛋白质的系统(例如大肠杆菌)中产生的那些)进一步突变以恢复FcγR结合，例如S298G及/或T299A/G/或H(WO 2009/079242)、或E382V及M428I(Jung等人(2010)Proc.Nat'l Acad.Sci(USA)107:604)。
另外，可通过改变糖基化制备具有增强ADCC的抗体。举例而言，基于与FcγRIIIa的改善结合，已显示自重链Asn297连接的寡糖去除岩藻糖可增加ADCC。Shields等人(2002)JBC 277:26733；Niwa等人(2005)J.Immunol.Methods 306:151；Cardarelli等人(2009)Clin.Cancer Res.15:3376(MDX-1401)；Cardarelli等人(2010)CancerImmunol.Immunotherap.59:257(MDX-1342)。此类低岩藻糖抗体可在(例如)无岩藻糖基转移酶(FUT8)的基因剔除中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生(Yamane-Ohnuki等人(2004)Biotechnol.Bioeng.87:614)，或在生成岩藻糖基化抗体的其他细胞中产生。参见(例如)Zhang等人(2011)mAbs 3:289及Li等人(2006)Nat.Biotechnol 24:210(二者皆阐述经糖改造的甲醇酵母(Pichia pastoris.)中的抗体产生)；Mossner等人(2010)Blood 115:4393；Shields等人(2002)J.Biol.Chem.277:26733；Shinkawa等人(2003)J.Biol.Chem.278:3466；EP 1176195B1。ADCC亦可如PCT公开案WO 03/035835中所述增强，该公开案公开使用变体CHO细胞系Lec13，其将岩藻糖附接至Asn(297)连接的碳水化合物的能力降低，亦导致在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(亦参见Shields,R.L.等人，(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740)。或者，可在抗体产生期间向培养基中添加岩藻糖类似物以抑制将岩藻糖纳入抗体上的碳水化合物中(参见(例如)WO 2009/135181)。
增加抗体链接的寡糖中的平分型GlcNac结构亦增强ADCC。Umana等人的PCT公开案WO 99/54342阐述经改造以表达修饰糖蛋白的糖基转移酶(例如，β(1,4)-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶III(GnTIII))的细胞系，使得在经改造细胞系中表达的抗体展现增加的平分型GlcNac结构，从而增加抗体的ADCC活性(亦参见Umana等人，(1999)Nat.Biotech.17:176-180)。
已研发了不含半乳糖、唾液酸、岩藻糖及木糖残基(所谓GNGN糖型)且展现增强的ADCC及ADCP但减少的CDC的其他糖基化变体，以及不含唾液酸、岩藻糖及木糖(所谓G1/G2糖型)且展现增强的ADCC、ADCP及CDC的其他糖基化变体。美国专利申请公开案第2013/0149300号。任选地在经遗传修饰的圆叶烟草(N.benthamiana)植物中产生具有此类糖基化型式的抗体，其中敲除了内源性木糖基及岩藻糖基转移酶基因。
糖改造亦可用于通过改变Fc区的Asn297处附接的碳水化合物链的α2,6唾液酸基含量来修饰IgG构建体的抗炎性质，其中增加比例的α2,6唾液酸化形式产生增强的抗炎症效应。参见Nimmerjahn等人(2008)Ann.Rev.Immunol.26:513。相反，在不期望抗炎性质的情形下，具有α2,6唾液酸化碳水化合物的抗体的比例减少可能是有用的。美国专利申请公开案第2008/0206246号提供(例如)通过选择性纯化α2,6唾液酸化形式或通过酶修饰修饰抗体的α2,6唾液酸化含量的方法。在其他实施方案中，Fc区的氨基酸序列可通过(例如)纳入F241A修饰而被修饰以模拟α2,6唾液酸化的效应(参见(例如)WO 2013/095966)。
VIII.抗体物理性质
本文所述的抗体可在轻链或重链可变区中含有一个或多个糖基化位点。此类糖基化位点由于改变的抗原结合可增加抗体的免疫原性或改变抗体的pK(Marshall等人(1972)Annu Rev Biochem 41:673-702；Gala及Morrison(2004)J.Immunol 172:5489-94；Wallick等人(1988)J Exp Med 168:1099-109；Spiro(2002)Glycobiology 12:43R-56R；Parekh等人(1985)Nature 316:452-7；Mimura等人(2000)Mol Immunol 37:697-706)。已知糖基化在含有N-X-S/T序列的基序处发生。在一些实施方案中，抗OX40抗体不含可变区糖基化。这可通过选择可变区中不含糖基化基序的抗体或通过使糖基化区内的残基突变来完成。
在某些实施方案中，本文所述抗体不含天冬酰胺异构位点。天冬酰胺的去酰胺化可在N-G或D-G序列上发生且导致异天冬氨酸残基的产生；异天冬氨酸残基可向多肽链中引入扭结且降低其稳定性(异天冬氨酸效应)。例如，若抗体的重链及/或轻链CDR序列中存在氨基酸序列Asp-Gly，则将该序列替换为不会经历异构化的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:76中所述的重链可变区CDR2序列，但其中Asp-Gly序列(LISYDGSRKHYADSVKG；SEQ ID NO:76)中的Asp或Gly被替换为不会异构化的氨基酸序列，例如Asp-Ser或Ser-Gly序列。在另一实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:88中所述的重链可变区CDR2序列，但其中Asp-Gly序列(AIDTDGGTFYADSVRG；SEQ ID NO:88)中的Asp或Gly被替换为不会异构化的氨基酸序列，例如Ser-Gly、Asp-Ala或Ser-Thr序列。
每一抗体将具有独特的等电点(pI)，其通常在介于6与9.5之间的pH范围内。IgG1抗体的pI通常在7-9.5的pH范围内，IgG4抗体的pI通常在6-8的pH范围内。推测认为pI在正常范围外的抗体可能在体内条件下有一些去折叠及不稳定。因此，优选的是具有含有在正常范围内的pI值的抗OX40抗体。这可通过选择pI在正常范围内的抗体、或使带电表面残基突变来达成。
每一抗体将具有特征性熔融温度，其中熔融温度越高表示体内总体稳定性越大(Krishnamurthy R及Manning M C(2002)Curr Pharm Biotechnol 3:361-71)。通常，优选地，TM1(初始展开的温度)大于60℃、优选大于65℃、更优选大于70℃。抗体的熔点可使用差示扫描量热法(Chen等人(2003)PharmRes 20:1952-60；Ghirlando等人(1999)ImmunolLett 68:47-52)或圆二色(Murray等人(2002)J.Chromatogr Sci 40:343-9)来测量。在优选实施方案中，选择不会快速降解的抗体。抗体的降解可使用毛细管电泳(CE)及MALDI-MS(Alexander AJ及Hughes D E(1995)Anal Chem 67:3626-32)来测量。在某些实施方案中，本文公开的抗OX40抗体(例如，OX40.21抗体)具有增加的稳定性。
因此，在其他实施方案中，选择具有最小聚集效应的抗体，聚集效应可导致触发不期望免疫反应及/或改变或不利的药物动力学性质。通常，抗体可接受25％或更小、优选20％或更小、更优选15％或更小、更优选10％或更小且更优选5％或更小的聚集度。聚集度可通过若干技术(包括大小排阻柱(SEC)、高效液相层析(HPLC)及光散射)来测量。
IX.改造抗体的方法
如本文所论述的，可通过修饰VH及/或VL序列或抗体的恒定区使用具有本文公开的VH及VL序列的抗OX40抗体以产生新抗OX40抗体。因此，在另一实施方案中，使用本文所述抗OX40抗体(例如3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及20C1)的结构特征以产生结构上有关的抗OX40抗体，其保留本文所述抗体的至少一种功能性质，例如与人OX40及食蟹猴OX40的结合。举例而言，可将3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及20C1或其突变的一个或多个CDR区与已知框架区及/或其他CDR以重组方式组合以产生其他经重组改造的本文所述抗OX40抗体，如上文所论述。其他类型的修饰包括先前部分中所阐述的那些。用于改造方法的起始材料系本文所提供VH及/或VL序列中的一或多者或其一个或多个CDR区。为产生经改造抗体，实际上无需制备(即表达为蛋白质)具有本文所提供VH及/或VL序列中的一或多者或其一个或多个CDR区的抗体。相反，使用序列中所含有的资讯作为起始材料以产生源自初始序列的“第二代”序列，且然后制备“第二代”序列并表达为蛋白质。
因此，本文提供生成抗OX40抗体的方法，其包含：
(a)提供：(i)重链可变区抗体序列，其包含选自下组的CDR1序列：SEQ ID NO:11、19、31、39、51、59、67、75及87、选自下组的CDR2序列：SEQ ID NO:12、20、32、40、52、60、68、76、88及317及/或选自下组的CDR3序列：SEQ ID NO:13、21、33、41、53、61、69、77及89；及(ii)轻链可变区抗体序列，其包含选自下组的CDR1序列：SEQ ID NO:14、22、25、34、42、45、54、62、70、78、81及90、选自下组的CDR2序列：SEQ ID NO:15、23、26、35、43、46、55、63、71、79、82及91及/或选自下组的CDR3序列：SEQ ID NO:16、24、27、36、44、47、56、64、72、80、83及92；
(b)改变重链可变区抗体序列及/或轻链可变区抗体序列内的至少一个氨基酸残基以产生至少一个经改变的抗体序列；及
(c)使经改变的抗体序列表达为蛋白质。
可使用标准分子生物学技术来制备并表达经改变的抗体序列。
优选地，由经改变的抗体序列编码的抗体保留本文所述抗OX40抗体的功能性质中的一种、一些或全部，此类功能性质包括：
(1)结合可溶性人OX40，例如以10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)的KD结合，例如如Biacore测定的；
(2)结合膜结合的人OX40，例如以1nM或更小(例如，0.01nM至1nM)的EC50结合，例如如通过FACS测量的；
(3)结合食蟹猴OX40，例如膜结合的食蟹猴OX40，例如以10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)的EC50结合，例如如通过FACS测量的；
(4)诱导或增强T细胞活化，如通过以下所证明：(i)表达OX40的T细胞中增加的IL-2及/或IFN-γ产生及/或(ii)增强的T细胞增殖；
(5)抑制OX40配体与OX40结合，例如如FACS测量的以1nM或更小的EC50结合，例如在利用hOX40-293细胞的测定中；
(6)结合成熟人OX40的细胞外部分上的表位(SEQ ID NO:2)，例如，在区域DVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO:178)或DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGK(SEQ IDNO:179)内的表位；
(7)与3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、18E9、8B11、20B3及20C1竞争结合人OX40；
(8)与6E1-1、6E1-2、14A2-1及14A2-2竞争结合人OX40。
经改变的抗体可展现如上文(1)至(7)所述的功能性质中的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或全部。经改变的抗体的功能特性可使用本领域可获得及/或本文所阐述的标准测定(例如实施例中所阐释的那些(例如ELISA、FACS))来评估。
在改造本文所述抗体的方法的某些实施方案中，可沿抗OX40抗体编码序列的全部或部分随机或选择性引入突变且可针对所得的经修饰的抗OX40抗体筛选如本文所述的结合活性及/或其他功能性质。突变方法已于本领域有所阐述。举例而言，Short的PCT公开案WO 02/092780阐述使用饱和诱变、合成性接合装配或其组合产生及筛选抗体突变的方法。或者，Lazar等人的PCT公开案WO 03/074679阐述使用计算筛选方法以优化抗体的生理化学性质的方法。
X.核酸分子
本文亦提供编码本文所述抗体的核酸分子。此类核酸可存在于全细胞中，存在于细胞溶解物中，或以部分纯化或实质上纯的形式存在。当通过标准技术实施纯化以清除其他细胞组分或其他污染物(例如其他细胞核酸(例如其他染色体DNA，例如连接至自然界中分离的DNA的染色体DNA)或蛋白质)时，核酸系“分离的”或“实质上纯化的”，此类标准技术包括碱/SDS处理、CsCl显带、柱层析、限制酶、琼脂糖凝胶电泳及本领域熟知的其他方法。参见F.Ausubel等人编辑，(1987)Current Protocols in Molecular Biology,GreenePublishing and Wiley Interscience,New York。核酸可为(例如)DNA或RNA且可含有或不含有内含子序列。在某些实施方案中，核酸为cDNA分子。
本文提供的核酸可使用标准分子生物学技术来获得。对于由杂交瘤(例如自携带人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤，如下文进一步阐述)表达的抗体，编码通过杂交瘤制备的抗体的轻链及重链的cDNA可通过标准PCR扩增或cDNA选殖技术来获得。对于自免疫球蛋白基因文库获得(例如使用噬菌体展示技术)的抗体，可自文库回收编码抗体的核酸。
优选的核酸分子是编码3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及20C1的VH及VL序列的那些。编码3F4、14B6、23H3、6E1、18E9、8B11、20B3、14A2及20C1的VH序列的示例性DNA序列分别阐述于SEQ ID NO:126、128、131、133、136、138、140、142及145中。编码3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及20C1的VL序列的示例性DNA序列分别阐述于SEQ ID NO:127、129、130、132、134、135、137、139、141、143、144及146中。编码重链序列的示例性DNA序列阐述于SEQID NO:147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、176及177中。编码轻链序列的示例性DNA序列阐述于SEQ ID NO:148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172及174中。
编码抗OX40抗体的成熟VH及VL结构域的示例性核苷酸序列分别阐述于SEQ IDNO:145及146中。编码抗OX40抗体的重链的示例性核苷酸序列阐述于SEQ ID NO:177中。编码OX40抗体的轻链的示例性核苷酸序列阐述于SEQ ID NO:168中。
制备本文提供的抗OX40抗体的方法可包括使重链及轻链在包含编码具有信号肽的重链及轻链的核苷酸序列的细胞系中表达。本文中亦提供包含此类核苷酸序列的宿主细胞。
一旦获得编码VH及VL区段的DNA片段，即可通过标准重组DNA技术进一步操纵此类DNA片段，以(例如)将可变区基因转化成全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在此类操纵中，编码VL或VH的DNA片段可操作地连接至编码另一蛋白质的另一DNA片段(例如抗体恒定区或柔性接头)。如本上下文中使用的术语“可操作地连接”指两个DNA片段接合，使得其编码的氨基酸序列保持合框。
可通过将编码VH的DNA可操作地连接至编码重链恒定区(铰链、CH1、CH2及/或CH3)的另一DNA分子，将编码VH区的分离的DNA转化成全长重链基因。人类重链恒定区基因的序列为本领域已知(例如，参见Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第五版，美国卫生及公共服务部,NIH公开案第91-3242号)且涵盖此类区的DNA片段可通过标准PCR扩增来获得。重链恒定区可为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，例如IgG1区。对于Fab片段重链基因，编码VH的DNA可操作地连接至仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子。
可通过将编码VL的DNA可操作地连接至编码轻链恒定区CL的另一DNA分子将编码VL区的分离的DNA转化成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人类轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(例如，参见Kabat,E.A.等人，(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第五版，美国卫生及公共服务部,NIH公开案第91-3242号)且涵盖此类区的DNA片段可通过标准PCR扩增来获得。轻链恒定区可为κ或λ恒定区。
为产生scFv基因，将编码VH及VL的DNA片段可操作地连接至编码挠性接头(例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3)的另一片段，使得VH及VL序列可表达为邻接单链蛋白，其中VL及VH区通过挠性接头接合(例如，参见Bird等人(1988)Science 242:423-426；Huston等人(1988)Proc.Natl Acad.Sci.USA85:5879-5883；McCafferty等人，(1990)Nature 348:552-554)。
本文亦提供编码与3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及20C1单克隆抗体的序列同源的VH及VL序列的核酸分子。示例性核酸分子编码与编码3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及20C1单克隆抗体的VH及VL序列的核酸分子至少70％同一、例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一的VH及VL序列。本文亦提供具有保守取代(即，在核酸分子翻译时不改变所得氨基酸序列的取代)的核酸分子，例如用于密码子最优选化。
XI.抗体生成
本文所述的抗OX40抗体可使用多种已知技术(例如由Kohler及Milstein,Nature256:495(1975)阐述的标准体细胞杂交技术)来产生。尽管体细胞杂交程序是优选的，但原则上亦可采用产生单克隆抗体的其他技术，例如B淋巴细胞的病毒性或癌基因性转化、使用人抗体基因文库的噬菌体展示技术。
制备杂交瘤的优选动物系统是鼠类系统。小鼠中的杂交瘤产生是已充分确立的程序。分离融合用免疫脾细胞的免疫方案及技术是本领域已知的。融合配偶体(例如，鼠类骨髓瘤细胞)及融合程序亦是已知的。
本文所述的嵌合或人源化抗体可基于如上文所述制备的鼠类单克隆抗体的序列来制备。编码重链及轻链免疫球蛋白的DNA可自所关注鼠类杂交瘤获得并使用标准分子生物学技术加以改造，使其含有非鼠类(例如，人类)免疫球蛋白序列。举例而言，为产生嵌合抗体，可使用本领域已知方法将鼠类可变区连接至人类恒定区(例如，参见颁予Cabilly等人的美国专利第4,816,567号)。为产生人源化抗体，可使用本领域已知方法将鼠类CDR区插入人类框架中(例如，参见颁予Winter的美国专利第5,225,539号及颁予Queen等人的美国专利第5,530,101号、第5,585,089号、第5,693,762号及第6,180,370号)。
在一个实施方案中，本文所述抗体是人类单克隆抗体。可使用携带人类免疫系统而非小鼠系统的部分的转基因或转染色体小鼠来产生针对OX40的此类人类单克隆抗体。此类转基因及转染色体小鼠包括在本文中分别称为HuMAb小鼠及KM小鼠的小鼠，且在本文中统称为“人类Ig小鼠”。
HuMAb
Figure BDA0001559815020000871
(Medarex,Inc.)含有编码非重排人类重链(μ及γ)及κ轻链免疫球蛋白序列以及使内源性μ及κ链基因座不活化的靶突变的人类免疫球蛋白基因微小基因座(例如，参见Lonberg等人(1994)Nature 368(6474):856-859)。因此，小鼠展现降低的小鼠IgM或κ表达，且响应于免疫，所引入的人类重链及轻链转基因经历类别转换及体细胞突变，生成高亲和力的人类IgGκ单克隆(Lonberg,N.等人(1994)，见上文引文；参阅Lonberg,N.(1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101；Lonberg,N.及Huszar,D.(1995)Intern.Rev.Immunol.13:65-93，及Harding,F.及Lonberg,N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764:536-546)。HuMab小鼠的制备及使用及由此类小鼠携带的基因体修饰进一步阐述于以下文献中：Taylor,L.等人(1992)Nucleic AcidsResearch 20:6287-6295；Chen,J.等人(1993)International Immunology 5:647-656；Tuaillon等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:3720-3724；Choi等人(1993)Nature Genetics 4:117-123；Chen,J.等人(1993)EMBO J.12:821-830；Tuaillon等人(1994)J.Immunol.152:2912-2920:Taylor,L.等人(1994)International Immunology 6:579-591；及Fishwild,D.等人(1996)NatureBiotechnology 14:845-851，所有参考文献的内容系全文以引用方式明确并入本文中。进一步参见所有皆颁予Lonberg及Kay的美国专利第5,545,806号、第5,569,825号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,789,650号、第5,877,397号、第5,661,016号、第5,814,318号、第5,874,299号及第5,770,429号；颁予Surani等人的美国专利第5,545,807号；所有皆颁予Lonberg及Kay的PCT公开案第WO 92/03918号、第WO 93/12227号、第WO 94/25585号、第WO 97/13852号、第WO 98/24884号及第WO 99/45962号；及颁予Korman等人的PCT公开案第WO 01/14424号。
在某些实施方案中，本文所述抗体系使用在转基因及转染色体上携带人类免疫球蛋白序列的小鼠(例如携带人类重链转基因及人类轻链转染色体的小鼠)产生。此类小鼠(在本文中称作“KM小鼠”)详细阐述于颁予Ishida等人的PCT公开案WO 02/43478中。
此外，本领域可获得表达人类免疫球蛋白基因的替代性转基因动物系统且可使用其来产生本文所述抗OX40抗体。
举例而言，可使用称作Xenomouse(Abgenix,Inc.)的替代性转基因系统；此类小鼠阐述于(例如)颁予Kucherlapati等人的美国专利第5,939,598号、第6,075,181号、第6,114,598号、第6,150,584号及第6,162,963号中。
此外，本领域可获得表达人类免疫球蛋白基因的替代性转染色体动物系统且可使用其来产生本文所述抗OX40抗体。举例而言，可使用携带人类重链转染色体及人类轻链转染色体的小鼠，称作“TC小鼠”；此类小鼠阐述于Tomizuka等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:722-727中。此外，携带人类重链及轻链转染色体的牛已在本领域加以阐述(Kuroiwa等人(2002)Nature Biotechnology 20:889-894)且可使用其来产生本文所述抗OX40抗体。
本领域阐述的用于产生人抗体(例如人类抗OX40抗体)的其他小鼠系统包括(i)
Figure BDA0001559815020000881
小鼠(Regeneron Pharmaceuticals,Inc.)，其中内源性小鼠重链及轻链可变区经由同源重组经人类重链及轻链可变区置换，可操作地连接至内源小鼠恒定区，使得在小鼠中产生嵌合抗体(人类V/小鼠C)，且随后使用标准重组DNA技术转化成完全人抗体；及(ii)
Figure BDA0001559815020000882
小鼠(Merus Biopharmaceuticals,Inc.)，其中小鼠含有非重排人类重链可变区而非单一重排人类常见轻链可变区。此类小鼠及其产生抗体的用途阐述于(例如)WO 2009/15777、US 2010/0069614、WO 2011/072204、WO 2011/097603、WO 2011/163311、WO 2011/163314、WO 2012/148873、US 2012/0070861及US 2012/0073004中。
本文所述人类单克隆抗体亦可使用用于筛选人类免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示方法来制备。用于分离人抗体的此类噬菌体展示方法已于本领域确立。参见(例如)：颁予Ladner等人的美国专利第5,223,409号、第5,403,484号及第5,571,698号；颁予Dower等人的美国专利第5,427,908号及第5,580,717号；颁予McCafferty等人的美国专利第5,969,108号及第6,172,197号；及颁予Griffiths等人的美国专利第5,885,793号、第6,521,404号、第6,544,731号、第6,555,313号、第6,582,915号及第6,593,081号。
本文所述人类单克隆抗体亦可使用SCID小鼠来制备，其中人类免疫细胞已经重构以使得可在实施免疫后生成人抗体反应。这些小鼠阐述于(例如)颁予Wilson等人的美国专利第5,476,996号及第5,698,767号中。
免疫
为生成OX40的完全人抗体，可利用OX40抗原的纯化或富集制备物及/或表达OX40或其片段的细胞对含有人类免疫球蛋白基因的转基因或转染色体小鼠(例如，HCo12、HCo7或KM小鼠)实施免疫，如针对其他抗原由(例如)Lonberg等人(1994)Nature 368(6474):856-859；Fishwild等人(1996)Nature Biotechnology 14:845-851及WO 98/24884所述。或者，可利用编码人OX40或其片段的DNA对小鼠实施免疫。优选地，小鼠在首次输注时为6-16周龄。举例而言，可使用重组OX40抗原的纯化或富集制备物(5-50μg)对HuMAb小鼠实施腹膜内免疫。倘若使用OX40抗原的纯化或富集制备物的免疫不产生抗体，亦可利用表达OX40的细胞(例如细胞系)对小鼠实施免疫以促进免疫反应。示例性细胞系包括过表达OX40的稳定CHO及Raji细胞系。
利用各种抗原的累积经验已显示，在最初用Ribi佐剂中的抗原经腹膜内(IP)或皮下(SC)实施免疫、而后用Ribi佐剂中的抗原每隔一周IP/SC免疫(至多总共10次)时，HuMAb转基因小鼠反应最佳。可在免疫方案过程中利用血浆样品监测免疫反应，此类血浆样品系通过眶后取血获得。通过ELISA及FACS(如下文所述)筛选血浆，且可使用具有抗OX40人类免疫球蛋白的足够效价的小鼠进行融合。可在处死及去除脾及淋巴结之前3天将小鼠用抗原静脉内加强免疫。预计每次免疫可能需要实施2-3次融合。通常对于每一抗原对介于6只与24只之间的小鼠实施免疫。通常，使用HCo7、HCo12及KM菌株。另外，可将HCo7及HCo12转基因一起配种成具有两种不同人类重链转基因(HCo7/HCo12)的单一小鼠。
产生OX40的单克隆抗体的杂交瘤的生成
为生成产生本文所述抗体的杂交瘤，可自免疫小鼠分离脾细胞及/或淋巴结细胞并融合至适当永生细胞系，例如小鼠骨髓瘤细胞系。所得杂交瘤可经筛选用于产生抗原特异性抗体。举例而言，可使用50％PEG将来自经免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬浮液融合至Sp2/0非分泌小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1581)。将细胞以约2×105铺板于平底微量滴定板中，而后在含有10％胎儿克隆血清、18％“653”条件化培养基、5％奥瑞金(origen，IGEN)、4mML-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、5mM HEPES、0.055mM 2-巯基乙醇、50单位/ml青霉素(penicillin)、50mg/ml链霉素(streptomycin)、50mg/ml庆大霉素(gentamycin)及1×HAT(Sigma)的选择性培养基中培育两周。约两周后，可在HAT更换为HT的培养基中培养细胞。然后可通过ELISA针对人类单克隆IgM及IgG抗体筛选个别孔。一旦出现杂交瘤过度生长，通常即可在10-14天后观察培养基。可将分泌抗体的杂交瘤再铺板，再次筛选，且若对人类IgG仍呈阳性，则可通过限制性稀释将单克隆抗体亚克隆至少两次。然后可在体外培养稳定的亚克隆以在组织培养基中产生少量抗体用于表征。
为纯化抗体，可使所选的杂交瘤在两升旋转烧瓶中生长用于单克隆抗体纯化。可将上清液过滤并浓缩，然后使用蛋白质A-sepharose(Pharmacia,Piscataway,N.J.)进行亲和层析。可通过凝胶电泳及高效液相层析检查所洗脱的IgG以确保纯度。可将缓冲溶液更换为PBS，且可使用1.43消光系数通过OD280来测定浓度。随后可将单克隆抗体等分并储存于-80℃下。
产生OX40的单克隆抗体的转染瘤的生成
抗体可在宿主细胞转染瘤中使用(例如)如本领域所熟知的重组DNA技术及基因转染方法的组合产生(Morrison,S.(1985)Science 229:1202)。
举例而言，为表达抗体或其抗体片段，可通过标准分子生物学技术(例如使用表达所关注抗体的杂交瘤的PCR扩增或cDNA克隆)获得编码部分或全长轻链及重链的DNA，且可将DNA插入表达载体中，使得此类基因可操作地连接至转录及翻译控制序列。在此背景下，术语“可操作地连接”欲指使抗体基因接合至载体中，使得该载体内的转录及翻译控制序列发挥其调控抗体基因的转录及翻译的预期功能。表达载体及表达控制序列经选择与所用表达宿主细胞相容。可将抗体轻链基因及抗体重链基因插入单独载体中，或将两种基因插入同一表达载体中。通过标准方法(例如将抗体基因片段上的互补限制位点与载体连接，或若不存在限制位点，则利用平端连接)将抗体基因插入表达载体中。可使用本文所述抗体的轻链及重链可变区通过将其插入已编码期望同型的重链恒定区及轻链恒定区的表达载体中来产生任何抗体同型的全长抗体基因，使得VH区段可操作地连接至载体内的CH区段，且使VL区段可操作地连接至载体内的CL区段。
另外/或者，重组表达载体可编码有利于自宿主细胞分泌抗体链的信号肽。可将抗体链基因克隆至载体中，使得信号肽在框架内连接至抗体链基因的氨基末端。信号肽可为免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。用于抗体重链及轻链中的示例性信号序列包括最初于本文所述抗OX40抗体中发现的信号序列。
除抗体链基因外，重组表达载体可携带控制抗体链基因在宿主细胞中的表达的调控序列。术语“调控序列”意欲包括控制抗体链基因转录或翻译的启动子、增强子及其他表达控制元件(例如，聚腺苷酸化信号)。此类调控序列阐述于(例如)Goeddel(GeneExpression Technology.Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990))中。本领域技术人员应了解，表达载体的设计(包括调控序列的选择)可依赖于诸如欲转化的宿主细胞的选择、期望蛋白质的表达程度等因素而定。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调控序列包括在哺乳动物细胞中引导较高蛋白质表达程度的病毒元件，例如源自以下各项的启动子及/或增强子：巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))及多瘤病毒。或者，可使用非病毒调控序列，例如泛素启动子或β-球蛋白启动子。此外，调控元件由来自不同来源(例如SRα启动子系统)的序列构成，该SRα启动子系统含有来自SV40早期启动子的序列及人类T细胞1型白血病病毒的长末端重复(Takebe,Y.等人(1988)Mol.Cell.Biol.8:466-472)。
除抗体链基因及调控序列外，重组表达载体亦可携带其他序列，例如调控载体在宿主细胞中复制的序列(例如复制起点)及可选标记物基因。可选标记物基因有利于选择其中已引入载体的宿主细胞(例如，参见所有皆由Axel等人的美国专利第4,399,216号、第4,634,665号及第5,179,017号)。举例而言，可选标记物基因通常赋予在已引入载体的宿主细胞上对药物(例如G418、潮霉素(hygromycin)或氨甲蝶呤(methotrexate))的抗性。优选可选标记物基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(针对dhfr-宿主细胞用于氨甲蝶呤选择/扩增)及neo基因(针对G418选择)。
对于轻链及重链的表达，通过标准技术将编码重链及轻链的表达载体转染至宿主细胞中。术语“转染”的各种形式意欲涵盖常用于将外源性DNA引入原核或真核宿主细胞中的多种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等等。尽管理论上可在原核或真核宿主细胞中表达本文所述抗体，但在真核细胞(且最优选哺乳动物宿主细胞)中表达抗体是最优选的，这是因为这些真核细胞，具体而言哺乳动物细胞，较原核细胞更有可能装配并分泌经适当折叠且具有免疫活性的抗体。已报导抗体基因的原核表达对高产率从的活性抗体的产生无效(Boss,M.A.及Wood,C.R.(1985)Immunology Today 6:12-13)。本文公开的抗体亦可在经糖改造的酵母——巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株中产生。Li等人(2006)Nat.Biotechnol 24:210。
用于表达本文所述重组抗体的优选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(包括dhfr-CHO细胞，阐述于Urlaub及Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-4220中，与DHFR可选标记物一起使用，例如如R.J.Kaufman及P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.759:601-621中所述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞及SP2细胞。具体而言，对于与NSO骨髓瘤细胞的使用，另一优选表达系统是WO 87/04462、WO 89/01036及EP 338,841中公开的GS基因表达系统。在将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养足以容许抗体在宿主细胞中表达、或更优选地，使抗体分泌至宿主细胞生长的培养基中的时间段来产生抗体。可使用标准蛋白质纯化方法自培养基回收抗体。
由于常见的翻译后修饰，本发明的抗体多肽的N-及C-末端与预期的序列可能有不同。举例而言，经常自抗体重链失去C-末端赖氨酸残基。Dick等人(2008)Biotechnol.Bioeng.100:1132。N-末端谷氨酰胺残基，以及谷氨酸残基(较前者为少见)经常在治疗抗体的轻链及重链上被转化成焦谷氨酸残基。Dick等人(2007)Biotechnol.Bioeng.97:544；Liu等人(2011)JBC 28611211；Liu等人(2011)J.Biol.Chem.286:11211。
XII.测定
可通过(例如)标准ELISA针对与OX40的结合测试本文所述抗OX40抗体。简而言之，将微量滴定板用PBS中的1-2μg/ml的纯化OX40涂布，且随后用PBS中的5％牛血清白蛋白封阻。将抗体的稀释物(例如，来自OX40免疫的小鼠的血浆的稀释物)添加至每一孔中并于37℃下培育1-2小时。将板用PBS/Tween洗涤且随后于37℃下与偶联至辣根过氧化酶(HRP)的二级试剂(例如，对于人抗体，山羊-抗人IgG Fc特异性多克隆试剂)一起培育1小时。在洗涤后，将板用ABTS受质(Moss Inc，产品：ABTS-1000)显影并通过分光光度计于OD 415-495下进行分析。随后通过流式细胞术针对与表达人OX40的细胞系、而非不表达OX40的对照细胞系的结合进一步筛选来自经免疫小鼠的血清。简而言之，通过将表达OX40的CHO细胞与抗OX40抗体以1:20稀释一起培育来评估抗OX40抗体的结合。洗涤细胞并利用PE标记的抗人IgG Ab检测结合。使用FACScan流式细胞术(Becton Dickinson,San Jose,CA)实施流式细胞分析。优选地，产生最高效价的小鼠将用于融合。
如上文所述ELISA分析可用于筛选抗体且因此筛选杂交瘤，此类杂交瘤产生显示与OX40免疫原的阳性反应性的抗体。随后可亚克隆并进一步表征产生优选以高亲和力结合OX40的抗体的杂交瘤。随后可选择来自每一杂交瘤的一个克隆(其保留母体细胞的反应性(通过ELISA))用于制备细胞库并用于抗体纯化。
为纯化抗OX40抗体，可使所选杂交瘤在两升旋转烧瓶中生长用于单克隆抗体纯化。可将上清液过滤并浓缩，而后使用蛋白质A-sepharose(Pharmacia,Piscataway,NJ)进行亲和层析。可通过凝胶电泳及高效液相层析检查所洗脱的IgG以确保纯度。可将缓冲溶液更换为PBS，且可使用1.43消光系数通过OD280来测定浓度。可将单克隆抗体等分并储存于-80℃下。
为确定所选抗OX40抗体是否结合独特表位，可使用市售试剂(Pierce,Rockford,IL)生物素化每一抗体。可利用链霉抗生物素蛋白标记的探针检测生物素化MAb结合。可使用如上文所述OX40包被的ELISA板实施使用未经标记的单克隆抗体及生物素化单克隆抗体的竞争研究。
为测定纯化抗体的同型，可使用对特定同型的抗体具有特异性的试剂实施同型ELISA。举例而言，为测定人类单克隆抗体的同型，可于4℃下将微量滴定板的孔用1μg/ml抗人免疫球蛋白包被过夜。在用1％BSA封闭后，于环境温度下使板与1μg/ml或更少测试单克隆抗体或纯化同型对照反应1至2小时。随后可使孔与人类IgG1或人类IgM特异性碱性磷酸酶偶联的探针反应。如上文所述使板显影并加以分析。
为测试单克隆抗体与表达OX40的活细胞的结合，可使用流式细胞术，如实施例中所述。简而言之，将表达膜结合的OX40的细胞系(在标准生长条件下生长)与含有0.1％BSA的PBS中的不同浓度的单克隆抗体于4℃下混合1小时。在洗涤后，在与一级抗体染色相同的条件下使细胞与荧光黄标记的抗IgG抗体反应。可通过FACScan仪器使用光及侧向散射性质分析样品以导通单一细胞且测定经标记抗体的结合。可使用使用荧光显微术的替代测定(除流式细胞术分析外或代替流式细胞术分析)。可如上文所述精确染色细胞并通过荧光显微术检查。此方法容许可视化个别细胞，但依赖于抗原的密度而定可具有减低的灵敏性。
可通过西方墨点法针对与OX40抗原的反应性进一步测试抗OX40抗体。简而言之，可自表达OX40的细胞制备细胞萃取物且使其经受十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。在电泳后，将分离抗原转移至硝基纤维素膜，用20％小鼠血清封闭，并用欲测试的单克隆抗体探测。可使用抗IgG碱性磷酸酶检测IgG结合并用BCIP/NBT受质片(Sigma Chem.Co.,St.Louis,MO)使其显影。
用于分析结合亲和力、交叉反应性及结合动力学的方法包括本领域已知的标准分析，例如使用
Figure BDA0001559815020000941
2000SPR仪器(Biacore AB,Uppsala,Sweden)的
Figure BDA0001559815020000942
SPR分析。
在某些实施方案中，抗OX40抗体特异性结合人OX40的细胞外区。举例而言，抗体可特异性结合OX40的细胞外结构域内的特定结构域(例如，功能结构域)。在特定实施方案中，抗体特异性结合OX40-L结合的OX40上的位点。在其他实施方案中，抗体特异性结合人OX40的细胞外区及食蟹猴OX40的细胞外区。
XIII.免疫偶联物、抗体衍生物及诊断
本文所述抗OX40抗体可用于诊断目的，包括样品测试及体内成像，且为此目的，可将抗体(或其结合片段)偶联至适当可检测的试剂，以形成免疫偶联物。为诊断目的，适当试剂是可检测的标记，其包括用于全身成像的放射性同位素、及用于样品测试的放射性同位素、酶、荧光标记及其他适宜抗体标记。
可检测标记可为体外诊断领域中当前所用的各种类型中的任一者，包括包含金属溶胶(例如胶状金)的颗粒标记、提供有(例如)N2S2、N3S或N4类型的肽螯合剂的同位素(例如I125或Tc99)、发色团(包括荧光标记物、生物素、发光标记物、磷光标记物等等)、以及将给定底物转化成可检测标记物的酶标记及在通过(例如)聚合酶链式反应扩增后显示的多核苷酸标记。随后可通过抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白结合来检测生物素化抗体。适宜的酶标记包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等等。举例而言，标记可为酶碱性磷酸酶，其系在1,2二氧杂环丁烷底物(例如金刚烷基甲氧基磷酰基氧基苯基二氧杂环丁烷(AMPPD)、3-(4-(甲氧基螺{1,2-二氧杂环丁烷-3,2'-(5'-氯)三环{3.3.1.13,7}癸}-4-基)苯基磷酸二钠(CSPD)、以及CDP及
Figure BDA0001559815020000951
或本领域技术人员熟知的其他发光底物(例如适宜镧系元素(例如铽(III)及铕(III))的螯合物)转化后通过测量化学发光的存在或形成来检测。通过所选标记测定检测方式。在标记是颗粒且以适当程度累积的情形下，标记或其反应产物的外观可使用裸眼看到，或使用仪器(例如分光光度计、发光仪、荧光计等等)看到，所有这些均根据标准实践。
优选地，偶联方法产生实质上(或几乎)是非免疫原性的联接，例如肽-(即酰胺-)、硫化物-(立体阻碍)、二硫化物-、腙-及醚联接。此类联接几乎是非免疫原性的且在血清内显示合理的稳定性(例如，参见Senter,P.D.,Curr.Opin.Chem.Biol.13(2009)235-244；WO2009/059278；WO 95/17886)。
依赖于部分及抗体的生物化学性质而定，可利用不同偶联策略。倘若部分是50至500个氨基酸的天然或重组多肽，则在阐述蛋白偶联物的合成的化学法的教科书中存在标准程序，其可由本领域普通技术人员容易地遵守(例如，参见Hackenberger,C.P.R.及Schwarzer,D.,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.47(2008)10030-10074)。在一个实施方案中，使用抗体或部分内的马来酰亚胺基部分与半胱氨酸残基的反应。倘若(例如)使用抗体的Fab或Fab'-片段，则此系尤其适宜的偶合化学。或者，在一个实施方案中，偶合至抗体或部分的C-末端。蛋白质(例如Fab-片段)的C-末端修饰可如(例如)所述实施(Sunbul,M.及Yin,J.,Org.Biomol Chem.7(2009)3361-3371)。
一般而言，位点特异性反应及共价偶合是基于将天然氨基酸转变成具有与存在的其他官能基的反应性正交的反应性的氨基酸。举例而言，稀有序列上下文内的具体半胱氨酸可在醛中经酶转化(参见Frese,M.A.及Dierks,T.,ChemBioChem.10(2009)425-427)。亦可通过在给定序列上下文中利用某些酶与天然氨基酸的特异性酶反应性来获得期望氨基酸修饰(例如，参见Taki,M.等人，Prot.Eng.Des.Sel.17(2004)119-126；Gautier,A.等人，Chem.Biol.15(2008)128-136；且蛋白酶催化的C-N键的形成阐述于Bordusa,F.,Highlights in Bioorganic Chemistry(2004)389-403中)。
亦可通过末端氨基酸与适当修饰试剂的选择性反应达成位点特异性反应及共价偶合。
N-末端半胱氨酸与苄腈的反应性(参见Ren,H.等人，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.48(2009)9658-9662)可用于实现位点特异性的共价偶合。
天然化学接合亦可依赖于C-末端半胱氨酸残基(Taylor,E.Vogel；Imperiali,B,Nucleic Acids and Molecular Biology(2009),22(Protein Engineering),65-96)。
EP 1 074 563阐述了偶联方法，其原理是一段带负电荷氨基酸内的半胱氨酸的反应较位于一段带正电氨基酸中的半胱氨酸快。
部分亦可为合成肽或肽模拟物。倘若多肽是化学合成的，则在该合成期间可纳入具有正交化学反应性的氨基酸(例如，参见de Graaf,A.J.等人，Bioconjug.Chem.20(2009)1281-1295)。由于有许多正交官能基可供使用且可引入合成肽中，故该肽与接头的偶联是标准化学方法。
为获得单标记的多肽，可通过层析分离具有1:1化学计量的偶联物与其他偶联副产物。可通过使用染料标记的结合对成员及带电接头促进此程序。通过使用此类经标记且带高负电荷的结合对成员，容易分离单偶联的多肽与未经标记的多肽及携带一个以上接头的多肽，这是因为可使用电荷及分子量的差异进行分离。荧光染料可用于纯化复合物与未结合的组分，如经标记的单价结合物。
在一个实施方案中，附接至抗OX40抗体的部分选自下组：结合部分、标记部分及生物活性部分。
本文所述抗OX40抗体亦可偶联至治疗剂以形成免疫偶联物，例如抗体-药物偶联物(ADC)。适宜的治疗剂包括抗代谢物、烷基化剂、DNA小沟粘合剂、DNA嵌入剂、DNA交联剂、组织蛋白去乙酰酶抑制剂、出核转运抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶I或II抑制剂、热休克蛋白抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、抗生素及抗有丝分裂剂。在ADC中，抗体及治疗剂优选经由可裂解接头(例如肽基、二硫化物或腙接头)偶联。更佳地，接头是肽基接头，例如Val-Cit、Ala-Val、Val-Ala-Val、Lys-Lys、Pro-Val-Gly-Val-Val(SEQ ID NO:180)、Ala-Asn-Val、Val-Leu-Lys、Ala-Ala-Asn、Cit-Cit、Val-Lys、Lys、Cit、Ser或Glu。ADC可如以下中所述制备：美国专利第7,087,600号、第6,989,452号及第7,129,261号；PCT公开案WO 02/096910、WO 07/038658、WO 07/051081、WO 07/059404、WO 08/083312及WO 08/103693；美国专利公开案20060024317、20060004081及20060247295；其公开内容以引用方式并入本文中。
更具体而言，在ADC中，抗体偶联至药物，其中抗体起靶向试剂的作用用于将ADC引导至表达其抗原的靶细胞(例如癌细胞)。优选地，抗原是肿瘤相关的抗原，即由癌细胞独特表达或过表达的抗原。一旦到达那里，药物就在靶细胞内部或在靶细胞附近释放，以用作治疗剂。关于ADC在癌症疗法中的作用机制及用途的综述，参见Schrama等人，NatureRev.Drug Disc.2006,5,147。
对于癌症治疗，药物优选是引起靶向癌细胞死亡的细胞毒性药物。可用于ADC中的细胞毒性药物包括以下类型的化合物及其类似物及衍生物：
(a)烯二炔(例如卡奇霉素(calicheamicin)(参见(例如)Lee等人，J.Am.Chem.Soc.1987,109,3464及3466)及安西霉素(uncialamycin)(参见(例如)Davies等人，WO 2007/038868 A2(2007)及Chowdari等人，US 8,709,431 B2(2012))；
(b)微管溶素(参见(例如)Domling等人，US 7,778,814B2(2010)；Cheng等人，US8,394,922 B2(2013)；及Cong等人，于2014年2月11日提出申请的美国第14/177376号))；
(c)CC-1065及多卡米星(duocarmycin)(参见(例如)Boger,US 6,5458,530 B1(2003)；Sufi等人，US 8,461,117 B2(2013)；及Zhang等人，US 2012/0301490 A1(2012))；
(d)埃博霉素(epothilone)(参见(例如)Vite等人，US 2007/0275904 A1(2007)及US RE42930 E(2011))；
(e)奥里斯他汀(auristatin)(参见(例如)Senter等人，US 6,844,869 B2(2005)及Doronina等人，US 7,498,298 B2(2009))；
(f)吡咯并苯并二氮卓(PBD)二聚体(参见(例如)Howard等人，US 2013/0059800Al(2013)；US 2013/0028919 A1(2013)；及WO 2013/041606 A1(2013))；及
(g)类美登素(maytansinoid)(例如DM1及DM4)(参见(例如)Chari等人，US 5,208,020(1993)及Amphlett等人，US 7,374,762 B2(2008))。
在ADC中，接头共价连接抗体及药物。通常，存在一个附接至每一接头的药物分子，但接头可具支链，从而容许附接复数个药物分子以增加每ADC递送的药物载荷。此外，每一抗体可附接一个以上的接头。ADC上携带的药物分子的数目称作药物-抗体比率(DAR)。举例而言，若抗体的每一重链附接有一个接头，该接头又附接有一个药物分子，则DAR为2。优选地，DAR介于1与5之间，更佳地介于2与4之间。本领域普通技术人员亦应了解，尽管在每一个别ADC中抗体偶联至整数数目的药物分子，但就整体而言，ADC的制备可分析非整数DAR，这反映统计平均数。概言之，ADC的架构可由下式代表：
[抗体]-[接头-(药物)n]m
其中通常m为1、2、3、4、5或6(优选2、3或4)且n为1、2或3。
在一些实施方案中，接头含有在靶细胞内部或在其附近裂解以释放药物的可裂解基团。在其他实施方案中，接头不含可裂解基团，而是ADC依赖于抗体的分解代谢以释放药物。
一类可裂解基团是pH敏感性基团。血浆中的pH稍微高于中性，而溶酶体—这是大部分ADC内化到靶细胞内后的归宿—内的pH为酸性，为约5。因此，酸催化裂解的可裂解基团的裂解速率在溶酶体内会比血浆内快若干个数量级。酸敏感性基团的实例包括顺式-乌头基酰胺及腙，如以下文献中所述：Shen等人，US 4,631,190(1986)；Shen等人，US 5,144,011(1992)；Shen等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.1981,102,1048；及Yang等人，Proc.Nat'l Acad.Sci(USA),1988,85,1189；其公开内容以引用方式并入本文中。
在另一实施方案中，可裂解基团是二硫化物。二硫化物可通过硫醇-二硫化物交换机制以取决于环境硫醇浓度的速率裂解。由于谷胱甘肽及其他硫醇的细胞内浓度高于其血清浓度，故二硫化物的裂解速率将在细胞内较高，即在ADC内化后。此外，可通过调节二硫化物的立体及电子特征(例如，烷基-芳基二硫化物对烷基-烷基二硫化物；芳基环上的取代等)、从而使得可设计具有增强的血清稳定性或特定裂解速率的二硫化物链接来调节硫醇-二硫化物交换的速率。对于与偶联物中的二硫化物可裂解基团有关的其他公开内容，参见(例如)Thorpe等人，Cancer Res.1988,48,6396；Santi等人，US 7,541,530 B2(2009)；Ng等人，US 6,989,452 B2(2006)；Ng等人，WO 2002/096910 A1(2002)；Boyd等人，US 7,691,962B2(2010)；及Sufi等人，US 2010/0145036 A1(2010)；其公开内容以引用方式并入本文中。
优选的可裂解基团是这样的肽，其选择性地被靶细胞内部的蛋白酶裂解，而不被血清内的蛋白酶裂解。通常，可裂解肽基团包含1至20个氨基酸、优选1至6个氨基酸、更佳1至3个氨基酸。氨基酸可为天然及/或非天然α-氨基酸。天然氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸以及由这些氨基酸衍生的氨基酸，例如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、瓜氨酸及O-磷酸丝氨酸。在此上下文中，术语“氨基酸”亦包括氨基酸类似物及模拟物。类似物系具有天然氨基酸的相同一般H2N(R)CHCO2H结构的化合物，只是R基团并非在天然氨基酸中发现。类似物的实例包括高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸-亚砜及甲硫氨酸甲基锍。氨基酸模拟物是具有不同于α-氨基酸的一般化学结构的结构但以与其类似的方式起作用的化合物。氨基酸可具有遗传编码的氨基酸的“L”立体化学、以及镜像异构“D”立体化学。
优选地，可裂解肽基团含有作为蛋白酶的可裂解识别序列的氨基酸序列。许多可裂解识别序列是本领域已知的。参见(例如)Matayoshi等人，Science 247:954(1990)；Dunn等人，Meth.Enzymol.241:254(1994)；Seidah等人，Meth.Enzymol.244:175(1994)；Thornberry,Meth.Enzymol.244:615(1994)；Weber等人，Meth.Enzymol.244:595(1994)；Smith等人，Meth.Enzymol.244:412(1994)；及Bouvier等人，Meth.Enzymol.248:614(1995)；其公开内容以引用方式并入本文中。
更优选地，可裂解肽基团包含被选用于供内体或溶酶体蛋白酶、尤其是后者所裂解的氨基酸序列。此类蛋白酶的实例包括组织蛋白酶B、C、D、H、L及S，尤其是组织蛋白酶B。组织蛋白酶B优先裂解在N-至-C方向上书写的序列-AA2-AA1-处的肽，其中AA1系碱性或强烈氢键结氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸或瓜氨酸)且AA2系疏水氨基酸(例如苯丙氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)，例如Val-Cit(其中Cit表示瓜氨酸)或Val-Lys。对于关于组织蛋白酶-可裂解基团的其他资讯，参见Dubowchik等人，Biorg.Med.Chem.Lett.1998,8,3341；Dubowchik等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,3347；及Dubowchik等人，Bioconjugate Chem.2002,13,855；其公开内容以引用方式并入。可用于裂解肽基接头的另一酶系天冬氨酸内肽酶(legumain，一种优先在Ala-Ala-Asn处裂解的溶酶体半胱氨酸蛋白酶)。
在优选实施方案中，ADC中的接头包含由位于靶细胞内部的蛋白酶优先裂解的二肽或三肽。优选地，二肽或三肽可由组织蛋白酶B裂解，更优选为Val-Cit或Val-Lys二肽。
亦可使用单一氨基酸可裂解肽基团，如Chen等人，US 2010/0113476 A1(2010)中所公开，其公开内容以引用方式并入本文中。
对于并不意图被细胞内化的偶联物，可选择可裂解基团，使得其由在靶细胞附近的细胞外基质内存在的蛋白酶、例如由接近死亡的细胞释放的蛋白酶或肿瘤相关的蛋白酶裂解。示例性细胞外肿瘤相关的蛋白酶系基质金属蛋白酶(MMP)、纤溶酶、甲拌磷寡肽酶(TOP)及CD10。参见(例如)Trouet等人，US 5,962,216(1999)及US 7,402,556 B2(2008)；Dubois等人，US 7,425,541 B2(2008)；及Bebbington等人，US 6,897,034 B2(2005)；其公开内容以引用方式并入本文中。
除共价连接抗体及药物外，接头可实施其他功能。举例而言，接头可含有聚(乙二醇)(PEG)基团，其增强在实施偶联化学期间或在最终ADC产物中的溶解性。
接头可进一步包括位于可裂解肽基团附近的自分解部分。自分解基团充当间隔物，其防止抗体及/或药物部分以立体方式干扰肽基团由蛋白酶裂解、但其后自身自发释放(即，自分解)以不干扰药物的作用。参见Carl等人，J.Med.Chem.1981,24(3),479；Carl等人，WO 81/01145(1981)；Dubowchik等人，Pharmacology&Therapeutics 1999,83,67；Firestone等人，US 6,214,345 B1(2001)；Toki等人，J.Org.Chem.2002,67,1866；Doronina等人，Nature Biotechnology 2003,21(7),778(勘误，第941页)；de Groot等人，Org.Chem.2001,66,8815；Boyd等人，US 7,691,962 B2(2010)；Boyd等人，US 2008/0279868A1(2008)；Sufi等人，WO 2008/083312 A2(2008)；Feng,US 7,375,078 B2(2008)；Jeffrey,US 8,039,273 B2(2011)；及Senter等人，US 2003/0096743A1(2003)；其公开内容以引用方式并入。
优选自分解基团系对-氨基苄基氧基羰基(PABC)，下文绘出了其结构及作用机制：
Figure BDA0001559815020001001
因此，在优选实施方案中，ADC具有包含由定位于靶细胞内部的蛋白酶优先裂解的二肽或三肽及毗邻二肽或三肽的自分解基团的接头。优选地，二肽或三肽可由组织蛋白酶B裂解。优选地，自分解基团系PABC基团。
多种技术可用于偶联抗体及药物。在优选者中，使抗体中的赖氨酸残基的侧链中的ε-氨基与2-亚氨基四氢噻吩反应以引入游离硫醇(-SH)基团。硫醇基团可与马来酰亚胺或其他亲核剂受体基团反应以实现偶联，如下文阐释的：
Figure BDA0001559815020001011
通常，获得每个抗体两个或三个硫醇的硫醇化程度。对于代表性程序，参见Chowdari等人，US 8,709,431 B2(2014)，其公开内容以引用方式并入本文中。因此，在一个实施方案中，本发明抗体具有一个或多个(优选两个或三个)通过与亚氨基四氢噻吩反应修饰的赖氨酸残基。
替代偶联技术采用无铜的“点击化学(click chemistry)”，其中横跨环辛炔的应变炔烃键添加叠氮化物基团以形成1,2,3-三唑环。参见(例如)Agard等人，J.Amer.Chem.Soc.2004,126,15046；Best,Biochemistry 2009,48,6571，其公开内容以引用方式并入本文中。叠氮化物可位于抗体上且环辛炔可位于药物部分上，或反之。优选环辛炔基团系二苯并环辛炔(DIBO)。具有DIBO基团的各种试剂可自Invitrogen/MolecularProbes、Eugene、Oregon获得。下文反应阐释DIBO基团附接至抗体的情况的点击化学偶联：
Figure BDA0001559815020001012
在通过此技术制得的ADC中，接头包含1,2,3-三唑环。
又一偶联技术涉及向抗体中引入非天然氨基酸，其中非天然氨基酸提供官能基用于与药物部分中的反应性官能基偶联。举例而言，可将非天然氨基酸对-乙酰基苯丙氨酸纳入抗体或其他多肽中，如Tian等人，WO 2008/030612 A2(2008)中所教示。对-乙酰基苯丙氨酸中的酮基团可为通过与羟基氨基在接头-药物部分上形成肟的偶联位点。或者，可经由点击化学将非天然氨基酸对-叠氮基苯丙氨酸纳入抗体中以为偶联提供叠氮化物官能基，如上文所论述。亦可使用无细胞的方法将非天然氨基酸纳入抗体或其他多肽中，如Goerke等人，US 2010/0093024 A1(2010)及Goerke等人，Biotechnol.Bioeng.2009,102(2),400-416中所教示。上述公开内容以引用方式并入本文中。因此，在一个实施方案中，抗体具有一个或多个由非天然氨基酸置换的氨基酸，其优选系对-乙酰基苯丙氨酸或对-叠氮基苯丙氨酸，更佳系对-乙酰基苯丙氨酸。
再一偶联技术使用转谷氨酰胺酶(优选细菌转谷氨酰胺酶或BTG)，如Jeger等人,Angew.Chem.Int.Ed.2010,49,9995中所教示的。BTG在谷氨酰胺的侧链甲酰胺与亚烷基氨基(其可为例如赖氨酸的ε-氨基或5-氨基-正戊基)之间形成酰胺键。在典型偶联反应中，谷氨酰胺残基位于抗体上，而亚烷基氨基位于接头-药物部分上，如下文所示：
Figure BDA0001559815020001021
谷氨酰胺残基于多肽链上的定位对其对BTG介导的转酰胺化的易感性具有大的效应。抗体上的谷氨酰胺残基通常皆不为BTG底物。然而，若抗体去糖基化(糖基化位点是天冬酰胺297(N297))，则使得附近谷氨酰胺295(Q295)变得对BTG敏感。或者，可通过在恒定区中引入N297A突变以消除N297糖基化位点来合成无糖苷的抗体。此外，已显示抗体中的N297Q取代不仅消除糖基化，且亦引入亦易于发生BTG介导的转酰胺作用的第二谷氨酰胺残基(于位置297处)。因此，在一个实施方案中，抗OX40抗体是去糖基化的。在另一实施方案中，抗OX40抗体具有N297Q取代。本领域普通技术人员应了解，通过合成后修饰或通过引入N297A突变的去糖基化生成每个抗体两个BTG反应性谷氨酰胺残基(每条重链1个，在位置295处)，而具有N297Q取代的抗体将具有四个BTG反应性谷氨酰胺残基(每条重链2个，在位置295及297处)。
此外，另一偶联技术使用转肽酶A，如Levary等人，PLoS One 2011,6(4),e18342；Proft,Biotechnol.Lett.2010,32,1-10；Ploegh等人，WO 2010/087994 A2(2010)；及Mao等人，WO 2005/051976A2(2005)中所教示，其公开内容以引用方式并入本文中。转肽酶A识别基序(通常LPXTG(SEQ ID NO:181)，其中X系任何天然氨基酸)可附接至抗体，且亲核受体基序(通常GGG)可位于药物部分上，或反之。
本文所述抗OX40抗体亦可用于检测OX40，例如人OX40，例如组织或组织样品中的人OX40。此类抗体可用于(例如)ELISA分析或流式细胞术中。在某些实施方案中，使抗OX40抗体与细胞(例如组织中的细胞)接触适于发生特异性结合的时间，且随后添加试剂(例如检测抗OX40抗体的抗体)。示例性分析提供于实施例中。抗OX40抗体可为完全人抗体，或其可为嵌合抗体，例如具有人类可变区及鼠类恒定区或其部分的抗体。用于检测样品(细胞或组织样品)中的OX40(例如人OX40)的示例性方法包含(1)使样品与抗OX40抗体接触足以容许抗OX40抗体与样品中的OX40特异性结合的时间，及(2)使样品与特异性结合抗OX40抗体(例如结合抗OX40抗体的Fc区)的检测试剂(例如抗体)接触，藉此检测由抗OX40抗体结合的OX40。在与抗体及/或检测试剂一起培育后，可包括洗涤步骤。用于此类方法中的抗OX40抗体不必连接至标记或检测试剂，这是因为可使用另外的检测试剂。
XIV.双特异性分子
本文所述抗OX40抗体可用于形成双特异性分子。举例而言，抗体或其抗原结合部分可衍生或连接至另一功能分子，例如另一肽或蛋白质(例如受体的另一抗体或配体)，以生成结合至少两个不同结合位点或靶分子的双特异性分子。在一个实施方案中，抗OX40抗体可连接至特异性结合任何可用作组合治疗的潜在靶标的蛋白质(例如本文所述蛋白质)的抗体或scFv(例如，PD-1、PD-L1或LAG-3的抗体)。或者，抗体可衍生或连接至一个以上的其他功能分子，以生成结合两个以上不同结合位点及/或靶分子的多特异性分子。此类多特异性分子亦欲涵盖于如本文所用的术语“双特异性分子”中。为产生本文所述双特异性分子，抗OX40抗体可在功能上连接(例如通过化学偶合、遗传融合、非共价缔合或其他方式)至一个或多个其他结合分子，例如另一抗体、抗体片段、肽或结合模拟物，使得产生双特异性分子。
因此，本文提供包含至少一种对OX40的第一结合特异性及对第二靶表位的第二结合特异性的双特异性分子。在一个实施方案中，双特异性分子是多特异性的，例如该分子进一步包括第三结合特异性。
在某些实施方案中，双特异性分子包含至少一种抗体或其抗体片段(包括例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或单链Fv(scFv))作为结合特异性。抗体亦可为轻链或重链二聚体或其任何最小片段，例如Fv或单链构建体，如Ladner等人，美国专利第4,946,778号中所述，其内容以引用方式明确并入。
尽管人类单克隆抗体是优选的，但本文所述双特异性分子中可采用其他抗体，包括(例如)鼠类嵌合及人源化单克隆抗体。
本文提供的双特异性分子可使用本领域已知的方法通过偶联作为组成部分的结合特异性来制备。举例而言，可单独生成双特异性分子的每一结合特异性且随后彼此偶联。当结合特异性是蛋白质或肽时，可使用多种偶合剂或交联剂进行共价偶联。交联剂的实施例包括蛋白质A、碳化二亚胺、N-琥珀酰亚氨基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫基双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻亚苯基二马来酰亚胺(oPDM)、丙酸N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫基)酯(SPDP)及4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-甲酸磺基琥珀酰亚氨基酯(磺基-SMCC)(例如，参见Karpovsky等人，(1984)J.Exp.Med.160:1686；Liu,MA等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:8648)。其他方法包括阐述于以下中的那些：Paulus(1985)Behring Ins.Mitt.第78号，118-132；Brennan等人(1985)Science 229:81-83)及Glennie等人(1987)J.Immunol 139:2367-2375)。优选偶联剂系SATA及磺基-SMCC，二者皆购自Pierce Chemical Co.(Rockford,IL)。
当结合特异性是抗体时，其可经由两条重链的C-末端铰链区的巯基键结来偶联。在尤佳实施方案中，铰链区在偶联之前经修饰以含有奇数个(优选一个)巯基残基。
或者，两种结合特异性可在同一载体中经编码且在同一宿主细胞中表达并装配。此方法在双特异性分子为mAb×mAb、mAb×Fab、mAb×(scFv)2、Fab×F(ab')2或配体×Fab融合蛋白时尤其有用。双特异性抗体可包含在每一重链的C-末端处包含scFv的抗体。本文所述双特异性分子可系包含一种单链抗体及结合决定簇的单链分子或包含两种结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可包含至少两种单链分子。用于制备双特异性分子的方法阐述于以下中：例如美国专利第5,260,203号、美国专利第5,455,030号、美国专利第4,881,175号、美国专利第5,132,405号、美国专利第5,091,513号、美国专利第5,476,786号、美国专利第5,013,653号、美国专利第5,258,498号及美国专利第5,482,858号。
双特异性分子与其特异性靶标的结合可使用本领域公认的方法(例如酶联免疫吸附分析(ELISA)、放射性免疫分析(RIA)、FACS分析、生物分析(例如生长抑制)或Western印迹测定)来确认。此类测定中的每一者通常通过采用对所关注复合物具有特异性的经标记试剂(例如抗体)来检测尤其受关注的蛋白质-抗体复合物的存在。
XV.组合物
进一步提供含有与医药上可接受的载体配制在一起的单独或与其他靶标的抗体组合的一种或多种抗OX40抗体的组合物(例如医药组合物)。此类组合物可包括本文所述抗体或免疫偶联物或双特异性分子中的一者或组合(例如两种或更多种不同者)。举例而言，组合物可包含结合OX40上的不同表位或具有补体活性的抗体(或免疫偶联物或双特异性物)的组合。
在某些实施方案中，组合物包含至少1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、150mg/ml、200mg/ml、1-300mg/ml或100-300mg/ml的浓度的抗OX40抗体。
本文所述医药组合物亦可以组合疗法、即与其他药剂组合施用。举例而言，组合疗法可包括与至少一种其他抗癌剂及/或T细胞刺激(例如，活化)剂组合的本文所述抗OX40抗体的施用。可用于组合疗法中的治疗剂的实施例更详细阐述于下文关于本文所述抗体的用途的部分中。
在某些实施方案中，本文公开的治疗组合物包括用于治疗癌症的其他化合物、药物及/或药剂。此类化合物、药物及/或药剂可包括(例如)刺激针对给定癌症的免疫反应的化学疗法药物、小分子药物或抗体。在一些情况下，治疗组合物可包括(例如)以下中的一或多者：抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、抗PDL-1抗体、抗GITR抗体、抗CD 137抗体或抗LAG-3抗体。
如本文所使用，“医药上可接受的载体”包括任何及所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌及抗真菌剂、等渗剂及吸收延迟剂及生理上相容的类似试剂。优选地，载体适于静脉内、肌内、皮下、非经肠、脊柱或表皮施用(例如，通过注射或输注)。依赖于施用途径而定，可于材料中对活性化合物(即抗体、免疫偶联物或双特异性分子)进行包衣以保护化合物免受酸及可使化合物不活化的其他天然条件的作用。
本文所述医药组合物可包括一种或多种医药上可接受的盐。“医药上可接受的盐”系指保留母体化合物的期望生物活性且不赋予任何不期望毒理学效应的盐(例如，参见Berge,S.M.等人(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。此类盐的实施例包括酸加成盐及碱加成盐。酸加成盐包括源自无毒无机酸(例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等等)以及源自无毒有机酸(例如脂肪族单-及二羧酸、经苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香族酸、脂肪族及芳香族磺酸等等)的那些。碱加成盐包括源自碱土金属(例如钠、钾、镁、钙等等)以及源自无毒有机胺(例如N,N'-二苄基乙二胺、N-甲基葡萄糖胺、氯普鲁卡因(chloroprocaine)、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因(procaine)等等)的那些。
本文所述医药组合物亦可包括医药上可接受的抗氧化剂。医药上可接受的抗氧化剂的实施例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等等；(2)油溶性抗氧化剂，例如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等等；及(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等等。
可用于本文所述医药组合物中的适宜水性及非水性载体的实施例包括水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、聚乙二醇等等)及其适宜混合物、植物油(例如橄榄油)及可注射有机酯(例如油酸乙酯)。可(例如)通过使用诸如卵磷脂等包衣材料、通过维持所需粒径(在分散液的情形下)及通过使用表面活性剂来维持适当流动性。
此类组合物亦可含有佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂及分散剂。通过上述灭菌程序并通过纳入各种抗细菌剂及抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等等)二者可确保防止微生物的存在。此类组合物中亦可期望包括等渗剂，例如糖、氯化钠等等。另外，可通过引入吸收延迟剂(例如单硬脂酸铝及明胶)来实现可注射医药形式的长期吸收。
医药上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉剂。本领域已知用于医药活性物质的此类介质及药剂的使用。除任何与活性化合物不相容的习用介质或药剂外，亦涵盖其于本文所述医药组合物中的使用。医药组合物可包含防腐剂或可不含防腐剂。此类组合物中亦可纳入附加活性化合物。
通常，治疗组合物在制造及储存条件下必须无菌且稳定。可将组合物配制成溶液、微乳液、脂质体或其他适于高药物浓度的有序结构。载体可为溶剂或分散介质，其含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇及液体聚乙二醇等等)及其适宜混合物。可(例如)通过使用包衣(例如卵磷脂)、通过维持所需粒径(在分散液情形下)且通过使用表面活性剂来维持适当流动性。在许多情形下，优选可将等渗剂(例如糖、多元醇(例如，甘露醇、山梨醇)或氯化钠)纳入组合物中。可通过向组合物中纳入延迟吸收剂(例如，单硬脂酸盐及明胶)实现可注射组合物的长期吸收。
无菌可注射溶液可通过以下方式来制备：将所需量的活性化合物纳入具有上文所列举成份中的一者或组合的适宜溶剂中，视需要而后进行无菌微滤。通常，可通过将活性化合物纳入含有基本分散介质及来自上文所列举那些的所需其他成份的无菌媒剂中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情形下，优选制备方法系真空干燥及冷冻-干燥(冻干)，其可自其预先经无菌过滤的溶液产生活性成份加上任一所期望额外成份的粉剂。
可与载体材料组合产生单一剂型的活性成份的量将依赖于所治疗受试者及特定施用模式而变化。可与载体材料组合产生单一剂型的活性成份的量通常可为产生治疗效应的组合物的量。通常，在100％中，此量将在与医药上可接受的载体组合的约0.01％至约99％的活性成份、优选约0.1％至约70％、最优选约1％至约30％活性成份范围内。
可对剂量方案进行调节以提供最优的期望反应(例如治疗反应)。举例而言，可施用单次浓注，可随时间施用若干个分次剂量或可根据治疗状况紧急程度所指示按比例减少或增加剂量。尤其有利地将非经肠组合物配制成剂量单位形式以便于剂量的施用及均匀性。如本文所使用的剂量单位形式系指适于作为单位剂量供欲治疗受试者使用的物理离散单元；各单元含有预定量的活性化合物，此预定量经计算与所需医药载体结合产生期望治疗效应。本文所述剂量单位形式的规格取决于且直接依赖于下列因素：(a)活性化合物的独特特性及欲达成的特定治疗效应，及(b)复合此活性化合物以治疗受试者敏感性的技术中的固有限制条件。
对于抗OX40抗体的施用，剂量在约0.0001至100mg/kg、约0.01至5mg/kg、约0.01至10mg/kg、约0.1至1mg/kg、约0.1至0.5mg/kg或约0.5至0.8mg/kg宿主体重的范围内。举例而言，剂量可为0.2mg/kg体重、0.3mg/kg体重、0.5mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg范围内。在某些实施方案中，剂量系0.2mg/kg。在一些实施方案中，剂量系0.25mg/kg。在其他实施方案中，剂量系0.5mg/kg。示例性治疗方案需要每周施用一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次或每3至6个月一次。本文所述抗体的示例性剂量方案包括经由静脉内施用1mg/kg体重或3mg/kg体重，其中抗体系使用以下施用排程表中的一者给予：(i)每四周共六个剂量，随后每三个月；(ii)每三周；(iii)3mg/kg体重一次，而后每三周1mg/kg体重。
在某些实施方案中，对于利用抗OX40抗体及抗PD-1或抗CTLA-4抗体的组合治疗，抗体以固定剂量施用。因此，在一些实施方案中，抗OX40抗体以约25至约320mg、例如约25至约160mg、约25至约80mg、约25至约40mg、约40至约320mg、约40至约160mg、约40至约80mg、约80至约320mg、约30至约160mg或约160至约320mg的固定剂量施用。在一个实施方案中，抗OX40抗体以20mg或约20mg的剂量施用。在另一实施方案中，抗OX40抗体以40mg或约40mg的剂量施用。在另一实施方案中，抗OX40抗体以80mg或约80mg的剂量施用。在另一实施方案中，抗OX40抗体以160mg或约160mg的剂量施用。在另一实施方案中，抗OX40抗体以320mg或约320mg的剂量施用。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体以约100至300mg的固定剂量施用。举例而言，免疫-肿瘤药剂的剂量可为240mg或约240mg、360mg或约360mg或480mg或约480mg。在某些实施方案中，抗PD1抗体的剂量在约0.0001mg/kg至100mg/kg范围内，且更通常0.01mg/kg至5mg/kg宿主体重范围内。举例而言，剂量可为0.3mg/kg体重或约0.3mg/kg体重、1mg/kg体重或约1mg/kg体重、3mg/kg体重或约3mg/kg体重、5mg/kg体重或约5mg/kg体重或10mg/kg体重或约10mg/kg体重，或在1-10mg/kg范围内。在一些实施方案中，抗PD-1抗体的剂量系240mg或约240mg，每2周施用一次(Q2W)。此剂量可按比例调节(120mg/周)达较长或较短时段，例如360mg每3周施用一次(Q3W)或480mg每4周施用一次(Q4W)。
在一些实施方案中，抗CTLA-4抗体以约0.1mg/kg至约10mg/kg的剂量施用。举例而言，剂量可为1mg/kg或约1mg/kg或3mg/kg或约3mg/kg宿主体重。
利用抗OX40及抗PD-1或抗CTLA-4抗体的组合治疗的示例性剂量方案在下文提供于标题为“使用及方法”的部分下。
在某些实施方案中，抗OX40抗体以约15分钟至约60分钟、例如约30分钟的输注持续时间施用患者。
在某些实施方案中，在以3mg/kg(0.1mg/kg/min)的剂量施用时，抗PD-1抗体(例如，纳武单抗)以约15分钟至约60分钟、例如约30分钟的输注持续时间施用患者。在某些实施方案中，在以10mg/kg的剂量施用时，抗PD-1抗体以约45分钟至75分钟、例如约60分钟的输注持续时间施用患者。
在某些实施方案中，在以3mg/kg的剂量施用时，抗CTLA-4抗体(例如，伊匹单抗)以约15分钟至120分钟、例如约30分钟的输注持续时间施用给患者。在某些实施方案中，在以10mg/kg的剂量施用时，抗CTLA-4抗体以约15分钟至120分钟、例如90分钟的输注持续时间施用给患者。
在某些实施方案中，在同一天施用时，抗OX40抗体在抗PD-1或抗CTLA-4抗体之前施用。在某些实施方案中，在同一天施用时，抗OX40抗体在抗PD-1或抗CTLA-4抗体之后施用。在某些实施方案中，在同一天施用时，抗OX40抗体与抗PD-1或抗CTLA-4抗体同时施用。
在某些实施方案中，在同一天施用时，抗OX40抗体在抗PD-1或抗CTLA-4抗体之前约15至45分钟(例如，约30分钟)施用。在某些实施方案中，在同一天施用时，抗OX40抗体在抗PD-1或抗CTLA-4抗体之后约15至45分钟(例如，约30分钟)施用。
或者，本文提供抗OX40抗体可以不变剂量(不变剂量方案)施用。
在一些情形下，同时施用两种或更多种具有不同结合特异性的单克隆抗体，使得所施用每一抗体的剂量在上述范围内。另外，抗体通常在多个时机下施用。各单一剂量之间的间隔可为(例如)每周、每月、每三个月或每年。间隔亦可如通过测量患者的针对靶抗原的抗体血液含量所指示而不规则。在一些方法中，对剂量进行调节以达成约1-1000μg/ml且在一些方法中约25-300μg/ml的血浆抗体浓度。
本文所述抗OX40抗体可以另一抗体的剂量方案与另一抗体一起施用。举例而言，抗OX40抗体可每两周在60分钟内以静脉内输注形式与抗PD-1抗体(例如纳武单抗(OPDIVO))一起施用直至疾病进展或不可接受的毒性发生为止。或者，抗OX40抗体可每3周在30分钟内以静脉内输注形式与派姆单抗(pembrolizumab)(KEYTRUDA)一起施用直至疾病进展或不可接受的毒性发生为止。
抗体可以持续释放配制物形式施用，在该情形下需要较不频繁的施用。剂量及频率依赖于抗体在患者中的半衰期而变化。通常，人抗体显示最长的半衰期，其次为人源化抗体、嵌合抗体及非人抗体。施用剂量及频率可因治疗为预防性抑或治疗性而变化。在预防性应用中，以相对较不频繁之间隔经较长时间段施用相对较低的剂量。一些患者在其余生中持续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要以相对较短间隔的相对较高的剂量直至减轻或终止疾病进展且优选直至患者显示疾病症状的部分或完全改善为止。此后，可向患者施用预防性方案。
本文所述医药组合物中活性成份的实际剂量可有所变化，以便获得对于特定患者、组合物及施用模式有效达到期望治疗反应而对患者不具毒性的活性成份量。所选剂量值将依赖于多种药物代谢动力学因素而定，此类因素包括所用本文所述特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、所用特定化合物的排泄速率、治疗的持续时间、与所用特定组合物组合使用的其他药物、化合物及/或物质、所治疗患者的年龄、性别、体重、身体状况、一般健康情况及先前医疗史及已为医学技术中所熟知的类似因素。
本文所述抗体的“治疗有效剂量”优选可降低疾病症状的严重程度，增加无疾病症状时段的频率及持续时间或预防因患病所致所致的损害或失能。在癌症的上下文中，治疗有效剂量优选可增加存活、及/或预防与癌症相关的身体症状的进一步劣化。癌症的症状为本领域所熟知且包括(例如)不常见的痣特征(unusual mole feature)、痣外观(包括不对称、边界、颜色及/或直径)变化、新近着色皮肤区域、异常痣、指甲下变深区域、乳房肿块、乳头变化、乳腺囊肿、乳房疼痛、死亡、体重减轻、虚弱、过度疲劳、进食困难、丧失食欲、慢性咳嗽、恶化气绝、咳血、尿液带血、粪便带血、恶心、呕吐、肝转移、肺转移、骨转移、腹痛下堕、气胀病、腹腔中流体、阴道出血、便秘、腹胀、结肠穿孔、急性腹膜炎(感染、发热、疼痛)、疼痛、吐血、严重出汗、发热、高血压、贫血、腹泻、黄疸、头晕、发冷、肌肉痉挛、结肠转移、肺转移、膀胱转移、肝转移、骨转移、肾转移及胰脏转移、吞咽困难等等。
治疗有效剂量可防止或延迟癌症发作，例如在存在疾病的早期或初步体征时可为期望的。用于诊断癌症的实验室测试包括化学(包括OX40含量的测量)、血液学、血清学及放射学。因此，监测上述中的任一者的任何临床或生物化学分析可用于确定特定治疗是否系用于治疗癌症的治疗有效剂量。本领域普通技术人员应能够基于诸如受试者的体格、受试者症状的严重程度及特定组合物或所选施用途径等因素来测定此类量。
本文所述抗体及组合物可使用此项技术中已知的多种方法中的一或多者经由一个或多个施用途径施用。如本领域普通技术人员应了解，施用途径及/或模式应视所期望结果而变化。本文所述抗体的优选施用途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜腔内、皮下、脊柱或其他非经肠施用途径，例如通过注射或输注。本文所用片语“非经肠施用”意指除经肠及局部施用以外的施用模式，通常通过注射，且包括(但不限于)静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼窝内、心内、皮内、腹膜腔内、经气管、皮下、表皮下、关节内、经囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外及胸骨内注射及输注。
或者，抗体可经由非经肠途径施用，例如局部、表皮或粘膜施用途径，例如经鼻内、经口、经阴道、经直肠、经舌下或经局部。
活性化合物可利用保护化合物免于快速释放的载体制备，例如控制释放配制物，包括植入体、经皮贴剂及微囊封递送系统。可使用生物可降解、生物相容的聚合物，例如乙烯基乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯及聚乳酸。用于制备这些配制物的许多方法已获得专利权或通常已为本领域技术人员所知。参见(例如)Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson编辑，Marcel Dekker公司，New York,1978。
抗体组合物可利用本领域已知的医学器件施用。举例而言，在一个实施方案中，组合物可利用无针皮下注射器件(例如公开于美国专利第5,399,163号、第5,383,851号、第5,312,335号、第5,064,413号、第4,941,880号、第4,790,824号或第4,596,556号中的器件)来施用。用于施用抗体的熟知植入体及模组的实施例包括：美国专利第4,487,603号，其公开用于以控制速率分配用药的可植入微输注泵；美国专利第4,486,194号，其公开用于经由皮肤施用药物的治疗器件；美国专利第4,447,233号，其公开用于以精确输注速率递送用药的用药输注泵；美国专利第4,447,224号，其公开用于连续药物递送的可变流量可植入输注装置；美国专利第4,439,196号，其公开具有多室隔间的渗透药物递送系统；及美国专利第4,475,196号，其公开渗透药物递送系统。这些专利皆以引用方式并入本文中。许多其他植入体、递送系统及模组为本领域普通技术人员已知。
在某些实施方案中，配制抗OX40抗体以确保在体内适当分布。举例而言，血脑障壁(BBB)可排斥许多高度亲水性化合物。为确保抗体跨越BBB(若期望，例如，针对脑癌)，则其可(例如)配制在脂质体中。对于制造脂质体的方法，参见(例如)美国专利4,522,811；5,374,548；及5,399,331。脂质体可包含一个或多个选择性运输至特定细胞或器官中、由此增强靶向药物递送的部分(例如，参见V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685)。示例性靶向部分包括叶酸或生物素(例如，参见颁予Low等人的美国专利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038)；抗体(P.G.Bloeman等人(1995)FEBS Lett.357:140；M.Owais等人(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39:180)；表面活性剂蛋白质A受体(Briscoe等人(1995)Am.J.Physiol.1233:134)；p120(Schreier等人(1994)J.Biol.Chem.269:9090)；亦参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBSLett.346:123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4:273。
XVI.应用及方法
本文所述抗OX40抗体及组合物具有多种体外及体内应用，其涉及(例如)通过活化OX40信号传导增强免疫反应或检测OX40。在优选实施方案中，抗体是人抗体。举例而言，本文所述抗OX40抗体可在体外或离体与培养物中的细胞接触或(例如)在体内施用人类受试者以增强多种疾病中的免疫性。因此，本文提供改善受试者中的免疫反应的方法，其包括向受试者施用本文所述抗体或其抗原结合部分，使得受试者中的免疫反应改善。优选地，反应被增强、刺激或上调。
优选的受试者包括这样的人类患者，对于他们而言免疫反应的增强是期望的。此类方法尤其适于治疗患有可通过加强免疫反应(例如，T细胞介导的免疫反应，例如抗原特异性T细胞反应)来治疗的病症的人类患者。在特定实施方案中，此类方法尤其适于在体内治疗癌症。为达成免疫性的抗原特异性增强，本文所述抗OX40抗体可与所关注的抗原一起施用，或者，抗原可以已经存在于欲治疗的受试者(例如，带有肿瘤或带有病毒的受试者)中。在抗OX40抗体与另一药剂一起施用时，两者可单独或同时施用。
亦涵盖用于检测样品中人OX40抗原的存在或测量人OX40抗原的量的方法，其包含在容许在抗体与人OX40之间形成复合物的条件下使样品及对照样品与本文所述抗OX40抗体(或其抗原结合部分)接触。随后检测复合物的形成，其中样品与对照样品相比之间的复合物形成差异指示样品中人OX40抗原的存在。本文所述抗OX40抗体亦可用于经由免疫亲和力纯化纯化人OX40。
鉴于本文所述抗OX40抗体刺激或共刺激T细胞反应(例如抗原特异性T细胞反应)的能力，本文亦提供使用抗体以刺激、增强或上调抗原特异性T细胞反应(例如抗肿瘤T细胞反应)的体外及体内方法。在某些实施方案中，亦包括CD3刺激(例如，通过与表达膜CD3的细胞共培育)，该刺激可与用抗OX40抗体刺激同时、之前或之后提供。在一个实施方案中，方法包含使T细胞与本文所述抗OX40抗体、及任选地抗CD3抗体接触，使得刺激抗原特异性T细胞反应。可使用抗原特异性T细胞反应的任何适宜指示因子以测量抗原特异性T细胞反应。此类适宜指示因子的非限制性实施例包括在抗体存在下增加的T细胞增殖及/或在抗体存在下增加细胞因子产生。在优选实施方案中，刺激由抗原特异性T细胞的介白素-2及/或干扰素-γ产生。
可利用抗OX40抗体增强或共刺激的T细胞包括CD4+ T细胞及CD8+ T细胞。T细胞可为Teff细胞，例如CD4+ Teff细胞、CD8+ Teff细胞、辅助(Th)细胞及T细胞毒性(Tc)细胞。
亦提供刺激受试者中免疫反应(例如，抗原特异性T细胞反应)的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本文所述抗OX40抗体，使得刺激受试者中的免疫反应(例如，抗原特异性T细胞反应)。在优选实施方案中，受试者系带有肿瘤的受试者且刺激针对肿瘤的免疫反应。肿瘤可为实体肿瘤或液体肿瘤(例如血液恶性病)。在某些实施方案中，肿瘤系免疫原性肿瘤。在某些实施方案中，肿瘤系非免疫原性。在某些实施方案中，肿瘤为PD-L1阳性。在某些实施方案中，肿瘤为PD-L1阴性。受试者亦可为带有病毒的受试者且刺激针对病毒的免疫反应。
进一步提供抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本文所述抗OX40抗体，使得抑制受试者中的肿瘤生长。亦提供治疗受试者中病毒感染的方法，其包括向受试者施用本文所述抗OX40抗体，使得治疗受试者中的病毒感染。
本文亦涵盖自患有肿瘤(例如癌性肿瘤)的受试者的肿瘤微环境耗竭Treg细胞的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本文所述抗OX40抗体，该抗OX40抗体包含刺激肿瘤微环境中Treg细胞的耗竭的Fc。Fc可为(例如)具有效应物功能或增强的效应物功能(例如结合一种或多种活化Fc受体或具有增强的与一种或多种活化Fc受体的结合)的Fc。在优选实施方案中，Treg耗竭发生而不显著耗竭或抑制肿瘤微环境中的Teff，且不显著耗竭或抑制肿瘤微环境外、例如外周中的Teff细胞及Treg细胞。在某些实施方案中，受试者在Treg细胞上较在Teff细胞上、例如在肿瘤微环境中具有较高含量的OX40。
在某些实施方案中，用具有增强激动作用(例如结合抑制性FcRIIb或具有增强的与抑制性FcRIIb的结合)的Fc的抗OX40抗体治疗受试者。抗OX40抗体可耗竭肿瘤中的Treg及/或肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)中的Treg。
在某些实施方案中，给予受试者抗OX40抗体作为附加疗法。利用抗OX40抗体治疗患有癌症的受试者可延长存活，例如相对于当前护理标准长期耐久反应；至少3个月、6个月、9个月、1年、2年、3年、4年、5年、10年或更多年的长期存活，或至少3个月、6个月、9个月、1年、2年、3年、4年、5年或10年或更多年的无复发存活。在某些实施方案中，用抗OX40抗体治疗患有癌症的受试者可防止癌症复发或延迟癌症复发(例如)3个月、6个月、9个月、1年、2年、3年、4年、5年或10年或更多年。抗OX40抗体治疗可用作一线、二线或三线治疗。
在优选实施方案中，抗OX40抗体并无显著毒性。举例而言，抗体对人类器官(例如肝、肾、脑、肺及心脏中的一或多者)并无显著毒性，如(例如)临床试验中所测定。在某些实施方案中，抗体并不显著触发不期望的免疫反应，例如自体免疫性或炎症。
在某些实施方案中，用抗OX40抗体治疗受试者不会引起免疫系统过刺激至受试者的免疫系统随后攻击受试者自身(例如，自体免疫反应)或引起(例如)过敏反应的程度。因此，抗体优选不引起过敏反应。
在某些实施方案中，用抗OX40抗体治疗受试者不会引起显著炎症反应，例如免疫介导的肺炎、免疫介导的结肠炎、免疫介导的肝炎、免疫介导的肾炎或肾功能障碍、免疫介导的垂体炎、免疫介导的甲状腺功能减退及甲状腺功能亢进或其他免疫介导的不良反应。
在某些实施方案中，抗OX40抗体与另一癌症疗法(例如刺激免疫系统的化合物(例如，免疫-肿瘤药剂)，例如本文所述化合物或调节本文所述靶标的化合物)组合提供协同抗肿瘤效应。
下文进一步详细论述本文所述此类及其他方法。
癌症
由抗OX40抗体活化OX40可增强对患者中癌细胞的免疫反应。因此，本文提供治疗患有癌症的受试者的方法，其包括向受试者施用本文所述抗OX40抗体，使得治疗受试者，例如使得抑制或减少癌性肿瘤的生长及/或肿瘤退化及/或达成延长存活。抗OX40抗体可单独使用以抑制癌性肿瘤的生长。或者，抗OX40抗体可与另一药剂(例如另一免疫原性药剂)、标准癌症治疗或另一抗体组合使用，如下文所述。
因此，本文提供(例如)通过抑制受试者中肿瘤细胞生长来治疗癌症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本文所述抗OX40抗体。抗体可为人抗体。另外或或者，抗体可为嵌合或人源化抗体。
本文亦提供组合疗法，其包含施用抗OX40抗体及抗PD-1或抗CTLA-4抗体以治疗患有肿瘤(例如，晚期实体肿瘤)的受试者。
在某些实施方案中，本文提供治疗癌症的方法，其中根据所定义临床剂量方案向患有肿瘤(例如，晚期实体肿瘤)的患者施用抗OX40抗体及抗PD-1抗体或抗CTLA-4抗体。在某些实施方案中，抗OX40抗体系OX40.21。在某些实施方案中，抗PD-1抗体系BMS-936558(纳武单抗)。在某些实施方案中，抗CTLA-4抗体系伊匹单抗
Figure BDA0001559815020001151
。在某些实施方案中，可对剂量方案进行调节以提供最优的期望反应(例如有效反应)。
如本文所用的，附加或组合施用(共施用)包括以相同或不同剂型同时施用化合物或分开施用化合物(例如，依序施用)。因此，抗OX40及抗PD-1抗体或抗CTLA-4抗体可在单一配制物中同时施用。或者，抗OX40及抗PD-1抗体或抗CTLA-4抗体可经配制用于分开施用且并行或依序施用(例如，一种抗体在施用第二抗体之前的约30分钟内施用)。
举例而言，可首先施用抗PD1抗体或抗CTLA-4抗体，然后(例如，之后立刻)施用抗OX40抗体，或反之。在某些实施方案中，在施用抗OX40抗体之前施用抗PD-1抗体或抗CTLA-4抗体。在另一实施方案中，在施用抗OX40抗体之后施用抗PD-1抗体或抗CTLA-4抗体。在另一实施方案中，并行施用抗OX40抗体及抗PD-1抗体或抗CTLA-4抗体。该并行或依序施用优选导致在所治疗患者中同时存在两种抗体。
可利用抗OX40抗体或与抗OX40及抗PD-1或抗CTLA-4抗体的组合疗法抑制生长的癌症包括通常对免疫疗法有反应的癌症及通常对免疫疗法无反应的那些。癌症可为具有实体肿瘤或血液恶性病(液体肿瘤)的癌症。用于治疗的癌症的非限制性实施例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、非鳞状NSCLC、神经胶质瘤、胃肠癌、肾癌(例如透明细胞癌)、卵巢癌、肝癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、肾癌(例如，肾细胞癌(RCC))、前列腺癌(例如激素难治性前列腺腺癌)、甲状腺癌、神经胚细胞瘤、胰脏癌、神经胶母细胞瘤(多形性神经胶母细胞瘤)、子宫颈癌、胃癌、膀胱癌、肝瘤、乳腺癌、结肠癌及头颈癌(或癌瘤)、胃癌、生殖细胞肿瘤、儿科肉瘤、鼻窦天然杀伤、黑色素瘤(例如，转移性恶性黑色素瘤，例如皮肤或眼内恶性黑色素瘤)、骨癌、皮肤癌、子宫癌、肛区癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、副甲状腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童期实体肿瘤、输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统的新生物(CNS)、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊轴肿瘤、脑癌、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱导的癌症(包括由石棉诱导的那些)、病毒相关癌症或病毒起源的癌症(例如，人类乳头瘤病毒(HPV相关或起源的肿瘤))、及源自两种主要血细胞谱系(即骨髓细胞系(其产生粒细胞、红细胞、血栓细胞、巨噬细胞及肥大细胞)或淋巴细胞系(其产生B、T、NK及浆细胞))中的任一者的血液学恶性病，例如所有类型的白血病、淋巴瘤及骨髓瘤，例如急性、慢性、淋巴细胞性及/或骨髓性白血病，例如急性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)及慢性骨髓性白血病(CML)、未分化的AML(M0)、骨髓母细胞性白血病(M1)、骨髓母细胞性白血病(M2；细胞成熟)、前髓球性白血病(M3或M3变体[M3V])、骨髓单核细胞性白血病(具有嗜酸性粒细胞增多症的M4或M4变体[M4E])、单核细胞性白血病(M5)、红白血病(M6)、巨核母球性白血病(M7)、分离的粒细胞性肉瘤及绿色瘤；淋巴瘤，例如霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)(HL)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、B细胞血液学恶性病(例如B细胞淋巴瘤)、T细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞样淋巴瘤、单核细胞样B细胞淋巴瘤、粘膜相关的淋巴组织(MALT)淋巴瘤、退行性(例如，Ki 1+)大细胞淋巴瘤、成人T细胞淋巴瘤/白血病、外套细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤、血管中心淋巴瘤、肠T细胞淋巴瘤、原发性纵膈B细胞淋巴瘤、前体T-淋巴母细胞性淋巴瘤、T-淋巴母细胞性淋巴瘤；及淋巴瘤/白血病(T-Lbly/T-ALL)、外周T细胞淋巴瘤、淋巴母细胞性淋巴瘤、移植后淋巴增殖病症、真实组织细胞性淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性积液淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、淋巴母细胞性淋巴瘤(LBL)、淋巴谱系的造血性肿瘤、急性淋巴母细胞性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、滤泡性淋巴瘤、弥漫性组织细胞性淋巴瘤(DHL)、免疫母细胞大细胞淋巴瘤、前体B-淋巴母细胞性淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤(CTLC)(亦称作蕈样真菌病或塞扎里综合征(Sezary syndrome))及具有华氏巨球蛋白血症的淋巴浆细胞样淋巴瘤(LPL)；骨髓瘤，例如IgG骨髓瘤、轻链骨髓瘤、非分泌骨髓瘤、焖燃型骨髓瘤(亦称作无痛骨髓瘤)、孤立性浆细胞瘤及多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、多毛细胞淋巴瘤；类骨髓谱系的造血性肿瘤、间质起源的肿瘤(包括纤维肉瘤及横纹肌肉瘤)；精细胞瘤、畸形癌、中枢及周围神经肿瘤，包括星细胞瘤、神经鞘瘤；间质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤及骨肉瘤；及其他肿瘤，包括黑色素瘤、着色性干皮病、角质棘皮瘤、精细胞瘤、甲状腺滤泡性癌及畸形癌、淋巴谱系的造血性肿瘤，例如T细胞及B细胞肿瘤，包括(但不限于)T细胞病症，例如T前淋巴细胞性白血病(T-PLL)，包括小细胞及脑回状细胞类型；优选T细胞类型的大的颗粒性淋巴细胞白血病(LGL)；a/d T-NHL肝脾淋巴瘤；外周/胸腺后T细胞淋巴瘤(多型及免疫母细胞亚型)；血管中心(鼻)T细胞淋巴瘤；头或颈癌、肾癌、直肠癌、甲状腺癌；急性类骨髓性淋巴瘤以及此类癌症的任何组合。本文所述方法亦可用于治疗转移性癌症、不可切除及/或难治性癌症(例如，利用(例如)阻断CTLA-4或PD-1抗体的先前免疫疗法难治的癌症)及复发性癌症。
在某些实施方案中，利用抗OX40抗体或抗OX40抗体与抗PD-1或抗CTLA-4抗体的组合治疗的患者患有晚期实体肿瘤。举例而言，在一个实施方案中，欲治疗的患者患有子宫颈癌。在另一实施方案中，欲治疗的患者患有结肠直肠(CRC)癌。在另一实施方案中，欲治疗的患者患有膀胱癌(例如，不可切除的局部晚期或转移膀胱癌)。在另一实施方案中，欲治疗的患者患有卵巢癌(例如，不可切除欲治疗的患者患有或转移卵巢癌)。
在一个实施方案中，利用抗OX40抗体或抗OX40抗体与抗PD-1或抗CTLA-4抗体的组合治疗的患者患有非小细胞肺癌(NSCLC)。在另一实施方案中，欲治疗的患者患有头颈鳞状细胞癌(SCCHN)。在另一实施方案中，欲治疗的患者患有B细胞非霍奇金氏淋巴瘤(B-NHL)。在另一实施方案中，欲治疗的患者患有骨髓瘤。在另一实施方案中，患者患有黑色素瘤。在另一实施方案中，欲治疗的患者患有弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。
在某些实施方案中，向对先前治疗(例如利用免疫-肿瘤药物的先前治疗)展现反应不足的患有癌症的患者或患有难治或抗性、固有难治或抗性(例如，利用PD-1路径拮抗剂难治)或其中抗性或难治性状态系获得性的癌症的患者施用抗OX40抗体。举例而言，可通过单独施用抗OX40抗体或与另一疗法(例如，抗PD-1疗法)的组合治疗对第一疗法无反应或反应不足或在治疗(例如抗PD-1治疗)后观察到疾病进展的受试者。
在某些实施方案中，向先前未接受免疫-肿瘤药剂(例如PD-1路径拮抗剂)(即，经其治疗)的患者施用抗OX40抗体。
在某些实施方案中，可利用护理治疗的标准(例如，手术、辐射及化学疗法)施用抗OX40抗体。在其他实施方案中，抗OX40抗体可作为维持疗法(例如意欲防止肿瘤发生或复发的疗法)施用。
在某些实施方案中，抗OX40抗体可与另一治疗(例如辐射、手术或化学疗法)一起施用。举例而言，在存在可存在微转移的风险时及/或为了降低复发的风险，可施用抗OX40抗体附加疗法。
在某些实施方案中，抗OX40抗体可作为单一疗法、或作为唯一免疫刺激疗法施用。在其他实施方案中，抗OX40抗体亦可免疫原试剂(例如癌细胞、纯化肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽及碳水化合物分子)、细胞及经编码免疫刺激细胞因子的基因转染的细胞)组合(He等人(2004)J.Immunol.173:4919-28)。可使用的肿瘤疫苗的非限制性实施例包括黑色素瘤抗原的肽(例如gp100、MAGE抗原、Trp-2、MART1及/或酪氨酸酶的肽)、或经转染以表达细胞因子GM-CSF的肿瘤细胞(下文进一步论述)。
在人类中，已显示一些肿瘤具有免疫原性，例如黑色素瘤。通过经由OX40活化降低T细胞活化的阈值，可活化宿主中的肿瘤反应，从而容许治疗非免疫原性肿瘤或具有限制免疫原性的那些。
在一些实施方案中，抗OX40抗体可结合疫苗接种方案使用。已设计出针对肿瘤的疫苗接种的许多实验策略(参见Rosenberg,S.,2000,Development of Cancer Vaccines,ASCO Educational Book Spring:60-62；Logothetis,C.,2000,ASCO Educational BookSpring:300-302；Khayat,D.2000,ASCO Educational Book Spring:414-428；Foon,K.2000,ASCO Educational Book Spring:730-738；亦参见Restifo,N.及Sznol,M.,CancerVaccines，第61章，第3023-3043页，DeVita等人(编辑),1997,Cancer:Principles andPractice of Oncology，第五版)。在此类策略的一个此策略中，使用自体或同种肿瘤细胞制备疫苗。已显示此类细胞疫苗在肿瘤细胞经转导以表达GM-CSF时最有效。已显示GM-CSF系用于肿瘤疫苗接种的抗原呈递的有效力的活化剂(Dranoff等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.90:3539-43)。
经过各种肿瘤中基因表达及大规模基因表达模式的研究，人们已经定义了所谓肿瘤特异性抗原(Rosenberg,S A(1999)Immunity 10:281-7)。在许多情形下，此类肿瘤特异性抗原是在肿瘤及产生肿瘤的细胞中表达的分化抗原，例如黑色素细胞抗原gp100、MAGE抗原及Trp-2。更重要的是，这些抗原中许多可被显示为宿主中发现的肿瘤特异性T细胞的靶标。OX40活化可与在肿瘤中表达的重组蛋白及/或肽的组合结合使用以生成对此类蛋白的免疫反应。此类蛋白通常由免疫系统视为自身抗原且因此对其具有耐受性。肿瘤抗原可包括蛋白端粒酶，这种酶是染色体的端粒的合成所需的，且在85％以上人类癌症、而仅有限数目的体细胞组织中表达(Kim等人(1994)Science 266:2011-2013)。肿瘤抗原亦可为在癌细胞中表达的“新抗原”(neo-antigens)，其是由于体细胞突变改变了蛋白序列或产生了两个无关序列(即，费城染色体(Philadelphia chromosome)中的bcr-abl)之间的融合蛋白；或者可以是来自B细胞肿瘤的独特型。
其他肿瘤疫苗可包括来自参与人类癌症的病毒(例如人类乳头瘤病毒(HPV)、肝炎病毒(HBV及HCV)及卡波西氏疱疹肉瘤病毒(KHSV))的蛋白质。可与OX40活化结合使用的另一形式的肿瘤特异性抗原是自肿瘤组织自身分离的纯化热休克蛋白(HSP)。此类热休克蛋白含有来自肿瘤细胞的蛋白的片段且此类HSP高度有效地递送至抗原呈递细胞用于引发肿瘤免疫性(Suot及Srivastava(1995)Science 269:1585-1588；Tamura等人(1997)Science278:117-120)。
树突细胞(DC)是可用于引发抗原特异性反应的有效力的抗原呈递细胞。可离体产生DC，并在其中装载各种蛋白质及肽抗原以及肿瘤细胞提取物(Nestle等人(1998)NatureMedicine 4:328-332)。亦可通过遗传学手段转导DC以表达此类肿瘤抗原。也有人将DC直接融合至肿瘤细胞用于免疫目的(Kugler等人(2000)Nature Medicine 6:332-336)。作为疫苗接种的方法，DC免疫可有效地与OX40活化组合以活化更有效力的抗肿瘤反应。
本文所述抗OX40抗体亦可与化学治疗方案组合。在此类情况下，可减少所施用化学治疗试剂的剂量(Mokyr等人(1998)Cancer Research 58:5301-5304)。举例而言，抗OX40抗体可与氨烯咪胺(decarbazine)组合用于治疗黑色素瘤。在另一实施例中，抗OX40抗体可与介白素-2(IL-2)组合用于治疗黑色素瘤。支持抗OX40抗体及化学疗法的组合使用的科学原理系细胞死亡，即大部分化学治疗化合物的细胞毒性作用的结果，应在抗原呈递路径中产生增加的肿瘤抗原含量。可经由细胞死亡与抗OX40抗体产生协同作用的其他组合疗法是辐射、手术及激素剥夺。此类方案中的每一者皆在宿主中产生肿瘤抗原的来源。血管生成抑制剂亦可与抗OX40抗体组合使用。血管生成的抑制导致肿瘤细胞死亡，此可将肿瘤抗原补充到宿主抗原呈递路径中。
本文所述抗OX40抗体亦可与将表达Fcα或Fcγ受体的效应物细胞靶向肿瘤细胞的双特异性抗体组合使用(例如，参见美国专利第5,922,845号及第5,837,243号)。双特异性抗体可用于靶向两种单独抗原。举例而言，抗Fc受体/抗肿瘤抗原(例如，Her-2/neu)双特异性抗体已用于将巨噬细胞靶向肿瘤的位点。此靶向可更有效地活化肿瘤特异性反应。可通过OX40的活化加强此类反应的T细胞臂。或者，可通过使用结合肿瘤抗原及树突细胞特异性细胞表面标记物的双特异性抗体将抗原直接递送至DC。
肿瘤通过多种机制逃避宿主免疫监督。许多此类机制可通过由肿瘤表达且具有免疫抑制性的蛋白质的不活化来克服。此类机制尤其包括TGF-β(Kehrl等人(1986)J.Exp.Med.163:1037-1050)、IL-10(Howard及O'Garra(1992)Immunology Today 13:198-200)及Fas配体(Hahne等人(1996)Science 274:1363-1365)。针对此类实体中的每一者的抗体可与抗OX40抗体组合使用以消除免疫抑制剂的效应并帮助由宿主的肿瘤免疫反应。
活化宿主免疫反应的其他抗体可与本文所述抗OX40抗体组合使用。此类抗体包括树突细胞表面上的分子，其活化DC功能及抗原呈递。抗CD40抗体能够有效地取代T细胞辅助活性(Ridge等人(1998)Nature 393:474-478)且可与抗OX40抗体结合使用。活化针对T细胞共刺激分子的抗体(例如CTLA-4(例如，美国专利第5,811,097号)、OX-40(Weinberg等人(2000)Immunol 164:2160-2169)、4-1BB(Melero等人(1997)Nature Medicine 3:682-685(1997)及ICOS(Hutloff等人(1999)Nature 397:262-266)亦可提供增加的T细胞活化程度。PD1或PD-L1的抑制剂亦可与抗OX40抗体结合使用。
目前使用骨髓移植以治疗多种造血性起源的肿瘤。尽管移植物抗宿主病系由此治疗所致，但可自移植物抗肿瘤反应获得治疗益处。抗OX40抗体可用于增加移入肿瘤特异性T细胞的供体的有效性。
亦存在若干实验治疗方案，其涉及抗原特异性T细胞的离体活化及扩增及此类细胞授受性转移至接受者中以刺激对抗肿瘤的抗原特异性T细胞(Greenberg及Riddell(1999)Science 285:546-51)。此类方法亦可用于活化T细胞对感染物(例如CMV)的反应。在抗OX40抗体存在下的离体活化可增加授受性转移的T细胞的频率及活性。
感染性疾病
本文亦提供治疗已暴露于特定毒素或病原体的患者的方法。因此，本文提供治疗受试者的感染性疾病的方法，其包括向受试者施用本文所述抗OX40抗体，使得治疗受试者的感染性疾病。在某些实施方案中，抗OX40抗体系嵌合或人源化抗体。
类似于如上文所论述抗OX40抗体对于肿瘤的应用，此类抗体可单独使用或作为佐剂与疫苗组合使用，以刺激对病原体、毒素及自身抗原的免疫反应。此治疗方法可尤其有用的病原体的实施例包括目前无有效疫苗的病原体或习用疫苗并非完全有效的病原体。此类病原体包括(但不限于)HIV、肝炎(A、B及C型)、流行性感冒、疱疹、贾第虫(Giardia)、疟疾、利什曼虫(Leishmania)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。抗OX40抗体可用于抵抗由在感染过程中呈递改变抗原的试剂(例如HIV)的确立感染。在抗OX40抗体施用时，此类新颖表位被识别为外来物，由此引起强的T细胞反应。
引起可通过本文所述方法治疗的感染的病原体病毒的一些实例包括HIV、肝炎(甲型、乙型或丙型)、疱疹病毒(例如，VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II及CMV、埃巴二氏病毒(EpsteinBarr virus))、腺病毒、流行性感冒病毒、虫媒病毒、埃可病毒(echovirus)、鼻病毒、柯萨奇病毒(coxsackie virus)、冠状病毒、呼吸道融合病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、小病毒、痘疮病毒、HTLV病毒、登革热病毒(dengue virus)、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰白质炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒及虫媒病毒脑炎病毒。
引起可通过本文所述方法治疗的感染的病原体细菌的一些实施例包括披衣菌(chlamydia)、立克次体细菌(rickettsial bacteria)、分枝杆菌(mycobacteria)、葡萄球菌(staphylococci)、链球菌(streptococci)、肺炎球菌(pneumonococci)、脑膜炎球菌(meningococci)及淋球菌(gonococci)、克雷伯氏菌属(klebsiella)、变形杆菌属(proteus)、沙雷菌属(serratia)、假单胞菌属(pseudomonas)、军团病杆菌属(legionella)、白喉(diphtheria)、沙门杆菌属(salmonella)、杆菌(bacilli)、霍乱(cholera)、破伤风(tetanus)、肉毒中毒、炭疽(anthrax)、鼠疫、钩端螺旋体病(leptospirosis)及莱姆病细菌(Lymes disease bacteria)。
引起可通过本文所述方法治疗的感染的病原体真菌的一些实施例包括念珠菌属(Candida)(白色念珠菌(albicans)、克鲁斯氏念珠菌(krusei)、光滑念珠菌(glabrata)、热带念珠菌(tropicalis)等)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、曲霉菌属(Aspergillus)(烟曲霉菌(fumigatus)、黑曲霉菌(niger)等)、毛霉菌属(GenusMucorales)(毛霉(mucor)、犁头霉(absidia)、根霉菌(rhizopus))、申克孢子丝菌(Sporothrix schenkii)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)及荚膜组织浆菌(Histoplasma capsulatum)。
引起可通过本文所述方法治疗的感染的病原体寄生虫的一些实施例包括溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、大肠纤毛虫(Balantidium coli)、福氏耐格里原虫(Naegleriafowleri)、棘状变形虫属(Acanthamoeba sp.)、蓝氏贾第虫(Giardia lambia)、隐孢子虫属(Cryptosporidium sp.)、肺泡囊虫(Pneumocystis carinii)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、焦虫(Babesia microti)、布鲁氏锥虫(Trypanosoma brucei)、克鲁氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、黑热病利什曼原虫(Leishmania donovani)、弓虫(Toxoplasma gondii)、巴西鼠钩虫(Nippostrongylus brasiliensis)。
在所有上述方法中，抗OX40抗体可与其他形式的免疫疗法(例如细胞因子治疗(例如，干扰素、GM-CSF、G-CSF、IL-2)或双特异性抗体疗法(其提供增强的肿瘤抗原呈递(例如，参见Holliger(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448；Poljak(1994)Structure2:1121-1123)))组合。
自体免疫反应
抗OX40抗体可引起并增强自体免疫反应。实际上，使用肿瘤细胞及肽疫苗的抗肿瘤反应的诱导公开，许多抗肿瘤反应涉及抗自身反应性(van Elsas等人(2001)J.Exp.Med.194:481-489；Overwijk等人(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96:2982-2987；Hurwitz,(2000)，见上文引文；Rosenberg及White(1996)J.Immunother EmphasisTumor Immunol 19(1):81-4)。因此，抗OX40抗体可结合各种自身蛋白使用以设计疫苗接种方案以有效地生成针对此类自身蛋白的免疫反应用于疾病治疗。举例而言，阿兹海默氏病(Alzheimer's disease)涉及Aβ肽在脑中类淀粉沉积物中的不适当累积；针对类淀粉的抗体反应能够清除此类类淀粉沉积物(Schenk等人，(1999)Nature 400:173-177)。
其他自身蛋白亦可用作用于治疗过敏及哮喘的靶标(例如IgE)及用于类风湿性关节炎的TNFc。最后，可通过使用抗OX40抗体诱导对于各种激素的抗体反应。中和对生殖激素的抗体反应可用于避孕。亦可将中和对激素及特定肿瘤的生长所需的其他可溶性因子的抗体反应视为可能的疫苗接种靶标。
如上文针对抗OX40抗体的使用所述的类似方法可用于诱导治疗性自体免疫反应以治疗具有其他自身抗原(例如类淀粉沉积物，包括阿兹海默氏病中的Aβ)、细胞因子(例如TNFα)及IgE的不适当累积的患者。
疫苗
本文所述抗OX40抗体可通过共施用此类抗体与所关注抗原(例如，疫苗)用于刺激抗原特异性免疫反应。因此，本文提供增强对受试者中的抗原的免疫反应的方法，其包括向受试者施用：(i)抗原；及(ii)抗OX40抗体，使得增强对受试者中的抗原的免疫反应。该抗体可为人类抗OX40抗体(例如本文所述人类抗OX40抗体中的任一者)。在其他实施方案中，抗体可为嵌合或人源化抗体。抗原可为(例如)肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原或来自病原体的抗原。此类抗原的非限制性实例包括上文部分中论述的那些，例如上文论述的肿瘤抗原(或肿瘤疫苗)、或来自上述病毒、细菌或其他病原体的抗原。
在某些实施方案中，使用包含抗OX40抗体结合的表位的肽或融合蛋白作为疫苗代替抗OX40抗体，或除抗OX40抗体外亦使用该肽或融合蛋白。
在体内及体外施用本文所述抗体组合物(例如，人类单克隆抗体、多特异性及双特异性分子及免疫偶联物)的适宜途径是本领域所熟知的且可由本领域技术人员选择。举例而言，抗体组合物可通过注射(例如，静脉内或皮下)施用。所用分子的适宜剂量将依赖于受试者的年龄及体重及抗体组合物的浓度及/或配制物而定。
如前文所述，本文所述抗OX40抗体可与一种或多种其他治疗剂(例如细胞毒性剂、放射性毒性剂或免疫抑制剂)共施用。抗体可连接至试剂(呈免疫-复合物形式)或可与试剂分开施用。在后一情形(单独施用)中，抗体可在试剂之前、之后或并行施用或可与其他已知疗法(例如抗癌疗法，例如辐射)共施用。此类治疗剂尤其包括抗新生物剂，例如多柔比星(doxorubicin)(阿德力霉素(adriamycin))、顺铂、硫酸博来霉素(bleomycin sulfate)、卡莫司汀(carmustine)、氮芥苯丁酸(chlorambucil)、达卡巴嗪(dacarbazine)及环磷酰胺羟基脲，其自身仅在对患者具有毒性或亚毒性的量下有效。顺铂以100mg/ml剂量每四周一次静脉内施用且阿德力霉素以60-75mg/ml剂量每21天一次静脉内施用。本文所述抗OX40抗体或其抗原结合片段与化学治疗剂的共施用提供两种抗癌剂，其经由对人类肿瘤细胞产生细胞毒性效应的不同机制起作用。该共施用可解决与发生对药物的抗性或可使得肿瘤细胞与抗体不反应的肿瘤细胞的抗原性变化有关的问题。
亦提供包含本文所述抗OX40抗体组合物(例如，人抗体、双特异性或多特异性分子或免疫偶联物)及使用说明书的试剂盒。该试剂盒可进一步含有至少一种额外试剂或一种或多种额外本文所述人抗体(例如，具有补体活性且结合不同于第一人抗体的OX40中的表位的人抗体)。试剂盒通常包括指示试剂盒的内容物的预期用途的标记。术语标记包括试剂盒上供应或与试剂盒一起供应或以其他方式伴随试剂盒的任何书面或记录材料。
治疗方案
适于治疗人类患者的实体肿瘤(例如，晚期实体肿瘤)的方案包括(例如)向患者施用有效量的抗OX40抗体，其包含具有阐述于SEQ ID NO:318中的序列的重链可变区的CDR1、CDR2及CDR3结构域及具有阐述于SEQ ID NO:94中的序列的轻链可变区的CDR1、CDR2及CDR3结构域，其中该方法包括至少一个施用周期，其中该周期是两周的时段(Q2W)，其中对于至少一个周期中的每一者，抗OX40抗体的至少一个剂量以1mg/kg体重的剂量；20mg、40mg、80mg、160mg或320mg的固定剂量；约1mg/kg体重的剂量；或约20mg、40mg、80mg、160mg或320mg的固定剂量施用。
用于治疗人类患者的实体肿瘤的另一适宜方案包括(例如)向患者施用有效量的以下中的每一者：
(a)抗OX40抗体，其包含具有阐述于SEQ ID NO:318中的序列的重链可变区的CDR1、CDR2及CDR3结构域及具有阐述于SEQ ID NO:94中的序列的轻链可变区的CDR1、CDR2及CDR3结构域，及
(b)抗PD-1抗体，其包含具有阐述于SEQ ID NO:301中的序列的重链可变区的CDR1、CDR2及CDR3结构域及具有阐述于SEQ ID NO:302中的序列的轻链可变区的CDR1、CDR2及CDR3结构域，
其中该方法包含至少一个施用周期，其中该周期系两周的时段，其中对于至少一个周期中的每一者，抗OX40抗体的至少一个剂量以1mg/kg体重的剂量；20mg、40mg、80mg、160mg或320mg的固定剂量；约1mg/kg体重的剂量；或约20mg、40mg、80mg、160mg或320mg的固定剂量施用，且抗PD-1抗体的至少一个剂量以240mg的不变剂量或约240mg的不变剂量施用。在一些实施方案中，抗PD-1抗体以360mg的固定剂量每三周施用一次(q3w)或以480mg的剂量每四周施用一次(q4w)。
用于治疗人类患者的实体肿瘤的另一适宜方案包括(例如)向患者施用有效量的以下中的每一者：
(a)抗OX40抗体，其包含具有阐述于SEQ ID NO:318中的序列的重链可变区的CDR1、CDR2及CDR3结构域及具有阐述于SEQ ID NO:94中的序列的轻链可变区的CDR1、CDR2及CDR3结构域，及
(b)抗CTLA-4抗体，其包含具有阐述于SEQ ID NO:309中的序列的重链可变区的CDR1、CDR2及CDR3结构域及具有阐述于SEQ ID NO:310中的序列的轻链可变区的CDR1、CDR2及CDR3结构域，
其中该方法包含至少一个施用周期，其中该周期为三周的时段(q3w)，其中对于至少一个周期中的每一者，抗OX40抗体的至少一个剂量以1mg/kg体重的剂量；20mg、40mg、80mg、160mg或320mg的固定剂量；约1mg/kg体重的剂量；或约20mg、40mg、80mg、160mg或320mg的固定剂量施用，且抗CTLA-4抗体的至少一个剂量以1mg/kg体重的不变剂量或约1mg/kg体重的不变剂量施用。在一个实施方案中，抗OX40抗体与抗CTLA-4抗体一起施用至少一个周期，之后施用抗OX40抗体单一疗法至少一个周期。在某些实施方案中，抗OX40抗体与伊匹单抗一起施用最初四个周期，之后施用抗OX40抗体单一疗法后续周期。
在一些实施方案中，抗OX40抗体及抗PD-1抗体以下列剂量施用：
(a)1mg/kg抗OX40抗体及240mg、360mg或480mg抗PD-1抗体；
(b)20mg抗OX40抗体及240mg、360mg或480mg抗PD-1抗体；
(c)40mg抗OX40抗体及240mg、360mg或480mg抗PD-1抗体；
(d)80mg抗OX40抗体及240mg、360mg或480mg抗PD-1抗体；
(e)160mg抗OX40抗体及240mg、360mg或480mg抗PD-1抗体；或
(f)320mg抗OX40抗体及240mg、360mg或480mg抗PD-1抗体。
在一些实施方案中，抗OX40抗体及抗CTLA-4抗体以下列剂量施用：
(a)1mg/kg抗OX40抗体及1mg/kg抗CTLA-4抗体；
(b)20mg抗OX40抗体及1mg/kg抗CTLA-4抗体；
(c)40mg抗OX40抗体及1mg/kg抗CTLA-4抗体；
(d)80mg抗OX40抗体及1mg/kg抗CTLA-4抗体；
(e)160mg抗OX40抗体及1mg/kg抗CTLA-4抗体；或
(f)320mg抗OX40抗体及1mg/kg抗CTLA-4抗体。
在一个实施方案中，计算每体重的抗OX40及/或抗PD-1或抗CTLA-4抗体的剂量，例如mg/kg体重。在另一实施方案中，抗OX40及/或抗PD-1或抗CTLA-4抗体的剂量为不变-固定剂量。在另一实施方案中，抗OX40及/或抗PD-1或抗CTLA-4抗体的剂量随时间变化。举例而言，抗OX40及/或抗PD-1或抗CTLA-4抗体最初可以高剂量施用且可随时间降低。在另一实施方案中，抗OX40及/或抗PD-1或抗CTLA-4抗体最初以低剂量施用且可随时间增加。
在另一实施方案中，所施用抗OX40及/或抗PD-1或抗CTLA-4抗体的量对于每一剂量恒定。在另一实施方案中，所施用抗体的量随每一剂量变化。举例而言，抗体的维持(或跟随)剂量可高于首先施用的负荷剂量或与其相同。在另一实施方案中，抗体的维持剂量可低于负荷剂量或与其相同。
在一些实施方案中，抗OX40及/或抗PD-1或抗CTLA-4抗体经配制用于静脉内施用。在一些实施方案中，在每一周期的第1天施用抗OX40抗体或抗OX40抗体及抗PD-1或CTLA-4抗体。
在一些实施方案中，抗OX40及/或抗PD-1或抗CTLA-4抗体每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次施用，或只要观察到临床益处或直至存在完全反应、确认进展性疾病或不可控制的毒性。
在一个实施方案中，施用周期是两周，若需要，其可重复。在另一实施方案中，周期系三周。在一些实施方案中，治疗由至多8个周期组成。在其他实施方案中，治疗由至多12个周期组成。
在一个实施方案中，每两周周期施用每一抗OX40抗体及抗PD-1抗体的一个剂量。在另一实施方案中，每三周周期施用每一抗PD-1抗体及抗OX40抗体的一个剂量。在另一实施方案中，每四周周期施用每一抗PD-1抗体及抗OX40抗体的一个剂量。
在一个实施方案中，每三周周期施用每一抗OX40抗体及抗CTLA-4抗体的一个剂量。在一些实施方案中，前四个周期每三周施用每一抗OX40抗体及抗CTLA-4抗体的一个剂量，之后第五至第八周期施用抗OX40抗体单一疗法。
在另一个实施方案中，施用抗OX40抗体及抗PD-1或抗CTLA-4抗体作为一线治疗(例如，初始或首次治疗)。在另一实施方案中，施用抗OX40抗体及抗PD-1或抗CTLA-4抗体作为二线治疗(例如，在初始或首次治疗之后，包括在复发之后及/或在首次治疗失败时)。
在另一方面，本发明特别提供上文所述的实施方案中的任一者，其中抗PD-1抗体被抗PD-L1或抗PD-L2抗体替换或与其组合。
在一些实施方案中，人类患者患有选自下组的癌症：子宫颈癌、膀胱癌、结肠直肠癌及卵巢癌。
在某些实施方案中，抗OX40抗体包括包含SEQ ID NO:87中所示出的序列的重链可变区CDR1、包含SEQ ID NO:317中所示出的序列的重链可变区CDR2、包含SEQ ID NO:89中所示出的序列的重链可变区CDR3、包含SEQ ID NO:90中所示出的序列的轻链可变区CDR1、包含SEQ ID NO:91中所示出的序列的轻链可变区CDR2及包含SEQ ID NO:92中所示出的序列的轻链可变区CDR3。在某些实施方案中，抗OX40抗体包括分别包含SEQ ID NO:318及94中所示出的序列的重链及轻链可变区。在某些实施方案中，抗OX40抗体包含分别包含SEQ IDNO:124及116中所示出的序列的重链及轻链序列。
在某些实施方案中，抗PD-1抗体包括分别包含SEQ ID NO:303-305中所示出的序列的重链可变区CDR1、CDR2及CDR3及分别包含SEQ ID NO:306-308中所示出的序列的轻链可变区CDR1、CDR2及CDR3。在某些实施方案中，抗PD-1抗体包含分别阐述于SEQ ID NO:301及302中的序列的重链及轻链可变区。在某些实施方案中，抗PD-1抗体包含分别阐述于SEQID NO:299及300中的重链及轻链序列。
在某些实施方案中，抗CTLA-4抗体包括分别包含SEQ ID NO:311-313中所示出的序列的重链可变区CDR1、CDR2及CDR3及分别包含SEQ ID NO:314-316中所示出的序列的轻链可变区CDR1、CDR2及CDR3。在某些实施方案中，抗CTLA-4抗体包含分别阐述于SEQ ID NO:309及310中的序列的重链及轻链可变区。
结果
关于靶病灶，对疗法的反应可包括：
Figure BDA0001559815020001281
Figure BDA0001559815020001291
关于非靶病灶，对疗法的反应可包括：
Figure BDA0001559815020001292
根据本文公开的方法治疗的患者优选经历癌症的至少一征象的改善。在一个实施方案中，通过可测量的肿瘤病灶的量及/或大小的减小来测量改善。在另一实施方案中，可利用胸部x射线或CT或MRI胶片来测量病灶。在另一实施方案中，可使用细胞学或组织学以评估对疗法的反应。
在一个实施方案中，所治疗患者展现完全反应(CR)、部分反应(PR)、稳定疾病(SD)、免疫有关的完全反应(irCR)、免疫有关的部分反应(irPR)或免疫有关的稳定疾病(irSD)。在另一实施方案中，所治疗患者经历肿瘤收缩及/或生长速率减小，即肿瘤生长被抑制。在另一实施方案中，不期望的细胞增殖被减少或抑制。在另一实施方案中，可发生下述的一项或多项：癌细胞的数目可减少；肿瘤大小可减小；癌细胞向周围器官中的浸润可被抑制、延迟、减缓或制止；肿瘤转移可被减缓或抑制；肿瘤生长可被抑制；肿瘤复发可被预防或延迟；一种或多种与癌症相关的症状可得到一定程度的减轻。
在其他实施方案中，根据本文提供的方法中的任一者施用有效量的抗OX40抗体及抗PD-1或抗CTLA-4抗体产生至少一个选自下组的治疗效应：肿瘤大小减小、随时间出现的转移性病灶的数目减少、完全消退、部分消退或疾病稳定。在其他实施方案中，治疗方法产生可比较的临床受益率(CBR＝CR+PR+SD≥6个月)，其好于仅使用抗OX40抗体或抗PD-1或抗CTLA-4抗体。在其他实施方案中，与单独抗OX40抗体或抗PD-1或抗CTLA-4抗体相比，临床受益率的改善为约20％20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更大。
组合疗法
除上文提供的组合疗法外，本文所述抗OX40抗体可用于如下文所述的组合疗法中。
组合疗法的方法包括抗OX40抗体或抗OX40抗体与抗PD-1或抗CTLA-4抗体的组合与一种或多种其他试剂(例如小分子药物、抗体或其抗原结合部分)共施用且有效刺激免疫反应以藉此进一步增强、刺激或上调受试者的免疫反应的那些。举例而言，如实施例中所示，向小鼠施用抗OX40抗体及拮抗剂抗PD-1抗体可在抑制肿瘤生长中具有协同效应。
抗OX40抗体可与以下物质组合：(i)刺激性(例如，共刺激)分子(例如，受体或配体)的激动剂及/或(ii)免疫细胞(例如T细胞)上的抑制性信号或分子(例如，受体或配体)的拮抗剂，二者皆可增强免疫反应(例如抗原特异性T细胞反应)。在某些方面中，免疫-肿瘤药剂是(i)刺激性(包括共刺激)分子(例如，受体或配体)的激动剂或(ii)参与先天免疫的细胞(例如NK细胞)上的抑制性(包括共抑制性)分子(例如，受体或配体)的拮抗剂，且其中免疫-肿瘤药剂增强先天免疫。此类免疫-肿瘤学药剂通常称作免疫检查点调节剂，例如免疫检查点抑制剂或免疫检查点刺激剂。
在某些实施方案中，抗OX40抗体与靶向作为免疫球蛋白超家族(IgSF)的成员的刺激性或抑制性分子的试剂一起施用。举例而言，抗OX40抗体可与靶向IgSF家族的成员的试剂一起施用受试者以增加免疫反应。在其他实施方案中，抗OX40抗体可与靶向(或特异性结合)膜结合的配体的B7家族的成员(其包括B7-1、B7-2、B7-H1(PD-L1)、B7-DC(PD-L2)、B7-H2(ICOS-L)、B7-H3、B7-H4、B7-H5(VISTA)及B7-H6)或特异性结合B7家族成员的共刺激性或共抑制性受体的试剂一起施用。
抗OX40抗体亦可与靶向分子(配体或受体)的TNF及TNFR家族的成员的试剂一起施用，此类试剂为例如CD40及CD40L、GITR、GITR-L、CD70、CD27L、CD30、CD30L、4-1BBL、CD137、TRAIL/Apo2-L、TRAILR1/DR4、TRAILR2/DR5、TRAILR3、TRAILR4、OPG、RANK、RANKL、TWEAKR/Fn14、TWEAK、BAFFR、EDAR、XEDAR、TACI、APRIL、BCMA、LTβR、LIGHT、DcR3、HVEM、VEGI/TL1A、TRAMP/DR3、EDA1、EDA2、TNFR1、淋巴毒素α/TNFβ、TNFR2、TNFα、LTβR、淋巴毒素α1β2、FAS、FASL、RELT、DR6、TROY及NGFR(参见(例如)Tansey(2009)Drug Discovery Today 00:1)。
可通过抗OX40抗体与以下试剂中的一或多者的组合刺激T细胞反应：
(1)抑制T细胞活化的蛋白质的拮抗剂(抑制剂或阻断剂)(例如，免疫检查点抑制剂)，例如如上文所述CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2及LAG-3及以下蛋白质中的任一者：TIM-3、半乳凝素(Galectin)9、CEACAM-1、BTLA、CD69、半乳凝素-1、TIGIT、CD113、GPR56、VISTA、B7-H3、B7-H4、2B4、CD48、GARP、PD1H、LAIR1、TIM-1及TIM-4；及/或
(2)刺激T细胞活化的蛋白质的激动剂，例如B7-1、B7-2、CD28、4-1BB(CD137)、4-1BBL、ICOS、ICOS-L、GITR、GITR-L、CD70、CD27、CD40、DR3及CD28H。
调节上述蛋白质中的一者且可与抗OX40抗体组合用于治疗癌症的示例性药剂包括：YervoyTM(伊匹单抗)或曲美目单抗(Tremelimumab)(针对CTLA-4)、加利昔单抗(galiximab)(针对B7.1)、BMS-936558(针对PD-1)、MK-3475(针对PD-1)、AMP224(针对B7DC)、BMS-936559(针对B7-H1)、MPDL3280A(针对B7-H1)、MEDI-570(针对ICOS)、AMG557(针对B7H2)、MGA271(针对B7H3)、IMP321(针对LAG-3)、BMS-663513(针对CD137)、PF-05082566(针对CD137)、CDX-1127(针对CD27)、阿塞西普(Atacicept)(针对TACI)、CP-870893(针对CD40)、鲁卡木单抗(Lucatumumab)(针对CD40)、达西珠单抗(Dacetuzumab)(针对CD40)、莫罗单抗-CD3(Muromonab-CD3)(针对CD3)、伊匹单抗(针对CTLA-4)。
抗OX40抗体亦可与匹利珠单抗(pidilizumab)(CT-011)一起施用。
可与抗OX40抗体组合用于治疗癌症的其他分子包括NK细胞上的抑制性受体的拮抗剂或NK细胞上的活化受体的激动剂。举例而言，抗OX40抗体可与KIR的拮抗剂(例如，利利单抗(lirilumab))组合。
T细胞活化亦由可溶性细胞因子调控，且抗OX40抗体可与抑制T细胞活化的细胞因子的拮抗剂或刺激T细胞活化的细胞因子的激动剂一起施用(例如)患有癌症的受试者。
在某些实施方案中，抗OX40抗体可与以下物质组合使用：(i)抑制T细胞活化的IgSF家族或B7家族或TNF家族的蛋白质的拮抗剂(或抑制剂或阻断剂)或抑制T细胞活化的细胞因子的拮抗剂(例如，IL-6、IL-10、TGF-β、VEGF；“免疫抑制性细胞因子”)及/或(ii)刺激T细胞活化的IgSF家族、B7家族或TNF家族的刺激性受体或细胞因子的激动剂，其用于刺激免疫反应、例如用于治疗增殖疾病(例如癌症)。
适用于组合疗法的其他药剂包括抑制或耗竭巨噬细胞或单核细胞的药剂，包括(但不限于)CSF-1R拮抗剂，例如CSF-1R拮抗剂抗体，包括RG7155(WO11/70024、WO11/107553、WO11/131407、W013/87699、W013/119716、WO13/132044)或FPA-008(WO11/140249；W013169264；WO14/036357)。
抗OX40抗体亦可与抑制TGF-β信号传导的药剂一起施用。
可与本文所述抗OX40抗体组合的其他药剂包括增强肿瘤抗原呈递的药剂，例如树突细胞疫苗、GM-CSF分泌细胞疫苗、CpG寡核苷酸及咪喹莫特(imiquimod)，或增强肿瘤细胞的免疫原性的疗法(例如，蒽环类)。
可与抗OX40抗体组合的其他疗法包括耗竭或阻断Treg细胞的疗法，例如特异性结合CD25的药剂。
另一种可与抗OX40抗体组合的疗法是抑制抑制代谢酶(例如吲哚胺加双氧酶(IDO)、加双氧酶、精氨酸酶或一氧化氮合成酶)的疗法。
可与抗OX40抗体一起使用的另一类药剂包括抑制腺苷形成或抑制腺苷A2A受体的药剂。
可与抗OX40抗体组合用于治疗癌症的其他疗法包括逆转/防止T细胞无反应或耗竭的疗法及在肿瘤位点处触发先天免疫活化及/或炎症的疗法。
抗OX40抗体可与一种以上免疫-肿瘤药剂组合，且可(例如)与靶向免疫路径的多个要素的组合方法组合，例如以下中的一或多者：增强肿瘤抗原呈递的疗法(例如，树突细胞疫苗、GM-CSF分泌性细胞疫苗、CpG寡核苷酸、咪喹莫特)；抑制阴性免疫调控的疗法，例如通过抑制CTLA-4及/或PD1/PD-L1/PD-L2路径及/或通过耗竭或阻断Treg或其他免疫抑制细胞；刺激阳性免疫调控的疗法，例如通过利用刺激CD-137及/或GITR路径及/或刺激T细胞效应物功能的激动剂；全身性增加抗肿瘤T细胞的频率的疗法；耗竭或抑制Treg(例如肿瘤中的Treg)的疗法，例如通过使用CD25的拮抗剂[例如达克珠单抗(daclizumab)]或通过离体抗CD25珠子耗竭；影响肿瘤中的抑制剂骨髓细胞的功能的疗法；增强肿瘤细胞的免疫原性的疗法(例如，蒽环类)；包括经遗传修饰的细胞(例如由嵌合抗原受体修饰的细胞)的过继性T细胞或NK细胞转移(CAR-T疗法)；抑制代谢酶(例如吲哚胺加双氧酶(IDO)、加双氧酶、精氨酸酶或一氧化氮合成酶)的疗法；逆转/防止T细胞无反应或耗竭的疗法；在肿瘤位点处触发先天免疫活化及/或炎症的疗法；施用免疫刺激性细胞因子；或阻断免疫抑制性细胞因子。
抗OX40抗体可与以下试剂中的一或多者一起使用：接合阳性共刺激性受体的激动试剂、经由抑制性受体减弱信号传导的阻断剂、拮抗剂及一种或多种全身性增加抗肿瘤T细胞的频率的药剂、克服肿瘤微环境内的不同免疫抑制性路径(例如，阻断抑制性受体接合(例如，PD-L1/PD-1相互作用)、耗竭或抑制Treg(例如，使用抗CD25单克隆抗体(例如，达克珠单抗)或通过离体抗CD25珠粒耗竭)、抑制代谢酶(例如IDO)或逆转/防止T细胞无反应或耗竭)的药剂及在肿瘤位点处触发先天免疫活化及/或炎症的药剂。
在某些实施方案中，若受试者为BRAF V600突变阳性，则将抗OX40抗体与BRAF抑制剂一起施用受试者。
在某些实施方案中，抗OX40抗体与另一免疫刺激抗体一起施用。
本文提供刺激受试者的免疫反应的方法，其包括向受试者施用抗OX40抗体及一种或多种其他免疫刺激性抗体，例如抗PD-1拮抗剂(例如拮抗剂抗体)、抗PD-L1拮抗剂(例如拮抗剂抗体)、拮抗剂抗CTLA-4拮抗剂(例如拮抗剂抗体)及/或抗LAG3拮抗剂(例如拮抗剂抗体)，使得在受试者中刺激免疫反应，以(例如)抑制肿瘤生长或刺激抗病毒反应。在一个实施方案中，向受试者施用抗OX40抗体及拮抗剂抗PD-1抗体。在一个实施方案中，向受试者施用抗OX40抗体及拮抗剂抗PD-L1抗体。在一个实施方案中，向受试者施用抗OX40抗体及拮抗剂抗CTLA-4抗体。在一个实施方案中，抗OX40抗体是人抗体。或者，抗OX40抗体可为(例如)嵌合或人源化抗体。在一个实施方案中，至少一种其他免疫刺激性抗体(例如，拮抗剂抗PD-1、拮抗剂抗PD-L1、拮抗剂抗CTLA-4及/或拮抗剂抗LAG3抗体)是人抗体。或者，至少一种其他免疫刺激性抗体可为(例如)嵌合或人源化抗体(例如，自小鼠抗PD-1、抗PD-L1、抗CTLA-4及/或抗LAG3抗体制备)。
本文提供治疗过度增殖疾病(例如，癌症)的方法，其包括向受试者施用抗OX40抗体与拮抗剂PD-1抗体、拮抗剂PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体或抗LAG3抗体。在某些实施方案中，以亚治疗剂量施用一种或两种抗体。本文亦提供改变与用免疫刺激剂治疗过度增殖疾病相关的不良事件的方法，其包括向受试者施用抗OX40抗体及亚治疗剂量的抗PD-1、抗PD-L1、抗CTLA-4或抗LAG3抗体。在某些实施方案中，抗OX40抗体包含3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及20C1的CDR或可变区，或者是另一种本文所述的激动剂抗OX40抗体。
适用于本文所述方法中的PD-1拮抗剂包括(但不限于)配体、抗体(例如，单克隆抗体及双特异性抗体)及多价作用剂。在一个实施方案中，PD-1拮抗剂是融合蛋白，例如Fc融合蛋白，例如AMP-244。在一个实施方案中，PD-1拮抗剂是抗PD-1或抗PD-L1抗体。
示例性抗PD-1抗体是纳武单抗(BMS-936558)或包含阐述于WO 2006/121168中的抗体17D8、2D3、4H1、5C4、7D3、5F4及4A11中的一者的CDR或可变区的抗体。在某些实施方案中，抗PD1抗体系阐述于WO2012/145493中的MK-3475(兰布鲁珠单抗(Lambrolizumab))；及阐述于WO 2012/145493中的AMP-514，其他已知PD-1抗体及其他PD-1抑制剂包括阐述于以下中的那些：WO 2009/014708、WO 03/099196、WO 2009/114335、WO 2011/066389、WO 2011/161699、WO 2012/145493、美国专利第7,635,757号及第8,217,149号及美国专利公开案第2009/0317368号。亦可使用WO2013/173223中公开的抗PD-1抗体中的任一者。与此类抗体中的一者竞争结合及/或结合与此类抗体中的一者相同的PD-1上的表位的抗PD-1抗体亦可用于组合治疗。靶向PD-1受体的另一方法系由融合至IgG1的Fc部分的PD-L2(B7-DC)的细胞外结构域构成的重组蛋白，称作AMP-224。在某些实施方案中，抗体与上文所提及抗体具有至少约90％可变区氨基酸序列同一性。
在某些实施方案中，抗OX40抗体与纳武单抗组合使用，该纳武单抗包括包含分别于SEQ ID NO:299及300中所示序列的重链及轻链、或其抗原结合片段及变体。在某些实施方案中，抗体具有纳武单抗的重链及轻链CDR或可变区。因此，在一个实施方案中，抗体包含具有阐述于SEQ ID NO:301中的序列的纳武单抗的VH的CDR1、CDR2及CDR3结构域、及具有阐述于SEQ ID NO:302中的序列的纳武单抗的VL的CDR1、CDR2及CDR3结构域。在某些实施方案中，抗体包括分别包含SEQ ID NO:303-305中所示出的序列的CDR1、CDR2及CDR3结构域、及分别包含SEQ ID NO:306-308中所示出的序列的CDR1、CDR2及CDR3结构域。在某些实施方案中，抗体包括分别包含SEQ ID NO:301及/或SEQ ID NO:302中的氨基酸序列的VH及/或VL区。在某些实施方案中，抗体与SEQ ID NO:301或SEQ ID NO:302具有至少约90％、例如至少约90％、95％或99％可变区同一性。
示例性抗PD-L1抗体包括BMS-936559(在WO 2007/005874及美国专利第7,943,743号中称作12A4)、或包含3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7及13G4的CDR或可变区的抗体，其阐述于PCT公开案WO 07/005874及美国专利第7,943,743号中。在某些实施方案中，抗PD-L1抗体系MEDI 4736(亦称作抗B7-H1)、MPDL3280A(亦称作RG7446)、MSB0010718C(WO2013/79174)或rHigM12B7。亦可使用WO2013/173223、WO2011/066389、WO2012/145493、美国专利第7,635,757号及第8,217,149号及美国公开案第2009/145493号中公开的抗PD-L1抗体中的任一者。
示例性抗CTLA-4抗体包括YervoyTM(伊匹单抗或抗体10D1，阐述于PCT公开案WO01/14424中)、曲美目单抗(先前称作替西莫单抗(ticilimumab)，CP-675,206)、或阐述于以下公开案中的任一者中的抗CTLA-4抗体：WO 98/42752；WO 00/37504；美国专利第6,207,156号；Hurwitz等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(17):10067-10071；Camacho等人(2004)J.Clin.Oncology 22(145):摘要号2505(抗体CP-675206)；及Mokyr等人(1998)CancerRes.58:5301-5304。亦可使用WO2013/173223中公开的抗CTLA-4抗体中的任一者。
示例性抗LAG3抗体包括包含抗体25F7、26H10、25E3、8B7、11F2或17E5的CDR或可变区的抗体，其阐述于美国专利公开案第US2011/0150892号、第WO10/19570号及第WO2014/008218号中。在一个实施方案中，抗LAG-3抗体系BMS-986016。可使用的其他本领域公认的抗LAG-3抗体包括IMP731及IMP-321，其阐述于US 2011/007023、WO08/132601及WO09/44273中。
在某些实施方案中，抗OX40抗体与伊匹单抗组合使用。在某些实施方案中，抗体具有伊匹单抗的重链及轻链CDR或可变区。因此，在一个实施方案中，抗体包含具有阐述于SEQID NO:309中的序列的伊匹单抗的VH的CDR1、CDR2及CDR3结构域、及具有阐述于SEQ ID NO:310中的序列的伊匹单抗的VL的CDR1、CDR2及CDR3结构域。在某些实施方案中，抗体包括分别包含阐述于SEQ ID NO:311-313中的序列的CDR1、CDR2及CDR3结构域、及分别包含阐述于SEQ ID NO:314-316中的序列的CDR1、CDR2及CDR3结构域。在某些实施方案中，抗体包括分别包含阐述于SEQ ID NO:309及/或SEQ ID NO:310中的氨基酸序列的VH及/或VL区。在某些实施方案中，抗体与SEQ ID NO:309或SEQ ID NO:310具有至少约90％、例如至少约90％、95％或99％可变区同一性。
向一种或多种第二靶抗原(例如LAG-3及/或CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1)施用抗OX40抗体及拮抗剂(例如拮抗剂抗体)可增强对患者中癌细胞的免疫反应。可使用抗OX40抗体抑制生长的癌症包括通常对免疫疗法有反应的癌症及通常对免疫疗法无反应的那些。利用本发明的组合疗法治疗的癌症的代表性实施例包括本文所列举的那些癌症。
在某些实施方案中，本文论述的治疗抗体的组合可以单一组合物形式在医药上可接受的载体中同时施用，或以单独组合物形式与每一抗体在医药上可接受的载体中同时施用。在另一实施方案中，治疗抗体的组合可依序施用。此外，若依序施用组合疗法的一个以上剂量，则依序施用的次序可在施用的每一时间点逆转或保持相同次序，且依序施用可与同时施用组合，或其任一组合。举例而言，抗OX40抗体与抗PD1抗体(及/或抗CTLA-4抗体及/或抗PD-L1抗体及/或抗LAG-3抗体)的组合的首次施用可同时，第二施用可与第一抗PD1抗体及第二抗OX40抗体依序，且第三施用可与第一抗OX40抗体及第二抗PD1抗体依序等。另一代表性施用方案涉及与第一抗OX40及第二抗PD1抗体(及/或抗CTLA-4抗体及/或抗PD-L1抗体及/或抗LAG-3抗体)依序的第一施用，且后续施用可同时。
在某些实施方案中，通过向患有可受益于免疫系统的刺激的疾病(例如癌症或感染性疾病)的受试者施用抗OX40抗体及免疫-肿瘤药剂治疗该受试者。示例性免疫-肿瘤药剂包括CD 137(4-1BB)激动剂(例如，激动性CD 137抗体，例如乌瑞鲁单抗(urelumab)或PF-05082566(W012/32433))；GITR激动剂(例如，激动性抗GITR抗体)、CD40激动剂(例如，激动性CD40抗体)；CD40拮抗剂(例如，拮抗性CD40抗体，例如鲁卡木单抗(HCD122)、达西珠单抗(SGN-40)、CP-870、893或Chi Lob 7/4)；CD27激动剂(例如，激动性CD27抗体，例如瓦利路单抗(varlilumab)(CDX-1127))、MGA271(针对B7H3)(WO11/109400))；KIR拮抗剂(例如，利利单抗)；IDO拮抗剂(例如，INCB-024360(WO2006/122150、WO07/75598、WO08/36653、WO08/36642)、吲哚西莫(indoximod)、NLG-919(WO09/73620、WO09/1156652、WOl 1/56652、W012/142237)或F001287)；Toll样受体激动剂(例如，TLR2/4激动剂(例如，卡介苗(BacillusCalmette-Guerin))；TLR7激动剂(例如，海特诺(Hiltonol)或咪喹莫特)；TLR7/8激动剂(例如，雷西莫特(Resiquimod))；或TLR9激动剂(例如，CpG7909))；及TGF-β抑制剂(例如，GC1008、LY2157299、TEW7197或IMC-TR1)。
在一个实施方案中，抗OX40抗体在施用第二药剂(例如免疫-肿瘤药剂)之前施用。在另一实施方案中，抗OX40抗体与第二药剂(例如免疫-肿瘤药剂)同时施用。在另一实施方案中，抗OX40抗体在施用第二药剂之后施用。两种药剂的施用可于以下时间开始：例如间隔30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、3小时、6小时、12小时、24小时、36小时、48小时、3天、5天、7天或一或多周，或第二药剂的施用可在施用第一药剂之后(例如)30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、3小时、6小时、12小时、24小时、36小时、48小时、3天、5天、7天或一或多周开始。
在某些实施方案中，抗OX40抗体及第二药剂(例如免疫-肿瘤药剂)系同时施用，例如在(例如)30分钟或60分钟的时段内向患者同时输注。抗OX40抗体可与第二药剂(例如免疫-肿瘤药剂)共配制。
任选地，作为单独免疫治疗剂的抗OX40抗体或抗OX40抗体与一种或多种其他免疫治疗抗体(例如，抗CTLA-4及/或抗PD-1及/或抗PD-L1及/或抗LAG-3阻断)的组合可进一步与免疫原试剂(例如癌细胞、纯化肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽及碳水化合物分子)、细胞及经编码免疫刺激细胞因子的基因转染的细胞)组合(He等人(2004)J.Immunol.173:4919-28)。可使用的肿瘤疫苗的非限制性实施例包括黑色素瘤抗原的肽(例如gp100、MAGE抗原、Trp-2、MART1及/或酪氨酸酶的肽)、或经转染以表达细胞因子GM-CSF的肿瘤细胞(下文进一步论述)。抗OX40抗体及一种或多种其他抗体(例如，CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻断)的组合亦可进一步与标准癌症治疗组合。举例而言，抗OX40抗体及一种或多种其他抗体(例如，CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻断)的组合可与化学治疗方案有效地组合。在此类情况下，可减少与该组合一起施用的化学治疗试剂的剂量(Mokyr等人(1998)Cancer Research 58:5301-5304)。举例而言，该组合可包括抗OX40抗体，同时有或没有其他抗体(例如抗CTLA-4抗体及/或抗PD-1抗体及/或抗PD-L1抗体及/或LAG-3抗体)，其进一步与氨烯咪胺或介白素-2(IL-2)组合用于治疗黑色素瘤。支持组合激动性抗OX40抗体与CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻断与化学疗法的科学原理是：细胞死亡——这是大部分化学治疗化合物的细胞毒性作用的结果——可能在抗原呈递路径中产生增加的肿瘤抗原含量。可能通过细胞死亡而和抗OX40抗体(有或没有CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻断)组合产生协同作用的其他组合疗法包括辐射、手术或激素剥夺。此类方案都可在宿主中产生肿瘤抗原的来源。血管生成抑制剂亦可与抗OX40抗体及CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻断的组合来组合。血管生成的抑制导致肿瘤细胞死亡，这可能是补充到宿主抗原呈递路径中的肿瘤抗原的来源。
在某些实施方案中，抗OX40抗体可用作唯一的免疫治疗剂，或者抗OX40抗体及CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻断抗体的组合亦可与将表达Fcα或Fcγ受体的效应细胞靶向肿瘤细胞的双特异性抗体组合使用(例如，参见美国专利第5,922,845号及第5,837,243号)。双特异性抗体可用于靶向两种单独抗原。可通过使用抗OX40抗体及CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻断的组合加强此类反应的T细胞臂。
在另一实例中，抗OX40抗体可用作唯一的免疫治疗剂，或者抗OX40抗体与其他免疫刺激剂(例如抗CTLA-4抗体及/或抗PD-1抗体及/或抗PD-L1抗体及/或LAG-3试剂，例如抗体)的组合可结合抗新生物抗体(例如
Figure BDA0001559815020001381
(利妥昔单抗)、
Figure BDA0001559815020001382
(曲妥珠单抗)、
Figure BDA0001559815020001383
(托西莫单抗(tositumomab))、
Figure BDA0001559815020001384
(替伊莫单抗(ibritumomab))、
Figure BDA0001559815020001385
(阿伦单抗)、
Figure BDA0001559815020001386
(依帕珠单抗(eprtuzumab))、
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(贝伐珠单抗(bevacizumab))及
Figure BDA0001559815020001392
(厄洛替尼(erlotinib))等等)使用。举例而言，且不希望受限于理论，用抗癌抗体或偶联至毒素的抗癌抗体的治疗可导致癌细胞死亡(例如，肿瘤细胞)，其可增强由免疫刺激剂(例如OX40、CTLA-4、PD-1、PD-L1或LAG-3试剂，例如抗体)介导的免疫反应。在示例性实施方案中，过度增殖疾病(例如，癌症肿瘤)的治疗可包括抗癌剂(例如抗体)与抗OX40抗体及任选地其他免疫刺激剂(例如抗CTLA-4及/或抗PD-1及/或抗PD-L1及/或抗LAG-3试剂，例如抗体)的组合，其同时或依序或其任一组合，其可增强由宿主的抗肿瘤免疫反应。
肿瘤通过多种机制逃避宿主免疫监督。此类机制中的许多可通过由肿瘤表达且具有免疫抑制性的蛋白质的去活化来克服。此类机制尤其包括TGF-β(Kehrl等人(1986)J.Exp.Med.163:1037-1050)、IL-10(Howard及O'Garra(1992)Immunology Today 13:198-200)及Fas配体(Hahne等人(1996)Science 274:1363-1365)。针对此类实体中的每一者的抗体可进一步与具有或不具有其他免疫刺激剂(例如抗CTLA-4及/或抗PD-1及/或抗PD-L1及/或抗LAG-3试剂，例如抗体)的抗OX40抗体组合，以消除免疫抑制剂的效应并帮助由宿主的抗肿瘤免疫反应。
可用于活化宿主免疫反应的其他试剂(例如抗体)可进一步与具有或不具有其他免疫刺激剂(例如抗CTLA-4及/或抗PD-1及/或抗PD-L1及/或抗LAG-3抗体)的抗OX40抗体组合使用。此类抗体包括树突细胞表面上的分子，其活化DC功能及抗原呈递。抗CD40抗体(Ridge等人，见上文引文)可结合抗OX40抗体及任选地其他免疫刺激剂(例如抗CTLA-4及/或抗PD-1及/或抗PD-L1及/或抗LAG-3试剂，例如抗体)使用。针对T细胞共刺激性分子的其他活化抗体(Weinberg等人，见上文引文；Melero等人，见上文引文；Hutloff等人，见上文引文)亦可提供增加的T细胞活化水平。
如上文所论述的，目前正使用骨髓移植以治疗多种造血性起源的肿瘤。单独或与CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻断组合的抗OX40免疫疗法可用于增加移入肿瘤特异性T细胞中的供体的有效性。
若干实验治疗方案涉及抗原特异性T细胞的离体活化及扩增及此类细胞过继性转移至接受者中以刺激对抗肿瘤的抗原特异性T细胞(Greenberg及Riddell，见上文引文)。此类方法亦可用于活化T细胞对感染物(例如CMV)的反应。预计在具有或不具有其他免疫刺激疗法(例如抗CTLA-4及/或抗PD-1及/或抗PD-L1及/或抗LAG-3抗体)的抗OX40抗体存在下的离体活化可增加授受性转移的T细胞的频率及活性。
本文提供改变与用免疫刺激剂治疗过度增殖疾病(例如癌症)相关的不良事件的方法，其包括向受试者施用具有或不具有抗CTLA-4及/或抗PD-1及/或抗PD-L1及/或抗LAG-3试剂(例如抗体)的抗OX40抗体。举例而言，本文所述的方法提供通过向患者施用非吸收性类固醇来降低免疫刺激性治疗抗体诱导的结肠炎或腹泻的发病率的方法。如本文所用的，“非吸收性类固醇”是这样的糖皮质激素，其表现大量的首过代谢，使得在肝中代谢后，该类固醇的生物利用度较低，即小于约20％。在一个实施方案中，非吸收性类固醇是布地奈德(budesonide)。布地奈德是局部作用的糖皮质类固醇，在经口施用后，其被大量代谢(主要是被肝脏)。
Figure BDA0001559815020001401
(Astra-Zeneca)是布地奈德的一种pH及时间依赖性口服制剂，它是为了优化药物的回肠递送及贯穿结肠递送而开发的。
Figure BDA0001559815020001402
在美国被批准用于治疗涉及回肠及/或升结肠的轻度至中度克罗恩氏病(Crohn's disease)。用于治疗克罗恩氏病的
Figure BDA0001559815020001403
的常见经口剂量是6mg/天至9mg/天。
Figure BDA0001559815020001404
在肠中释放，之后吸收并保留于肠粘膜中。一旦其穿过肠粘膜靶组织，
Figure BDA0001559815020001405
即被细胞色素P450系统在肝中大量代谢成糖皮质激素活性可忽略的代谢物。因此，生物利用度较低(约10％)。与首过代谢较少的其他糖皮质激素相比，布地奈德的低生物利用度产生改善的治疗比率。布地奈德的不良反应较全身作用的皮质类固醇少，包括下丘脑-垂体抑制较少。然而，长期施用
Figure BDA0001559815020001406
可引起全身性糖皮质激素效应，例如肾上腺功能亢进及肾上腺抑制。参见PDR，第58版，2004；608-610。
在又一些实施方案中，具有或不具有CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻断(即，抗CTLA-4及/或抗PD-1及/或抗PD-L1及/或抗LAG-3抗体)的抗OX40抗体以及非吸收性类固醇可进一步与柳酸盐组合。柳酸盐包括5-ASA试剂，例如：磺胺塞拉金(sulfasalazine)(
Figure BDA0001559815020001407
Pharmacia&UpJohn)；奥沙拉秦(olsalazine)(
Figure BDA0001559815020001408
Pharmacia&UpJohn)；巴柳氮(balsalazide)(
Figure BDA0001559815020001409
SalixPharmaceuticals,Inc.)；及美沙拉秦(mesalamine)(
Figure BDA00015598150200014010
Procter&GamblePharmaceuticals；
Figure BDA00015598150200014011
Shire US；
Figure BDA00015598150200014012
Axcan Scandipharm,Inc.；
Figure BDA00015598150200014013
Solvay)。
根据本文所述方法，出于降低由免疫刺激性抗体诱导的结肠炎的发病率的目的，与具有或不具有抗CTLA-4及/或抗PD-1及/或抗PD-L1及/或LAG-3抗体的抗OX40抗体及非吸收性类固醇组合施用的柳酸盐可包括柳酸盐及非吸收性类固醇的任何重叠或依序施用。因此，例如，用于降低由本文所述免疫刺激性抗体诱导的结肠炎的发病率的方法涵盖同时或依序施用柳酸盐及非吸收性类固醇(例如，在非吸收性类固醇6小时后施用柳酸盐)或其任一组合。此外，柳酸盐及非吸收性类固醇可通过相同途径施用(例如，二者皆系经口施用)或通过不同途径施用(例如，柳酸盐为经口施用且非吸收性类固醇为经直肠施用)，其可不同于用于施用抗OX40抗体及抗CTLA-4及/或抗PD-1及/或抗PD-L1及/或抗LAG-3抗体的途径。
本文所述抗OX40抗体及组合抗体疗法亦可结合其他熟知疗法使用，此类熟知疗法针对其针对所治疗适应症(例如癌症)的特定有用性进行选择。与抗OX40抗体的组合可与已知医药上可接受的药剂依序使用。
举例而言，本文所述抗OX40抗体及组合抗体疗法可与其他治疗(例如辐照、化学疗法(例如，使用喜树碱(camptothecin)(CPT-11)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)(5-FU)、顺铂、多柔比星、伊立替康(irinotecan)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、吉西他滨(gemcitabine)、顺铂、太平洋紫杉醇、卡铂-太平洋紫杉醇(紫杉醇)、多柔比星、5-fu或喜树碱+apo21/TRAIL(6X combo))、一种或多种蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米(bortezomib)或MG132)、一种或多种Bcl-2抑制剂(例如，BH3I-2’(bcl-xl抑制剂)、吲哚胺加双氧酶-1抑制剂(例如，INCB24360、吲哚西莫、NLG-919或F001287)、AT-101(R-(-)-棉酚衍生物)、ABT-263(小分子)、GX-15-070(奥巴克拉(obatoclax))或MCL-1(类骨髓性白血病细胞分化蛋白-1)拮抗剂)、iAP(细胞雕亡蛋白的抑制剂)拮抗剂(例如，smac7、smac4、小分子smac模拟物、合成smac肽(参见Fulda等人，Nat Med 2002；8:808-15)、ISIS23722(LY2181308)或AEG-35156(GEM-640))、HDAC(组织蛋白去乙酰酶)抑制剂、抗CD20抗体(例如，利妥昔单抗)、血管生成抑制剂(例如，贝伐珠单抗)、靶向VEGF及VEGFR的抗血管生成剂(例如，癌思停(Avastin))、合成三萜系化合物(参见Hyer等人，Cancer Research 2005；65:4799-808)、c-FLIP(细胞FLICE-抑制性蛋白)调节剂(例如，PPARγ(过氧化体增殖子-活化受体γ)的天然及合成配体、5809354或5569100)、激酶抑制剂(例如，索拉菲尼(Sorafenib))、曲妥珠单抗、西妥昔单抗、替西罗莫司(Temsirolimus)、mTOR抑制剂(例如雷帕霉素(rapamycin)及替西罗莫司、硼替佐米、JAK2抑制剂、HSP90抑制剂、PI3K-AKT抑制剂、来那度胺(Lenalildomide)、GSK3β抑制剂、IAP抑制剂及/或遗传毒性药物组合使用(例如同时或分开)。
本文所述抗OX40抗体及组合抗体疗法可进一步与一种或多种抗增殖细胞毒性剂组合使用。可用作抗增殖细胞毒性剂的化合物的类别包括(但不限于)以下：
烷基化剂(包括但不限于氮芥(nitrogen mustard)、次乙亚胺衍生物、磺酸烷基酯、亚硝基脲及三氮烯)：尿嘧啶氮芥、甲川氯(Chlormethine)、环磷酰胺(CYTOXANTM)爱斯达(fosfamide)、美法仑(Melphalan)、氮芥苯丁酸(Chlorambucil)、哌泊溴烷(Pipobroman)、曲他胺(Triethylenemelamine)、三乙烯硫代磷酰胺、白消安(Busulfan)、卡莫司汀(Carmustine)、洛莫司汀(Lomustine)、链脲菌素(Streptozocin)、达卡巴嗪及替莫唑胺(Temozolomide)。
抗代谢物(包括但不限于叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物及腺苷去胺酶抑制剂)：胺甲喋呤、5-氟尿嘧啶、氟尿苷(Floxuridine)、阿糖胞苷(Cytarabine)、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、磷酸氟达拉滨(Fludarabine phosphate)、喷司他汀(Pentostatine)及吉西他滨。
除本领域已知的其他微管蛋白稳定剂外，适于与抗OX40抗体组合的抗增殖剂包括但不限于紫杉烷、太平洋紫杉醇(太平洋紫杉醇以TAXOLTM购得)、欧洲紫杉醇(docetaxel)、盘皮海绵内酯(discodermolide)(DDM)、地特斯他汀(dictyostatin)(DCT)、培洛赛德A(Peloruside A)、埃博霉素、埃博霉素A、埃博霉素B、埃博霉素C、埃博霉素D、埃博霉素E、埃博霉素F、呋喃埃博霉素D(furanoepothilone D)、去氧埃博霉素Bl、[17]-脱氢去氧埃博霉素B、[18]脱氢去氧埃博霉素B、C12,13-环丙基-埃博霉素A、C6-C8桥接埃博霉素A、反式-9,10-脱氢埃博霉素D、顺式-9,10-脱氢埃博霉素D、16-去甲基埃博霉素B、埃博霉素B10、盘皮海绵内酯、帕土匹龙(patupilone)(EPO-906)、KOS-862、KOS-1584、ZK-EPO、ABJ-789、XAA296A(盘皮海绵内酯)、TZT-1027(索博列多汀(soblidotin))、ILX-651(盐酸泰丝多汀(tasidotin hydrochloride))、软海绵素B(Halichondrin B)、甲磺酸埃雷布林(Eribulinmesylate)(E-7389)、哈米特林(Hemiasterlin)(HTI-286)、E-7974、念珠藻素(Cyrptophycin)、LY-355703、类美登素(Maytansinoid)免疫偶联物(DM-1)、MKC-1、ABT-751、T1-38067、T-900607、SB-715992(伊匹尼塞(ispinesib))、SB-743921、MK-0731、STA-5312、软珊瑚醇(eleutherobin)、17β-乙酰氧基-2-乙氧基-6-侧氧基-B-均-雌-1,3,5(10)-三烯-3-醇、环链霉菌素(cyclostreptin)、异劳力马来(isolaulimalide)、劳力马来(laulimalide)、4-表-7-去羟基-14,16-二去甲基-(+)-盘皮海绵内酯及隐塞龙1(cryptothilone 1)。
在期望结合抗OX40抗体或在用抗OX40抗体治疗之前使得异常增殖细胞休眠的情形下，亦可向患者施用激素及类固醇(包括合成类似物)，例如17a-乙炔基雌二醇、已烯雌酚(Diethylstilbestrol)、睪固酮、普赖松(Prednisone)、氟甲睪酮(Fluoxymesterone)、丙酸甲雄烷酮(Dromostanolone propionate)、睪内酯(Testolactone)、乙酸甲地孕酮(Megestrolacetate)、甲基普赖苏浓(Methylprednisolone)、甲基-睪固酮、普赖苏浓(Prednisolone)、曲安西龙(Triamcinolone)、氯烯雌醚(Chlorotrianisene)、羟助孕酮(Hydroxyprogesterone)、胺鲁米特(Aminoglutethimide)、雌氮芥(Estramustine)、乙酸甲羟助孕酮(Medroxyprogesteroneacetate)、柳培林(Leuprolide)、氟他胺(Flutamide)、托瑞米芬(Toremifene)、ZOLADEXTM。在采用本文所述方法或组合物时，若期望，亦可施用在临床设定中用于调节肿瘤生长或转移的其他药剂，例如抗模拟物。
在某些实施方案中，抗OX40抗体系与纳武单抗(同时或分开)施用以治疗患有癌症(例如结肠直肠或膀胱癌)的患者。
在某些实施方案中，抗OX40抗体系与伊匹单抗(同时或分开)施用以治疗患有癌症(例如卵巢、膀胱或前列腺癌)的患者。
安全有效施用化学治疗剂的方法已为本领域普通技术人员所知。另外，其施用阐述于标准文献中。举例而言，许多化学治疗剂的施用阐述于Physicians'Desk Reference(PDR)，例如1996版(Medical Economics Company，Montvale,N.J.07645-1742,USA)中；其公开内容以引用方式并入本文中。化学治疗剂及/或辐射疗法可根据本领域熟知的治疗方案施用。本领域普通技术人员应明了，化学治疗剂及/或辐射疗法的施用可依赖于所治疗疾病及化学治疗剂及/或辐射疗法对该疾病的已知效应而变。同样，根据熟练临床医师的知识，治疗方案(例如，施用的剂量值及时间)可鉴于所施用治疗剂对患者的观察效应并鉴于疾病对所施用治疗剂的观察反应而变。
通过以下实施例进一步阐释本发明，但其不应视为进一步限制本发明。贯穿本申请案引用的所有图及所有参考文献、基因库序列、专利及已公开专利申请案的内容皆以引用方式明确并入本文中。
XVII.试剂盒及单位剂型
本文亦提供试剂盒，其包括含有适用于前述方法的治疗有效量的抗OX40抗体(例如，OX40.21)及抗PD-1(例如，纳武单抗)或抗CTLA-4(伊匹单抗)抗体及医药上可接受的载体的医药组合物。试剂盒亦可任选地包括说明书，例如包含施用排程表，以容许从业人员(例如，医师、护士或患者)施用其中所含组合物以将组合物施用患有癌症(例如，实体肿瘤)的患者。试剂盒亦可包括注射器。
任选地，试剂盒包括单一剂量医药组合物的多个包装，其各自含有有效量的抗OX40抗体或抗PD-1或抗CTLA-4抗体用于跟随上文提供的方法单一施用。试剂盒中亦可包括施用医药组合物所需的仪器或器件。举例而言，试剂盒可提供一个或多个含有一定量的抗OX40抗体或抗PD-1或抗CTLA-4抗体的预填充注射器。
在一个实施方案中，本发明提供用于治疗人类患者的实体肿瘤的试剂盒，该试剂盒包含一定剂量的抗OX40抗体及用于本文所述方法中的说明书，该抗OX40抗体包含具有阐述于SEQ ID NO:318中的序列的重链可变区的CDR1、CDR2及CDR3结构域及具有阐述于SEQID NO:94中的序列的轻链可变区的CDR1、CDR2及CDR3结构域。在某些实施方案中，试剂盒进一步包含(a)一定剂量的抗PD-1抗体，其包含具有阐述于SEQ ID NO:301中的序列的重链可变区的CDR1、CDR2及CDR3结构域及具有阐述于SEQ ID NO:302中的序列的轻链可变区的CDR1、CDR2及CDR3结构域，或(b)一定剂量的抗CTLA-4抗体，其包含具有阐述于SEQ ID NO:309中的序列的重链可变区的CDR1、CDR2及CDR3结构域及具有阐述于SEQ ID NO:310中的序列的轻链可变区的CDR1、CDR2及CDR3结构域。
实施方案
1.一种分离的抗体或其抗原结合部分，其结合人OX40且展现以下性质：
(a)结合膜结合的人OX40；
(b)结合食蟹猴OX40；
(c)结合可溶性人OX40；
(d)诱导或增强T细胞活化；
(e)抑制OX40配体与OX40结合；
(f)与抗体3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及20C1中的一或多者竞争结合人OX40。
2.如实施方案1的抗体，其中该抗体不结合小鼠及/或大鼠OX40。
3.如实施方案1或2的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体刺激抗肿瘤免疫反应。
4.如前述实施方案中任一实施方案的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体刺激抗原特异性T细胞反应。
5.如前述实施方案中任一实施方案的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体增加表达OX40的T细胞中的IL-2及/或IFN-γ产生。
6.如前述实施方案中任一实施方案的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体增加T细胞增殖。
7.如前述实施方案中任一实施方案的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体结合Fc受体。
8.如实施方案7的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体结合一种或多种活化FcγR。
9.如前述实施方案中任一实施方案的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体如通过Biacore所测量以约1nM或更小、例如0.5nM或更小或0.1nM或更小的KD结合可溶性人OX40。
10.如前述实施方案中任一实施方案的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体如通过FACS所测量以50nM或更小、例如10nM或更小或1nM或更小的EC50结合膜结合的人OX40。
11.如前述实施方案中任一实施方案的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体如通过FACS所测量以50nM或更小、例如10nM或更小或1nM或更小的EC50结合膜结合的食蟹猴OX40。
12.如前述实施方案中任一实施方案的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体经由多价交联诱导或增强T细胞活化。
13.如前述实施方案中任一实施方案的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体结合人类补体的C1q组分。
14.如前述实施方案中任一实施方案的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体诱导NK细胞介导的活化CD4+ T细胞的溶解。
15.如前述实施方案中任一实施方案的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体促进巨噬细胞介导的表达OX40的细胞的吞噬作用。
16.如前述实施方案中任一实施方案的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体抑制调控性T细胞介导的CD4+ T细胞增殖的阻遏。
17.如前述实施方案中任一实施方案的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体结合人OX40(SEQ ID NO:2)的序列DVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO:178)。
18.如实施方案1至16中任一实施方案的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体结合人OX40(SEQ ID NO:2)的序列DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGK(SEQ ID NO:179)。
19.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特异性结合OX40且包含呈选自下组的可变重链及可变轻链对的三个可变重链CDR及三个可变轻链CDR：
(a)SEQ ID NO:318及94；
(b)SEQ ID NO:17及18；
(c)SEQ ID NO:28及29；
(d)SEQ ID NO:28及30；
(e)SEQ ID NO:37及38；
(f)SEQ ID NO:48及49；
(g)SEQ ID NO:48及50；
(h)SEQ ID NO:57及58；
(i)SEQ ID NO:65及66；
(j)SEQ ID NO:73及74；
(k)SEQ ID NO:84及85；
(l)SEQ ID NO:84及86；及
(m)SEQ ID NO:93及94。
20.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合OX40且包含：
(a)分别包含SEQ ID NO:87、317及89的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQ ID NO:90-92的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(b)分别包含SEQ ID NO:11-13的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQID NO:14-16的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(c)分别包含SEQ ID NO:19-21的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQID NO:22-24的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(d)分别包含SEQ ID NO:19-21的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQID NO:25-27的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(e)分别包含SEQ ID NO:31-33的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQID NO:34-36的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(f)分别包含SEQ ID NO:39-41的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQID NO:42-44的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(g)分别包含SEQ ID NO:39-41的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQID NO:45-47的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(h)分别包含SEQ ID NO:51-53的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQID NO:54-56的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(i)分别包含SEQ ID NO:59-61的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQID NO:62-64的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(j)分别包含SEQ ID NO:67-69的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQID NO:70-72的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(k)分别包含SEQ ID NO:75-77的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQID NO:78-80的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(l)分别包含SEQ ID NO:75-77的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQID NO:81-83的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；或
(m)分别包含SEQ ID NO:87-89的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQID NO:90-92的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列。
21.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合OX40且包含：
(a)分别由SEQ ID NO:87、317及89组成的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别由SEQ ID NO:90-92组成的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(b)分别由SEQ ID NO:11-13组成的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别由SEQID NO:14-16组成的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(c)分别由SEQ ID NO:19-21组成的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别由SEQID NO:22-24组成的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(d)分别由SEQ ID NO:19-21组成的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别由SEQID NO:25-27组成的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(e)分别由SEQ ID NO:31-33组成的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别由SEQID NO:34-36组成的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(f)分别由SEQ ID NO:39-41组成的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别由SEQID NO:42-44组成的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(g)分别由SEQ ID NO:39-41组成的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别由SEQID NO:45-47组成的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(h)分别由SEQ ID NO:51-53组成的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别由SEQID NO:54-56组成的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(i)分别由SEQ ID NO:59-61组成的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别由SEQID NO:62-64组成的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(j)分别由SEQ ID NO:67-69组成的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别由SEQID NO:70-72组成的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(k)分别由SEQ ID NO:75-77组成的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别由SEQID NO:78-80组成的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(l)分别由SEQ ID NO:75-77组成的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别由SEQID NO:81-83组成的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；或
(m)分别由SEQ ID NO:87-89组成的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别由SEQID NO:90-92组成的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列。
22.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合OX40且包含重链及轻链可变区，其中该重链可变区包含与选自下组的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列：SEQID NO:17、28、37、48、57、65、73、84及93。
23.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合OX40且包含重链及轻链可变区，其中该轻链可变区包含与选自下组的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列：SEQID NO:18、29、30、38、49、50、58、66、74、85、86及94。
24.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合OX40且包含与选自下组的氨基酸序列至少85％同一的重链及轻链可变区序列：
(a)SEQ ID NO:318及94；
(b)SEQ ID NO:17及18；
(c)SEQ ID NO:28及29；
(d)SEQ ID NO:28及30；
(e)SEQ ID NO:37及38；
(f)SEQ ID NO:48及49；
(g)SEQ ID NO:48及50；
(h)SEQ ID NO:57及58；
(i)SEQ ID NO:65及66；
(j)SEQ ID NO:73及74；
(k)SEQ ID NO:84及85；
(l)SEQ ID NO:84及86；及
(m)SEQ ID NO:93及94。
25.如实施方案24的抗体或其抗原结合部分，其中此类重链及轻链可变区包含与选自下组的重链及轻链可变区至少90％同一的氨基酸序列：实施方案24的(a)至(l)。
26.如实施方案25的抗体或其抗原结合部分，其中此类重链及轻链可变区包含与选自下组的重链及轻链可变区至少95％同一的氨基酸序列：实施方案24的(a)至(l)。
27.如实施方案26的抗体或其抗原结合部分，其中该重链及轻链可变区包含选自下组的重链及轻链可变区：实施方案24的(a)至(l)。
28.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合OX40且包含与选自下组的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的重链及轻链序列：
(a)分别SEQ ID NO:124及116；
(b)分别SEQ ID NO:95及96；
(c)分别SEQ ID NO:97及98；
(d)分别SEQ ID NO:99及100；
(e)分别SEQ ID NO:101及102；
(f)分别SEQ ID NO:103及104；
(g)分别SEQ ID NO:105及106；
(h)分别SEQ ID NO:107及108；
(i)分别SEQ ID NO:109及110；
(j)分别SEQ ID NO:111及112；
(k)分别SEQ ID NO:113及114；
(l)分别SEQ ID NO:115及116；
(m)分别SEQ ID NO:117及118；
(n)分别SEQ ID NO:119及120；
(o)分别SEQ ID NO:121及122；
(p)分别SEQ ID NO:123及116；及
(q)分别SEQ ID NO:125及116。
29.如实施方案28的抗体或其抗原结合部分，其中此类重链及轻链包含选自下组的重链及轻链：实施方案28的(a)至(r)。
30.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其(a)与如实施方案27的抗体结合OX40上的相同表位，及/或(b)将如实施方案27的抗体与活化T细胞上的OX40的结合抑制至少95％，如通过FACS所测量。
31.如实施方案19至30中任一实施方案的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体结合人OX40(SEQ ID NO:2)的序列DVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQID NO:178)。
32.如实施方案19至30中任一实施方案的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体结合人OX40(SEQ ID NO:2)的序列DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGK(SEQ ID NO:179)。
33.如实施方案19至31中任一实施方案的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体结合人OX40及食蟹猴OX40二者。
34.如前述实施方案中任一实施方案的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体选自下组：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体。
35.如实施方案34的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体系IgG1抗体。
36.如实施方案35的抗体，其中该抗体或其抗原结合部分包含具有增强的与活化FcγR的结合的Fc。
37.如前述实施方案中任一实施方案的抗体或其抗原结合部分，其中此类CDR区中的一个或多个甲硫氨酸残基被取代为不会经受氧化的氨基酸残基。
38.如前述实施方案中任一实施方案的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体或其抗原结合部分是人抗体或人源化抗体。
39.如前述实施方案中任一实施方案的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体系非免疫原性，如根据实施例21所评估的。
40.如前述实施方案中任一实施方案的抗体或其抗原结合部分，其中重链及/或轻链CDR序列中的氨基酸序列Asp-Gly(若存在)被不会经历异构化的氨基酸序列取代。
41.如实施方案40的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体包含阐述于SEQ ID NO:76中的重链可变区CDR2序列，但其中该Asp-Gly序列被不会经历异构化的氨基酸序列置换。
42.如实施方案41的抗体，其中该Asp-Gly序列中的该Asp或Gly被Ser置换。
43.一种双特异性分子，其包含连接至具有第二结合特异性的分子的如前述实施方案中任一实施方案的抗体。
44.一种核酸，其编码如实施方案1至42中任一实施方案的抗体或其抗原结合部分的重链及/或轻链可变区。
45.一种表达载体，其包含如实施方案44的核酸分子。
46.一种细胞，其经如实施方案45的表达载体转化。
47.一种免疫偶联物，其包含连接至作用剂的如实施方案1至42中任一实施方案的抗体。
48.一种组合物，其包含如实施方案1至43及47中任一实施方案的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或免疫偶联物以及载体。
49.一种试剂盒，其包含如实施方案1至43及47中任一实施方案的抗体或其抗原结合部分、或双特异性分子或免疫偶联物以及使用说明书。
50.一种制备抗OX40抗体或其抗原结合部分的方法，其包含使该抗体或其抗原结合部分在如实施方案46的细胞中表达，和自该细胞分离该抗体或其抗原结合部分。
51.一种刺激抗原特异性T细胞反应的方法，其包含使该T细胞与如实施方案1至43及47中任一实施方案的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或免疫偶联物接触，使得抗原特异性T细胞反应被刺激。
52.一种活化或共刺激效应物T细胞的方法，其包括使效应物T细胞与如实施方案1至43及47中任一实施方案的抗OX40抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或免疫偶联物与CD3接触，其中该效应物T细胞被活化或共刺激。
53.一种增加T细胞中IL-2及/或IFN-γ产生的方法，其包含使该T细胞与有效量的如实施方案1至43及47中任一实施方案的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或免疫偶联物接触。
54.一种增加T细胞增殖的方法，其包含使该细胞与有效量的如实施方案1至43及47中任一实施方案的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或免疫偶联物接触。
55.一种增加受试者的T细胞中IL-2及/或IFN-γ产生的方法，其包含施用有效量的如实施方案1至43及47中任一实施方案的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或免疫偶联物，以增加自此类T细胞的IL-2及/或IFN-γ产生。
56.一种减少或耗竭有需要的受试者的肿瘤中T调控性细胞的数目的方法，其包含施用有效量的如实施方案1至43及47中任一实施方案的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或免疫偶联物，以减少该肿瘤中T调控性细胞的数目，其中该抗体或其抗原结合部分具有效应物或增强的效应物功能。
57.一种刺激受试者的免疫反应的方法，其包括向该受试者施用如实施方案1至43及47中任一实施方案的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或免疫偶联物，使得该受试者的免疫反应被刺激。
58.如实施方案57的方法，其中该受试者患有肿瘤且针对该肿瘤的免疫反应被刺激。
59.一种抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，其包括向该受试者施用如实施方案1至43及47中任一实施方案的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或免疫偶联物，使得抑制该肿瘤的生长。
60.一种治疗癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的如实施方案1至43及47中任一实施方案的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或免疫偶联物，以治疗该癌症。
61.如实施方案60的方法，其中该癌症选自下组：膀胱癌、乳腺癌、子宫/子宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、食道癌、胃肠癌、胰脏癌、结肠直肠癌、结肠癌、肾癌、头颈癌、肺癌、胃癌、生殖细胞癌、骨癌、肝癌、甲状腺癌、皮肤癌、中枢神经系统的新生物、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤及病毒相关癌症。
62.如实施方案60或61的方法，其中该癌症是转移性癌症、难治性癌症或复发性癌症。
63.如实施方案56至62中任一实施方案的方法，其进一步包括施用一种或多种其他治疗剂。
64.如实施方案63的方法，其中该一种或多种其他治疗剂是抗体或小分子。
65.如实施方案64的方法，其中该其他疗法是抗PD1抗体、LAG-3抗体、CTLA-4抗体、PD-L1抗体或抗TGFβ抗体。
66.一种治疗人类受试者的实体肿瘤的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的抗OX40抗体，该抗体包含具有SEQ ID NO:318中所示的序列的重链可变区的CDR1、CDR2及CDR3结构域及具有SEQ ID NO:94中所示的序列的轻链可变区的CDR1、CDR2及CDR3结构域，其中该方法包含至少一个施用周期，其中该周期是两周的时段，其中对于该至少一个周期中的每一者，该抗OX40抗体的一个剂量以1mg/kg体重的剂量；20mg、40mg、80mg、160mg或320mg的固定剂量；约1mg/kg体重的剂量；或约20mg、40mg、80mg、160mg或320mg的固定剂量施用。
67.一种治疗人类受试者的实体肿瘤的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的以下中的每一者：
(a)抗OX40抗体，其包含具有SEQ ID NO:318中所示的序列的重链可变区的CDR1、CDR2及CDR3结构域及具有SEQ ID NO:94中所示的序列的轻链可变区的CDR1、CDR2及CDR3结构域，
(b)抗PD-1抗体，其包含具有SEQ ID NO:301中所示的序列的重链可变区的CDR1、CDR2及CDR3结构域及具有SEQ ID NO:302中所示的序列的轻链可变区的CDR1、CDR2及CDR3结构域，
其中该方法包含至少一个施用周期，其中该周期为两周、三周或四周的时段，其中对于该至少一个周期中的每一者，该抗OX40抗体的至少一个剂量以1mg/kg体重的剂量；20mg、40mg、80mg、160mg或320mg的固定剂量；约1mg/kg体重的剂量；或约20mg、40mg、80mg、160mg或320mg的固定剂量施用，且该抗PD-1抗体的一个剂量以240mg、360mg或480mg的剂量或约240mg、360mg或480mg的剂量施用。
68.如实施方案67的方法，其中此类抗OX40抗体及抗PD-1抗体以如下剂量施用：
(a)1mg/kg体重的抗OX40抗体及240mg、360mg或480mg抗PD-1抗体；
(b)20mg抗OX40抗体及240mg、360mg或480mg抗PD-1抗体；
(c)40mg抗OX40抗体及240mg、360mg或480mg抗PD-1抗体；
(d)80mg抗OX40抗体及240mg、360mg或480mg抗PD-1抗体；
(e)160mg抗OX40抗体及240mg、360mg或480mg抗PD-1抗体；或
(f)320mg抗OX40抗体及240mg、360mg或480mg抗PD-1抗体。
69.一种治疗人类受试者的实体肿瘤的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的以下中的每一者：
(a)抗OX40抗体，其包含具有SEQ ID NO:318中所示的序列的重链可变区的CDR1、CDR2及CDR3结构域及具有SEQ ID NO:94中所示的序列的轻链可变区的CDR1、CDR2及CDR3结构域，
(b)抗CTLA-4抗体，其包含具有SEQ ID NO:309中所示的序列的重链可变区的CDR1、CDR2及CDR3结构域及具有SEQ ID NO:310中所示的序列的轻链可变区的CDR1、CDR2及CDR3结构域，
其中该方法包含至少一个施用周期，其中该周期是三周的时段，其中对于该至少一个周期中的每一者，该抗OX40抗体的至少一个剂量以1mg/kg体重的剂量；20mg、40mg、80mg、160mg或320mg的固定剂量；约1mg/kg体重的剂量；或约20mg、40mg、80mg、160mg或320mg的固定剂量施用，且该抗CTLA-4抗体的一个剂量以1mg/kg的剂量或约1mg/kg的剂量施用，
其中该抗OX40抗体与该抗CTLA-4抗体一起施用至少一个周期，之后施用抗OX40抗体单一疗法至少一个周期。
70.如实施方案67的方法，其中该抗OX40抗体及抗CTLA-4抗体以如下剂量施用：
(a)1mg/kg体重的抗OX40抗体及1mg/kg抗CTLA-4抗体；
(b)20mg抗OX40抗体及1mg/kg抗CTLA-4抗体；
(c)40mg抗OX40抗体及1mg/kg抗CTLA-4抗体；
(d)80mg抗OX40抗体及1mg/kg抗CTLA-4抗体；
(e)160mg抗OX40抗体及1mg/kg抗CTLA-4抗体；或
(f)320mg抗OX40抗体及1mg/kg抗CTLA-4抗体。
71.如实施方案66至70中任一实施方案的方法，其中此类抗OX40抗体、或抗OX40抗体及抗PD-1或抗CTLA-4抗体配制用于静脉内施用。
72.如实施方案67至71中任一实施方案的方法，其中此类抗OX40及抗PD-1或抗CTLA-4抗体配制在一起。
73.如实施方案67至71中任一实施方案的方法，其中此类抗OX40及抗PD-1或抗CTLA-4抗体单独配制。
74.如实施方案66至68及71至73中任一实施方案的方法，其中该治疗由至多12个周期组成。
75.如实施方案69至73中任一实施方案的方法，其中该治疗由8个周期组成。
76.如实施方案75的方法，其中该抗OX40抗体与该抗CTLA-4抗体一起施用前4个周期，之后施用抗OX40抗体单一疗法后4个周期。
77.如实施方案66至76中任一实施方案的方法，其中在每一周期的第1天施用此类抗OX40抗体、或抗OX40抗体及抗PD-1或抗CTLA-4抗体。
78.如实施方案67至77中任一实施方案的方法，其中在施用该抗PD-1或抗CTLA-4抗体之前施用该抗OX40抗体。
79.如实施方案78的方法，其中在施用该抗PD-1或抗CTLA-4抗体之前的约30分钟内施用该抗OX40抗体。
80.如实施方案67至77中任一实施方案的方法，其中在施用该抗PD-1或抗CTLA-4抗体之前施用该抗OX40抗体。
81.如实施方案67至77中任一实施方案的方法，其中该抗OX40抗体与该抗PD-1或抗CTLA-4抗体同时施用。
82.如实施方案66至81中任一实施方案的方法，其中该治疗产生至少一个选自以下的治疗效应：肿瘤大小减小、转移性病灶的数目随时间减少、完全反应、部分反应及稳定疾病。
83.如实施方案66至82中任一实施方案的方法，其中该实体肿瘤与选自下组的癌症相关：子宫颈癌、膀胱癌、结肠直肠癌及卵巢癌。
84.如实施方案66至83中任一实施方案的方法，其中该抗OX40抗体包括包含分别于SEQ ID NO:87、317及89及90至92中示出的氨基酸序列的重链及轻链可变区CDR。
85.如实施方案66至84中任一实施方案的方法，其中该抗OX40抗体包含分别于SEQID NO:318及94中示出的重链及轻链可变区序列。
86.如实施方案66至85中任一实施方案的方法，其中该抗OX40抗体包含分别于SEQID NO:124及116中示出的重链及轻链序列。
87.如实施方案67、68及71至86中任一实施方案的方法，其中该抗PD-1抗体包括包含分别于SEQ ID NO:303-305及306-308中示出的氨基酸序列的重链及轻链可变区CDR。
88.如实施方案67、68及71至87中任一实施方案的方法，其中该抗PD-1抗体包含分别于SEQ ID NO:301及302中示出的重链及轻链可变区序列。
89.如实施方案69至86中任一实施方案的方法，其中该抗CTLA-4抗体包括包含分别于SEQ ID NO:311-313及314-316中示出的氨基酸序列的重链及轻链可变区CDR。
90.如实施方案69至86及89中任一实施方案的方法，其中该抗CTLA-4抗体包含分别于SEQ ID NO:309及310中示出的重链及轻链可变区序列。
91.一种用于治疗人类受试者的实体肿瘤的试剂盒，该试剂盒包含一定剂量的抗OX40抗体及使用说明书，该抗OX40抗体包含具有于SEQ ID NO:318中所示的序列的重链可变区的CDR1、CDR2及CDR3结构域及具有SEQ ID NO:94中所示的序列的轻链可变区的CDR1、CDR2及CDR3结构域。
92.如权利要求91的试剂盒，其进一步包含(a)一定剂量的抗PD-1抗体，其包含具有SEQ ID NO:301中所示的序列的重链可变区的CDR1、CDR2及CDR3结构域及具有SEQ IDNO:302中所示的序列的轻链可变区的CDR1、CDR2及CDR3结构域，或(b)一定剂量的抗CTLA-4抗体，其包含具有SEQ ID NO:309中所示的序列的重链可变区的CDR1、CDR2及CDR3结构域及具有SEQ ID NO:310中所示的序列的轻链可变区的CDR1、CDR2及CDR3结构域。
93.一种检测样品中OX40的存在的方法，其包含使该样品与如实施方案1至38中任一实施方案的抗体或其抗原结合部分在容许在该抗体或抗原结合之间形成复合物的条件下接触。
94.一种结合OX40的抗体，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:282至296。
95.如实施方案94的抗体，其中该抗体包含由选自下组的氨基酸序列组成的重链：SEQ ID NO:282至296。
96.一种分离的单克隆抗体，其结合OX40且包含分别包含SEQ ID NO:87、317及89的重链CDR1、CDR2及CDR3序列及分别包含SEQ ID NO:90至92的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列。
97.一种分离的单克隆抗体，其结合OX40且包含分别包含SEQ ID NO:318及94的氨基酸序列的重链及轻链可变区。
98.一种分离的单克隆抗体，其结合OX40且包含分别包含SEQ ID NO:124及116的氨基酸序列的重链及轻链。
99.一种分离的单克隆抗体，其结合OX40，其中该抗体结合人OX40(SEQ ID NO:2)的序列DVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO:178)的全部或一部分。
100.一种组合物，其包含如实施方案96至99中任一实施方案的分离的单克隆抗体及载体。
101.一种核酸，其编码如实施方案96或97的抗体的重链及/或轻链可变区、或如实施方案98的重链及/或轻链。
102.一种试剂盒，其包含如实施方案96至99中任一实施方案的抗体。
103.一种刺激抗原特异性T细胞反应的方法，其包含使该T细胞与如实施方案96至99中任一实施方案的抗体接触。
104.一种治疗癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的如实施方案96至99中任一实施方案的抗体，以治疗该癌症。
105.如实施方案104的方法，其中该癌症或实体肿瘤选自下组：子宫颈癌、膀胱癌、结肠直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌及头颈的鳞状细胞癌。
实施例
实施例1：抗OX40抗体的生成
使用重组六聚组氨酸-OX40抗原在
Figure BDA0001559815020001571
转基因小鼠(“HuMAb”系Medarex,Inc.,Princeton,New Jersey的商标)及KM小鼠(KM
Figure BDA0001559815020001572
品系含有如PCT公开案WO 02/43478中所述的SC20转染色体)的Hco7、Hco12、Hco17及Hco38品系中生成人类抗OX40单克隆抗体。
用不同免疫策略对总共52只小鼠(其包括转基因小鼠的5种基因型(KM、Hco7、Hco12、Hco17及Hco38))进行了免疫。免疫原为内部制备且以2.0mg/mL用于20μg/小鼠的总剂量的huOX40-6xhis。施用途径包括：尾部基底注射、后踝免疫、腹膜内(ip)及皮下(sc)注射及佐剂(Ribi，目录号S6322，Sigma)。自30只小鼠实施了27次融合和筛选。自该27次融合鉴定了541种ELISA抗原阳性抗体，且通过进一步表征分离了特别感兴趣的抗体，包括命名为F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3(亦称作OX40.17)、14A2-1、14A2-2及20C1的抗体。其可变区氨基酸序列及同型示于图1-9中。3F4的重链及轻链可变区由氨基酸序列SEQ ID NO:17及18组成。14B6-1的重链及轻链可变区由氨基酸序列SEQ IDNO:28及29组成。14B6-2的重链及轻链可变区由氨基酸序列SEQ ID NO:28及30组成。23H3的重链及轻链可变区由氨基酸序列SEQ ID NO:37及38组成。6E1-1的重链及轻链可变区由氨基酸序列SEQ ID NO:48及49组成。6E1-2的重链及轻链可变区由氨基酸序列SEQ ID NO:48及50组成。18E9的重链及轻链可变区由氨基酸序列SEQ ID NO:57及58组成。8B11的重链及轻链可变区由氨基酸序列SEQ ID NO:65及66组成。20B3的重链及轻链可变区由氨基酸序列SEQ ID NO:73及74组成。14A2-1的重链及轻链可变区由氨基酸序列SEQ ID NO:84及85组成。14A2-2的重链及轻链可变区由氨基酸序列SEQ ID NO:84及86组成。20C1的重链及轻链可变区由氨基酸序列SEQ ID NO:93及94组成。
cDNA测序鉴定了抗体3F4、23H3、18E9、8B11、20B3(亦称作OX40.17)及20C1中每一者的一条重链及一条轻链及抗体14B6、14A2及6E1中每一者的一条重链及两条轻链(轻链1或“L1”及轻链2或“L2”)。通过蛋白质分析，鉴定了抗体14B6、6E1及14A2的单一轻链，且N-末端测序及分子测量定指示其系14B6及14A2的轻链L1及6E1的轻链L2。抗体14B6-1及14B6-2分别对应于具有轻链L1及L2的抗体14B6。抗体14A2-1及14A2-2分别对应于具有轻链L1及L2的抗体14A2。抗体6E1-1及6E1-2分别对应于具有轻链L1及L2的抗体6E1。3种抗体的各自轻链的氨基酸及核苷酸序列提供于表23中。
对于上述的一些抗体，在亲代抗体中的HCDR2中进行取代以去除异构化位点(DG)，且引入框架取代(由于衍生自DP44种系所致)以使得框架更类似于通常表达的抗体。对于基于20C1的抗体，将三个其他不常见的框架残基逆转为种系(A2V、D24G及G82bS)。G82bS框架逆转还消除了一个去酰胺位点(NG)。引入亲代杂合克隆序列中的各种取代的汇总提供于表6中。
表6.
Figure BDA0001559815020001581
Figure BDA0001559815020001591
*取决于种系，可能存在D53及G54或D54及G55作为潜在异构化位点
实施例2：抗OX40抗体与活化原代人类T细胞的结合
测试实施例1所生成的人类单克隆抗OX40抗体与活化原代人类T细胞的结合的能力。
在结合测定之前，将细胞活化若干天，以诱导OX40表达。简而言之，在重组人类IL-2存在下将PBMC与用抗人CD3加抗人CD28包被的磁珠粒一起培养3天或4天。在测定当天，移除珠粒，并使用滴定浓度的各种抗OX40抗体对细胞染色。利用荧光偶联的抗人IgG多克隆第二抗体检测结合的抗体，且针对CD4及CD25共染色细胞以检测活化的CD4T细胞。使用FACSCanto II流式细胞仪(Becton Dickinson)测量染色的荧光强度。针对CD4+CD25+群体计算抗OX40抗体染色的几何平均荧光强度(GMFI)或中值荧光强度(MedFI)(FACSDiva软件)。使用GraphPad Prism软件计算抗体结合的EC50。
如图11A中所示，抗OX40抗体以低于纳摩尔浓度的EC50结合活化原代人类T细胞。值得注意的是，OX40.5显示的结合性是所测试的抗OX40抗体中最低的。利用具有可变区取代的抗OX40抗体实施了相同实验。用来实施初始实验的抗体的形式是重组抗体表达载体转染的宿主细胞的培养上清液。如图11B中所示，某些取代导致结合性的显著损失，即针对抗体OX40.7、OX40.9、OX40.14及OX40.15而言。进一步使用纯化抗体材料来分析一组具有可变区取代的抗体。
如图11C及11D中所示，所有测试抗体皆以低于纳摩尔浓度的EC50结合OX40，但OX40.18除外，其显示的结合性比3F4杂交瘤亲代克隆低。在图11B中测试的抗体组中，OX40.5显示的结合性最低，而在图11C中测试的抗体的组中，OX40.1显示的结合性最低。EC50值的概述提供于下表7中。
表7：OX40抗体与活化人类原代T细胞的结合的EC50.
Figure BDA0001559815020001601
实施例3：抗OX-40抗体与活化原代食蟹猴T细胞的结合
对于在实施例1中测试了对活化的原代人类T细胞的结合的人单克隆抗OX-40抗体，测试了其结合活化的原代食蟹猴T细胞的能力。
简而言之，在结合测定之前，将细胞活化若干天，以诱导OX40表达。通过使用氯化铵缓冲液溶解红细胞来从食蟹猴外周血分离总白细胞。随后在包被有与食蟹猴交叉反应的抗人CD3加抗人CD28抗体的烧瓶中，在重组人IL-2存在下将白细胞培养4至5天，以扩增并活化T细胞。在测定当天，收获细胞并用递增的每种抗OX40抗体染色。利用荧光偶联的抗人IgG多克隆第二抗体检测结合的抗体，并将细胞针对CD4及CD25共染色，以检测活化的CD4T细胞。使用FACSCanto II流式细胞仪(Becton Dickinson)测量染色的荧光强度。针对CD4+CD25+群体计算抗OX40抗体染色的几何平均荧光强度(GMFI)或中值荧光强度(MedFI)(FACSDiva软件)。生成剂量-反应曲线且使用GraphPad Prism软件计算抗体结合的EC50。
如图12A及12B中所示，所测试的抗OX40抗体以高效力结合活化食蟹猴CD4T细胞，其中EC50在0.068nM(20C1)至1.4nM(20B3)的范围内。18E9及20B3以介于1nM与1.5nM之间的EC50结合，其余的抗体以低于1nM的EC50结合。在图12A中测试的抗OX40抗体中，OX40.1显示最低的结合，在图12B中测试的抗OX40抗体中，OX40.5显示最低的结合。利用具有可变区取代的抗OX40抗体实施相同实验。如图12C中所示，OX40.6、OX40.8及OX40.21抗体显示最高的结合效力，EC50为0.12nM或更低。OX40.1显示的与食蟹猴CD4T细胞的结合低得多。未检测到OX40.21抗体在活化的小鼠或大鼠CD4+T细胞上的结合。EC50值的汇总提供于下表8中。
表8：
Figure BDA0001559815020001611
Figure BDA0001559815020001621
实施例4：抗OX40抗体与活化原代T细胞及过表达人及食蟹猴OX40的细胞的结合的Scatchard分析
进一步使用Scatchard分析来评估OX40.21(IgG1同型)与活化人类T细胞的结合。简而言之，使用
Figure BDA0001559815020001622
固相碘化试剂(1,3,4,6-四氯-3a-6a-二苯基甘脲；Pierce目录号28601)利用125I-Na(1mCi；PerkinElmer目录号NEZ033H001MC)放射性碘化OX40.21。自外周血单个核细胞(PBMC)(供体W-326470)(购自Stanford Blood Bank)分离活化人CD4+ T细胞。通过负选择(RosetteSepTM人CD4+ T细胞富集混合剂，StemCell Technologies目录号15062)分离CD4+ T细胞并将其冷冻。在结合测定之前，将分离的CD4+ T细胞活化4天以诱导OX40表达，如下所述。将解冻的细胞在200IU/mL重组人类IL-2(Peprotech目录号200-02)存在下与包被有抗人CD3加上抗人CD28的磁珠粒(人T-Expander CD3/CD28Dynabeads,Invitrogen目录号111.41D)以1:1的珠粒细胞比例一起培养4天。
通过将活化的人T细胞与滴定浓度的125I-OX40.21IgG1一起温育来展示放射性碘化的OX40.21IgG1与活化人T细胞的结合。通过在滴定浓度的100倍摩尔浓度过量的未经标记的抗体存在下的结合测定非特异性结合，并从总CPM减去该非特异性结合以计算特异性结合。使用125I-OX40.21IgG1浓度对CPM的线性标准曲线以外推特异性结合(即最大nM结合的125I-OX40.21IgG1)并藉此计算平均每个细胞的受体数目。
如表9及图13A中所示，在内源性表达OX40的活化人类T细胞上观察到了OX40.21IgG1的可饱和结合，且对于两种T细胞供体的KD均为0.05nM。
表9.125I-OX40.21与活化人类T细胞的结合
Figure BDA0001559815020001631
使用过表达人OX40的HEK293细胞(“hOX40-293”)实施了相同的测定。简而言之，放射性碘化OX40.21与过表达人OX40的结合系通过将hOX40-293细胞与递增的125I-OX40.21一起温育来展示。通过在递增的100倍摩尔浓度过量的未经标记的抗体存在下的结合测定非特异性结合且将其自总CPM减去以计算特异性结合。使用125I-OX40.21浓度对CPM的线性标准曲线以外推最大nM结合的125I-OX40.21并藉此计算每细胞的受体数目。如图13B及表10中所示，针对与hOX40-293细胞上表达的OX40的结合观察到了OX40.21IgG1的可饱和的结合。来自使用不同数目的hOX40-293细胞/样品的两种测试条件的结合的平均KD为0.22nM。
表10：OX40.21与hOX40-293细胞的结合
Figure BDA0001559815020001632
Figure BDA0001559815020001641
使用过表达食蟹猴OX40的CHO细胞(“cynoOX40-CHO”)实施相同的测定。简而言之，通过将cynoOX40-CHO细胞与滴定浓度的125I-OX40.21一起温育来展示放射性碘化OX40.21与食蟹猴OX40的结合。通过在滴定浓度的100倍摩尔浓度过量的未标记的抗体存在下的结合来测定非特异性结合，并自总CPM减去非特异性结合以计算特异性结合。使用125I-OX40.21浓度对CPM的线性标准曲线以外推最大nM的结合125I-OX40.21并藉此计算平均每个细胞的受体数目。如图13C及表11中所示，针对与cynoOX40-CHO细胞上表达的食蟹猴OX40的结合观察到了OX40.21IgG1的可饱和的结合。来自使用不同数目的细胞/样品的两种测试条件的结合的平均KD为0.63nM。
表11：OX40.21与cynoOX40-CHO细胞的结合
Figure BDA0001559815020001642
Figure BDA0001559815020001651
实施例5：抗OX40抗体与淋巴细胞的特异性结合
在一组22种正常人类组织(包括脾、扁桃体、胸腺、大脑、小脑、心脏、肝、肺、肾、胰脏、垂体、周围神经、胃、结肠、小肠、甲状腺、皮肤、骨胳肌、前列腺、子宫、睾丸及胎盘)上通过免疫组织化学测试各种OX40抗体的特异性。
新鲜的冷冻及/或OCT包埋的人类组织自多个商业组织网络/供应商(AsterandInc.Detroit,MI；Cooperative Human Tissue Network,Philadelphia,PA；ProteoGenexInc,Culver City,CA)购得。为了检测组织结合，将一系列抗OX40抗体(OX40.6-FITC、OX40.8-FITC、6E1-FITC、OX40.16-FITC、OX40.17-FITC、OX40.20-FITC及OX40.21-FITC)荧光素化，并施加到丙酮固定的冷冻切片上，然后加入抗FITC桥接抗体，通过EnVision+系统可视化。使用荧光素化的非特异性人IgG1作为同型对照抗体。使用稳定表达人OX40的HT1080细胞(HT1080/huOX40)及增生性人扁桃体组织切片作为阳性对照细胞及组织。为确定FITC偶联对结合性质是否具有任何影响，在HT1080/huOX40细胞中使用抗huIgG作为桥接抗体比较FITC偶联及未偶联的抗OX40抗体。在光学显微镜下评估经染色的载玻片。
初始测试揭示，未偶联的抗OX40抗体和FITC偶联的抗OX40抗体均特异性地染色人OX40转染的细胞的细胞质及膜，而非亲代HT1080细胞的细胞质及膜。未偶联及FITC偶联的抗OX40抗体之间不存在差异。此类结果表明，抗体适于免疫组织化学分析，且FITC偶联对组织结合性质无影响。
所有所测试的抗OX40抗体在淋巴组织(扁桃体、脾及胸腺)及富含淋巴组织(结肠、胃及小肠)中的单核细胞(MNC)的一小部分(呈离散或小簇形式)、以及多个组织(肺、皮肤及甲状腺)中的几个离散MNC中皆展现阳性染色。基于形态，此类阳性细胞主要是淋巴细胞。
除了一部分染色淋巴细胞之外，OX40.6抗体(一种配体阻断剂)在更通常与小动脉及血管的外膜及其周围结缔组织相关的内皮/内皮下膜基质及间质元素的亚组中、在几乎所有检查组织(图14A)、以及专门组织元素(例如围绕睾丸中的生精小管的鞘状间质)中展示了强染色。OX40.8抗体(一种配体非阻断剂)阳性标记了心脏的心肌中的肌丝样结构(图14A)及肾的肾小球中的肾小球系膜样细胞。利用另一配体非阻断剂(即6E1抗体)的染色亦显示了心肌细胞、以及大脑与小脑的神经元及神经纤维网及肾中的小管上皮细胞中的染色。总的来说，仅在以相对高浓度(3μg/ml或5μg/ml)、而非以较低浓度(1μg/ml)使用抗体时检测到非淋巴细胞的染色，这提示结合的亲和力低，或者有潜在的脱靶结合。
对其他配体阻断性抗体——OX40.16(图14A)及OX40.17的进一步测试揭示了对一部分淋巴细胞的干净染色，且对于所有检查组织的其他组织元素无特异性染色。OX40.21抗体(OX40.16抗体的一种变体)具有与OX40.16抗体(图14B)类似的结合型式。在正常食蟹猴组织的一个类似的组中进行的免疫组织化学揭示了与人类极类似的染色型式，这表明食蟹猴可用作相关临床前物种。
实施例6：癌症中OX40的表达
FFPE(福尔马林固定石蜡包埋)肿瘤组织样品自商业组织供应商购得(对于每一肿瘤类型，n＝12-20)。为了检测与组织的结合，利用Leica BondRX平台开发了一种利用商业抗人OX40抗体的自动化IHC测定。简而言之，在95℃下的pH9ER2缓冲液(Leica)中实施20min热诱导的抗原修复(HIER)。与5μg/ml的小鼠抗人OX40单克隆抗体克隆ACT35(BDPharmingen)温育60分钟，之后与Novolink Max聚合物(Leica)温育30分钟。最后，使载玻片与DAB底物-色素原溶液反应6分钟，利用Mayer苏木素复染，脱水，透明并用Permount盖上盖玻片。使用Dako蛋白质阻断剂作为第一抗体的稀释剂。
为剖析TIL，使用市售抗CD3(T细胞标记物)及抗FoxP3(Treg标记物)单克隆抗体染色毗邻的切片。使用市售小鼠IgG1作为阴性对照，并使用增生性人类扁桃体组织作为阳性对照。在免疫染色后，人工评估载玻片并在光学显微镜下进行评分。
在所检查的四种肿瘤类型中，CD3+TIL存在于所有被检查的样品中，TIL的量在样品之间变化，且在同一组织内分布不均一。在一些情形下，如所预计的，TIL在肿瘤及宿主界面中分布更大。大部分TIL位于绝大多数组织样品中的肿瘤间质中。然而，在许多情形下，其易于在肿瘤内巢中发现。在小部分TIL中观察到阳性OX40染色且其主要分布于肿瘤间质中。一般而言，OX40+TIL的丰度与CD3+TIL的丰度成正比。在所检查的四种肿瘤类型中，OX40+TI在HCC及CRC中更丰富(图15A-15C)。
实施例7：阻断OX-40L与OX-40的结合的人类单克隆抗OX40抗体
测试了若干抗OX40抗体的阻断重组可溶性OX40L与人OX40转染的293细胞的结合的能力。简而言之，首先将人OX40稳定转染的293细胞与不同浓度的抗OX40抗体一起预温育。随后添加固定浓度(0.2μg/mL)的重组可溶性his标记的人OX40L(OX40L-His,R&DSystems)，并进一步温育样品。在洗涤细胞后，使用内部APC标记的抗His标签抗体检测结合的OX40L-His。使用FACSCanto II流式细胞仪(Becton Dickinson)测量染色的荧光强度。计算细胞群体的APC-抗His标签抗体/OX40L-His染色的几何平均荧光强度(GMFI)(FACSDiva软件)。生成剂量-反应曲线且使用GraphPad Prism软件计算OX40L结合的抗体阻断的EC50；EC50示于表12中。
表12.如通过FACS测量的用于阻断OX40L/OX40相互作用的EC50值.
Figure BDA0001559815020001671
如图16中所示，大部分所测试的抗OX40抗体完全阻断了可溶性人OX40L与转染细胞表面上的人OX40的结合，只是6E1、OX40.4及OX40.5除外。OX40.5的不完全阻断可能是由于与人OX40较其他测试抗体的结合或与重叠但不同表位的结合低的功效。相比的下，6E1及OX40.4不阻断人类OX-40L与OX40的结合。这里的缺乏阻断可能是由于与其余抗体不同的表位的结合。
实施例8：抗体竞争/分拣
如下实施抗体分拣实验。使用胺偶合化学法将一种或多种抗OX40抗体直接包被至Biacore CM5芯片上。将自60μg/mL的起始浓度连续稀释(1:3)的抗OX40抗体与20nM OX40-6X-His抗原一起温育至少1小时。使温育后的复合物流过抗体偶合的表面，并观察交叉阻断。用若干抗体在表面上重复实施，以基于所有抗体的相互交叉阻断生成表位地图。亦在表面上包被OX40L，以鉴定并分拣能够阻断OX40-OX40L相互作用的抗体。实验在Biacore T200或Biacore 3000SPR仪器上实施。
如图17中所概述的，抗体20C1、20B3、8B11、23H3、18E9、14B6、OX40.1及OX40.2为配体阻断剂；抗体3F4为部分配体阻断剂；且14A2、6E1及OX40.5为配体非阻断剂。
实施例9：OX40抗体的生物物理性质
通过SPR分析测试若干OX40抗体对可溶性人OX40的亲和力。简而言之，通过将1-10μg/mL的各别抗体捕获于包被有抗人-CH1的CM5芯片上来实施亲和力测量。使用400nM的单一浓度或自400nM的1:2连续稀释的人类-OX40-6XHIS抗原。在
Figure BDA0001559815020001681
T200或
Figure BDA0001559815020001682
3000SPR仪器上实施实验。将数据拟合至1:1模型。
如表13中所示，所测试抗OX40抗体具有10-8M至10-9M范围内的解离常数(KD)。
表13：OX-40抗体的KD值
克隆 K<sub>D</sub>(M) k-on(1/Ms) k-off(1/s)
3F4 7.13 e-9 5.31 e4 3.79 e-4
8B11 1.05 e-8 4.8 e4 5.1 e-4
14B6 8.84 e-9 7.4 E4 6.54 e-4
6E1 1.1 e-8 1.28 e5 1.41 e-3
14A2 1.51 e-9 1.46 e5 2.2 e-4
18E9 2.04 e-9 6.83 E4 1.39 e-4
20B3 3.71 e-9 5.42 e4 2.01 e-4
23H3 3.6 e-9 1.1 E5 3.95 e-4
20C1 3.22 e-9 6.48 E4 2.09 e-4
OX40.21 1.49 e-9 9.41e+5 0.0014
亦了测试OX40.21抗体的热稳定性，且结果概述于表14中。使用GE HealthcareCAP-DSC测定了热稳定性。样品以250μg/mL浓度在PBS中运行。扫描速率为60℃/hr。将数据拟合至非2态模型。与其他属性(例如，低脱靶效应、免疫原性等)一起考虑，确定OX40.21抗体是所测试的更稳定的抗体之一。
表14：
克隆 Tm1 Tm2 Tm3 可逆性％
3F4 68 83
8B11 72.7 82.9
14B6 66.3 70.5
18E9 65.8 71.2
23H3 72.3 82.7
20C1 68.0 83.0
OX40.21 72.2 79.5 于80℃下为48％
亦测试了在向食蟹猴单次静脉内给药后的OX40.21抗体的药物动力学。OX40.21抗体展现在向食蟹猴单一静脉内(IV)施用后可接受的药物动力学(PK)性质，线性PK(0.4至4mg/kg)及长的终末半衰期(6天)。
表15：在食蟹猴(N＝3)中静脉内施用后OX40.1的药物动力学参数
Figure BDA0001559815020001691
PK参数是通过非区室化方法计算的。值为平均值±SD。
*使用直至10天的血浆浓度计算PK参数，只是第2只猴为0.4mg/kg直至7天
*％AUC额外介于24％与42％之间的范围
使用异速放大(allometric scaling)(假定：CLT的幂指数＝0.85，且Vss＝1)自食蟹猴PK数据预计OX40.21的人PK参数。所预计的人类t1/2为10天(表16)。通过两区室方法计算PK参数。
表16：OX40.21的预计人类药物动力学参数
Figure BDA0001559815020001692
Figure BDA0001559815020001701
实施例10：一组未经标记的抗OX40抗体对PE标记的抗OX40抗体克隆L106的FACS交叉阻断
测试若干抗OX40抗体阻断PE标记的抗OX40抗体克隆L106与人OX40转染的293细胞的结合的能力。简而言之，首先将经人OX40稳定转染的293细胞与不同浓度的未经标记的抗OX40抗体一起温育。随后将细胞洗涤并与2.5μg/mL的固定浓度的PE标记的L106抗体(BDBiosciences)一起温育。使用FACSCanto II流式细胞仪(Becton Dickinson)测量染色的荧光强度。计算细胞群体的PE-L106抗体染色的几何平均荧光强度(GMFI)(FACSDiva软件)。使用GraphPad Prism软件生成L106结合的阻断的剂量-反应曲线。
如图18中所示，18E9及OX40.1抗体完全阻断L106与人OX40转染的细胞的结合，而20B3显示部分阻断。其余抗体显示较小阻断或不显示阻断，这指示18E9及OX40.1在OX40上结合的表位与所测试的其他抗体不同。
实施例11：抗OX40抗体的交叉阻断分析
实施此实验以测试各种抗OX40抗体的交叉阻断性质以评估结合特异性。简而言之，将OX40抗体OX40.1偶联至别藻蓝蛋白(APC)，且将人OX40抗体OX40.4及OX40.5生物素化。将一组未偶联人OX40抗体以一定剂量施加至经改造的在表面上过表达人OX40蛋白质的293或HT1080细胞系，并允许于4℃下结合30min。在未洗去未偶联的Ab情况下，将APC-OX40.1(1μg/mL)、生物素-OX40.4(0.4μg/mL)或生物素-OX40.5(0.4μg/mL)施加至测定孔并容许其于4℃下结合30min。将细胞洗涤，且若需要在相同条件下在链霉抗生物素蛋白-APC偶联物存在下进一步温育。在最终洗涤后，在FACSCanto流式细胞仪(BD Bioscience,SanJose,CA)上分析细胞。平均荧光强度(MFI)信号与结合的偶联抗体成正比。
如图19A-19C中所示，APC-OX40.1与过表达人类OX-40蛋白质的细胞的结合被OX40.2及OX40.5所阻断，但仅被OX40.4稍微(如果有的话)阻断。APC-OX40.1的结合被8B11.H9、3F4.G11、20B3.G2及14B6.C5阻断，但不被6E1.A12及14A2.B9阻断。图19A-19C中评估的抗体之间观察到的结合关系的图示于图19H中。
图19D-19E显示生物素-OX40.4的结合被20B3.G2强烈阻断，被20C1.F2中等阻断，被3F4.G11及23H3.C6微弱阻断(如果有的话)，且不被14A2.B9阻断。生物素-OX40.5的结合被20B3.G2、23H3.C6及20C1.F2强烈阻断，被3F4.G11中等阻断，且被14A2.B9微弱阻断。
图19F-19G显示生物素-OX40.4的阻断不被OX40.1或OX40.8阻断，且仅被OX40.5或OX40.6极弱阻断(如果有的话)。生物素-OX40.5的结合被OX40.1阻断，被OX40.6中等阻断，且仅被OX40.4或OX40.6极弱阻断(如果有的话)。
图19D-19G中评估的抗体之间观察到的结合关系的图示于图19I中。
实施例12：抗OX40抗体结合构象表位/表位定位
此实施例显示：OX40.21结合非变性人OX40，但不结合变性人OX40，且结合并非通过N-糖基化实现。
如下测定OX40.21与具有或无N-连接糖基化的天然或变性OX40的结合。将天然(即，非变性)及变性人OX40的样品与或不与用于去除N-糖基化的N-聚糖酶PNGase F一起温育。对具有或无N-连接糖基化的天然人OX40的样品进行SDS凝胶电泳，且对具有或无N-连接糖基化的变性人OX40的样品进行变性SDS凝胶电泳。
如图20A中所示，OX40.21仅结合天然OX40，且不结合变性形式，且糖基化的存在或不存在不影响与OX40的结合。图20B及20C显示在去糖基化后通过肽定位鉴定了两种N-糖肽(对于AspN118及AspN12二者为60％占据率)。
这些数据表明，OX40.21结合的表位是构象性的，且不依赖N-连接糖基化。
亦使用质谱执行表位定位研究。通过利用胞内蛋白酶的酶消化生成了带his标签的人OX40(“hOX40”)的肽片段。使用AB Sciex 5600Triple-TOF实施LC-MS。
如图20D及20E中所示，通过天然hOX40的限制性蛋白水解的结合实验揭示，OX40.16及OX40.21主要结合肽DVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO:178)，其对应于成熟人类OX-40(SEQ ID NO:2)的细胞外部分的氨基酸46-62。OX40.8结合肽DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGK(SEQ ID NO:179)，其对应于成熟人OX40(SEQ ID NO:2)的细胞外部分的氨基酸89-124。表位被OX40.21结合的位置与OX40配体的结合位点的部分重叠，如通过人OX40/OX40L复合物(蛋白质数据库(Protein Data Bank，PDB)ID代码2HEV)的结晶结构所测定的。针对OX40.21通过质谱鉴定的其他肽示于图20E的上图中，包括QLCTATQDTVCR(SEQ IDNO:184)、SQNTVCRPCGPGFYN(SEQ ID NO:185)、SQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQID NO:182)及PCKPCTWCNLR(SEQ ID NO:183)。
实施例13：抗OX-40抗体促进T细胞增殖并诱导T细胞的IFN-γ及IL-2分泌
测试抗OX-40抗体诱导体外T细胞活性的能力，测试的方式是将抗体与T细胞一起温育，并测量T细胞的增殖及由T细胞分泌的IL-2及IFN-γ的量。
生成转染的CHO细胞以在原代T细胞活化测定中用作人工抗原呈递细胞。CHO-CD3-CD32A细胞系表达单链Fv型式的抗人CD3抗体，以及人类Fc受体CD32A，以将抗OX40抗体呈递于CHO细胞表面上。简而言之，通过负选择(RosetteSepTM,StemCell Technologies)分离人类原代CD4T细胞，并在分级剂量的抗OX40抗体或同型对照抗体存在下将其与经辐照的CHO-CD3-CD32A细胞以8:1的T:CHO比率共培养。于37℃下在培养物中3至4天后，收获上清液，按照制造商的建议通过ELISA(BD Biosciences)或HTRF测定(Cisbio)测量所分泌的人类IFNγ，以评估T细胞活化。其后，添加氚化胸苷，最后持续培养约18小时以借助氚化胸苷掺入来测量T增殖，作为T细胞活化的额外评估。
如图21A-21D及22A-22D中所示(以及下表17中所概述的)，大部分测试的抗OX40抗体以剂量依赖性方式强烈增强由CHO-CD3-CD32细胞刺激的人类CD4T细胞活化，如通过增殖及IFNγ分泌所测量。此测定中测试的抗体组与OX40.1、OX40.4及OX40.5相比至少一样或更好地共刺激T细胞活化。
表17.
Figure BDA0001559815020001721
Figure BDA0001559815020001731
亦在葡萄球菌肠毒素B(SEB)活化的人类外周血单个核细胞(PBMC)的培养物中测试了抗人OX40抗体对刺激原代T细胞的效应。人全血自AllCells,Inc.(Berkeley,CA)获得或自Bristol-Myers Squibb,Redwood City,CA处的供体在内部静脉切开术程序支持下获得。通过在Ficoll-Hypaque垫层上梯度纯化分离PBMC，并在分级剂量的OX40抗体或同型对照抗体以及2-5μg/mL可溶性交联抗体F(ab')2山羊抗人Fcγ存在下将其在补充有固定的、亚最优的(85ng/mL)的超抗原葡萄球菌肠毒素B(SEB；Toxin Technologies,Sarasota,FL)的培养基中培养3天。于37℃下培养3天后，收获上清液，通过对分泌的人IL-2的ELISA测量来评估T细胞活化。简而言之，将培养上清液在样品稀释剂中1:10稀释，并根据制造商推荐的方案通过ELISA(BD Bioscience)测试人IL-2的存在。在添加TMB底物后，使用Softmax操作软件于650nm的波长下在Spectramax 340PC读数器上对测定板进行读数。生色底物的测得的光密度与发生了结合的检测抗体成正比。
来自分离自不同供体的PBMC的数据示于图23A-23F中。一般而言，与可溶交联的克隆23H3.C6、8B11.H9、3F4.G11、18E9.G5、6E1.A12及20B3.G2相比，可溶交联的克隆20C1.F2引发了更鲁棒的细胞因子反应(EC50为1.3-2.0nM)(图23A-23C)。关于具有可变区突变的抗体，与可溶性交联抗体OX-40.17、OX40.18、OX40.6及OX40.8相比，OX-40.21普遍地引发了更鲁棒的细胞因子反应(图23D-23F)。来自这些供体的数据以及来自8个其他供体(其中测试其他抗OX40抗体)的数据共同展示，与OX40.1、OX40.2、OX40.4、OX40.5、OX40.17及OX40.18相比，OX40.21平均展现增强T细胞反应的优异功效。这些结果进一步展示，OX40.21引发与由OX40.6及OX40.8引发的反应相当的反应(表18)。
表18：
供体编号 OX40.21 OX40.17 OX40.18 OX40.6 OX40.8
BMS-009 EC50(nM) 0.34 0.97 3.21 0.45 0.50
BMS-012 EC50(nM) 0.29 1.74 约1.67 0.66 0.09
BMS-016 EC50(nM) 0.04 1.40 ＞100 0.29 0.09
供体编号 OX40.21 OX40.17 OX40.18 OX40.6 OX40.8 OX40.1 OX40.2 OX40.4 OX40.5
WB10024 EC50(nM) 0.82 1.06 约3.17 约0.42 约0.44 1.87 2.53 1.25 约1.83
WB10025 EC50(nM) 1.31 1.35 约1.14 约0.85 0.79 2.08 约3.26 1.08 3.07
WB10026 EC50(nM) 0.79 1.68 3.02 0.28 0.63 2.24 3.16 1.14 2.59
WB10027 EC50(nM) 1.08 1.15 约3.27 0.45 约0.46 1.26 2.26 0.93 约3.09
供体编号 OX40.21 OX40.17 OX40.18 OX40.6 OX40.8 OX40.1 0X40.2 OX40.4 OX40.5
WB10137 EC50(nM) 0.56 0.92 ＞100 0.56 0.42 约1.824 ＞100 1.37 ＞100
BMS-001 EC50(nM) 0.41 0.41 约84.76 0.49 约0.42 0.64 4.95 约0.89 约0.43
BMS-004 EC50(nM) 约0.84 1.03 2.43 0.48 0.55 2.52 13.89 0.84 1.94
BMS-015 EC50(nM) 0.76 1.16 ＞100 约0.46 约0.42 2.41 ＞100 0.91 1.92
平均EC50(nM) 0.64 1.17 2.89 0.46 0.44 1.86 5.36 1.07 2.38
*每一组实验在不同日实施。
实施例14：抗OX40抗体促进NK92介导的细胞溶解(使用细胞系)
使用钙黄绿素释放作为读出(read-out)来测试若干抗人OX40抗体促进NK92细胞介导的活化CD4+ T细胞溶解的能力。简而言之，通过使用磁珠粒负向选择分离用作靶细胞的CD4+ T细胞，并利用抗CD3及抗CD28包被的珠粒活化72小时。3天后，将NK92细胞与钙黄绿素AM标记的活化CD4+细胞以5对1的比率一起铺板。添加滴定浓度的每一抗OX40抗体并将细胞温育2小时。通过使用Envision读板仪(Perkin Elmer)对介质的荧光强度进行读数来测量钙黄绿素释放。基于平均荧光强度(MFI)利用下式计算抗体依赖性细胞溶解的百分比：[(测试MFI-平均背景)/(平均最大值-平均背景)]×100。
如图24中所示，OX40.8及OX40.16诱导了最高量的靶细胞特异性溶解(分别为60％及30％)。OX40.8的EC50为16ng/mL，OX40.16的EC50为4ng/mL。所测试的所有其他抗体诱导的ADCC水平过低以至于无法精确定量。
实施例15：抗OX40抗体促进NK介导的原代人类CD4+T细胞的细胞溶解
测试了若干抗人OX40抗体促进原代NK细胞介导的活化CD4+ T细胞溶解的能力。简而言之，通过磁性选择自两个供体的PBMC分离用作靶细胞的CD4+ T细胞，并利用经抗CD3及抗CD28包被的珠粒活化72小时。通过使用磁珠粒负向选择自单独供体分离用作效应物的NK细胞，并利用IL-2活化24hr。在活化期之后，在1μg/ml的抗体存在下将NK效应细胞与钙黄绿素标记的靶T细胞以20:1、10:1或5:1比率混合2小时。通过使用Envision读板仪(PerkinElmer)对介质的荧光强度进行读数来测量由溶解的靶细胞释放的钙黄绿素的量。基于平均荧光强度(MFI)利用下式计算抗体依赖性细胞溶解的百分比：[(测试MFI-平均背景)/(平均最大值-平均背景)]×100。
如图25A及25B中所示，OX40.8最有效地溶解了来自两个供体的活化CD4+ T细胞靶标。利用OX40.21及OX40.1二者观察到了较之为低的ADCC活性水平。
实施例16：OX40抗体促进表达OX40之HEK293细胞的巨噬细胞介导的细胞吞噬作用
为测定若干OX40抗体的抗体介导的吞噬性活性，将原代人类巨噬细胞与CellTrace Violet标记的HEK293/OX40细胞及滴定浓度的抗OX40抗体一起培养4小时。4小时后，收获细胞，用抗CD64-APC染色，并在流式细胞仪上运行。将对CD64及CellTraceViolet双阳性染色的细胞视为被吞噬。使用下式计算被吞噬靶细胞的百分比：100×(双阳性细胞的数目/CellTrace Violet阳性细胞的总数)。
如图26中所示，所有测试抗OX40抗体皆以剂量依赖性方式诱导了表达OX40的靶细胞的吞噬作用。OX40.8具有最高的吞噬作用总体水平，以及最低的EC50浓度，6.2ng/mL。这表明人类IgG1抗OX40抗体以剂量依赖性方式诱导FcR介导的吞噬作用。
实施例17：抗OX40抗体结合人补体的C1q组分
研发比色ELISA测定以评估人类血清补体的C1q组分是否结合OX40.21抗体。将所有测试抗体以10μg/mL包被于高结合免疫测定板上。在封闭了未被占据的蛋白结合位点后，向各孔(包括用作结合测定板的非特异性背景C1q的对照的阻断空白孔)中添加分级剂量的人类C1q(3.125-200μM)。使用生物素化小鼠抗C1q抗体与链霉抗生物素蛋白-聚-HRP的组合以及四甲基联苯胺底物检测C1q与固定抗体的结合。报告450nm处的光密度读数减去630nm的读数作为结果。
如图27中所示，C1q以剂量依赖性方式结合OX40.21(实心方形)及人类IgG1同型对照(空心圆)。然而，C1q与OX40.21的结合水平低于与人类IgG1同型对照抗体的结合水平。如所预期的，存在极少背景信号(灰色圆)且C1q与IgG1.l同型对照物明显结合(实心黑色圆)。IgG1.l抗体在Fc区中含有五个经设计以消除C1q结合及FcR相互作用的突变。此结果展示人类血清补体的C1q组分可结合OX40.21，且指示OX40.21可诱导补体介导的表达OX40的细胞在体内溶解。
实施例18：OX40在肿瘤浸润淋巴细胞中表达
在结肠直肠癌、肺癌及卵巢癌中(图28C)，OX-40在肿瘤浸润淋巴细胞中表达，表达模式是大体上限于CD4+细胞(图28A)，在CD8+ T细胞上表达极少(图28B)。
类似地，OX40被小鼠Sa1N肿瘤(图28D)及小鼠MC38肿瘤(图28E)中的CD4+ T细胞及Treg表达。为测试肿瘤中小鼠OX-40的表达，分别向AJ或B6小鼠中皮下植入2×106个SA1N肉瘤细胞或2×106个MC38细胞。在植入后第15天，收获肿瘤，解离成单细胞悬浮液，并染色用于流式细胞术。基于CD8、CD4及Foxp3的其表达来鉴定T细胞群体。对于Sa1N肿瘤，肿瘤的CD4+Foxp3+细胞示于红色直方图中，CD4+Foxp4-细胞示于蓝色直方图中且CD8+细胞示于橙色直方图中(图28D)。同型对照染色的细胞示于绿色直方图中。对于MC38肿瘤，Treg示于蓝色直方图中，CD4+细胞示于绿色直方图中且CD8+细胞示于红色直方图中(图28E)。
实施例19：抗OX40抗体逆转Treg细胞介导的阻遏作用
测试了若干抗人OX40抗体逆转调控性T(Treg)细胞介导的人类CD4+ T细胞增殖阻遏作用的能力。简而言之，通过磁珠粒分离从PBMC富集CD4+细胞，随后分选CD4+CD25hiCD127lo Treg及CD4+CD25loCD127hiCD45RO+Tresp细胞，来分离Treg及T反应(Tresp)细胞。随后用增殖染料标记Tresp细胞并与经滴定的数目的Treg细胞以1:1比率铺板。用3μg/mL结合于板的抗CD3、1μg/mL可溶性抗CD28及2μg/mL结合于板的抗OX40或同型对照刺激培养物。96小时后，通过使用流式细胞术评估染料稀释来测量Tresp细胞增殖。
如图29中所示，在Treg细胞存在及不存在下，与同型对照相比，抗OX40抗体都增加了Tresp细胞增殖。这表明，所测试的抗OX40抗体逆转了Treg细胞对Tresp细胞增殖的阻遏效应。
实施例20：毒性研究
在第1天(图30A)及第29天(图30B)向猴静脉内施用OX40.6(2mg/kg)以评估任何相关毒性。未观察到耐受性问题或临床病理异常的证据。OX40.6刺激了对KLH的增强的免疫反应，如在离体KLH记忆测定中朝向在CD4+ T细胞中增强的CD69表达的趋势所表征的。4只猴中的两只展现加速的清除率，其与抗药物抗体的形成相关。
通过化学发光(CL)免疫测定来测定上述实验的食蟹猴血清样品中OX40.6的浓度。使用OX40.6抗体以制备校准剂及质量控制(QC)样品。将生物素化-人OX40-his固定于链霉抗生物素蛋白包被的微量滴定板(GreinerBio-one)上作为OX40.6的捕获分子。在板上温育达到10％食蟹猴血清的最终基质的样品、标准品及质量控制样品。在含有2％小鼠血清的1％BSA/PBS/0.05％Tween 20(PTB)中以10％最小所需稀释测定样品。洗掉未结合的物质并使用HRP标记的小鼠单克隆抗人IgG抗体作为检测分子检测所捕获的OX40.6抗体。在添加SuperSignal ELISAPico化学发光底物(Thermo Scientific)后，使用自OX40.6抗体校准剂生成的4-参数对数(4-PL)校正曲线自发光强度计算食蟹猴血清样品中OX40.6的浓度，如通过M5读板仪所测量的。OX40.6抗体校正曲线的范围在食蟹猴血清中为5ng/mL至5,000ng/mL。定量的上限及下限分别为5,000ng/mL及10ng/mL(即，ULOQ 5000ng/mL，LLOQ 10ng/mL)。在食蟹猴血清中制备3750ng/mL、400ng/mL及20ng/mL的质量控制样品且在每一板上对其进行测定以确保可接受的测定性能。将校准剂、QC及样品在含有2％小鼠血清的PTB中稀释5倍。使用四个链霉抗生物素蛋白板以测定样品。测定性能在可接受范围内：标准品的板间％CV低于25％，且QC回收率在±30％标称值内。
通过电致化学发光(ECL)桥接免疫测定确定上述实验中食蟹猴血清中OX40.6的抗药物抗体的存在。具体而言，使用小鼠单克隆抗人IgG Fc抗体以制备阳性对照。生物素化-抗OX40:抗hOX40-his以25ng/mL用作捕获分子且钌化抗OX40:抗hOX40-his以25ng/mL用作检测分子。以含有捕获及检测分子的1％BSA/PBS/0.05％Tween 20(PTB)中的100倍稀释测定样品。在聚丙烯板中温育2小时后，将样品混合物转移至链霉抗生物素蛋白包被的MSD板。在1小时温育后，洗掉未结合物质，添加MSD读取缓冲液，且利用MSD读板仪SI6000测量ECL。在食蟹猴血清中制备1000ng/mL(HPC)、100ng/mL(MPC)及10ng/mL(LPC)的阳性对照(小鼠抗人IgG Fc)。使用汇集食蟹猴血清作为阴性对照(NC)。HPC、MPC及LPC对NC的信号比分别系102、10及2。使用一个链霉抗生物素蛋白板以测定样品。测定性能在可接受范围内：PC的％CV低于10％，且阴性对照的原始信号(54RLU)与施用前样品的原始信号(48-55RLU)相当。
实施例21：免疫原性风险评估研究
针对若干抗人OX40抗体进行体外T细胞增殖测定以评估其人类免疫原性潜能。简而言之，通过Ficoll(GE Healthcare)及梯度离心分离健康志愿者的外周血单个核细胞(PBMC)，且通过聚合酶链式反应(PCR)扩增和与寡核苷酸探针(Prolmmune)杂交来表征人类淋巴细胞抗原(HLA)类别II。
使用一组40个具有密切匹配世界人口频率的HLA类别II型的PBMC供体进行一次测定。用CFSE(Invitrogen)标记PBMC以监测增殖并在含有10％人类AB(Bioreclamation)、非必需氨基酸(Gibco)及青链霉素(Gibco)的RPMI(Lonzo)中以200,000个细胞/孔以6个重复铺板于96孔板上。将抗人OX40抗体、对照蛋白质、参照抗体及ConA与PBMC以1μM一起培养7天，其后洗掉培养基并用抗人CD4 APC(BD science)单克隆抗体标记细胞。在利用洗涤步骤去除未结合的抗CD4抗体后，将细胞用PBS中的3.7％福尔马林(Sigma)固定，并通过流式细胞术测定以测定增殖CD4+细胞的百分比。
对于不同抗人OX40抗体显示阳性反应(定义为增殖CD4+ T细胞相对于培养基温育的PBMC显著增加)的40个供体的百分比示于图31中。抗人OX40抗体的所有变体在此测定中皆显示低的活化CD4+细胞的潜能，与低的QC蛋白质相当，例外是OX40.16及OX40.21，它们在40个供体中均不显示阳性CD4增殖反应。这些结果表明，这些抗人OX40抗体具有引发人类的抗药物抗体反应的低潜能。
实施例22：在结肠癌模型中，与活化Fc受体的结合增强抗mOX40活性
为测试小鼠肿瘤模型中FcR结合在抗小鼠OX40抗体的活性中的作用，测试了不同同型的抗OX40抗体。向C57BL/6小鼠皮下注射200万个MC38肿瘤细胞。7天后，测定肿瘤体积并将小鼠随机分入治疗组，使之具有相当的平均肿瘤体积。在第7、10及14天以200μg/剂量以200μl的体积腹膜内施用配制于PBS中的抗体。
在同基因小鼠肿瘤模型中，抗鼠类OX40抗体(例如，OX86、大鼠IgG1)展现了抗肿瘤活性。由于改变许多对T细胞表面受体(共刺激性及共抑制性)具有特异性的抗体的同型可改变这些抗体的抗肿瘤活性，故生成了OX86——一种不阻断OX40/OX40L相互作用的抗体——的小鼠Fc同型变体。如图32A-32C中所示，与采用小鼠IgG1型式的OX86(图32B)相比，采用小鼠IgG2aFc型式的OX86(图32C)产生了更优的抗肿瘤活性。其原因可能是由于肿瘤位点处Treg细胞的耗竭，以及抗体介导的OX40的激动作用所致的T效应细胞扩增。
为确认不同抗体同型对肿瘤浸润T细胞群体的效应，通过流式细胞术评估了经不同同型治疗的MC38小鼠的肿瘤。将所选小鼠处死，并在肿瘤植入后第15天收获肿瘤及脾用于测定。通过利用注射器在24孔板中解离肿瘤及淋巴结制备单一细胞悬浮液。使细胞悬浮液通过70μm过滤器，离心沉降，重新悬浮并计数。随后将细胞以1×106个细胞/孔铺板于96孔板中用于染色。随后在FACS Canto流式细胞仪(BD)上测定样品。经抗OX40抗体治疗的带有肿瘤的小鼠的脾及肿瘤的测定显示，IgG2a同型可耗竭肿瘤中的CD4+Treg(图33A)，IgG1及IgG2a同型可活化外周中的T细胞扩增(图33B)且可增加脾中的细胞数目(图33C)。这些结果表明，OX40的激动作用(但不一定是阻断OX40/OX40L相互作用)及OX86抗体的Fc受体结合促进抗肿瘤活性。
使用小鼠测试人Fc及FcR的作用，其中小鼠FcR已敲除且被置换为人FcR。这些实验使用骨髓嵌合体系统实施，骨髓嵌合体系统中CD45.1同基因型宿主被施以辐照，随后利用人类FcR转基因骨髓细胞重建。随后使这些小鼠重建8周，之后接种2×106个MC38肿瘤细胞。7天后，测定肿瘤体积并将小鼠随机分入治疗组使之具有相当的平均肿瘤体积。在第7、10及14天以200μg/剂量以200μl的体积腹膜内施用配制于PBS中的抗体。用对照人类IgG1(图34A)、嵌合OX-86人类G1杂合Ab(图34B)或具有S267E突变的OX-86人类G1杂合体(图34C)治疗小鼠。结果与使用小鼠同型所见的结果相似，即人类IgG1抗体具有显著的抗肿瘤效应，因为其可结合活化FcR；而S267E突变，其增加与CD32B及CD32A二者的结合，具有较高的活性(图34A-34C)。此较高的活性水平可能是由于对效应物T细胞的激动作用增加以及肿瘤位点处Treg的耗竭增加所致。
如先前所述检查带有肿瘤的小鼠的肿瘤位点及脾处的T细胞群体。Treg在经G1或G1S267E抗体治疗的小鼠中较不普遍，其中利用S267E同型观察到更大的效应(图35A)。肿瘤位点处CD8+ T细胞(图35B)及CD4+效应物(图35C)的百分比的增加亦明显，且利用G1S267E抗体时这些增加更显著。亦注意到经抗OX-40抗体治疗的小鼠的脾中的细胞性增加(图35D)。这些结果提示，OX86-hIgG1抗体展现了强有力的抗肿瘤活性(图34A-34C)及可测量的Treg耗竭(图35A-35D)。
实施例23：阻断抗OX40抗体在小鼠肿瘤模型中展现抗肿瘤活性
执行以下实验以确定阻断OX40/OX40L之间的相互作用的抗体是否展现强有力的抗肿瘤活性。为此，生成阻断OX40/OX40L相互作用的仓鼠抗小鼠OX40抗体(仓鼠IgG1 8E5抗体)并在皮下小鼠CT-26肿瘤模型中测试其抗肿瘤活性。CT-26是小鼠结肠腺癌肿瘤细胞系，在皮下移植细胞时可在BALB/c小鼠中监测其实体肿瘤生长。
在研究开始之前，使雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories,Hollister,CA)适应最少三天。将小鼠以每个笼5只动物圈养，且将笼放置于微隔离器通气槽中。圈养于18℃至26℃及50+20％相对湿度下进行，每小时至少12次更换室内空气。维持12h光/暗循环。向动物随意提供经卫生处理的实验室啮齿类动物饮食及城市用水。
将CT-26细胞维持于补充有10％胎牛血清(FBS；Hyclone,目录号SH30071.03)的RPMI-1640培养基(Hyclone,目录号SH30096.01)中。约一周两次将包含于单一T175烧瓶中的细胞以1:5稀释分化并扩增至四个T175烧瓶，直至获得足够数目的细胞用于肿瘤植入。接近80％铺满收获细胞，洗涤并重新悬浮于PBS中。
在第0天，使用1cc注射器(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)及27规5/8英吋针向小鼠中植入1×106个CT-26细胞。随后每周两次利用电子测径器(Mitutoyo,Aurora,Illinois)3维测量肿瘤并记录。使用下式计算肿瘤体积(mm3)：宽度×长度×高度×0.5。在植入后第6天肿瘤体积测量后，根据肿瘤体积对小鼠进行分级。将具有26mm3的平均肿瘤体积的小鼠随机分组并如表19中所示治疗。
仓鼠同型对照抗体为抗GST的惰性美国仓鼠IgG单克隆抗体(mAb)(克隆PIP，目录号BE0260；BioXcell,West Lebanon,NH)。在即将施用之前在PBS中制备该抗体，在第6、10及14天经由腹膜内(IP)注射提供10mg/kg/小鼠的剂量，如表19中所示。
单抗小鼠OX40(克隆8E5)的单克隆抗体系在即将施用之前在PBS中制备以在第6、10及13天经由IP注射提供10mg/kg、3mg/kg、1mg/kg或0.3mg/kg/小鼠的剂量，如表19中所示。
表19：
Figure BDA0001559815020001811
每日检查动物是否有姿势、梳毛行为、及呼吸的变化以及嗜睡。每周两次称重动物，且若重量损失>20％，则将其安乐死。每周两次检查小鼠的肿瘤的存在及大小直至死亡或安乐死。利用电子测径器(Mitutoyo,Aurora,Illinois)以3维测量肿瘤并记录。测量随肿瘤生长变化的对治疗化合物的反应。若肿瘤达到≥1500mm3的体积或出现溃疡，则将动物安乐死。
如图36A-36E中所示，与仓鼠IgG同型对照组(图36A)相比，仓鼠抗小鼠OX40mAb(克隆8E5；图36B-36E显示利用不同剂量的8E5的治疗)在皮下CT-26模型中展示强有力的抗肿瘤活性。8E5抗体以介于0.3mg/kg至10mg/kg范围内的剂量施用，且即使在评估的最低剂量(0.3mg/kg)下，在研究时段结束时(第72天)，12只小鼠中的10只无肿瘤(TF)。尽管无肿瘤的小鼠的数目在每一剂量组之间无显著不同(其中直至研究时段结束，每一组具有9或10只无肿瘤小鼠)，但与经两个最低剂量(0.3mg/kg或1mg/kg)治疗的小鼠相比，用两个最高剂量(3mg/kg或10mg/kg)中的任一者治疗的小鼠显示了更大的肿瘤生长延迟。同型对照治疗组中存在无肿瘤的小鼠；该组中的所有小鼠至第39天为止皆由于溃疡或肿瘤负荷(>1500mm3)而被处死。
这些数据指示，在对患有已建立的肿瘤的小鼠施用阻断OX40与OX40-L之间的相互作用的抗OX40抗体时，在皮下小鼠CT-26肿瘤模型中展示了强有力的抗肿瘤活性。
实施例24：在鼠类MC38结肠癌模型中，OX40激动作用与PD-1阻断协同作用
为测试抗OX-40抗体与抗PD-1抗体治疗之间的协同作用，在MC38小鼠肿瘤模型中测试了这些抗体的组合。向C57BL/6小鼠皮下注射200万个MC38肿瘤细胞。7天后，测定肿瘤体积并将小鼠随机分入治疗组，使之具有相当的平均肿瘤体积。在第7、10及14天以200μg/剂量以200μl的体积腹膜内施用配制于PBS中的抗体。
如图37A-37D中所示，抗PD-1抗体(图37B)及抗OX40抗体(图37C)二者在单独使用时均显示极小的活性，但在组合时具有显著的抗肿瘤活性(图37D)，使得8只小鼠中的5只变得无肿瘤。
实施例25：OX40激动作用增强食蟹猴对疫苗的反应
测量对疫苗的免疫反应的增强以评估OX40.6抗体刺激食蟹猴的免疫反应的能力。选择此方法，这是因为不可在健康非人类灵长类动物中评估期望效应(即对肿瘤的免疫反应的增强)，这是因为其无肿瘤。
第1天用钥孔戚血蓝蛋白(KLH)(10mg，肌内)并用B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)(ENGERIX-B)(20μg，肌内，在第1及29天)对猴进行免疫。在施用疫苗后，在第1及29天向猴静脉内投用0mg/kg或2mg/kg的OX40.6抗体。在第22及41天通过对KLH的离体T细胞反应及通过对KLH及HBsAg的T细胞依赖性抗体反应测量免疫反应。如图38A及38B中所示，在第22天(图38A)及第41天(图38B)时2mg/kg下的OX40.6相关所见包括对KLH的离体记忆反应增加，其以表达CD69+、IFN-γ+及TNF-α+的CD4+CD8- T细胞的平均百分比增加为特征。
实施例26：具有经改造的恒定结构域的抗体的Fc受体结合
此实施例展示，对于具有包含IgG2的CH1及铰链的经修饰的重链恒定区的抗体而言，当其含有IgG1的CH2及CH3结构域时，可结合FcγR。
除由可变结构域抗原结合外，抗体亦可经由与恒定结构域的相互作用接合Fc-γ受体(FcgR)。这些相互作用介导效应物功能，例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)及抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。IgG1同型的效应物功能活性较高，但IgG2及IgG4的效应物功能活性极低或不存在，这是因为这些同型对FcgR具有较低亲和力。另外，IgG1的效应物功能可经由恒定区内的氨基酸残基的突变来修饰以改变FcgR亲和力及选择性。
使用生物传感器技术(包括Biacore表面等离子共振(SPR)及Fortebio生物膜层干涉法(BLI))研究抗体与Fcγ受体(FcγR或FcgR)的结合。在25℃下在Biacore T100仪器(GEHealthcare)上实施SPR研究。使用EDC/NHS将鼠类抗6xHis抗体的Fab片段固定于CM5传感器芯片上至约3000RU的密度。经由C-末端his-标记使用30s的接触时间以10ul/min捕获各种带his标签的FcgR(7μg/ml)，且在10mM NaPO4、130mM NaCl、0.05％p20(PBS-T)pH 7.1的运行缓冲液中评估1.0uM抗体的结合。用于这些实验的FcgR包括CD64(FcgRI)、CD32a-H131(FcgRIIa-H131)、CD32a-R131(FcgRIIa-R131)、CD32b(FcgRIIb)、CD16a-V158(FcgRIIIa-V158)、CD16b-NAl(FcgRIIIb-NAl)及CD16B-NA2(FcgRIIIb-NA2)。于25℃下在10mM NaPO4、130mM NaCl、0.05％p20(PBS-T)pH 7.1中在Fortebio Octet RED仪器(Pall,Fortebio)上实施BLI实验。在蛋白A包被的传感器上从未经稀释的表达上清液中捕获抗体，之后结合1μMhCD32a-H131、hCD32a-R131、hCD32b、hCD16a-V158或0.1μM hCD64测定物。
首先，制得含有包括取代S267E(SE)及S267E/L328F(SELF)、以及突变P238D、P271G、H268D、A330R、G237D、E233D的各种组合(称作V4、V7、V8、V9及V12)的经修饰IgG1 Fc结构域的抗体。通过Biacore SPR与IgG1f、IgG2.3(IgG2-C219S)及IgG4.1(IgG4-S228P)抗体、以及经改造以减少与所有FcgR的结合的IgG1.1f抗体比较来研究这些抗体的结合。结果如图70中所示，其展示了IgG1f、IgG2.3及IgG4.1及突变IgG1抗体的预期的FcgR结合性质，包括SE及SELF的增加的CD32a-H131、CD32a-R131及CD32b结合，以及V4、V7、V8、V9及V12突变体相比于CD32a-H131及CD32a-R131对CD32b的选择性增加(图39)。
使用下一组构建体将原本为效应物功能阴性的IgG2同型改造为具备效应物功能。对于此研究，在IgG2.3恒定区或IgG2.3/IgG1f杂合体(称作IgG2.3G1-AY(表20))的背景下引入上述突变。抗体以小规模表达为上清液，且使用Fortebio Octet生物膜层干涉法生物传感器技术测试对FcgR的结合。由于抗体以低浓度存于上清液中，故通过使用蛋白A包被的传感器自上清液捕获抗体、之后结合溶液中的FcgR测定物来实施实验。亦包括了纯化的上清液对照IgG1f(包括野生型IgG1、SE、P238D、V4及V12抗体)用于比较，且这些对照抗体中的每一者皆展示了预期的FcgR结合性质(图40)。IgG2.3抗体亦展示了预期的结合性质，与仅CD32a-H131具有明显结合。然而，用以向IgG2.3中引入S267E、L328F、P238D、P271G、H268D、A330R、G237D或E233D突变的所有突变皆不能重演相应经改造IgG1mAb的FcgR亲和力(图40)。相比之下，IgG2.3G1-AY构建体能够完全保留野生型IgG1的FcgR结合性质，同时保留IgG2.3的CH1及铰链区。另外，含有S267E、L328F、P238D、P271G、H268D、A330R、G237D及E233D的所有IgG2.3G1-AY突变体皆展示与含有相同突变的IgG1型式mAb相当的FcgR结合性质(图40)。这表明改造具有IgG2的CH1及铰链区、以及野生型或突变体IgG1的效应物功能的抗体是成功的。
表20：经改造的IgG2构建体
Figure BDA0001559815020001841
Figure BDA0001559815020001851
通过产生具有IgG2.3G1-AY、IgG2.3G1-AY-S267E(IgG2.3G1-AY-V27)型式的其他抗体、以及IgG2-B-形式变体(IgG2.5G1-AY及IgG2.5G1-AY-V27)、及含有IgG1及IgG2恒定结构域的不同组合的其他杂合抗体，并使用Biacore SPR技术测试这些抗体与抗his Fab捕获的带his标签的FcgR的结合，来进一步探索此改造策略。与Octet上清液数据相同，SPR数据显示，IgG2.3G1-AY及IgG2.3G1-AY-V27抗体尽管含有A-形式IgG2抗体(IgG2.3)的CH1及铰链区，但分别与IgG1f及IgG1f-S267E具有相当的FcgR结合性质(表21)。亦使用IgG2.5G1-AY及IgG2.5G1-AY-V27抗体获得了类似数据，这表明成功改造了具有IgG1f或经修饰IgG1f样效应物功能的B-形式IgG2抗体(含有C131S突变，称作IgG2.5)。具有IgG2.3G1-AY、IgG2.3G1-AY-V27、IgG2.5G1-AY或IgG2.5G1-AY-V27恒定区但不同可变区的若干其他抗体的数据显示，此改造策略广泛适于独立于可变结构域的其他抗体(表21)。
表21：1uM结合抗his Fab捕获的FcgR-his蛋白质的抗体的％Rmax值
Figure BDA0001559815020001852
Figure BDA0001559815020001861
Figure BDA0001559815020001871
实施例27：具有经修饰重链恒定区的抗OX40抗体在有或无交联情况下对T细胞增殖及T细胞的IFN-γ及IL-2分泌的效应.
具有经修饰IgG2 CH1/铰链区的抗OX40抗体可具有在不存在交联下促进T细胞活化的能力，且因此可能够在不存在表达FcγR的细胞类型或低表达下促进体内T细胞活化，且可能在较IgG1同型抗体更宽范围的肿瘤类型中促进抗肿瘤活性。
或者，经修饰CH1/铰链区抗体可能仍需要交联以促进T细胞活化，但与IgG1同型抗体相比，在结合FcγR时可具有增加的激动剂活性，且因此在促进T细胞活化及抗肿瘤活性中更有效力。
生成具有包含表22中所示序列的经修饰重链恒定区的抗OX40抗体且使用上述测定测试在具有或无交联情况下其对T细胞增殖及自T细胞的IFN-γ及IL-2分泌的效应。抗体OX40.6、40.8、40.16及40.21的轻链序列分别对应于SEQ ID NO:96、110及116(对于OX40.16及40.21二者)。
表22.
Figure BDA0001559815020001872
Figure BDA0001559815020001881
CHO-CD3+/-CD32测定
通过将T细胞与具有表22中所示序列的抗OX-40抗体一起温育，测量这些T细胞的增殖及由这些T细胞分泌的IL-2及IFN-γ的量，来测试所述抗体诱导体外T细胞活性的能力。
生成转染的CHO细胞以在原代T细胞活化测定中用作人工抗原呈递细胞。CHO-CD3-CD32A细胞表达单链Fv型式的抗CD3抗体以及人Fc受体(FcR)CD32A，以将抗OX40抗体呈递于CHO细胞表面上。CHO-CD3细胞系在无FcR的单链Fv格式中表达抗人CD3抗体。
简而言之，通过负向选择(RosetteSepTM,StemCell Technologies)分离人类原代CD4T细胞，并在分级剂量的抗OX40抗体或同型对照抗体存在下将其与经辐照的CHO-CD3-CD32A细胞或经辐照的CHO-CD3细胞以8:1T:CHO比率共培养。于37℃下在培养物中3至4天后，收获上清液用于遵循制造商的建议藉助通过ELISA(BD Biosciences)或HTRF测定(Cisbio)测量所分泌人类IFNγ来评估T细胞活化。其后，添加氚化胸苷，最后持续培养约18小时以借助氚化胸苷掺入来测量T增殖，作为T细胞活化的额外评估。
SEB PBMC测定
亦在葡萄球菌肠毒素B(SEB)活化的人类外周血单个核细胞(PBMC)的培养物中测试具有表22中所示序列的抗OX-40抗体对刺激原代T细胞的效应。人类全血样品自AllCells,Inc.(Berkeley,CA)获得或自Bristol-Myers Squibb,Redwood City,CA处的供体在内部静脉切开术程序支持下获得。通过在Ficoll-Hypaque垫层上梯度纯化分离PBMC并在分级剂量的OX40抗体或同型对照抗体存在下将其在补充有固定的、亚最优的(85ng/mL)的超抗原葡萄球菌肠毒素B(SEB；Toxin Technologies,Sarasota,FL)的培养基中培养3天。在一些情形下，还向培养物中添加2-5μg/mL的可溶性交联抗体F(ab')2山羊抗人Fcγ。于37℃下培养3天后，收获上清液，通过对分泌的人IL-2的ELISA测量来评估T细胞活化。简而言之，将培养上清液在样品稀释剂中1:10稀释，并根据制造商推荐的方案通过ELISA(BDBioscience)测试人IL-2的存在。在添加TMB底物后，使用Softmax操作软件于650nm的波长下在Spectramax 340PC读数器上对测定板进行读数。生色底物的测得的光密度与发生了结合的检测抗体成正比。
MLR测定
测试具有表22中所示序列的抗OX-40抗体是否能够在T细胞:树突细胞同种异体混合淋巴细胞反应(T:DC AlloMLR)中增强原代人类T细胞增殖及IFN-γ分泌。通过负向选择(RosetteSep,Stemcell Technologies)自健康人类供体的外周血分离总T细胞。使用CD 14微珠粒(Miltenyi)自健康人类供体的外周血分离单核细胞，且在GM-CSF及IL-4存在下培养6天以衍生不成熟树突细胞(DC)。在分级剂量的OX40抗体或同型对照抗体存在下共培养DC及T细胞。在一些情形下，亦向培养物中添加2-5μg/mL的可溶性交联抗体，例如F(ab')2山羊抗人Fcγ。在第4天与第7天之间收获每一样品的上清液，遵循制造商的建议通过ELISA(BDBiosciences)或HTRF测定(Cisbio)测量分泌的IFN-γ。在收获上清液后，将细胞培养物用1μCi/孔的3[H]-胸苷脉冲培养的最后16-18小时。将细胞收获于滤板上，并读取平均每分钟纳入细胞的3[H]-胸苷的3[H]计数作为T细胞增殖的量度。
实施例28：CT26模型中OX40激动剂mAb结合CTLA-4阻断的抗肿瘤活性
为测试抗OX-40抗体与抗CTLA-4抗体治疗之间的协同作用，在CT26小鼠肿瘤模型中测试了这些抗体的组合。向小鼠接种CT26肿瘤，并在接种后第+3天开始用200μg/小鼠的抗体给药mAb(在第3、7及10天给药)，如图41A-41D中所指示的。
如图41A-41D中所示的，抗CTLA-4抗体(图41B)及抗OX40抗体(图41C)二者在单独使用时显示极小的活性(对于两种处理，8只小鼠中的1只无肿瘤)，但在组合时具有显著抗肿瘤活性(图41D)，使8只小鼠中的4只变得无肿瘤。
实施例29：患有实体肿瘤的受试者中的1/2a期试验
在患有晚期实体肿瘤的受试者中实施OX40.21单独或与纳武单抗或伊匹单抗组合施用的1/2a期研究，以展示OX40.21单独或与纳武单抗或伊匹单抗组合施用的效能。
1.目的
研究的主要目的是评估患有晚期恶性肿瘤的受试者中OX40.21单独或与纳武单抗或伊匹单抗组合施用的安全性、耐受性、剂量限制性毒性(DLT)及最大耐受剂量(MTD)/建议2期剂量(RP2D)。
次要目的包括研究患有晚期恶性肿瘤的受试者中OX40.21单独或与纳武单抗或伊匹单抗组合施用的初步抗肿瘤活性；表征OX40.21单独或与纳武单抗或伊匹单抗组合施用的PK；及表征OX40.21单独或与纳武单抗或伊匹单抗组合施用的免疫原性及与OX40.21一起施用的纳武单抗或伊匹单抗的免疫原性。其他探索性目的包括探索在治疗之前及在OX40.21单独或与纳武单抗或伊匹单抗组合施用之后肿瘤生检样品及外周血中抗肿瘤活性与选择生物标记量度之间的潜在相关性；评估OX40.21单一疗法及组合疗法对QTc间隔的潜在效应；表征接受纳武单抗与OX40.21的组合的受试者中的纳武单抗PK；表征接受伊匹单抗与OX40.21的组合的受试者中的伊匹单抗PK；评估经OX40.21单独或与纳武单抗或伊匹单抗组合治疗的受试者的整体存活(OS)；及探索经OX40.21单独或与纳武单抗或伊匹单抗组合治疗的受试者中剂量/暴露与抗肿瘤活性、药效学(PD)效应(外周血及肿瘤生检样品中的选择生物标记)及关键安全性量度之间的潜在关系。
2.研究设计及持续时间
此系患有晚期实体肿瘤的受试者中OX40.21的1/2a期开放标记研究，其整合初始OX40.21单一疗法与随后纳武单抗或伊匹单抗组合疗法。
研究部分(剂量递增及剂量及剂量扩展)以基于研究突现的安全性、PK及PD数据的分期方法进行。研究的第一部分始于OX40.21单一疗法剂量递增队列。前3个单一疗法剂量队列的临床数据用作起始OX40.21与纳武单抗的组合的剂量递增的基础。除OX40.21与纳武单抗的组合的第一队列的临床数据外，前3个单一疗法剂量队列的临床数据亦用作起始OX40.21与伊匹单抗的组合的剂量递增的基础。在确立剂量递增部分中OX40.21的可耐受及药理学活性RP2D后，特定肿瘤队列中的起始剂量扩展。
3.剂量递增
部分1A的研究设计的示意图示于图42中。
研究的剂量递增期评估单独或与纳武单抗或伊匹单抗组合的OX40.21在患有晚期实体肿瘤的受试者中的安全性及耐受性。
OX40.21的初始剂量值为20mg。后续剂量的剂量递增决定基于使用BLRM模型(对于OX40.21单一疗法)或BLRM(-Copula)模型(对于OX40.21与纳武单抗或伊匹单抗的组合)的DLT。对于单一疗法及组合疗法剂量递增部分二者，DLT时段为28天。DLT比率基于在DLT时段内出现且不可鉴定替代性原因的AE的发病率、严重水平及持续时间来测定。下一单一疗法队列的剂量选择/剂量值虑及BLRM(-Copula)建议以及来自所有经治疗受试者的所有可用PK、PD及临床及实验室安全性数据。使用自部分1A获得的数据(包括临床及实验室安全性评估、PK/PD数据)及在Bayesian阶层式建模框架内通过纳入OX40.21(部分1A)及纳武单抗(CA209-003)二者的单一试剂毒性性质对建议进行建模测定部分2A的OX40.21的开始剂量选择。使用自部分1A及2A获得的数据(包括临床及实验室安全性评估、PK/PD数据)及在Bayesian建模框架内通过纳入OX40.21(部分1A)及伊匹单抗(CA184-022)二者的单一试剂毒性性质对建议进行建模测定部分3A的OX40.21的开始剂量选择。实际剂量可根据BLRM(-Copula)修饰，但不超过先前所测试剂量的两倍。
在所有剂量队列的剂量递增期间，在用研究药物治疗该队列中的其他受试者之前，观察初始受试者(标记受试者)5天。
约30个受试者入选每一剂量递增部分。每一剂量递增队列中受试者的数目根据BLRM(-Copula)建议变化。最初，以开始剂量值的OX40.21或OX40.21与纳武单抗或伊匹单抗的组合治疗约3个受试者。在剂量递增期期间根据BLRM(-Copula)以推荐剂量治疗约3个可评估受试者的其他队列。以MTD治疗至少6个DLT可评估受试者。
部分1A：入选在部分1A、OX40.21单一疗法剂量递增中开始。部分1A的OX40.21的初始剂量为20mg，预计后续剂量为40mg、80mg、160mg及320mg。实际剂量可根据BLRM修饰，但不超过先前所测试剂量的两倍。
部分2A：部分2A为OX40.21与纳武单抗的组合臂，其在发现可耐受单一疗法剂量递增中的至少3个剂量值或在单一疗法剂量递增(部分1A)中测定MTD后起始。部分2A中的OX40.21的开始剂量低于展示可在部分1A中耐受的剂量的至少1个剂量值，以确保组合的进一步安全性。部分2A中的OX40.21的剂量绝不超过部分1A中的最高耐受剂量。纳武单抗以240mg的不变剂量施用。每一治疗周期长为2周且在每一周期的第1天开始每2周施用研究药物达至多12个周期。
部分3A：部分3A为OX40.21与伊匹单抗的组合臂，其仅在发现可耐受单一疗法剂量递增中的至少3个剂量值或在单一疗法剂量递增(部分1A)中测定MTD且发现OX40.21与纳武单抗剂量递增部分中可耐受至少1个剂量队列后起始。部分3A中的OX40.21的开始剂量低于展示可在部分1A中耐受的剂量的至少1个剂量值。部分3A中的OX40.21的剂量绝不超过部分1A中的最高耐受剂量，以进一步确保经治疗受试者中组合剂量的安全性。伊匹单抗以1mg/kg的剂量施用。每一治疗周期长3周。OX40.21在第1周期第1天开始每3周施用至多且包括8个周期，且伊匹单抗在第1天开始每3周施用达4个周期。仅OX40.21系在后4个周期中施用。
剂量扩展：
在基于来自剂量递增(部分1A、2A及3A)的可用临床安全性(DLT、在DLT时段后出现的显著AE)、PK、PD及建模数据的总数的评估来测定MTD/RP2D时，起始剂量扩展队列中的治疗。在所有剂量扩展队列中治疗约110个受试者。
部分1B为在部分1A中测定的MTD/RP2D下的患有子宫颈癌的受试者中的OX40.21单一疗法剂量扩展队列。OX40.21的投用在每一周期的第1天开始且每2周施用达至多12个周期。在此扩展队列中治疗约12个受试者。
部分2B为在部分2A中测定的MTD/RP2D下的患有CRC的受试者中的组合疗法(OX40.21与纳武单抗)剂量扩展部分。纳武单抗以240mg的不变剂量施用。每一治疗周期系2周长且在每一周期的第1天开始每2周施用研究药物达至多12个周期。在此扩展队列中治疗约35个受试者。
部分2C为在部分2A中测定的MTD/RP2D下的患有BC的受试者中的组合疗法(OX40.21与纳武单抗)剂量扩展部分。每一治疗周期系2周长且在每一周期的第1天开始每2周施用研究药物达至多12个周期。在此扩展队列中治疗约27个受试者。
部分3B为在部分3A中测定的MTD/RP2D下的患有OC的受试者中的组合疗法(OX40.21与伊匹单抗)剂量扩展部分。每一治疗周期系3周长。在初始4个周期中施用伊匹单抗与OX40.21的组合。随后受试者继续OX40.21单一疗法至多额外4个周期，总共至多24周(8个周期)治疗。在此扩展队列中治疗约35个患有OC总共受试者。
研究时段之概述：
在研究中受试者完成至多5个时段：筛选(至多28天)、治疗(至多24周)、安全性随访(最少100天)、反应随访及存活长期随访(自第一剂量至多约2年)，如下文所述。研究拜访示意图提供于图43中。
筛选时段：
筛选时段持续至多28天。筛选时段以确立受试者的初始合格性及签署知情同意书开始。使用交互反应技术(IRT)入选受试者。
治疗时段：
治疗时段由至多24周施用组成。在每一治疗周期后，基于风险/益处及肿瘤评估决定用至多24周治疗的下一周期的研究疗法治疗受试者。对于每2周(q2w)施用方案每8周实施肿瘤评估且对于每3周(q3w)施用方案每9周实施肿瘤评估。在初始评估后至少4周确认对部分反应(PR)及完全反应(CR)的评估。使用实体肿瘤中的反应评估准则(RECIST)v1.1评估肿瘤进展或反应终点。
在给定周期结束时具有稳定疾病(SD)、PR或CR的反应的受试者继续下一治疗周期。通常使受试者继续研究疗法直至首先出现以下中的一者：1)完成最大数目的周期；2)进展性疾病；3)临床劣化，表明不可自治疗获得进一步益处；4)对疗法不耐受性；或5)满足中断研究疗法的准则。
安全性随访：
在完成研究疗法后，受试者进入安全性随访期。在治疗结束(EOT)拜访时，在疗法的最后剂量后，评估受试者的任何新不良事件(AE)达至少100天。随访拜访发生在最后剂量后第30、60及100天或中断日期。受试者(撤回同意研究参与的那些除外)完成3次临床安全性随访拜访，而与其是否开始新抗癌症疗法无关。
存活随访：
在完成安全性随访期后，受试者进入存活随访期。约每3个月(12周)随访受试者，直至死亡、失访、撤回同意书或结束研究，以先达到者为准。此期的持续时间系在研究药物的第一剂量后至多2年。
反应随访：
在完成安全性随访期后，在EOT拜访时所有具有进行性SD、PR或CR的受试者皆进入反应随访期，其与存活随访期同时发生。在反应随访期期间或直至疾病进展或撤回研究同意书，这些受试者每3个月(12周)继续进行放射学及临床肿瘤评估。在受试者完成研究的存活期后，继续收集具有进行性临床益处的受试者的放射学肿瘤评估。不评估在研究疗法的初始过程后具有疾病进展的受试者的超出EOT拜访的反应，且若需要，使其接受其他肿瘤引导的疗法。
研究的持续时间：
任何个别受试者的研究时间的总持续时间系约2年。在最后受试者完成其最后研究拜访时(其系在研究开始后约4年)，研究结束。
受试者的数目：
入选约225个受试者，且研究中治疗约200个受试者。
研究群体：
受试者至少18岁且具有恶性病的组织学或细胞学确认，根据RECISTv1.1，该恶性病系具有可测量疾病的晚期(转移、复发、难治及/或不可切除)的。
剂量递增及停止规则
在部分1A、2A及3A中，在DLT资讯可用于受试者的每一队列后，针对剂量递增建议利用BLRM及BLRM(-Copula)模型。下一队列的OX40.21剂量选择/剂量值虑及BLRM(-Copula)建议以及临床建议及来自所有经治疗受试者的所有可用PK、PD及临床及实验室安全性数据。
剂量限制性毒性
为引导剂量递增，基于未鉴定明确替代性原因的AE的发病率、强度及持续时间定义DLT。DLT时段系研究药物起始的28天。对于受试者管控，满足DLT准则的AE(与其所发生的周期无关)导致研究药物中断。在DLT评估间隔期间出于DLT除外的原因撤出研究的受试者可经新受试者以相同剂量值置换。DLT评估时段期间DLT的发生率用于剂量递增决定中且用于定义MTD。若在DLT时段后出现的AE经测定无明确替代性原因且与疾病进展无关，则出于定义MTD的目的，考虑这些AE。经历DLT的受试者未经研究药物再治疗且进入研究的安全性随访期。根据国家癌症研究所(National Cancer Institute)(NCI)常见不良事件评估准则(Terminology Criteria for Adverse Events)(CTCAE)v4.03对AE进行分级。
非血液学DLT：
A.肝DLT
·AST、ALT或总胆红素升高任何≥3级
·AST、ALT或总胆红素，
·具有症状性肝炎症(例如，右上象限压痛、黄疸、瘙痒)的2级AST或ALT
·AST或ALT>3×ULN及同时总胆红素>2×ULN，而无胆汁淤积(升高血清碱性磷酸酶[ALP])的初始发现(例如，与潜在药物诱导的肝损伤或pDILI的Hy定律或或FDA定义同一的发现)
B.非肝DLT
·2或更大级眼色素层炎、上巩膜炎或虹膜炎
·任何其他2级眼疼痛或视力模糊，其对局部疗法无反应且在2周内不改善至1级严重性或需要全身治疗
·3或更大级肺炎、支气管痉挛、神经病学毒性、过敏性反应或输注反应
·考虑任何3或更大级非皮肤、非肝毒性的DLT，具有以下具体例外：
·3级或4级电解质异常，其不因相关临床不利经历而变复杂，持续小于72小时，且自发消退或对习用医学干预有反应
·3级恶心、呕吐或腹泻，其持续小于72小时，且自发消退或对习用医学干预有反应
·与胰脏炎的临床或放射照相证据无关的淀粉酶或脂肪酶的3或4级升高
·与血液动力学受损(例如，低血压、受损末端器官灌注的临床或实验室)无关的分离的3级发热
·3级内分泌病，其通过激素补充得到良好控制
·3级肿瘤加剧(定义为定位至已知或怀疑肿瘤的位点的疼痛、刺激或疹)
·3级疲劳，持续小于7天
·3级输注反应，其在小于6小时内恢复至1级
皮肤DLT
·4级疹
·若在1至2周输注延迟后无改善(即，消退至≤1级)，则3级疹在2级皮肤毒性存在下，尚未经历3级皮肤AE的受试者可重新开始治疗。
血液学DLT
·在持续时间内4级嗜中性粒细胞减少症≥5天
·具有临床显著出血或血小板输血的任何需求的4级血小板减少症或3级血小板减少症
·不由潜在疾病解释的4级贫血
·4级发热性嗜中性粒细胞减少症
·持续>48小时的3级发热性嗜中性粒细胞减少症
·≥3级溶血(即，需要输血或医学干预，例如类固醇)
超出24周利用额外周期的治疗
将受试者治疗24周，除非更早满足研究药物中断的准则。在风险/益处评估有利于继续施用研究疗法时，完成进行性疾病控制(CR、PR或SD)的约24周治疗的受试者对于超出初始24周的单一疗法(部分1)及组合疗法(部分2及3)中的额外24周研究疗法合格。在完成额外24周研究疗法后，受试者进入安全性随访期。
进展后的治疗
在确定风险/益处评估有利于继续施用研究疗法后，在具有初始RECISTv1.1的选择受试者中进行进展后的治疗-定义进展性疾病(例如，受试者继续经历临床益处、耐受治疗并满足其他准则)。
再治疗
若在反应随访期期间出现确认疾病进展，则进行再治疗。完成约24周(若适当，或额外治疗周期)疗法且以进行性疾病控制(CR、PR或SD)而无任何显著毒性进入反应随访期的受试者对于再治疗合格。在评估及确定风险/益处比是否支持其他研究疗法的施用后，这些受试者在个案基础(case-by-case basis)上对于再治疗合格，且受试者继续满足研究疗法治疗的合格性准则。利用最初分配的单一疗法或组合疗法方案(例如，与前24周期间所施用相同的剂量及剂量排程表)治疗满足再治疗的准则的受试者，除非随后发现该剂量及排程表超过MTD，在该情形下，以认为可耐受/安全的下一较低剂量治疗受试者。
纳入准则
1)签署书面知情同意书
a)在实施不被视为SOC的部分的任何研究相关程序之前，受试者必须签署知情同意书。
b)同意肿瘤生检样品(剂量扩展队列及添加至先前完成剂量递增队列中的任一者及对于剂量递增队列可选的其他受试者需要强制性治疗前及治疗时生检).
2)靶群体
受试者必须至少18岁且具有恶性病的组织学或细胞学确认，根据RECIST v1.1，该恶性病系具有可测量疾病的晚期(转移、复发、难治及/或不可切除)的。
A.剂量递增：
在晚期或转移设定中，受试者必须已接受至少1个标准治疗方案，且随后进展，或对于该至少1个标准治疗方案难治或不耐受(若该疗法存在)。容许对于任何标准疗法不合格的受试者入选，条件是医学记录中记载其不合格性。允许以下肿瘤组织学，只是患有原发性中枢神经系统(CNS)肿瘤或具有CNS转移作为唯一活跃疾病位点的受试者除外。
(i)黑色素瘤：若已知，必须记载BRAF突变状态。
(ii)NSCLC：若已知，必须记载EGFR、ALK、KRAS及ROS1突变状态
(iii)头颈癌限于鳞状细胞癌。若已知，必须记载HPV状态
(iv)泌尿生殖道的移行细胞癌
(v)肾细胞癌
(vi)胰脏腺癌
(vii)CRC：若已知，必须记载MSI、KRAS及BRAF状态。
(viii)子宫颈癌：若已知，必须记载HPV状态。
(ix)必须记载三阴性乳腺癌HER2、ER及PR状态
(x)子宫内膜的腺癌
(xi)卵巢癌
(xii)前列腺腺癌
(xiii)肝细胞癌-仅Child Pugh A
(xiv)小细胞肺癌
(xv)胃及胃食道结合部癌：若已知，必须记载HER2状态。
B.剂量扩展：部分1B、2B、2C及3B
将允许以下肿瘤类型：
(a)子宫颈癌-部分1B
(i)不可切除、伴随记载疾病进展转移或复发的组织学确认的子宫颈癌
(ii)若已知，记载肿瘤HPV状态。若未知，个别必须同意测试其提交存档肿瘤组织样品(块或未染色载玻片)。
(iii)先前疗法要求：
1.对于转移及/或不可切除疾病，必须已接受至少1个标准全身性疗法(例如，太平洋紫杉醇/顺铂、太平洋紫杉醇/顺铂/贝伐珠单抗)且随后进展或对该至少1个标准全身性疗法不耐受或难治。在完成辐射疗法后给予且与主要辐射及辅助化学疗法一起施用的同时化学疗法不当作全身性化学疗法方案。
(b)结肠直肠癌-部分2B
(i)伴随记载疾病进展转移或复发的组织学确认的CRC
(ii)若已知，记载MSI、MMR、KRAS及BRAF状态。若未知，个别必须同意测试其提交存档肿瘤组织样品(块或未染色载玻片)。
(iii)先前疗法要求：
对于转移及/或不可切除疾病(或在辅助疗法的6个月内进展)，受试者必须已接受至少1个标准全身性疗法且随后进展或对该至少1个标准全身性疗法不耐受或难治。
(c)膀胱癌-部分2C
(i)具有进展或难治性疾病的肾骨盆、输尿管、膀胱或尿道的组织学或细胞学确认的泌尿道上皮癌(包括具有其他亚型的元素的泌尿道上皮癌的混合组织学)
(ii)先前疗法要求：
对于转移(IV期)或局部晚期不可切除疾病的治疗，受试者必须已接受至少1个标准全身性疗法(例如，基于铂的化学疗法)方案且随后进展或对于该方案不耐受或难治。
(d)卵巢-部分3B
(i)具有记载疾病进展的组织学或细胞学确认的卵巢癌(包括上皮OC、原发性腹膜或输卵管癌)
(ii)若已知，记载种系BRCA突变状态。若未知，个别必须同意测试其提交存档肿瘤组织样品(块或未染色载玻片)。
(iii)先前疗法要求：
对于转移及/或不可切除疾病，受试者必须已接受至少1个标准全身性疗法(例如，基于铂的化学疗法)且随后进展或对该至少1个标准全身性疗法不耐受或难治。
3)美国东岸癌症临床研究合作组织(Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG)体能状态≤1。
4)存在至少1个病灶与可测量疾病，如通过RECIST v 1.1所定义用于反应评估。允许作为可测量疾病的唯一位点的先前经辐照领域中具有病灶的受试者入选，条件是病灶已展示明确进展且可精确测量。
5)对于需要新鲜肿瘤生检的受试者，除反应评估所需的最少一个RECISTv 1.1可测量病灶外，受试者必须具有至少一个病灶可用于治疗前及治疗时生检。此病灶需要不同于所评估指数病灶用于放射学反应。
6)在自最终治疗大于4周的任何时间的洗涤时段后，允许先前暴露于利用任何尤其靶向检查点路径抑制的试剂(例如抗PD-1、抗PD-L1、抗PD-L2、抗LAG-3及抗CTLA-4抗体)的疗法的受试者
注意：(i)经历先前1至2级检查点疗法相关的免疫介导的AE的受试者必须确认在研究进入时自这些时间恢复，经补充物治疗之内分泌病除外，如通过所有相关临床症状、在体检时的异常发现及/或相关实验室异常消退所记载。若适用，截止在开始研究疗法治疗前最少14天，这些受试者必须亦完成类固醇渐减用于治疗这些AE。(ii)在与医疗监测者讨论后，将在个案基础上考虑具有先前≥3级检查点疗法相关免疫AE的受试者的合格性(例如，允许无胰脏炎的临床或放射学特征的症状性分离3级脂肪酶升高入选)。
7)在自最终治疗大于4周的任何时间的洗涤时段后，允许利用任何尤其靶向T细胞共刺激路径的试剂(抗OX40抗体、抗CD 137、抗GITR抗体及抗CD27除外)的先前疗法的受试者。
8)必须在研究药物的第一剂量之前的至少2周完成先前姑息性放射疗法。强烈鼓励在基线处具有症状性肿瘤病灶且在研究药物的第一剂量的4周内可能需要姑息性放射疗法的受试者在入选之前接受姑息性放射疗法。
9)入选剂量递增及扩展队列的受试者必须同意获取现存福马林固定、石蜡包埋(FFPE)的肿瘤组织，块或最少15个未染色载玻片(优选25个载玻片)，用于实施相关研究。若存档样品不可用，则受试者必须同意治疗前肿瘤生检。不能提供存档肿瘤样品且不同意治疗前肿瘤生检或不具有可及病灶的受试者不合格。(然而，治疗前生检所产生组织的量或品质不足的受试者不会仅基于此而不合格)。对于添加至先前完成的剂量递增队列的任何其他受试者，需要强制性治疗前及治疗时生检。
10)需要入选剂量扩展或添加至任何先前完成的剂量递增队列的受试者在可接受的临床风险下经历强制性治疗前及治疗时生检。(a)实体肿瘤组织样品必须为粗针可切除或切开的生检。认为细针生检(利用细胞离心涂片器引流胸膜渗出液)或冲压生检对于生物标记综述不足。不具有软组织组分或脱钙骨肿瘤样品的骨病灶的生检亦不可接受，(b)生检病灶应不同于所评估指数病灶用于放射学反应
11)对于受试者不足的器官功能，如通过以下所定义：
(a)嗜中性粒细胞≥1500/μL(在首次研究药物施用的4周内稳定，关闭任何生长因子)
(b)血小板≥80×103/μL(在首次研究药物施用的2周内不允许输血以达成此水平)
(c)血红素≥8g/dL(在首次研究药物施用的2周内不允许输血以达成此水平)
(d)ALT及AST≤3×正常值上限(ULN)
(e)总胆红素≤1.5×ULN(具有吉伯特氏综合征(Gilbert's Syndrome)且必须具有正常直接胆红素的受试者除外)
(f)根据研究者评估，正常甲状腺功能或在激素补充时稳定
(g)白蛋白≥2mg/dl
(h)血清肌酸酐≤1.5×ULN或肌酸酐清除率(CrCl)≥40ml/min(使用以下Cockcroft-Gault式测量)：
雌性CrC1＝(140-年龄(岁))×重量(kg)×0.85
72×血清肌酸酐(mg/dL)
雄性CrCl＝(140-年龄(岁))×重量(kg)×1.00
72×血清肌酸酐(mg/dL)
12)能够遵守治疗、PK及PD样品收集及需要研究随访
年龄及生殖状态
a)男性及女性，在知情同意书时年龄≥18岁。
b)在开始研究药物之前的24小时内，育龄女性(WOCBP)必须具有阴性血清或尿液怀孕测试(最小灵敏性25IU/L或等效单位的人类绒促性素[hCG])。
c)女性必须未哺乳。
d)WOCBP必须同意遵循避孕方法的说明达研究药物OX40.21治疗的持续时间加上研究药物的5个半衰期加上30天。此持续时间对于部分1及3受试者应为12周(50天加上30天)或对于部分2受试者为23周(130天加上30天[排卵周期的持续时间])，完成治疗后总共高达160天。
e)与WOCBP有性行为的男性必须同意遵循避孕方法的说明达研究药物OX40.21治疗的持续时间加上研究药物的5个半衰期加上90天。持续时间应为20周(对于部分1及3受试者，50天加上90天)或31周(对于部分2受试者，130天完成)。另外，雄性受试者必须愿意在此时间期间避免捐精。
f)无精子雄性免除避孕需求。连续无异性性交的WOCBP亦免除避孕需求，但仍经历怀孕测试。
排除准则
1)靶疾病例外
a)排除具有已知或怀疑CNS转移或未经治疗CNS转移、或CNS作为疾病的唯一位点的受试者。然而，容许脑转移得到控制的受试者入选。受控脑转移定义为在辐射及/或手术治疗后至少4周(或若临床上指示无干预，则观察4周)无放射照相进展，且脱离类固醇至少2周，且无新的或进行性神经病学体征及症状。
b)患有癌性脑膜炎的受试者
c)对于卵巢癌：
i)排除在前6个月内具有肠梗塞史或利用Tenckhoff导管的卵巢癌受试者。
ii)允许高达4个先前抗癌治疗(即，化学疗法、放射疗法、激素或免疫疗法)。在药物假期后重新开始相同方案可视为一个方案；然而，若之间使用任何其他方案，则其应当作两个方案。
2)病历及同时疾病
a)排除在研究进入之前小于2年内经诊断患有先前恶性病(不同于用于入选此研究中者)的受试者(非黑色素瘤皮肤癌及原位癌(例如膀胱、结肠、子宫颈/发育不良、黑色素瘤或乳房)除外)。另外，在超过2年以前诊断有其他第二恶性病且以治愈性目的接受疗法而在间隔期间无疾病的证据且被视为出现低复发风险的受试者系合格的。
b)需要同时干预的其他活动性恶性病
c)先前器官同种异体移植
d)先前治疗：
i)允许先前抗癌治疗(即化学疗法、放射疗法、激素或免疫疗法)
ii)与先前抗癌症疗法及/或手术相关的毒性(脱髪除非)必须已消退、恢复至基线或1级或认为不可逆
iii)对于细胞毒性剂，先前抗癌症疗法的最后剂量与起始研究疗法之间必须已过去至少4周
iv)对于非细胞毒性剂，自先前抗癌症疗法的最后剂量与起始研究疗法必须已过去至少4周或5个半衰期(以较短者为准)。
e)利用抗OX40抗体的先前疗法
f)排除具有活动性、已知或怀疑自体免疫疾病的受试者。允许患有白斑病、1型糖尿病、由于自体免疫病况所致且仅需要激素补充的残余甲状腺功能减退的受试者、具有葛雷夫斯氏病(Grave's disease)(在研究药物的第一剂量之前，患有怀疑自体免疫甲状腺病症的受试者必须对甲状腺球蛋白及甲状腺过氧化酶抗体及甲状腺刺激免疫球蛋白呈阴性)、无需全身治疗的牛皮癣、或预计在不存在外部触发下不复发的病况的历史的甲状腺机能正常的受试者入选。气喘及/或轻度过敏性鼻炎(季节性过敏)得到充分控制的受试者系合格的。
g)具有与先前免疫疗法(例如，抗CTLA-4或抗PD-1/PD-L1治疗或尤其靶向T细胞共刺激或免疫检查点路径的任何其他抗体或药物)相关的威胁生命的毒性的历史的受试者，不可能随标准对抗措施(例如，肾上腺危象后补充激素)复发者除外。
h)患有症状性或可干扰怀疑药物相关肺毒性的检测或管控之间质肺病的受试者
i)需要大于10mg/天的普赖松或等效物的剂量的复现类固醇加强或长期类固醇的慢性阻塞性肺病
j)患有在研究药物施用的14天内需要利用皮质类固醇(>10mg每日普赖松等效物)或其他免疫抑制医药全身治疗的病况的受试者，在不存在活动性自体免疫疾病下肾上腺补充类固醇剂量>10mg每日普赖松等效物除外。注意：允许的起始研究药物之前至多7天的短过程的类固醇治疗(<5天)。
k)不受控或显著心血管疾病，包括(但不限于)以下中的任一者：
i)在过去6个月内心肌梗塞或中风/暂时性脑缺血发作
ii)在过去3个月内不受控心绞痛
iii)临床上显著的心律不整(例如室性心动过速、心室震颤或尖端扭转型室性心动过速)的任何历史
iv)其他临床上显著的心脏病(例如，心肌病、纽约心脏学会(New York HeartAssociation)功能分类III-IV的郁血性心脏衰竭、心包炎、显著心包渗出液)的历史
v)每日补充氧疗法的心血管疾病相关的需求
vi)使用Fridericia式(QTcF)延长>480msec针对心率校正QT间隔
1)任何慢性肝炎的历史，如通过以下所证明：
i)对于B型肝炎表明抗原阳性测试
ii)对于定性C型肝炎病毒负荷阳性测定(通过PCR)
注意：通过PCR具有阳性C型肝炎抗体及阴性定量C型肝炎的受试者系合格的。消退A型肝炎病毒感染的历史并非排除准则。允许根据机构指南以排除感染的其他测试或取代测试。
m)需要在起始研究药物疗法之前≤7天全身抗细菌、抗病毒或抗真菌剂疗法的活动性感染的证据(不适于经推测与研究进入所需的潜在肿瘤类型相关的病毒感染)
n)对HIV或已知获得性免疫缺失综合征测试呈阳性的已知历史
o)活动性或潜在结核病感染(包括最近转化成阳性的PPD)的证据或历史；具有感染性浸润的证据的胸部x射线；最近无法解释的发热/寒冷型式的变化。
p)在研究药物施用的4周内任何大手术。在研究药物的第一剂量之前至少14天，受试者必须已自大手术或严重创伤性损伤的效应恢复。
q)在研究药物之前4周内使用含有活病毒的非肿瘤疫苗用于预防感染性疾病。允许使用不活化季节性流行性感冒疫苗，例如
Figure BDA0001559815020002031
r)在研究药物的第一剂量之前的2周内使用pRBC或血小板输血
s)可使得研究药物的施用对受试者有危险或可不利地影响受试者遵守或耐受研究的能力的已知或潜在医学或精神病学病况及/或社会原因。
3)过敏及不利药物反应
a)对纳武单抗或伊匹单抗(分别仅部分2及3)过敏的历史
b)对先前抗癌免疫调节疗法(例如，检查点抑制剂、T细胞共刺激抗体)任何显著药物过敏(例如过敏反应或肝毒性)的历史
研究评估：
贯穿施用间隔在所选时间实施体检、生命征象测量、12导线心电图(ECG)及临床实验室评估。贯穿研究密切监测受试者的AE。
·安全性评估：在研究期间并在最后治疗后持续100天评估AE。根据NCI CTCAEv4.03评估AE。随访受试者直至所有治疗相关的AE恢复至基线或认为不可逆。
·效能评估：在基线及对于q2w施用方案每8周(±1周)及对于q3w施用方案每9周(±1周)、随后在治疗及反应随访期期间直至中断治疗或退出研究每12周实施利用CT及/或MRI(若适当)的疾病评估。若存在关于肿瘤进展的问题，则实施其他时间点时的肿瘤评估。对于患有恶性肿瘤的受试者，根据RECIST v1.1评估肿瘤反应。
·药物动力学及免疫原性评估：对于接受单独或与纳武单抗或伊匹单抗组合的OX40.21的受试者，收集用于PK及免疫原性评估的样品。通过非分室测定(NCA)方法表征OX40.21的PK。通过验证免疫测定针对抗OX40.21抗体及/或抗纳武单抗抗体及/或抗伊匹单抗抗体测定免疫原性样品。
·探索性生物标记评估：为探索与剂量及PK相关的对OX40.21的临床反应的潜在预测标记物，自所有受试者获得3种类型的样品用于生物标记测试：(i)全血、(ii)血清/血浆及(iii)肿瘤组织。
统计考虑
样本大小测试
剂量递增：
作为1期剂量递增试验，每一剂量递增队列的样本大小取决于观察毒性及后验推断。在每一剂量递增部分(OX40.21单一疗法[部分1A]、OX40.21与纳武单抗组合[部分2A]及OX40.21与伊匹单抗组合[部分3A])期间治疗约30个受试者，在部分1A、2A及3A中组合总共约90个受试者。最初，以OX40.21或OX40.21与纳武单抗或伊匹单抗的组合的开始剂量值治疗约3个受试者。在剂量递增期期间根据BLRM(-Copula)建议以推荐剂量值治疗约3个可评估受试者的其他队列。以MTD治疗至少6个DLT可评估受试者。
剂量扩展：
在一般意义上，扩展期长度估计系基于靶反应比率(靶整体反应比率)及鉴定高于护理标准的该临床反应的信号的能力(历史整体反应比率)。
在部分1B剂量扩展队列中治疗约12个受试者。在部分2B剂量扩展队列中治疗约35个受试者。在部分2C剂量扩展队列中治疗约27个受试者。在部分3B剂量扩展队列中治疗约35个受试者。
终点
主要终点
安全性的评估系基于AE、严重AE、导致中断的AE及死亡的发病率。另外，检查临床实验室测试异常。
次要终点
效能：通过基于RECIST v1.1的24周时的ORR、反应的持续时间及无进展存活率(PFSR)测量单独OX40.21及OX40.21与纳武单抗或伊匹单抗组合的抗肿瘤活性。上述系基于以下时出现的肿瘤测量来测定：基线、在治疗时段期间对于q2w施用方案每8周(±1周)及对于q3w施用方案每9周(±1周)及在存活随访期期间每3个月(12周)。
·根据RECIST 1.1准则评估最优选整体反应(BOR)。
·ORR系BOR系CR或PR的所有经治疗受试者的比例。
·针对具有CR或PR的BOR的所有经治疗受试者计算的反应的持续时间系第一反应的日期与疾病进展或死亡的日期(以先达到者为准)之间的时间。
·24周时的PFSR定义为在24周时保持无进展且存活的经治疗受试者的比例。通过Kaplan-Meier估计(其虑及被检查过的数据)计算该比例。
药物动力学
对于单一疗法或与纳武单抗或伊匹单抗组合，依赖于排程表在2个周期中评估选择参数(例如Cmax、Tmax、AUC(0-t)及AUC(TAU))。在收集广泛PK时，在第二周期中评估参数(例如Ctau、CLT、Css-avg、累积指数(AI)及有效消除半衰期(T-HALFeff)。
免疫原性
通过对OX40.21或纳武单抗或伊匹单抗阳性ADA的频率评估免疫原性的次要目的。
探索性终点
通过特定时间点(例如，2年)时的OS比率评估与OS相关的探索性目的。OS比率系在该时间点时存活受试者的比例。受试者的OS定义为自研究医药的第一剂量的日期至因任何原因死亡的日期的时间。通过自外周血(例如，可溶性因子，包括但不限于细胞因子及趋化因子)或肿瘤组织(例如，肿瘤浸润淋巴细胞)中的基线或基线水准生物标记测量的变化评估与生物标记相关的探索性目的。
对于进行多次ECG测量的受试者，任选地评估以下参数：自基线的ECG间隔QT、QTc、QRS及P-R间隔变化。
测定
安全性测定：依据系统器官分类、优先项及治疗列举所记录的所有AE并将其制表。通过治疗列表并概述生命征象及临床实验室测试结果。亦注意任何显著体检发现及临床实验室结果。评估ECG读数，且注意异常(若存在)。
效能测定：由每一臂及剂量值中的受试者及研究天提供肿瘤测量的清单。基于RECIST 1.1列举个别受试者的BOR。为阐述单独或与纳武单抗或伊匹单抗组合的OX40.21的抗肿瘤活性，计算ORR。通过治疗及/或剂量值及肿瘤类型提供通过Clopper-Pearson方法的ORR及相应2侧95％CI。通过治疗及/或剂量值及肿瘤类型提供反应之中值持续时间及相应2侧95％CI。使用Kaplan-Meier方法测定反应的持续时间。另外，通过Kaplan-Meier方法通过治疗、肿瘤类型及剂量值估计PFSR(即受试者保持无进展或存活至24周的机率)。相应95％CI系基于Greenwood式衍生。使用Kaplan-Meier方法绘示OS的曲线。报告中值OS及相应2侧95％CI。
药物动力学测定：针对每一测定物列举所有个别PK参数，包括任何排除及自概述排除的原因。通过治疗针对每一PK参数将概述统计学制表。针对Cmax、AUC(0-t)、AUC(TAU)、Ctau、CLT、Cssavg及AI提供几何平均值及变异系数。针对Tmax提供中值及范围。针对所有其他PK参数(例如，T-HALFeff)提供平均值及标准偏差。
在剂量递增单一疗法中评估OX40.21剂量依赖性。为阐述对OX40.21的剂量的依赖性，针对测量的每一天提供Cmax、AUC(0-t)及AUC(TAU)对剂量的散布图。基于功率模型及功率系数周围的CI探索性评估剂量比例。使用概述统计学通过治疗及研究天将纳武单抗及伊匹单抗输注结束及波谷(C波谷)浓度及OX40.21波谷浓度制表。亦可将这些数据与其他数据集汇集在一起用于群体PK测定。
免疫原性测定：通过治疗、剂量及免疫原性状态提供所有可用免疫原性数据。测定具有OX40.21、纳武单抗及伊匹单抗的阳性ADA评估的受试者的频率。
探索性生物标记测定：通过每一臂中的计划研究天及剂量将生物标记的概述统计学及其自基线的相应变化(或变化％)制表。以图表方式表示生物标记量度的时程。若存在随时间有意义的型式的指示，则实施进一步测定(例如，通过线性混合模型)以表征关系。使用诸如但不限于逻辑式回归等方法以探索来自外周血或肿瘤生检的生物标记量度与临床结果之间的可能相关性。
表23：序列的概述
Figure BDA0001559815020002071
Figure BDA0001559815020002081
Figure BDA0001559815020002091
Figure BDA0001559815020002101
Figure BDA0001559815020002111
Figure BDA0001559815020002121
Figure BDA0001559815020002131
Figure BDA0001559815020002141
Figure BDA0001559815020002151
Figure BDA0001559815020002161
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Figure BDA0001559815020002181
Figure BDA0001559815020002191
Figure BDA0001559815020002201
Figure BDA0001559815020002211
Figure BDA0001559815020002221
Figure BDA0001559815020002231
Figure BDA0001559815020002241
Figure BDA0001559815020002251
Figure BDA0001559815020002261
Figure BDA0001559815020002271
Figure BDA0001559815020002281
Figure BDA0001559815020002291
Figure BDA0001559815020002301
Figure BDA0001559815020002311
Figure BDA0001559815020002321
Figure BDA0001559815020002331
Figure BDA0001559815020002341
Figure BDA0001559815020002351
Figure BDA0001559815020002361
Figure BDA0001559815020002371
Figure BDA0001559815020002381
Figure BDA0001559815020002391
Figure BDA0001559815020002401
Figure BDA0001559815020002411
Figure BDA0001559815020002421
Figure BDA0001559815020002431
Figure BDA0001559815020002441
Figure BDA0001559815020002451
Figure BDA0001559815020002461
Figure BDA0001559815020002471
Figure BDA0001559815020002481
Figure BDA0001559815020002491
Figure BDA0001559815020002501
Figure BDA0001559815020002511
Figure BDA0001559815020002521
Figure BDA0001559815020002531
Figure BDA0001559815020002541
Figure BDA0001559815020002551
Figure BDA0001559815020002561
Figure BDA0001559815020002571
Figure BDA0001559815020002581
Figure BDA0001559815020002591
Figure BDA0001559815020002601
Figure BDA0001559815020002611
Figure BDA0001559815020002621
Figure BDA0001559815020002631
Figure BDA0001559815020002641
Figure BDA0001559815020002651
Figure BDA0001559815020002661
Figure BDA0001559815020002671
Figure BDA0001559815020002681
Figure BDA0001559815020002691
Figure BDA0001559815020002701
Figure BDA0001559815020002711
Figure BDA0001559815020002721
Figure BDA0001559815020002731
Figure BDA0001559815020002741
Figure BDA0001559815020002751
Figure BDA0001559815020002761
Figure BDA0001559815020002771
表23提供成熟可变区及重链及轻链的序列及(若指示)具有信号肽的序列。
等效方案：
本领域技术人员仅使用常规实验即可认识或能够确定本文所公开的具体实施方案的许多等效方案。这些等效方案皆意欲涵盖在随附的权利要求中。
序列表
<110> 百时美施贵宝公司
MARK J. SELBY
<120> 抗OX40抗体及其用途
<130> MXI-543PC
<140> 新申请
<141> 与本案同时
<150> US 62/168,377
<151> 2015-05-29
<150> US 62/239,574
<151> 2015-10-09
<150> US 62/264,691
<151> 2015-12-08
<150> US 62/327,140
<151> 2016-04-25
<150> US 62/333,556
<151> 2016-05-09
<160> 318
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 277
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(277)
<223> Human OX40 precursor
<400> 1
Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val
20 25 30
Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro
35 40 45
Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys
50 55 60
Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro
65 70 75 80
Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys
85 90 95
Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly
100 105 110
Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys
115 120 125
Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp
130 135 140
Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn
145 150 155 160
Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro
165 170 175
Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr
180 185 190
Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu
195 200 205
Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val
210 215 220
Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu
225 230 235 240
Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly
245 250 255
Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser
260 265 270
Thr Leu Ala Lys Ile
275
<210> 2
<211> 189
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(189)
<223> Extracellular domain of mature human OX40
<400> 2
Leu His Cys Val Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His
1 5 10 15
Glu Cys Arg Pro Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln
20 25 30
Asn Thr Val Cys Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val
35 40 45
Ser Ser Lys Pro Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly
50 55 60
Ser Glu Arg Lys Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg
65 70 75 80
Cys Arg Ala Gly Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp
85 90 95
Cys Ala Pro Cys Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala
100 105 110
Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln
115 120 125
Pro Ala Ser Asn Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro
130 135 140
Ala Thr Gln Pro Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr
145 150 155 160
Val Gln Pro Thr Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr
165 170 175
Arg Pro Val Glu Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala
180 185
<210> 3
<211> 277
<212> PRT
<213> Macaca fascicularis
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(277)
<223> Cynomolgus OX40
<400> 3
Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Thr Ala Lys Leu His Cys Val
20 25 30
Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys Gln Glu Cys Arg Pro
35 40 45
Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Asn Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys
50 55 60
Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ala Lys Pro
65 70 75 80
Cys Lys Ala Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys
85 90 95
Gln Pro Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly
100 105 110
Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys
115 120 125
Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp
130 135 140
Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn
145 150 155 160
Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Pro Thr Gln Pro
165 170 175
Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Thr Thr Val Gln Pro Thr
180 185 190
Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Arg Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu
195 200 205
Val Pro Arg Gly Pro Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Ala
210 215 220
Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Met Leu Leu Ala Leu Leu Leu Leu
225 230 235 240
Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala Pro Lys Ala Pro Gly Gly
245 250 255
Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser
260 265 270
Ala Leu Ala Lys Ile
275
<210> 4
<211> 183
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(183)
<223> Human OX40-L
<400> 4
Met Glu Arg Val Gln Pro Leu Glu Glu Asn Val Gly Asn Ala Ala Arg
1 5 10 15
Pro Arg Phe Glu Arg Asn Lys Leu Leu Leu Val Ala Ser Val Ile Gln
20 25 30
Gly Leu Gly Leu Leu Leu Cys Phe Thr Tyr Ile Cys Leu His Phe Ser
35 40 45
Thr Leu Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val
50 55 60
Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln
65 70 75 80
Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn
85 90 95
Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu
100 105 110
Val Asn Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln
115 120 125
Leu Lys Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr
130 135 140
Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu
145 150 155 160
Asp Asp Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn
165 170 175
Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu
180
<210> 5
<211> 329
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(329)
<223> human IgG1 constant domain
<400> 5
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 6
<211> 329
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(329)
<223> human IgG1 constant domain (allotypic variant)
<400> 6
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 7
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(107)
<223> human IgG1 kappa light chain
<400> 7
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 8
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: heavy chain constant region alternative C-terminus
<400> 8
Leu Ser Pro Gly Lys
1 5
<210> 9
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: heavy chain constant region alternative C-terminus
<400> 9
Leu Ser Pro Gly
1
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(107)
<223> Human IgG1 kappa light chain constant region (CL)
<400> 10
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
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Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
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Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
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Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
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Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
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Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
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Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
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Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
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Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
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50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
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<220>
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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Leu Ile Ser Tyr Asp Ser Ser Arg Lys His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Leu Thr Tyr Val Arg Glu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
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Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
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420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440
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<211> 215
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 114
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1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
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50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
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195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
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<213> Artificial Sequence
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
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100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
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305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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OX40.22)
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20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
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<213> Artificial Sequence
<220>
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
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305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
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370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
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420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
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<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 119
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1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asp Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ile Tyr Ser Ser Ser Tyr Asn Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
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210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
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<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: OX40.18 light chain
<400> 120
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
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<213> Artificial Sequence
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Ala Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Leu Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Arg Lys His Tyr Ala Asp Ser Val
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65 70 75 80
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
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385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440
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<220>
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<400> 122
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
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Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 123
<211> 446
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: OX40.20 heavy chain
<400> 123
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Asp Thr Ser Gly Gly Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Arg
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Leu Gly Glu Gly Tyr Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 124
<211> 446
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 124
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Asp Thr Asp Ala Gly Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Arg
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Leu Gly Glu Gly Tyr Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
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195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
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290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
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370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
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405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
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<213> Artificial Sequence
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Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 3F4 VH (nucleotide sequence)
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caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggaaa caccttcacc agttatgatg tcaactgggt gcgacaggcc 120
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gcaccgaagt tccagggcag agtcaccatg accaggaaca cctccataag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgttt attactgtgc gagaatatat 300
agcagctcgt acaactggtt cgacccctgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360
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<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 3F4 VL
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gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcctctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic: 14B6 VH
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gaggtgcagc tggagcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60
tcctgtaagg gttctggata cagctttacc agcaactgga tcggctgggt gcgccagatg 120
cccgggaaag gcctggagtg gatggggttc atctatcctg gtgactctga taccaggtac 180
agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240
ctgcagtgga gcagcctcaa ggcctcggac atcgccatgt attactgtgc gagatatggg 300
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 14B6 VL1
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gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggttcca acagagacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttctctctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtggcgact ggcccatcac cttcggccaa 300
gggacacgac tggagattaa a 321
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<211> 324
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 14B6 VL2
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gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120
gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt accctcggat caccttcggc 300
caagggacac gactggagat taaa 324
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<211> 351
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 23H3 VH
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gaggttcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtacatc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag gctctggatt caccttcagt aactatgcta tgtactgggt tcgccaggct 120
ccaggaaaag gtctggagtg ggtatcagcc attggtattg gtggtgacac attctataca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaactc cttgtctctt 240
caaatgaaca gcctgagagc cgaggacatg gctgtgtatt actgtgcaag aatgggaact 300
gggtacttct ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc a 351
<210> 132
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 23H3 VL
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gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcctctcac tttcggccct 300
gggaccaaag tggatatcaa a 321
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<211> 363
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 6E1 VH
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caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
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tca 363
<210> 134
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120
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aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt accctcggac gttcggccaa 300
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<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
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<211> 360
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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gaggttcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggttcatc ctggggggtc cctgagactc 60
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ccaggaaaag gtctggaatg gatatcagct attggtactg gtggtgacac atactatgca 180
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caaataaaca gcctgagagc cgaggacatg gctgtatatt actgtgcaag agacttttac 300
gatattttga ctggtatctt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360
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<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 18E9 VL
<400> 137
gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcataaacca 120
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gaagattttg caacttacta ttgtcaacag gctaatagtt tcccttcgac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa a 321
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<211> 408
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 8B11 VH
<400> 138
atggagtttg tgctgagctg ggttttcctt gttgctatat taaaaggtgt ccagtgtgaa 60
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atgaacagcc tgagagccga ggacatggct gtgtattact gtgcaaggct ggggatgggg 360
tactactttg actactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcctca 408
<210> 139
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 8B11 VL
<400> 139
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120
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aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcctccgac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa a 321
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<211> 351
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 20B3 VH
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gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctacgaca tgcactgggt ccgccaaact 120
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caaatgaaca gcctgagagc cggggacacg gctgtgtatt actgtgcaag aggggggatg 300
gggaactact ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc a 351
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<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 20B3 VL
<400> 141
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
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gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggccgctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
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<211> 345
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 14A2 VH
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gcagactccg tgaagggccg attcagtatc tccagagaca attccaagaa cacactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gagtcttact 300
atggttcggg aggggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctca 345
<210> 143
<211> 324
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 14A2 VL1
<400> 143
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
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gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccatt cactttcggc 300
cctgggacca aagtggatat caaa 324
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<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 14A2 VL2
<400> 144
gacatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
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gggaaagttc ctaagctcct gatctatagt gcatccaatt tgcaatctgg agtcccatct 180
cggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ctatcagcag cctgcagcct 240
gaagatgttg caacttatta cggtcaacgg acttacaatg ccccttacac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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ccaggaaaag gtctggagtg ggtatcagct attgatactg atggtggcac attctatgca 180
gactccgtgc ggggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaactc cttgtatctt 240
caaatgaacg gcctgagagc cgaggacatg gctgtgtatt tctgtgcaag acttggggaa 300
gggtacttct ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc a 351
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 20C1 VL
<400> 146
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: OX40.6 heavy chain
<400> 147
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: OX40.12 heavy chain
<400> 159
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
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ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcactt atatcatata gtggaagcag gaaacactac 180
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ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 420
ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 480
ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 540
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gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1020
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gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140
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tccttcttcc tctatagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1260
ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1320
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 645
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic: OX40.15 light chain
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aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: OX40.16 light chain (shared by OX40.20, OX40.21,
OX40.22)
<400> 168
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<210> 169
<211> 1341
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: OX40.17 heavy chain
<400> 169
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
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ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020
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<210> 170
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: OX40.17 light chain
<400> 170
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120
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aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
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cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: OX40.18 heavy chain
<400> 171
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
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actggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atgaacccta acagtggtaa cacaggctat 180
gcaccgaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cctccataag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgttt attactgtgc gagaatatat 300
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gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 660
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1080
atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200
ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320
cagaagagcc tctccctgtc cccgggttga 1350
<210> 172
<211> 645
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: OX40.18 light chain
<400> 172
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcctctcac tttcggcgga 300
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cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645
<210> 173
<211> 1332
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: OX40.19 heavy chain
<400> 173
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt aactatgctc tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcactt atatcatatg atggaagcag gaaacactac 180
gcagactccg tgaagggccg attcagtatc tccagagaca attccaagaa cacactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gagtcttact 300
ctggttcggg agtggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctcagctag caccaagggc 360
ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 420
ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 480
ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 540
agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 600
aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagagagttg agcccaaatc ttgtgacaaa 660
actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc 720
ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 780
gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 840
gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 900
gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 960
gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1020
ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg aggagatgac caagaaccag 1080
gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140
agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1200
tccttcttcc tctatagcaa gctcaccgtg gacaagagta ggtggcagca ggggaacgtc 1260
ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1320
ctgtccccgg gt 1332
<210> 174
<211> 645
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: OX40.19 light chain
<400> 174
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccatt cactttcggc 300
cctgggacca aagtggatat caaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645
<210> 175
<211> 1341
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: OX40.20 heavy chain
<400> 175
gaggttcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggttcagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag gctctggatt caccttcagt agctatgcta tgtactgggt tcgccaggct 120
ccaggaaaag gtctggagtg ggtatcagct attgatacta gtggtggcac attctatgca 180
gactccgtgc ggggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaactc cttgtatctt 240
caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt tctgtgcaag acttggggaa 300
gggtacttct ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc agctagcacc 360
aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt 660
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 720
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1080
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200
gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320
ctctccctgt ccccgggttg a 1341
<210> 176
<211> 1341
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: OX40.21 heavy chain
<400> 176
gaggttcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggttcagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag gctctggatt caccttcagt agctatgcta tgtactgggt tcgccaggct 120
ccaggaaaag gtctggagtg ggtatcagct attgatactg atgctggcac attctatgca 180
gactccgtgc ggggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaactc cttgtatctt 240
caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt tctgtgcaag acttggggaa 300
gggtacttct ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc agctagcacc 360
aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt 660
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 720
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1080
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200
gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320
ctctccctgt ccccgggttg a 1341
<210> 177
<211> 1341
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: OX40.22 heavy chain
<400> 177
gaggttcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggttcagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag gctctggatt caccttcagt agctatgcta tgtactgggt tcgccaggct 120
ccaggaaaag gtctggagtg ggtatcagct attgatacta gtactggcac attctatgca 180
gactccgtgc ggggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaactc cttgtatctt 240
caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt tctgtgcaag acttggggaa 300
gggtacttct ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc agctagcacc 360
aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt 660
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 720
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1080
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200
gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320
ctctccctgt ccccgggttg a 1341
<210> 178
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: hOX40 epitope
<400> 178
Asp Val Val Ser Ser Lys Pro Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu
1 5 10 15
Arg
<210> 179
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: hOX40 epitope
<400> 179
Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys Pro Pro Gly His
1 5 10 15
Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys Thr
20 25 30
Leu Ala Gly Lys
35
<210> 180
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: peptide linker
<400> 180
Pro Val Gly Val Val
1 5
<210> 181
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: sortase A recognition motif
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 181
Leu Pro Xaa Thr Gly
1 5
<210> 182
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: hOX40 epitope
<400> 182
Gln Asn Thr Val Cys Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val
1 5 10 15
Val Ser Ser Lys Pro Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg
20 25 30
<210> 183
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: hOX40 epitope
<400> 183
Pro Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg
1 5 10
<210> 184
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: hOX40 epitope
<400> 184
Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg
1 5 10
<210> 185
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: hOX40 epitope
<400> 185
Ser Gln Asn Thr Val Cys Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn
1 5 10 15
<210> 186
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG1 C-termianl CH1 (same for IgG3 (17-15-15-15), igG3
(17-15-15), IgG3 (17-15), IgG3 (15-15-15), IgG3 (15), and IgG4
<400> 186
Val Asp Lys Arg Val
1 5
<210> 187
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG2 C-terminal CH1
<400> 187
Val Asp Lys Thr Val
1 5
<210> 188
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG1 upper hinge
<400> 188
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
1 5 10
<210> 189
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG3 (17-15-15-15) upper hinge (same for IgG3
(17-15-15) and IgG3 (17-15))
<400> 189
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr
1 5 10
<210> 190
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG3 (15-15-15) upper hinge (same for IgG3(15))
<400> 190
Glu Pro Lys Ser
1
<210> 191
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG4 upper hinge
<400> 191
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
1 5
<210> 192
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG1 middle hinge
<400> 192
Cys Pro Pro Cys Pro
1 5
<210> 193
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG2 middle hinge
<400> 193
Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
1 5
<210> 194
<211> 50
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG3 (17-15-15-15) middle hinge
<400> 194
Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys
1 5 10 15
Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro
20 25 30
Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg
35 40 45
Cys Pro
50
<210> 195
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG3 (17-15-15) middle hinge
<400> 195
Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys
1 5 10 15
Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro
20 25 30
Arg Cys Pro
35
<210> 196
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG3 (17-15) middle hinge
<400> 196
Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys
1 5 10 15
Pro Arg Cys Pro
20
<210> 197
<211> 41
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG3 (15-15-15) middle hinge
<400> 197
Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys
1 5 10 15
Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp
20 25 30
Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
35 40
<210> 198
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG3 (15) middle hinge
<400> 198
Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
1 5 10
<210> 199
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG4 middle hinge
<400> 199
Cys Pro Ser Cys Pro
1 5
<210> 200
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG1 lower hinge (same for IgG3 (17-15-15-15), IgG3
(17-15-15), IgG3 (17-15), IgG3 (15-15-15), IgG3 (15), and IgG4)
<400> 200
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
1 5
<210> 201
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG2 lower hinge
<400> 201
Ala Pro Pro Val Ala Gly
1 5
<210> 202
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(98)
<223> Wildtype human IgG1 CH1
<400> 202
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val
<210> 203
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(98)
<223> Wildtype human IgG2 CH1
<400> 203
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val
<210> 204
<211> 103
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(103)
<223> Wildtype human IgG1 CH2
<400> 204
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
1 5 10 15
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
20 25 30
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
35 40 45
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
50 55 60
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
65 70 75 80
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
85 90 95
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
100
<210> 205
<211> 103
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(103)
<223> Wildtype human IgG2 CH2
<400> 205
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
1 5 10 15
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
20 25 30
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
35 40 45
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg
50 55 60
Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
65 70 75 80
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu
85 90 95
Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys
100
<210> 206
<211> 106
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(106)
<223> Wildtype human IgG1 CH3
<400> 206
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
100 105
<210> 207
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(107)
<223> Wildtype human IgG2 CH3
<400> 207
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 208
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Alternative hinge
<400> 208
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly
<210> 209
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Alternative hinge
<400> 209
Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly
<210> 210
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Alternative hinge
<400> 210
Glu Arg Lys Cys Ser Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly
<210> 211
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Alternative hinge
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 211
Glu Arg Lys Xaa Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly
<210> 212
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<220>
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<222> (5)..(5)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 212
Glu Arg Lys Cys Xaa Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<222> (19)..(19)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 213
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly Xaa
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<212> PRT
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<220>
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<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 214
Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly Xaa
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<222> (19)..(19)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
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Glu Arg Lys Cys Ser Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly Xaa
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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
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Glu Arg Lys Xaa Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly Xaa
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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
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<222> (19)..(19)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 217
Glu Arg Lys Cys Xaa Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly Xaa
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Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
1 5 10 15
Leu Gly Gly
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Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
1 5 10 15
Leu Gly Gly
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<220>
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<400> 220
Glu Arg Lys Cys Cys Ser Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
1 5 10 15
Leu Leu Gly Gly
20
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<212> PRT
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<222> (4)..(4)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 221
Glu Arg Lys Xaa Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
1 5 10 15
Leu Gly Gly
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<220>
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<222> (5)..(5)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 222
Glu Arg Lys Cys Xaa Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
1 5 10 15
Leu Gly Gly
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<220>
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<400> 223
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
1 5 10 15
Leu Gly
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<220>
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<400> 224
Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
1 5 10 15
Leu Gly
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 225
Glu Arg Lys Cys Cys Ser Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
1 5 10 15
Leu Leu Gly
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<211> 18
<212> PRT
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 226
Glu Arg Lys Xaa Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
1 5 10 15
Leu Gly
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<211> 18
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<220>
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<222> (5)..(5)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 227
Glu Arg Lys Cys Xaa Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
1 5 10 15
Leu Gly
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<400> 228
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
1 5 10
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<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Alternative hinge
<400> 229
Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
1 5 10
<210> 230
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Alternative hinge
<400> 230
Glu Arg Lys Cys Ser Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
1 5 10
<210> 231
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Alternative hinge
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 231
Glu Arg Lys Xaa Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
1 5 10
<210> 232
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Alternative hinge
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 232
Glu Arg Lys Cys Xaa Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
1 5 10
<210> 233
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Portion of hinge
<400> 233
Pro Val Ala Gly
1
<210> 234
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Portion of hinge
<400> 234
Glu Leu Leu Gly
1
<210> 235
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Portion of hinge
<400> 235
Glu Leu Leu Gly Gly
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Portion of hinge
<400> 236
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
1 5
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<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Portion of hinge
<400> 237
Cys Cys Val Glu
1
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<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> WT human IgG2 hinge
<400> 238
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly
<210> 239
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> Human IgG2 hinge with C219S
<400> 239
Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly
<210> 240
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG2/IgG1 hinge
<400> 240
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
1 5 10 15
Leu Gly Gly
<210> 241
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG2 (C219S)/IgG1 hinge
<400> 241
Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
1 5 10 15
Leu Gly Gly
<210> 242
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> Wild type human IgG1 hinge
<400> 242
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly
20
<210> 243
<211> 103
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(103)
<223> Human IgG1 CH2 with A330S/P331S
<400> 243
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
1 5 10 15
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
20 25 30
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
35 40 45
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
50 55 60
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
65 70 75 80
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu
85 90 95
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
100
<210> 244
<211> 326
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG1-IgG2-IgG1f
<400> 244
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
195 200 205
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 245
<211> 325
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG1-IgG2-1gG1f2
<400> 245
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
165 170 175
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 246
<211> 325
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG1-IgG2CS-IgG1f
<400> 246
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
165 170 175
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 247
<211> 325
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG1-IgG2CS-IgG1f2
<400> 247
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
165 170 175
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 248
<211> 326
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IgG2-IgG1f
<400> 248
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
195 200 205
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
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20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 301
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Heavy chain variable region nivolumab
<400> 301
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
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<211> 107
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic: Light chain variable region nivolumab
<400> 302
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<223> Synthetic: HCDR1 nivolumab
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Asn Ser Gly Met His
1 5
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<213> Artificial Sequence
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<400> 304
Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
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<211> 4
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: HCDR3 nivolumab
<400> 305
Asn Asp Asp Tyr
1
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<211> 11
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<223> Synthetic: LCDR1 nivolumab
<400> 306
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
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<223> Synthetic: LCDR2 nivolumab
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Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
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<223> Synthetic: LCDR3 nivolumab
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Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg Thr
1 5
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Heavy chain variable region ipilimumab (from
WO01/014424)
<400> 309
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Light chain variable region ipilimumab (from
WO01/014424)
<400> 310
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: HCDR1 ipilimumab (from WO01/014424)
<400> 311
Ser Tyr Thr Met His
1 5
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic: HCDR2 ipilimumab (from WO01/014424)
<400> 312
Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
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<211> 9
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic: HCDR3 ipilimumab (from WO01/014424)
<400> 313
Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr
1 5
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic: LCDR1 ipilimumab (from WO01/014424)
<400> 314
Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
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<223> Synthetic: LCDR2 ipilimumab (from WO01/014424)
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Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: LCDR3 ipilimumab (from WO01/014424)
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Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr
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<223> Synthetic: HCDR2 of OX40.21
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Ala Ile Asp Thr Asp Ala Gly Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Arg Gly
1 5 10 15
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic: VH of OX40.21
<400> 318
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Asp Thr Asp Ala Gly Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Arg
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Leu Gly Glu Gly Tyr Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115

Claims (24)

1.一种结合人OX40的分离的抗体，其中该抗体包含：由SEQ ID NO: 87的序列组成的重链可变区CDR1、由SEQ ID NO: 317的序列组成的重链可变区的CDR2、和由SEQ ID NO: 89的序列组成的重链可变区CDR3；以及由SEQ ID NO: 90的序列组成的轻链可变区CDR1、由SEQID NO: 91的序列组成的轻链可变区CDR2、和由SEQ ID NO: 92的序列组成的轻链可变区CDR3。
2.权利要求1的抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO: 318的序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO: 94的序列的轻链可变区。
3.权利要求1的抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO: 124的序列的重链，和包含SEQID NO: 116的序列的轻链。
4.权利要求1的抗体，其中该抗体包含：由SEQ ID NO: 318的序列组成的重链可变区，和由SEQ ID NO: 94的序列组成的轻链可变区。
5.权利要求1的抗体，其中该抗体包含：包含SEQ ID NO: 124的序列的重链，和包含SEQID NO: 116的序列的轻链。
6.如权利要求1所述的抗体，其中该抗体包含重链恒定区和轻链恒定区。
7.如权利要求6所述的抗体，其中所述重链恒定区或是缺少C末端赖氨酸，或是在C末端包含赖氨酸以外的氨基酸。
8.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体刺激抗原特异性T细胞反应。
9.如权利要求1所述的抗体，其中如通过Biacore测量的，所述抗体以1 nM或更小的KD结合可溶性人OX40。
10.如权利要求1所述的抗体，其中该抗体结合人OX40 (SEQ ID NO: 2)的序列DVVSSKPCKPCTWCNLR (SEQ ID NO: 178)的全部或一部分。
11.如权利要求1所述的抗体，其是IgG1同型。
12.如权利要求1所述的抗体，其是人抗体。
13.一种核酸，其编码如权利要求1至12中任一项所述的抗体的重链可变区及/或轻链可变区。
14.一种表达载体，其包含如权利要求13所述的核酸分子。
15.一种细胞，其经如权利要求14所述的表达载体转化。
16.一种组合物，其包含如权利要求1至12中任一项所述的抗体及载体。
17.如权利要求16所述的组合物，其还包含一种或多种其他治疗剂。
18.如权利要求17所述的组合物，其中所述一种或多种其他治疗剂选自下组：抗PD1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体及其组合。
19.如权利要求1至12中任一项所述的抗体用于制备治疗癌症的药物的用途，其中所述癌症选自下组：子宫颈癌、结肠直肠癌、膀胱癌、和卵巢癌。
20.如权利要求16所述的组合物用于制备治疗癌症的药物的用途，其中所述癌症选自下组：子宫颈癌、结肠直肠癌、膀胱癌、和卵巢癌。
21.如权利要求1-12中任一项所述的抗体与抗PD-1抗体的组合用于制备用于治疗癌症的药物的用途，其中所述抗PD-1抗体是纳武单抗，其中所述癌症选自下组：子宫颈癌、结肠直肠癌、膀胱癌、和卵巢癌。
22.如权利要求1-12中任一项所述的抗体与抗CTLA-4抗体的组合用于制备用于治疗癌症的药物的用途，其中所述抗CTLA-4抗体是伊匹单抗，其中所述癌症选自下组：子宫颈癌、结肠直肠癌、膀胱癌、和卵巢癌。
23.如权利要求1-12中任一项所述的抗体与抗PD-1抗体以及抗CTLA-4抗体的组合用于制备用于治疗癌症的药物的用途，其中所述抗PD-1抗体是纳武单抗，所述抗CTLA-4抗体是伊匹单抗，其中所述癌症选自下组：子宫颈癌、结肠直肠癌、膀胱癌、和卵巢癌。
24.一种制备结合人OX40的抗体的方法，包括在合适的条件下培养权利要求15的细胞和分离所述抗体。
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