EA029793B1 - Антитела к ох40 и способы их применения - Google Patents

Abstract

Данное изобретение описывает антитела человека, предпочтительно рекомбинантные антитела человека, как гуманизированные, так и химерные, которые специфически связываются с OX40 человека. Предпочтительные антитела имеют высокую аффинность к рецептору OX40 и активируют рецептор in vitro и in vivo. Антитело может быть полноразмерным антителом или его антигенсвязывающей детерминантой. Антитела или детерминанты антител полезны в модуляции активности рецептора, например, у людей, страдающих от нарушений, в которых активность OX40 вредна. Описаны нуклеиновые кислоты, векторы и клетки-хозяева для экспрессии рекомбинантных антител человека и также приведены способы синтеза рекомбинантных антител человека.

Description

изобретение относится в основном к модуляции активации рецептора 0X40 и более конкретно к модуляции рецептора 0X40 для ингибирования иммуносупрессивной функции интерлейкин-10 (ИЛ-10)-продуцирующих СБ4' регуляторных Т-клеток 1-го типа ("Тг1-клетки") и Рохр3+экспрессирующих регуляторных Т-клеток (также иногда называемых в настоящем документе "Рохр3+ Тгед" клетки) и формирования Тг1-клеток из СБ4' клеток или наивных клеток и продукции ИЛ-10.

Перекрестная ссылка на родственные заявки

По настоящей заявке испрашивается приоритет заявки на патент США № 61/375999, поданной 23 августа 2010 г. и заявки на патент США № 61/380827, поданной 8 сентября 2010 г. Обе заявки включены в настоящий документ в качестве ссылки.

Заявление относительно финансирования исследования или разработки из федерального бюджета

Описываемое изобретение сделано при поддержке правительства на основании грантов К01 ΑΙ061645-01, К01 ΑΙ062888-01 и И19 ΑΙ071130-01, выданных Ναΐίοηαΐ 1п8Й1и1е о£ НеаНЬ. Правительство имеет определенные права на изобретение.

Ссылка на списки последовательностей

Настоящее изобретение содержит списки последовательностей, представленные в виде текстового файла в соответствии с 37 СРК § 1.52 (е) (V), названного кедиепсе Й8Йпд.1х1, созданного 23 августа 2011 года, размером 13836 байт, который включен в настоящий документ в качестве ссылки. Прилагаемые описания последовательностей и списки последовательностей отвечают правилам, регулирующим описание нуклеотидных и/или аминокислотных последовательностей в патентных заявках, как указано в 37 СРК § 1.821-1.825. Списки последовательностей содержат однобуквенный код для символов нуклеотидных последовательностей и трехбуквенные коды для аминокислот, что определено в соответствии со стандартами ЮТАС-ШВМВ, описанными в ШЭею Ααάκ Кек. 13:3021-3030 (1985) и в Вюс11еписа1 1. 219 (Νο. 2):345-373 (1984). Символы и формат, используемые для нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, соответствуют правилам, изложенным в 37 СРК § 1.822.

Известный уровень техники

Тг1-клетки играют важную роль в периферической толерантности. Тг1-клетки являются особенно важными в ограничении повреждения тканей хозяина при воспалительных иммунных ответах. Формирование Тг1-клеток сопровождает как ТН1, так и ТН2 иммунные ответы ίη νί\Ό и ίη νίΙΐΌ.

Тг1-клетки формируются из наивных СБ4+ Т-клеток во время антиген-индуцированного Тклеточного иммунного ответа. Тг1-клетки энергичны в ответ на активацию через рецепторы ТСК, СБ28 и ИЛ-2 и обладают способностью подавлять антиген-индуцируемую пролиферацию наивных СБ4+ Тклеток ίη У1уо и ίη νίΙΐΌ. Тг1-клетки обладают способностью ингибировать развитие аутоиммунных заболеваний и ограничивать величину иммунного ответа на микробные патогены.

Несмотря на то, что были изучены молекулярные сигналы, которые ведут к формированию Тг1клеток, мало известно о молекулярных сигналах, которые негативно регулируют формирование этих клеток. Хотя иммуносупрессивные препараты, цитокины, костимулирующие молекулы и ДК вовлечены в индукцию Тг1-клеток, сигналы, которые негативно регулируют формирование Тг1-клеток, остаются неуловимыми.

Сущность изобретения

Активация рецептора 0X40 блокирует формирование Тг1-клеток из наивных или СБ4+ Т-клеток памяти, а также продукцию ИЛ-10 Тг1-клетками и иммуносупрессивную функцию Тг1-клеток. Активация рецептора 0X40 также блокирует продукцию ИЛ-10 Рохр3+ Т-гед клетками и иммуносупрессивную функцию. Таким образом, представленные в настоящем документе являются агонистичными антителами, которые связываются с рецептором 0X40, где агонист модулирует активацию рецептора 0X40 для блокирования ИЛ-10-цитокиновой секреции и/или общей иммуносупрессивной функции Тг1 и Рохр3+ Тгед клеток. Фактически антитела могут имитировать лиганд 0X40 и триггировать ОХ40-рецептор на Тг1 и/или натуральных регуляторных Т-клетках ("иГгедк"), также называемых "Рохр3+ Т-гедк".

Как показано в находящихся на совместном рассмотрении заявках на патент США 11/659266 и 12/861135, 0x40В ингибирует формирование и функцию ИЛ-10-продуцирующих Тг1-клеток из наивных и СБ4' Т-клеток памяти, которые были индуцированы иммуносупрессивными препаратами дексаметазоном и витамином Б₃. Мы обнаружили, что 0Х40Ь ингибирует формирование и функцию ИЛ-10продуцирующих регуляторных Т-клеток. Эти открытия показывают, что активация 0X40 0Х40Ь подавляет в культуре формирование иммуносупрессивных ИЛ-10-продуцирующих Т-клеток человека. Эта уникальная функция 0Х40Ь не характерна для двух других костимулирующих членов семейства ΊΝΡ, лиганда О1ТК и лиганда 4-1ВВ. 0Х40Ь также сильно ингибирует формирование и функцию ИЛ-10продуцирующих Тг1-клеток, индуцируемых двумя физиологическими импульсами, генерируемыми индуцибельным костимулирующим лигандом и незрелыми ДК. Активация рецептора 0X40 на Т-клетках человека с помощью моноклональных антител, малых молекул или 0x40В или белком, имеющим по меньшей мере 90% гомологии, модулирует и регулирует формирование и функцию ИЛ-10продуцирующих иммуносупрессивных Т-клеток.

- 1 029793

Открытие имеет множество практических применений в лечении. Например, агонистические антитела, малые молекулы или ОХ40Ь могут быть использованы для подавления формирования и функции ИЛ-10-продуцирующих иммуносупрессивных Т-клеток и, следовательно, могут использоваться для усиления иммунных ответов для лечения рака и инфекционных заболеваний или в качестве адъюванта для противораковых вакцин. Антагонистические антитела к ОХ40 или ОХ40Ь или антагонистические малые молекулы могут использоваться для усиления формирования и функции ИЛ-10-продуцирующих иммуносупрессивных Т-клеток и, следовательно, могут быть использованы для разработки терапии аутоиммунных заболеваний и реакций "трансплантат против хозяина". Наше открытие также создает высокопроизводительные способы скрининга антител или малых молекул либо активирующих рецептор ОХ40 (или, наоборот, блокирующих активацию ОХ40) на Т-клетках для разработки терапевтических средств для лечения рака или, альтернативно, аутоиммунных заболеваний и реакций "трансплантат против хозяина".

Моноклональные антитела и антитела человека (иногда называемые в настоящем документе "антитело к ОХ40" и/или другие сходные варианты), которые связываются с рецептором ОХ40 человека, приведены в настоящем документе. Эти антитела полезны при лечении или профилактике острых или хронических заболеваний или состояний, патология которых сопряжена с ОХ40. В одном аспекте настоящего изобретения описано изолированное антитело человека или его антигенсвязывающая детерминанта, которое связывается с ОХ40 человека и является эффективным при лечении рака или лечении аутоиммунных заболеваний. Любое из описанных в настоящем документе антител к ОХ40 может быть использовано в качестве лекарственного средства. Любое одно или более антител к ОХ40 могут быть использованы для лечения одного или нескольких различных видов рака или аутоиммунных заболеваний, описанных в настоящем документе.

В настоящем документе приведены выделенные гуманизированные антитела, которые связываются с ОХ40. Выделенные антитела, как описано в настоящем документе, связываются с ОХ40 и могут связываться с ОХ40, закодированным следующими генами: идентификационный номер по ΝΟΒΙ ΝΡ_003317, идентификационный номер по Оепрер! Р23510, или генами, имеющими 90% гомологии к ним. Приведенное в настоящем документе выделенное антитело может дополнительно связываться с рецептором ОХ40, имеющим один из следующих идентификационных номеров по ОепВапк: ΑΑΒ39944, САЕ11757 или ΑΑΙ05071.

Согласно изложенному в настоящем документе типичным является выделенное антитело, которое связывается с ОХ40, содержащее: (а) СГОР1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕО ГО NО:1; (б) СЭР2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕО ГО NО:2; (в) СЭР3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕО ГО NО:3; (г) СЭР1 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕО ГО NО:7; (д) СЭР2 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕО ГО NО:8; и (е) СЭР3 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕО ГО NО:9.

Альтернативно, выделенное антитело может иметь СГОК 1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕО ГО NО:1; СЭР2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕО ГО NО:2; и/или СГОР3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕО ГО NО:3, или иметь СЭР вариабельной области тяжелой цепи, имеющую 90% гомологии к ним.

Кроме того, выделенное антитело может иметь СГОР1 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕО ГО NО:7; СЭР2 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕО ГО NО:8; и/или СГОР3 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕО ГО NО:9, или вариабельную область тяжелой цепи, имеющую 90% гомологии к ним.

Выделенное антитело может иметь вариабельную область легкой цепи ("УЪ"), содержащую аминокислотную последовательность 8ЕО ГО NО:10, 11, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотным последовательностям 8ЕО ГО NО:10, 11. Выделенное антитело может иметь вариабельную область тяжелой цепи ("УН"), содержащую аминокислотную последовательность 8ЕО ГО NО:4, 5 или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотным последовательностям 8ЕО ГО NО:4, 5. Таким образом, в качестве примера, выделенное антитело может иметь вариабельную тяжелую последовательность 8ЕО ГО NО:5 и вариабельную легкую последовательность 8ЕО ГО NО:11, или последовательность, имеющую 90% гомологии к ним. Выделенное антитело может содержать вариабельную легкую цепь, кодируемую последовательностью нуклеиновых кислот 8ЕО ГО NО:12, или последовательностью нуклеиновых кислот, по меньшей мере на 90% идентичной нуклеотидным последовательностям 8ЕО ГО NО:12. Выделенное антитело может содержать вариабельную тяжелую цепь, кодируемую последовательностью нуклеиновых кислот 8ЕО ГО NО:6 или последовательностью нуклеиновых кислот, по меньшей мере на 90% идентичной нуклеотидным последовательностям 8ЕО ГО NО:6.

Также в настоящем документе приведены моноклональные антитела. Моноклональные антитела

- 2 029793

могут иметь вариабельную легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность 8Еф ГО N0:10 или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90 % идентичную аминокислотным последовательностям 8Еф ГО N0:10. Дополнительно приведены моноклональные антитела, имеющие вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность 8Еф ГО N0:4, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотным последовательностям 8Еф ГО N0:4.

Также в настоящем документе приведена выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая любое из антител к 0X40, приведенных в настоящем документе. Дополнительно в настоящем документе приведены клетки-хозяева, каждая из которых содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую любое из описанных в настоящем документе антител к 0X40. Далее приведены способы получения антител (например, клеток-хозяев, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую любое из описанных в настоящем документе антител к ОХ40), включающие культивирование клеток-хозяев, таким образом, что продуцируется антитело и/или восстановление антитела из клетки-хозяина.

Краткое описание чертежей

Манеру, в которой вышеупомянутые признаки, аспекты и преимущества изобретения, а также другое, что станет очевидными, достигаются и могут быть поняты в деталях, более конкретное описание изобретения, кратко изложенное выше, возможно увидеть путем ссылки на варианты его осуществления, которые представлены на фигурах, являющихся частью этого описания изобретения. Следует, однако, отметить, что прилагаемые фигуры иллюстрируют некоторые варианты осуществления изобретения и, следовательно, не должны рассматриваться как ограничивающие рамки изобретения, для изобретения могут быть признаны другие столь же эффективные варианты осуществления изобретения.

Фиг. 1 демонстрирует, что Р0ХР3+ Тгедк проникли в ткани фолликулярной лимфомы (ФЛ) человека и колокализовались с опухолевыми В-клетками и моноцитами. Слева: Двойное иммунное окрашивание Р0ХР3+ Тгедк (красный цвет) и ΟΌ20+ В-клеток лимфомы (зеленый цвет); справа: Р0ХР3+ Тгедк (красный цвет) и СГО11с' моноциты/макрофаг/ДК (зеленый цвет).

Фиг. 2А и 2В описывают возросшее число СЭ4+Е0ХР3+ Тгедк у пациентов с ФЛ. Опухолевые клетки и МКПК были получены от шести пациентов с ФЛ при начальной диагностике до лечения. МКПК были также получены от шести здоровых доноров для сравнения. Проценты регуляторных Т-клеток от общего числа СГО4' Т-клеток определяли с помощью проточного цитометрического анализа С04+СЭ25+С0127^1о"Е0ХР3+ Тгед. Фиг. 2А демонстрирует репрезентативный ЕАС8 анализ Ттедк. МКПК ФЛ и клетки опухоли ФЛ были взяты от того же пациента. Фиг. 2В демонстрирует процент Тгедк всех доноров. Горизонтальная полоса указывает значения.

Фиг. 3 демонстрирует выделение 1С08+Р0ХР3+ или 1С08Т0ХР3+ Тгедк из ФЛ. Была получена суспензия отдельных клеток из образца селезенки до какого-либо лечения. Клетки оттаивали в день анализа. Обогащенные СГО4'СГО8^-СГО14^-СГО16^-СГО56^-СГО11с^-ТС.’В',/5^- Т-клетки были разделены на субпопуляции СГО25^|о'“ и ί.Ό25^|ιι?|1. С04+С025^Ь1бЬР0ХР3+ Тгедк были дополнительно разделены на субпопуляции 1С08^Н|?Н и 1С08^1оте на основе поверхностной экспрессии 1С08. Была определена внутриклеточная экспрессия Р0ХР3 во всех субпопуляциях.

Фиг. 4 демонстрирует ингибирование пролиферации инфильтрирующих СО4+СО25^- Т-клеток в ФЛ внутриопухолевыми Ттедк, и ингибирование может быть частично блокировано анти-ИЛ-10нейтрализирующими антителами. Меченные СР8Е инфильтрирующие опухоль ΟΌ4+ΟΌ25^- Т-клетки культивировали с аутологичными опухолевыми клетками, предварительно активированными рекомбинантным СГО40Е в присутствии или в отсутствие аутологичных 1С08+Е0ХР3+ Тгедк или 1С08Т0ХР3+ Ттедк, или анти-ИЛ-10 (10 мкг/мл). После 72 ч культивирования определяли пролиферацию клеток СЭ4+СО25^- при помощи проточного цитометрического анализа разведения СЕ8Е.

Фиг. 5А демонстрирует внутриклеточный анализ продукции цитокинов наивными СГО4' Тклетками, что установлено при помощи проточной цитометрии в соответствии с вариантом осуществления способа настоящего изобретения.

Фиг. 5В демонстрирует продукцию цитокинов наивными СГО4' Т-клетками, что установлено ЕЬ18А в соответствии с вариантом осуществления способа настоящего изобретения.

Фиг. 5С демонстрирует супрессивную функцию ИЛ-10-продуцирующих Тг1-клеток, что установлено захватом [³Н]тимидина в соответствии с вариантом осуществления способа настоящего изобретения.

Фиг. 6А демонстрирует внутриклеточный анализ продукции цитокинов СГО4' Т-клетками памяти, что установлено при помощи проточной цитометрии в соответствии с вариантом осуществления способа настоящего изобретения.

Фиг. 6В демонстрирует продукцию ИЛ-10 СГО4' Т-клетками памяти, что установлено ЕЬ18А в соответствии с вариантом осуществления способа настоящего изобретения.

Фиг. 7А демонстрирует внутриклеточный анализ продукции цитокинов наивными СЭ4+ Тклетками, что установлено при помощи проточной цитометрии в соответствии с вариантом осуществления способа настоящего изобретения.

Фиг. 7В демонстрирует продукцию ИЛ-10 наивными СЭ4+ Т-клетками, что установлено ЕЬ18А в соответствии с вариантом осуществления способа настоящего изобретения.

- 3 029793

Фиг. 7С демонстрирует число жизнеспособных Т-клеток, подсчитанное в соответствии с вариантом осуществления способа настоящего изобретения.

Фиг. 8А демонстрирует внутриклеточный анализ продукции цитокинов наивными С.Н4' Тклетками, что установлено при помощи проточной цитометрии в соответствии с вариантом осуществления способа настоящего изобретения.

Фиг. 8В демонстрирует продукцию ИЛ-10 наивными С.Н4' Т-клетками, что установлено ЕЬ1ЗА в соответствии с вариантом осуществления способа настоящего изобретения.

Фиг. 8С демонстрирует внутриклеточный анализ продукции цитокинов С.Н4' Т-клетками памяти, что установлено при помощи проточной цитометрии в соответствии с вариантом осуществления способа настоящего изобретения.

Фиг. 8Ό демонстрирует продукцию ИЛ-10 СЭ4' Т-клетками памяти, что установлено ЕЬ1ЗА в соответствии с вариантом осуществления способа настоящего изобретения.

Фиг. 8Е демонстрирует внутриклеточный анализ продукции цитокинов наивными С.Н4' Тклетками, что установлено при помощи проточной цитометрии в соответствии с вариантом осуществления способа настоящего изобретения.

Фиг. 8Р демонстрирует продукцию ИЛ-10 наивными СЭ4' Т-клетками, что установлено ЕЬ1ЗА в соответствии с вариантом осуществления способа настоящего изобретения.

Фиг. 9 демонстрирует продукцию ИЛ-10 регуляторными Т-клетками, что установлено ЕЫЗА в соответствии с вариантом осуществления способа настоящего изобретения.

Фиг. 10 демонстрирует результаты скрининга супернатантов гибридомы анти-ОХ40 человека на Ь0X40 против родительских Ь-клеток, что установлено ЕЫЗА.

Фиг. 11 демонстрирует скрининг специфичных моноклональных антител к 0X40 человека, что установлено при помощи проточного цитометрического анализа в соответствии с вариантом осуществления способа настоящего изобретения.

Фиг. 12 демонстрирует подтверждение специфичности моноклональных антител к 10X40, используя клетки ЗИРМ2, экспрессирующие 0X40 (8ИРМ2-0Х40) в соответствии с вариантом осуществления способа настоящего изобретения.

Фиг. 13 демонстрирует специфичные моноклональные антитела к 0X40, которые могут ингибировать формирование ИЛ-10-продуцирующих клеток (Тг1) из СЭ4' Т-клеток, стимулированное витамином Ό₃ (0,1 мкМ)/дексаметозон (50 нм), СН32Е/1С0ЗЬ и анти-СО3/СЭ28 (0,2 мкг/мл) в соответствии с вариантом осуществления способа настоящего изобретения. Репрезентативные данные сортировки флуоресцентно-активированных клеток (РАСЗ) приведены на А, и проценты ИЛ-10- продуцирующих клеток для всех препаратов моноклональных антител к 0X40 показаны В.

Фиг. 14 демонстрирует результаты специфичных моноклональных антител к 110X40. которые ингибируют формирование Тг1-клеток, также стимулируют пролиферацию СЭ4' Т-клеток в соответствии с вариантом осуществления способа настоящего изобретения.

Фиг. 15А, 15В и 15С детализируют титрацию моноклональных антител к 0X40 на их способность ингибировать формирование Тг1-клеток из СЭ4' Т-клеток в соответствии с вариантом осуществления способа настоящего изобретения. Репрезентативные данные РАСЗ приведены на фиг. 15 А, а проценты Тг1-клеток после обработки девятью моноклональными антителами к 0X40 приведены на фиг. 15В.

Фиг. 16А, 16В и 16С описывают специфичные моноклональные антитела к 0X40, которые ингибируют формирование ИЛ-10-продуцирующих Тг1-клеток из СЭ4' Т-клеток, также ингибируют продукцию ИЛ-10 1С0З⁺СН4⁺СН25^Ыб1С0127^- Тгед и иммуносупрессивную функцию. Свежеотсортированные Ι003⁺0Ό4⁺0Ό25^1ΐ8ΐ0Ό127^- Тгедк (1С0З'Тге§5) были стимулированы анти-СЭЗ (0,2 мкг/мл) в присутствии клеток СН32Е/1С0ЗЬ и клеток (.'□326/0X406 (фиг. 16А) или моноклональных антител к 0X40 или контрольного антитела (фиг. 16В) пять дней. Далее клетки были повторно стимулированы анти003/0028 24 ч и супернатанты были оценены на ИЛ-10 твердофазным иммуносорбентным анализом (ЕЬ1ЗА). Фиг. 16С - это анализ пролиферации, основанный на моноцитах, показывающий, что два из антител блокировали функцию 1С0З+Тгед.

Фиг. 17А и 17В описывают идентификацию моноклональных антител к 10X40, которые ингибируют формирование Тг1-клеток и блокируют функцию Р0XР3'С^4'С^25^ι"^дIι Тгед в соответствии с вариантом осуществления способа настоящего изобретения. Репрезентативные анализы методом проточной цитометрии представлены на фиг. 17А. Данные для шести моноклональных антител приведены на фиг. 17В.

Фиг. 18 демонстрирует идентификацию моноклональных антител к 10X40, которые не ингибируют формирование Тг1-клеток, но блокируют функцию Р0XР3⁺С^4⁺С^25¹¹⁸¹ Тгед в соответствии с вариантом осуществления способа настоящего изобретения.

Фиг. 19А и 19В описывают агонистичные антитела к 10X40, блокирующие лимфомоопосредованную функцию СО4⁺СО25^Ыд1 Тгед в соответствии с вариантом осуществления способа настоящего изобретения. Репрезентативные РАСЗ анализы представлены на фиг. 19А, а данные для всех экспериментов представлены на фиг. 19В.

На фиг. 20 показано, что моноклональные антитела к 10X40 могут связываться с С.Н4' Т-клетками

- 4 029793

макаки-резуса. Как показано, шесть из МАт к ЮХ40 могут связываться с активированными СЭ4' Тклетками макаки-резуса и будут связываться с 0X40 макаки-резуса и активировать стимуляцию 0X40.

Фиг. 21 показывает, что каждое из антител Ни106-222 Серия I и II примера I состоит из тяжелой цепи с молекулярным весом около 50 кДа и легкой цепи с молекулярным весом около 25 кДа. Чистота антител Ни106-222 Серия I и II составляет более 95%.

Фиг. 22 демонстрирует анализ связывания мышиных антител 106-122, СЙ106 и Ни106-222 (Серия II) с клетками Ь/0Х40 (пример I).

Фиг. 23 изображает схематическую структуру вектора экспрессии антитела Ни106 !§С1/каппа (вектор экспрессии). Двигаясь по часовой стрелке с сайта §ай наверху, плазмида содержит транскрипционный участок тяжелой цепи, начинающийся с главного предраннего промотора цитомегаловируса человека (СМУ) и энхансера (СМУ промотор) для инициации транскрипции гена тяжелой цепи антитела. За СМУ-промотором следует экзон УН, геномная последовательность, содержащая гамма-1 константную область тяжелой цепи человека, имеющую экзоны СН1, шарнира, СН2 и СН3 с промежуточными интронами и сайт полиденилирования за экзоном СН3. После нуклеотидной последовательности гена тяжелой цепи с СМУ промотора начинается участок транскрипции легкой цепи, за которым следует экзон УЪ и геномная последовательность, содержащая экзон цепи каппа константной области человека (СЬ) с предшествующим интроном и сайт полиаденилирования после экзона СЬ. После гена легкой цепи следует предранний промотор ЗУ40 (ЗУ40 промотор), ген ксантин-гуанин-фосфорибозил трансферазы Е. сой (др4) и сегмент, содержащий сайт полиаденилирования ЗУ40 (ЗУ40 поли (А) сайт). В конце плазмида содержит часть плазмиды рИС19, содержащую бактериальную точку начала репликации (рИС от!) и ген бета-лактамазы (бета-лактамаза). Локализация соответствующих сайтов рестрикции ферментов показана на фигуре.

Фиг. 24 демонстрирует сравнение между связыванием антител Ни 106-222 Серия I и II с клетками Ь/0Х40 (пример I ниже).

Фиг. 25 демонстрирует, что мутировавший клон 106-222 (Ни222АА) МАт к ОХ40 человека и клон 106-222 (СЙ222) химерного МАт к 0X40 человека усилил стимулированную анти-СЭЗ пролиферацию наивных СО4+ Т-клеток. Эти антитела имеют схожую стимулирующую активность в сравнении с мышиным МАт к 0X40 человека (Моике222). Однако полностью гуманизированное Ат к 0X40 человека Ни222 не усиливало Т-клеточную пролиферацию в сравнении с !дС1 человека.

Фиг. 26 предоставляет данные, показывающие усиление СЭ4' и СО8+ Т-клеточной пролиферации антителами к 0X40 человека, используя антитела, связанные с пластиной.

Фиг. 27 демонстрирует, что гуманизированные и мышиные антитела к 0X40 человека требуют перекрестного связывания для усиления Т-клеточной пролиферации.

Фиг. 28 демонстрирует блокирование активности С^4⁺Ρ0XΡ3⁺ηТ^ед8 антителами к ОХ40 человека, используя антитела, связанные с пластиной.

Фиг. 29 показывает, что высокая концентрация мышиных антител к ОХ40 человека предпочтительно убивает Ρ0XΡ3⁺ Тгедк.

Фиг. 30 показывает, что мышиные моноклональные антитела к 0X40 человека действуют либо прямо на эффекторные Т-клетки, либо на иТгедк для блокирования супрессивной функции Тгедк.

Фиг. 31 А, 31В и 31С описывают результаты лечения опухоли у мышей при помощи МАт к Й0X40, которым были пересажены Й0X40+С^8+ Т-клетки. МАт к 0X40 человека улучшает Т-клеточную экспансию и выживаемость ίη νίνο. На фиг. 31А приведен терапевтический режим вакцинирования. Репрезентативные ίη νίνο биолюминисцентные изображения приведены на фиг. 31В. Результаты лечения опухоли антителом приведены на фиг. 31 С.

Фиг. 32 демонстрирует расположение аминокислотных последовательностей УН 106-222, гуманизированного 106-222 (Ни106) и человеческого акцептора Х61012 (идентификационный номер по ОепВапк). Аминокислотные остатки показаны однобуквенным кодом. Номера выше последовательностей указывают на локализацию в соответствии с КаЬа1 е( а1. (Зедиепсек о£ РгоЮйъ о£ !ттипо1од1са1 [ШегезГк, Ийй еййюп, №Н Риййсайоп До. 91-3242, И.8. ЭераПтеШ о£ Неайй апй Нитап ЗегЛсех. 1991). Те же последовательности, как заявлено в настоящем документе, также представлены в Списке последовательностей и номера позиций могут быть различными. На фиг. 32 СОК последовательности, определенные КаЬа1 е( а1. (1991), подчеркнуты в УН 106-222. Остатки СЭР в УН X61012 пропущены на фигуре. Был проведен поиск последовательностей УН человека, гомологичных каркасным участкам УН 106-222 в базе данных ОепВапк, и последовательность УН, кодируемая человеческой Х61012 кДНК (УН X61012) была выбрана в качестве акцептора для гуманизации. Последовательности СОК УН 106-222 были впервые перенесены в соответствующие позиции УН X61012. Далее, в каркасных участках, где трехмерная модель вариабельных регионов 106-222 продемонстрировала значительный контакт с СОК, аминокислотные остатки УН 106-222 мыши заменили соответствующие остатки человека. Эти замены были выполнены в позициях 46 и 94 (подчеркнуто в УН Ни106). Кроме того, остаток каркасного участка человека, который оказался атипичным в соответствующей подгруппе области У, был заменен на наиболее типичный остаток, чтобы уменьшить возможную иммуногенность. Эта замена была выполнена в положении 105 (дважды подчеркнуто в УН Ни106).

- 5 029793

Фиг. 33 демонстрирует расположение аминокислотных последовательностей УЬ 106-222, гуманизированного 106-222 (Ни106) и человеческого акцептора Л1388641 (идентификационный номер по ОепВапк). Аминокислотные остатки показаны однобуквенным кодом. Номера выше последовательностей указывают на локализацию в соответствии с КаЬа1 е1 а1. (1991). Те же последовательности, как заявлено в настоящем документе, также представлены в Списке последовательностей, хотя номера позиций могут быть различными. Последовательности СОК, определенные КаЬа1 е1 а1. (1), подчеркнуты в УН 106-222. Остатки СОК в УЪ А1388641 пропущены на фигуре. Был проведен поиск последовательностей УЪ человека, гомологичных каркасным участкам УЪ 106-222 в базе данных ОепВапк, и последовательность УЪ, кодируемая человеческой А1388641 кДНК (УЪ А1388641), была выбрана в качестве акцептора для гуманизации. Последовательности СОК УЪ 106-222 были впервые перенесены в соответствующие позиции УЪ А1388641. В каркасных участках гуманизированной формы не было проведено никаких замен.

Фиг. 34 демонстрирует нуклеотидную последовательность гена УН Ни106, окруженную сайтами 8ре1 и НίπΟΙΙI (подчеркнуто), показаными вместе с выведенной аминокислотной последовательностью. Аминокислотные остатки показаны однобуквенным кодом. Последовательность сигнального пептида приведена курсивом. Ν-конечный аминокислотный остаток (О) зрелой УН имеет двойное подчеркивание. Последовательности СОК в соответствии с определением КаЬа1 е1 а1. (1991) подчеркнуты. Те же последовательности, как заявлено в настоящем документе, приведены в Списке последовательностей, хотя номера позиций могут быть разными в Списке последовательностей. Интронная последовательность выделена курсивом. Фрагмент гена Ни106 УН, окруженный §ре1 и НшйШ, был клонирован между соответствующими сайтами вектора экспрессии как показано на фиг. 23.

Фиг. 35 демонстрирует последовательность нуклеотидов гена УЪ Ни106-222, окруженную сайтами ΝΙκΙ и ЕсоК1 (подчеркнуто) показаны вместе с выведенной аминокислотной последовательностью. Аминокислотные остатки показаны однобуквенным кодом. Последовательность сигнального пептида приведена курсивом. Ν-конечный аминокислотный остаток (Ό) зрелой УЪ имеет двойное подчеркивание. Последовательности СОК в соответствии с определением КаЬа1 е1 а1. (1991) подчеркнуты. Интронная последовательность выделена курсивом. Фрагмент гена УЬ Ни106, окруженный ΝΑΙ и ЕсоК1, был клонирован между соответствующими сайтами вектора экспрессии, как показано на фиг. 23. Те же последовательности, как заявлено в настоящем документе, приведены в Списке последовательностей, хотя номера позиций могут быть разными в Списке последовательностей.

Детальное описание изобретения

Термин "антитело" включает молекулу иммуноглобулина, содержащую четыре полипептидные цепи, две тяжелые (Н) цепи и две легкие (Ъ) цепи, соединенные между собой дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (сокращенно в настоящем документе как НСУК или УН) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи содержит три домена СН1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (сокращенно в настоящем документе как ЬСУК или УЪ) и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи содержит один домен СЬ. УН и УЪ области могут быть далее подразделены на области гипервариабельности, называемые гипервариабельные области (СОК), чередующиеся с областями, которые являются более консервативными, называемыми каркасные участки (РК). Каждая УН и УЪ состоит из трех СОК и четырех РК, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: РК1, СОК1, РК2, СОК2, РК3, СОК3, РК4.

Термин "антигенсвязывающая детерминанта" антитела (или "детерминанта антитела") содержит фрагменты антитела, которые обеспечивают способность специфически связываться с антигеном (например, 10X40). Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может обеспечиваться фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином "антигенсвязывающая детерминанта" антитела включают (ί) РаЬ-фрагмент, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов УЪ, УН, СЬ и СН1; (ίί) Р(аЬ')₂-фрагмент, бивалентный фрагмент, содержащий два РаЬ-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в районе шарнирной петли; (ίίί) Рй-фрагмент, состоящий из доменов УН и СН1; (ιν) Ρν-фрагмент, состоящий из доменов УЪ и УН одного плеча антитела, (ν) йАЬ-фрагмент (^атй е1 а1., (1989) №Циге 341:544-546), который состоит из домена УН, и (νί) изолированная гипервариабельная область (СОК). Кроме того, хотя два домена Ρν-фрагмента, УЬ и УН, кодируются отдельными генами, они могут быть соединены при помощи рекомбинантных способов, используя синтетический линкер, что позволяет им быть построенными в виде одной белковой цепи, в которой области УЪ и УН паруются с образованием моновалентных молекул (известных как одноцепочечный Ρν АсРу); см., например, Βίτά е1 а1. (1988) §аепсе 242:423-426; и НиЦоп е1 а1. (1988) Ргос. №и1. Асай. 8с1. И8А 85:5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также определяются термином "антигенсвязывающая детерминанта" антитела. Другие формы одноцепочечных антител, такие как диатела, также включены. Диатела являются бивалентными, биспецифичными антителами, в которых домены УН и УЪ выражены на одной полипептидной цепи, но с использованием линкера, который является слишком коротким, чтобы позволить спаривание между двумя доменами одной цепи, тем самым вынуждая домены пароваться с комплементарными доменами другой цепи и создавать два сайта связывания антигена (см., например, НоШдет, Р., е1 а1. (1993) Ргос. №ιΐ1. Асай. 8с! И8А 90:6444-6448; РоЦак, К. 1., е1 а1. (1994) §1тис- 6 029793

(иге 2:1121-1123). Более того, антитело или его антигенсвязывающая детерминанта могут быть частью более крупных молекул иммуноадгезии, образованных ковалентной или нековалентной ассоциацией антитела или детерминанты антитела с одним или несколькими другими белками или пептидами. Примеры таких молекул иммуноадгезии включают использование области ядра стрептавидина для получения тетрамерной молекулы 8сРу (Карпуамоу δ.Μ. е! а1. (1995) Нитап ЛпПЬоШсх апб НуЬпботак 6:93-101) и использование остатка цистеина, маркерного пептида и С-концевой полигистидиновой метки для получения бивалентных и биотинилированных молекул 8сРу (Κίρπναηον δ.Μ. е! а1. (1994) Мо1. 1ттипо1., 31:1047-1058). Детерминанты антител, такие как РаЬ и Р(аЬ')₂-фрагменты могут быть получены из целых антител с использованием традиционных способов, таких как расщепление папаином или пепсином, соответственно, целых антител. Более того, антитела, детерминанты антител и молекулы иммуноадгезии могут быть получены с использованием стандартных способов с применением рекомбинантной ДНК, как описано в настоящем документе. Предпочтительными антигенсвязывающими детерминантами являются полные домены или пары полных доменов.

ОХ40/лиганд ОХ40 (рецептор ОХ40)/(ОХ40Ь) представляют собой пару костимулирующих молекул, являющихся важными для Т-клеточной пролиферации, выживаемости, продукции цитокинов и формирования клеток памяти. Предыдущие эксперименты ίη νίίΓΟ показали, что активация через ОХ40 на СЭ4' Т-клетках приводила к формированию ТН2, но не формированию ТН1. Эти результаты нашли поддержку в исследованиях ίη νίνο, которые продемонстрировали, что блокирование взаимодействия ОХ40/ОХ40Ь предотвращало индукцию и поддержание ТН2-опосредованных аллергических иммунных ответов. Тем не менее, блокирование взаимодействия ОХ40/ОХ40Ь улучшает или предотвращает ТН1опосредованные заболевания. Кроме того, прием растворимого ОХ40Ь или перенос генов ОХ40Ь в опухоли продемонстрировали сильное повышение противоопухолевого иммунитета у мышей. Недавние исследования также позволяют предположить, что ОХ40/ОХ40Ь могут играть роль в промотировании СЭ8 Т-клеточного иммунного ответа. Как уже говорилось в настоящем документе, активация ОХ40 блокирует ингибирующую функцию натуральных ί'.Ό4'ί'.Ό25' регуляторных Т-клеток и пара ОХ40/ОХ40Ь играет важную роль в глобальной регуляции периферического иммунитета против толерантности.

Термин "нумерация КаЬа!", "определение КаЬа!" и "маркировка КаЬа!" используются в настоящем документе взаимозаменяемо. Эти термины, которые приняты в данной области, относятся к системе нумерации аминокислотных остатков, которые являются более вариабельными (т. е. гипервариабельными) по сравнению с другими аминокислотными остатками вариабельных областей тяжелой и легкой цепи антитела или его антигенсвязывающей детерминанты (КаЬа! е! а1. (1971) Αηη. ΝΥ Асаб, δα. 190:382-391 и, КаЬа!, Е. А., е! а1. (1991) δе^иеηсе8 о£ Рго!еш8 о£ Iттиηο1οд^са1 Шсгек!, ΡίΠΙι Ε6ί!ίοη, υ.δ. ОераЦтеШ о£ Неа1!Ь апб Нитаη δе^ν^се8, ΝΙΗ РиМка!^ №. 91-3242).

Выражение "рекомбинантное антитело человека" включает антитела человека, которые подготовлены, экспрессированы, созданы или выделены с помощью рекомбинантных способов, таких как антитела, экспрессированные с использованием рекомбинантного вектора экспрессии, перенесенного в клеткухозяина, антитела, выделенные из рекомбинантной комбинаторной библиотеки антител человека, антитела, выделенные из животных (например, мышиные), которые являются трансгенными по генам иммуноглобулинов человека (см., например, Тау1ог, Ь. Ό., е! а1. (1992) №с1. Аабк Кек. 20:6287-6295) или антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любым другим способом, которые используют сплайсинг нуклеотидных последовательностей гена иммуноглобулина человека в другие последовательности ДНК. Такие рекомбинантные антитела человека имеют вариабельные и константные области, полученные из последовательностей зародышевых линий иммуноглобулина человека (см. КаЬа!, Е. А., е! а1. (1991) δе^иеηсе8 о£ Рго!еш8 о£ Iттиηο1οд^са1 Шегек!, Р1ЙЬ Еббющ υ.δ. ОераПтеШ о£ Неа1!Ь апб Ηитаη δе^ν^се8, ΝΙΗ РиМка!^ №. 91-3242).

"Выделенное антитело" включает антитело, которое, по существу, не содержит других антител, имеющих различные антигенные особенности (например, выделенное антитело, которое специфически связывается с ЬОХ40, практически не содержит антитела, которые специфически связываются с антигенами, отличными ЮХ40). Выделенное антитело, которое специфически связывается с ЬОХ40, может связываться с молекулами ОХ40 других видов. Кроме того, выделенное антитело может быть, по существу, свободно от другого клеточного материала и/или химических веществ.

Термин "активность" включает такие свойства, как специфичность/аффинность связывания антитела с антигеном, например, антитело к ОХ40 человека, которое связывается с антигеном ОХ40 и/или активационная сила антитела, например антитело к ОХ40, чье связывание с рецептором ЬОХ40 активирует биологическую активность ЬОХ40 или активацию рецепторного связывания в Ь/ОХ40-клеточном анализе человека.

Термин "К_о££", используемый в настоящем документе, предназначен для определения константы скорости диссоциации антитела из комплекса антитело/антиген. Термин "К_б", используемый в настоящем документе, предназначен для обозначения константы диссоциации конкретного взаимодействия антиген-антитело.

Выражение "поверхностный плазмонный резонанс" включает оптическое явление, которое позволяет проводить анализ биоспецифичных взаимодействий в режиме реального времени путем выявления

- 7 029793

изменений в концентрации белка в биосенсорной матрице, например, с помощью системы В1Асоге (РЬагтас1а Вюкеиког АВ, Ирр5а1а, 8\уебеп апб Р15са1а\уау, N.1.). Для дальнейших описаний, см. пример 5 и 1оп55оп, и., е! а1. (1993) Апп. ΒίοΙ. С1ш. 51:19-26; 1оп55оп, и., е! а1. (1991) Вю!есЬтдие5 11:620-627; 1окп55оп, В., е! а1. (1995) 1. Мо1. Кесодт!. 8:125-131; и 1оЬпи5оп, В., е! а1. (1991) Апа1. Вюскет. 198:268277.

Термин "вектор" включает молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, к которой она была присоединена. Одним типом вектора является "плазмида", которая относится к кольцевой двухцепочечной ДНК-петле, в которую могут лигироваться дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, где дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они встроены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальную точку начала репликации и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяина и, таким образом, реплицируются вместе с геномом хозяина. Кроме того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы в настоящем документе называются "рекомбинантные векторы экспрессии" (или просто "векторы экспрессии"). В общем, векторы экспрессии, применяемые в технологии рекомбинантных ДНК, часто находятся в форме плазмид. В настоящем описании изобретения "плазмида" и "вектор" могут быть использованы взаимозаменяемо, поскольку плазмида является наиболее часто используемой формой вектора. Тем не менее, подразумевается, что изобретение включает такие другие формы векторов экспрессии как вирусные векторы (например, ретровирусы с дефективной репликацией, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые выполняют эквивалентные функции.

Фраза "рекомбинантная клетка-хозяин" (или просто "клетка-хозяин") включает клетку, в которую был введен рекомбинантный вектор экспрессии. Следует понимать, что такие термины предназначены не только для обозначения конкретной клетки, но и для потомства такой клетки. Поскольку могут произойти некоторые изменения в последующих поколениях вследствие либо мутации, либо влияний окружающей среды, такое потомство может не быть на самом деле идентичным родительской клетке, но попрежнему включено в объем термина "клетка-хозяин", используемого в настоящем документе.

Термин "моноклональное антитело" (моноклональное антитело) относится к антителу или популяции других антител, полученных из популяции по существу гомогенных антител и не должно быть истолковано как императивное получение антитела каким-либо конкретным способом, включая, но не ограничиваясь этим, моноклональные антитела, которые могут быть получены гибридомным способом, впервые описанным КоЫег апб МЙ5!еш (№!иге, 256: 495-497, 1975), или способами рекомбинантной ДНК. Термин "химерное антитело" (или "химерный иммуноглобулин") относится к молекуле, содержащей тяжелую и/или легкую цепь, которая идентична или гомологична соответствующим последовательностям антител, полученным от конкретного вида или принадлежащих к антителами определенного класса или подкласса, в то время как остальная часть цепи (цепей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям антител, полученным от другого вида или принадлежащим к антителам другого класса или подкласса, а также фрагменты таких антител, при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность (СаЫ11у е! а1. (1984), 1пГга; Мот5оп е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8сг И.8.А. 81:6851).

Термин "гуманизированное антитело" относится к формам антител, которые содержат последовательности из нечеловеческих (например, мышиных) антител, а также антител человека. Гуманизированное антитело может включать консервативные аминокислотные замены или ненатуральные остатки одного и того же или других видов, которые существенно не изменяют своей связывающей и/или биологической активности. Такие антитела представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, полученную из нечеловеческих иммуноглобулинов. По большей части гуманизированные антитела представляют собой иммуноглобулины человека (антитело-реципиент), в которых остатки гипервариабельной области (СОК) реципиента заменены остатками СОК нечеловеческих видов (антитело-донор), таких как мышь, крыса, верблюд, крупный рогатый скот, коза или кролик, имеющих требуемые свойства. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не найдены ни в антителе-реципиенте, ни в импортированной СОК или каркасных участках. Эти модификации сделаны для дальнейшего улучшения и максимизации параметров антитела. Как правило, гуманизированное антитело будет содержать, по существу, все по меньшей мере из одного и, как правило, из двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все гипервариабельные петли соответствуют таковым нечеловеческого иммуноглобулина и все или по существу все области РК из последовательности иммуноглобулина человека. Также гуманизированное антитело необязательно будет содержать по меньшей мере участок константной области (Рс) иммуноглобулина, как правило, константной области иммуноглобулина человека (см., например, СаЪШу е! а1., и.8. Ра!. №. 4,816,567; СаЫ11у е! а1., Еигореап Ра!еп! №. 0,125,023 В1; Во55 е! а1., и.8. Ра!. №. 4,816,397; Во55 е! а1., Еигореап Ра!еп! №. 0,120,694 В1; №иЪегдег, М. 8. е! а1., \УО 86/01533; №иЪегдег, М. 8. е! а1., Еигореап Ра!еп! №. 0,194,276 В1; \Уш1ег. и.8. Ра!. №. 5,225,539; \Уш1ег. Еигореап Ра!еп! №. 0,239,400 В1; Раб1ап, Е. А. е! а1., Еигореап

- 8 029793

Ра!еп! АррбсаНоп Νο. 0,519,596 А1; Онееп е! а1. (1989) Ргос. N11. Асаб. δοί. И8А, Уо1 86:10029-10033).

Каждое из антител, описанных и заявленных в настоящем документе, могут быть переданы в единственном или множественном числе, как: "антитело к ОХ40"; "антитело к 60X40"; "моноклональное антитело к 60X40"; "антитело к 0X40 человека"; "МАт к 0X40 человека"; "МАт к 60X40"; "специфичное моноклональное антитело к 60X40"; "антитело к 0X406"; "антитело к 60X406"; "антитело к 0X406 человека"; "специфичное антитело к 0X40 человека"; "специфичное моноклональное антитело к 0X40 человека"; "специфичное антитело к 0X40 человека"; "античеловеческое 0X40 специфичное антитело"; "моноклональное специфичное антитело к 0X40 человека"; "специфичное антитело к 6-ОХ40"; "специфичное моноклональное антитело к 6-ОХ40"; "агонистическое антитело к 60X40"; "антагонист 60X40" и/или другие подобные вариации их же.

Как описано в заявке на патент США 11/659266 под названием "Ме!6об8 !о Тгеа! Эбеахе §1а1е8 Ьу 1пГ1иепс1п§ !6е 81дпа1шд оГ 0X-40-Κесерΐο^8 апб Нф6 Т6гоид6ри! §сгеешпд Ме!6обх апб 1бепбГутд §цЬ81та1е8 Т6егеоГ", которая включена в настоящий документ в качестве ссылки, было обнаружено, что функцией 0X406 является негативная регуляция формирования Тг1-клеток, индуцированного иммуносупрессивными препаратами дексаметазоном и Витамином Ό₃, 1С08Ь или незрелыми ДК. Это открытие демонстрирует общий механизм, посредством которого 0X406 повышает иммунитет и нарушает иммунологическую толерантность.

С помощью иммуногистологического анализа (фиг. 1), внутриклеточного окрашивания (фиг. 2) и сортировки клеток (фиг. 3) мы показали, что как ИЛ-10-продуцирующие 1С08+, так и 1С08-Т0Р-Рпродуцирующие Тгед8 инфильтрировали ткани ФЛ человека. Эти ФЛ-опосредованные Ρ0XР3⁺ Тгед8 могут сильно ингибировать пролиферацию инфильтрирующих опухоль Ρ0XР3^-С^4⁺С^25^- Т-клеток в ответ на предварительно активированные лигандом СЭ40^-аутологичные клети лимфомы (фиг. 4). Супрессивная активность 1С08+ Тгед8 может быть частично заблокирована нейтрализующим анти-ИЛ-10 антителом, подтверждая роль ИЛ-10-продуцирующих 1С08+ Тгед8 в ФЛ (фиг. 4). В эксперименте на фиг. 2 опухолевые клетки и МКПК были получены от 7 больных с начальной диагностикой до лечения. МКПК были также получены от 7 здоровых доноров для сравнения. Проценты регуляторных Т-клеток в общем числе СЭ4' Т-клеток определяли с помощью проточного цитометрического анализа С^4⁺С^25⁺С^127^1ο"ΡΟXР3⁺ Тгед8. Фиг. 2А демонстрирует репрезентативный РАС8 анализ Тгед8, а фиг. 2В демонстрирует процент Тгед8 всех доноров.

Было также обнаружено, что 0X406 ингибирует формирование Тг1-клеток из СЭ4' Т-клеток, индуцированное дексаметазоном и витамином Ό₃. Известно, что сочетание иммуносупрессивных препаратов дексаметазона и витамина Ό₃ устойчиво индуцирует дифференцировку наивных СЭ4' Т-клеток в Тг1клетки. Чтобы исследовать, может ли 0X406 ингибировать формирование и функцию Тг1-клеток, наивные СЭ4' Т-клетки культивировали с моноклональными анти-СЭ3 плюс анти-СЭ28 антителами в присутствии или в отсутствии 0X40^-трансфицированных Ь-клеток в четырех различных условиях культивирования, включая: (1) Тг1 (дексаметазон и витамин Ό₃), (2) ТН1 (ИЛ-12), (3) ТН2 (ИЛ-4), или (4) нейтральное (только среда) в течение 7 дней (фиг. 5А). Продукция ИЛ-10 примированными Т-клетками была проанализирована внутриклеточным окрашиванием цитокинов и ЕЬРЗА.

В экспериментах на фиг. 5А был проведен внутриклеточный анализ продукции цитокинов наивными СЭ4' Т-клетками методом проточной цитометрии. Наивные СЭ4' Т-клетки культивировали с моноклональными анти-СЭ3 и анти-СЭ28 антителами в присутствии ИЛ-2 на родительских Ь-клетках или ОХ406-Ь-клетках с указанными рекомбинантными цитокинами или реагентами 7 дней. Проценты соответствующих цитокин-продуцирующих Т-клеток указаны в каждом профиле дот-блот. Результаты показывают, что 0X406 ингибирует формирование Тг1-клеток из наивных СЭ4' Т-клеток, индуцированное различными поляризационными сигналами. Как показано на фиг. 5 А от 2 до 4% Тг1-клеток были получены из наивных СЭ4' Т-клеток, культивированных в нейтральных или ТН1, или ТН2 условиях. Более 15% Тг1-клеток были получены в культуре с дексаметазоном плюс витамин Ό₃. Добавление 0X406 полностью блокировало формирование Тг1-клеток, а также содействовало образованию ФНО-апродуцирующих Т-клеток во всех культуральных условиях.

Эти данные были подтверждены данными ЕЫ8А (фиг. 5В). В экспериментах на фиг. 5В продукция цитокинов наивными СЭ4' клетками в супернатантах после повторной стимуляции моноклональными анти-СЭ3 и анти-СЭ28 антителами в течение 24 ч была измерена с помощью ЕЬРЗА. Наивные СЭ4' Тклетки культивировали с моноклональными анти-СЭ3 и анти-СЭ28 антителами в присутствии ИЛ-2 на родительских Ь-клетках или ОХ406-Ь-клетках с указанными рекомбинантными цитокинами или реагентами 7 дней. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего (8ЕМ) четырех независимых экспериментов. Результаты показывают, что 0X406 ингибирует формирование Тг1-клеток из наивных СЭ4' Т-клеток, индуцированное различными поляризационными сигналами.

Наивные СЭ4' Т-клетки, примированные условиями Тг1 (дексаметазон плюс витамин Ό₃) были энергичны и имели способность подавлять пролиферацию наивных СЭ4' Т-клеток в ответ на моноклональные анти-СЭ3 плюс анти-СО28 антитела (фиг. 5С). В экспериментах на фиг. 5С супрессивную функцию Т-клеток измеряли поглощением [³Н]тимидина. Смеси указанных Т-клеточных популяций бы- 9 029793

ли повторно стимулированы моноклональными анти-СЭЗ и анти-СЭ28 антителами. Планки погрешностей представляют §ЕМ для трех лунок. Было обнаружено, что наивные СЭ4' Т-клетки, примированные теми же условиями Тг1 в присутствии ОХ40Ь, энергично пролиферировали и не ингибировали пролиферацию наивных СЭ4' Т-клеток в ответ на моноклональные анти-СЭЗ плюс анти-СЭ28 антитела. Полученные данные свидетельствуют о том, что ОХ40Б блокирует формирование функциональных Тг1клеток из наивных СЭ4' Т-клеток, индуцированное дексаметазоном и витамином Ό₃.

Было обнаружено, что Тг1-клетки могут быть получены из СО4⁺СО45КА^-СО45КО⁺ Т-клеток памяти и что ОХ40Б может подавлять формирование Тг1-клеток из СЭ4' Т-клеток памяти. СО4⁺СО45КА СО45РО' Т-клетки памяти культивировали в течение 7 дней с моноклональными анти-СЭЗ плюс антиСЭ28 антителами в присутствии или в отсутствии ОХ40Ь-трансфицированных Ь-клеток в условиях Тг1 (дексаметазон плюс витамин Ό3). В экспериментах фиг. 6А внутриклеточный анализ продукции цитокинов СЭ4' Т-клетками памяти проводился методом проточной цитометрии. СО4'СО45РО'СЭ25^- Т-клетки памяти культивировали с моноклональными анти-СО3. анти-СЭ28 антителами и ИЛ-2 на родительских Ь-клетках или ОХ40Е-Ь-клетках в присутствии или отсутствии дексаметазона плюс витамин Ό3 в течение 7 дней. Проценты соответствующих цитокин-продуцирующих Т-клеток указаны в каждом профиле дот-блот. Результаты показывают, что ОХ40Б ингибирует формирование Тг1-клеток из СЭ4' Т-клеток памяти в условиях с дексаметазоном плюс витамин Ό₃. Фиг. 6А показывает, что большое количество Тг1клеток (>20%) сформировалось из СЭ4' Т-клеток памяти в культуре с дексаметазоном плюс витамин Ό₃. Добавление ОХ40Б полностью блокировало формирование Тг1-клеток и способствовало формированию ФНО-а-продуцирующих клеток из СЭ4' Т-клеток памяти.

Способность дексаметазона плюс витамин Ό₃ активировать продукцию ИЛ-10 СЭ4' Т-клетками памяти и что эта способность может быть ингибирована ОХ40Б, было подтверждено анализами ИЛ-10 ЕЫ§А (фиг. 6В). В экспериментах на фиг. 6В продукция ИЛ-10 СЭ4+ Т-клетками памяти была измерена в супернатантах после повторной стимуляции с моноклональными анти-СО3 и анти-СО28 антителами в течение 24 ч при помощи ЕЬРЗА. Данные представлены как среднее ± 8ЕМ четырех независимых экспериментов. Результаты демонстрируют, что ОХ40Б ингибирует формирование Тг1-клеток из СЭ4' Тклеток памяти в условиях с дексаметазоном плюс витамин Ό₃.

Кроме того, было обнаружено, что ОХ40Б ингибирует формирование Тг1-клеток, в то время как другие члены семейства ТИЕ не ингибируют (С1ТКЬ и 4-1ВВЬ). В суперсемействе ТИЕ ОХ40Ь, лиганд индуцируемого глюкокортикоидами ТИЕ-рецептора (С1ТКЬ) и лиганд 4-1ВВ (4-1ВВЬ) обладают костимуляторной функцией для Т-клеток. Чтобы исследовать, был ли ОХ40Ь уникальным в ингибировании Тг1-клеток, наивные СЭ4' Т-клетки культивировали с моноклональными анти-СЭЗ плюс анти-СО28 антителами с дексаметазоном плюс витамин Ό₃, с родительскими Ь-клетками или Ь-клетками, трансфицированными ОХ40Ь, С1ТРЬ или 4-1ВВЬ в течение 7 дней. В то время как ОХ40Ь, С1ТКЬ и 4-1ВВЬ все способствовали образованию ФНО-а-продуцирующих клеток, только ОХ40Ь ингибировал формирование Тг1-клеток (фиг. 7А и 7В).

В экспериментах на фиг. 7 А внутриклеточный анализ продукции цитокинов наивными СЭ4' Тклетками был проведен методом проточной цитометрии. Наивные СЭ4' Т-клетки культивировали с моноклональными анти-СЭ3, анти-СО28 антителами и ИЛ-2 на родительских Ь-клетках, ОХ40Ь-Ьклетками, О1ТКЕ-Ь-клетками или 4-1ВВЬ-Ь-клетками в присутствии дексаметазона плюс витамин Ό₃ в течение 7 дней. Проценты соответствующих цитокин-продуцирующих Т-клеток указаны в каждом профиле дот-блот. Результаты показывают, что ОХ40Ь, но ни О1ТКЕ, ни 4-1ВВЬ, подавляет формирование Тг1-клеток.

В экспериментах на фиг. 7В ИЛ-10 наивных СЭ4' клеток был измерен в супернатантах после повторной стимуляции с моноклональными анти-СЭ3 и анти-СО28 антителами в течение 24 ч с помощью ЕЫ§А. Данные представлены как среднее ± 8ЕМ четырех независимых экспериментов. Результаты показывают, что ОХ40Ь, но ни О1ТРЬ, ни 4-1ВВЬ, подавляет формирование Тг1-клеток.

ОХ40Ь, С1ТКЬ и 4-1ВВЬ все способствовали повышению общего количества Т-клеток (фиг. 7С). В экспериментах на фиг. 7С подсчитывали количество жизнеспособных Т-клеток. Данные представлены как среднее ± 8ЕМ четырех независимых экспериментов.

Как понятно специалистам в данной области, результаты на фиг. 7 А, 7В и 7С показывают, что ОХ40Ь, но ни С1ТРЬ, ни 4-1ВВЬ, подавляет формирование Тг1-клеток. Эти данные позволяют предположить, что среди трех членов суперсемейства ТИЕ, которые костимулируют Т-клетки, ОХ40Ь имеет новую и уникальную функцию ингибирования образования Тг1-клеток.

Кроме того, было обнаружено, что ОХ40Ь ингибирует формирование Тг1-клеток, индуцированное 1СО8Ь или незрелыми ДК. 1СО8 и СО28 представляют собой два положительных костимулирующих рецептора в семействе СО28, экспрессируемых на Т-клетках. Было показано, что активация через 1СО8 агонистическими антителами или 1СО8Ь промотирует СЭ4' Т-клетки продуцировать ИЛ-10. Чтобы исследовать, может ли ОХ40Ь ингибировать способность 1СО8 стимулировать продукцию ИЛ-10 СЭ4' Т-клетками, наивные и СЭ4' Т-клетки памяти культивировали с антн-СЭЗ в присутствии 1СО5>Б-трансфицированных Ь-клеток или 1СО5>Б-трансфицированных Ь-клеток в присутствии ОХ40Ь течение 7 дней.

- 10 029793

В экспериментах на фиг. 8 А внутриклеточный анализ продукции цитокинов наивными СБ4⁺ Тклетками был проведен методом проточной цитометрии. Наивные СБ4⁺ Т-клетки культивировали в течение 7 дней на родительских Ь-клетках, на смеси 1СО8Ь-Ь-клеток и Ь-клеток или на смеси 1СО8Ь-Ьклеток и ОХ40Ь-Ь-клеток, которые были предварительно покрыты моноклональным анти-СБ3 антителом. Проценты соответствующих цитокин-продуцирующих Т-клеток указаны в каждом профиле дотблот. Результаты показывают, что ОХ40Ь ингибирует формирование Тг1-клеток из наивных СБ4⁺ Тклеток, индуцированных 1СО8Ь.

В экспериментах на фиг. 8В продукция ИЛ-10 наивными СБ4⁺ клетками была измерена в супернатантах после повторной стимуляции моноклональными анти-СБ3 и анти-СБ28 антителами в течение 24 часов с помощью ЕЬЬЗА. Наивные СБ4⁺ Т-клетки культивировали в течение 7 дней на родительских Ьклетках, на смеси 1СО8Ь-Ь-клеток и Ь-клеток или на смеси 1СО8Ь-Ь-клеток и ОХ40Ь-Ь-клеток, которые были предварительно покрыты моноклональным анти-СБ3 антителом. Данные представлены как среднее ± 8ЕМ трех независимых экспериментов. Результаты показывают, что ОХ40Ь ингибирует формирование Тг1-клеток из наивных СБ4⁺ Т-клеток, индуцированных 1СО8Ь.

В экспериментах на фиг. 8С внутриклеточный анализ продукции цитокинов СБ4⁺ Т-клетками памяти был проведен методом проточной цитометрии. СБ4⁺ Т-клетки памяти культивировали в течение 7 дней на родительских Ь-клетках, на смеси 1СО8Ь-Ь-клеток и Ь-клеток или на смеси 1СО8Ь-Ь-клеток и ОХ40Ь-Ь-клеток, которые были предварительно покрыты моноклональным анти-СБ3 антителом. Проценты соответствующих цитокин-продуцирующих Т-клеток указаны в каждом профиле дот-блот. Результаты показывают, что ОХ40Ь ингибирует формирование Тг1-клеток из СБ4⁺ Т-клеток памяти, индуцированных 1СО8Ь.

В экспериментах на фиг. 8Ό продукция ИЛ-10 СБ4⁺ Т-клетками памяти была измерена в супернатантах после повторной стимуляции моноклональными анти-СБ3 и анти-СБ28 антителами в течение 24 ч при помощи ЕЬЬЗА. СБ4⁺ Т-клетки памяти культивировали в течение 7 дней на родительских Ьклетках, на смеси 1СО8Ь-Ь-клеток и Ь-клеток или на смеси 1СО8Ь-Ь-клеток и ОХ40Ь-Ь-клеток, которые были предварительно покрыты моноклональным анти-СБ3 антителом. Данные представлены как среднее ± 8ЕМ трех независимых экспериментов. Результаты показывают, что ОХ40Ь ингибирует формирование Тг1-клеток из СБ4⁺ Т-клеток памяти, индуцированных 1СО8Ь.

Результаты экспериментов на фиг. 8А, 8В, 8С и 8Ό показывают, что 1СО8Ь значительно способствовал образованию Тг1-клеток как из наивных, так и из СБ4⁺ Т-клеток памяти. Добавление ОХ40Ь полностью ингибировало формирование Тг1-клеток как из наивных, так и из СБ4⁺ Т-клеток памяти, в то же время значительно промотируя формирования ФНО-а-продуцирующих клеток.

Известно, что незрелые ДК или ДК, обработанные ИФН-α или ИЛ-10, могут индуцировать наивные СБ4⁺ Т-клетки к дифференцировке в Тг1-клетки. Было исследовано, может ли ОХ40Ь ингибировать формирование Тг1-клеток, индуцированное ДК. Как показано на фиг. 8Е, незрелые ДК или ДК, обработанные ИФН-α или ИЛ-10, все индуцировали формирование Тг1-клеток из наивных СБ4⁺ Т-клеток более, чем на 10%. В противоположность этому ДК, активированные СБ40Ь, индуцируют сильный ТН1ответ, сопровождавшийся формированием около 3% Тг1-клеток. Добавление рекомбинантного ОХ40Ь в ДК-Т-клеточные культуры полностью ингибировало формирование Тг1-клеток, индуцированное незрелыми ДК и ДК, обработанными ИЛ-10 и ИФН-α. Кроме того, ОХ40Ь также ингибировало формирование остаточного количества Тг1-клеток, индуцированное СБ40Ь-активированными зрелыми ДК. В экспериментах на фиг. 8Е внутриклеточный анализ продукции цитокинов наивными СБ4⁺ Т-клетками был проведен методом проточной цитометрии. Наивные СБ4⁺ Т-клетки сокультивировали в присутствии или в отсутствие растворимого рекомбинантного ОХ40Ь в течение 7 дней с незрелыми ДК или ДК, культивированными с ИФН-α, ИЛ-10 и СБ40Ь. Проценты соответствующих цитокин-продуцирующих Т-клеток указаны в каждом профиле дот-блот. Результаты показывают, что ОХ40Ь ингибирует формирование Тг1клеток из СБ4⁺ Т-клеток, индуцированных ДК.

Способность ОХ40Ь ингибировать формирование Тг1-клеток, индуцированное ДК, была подтверждена данными ЕЫ8А (фиг. 8Р). В экспериментах на фиг. 8Р продукция ИЛ-10 наивными СБ4⁺ клетками была измерена в супернатантах после повторной стимуляции с моноклональными анти-СБ3 и антиСБ28 антителами в течение 24 ч при помощи ЕЫ8А. Наивные СБ4⁺ Т-клетки сокультивировали в присутствии или в отсутствие растворимого рекомбинантного ОХ40Ь в течение 7 дней с незрелыми ДК или ДК, культивированными с ИФН-α, ИЛ-10 и СБ40Ь. Данные представлены как среднее ± 8ЕМ трех независимых экспериментов. Результаты показывают, что ОХ40Ь ингибирует формирование Тг1-клеток из СБ4⁺ Т-клеток, индуцированных ДК. Таким образом, эти данные показывают, что ОХ40Ь может ингибировать формирование Тг1-клеток, индуцированное большим количеством физиологических сигналов, передаваемыми 1СО8Ь и ДК.

Ранее было предположено, что регуляторные Т-клетки высоко представлены в В-клеточной области неходжкинской лимфомы и что В-клетки участвуют в накоплении регуляторных Т-клеток в области лимфомы. Было исследовано может ли влияние на активацию рецептора ОХ40, например, при помощи ОХ40Ь, обеспечить терапию против В-клеточной лимфомы.

- 11 029793

Криоконсервированные образцы от пациентов с В-клеточной лимфомой были использованы для оценки способности ОХ40Ь отключать Тг1-клетки. Используемыми образцами была фолликулярная лимфома, полученная из образца селезенки до какого-либо лечения. Клетки оттаивали, из 400х10⁶ замороженных клеток получали 127х10⁶ живых клеток и 33,9х10⁶ мертвых клеток (79% выживаемости). Достаточное количество СЭ25' клеток было выявлено путем РАС8 окрашивания. В экспериментах на фиг. 9 секрецию ИЛ-10 ИЛ-10-продуцирующими 1СО8+ Тгедк определяли при помощи ЕЫ8А. Тгед клетки культивировали в двух различных условиях. В условии 1 клетки СЭ25 '/1СО8' культивировали с антиСЭ3 в присутствии ИЛ-2 (900 мкл/мл) на родительских Ь-клетках или ОХ40Ь-Ь-клетках с анти-1СО8антителом в течение 3-6 дней. В условии 2, клетки СЭ25+/1СО8+ культивировали с анти-СЭЗ в присутствии ИЛ-2 (900 мкл/мл) на 1СО8-Ь-Ь-клетках или смеси ОХ40Ь-Ь инфильтрированных 1СО8-Ь-Ь-клеток от 3 до 6 дней. Продукцию цитокинов в супернатантах измеряли при помощи ЕЫ8А. Результаты показывают, что ОХ40Ь значительно ингибирует продукцию ИЛ-10 Тгед-клетками.

Полученные результаты того, что ОХ40Ь имеет способность ингибировать формирование и функцию Тг1-клеток, индуцированные иммуносупрессивными препаратами дексаметозоном плюс витамин Ό3, 1СО8Ь или ДК, подчеркивает новый механизм, с помощью которого ОХ40Ь повышает иммунитет и нарушает толерантность в различных формах СЭ4- или СЭ8-опосредованных иммунных ответов, что понятно специалистам в данной области. Способность ОХ40Ь ингибировать формирование Тг1-клеток во время как и ИЛ-12-индуцированных ТН1, так и ИЛ-4-индуцированных ТН2 ответов дает основания предполагать, что ОХ40Ь может контролировать силу ТН1- или ТН2-опосредованных иммунных ответов. Кроме того, способность ОХ40Ь ингибировать формирование Тг1-клеток представляется уникальным свойством ОХ40Ь, поскольку два других члена семейства ТОТ¹ - О1ТКЬ и 4-1ВВЬ не имеют этого функционального свойства. Более того, способность ОХ40Ь ингибировать продукцию ИЛ-10 Тгед-клетки определяет ОХ40Ь как сильное лекарство против В-клеточной лимфомы и других видов рака.

Были выявлены многие молекулы, которые промотируют образование Тг1-клеток, включая ИЛ-10, ИФН-α, 1СО8Ь и иммуносупрессивные соединения, такие как дексаметазон плюс витамин Ό₃. ОХ40Ь представляет собой мощный ингибитор образования Тг1-клеток не только из наивных СЭ4' Т-клеток, но и из СЭ4' Т-клеток памяти и регуляторных Т-клеток. Это новое свойство ОХ40/ОХ40Б может объяснить недавний отчет, показывающий, что активация ОХ40 позволяет анергическим аутореактивным Тклеткам приобрести эффекторные клеточные функции. Таким образом, таргетинг ОХ40/ОХ40Б обеспечивает лекарственные средства против аллергических и аутоиммунных заболеваний человека, а также для разработки препаратов для лечения инфекционных заболеваний человека и рака, включая, но не ограничиваясь этим, меланому, рак мозга, рак кости, лейкоз, лимфому, эпителиальную неоплазию (эпителиальный рак), такую как базальноклеточная карцинома, аденокарцинома, рака желудочно-кишечного тракта, такой как рак губы, рак полости рта, рак пищевода, рак тонкой кишки и рак желудка, рак толстой кишки, рак печени, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак яичников, рак шейки матки, рак легкого, рак молочной железы и рак кожи, такой как плоскоклеточный рак и базальный рак, рак предстательной железы, почечно-клеточная карцинома и другие известные виды рака.

Нарушения или состояния, которые можно предотвратить или лечить антителами и способами, описанными в настоящем документе, включают профилактику или лечение рака, такого как кожный Тклеточный лейкоз, опухоли головы и шеи, рак поджелудочной железы, рак мочевого пузыря, глиома высокой степени злокачественности, метастазы мозга, меланома, рак кожи, рак легкого, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак толстой кишки, лейкоз, миелодиспластический синдром (предлейкозное состояние) и множественная миелома. В общем, метастазы любого рака возможно предотвратить или лечить соединениями и способами, описанными в настоящем документе. Антитела также могут быть использованы для предотвращения или лечения пролиферативных состояний кровеносных сосудов, включая талангэктазию, венозные ангиомы, гемангиобластому. Другие нарушения, заболевания или состояния включают вирусные заболевания, некоторые из которых могут традиционно считаться "неизлечимыми". Антитела, например, могут также быть использованы для классификации штаммов одного патогена. Исследователи могут использовать антитела, описанные в настоящем документе, чтобы идентифицировать и отслеживать специфические клетки или молекулы в организме.

Как правило, термин "рак" и "раковый" относятся или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, которое обычно характеризуется неконтролируемым ростом клеток. В частности рак, который можно лечить или предотвращать при помощи одного или более антител, описанных в настоящем документе, или их вариантов, включает, но не ограничивается этим, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз. Более конкретные примеры такого рака включают в качестве неограничивающих примеров плоскоклеточный рак, рак легких (в том числе мелкоклеточный рак легких, немелкоклеточный рак легких, аденокарцинома легких и плоскоклеточный рак легких), рак брюшины, гепатоцеллюлярный рак, рак желудка (в том числе рак желудочно-кишечного тракта и гастроинтестинальный стромальный рак), рак поджелудочной железы, глиобластома, рак шейки матки, рак яичников, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатома, рак молочной железы, рак толстой кишки, колоректальный рак, карцинома эндометрия или карцинома матки, карцинома слюнной железы, рак почки и ренальный рак, рак печени, рак

- 12 029793

предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, карцинома печени и различные типы рака головы и шеи, меланома, поверхностно-распространяющаяся меланома, меланома типа злокачественного лентиго, акральные лентигинозные меланомы, узловые меланомы, а также В-клеточная лимфома (в том числе низкодиффереинцированная/фолликулярная неходжкинская лимфома (НХЛ); мелколимфоцитарная (МЛ) НХЛ, средней диффереинциации/фолликулярная НХЛ, диффузная НХЛ средней диффереинциации, иммунобластная злокачественная НХЛ, лимфобластная злокачественная НХЛ, злокачественная мелкоклеточная НХЛ с нерасщепленным ядром, генерализованная лимфаденопатическая НХЛ; лимфома клеток мантии; СПИД-ассоциированная лимфома; и макроглобулинемия Вальденстрема; хронический лимфолейкоз (ХЛЛ); острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ); волосатоклеточный лейкоз, хронический миелобластный лейкоз; и посттрансплантационное лимфопролиферативное заболевание (ΡΊΈΌ), а также анормальная пролиферация сосудов, связанная с факоматозом, отек (например, ассоциированный с опухолями головного мозга) и синдром Мейгса.

Способы лечения или профилактики иммунного нарушения также приведены в настоящем документе. Эти способы включают введение эффективного количества антитела субъекту, нуждающемуся в таком лечении. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммунологическое нарушение это иммунологическое нарушение или аутоиммунологическое нарушение. Этим нарушением является астма, атопический дерматит, аллергический ринит, воспалительное заболевание кишечника, рассеянный склероз, РТПХ и/или системная красная волчанка. В некоторых вариантах осуществления изобретения нарушение - это заболевание, ассоциированное с вирусом, бактериями или другим инфекционным агентом.

Кроме того, антитела и способы, описанные в настоящем документе, могут быть использованы для профилактики или лечения воспалительных заболеваний и состояний, таких как остеоартрит, ревматоидный артрит, болезнь Крона, язвенный колит, и аутоиммунных заболеваний, таких как волчанка и смешанные аутоиммунные заболевания. Например, антитела, описанные в настоящем документе, могут быть полезны в лечении различных аутоиммунных и воспалительных заболеваний, включающих стадию введения терапевтически эффективного количества антитела субъекту, нуждающемуся в этом, где аутоиммунным заболеванием или воспалительным заболеванием является одно или более из следующих заболеваний: инсулинозависимый сахарный диабет (ИЗСД), сахарный диабет, рассеянный склероз, экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит, острый рассеянный энцефаломиелит, артрит, ревматоидный артрит, экспериментальный аутоиммунный артрит, миастения гравис, тиреоидит, болезнь Хашимото, первичная микседема, тиреотоксикоз, пернициозная анемия, аутоиммунный атрофический гастрит, болезнь Аддисона, преждевременная менопауза, мужское бесплодие, ювенильный диабет, синдром Гудпасчера, вульгарный пемфигус, пемфигоид, симпатическая офтальмия, фагогенный увеит, аутоиммунная гемолитическая анемия, идиопатическая лейкопения, первичный билиарный цирроз, активный хронический гепатит НЬ_8-уе, криптогенный цирроз, язвенный колит, синдром Шегрена, склеродермия, гранулематоз Вегенера, поли/дерматомиозит, дискоидная КВ, системная красная волчанка, болезнь Крона, псориаз, анкилозирующий спондилит, синдром антифосфолипидных антител, апластическая анемия, аутоиммунный гепатит, целиакия, болезнь Грейвса, синдром Гийена-Барре (СГБ), идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, опсоклонус-миоклонус синдром (ОМС), неврит зрительного нерва, тиреоидит Орда, пемфигус, полиартрит, первичный билиарный цирроз, синдром Рейтера, Такаясу, темпоральный артериит, тепловая аутоиммунная гемолитическая анемия, гранулематоз Вегенера, алопеция универсальная, болезнь Бехчета, болезнь Чагаса, синдром хронической усталости, дизавтомия, эндометриоз, гнойный гидраденит, интерстициальный цистит, нейромиотония, саркоидоз, склеродермия, язвенный колит, витилиго, вульводиния, воспалительные заболевания кожи, аллергический контактный дерматит; гастрит, ассоциированный с Н. ру1огу, хроническая заложенность носа, атеросклероз и реакция "трансплантат против хозяина".

Более конкретно, "аутоиммунное заболевание", о котором говорится в настоящем документе, это заболевание или расстройство, вызванное и направленное против собственных тканей или органов индивида, или совместная косегрегация, или их проявление или вызванное этим состояние. Аутоиммунное заболевание может относиться к состоянию, которое является результатом или усугубляется продукцией антител В-клетками, которые реактивны на нормальные ткани организма и антигены. Кроме того, аутоиммунным заболеванием является заболевание, которое может включать секрецию аутоантител, которые являются специфичным для эпитопа аутоантигена (например, ядерный антиген).

Аутоиммунные заболевания или нарушения, которые поддаются лечению и/или предотвращаются с помощью одного или более из антител, описанных в настоящем документе, включают в качестве неограничивающих примеров артрит (ревматоидный артрит, такой как острый артрит, хронический ревматоидный артрит, подагру или подагрический артрит, острый подагрический артрит, острый иммунологический артрит, хронический воспалительный артрит, дегенеративный артрит, индуцированный коллагеном II типа артрит, инфекционный артрит, артрит Лайма, пролиферативный артрит, псориатический артрит, болезнь Стилла, позвоночный артрит и ювенильный ревматоидный артрит, остеоартрит, хронический прогрессирующий артрит, деформирующий артрит, первичный хронический полиартрит, реактивный артрит, анкилозирующий спондилоартрит), воспалительные гиперпролиферативные заболевания кожи, псориаз, такой как бляшковидный псориаз, каплевидный псориаз, пустулезный псориаз и псориаз ног- 13 029793

тей, атопия, в том числе такие атопические заболевания как сенная лихорадка и синдром Джоба, дерматит, включая контактный дерматит, хронический контактный дерматит, эксфолиативный дерматит, аллергический дерматит, аллергический контактный дерматит, герпетиформный дерматит, монетовидный дерматит, себорейный дерматит, неспецифический дерматит, первичный раздражающий контактный дерматит и атопический дерматит, Х-сцепленный гипер-1дМ-синдром, аллергические интраокулярные воспалительные заболевания, крапивницу, такую как хроническая аллергическая крапивница и хроническая идиопатическая крапивница, включая хроническую аутоиммунную крапивницу, миозит, полимиозит/дерматомиозит, ювенильный дерматомиозит, токсический эпидермальный некролиз, склеродермию (включая системную склеродермию), склероз, такой как системный склероз, рассеянный склероз (РС), такой как спинооптический РС, первичный прогрессирующий РС (ППРС) и ремиттирующерецидивирующий РС (РРРС), прогрессирующий системный склероз, атеросклероз, артериосклероз, болезнь Шарко-Вюльпиана, атаксический склероз, оптиконейромиелит (ΝΜΟ), воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) (например, болезнь Крона, аутоиммуноопосредованные гастроинтестинальные заболевания, колит, такой как неспецифический язвенный колит, язвенный колит, микроскопический колит, коллагеновый колит, полипозный колит, некротизирующий энтероколит и трансмуральный колит и аутоиммунное воспалительное заболевание кишечника), воспаление кишечника, гангренозную пиодермию, узелковую эритему, первичный склерозирующий холангит, респираторный дистресс-синдром, включающий респираторный дистресс-синдром взрослых или острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС), менингит, воспаление всей или части сосудистой оболочки глаза, ирит, хориоидит, аутоиммунное гематологическое нарушение, ревматоидный спондилит, ревматоидный синовит, наследственный ангионевротический отек, повреждение черепного нерва как при менингите, гестационный герпес, пемфигоид беременных, зуд мошонки, аутоиммунное преждевременное угасание функции яичников, внезапная потеря слуха вследствие аутоиммунного состояния, 1§Е-опосредованные заболевания, такие как анафилаксия и аллергический и атопический ринит, энцефалит, такой как энцефалит Расмуссена и лимбический энцефалит и/или энцефалит ствола головного мозга, увеит, такой как передний увеит, острый передний увеит, гранулематозный увеит, негранулематозный увеит, факоантигенный увеит, задний увеит, или аутоиммунный увеит, гломерулонефрит (ГН) с нефротическим синдромом и без него, такой как хронический или острый гломерулонефрит, такой как первичный ГН, иммуноопосредованный ГН, мембранозный ГН (мембранозная нефропатия), идиопатический мембранозный ГН или идиопатическая мембранозная нефропатия, мембрано- или мембранозно-пролиферативный ГН (МПГН), в том числе тип I и тип II, и быстро прогрессирующий ГН, пролиферативный нефрит, аутоиммунная полигландулярная эндокринная недостаточность, баланит, включая ограниченный плазмоклеточный баланит, баланопостит, центробежная кольцевидная эритема, стойкая дисхромическая эритема, мультиформная эритема, кольцевидная гранулема, блестящий лишай, склеротический атрофический лишай, простой хронический лишай, шиповидный лишай, плоский лишай, ламеллярный ихтиоз, эпидермолитический гиперкератоз, предраковый кератоз, гангренозная пиодермия, аллергические состояния и ответы, аллергическая реакция, экзема, включая аллергическую или атопическую экзему, астеатозную экзему, дисгидротическую экзему и пузырчатую ладонно-подошвенную экзему, астму, такую как бронхиальная астма и аутоиммунная астма, состояния, включающие инфильтрацию Т-клеток и хронические воспалительные ответы, иммунные реакции против чужеродных антигенов, такие как группы крови А-В-Ο плода при беременности, хроническое легочное воспалительное заболевание, аутоиммунный миокардит, недостаточность адгезии лейкоцитов, волчанку, включая волчаночный нефрит, волчаночный энцефалит, педиатрическую волчанку, непочечную волчанку, экстраренальную волчанку, дискоидную волчанку и дискоидную красную волчанку, волчаночную алопецию, системную красную волчанку (СКВ), такую как кожная СКВ или подострая кожная СКВ, неонатальный волчаночный синдром (ΝΣΕ), и диссеминированная красная волчанка, юношеский (типа I) сахарный диабет, включая детский инсулин-зависимый сахарный диабет (ИЗСД), сахарный диабет взрослых (диабет типа II), аутоиммунный диабет, идиопатический несахарный диабет, диабетическую ретинопатию, диабетическую нефропатию, диабетическое нарушение крупных артерий, иммунные ответы, ассоциированные с острой или замедленной гиперчувствительностью, опосредованной цитокинами и Т-лимфоцитами, туберкулез, саркоидоз, гранулематоз, включая лимфоматоидный гранулематоз, гранулематоз Вегенера, агранулоцитоз, васкулиты, включая васкулит, васкулит крупных сосудов (включая ревматическую полимиалгию и гигантоклеточный (Такаясу) артериит), васкулит сосудов среднего калибра (включая болезнь Кавасаки и узелковый полиартериит/узелковый периартериит), микроскопический полиартериит, иммуноваскулит, васкулит ЦНС, кожный васкулит, васкулит вследствие гиперчувствительности, некротизирующий васкулит, такой как системный некротизирующий васкулит и АНЦА-ассоциированный васкулит, такой как васкулит Черджа-Стросса или синдром (СЧС) и АНЦАассоциированный васкулит сосудов мелкого калибра, темпоральный артериит, апластическую анемию, аутоиммунную апластическую анемию, анемию с положительным тестом Кумбса, анемию ДаймондаБлэкфана, гемолитическую анемию или иммунную гемолитическую анемию, включая аутоиммунную гемолитическую анемию (АИГА), пернициозную анемию (апет1а реттсюка), болезнь Аддисона, истинную эритроцитарную анемию или аплазию (ИЭА), дефицит фактора VIII, гемофилию А, аутоиммунную нейтропению, панцитопению, лейкопению, заболевания, включающие диапедез лейкоцитов, воспали- 14 029793

тельные нарушения ЦНС, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, синдром полиорганного повреждения, такой как вторичные синдромы септицемии, травмы или кровоизлияния, опосредованные комплексами антиген-антитело заболевания, болезнь антител к базальной мембране клубочков, синдром антифосфолипидных антител, аллергический неврит, болезнь/синдром Бехчета, синдром Кастлмена, синдром Гудпасчера, синдром Рейно, синдром Шегрена, синдром Стивенса-Джонсона, пемфигоид, такой как буллезный пемфигоид и пемфигоид кожи, пемфигус (в том числе вульгарный пемфигус, эксфолиативная пузырчатка, пемфигусный пемфигоид слизистой оболочки и пемфигусный эритематоз), аутоиммунные полиэндокринопатии, болезнь Рейтера или синдром, термическая травма, преэклампсия, нарушение вследствие иммунных комплексов, такое как нефрит иммунных комплексов, антителоопосредованный нефрит, полинейропатии, хроническую нейропатию, такую как 1дМ-полинейропатии или 1дМопосредованная нейропатия, тромбоцитопению (например, как развивается у пациентов с инфарктом миокарда), включая тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру (ТТП), посттрансфузионную пурпуру (РТР), гепарининдуцированную тромбоцитопению и аутоиммунную или иммуноопосредованную тромбоцитопению, такую как идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (ИТП), включая хроническую или острую ИТП, склерит, такой как идиопатический кератосклерит, эписклерит, аутоиммунное заболевание семенников и яичников, включая аутоиммунный орхит и оофорит, первичный гипотиреоз, гипопаратиреоз, аутоиммунные эндокринные заболевания, включая тиреоидит, такой как аутоиммунный тиреоидит, болезнь Хашимото, хронический тиреоидит (тиреоидит Хашимото), или подострый тиреоидит, аутоиммунную болезнь щитовидной железы, идиопатический гипотиреоз, болезнь Грейвса, полигландулярные синдромы, такие как аутоиммунные полигландулярные синдромы (или полигландулярные эндокринопатические синдромы), паранеопластические синдромы, включая неврологические паранеопластические синдромы, такие как миастенический синдром Ламберта-Итона или синдром ЛамбертаИтона, синдром застывшего человека или застывшего индивидуума, энцефаломиелит, такой как аллергический энцефаломиелит и экспериментальный аллергический энцефаломиелит (ЭАЭ), миастению гравис, такую как ассоциированную с тимомой миастению гравис, дегенерацию мозжечка, нейромиотонию, опсоклонус или опсоклонус-миоклонус синдром (ОМС) и сенсорную нейропатию, мультифокальную моторную нейропатию, синдром Шихана, аутоиммунный гепатит, хронический гепатит, волчаночный гепатит, гигантоклеточный гепатит, хронический активный гепатит или аутоиммунный хронический активный гепатит, лимфоидный интерстициальный пневмонит (ЛИП), облитерирующий бронхиолит (нетрансплантатный) против ΝδΙΡ, синдром Гийена-Барре, болезнь Бергера (1дА-нефропатия), идиопатическую 1дА-нефропатию, линейный 1дА дерматоз, острый фебрильный нейтрофильный дерматоз, субкорнеальный пустулезный дерматоз, транзиторный акантолитический дерматоз, цирроз, такой как первичный биллиарный цирроз и пневмоноцирроз, аутоиммунный синдром энтеропатии, целиакию, целиакиюспру (глютеновая энтеропатия), рефракторную спру, идиопатическую спру, криоглобулинемию, боковой амиотрофический склероз (БАС, болезнь Лу Герига), ишемическую болезнь сердца, аутоиммунное заболевание ушей, такое как аутоиммунное заболевание внутреннего уха (АЗВУ), аутоиммунная потеря слуха, полихондрит, такой как рефракторный или рецидивирующий полихондрит, легочный альвеолярный протеиноз, синдром Когана/несифилитический интерстициальный кератит, паралич Белла, болезнь/синдром Свита, аутоиммунная розацеа, боль, связанная с опоясывающим лишаем, амилоидоз, незлокачественный лимфоцитоз, первичный лимфоцитоз, который включает В-клеточный лимфоцитоз (например, доброкачественную моноклональную гаммапатию и моноклональную гаммапатию неопределенного значения, МГНЗ), периферическую нейропатию, паранеопластический синдром, каналопатии, такие как эпилепсия, мигрень, аритмия, мышечные нарушения, глухота, слепота, периодический паралич и каналопатии ЦНС, аутизм, воспалительная миопатия, фокальный или сегментарный или фокальносегментарный гломерулосклероз (ФСГС), эндокринную офтальмопатию, увеоретинит, хориоретинит, аутоиммунное гепатологическое нарушение, фибромиалгию, множественную эндокринную недостаточность, синдром Шмидта, адреналит, атрофию желудка, пресенильную деменцию, демиелинизирующие заболевания, такие как аутоиммунные демиелинизирующие заболевания, и хроническую воспалительную демиелинизирующую полинейропатию, синдром Дресслера, очаговую алопецию, тотальную алопецию, СКЕБТ-синдром (кальциноз, феномен Рейно, эзофагальная дискинезия, склеродактилия и телангиэктазия), мужское и женское аутоиммунное бесплодие, например, вследствие антител к сперматозоидам, смешанное поражение соединительной ткани, болезнь Чагаса, ревматическую лихорадку, привычный выкидыш, легкое фермера, мультиформную эритему, посткардиотомический синдром, синдром Кушинга, легкое птицевода, аллергический гранулематозный ангиит, доброкачественный лимфоцитарный ангиит, синдром Альпорта, альвеолит, такой как аллергический альвеолит и фиброзирующий альвеолит, интерстициальное заболевание легких, трансфузионную реакцию, лепру, малярию, паразитарные заболевания, такие как лейшманиоз, кипаносомиоз, шистозомоз, аскаридоз, аспергиллез, синдром Сэмптера, синдром Каплана, денге, эндокардит, эндомиокардиальный фиброз, диффузный интерстициальный фиброз легких, интерстициальный фиброз легких, фиброз легких, идиопатический фиброз легких, муковисцидоз, эндофтальмит, стойкую возвышающуюся эритему, эритробластоз плода, эозинофильный фасциит, синдром Шульмана, синдром Фелти, флариаз, циклит, такой как хронический циклит, гетерохронный циклит, иридоциклит (острый или хронический) или циклит Фукса, пурпура Шенлейн-Геноха, инфекцию

- 15 029793

вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), ТКИН, синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), эховирусную инфекцию, сепсис, эндотоксемию, панкреатит, тиреотоксикоз, парвовирусную инфекцию, инфекцию вирусом краснухи, поствакцинальные синдромы, врожденную инфекцию краснухи, инфекцию вирусом Эпштейна-Барра, эпидемический паротит, синдром Эвана, аутоиммунное поражение гонад, хорею Сиденгама, постстрептококковый нефрит, облитерирующий тромбангиит, тиреотоксикоз, сухотку спинного мозга, хориоидит, гигантоклеточную полимиалгию, хронический гиперчувствительный пневмонит, сухой кератоконъюнктивит, эпидемический кератоконъюнктивит, идиопатический почечный синдром, нефропатию с минимальными изменениями, доброкачественная семейная недостаточность и недостаточность вследствие ишемии-реперфузии, реперфузия трансплантированного органа, аутоиммунная реакция на сетчатку, воспаление суставов, бронхит, хроническую обструктивную болезнь дыхательных путей/легких, силикоз, афту, афтозный стоматит, артериосклеротические нарушения, асперниогенез, аутоиммунный гемолиз, болезнь Бека, криоглобулинемию, контрактуру Дюпюитрена, факоанафилактическую эндофтальмию, аллергический энтерит, лепрозную узелковую эритему, идиопатический лицевой паралич, синдром хронической усталости, ревматическую лихорадку, болезнь Хаммена-Рича, сенсоневральную потерю слуха, пароксизмальную гемоглобинурию, гипогонадизм, региональный илеит, лейкопению, инфекционный мононуклеоз, поперечный миелит, первичную идиопатическую микседему, нефроз, симпатическау офтальмию, гранулематозный орхит, панкреатит, острый полирадикулит, гангренозную пиодермию, тиреоидит Квервайна, приобретенную атрофию селезенки, незлокачественную тимому, витилиго, синдром токсического шока, пищевое отравление, состояния, включающие инфильтрацию Т-клеток, недостаточность адгезии лейкоцитов, иммунные ответы, ассоциированные с острой или замедленной гиперчувствительностью, опосредованной цитокинами и Т-лимфоцитами, заболевания, включающие лейкоцитарный диапедез, синдром полиорганной недостаточности, заболевания, опосредованные комплексами антиген-антитело, заболевание, обусловленное антителами к базальной мембране клубочков, аллергический неврит, аутоиммунные полиэндокринопатии, оофорит, первичную микседему, аутоиммунный атрофический гастрит, симпатическую офтальмию, ревматические заболевания, смешанное поражение соединительной ткани, нефротический синдром, инсулит, полиэндокринная недостаточность, аутоиммунный полигландулярный синдром типа I, идиопатический гипопаратиреоз взрослых (ΑΟΙΗ), кардиомиопатию, такую как дилатационная кардиомиопатия, приобретенный буллезный эпидермолиз (ПБЭ), гемохроматоз, миокардит, нефротический синдром, первичный склерозирующий холангит, гнойный или негнойный синусит, острый или хронический синусит, этмоидный, фронтальный, максиллярный или сфеноидный синусит, нарушение, связанное с эозинофилами, такое как эозинофилия, легочная инфильтрирующая эозинофилия, синдром эозинофилии-миалгии, синдром Лефлера, хроническая эозинофильная пневмония, тропическая легочная эозинофилия, бронхопневмонический аспергиллез, аспергиллему или гранулемы, содержащие эозинофилы, анафилаксию, серонегативные спондилоартриты, полиэндокринное аутоиммунное заболевание, склерозирующий холангит, склерозный, эписклерозный, хронический кожно-слизистый кандидоз, синдром Брутона, преходящую гипогаммаглобулинемию детского возраста, синдром Вискотта-Олдрича, синдром атаксии-телеангиэктазии, ангиэктазию, аутоиммунные нарушения, ассоциированные с коллагеновым заболеванием, ревматизм, неврологическая болезнь, лимфаденит, снижение артериального давления срабатывания, сосудистая дисфункция, повреждение тканей, сердечно-сосудистая ишемия, гипералгезия, почечная ишемия, ишемия головного мозга и заболевание, сопровождающее васкуляризацию, аллергические расстройства чувствительности, гломерулонефриты, реперфузионное повреждение, ишемическое реперфузионное повреждение, реперфузионная травма миокардиальной или других тканей, лимфоматозный трахеобронхит, воспалительные дерматозы, дерматозы с острыми воспалительными компонентами, полиорганную недостаточность, буллезные заболевания, почечный кортикальный некроз, острый гнойный менингит или другие воспалительные нарушения центральной нервной системы, окулярные и орбитальные воспалительные нарушения, гранулоцитарные синдромы, ассоциированные с трансфузией, индуцированную цитокинами токсичность, нарколепсию, острое тяжелое воспаление, хроническое не поддающееся лечению воспаление, пиелит, эндартериальную гиперплазию, пептическую язву, вальвулит и эндометриоз.

Антитела, описанные в настоящем документе, могут иметь различное научное, медицинское и коммерческое использование. Антитела могут быть использованы в различных типах диагностических тестов, например, для обнаружения широкого спектра заболеваний или наличия препаратов (лекарственных средств), токсинов или других белков, в том числе гормонов либо ίη νίΐτο, либо ίη νίνο. Антитела, описанные в настоящем документе, могут быть полезны при тестировании на наличие болезни, например, в сыворотке или крови пациентов. Болезнь может включать ОХ40-опосредованные заболевания или заболевания или показания, не связанные с 0X40, в том числе различные виды рака, воспалительное или аутоиммунное заболевание. Антитела также могут быть использованы в радиоиммуноанализе и радиоиммунотерапии рака и некоторые новые способы тестирования могут использовать эти описанные антитела для нацеливания только на клеточные мембраны специфических типов клеток, например, рака.

Антитела, описанные в настоящем документе, могут быть частью набора или другого диагностического пакета. Как таковой в настоящем документе приведен диагностический набор или изделие для использования со способом предварительной обработки в настоящем документе. Диагностический набор

- 16 029793

может содержать один или более из следующих: антагонист/антитело/референтный препарат, позитивное контрольное нейтрализующее антитело (предпочтительно козы или яванского макака); протеинА+О-колонку (например, протеин-Л./0-колонка); обезжиривающий реагент; буфер(ы) для аффинной очистки иммуноглобулина (например, связывающий, элюирующий и нейтрализующий буферы); комплементарную сыворотку; раствор для разведения клеток, инструкции по эксплуатации или литературу; виал замороженных клеток (например, клетки VIЬ2); реагент для мечения клеток (такой как СЕЬЬ ΤΙТЕР ОЬО.РТМ) и т.д. Как пример, диагностический набор может включать, но не ограничиваться этим: (а) обезжиривающий реагент; (б) буферы (например, связывающий и элюирующий буферы) для аффинной очистки иммуноглобулинов, а также (в) инструкцию, инструктирующую пользователей диагностического набора как использовать набор для предварительной обработки биологических образцов от субъекта с аутоиммунным заболеванием или раком до проведения клеточного биотестирования (такого, как анализ нейтрализующего антитела) на образце (например, во избежание сывороточной интерференции). Диагностический набор необязательно дополнительно включает один или более из: референтный препарат, позитивное контрольное нейтрализующее антитело, комплементарную сыворотку, раствор для разведения клеток и реагент для мечения клеток и т.д.

Антитела и другие открытия, описанные в настоящем документе, также обеспечивают высокопроизводительные скрининговые способы. Более конкретно и, как понятно специалистам в данной области, стали возможными высокопроизводительные способы для выявления антагонистических или агонистических моноклональных антител или малых молекул, которые связываются с рецепторами ОХ40 и могут ингибировать формирование и функцию Тг1-клеток или способствовать образованию и функции Тг1клеток. В одном из таких способов линия Т-клеток человека (8и-ЭНЬ-1), имеющих способность продуцировать ИЛ-10, была трансфицирована геном ОХ40 человека (8ИОХ40). 100000 клеток 8ИОХ40 культивировали либо с 100000 мышиных фибробластов (Ь-клеток), либо с 100000 мышиных фибробластов, экспрессирующих лиганд ОХ40 человека (лиганд ОХ40 Ь-клеток) в 96-луночном планшете. После 48 ч культивирования супернатанты культуры собирали для измерения ИЛ-10 ИЛ-10-специфическим ΕΟδΑ. В репрезентативном эксперименте 100 000 клеток 8ИОХ40, культивируемые в отсутствии лиганда ОХ40, секретировали до 6000 пг/мл ИЛ-10. В присутствии лиганда ОХ40 100000 клеток 8ИОХ40 секретировали менее 1000 пг/мл ИЛ-10. Этот способ культивирования может быть использован для скрининга, в частности, антагонистических моноклональных антител или малых молекул, которые блокируют способность лиганда ОХ40 ингибировать продукцию ИЛ-10 клетками 8ИОХ40. В качестве альтернативного варианта этот способ культивирования может быть изменен путем замены Ь-клеток, экспрессирующих лиганд ОХ40, потенциальными агонистическими моноклональными антителами или малыми молекулами, специфичными к ОХ40, чтобы определить, в частности, их способность ингибировать продукцию ИЛ-10 клетками 8ИОХ40.

Антитела к ОХ40, описанные в настоящем документе, могут быть использованы в качестве анализа или в анализе для тестирования или измерения активности препарата или другой молекулы, обнаруженной в организме или органическом образце. Они также могут быть использованы в количественном анализе для измерения количества вещества в образце. Биотестирования и иммунотестирования являются одними из многих разновидностей специализированных биохимических анализов, которым эти антитела могут быть использованы. Антитела к ОХ40, изложенные в настоящем документе, могут быть использованы в других тестах для оценки процессов, таких как активность фермента, захват антигена, активность стволовых клеток и конкурентное белковое связывание.

Человеческие Ь-клетки, экспрессирующие О1ТРЬ, ОХ40Ь, 4-1ВВЬ, 1СО8Ь, были получены ретровирус-опосредованной трансдукцией, что понятно специалистам в данной области. Вкратце, полноразмерная кодирующая последовательность О1ТРЬ человека (идентификационный номер ΝΜ_005092), ОХ40Ь (идентификационный номер ΝΜ_003326), 4-1ВВЬ (идентификационный номер ΝΜ_003811), 1СО8Ь (идентификационный номер ΝΜ_015259) была амплифицирована ОТ-ПЦР с РНК, полученной из Н8У-1, стимулированного МКПК. Затем кДНК клонировали в ретровирусный вектор ρΜΙ0ν2 на основе М8СУ и полученные плазмиды были верифицированы расщеплением рестриктазой и секвенированием ДНК. Для получения рекомбинантного ретровируса каждый вектор котрансфицировали упаковочными конструкциями рСЬ-др (дад/ро1) и рНСМУ-У§У§ (У§У-гликопротеиновый внешний слой) в клетках НЕК293Т. Два дня спустя собирали супернатанты вируссодержащих культур и использовали для инфицирования СГО32 Ь-клеток при ПУМ 100. При этом условии >95% клеток были продуктивно трансдуцированны.

Изолированные СЭ14+ моноциты (чистота >94%) культивировали в присутствии 100 нг/мл ОМ-С8Р и 50 нг/мл ИЛ-4 (оба от Ρ&Ό) в течение 5 дней, что понятно специалистам в данной области. Полученные незрелые ДК промывали и культивировали в течение 24 ч с ИФН-а (1000 ед/мл, РВЬ ВютеФса1 ЬаЬогаЮпеД. ИЛ-10 (10 нг/мл, Ρ&Ό) и облученными СО40Ь-трансфицированными Ь-клетками (соотношение ДК к Ь-клеткам 4:1) для получения зрелых ДК, что понятно специалистам в данной области.

Наивные СГО4' Т-клетки и СЭ4+ Т-клетки памяти (каждые чистотой >99%) были выделены из МКПК использованием набора II для выделения СЭ4' Т-клеток (МШепу1 Вю1ес) с последующей сортировкой клеток (СО4'СО45КЛ'СО45КО^-СО25-фракция как наивные Т-клетки и СО4'СЭ45КЛ^-

- 17 029793

СО45ВО'СО25^--фракция как Т-клетки памяти), что понятно специалистам в данной области. 4х10⁴ свежих очищенных аллогенных наивных СЭ4' Т-клеток были сокультивированы с незрелыми или культивированными ДК (соотношение ДК к Т 1:10) в присутствии или в отсутствии рекомбинантного ОХ40Ь человека (Κ&Ό, 100 нг/мл) в круглодонных 96-луночных планшетах для культуры в течение 7 дней, что понятно специалистам в данной области. Очищенные СЭ4' Т-клетки также культивировали с ИЛ-12 (10 нг/мл, Κ&Ό), ИЛ-4 (25 нг/мл, Κ&Ό) или с комбинацией дексаметазона (5х10^-8 М, И£е ТесЬпо1од1е8) и 1альфа, 25-дигидроксивитамина Ό₃ (10^-7 М) в течение 7 дней в присутствии растворимого моноклонального анти-СЭ28 антитела (СЭ28.2. 1 мкг/мл) и ИЛ-2 (50 ед/мл, Κ&Ό) на облученных СП32/ОХ40Ь-Ьклетках, СП32/О1ТКЬ-Ь-клетках, СП32/4-1ВВЬ-Ь-клетках или родительских СП32-Ь-клетках, которые были предварительно покрыты моноклональным анти-СЭ3 антителом (ОКТ3, 0,2 мкг/мл) в 48-луночных планшетах для культуры (соотношение Т-клетки к Ь-клетке 2,5:1), что понятно специалистам в данной области. В некоторых экспериментах СЭ4' Т-клетки культивировали в течение 7 дней на СО32-Ьклетках, смеси СО32-Ь-клеток и СП32/1СО8Ь-Ь-клеток (соотношение 1:1) или смеси СП32/1СО8Ь-Ьклеток и СП32/ОХ40Ь-Ь-клеток (соотношение 1:1), предварительно покрытых моноклональным антиСЭ3 антителом (0,2 мкг/мл) в 48-луночных планшетах для культуры, что понятно специалистам в данной области. Для культур была использована ΡΡΜΙ 1640 с добавлением 10% РС8, 2 мМ Ь-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, пенициллина О и стрептомицина, что понятно специалистам в данной области.

Культивированные Т-клетки были собраны и промыты, затем повторно стимулированы анти-СП3, связанными с пластиной (5 мкг/мл) и растворимым анти-СО28 (2 мкг/мл) в концентрации 1х10⁶ клеток/мл в течение 24 ч, что понятно специалистам в данной области. Уровни ИЛ-4, ИЛ-10, ФНО-α и ИФН-α в супернатантах измеряли при помощи ЕЫ8А (все комплекты Κ&Ό), что понятно специалистам в данной области. Для внутриклеточной продукции цитокинов, культурованные Т-клетки повторно стимулировали 50 нг/мл РМА плюс 2 мкг/мл иономицина в течение 6 ч. Брефелдин А (10 мкг/мл) был добавлен в течение последних 2 ч, что понятно специалистам в данной области. Клетки окрашивали комбинацией меченных фикоэритрином моноклональных антител к ИЛ-4 или ФНО-α с НТС-меченными моноклональными антителами к ИФН-α и мечеными аллофикоцианином анти-ИЛ-10 (все от ΒΌ) с использованием набора ИХ и ΡΕΚΜ (САЬТАО), что понятно специалистам в данной области.

Т-клетки были собраны и ресуспендированы в среде, содержащей ЭДТА, чтобы диссоциировать кластеры, что понятно специалистам в данной области. Подсчитывали живые клетки методом исключения мертвых клеток трипановым синим, что понятно специалистам в данной области. Для анализа суппрессивной функции наивные СЭ4' Т-клетки (А) и Тг1-клетки, образованные из наивных СЭ4' Т-клеток под действием моноклонального анти-СО3 антитела, моноклонального анти-СЭ28 антитела, ИЛ-2, дексаметазона и витамина Ό₃ в присутствии родительских Ь-клеток (В) или ОХ40Ь-Ь-клеток (С), этих трех типов клеток и их смеси в соотношении 1:1, затем повторно стимулировали в течение 5 дней культивированием в присутствии 5 мкг/мл моноклонального анти-СЭ3 антитела и 1 мкг/мл моноклонального анти-СО28 антитела, после чего клеточную пролиферацию оценивали по захвату [³Н]тимидина, что понятно специалистам в данной области.

Получение специфичных моноклональных антител к ОХ40 человека

Мы получили множественные агонистические мышиные моноклональные антитела к ОХ40 человека. Антигенспецифичная связывающая способность антител была подтверждена методом проточной цитометрии (фиг. 10-12). Агонистическая активность антител была подтверждена с помощью функциональных анализов. Мы обнаружили, что девять из 20 специфичных антител к ОХ40 могут блокировать витамин О₃/дексаметазон-индуцированнное формирование Тг1-клеток из СЭ4' Т-клеток (фиг. 13), усиливать СЭ4' Т-клеточную пролиферацию (фиг. 14) и подавлять продукцию ИЛ-10

1СО8'СО4'СО25^|"^?|ИОХР3' Тгед (фиг. 16). Мы титровали антитела и обнаружили, что пятеро обладали мощной активностью в подавлении формирования Тг1-клеток в концентрациях всего 4 нг/мл (фиг. 15).

Антитела к ОХ40 ингибируют функцию СО4'СО25^|"^?||РОХР3' Тгед

Некоторые из моноклональных антител к ОХ40 ингибируют супрессивную функцию ИОХР3+ Тгед (фиг. 17). Из пяти антител (119-8В, 119-43, 119-122, 119-173В и 106-222), которые мощно ингибируют продукцию ИЛ-10 Тг1-клетками и СП4⁺СП25^ЫбЬСП127ТОХР3⁺ Тге§5, три (119-43, 119-122 и 106-222) были мощными в блокировании функции СО4'СО25^|"^?||СО127^-РОХР3' Тгед (фиг. 17). Тем не менее, два (119-33 и 120-140А) из 11 антител, которые не имеют активности против продукции ИЛ-10, блокируют функцию СО4'СО25^|"^?||РОХР3' Тге§ (фиг. 18).

Моноклональные антитела к ОХ40 человека

Получение моноклональных антител к ОХ40 человека было проведено, например, путем иммунизации 6-8-недельных мышей линии ВАЬВ/С линией мышиных клеток, трансфицированных ОХ40 человека в соответствии с установленными протоколами. Клоны гибридомы, секретирующие моноклональное антитело, которое специфически окрашивало клетки ОХ40+, были установлены и в дальнейшем проанализированы.

Мы разрабатываем исчерпывающий скрининг для выявления тех клонов, которые триггируют активацию ОХ40 (например, агонистические антитела) путем ингибирования образования и функции Тг1- 18 029793

клеток. Эти клоны в дальнейшем очищались. Агонистические антитела к Ь0Х40 могут быть гуманизированны и использованы в клинических протоколах для противоопухолевой терапии у человека либо самостоятельно, либо в комбинации с противоопухолевой вакцинацией и другими адъювантами. Несколько различных типов опухолей могут быть целью этих антител, в том числе меланома, лимфома и рак молочной железы.

В другом варианте осуществления изобретения для иммунизация путем инъекции в подушечки лап или подкожной иммунизации использовали 6-8 недельных самок мышей линии ΒΑΣΒ/С. Каждой мыши вводили 5 млн мышиных Ь-клеток, трансфицированных 0X40 человека (Ь-0Х40) 6 раз с интервалом в 3 дня. Через три дня после шестой инъекции мышей умерщвляли и удаляли подколенные лимфатические узлы (при иммунизация путем инъекции в подушечки лап) или селезенку (при подкожной иммунизации) и клетки сливали с клетками миеломы 8Р2.0 или миеломы N80 в соотношении 1 к 1 для получения гибридомных клонов, используя установленные протоколы. Клоны гибридом, секретирующие моноклональное антитело, были затем проверены на их аффинность связывания с клетками Ь-Ь0Х40 анализами ΕΜ8Α. Супернатанты гибридом, которые связываются с клетками Ь-Ь0Х40, но не с родительскими Ьклетками, были дополнительно подтверждены на связывание с клетками Ь-Ь0Х40 и 8ИРМ2-Й0Х40 проточным цитометрическим анализом.

В эксперименте на фиг. 10 супернатанты гибридомы Ь0Х40 были проверены против Ь-Ь Ь0Х40 по сравнению с родительскими Ь-клетками при помощи ΕΟδΑ. Были выбраны двадцать специфичных моноклональных антител к Ь0Х40. Двадцать миллионов Ь-клеток или Ь-клеток, экспрессирующих 0X40 человека (Ь-Ь0Х40), наносили на 96-луночный планшет, смешивая клетки с 0,01% хлоридом магния кальция в РВ8 и оставляли высыхать в течение ночи в ламинарном шкафу. Планшеты затем замораживали при температуре -20°С, по крайней мере, за день до использования. Для реакции преципитации антител замороженные клетки регидратировали с РВ8 и промывали промывочным буфером, содержащим РВ8 плюс 0,05% Твин-20 и блокировали 2% Β8Α в промывочном буфере. Высушенные клетки затем были использованы для связывания с антителами к 0Х40 супернатантов. Связывание антитела с клеткам затем обнаруживали с вторичным антителом, антимышиным 1дО РС НКР. Гибридомные специфичные Ь0Х40 супернатанты узнают Ь-клетки, экспрессирующие 0X40, но не родительские Ь-клетки.

В эксперименте на фиг. 11 моноклональные специфичные антитела к Ь0Х40 были исследованы с помощью проточного цитометрического анализа. Равное число (100к) Ь-клеток и Ь-Ь0Х40 были смешаны в буфере РΑС8 (1% РС8/2мМ ЭДТА/ФСБ) и инкубировали с 0,5 мкг антител, очищенных РРЬС (Рго1еш Α Н|Тгар/СеШ1е Αд/ΑЬ элюирующий буфер). Затем клетки промывали и окрашивали с вторичным антителом, фикоэритринконьюгированным анти-1дО мыши. Два пика указывают на положительную и отрицательную окраску моноклональным антителом к Ь0Х40. Один пик говорит об отсутствии связывания или неспецифическом связывании антител. Двадцать специфичных моноклональных антител к Ь0Х40 были подтверждены методом проточной цитометрии.

В эксперименте на фиг. 12 специфичность моноклональных антител к Ь0Х40 была подтверждена с помощью клеток 8ИРМ2, экспрессирующих Ь0Х40 (8ИРМ2-ЮХ40). Равное число (100к) 8ИРМ2 и 8ИРМ2-Ь0Х40-клеток были смешаны в буфере РΑС8 (1% РС8/2 мМ ЭДТА/ФСБ) и использованы для связывания моноклональных антител к Ь0Х40, как на фиг. 11. Специфичность связывания каждого антитела была проанализирована методом проточной цитометрии. Два пика указывают на положительную и отрицательную окраску моноклональным антителом к Ь0Х40, в то время как один пик говорит об отсутствии связывания или неспецифическом связывании антител. Двадцать специфичных моноклональных антител к Ь0Х40 были подтверждены.

В эксперименте на фиг. 13 мы попытались идентифицировать специфичные моноклональные антитела к 0X40 человека, которые могут ингибировать формирование Тг1-клеток из СБ4' Т-клеток, стимулированных витамином Ό3 (10 микромоль мМ)/дексаметазоном (50 наноМ), СБ32Ь/1С08Ь и антиСБ3/СБ28 (0,2 микрограмм/мл). Моноклональные антитела к Ь0Х40 были добавлены на день 0 культуры клеток и СБ4' Т-клетки после 7 дней стимуляции были подвержены внутриклеточному окрашиванию ИЛ-10 с последующим анализом методом проточной цитометрии. Данные репрезентативного анализа с помощью активизированной флюоресценцией сортировки клеток (РΑС8) приведены на А и проценты Тг1-клеток для всех обработок моноклональными антителами к Ь0Х40 показаны на В. Используя клетки, полученные в этом эксперименте, мы попытались выявить специфичные моноклональные антитела к Ь0Х40, которые стимулируют СБ4' Т-клеточную пролиферацию (фиг. 14, клетки подсчитывали на 7 день после стимуляции) и ингибируют формирование Тг1 из СБ4' (фиг. 13).

Для того, чтобы идентифицировать такие моноклональные антитела к Ь0Х40 на их способность ингибировать образование Тг1-клеток из СБ4' Т-клеток, Тг1-клетки были получены и культивированы, как описано в экспериментах на фиг. 13 выше. Репрезентативные данные РΑС8 приведены на А и проценты Тг1-клеток после обработки девятью моноклональными антителами к Ь0Х40 приведены на В. Пять специфичных моноклональных антител к Ь0Х40 сильно ингибировали формирование Тг1-клеток в концентрации 4 нг/мл (фиг. 15).

В эксперименте на фиг. 16А, 16В и 16С свежеотсортированные 1С08⁺СБ4⁺СБ127^-СБ25^Ь1дЬ Т-клетки стимулировали анти-СБ3 (0,2 мкг/мл) в присутствии СБ32Ь/1С08Ь-клеток и СБ32Ь/Ь0Х40Ь-клеток или

- 19 029793

моноклональных антител к 10X40 или контрольного антитела в течение 5 дней. Затем клетки подсчитывали и 5х10⁴ клеток повторно стимулированы с анти-СЭ3/СЭ28 в течение 24 часов и супернатанты анализировали на продукцию ИЛ-10 набором ЕНка. Мы идентифицировали специфичные моноклональные антитела к 10X40, которые ингибируют формирование Тг1 из СЭ4' Т-клеток, также подавляют продукцию ИЛ-10 натуральными 1С0З'СЭ4'С025¹"^д1' Т -клетками.

Свежеотсортированные 1С0З+ 1С0З^-СЭ4'С0127^-С025¹"^д1' Тгедк культивировали с меченными СРЗЕ клетками СО4+СО25¹⁰" в присутствии облученных моноцитов и анти-СЭ3 (0,3 мкг/мл) и МАт к 10X40. Через 3,5 дня культивирования пролиферацию клеток оценивали разведением СРЗЕ в клетках РАСЗ анализом (фиг. 16С).

Фиг. 17А и 17В описывают идентификацию моноклональных антител к 10X40, которые ингибируют формирование Тг1-клеток и блокируют функцию Р0XР3'С^4'С^25^|"^д|ι Тгед. Свежеотсортированные РΟXР3'С^4'С^127^-С^25^|"^д|ι Т-клетки (3,5х10⁴) культивировали с меченными СРЗЕ клетками С04'СЭ25^|о'“ (7х10⁴) в присутствии облученных моноцитов (7х10⁴, 6000 рад) и 0,3 мкг/мл анти-СЭ3 и различных концентраций моноклонального антитела к 10X40. После 3-4 дней культивирования пролиферацию клеток оценивали по разведению СРЗЕ в клетках методом проточной цетометрии. Процент разделенных клеток указан. Репрезентативные анализы проточной цитометрии приведены на фиг. 17А. Данные для 6 моноклональных антител приведены на фиг. 17В.

В эксперименте на фиг. 18 свежеотсортированные 60X63 'СО4'СО127^-СО25^1|дН Т-клетки (3,5х10⁴) культивировали с меченными СРЗЕ клетками С04'СЭ25^|о'“ (7х10⁴) в присутствии облученных моноцитов (7х10⁴, 6000 рад) и 0,3 мкг/мл анти-СЭ3 и различных концентраций моноклонального антитела к 0X40. После 3-4 дней культивирования пролиферацию клеток оценивали по разведению метки СРЗЕ в клетках методом РАСЗ. Данные репрезентативны для двух экспериментов. Мы определили моноклональные антитела к 10X40, которые не ингибируют формирование Тг1, но блокируют функцию Р0XР3⁺С^4⁺С^25^11д1 Тгед.

В эксперименте на фиг. 19А и 19В полученные из лимфомы СО4'СО25^11|д1' Т-клетки культивировали с меченными СРЗЕ клетками С04'СЭ25^|о'“ (7х10⁴), изолированными от здорового донора, в присутствии облученных аллогенных моноцитов (7х10⁴, 6000 рад) и 0,3 мкг/мл анти-СЭ3 и 25 мкг/мл моноклонального антитела к 10X40. После 3-4 дней культивирования пролиферацию клеток оценивали по разведению СРЗЕ РАСЗ анализом. Репрезентативные РАСЗ анализы показаны на фиг. 19А и данные для всех экспериментов показаны на фиг. 19В. Мы обнаружили, что агонистические антитела к 10X40 блокируют функцию СО4'СО25^1||д11 Тгед, полученных из лимфомы.

Фиг. 20 демонстрирует идентификацию агонистических антител к 0X40, которые специфически связываются с 0X40 человека и макаки резуса. Мононуклеарные клетки периферической крови макаки резуса были получены путем фиколл-центрифугирования. СЭ4+ Т-клетки были получены из микрогранулированных СЭ4. СЭ4' Т-клетки стимулировали 10 мкг/мл лектина фасоли обыкновенной (РНА). Через два дня после стимуляции клетки окрашивали МАт к 10X40 с козьим антимышиным 1§С АРС и СЭ69-РЕ. 106-317 служил в качестве отрицательного контроля. Показано, что шесть МАт к 10X40, которые сильно активируют Т-клеточную пролиферацию, могли связывать активированные СЭ4' Т-клетки макаки-резуса. Эти результаты указывают на то, что токсичность этих шести моноклональных тел к 10X40 может быть проверена на обезьянах.

Только семь из 500 положительных клонов к ОХ40 человека, полученных с использованием принятых протоколов слияния, проявили свойство триггирования 0X40, включая, но не ограничиваясь этим, способность блокировать формирование ИЛ-10-продуцирующих Тг1 и супрессивную функцию пТгед, как описано в табл. 1.

- 20 029793

Таблица 1. Список специфичных моноклональных антител к 0X40

Клоны гибридомы 106-222 и 119-122 были выбраны, основываясь на трех критериях

1. Они ингибируют формирование Тг1-клеток из Т-клеток СЭ4+ (индуцибельные Тгед)

2. Обращают супрессивную функцию ΡΟXΡ3+ηТ^ед-клеток

3. Они подавляют дозозависимое ингибирование выключения Тг1-клеток и обращение функции ΡΟXΡ3 +Тгед- клеток

Химерные и гуманизированные антитела

Гуманизация (также называемая решейпинг или СЭК-пересадка) является признанной техникой для снижения иммуногенности моноклональных антител из ксеногенных источников (включая, но не ограничиваясь этим, грызунов), а также для улучшения активации ими иммунной системы человека. Хотя механика получения инженерного моноклонального антитела с использованием способов молекулярной биологии известна, простая пересадка гипервариабельных участков грызунов (СЭК) в человеческие каркасные участки не всегда воссоздает сродство и специфичность исходного моноклонального антитела.

Чтобы гуманизировать антитело, дизайн гуманизированного антитела становится важнейшим этапом в воспроизведении функции исходной молекулы. Этот дизайн включает различные варианты: длина СЭК, используемые каркасные участки человека и замена остатков моноклонального антитела грызунов в каркасные участки человека (обратные мутации). Положения этих обратных мутаций были определены главным образом секвенированием/структурным анализом или анализом гомологичной модели 3Όструктуры вариабельных областей.

В последнее время были использованы библиотеки фагов для варьирования аминокислотами в выбранных позициях. Аналогично были использованы многие подходы для выбора наиболее подходящих каркасных участков человека, в которые прививать СЭК грызунов. В ранних экспериментах использовали ограниченный набор хорошо изученных моноклональных антител человека (часто, но не всегда там, где структура была доступна), независимо от идентичности последовательности моноклональному антителу грызуна (так называемый подход фиксированных каркасных участков). Некоторые группы используют вариабельные области с высокой идентичностью аминокислотной последовательности вариабельным областям грызунов (гомологичное соответствие или наилучшее совпадение), другие используют консенсусные последовательности или последовательности зародышевой линии, а третьи выбирают фрагменты последовательностей каркасных участков в каждой вариабельной области легкой или тяжелой цепи из нескольких различных моноклональных антител человека. Есть также разработанные подходы к гуманизации, которые заменяют поверхностные остатки антитела грызуна на наиболее похожие остатки, найдены в моноклональных антителах человека ("гезигГастд" или %епеегтд"), и те, которые используют различные определения длины СЭК. Гуманизированные антитела описаны ниже. Однако, химерное антитело, содержащее вариабельные тяжелые и легкие области 8Ε^ ГО N0: 4 и 10, также описаны в настоящем документе.

Гуманизированные моноклональные антитела были получены из мышиного антитела к 0X40.

- 21 029793

Выделенное гуманизированное антитело к 0X40 может иметь СЭК1 вариабельной тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:1. Выделенное гуманизированное антитело к 0X40 может иметь СЭК2 вариабельной тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:2. Выделенное гуманизированное антитело к 0X40 может иметь СЭК3 вариабельной тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:3.

Выделенное гуманизированное антитело к 0X40 может иметь СЭК1 вариабельной легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:7. Выделенное гуманизированное антитело к 0X40 может иметь СЭК2 вариабельной легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:8. Выделенное гуманизированное антитело к 0X40 может иметь СЭК3 вариабельной легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:9.

Выделенное гуманизированное антитело к 0X40 может иметь вариабельную легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:11, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0:11. Выделенное гуманизированное антитело к 0X40 может иметь вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:5 или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0:5.

Выделенное гуманизированное антитело к 0X40 может иметь вариабельную легкую цепь, кодируемую нуклеотидной последовательностью 8Е0 ГО N0:12, или нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 90% идентичной аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0: 12. Выделенное гуманизированное антитело к 0X40 может иметь вариабельную тяжелую цепь, кодируемую нуклеотидной последовательностью 8Е0 ГО N0:6 или нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 90% дентичной аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0:6.

Экспрессия гуманизированных антител к 0X40

Антитело или детерминанта антитела, в соответствии с изобретением, могут быть получены путем рекомбинантной экспрессии генов легкой и тяжелой цепи иммуноглобулина в клетке-хозяине. Чтобы экспрессировать антитело рекомбинантно, клетку-хозяин трансфицируют одним или более рекомбинантными векторами экспрессии, несущими фрагменты ДНК, которые кодируют легкую и тяжелую цепи антитела, таким образом, что легкие и тяжелые цепи экспрессируются в клетке-хозяине и предпочтительно секретируются в среду, в которой культивируют клетки-хозяева, из этой среды антитела могут быть восстановлены. Стандартные методики рекомбинантной ДНК используются для получения генов тяжелой и легкой цепи антител, включение этих генов в рекомбинантные векторы экспрессии и введение векторов в клетки-хозяева как описано в §ашЬтоок, РпЕсй апб Машайк (ебк), Мо1еси1аг С1ошп§; А ЬаЬогаЮгу Мапиа1, 8есопб ЕбШоп, Со1б 8рппд НагЬог, ΝΥ., (1989), Аи§иЬе1, Р. М. е! а1. (еб8.) СиггеЩ РгоЮсок ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Отеепе РиЬйкШпд А^ощаЮ^ (1989) и в патенте США № 4816397 Во88 е! а1.

Антитела или фрагменты антител и варианты могут быть получены из различных клеток животных, преимущественно из клеток млекопитающих, особенно предпочтительными являются клетки мыши и человека. Кроме того, системы для экспрессии рекомбинантных ДНК могут включать те, которые используют клетки-хозяева и экспрессионные конструкции, которые были разработаны для продуцирования высоких уровней того или иного белка. Такие клетки-хозяева и экспрессионные конструкции могут включать ЕксйепсЫа сой; несущие экспрессионные конструкции, полученные из плазмид или вирусов (бактериофагов), дрожжи, такие как §ассйатотусе8 сегетыеае или РюЫа работах, несущие эписомные или хромосомные интегрированные экспрессионные конструкции; клетки насекомых и вирусов, такие как клетки §Г9 и бакуловирус; клетки млекопитающих, несущие интегрированные в эписомы или хромосомы (включая, но не ограничиваясь этим, ретровирусные) экспрессионные конструкции (такие способы, например, показаны в рукописи Уегта е! а1., I. 1ттипо1. МеШобк 216:165-181, 1998). Антитела могут также продуцироваться в растениях (такие способы, например, показаны в патенте США № 6046037;. Ма е! а1., 8шепсе 268:716-719, 1995) или по технологии фагового дисплея (такие способы, например, показаны в \Уш1ег е! а1., Аппи. Кеу. 1ттипо1. 12:433-455, 1994).

Антитела к 0X40 человека, показавшие уровень активности и специфичность связывания/афинность, которые являются желательными, могут быть в дальнейшем манипулированы стандартными технологиями рекомбинантной ДНК, например, для преобразования генов вариабельной области в гены полноразмерной цепи антитела, в гены РаЬ-фрагмента или ген §сРу. В этих манипуляциях УЬ- или УН-кодирующий фрагмент ДНК функционально связан с другим фрагментом ДНК, кодирующим другой белок, таким как константная область антитела или гибкий линкер. Термин "функционально связанный", используемый в данном контексте, подразумевает, что два фрагмента ДНК соединены таким образом, что аминокислотные последовательности, кодируемые этими двумя фрагментами ДНК, остаются внутри рамки.

В другом аспекте изолированная ДНК, кодирующая область УН, может быть преобразована в ген полноразмерной тяжелой цепи путем функционального связывания УН-кодирующей ДНК с другой молекулой ДНК, кодирующей константные области тяжелой цепи (СН1, СН2 и СН3). Последовательности генов тяжелой цепи константной области человека известны в данной области техники (см., например, КаЬа!, Е.А., е! а1. (1991) §едиепсе8 оГ Рго1еш8 оГ 1ттипо1ощса1 1п1еге81, Рьйй Ебйюп, И.8. ОераПтеЩ оГ

- 22 029793

Неа1!Ь апй Нитап 8егу1се§, XIII РиЬНсайоп N0. 91-3242), и фрагменты ДНК, охватывающие эти области, могут быть получены с помощью стандартной ПЦР-амплификации. Константной областью тяжелой цепи может быть константная область ΙβΟ-1, 1дС2, 1§С3, 1дС4, 1дА, ЕЕ, 1дМ или ЕЕ и любой их аллотипический вариант, как описано в КаЬа! (КаЬа1, Е. А., е1 а1. (1991) 8ециепсе§ о£ Рго1ет§ о£ 1ттипо1од1са1 1п1еге§1, ΕίΙΙΙι Еййюп, и.8. ЕераПтеп! о£ НеаЙЬ апй Нитап 8егу1се§, N11 РиЬНсайоп Ш. 91-3242), но наиболее предпочтительны константные области Ε(τ1 и ЕС 4. Для гена тяжелой цепи ЕаЬ-фрагмента, УНкодирующая ДНК может быть функционально связана с другой молекулой ДНК, кодирующей только тяжелую цепь СН 1 константной области.

Кроме того, гуманизированное антитело, связанное с поверхностным антигеном, может взаимодействовать с ЕсК-несущими клетками. Такое взаимодействие может вызвать эффекторную функцию, такую как ЛЕСС и/или повысить активацию из-за Ес-опосредованного перекрестного сшивания. Взаимодействие может быть полезно или вредно для терапии. Такие вредные побочные эффекты включают озноб, лихорадку, артериальную гипотензию, а в некоторых случаях, одышку (ТНыЕеЕтаДе 1Е 1г., Со§1т1 АВ, Ее1тотсо ЕЬ, е1 а1.).

Начало некоторых вредных эффектов может быть положено белковым комплексом, найденным на поверхности Т-клетки. После активации Т-клетки белковый комплекс принимает участие в трансдукции сигналов, генерируемых с помощью рецептора антигена. Вкратце, активация Т-клетки начинает каскад событий, которые включают усиленное перекрестное сшивание рецептора антигена. Перекрестное сшивание рецепторов может способствовать сильной митогенной активации, которая приводит к индуцированию некоторых цитокинов, таких как фактор некроза опухолей альфа (ФНО-α), интерлейкин-2 (ИЛ-2) и гамма-интерферон (ИФН-γ). Эти цитокины, как известно, токсичны, если продуцируются в больших количествах.

Например, моноклональные анти-СЭ3-антитела используются в настоящее время для лечения аутоиммунных заболеваний, включая сахарный диабет I типа, в котором Т-клетки медиировали нападение на панкреатические островки, продуценты инсулина (Каи£тап А, апй НегоЫ К. ЛпЕ-СЕ3 тАЬ§ £ог 1геа1теп1 о£ 1уре 1 ФаЬе1е§ Е1аЬе1е§ Ме!аЬ Ке§ Еес 2009; 25: 302-306). Анти-СЭ3-антитела, как известно, ингибируют лизис мишеней Т-клетками и усиливают перекрестное сшивание рецептора антигена СЕ3. Кроме того, вместе с его мощной митогенной активностью анти-СЭ3-антитело, как известно, является мощным индуктором цитокинов, в частности, фактора некроза опухолей альфа (ФНО-α), интерлейкина-2 (ИЛ-2) и гамма-интерферона (ИФН-γ). Массивное высвобождение цитокинов, в частности ФНО-α, из Т-клеток в ответ на препарат (СЬа1епоий Е.) создает токсические эффекты. Эти нежелательные побочные эффекты были отнесены к перекрестному сшиванию Т-клеток, несущих молекулы СЭ3 и ЕсК-несущих клеток, которые связываются с Ес-детерминантой антител. Перекрестное сшивание активирует как Т-клетки, так и ЕсК-несущие клетки, что ведет к массивному высвобождению цитокинов, как упоминалось ранее.

Аналогично, к потенциальным нежелательным побочным эффектам может привести использование антител к ОХ40. Например, антитела к 0Х40, которые связываются с 0Х40-экспрессирующими Тклетками, могут также связываться с ЕсК-несущими клетками и провоцировать выработку цитокинов, что может быть полезным или вредным для пациентов с антителом. Чтобы преодолеть эту потенциальную проблему, мы разработали и представили в настоящем документе способы мутирования ЕсЕдетерминанты антитела кОХ40 во избежание токсичных эффектов и обеспечения мутаций ЕсКдетерминанты, которые могут быть желательными.

Сайт 1§С1 человека, который взаимодействует с ЕсК (СЭ16, СЭ32 и СЭ64), известен. Он расположен в верхнем домене СН2. Наиболее важными аминокислотами являются два остатка Ьеи в положениях 234 и 235. Путем мутации этих двух остатков на два остатка А1а взаимодействие ЕС1 со всеми ЕсК§ прекращается. Гуманизированное анти-СЭ3, содержащее эти мутации (Ни0КТ3АА), является более безопасным препаратом и имеет механизм действия, который отличен от Ни0КТ3. См., например, патент США № 6491916, включенный в качестве ссылки во всей своей полноте в настоящем документе.

Позиции АА-мутанта показаны в следующем порядке:

234 235

---А---Р---Е---Ь---Ь---С---С---Р---Дикий тип верхнего СН2 1дС1

---А---Р---Е---А---А---С---С---Р---АА Мутант верхнего СН2 1дС1

Ни222АА и Ни122АА, описанные в настоящем документе, могут содержать эти мутации. Если тестсистема содержит ЕсЕ-несущие клетки, вы можете увидеть разницу между диким типом и АА-мутантом. В противном случае, два антитела должны вести себя одинаково.

Изолированная ДНК, кодирующая область УЬ, может быть конвертирована в ген полноразмерной легкой цепи (а также ген легкой цепи ЕаЬ) путем функционального связывания УЬ-кодирующей ДНК с другой молекулой ДНК, кодирующей легкую цепь константной области, СЕ Последовательности генов константных областей легкой цепи человека известны в данной области техники (см., например, КаЬа!, Е. А., е1 а1. (1991) 8ециепсе§ о£ Рго1ет§ о£ 1ттнпо1ощса1 1п1еге§1, ΕίίΐΙ ЕсЕпоп, и.8. ЕераПтеп! о£ НеаНЕ апс.1 Нитап 8егу1се§, №Н РиЬНсайоп №. 91-3242), и фрагменты ДНК, имеющие эти области, могут быть получены при помощи стандартной ПЦР-амплификации. Константная область легкой цепи может быть

- 23 029793

константной областью каппа или лямбда.

Для создания гена 8сРу νΗ- и νΣ-кодирующе фрагменты ДНК функционально связываются с другим фрагментом, кодирующим гибкий линкер, например кодирующий последовательность аминокислот (С1у.8иЬ.4-8ег).8иЬ.3 таким образом, что последовательности νΗ и νΣ могут быть экспрессированы в виде непрерывного одноцепочечного белка с областями νΣ и νΗ, соединенными гибким линкером (см., например, Βίτά е! а1. (1988) 8аепсе 242:423-426; Ник!оп е! а1. (1988) Ргос. Νηΐ1. Асаб. δα. И8А 85:58795883; МсСайеПу е! а1., Ыа!иге (1990) 348:552-554.

Рассматривается модификация(ции) аминокислотных последовательностей антител, описанных в настоящем документе. Например, может быть желательным улучшение аффинности связывания и/или других биологических свойств антитела. Варианты аминокислотной последовательности антитела получают путем внесения соответствующих изменений нуклеотидов в нуклеиновую кислоту антитела или синтезом пептида. Такие модификации включают, например, делеции из, и/или инсерции в, и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антитела. Любая комбинация делеции, инсерции и замены сделана для получения окончательной конструкции при условии, что конечная конструкция обладает требуемыми характеристиками. Эти изменения аминокислот могут быть введены в конкретную аминокислотную последовательность антитела во время создания последовательности.

Полезный способ идентификации определенных остатков или областей антитела, которые являются предпочтительными местами для мутагенеза, называется "аланин-сканирующий мутагенез", как описано СиптпдЬат апб \Уе118 (1989) 8аепсе, 244:1081-1085. Здесь определяют остаток или группу целевых остатков (например, заряженные остатки, такие как агд, акр, +8, 1у8 и д1и) и замещают нейтральной или отрицательно заряженной аминокислотой (наиболее предпочтительно, аланином или полиаланином), чтобы повлиять на взаимодействие аминокислот с антигеном. Те локализации аминокислот, которые демонстрируют функциональную чувствительность к заменам, затем изменяют путем введения дополнительных или других вариантов или сайтов замещения. Таким образом, в то время как сайт для введения варианта аминокислотной последовательности предопределен, природу самой мутации не нужно предопределять. Например, для анализа проявления мутации в данном сайте проводятся сканирование аланином или случайный мутагенез в целевом кодоне или области и экспрессируемые иммуноглобулины скринируют на желаемую активность.

Инсерции аминокислотной последовательности включают амино- и/или карбокси-концевые слияния в длину от одного остатка с полипептидами, содержащим сто или более остатков, а также инсерции одного или нескольких аминокислотных остатков в последовательности. Примеры терминальных инсерции включают антитело с Ν-концевым остатком метионина или антитело, слитое с цитотоксическим полипептидом. Другие инсерционные варианты молекулы антитела включают слияние Ν- или С-конца антитела с ферментом (например, для АОЕРТ) или полипептидом, который увеличивает период полураспада антитела в сыворотке. Другой тип варианта аминокислот антитела изменяет изначальный паттерн гликозилирования антитела. Такое изменение включает удаление одного или нескольких углеводных остатков, найденных в антителе, и/или добавление одного или более сайтов гликозилирования, которые не присутствуют в антителе.

Другой тип варианта - это вариант замены аминокислоты. Эти варианты имеют по крайней мере один аминокислотный остаток в молекуле антитела, замененный другим остатком. Сайты, представляющие наибольший интерес для заместительного мутагенеза, включают гипервариабельные области, но изменения РК также рассматриваются. Консервативные замены представлены в табл. 1 патента США № 7812133, кол. 43, ст. 55 до кол. 44 ст. 49, включены в настоящий документ путем ссылки и под заголовком "предпочтительные замены". Если такие замены приводят к изменению биологической активности, то более существенные изменения, названные "типичные замены" в табл. 1, или как описано далее в отношении классов аминокислот, могут быть введены и продукты проскринированы.

Кроме того, существенные модификации биологических свойств антитела достигаются путем выбора замен, которые значительно отличаются по их влиянию на поддержание (а) структуры полипептидного остова в области замены, например, листа или спиральной конформации, (б) заряда или гидрофобности молекулы в целевом сайте, или (в) основной части боковой цепи. Натуральные остатки делятся на группы на основе общих свойств боковой цепи: (1) гидрофобные: норлейцин, те!, а1а, уа1, 1еи, Не; (2) нейтральные гидрофильные: Су8, 8ег, ТЬг, Акп, С1п; (3) кислые: Акр, С1и, (4) основные: Ык, 1у8, агд; (5) остатки, влияющие на ориентацию цепи: д1у, рго; и (6) ароматические: !гр, 1уг, рЬе. Неконсервативные замены повлекут за собой замену члена одного из этих классов на другой класс.

Для экспрессии антител или детерминант антител, описанных в настоящем документе, ДНК, кодирующие частичные или полноразмерные легкие и тяжелые цепи, полученные как описано выше, вводятся в векторы экспрессии таким образом, что гены функционально связаны с последовательностями, управляющими транскрипцией и трансляцией. В этом контексте термин "функционально связанный" предназначен для обозначения того, что ген антитела лигируют в вектор таким образом, что последовательности, управляющие транскрипцией и трансляцией, в векторе служат своему целевому предназначению регуляции транскрипции и трансляции гена антитела. Вектор экспрессии и последовательности, контролирующие экспрессию, выбираются таким образом, чтобы они были совместимы с используемой

- 24 029793

экспрессирующей клеткой-хозяином. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела могут быть вставлены в отдельный вектор или, что более типично, оба гены вставляют в один и тот же вектор экспрессии. Гены антител вставляются в вектор экспрессии с помощью стандартных способов (например, лигирование комплементарных сайтов рестрикции на фрагменте гена антитела и вектора или лигирование тупых концов, если нет сайтов рестрикции).

На фиг. 23 показана одна такая схематическая структура вектора экспрессии для антитела Ни106222 1дС1/каппа. Двигаясь по часовой стрелке с сайта δа1I наверху, плазмида содержит транскрипционный участок тяжелой цепи, начинающийся с главного предраннего промотора цитомегаловируса человека (СМУ) и энхансера (СМУ промотор) для инициации транскрипции гена тяжелой цепи антитела. За СМУ промотором следует экзон УН, геномная последовательность, содержащая гамма-1 константную область тяжелой цепи человека, включающая экзоны СН1, шарнира, СН2 и СН3 с промежуточными интронами и сайт полиаденилирования за экзоном СН3. После последовательности гена тяжелой цепи с СМУ промотора начинается участок транскрипции легкой цепи, за которым следует экзон УЬ и геномная последовательность, содержащая экзон цепи каппа константной области человека (СЬ) с предшествующим интроном, и сайт полиаденилирования после экзона СЬ. После гена легкой цепи следует предранний промотор δУ40 ^У40 промотор), ген ксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы Е. сой (др!) и сегмент, содержащий сайт полиаденилирования δУ40 ^У40 поли(А) сайт). В конце плазмида содержит часть плазмиды риС19, содержащую бактериальную точку начала репликации (риС оп) и ген беталактамазы (бета-лактамаза). Локализация соответствующих сайтов рестрикции ферментов показана на фигуре. Рекомбинантный вектор экспрессии может кодировать сигнальный пептид, который способствует секреции цепи антитела из клетки-хозяина. Ген цепи антитела может быть клонирован в вектор таким образом, что сигнальный пептид связан в рамке с амино-концом гена цепи антитела. Сигнальный пептид может быть сигнальным пептидом иммуноглобулина или гетерологичным сигнальным пептидом (т.е. сигнальный пептид из неиммуноглобулинового белка).

Как отмечалось выше, в дополнение к генам цепей антитела рекомбинантные векторы экспрессии, соответствующие изобретению, несут регуляторные последовательности, которые контролируют экспрессию генов цепи антитела в клетке-хозяине. Термин "регуляторная последовательность" предназначен для охватывания промоторов, энхансеров и других элементов, контролирующих экспрессию (например, сигналы полиаденилирования), которые контролируют транскрипцию или трансляцию генов цепи антитела. Такие регуляторные последовательности описаны, например, в Соеббе1; Семе Ехргсккюп Тесйгю1оду: Ме!йобк ίη Εηζутο1οду 185, Асабетк Ргекк, δаη О1едо, СаНГ. (1990). Следует понимать, что дизайн вектора экспрессии, включая выбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина для трансформации, желаемый уровень экспрессии белка и т.д. Предпочтительные регуляторные последовательности для экспрессии в клетке-хозяине млекопитающих включают вирусные элементы, которые направляют экспрессию белка в клетках млекопитающих на высоком уровне, такие как промоторы и/или энхансеры, выделенные из цитомегаловируса (СМУ) (такие как промотор/энхансер СМУ), вирус δίιηίηη 40 ^У40) (такие как промотор/энхансер δУ40), аденовирус (например, аденовирусный главный поздний промотор (АбМЬР)) и полиома. Для дальнейшего описания вирусных регуляторных элементов и их последовательностей см., например, патент США № 5168062, διίηδίά, патент США № 4510245, Ве11 е! а1., патент США № 4968615, δΦιηΓΓικΓ е! а1., патент США № 5464758, Вщагб е! а1., и патент США № 5654168, Вщагб е! а1.

В дополнение к генам цепей антитела и регуляторным последовательностям рекомбинантные векторы экспрессии, соответствующие изобретению, могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, регулирующие репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, точки начала репликации) и гены селектируемых маркеров. Ген селектируемого маркера облегчает селекцию клетки хозяина, в которую был интродуцирован вектор (см., например, патенты США № 4399216, 4634665 и 5179017, все А\е1 е! а1.). Например, в типичном случае ген селектируемого маркера обусловливает устойчивость к лекарственным веществам, таким как С418, гигромицин или метотрексат клеткихозяина, в которую был интродуцирован вектор. Предпочтительные гены селектируемых маркеров включают ген дигидрофолатредуктазы (ЭНРК) (для применения в бйГг.кцр.-клетках-хозяевах с селекцией/амплификацией, основанной на метотрексате) и ген псо (для селекции, основанной на С418).

Для экспрессии легких и тяжелых цепей вектор(ы) экспрессии, кодирующий(щие) тяжелую и легкую цепи, трансфицируют в клетку-хозяин с помощью стандартных способов. Различные трактовки термина "трансфекция" преднаначены для включения широкого ряда способов, обычно используемых при интродукции экзогенной ДНК в прокариотную или эукариотную клетку-хозяина, например электропорацию, преципитацию фосфатом кальция, трансфекцию с помощью ЭЕАЕ-декстрана и т.п. Хотя теоретически является возможным экспрессировать антитела, соответствующие изобретению, либо в прокариотных, либо в эукариотных клетках-хозяевах, экспрессия антител в эукариотных клетках и, наиболее предпочтительно, в клетках-хозяевах млекопитающих является наиболее предпочтительной, поскольку такие эукариотные клетки и особенно клетки млекопитающих более вероятно, чем прокариотные клетки, собирают и секретируют правильно образованное и иммунологически активное антитело. Клеткихозяева млекопитающих для экспрессии рекомбинантных антител, описанные в настоящем документе,

- 25 029793

включают яичник китайского хомячка (клетки СНО) (такие как клетки ОНРК-СН0, описанные в Иг1аиЬ апй СЬавш, (1980) Ргос. №И. Асай. δα. υδΛ 77:4216-4220, использованные с селективным маркером ОНРК, например, как описано в К. 1. Каиктап апй Р. А. δΑτρ, (1982) Мо1. Вю1. 159:601-621), клетки шеломы Νδ0, клетки ί',Όδ и клетки δР2. Когда рекомбинантные векторы экспрессии, кодирующие гены антитела, интродуцируют в клетки-хозяева млекопитающих, антитела образуются при культивировании клеток-хозяев в течение периода времени, достаточного для экспрессии антитела в клетке-хозяине или секреции антитела в культуральную среду, в которой выращивают клетки-хозяева. Антитела могут быть выделены из культуральной среды с использованием стандартных способов очистки белков.

Клетки-хозяева также могут быть использованы для получения детерминант интактных антител, таких как РаЬ-фрагменты или молекулы δсΡν. Следует понимать, что варианты вышеописанной процедуры входят в объем настоящего изобретения. Например, может быть желательно трансфицировать клетку-хозяина ДНК, кодирующей либо легкую цепь, либо тяжелую цепь (но не обе) антитела, соответствующего изобретению. Технология рекомбинантной ДНК также может быть использована для удаления некоторых или всех ДНК, кодирующих отдельно или обе легкую и тяжелую цепи, которые не являются необходимыми для связывания 0X40. Молекулы, экспрессируемые с таких усеченных молекул ДНК, также охватываются антителами, соответствующими изобретению. Также могут быть получены бифункциональные антитела, в которых одна тяжелая и одна легкая цепь являются антителом, соответствующим изобретению, а другая тяжелая и другая легкая цепь специфичны к антигену, отличному от 0X40 путем перекрестного сшивания антитела, соответствующего изобретению, со вторым антителом с помощью стандартных химических способов перекрестного сшивания.

Фармацевтические композиции и фармацевтическое применение

Антитела и детерминанты антител, соответствующие изобретению, могут быть включены в фармацевтические композиции, пригодные для введения субъекту. Как правило, фармацевтическая композиция содержит антитело или детерминанту антитела, соответствующие изобретению, и фармацевтически приемлемый носитель. В настоящем документе "фармацевтически приемлемый носитель" включает любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие абсорбцию агенты и т.п., которые являются физиологически совместимыми. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают один или несколько: воду, физиологический раствор, фосфатный буферный раствор, декстрозу, глицерин, этанол и т.п., а также их комбинации. Во многих случаях будет предпочтительно включать в состав изотонические агенты, например сахара, многоатомные спирты, такие как маннит, сорбит или хлорид натрия. Фармацевтически приемлемые носители могут дополнительно содержать незначительные количества вспомогательных веществ, таких как увлажнители или эмульгаторы, консерванты или буферы, которые увеличивают срок хранения или эффективность антитела, или детерминанты антитела.

Антитела и детерминанты антител, соответствующие изобретению, могут быть включены в фармацевтическую композицию, подходящую для парентерального введения (например, внутривенного, подкожного, внутрибрюшинного, внутримышечного). Композиции, соответствующие изобретению, могут быть в различных формах. К ним относятся, например, жидкие, полутвердые и твердые лекарственные формы, такие как жидкие растворы (например, инъекционные и инфузионные растворы), дисперсии или суспензии, таблетки, пилюли, порошки, липосомы и суппозитории. Предпочтительная форма зависит от предполагаемого способа введения и терапевтического применения. Типичные композиции - в виде инъекционных и инфузионных растворов, таких как композиции, похожие на те, которые используются для пассивной иммунизации людей другими антителами. Антитело можно вводить путем внутривенной инфузии или инъекции, или внутримышечной, или подкожной инъекции.

Путь и/или способ введения будет изменяться в зависимости от желаемых результатов. В некоторых вариантах осуществления изобретения активное соединение может быть приготовлено с носителем, который будет защищать соединение от быстрого высвобождения, например, как формы с контролируемым высвобождением, включая имплантаты, трансдермальные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Могут быть использованы биоразлагаемые, биосовместимые полимеры, например этилвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Многие способы получения таких препаратов запатентованы или известны специалистам в данной области. См., например, δ^Αί^ά апй Сойто11ей Ке1еа§е Эгид ОеПуегу δуδΐетδ, I К. КоЬшвоп, ей., Магсе1 Эеккег, 1пс., Νον Уотк, 1978.

Дополнительные активные соединения также могут быть включены в композиции. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или детерминанта антитела, соответствующие изобретению, комбинируются и/или вводятся совместно с одним или несколькими дополнительными терапевтическими агентами, которые являются полезными для лечения нарушений, в которых инактивация 0X40 приносит вред. Например, антитело к 0X40 или детерминанта антитела, соответствующие изобретению, могут комбинироваться и/или вводятся совместно с одним или несколькими дополнительными антителами, которые связываются с другими целями (например, антитела, которые связываются с другими цитокинами или которые связываются с молекулами клеточной поверхности). Кроме того, одно или несколько антител, соответствующих изобретению, могут быть использованы в сочетании с двумя или бо- 26 029793

лее из вышеупомянутых лекарственных средств. Такие комбинированные препараты могут с успехом использовать более низкие дозы вводимых терапевтических агентов, что позволяет избежать возможных токсических эффектов или осложнений, связанных с различными монопрепаратами. Опытному специалисту-практику понятно, что когда антитела, соответствующие изобретению, используются как часть комбинированной терапии, желательными могут быть более низкие дозы антител, чем когда субъекту вводится только антитело (например, синергический терапевтический эффект может быть достигнут за счет использования комбинированной терапии, что в свою очередь, позволяет использовать более низкую дозу антител для достижения желаемого терапевтического эффекта).

Антитела, описанные в настоящем документе, или их антигенсвязывающие детерминанты могут быть использованы отдельно или в комбинации для лечения таких заболеваний. Следует понимать, что эти антитела или их антигенсвязывающие детерминанты можно использовать отдельно или в комбинации с дополнительным агентом, например терапевтическим агентом, упомянутым дополнительным агентом, выбранным специалистом для употребления. Например, дополнительным агентом может быть терапевтическое средство, принятое в данной области, полезное для лечения заболевания или состояния, которое лечат антителом, изложенном в настоящем документе. Дополнительным агентом также может быть агент, который придает полезные свойства терапевтической композиции, например агент, который влияет на вязкость композиции.

Фармацевтические композиции, описанные в настоящем документе, могут включать "терапевтически эффективное количество" или "профилактически эффективное количество", антитела или детерминанты антитела, соответствующих изобретению. "Терапевтически эффективное количество" относится к количеству, эффективному в дозах и в течение периода времени, необходимого для достижения желаемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество антитела или детерминанты антитела могут варьировать в зависимости от таких факторов, как состояние заболевания, возраст, пол и вес человека, и способности антитела или детерминанты антитела вызвать желаемый ответ индивида. Терапевтически эффективное количество является также количеством, при котором любые токсичные или вредные эффекты антитела или детерминанты антитела перевешиваются терапевтически полезными эффектами. "Профилактически эффективное количество" относится к количеству, эффективному в дозах и в течение периода времени, необходимого для достижения желаемого профилактического результата.

Режимы дозирования могут быть скорректированы для обеспечения оптимального желаемого ответа (например, терапевтического или профилактического ответа). Например, можно принимать один болюс, несколько разделенных доз могут быть приняты в течение времени или доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена, что диктуется конкретной терапевтической ситуацией. Наиболее выгодно создавать парентеральные композиции в стандартных лекарственных формах для простоты применения и однородности дозировки. Стандартная лекарственная форма, как используется в настоящем документе, относится к физически дискретным единицам, пригодным в качестве стандартных доз для млекопитающих, которых будут лечить; каждая единица содержит заданное количество активного вещества, рассчитанное для получения желаемого терапевтического эффекта в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем. Спецификация на стандартную лекарственную форму диктуется и напрямую зависит от (а) уникальных характеристик активного соединения и конкретного лечебного или профилактического эффекта, который необходимо достичь, и (б) ограничений, присущих области создания рецептуры, например активное соединение для лечения чувствительности у людей.

Пример I.

Химерные и гуманизированные моноклональные антитела 106-222 1§С1/каппа (СЬ222 и Ни222 соответственно) очищали из супернатантов культуры соответствующих стабильных трансфектантов N80. используя протеин-А-колонку, как описано в приложениях А и В. Ни222 элюировали с колонки двумя различнымии способами. Вкратце, Ни222 Серия I элюировали буфером с низким рН и Серия II буфером для элюирования Иегсе'з СсШ1с Ад/АЬ. Выход Ни222 был лучше при использовании буфера с низким рН. СЬ222 элюировали с колонки буфером для элюирования Оепбе Ад/АЬ.

Очищенные антитела Ни222 Серия I и II характеризовались 8Ό8-ΡΑΟΕ наряду с мышиным 106-222 в соответствии со стандартными процедурами. 5 мкг каждого антитела были проанализированы в восстановительных условиях. Как показано на фиг. 21, каждое из антител Ни222 Серия I и II состоит из тяжелой цепи с молекулярной массой около 50 кДа и легкой цепи с молекулярной массой около 25 кДа. Чистота Ни222 Серия I и II антител оказалась более 95%.

Эндотоксиновая контаминация гуманизированных антител была проанализирована с использованием набора Ьоп/аТ Ыти1и8 ΑтеЬοсуΐе Еу5а1е (ЬАЬ) ОСЕ-1000. Уровень эндотоксинов был менее 0,5 ЕЭ/мг белка для антител Ни222 Серия I и II.

Исследование связывания Ни106-222 с клетками Ь/0Х40

Связывание мышиных антител 106-222, СН106-222 и Ни106-222 с 0X40 было изучено РАС8 анализом связывания с клетками Ь/Ь0Х40 в соответствии с протоколом, предоставленным Όγ. Байга Воуег. Антитела, связанные с клетками Ь/Ъ0Х40, были обнаружены при помощи меченного фикоэритрином козьего антимышиного !дС антитела (для мышиного 106-222) или меченного фикоэритрином козьего !дС античеловеческого антитела (для СН106 и Ни 106).

- 27 029793

Фиг. 22 демонстрирует анализ мышиных антител 106-222, СЫ06 и Ни106-222 (Серия II) на связывание с клетками Ь/ОХ40. Кривая титрования Ни106-222 (Серия II) была почти идентична такой же кривой для СН106-222, указывая на то, что афинность связывания антигена мышиным 106-222 сохраняется в Ни106-222. Кривая титрования мышиного 106-222 была похожа на такие же кривые для СН106 и Ни106, однако из-за разницы вторичных антител, данные только указывают на то, что афинность мышиного 106222 схожа с афинностью Ни106-222.

Фиг. 24 демонстрирует сравнение между антителами Ни106-222 Серия I и II на связывание с клетками 12НОХ40. Хотя необходим дальнейший анализ, афинность двух лотов Ни106-222 оказалась похожей, если не идентичной, друг к другу. Таким образом, кислотное элюирование Ни106-222 из протеин-Аколонки похоже, не влияет на его афинность.

Очистка СН106-222

N80 стабильный трансфектант С8 выращивали в 500 мл среды Ыуйгодеп'з НуЪпбота 8ТМ в роллер-флаконе до истощения. Культуру центрифугировали в центрифужной пробирке Согптд на 250 мл (кат. № 430776) в центрифуге А11едга Весктап СоиЙег Х-12К (2000 КРМ в течение 15 мин). Культуральный супернатант вносили в колонку 1 мл ОЕ НеаЙЬсаге ЮТгар МаЪ8е1ес1 8иКе (кат. № 11-034-95) с помощью насоса РЬагтас1а Р1. Колонку промывали буферизированным физиологическим раствором ТЫ8 (Р1егсе, кат. № 28379) и элюировали буфером для элюирования Р1егсе'§ Оепйе Ад/АЪ (кат. № 21027). Фракции (около 1 мл) собирали и снимали их ОП при 280 нм._

№ фракции	ОП при 280 нм
3	0, 12
4	0,30
5	0, 18
6	0, 11

Фракции 3-6 объединяли (объем = 3,0 мл, ОП при 280 нм = 0,14). Объединенные фракции обессоливали на средней колонке 10 мл 8ерЬабех О25 против РВ8. Фракции объемо м 1 мл были собраны.

№ фракции	ОП при 280 нм
5	0, 09
6	0, 19
7	0, 12
8	0, 12
9	0, 00

Фракции 6-9 объединяли (объем = 3,0 мл, ОП при 280 нм = 0,11). Объединенные фракции диализовали в течение ночи против РВ8. После диализа объем составил 3,0 мл и ОП при 280 нм была 0,19. Этот препарат называется СН106, серия 8/31/09 с концентрацией 0,13 мг/мл.

Очистка Ни106-222

N80 стабильный трансфектант 1-С6 выращивали в 500 мл среды Шуйтодеп'з НуЪпбота 8ТМ в роллер-флаконе до истощения. Культуру центрифугировали в центрифужной пробирке Согшпд на 250 мл (кат. № 430776) в центрифуге А11едга Весктап СонНег Х-12К (2000 КРМ в течение 15 мин).

Серия 1: 150 мл супернатанта культуры были загружены в колонку 1 мл ОЕ НеаКЬсаге НПгар МаЪ8е1ес1 8иКе (кат. № 11-034-95) с помощью насоса РЬагтас1а Р1. Колонку промывали РВ8 и связанное антитело элюировали 0,1 М глицин-НС 1, 0,1 М ХаС1 (рН 3,0). Элюированные фракции (1 мл каждая) собирали в пробирки, содержащие 50 мкл 1М Тп§-НС1 (рН 8,0)._

№ фракции	ОП при 280 нм
2	0, 88
3	2,84
4	1,29
5	0, 63
6	0, 18

Фракции 2-5 объединяли (объем = 4,2 мл, ОП при 280 нм = 1,59). Объединенные фракции диализовали в течение ночи против РВ8. После диализа объем составил 4,2 мл и ОП при 280 нм была 1,54. Раствор антитела (серия 9/18/09 I; 1,1 мг/мл) был простерилизован посредством фильтрации.

Серия II: Оставшийся супернатант культуры (350 мл) вносили в колонку 1 мл ОЕ НеаКЬсаге ШТгар МаЪ8е1ес1 8иКе с помощью насоса РЬагтас1а Р1. Колонку промывали буферизированным физиологическим раствором ТМ8 и элюировали буфером для элюирования Р1егсе'§ ОепЙе Ад/АЪ. Фракции (около 1 мл) собирали и снимали их ОП при 280 нм.

- 28 029793

Фракции 3-7 объединяли (объем = 4,2 мл, ОП при 280 нм = 1,22). Колонку промывали буферизированным физиологическим раствором ТК18 и антитела элюировали 0.1 М глицин-НС1, 0,1 М ΝαΟ (рН 3,0), чтобы определить, было ли элюирование элюирующим буфером ОепИеАд/АЪ достаточным.

Фракции 3-7, элюированные элюирующим буфером ОепЙеАд/АЪ, объединяли и обессаливали на средней колонке 10 мл ЗерйаТех Θ25 в ΡΒδ. Фракции объемом 1 мл были собраны.

№ фракции	ОП при 280 нм
4	0,38
5	0, 96
6	1,38
7	1,33
8	1,10
9	0, 12

Фракции 5-8 объединяли (объем = 4,0 мл, ОП при 280 нм = 1,12). Объединенные фракции диализовали в течение ночи против ΡΒδ. После диализа объем составил 4,0 мл и ОП при 280 нм была 1,12. Раствор антител (серия 9/18/09 II; 0,8 мг/мл) был простерилизован посредством фильтрации.

Способ высокосолевого элюирования буфером для элюирования Р1егсе'Б ОепЙе Ад/АЪ был не так эффективен, как способ низкого рН для элюирования связанного антитела 1дО1 человека из протеин-Абелковой колонки. Так как антитела не элюировались в острый пик буфером для элюирования ОепИе Ад/АЪ, необходимо было объединить многие фракции для сбора элюированного 1дО и опреснить объединенные фракции перед диализом. Слабый профиль элюирования буфером для элюирования ОепИе Ад/АЪ и дополнительные стадии очистки повлияли на выход антитела. Рекомендуется использовать способ высокосолевого элюирования только тогда, когда 1дО, который необходимо очистить, является кислотолабильным.

Пример II.

Для оценки способности наших гуманизированных антител к 0X40 человека усиливать Т-клеточну пролиферацию мы провели анализы пролиферации с использованием покрытых анти-СЭЗ клеток СЭ32Ь и свежеотсортированных наивных СР4+ Т-клеток.

Клон 106-222 (Ни222-АА) РсК-связывающего мутировавшего гуманизированного МАт к 0X40 человека и химерный клон 106-222 (СР222) МАт к ОХ40 человека усиливали анти-СР3-стимулированную пролиферацию наивных СР4+ Т-клеток. Эти антитела имеют схожую стимулирующую активность по сравнению с родительскими мышиными МАт к 0X40 человека (Моизе 106-222). Тем не менее, полностью гуманизированное Ат к ОХ40 человека, Ни106, не усиливало пролиферации Т-клеток. (фиг. 25)

Для оценки способности гуманизированных антител к 0X40 человека блокировать суппрессивную функцию СР4+ регуляторных Т-клеток (Тгедз) мы провели анализ пролиферации с использованием свежеотсортированных наивных СР4+ Т-клеток и СТ)4'СТ)25^|11д|1СТ)127¹⁰" Тгедз. Мы обнаружили, что химерное антитело СЫ22 и мутировавшее Рс-связывающее гуманизированное антитело (Ни122-АА) проявляли большую силу, чем родительские мышиные МАт к 0X40 человека (Моизе122) в блокировании суппрес- 29 029793

сивной функции СЭ4' Тгед. (фиг. 29 А-В)

В эксперименте на фиг. 27 свежеотсортированные наивные СО4'СО25^1о'“СО127'СО45КО^-СО45КА' Т-клетки стимулировали Ь-клетками, экспрессирующими СЭ32 (СО32-Ь), покрытыми 4-мя концентрациями анти-СО3-антитела плюс 2 мкг/мл антител клона 119 АТ к 0X40 человека или контрольными антителами. Через 3 дня после стимуляции был добавлен радиоизотоп тритий и культивирование продлилось в течение дополнительных 16-18 часов до сбора клеток. Данные представляют эксперименты от двух доноров. СО32-Ц клетки, экспрессирующие лиганд НОХ40 (СО32-Ь/ЬОХ40Ь), выступают в качестве положительного контроля, в то время как антитела изотипа 1дО1 мыши и человека служат в качестве отрицательных контролей.

В эксперименте на фиг. 25 свежеотсортированные наивные СЭ4' Т-клетки стимулировали клетками СО32-Ь, покрытыми 4 концентрациями анти-СЭ3 антитела плюс 2 мкг/мл антител клона 106-222 (Ни222) МАт к ОХ40 человека или контрольными антителами. Через три дня после стимуляции был добавлен радиоизотоп тритий и культивирование продлилось в течение дополнительных 16-18 ч до сбора клеток. Данные представляют эксперименты от двух доноров. СО32-Ь/ЬОХ40Ь выступают в качестве положительного контроля, в то время как антитела изотипа 1дО1 мыши и человека служат в качестве отрицательного контроля.

Пример III.

Поскольку антитела будут встречаться с мононуклеарными клетками периферической крови (МКПК), когда они вводятся пациентам при помощи внутривенной инъекции, мы проверили способность наших антител к ОХ40 человека стимулировать пролиферацию Т-клеток с использованием МКПК в качестве антиген-репрезентирующих клеток (АРК) в наших анализах пролиферации. Однако мы получили очень переменные данные с нашими мышиными МАт к ОХ40 человека при использовании МКПК в качестве АРК, что не наблюдается при использовании моноцитов в качестве АРК и позволяет предположить, что наши антитела требуют некоего перекрестного сшивания для активности. Чтобы проверить эту возможность, пластины были покрыты нашими МАт к ОХ40 человека и анти-СО3, промыты и использованы для стимуляции пролиферации СЭ4' или СЭ8' Т-клеток в отсутствие вспомогательных клеток. Фиг. 26 демонстрирует результаты, которые показывают, что антитела к ОХ40 человека усиливают пролиферацию СЭ4' и СЭ8' Т-клеток.

Свежеотсортированные 1х10⁵ СО4⁺СО25^1о"СО45КО^-СО45КА⁺ наивные Т-клетки (фиг. 26А) или ί'.Ό3'ί'.Ό8' Т-клетки (фиг. 26В) стимулировали анти-СЭ3 (3 мкг/мл), нанесенными на пластины, и мышиным МАт к ОХ40 человека (2 мкг/мл). Меченный тритием тимидин был добавлен на третий день культивирования, и клетки собирали после следующих 15 ч инкубации. Пролиферацию Т-клеток оценивали по захвату тимидина. МАт к ОХ40 человека были получены от трех гибридомных слияний. Номера после номера слияния обозначают специфическое антитело. Антитела мыши изотипа 1дО1 и 119-42 служили в качестве отрицательных контролей. Каждая процедура была выполнена трижды. Репрезентативные данные от 4 доноров Т-клеток представлены на фигуре. (фиг. 26С) Все три версии гуманизированных МАт к ОХ40 человека [Ни106-222 и Ни119-122; Ни106-222АА и Ни119-122АА (АА обозначает, что двое из Рссвязывающих остатков мутировали в аминокислоту аланин) и СЫ19-122 (похож на гуманизированное 119-122 за исключением того, что "паратоп" мышиной вариабельной области был сохранен)] стимулировали пролиферацию наивных СЭ4' Т-клеток. Анти-СО28 служил в качестве положительного контроля.

Как изображено на фиг. 26, панели А и В показывают, что связанные с пластиной мышиные МАт к ОХ40 человека мощно стимулировали пролиферацию наивных СЭ4' Т-клеток и СЭ8' Т-клеток в диапазоне от 10 до 40 раз. Мы расширили наши исследования наших гуманизированных МАт к ОХ40 человека и обнаружил, что три версии наших гуманизированных антител, если они полностью гуманизированны, химерных или имеющих мутантов АА, в которых остатки, отвечающие за связывание с рецептором Рс, были изменены на аланин, были мощными стимуляторами пролиферации наивных СЭ4' Т-клеток (фиг. 26С).

Фиг. 27 демонстрирует, что мышиные и гуманизированные антитела к ОХ40 человека требуют перекрестного сшивания для усиления Т-клеточной пролиферации.

Свежеотсортированные наивные СЭ4' Т-клетки стимулировали анти-СЭ3 (3 мкг/мл), связанными с пластиной, плюс со связанными с пластиной или растворимыми гуманизированными МАт к ОХ4 человека (2 мкг/мл) в отсутствие вспомогательных клеток. Меченный тритием тимидин был добавлен на третий день культивирования и клетки собирали после следующих 15 ч инкубации. Пролиферацию Т-клеток оценивали по захвату тимидина. Антитела мыши изотипа 1дО1 и анти-СЭ28 служили отрицательным и положительным контролем, соответственно. Репрезентативные данные от двух доноров показаны на фигуре. Наивные СЭ4' Т-клетки были стимулированы анти-СО3, связанными с пластиной, в отсутствии вспомогательных клеток. На следующий день было добавлено МАт к ОХ40 человека 119-122 (2 мкг/мл) отдельно или в комбинации с равным количеством вторичных антител против Рс. Пролиферацию клеток оценивали, как описано в панели А.

Сила наших гуманизированных МАт к ОХ40 человека Ни106-222 и Ни119-122 была сопоставима с анти-СЭ28. Напротив, когда растворимое антитело к ОХ40 человека было добавлено в культуру Тклеток, стимулирующий эффект был упразднен. (Фиг. 27А). Однако, когда растворимое МАт к ОХ40

- 30 029793

человека 119-122 было добавлено вместе с Р(аЬ')₂-фрагментом козьего антимышиного 1дС. Ре-фрагмент специфическим вторичным антителом. стимулирующий эффект был восстановлен (фиг. 27В). Эти результаты показывают. что МАт к 0X40 человека требуют перекрестного сшивания для их биологических активностей.

Для оценки способности наших агонистических. МАт к 0X40 человека блокировать супрессивную функцию СЭ4'СО25^й|дйСЭ12Т пТгедк. мы провели анализы пролиферации в присутствии С04'СЭ25^|о^С0127'СЭ45Р0' эффекторных Т-клеток (Тей) и СЭ4' пТгедк. Используя нашу систему. связанную с пластиной. в которой МАт к 0X40 человека вместе с анти-СЭ3 наносили на пластину и в отсутствие вспомогательных клеток двенадцать (222. 132. 8В. 33А. 43. 58В. 122. 157А. 173В. 220С. 140А. 270) наших мышиных МАт к 0X40 человека сильно ингибировали супрессию пТгед (фиг. 28А и 28В). Хотя соотношение пТгедк к эффекторным Т-клеткам. используемое в этих анализах. было 1:1. эти антитела способны стимулировать пролиферацию эффекторных Т-клеток от 10 до 35% выше процента. достигаемого эффекторными Т-клетками в отсутствии пТгедк. Наши гуманизированные МАт к 0X40 человека также обращали супрессивную функцию пТгедк на схожих уровнях (фиг. 28С). Эти результаты. рассматриваемые вместе. позволяют предположить. что наши мышиные МАт к 0X40 человека являются мощными стимуляторами 0X40. которые значительно усиливают пролиферацию Т-клеток и ингибируют супрессивную функцию пТгед. Кроме того. наши гуманизированные МАт к 0X40 человека сохраняли сильную биологическую активность родительских мышиных антител.

Фиг. 28 демонстрирует. что МАт к 0X20 человека блокирует активность С^4⁺Р0XΡ3⁺пТ^ед8. Меченные СР8Е СЭ4'СЭ25^-СЭ45Р0' эффекторные Т-клетки и С^4'Р0XΡ3' Тгедк были получены от одного и того же здорового донора. Т-клетки стимулировали растворимым анти-СЭ28 (0.5 мкг/мл) и антиСЭ3 (3 мкг/мл). связанным с пластиной. и МАт к 0X40 человека (2 мкг/мл). Пролиферацию эффекторных Т-клеток оценивали с помощью проточной цитометрии СР8Е разведения. Соотношение пТгедк к эффекторным Т-клетками было 1:1. Антитела мыши изотипа 1§01 служили в качестве отрицательного контроля. Наивные СЭ4' Т-клетки служили как контрольные Т-клетки. чтобы продемонстрировать специфическое ингибирование пролиферации эффекторных Т-клеток пТгедк. Фиг. 28А является репрезентативными данными РАС8. показывающими пролиферацию эффекторных Т-клеток в присутствии наивных СЭ4' Т-клеток. пТгедк или пТгедк плюс МАт к 0X40 человека 119-33А. Фиг. 28В показывает процент пролиферации эффекторных Т-клеток в присутствии пТгедк после обработки мышиным МАт к 0X40 человека (20 проверенных). Фиг. 28С показывает все три версии гуманизированных МАт к 0X40 человека. восстановивших пролиферацию эффекторных Т-клеток.

Недавний отчет говорит о том. что триггирование 0X40 может индуцировать апоптоз линии Тклеток человека. экспрессирующих ОХ40 (УокЫаИ Такайакй е! а1.. 200В. Αίάκ Кекеагсй апб йишап Ке!гоу1ги8е8. 24). Поэтому мы протестировали эффект увеличения концентраций МАт к 0X40 человека 106222 в сочетании с фиксированной. низкой дозой анти-СЭ3 на выживаемость трех субпопуляций Т-клеток в присутствии моноцитов. Фиг. 29А показывает. что высокие концентрации МАт к ОХ40 человека 106222 (20-30 мкг/мл) преимущественно убивали активированные Р0XΡ3⁺ пТгедк. в то время как активированные наивные и СЭ4' Т-клетки памяти были либо устойчивы. либо менее восприимчивы к этому. Чтобы проверить. непосредственно ли МАт к ОХ40 человека действует на Тгедк и вызовет гибель клеток. мы провели новые эксперименты в отсутствии вспомогательных клеток. Фиг. 29В показывает. что сильная активация ОХ40 в сочетании с анти-СЭ3 специфично убивает пТгедк в отсутствие вспомогательных клеток. Чтобы подтвердить. что поражающие эффекты. опосредованные МАт к 0X40 человека. имитировали триггирование 0X40 натуральным лигандом 0X40. мы использовали клеток мышиные фибробласты линии Ь. которые сверхэкспрессируют 10X400 и использовали их для стимулирования пТгедк в присутствии низкой дозы анти-СЭ3 и получили аналогичные поражающие эффекты на пТгедк (фиг. 29С). Эти результаты позволяют предположить. что сильное триггирование 0X40 убивает ОХ40-экспрессирующие Тгедк-клетки.

В частности. фиг. 29 демонстрирует. что высокие концентрации МАт к 0X40 человека преимущественно убивают Р0XΡ3⁺ Тгедк. На фиг. 29А каждая субпопуляция Т-клеток (наивные.

ΟΌ4⁺ΟΌ25^1ο'^ϊΟΌ127⁺ΟΌ45ΚΌ^-ΟΌ45ΚΑ⁺; клетки памяти. ΟΌ4⁺ΟΌ25^1ο'^ϊΟΌ127⁺ΟΌ45ΚΑ^-ΟΌ45ΚΌ⁺ и пТгедк. СЭ4'С025^|"^д||СЭ127^|о'“) были культивированы с равным соотношением СЭ14' моноцитов в присутствии растворимого анти-СЭ3 (0.3 мкг/мл) и повышающимися концентрациями мышиного МАт к ОХ40 человека 106-222. Жизнеспособность клеток определяли после 3 дней культивирования с помощью проточного цитометрического анализа. проведенного на жизнеспособных лимфоцитах. Данные от двух доноров Т-клеток показаны на фигуре. Фиг. 29В и 29С описывают. что сильное триггирование ОХ40 убивает С^4'Р0XΡ3' Тгедк. Фиг. 29В демонстрирует. что С^4⁺Р0XΡ3⁺ Тгедк были стимулированы анти-СЭ3 (2 мкг/мл). связанного с пластиной. а также растворимым МАт 119-122 (30 мкг на миллион клеток) или контрольным мышиным антителом изотипа 1дО1. Через один день культивирования на гемацитометре были подсчитаны живые трипан-отрицательные клетки. Фиг. 29С показывает. что С^4'Р0XΡ3' Тгедк стимулировали растворимым анти-СЭ3 (0.2 мкг/мл) плюс Ь-клетками или Ь-клетками. экспрессирующими лиганд 10X40 (010X4(0). Живые клетки подсчитывали после одного дня стимуляции.

Далее мы стремились определить. воздействует ли МАт к ОХ40 человека непосредственно на Т- 31 029793

клетки, чтобы блокировать супрессорную функцию пТгед. Свежеотсортированные СБ4⁺ эффекторные Тклетки или пТтедк были предварительно активированы в течение ночи с анти-СБ3 и активированы МАт к ОХ40 человека в течение 4 ч. Эффекторные Т-клетки затем промывали, метили СР8Е и сокультивировали с пТтедк в присутствии равного количества СБ14+ моноцитов и анти-СБ3. Аналогично предварительно простимулированные пТтедк промывали и культивировали с необработанными меченными СР8Е эффекторными Т-клетками.

Фиг. 30 показывает, что МАт к ОХ40 человека непосредственно воздействуют на Т-клетки для блокирования супрессорной функции Ттедк. Фиг. 30А показывает, что МАт к ОХ40 человека воздействует непосредственно на эффекторные Т-клетки памяти, чтобы придать им устойчивость к супресси пТтедк. СБ4⁺ СБ25^1о"СБ127⁺СБ45КА^-СБ45КО⁺ Т-клетки памяти стимулировали анти-СБ3 (0,8 мкг/мл), связанным с пластиной, в культуральной среде (КРМ1/10% РС8/Р/8 плюс ИЛ-2 при 30 МЕ/мл) в течение 12 ч, затем были активированы МАт к ОХ40 человека (119-122, 22 мкг на 0,5 млн. клеток) в культуральной среде в течение 4 ч, промывали 3 раза и 8х10⁴ меченных СР8Е эффекторных Т-клеток культивировали с уменьшающимися значениями пТтедк. Пролиферацию эффекторных Т-клеток оценивали с помощью проточной цитометрии СР8Е разведения. МАт к ОХ40 человека воздействует на Ттедк, что делает их неспособными супрессировать пролиферацию эффекторных Т-клеток (фиг. 30В). ί.Ό4'ί'.Ό25^ι"^?Ιιί'.Ό127^Ιο'“ пТтедк предварительно стимулировали анти-СБ3 (2 мкг/мл), связанным с пластиной, в культуральной среде в течение 12 ч, затем активированы МАт к ОХ40 человека 119-122 или 106-222, или контрольным антителом, анти-1СО8 или мышиным антителом изотипа 1дС1, как описано в панели А, промывали и культивировали с меченными СР8Е эффекторными Т-клетками памяти. Пролиферацию эффекторных Тклеток оценивали с помощью проточной цитометрии СР8Е разведения.

Эффекторные Т-клетки, обработанные МАт к ОХ40 человека, стали устойчивыми к супрессии пТгед клетками. (Фиг. 30А). Напротив, пролиферация эффекторных Т-клеток, обработанных контрольным мышиным антителом изотипа 1дС1, оставалась восприимчивой к супрессии пТтедк. Фиг. 30В показывает, что пТтедк, обработанные МАт к ОХ40 человека, были не способны супрессировать пролиферацию эффекторных Т-клеток. Напротив, пТтедк, обработанные контрольными антителами, такими как анти-1 СО8 или мышиным антителом изотипа 1дС1, оставались супрессивными. Эти результаты позволяют предположить, что наши МАт к ОХ40 человека воздействуют непосредственно как на эффекторные Т-клетки, так и на пТтедк для восстановления пролиферации эффекторных Т-клеток.

Пример IV.

Дополнительные предварительные данные ш νίνο показали, что антитела к ОХ40 человека у мышей увеличивает экспансию Т-клетками и отторжение опухоли у мышей. Ранее было показано, что МАт к ОХ40 человека может специфично активировать каскад МР-кВ В СБ8⁺ Т-клетках мышей, трансдуцированных ОХ40 человека. Чтобы определить, может ли МАт к НОХ40 способствовать отторжению опухоли путем содействия выживаемости эффекторных СБ8⁺ Т-клеток и клональной экспансии ш νίνο, трансгенным Рте1 СБ8⁺ Т-клеткам трансдуцировали ген люциферазы и НОХ40 были адаптивно перенесены в мышей-альбиносов линии С57ВЬ/6, несущих непигментированные МС38 опухоли. После адаптивного переноса трансдуцированных Т-клеток мышам вводили антитела. Было обнаружено, что значительно больше ОХ40+ РюИспше' Рте1 Т-клеток человека мигрировали в легкое на 4-й день у мышей, получавших МАт к ЮХ40 по сравнению с мышами, получавшими контрольное антитело изотипа 1§С1 (фиг. 31В), указывая на то, что триггирование НОХ40 у мышей способствовало экспансии СБ8⁺ Т-клеток. На 8-й (данные не представлены) и 12-й день после лечения было установлено, что одна группа мышей, получавшая МАт к НОХ40 сохранила значительно больше 1исГГега8е⁺Рте1 Т-клеток в опухоли по сравнению с контрольной группой мышей, получавших антитело изотипа 1§С1 (фиг. 31В), это снова указывало на то, что триггирование ЮХ40 у мышей способствовало выживаемости СБ8+Т-клеток. Наконец, размеры опухолей у мышей, которые получали кОХ40'Рте1 СБ8⁺ Т-клетки и затем получали МАт к НОХ40. были значительно меньше по сравнению с теми мышами, которые получали нетрансдуцированные Рте1 Т-клетки и МАт к НОХ40 или НОХ40'Рте1 Т-клетки, а затем получали контрольное мышиное антитело изотипа 1дС1. Эти результаты показывают, что триггирование ОХ40 человека у мышей приводит к биологическим эффектам, аналогичными ОХ40 мыши (СоидВ М1 ер 2008). Таким образом, данные демонстрируют способность МАт к ОХ40 человека стимулировать экспансию СБ⁺ Т-клеток и выживаемость ш νίνο и способствовать отторжению опухоли.

МАт к ОХ40 человека усиливает Т-клеточную экспансию и выживаемость ш νίνο.

Наш режим терапевтической вакцинации показан на фиг. 31 А. Белым мышами линии С57ВЬ/6 в группах по 5 особей подкожно (8С) имплантировали 5х10⁵ клеток непигментированной опухоли МС38/др100 (день 0). На 6-й день лимфопения была вызвана дозой радиации 350 сГр. На 7-й день, 1х10⁶ 1исГега8е (гапЩисей Рте1-1 Т-клеток с или без экспрессии ОХ40 человека были адаптивно перенесены мышам с опухолями (п=5 в группе) с последующим внутривенным введением 5х10⁵ Ср100 рерШе-рикеб ДК. Рекомбинантный ИЛ-2 человека вводили внутрибрюшинно в течение 3 дней после переноса Тклеток. Антитела вводились на 7, 9 и 11 дни в дозе 100, 50 и 50 мкг соответственно в инъекции на мышь (фиг. 31В). 1п νίνο биолюминесцентные изображения показали накопление люцифераза- 32 029793

экспрессирующих СЭ8' рте1-1 Т-клеток в легком и опухоли в дни 4 и 12. Две из пяти мышей из группы на 4-й день и 12 день показаны (фиг. 31С). Опухоли ответили на лечение с использованием МАт к 60X40. Размер опухоли измеряли каждые 3 дня. Рте1-1 и Рте1-1 плюс мышиное антитело изотипа 1§01 служили контролем.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110>	БОАКБ ОЕ КЕОЕЫТЗ,	ТНЕ	υNIVЕΚЗIΤΥ ОЕ ТЕХАЗ
<120>	АНТИТЕЛА К 0X40 И	СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
<130>	ИТЕС.Р1193ИО
<140>
<141>
<150>	61/380,827
<151>	2010-09-08
<150>	61/375,999
<151>	2010-08-23
<160>	24
<170>	Патентная версия 3	.5
<210>	1
<211>	5
<212>	БЕЛОК
<213>	Миз зр.
<400>	1
Азр Туг Зег МеС Нтз
1	5
<210>	2
<211>	17
<212>	БЕЛОК
<213>	Миз зр.
<400>	2
Тгр 11е Азп ТЬг О1и ТЬг	О1у	О1и Рго ТЬг Туг А1а
1	5		10
О1у
<210>	3
<211>	13
<212>	БЕЛОК
<213>	Миз зр.
<400>	3
Рго Туг Туг Азр Туг Уа1	Зег	Туг Туг А1а МеС Азр
1	5		10
<210>	4
<211>	122
<212>	БЕЛОК

ΕΥΕΤΕΜ

Азр Азр РЬе Ьуз 15

Туг

- 33 029793

<213> Миз зр.

<400> 4

О1у

Рго

О1и 10

Беи

Буз

Буз

Рго

О1у 15

О1и

О1п 1

11е

О1п

Беи Уа1 5

О1п

Бег

ТЬг

Уа1

Буз

11е

Бег

Суз

Буз

А1а

Бег

О1у

Туг

ТЬг

РЬе

ТЬг

Азр

Туг

20

25

30

Бег

Мек

Нчз

Тгр

Уа1

Буз

О1п

А1а

Рго

О1у

Буз

О1у

Беи

Буз

Тгр

Мек

35

40

45

О1у

Тгр

11е

Азп

ТЬг

О1и

ТЬг

О1у

О1и

Рго

ТЬг

Туг

А1а

Азр

Азр

РЬе

50

55

60

Буз

О1у

Агд

РЬе

А1а

РЬе

Бег

Беи

О1и

ТЬг

Бег

А1а

Бег

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

Беи

О1п

11е

Азп

Азп

Беи

Буз

Азп

О1и

Азр

ТЬг

А1а

ТЬг

Туг

РЬе

Суз

85

90

95

А1а

Азп

Рго

Туг

Туг

Азр

Туг

Уа1

Бег

Туг

Туг

А1а

Мек

Азр

Туг

Тгр

100

105

110

О1у

Нтз

О1у

ТЬг

Бег

Уа1

ТЬг

Уа1

Бег

Бег

115

120

<210> 5

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 5

Беи Уа1 5

О1п

Бег

О1у

Бег

О1и 10

Беи

Буз

Буз

Рго

О1у 15

А1а

О1п 1

Уа1

О1п

Бег

Уа1

Буз

Уа1 Бег 20

Суз

Буз

А1а

Бег 25

О1у

Туг

ТЬг

РЬе

ТЬг 30

Азр

Туг

Бег

Мек

Нчз 35

Тгр Уа1

Агд

О1п

А1а 40

Рго

О1у

О1п

О1у

Беи 45

Буз

Тгр

Мек

О1у

Тгр 50

11е

Азп ТЬг

О1и

ТЬг 55

О1у

О1и

Рго

ТЬг

Туг 60

А1а

Азр

Азр

РЬе

Буз 65

О1у

Агд

РЬе Уа1

РЬе 70

Бег

Беи

Азр

ТЬг

Бег 75

Уа1

Бег

ТЬг

А1а

Туг 80

- 34 029793

Ьеи

Ο1η

11е

Бег

Бег Ьеи 85

Ьуз

А1а О1и Азр 90

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг 95

Суз

А1а

Азп

Рго

Туг

Туг

Азр

Туг

Уа1

Бег

Туг

Туг

А1а

Меб

Азр

Туг

Тгр

100

105

110

О1у

Ο1η

О1у

ТЬг

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

Бег

Бег

115

120

<210> 6

<211> 458

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид

<400> 6 асбадбасса	ссабддсббд	ддбдбддасс	ббдсбаббсс	бдабддсадс	бдсссааадб	60
абссаадсас	аддббсадбб	ддбдсадбсб	ддабсбдадс	бдаадаадсс	бддадссбса	120
дбсааддббб	ссбдсааддс	ббсбддббаб	ассббсасад	асбаббсааб	дсасбдддбд	180
сдасаддсбс	саддасаадд	бббааадбдд	абдддсбдда	бааасасбда	дасбддбдад	240
ссаасабабд	садабдасбб	саадддасдд	бббдбсббсб	сбббддасас	сбсбдбсадс	300
асбдссбабб	бдсадабсад	садссбсааа	дсбдаддаса	сддсбдбдба	ббасбдбдсб	360
аабсссбасб	абдаббасдб	сбсббасбаб	дсбабддасб	асбддддбса	дддаассасд	420
дбсассдбсб	ссбсаддбаа	даабддссбс	бсаадсбб			458

<210> 7

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Миз зр.

<400> 7

Ьуз А1а Бег Ο1η Азр Уа1 Бег ТЬг А1а Уа1 А1а

1 5 10

<210> 8

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Миз зр.

<400> 8

Бег А1а Бег Туг Ьеи Туг ТЬг 1 5

<210> 9 <211> 9

- 35 029793

<212> БЕЛОК

<213> Миз зр.

<400> 9

Ο1η Ο1η Ηΐ3 Туг Бег ТЪг Рго Агд ТЪг 1 5

<210> 10 <211> 107 <212> БЕЛОК <213> Миз зр.

<400> 10

Азр 1

11е

Уа1

МеЕ

ТЪг 5

Ο1η

Бег

Няз

Ьуз

РЪе 10

МеЕ

Бег ТЪг

Бег

Уа1 15

Агд

Азр

Агд

Уа1

Бег

11е

ТЪг

Суз

Ьуз

А1а

Бег

Ο1η

Азр

Уа1

Бег

ТЪг

А1а

20

25

30

Уа1

А1а

Тгр

Туг

Ο1η

Ο1η

Ьуз

Рго

О1у

Ο1η

Бег

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

11е

35

40

45

Туг

Бег

А1а

Бег

Туг

Ьеи

Туг

ТЪг

О1у

Уа1

Рго

Азр

Агд

РЪе

ТЪг

О1у

50

55

60

Бег

О1у

Бег

О1у

ТЪг

Азр

РЪе

ТЪг

РЪе

ТЪг

11е

Бег

Бег

Уа1

Ο1η

А1а

65

70

75

80

О1и

Азр

Ьеи

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

Ο1η

Ο1η

Ηίβ

Туг

Бег

ТЪг

Рго

Агд

85

90

95

ТЪг

РЪе

О1у

О1у

О1у

ТЪг

Ьуз

Ьеи

О1и

11е

Ьуз

100

105

<210> 11

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 11

ТЪг 5

Ο1η

Бег

Рго

Бег

Бег 10

Ьеи

Бег

А1а

Бег

Уа1 15

О1у

Азр 1

11е

Ο1η

МеЕ

Азр

Агд

Уа1

ТЪг 20

11е

ТЪг

Суз

Ьуз

А1а 25

Бег

Ο1η

Азр

Уа1

Бег 30

ТЪг

А1а

Уа1

А1а

Тгр 35

Туг

Ο1η

Ο1η

Ьуз

Рго 40

О1у

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз 45

Ьеи

Ьеи

11е

- 36 029793

Туг

Зег 50

А1а

Зег Туг

Ьеи

Туг 55

ТЬг

О1у

Уа1

Рго

Зег 60

Агд

РЬе

Зег

О1у

Зег

О1у

Зег

О1у ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

РЬе

ТЬг

11е

Зег

Зег

Ьеи

О1п

Рго

65

70

75

80

О1и

Азр

11е

А1а ТЬг

Туг

Туг

Суз

О1п

О1п

Ηΐ3

Туг

Зег

ТЬг

Рго

Агд

85

90

95

ТЬг

РЬе

О1у

О1п О1у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

О1и

11е

Ьуз

100 105

<210> 12

<211> 416

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид

<400> 12

дсбадсасса ссабддадбс асадаббсад дбсбббдбаб бсдбдбббсб сбддббдбсб 60

ддбдббдасд дадасаббса дабдасссад бсбссабссб сссбдбссдс абсадбддда 120

дасадддбса ссабсассбд сааддссадб саддабдбда дбасбдсбдб адссбддбаб 180

саасадааас саддаааадс сссбааасба сбдабббасб сддсабссба ссбсбасасб 240

ддадбсссбб сасдсббсад бддсадбдда бсбдддасдд абббсасббб сассабсадс 300

адбсбдсадс сбдаадасаб бдсаасабаб басбдбсадс аасаббабад басбссбсдд 360

асдббсддбс адддсассаа дсбддааабс ааасдбаадб адаабссааа дааббс 416

Claims (13)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Выделенное антитело, которое связывается с ОХ40, содержащее

   (а) СГОК1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность ЗЕО ГО N0:1;

   (a) СГОК2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность ЗЕО ГО N0:2;

   (b) СГОК3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность ЗЕО ГО N0:3;

   (c) СГОК1 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность ЗЕО ГО N0:7;

   (б) СГОК2 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность ЗЕО ГО N0:8;

   (е) СГОК3 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность ЗЕО ГО N0:9.
2. 2. Выделенное антитело по п.1, содержащее вариабельную область легкой цепи, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности ЗЕО ГО N0:10, и вариабельную область тяжелой цепи, которая на 90% идентична аминокислотной последовательности ЗЕО ГО N0:4.
3. 3. Выделенное антитело по п.1 или 2, которое представляет собой моноклональное антитело.
4. 4. Выделенное антитело по любому из пп.1-3, которое представляет собой гуманизированное анти- 37 029793

   тело.
5. 5. Выделенное антитело по п.4, которое содержит вариабельную область легкой цепи с последовательностью, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности 8ЕЦ ГО N0:11, и вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью, которая на 90% идентична аминокислотной последовательности 8ЕЦ ГО N0:5.
6. 6. Антиген-связывающий фрагмент антитела по любому из пп.1-5, где антиген-связывающий фрагмент сохраняет способность специфически связываться с рецептором 0X40 и проявлять активность агониста.
7. 7. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело, по любому из пп.1-5 или его антигенсвязывающий фрагмент по п.6.
8. 8. Выделенная клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п.7.
9. 9. Способ получения антитела по любому из пп.1-5 или его антиген-связывающего фрагмента по п.6, включающий стадию ех νίνο культивирования клетки-хозяина по п.8 и выделение указанного антитела из культуральной среды.
10. 10. Способ по п.9, отличающийся тем, что дополнительно включает выделение антитела или его антиген-связывающего фрагмента из клетки-хозяина.
11. 11. Применение выделенного антитела по любому из пп.1-5 или его антиген-связывающего фрагмента по п.6 в качестве лекарственного средства для лечения рака.
12. 12. Применение антитела по любому из пп.1-5 или его антиген-связывающего фрагмента по п.6 для лечения рака.
13. 13. Применение антитела по любому из пп.1-5 или его антиген-связывающего фрагмента по п.6 для получения лекарственного средства, где лекарственное средство предназначено для лечения рака.