ES2937020T3 - Anticuerpos, usos y métodos - Google Patents

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Miha Kosmac
Steve Holmes
Ian Kirby
Jamie Campbell
Leslie Susan Kean
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Abstract

La presente invención se relaciona con anticuerpos antihumanos OX40L, nuevos métodos de uso médico. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos, usos y métodos
La presente invención se define por las reivindicaciones, y se refiere a anticuerpos anti-OX40L humano, nuevos usos médicos y métodos. La invención se define mediante las reivindicaciones, y cualesquiera otros aspectos, configuraciones o realizaciones establecidos aquí que no estén dentro del alcance de las reivindicaciones son para información.
Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).
ANTECEDENTES
El ligando de OX40 (OX40L) es un miembro de la familia de TNF; una proteína transmembrana tipo II de 34 kDa. El complejo cristalizado de OX40 y OX40L humanos es una configuración trimérica de un OX40L (trímero) y tres monómeros de OX40. El dominio extracelular humano tiene una homología del 42% con el OX40L de ratón.
OX40L no se expresa de forma constitutiva, pero se puede inducir en APC profesionales, tales como células B, células dendríticas (DC) y macrófagos. Se pueden inducir otros tipos de células, tales como las células de Langerhans, células endoteliales, células del músculo liso, mastocitos, y células asesinas naturales (NK), para que expresen OX40L. Las células T también pueden expresar OX40L. El receptor de OX40L, OX40, se expresa en células T activadas (células T CD4 y CD8, células Th2, Th1 y Th17) y células CD4+Foxp3+, incluso en ausencia de activación.
La interacción entre OX40 y OX40L ocurre durante la interacción célula T-DC, 2 o 3 días después del reconocimiento del antígeno. Después de dejar las DC, la célula T que expresa OX40 puede interactuar con una célula que expresa OX40L que no sea una DC y recibir una señal de OX40 de esta célula, que puede proporcionar señales esenciales para la generación de células T de memoria, la mejora de la respuesta Th2, y la prolongación de las respuestas inflamatorias. Las señales de OX40 en las células T respondedoras las hacen resistentes a la supresión mediada por Treg.
La enfermedad de injerto contra hospedante es una de las principales causas de mortalidad después del tratamiento alogénico de médula ósea. En la versión aguda de la enfermedad, las células T maduras presentes en el injerto de médula ósea reconocen el tejido donante como extraño en un entorno de tejido dañado, lo que, a través de las APC del hospedante, provoca la activación y proliferación de las células T del donante, con la consiguiente migración de células T hacia el hígado, el bazo, el intestino, la piel y los pulmones, lo que causa daño tisular por la respuesta del efector CTL y la liberación de citocinas/quimiocinas inflamatorias. El inicio de la enfermedad aguda suele ser dentro de los primeros 100 días posteriores al trasplante (Hill-Ferrara, Blood, 1 de mayo de 2000, vol. 95, núm. 9, 2754-275, Reddy-Ferrara Blood, volumen 17, número 4, diciembre de 2003).
La EICH crónica suele aparecer 100 días después del trasplante, y se cree que intervienen varios factores, incluyendo el daño tímico causado por la EICH aguda anterior, que da como resultado una eliminación reducida de las células T patógenas (Zhang et al., 1 de septiembre de 2007 vol. 179 núm. 5 3305-3314), un aumento de TGF-p, que causa fibrosis (McCormick et al J Immuno, 15 de noviembre de 1999, vol. 163 núm. 105693-5699), y un componente de células B impulsado por un factor activador de células B elevado (BAFF) (Sarantopoulos et al, Clin Cancer Res 15 de octubre de 200713; 6107), así como autoanticuerpos contra el receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (Svegliati et al, Blood 1 de julio de 2007 vol. 110 núm. 1237-241).
Los estudios clínicos han demostrado que OX40 está regulado al alza tanto en la EICH aguda (Morante et al, Clinical and Experimental Immunology, 145:36-43) como crónica (Kotani et al, Blood 15 de noviembre de 2001, vol. 98 núm.
10 3162-3164). La administración de un antagonista anti-OX40L mejoró la supervivencia en un modelo letal de EICH en ratones agudos, con una supervivencia del 70% en el grupo tratado en comparación con el grupo no tratado, que murió el día 43 (Tsukada et al, Blood, 1 de abril de 2000, Volumen 95, Número 7), mientras que el tratamiento con un Ab anti-OX40 agonista aceleró la enfermedad y la mortalidad (Blazar et al Blood 1 de mayo de 2003 vol. 101 no. 9 3741-3748). Se ha demostrado que el bloqueo de la interacción OX40-OX40L es eficaz en varias otras enfermedades inflamatorias, y se usa Ab anti-OX40L para tratar un modelo de colitis en ratones (Totsuka et al., AJP - GI 1 de abril de 2003 vol. 284 núm. 4 G595-G603), y que un Ab anti-OX40L podría bloquear el desarrollo de diabetes en ratones NOD (Pakala et al European Journal of Immunology Volumen 34, número 11, páginas 3039-3046, noviembre de 2004).
Referencias
Lamb, L.S., Abhyankar, S.A., Hazlett, L., O’Neal, W., Folk, R.S., Vogt, S., Parrish, R.S., Bridges, K., Henslee-Downey, P.J. and Gee, A. P. (1999), Expression of CD134 (0X-40) on T-cells during the first 100 days following allogeneic bone marrow transplantation as a marker for lymphocyte activation and therapy-resistant graft-versus-host disease. Cytometry, 38: 238-243.
Xupeng Ge, Julia Brown, Megan Sykes, Vassiliki A. Boussiotis, CD134-Allodepletion Allows Selective Elimination of Alloreactive Human T-cells without Loss of Virus-Specific and Leukemia-Specific Effectors, Biology of Blood and Marrow Transplantation, volumen 14, número 5, mayo de 2008, páginas 518-530.
Naoto Ishii, Takeshi Takahashi, Pejman Soroosh, Kazuo Sugamura, Chapter 3 - OX40-OX40 Ligand Interaction in T-Cell-Mediated Immunity and Immunopathology, In: Frederick W. Alt, Editor(s), Advances in Immunology, Academic Press, 2010, Volumen 105, páginas 63-98.
Croft, M., So, T., Duan, W. and Soroosh, P. (2009), The significance of OX40 and OX40L to T-cell biology and immune disease. Immunological Reviews, 229: 173-191.
El documento WO 2006/029879 (F. Hoffman-La Roche) describe anticuerpos anti-OX40L, y en particular, anticuerpos anti-OX40L y variantes de los mismos que contienen una parte Fc de origen humano y no se unen al factor C1q del complemento.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La invención se define por las reivindicaciones, y cualesquiera otros aspectos, configuraciones o realizaciones expuestos aquí que no estén dentro del alcance de las reivindicaciones son para información. La invención proporciona fragmentos y anticuerpos contra el OX40L humano (hOX40L), y aplicaciones médicas novedosas para tratar o prevenir enfermedades o afecciones mediadas por el hOX40L en seres humanos. Con este fin, la invención proporciona: -En una primera configuración
Un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une específicamente a hOX40L para tratar o prevenir una enfermedad o afección mediada por hOX40L en un ser humano en un método en el que el anticuerpo o fragmento se administra a dicho ser humano, en el que el anticuerpo o fragmento es para tratar o prevenir dicha enfermedad o afección mediada por hOX40L al disminuir uno, más o todos de
a. la secreción de una citocina seleccionada de TNF alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-13, IL-17, RANTES e interferón gamma en seres humanos;
b. la proliferación de leucocitos del ser humano; y
c. la unión del receptor hOX40, expresado por células T humanas, con hOX40L, expresado en células endoteliales.
En una segunda configuración
Un anticuerpo o un fragmento del mismo, que se une específicamente a hOX40L y compite por la unión a dicho hOX40L con un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en 02D10, 10A07, 09H04 y 19H01.
En una tercera configuración
Uso de un anticuerpo o un fragmento del mismo, que se une específicamente a hOX40L, en la fabricación de un medicamento para administrarlo a un ser humano, para tratar o prevenir una enfermedad o afección humana mediada por hOX40L mediante la disminución de uno, más o todos de
a. la secreción de una citocina seleccionada de TNF alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-13, IL-17, RANTES e interferón gamma en seres humanos;
b. la proliferación de leucocitos del ser humano; y
c. la unión del receptor hOX40, expresado por células T humanas, con hOX40L, expresado en células endoteliales.
En una cuarta configuración
Un método para tratar o prevenir una enfermedad o afección mediada por hOX40L en un ser humano mediante la disminución de uno, más o todos de
a. la secreción de una citocina seleccionada de TNF alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-13, IL-17, RANTES e interferón gamma en seres humanos;
b. la proliferación de leucocitos del ser humano; y
c. la unión del receptor hOX40, expresado por células T humanas, con hOX40L, expresado en células endoteliales;
en el que el método comprende administrar a dicho ser humano una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o fragmento que se une específicamente a hOX40L.
En una quinta configuración
Un anticuerpo o un fragmento del mismo, que se une específicamente a hOX40L y compite por la unión a dicho hOX40L con el anticuerpo 02D10, en el que el anticuerpo o fragmento comprende un dominio VH que comprende una HCDR3 que comprende el motivo VRGXYYY, en el que X es cualquier aminoácido.
En una sexta configuración
Un anticuerpo o un fragmento del mismo, que se une específicamente a hOX40L y compite por la unión a dicho hOX40L con el anticuerpo 02D10, en el que el anticuerpo o fragmento comprende un dominio VH que comprende la secuencia de HCDR3 de SEQ ID NO: 40 o 46 o la secuencia de HCDR3 de SEQ ID NO: 40 o 46 que comprende menos de 5 sustituciones de aminoácidos.
En una séptima configuración
Un anticuerpo humano o fragmento del mismo que comprende una HCDR3 de 16 a 27 aminoácidos y derivada de la recombinación de un segmento del gen VH humano, un segmento del gen D humano y un segmento del gen JH humano, en el que el segmento del gen JH humano es IGHJ6, que se une específicamente a hOX40L, para tratar o prevenir una enfermedad autoinmune seleccionada de una enfermedad o afección autoinmune, una enfermedad o afección inflamatoria sistémica, o el rechazo de un trasplante.
En una octava configuración
Uso de un anticuerpo humano o fragmento del mismo que comprende una HCDR3 de 16 a 27 aminoácidos y derivada de la recombinación de un segmento del gen VH humano, un segmento del gen D humano y un segmento del gen JH humano, en el que el segmento del gen JH humano es IGHJ6, que se une específicamente a hOX40L, en la fabricación de un medicamento para administrarlo a un ser humano para tratar o prevenir una enfermedad o afección mediada por hOX40L en el ser humano seleccionada de una enfermedad o afección autoinmune, una enfermedad o afección inflamatoria sistémica, o el rechazo de trasplante.
En una novena configuración
Un método para tratar o prevenir una enfermedad o afección mediada por hOX40L seleccionada de una enfermedad o afección autoinmune, una enfermedad o afección inflamatoria sistémica o el rechazo de un trasplante, que comprende administrar a dicho ser humano una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo humano o fragmento del mismo que comprende una HCDR3 de 16 a 27 aminoácidos y derivada de la recombinación de un segmento del gen VH humano, un segmento del gen D humano y un segmento del gen JH humano, en el que el segmento del gen JH humano es IGHJ6, que se une específicamente a hOX40L, en el que la enfermedad o afección mediada por hOX40L es así tratada o prevenida.
La invención también proporciona composiciones farmacéuticas, kits, ácidos nucleicos, vectores y hospedantes. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1: Perfilado de anticuerpos anti-OX40L recombinantes completamente humanos en el ensayo de neutralización de ligando/receptor de HTRF. Los datos mostrados son representativos de tres experimentos repetidos.
Figura 2: Determinación del efecto de los anticuerpos anti-OX40L en la reacción alogénica de PBMC/linfocitos mixtos T. Los datos que se muestran son de tres emparejamientos de donantes independientes en los que se supone que cada donante es un individuo diferente.
Figura 3: Expansión de células Tscm después de HCT alogénico. Las parcelas están cerradas en células T CD4+ CD45RA+CCR7+.
Figura 4: El bloqueo de OX40L controla la expansión de las células Tscm CD4+ mientras preserva las células T CD4+ sin tratamiento previo después de un HCT alogénico. Números absolutos Tscm CD4+ (izquierda) y Tvírgenes (derecha) de sangre periférica después de HCT alogénico en animales de control y animales tratados con 2D10 IgG4PE.
Figura 5: Expresión de OX40 en linfocitos T CD4+ sin tratamiento previo y células T madre de memoria en un animal representativo después de un TCH alogénico. Los gráficos FACS de la izquierda y central se seleccionaron en CD3+CD4+CD45RA+CCR7+. El histograma de la derecha muestra la expresión de OX40 en diferentes subconjuntos de células T de células T CD4+: sin tratamiento previo (CD45RA+CCR7+CD95-), madre de memoria (SCM: CD45RA+CCR7+CD95+), memoria central (CM: CD45RA-CCR7+), memoria efectora (EM: CD45RA-CCR7-) y células de memoria efectora diferenciadas terminalmente que reexpresan CD45RA (TEMRA: CD45RA+CCR7-).
Figura 6a: Efectos del bloqueo de OX40L en las células T CD4+ de SCM. Los puntos de datos para 02D10 Ig4PE se muestran mediante círculos, rapamicina mediante cuadrados negros, y tacrolimus más metotrexato (Tac/MTX) mediante cuadrados blancos.
Figura 6a: Efectos del bloqueo de OX40L en células T CD8+ de SCM. Los puntos de datos para 02D10 Ig4PE se muestran mediante círculos, rapamicina mediante cuadrados negros, y Tac/MTX mediante cuadrados blancos.
Figura 7: Curva de supervivencia de Kaplan-Meier para monos rhesus receptores de trasplantes de células madre hematopoyéticas derivadas de la sangre periférica de donantes haploidénticos medio hermanos. Se muestran los resultados para los animales que no recibieron terapia profiláctica postrasplante (control sin tratamiento; mediana de tiempo de supervivencia, MST= 8 días; n=4), y los que recibieron monoterapia con rapamicina (MST= 17 días; n=4), monoterapia 2D10 (MST= 19 días; n=4), o rapamicina más 2D10 (m St > 82 días; n=3). Observe que los animales 2 y 3 indicados en la figura estaban en estudio en el momento de la redacción; ninguno mostró signos de EICH en el Día 82 o el Día 41 después del trasplante, respectivamente. El asterisco * para los grupos de control sin tratamiento y de monoterapia con rapamicina es dato tomado de Furlan et al., 2015, Science Translational Medicine, vol 7 (315), 315ra191.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La descripción proporciona los siguientes aspectos 1 a 113.
La invención es útil, por ejemplo, para tratar o prevenir el rechazo de trasplantes, por ejemplo la enfermedad de injerto contra hospedante (EICH) o el rechazo de trasplantes alogénicos. La invención también es útil, por ejemplo, para tratar o prevenir una enfermedad inflamatoria intestinal, por ejemplo CU o EC, o para tratar o prevenir una enfermedad o afección inflamatoria de las vías respiratorias. En un ejemplo, este aspecto es útil para tratar o prevenir el asma. La invención también es útil, por ejemplo, para tratar o prevenir la fibrosis. La invención también es útil, por ejemplo, para tratar o prevenir la diabetes. La invención también es útil, por ejemplo, para tratar o prevenir la uveítis. La invención también es útil, por ejemplo, para tratar o prevenir el pioderma gangrenoso. La invención también es útil, por ejemplo, para tratar o prevenir la arteritis de células gigantes. La invención también es útil, por ejemplo, para tratar o prevenir el síndrome de Schnitzler. La invención también es útil, por ejemplo, para tratar o prevenir la escleritis no infecciosa.
1. Un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une específicamente a hOX40L para tratar o prevenir una enfermedad o afección mediada por hOX40L en un ser humano en un método en el que el anticuerpo o fragmento se administra a dicho ser humano, en el que el anticuerpo o fragmento es para tratar o prevenir dicho enfermedad o afección mediada por hOX40L al disminuir uno, más o todos de
a. la secreción de una citocina seleccionada de TNF alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-13, IL-17, RANTES e interferón gamma en seres humanos;
b. la proliferación de leucocitos del ser humano; y
c. la unión del receptor hOX40, expresado por células T humanas, con hOX40L, expresado en células endoteliales.
Los inventores identificaron así por primera vez disminuciones de (a), (b) y (c) como formas de tratar y/o prevenir enfermedades y afecciones mediadas por OX40L en seres humanos, y proporcionan anticuerpos y fragmentos de anticuerpos para este fin.
En un ejemplo, la secreción es secreción de leucocitos. En un ejemplo, (a) está indicado por un nivel significativamente elevado de la(s) citocina(s) en sangre, plasma o suero humanos.
En un ejemplo, la citocina se selecciona de (i) TNF alfa, (ii) IL-2, e (iii) interferón gamma. Por ejemplo, la citocina TNF alfa. Por ejemplo, la citocina es IL-2. En un ejemplo, la citocina es interferón gamma. En un ejemplo, las citocinas son (i) y (ii); o (i) y (iii); o (ii) y (iii); o (i)-(iii).
En un ejemplo, la disminución de (a), (b) o (c), o cualquier otra disminución descrita aquí, es una disminución de al menos 10 o 20% en comparación con el nivel en un ser humano con riesgo o que padece enfermedad o afección mediada por hOX40L. En un ejemplo, este último es el ser humano mencionado en el aspecto 1 antes de la administración del anticuerpo o fragmento; en otro ejemplo, este último ser humano es un ser humano diferente. En un ejemplo, dicha disminución es al menos 10, 20, 30, 40, 50 o 60%.
(i) En un ejemplo, el anticuerpo o fragmento es capaz de efectuar una disminución de la secreción de la citocina relevante de los leucocitos (por ejemplo, células T humanas) en un ensayo in vitro (como se explica más adelante), y por lo tanto, la administración de dicho anticuerpo o fragmento al ser humano conduce a una disminución de (a).
(ii) En un ejemplo, el anticuerpo o fragmento es capaz de efectuar una disminución de la proliferación de leucocitos (por ejemplo, PBMC humanas y/o células T humanas) en un ensayo in vitro (como se explica más adelante), y por lo tanto, la administración de dicho anticuerpo o fragmento al ser humano conduce a la disminución de (b).
(iii) En un ejemplo, el anticuerpo o fragmento es capaz de efectuar una disminución de la unión del receptor hOX40 expresado por células T humanas con hOX40L expresado por células endoteliales en un ensayo in vitro (como se explica más adelante), y por lo tanto, la administración de dicho anticuerpo o fragmento al ser humano conduce a una disminución de (c).
En un ejemplo, se aplican (i) y (ii); o (i) y (iii); o (ii) y (iii); o (i)-(iii).
Adicional o alternativamente, la evaluación de dichas disminuciones se puede llevar a cabo usando muestras del ser humano tratado. Por ejemplo, se hace referencia a J. Clin. Immunol., enero de 2004, 24(1):74-85; “Increased expression of CCL20 in human inflammatory bowel disease”; Kaser A et al. Esta publicación proporciona un ejemplo de una técnica de aplicación general de uso de biopsias de tejido y lectura de niveles de citocinas disminuidos que indican una secreción de citocinas disminuida después del tratamiento con un anticuerpo in vivo. Pueden usarse métodos similares para determinar la disminución de la secreción de una o más citocinas en un ser humano que haya recibido un anticuerpo de la invención. El experto en la técnica estará familiarizado con las técnicas para evaluar los niveles de citocinas en pacientes y muestras de pacientes, por ejemplo mediante el uso de una o más biopsias de tejidos, inmunohistoquímica, inmunofluorescencia, tinción de tejidos, cuantificación de ARNm de citocinas (por ejemplo, mediante PCR, tal como Taqman™ PCR), detección y cuantificación de proteínas de citocinas (por ejemplo, usando anticuerpos y cuantificación de herramientas específicas de citocinas, tal como por ELISA u otra técnica estándar de cuantificación de proteínas). Por ejemplo, cuando la enfermedad o afección es del tracto GI (por ejemplo, EII), se puede realizar una biopsia de tejido intestinal relevante de un paciente que haya recibido un anticuerpo de la invención, seguido de la cuantificación del ARNm de la citocina y/o la proteína de la citocina (por ejemplo, usando PCR cuantitativa). El resultado se puede comparar con una cuantificación de citocinas en tejido relevante de la biopsia del mismo paciente antes de la administración del anticuerpo, o se puede comparar con otro paciente humano que padece la misma enfermedad o afección pero que no recibe tratamiento anti-OX40L o ningún tratamiento para la enfermedad o afección. De esta forma, el experto en la técnica puede determinar que el anticuerpo de la invención disminuye la secreción de la citocina en el receptor humano. En lugar de evaluar los niveles de tejido intestinal, se puede usar un tejido o muestra diferente del paciente humano, dependiendo de la naturaleza y ubicación de la enfermedad o afección. Por ejemplo, cuando la enfermedad o afección es aquella de las vías respiratorias (por ejemplo, pulmón), es posible tomar una muestra de pulmón u otro tejido de las vías respiratorias para la evaluación de citocinas. Alternativamente, se puede usar una muestra de lavado broncoalveolar (LBA), como será evidente para el experto en la técnica. En otro ejemplo, para algunas enfermedades o afecciones, la disminución de citocinas se puede evaluar en una muestra de sangre, suero o plasma tomada de un ser humano que ha recibido un anticuerpo de la invención, y entonces se puede comparar con el nivel antes de recibir el anticuerpo, o se puede comparar con el nivel en un ser humano no tratado, como se discutió anteriormente.
Como se sabe en la técnica, el término “leucocitos” incluye, por ejemplo, uno o más de linfocitos, leucocitos polimorfonucleares, y monocitos. Como también es evidente para el experto en la técnica, el término “monocitos” incluye, por ejemplo, células mononucleares de sangre periférica (PBMC), o células derivadas de monocitos, por ejemplo células dendríticas (DC). Véase, por ejemplo, Immunobiology, noviembre de 2013, 218(11):1392-401. doi: 10.1016/j.imbio.2013.07.005. Epub 2013 25 de julio; “Leukoreduction system chambers are an efficient, valid, and economic source of functional monocyte-derived dendritic cells and lymphocytes”, Pfeiffer IA et al.
La proliferación de leucocitos, por ejemplo linfocitos de la lámina propia (LPL), puede evaluarse usando biopsia de tejido, tinción e histología, como será evidente para el experto en la técnica. La tinción de hematoxilina y eosina (tinción H&E o tinción HE) se usa, por ejemplo, comúnmente en histología para buscar linfocitos infiltrantes en una amplia gama de tejidos humanos, y es una de las principales tinciones en histología. Es la tinción más usada en el diagnóstico médico, y a menudo es el estándar de oro, y como tal, puede usarse para evaluar la proliferación de leucocitos según la invención. Por ejemplo, se puede obtener, teñir y evaluar el grado de infiltración de LPL en tejido del tracto GI (por ejemplo, tejido intestinal) de un ser humano que padece o está en riesgo de padecer una enfermedad o afección mediada por hOX40L. Se puede hacer una comparación entre dicho tejido de un ser humano que ha recibido un anticuerpo de la invención en comparación con el grado de infiltración en tejido obtenido del mismo ser humano antes de la administración del anticuerpo, o de otro ser humano que no haya recibido tratamiento y esté en riesgo de padecer la enfermedad o afección. Por ejemplo, la comparación es entre tejidos intestinales humanos tomados de los mismos (o diferentes) seres humanos que padecen EII.
Por ejemplo, se puede determinar si el anticuerpo o fragmento es capaz de disminuir la unión del receptor hOX40, expresado por células T humanas, con hOX40L, expresado en células endoteliales, usando ensayos de unión estándar que son familiares para el experto en la técnica, por ejemplo usando ELISA o SPR.
La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es un trastorno inflamatorio crónico que afecta el tracto gastrointestinal con una incidencia aparentemente cada vez mayor y tendencia a fenotipos clínicos más severos. La enfermedad se caracteriza por una respuesta inmune exagerada a la flora luminal, lo que sugiere que pueden estar involucradas deficiencias en la función de barrera de la flora intestinal, y los estudios respaldan esta idea (Cucchiara et al., 2012; Jostins et al., 2012; Manichanh et al. ., 2012; Salzman et al., 2007, todos citados en Deuring et al., “The cell biology of the intestinal epithelium and its relation to inflammatory bowel disease”, The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 45 (2013) 798-806). La EII incluye dos grupos principales: la enfermedad de Crohn (EC), y la colitis ulcerosa (CU). Los pacientes con EC pueden tener lesiones inflamatorias en todo el tracto gastrointestinal, mientras que la inflamación en los pacientes con CU está restringida al colon. También se hace referencia a Hisamatsu et al. (“Immune aspects of the pathogenesis of inflammatory bowel disease”, Pharmacology & Therapeutics 137 (2013) 283­ 297) y documentos citados allí.
La formación de granulomas es una de las características patológicas más importantes de la enfermedad de Crohn humana. Mizoguchi et al. demostraron que las células dendríticas (DC) CD11c+ inmaduras positivas para F4/80 producen IL-23 y contribuyen a la formación de granulomas en un modelo de colitis murina (Mizoguchi et al., 2007). Una respuesta inmune Th1 es predominante en la enfermedad de Crohn. De hecho, las células T CD4+ en la LP de la enfermedad de Crohn expresaron T-bet y produjeron grandes cantidades de interferón (IFN)-g (Matsuoka et al., 2004). Sakuraba et al. demostraron que las CD en los ganglios linfáticos mesentéricos de pacientes con enfermedad de Crohn promovieron fuertemente una respuesta inmune Th1 y Th17 (Sakuraba et al., 2009). Las DC de los ganglios linfáticos mesentéricos contribuyen a la patogenia de la EII, en particular a la de la enfermedad de Crohn.
Papel de las citocinas en enfermedades y afecciones
Se hace referencia a Muzes et al, World J Gastroenterol 2012 7 de noviembre; 18(41): 5848-5861 ISSN 1007-9327 (impreso) ISSN 2219-2840 (en línea), “Changes of the cytokine profile in inflammatory bowel Diseased”.
Las citocinas son señales indispensables del sistema inmunitario asociado a la mucosa para mantener la homeostasis intestinal normal. Un desequilibrio de su perfil a favor del inicio de la inflamación puede conducir a estados patológicos, tal como el que se observa en las enfermedades inflamatorias del intestino (EII), por ejemplo la enfermedad de Crohn (CD) y la colitis ulcerosa (UC). El papel de las citocinas proinflamatorias, tales como IL-1a, IL-1 b, IL-2, -6, -8, -12, -17, -23, IFN-gamma o TNF alfa, en la EII, está asociado con el inicio y progresión de UC y CD. La EC a menudo se describe como un prototipo de enfermedades mediadas por T-helper (Th) 1, debido a que los mediadores inflamatorios primarios son las citocinas Th1, tal como la interleucina (IL)-12, el interferón (IFN)-g, y el factor de necrosis tumoral (TNF)-a.
La unión de ligandos similares a TNF a sus receptores desencadena rutas intracelulares que están directamente involucradas en la proliferación, diferenciación y supervivencia celulares. La mayoría de los miembros de las superfamilias de proteínas TNF/receptor de TNF se expresan en las células inmunitarias, y desempeñan un papel fundamental en múltiples componentes de la respuesta inmunitaria. El TNF-a es una citocina maestra en la patogenia de la EII. Ejerce sus efectos pleiotrópicos a través de la expresión de moléculas de adhesión, proliferación de fibroblastos, factores procoagulantes, así como el inicio de respuestas citotóxicas, apoptóticas y de fase aguda. La fuente de TNF-a en la EII son, en parte, las células inmunitarias innatas, tales como los macrófagos o los monocitos, y también las células Th1 diferenciadas. Los niveles séricos de TNF-a se correlacionan con la actividad clínica de la CU y la EC[31]. Desempeña un papel orquestador en la inflamación del colon en la EII. El papel del TNF-a en la EC ha sido ampliamente investigado. La unión de TNF-a al receptor de TNF soluble en suero 1 y 2 (sTNFR1 y 2) inicia la señalización proinflamatoria. Los niveles de sTNFR1 y 2 están elevados en la EC.
El factor similar al factor de necrosis tumoral (TL1 A), otro miembro de la familia TNF, estimula la secreción de IFN-g al unirse al receptor de muerte 3 (DR3). DR3 se expresa en un alto porcentaje de células de biopsias mucosales de Cu y EC, y se ha observado un aumento del nivel de IFN-g con la actividad de la enfermedad en pacientes con EII. El sistema TL1A/DR3 está involucrado en la patogenia de la EC. Los macrófagos de la lámina propia son un importante productor de TL1A, cuya expresión está notablemente potenciada en la EC. Se ha encontrado que TL1A e IL-23 promueven sinérgicamente la producción de IFN-g por las células T mucosales. FN-Y: es producido por las células T TH1. Una vez que se inicia la inflamación, se produce IFN-g, y posteriormente actúa a través de diversas moléculas y rutas del sistema inmunitario para intensificar el proceso inflamatorio. Existe una abrumadora cantidad de bibliografía que documenta ampliamente la naturaleza proinflamatoria del IFN-g, lo que ha llevado a la opinión generalizada de que el IFN-g es una citocina proinflamatoria principal en la inflamación y la enfermedad autoinmune. El interferóngamma está implicado causalmente en la enfermedad intestinal inflamatoria experimental en ratones (Ito et al, Clinical and Experimental Immunology (2006), 146:330-338). El estudio demostró claramente que los ratones IFN-y/-manifestaron colitis atenuada después de la estimulación con DSS, en términos del grado de pérdida de peso corporal, DAI, puntuación histológica, y actividad de MPO. El IFN-g se producía cada vez más en el colon de los ratones WT tratados con DSS que mostraban síntomas graves similares a los de la EII.
La interleucina-2 (IL-2) es producida por las células T, y es principalmente importante para que las células T se diferencien en células T efectoras. IL-2 también es importante para la proliferación de células T. Esto es importante para la EII, debido a que se cree que las células T efectoras son un tipo de célula principal que causa daño en la EII.
La IL-8 (interleucina-8; también conocida como CXCL8) media principalmente en la activación y migración de los neutrófilos al tejido desde la sangre periférica y hacia los sitios de inflamación. Se ha encontrado que el nivel tisular de IL-8 es mayor en la CU activa en comparación con el tejido colónico normal, y su concentración sérica se ha relacionado con la gravedad endoscópica e histológica de la CU. IL-8 es importante para los entornos inflamatorios y el cáncer (véase, por ejemplo, 'The Chemokine CXCL8 in Carcinogenesis and Drug Response”, ISRN Oncol. 2013 Oct 9;2013:859154; Gales D et al., y Future Oncol., 2010 Ene;6(1):111-6. doi: 10.2217/fon.09.128; “CXCL8 and its cognate receptors in melanoma progression and metastasis”, Singh S et al.). Particularmente en el cáncer, se cree que la IL-8 también contribuye apoyando la angiogénesis.
En cualquier configuración, aspecto, concepto o ejemplo aquí, el anticuerpo o fragmento antagoniza la unión de hOX40L a un receptor OX40.
En cualquier configuración, aspecto, concepto o ejemplo aquí, el anticuerpo o fragmento antagoniza la unión de hOX40L a OX40.
En cualquier configuración, aspecto, concepto o ejemplo aquí, el receptor OX40L puede ser OX40 humano.
En cualquier configuración, aspecto, concepto o ejemplo aquí, el ser humano padece o corre el riesgo de padecer asma, y el anticuerpo o fragmento disminuye la IgE en un ser humano.
En cualquier configuración, aspecto, concepto o ejemplo aquí, el ser humano padece o corre el riesgo de padecer asma, y el anticuerpo o fragmento es para disminuir la IgE en un ser humano.
2. El anticuerpo o fragmento del aspecto 1, en el que el anticuerpo o fragmento disminuye la unión del receptor hOX40, expresado por células T humanas, con hOX40L, expresado en células endoteliales, y disminuye la proliferación de células T humanas; en el que el anticuerpo o fragmento es para tratar o prevenir dicha enfermedad o afección mediada por hOX40L al disminuir la secreción de una citocina seleccionada de TNF alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-13, IL-17, RANTES e interferón gamma.
En un ejemplo, la citocina se selecciona de (i) TNF alfa, (ii) IL-2, e (iii) interferón gamma. En un ejemplo, la citocina es TNF alfa. En un ejemplo, la citocina es IL-2. En un ejemplo, la citocina es interferón gamma. En un ejemplo, las citocinas son (i) y (ii); o (i) y (iii); o (ii) y (iii); o (i)-(iii).
3. El anticuerpo o fragmento del aspecto 1, en el que los leucocitos se seleccionan del grupo que consiste en leucocitos polimorfonucleares, monocitos, células mononucleares de sangre periférica (PBMC), linfocitos, células T, células presentadoras de antígeno (APC), células dendríticas (células DC), y células asesinas naturales (células NK).
En una realización, los leucocitos son células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células T (por ejemplo, PBMC).
4. El anticuerpo o fragmento del aspecto 3, en el que los leucocitos comprenden linfocitos de la lámina propia (LPL), y la enfermedad o afección es una enfermedad o afección del tracto gastrointestinal (tracto GI).
5. El anticuerpo o fragmento de cualquier aspecto anterior, en el que las células epiteliales comprenden células seleccionadas del grupo que consiste en células gastrointestinales, células del colon, células intestinales, y células epiteliales de las vías respiratorias (por ejemplo, pulmón).
En otra realización, las células epiteliales comprenden células seleccionadas del grupo que consiste en células gastrointestinales, células del colon, células intestinales, células oculares, y células epiteliales de las vías respiratorias (por ejemplo, pulmón). En otra realización, las células epiteliales comprenden células seleccionadas del grupo que consiste en células gastrointestinales, células del colon, células intestinales, y células oculares. En otra realización, las células epiteliales comprenden células oculares.
6. El anticuerpo o fragmento de cualquier aspecto anterior, para tratar o prevenir dicha enfermedad o afección mediada por hOX40L en dicho ser humano mediante la disminución de la proliferación de células T en dicho ser humano.
En un ejemplo, el anticuerpo o fragmento es capaz de efectuar una disminución de la proliferación de células T en un ensayo in vitro (por ejemplo, en un ensayo in vitro de una célula DC/célula T humana, por ejemplo como se explica más adelante), y por lo tanto, la administración de dicho anticuerpo o fragmento al ser humano conduce a la disminución de la proliferación de células T en dicho ser humano.
7. El anticuerpo o fragmento de cualquier aspecto anterior, para tratar o prevenir dicha enfermedad o afección mediada por hOX40L en dicho ser humano al antagonizar la interacción entre hOX40L y los leucocitos del ser humano, en el que se reduce la proliferación de leucocitos.
En un ejemplo, el anticuerpo o fragmento es capaz de efectuar una disminución de la proliferación de leucocitos (por ejemplo, células mononucleares) en un ensayo in vitro (por ejemplo, en un ensayo de MLR in vitro, por ejemplo como se explica más adelante), y por lo tanto, la administración de dicho anticuerpo o fragmento al ser humano conduce a la disminución de la proliferación de leucocitos en dicho ser humano.
8. El anticuerpo o fragmento de cualquier aspecto anterior, para tratar o prevenir dicha enfermedad o afección mediada por hOX40L en dicho ser humano al disminuir la proliferación de leucocitos del ser humano al antagonizar la interacción OX40L/receptor de OX40L mediada por células T en dicho ser humano.
En un ejemplo, el anticuerpo o fragmento es capaz de efectuar una disminución de la proliferación de leucocitos (por ejemplo, células mononucleares) en un ensayo in vitro en el que el anticuerpo o fragmento antagoniza la interacción OX40L/receptor de OX40L mediada por células T en dicho ensayo, y por lo tanto, la administración de dicho anticuerpo o fragmento al ser humano conduce a la disminución de la proliferación de leucocitos en dicho ser humano.
9. El anticuerpo o fragmento de cualquier aspecto anterior, para tratar o prevenir dicha enfermedad o afección mediada por hOX40L en dicho humano al disminuir la secreción de una citocina seleccionada de TNF alfa, IL-2 e interferón gamma en el ser humano.
En un ejemplo, el anticuerpo o fragmento es para tratar o prevenir dicha enfermedad, afección o daño celular epitelial mediados por hOX40L en dicho ser humano al disminuir la secreción de (i) IL-2 e interferón gamma, (ii) IL-2 y TNF alfa, o (iii) interferón gamma y TNF alfa en el ser humano.
En un ejemplo, el anticuerpo o fragmento es capaz de efectuar una disminución de la secreción de una citocina seleccionada de IL-2, TNF alfa e interferón gamma en un ensayo in vitro (por ejemplo, en un ensayo de MLR in vitro, por ejemplo como se explica más adelante), y por lo tanto, la administración de dicho anticuerpo o fragmento al ser humano conduce a la disminución de la secreción de dicha o dichas citocinas seleccionadas en dicho ser humano.
En un ejemplo, el anticuerpo o fragmento es capaz de efectuar una disminución de la secreción de IL-8 en un ensayo in vitro (por ejemplo, en un ensayo de MLR in vitro, por ejemplo como se explica más adelante), y por lo tanto, la administración de dicho anticuerpo o fragmento al ser humano conduce a una disminución de la secreción de IL-8 en dicho ser humano.
10. El anticuerpo o fragmento del aspecto 9, para tratar o prevenir dicha enfermedad o afección al disminuir la secreción de dicha citocina mediada por la interacción de las células dendríticas (células DC) con las células T en el ser humano.
En un ejemplo, el anticuerpo o fragmento es capaz de efectuar una disminución de dicha secreción de citocina o citocinas en un ensayo in vitro de células DC/células T (por ejemplo, como se explica más adelante), y por lo tanto, la administración de dicho anticuerpo o fragmento al ser humano conduce a la disminución de la secreción de dicha citocina o citocinas en dicho ser humano.
11. El anticuerpo o fragmento de cualquier aspecto anterior, en el que el daño a las células gastrointestinales, células del colon, células intestinales o células de las vías respiratorias (por ejemplo, pulmón) es un síntoma o causa de dicha enfermedad o afección en seres humanos.
En otra realización, las células epiteliales comprenden células seleccionadas del grupo que consiste en células gastrointestinales, células del colon, células intestinales, células oculares, y células epiteliales de las vías respiratorias (por ejemplo, pulmón). En otra realización, las células epiteliales comprenden células seleccionadas del grupo que consiste en células gastrointestinales, células del colon, células intestinales, y células oculares. En otra realización, las células epiteliales comprenden células oculares.
12. El anticuerpo o fragmento de cualquier aspecto anterior, en el que el ser humano padece o corre el riesgo de padecer una enfermedad inflamatoria intestinal (EII), rechazo de trasplantes alogénicos, enfermedad de injerto contra hospedante (EICH), diabetes, o inflamación de las vías respiratorias, y dicho método trata o previene la EII, el rechazo de trasplantes alogénicos, la EICH, la diabetes o la inflamación de las vías respiratorias en el ser humano.
12a. El anticuerpo o fragmento de cualquier aspecto anterior, en el que el ser humano padece o corre el riesgo de padecer una enfermedad inflamatoria intestinal (EII), rechazo de trasplantes alogénicos, enfermedad de injerto contra hospedante (EICH), uveítis, pioderma gangrenoso, arteritis de células gigantes, síndrome de Schnitzler, escleritis no infecciosa, diabetes, o inflamación de las vías respiratorias, y dicho método trata o previene la EII, el rechazo de trasplantes alogénicos, la EICH, la uveítis, el pioderma gangrenoso, la arteritis de células gigantes, el síndrome de Schnitzler, la escleritis no infecciosa, la diabetes o la inflamación de las vías respiratorias en el ser humano.
En un ejemplo de cualquier aspecto anterior, el ser humano padece o está en riesgo de padecer una enfermedad o afección inflamatoria o autoinmune, o ha sido diagnosticado como tal.
En un ejemplo, la enfermedad o afección autoinmune se selecciona de lo siguiente:
Encefalomielitis diseminada aguda (ADEM)
Enfermedad de Addison
Granulomatosis alérgica y angeítis o síndrome de Churg-Strauss (CSS)
Alopecia o Alopecia Areata (AA)
Espondilitis anquilosante
Hepatitis activa crónica autoinmune (CAH)
Anemia hemolítica autoinmune
Pancreatitis autoinmune (PAI)
Retinopatía autoinmune (AR); véase Retinopatía
Púrpura trombocitopénica autoinmune
Neutropenia autoinmune
Enfermedad autoinmune del oído interno (AIED)
Síndrome Antifosfolípido (SAF)
Síndrome Linfoproliferativo Autoinmune (ALPS)
Síndrome de Behget
Penfigoide ampolloso
Celiaquía
Síndrome de Churg-Strauss (SCS) o Angiitis Granulomatosis Alérgica
Enfermedad ampollosa crónica de la infancia
Polirradiculoneuropatía inflamatoria desmielinizante crónica (CIDP)
Penfigoide cictricial (PC)
Vasculitis del Sistema Nervioso Central
Enfermedad de Crohn
Crioglobulinemia
Dermatitis herpetiforme (DH)
Lupus eritematoso discoide (LED)
Encefalomielitis
Epidermólisis ampollosa adquirida (EBA)
Arteritis de células gigantes; véase Arteritis temporal
Enfermedad de injerto contra hospedante
Enfermedad de Graves
Síndrome de Gullain-Barré
Síndrome de Hanot; véase Cirrosis biliar primaria
Tiroiditis de Hashimoto, también llamada tiroiditis autoinmune y tiroiditis linfocítica crónica Vasculitis por hipersensibilidad (HV) o vasculitis de vasos pequeños
Infertilidad inmunomediada
Enfermedad inflamatoria intestinal
Diabetes mellitus insulinodependiente
Vasculitis aislada del sistema nervioso central o Vasculitis del SNC
Síndrome de Isaacs: Neuromiotonía
Enfermedad de Kawasaki (EK)
Síndrome miasténico de Lambert-Eaton (LEMS)
Enfermedad de IgA lineal
Lupus - véase lupus eritematoso sistémico
Enfermedad de Meniere
Poliangitis microscópica (MPA)
Enfermedad mixta del tejido conjuntivo o EMTC
Gammapatía monoclonal
Miastenia grave
Esclerosis múltiple
Neuropatía motora multifocal
Neuromiotonía o síndrome de Isaac
Neutropenia; véase Neutropenia autoinmune
Ooforitis
Síndrome de opsoclono-mioclono
Orquitis
Trastornos neurológicos paraneoplásicos
Pénfigo vulgar
Pénfigo follaceo PF)
Penfigoide gestacional (PG)
Anemia perniciosa
Pénfigo paraneoplásico (PNP)
Poliangeítis - véase Poliangeítis microscópica
Poliarteritis nodosa (PAN)
Polimiositis/dermatomiositis
Polimialgia reumática
Cirrosis biliar primaria (CBP) también llamada Síndrome de Hanot Colangitis esclerosante primaria (CEP)
Fenómeno de Raynaud
Retinopatía asociada a Recoverina (RAR); véase Retinopatía
Artritis reactiva, anteriormente conocida como síndrome de Reiter, Retinopatía
Artritis reumatoide (AR)
Sarcoidosis
Colangitis esclerosante; véase Colangitis esclerosante primaria Síndrome de Sjogren
Vasculitis necrosantes sistémicas
Síndrome del hombre rígido o síndrome de Moersch-Woltmann
Lupus eritematoso sistémico
Esclerosis sistémica (esclerodermia)
Arteritis temporal o arteritis de células gigantes (GCV)
Arteritis de Takayasu
Tromboangeítis obliterante o enfermedad de Buerger
Tiroiditis con hipotiroidismo
Tiroiditis con hipertiroidismo
Síndrome poliglandular autoinmune tipo I (PAS)
Síndrome poliglandular autoinmune tipo II
Vasculitis
Granulomatosis de Wegener
En un ejemplo de cualquier aspecto, configuración, concepto o realización, el ser humano padece uveítis. Por ejemplo, la uveítis es de naturaleza no infecciosa y/o autoinmune, es decir, es una uveítis no infecciosa o es una uveítis autoinmune. Por ejemplo, la uveítis no infecciosa/autoinmune es causada por y/o está asociada con la enfermedad de Behget, iridociclitis heterocrómica de Fuchs, granulomatosis con poliangitis, uveítis relacionada con HLA-B27, artritis idiopática juvenil, sarcoidosis, espondiloartritis, oftalmía simpática, nefritis tubulointersticial o síndrome de uveítis. En un ejemplo, la uveítis es de naturaleza sistémica, es decir, es una uveítis sistémica. Por ejemplo, la uveítis sistémica es causada y/o está asociada con espondilitis anquilosante, enfermedad de Behget, enfermedad granulomatosa crónica, entesitis, enfermedad inflamatoria intestinal, artritis reumatoide juvenil, enfermedad de Kawasaki, esclerosis múltiple, poliarteritis nodosa, artritis psoriásica, artritis reactiva, sarcoidosis, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada, o enfermedad de Whipple.
En un ejemplo de cualquier aspecto, configuración, concepto o realización, el ser humano padece pioderma gangrenoso, arteritis de células gigantes, síndrome de Schnitzler, o escleritis no infecciosa. En un ejemplo, el ser humano padece de pioderma gangrenoso. En un ejemplo, el ser humano padece de arteritis de células gigantes. En un ejemplo, el ser humano padece del síndrome de Schnitzler. En un ejemplo, el ser humano padece escleritis no infecciosa.
En un ejemplo de cualquier aspecto, configuración, concepto o realización, el ser humano padece una enfermedad o afección mediada por hOX40L, seleccionada de una enfermedad o afección autoinmune, una enfermedad o afección inflamatoria sistémica, o rechazo de trasplantes; por ejemplo, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, rechazo de trasplantes, rechazo de trasplantes alogénicos, enfermedad de injerto contra hospedante (EICH), colitis ulcerosa, lupus eritematoso sistémico (LES), diabetes, uveítis, espondilitis anquilosante, hipersensibilidad por contacto, esclerosis múltiple, y aterosclerosis, en particular EICH. En otra realización, el ser humano padece o está en riesgo de rechazo de trasplante de órganos multiviscerales.
13. Un anticuerpo o un fragmento del mismo, que se une específicamente a hOX40L y compite por la unión a dicho hOX40L con un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en 02D10, 10A07, 09H04 y 19H01.
En un ejemplo de cualquier aspecto, configuración, concepto o realización, la competición puede determinarse mediante resonancia de plasmones superficiales (SPR), siendo dichas técnicas fácilmente evidentes para el experto en la técnica. SPR se puede realizar con Biacore™, Proteona™, u otra técnica de SPR estándar. Tal competición puede deberse, por ejemplo, a los anticuerpos/fragmentos que se unen a epítopos idénticos o superpuestos de hOX40L. En un ejemplo de cualquier aspecto, configuración, concepto o realización, la competición se determina mediante ELISA, siendo dichas técnicas fácilmente evidentes para el experto en la técnica. En un ejemplo de cualquier aspecto, configuración, concepto o realización, la competición se determina mediante fluorescencia homogénea resuelta en el tiempo (HTRF), siendo dichas técnicas fácilmente evidentes para el experto en la técnica. En un ejemplo de cualquier aspecto, configuración, concepto o realización, la competición se determina mediante la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), siendo dichas técnicas fácilmente evidentes para el experto en la técnica. En un aspecto, los métodos HTRF, ELISA y/o FACS se llevan a cabo como se describe en los Ejemplos a continuación. 14. El anticuerpo o fragmento del aspecto 13, en el que el anticuerpo o fragmento es según uno cualquiera de los aspectos 1 a 12.
15. El anticuerpo o fragmento de cualquier aspecto anterior, que comprende dominios variables de cadena ligera lambda (que opcionalmente son humanos).
En un ejemplo de cualquier aspecto, configuración, concepto o realización de la presente invención, los dominios variables del anticuerpo o fragmento son humanos o humanizados. Además, opcionalmente, el anticuerpo o fragmento comprende además regiones constantes humanas o humanizadas (por ejemplo, Fc humana y/o CL humana). En un ejemplo de cualquier aspecto de la presente invención, los dominios variables del anticuerpo o fragmento son producidos por un animal transgénico (por ejemplo, un roedor, ratón, rata, conejo, pollo, oveja, camélido o tiburón). En un ejemplo de cualquier aspecto de la presente descripción, los dominios variables del anticuerpo o fragmento se producen o identifican mediante presentación en fagos, presentación en ribosomas o presentación en levaduras. En un ejemplo de cualquier aspecto, configuración, concepto o realización de la presente invención, el anticuerpo o fragmento es recombinante.
En un ejemplo de cualquier aspecto, configuración, concepto o realización de la presente invención, el anticuerpo o fragmento es producido por una célula recombinante de mamífero, bacteria, insecto, planta o levadura. En un ejemplo, la célula de mamífero es una célula CHO o HEK293, y el anticuerpo o fragmento comprende glicosilación de células CHO o HEK293.
En un ejemplo de cualquier aspecto, configuración, concepto o realización de la presente invención, el anticuerpo o fragmento se aísla.
16. El anticuerpo o fragmento de cualquier aspecto anterior, que comprende un dominio VH que comprende una secuencia de HCDR1 seleccionada del grupo que consiste en la HCDR1 de:
a. 02D10, y en el que el anticuerpo o fragmento compite con 02D10 por la unión a dicho hOX40L;
b. 10A07, y en el que el anticuerpo o fragmento compite con 10A07 por la unión a dicho hOX40L;
c. 09H04, y en el que el anticuerpo o fragmento compite con 09H04 por la unión a dicho hOX40L; y d. 19H01, y en el que el anticuerpo o fragmento compite con 19H01 por la unión a dicho hOX40L.
17. El anticuerpo o fragmento de cualquier aspecto anterior, que comprende un dominio VH que comprende una secuencia de HCDR2 seleccionada del grupo que consiste en la HCDR2 de:
a. 02D10, y en el que el anticuerpo o fragmento compite con 02D10 por la unión a dicho hOX40L;
b. 10A07, y en el que el anticuerpo o fragmento compite con 10A07 por la unión a dicho hOX40L;
c. 09H04, y en el que el anticuerpo o fragmento compite con 09H04 por la unión a dicho hOX40L; y d. 19H01, y en el que el anticuerpo o fragmento compite con 19H01 por la unión a dicho hOX40L.
18. El anticuerpo o fragmento de cualquier aspecto anterior, que comprende un dominio VH que comprende una secuencia de HCDR3 seleccionada del grupo que consiste en la HCDR3 de:
a. 02D10, y en el que el anticuerpo o fragmento compite con 02D10 por la unión a dicho hOX40L;
b. 10A07, y en el que el anticuerpo o fragmento compite con 10A07 por la unión a dicho hOX40L;
c. 09H04, y en el que el anticuerpo o fragmento compite con 09H04 por la unión a dicho hOX40L; y d. 19H01, y en el que el anticuerpo o fragmento compite con 19H01 por la unión a dicho hOX40L.
19. El anticuerpo o fragmento de cualquier aspecto anterior, que comprende un dominio VH que comprende las secuencias de (i) CDR1 y 2, (ii) CDR1 y 3, (iii) CDR2 y 3, o (iv) CDR1,2 y 3:
a. citadas en (a) de los aspectos 16 a 18, y en el que el anticuerpo o fragmento compite con 02D10 por la unión a dicho hOX40L;
b. citadas en (b) de los aspectos 16 a 18, y en el que el anticuerpo o fragmento compite con 10A07 por la unión a dicho hOX40L;
c. citadas en (c) de los aspectos 16 a 18, y en el que el anticuerpo o fragmento compite con 09H04 por la unión a dicho hOX40L; o
d. citadas en (d) de los aspectos 16 a 18, y en el que el anticuerpo o fragmento compite con 19H01 por la unión a dicho hOX40L.
20. El anticuerpo o fragmento de cualquier aspecto anterior, que comprende un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de VH en el listado de secuencias.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo o fragmento anti-hOX40L (opcionalmente según cualquier otro aspecto mencionado aquí) que comprende un dominio VH que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de VH en el listado de secuencias. En un aspecto, el dominio VH comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de Seq ID No: 2, Seq ID No: 34, Seq ID No: 66, Seq ID No: 94, Seq ID No: 122, Seq ID No: 124, Seq ID NO: 126, Seq ID No: 128, Seq ID No: 132 o Seq ID No: 134.
En otro ejemplo de la invención, el anticuerpo o fragmento comprende una secuencia de aminoácidos del dominio VH expuesta en el listado de secuencias a continuación. Adicional o alternativamente, el anticuerpo o fragmento comprende una secuencia de aminoácidos del dominio de HCDR1 expuesta en el listado de secuencias a continuación (es decir, Seq ID No: 4, Seq ID No: 10, Seq ID No: 36, Seq ID No: 42, Seq ID No: No: 68, Seq ID No: 74, Seq ID No: 96 o Seq ID No: 102, en particular, Seq ID No: 36 o Seq ID No: 42). Adicional o alternativamente, el anticuerpo o fragmento comprende una secuencia de aminoácidos del dominio de HCDR2 expuesta en el listado de secuencias a continuación (es decir, Seq ID No: 6, Seq ID No: 12, Seq ID No: 38, Seq ID No: 44, Seq ID No: No: 70, Seq ID No: 76, Seq ID No: 98 o Seq ID No: 104, en particular Seq iD No: 38 o Seq ID No: 44). Adicional o alternativamente, el anticuerpo o fragmento comprende una secuencia de aminoácidos del dominio de HCDR3 expuesta en el listado de secuencias a continuación (es decir, Seq ID No: 8, Seq ID No: 14, Seq ID No: 40, Seq ID No: 46, Seq ID No: No: 72, Seq ID No: 78, Seq ID No: 100 o Seq ID No: 106, en particular Seq ID No: 40 o Seq ID No: 46).
En un ejemplo de la invención, el anticuerpo o fragmento comprende una secuencia de aminoácidos del dominio VL expuesta en el listado de secuencias a continuación. Adicional o alternativamente, el anticuerpo o fragmento comprende una secuencia de aminoácidos del dominio de LCDR1 expuesta en el listado de secuencias a continuación (es decir, Seq ID No: 18, Seq ID No: 24, Seq ID No: 50, Seq ID No: 56, Seq ID No: No: 82, Seq ID No: 88, Seq ID No: 110 o Seq ID No: 116, en particular Seq ID No: 50 o Seq ID No: 56). Adicional o alternativamente, el anticuerpo o fragmento comprende una secuencia de aminoácidos del dominio de LCDR2 expuesta en el listado de secuencias a continuación (es decir, Seq ID No: 20, Seq ID No: 26, Seq ID No: 52, Seq ID No: 58, Seq ID No: No: 84, Seq ID No: 90, Seq ID No: 112 o Seq Id No: 118, en particular Seq iD No: 52 o Seq ID No: 58). Adicional o alternativamente, el anticuerpo o fragmento comprende una secuencia de aminoácidos del dominio de LCDR3 expuesta en el listado de secuencias a continuación (es decir, Seq ID No: 22, Seq ID No: 28, Seq ID No: 54, Seq ID No: 60, Seq ID No: No: 86, Seq ID No: 92, Seq ID No: 114 o Seq ID No: 120, en particular Seq ID No: 54 o Seq ID No: 60).
En un ejemplo de cualquier aspecto aquí, el anticuerpo o fragmento comprende una cadena pesada que comprende una región constante seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO de la región constante de la cadena pesada en el listado de secuencias (es decir, cualquiera de Seq ID Nos: 126, 128, 132 o 134, en particular la región constante de Seq ID No: 128); y opcionalmente un dominio VH como se indica en el aspecto 19 o 20. En un ejemplo, el anticuerpo o fragmento comprende dos copias de dicha cadena pesada. En otro ejemplo, la cadena pesada comprende una región constante de roedor, rata, ratón, humano, conejo, pollo, camélido, oveja, bovino, primate no humano, o tiburón (por ejemplo, Fc), en particular una región constante de ratón.
En un ejemplo de cualquier aspecto aquí, el anticuerpo o fragmento comprende una cadena pesada que comprende una región constante gamma (por ejemplo, gamma humana), por ejemplo una región constante gamma1 humana. En otro ejemplo de cualquier aspecto aquí, el fragmento de anticuerpo comprende una región constante gamma 4 humana. En otra realización, la región constante de la cadena pesada no se une a los receptores Fc-y, y comprende por ejemplo una mutación Leu235Glu (es decir, en la que el resto de leucina de tipo salvaje está mutado a un resto de ácido glutámico). En otra realización, la región constante de la cadena pesada comprende una mutación Ser228Pro para aumentar la estabilidad. En otra realización, la región constante de cadena pesada es IgG4 que comprende tanto la mutación Leu235Glu como la mutación Ser228Pro. Esta región constante de cadena pesada se denomina aquí “IgG4-PE”.
En un ejemplo de cualquier aspecto aquí, el anticuerpo o fragmento es quimérico, por ejemplo comprende dominios variables humanos y regiones constantes no humanas (por ejemplo, roedor, ratón o rata, tal como ratón).
21. El anticuerpo o fragmento de uno cualquiera de los aspectos 16 a 20, que comprende la primera y la segunda copias de dicho dominio VH.
22. El anticuerpo o fragmento de cualquier aspecto anterior, que comprende un dominio VL que comprende una secuencia de LCDR1 seleccionada del grupo que consiste en la LCDR1 de:
a. 02D10, y en el que el anticuerpo o fragmento compite con 02D10 por la unión a dicho hOX40L;
b. 10A07, y en el que el anticuerpo o fragmento compite con 10A07 por la unión a dicho hOX40L;
c. 09H04, y en el que el anticuerpo o fragmento compite con 09H04 por la unión a dicho hOX40L; y
d. 19H01, y en el que el anticuerpo o fragmento compite con 19H01 por la unión a dicho hOX40L.
23. El anticuerpo o fragmento de cualquier aspecto anterior, que comprende un dominio VL que comprende una secuencia de LCDR2 seleccionada del grupo que consiste en la LCDR2 de:
a. 02D10, y en el que el anticuerpo o fragmento compite con 02D10 por la unión a dicho hOX40L; b. 10A07, y en el que el anticuerpo o fragmento compite con 10A07 por la unión a dicho hOX40L;
c. 09H04, y en el que el anticuerpo o fragmento compite con 09H04 por la unión a dicho hOX40L; y d. 19H01, y en el que el anticuerpo o fragmento compite con 19H01 por la unión a dicho hOX40L.
24. El anticuerpo o fragmento de cualquier aspecto anterior, que comprende un dominio VL que comprende una secuencia de LCDR3 seleccionada del grupo que consiste en la LCDR3 de:
a. 02D10, y en el que el anticuerpo o fragmento compite con 02D10 por la unión a dicho hOX40L;
b. 10A07, y en el que el anticuerpo o fragmento compite con 10A07 por la unión a dicho hOX40L;
c. 09H04, y en el que el anticuerpo o fragmento compite con 09H04 por la unión a dicho hOX40L; y d. 19H01, y en el que el anticuerpo o fragmento compite con 19H01 por la unión a dicho hOX40L.
25. El anticuerpo o fragmento de cualquier aspecto anterior, que comprende un dominio VL que comprende las secuencias de (i) CDR1 y 2, (ii) CDR1 y 3, (iii) CDR2 y 3, o (iv) CDR1,2 y 3:
a. citadas en (a) de los aspectos 22-24, y en el que el anticuerpo o fragmento compite con 02D10 por la unión a dicho hOX40L;
b. citadas en (b) de los aspectos 22-24, y en el que el anticuerpo o fragmento compite con 10A07 por la unión a dicho hOX40L;
c. citadas en (c) de los aspectos 22-24, y en el que el anticuerpo o fragmento compite con 09H04 para unirse a dicho hOX40L; o
d. citadas en (d) de los aspectos 22-24, y en el que el anticuerpo o fragmento compite con 19H01 para unirse a dicho hOX40L.
26. El anticuerpo o fragmento de cualquier aspecto anterior, que comprende un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de VL en el listado de secuencias.
En un aspecto de la invención, se proporciona un fragmento o anticuerpo anti-hOX40L (opcionalmente según cualquier otro aspecto aquí), que comprende un dominio VL que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de VL en el listado de secuencias (es decir, Seq ID No: 16, Seq ID No: 48, Seq ID No: 80 o Seq ID No: 108, en particular Seq ID No: 48).
En un ejemplo de cualquier aspecto aquí, el anticuerpo o fragmento comprende una cadena ligera (por ejemplo, cadena ligera lambda) que comprende una región constante seleccionada del grupo que consiste en secuencias de región constante de cadena ligera en el listado de secuencias (es decir, Seq ID No: 136, Seq ID No: 138, Seq ID No: 140, Seq ID No: 142, Seq ID No: 144, Seq ID No: 146, Seq ID No: 148, Seq ID No: 152, Seq ID No: 154, Seq ID No: 156, Seq ID No: 158, Seq ID No: 160, Seq ID No: 162, Seq ID No: 164 o Seq ID No: 166); y opcionalmente un dominio VL (por ejemplo, VL lambda) como se indica en el aspecto 25 o 26. En un ejemplo, el anticuerpo o fragmento comprende dos copias de dicha cadena ligera (opcionalmente también dos copias de la cadena pesada descrita anteriormente). En otro ejemplo, la cadena ligera comprende una región constante de roedor, rata, ratón, ser humano, conejo, pollo, camélido, oveja, bovino, primate no humano, o tiburón.
En un ejemplo de cualquier aspecto aquí, el anticuerpo o fragmento comprende una cadena ligera (por ejemplo, cadena ligera kappa) que comprende una región constante seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de región constante de cadena ligera en el listado de secuencias (es decir, Seq ID No: 136, Seq ID No: 138, Seq ID No: 140, Seq ID No: 142, Seq ID No: 144, Seq ID No: 146, Seq ID No: 148, Seq ID No: 152, Seq ID No: 154, Seq ID No: 156, Seq ID No: 158, Seq ID No: 160, Seq ID No: 162, Seq ID No: 164 o Seq ID No: 166); y opcionalmente un dominio VL (por ejemplo, VL kappa) como se indica en el aspecto 25 o 26. En un ejemplo, el anticuerpo o fragmento comprende dos copias de dicha cadena ligera (opcionalmente también dos copias de la cadena pesada descrita anteriormente). En otro ejemplo, la cadena ligera comprende una región constante de roedor, rata, ratón, ser humano, conejo, pollo, camélido, oveja, bovino, primate no humano, o tiburón.
En un ejemplo, el anticuerpo o fragmento comprende una cadena ligera lambda que comprende una región constante seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de la región constante de la cadena ligera en el listado de secuencias (es decir, Seq ID No: 146, Seq ID No: 148, Seq ID No: 152, Seq ID No: 154, Seq ID No: 156, Seq ID No: 158, Seq ID No: 160, Seq ID No: 162, Seq ID No: 164 o Seq ID No: 166); y opcionalmente un dominio VL lambda.
En un ejemplo, el anticuerpo o fragmento comprende una cadena ligera kappa que comprende una región constante seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de la región constante de la cadena ligera en el listado de secuencias (es decir, Seq ID No: 136, Seq ID No: 138, Seq ID No: 140, Seq ID No: 142 o Seq ID No: 144); y opcionalmente un dominio VL kappa.
En un ejemplo, los dominios VL del anticuerpo o fragmento son dominios variables de cadena ligera lambda. En un ejemplo, los dominios VL del anticuerpo o fragmento son dominios variables de cadena ligera kappa.
27. El anticuerpo o fragmento de uno cualquiera de los aspectos 22 a 26, que comprende la primera y la segunda copias de dicho dominio VL.
28. El anticuerpo o fragmento de cualquier aspecto anterior, en el que el hOX40L es hOX40L expresado en la superficie celular humana, por ejemplo en células endoteliales (por ejemplo, una célula endotelial de las vías respiratorias o del tracto GI).
En otra realización, las células epiteliales comprenden células seleccionadas del grupo que consiste en células gastrointestinales, células del colon, células intestinales, células oculares, y células epiteliales de las vías respiratorias (por ejemplo, pulmón). En otra realización, las células epiteliales comprenden células seleccionadas del grupo que consiste en células gastrointestinales, células del colon, células intestinales, y células oculares. En una realización adicional, las células epiteliales pueden comprender células oculares.
29. El anticuerpo o fragmento de cualquier aspecto anterior, en el que el anticuerpo o fragmento disminuye la proliferación de PBMC o células T humanas en presencia de hOX40L en un ensayo in vitro de reacción de linfocitos mixtos (MLR) en al menos un 20, 30, 40, 50 o 60% en comparación con la proliferación de PBMC o células T humanas en presencia de hOX40L en un ensayo in vitro de MLR de control en ausencia de un anticuerpo que es específico para hOX40L. En los ejemplos siguientes se proporciona una ilustración de un ensayo adecuado.
30. El anticuerpo o fragmento del aspecto 29, en el que el hOX40L en el ensayo se expresa en la superficie de células dendríticas humanas (células DC).
En los ejemplos siguientes se proporciona una ilustración de un ensayo adecuado.
31. El anticuerpo o fragmento de cualquier aspecto anterior, en el que el anticuerpo o fragmento disminuye la actividad de NF-kB en células HT-1080 humanas que expresan el receptor hOX40 in vitro en presencia de hOX40L.
En un ejemplo, el anticuerpo o fragmento cuya disminución en la actividad de NF-kB se determina detectando una disminución en la secreción de IL-8 por parte de las células HT-1080 (ATCC® CCL-121) (opcionalmente transfectadas con receptor hOX40, en presencia de hOX40) in vitro.
32. El anticuerpo o fragmento de cualquier aspecto anterior, en el que el anticuerpo o fragmento disminuye la secreción de IL-8 de células HT-1080 humanas que expresan el receptor hOX40 in vitro en presencia de hOX40L.
33. El anticuerpo o fragmento del aspecto 32, en el que el anticuerpo o fragmento disminuye la secreción de IL-8 en al menos un 20, 30, 40, 50 o 60% en comparación con la producción de IL-8 por células HT-1080 que expresan el receptor hOX40 in vitro en presencia de hOX40L en ausencia de un anticuerpo que es específico para hOX40L.
34. El anticuerpo o fragmento de cualquier aspecto anterior, en el que el anticuerpo o fragmento disminuye la proliferación de células T humanas estimulada por hOX40L in vitro.
35. El anticuerpo o fragmento de cualquier aspecto anterior, en el que el anticuerpo o fragmento disminuye la secreción de IL-2 estimulada por hOX40L de células T humanas in vitro.
36. El anticuerpo o fragmento de cualquier aspecto anterior, en el que el anticuerpo o fragmento disminuye la secreción de citocinas mediada por la interacción de células dendríticas humanas (células DC) con células T humanas, en el que la citocina se selecciona de una, dos, más o todos de TNF alfa, IL-2, iL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-13, IL-17, RANTES e interferón gamma.
Esto se puede evaluar, por ejemplo, usando un ensayo de MLR in vitro (por ejemplo, un ensayo de MLR de DC/células T in vitro). En los ejemplos siguientes se proporciona una ilustración de un ensayo adecuado.
En un ejemplo, las células DC no coinciden con las células T, por ejemplo no coinciden en el MHC, como es posible, por ejemplo, cuando las células DC son de un ser humano que es diferente de la fuente humana de células T. En un ejemplo, las celdas DC son producidas por inducción in vitro de monocitos humanos con GMCSF e IL-4.
37. El anticuerpo o fragmento de cualquier aspecto anterior, en el que el anticuerpo o fragmento disminuye la secreción de interferón gamma en al menos un 20, 30, 40, 50 o 60% en comparación con la producción de interferón gamma mediada por la interacción de células dendríticas humanas (células DC) con células T humanas en ausencia de un anticuerpo que es específico para hOX40L.
38. El anticuerpo o fragmento de cualquier aspecto anterior, en el que el anticuerpo o fragmento disminuye la secreción de TNF alfa en al menos un 20, 30, 40, 50 o 60% en comparación con la producción de TNF alfa mediada por la interacción de células dendríticas humanas (células DC) con células T humanas en ausencia de un anticuerpo que es específico para hOX40L.
39. El anticuerpo o fragmento de cualquier aspecto anterior, en el que el anticuerpo o fragmento disminuye la secreción de IL-2 en al menos un 10, 20, 30, 40, 50 o 60% en comparación con la producción de IL-2 mediada por la interacción de células dendríticas humanas (células DC) con células T humanas en ausencia de un anticuerpo que es específico para hOX40L.
40. El anticuerpo o fragmento de cualquier aspecto anterior, en el que el anticuerpo o fragmento disminuye la secreción de citocinas (por ejemplo, la secreción de citocinas leucocitarias) en un ensayo de linfocitos mixtos (MLR) de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC), en el que la citocina se selecciona de uno, dos, más o todos de TNF alfa, IL-2, IL-4, IL-3, iL-6, IL-8, IL-10, IL-17, RANTES e interferón gamma.
41. El anticuerpo o fragmento de cualquier aspecto anterior, en el que el anticuerpo o fragmento disminuye la secreción de interferón gamma en al menos un 20, 30, 40, 50 o 60% en comparación con la producción de interferón gamma en un ensayo de MLR de PBMC humanas en ausencia de un anticuerpo que es específico para hOX40L.
En una realización, la comparación es con la producción de interferón gamma en un ensayo de MLR de PBMC humanas en ausencia de anticuerpo.
42. El anticuerpo o fragmento de cualquier aspecto anterior, en el que el anticuerpo o fragmento disminuye la secreción de TNF alfa en al menos un 20, 30, 40, 50 o 60% en comparación con la producción de TNF alfa en un ensayo de MLR de PBMC humanas en ausencia de un anticuerpo que es específico para hOX40L.
43. El anticuerpo o fragmento de cualquier aspecto anterior, en el que el anticuerpo o fragmento disminuye la secreción de IL-2 en al menos un 10, 20, 30, 40, 50 o 60% en comparación con la producción de IL-2 en un ensayo de MLR de PBMC humanas en ausencia de un anticuerpo que es específico para hOX40L.
44. El anticuerpo o fragmento de uno cualquiera de los aspectos 36 a 43, en el que las células son células primarias.
Una “célula primaria” se refiere a una célula en un ser humano o una célula tal que se ha tomado del paciente para unirse al anticuerpo o fragmento de la invención in vitro (como puede ser útil, por ejemplo, en un método de diagnóstico del estado de OX40L o estado de enfermedad/afección en el ser humano). Las células primarias, tal como se usan aquí, no son células de líneas celulares humanas, que normalmente se han sometido a muchos cultivos in vitro. La capacidad del anticuerpo o fragmento de la invención para inhibir específicamente la unión de hOX40L al receptor en esta realización es ventajosa, ya que proporciona una indicación directa de la utilidad para dirigirse a células en pacientes humanos que padecen o corren el riesgo de padecer una enfermedad o afección mediada por hOX40L.
45. El anticuerpo o fragmento de cualquier aspecto anterior, en el que el anticuerpo o fragmento inhibe la unión de hOX40L a un receptor de hOX40L (por ejemplo, hOX40) con una IC50 de 1x10-8 o menos en un ensayo de HTRF (fluorescencia homogénea resuelta en el tiempo).
En un ejemplo, la IC50 está en el intervalo de 1x10-8 a 1x10-11, o en el intervalo de 1x10-9 a 1x10-10.
46. Una composición farmacéutica para tratar y/o prevenir una afección o enfermedad mediada por OX40L, comprendiendo la composición un anticuerpo o fragmento de cualquier aspecto anterior, y un diluyente, excipiente o vehículo; y opcionalmente que comprende además un fármaco antiinflamatorio.
En un ejemplo, el fármaco antiinflamatorio se selecciona de forma independiente del grupo que consiste en corticosteroides (por ejemplo, metilprednisolona), anticuerpos anti-IL12/IL-23 (por ejemplo, ustekinumab), anticuerpos anti-VLA4 (por ejemplo, natalizumab), anticuerpos anti-LFA1, anticuerpos anti-C5 del complemento (por ejemplo, eculizumab), anticuerpos anti-integrina a4b7 (por ejemplo, vedolizumab), anticuerpos anti-IL6 (por ejemplo, tocilizumab), anticuerpos anti-IL2R (por ejemplo, basilixumab) o anticuerpos anti-TNFa/moléculas TNFa-Fc (por ejemplo, etanercept, adalimumab, infliximab, golimumab, certolizumab pegol). En un ejemplo, el fármaco antiinflamatorio se selecciona independientemente del grupo que consiste en corticosteroides (por ejemplo, metilprednisolona) y anticuerpos anti-LFA1.
47. Una composición farmacéutica o kit para tratar y/o prevenir una afección o enfermedad mediada por OX40L, comprendiendo la composición o kit un anticuerpo o fragmento de la invención (y opcionalmente un fármaco antiinflamatorio) opcionalmente en combinación con una etiqueta o instrucciones de uso para tratar y/o prevenir dicha enfermedad o afección en un ser humano; opcionalmente, en el que la etiqueta o las instrucciones comprenden un número de autorización de comercialización (por ejemplo, un número de autorización de la FDA o EMA); opcionalmente, en el que el kit comprende un dispositivo intravenoso o de inyección que comprende el anticuerpo o fragmento.
48. Un ácido nucleico que codifica la HCDR3 de un anticuerpo citado en uno cualquiera de los aspectos 1 a 45.
En una realización, las HCDR aquí están de acuerdo con la nomenclatura de Kabat. En otra realización, las HCDR aquí están de acuerdo con la nomenclatura IMGT.
49. El ácido nucleico del aspecto 48, que comprende una secuencia nucleotídica que es al menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% idéntica o es 100% idéntica a una secuencia de HCDR3 en el listado de secuencias.
En un aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un dominio VH de un anticuerpo anti-hOX40L, en el que la secuencia nucleotídica comprende una secuencia de HCDR3 que es al menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% idéntica o es 100% idéntica a una secuencia de HCDR3 en el listado de secuencias. Opcionalmente, el anticuerpo está de acuerdo con cualquier otro aspecto aquí.
En otra realización, se proporciona el ácido nucleico como se describe en el aspecto 48, que comprende una secuencia nucleotídica que es 100% idéntica a una secuencia de HCDR3 en el listado de secuencias, excepto por 1, 2 o 3 sustituciones nucleotídicas, en la que cada sustitución no produce ningún cambio de aminoácido o produce un cambio de aminoácido conservativo (es decir, la sustitución de nucleótidos es una sustitución sinónima) en la secuencia de proteína correspondiente. El experto en la técnica estará familiarizado con los cambios conservativos de aminoácidos.
Las sustituciones de aminoácidos incluyen alteraciones en las que un aminoácido se reemplaza por un resto de aminoácido natural diferente. Tales sustituciones pueden clasificarse como “conservativas”, en cuyo caso un resto de aminoácido contenido en un polipéptido se reemplaza por otro aminoácido natural de carácter similar con respecto a la polaridad, la funcionalidad de la cadena lateral, o el tamaño. Tales sustituciones conservativas son bien conocidas en la técnica. Las sustituciones englobadas por la invención también pueden ser “no conservativas”, en las que un resto de aminoácido que está presente en un péptido se sustituye por un aminoácido que tiene propiedades diferentes, tal como un aminoácido natural de un grupo diferente (por ejemplo, sustituyendo un aminoácido cargado o aminoácido hidrófobo por alanina), o alternativamente, en las que un aminoácido natural se sustituye por un aminoácido no convencional.
Adicional o alternativamente, se proporciona el ácido nucleico del aspecto 49, que comprende una secuencia nucleotídica que es 100% idéntica a una secuencia de HCDR3 en el listado de secuencias, excepto por 1,2, 3, 4, 5, 6 o 7 sustituciones nucleotídicas sinónimas, y ninguna, 1, 2 o 3 sustituciones nucleotídicas que produzcan cambios conservativos de aminoácidos en la secuencia de proteína correspondiente.
50. Un ácido nucleico que codifica la HCDR2 de un anticuerpo citado en uno cualquiera de los aspectos 1 a 45; en el que opcionalmente el ácido nucleico es según el aspecto 48 o 49.
51. El ácido nucleico del aspecto 50, que comprende una secuencia nucleotídica que es al menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% idéntica o es 100% idéntica a una secuencia de HCDR2 en el listado de secuencias.
En un aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un dominio VH de un anticuerpo anti-hOX40L, en el que la secuencia nucleotídica comprende una secuencia de HCDR2 que es al menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% idéntica o es 100% idéntica a una secuencia de HCDR2 en el listado de secuencias. Opcionalmente, el anticuerpo está de acuerdo con cualquier otro aspecto aquí.
En otra realización, se proporciona el ácido nucleico del aspecto 51, que comprende una secuencia nucleotídica que es 100% idéntica a una secuencia de HCDR2 en el listado de secuencias, excepto por 1, 2 o 3 sustituciones nucleotídicas, en la que cada sustitución no produce ningún cambio de aminoácido o produce un cambio de aminoácido conservativo (es decir, la sustitución de nucleótidos es una sustitución sinónima) en la secuencia de proteína correspondiente. El experto en la técnica estará familiarizado con los cambios conservativos de aminoácidos.
Adicional o alternativamente, se proporciona el ácido nucleico del aspecto 50, que comprende una secuencia nucleotídica que es 100% idéntica a una secuencia de HCDR2 en el listado de secuencias, excepto por 1,2, 3, 4, 5, 6 o 7 sustituciones de nucleótidos sinónimas, y ninguna, 1, 2 o 3 sustituciones de nucleótidos que produzcan cambios conservativos de aminoácidos en la secuencia de proteína correspondiente.
52. Un ácido nucleico que codifica la HCDR1 de un anticuerpo citado en uno cualquiera de los aspectos 1 a 45; en el que opcionalmente el ácido nucleico es según uno cualquiera de los aspectos 48 a 51.
53. El ácido nucleico del aspecto 52, que comprende una secuencia nucleotídica que es al menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% idéntica o es 100% idéntica a una secuencia de HCDR1 en el listado de secuencias.
En un aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un dominio VH de un anticuerpo anti-hOX40L, en el que la secuencia nucleotídica comprende una secuencia de HCDR1 que es al menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% idéntica o es 100% idéntica a una secuencia de HCDR1 en el listado de secuencias. Opcionalmente, el anticuerpo está de acuerdo con cualquier otro aspecto aquí.
En otra realización, se proporciona el ácido nucleico del aspecto 52, que comprende una secuencia nucleotídica que es 100% idéntica a una secuencia de HCDR1 en el listado de secuencias, excepto por 1, 2 o 3 sustituciones de nucleótidos, en la que cada sustitución no produce ningún cambio de aminoácido o produce un cambio de aminoácido conservativo (es decir, la sustitución de nucleótidos es una sustitución sinónima) en la secuencia de proteína correspondiente. El experto en la técnica estará familiarizado con los cambios conservativos de aminoácidos.
Adicional o alternativamente, se proporciona el ácido nucleico del aspecto 52, que comprende una secuencia nucleotídica que es 100% idéntica a una secuencia de HCDR1 en el listado de secuencias, excepto por 1,2, 3, 4, 5, 6 o 7 sustituciones de nucleótidos sinónimas, y ninguna, 1,2 o 3 sustituciones de nucleótidos que produzcan cambios conservativos de aminoácidos en la secuencia de proteína correspondiente.
54. Un ácido nucleico que codifica un dominio VH y/o un dominio VL de un anticuerpo mencionado en cualquiera de los aspectos 1 a 45.
55. El ácido nucleico del aspecto 54, que comprende una secuencia nucleotídica que es al menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% idéntica o es 100% idéntica a una secuencia de nucleotídica del dominio VH en el listado de secuencias.
En otra realización, se proporciona el ácido nucleico del aspecto 54, que comprende una secuencia nucleotídica que es 100% idéntica a una secuencia nucleotídica del dominio VH en el listado de secuencias, excepto por 1, 2 o 3 nucleótidos. sustituciones, en la que cada sustitución no produce ningún cambio de aminoácido o produce un cambio de aminoácido conservativo (es decir, la sustitución de nucleótidos es una sustitución sinónima) en la secuencia de proteína correspondiente. El experto en la técnica estará familiarizado con los cambios conservativos de aminoácidos.
Adicional o alternativamente, se proporciona el ácido nucleico del aspecto 54, que comprende una secuencia nucleotídica que es 100% idéntica a una secuencia nucleotídica del dominio VH en el listado de secuencias, excepto por 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 sustituciones de nucleótidos sinónimas, y ninguna, 1, 2 o 3 sustituciones de nucleótidos que produzcan cambios conservativos de aminoácidos en la secuencia de proteína correspondiente.
56. El ácido nucleico del aspecto 54 o 55, que comprende una secuencia nucleotídica que es al menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% idéntica o es 100% idéntica a una secuencia nucleotídica del dominio VL en el listado de secuencias.
En otra realización, se proporciona el ácido nucleico de los aspectos 54 o 55, que comprende una secuencia nucleotídica que es 100% idéntica a una secuencia nucleotídica del dominio VL en el listado de secuencias, excepto por 1, 2 o 3 sustituciones de nucleótidos, en la que cada sustitución no produce ningún cambio de aminoácido o produce un cambio de aminoácido conservativo (es decir, la sustitución de nucleótidos es una sustitución sinónima) en la secuencia de proteína correspondiente. El experto en la técnica estará familiarizado con los cambios conservativos de aminoácidos.
Adicional o alternativamente, se proporciona el ácido nucleico de los aspectos 54 o 55, que comprende una secuencia nucleotídica que es 100% idéntica a una secuencia nucleotídica del dominio VL en el listado de secuencias, excepto por 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 sustituciones de nucleótidos sinónimas, y ninguna, 1, 2 o 3 sustituciones de nucleótidos que produzcan cambios conservativos de aminoácidos en la secuencia de proteína correspondiente.
57. Un ácido nucleico que codifica una cadena pesada o una cadena ligera de un anticuerpo mencionado en uno cualquiera de los aspectos 1 a 45.
58. El ácido nucleico del aspecto 57, que comprende una secuencia nucleotídica como se indica en uno cualquiera de los aspectos 48 a 56.
59. Un vector (por ejemplo, un vector de expresión de mamífero) que comprende el ácido nucleico de uno cualquiera de los aspectos 48 a 58; en el que opcionalmente el vector es un vector CHO o HEK293. En un ejemplo, el vector es un vector de levadura, por ejemplo un vector de Saccharomyces o Pichia.
60. Un hospedante, que comprende el ácido nucleico de uno cualquiera de los aspectos 48 a 58, o el vector del aspecto 59. En un ejemplo, el hospedante es una línea celular de mamífero (por ejemplo, humana, por ejemplo, CHO o HEK293) o una línea celular de levadura o bacteriana.
61. Uso de un anticuerpo o un fragmento del mismo, que se une específicamente a hOX40L, en la fabricación de un medicamento para administrarlo a un ser humano, para tratar o prevenir una enfermedad o afección mediada por hOX40L en el ser humano al disminuir uno, más o todos de
a. la secreción de una citocina seleccionada de TNF alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-13, IL-17, RANTES e interferón gamma en el ser humano;
b. la proliferación de leucocitos del ser humano; y
c. la unión del receptor hOX40 expresado por células T humanas con hOX40L expresado en células endoteliales.
Las características de cualquiera de los aspectos, configuraciones, conceptos, ejemplos o realizaciones anteriores se aplican opcionalmente, mutatis mutandis, a este uso.
En un ejemplo, el ser humano padece o corre riesgo de asma, y el anticuerpo o fragmento es para disminuir la IgE en el ser humano, tratando, previniendo o reduciendo así el asma en el ser humano.
62. Un método para tratar o prevenir una enfermedad o afección mediada por hOX40L en un ser humano mediante la disminución de uno, más o todos de
a. la secreción de una citocina seleccionada de TNF alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-13, IL-17, RANTES e interferón gamma en el ser humano;
b. la proliferación de leucocitos del ser humano; y
c. la unión del receptor hOX40 expresado por células T humanas con hOX40L expresado en células endoteliales;
en el que el método comprende administrar a dicho ser humano una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o fragmento que se une específicamente a hOX40L.
Las características de cualquiera de los aspectos, ejemplos o realizaciones anteriores se aplican opcionalmente, mutatis mutandis, a este método.
El método de la invención trata o previene dicha enfermedad o afección en el ser humano. Una “cantidad terapéuticamente eficaz” del anticuerpo o fragmento es aquella cantidad (administrada en una o varias dosis, que pueden espaciarse en el tiempo, por ejemplo administración sustancialmente mensual) que es eficaz para lograr dicho tratamiento o prevención. Esto será fácilmente evidente para el experto en la técnica, y puede variar según el paciente humano particular y la enfermedad o afección que se trate.
En un ejemplo, el ser humano padece o corre el riesgo de padecer asma, y el anticuerpo o fragmento disminuye la IgE en el ser humano, tratando, previniendo o reduciendo así el asma en el ser humano.
63. El método o uso del aspecto 61 o 62, para tratar o prevenir dicha enfermedad, afección o daño de células epiteliales mediada por hOX40L en dicho ser humano al disminuir la proliferación de células T en dicho ser humano.
64. El método o uso de uno cualquiera de los aspectos 61 a 63, para tratar o prevenir dicha enfermedad, afección o daño de células epiteliales mediada por hOX40L en dicho ser humano al antagonizar la interacción entre hOX40L y los leucocitos del ser humano, en el que se reduce la proliferación de leucocitos.
65. El método o uso de uno cualquiera de los aspectos 61 a 64, para tratar o prevenir dicha enfermedad, afección o daño de células epiteliales mediada por hOX40L en dicho ser humano al disminuir la proliferación de leucocitos del ser humano antagonizando la interacción OX40L/receptor de OX40L mediada por células T en dicho ser humano.
66. El método o uso de uno cualquiera de los aspectos 61 a 65, para tratar o prevenir dicha enfermedad, afección o daño de células epiteliales mediada por hOX40L en dicho ser humano al disminuir la secreción de citocina IL-8 en el ser humano.
67. El método del aspecto 66, para tratar o prevenir dicha enfermedad, afección o daño de células epiteliales al disminuir la secreción de dicha IL-8 mediada por la interacción de células dendríticas (células DC) con células T en el ser humano.
68. El método o uso de uno cualquiera de los aspectos 61 a 67, en el que el daño a las células gastrointestinales, células del colon, células intestinales o células de las vías respiratorias (por ejemplo, pulmón) es un síntoma o causa de dicha enfermedad o afección en seres humanos.
En otra realización, las células epiteliales comprenden células seleccionadas del grupo que consiste en células gastrointestinales, células del colon, células intestinales, células oculares y células epiteliales de las vías respiratorias (por ejemplo, pulmón). En otra realización, las células epiteliales comprenden células seleccionadas del grupo que consiste en células gastrointestinales, células del colon, células intestinales y células oculares. En una realización adicional, las células epiteliales comprenden células oculares.
69. El método o uso de uno cualquiera de los aspectos 61 a 68, en el que el ser humano padece o está en riesgo de padecer una enfermedad inflamatoria intestinal (EII), rechazo de trasplantes alogénicos, enfermedad de injerto contra hospedante (EICH), diabetes, o inflamación de las vías respiratorias, y dicho método trata o previene la EII, el rechazo de trasplantes alogénicos, EICH, diabetes, o la inflamación de las vías respiratorias en seres humanos.
69a. El método o uso de uno cualquiera de los aspectos 61 a 68, en el que el ser humano padece o está en riesgo de padecer una enfermedad inflamatoria intestinal (EII), rechazo de trasplantes alogénicos, enfermedad de injerto contra hospedante (EICH), uveítis, pioderma gangrenoso, arteritis de células gigantes, síndrome de Schnitzler, escleritis no infecciosa, diabetes, o inflamación de las vías respiratorias, y dicho método trata o previene la EII, el rechazo de trasplantes alogénicos, la EICH, la uveítis, el pioderma gangrenoso, la arteritis de células gigantes, el síndrome de Schnitzler, la escleritis no infecciosa, la diabetes, o la inflamación de las vías respiratorias en el ser humano.
En cualquier aspecto, configuración, concepto o realización, el ser humano padece o está en riesgo de padecer una enfermedad o afección mediada por hOX40L seleccionada de una enfermedad o afección autoinmune, una enfermedad o afección inflamatoria sistémica o rechazo de trasplantes; por ejemplo, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, rechazo de trasplantes, rechazo de trasplantes alogénicos, enfermedad de injerto contra hospedante (EICH), colitis ulcerosa, lupus eritematoso sistémico (LES), diabetes, uveítis, espondilitis anquilosante, hipersensibilidad por contacto, esclerosis múltiple, y aterosclerosis, en particular EICH.
70. El método o uso de uno cualquiera de los aspectos 61 a 69a, en el que el anticuerpo o fragmento está según cualquiera de los aspectos 1 a 45, o cualquier ejemplo, configuración, concepto, aspecto o realización descritos aquí.
71. El anticuerpo, fragmento, composición, kit, método o uso de cualquier aspecto anterior, para tratar o prevenir una enfermedad o afección inflamatoria o autoinmune en un ser humano, o para reducir o prevenir la angiogénesis en un ser humano.
72. El anticuerpo, fragmento, composición, kit, método o uso de cualquier aspecto anterior, en el que la enfermedad o afección se selecciona del grupo que consiste en enfermedad inflamatoria intestinal (EII), enfermedad de Chrohn, artritis reumatoide, psoriasis, bronquiolitis, gingivitis, rechazo de trasplantes, rechazo de trasplantes alogénicos, enfermedad de injerto contra hospedante (EICH), asma, síndrome disneico del adulto (SDRA), choque séptico, colitis ulcerosa, síndrome de Sjorgen, inflamación de las vías respiratorias, lupus eritematoso sistémico (LES), diabetes, hipersensibilidad por contacto, esclerosis múltiple, y aterosclerosis.
72a. El anticuerpo, fragmento, composición, kit, método o uso de cualquier aspecto anterior, en el que la enfermedad o afección se selecciona del grupo que consiste en enfermedad inflamatoria intestinal (EII), enfermedad de Chrohn, artritis reumatoide, psoriasis, bronquiolitis, gingivitis, rechazo de trasplantes, rechazo de trasplantes alogénicos, enfermedad de injerto contra hospedante (EICH), asma, síndrome disneico del adulto (SDRA), choque séptico, colitis ulcerosa, síndrome de Sjorgen, inflamación de las vías respiratorias, lupus eritematoso sistémico (LES), uveítis, pioderma gangrenoso, arteritis de células gigantes, síndrome de Schnitzler, escleritis no infecciosa, diabetes, hipersensibilidad de contacto, esclerosis múltiple, y aterosclerosis.
En cualquier aspecto, configuración, concepto o realización, el ser humano padece o está en riesgo de padecer una enfermedad o afección mediada por hOX40L seleccionada de una enfermedad o afección autoinmune, una enfermedad o afección inflamatoria sistémica o rechazo de trasplantes; por ejemplo, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, rechazo de trasplantes, rechazo de trasplantes alogénicos, enfermedad de injerto contra hospedante (EICH), colitis ulcerosa, lupus eritematoso sistémico (LES), diabetes, uveítis, espondilitis anquilosante, hipersensibilidad por contacto, esclerosis múltiple, y aterosclerosis, en particular EICH.
En un ejemplo, la enfermedad o afección es una enfermedad o afección mediada por OX40L descrita en los documentos US7812133 o EP1791869.
En un ejemplo, la enfermedad o afección es una enfermedad o afección inflamatoria o autoinmune. En un ejemplo, la enfermedad o afección es el rechazo de trasplante.
Como se usa aquí, enfermedad o afección inflamatoria se refiere a estados patológicos que dan como resultado inflamación, por ejemplo causada por quimiotaxis de neutrófilos. Los ejemplos de dichos trastornos incluyen enfermedades inflamatorias de la piel, incluyendo la psoriasis; respuestas asociadas con la enfermedad inflamatoria del intestino (tal como la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa); reperfusión isquémica; síndrome disneico del adulto; dermatitis; meningitis; encefalitis; uveítis; enfermedades autoinmunes, tales como artritis reumatoide, síndrome de Sjorgen, vasculitis; enfermedades que implican diapédesis de leucocitos; trastorno inflamatorio del sistema nervioso central (SNC), síndrome de lesión de múltiples órganos como consecuencia de septicemia o traumatismo; hepatitis alcohólica, neumonía bacteriana, enfermedades mediadas por complejos antígeno-anticuerpo; inflamaciones del pulmón, incluyendo pleuresía, alveolitis, vasculitis, neumonía, bronquitis crónica, bronquiectasias y fibrosis quística; etc. Las indicaciones preferidas son la neumonía bacteriana y la enfermedad inflamatoria intestinal, tal como la colitis ulcerosa. La invención se proporciona, por lo tanto, en un ejemplo, para tratar o prevenir una cualquiera o más de dichas afecciones.
En un ejemplo, la enfermedad o afección es cáncer.
En un ejemplo, la enfermedad es uveítis, tal como uveítis sistémica o uveítis autoinmune/no infecciosa.
73. Un anticuerpo o un fragmento del mismo, que se une específicamente a hOX40L y compite por la unión a dicho hOX40L con el anticuerpo 02D10, en el que el anticuerpo o fragmento comprende un dominio VH que comprende una HCDR3 que comprende el motivo VRGXYYY, en el que X es cualquier aminoácido.
Las características de los anticuerpos de cualquiera de los aspectos, configuraciones, conceptos, ejemplos o realizaciones descritos aquí se aplican opcionalmente, mutatis mutandis, a estos anticuerpos, por ejemplo el anticuerpo puede ser un anticuerpo humano o un anticuerpo quimérico que tenga características funcionales como se describe aquí. La competición se puede determinar como se describe en cualquier aspecto, realización, ejemplo, concepto o configuración descritos aquí, por ejemplo según lo determinado por SPR, ELISA, HTRF o FACS.
En una realización, el anticuerpo o fragmento compite con las regiones variables de 02D10 (por ejemplo, compite con un anticuerpo que comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID No: 34 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID No: 48). En otra realización, el anticuerpo o fragmento compite con IgG4-PE de 02D10 que tiene una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID No:62 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID No:64.
En otra realización, el anticuerpo o fragmento compite adicional o alternativamente con 10A7. En una realización, el anticuerpo o fragmento compite con las regiones variables de 10A7 (por ejemplo, compite con un anticuerpo que comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID No: 2 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID No: 16). En otra realización, el anticuerpo o fragmento compite con IgG4-PE de 02D10 que tiene una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID No:30 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID No:32.
En una realización, el aminoácido es cualquier aminoácido natural.
74. El anticuerpo o fragmento según el aspecto 73, en el que X es un aminoácido neutro, opcionalmente P o G.
En una realización, X es P o G. En una realización, X se selecciona de P, N, A o G. En otra realización, X se selecciona de P, G o N. En otra realización, X se selecciona de P, G o A.
75. Un anticuerpo o un fragmento del mismo, opcionalmente según el aspecto 73 o 74, que se une específicamente a hOX40L y compite por la unión a dicho hOX40L con el anticuerpo 02D10, en el que el anticuerpo o fragmento comprende un dominio VH que comprende la secuencia de HCDR3 de SEQ ID NO: 40 o 46 o la secuencia de HCDR3 de SEQ ID NO: 40 o 46 que comprende menos de 5 sustituciones de aminoácidos.
Las características de los anticuerpos de cualquiera de los aspectos, configuraciones, conceptos, ejemplos o realizaciones descritos aquí se aplican opcionalmente, mutatis mutandis, a estos anticuerpos, por ejemplo el anticuerpo puede ser un anticuerpo humano o un anticuerpo quimérico que tenga características funcionales como se describe aquí. La competición se puede determinar como se describe en cualquier aspecto, realización, concepto, ejemplo o configuración descritos aquí, por ejemplo según lo determinado por SPR, ELISA, HTRF o FACS.
En una realización, la secuencia de HCDR3 de SEQ ID NO: 40 o 46 comprende menos de 4 sustituciones de aminoácidos (es decir, 3 o menos). En una realización, la secuencia de HCDR3 de SEQ ID NO: 40 o 46 comprende menos de 3 sustituciones de aminoácidos (es decir, 2 o 1 sustituciones). En una realización, la secuencia de HCDR3 de SEQ ID NO: 40 o 46 comprende menos de 2 sustituciones de aminoácidos (es decir, una sustitución).
En una realización, el anticuerpo o fragmento compite con las regiones variables de 02D10 (por ejemplo, compite con un anticuerpo que comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID No: 34 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID No: 48). En otra realización, el anticuerpo o fragmento compite con IgG4-PE de 02D10 que tiene una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID No:62 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID No:64.
En otra realización, el anticuerpo o fragmento compite adicional o alternativamente con 10A7. En una realización, el anticuerpo o fragmento compite con las regiones variables de 10A7 (por ejemplo, compite con un anticuerpo que comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID No: 2 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID No: 16). En otra realización, el anticuerpo o fragmento compite con IgG4-PE de 02D10 que tiene una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID No:30 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID No:32.
76. Un anticuerpo o fragmento según uno cualquiera de los aspectos 73 a 75, comprendiendo el dominio VH una HCDR3 de 16 a 27 aminoácidos y que deriva de la recombinación de un segmento del gen VH humano, un segmento génico D humano y un segmento génico JH humano, en el que el segmento génico JH humano es IGHJ6 (por ejemplo, IGHJ6*02).
En una realización, el segmento del gen JH humano se selecciona de IGHJ6*01, IGHJ6*02, IGHJ6*03 y IGHJ6*04. En otra realización, el segmento del gen JH humano se selecciona de IGHJ6*01, IGHJ6*02 y IGHJ6*04. En otra realización, el segmento del gen JH es IGHJ6*02.
En una realización adicional, el segmento del gen VH humano es IGHV3-23, por ejemplo seleccionado de IGHV3-23* 01, IGHV3-23*02, IGHV3-23*03, IGHV3-23*04 o IGHV3-23*05. En otra realización, el segmento del gen VH humano es IGHV3-23*01 o IGHV3-23*04, en particular IGHV3-23*04.
En una realización adicional, el segmento del gen DH humano es IGHD3-10, por ejemplo seleccionado de IGHD3-10 *01 o IGHD3-10*02. En una realización, el segmento del gen DH humano es IGHD3-10*01. En una realización, el segmento del gen DH humano es IGHD3-10*02.
77. El anticuerpo o fragmento según uno cualquiera de los aspectos 73 a 76, comprendiendo el dominio VH la secuencia de HCDR1 de SEQ ID NO: 36 o 42, o comprendiendo la secuencia de HCDR1 de SEQ ID NO: 36 o 42 menos de 4 sustituciones de aminoácidos.
En una realización, la secuencia de HCDR1 de SEQ ID NO: 36 o 42 comprende menos de 3 sustituciones de aminoácidos (es decir, 2 o 1 sustituciones). En una realización, la secuencia de HCDR1 de SEQ ID NO: 36 o 42 comprende menos de 2 sustituciones de aminoácidos (es decir, una sustitución).
78. El anticuerpo o fragmento según uno cualquiera de los aspectos 73 a 77, comprendiendo el dominio VH la secuencia de HCDR2 de SEQ ID NO: 38 o 44, o comprendiendo la secuencia de HCDR2 de SEQ ID NO: 38 o 44 menos de 5 sustituciones de aminoácidos.
En una realización, la secuencia de HCDR2 de SEQ ID NO: 38 o 44 comprende menos de 4 sustituciones de aminoácidos (es decir, 3 o menos). En una realización, la secuencia de HCDR2 de SEQ ID NO: 38 o 44 comprende menos de 3 sustituciones de aminoácidos (es decir, 2 o 1 sustituciones). En una realización, la secuencia de HCDR2 de SEQ ID NO: 38 o 44 comprende menos de 2 sustituciones de aminoácidos (es decir, una sustitución).
79. El anticuerpo o fragmento según con uno cualquiera de los aspectos 73 a 78, comprendiendo el dominio VH una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, o una secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada que es al menos 80% (por ejemplo, al menos 85%) idéntica a SEQ ID NO:34.
En una realización, la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada es al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% idéntica a SEQ ID NO:34.
80. El anticuerpo o fragmento según uno cualquiera de los aspectos 73 a 79, que comprende la primera y la segunda copias de dicho dominio VH.
81. El anticuerpo o fragmento según uno cualquiera de los aspectos 73 a 80, que comprende un dominio VL que comprende la secuencia de LCDR1 de SEQ ID NO: 54 o 60, o la secuencia LCRD3 de SEQ ID NO: 54 o 60 que comprende menos de 5 sustituciones de aminoácidos.
En una realización, la secuencia de LCRD3 de SEQ ID NO: 54 o 60 comprende menos de 4 sustituciones de aminoácidos (es decir, 3 o menos). En una realización, la secuencia de LCRD3 de SEQ ID NO: 54 o 60 comprende menos de 3 sustituciones de aminoácidos (es decir, 2 o 1 sustituciones). En una realización, la secuencia de LCRD3 de SEQ ID NO: 54 o 60 comprende menos de 2 sustituciones de aminoácidos (es decir, una sustitución).
82. El anticuerpo o fragmento según uno cualquiera de los aspectos 73 a 81, que comprende un o dicho dominio VL, dominio VL el cual comprende la secuencia de LCDR2 de SeQ ID NO: 52 o 58, o la secuencia LCRD2 de SEQ ID NO: 52 o 58 que comprende menos de 2 sustituciones de aminoácidos.
83. El anticuerpo o fragmento según uno cualquiera de los aspectos 73 a 82, que comprende un o dicho dominio VL, dominio VL el cual comprende la secuencia de LCDR1 de SeQ ID NO: 54 o 60, o la secuencia LCRD1 de SEQ ID NO: 54 o 60 que comprende menos de 4 sustituciones de aminoácidos.
En una realización, la secuencia de LCDR1 de SEQ ID NO: 54 o 60 comprende menos de 3 sustituciones de aminoácidos (es decir, 2 o 1 sustituciones). En una realización, la secuencia de LCDR1 de SEQ ID NO: 54 o 60 comprende menos de 2 sustituciones de aminoácidos (es decir, una sustitución).
84. El anticuerpo o fragmento según uno cualquiera de los aspectos 73 a 83, que comprende un o dicho dominio VL, dominio VL el cual comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, o una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera que es al menos un 80% (por ejemplo, al menos un 85%) idéntica a la SEQ ID NO:48.
En una realización, la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera es al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% idéntica a SEQ ID NO:48.
85. El anticuerpo o fragmento según uno cualquiera de los aspectos 81 a 84, que comprende la primera y la segunda copias de dicho dominio VL.
86. El anticuerpo o fragmento según uno cualquiera de los aspectos 81 a 85, en el que el anticuerpo o fragmento comprende una cadena ligera kappa.
En otra realización, el dominio VL es un dominio VL kappa. En una realización, el dominio VL kappa deriva de la recombinación de un segmento del gen VL humano y un segmento del gen JL humano, en el que el segmento del gen VL humano es IGKV1D-39. En otra realización, el segmento del gen VL es IGKV1 D-39*01.
En una realización adicional, el segmento del gen JL humano es IGKJ1 o IGKJ3. En otra realización, el segmento del gen JL es IG KJ1 *01. En otra realización, el segmento del gen JL es IGKJ3*01.
87. El anticuerpo o fragmento según uno cualquiera de los aspectos 75 a 86, en el que las sustituciones de aminoácidos son sustituciones de aminoácidos conservativas, opcionalmente en el que las sustituciones conservativas son de uno de seis grupos (conteniendo cada grupo aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí) seleccionados de:
1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T);
2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E);
3) Asparagina (N), Glutamina (Q);
4) Arginina (R), Lisina (K);
5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); y
6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W)
En una realización, las sustituciones conservativas de aminoácidos son como se describe aquí. Por ejemplo, la sustitución puede ser Y por F, T por S o K, P por A, E por D o Q, N por D o G, R por K, G por N o A, T por S o K, D por N o E, I por L o V, F por Y, S por T o A, R por K, G por N o A, K por R, A por S, K o P. En otra realización, las sustituciones de aminoácidos conservativas pueden ser aquellas en las que Y se sustituye por F, T por A o S, I por L o V, W por Y, M por L, N por D, G por A, T por A o S, D por N, I por L o V, F por Y o L, S por A o T y A por S, G, T o V.
88. El anticuerpo o fragmento según uno cualquiera de los aspectos 73 a 87, en el que el anticuerpo o fragmento comprende una región constante, por ejemplo una región constante de IgG4, en el que opcionalmente la región constante es IgG4-PE (Seq ID No: 128).
En otro ejemplo de cualquier aspecto aquí, el fragmento de anticuerpo comprende una región constante gamma 4 humana. En otra realización, la región constante de la cadena pesada no se une a los receptores Fc-y, y por ejemplo comprende una mutación Leu235Glu (es decir, en la que el resto de leucina de tipo salvaje está mutado a un resto de ácido glutámico). En otra realización, la región constante de la cadena pesada comprende una mutación Ser228Pro para aumentar la estabilidad.
89. El anticuerpo según uno cualquiera de los aspectos 73 a 88, en el que el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, consistiendo la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada en la secuencia de SEQ ID No: 62, y consistiendo la secuencia de aminoácidos de cadena ligera en la secuencia de SEQ ID No:64.
90. Un anticuerpo o fragmento como se define en uno cualquiera de los aspectos 73 a 89, 98, 99, 101 o 102, para uso para tratar o prevenir una enfermedad o afección mediada por hOX40L seleccionada de una enfermedad o afección autoinmune, una enfermedad o afección inflamatoria sistémica o rechazo de trasplantes; por ejemplo, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, rechazo de trasplantes, rechazo de trasplantes alogénicos, enfermedad de injerto contra hospedante (EICH), colitis ulcerosa, lupus eritematoso sistémico (LES), diabetes, uveítis, espondilitis anquilosante, hipersensibilidad por contacto, esclerosis múltiple, o aterosclerosis, en particular EICH.
Las características de los anticuerpos, y la enfermedad mediada por hOX40L de cualquiera de los aspectos, configuraciones, conceptos, ejemplos o realizaciones como se describen aquí se aplican opcionalmente, mutatis mutandis, a este uso. Cualquiera de las composiciones, programas de dosificación o modos de administración descritos en cualquier aspecto, configuración, concepto, ejemplo o realización aquí se aplican opcionalmente, mutatis mutandis, a este uso.
91. Uso de un anticuerpo o fragmento como se define en uno cualquiera de los aspectos 73 a 89, 98, 99, 101 o 102, en la fabricación de un medicamento para administrar a un ser humano para tratar o prevenir una enfermedad o afección mediada por hOX40L en el ser humano, seleccionada de una enfermedad o afección autoinmune, una enfermedad o afección inflamatoria sistémica, o rechazo de trasplante/hospedante; por ejemplo, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, rechazo de trasplantes, rechazo de trasplantes alogénicos, enfermedad de injerto contra hospedante (EICH), colitis ulcerosa, lupus eritematoso sistémico (LES), diabetes, uveítis, espondilitis anquilosante, hipersensibilidad por contacto, esclerosis múltiple, o aterosclerosis, en particular EICH.
Las características de los anticuerpos, y la enfermedad mediada por hOX40L de cualquiera de los aspectos, configuraciones, conceptos, ejemplos o realizaciones como se describen aquí se aplican opcionalmente, mutatis mutandis, a este uso. Cualquiera de las composiciones, programas de dosificación o modos de administración descritos en cualquier aspecto, configuración, concepto, ejemplo o realización aquí se aplican opcionalmente, mutatis mutandis, a este uso.
92. Un método para tratar o prevenir una enfermedad o afección mediada por hOX40L seleccionada de una enfermedad o afección autoinmune, una enfermedad o afección inflamatoria sistémica, o rechazo de trasplantes; por ejemplo, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, rechazo de trasplantes, rechazo de trasplantes alogénicos, enfermedad de injerto contra hospedante (EICH), colitis ulcerosa, lupus eritematoso sistémico (LES), diabetes, uveítis, espondilitis anquilosante, hipersensibilidad por contacto, esclerosis múltiple, o aterosclerosis, en particular EICH, en un ser humano, que comprende administrar a dicho ser humano una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o fragmento como se define en uno cualquiera de los aspectos 73 a 89, 98, 99, 101 o 102, en el que la enfermedad o afección mediada por hOX40L se trata o previene de ese modo.
Las características de los anticuerpos, y la enfermedad mediada por hOX40L de cualquiera de los aspectos, configuraciones, conceptos, ejemplos o realizaciones como se describen aquí se aplican opcionalmente, mutatis mutandis, a este método. Cualquiera de las composiciones, programas de dosificación o modos de administración descritos en cualquier aspecto, configuración, concpeot, ejemplo o realización aquí se aplican opcionalmente, mutatis mutandis, a este método.
93. El anticuerpo o fragmento según el aspecto 90, el uso según el aspecto 91, o el método según el aspecto 92, en el que la enfermedad o afección mediada por hOX40L es EICH.
En otra realización, el anticuerpo o fragmento es capaz de tratar o prevenir la EICH.
94. El anticuerpo o fragmento, el uso o el método según cualquiera de los aspectos 90 a 93, en el que el anticuerpo se administra profilácticamente.
En una realización, la profilaxis previene la aparición de la enfermedad o afección o de los síntomas de la enfermedad o afección. En una realización, el tratamiento profiláctico evita el empeoramiento o la aparición de la enfermedad o afección. En una realización, el tratamiento profiláctico previene el empeoramiento de la enfermedad o afección.
En otra realización, dicho anticuerpo se administra por vía intravenosa. En otra realización, dicho anticuerpo se administra a una dosis de alrededor de 5-10 mg/kg (por ejemplo, alrededor de 8 mg/kg). En otra realización, dicho anticuerpo se administra a una dosis seleccionada de alrededor de 0,1 mg/kg, alrededor de 0,5 mg/kg, alrededor de 1 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, alrededor de 10 mg/kg, alrededor de 15 mg/kg, alrededor de 20 mg/kg, alrededor de 25 mg/kg, alrededor de 30 mg/kg, alrededor de 40 mg/kg, alrededor de 50 mg/kg, alrededor de 60 mg/kg, alrededor de 70 mg/kg, alrededor de 80 mg/kg, alrededor de 90 mg/kg, o alrededor de 100 mg/kg, en particular alrededor de 1 mg/kg, o alrededor de 3 mg/kg.
En otra realización, dicho anticuerpo se administra 1-4 días antes del trasplante, por ejemplo 1-3 días antes del trasplante, o 1-2 días antes del trasplante. En otra realización, dicho anticuerpo se administra semanal, quincenal o mensualmente después del trasplante, por ejemplo quincenal. En una realización adicional, dicho anticuerpo se administra profilácticamente por vía intravenosa 1-3 días antes del trasplante a una dosis de alrededor de 5-10 mg/kg (por ejemplo, alrededor de 8 mg/kg), y luego por vía intravenosa, cada dos semanas, a una dosis de alrededor de 5­ 10 mg/kg (por ejemplo, alrededor de 8 mg/kg).
En otra realización, el paciente es monitorizado periódicamente después del trasplante, para detectar la presencia de un biomarcador predictivo para el desarrollo de EICH (por ejemplo, EICH aguda), y el anticuerpo anti-OX40L de la invención se administra una vez que los niveles de biomarcadores son tales que se determina que el paciente tiene riesgo de desarrollar EICH (por ejemplo, EICH aguda). Esta estrategia evitaría la dosificación innecesaria del fármaco y la supresión innecesaria del sistema inmunitario. Los ejemplos de biomarcadores que pueden ser útiles como biomarcadores predictivos de la EICH aguda pueden ser los identificados en Levine et al., “A prognostic score for acute graft-versus-host disease based on biomarkers: a multicentre study”, Lancet Haematol 2015; 2:e21-29. Estos biomarcadores incluyen, entre otros, TNFR1, ST-2, elafina, e IL2Ra y Reg3a.
95. Un anticuerpo humano o fragmento del mismo que comprende una HCDR3 de 16 a 27 aminoácidos, y derivado de la recombinación de un segmento del gen VH humano, un segmento del gen D humano y un segmento del gen JH humano, en el que el segmento del gen JH humano es IGHJ6 (por ejemplo IGHJ6*02), que se une específicamente a hOX40L, para tratar o prevenir una enfermedad o afección mediada por hOX40L, seleccionada de una enfermedad o afección autoinmune, una enfermedad o afección inflamatoria sistémica, o rechazo de trasplantes; por ejemplo, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, rechazo de trasplantes, rechazo de trasplantes alogénicos, enfermedad de injerto contra hospedante (EICH), colitis ulcerosa, lupus eritematoso sistémico (LES), diabetes, uveítis, espondilitis anquilosante, hipersensibilidad por contacto, esclerosis múltiple, o aterosclerosis, en particular EICH (por ejemplo, en el que el anticuerpo es para la prevención de EICH).
Las características de los anticuerpos, y la enfermedad mediada por hOX40L de cualquiera de los aspectos, configuraciones, conceptos, ejemplos o realizaciones se aplican opcionalmente, mutatis mutandis, a este uso. Cualquiera de las composiciones, programas de dosificación o modos de administración descritos en cualquier aspecto, configuración, concepto, ejemplo o realización aquí se aplican opcionalmente, mutatis mutandis, a este uso.
96. Uso de un anticuerpo humano o fragmento del mismo que comprende una HCDR3 de 16 a 27 aminoácidos, y derivado de la recombinación de un segmento del gen VH humano, un segmento del gen D humano y un segmento del gen JH humano, en el que el segmento del gen JH humano es IGHJ6 (por ejemplo, IGHJ6*02), que se une específicamente a hOX40L, en la fabricación de un medicamento para administrar a un ser humano, para tratar o prevenir una enfermedad o afección mediada por hOX40L en el ser humano, seleccionada de una enfermedad o afección autoinmune, una enfermedad o afección inflamatoria sistémica, o rechazo de trasplantes; por ejemplo, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, rechazo de trasplantes, rechazo de trasplantes alogénicos, enfermedad de injerto contra hospedante (EICH), colitis ulcerosa, lupus eritematoso sistémico (LES), diabetes, uveítis, espondilitis anquilosante, hipersensibilidad por contacto, esclerosis múltiple, o aterosclerosis, en particular EICH.
Las características de los anticuerpos, y la enfermedad mediada por hOX40L de cualquiera de los aspectos, configuraciones, conceptos, ejemplos o realizaciones se aplican opcionalmente, mutatis mutandis, a este uso. Cualquiera de las composiciones, programas de dosificación o modos de administración descritos en cualquier aspecto, configuración, concepto, ejemplo o realización aquí se aplican opcionalmente, mutatis mutandis, a este uso.
97. Un método para tratar o prevenir una enfermedad o afección mediada por hOX40L seleccionada de una enfermedad o afección autoinmune, una enfermedad o afección inflamatoria sistémica, o rechazo de trasplantes; por ejemplo, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, rechazo de trasplantes, rechazo de trasplantes alogénicos, enfermedad de injerto contra hospedante (EICH), colitis ulcerosa, lupus eritematoso sistémico (LES), diabetes, uveítis, espondilitis anquilosante, hipersensibilidad por contacto, esclerosis múltiple, o aterosclerosis, en particular EICH, en un ser humano, que comprende administrar a dicho ser humano una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo humano o fragmento del mismo que comprende una HCDR3 de 16 a 27 aminoácidos y derivado de la recombinación de un segmento del gen VH humano, un segmento del gen D humano y un segmento del gen JH humano, en el que el segmento del gen JH humano es IGHJ6 (por ejemplo, IGHJ6 *02), que se une específicamente a hOX40L, en el que la enfermedad o afección mediada por hOX40L se trata o previene de este modo.
Las características de los anticuerpos, y la enfermedad mediada por hOX40L de cualquiera de los aspectos, configuraciones, conceptos, ejemplos o realizaciones se aplican opcionalmente, mutatis mutandis, a este método. Cualquiera de las composiciones, programas de dosificación o modos de administración descritos en cualquier aspecto, configuración, concepto, ejemplo o realización aquí se aplican opcionalmente, mutatis mutandis, a este método.
En una realización de uno cualquiera de los aspectos 95 a 97, el segmento del gen JH humano se selecciona de IGHJ6*01, IGHJ6*02, IGHJ6*03 y IGHJ6*04. En otra realización de uno cualquiera de los aspectos 95 a 97, el segmento del gen JH humano se selecciona de IGHJ6*01, IGHJ6*02 y IGHJ6*04. En otra realización de uno cualquiera de los aspectos 95 a 97, el segmento del gen JH es IGHJ6*02.
En una realización adicional de uno cualquiera de los aspectos 95 a 97, el segmento del gen VH humano es IGHV3-23, por ejemplo seleccionado de IGHV3-23*01, IGHV3-23*02, IGHV3-23*03, IGHV3-23*04 o IGHV3-23*05. En otra realización de uno cualquiera de los aspectos 95 a 97, el segmento del gen VH humano es IGHV3-23*01 o IGHV3-23 *04, en particular IGHV3-23*04.
En una realización adicional de uno cualquiera de los aspectos 95 a 97, el segmento del gen DH humano es IGHD3-10, por ejemplo seleccionado de IGHD3-10*01 o IGHD3-10*02. En una realización de uno cualquiera de los aspectos 95 a 97, el segmento del gen DH humano es IGHD3-10*01. En una realización de uno cualquiera de los aspectos 95 a 97, el segmento del gen DH humano es IGHD3-10*02.
En una realización de uno cualquiera de los aspectos 90 a 97, el anticuerpo es capaz de tratar o prevenir la EICH. En otra realización de uno cualquiera de los aspectos 90 a 97, el anticuerpo o fragmento se usa para el tratamiento o prevención de una enfermedad distinta de EICH, pero el anticuerpo o fragmento es capaz de tratar o prevenir EICH.
98. El anticuerpo o fragmento según el aspecto 86, o el anticuerpo o fragmento según el aspecto 95, el uso según el aspecto 96, o el método según el aspecto 97, en el que el anticuerpo o fragmento comprende una cadena ligera kappa, por ejemplo en el que el dominio VL de la cadena ligera deriva de la recombinación de un segmento del gen VL humano y un segmento del gen JL humano, en el que el segmento del gen VL humano es IGKV1D-39 (por ejemplo, IGKV1D-39*01), y opcionalmente el segmento del gen JL humano es IGKJ1 (por ejemplo, IGKJ1 *01) o IGKJ3 (por ejemplo, IGKJ3*01).
En otra realización, el dominio VL es un dominio VL kappa. En una realización, el dominio VL kappa deriva de la recombinación de un segmento del gen VL humano y un segmento del gen JL humano, en el que el segmento del gen VL humano es IGKV1 D-39. En otra realización, el segmento del gen VL es IGKV1 D-39*01.
En otra realización, el segmento del gen JL humano es IGKJ1. En otra realización, el segmento del gen JL es IGKJ1* 01. En otra realización, el segmento del gen JL humano es IGKJ3. En otra realización, el segmento del gen JL es IGKJ3*01
99. El anticuerpo o fragmento según uno cualquiera de los aspectos 73 a 89, 98, 101 o 102, o el uso o método del anticuerpo o fragmento según uno cualquiera de los aspectos 90 a 98, en el que el anticuerpo o fragmento permite más de 80% de quimerismo de donante de células madre para el día 12 en un modelo de macaco Rhesus de trasplante de células madre hematopoyéticas haploidénticas, opcionalmente en el que el anticuerpo es para la prevención de la EICH.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo o fragmento, uso o método según uno cualquiera de los aspectos 95 a 98, en el que el anticuerpo o fragmento es para tratar o prevenir el rechazo de trasplantes (por ejemplo, EICH) en un ser humano al permitir más de 80% de quimerismo de donante de células madre para el día 12 en dicho ser humano después del trasplante de células madre hematopoyéticas humanas del donante.
En otro realización, se proporciona un anticuerpo o fragmento según uno cualquiera de los aspectos 73 a 89, 98, 101 o 102, en el que el anticuerpo o fragmento permite más de 80% de quimerismo de donante de células madre para el día 12 en un modelo de macaco Rhesus de trasplante de células madre hematopoyéticas haploidénticas.
En una realización, el quimerismo es quimerismo de células T (CD3+/CD20-). En otra realización, el quimerismo es quimerismo de sangre periférica. En otra realización, el quimerismo es quimerismo de sangre periférica o de células T (CD3+/CD20-).
En una realización, el quimerismo de donante de células madre (por ejemplo, quimerismo de sangre periférica o de células T (CD3+/CD20-)) se determina usando marcadores de microsatélites ligados al MHC específicos del donante y del receptor divergentes, comparando las alturas de los picos de los amplicones específicos del donante y del receptor. En otra realización, el quimerismo de donante de células madre se determina como se describe en Kean, LS, et al., “Induction of chimerism in rhesus macaques through stem cell transplant and costimulation blockade-based immunosuppression”, Am J Transplant. 2007 febrero;7(2):320-35. En otra realización, el quimerismo de donante de células madre se determina como se describe en el Ejemplo 7.
En una realización, el modelo de macaco Rhesus de trasplante de células madre hematopoyéticas haploidénticas (HSCT) es realizado por los animales receptores, que se someten a un procedimiento de acondicionamiento junto con la administración de anticuerpos anti-OX40L, seguido de la infusión de un producto de sangre periférica aislado de un animal donante medio hermano, después de lo cual los animales continúan recibiendo dosis semanales del anticuerpo anti-OX40L de la invención, y se toman muestras de sangre y se analizan en busca de quimerismo.
En otra realización, en el modelo de HSCT, los animales receptores reciben una dosis de radiación acondicionadora de 1020 cGy en 4 fracciones de dosis durante 2 días (Día -2 y Día -1 experimentales) para abolir el sistema hematopoyético del hospedante antes de la administración intravenosa de un anticuerpo anti-OX40L de la invención (Día -2, con dosis intravenosas posteriores en los Días 5, 12, 19, 26, 33, 40, 47) y trasplante de sangre periférica enriquecida con glóbulos blancos y células madre procedente de un animal donante con MHC medio emparejado (medio hermano) para reconstituir el sistema inmunitario del receptor, junto con la provisión de cuidados de apoyo continuos, toma de muestras de sangre y monitorización de signos de EICH.
En una realización, el anticuerpo o fragmento, uso o método es para la prevención de EICH.
En una realización, el anticuerpo anti-hOX40L de la invención se administra de manera profiláctica. En una realización, el tratamiento profiláctico evita el empeoramiento o la aparición de la enfermedad o afección.
En otra realización, dicho anticuerpo se administra por vía intravenosa. En otra realización, dicho anticuerpo se administra a una dosis de alrededor de 5-10 mg/kg (por ejemplo, alrededor de 8 mg/kg). En otra realización, dicho anticuerpo se administra por vía intravenosa. En otra realización, dicho anticuerpo se administra a una dosis de alrededor de 5-10 mg/kg (por ejemplo, alrededor de 8 mg/kg). En otra realización, dicho anticuerpo se administra a una dosis seleccionada de alrededor de 0,1 mg/kg, alrededor de 0,5 mg/kg, alrededor de 1 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, alrededor de 10 mg/kg, alrededor de 15 mg/kg, alrededor de 20 mg/kg, alrededor de 25 mg/kg, alrededor de 30 mg/kg, alrededor de 40 mg/kg, alrededor de 50 mg/kg, alrededor de 60 mg/kg, alrededor de 70 mg/kg, alrededor de 80 mg/kg, alrededor de 90 mg/kg, o alrededor de 100 mg/kg, en particular alrededor de 1 mg/kg, o alrededor de 3 mg/kg.
En otra realización, dicho anticuerpo se administra 1-4 días antes del trasplante, por ejemplo 1-3 días antes del trasplante, o 1-2 días antes del trasplante. En otra realización, dicho anticuerpo se administra semanal, quincenal o mensualmente después del trasplante, por ejemplo quincenalmente. En una realización adicional, dicho anticuerpo se administra profilácticamente por vía intravenosa 1-3 días antes del trasplante, a una dosis de alrededor de 5-10 mg/kg (por ejemplo, alrededor de 8 mg/kg), y después por vía intravenosa, cada dos semanas, a una dosis de alrededor de 5-10 mg/kg (por ejemplo, alrededor de 8 mg/kg).
En otra realización, el paciente es monitorizado periódicamente después del trasplante, para detectar la presencia de un biomarcador predictivo para el desarrollo de EICH (por ejemplo, EICH aguda), y el anticuerpo anti-OX40L de la invención se administra una vez que los niveles de biomarcadores son tales que se determina que el paciente tiene riesgo de desarrollar EICH (por ejemplo, EICH aguda). Esta estrategia evitaría la dosificación innecesaria del fármaco y la supresión innecesaria del sistema inmunitario. Los ejemplos de biomarcadores que pueden ser útiles como biomarcadores predictivos de la EICH aguda pueden ser los identificados en Levine et al., “A prognostic score for acute graft-versus-host disease based on biomarkers: a multicentre study”, Lancet Haematol 2015; 2:e21-29. Estos biomarcadores incluyen, entre otros, TNFR1, ST-2, elafina e IL2Ra y Reg3a.
En una realización adicional, el modelo de HSCT se lleva a cabo como se describe en Miller, Weston P., et al. “EICH after haploidentical transplantation: a novel, MHC-defined rhesus macaque model identifies CD28- CD8+ T cells as a reservoir of breakthrough T-cell proliferation during costimulation blockade and sirolimus-based immunosuppression.” Blood, 116, 24 (2010):5403-5418. En otra realización, el modelo de HSCT se lleva a cabo como se describe en el Ejemplo 7.
100. El anticuerpo o fragmento, uso o método según uno cualquiera de los aspectos 95 a 99, en el que el anticuerpo es uno cualquiera de los aspectos 73 a 89, 98, 99, 101 o 102.
101. El anticuerpo o fragmento según uno cualquiera de los aspectos 73 a 89, 98, 99 o 102, o el anticuerpo o fragmento, uso o método según uno cualquiera de los aspectos 90 a 100, en el que el anticuerpo o fragmento se expresa como un conjunto transfectado de forma estable en Lonza GS-XceedTM a un nivel mayor que 1,5 g/l en un cultivo de sobrecrecimiento alimentado por lotes utilizando el sistema de alimentación Lonza versión 8 con un período de crecimiento excesivo de 14 días.
En una realización, el nivel de expresión es mayor que 1,0 g/l, mayor que 1,1 g/l, mayor que 1,2 g/l, mayor que 1,3 g/l, o mayor que 1,4 g/l.
102. Un anticuerpo o fragmento según uno cualquiera de los aspectos 73 a 89, 98, 99 o 101, o el anticuerpo o fragmento, uso o método según cualquiera de los aspectos 90 a 101, en el que el anticuerpo o fragmento mantiene una población sin tratamiento previo de células T CD4+ de >20% del total de la población de células T CD4+ en el día 12 en un modelo de macaco Rhesus de trasplante de células madre hematopoyéticas haploidénticas.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo o fragmento según uno cualquiera de los aspectos 73 a 89, 98, 99 o 101, o un anticuerpo o fragmento, uso o método según cualquiera de los aspectos 90 a 101, en el que el anticuerpo o fragmento es para tratar o prevenir el rechazo de trasplante en un ser humano mediante el mantenimiento de una población sin tratamiento previo de células T CD4+ del donante de >20% del total de la población de células T CD4+ en el día 12 en dicho ser humano después del trasplante de células madre hematopoyéticas humanas del donante.
En una realización, el modelo de HSCT es como se describe en cualquier realización contemplada anteriormente, por ejemplo como se describe con respecto el aspecto 99.
En otra realización, la población sin tratamiento previo se mide evaluando la proporción relativa de fenotipos de células T específicas mediante citometría de flujo, en la que los subconjuntos de células se identifican mediante el marcaje con sondas de anticuerpos fluorescentes, y las células T CD4 o CD8 sin tratamiento previo se marcan como CD4+/CD28+/CD95- o CD8+/CD28+/CD95-, respectivamente, las células T CD4 o CD8 de memoria central se marcan como CD4+/CD28+/CD95+ o CD8+/CD28+/CD95+, respectivamente, y las células T CD4 o CD8 de memoria efectora se marcan como CD4+/CD28-/CD95+ o CD8+/CD28-/CD95+, respectivamente.
103. El anticuerpo o fragmento, el uso o el método según uno cualquiera de los aspectos 90 a 102, que comprende además administrar al ser humano un agente terapéutico adicional, opcionalmente en el que el agente terapéutico adicional se selecciona independientemente del grupo compuesto por rapamicina (sirolimus), tacrolimus, ciclosporina, corticosteroides (por ejemplo, metilprednisolona), metotrexato, micofenolato mofetilo, anticuerpos anti-CD28, anticuerpos anti-IL12/IL-23 (por ejemplo, ustekinumab), anticuerpos anti-CD20 (por ejemplo, rituximab), anticuerpos anti-CD30 (por ejemplo, brentuximab), moléculas CTLA4-Fc (por ejemplo, abatacept), antagonistas del receptor CCR5 (por ejemplo, maraviroc), anticuerpos anti-CD40L, anticuerpos anti-VLA4 (por ejemplo, natalizumab), anticuerpos anti-LFA1, fludarabina, anticuerpos anti-CD52 (por ejemplo, alemtuzumab), anticuerpos anti-CD45, ciclofosfamida, globulinas antitimocitos, anticuerpos anti-C5 del complemento (por ejemplo, eculizumab), anticuerpos anti-integrina a4b7 (por ejemplo, vedolizumab), anticuerpos anti-IL6 (por ejemplo tocilizumab), anticuerpos anti-IL2R (por ejemplo, basilixumab), anticuerpos anti-CD25 (por ejemplo, daclizumab), anti-TNFa/moléculas TNFa-Fc (por ejemplo, etanercept, adalimumab, infliximab, golimumab o certolizumab pegol) y Vorinostat, en particular rapamicina (sirolimus), tacrolimus, ciclosporina, corticosteroides (por ejemplo, metilprednisolona), metotrexato, micofenolato mofetilo, anticuerpos anti-CD28, moléculas CTLA4-Fc (por ejemplo, etanercept), anticuerpos anti-CD40, anticuerpos anti-LFA1, anticuerpos anti-CD52 (por ejemplo, alemtuzumab), ciclofosfamida y globulinas antitimocitos.
En una realización, el agente terapéutico adicional es un fármaco antiinflamatorio. En otra realización, el fármaco antiinflamatorio se selecciona independientemente del grupo que consiste en corticosteroides (por ejemplo, metilprednisolona), anticuerpos anti-IL12/IL-23 (por ejemplo, ustekinumab), anticuerpos anti-VLA4 (por ejemplo, natalizumab), anticuerpos anti-LFA1, anticuerpos anti-C5 del complemento (por ejemplo, eculizumab), anticuerpos anti-integrina a4b7 (por ejemplo, vedolizumab), anticuerpos anti-IL6 (por ejemplo, tocilizumab), anticuerpos anti-IL2R (por ejemplo, basilixumab) o anticuerpos anti-TNFa/moléculas TNFa-Fc (por ejemplo, etanercept, adalimumab, infliximab, golimumab, certolizumab pegol). En un ejemplo, el fármaco antiinflamatorio se selecciona independientemente del grupo que consiste en corticosteroides (por ejemplo, metilprednisolona) y anticuerpos anti-LFA1.
En una realización, la combinación comprende un anticuerpo anti-OX40L de la invención y agentes terapéuticos adicionales seleccionados independientemente del grupo que consiste en inhibidores de calcineurina (por ejemplo, tacrolimus, ciclosporina), inhibidores de mTOR (por ejemplo, rapamicina (sirolimus)), y agentes antiproliferativos (por ejemplo, micofenolato mofetilo, ciclofosfamida).
En una realización, la combinación comprende un anticuerpo anti-OX40L de la invención y otros agentes terapéuticos seleccionados independientemente del grupo que consiste en inmunosupresores que modulan la señalización de IL-2 (por ejemplo, tacrolimus, ciclosporina, rapamicina (sirolimus), y anticuerpos anti-CD25 (por ejemplo, basilixumab, daclizumab).
En una realización, la combinación comprende un anticuerpo anti-OX40L de la invención y rapamicina (sirolimus). En otra realización, la combinación comprende un anticuerpo anti-OX40L de la invención y tacrolimus. En otra realización, la combinación comprende un anticuerpo anti-OX40L de la invención y tacrolimus y metotrexato. En otra realización, la combinación comprende un anticuerpo anti-OX40L de la invención y ciclosporina. En otra realización, la combinación comprende un anticuerpo anti-OX40L de la invención y ciclosporina y metotrexato. En otra realización, la combinación comprende un anticuerpo anti-OX40L de la invención y ciclofosfamida. En otra realización, la combinación comprende un anticuerpo anti-OX40L de la invención y micofenolato mofetilo.
104. El anticuerpo o fragmento, uso o método según el aspecto 103, en el que el agente terapéutico adicional se administra de forma secuencial o simultánea con el anticuerpo o fragmento anti-hOX40L.
105. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento como se define en uno cualquiera de los aspectos 73 a 89, 98, 99, 101 o 102, y un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable, y que opcionalmente comprende además otro agente terapéutico seleccionado independientemente del grupo que consiste en rapamicina (sirolimus), tacrolimus, ciclosporina, corticosteroides (por ejemplo, metilprednisolona), metotrexato, micofenolato mofetilo, anticuerpos anti-CD28, anticuerpos anti-IL12/IL-23 (por ejemplo, ustekinumab), anticuerpos anti-CD20 (por ejemplo, rituximab), anticuerpos anti-CD30 (por ejemplo, brentuximab), moléculas CTLA4-Fc (por ejemplo, abatacept), antagonistas del receptor CCR5 (por ejemplo, maraviroc), anticuerpos anti-CD40L, anticuerpos anti-VLA4 (por ejemplo, natalizumab), anticuerpos anti-LFA1, fludarabina, anticuerpos anti-CD52 (por ejemplo, alemtuzumab), anticuerpos anti-CD45, ciclofosfamida, globulinas antitimocitos, anticuerpos anti-C5 del complemento (por ejemplo eculizumab), anticuerpos anti-integrina a4b7 (por ejemplo, vedolizumab), anticuerpos anti-IL6 (por ejemplo, tocilizumab), anticuerpos anti-IL2R (por ejemplo, basilixumab), anticuerpos anti-CD25 (por ejemplo, daclizumab), anti-TNFa/moléculas TNFa-Fc (por ejemplo, etanercept, adalimumab, infliximab, golimumab o certolizumab pegol) y Vorinostat, en particular rapamicina (sirolimus), tacrolimus, ciclosporina, corticosteroides (por ejemplo, metilprednisolona), metotrexato, micofenolato mofetilo, anticuerpos anti-CD28, moléculas CTLA4-Fc (por ejemplo, abatacept), anticuerpos anti-CD40L, anticuerpos anti-LFA1, anticuerpos anti-CD52 (por ejemplo, alemtuzumab), ciclofosfamida y globulinas antitimocito.
Los excipientes, diluyentes o vehículos farmacéuticamente aceptables que se describen aquí se aplican, mutatis mutandis, a estas composiciones.
En una realización, el agente terapéutico adicional es un fármaco antiinflamatorio. En otra realización, el fármaco antiinflamatorio se selecciona independientemente del grupo que consiste en corticosteroides (por ejemplo, metilprednisolona), anticuerpos anti-IL12/IL-23 (por ejemplo, ustekinumab), anticuerpos anti-VLA4 (por ejemplo, natalizumab), anticuerpos anti-LFA1, anticuerpos anti-C5 del complemento (por ejemplo, eculizumab), anticuerpos anti-integrina a4b7 (por ejemplo, vedolizumab), anticuerpos anti-IL6 (por ejemplo, tocilizumab), anticuerpos anti-IL2R (por ejemplo, basilixumab) o anticuerpos anti-TNFa/moléculas TNFa-Fc (por ejemplo, etanercept, adalimumab, infliximab, golimumab, certolizumab pegol). En un ejemplo, el fármaco antiinflamatorio se selecciona independientemente del grupo que consiste en corticosteroides (por ejemplo, metilprednisolona) y anticuerpos anti-LFA1.
En una realización, el agente terapéutico adicional se selecciona independientemente del grupo que consiste en inhibidores de calcineurina (por ejemplo, tacrolimus, ciclosporina), inhibidores de mTOR (por ejemplo, rapamicina (sirolimus)), y agentes antiproliferativos (por ejemplo, micofenolato mofetilo, ciclofosfamida).
En una realización, el agente terapéutico adicional se selecciona independientemente del grupo que consiste en inmunosupresores que modulan la señalización de IL-2 (por ejemplo, tacrolimus, ciclosporina, rapamicina (sirolimus), y anticuerpos anti-CD25 (por ejemplo, basilixumab, daclizumab).
En una realización, el agente terapéutico adicional es rapamicina (sirolimus). En otra realización, el agente terapéutico adicional es tacrolimus. En otra realización, el agente terapéutico adicional es una combinación de tacrolimus y metotrexato. En otra realización, el agente terapéutico adicional es ciclosporina. En otra realización, el agente terapéutico adicional es una combinación de ciclosporina y metotrexato. En otra realización, el agente terapéutico adicional es ciclofosfamida. En otra realización, el agente terapéutico adicional es micofenolato mofetilo.
106. Una composición farmacéutica según el aspecto 105, o un kit que comprende una composición farmacéutica como se define en el aspecto 105, en el que la composición es para tratar y/o prevenir una enfermedad o afección mediada por hOX40L seleccionada de una enfermedad o afección autoinmune, una enfermedad o afección inflamatoria sistémica, o rechazo de trasplantes; por ejemplo, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, rechazo de trasplantes, rechazo de trasplantes alogénicos, enfermedad de injerto contra hospedante (EICH), colitis ulcerosa, lupus eritematoso sistémico (LES), diabetes, uveítis, espondilitis anquilosante, hipersensibilidad por contacto, esclerosis múltiple y aterosclerosis, en particular EICH.
Las enfermedades mediadas por hOX40L de cualquiera de los aspectos, configuraciones, conceptos, ejemplos o realizaciones aquí se aplican opcionalmente, mutatis mutandis, a esta combinación.
107. Una composición farmacéutica según el aspecto 105 o el aspecto 106 en combinación con, o un kit según el aspecto 106, que comprende una etiqueta o instrucciones de uso para tratar y/o prevenir dicha enfermedad o afección en un ser humano; opcionalmente, en el que la etiqueta o las instrucciones comprenden un número de autorización de comercialización (por ejemplo, un número de autorización de la FDA o EMA); opcionalmente, en el que el kit comprende un dispositivo intravenoso o de inyección que comprende el anticuerpo o fragmento.
Las etiquetas, instrucciones, enfermedades y afecciones mediadas por hOX40L de cualquiera de los aspectos, configuraciones, conceptos, ejemplos o realizaciones descritos aquí se aplican opcionalmente, mutatis mutandis, a esta combinación.
108. Un ácido nucleico que codifica la HCDR3 de un anticuerpo o fragmento como se define en uno cualquiera de los aspectos 73 a 89, 98, 99, 101 o 102.
109. Un ácido nucleico que codifica un dominio VH y/o un dominio VL de un anticuerpo o fragmento como se define en uno cualquiera de los aspectos 73 a 89, 98, 99, 101 o 102.
110. Un ácido nucleico según el aspecto 109, que comprende una secuencia nucleotídica que es al menos 80% idéntica a la secuencia de SEQ ID n O: 33 y/o SEQ ID NO: 47.
En un ejemplo, la secuencia nucleotídica es al menos 85% idéntica, al menos 90% idéntica, al menos 95% idéntica, al menos 96% idéntica, al menos 97% idéntica, al menos 98% idéntica, o al menos 99% idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 33 y/o SEQ ID NO: 47.
111. Un ácido nucleico que codifica una cadena pesada o una cadena ligera de un anticuerpo mencionado en uno cualquiera de los aspectos 73 a 89, 98, 99, 101 o 102.
112. Un vector que comprende el ácido nucleico de uno cualquiera de los aspectos 108 a 111; en el que opcionalmente el vector es un vector CHO o HEK293.
113. Un hospedante que comprende el ácido nucleico de uno cualquiera de los aspectos 108 a 111, o el vector del aspecto 112.
La presente invención se refiere además a los siguientes conceptos:
Concepto 1. Un método para reducir la proporción de (por ejemplo, agotar o disminuir el nivel de) células T madre de memoria (Tscm) CD45RA+CCR7+CD95+OX40+, que comprende combinar dichas células con un agente (tal como un anticuerpo anti-OX40 o anti-OX40L o un fragmento del mismo) que reduce la proporción de células Tscm (por ejemplo, que agota o disminuye el nivel de dichas células Tscm), y por el que se reduce la proporción de dichas células Tscm (por ejemplo, por el que se disminuye o agota el nivel de dichas células Tscm).
Se cree que las células T madre de memoria (Tscm) CD45RA+CCR7+CD95+OX40+ son un subconjunto recién definido de células T de memoria de células madre que son de larga duración y tienen la capacidad de autorrenovarse. Por lo tanto, estas células pueden ser perjudiciales en diversas enfermedades, tales como EICH y trastornos autoinmunes, debido a que son la fuente de una población persistente y multipotente de células T efectoras potencialmente autorreactivas. Se sabe que las células T se desarrollan a través de un camino que comienza con células T sin tratamiento previo (Tn), a través de células T de memoria de células madre (Tscm), a través de células T de memoria central (Tcm) y células T de memoria efectoras (Tem), antes de convertirse en células T efectoras de vida corta (Teff), como se describe en Gattinoni y Restifo (2013), Inside Blood, 121(4), 567-568. En estas diversas etapas, diferentes marcadores se expresan en la superficie de las células T, que reflejan el estado de activación de las células T, su localización en los tejidos, y su capacidad de respuesta a diversos estímulos, tales como las citocinas inflamatorias.
Las células Tscm, tal como se definen aquí, se caracterizan como CD45RA+CCR7+CD95+OX40+. Para clasificaciones alternativas de la técnica anterior de diferentes tipos de células T, véase la figura en Gattinoni y Restifo (2013). Otros marcadores pueden estar presentes o ausentes, pero las células Tscm deben ser como mínimo CD45RA+CCR7+CD95+OX40+. Los diversos marcadores de superficie celular se identifican, en una realización, usando citometría de flujo usando métodos que son bien conocidos por los expertos en la técnica. En una realización, las células Tscm pueden ser además CD8+. En otra realización, las células Tscm pueden ser además CD62L+. Las técnicas de citometría de flujo son bien conocidas por los expertos en la técnica. Los agentes que pueden usarse en técnicas de citometría de flujo se definen en el Ejemplo 7 más abajo. En una realización, la citometría de flujo se lleva a cabo como se describe en el Ejemplo 7 más abajo. En otra realización, la citometría de flujo se lleva a cabo como se describe en Baumgarth y Roederer (2000), Journal of Immunological Methods, 243, 77-97. (véase el concepto 25 más abajo).
En una realización particular, las células Tscm se caracterizan por ser CD4+CD45RA+ CCR7+CD95+OX40+.
Sin estar ligados a ninguna teoría, se cree que la reducción de esta población de Tscm tendrá una serie de beneficios en varias enfermedades, como se establece aquí. En una realización, las células Tscm son células Tscm activas.
A lo largo de los conceptos 1 a 83 aquí, la proporción o los niveles de células Tscm pueden reducirse en una muestra, o incluso en (una muestra de) la sangre de un sujeto. La proporción o los niveles de células Tscm se pueden determinar con respecto a toda la población de células T en la muestra. En una realización, la proporción o nivel de células Tscm se determina con respecto a otras células T en la muestra. Las células T generalmente pueden identificarse como CD3+, e incluyen células Tn, células Tscm, células Tcm, células Tem y células Teff. En una realización particular, la proporción o nivel de células Tscm se determina con respecto a las células Tn (como se define más abajo) en la muestra. La proporción o el nivel de células Tscm puede verse alterado por el agotamiento o por una disminución. En una realización, una relación de tipos de células T puede ser la misma que una proporción de células Tscm (por ejemplo, como para el concepto 2 a continuación). En otra realización, un nivel de tipos de células T puede ser el mismo que una proporción de células Tscm. En una realización, la relación o proporción de Tscm:Tn es mayor que 50:50. Las relaciones y proporciones particulares son como se describen en los conceptos 23 y 24.
Como se usa en los conceptos 1 a 83 aquí, “agotamiento” y “agota” describen un efecto activo después de la combinación con un agente (tal como un anticuerpo) en la diana deseada para exterminar o eliminar las células diana (por ejemplo, células Tscm). Cuando el agente es un anticuerpo, esto generalmente se logra a través de funciones efectoras, tales como ADC, ADCC o CDC. Alternativamente, la diana puede ser exterminada o eliminada por una toxina, que puede conjugarse con un fármaco o un resto de direccionamiento (tal como un anticuerpo anti-OX40 o anti-OX40L). Tales toxinas exterminarán o eliminarán selectivamente la célula a la que están dirigidas. Los inmunoconjugados adecuados se describen en la página 90 y en las páginas 114 a 118 y 134 (en particular, en las páginas 114 a 116) aquí.
“Disminuir” o “disminuye”, como se usa en los conceptos 1 a 83 aquí, se refiere a un mecanismo distinto del agotamiento, que reduce el número absoluto de células en una población dada. Esto puede lograrse indirectamente, por ejemplo a través de un agente bloqueante o neutralizante (tal como un anticuerpo) contra una diana que provoca indirectamente la destrucción de una célula diana (tal como una Tscm), o evita la expansión o el crecimiento de las células diana, lo que da como resultado una aparente disminución de las proporciones con respecto a otro tipo de células (tales como células Tn).
Como se usa en los conceptos 1 a 83 aquí, un “nivel” de una población de células T puede referirse al número absoluto, o a la proporción relativa de un tipo de célula T.
A lo largo de los diversos conceptos 1 a 83 descritos aquí, un agente que reduce la proporción de células Tscm puede ser, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo, un ARN de interferencia corto (ARNic), un dedo de zinc, un DARPin, un aptámero, un Spiegelmer, una anti-calina, una fusión receptor-Fc, una fusión ligando-Fc, o una molécula pequeña. En una realización, el agente se dirige contra OX40 (por ejemplo, OX40 humano) o ligandos de OX40. En otra realización, el agente se dirige contra OX40L (por ejemplo, OX40L humano) o receptores de OX40L. En un ejemplo, el agente puede ser una proteína de fusión OX40-Fc (por ejemplo, fusión hOX40-Fc), o puede ser una proteína de fusión OX40L-Fc (por ejemplo, fusión hOX40L-Fc), incluyendo ambos fragmentos funcionales de OX40 y OX40L. Estos tipos de construcciones son conocidas por los expertos en la técnica. En otra realización, el agente se dirige contra OX40 (por ejemplo, OX40 humano). En otra realización, el agente se dirige contra OX40L (por ejemplo, OX40L humano).
En una realización particular, el agente es un anticuerpo o fragmento del mismo. Los formatos y estructuras de anticuerpos y fragmentos se describen aquí en otra parte, y pueden aplicarse a cualquiera de los conceptos descritos aquí. El anticuerpo o fragmento puede ser cualquiera de las construcciones que se describen aquí (por ejemplo, como en uno cualquiera de los conceptos 52 a 64 aquí). En una realización particular, el agente es un anticuerpo anti-OX40 humano o un fragmento del mismo. En otra realización particular, el agente es un anticuerpo anti-OX40L humano, tal como un anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de 02D10 descrita aquí o un anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de oxelumab.
Concepto 2. Un método para alterar la relación de tipos de células en una población de células T en una muestra, comprendiendo el método:
a. proporcionar dicha población, en el que la población comprende una mezcla de diferentes tipos de células T, en el que la población comprende células Tscm CD45RA+CCR7+CD95+OX40+,
b. proporcionar un agente que reduzca la proporción de células Tscm (o proporcionar un anticuerpo anti-OX40 o anti-OX40L o un fragmento del mismo); y
c. combinar dicha población celular con una cantidad de dicho agente (por ejemplo, anticuerpo o fragmento del mismo) eficaz para alterar la relación (por ejemplo, para reducir la proporción) de células Tscm en dicha población.
A lo largo de los conceptos 1 a 83 aquí, la relación de tipos de células T puede alterarse en una muestra, por ejemplo aumentando la proporción de células T sin tratamiento previo (Tn, como se define a continuación). En otra realización, la relación de tipos de células T puede alterarse disminuyendo la proporción de células Tscm. La relación de células Tscm se puede determinar con respecto a toda la muestra. En una realización, la relación de células T se determina comparando la proporción de células T sin tratamiento previo o células Tscm con respecto a otras células T en la muestra. Las células T generalmente pueden identificarse como CD3+, e incluyen células Tn, células Tscm, células Tcm, células Tem y células Teff. En una realización particular, la relación de células T se determina como la relación de células Tscm con respecto a las células T sin tratamiento previo en la muestra. La relación de células T puede verse alterada por el agotamiento o por una disminución de las células Tscm. La relación de células T puede verse alterada por un aumento o expansión de células T sin tratamiento previo.
Concepto 3. Un método según el concepto 2, en el que, en la etapa a), la población comprende además células T sin tratamiento previo (Tn) CD45RA+CCR7+CD95-.
Las células T sin tratamiento previo (Tn), como se definen en los conceptos 1 a 83 aquí, se caracterizan como CD45RA+CCR7+CD95-. Pueden estar presentes o ausentes otros marcadores, pero las células Tn deben ser como mínimo CD45RA+CCR7+CD95-. En una realización, las células Tn pueden ser además CD8+ o CD4+, en particular CD4+. Se cree que las Tn son beneficiosas porque representan el conjunto completo de células T a partir de las cuales se pueden desarrollar respuestas inmunitarias de células T adaptativas para proteger a un individuo cuando se expone a patógenos potencialmente dañinos y células malignas.
Concepto 4. Un método según el concepto 3, en el que la relación de Tscm:Tn en la población de la etapa a) es mayor que 50:50.
Concepto 5. Un método según uno cualquiera de los conceptos 1 a 4, en el que el método se lleva a cabo ex-vivo en una muestra de sangre extraída de un sujeto donante humano.
Concepto 6. Un método según el concepto 5, en el que la sangre producida por dicho método se vuelve a introducir en un sujeto humano receptor.
En una realización, el sujeto humano receptor es el mismo sujeto humano donante del que se extrajo la muestra. En otra realización, el sujeto humano receptor es diferente del sujeto humano donante. Cuando el receptor es diferente del donante, es preferible que el donante sea del mismo género que el sujeto receptor. En otra realización, el donante puede tener una edad y una etnia similares a las del sujeto receptor. En otra realización, el donante puede tener los mismos o similares marcadores de alotipo que el sujeto receptor.
En otra realización, el donante humano receptor puede recibir más de una transfusión de sangre de donante, según la gravedad de la enfermedad a tratar.
Concepto 7. Un método según uno cualquiera de los conceptos 1 a 4, en el que el método se lleva a cabo in vivo en un sujeto humano.
Concepto 8. Un método según el concepto 7, en el que el sujeto tiene o está en riesgo de padecer una enfermedad o afección mediada por Tscm.
Como se usa aquí, un sujeto puede identificarse como “en riesgo de una enfermedad o afección mediada por Tscm” cuando los cambios celulares en su población de células T han comenzado a tener lugar, pero el sujeto aún no ha presentado síntomas o no se diagnosticaría con tal enfermedad por cualquier método convencional. Por lo tanto, los métodos y usos descritos aquí pueden ayudar en la identificación temprana de pacientes que desarrollarán tales enfermedades. En una realización, se previene la enfermedad (es decir, el tratamiento es profiláctico).
En una realización particular, el sujeto está en riesgo de EICH o rechazo de trasplante cuando está en el preoperatorio de un trasplante. En el concepto 78, más abajo, se contemplan terapias de trasplante potenciales.
En cualquiera de los conceptos 1 a 83 descritos aquí, una enfermedad mediada por Tscm puede ser como se define en cualquiera de los conceptos 71 a 80 a continuación.
Concepto 9. Un método para tratar o reducir el riesgo de una enfermedad o afección mediada por Tscm en un sujeto, comprendiendo el método combinar una población de células T con un agente (por ejemplo, un anticuerpo anti-OX40 o anti-OX40L o fragmento del mismo) que reduce la proporción de células Tscm (por ejemplo, que agota o disminuye el nivel de dichas células Tscm), y por el que se reduce la proporción de células Tscm CD45RA+CCR7+CD95+OX40+ en la población (por ejemplo, por el que se disminuye o se agota el nivel de dichas células Tscm células en dicha población).
Como se usa en los conceptos 1 a 83 aquí, el “tratamiento” de una enfermedad mediada por Tscm incluye la reducción de uno o más síntomas de dicha enfermedad mediada por Tscm. La “prevención” de una enfermedad mediada por Tscm incluye la prevención de uno o más síntomas de dicha enfermedad mediada por Tscm.
Concepto 10. Un método según uno cualquiera de los conceptos 7 a 9, en el que el agente (por ejemplo, anticuerpo o fragmento del mismo) se combina mediante la administración de dicho agente (por ejemplo, anticuerpo o fragmento) en una cantidad terapéuticamente eficaz a dicho sujeto, por lo que se trata dicha enfermedad o afección mediada por Tscm, o se reduce el riesgo de dicha enfermedad o afección mediada por Tscm en dicho sujeto.
En una realización, la administración es profiláctica para reducir el riesgo de una enfermedad mediada por Tscm.
En cualquiera de los conceptos descritos aquí, una cantidad terapéuticamente eficaz o profilácticamente eficaz del anticuerpo o fragmento es como se describe en otra parte (véanse las páginas 29, 73, 105 a 107 para la terapia, y las páginas 72 y 102 a 103 para la profilaxis). En cualquiera de los conceptos descritos aquí, los modos y las composiciones para la administración pueden ser como se describe en otra parte (véanse las páginas 118 a 142 aquí). En una realización, el anticuerpo o fragmento se administra mediante inyección en bolo (por ejemplo, por vía intravenosa).
Concepto 11. Un método para tratar o reducir el riesgo de una enfermedad o afección mediada por Tscm en un sujeto, que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente (por ejemplo, un anticuerpo anti-OX40 o anti-OX40L o un fragmento del mismo) que reduce la proporción de células Tscm (por ejemplo, que agota o disminuye el nivel de dichas células Tscm), y por el que se reduce la proporción de células Tscm CD45RA+CCR7+CD95+OX40+ (por ejemplo, por el que se disminuye o se agota el nivel de dichas células Tscm), en el que la enfermedad o afección mediada por Tscm se trata de este modo, o se reduce el riesgo de dicha enfermedad o afección mediada por Tscm.
Concepto 12a. Un agente (por ejemplo, un anticuerpo anti-OX40 o anti-OX40L o un fragmento del mismo) que reduce la proporción de células Tscm (por ejemplo, que agota o disminuye el nivel de dichas células Tscm), para uso en el tratamiento o la reducción del riesgo de una enfermedad o afección mediada por Tscm en un sujeto; o concepto 12b. Un anticuerpo anti-OX40 o anti-OX40L o fragmento del mismo para uso en el tratamiento o la reducción del riesgo de una enfermedad o afección mediada por Tscm en un sujeto.
Concepto 13a. Uso de un agente (por ejemplo, un anticuerpo anti-OX40 o anti-OX40L o un fragmento del mismo) que reduce la proporción de células Tscm (por ejemplo, que agota o disminuye el nivel de dichas células Tscm), para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o afección mediada por Tscm en un sujeto; o concepto 13b. Uso de un anticuerpo anti-OX40 o anti-OX40L o fragmento del mismo para el tratamiento o prevención de una enfermedad o afección mediada por Tscm en un sujeto.
Concepto 14a. Uso de un agente (por ejemplo, un anticuerpo anti-OX40 o anti-OX40L o un fragmento del mismo) que reduce la proporción de células Tscm (por ejemplo, que agota o disminuye el nivel de dichas células Tscm), en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad o afección mediada por Tscm en un sujeto; o concepto 14b. El uso de un anticuerpo anti-OX40 o anti-OX40L o fragmento del mismo en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad o afección mediada por Tscm en un sujeto.
Concepto 15a. Una composición que comprende un agente (por ejemplo, un anticuerpo anti-OX40 o anti-OX40L o un fragmento del mismo) que reduce la proporción de células Tscm (por ejemplo, que agota o disminuye el nivel de dichas células Tscm), para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o afección mediada por Tscm en un sujeto; o concepto 15b. Una composición que comprende un anticuerpo anti-OX40 o anti-OX40L o un fragmento del mismo para el tratamiento o prevención de una enfermedad o afección mediada por Tscm en un sujeto.
Concepto 16. Un método para tratar una enfermedad o afección en un sujeto que lo necesite, que comprende:
a. Realizar un ensayo para medir el nivel de células Tn CD45RA+CCR7+CD95- y el nivel de células Tscm CD45RA+CCR7+CD95+OX40+ en una muestra obtenida del sujeto; y
b. Administrar un agente (por ejemplo, un anticuerpo anti-OX40 o anti-OX40L o un fragmento del mismo) que reduce la proporción de células Tscm (por ejemplo, que agota o disminuye el nivel de dichas células Tscm), tal como un anticuerpo anti-OX40 o anti-OX40L o fragmento del mismo, al sujeto cuando se determina en el ensayo que la relación de células Tscm:Tn en la muestra es mayor que 50:50.
Concepto 17a. Un agente (por ejemplo, un anticuerpo anti-OX40 o anti-OX40L o un fragmento del mismo) que reduce la proporción de células Tscm (por ejemplo, que agota o disminuye el nivel de dichas células Tscm), para uso en la terapia de un sujeto, en el que el agente es para ser administrado a un sujeto que tiene, o se ha determinado que tiene, una relación de células Tscm CD45RA+CCR7+CD95+OX40+:células Tn CD45RA+CCR7+ CD95- mayor que 50:50; o el concepto 17b. Un anticuerpo anti-OX40 o anti-OX40L o un fragmento del mismo para uso en la terapia de un sujeto, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo se va a administrar a un sujeto que tiene, o se ha determinado que tiene, una relación de células Tscm CD45RA+CCR7 CD95+OX40+:células Tn CD45RA+CCR7+CD95- mayor que 50:50.
Concepto 18a. Uso de un agente (por ejemplo, un anticuerpo anti-OX40 o anti-OX40L o fragmento del mismo) que reduce la proporción de células Tscm (por ejemplo, que agota o disminuye el nivel de dichas células Tscm), para la terapia de un sujeto que tiene, o se ha determinado que tiene, una relación de células Tscm CD45RA+CCR7+CD95+OX40+:células Tn CD45RA+CCR7+CD95- mayor que 50:50; o concepto 18b. Uso de un anticuerpo anti-OX40 o anti-OX40L o fragmento del mismo para la terapia de un sujeto que tiene, o se ha determinado que tiene, una relación de células Tscm CD45RA+CCR7+CD95+OX40+:células Tn CD45RA+CCR7+CD95- mayor que 50:50.
Concepto 19a. Uso de un agente (por ejemplo, un anticuerpo anti-OX40 o anti-OX40L o un fragmento del mismo) que reduce la proporción de células Tscm (por ejemplo, que agota o disminuye el nivel de dichas células Tscm), en la fabricación de un medicamento para uso en terapia de un sujeto, en el que el agente se va a administrar a un sujeto que tiene, o se ha determinado que tiene, una relación de células Tscm CD45RA+CCR7+CD95+OX40+:células Tn CD45RA+CCR7+CD95- mayor que 50: 50; o concepto 19b. Uso de un anticuerpo anti-OX40 o anti-OX40L o un fragmento del mismo en la fabricación de un medicamento para uso en la terapia de un sujeto, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo se va a administrar a un sujeto que tiene, o se ha determinado que tienen una relación de células Tscm CD45RA+CCR7+CD95+OX40+:células Tn CD45RA+ CCR7+CD95- mayor que 50:50.
En cualquiera de los conceptos 17 a 19, la relación se determina en una muestra, por ejemplo en una muestra de sangre obtenida de dicho sujeto.
Concepto 20. Un método según el concepto 16a o b, un agente o un anticuerpo o fragmento para el uso según el concepto 17a o b, o el uso según el concepto 18a o b o el concepto 19 a o b, en el que la terapia es la tratamiento o prevención de una enfermedad o afección mediada por Tscm, preferiblemente en el que la terapia es el tratamiento de una enfermedad o afección mediada por Tscm.
En otra realización, el sujeto tiene o está en riesgo de tener una enfermedad o afección mediada por Tscm. La enfermedad o afección mediada por Tscm puede ser como se define en cualquiera de los conceptos 71 a 80 a continuación.
Concepto 21. Un método para clasificar a un sujeto que tiene o está en riesgo de padecer una enfermedad o afección mediada por Tscm (por ejemplo, enfermedad o afección que es adecuada para el tratamiento con un anticuerpo anti-OX40 o anti-OX40L o un fragmento del mismo), que comprende:
a. realizar un ensayo que detecta (i) células Tscm CD45RA+CCR7+CD95+OX40+, y (ii) células Tn CD45RA+CCR7+CD95- en una muestra obtenida de dicho sujeto; y
b. clasificar al sujeto como portador o que está en riesgo de padecer una enfermedad o afección mediada por Tscm si la relación de células Tscm:Tn en la muestra es mayor que 50:50.
Concepto 22. Un método según el concepto 21, que comprende además la etapa de:
c. administrar a dicho sujeto un anticuerpo anti-OX40 o anti-OX40L o un fragmento del mismo que reduce la proporción de dichas células Tscm en la sangre de dicho sujeto (por ejemplo, que agota o disminuye el nivel de dichas células Tscm) si dicho sujeto ha sido clasificado como portador o que está en riesgo de padecer una enfermedad o afección mediada por Tscm en la etapa b).
Las enfermedades o afecciones mediadas por Tscm que pueden ser adecuadas para el tratamiento con un anticuerpo anti-OX40 o anti-OX40L o un fragmento del mismo son como se describen en cualquiera de los conceptos 71 a 80 a continuación.
Concepto 23. Un método según uno cualquiera de los conceptos 4, 16 o 20 a 22, un agente o un anticuerpo o fragmento para el uso según el concepto 17 o 20, o el uso según uno cualquiera de los conceptos 18 a 20, en el que la relación de células Tscm:Tn es (o se determina o clasifica como) mayor que 60:40, o es mayor que 70:30, o es mayor que 75:25, tal como mayor que 70:30.
En otra realización, la relación es (o se determina o clasifica como) mayor que 55:45. En otra realización, la relación es (o se determina o clasifica como) mayor que 65:35.
Concepto 24. Un método, agente o anticuerpo o fragmento para el uso, o el uso según el concepto 23, en el que la relación de células Tscm:Tn es (o se determina o clasifica como) mayor que 80:20, o es mayor que 85:15, por ejemplo mayor que 90:10, por ejemplo mayor que 95:5.
Concepto 25. Un método según uno cualquiera de los conceptos 4, 16 o 20 a 24, un agente o un anticuerpo o fragmento para el uso según uno cualquiera de los conceptos 17, 20, 23 o 24, o el uso según uno cualquiera de los conceptos 18 a 20, 23 o 24, en el que la relación de células Tscm:Tn se determina (o es determinable) mediante citometría de flujo.
Las técnicas de citometría de flujo son bien conocidas por los expertos en la técnica, como se ha comentado anteriormente. Los agentes que pueden usarse en técnicas de citometría de flujo se definen en el Ejemplo 7 más abajo. En una realización, la citometría de flujo se lleva a cabo como se describe en el Ejemplo 7 más abajo. En otra realización, la citometría de flujo se lleva a cabo como se describe en Baumgarth y Roederer (2000).
Concepto 26. Un método para tratar o reducir el riesgo de una enfermedad o afección mediada por Tscm con un agente (por ejemplo, un anticuerpo anti-OX40 o anti-OX40L o un fragmento del mismo) que reduce la proporción de células Tscm (por ejemplo, que agota o disminuye el nivel de dichas células Tscm), o con un anticuerpo anti-OX40 o anti-OX40L o fragmento del mismo, que comprende las etapas de:
a. determinar si el sujeto es candidato para el tratamiento detectando la presencia de OX40 en la superficie de las células Tscm CD45RA+CCR7+CD95+ obtenidas de una muestra del sujeto; y
b. administrar dicho agente, tal como dicho anticuerpo o fragmento, al sujeto si el sujeto se identifica como candidato para el tratamiento.
Concepto 27. Un método según el concepto 26, en el que la presencia de OX40 en la superficie de las células Tscm se determina usando citometría de flujo.
En una realización, el sujeto es un ser humano, y el OX40 es un OX40 humano.
Concepto 28. Un método, que comprende:
a. obtener al menos dos muestras de células T derivadas de un sujeto que tiene o está en riesgo de padecer una enfermedad o afección mediada por Tscm, en el que dichas al menos dos muestras comprenden una primera muestra y una segunda muestra,
b. determinar los niveles de células Tscm CD45RA+CCR7+CD95+OX40+ en dichas muestras primera y segunda;
c. tratar a dicho sujeto para reducir la proporción de células Tscm CD45RA+CCR7+CD95+OX40+ (por ejemplo, para agotar o disminuir el nivel de células Tscm) mediante la administración de un agente que reduce la proporción de células Tscm (por ejemplo, que agota o disminuye el nivel de dichas células Tscm), o mediante la administración de un anticuerpo anti-OX40 o anti-OX40L o un fragmento del mismo, si los niveles de células Tscm en dicha segunda muestra son elevados en comparación con dicha primera muestra, con el fin de tratar o reducir el riesgo de dicha enfermedad o afección mediada por Tscm.
Los niveles de Tscm en dichas muestras primera y segunda en la etapa b. pueden ser el número absoluto de células Tscm, o pueden ser las proporciones relativas de Tscm (por ejemplo, la relación de Tscm:Tn, o Tacm:recuento total de células T). Los niveles de células Tscm pueden estar elevados en la segunda muestra si son estadísticamente significativamente más altos que los niveles en la primera muestra.
Concepto 29. Un método según el concepto 28, en el que dicha primera muestra se recoge:
i. antes del inicio de dicha enfermedad o afección; o
ii. después del inicio de dicha enfermedad o afección; y
opcionalmente, en el que dicha segunda muestra no se recoge durante más de un mes, por ejemplo no más de una semana después de la primera muestra.
Tal como se utiliza en los conceptos aquí, se puede determinar que un sujeto está “antes del inicio de una enfermedad o afección mediada por Tscm” si el sujeto no presenta síntomas que convencionalmente se asociarían con dicha enfermedad o afección, o si el sujeto no se diagnosticaría con tal enfermedad o afección por cualquier método convencional. Por ejemplo, la presencia de signos y síntomas de EICH aguda puede clasificarse por etapas y clasificarse de acuerdo con una escala estandarizada, tal como la descrita en Przepiorka et al. (1995), 1994 Consensus Conference on Acute EICH Grading Bone Marrow Transplant 1995; 15, 825-828. También se utilizan clínicamente de forma rutinaria escalas de clasificación de enfermedades similares para otras enfermedades relevantes, tales como artritis reumatoide y enfermedades inflamatorias del intestino.
Concepto 30. Un método según el concepto 28 o el concepto 29, en el que la enfermedad o afección mediada por Tscm es un trasplante, y en el que, en la etapa c), el tratamiento es para reducir el riesgo de rechazo de trasplante, opcionalmente en el que la primera muestra se toma antes del trasplante, y la segunda muestra se toma después del trasplante.
La primera muestra se puede tomar antes de la operación, por ejemplo después de que el sujeto haya sido identificado como candidato para el tratamiento. La segunda muestra se toma después del trasplante, y puede ser utilizada por los médicos como método de seguimiento de la aceptación del trasplante. Por lo tanto, puede ser que el médico tome más de una muestra después del trasplante, por ejemplo una muestra de sangre diaria para monitorizar al sujeto en busca de cambios en la proporción de Tscm:Tn o los niveles de Tscm en la muestra. Las muestras pueden tomarse cada dos días, semanalmente, mensualmente o más (incluso anualmente), según la probabilidad de rechazo de trasplante. Por ejemplo, si el trasplante es autólogo, entonces la probabilidad de rechazo de trasplante puede reducirse en comparación con un trasplante alogénico, y por lo tanto el período de tiempo entre la recogida de muestras después del trasplante puede ser más largo que con un trasplante alogénico, en el que el riesgo de rechazo es más alto.
Concepto 31. Un método según el concepto 30, en el que, en la etapa a), la primera muestra se recoge no más de una semana, por ejemplo no más de 6 días, no más de 5 días, no más de 4 días, o no más de 3 días, tal como no más de 2 días antes de dicho trasplante.
Concepto 32. Un método según uno cualquiera de los conceptos 28 a 31, en el que la segunda muestra se toma no más de 6 días, no más de 5 días, no más de 4 días, o no más de 3 días, tal como no más de 2 días después de la primera muestra o después de dicho trasplante.
Concepto 33. Un método según uno cualquiera de los conceptos 28 a 32, en el que, en la etapa c), los niveles de células Tscm en dicha segunda muestra son mayores que el doble de los niveles en comparación con dicha primera muestra, por ejemplo son mayores que tres veces el nivel, o preferiblemente son mayores que 4 veces los niveles en comparación con dicha primera muestra.
En una realización, en la etapa c), los niveles de células Tscm en dicha segunda muestra son mayores que 4 veces (por ejemplo, mayores que 4,5 veces) los niveles en comparación con dicha primera muestra. En otra realización, en la etapa c), los niveles de células Tscm en dicha segunda muestra son mayores que 5 veces los niveles en comparación con dicha primera muestra.
Concepto 34. Un método según uno cualquiera de los conceptos 30 a 33, en el que al sujeto se le administra una dosis profiláctica de un agente que reduce la proporción de células Tscm (por ejemplo, que agota o disminuye el nivel de dichas células Tscm), o se administra una dosis profiláctica de un anticuerpo anti-OX40 o anti-OX40L o fragmento del mismo, antes de dicho trasplante, y la primera muestra se toma antes de la administración de dicho agente, o anticuerpo o fragmento del mismo, y en el que la segunda muestra se toma después del trasplante o después de la administración del agente, o el anticuerpo o fragmento del mismo (preferiblemente, en el que la segunda muestra se toma después del trasplante).
En una realización, la dosis profiláctica es una dosis profiláctica eficaz. Por “eficaz” se entiende que la dosis es eficaz para reducir la proporción o el nivel de Tscm como se describe aquí, o eficaz para prevenir o reducir el riesgo de una enfermedad o afección mediada por Tscm.
Los métodos descritos aquí pueden usarse para corregir un nivel ya aberrante de células Tscm, mediante la administración de un agente que reduce la proporción de células Tscm (por ejemplo, que agota o disminuye el nivel de dichas células Tscm), o mediante la administración de un anticuerpo anti-OX40 o anti-OX40L o fragmento del mismo, antes de un trasplante, para reducir el riesgo de rechazo de trasplante después del trasplante. Por lo tanto, se pueden tomar múltiples muestras después de la administración del agente (o del anticuerpo anti-OX40 o anti-OX40L o fragmento del mismo), pero antes del trasplante. Se puede hacer una comparación entre las muestras recogidas y una muestra obtenida de un donante sano.
Concepto 35. Un método según uno cualquiera de los conceptos 30 a 33, en el que al sujeto se le administra una dosis terapéutica de un agente que reduce la proporción de células Tscm (por ejemplo, que agota o disminuye el nivel de dichas células Tscm), o se administra una dosis terapéutica de un anticuerpo anti-OX40 o anti-OX40L o fragmento del mismo, después del trasplante, y en el que la primera muestra se toma antes de dicho trasplante, y la segunda muestra se toma después del trasplante.
En una realización, la dosis terapéutica es una dosis terapéutica eficaz. Por “eficaz” se entiende que la dosis es eficaz para reducir la proporción o el nivel de Tscm como se describe aquí, o eficaz para tratar una enfermedad o afección mediada por Tscm.
En una realización, la segunda muestra se toma después de la administración del agente, o anticuerpo o fragmento del mismo. Esto permitiría a un médico comprobar que los niveles o la proporción de células Tscm permanecen “normales”, es decir, en comparación con la primera muestra o con una muestra obtenida de un donante sano.
Concepto 36. Un método según uno cualquiera de los conceptos 30 a 33, en el que al sujeto se le administra una dosis terapéutica de un agente que reduce la proporción de células Tscm (por ejemplo, que agota o disminuye el nivel de dichas células Tscm), o se administra una dosis terapéutica de un anticuerpo anti-OX40 o anti-OX40L o fragmento del mismo, después del trasplante, y en el que la primera muestra se toma antes de dicho trasplante, y la segunda muestra se toma después de la administración de dicho agente, o de dicho anticuerpo o fragmento del mismo.
Concepto 37. Un método según uno cualquiera de los conceptos 34 a 36, que comprende además las etapas de:
d. obtener una tercera muestra derivada de dicho sujeto;
e. determinar los niveles de células Tscm CD45RA+CCR7+CD95+OX40+ en dicha tercera muestra;
f. tratar a dicho sujeto para reducir la proporción de células Tscm CD45RA+CCR7+CD95+OX40+ (por ejemplo, para agotar o disminuir el nivel) de células Tscm administrando un agente que reduce la proporción de células Tscm (por ejemplo, que agota o disminuye el nivel de dichas células Tscm), o administrando un anticuerpo anti-OX40 o anti-OX40L o un fragmento del mismo, si los niveles de células Tscm en dicha tercera muestra son elevados en comparación con dicha segunda o dicha primera muestra.
Los niveles se consideran “elevados” como se describe anteriormente (por ejemplo, en cuanto al concepto 28 o 33).
Concepto 38. Un método según el concepto 37, en el que las etapas d) a f) se repiten según sea necesario hasta que los niveles de células Tscm permanezcan en niveles terapéuticamente eficaces o en niveles profilácticamente eficaces, por ejemplo a un nivel sustancialmente constante, en dicho sujeto.
Como se utiliza en los conceptos aquí, un “nivel sustancialmente constante” puede describirse como dentro del 30% de varianza entre muestras. En una realización, un nivel sustancialmente constante está dentro del 20% de varianza entre muestras. En otra realización, un nivel sustancialmente constante está dentro del 15% de varianza entre muestras, tal como dentro del 10% de varianza entre muestras, por ejemplo dentro del 5% de varianza entre muestras.
Concepto 39. Un método según uno cualquiera de los conceptos 28 a 38, en el que la segunda muestra se toma no más de un mes después de la primera muestra, tal como no más de una semana, no más de 6 días, no más de 5 días, no más de 4 días, o no más de 3 días, por ejemplo no más de 2 días después de la primera muestra, y opcionalmente en el que la tercera muestra se toma no más de un mes después de la segunda muestra, tal como no más de una semana, no más de 6 días, no más de 5 días, no más de 4 días, o no más de 3 días, por ejemplo no más de 2 días después de la segunda muestra.
Los puntos de tiempo para tomar cualquiera de las muestras descritas en estos conceptos dependerán de una serie de factores, tales como la probabilidad de que el sujeto tenga o esté en riesgo de padecer una enfermedad mediada por Tscm (por ejemplo, EICH o rechazo de trasplante), el nivel determinado en el muestra previa, el tipo de trasplante, etc. Un experto en la materia podrá determinar los momentos oportunos según sea necesario o deseado. Los puntos de tiempo pueden ser mensuales, cada dos meses, trimestrales, semestrales o anuales, si se desea.
Concepto 40. Uso in vitro de células Tscm CD45RA+CCR7+CD95+OX40+, como diagnóstico de una enfermedad o afección mediada por Tscm en un sujeto (por ejemplo, enfermedad o afección la cual se puede tratar o prevenir con un agente que reduce la proporción de células Tscm (por ejemplo, que agota o disminuye el nivel de dichas células Tscm), o con un anticuerpo anti-OX40 o anti-OX40L o fragmento del mismo en el sujeto).
En una realización, se proporciona un biomarcador de una enfermedad autoinmune, VIH-1, y una neoplasia maligna de células T, en el que el biomarcador es una célula Tscm CD45RA+CCR7+CD95+OX40+. En otra realización, el biomarcador es de cualquiera de las enfermedades descritas en los conceptos 71 a 80 más abajo. En otra realización, la célula Tscm es una célula Tscm CD4+CD45RA+CCR7+CD95+OX40+.
Concepto 41. Uso in vitro de un biomarcador de una enfermedad o afección mediada por Tscm, en el que el biomarcador son células Tscm CD45RA+CCR7+CD95+OX40+, como diagnóstico de una enfermedad o afección mediada por Tscm (por ejemplo, enfermedad o afección la cual puede tratarse o prevenirse con un agente que reduce la proporción de células Tscm (por ejemplo, que agota o disminuye el nivel de dichas células Tscm), o con un anti-OX40 o un anticuerpo anti-OX40L o fragmento del mismo en el sujeto).
En una realización, las enfermedades mediadas por Tscm son cualquiera de las descritas en los conceptos 71 a 80 más abajo.
Concepto 42. Un método para mantener las células Tn CD45RA+CCR7+CD95-, al tiempo que se disminuyen las células Tscm CD45RA+CCR7+CD95+OX40+ en una población de células T en una muestra, comprendiendo dicho método poner en contacto dicha muestra con una cantidad eficaz de un agente que reduce la proporción de células Tscm (por ejemplo, que agota o disminuye el nivel de dichas células Tscm), o con un anticuerpo anti-OX40 o anti-OX40L o fragmento del mismo.
Como se usa en los conceptos 1 a 83 aquí, “mantiene” o “manteniendo”, con respecto a un nivel o una proporción, puede describirse como sustancialmente constante. Un nivel sustancialmente constante puede estar dentro del 30% de varianza entre muestras. En una realización, un nivel sustancialmente constante está dentro del 20% de varianza entre muestras. En una realización, un nivel sustancialmente constante está dentro del 15 % de varianza entre muestras, tal como dentro del 10% de varianza entre muestras, por ejemplo dentro del 5% de varianza entre muestras. En otra realización, un nivel sustancialmente constante es aquel que no muestra un cambio de nivel estadísticamente significativo. En una realización, un nivel sustancialmente constante es aquel que alcanza el nivel de confianza del 95% (por ejemplo, mayor que 97% o mayor que 99%). “Estadísticamente significativo” puede ser como se define anteriormente en el concepto 28 aquí.
Concepto 43. Un método según el concepto 42, en el que al menos se mantiene el nivel de dichas células Tn, al tiempo que los niveles de dichas células Tscm disminuyen en dicha muestra, opcionalmente en el que la muestra es de un sujeto.
Concepto 44. Un método según uno cualquiera de los conceptos 2 a 8, 10, 16, 20, 21,23 a 39, 42 o 43, un agente o un anticuerpo o fragmento del mismo para el uso según cualquiera de los conceptos 12, 17, 20, 21 o 23 a 25, el uso según uno cualquiera de los conceptos 13, 14, 18 a 20 o 23 a 25, o la composición según el concepto 15, en el que el agente (por ejemplo, el anticuerpo o fragmento del mismo) reduce la proporción de células Tscm CD45RA+CCR7+CD95+OX40+ (por ejemplo, agota o disminuye el nivel de células Tscm).
Concepto 45. Un método o fragmento del mismo según uno cualquiera de los conceptos 1 a 8, 10, 16, 20, 21,23 a 39 o 42 a 44, un agente o un anticuerpo o fragmento del mismo para el uso según uno cualquiera de los conceptos 12, 17, 20, 21,23 a 25 o 44, el uso según uno cualquiera de los conceptos 13, 14, 18 a 20 o 23 a 25 o 44, o la composición según el concepto 15 o el concepto 44, en el que el agente (por ejemplo, el anticuerpo o fragmento del mismo) mantiene las células Tn CD45RA+CCR7+CD95-.
Concepto 46. Un método según el concepto 42 o 45, un agente o un anticuerpo o fragmento del mismo para el uso según el concepto 45, el uso según el concepto 45, o la composición según el concepto 45, en el que las células Tn se mantienen a un nivel no menor que 50% del nivel de dichas células Tn en una muestra de un donante sano o de dicho sujeto antes del inicio de la enfermedad.
El donante sano es preferiblemente de la misma especie que el sujeto; por ejemplo, cuando el sujeto es un ser humano, lo más preferible el donante también es un ser humano. El donante también es preferiblemente del mismo género que el sujeto. El donante es preferiblemente de una edad y etnia similares a las del sujeto.
Concepto 47. Un método, un agente o un anticuerpo o fragmento para el uso, un uso o una composición según el concepto 46, en el que las células Tn se mantienen a un nivel no menor que 55 % (tal como no menor que 60%, por ejemplo no menor que 65%, por ejemplo no menor que 70%).
Concepto 48. Un método, un agente o un anticuerpo o fragmento para el uso, un uso o una composición según el concepto 47, en el que las células Tn se mantienen a un nivel menor que 75 % (tal como no menor que 80%, por ejemplo no menor que 85%, por ejemplo no menor que 90%)
Concepto 49. Un método según uno cualquiera de los conceptos 1 a 8, o 42 a 48, un agente o un anticuerpo o fragmento del mismo para el uso según uno cualquiera de los conceptos 44 a 48, el uso según uno cualquiera de los conceptos 38 a 41, o la composición según uno cualquiera de los conceptos 44 a 48, en el que las células Tscm se agotan o disminuyen a un nivel menor que 50% del nivel de dichas células Tscm en una muestra de un donante sano o de dicho sujeto antes del inicio de la enfermedad.
Concepto 50. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, un uso o una composición según el concepto 49, en el que las células Tscm se agotan o disminuyen a un nivel menor que 45% (tal como menor que 40%, por ejemplo menor que 35%, por ejemplo menor que 30% o menor que 25%).
Concepto 51. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, un uso o una composición según el concepto 50, en el que las células Tscm se agotan o disminuyen a un nivel menor que 20% (tal como menor que 15%, por ejemplo menor que 10%.
Concepto 52. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, un uso o una composición según cualquier concepto anterior, en el que el anticuerpo o fragmento es un anticuerpo o fragmento empobrecido que se une específicamente a OX40 (en particular, OX40 humano), opcionalmente en el que el anticuerpo está diseñado para ADC, ADCC y/o CDC mejoradas.
La potencia de los efectos mediados por Fc puede mejorarse manipulando el dominio Fc mediante diversas técnicas establecidas. Dichos métodos aumentan la afinidad por ciertos receptores Fc, creando así diversos perfiles potenciales de potenciación de la activación. Esto se puede lograr mediante la modificación de uno o varios restos de aminoácidos (por ejemplo, como se describe en Lazar et al., 2006, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 14 de marzo; 103(11) :4005-10.), o alterando el perfil de glicosilación natural del dominio Fc, por ejemplo generando variantes subfucosiladas o desfucosiladas (como se describe en Natsume et al., 2009, Drug Des Devel Ther., 3:7-16). Por ejemplo, para aumentar la ADCC, los restos en la región bisagra se pueden alterar para aumentar la unión a Fc-gamma RIII (véase, por ejemplo, Shields et al, 2001, J Biol Chem., 2 de marzo; 276(9):6591-604.).
Del mismo modo, la mejora de CDC puede lograrse mediante cambios de aminoácidos que aumentan la afinidad por C1q, el primer componente de la cascada clásica de activación del complemento (véase Idusogie et al., J. Immunol., 2001 ;166:2571-2575). Otro enfoque es crear un dominio Fc quimérico creado a partir de segmentos IgG1 humanos e IgG3 humanos que explota la mayor afinidad de IgG3 por C1q (Natsume et al., 2008, Cancer Res., 68: 3863-3872).
El anticuerpo puede ser un anticuerpo dirigido (tal como un anticuerpo anti-OX40 o anti-OX40L), que muestra sus efectos a través de una toxina, a la que se puede conjugar el anticuerpo. Tales toxinas exterminarán o eliminarán selectivamente la célula a la que están dirigidas. Los inmunoconjugados adecuados se describen en la página 90, y en las páginas 114 a 118 y 134 (en particular, en las páginas 114 a 116) aquí.
Por lo tanto, en una realización, el anticuerpo o fragmento del mismo está desfucosilado. En otra realización, el anticuerpo o fragmento del mismo contiene una o más mutaciones en la región bisagra o Fc que potencia la funcionalidad de ADCC y/o CDC.
Los métodos para determinar el agotamiento y/o la funcionalidad de ADCC y/o CDC pueden ser como se describen aquí, o bien conocidos por los expertos en la técnica.
Los anticuerpos OX40 pueden ser como se describen en el documento WO2014/148895 (Biocerox Products & Janssen Pharmaceuticals; véanse las reivindicaciones en las páginas 138 a 139 para secuencias específicas), el documento WO2013/068563 (Biocerox Products & Janssen Pharmaceuticals; véanse las reivindicaciones en las páginas 138 a 139 para secuencias específicas), los documentos WO2013/130102 y WO2013/119202 (Providence Health & Services - Oregon, véase mAb 9B12 como se describe en Weinberg, A.D., et al., J. Immunother., 29, 575­ 585 (2006), y fusiones con IL-2), el documento WO2013/038191 (Bioceros B.V.; véanse las reivindicaciones 4 a 11 para secuencias de anticuerpos específicas), el documento WO2013/028231 (Board of Regents, the University of Texas System; véanse las reivindicaciones 1 a 12 para secuencias de anticuerpos específicas), el documento WO2013/008171 (Glenmark Pharmaceuticals S.A.; véanse las reivindicaciones 1, 2, 5 a 12, 16 a 21 y 28 a 29 para secuencias de anticuerpos específicas), el documento WO2012/027328 (Board of Regents, the University of Texas System; véanse las reivindicaciones 1 a 11 para secuencias de anticuerpos específicas), el documento WO2010/096418 (UCB Pharma S.A.; véanse las reivindicaciones 1 a 9 y 11 a 14 para secuencias de anticuerpos específicas), el documento WO2009/079335 (Medarex, Inc & Pfizer, Inc; véanse las reivindicaciones 1 a 9 y 14 a 17 para secuencias de anticuerpos específicas), el documento WO2008/106116 (Genentech, Inc; véanse las reivindicaciones 1 a 12 para secuencias de anticuerpos específicas), el documento WO2007/062245 (Kirin Beer Kabushiki Kaisha & La Jolla Institute for Allergy and Immunology; véase la reivindicación 12 para los números de depósito de anticuerpos específicos, y la reivindicación 16 para las secuencias de anticuerpos específicas), el documento WO03/106498 (Crucell Holland B.V.; véanse las reivindicaciones 3 y 4 para conocer las secuencias de anticuerpos específicas).
Más generalmente, los anticuerpos anti-OX40 se describen en los documentos WO99/42585, WO95/21251, WO95/21915 y WO95/12673.
Concepto 53. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, un uso o una composición según cualquier concepto anterior, en el que el anticuerpo es un anticuerpo antagonista o bloqueante.
Los métodos para determinar el antagonismo o la funcionalidad de bloqueo pueden ser los descritos aquí, o bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las técnicas in vitro incluyen SPR y/o ELISA, que se describen en otra parte aquí.
Concepto 54. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, un uso o una composición según el concepto 53, en el que el anticuerpo se une específicamente a OX40L (en particular, OX40L humano).
Los anticuerpos OX40L pueden ser cualquier anticuerpo o fragmento como se describe aquí. En una realización, el anticuerpo OX40L es el anticuerpo antagonista anti-OX40L humano (gp34) ik-1 descrito por Matsumura et al., J Immunol. (1999), 163:3007.
Concepto 55. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, un uso o una composición según el concepto 56, en el que el anticuerpo antagoniza la unión específica de OX40 a OX40L, por ejemplo según lo determinado usando SPR o ELISA.
Los métodos SPR y ELISA pueden ser como se describe en otra parte aquí.
Concepto 56. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, un uso o una composición según cualquier concepto anterior, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado, humano o completamente humano.
Otras construcciones de anticuerpos pueden ser como se describe aquí.
Concepto 57. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, un uso o una composición según cualquier concepto anterior, en el que el anticuerpo es un fragmento de un anticuerpo seleccionado de la lista de anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), intracuerpos, anticuerpos Fv monocatenarios (scFv), anticuerpos camelizados, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), Fv enlazados por disulfuro (sdFv), anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id), y fragmentos de unión a epítopo de los mismos.
Concepto 58. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, un uso o una composición según cualquier concepto anterior, en el que el anticuerpo o fragmento permite más del 80% de quimerismo de donantes de células madre para el día 12 en un modelo de macaco Rhesus de trasplante de células madre hematopoyéticas haploidénticas.
Concepto 59. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, un uso o una composición según cualquier concepto anterior, en el que el anticuerpo o fragmento se expresa como un conjunto transfectado de forma estable en Lonza GS-XceedTM a un nivel mayor que 1,5 g/l en un cultivo de sobrecrecimiento alimentado por lotes utilizando el sistema de alimentación Lonza versión 8 con un período de sobrecrecimiento de 14 días.
Concepto 60. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, un uso o una composición según cualquier concepto anterior, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una HCDR3 de 16 a 27 aminoácidos y derivada de la recombinación de un segmento génico VH humano, un segmento génico D humano y un segmento génico JH humano, en el que el segmento génico JH humano es IGHJ6 (por ejemplo, IGHJ6*02).
Concepto 61. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, un uso o una composición según cualquier concepto anterior, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una HCDR3 seleccionada de:
a. la HCDR3 del anticuerpo 2D10 (Seq ID No: 40 o Seq ID No: 46);
b. la HCDR3 del anticuerpo 10A7 (Seq ID No: 8 o SEQ ID No:14);
c. la HCDR3 del anticuerpo 09H04 (Seq ID No: 72 o Seq ID No: 78);
d. la HCDR3 del anticuerpo 19H01 (Seq ID No: 100 o Seq ID No: 106);
e. una CDR3 de cualquiera de los nanocuerpos descritos en el documento WO2011/073180 (Ablynx, Seq ID Nos: 161 a 167 en el mismo);
f. una HCDR3 de cualquiera de los anticuerpos descritos en el documento WO2006/029879 (Roche/Genentech, Seq ID Nos: 33 a 38 en el mismo); o
g. una HCDR3 de cualquiera de los anticuerpos descritos en el documento US7.812.133 (Genentech, Seq ID Nos: 11 o 12 en el mismo).
Concepto 62. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, un uso o una composición según cualquier concepto anterior, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo comprende:
a. las CDR del anticuerpo 2D10 (Seq ID No:40 o Seq ID No:46 para CDRH3, SEQ ID No:38 o SEQ ID No:44 para CDRH2, SEQ ID No:36 o SEQ ID No:42 para CDRH1, SEQ ID No: 50 o SEQ ID No: 56 para CDRL1, SEQ ID No: 52 o SEQ ID No: 58 para CDRL2, y SEQ ID No: 54 o SEQ ID No: 60 para CDRL3);
b. las CDR del anticuerpo 10A7 (Seq ID No:8 o SEQ ID No:14 para CDRH3, SEQ ID No:6 o SEQ ID No:12 para CDRH2, SEQ ID No:4 o SEQ ID No:10 para CDRH1, SEQ ID No: 18 o SEQ ID No: 24 para CDRL1, SEQ ID No: 20 o SEQ ID No: 26 para CDRL2, y SEQ ID No: 22 o SEQ ID No: 28 para CDRL3);
c. las CDR del anticuerpo 09H04 (Seq ID No:72 o Seq ID No:78 para CDRH3, SEQ ID No:70 o SEQ ID No:76 para CDRH2, SEQ ID No:68 o SEQ ID No:74 para CDRH1, SEQ ID No: 82 o SEQ ID No: 88 para CDRL1, SEQ ID No: 84 o SEQ ID No: 90 para CDRL2, y SEQ ID No: 86 o SEQ ID No: 92 para CDRL3);
d. las CDR del anticuerpo 19H01 (Seq ID No: 100 o Seq ID No: 106 para CDRH3, SEQ ID No: 98 o SEQ ID No: 104 para CDRH2, SEQ ID No: 96 o SEQ ID No: 102 para CDRH1, SEQ ID No: 110 o SEQ ID No: 116 para CDRL1, SEQ ID No: 112 o SEQ ID No: 118 para CDRL2, y SEQ ID No: 114 o SEQ ID No: 120 para CDRL3);
e. las CDR de cualquiera de los nanocuerpos descritos en el documento WO2011/073180 (Ablynx: Seq ID Nos: 161 a 167 en el mismo para CDR3; Seq iD Nos: 147 a 153 en el mismo para CDR2; y Seq ID Nos: 133 a 139 en el mismo para CDR1);
f. las CDR de cualquiera de los anticuerpos descritos en el documento WO2006/029879 (Roche/Genentech: Seq ID Nos: 33 a 38 en el mismo para CDRH3; Seq ID Nos: 21 a 25 en el mismo para CDRH1, y Seq ID Nos: 26 a 32 en el mismo para CDRH2; s Eq ID NO: 39 a 44 en el mismo para CDRL1; s Eq ID NO: 45 a 50 en el mismo para CDRL2, y SEQ ID NO: 51 a 57 en el mismo para CDRL3); o
g. las CDR de cualquiera de los anticuerpos descritos en el documento US7.812.133 (Genentech: Seq ID Nos: 11 o 12 en el mismo para CDRH3; Seq ID Nos: 7 u 8 en el mismo para CDRH1 y Seq Id Nos: 9 o 10 en el mismo para CDRH2; SEQ ID NO: 1 o 2 en el mismo para CDRL1; SEQ ID NO: 3 o 4 en el mismo para CDRL2, y SEQ ID NO: 5 o 6 en el mismo para CDRL3).
Concepto 63. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, un uso o una composición según cualquier concepto anterior, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo comprende los dominios VH y/o VL seleccionados de los siguientes:
a. los dominios VH y/o VL del anticuerpo 2D10 (Seq ID No: 34 para VH y/o Seq ID No: 48 para VL);
b. los dominios VH y/o VL del anticuerpo 10A7 (Seq ID No: 2 para VH y/o Seq ID No: 16 para VL);
c. los dominios VH y/o VL del anticuerpo 09H04 (Seq ID No: 66 para VH y/o Seq ID No: 80 para VL);
d. los dominios VH y/o VL del anticuerpo 19H01 (Seq ID No: 94 para VH y/o Seq ID No: 108 para VL);
e. un dominio VH de cualquiera de los nanocuerpos descritos en el documento WO2011/073180 (Ablynx, Seq ID Nos: 177 a 185, 199 a 226 [reproducidas aquí como Seq ID Nos: 177 a 213]);
f. los dominios VH y/o VL de cualquiera de los anticuerpos descritos en el documento WO2006/029879 (Roche/Genentech, Seq ID Nos: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 17, 19 y 20 para los dominios VH; y Seq ID Nos: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 16 y 18 para los dominios VL [reproducidas aquí como Seq ID Nos: 214 a 230]); o
g. los dominios VH y/o VL de cualquiera de los anticuerpos descritos en el documento US7.812.133 (Genentech, Seq ID Nos: 15 y 16 para los dominios VH; y Seq ID Nos: 13 y 14 para los dominios VL [reproducidas aquí como Seq ID Nos: 231 a 234]).
Concepto 64. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, un uso o una composición según cualquier concepto anterior, en el que el anticuerpo es oxelumab.
Concepto 65. Un método, un agente o un anticuerpo o fragmento para el uso, un uso o una composición según cualquier concepto anterior, en el que las células Tscm y/o las células Tn son CD4+.
En otra realización, las células Tscm y/o las células Tn son CD8+.
Concepto 66. Un método, un agente o un anticuerpo o fragmento para el uso, un uso o una composición según el concepto 64, en el que las células Tscm y/o las células Tn son células T circulantes.
Concepto 67. Un método, un agente o un anticuerpo o fragmento para el uso, un uso o una composición según el concepto 65, en el que las células Tscm y/o las células Tn están en una muestra de sangre, por ejemplo sangre periférica.
Mientras que las células T presentes en la sangre son relativamente sencillas de aislar y caracterizar, las células T que están presentes en los tejidos de un sujeto son generalmente más difíciles de aislar. Dicho esto, puede ser posible aislar las células T de diversos tejidos (tales como la piel, los tejidos del tracto gastrointestinal, por ejemplo el intestino, y de las articulaciones inflamadas, por ejemplo sinovio)
Concepto 68. Un método según uno cualquiera de los conceptos 9 a 11, 16, 20 a 39 o 43 a 67, un agente o un anticuerpo o fragmento para el uso según uno cualquiera de los conceptos 12, 17, 20, 21,23 a 25 o 44 a 67, un uso según uno cualquiera de los conceptos 13, 14, 18 a 20 o 23 a 25 o 44 a 67, o una composición según uno cualquiera de los conceptos 15 o 44 a 67, en el que el sujeto es un paciente humano.
Concepto 69. Un método, un agente o un anticuerpo o fragmento para el uso, un uso o una composición según el concepto 68, en el que el sujeto está en riesgo de padecer una enfermedad o afección mediada por Tscm.
Concepto 70. Un método, un agente o un anticuerpo o fragmento para el uso, un uso o una composición según el concepto 68, en el que el sujeto tiene una enfermedad o afección mediada por Tscm.
Concepto 71. Un método, un agente o un anticuerpo o fragmento para el uso, un uso o una composición según cualquier concepto anterior, en el que la enfermedad o afección mediada por Tscm está mediada por células Tscm CD45RA+CCR7+CD95+OX40+.
Concepto 72. Un método, un agente o un anticuerpo o fragmento para el uso, un uso o una composición según uno cualquiera de los conceptos 68 a 70, en el que la enfermedad o afección mediada por Tscm se caracteriza por tener una relación de células Tscm CD45RA+CCR7 CD95+OX40+:células Tn CD45RA+CCR7+CD95- mayor que 50:50. En otra realización, la enfermedad o afección se caracteriza por tener una relación de células Tscm:células Tn como se establece en cualquiera de los conceptos 23 a 25.
Concepto 73. Un método, un agente o un anticuerpo o fragmento para el uso, un uso o una composición según el concepto 72, en el que la enfermedad o afección mediada por Tscm se caracteriza por tener una relación de Tscm:Tn mayor que 60:40, o mayor que 70:30, o mayor que 75:25, tal como mayor que 70:30.
Concepto 74. Un método, un agente o un anticuerpo o fragmento para el uso, un uso o una composición según el concepto 73, en el que la enfermedad o afección mediada por Tscm se caracteriza por tener una relación de Tscm:Tn mayor que 80:20, o mayor que 85:15, por ejemplo mayor que 90:10, por ejemplo mayor que 95:5.
Concepto 75. Un método, un agente o un anticuerpo o fragmento para el uso, un uso o una composición según cualquier concepto anterior, en el que la enfermedad o afección mediada por Tscm se selecciona de una enfermedad autoinmune, VIH-1 y una neoplasia maligna de células T.
Concepto 76. Un método, un agente o un anticuerpo o fragmento para el uso, un uso o una composición según el concepto 75, en el que la enfermedad o afección mediada por Tscm se selecciona de EICH, rechazo de trasplante, psoriasis, artritis reumatoide, lupus sistémico eritematoso, esclerosis múltiple, dermatomiositis juvenil, linfoma de células T y leucemia de células T.
Concepto 77. Un método, un agente o un anticuerpo o fragmento para el uso, un uso o una composición según el concepto 76, en el que la enfermedad o afección mediada por Tscm es EICH o rechazo de trasplante.
Concepto 78. Un método, un agente o un anticuerpo o fragmento para el uso, un uso o una composición según el concepto 76, en el que el trasplante es un trasplante de células, tejidos u órganos (por ejemplo, hígado, pulmón, corazón, riñón o intestino), o un trasplante de sangre (por ejemplo, autólogo o alogénico), por ejemplo cuando la sangre deriva de la médula ósea, deriva de la sangre del cordón (umbilical), o deriva de sangre periférica.
En una realización, el trasplante es un trasplante de células T con CAR (receptor de antígeno quimérico).
Concepto 79. Un método, un agente o un anticuerpo o fragmento para el uso, un uso o una composición según el concepto 76, en el que la enfermedad o afección mediada por Tscm es un linfoma de células T seleccionado de linfoma no Hodgkin de células T, linfoma periférico de células T (PTCL), linfoma anaplásico de células grandes (ALCL), linfoma angioinmunoblástico, linfoma cutáneo de células T, leucemia/linfoma de células T en adultos, linfoma blástico de células NK, linfoma de células T de tipo enteropatía, linfoma de células T gamma-delta hematoesplénico, linfoma linfoblástico (T-LBL), y linfoma nasal de células T/NK.
Concepto 80. Un método, un agente o un anticuerpo o fragmento para el uso, un uso o una composición según el concepto 76, en el que la enfermedad o afección mediada por Tscm es una leucemia de células T seleccionada de la leucemia linfocítica granular grande (LGLL), leucemia prolinfocítica de células T (T-PLL), leucemia linfoblástica aguda de células T (T-ALL), y síndrome de Sezary.
Concepto 81. Un método, un agente o un anticuerpo o fragmento para el uso, un uso o una composición según cualquier concepto anterior, que comprende además administrar al ser humano un agente terapéutico adicional, opcionalmente en el que el agente terapéutico adicional se selecciona independientemente del grupo que consiste en rapamicina (sirolimus), tacrolimus, ciclosporina, corticosteroides (por ejemplo, metilprednisolona), metotrexato, micofenolato mofetilo, anticuerpos anti-CD28, anticuerpos anti-IL12/IL-23 (por ejemplo, ustekinumab), anticuerpos anti-CD20 (por ejemplo, rituximab), anticuerpos anti-CD30 (por ejemplo, brentuximab), moléculas CTLA4-Fc (por ejemplo, abatacept), antagonistas del receptor CCR5 (por ejemplo, maraviroc), anticuerpos anti-CD40L, anticuerpos anti-VLA4 (por ejemplo, natalizumab), anticuerpos anti-LFA1, fludarabina, anticuerpos anti-CD52 (por ejemplo, alemtuzumab), anticuerpos anti-CD45, ciclofosfamida, globulinas antitimocitos, anticuerpos anti-C5 del complemento (por ejemplo, eculizumab), anticuerpos anti-integrina a4b7 (por ejemplo, vedolizumab), anticuerpos anti-IL6 (por ejemplo, tocilizumab), anticuerpos anti-IL2R (por ejemplo, basilixumab), anticuerpos anti-CD25 (por ejemplo, daclizumab), moléculas anti-TNFa/TNFa-Fc (por ejemplo, etanercept, adalimumab, infliximab, golimumab o certolizumab pegol) y Vorinostat, en particular rapamicina (sirolimus), tacrolimus, ciclosporina, corticosteroides (por ejemplo, metilprednisolona), metotrexato, micofenolato mofetilo, anticuerpos anti-CD28, moléculas CTLA4-Fc (por ejemplo, abatacept), anticuerpos anti-CD40L, anticuerpos anti-LFA1, anticuerpos anti-CD52 (por ejemplo, alemtuzumab), ciclofosfamida, y globulinas antitimocito.
En una realización, el agente terapéutico adicional se selecciona independientemente del grupo que consiste en inhibidores de calcineurina (por ejemplo, tacrolimus, ciclosporina), inhibidores de mTOR (por ejemplo, rapamicina (sirolimus)), y agentes antiproliferativos (por ejemplo, micofenolato mofetilo, ciclofosfamida).
En una realización, el agente terapéutico adicional se selecciona independientemente del grupo que consiste en inmunosupresores que modulan la señalización de IL-2 (por ejemplo, tacrolimus, ciclosporina, rapamicina (sirolimus), y anticuerpos anti-CD25 (por ejemplo, basilixumab, daclizumab).
En una realización, el agente terapéutico adicional es rapamicina (sirolimus). En otra realización, el agente terapéutico adicional es tacrolimus. En otra realización, el agente terapéutico adicional es una combinación de tacrolimus y metotrexato. En otra realización, el agente terapéutico adicional es ciclosporina. En otra realización, el agente terapéutico adicional es una combinación de ciclosporina y metotrexato. En otra realización, el agente terapéutico adicional es ciclofosfamida. En otra realización, el agente terapéutico adicional es micofenolato mofetilo.
Concepto 82. Un método, un agente o un anticuerpo o fragmento para el uso, un uso o una composición según cualquier concepto anterior, que comprende además administrar al ser humano una cantidad terapéuticamente eficaz de rapamicina.
Concepto 83. Un método, un agente o un anticuerpo o fragmento para el uso, un uso o una composición según cualquier concepto anterior, que comprende además administrar al ser humano una cantidad terapéuticamente eficaz de tacrolimus.
Los inventores han encontrado sorprendentemente que un anticuerpo anti-OX40L puede proporcionar efectos sinérgicos cuando se administra como parte de una terapia de combinación con otro agente terapéutico. Con ese fin, se proporcionan conceptos adicionales a continuación:
Concepto 101. Un anticuerpo anti-OX40L o fragmento del mismo para uso en el tratamiento o la reducción del riesgo de una enfermedad o afección mediada por OX40L en un sujeto, en combinación con otro agente terapéutico seleccionado independientemente del grupo que consiste en rapamicina (sirolimus), tacrolimus, ciclosporina, corticosteroides (por ejemplo, metilprednisolona), metotrexato, micofenolato mofetilo, anticuerpos anti-CD28, anticuerpos anti-IL12/IL-23 (por ejemplo, ustekinumab), anticuerpos anti-CD20 (por ejemplo, rituximab), anticuerpos anti-CD30 (por ejemplo, brentuximab), moléculas CTLA4-Fc (por ejemplo, abatacept), antagonistas del receptor CCR5 (por ejemplo, maraviroc), anticuerpos anti-CD40L, anticuerpos anti-VLA4 (por ejemplo, natalizumab), anticuerpos anti-LFA1, fludarabina, anticuerpos anti-CD52 (por ejemplo, alemtuzumab), anticuerpos anti-CD45, ciclofosfamida, globulinas antitimocitos, anticuerpos anti-C5 del complemento (por ejemplo, eculizumab), anticuerpos anti-integrina a4b7 (por ejemplo, vedolizumab), anticuerpos anti-IL6 (por ejemplo, tocilizumab), anticuerpos anti-IL2R (por ejemplo, basilixumab), anticuerpos anti-CD25 (por ejemplo, daclizumab), moléculas anti-TNFa/TNFa-Fc (por ejemplo, etanercept, adalimumab, infliximab, golimumab o certolizumab pegol) y Vorinostat.
Concepto 102. Uso de un anticuerpo anti-OX40L o fragmento del mismo para el tratamiento o prevención de una enfermedad o afección mediada por OX40L en un sujeto, en combinación con otro agente terapéutico seleccionado independientemente del grupo que consiste en rapamicina (sirolimus), tacrolimus, ciclosporina, corticosteroides (por ejemplo, metilprednisolona), metotrexato, micofenolato mofetilo, anticuerpos anti-CD28, anticuerpos anti-IL12/IL-23 (por ejemplo, ustekinumab), anticuerpos anti-CD20 (por ejemplo, rituximab), anticuerpos anti-CD30 (por ejemplo, brentuximab), moléculas CTLA4-Fc (por ejemplo, abatacept), antagonistas del receptor CCR5 (por ejemplo, maraviroc), anticuerpos anti-CD40L, anticuerpos anti-VLA4 (por ejemplo, natalizumab), anticuerpos anti-LFA1, fludarabina, anticuerpos anti-CD52 (por ejemplo, alemtuzumab), anticuerpos anti-CD45, ciclofosfamida, globulinas antitimocitos, anticuerpos anti-C5 del complemento (por ejemplo, eculizumab), anticuerpos anti-integrina a4b7 (por ejemplo, vedolizumab), anticuerpos anti-IL6 (por ejemplo, tocilizumab), anticuerpos anti-IL2R (por ejemplo, basilixumab), anticuerpos anti-CD25 (por ejemplo, daclizumab), moléculas anti-TNFa/TNFa-Fc (por ejemplo, etanercept, adalimumab, infliximab, golimumab o certolizumab pegol) y Vorinostat.
Concepto 103. Uso de un anticuerpo anti-OX40L o fragmento del mismo en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad o afección mediada por OX40L en un sujeto, en combinación con otro agente terapéutico seleccionado independientemente del grupo que consiste en rapamicina (sirolimus), tacrolimus, ciclosporina, corticosteroides (por ejemplo, metilprednisolona), metotrexato, micofenolato mofetilo, anticuerpos anti-CD28, anticuerpos anti-IL12/IL-23 (por ejemplo, ustekinumab), anticuerpos anti-CD20 (por ejemplo, rituximab), anticuerpos anti-CD30 (por ejemplo, brentuximab), moléculas CTLA4-Fc (por ejemplo, abatacept), antagonistas del receptor CCR5 (por ejemplo, maraviroc), anticuerpos anti-CD40L, anticuerpos anti-VLA4 (por ejemplo, natalizumab), anticuerpos anti-LFA1, fludarabina, anticuerpos anti-CD52 (por ejemplo, alemtuzumab), anticuerpos anti-CD45, ciclofosfamida, globulinas antitimocitos, anticuerpos anti-C5 del complemento (por ejemplo, eculizumab), anticuerpos anti-integrina a4b7 (por ejemplo, vedolizumab), anticuerpos anti-IL6 (por ejemplo, tocilizumab), anticuerpos anti-IL2R (por ejemplo, basilixumab), anticuerpos anti-CD25 (por ejemplo, daclizumab), moléculas anti-TNFa/TNFa-Fc (por ejemplo, etanercept, adalimumab, infliximab, golimumab o certolizumab pegol) y Vorinostat.
Concepto 104. Una composición que comprende un anticuerpo anti-OX40L o un fragmento del mismo para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o afección mediada por OX40L en un sujeto, en combinación con otro agente terapéutico seleccionado independientemente del grupo que consiste en rapamicina (sirolimus), tacrolimus, ciclosporina, corticosteroides (por ejemplo, metilprednisolona), metotrexato, micofenolato mofetilo, anticuerpos anti-CD28, anticuerpos anti-IL12/IL-23 (por ejemplo, ustekinumab), anticuerpos anti-CD20 (por ejemplo, rituximab), anticuerpos anti-CD30 (por ejemplo, brentuximab), moléculas CTLA4-Fc (por ejemplo, abatacept), antagonistas del receptor CCR5 (por ejemplo, maraviroc), anticuerpos anti-CD40L, anticuerpos anti-VLA4 (por ejemplo, natalizumab), anticuerpos anti-LFA1, fludarabina, anticuerpos anti-CD52 (por ejemplo, alemtuzumab), anticuerpos anti-CD45, ciclofosfamida, globulinas antitimocitos, anticuerpos anti-C5 del complemento (por ejemplo, eculizumab), anticuerpos anti-integrina a4b7 (por ejemplo, vedolizumab), anticuerpos anti-IL6 (por ejemplo, tocilizumab), anticuerpos anti-IL2R (por ejemplo, basilixumab), anticuerpos anti-CD25 (por ejemplo, daclizumab), moléculas anti-TNFa/TNFa-Fc (por ejemplo, etanercept, adalimumab, infliximab, golimumab o certolizumab pegol) y Vorinostat.
Concepto 105. Un método para tratar o prevenir una enfermedad o afección mediada por OX40L en un sujeto, que comprende administrar a dicho ser humano una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-OX40L o fragmento del mismo en combinación con otro agente terapéutico seleccionado independientemente del grupo que consiste en rapamicina (sirolimus), tacrolimus, ciclosporina, corticosteroides (por ejemplo, metilprednisolona), metotrexato, micofenolato mofetilo, anticuerpos anti-CD28, anticuerpos anti-IL12/IL-23 (por ejemplo, ustekinumab), anticuerpos anti-CD20 (por ejemplo, rituximab), anticuerpos anti-CD30 (por ejemplo, brentuximab), moléculas CTLA4-Fc (por ejemplo, abatacept), antagonistas del receptor CCR5 (por ejemplo, maraviroc), anticuerpos anti-CD40L, anticuerpos anti-VLA4 (por ejemplo, natalizumab), anticuerpos anti-LFA1, fludarabina, anticuerpos anti-CD52 (por ejemplo, alemtuzumab), anticuerpos anti-CD45, ciclofosfamida, globulinas antitimocitos, anticuerpos anti-C5 del complemento (por ejemplo, eculizumab), anticuerpos anti-integrina a4b7 (por ejemplo, vedolizumab), anticuerpos anti-IL6 (por ejemplo, tocilizumab), anticuerpos anti-IL2R (por ejemplo, basilixumab), anticuerpos anti-CD25 (por ejemplo, daclizumab), moléculas anti-TNFa/TNFa-Fc (por ejemplo, etanercept, adalimumab, infliximab, golimumab o certolizumab pegol) y Vorinostat, en el que de ese modo se trata o previene la enfermedad o afección mediada por OX40L.
En cualquiera de los conceptos aquí, la combinación puede usarse en la prevención de una enfermedad mediada por OX40L. En cualquiera de los conceptos, la combinación puede utilizarse para reducir el riesgo de una enfermedad mediada por OX40L. En cualquiera de los conceptos, la combinación puede utilizarse en el tratamiento de una enfermedad mediada por OX40L.
Una “combinación”, como se describe aquí, puede ser como se define en otra parte aquí, por ejemplo en la página 100, en las páginas 105 a 107, y en las páginas 119 a 120. En una realización, la enfermedad es artritis reumatoide o psoriasis, y el agente terapéutico adicional es un anticuerpo anti-IL-17 (tal como brodalumab, secukinumab e ixekizumab). Las combinaciones se pueden administrar de forma concomitante o secuencial. La administración puede ser vía cualquiera de los métodos descritos aquí, por ejemplo como se describe en la sección titulada “Métodos de administración y dosificación” que comienza en la página 130 aquí.
Como se usa en cualquiera de los conceptos aquí, el “tratamiento” de una enfermedad mediada por OX40L incluye la reducción de uno o más síntomas de dicha enfermedad mediada por OX40L. El tratamiento puede interpretarse como se describe en otra parte aquí, por ejemplo en la página 107, y en la sección titulada “Kits” (que comienza en la página 149, en particular la página 152)
Se puede administrar una intervención farmacológica inmunosupresora en el tratamiento de la EICH asociada con el trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT) para tratar a pacientes con enfermedad confirmada. La clasificación de EICH se puede determinar como se describe a continuación.
En una realización, la administración es profiláctica para reducir el riesgo de una enfermedad mediada por OX40L. Como se usa en los conceptos aquí, “prevención” (o “prevenir” o “previniendo”, y similares) de una enfermedad mediada por OX40L incluye la prevención de uno o más síntomas de dicha enfermedad mediada por OX40L. La prevención puede referirse a la inhibición total o parcial del desarrollo, la recurrencia, la aparición o la propagación de una enfermedad mediada por OX40L y/o un síntoma relacionado con la misma, como resultado de la administración de una combinación de terapias proporcionadas aquí (por ejemplo, una combinación de terapias profilácticas y/o agentes terapéuticos). La prevención puede interpretarse como se describe en otra parte aquí.
Se puede administrar una intervención farmacológica inmunosupresora en el tratamiento de la EICH asociada con el trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT) para prevenir la enfermedad en pacientes que se sabe que están en riesgo.
Por lo tanto, en una realización, se administra una dosis profilácticamente eficaz antes del inicio de una enfermedad o afección mediada por OX40L. Como se utiliza en los conceptos aquí, se puede determinar que un sujeto está “antes del inicio de una enfermedad o afección mediada por OX40L” si el sujeto no presenta síntomas que convencionalmente se asociarían con dicha enfermedad o afección, o si el sujeto no se diagnosticaría con tal enfermedad o afección por cualquier método convencional. En otra realización, la administración que es anterior a la aparición de la enfermedad puede denominarse “tratamiento preventivo”, que se refiere al uso de agentes terapéuticos adicionales (tales como agentes inmunosupresores) y/o un anticuerpo anti-OX40L de la invención en individuos en riesgo de desarrollar la enfermedad y en los que puede haber signos tempranos de que es inminente la aparición de EICH clínicamente relevante. Por ejemplo, un biomarcador sérico o celular experimental o predictivo puede indicar el momento óptimo para iniciar el tratamiento preventivo de la EICH.
Por ejemplo, la presencia de signos y síntomas de EICH aguda en un ser humano puede clasificarse por etapas y clasificarse según una escala estandarizada, tal como la descrita en Przepiorka et al. En un primate, tal como un mono macaco rhesus, la presencia de signos y síntomas de EICH aguda puede clasificarse por etapas y clasificarse según una escala estandarizada tal como la que se describe en el Ejemplo 7. También se usan escalas de clasificación de enfermedades similares en el uso clínico rutinario para otras enfermedades relevantes, tales como artritis reumatoide y enfermedades inflamatorias del intestino.
“Prevención” o “profilaxis” puede ser como se describe en el aspecto 94 aquí, con dosis y tiempos de administración del anticuerpo anti-OX40L como se describe. Se puede usar un agente profiláctico en cualquiera de los métodos descritos en las páginas 102 a 103.
Las enfermedades o afecciones mediadas por OX40L pueden ser cualquiera de las enfermedades o afecciones mencionadas aquí, incluyendo las que se definen en otra parte aquí como enfermedades o afecciones mediadas por Tscm (véanse los conceptos 75 a 80 anteriores). En una realización, las enfermedades o afecciones mediadas por OX40L son como se describen en cualquiera de los aspectos 12, 12a, 69, 69a, 71,72, 72a, 90 a 93 como se describe aquí. En una realización, las enfermedades o afecciones mediadas por OX40L son como se describen en cualquiera de los aspectos 12, 12a, 69, 69a, 71, 72, 72a, 90 a 93 como se describe aquí. En una realización, la enfermedad o afección mediada por OX40L es una enfermedad o afección mediada por hOX40L como se describe aquí, por ejemplo en las páginas 103 a 104, o en la página 131. En otra realización, las enfermedades o afecciones mediadas por OX40L son como se describe en la sección titulada “Métodos de administración y dosificación” que comienza en la página 130 aquí. En una realización preferida, la enfermedad o afección es EICH o rechazo de trasplante, en particular EICH. En otra realización, la enfermedad o afección mediada por OX40L es la enfermedad de Chron. En otra realización, la enfermedad o afección mediada por OX40L es la enfermedad inflamatoria intestinal (EII). En otra realización, la enfermedad o afección mediada por OX40L es la colitis ulcerosa. En otra realización, la enfermedad o afección mediada por OX40L es la psoriasis.
En cualquiera de los conceptos descritos aquí, el anticuerpo anti-OX40L y/o el agente terapéutico adicional se administran al sujeto. La administración puede ser por cualquier método descrito aquí, por ejemplo como se describe en la página 93, o en las secciones tituladas “Composiciones farmacéuticas” y “Métodos de administración” que comienzan en las páginas 118 y 130 respectivamente. En una realización, el anticuerpo anti-OX40L de la invención se administra por vía intravenosa. En una realización, el anticuerpo anti-OX40L de la invención se administra por vía subcutánea.
En una realización, el agente terapéutico adicional es rapamicina (sirolimus), y se administra por vía oral. En una realización, el agente terapéutico adicional es tacrolimus, y se administra por vía oral. En una realización, el agente terapéutico adicional es metotrexato, y se administra por vía oral y/o intravenosa. En una realización, el agente terapéutico adicional es ciclosporina, y se administra por vía intravenosa y/u oral. En una realización, el agente terapéutico adicional es ciclofosfamida, y se administra por vía intravenosa y/u oral. En una realización, el agente terapéutico adicional es metilprednisolona, y se administra por vía oral y/o intravenosa.
Concepto 106. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, una composición para el uso, o el uso según uno cualquiera de los conceptos 101 a 105, en el que el sujeto tiene un tiempo de supervivencia post-tratamiento o post­ profilaxis de al menos 14 días, o al menos 21 días, o al menos 28 días, o al menos 40 días, o al menos 50 días, o al menos 60 días.
Concepto 107. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, una composición para el uso, o el uso según uno cualquiera de los conceptos 101 a 105, en el que, después de la profilaxis, el sujeto está al menos 7 días, o al menos 14 días, o al menos 21 días, o al menos 28 días, o al menos 40 días, o al menos 50 días, o al menos 60 días libre de la enfermedad.
Concepto 108. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, una composición para el uso, o el uso según uno cualquiera de los conceptos 101 a 105, en el que, después del tratamiento, el sujeto está al menos 7 días, o al menos 14 días, o al menos 21 días, o al menos 28 días, o al menos 40 días, o al menos 50 días, o al menos 60 días sin progresión de la enfermedad.
Concepto 109. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, una composición para el uso, o el uso según uno cualquiera de los conceptos 106 a 108, en el que el número de días de supervivencia, el número de días libres de la enfermedad, o el número de días sin progresión de la enfermedad es al menos 2 meses, o al menos 3 meses, o al menos 4 meses, por ejemplo al menos 5 meses, tal como al menos 6 meses.
Concepto 110. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, una composición para el uso, o el uso según el concepto 109, en el que el número de días de supervivencia, el número de días libres de la enfermedad o el número de días sin progresión de la enfermedad es menos 9 meses, o al menos un año.
Concepto 111. Un método para prevenir la aparición de una enfermedad o afección mediada por OX40L en un sujeto mediante la administración de una cantidad profilácticamente eficaz de un anticuerpo anti-OX40L y la administración de una cantidad profilácticamente eficaz de otro agente terapéutico seleccionado independientemente del grupo que consiste en rapamicina (sirolimus), tacrolimus, ciclosporina, corticosteroides (por ejemplo, metilprednisolona), metotrexato, micofenolato mofetilo, anticuerpos anti-CD28, anticuerpos anti-IL12/IL-23 (por ejemplo, ustekinumab), anticuerpos anti-CD20 (por ejemplo, rituximab), anticuerpos anti-CD30 (por ejemplo, brentuximab), moléculas CTLA4-Fc (por ejemplo, abatacept), antagonistas del receptor CCR5 (por ejemplo, maraviroc), anticuerpos anti-CD40L, anticuerpos anti-VLA4 (por ejemplo, natalizumab), anticuerpos anti-LFA1, fludarabina, anticuerpos anti-CD52 (por ejemplo, alemtuzumab), anticuerpos anti-CD45, ciclofosfamida, globulinas antitimocitos, anticuerpos anti-C5 del complemento (por ejemplo, eculizumab), anticuerpos anti-integrina a4b7 (por ejemplo, vedolizumab), anticuerpos anti-IL6 (por ejemplo, tocilizumab), anticuerpos anti-IL2R (por ejemplo, basilixumab), anticuerpos anti-CD25 (por ejemplo, daclizumab), moléculas anti-TNFa/TNFa-Fc (por ejemplo, etanercept, adalimumab, infliximab, golimumab o certolizumab pegol) y Vorinostat, en el que se previene el inicio de la enfermedad o afección mediada por OX40L.
Por “profilácticamente eficaz” se entiende que la dosis es eficaz para prevenir o reducir el riesgo de una enfermedad o afección mediada por OX40L.
En una realización, la combinación puede usarse para reducir el riesgo de una enfermedad o afección mediada por OX40L. En el concepto 111, el anticuerpo anti-OX40L de la invención y el agente terapéutico adicional pueden administrarse al paciente de manera profiláctica, administración la cual puede ser secuencial o simultánea. Los regímenes de dosificación y los modos de administración pueden ser los que son normales o se administran tradicionalmente por médicos para el agente terapéutico adicional. Los regímenes de dosificación y los modos de administración pueden ser los que son normales o se administran tradicionalmente por médicos para el anticuerpo anti-OX40L de la invención. Sin embargo, se espera que el uso concurrente de ambos agentes dé como resultado una profilaxis mejorada en comparación con cualquiera de los agentes solos.
Concepto 112. Un método para tratar una enfermedad o afección mediada por OX40L en un sujeto mediante la administración de una cantidad profilácticamente eficaz de un anticuerpo anti-OX40L y la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de otro agente terapéutico seleccionado independientemente del grupo que consiste en rapamicina (sirolimus), tacrolimus, ciclosporina, corticosteroides (por ejemplo, metilprednisolona), metotrexato, micofenolato mofetilo, anticuerpos anti-CD28, anticuerpos anti-IL12/IL-23 (por ejemplo, ustekinumab), anticuerpos anti-CD20 (por ejemplo, rituximab), anticuerpos anti-CD30 (por ejemplo, brentuximab), moléculas CTLA4-Fc (por ejemplo, abatacept), antagonistas del receptor CCR5 (por ejemplo, maraviroc), anticuerpos anti-CD40L, anticuerpos anti-VLA4 (por ejemplo, natalizumab), anticuerpos anti-LFA1, fludarabina, anticuerpos anti-CD52 (por ejemplo, alemtuzumab), anticuerpos anti-CD45, ciclofosfamida, globulinas antitimocitos, anticuerpos anti-C5 del complemento (por ejemplo, eculizumab), anticuerpos anti-integrina a4b7 (por ejemplo, vedolizumab), anticuerpos anti-IL6 (por ejemplo, tocilizumab), anticuerpos anti-IL2R (por ejemplo, basilixumab), anticuerpos anti-CD25 (por ejemplo, daclizumab), moléculas anti-TNFa/TNFa-Fc (por ejemplo, etanercept, adalimumab, infliximab, golimumab o certolizumab pegol) y Vorinostat, en el que se trata el inicio de la enfermedad o afección mediada por OX40L.
Por “terapéuticamente eficaz” se entiende que la dosis es eficaz para tratar una enfermedad o afección mediada por OX40L. Eficaz puede ser como se define en las páginas 96 a 97, o en la página 152 aquí, y puede proporcionar concentraciones séricas como se describe en la sección titulada “Composiciones farmacéuticas” que comienza en la página 118 aquí.
En el concepto 112, el anticuerpo anti-OX40L de la invención puede administrarse al paciente, pero a pesar de la profilaxis, se produce la aparición de la enfermedad o afección mediada por OX40L (la aparición puede retrasarse varios días o semanas, en comparación con un paciente que no ha estado recibiendo el anticuerpo de la invención). En este caso, se puede administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de otro agente terapéuti enfermedad o afección.
Concepto 113. Un método para tratar una enfermedad o afección mediada por OX40L en un sujeto mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-OX40L y la administración de una cantidad profilácticamente eficaz de otro agente terapéutico seleccionado independientemente del grupo que consiste en rapamicina (sirolimus), tacrolimus, ciclosporina, corticosteroides (por ejemplo, metilprednisolona), metotrexato, micofenolato mofetilo, anticuerpos anti-CD28, anticuerpos anti-IL12/IL-23 (por ejemplo, ustekinumab), anticuerpos anti-CD20 (por ejemplo, rituximab), anticuerpos anti-CD30 (por ejemplo, brentuximab), moléculas CTLA4-Fc (por ejemplo, abatacept), antagonistas del receptor CCR5 (por ejemplo, maraviroc), anticuerpos anti-CD40L, anticuerpos anti-VLA4 (por ejemplo, natalizumab), anticuerpos anti-LFA1, fludarabina, anticuerpos anti-CD52 (por ejemplo, alemtuzumab), anticuerpos anti-CD45, ciclofosfamida, globulinas antitimocitos, anticuerpos anti-C5 del complemento (por ejemplo, eculizumab), anticuerpos anti-integrina a4b7 (por ejemplo, vedolizumab), anticuerpos anti-IL6 (por ejemplo, tocilizumab), anticuerpos anti-IL2R (por ejemplo, basilixumab), anticuerpos anti-CD25 (por ejemplo, daclizumab), moléculas anti-TNFa/TNFa-Fc (por ejemplo, etanercept, adalimumab, infliximab, golimumab o certolizumab pegol) y Vorinostat, en el que se trata la aparición de la enfermedad o afección mediada por OX40L.
En el concepto 113, el agente terapéutico adicional puede administrarse al paciente, pero a pesar de la profilaxis, se produce la aparición de la enfermedad o afección mediada por OX40L (la aparición puede retrasarse varios días o semanas, en comparación con un paciente que no ha estado recibiendo el agente terapéutico adicional). En este caso, se puede administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-OX40L de la invención para tratar la enfermedad o afección.
Concepto 114. Un método para tratar una enfermedad o afección mediada por OX40L en un sujeto mediante la administración de una cantidad terapéuticamente efricaz de un anticuerpo anti-OX40L y la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de otro agente terapéutico seleccionado independientemente del grupo que consiste en rapamicina (sirolimus), tacrolimus, ciclosporina, corticosteroides (por ejemplo, metilprednisolona), metotrexato, micofenolato mofetilo, anticuerpos anti-CD28, anticuerpos anti-IL12/IL-23 (por ejemplo, ustekinumab), anticuerpos anti-CD20 (por ejemplo, rituximab), anticuerpos anti-CD30 (por ejemplo, brentuximab), moléculas CTLA4-Fc (por ejemplo, abatacept), antagonistas del receptor CCR5 (por ejemplo, maraviroc), anticuerpos anti-CD40L, anticuerpos anti-VLA4 (por ejemplo, natalizumab), anticuerpos anti-LFA1, fludarabina, anticuerpos anti-CD52 (por ejemplo, alemtuzumab), anticuerpos anti-CD45, ciclofosfamida, globulinas antitimocitos, anticuerpos anti-C5 del complemento (por ejemplo, eculizumab), anticuerpos anti-integrina a4b7 (por ejemplo, vedolizumab), anticuerpos anti-IL6 (por ejemplo, tocilizumab), anticuerpos anti-IL2R (por ejemplo, basilixumab), anticuerpos anti-CD25 (por ejemplo, daclizumab), moléculas anti-TNFa/TNFa-Fc (por ejemplo, etanercept, adalimumab, infliximab, golimumab o certolizumab pegol) y Vorinostat, en el que se trata la aparición de la enfermedad o afección mediada por OX40L.
En el concepto 114, tanto el anticuerpo anti-OX40L de la invención como el agente terapéutico adicional no se administran hasta que existen signos clínicos de la enfermedad o afección mediada por OX40L. El tratamiento combinado de ambos agentes puede proporcionar beneficios adicionales en comparación con cualquier agente solo.
Concepto 115. Un método según el concepto 111 o el concepto 113, en el que el agente terapéutico adicional se selecciona independientemente de rapamicina (sirolimus), tacrolimus, una combinación de tacrolimus y metotrexato, ciclofosfamida, ciclosporina y una combinación de ciclosporina y metotrexato.
En una realización, la enfermedad o afección mediada por OX40L es EICH o rechazo de trasplante, particularmente EICH. En una realización, la enfermedad o afección mediada por OX40L es EICH o rechazo de trasplante, particularmente EICH, y el agente terapéutico adicional es rapamicina (sirolimus). En una realización, la enfermedad o afección mediada por OX40L es EICH o rechazo de trasplante, particularmente EICH, y el agente terapéutico adicional es tacrolimus. En una realización, la enfermedad o afección mediada por OX40L es EICH o rechazo de trasplante, particularmente EICH, y el agente terapéutico adicional es una combinación de tacrolimus y metotrexato. En una realización, la enfermedad o afección mediada por OX40L es EICH o rechazo de trasplante, particularmente EICH, y el agente terapéutico adicional es ciclofosfamida. En una realización, la enfermedad o afección mediada por OX40L es EICH o rechazo de trasplante, particularmente EICH, y el agente terapéutico adicional es ciclosporina. En una realización, la enfermedad o afección mediada por OX40L es EICH o rechazo de trasplante, particularmente EICH, y el agente terapéutico adicional es una combinación de ciclosporina y metotrexato. En una realización, la enfermedad o afección mediada por OX40L es EICH o rechazo de trasplante, particularmente EICH, y el agente terapéutico adicional es micofenolato mofetilo.
En una realización, el anticuerpo anti-OX40L se administra a un paciente que ya está recibiendo rapamicina (sirolimus). En otra realización, el anticuerpo anti-OX40L se administra a un paciente que ya está recibiendo tacrolimus. En otra realización, el anticuerpo anti-OX40L se administra a un paciente que ya está recibiendo una combinación de tacrolimus y metotrexato. En otra realización, el anticuerpo anti-OX40L se administra a un paciente que ya está recibiendo una combinación de ciclosporina y metotrexato. En otra realización, el anticuerpo anti-OX40L se administra a un paciente que ya está recibiendo ciclosporina. En otra realización, el anticuerpo anti-OX40L se administra a un paciente que ya está recibiendo ciclofosfamida. En otra realización, el anticuerpo anti-OX40L se administra a un paciente que ya está recibiendo micofenolato mofetilo.
Estos agentes terapéuticos adicionales pueden usarse profilácticamente en el tratamiento de enfermedades o afecciones mediadas por OX40L. Por ejemplo, en la EICH, la terapia preventiva (profilaxis) generalmente se administra alrededor del momento del HSCT, y continúa durante un período de tiempo después del trasplante para mantener la inmunosupresión durante el período de mayor riesgo de desarrollar EICH aguda. Los regímenes de medicamentos específicos difieren entre los centros de trasplante, pero como ejemplo, la profilaxis con inhibidores de la calcineurina, tales como ciclosporina o tacrolimus, o con rapamicina (sirolimus), puede iniciarse dentro del período de 7 días anterior al trasplante (tal como el Día -3 o el Día -1 antes del HSCT), o inmediatamente después del procedimiento de HSCT (por ejemplo, el día 0 o el día 1 después del trasplante). La profilaxis con micofenolato mofetilo normalmente se dosifica después del HSCT, por ejemplo, comenzando entre el Día 1 y el Día 5 después del trasplante. La profilaxis con estos agentes puede continuarse, por ejemplo, entre 28 y 180 días o más después del trasplante, con dosis diarias calculadas para mantener los niveles séricos en el intervalo para lograr una inmunosupresión eficaz sin limitar los efectos secundarios. Además de los inhibidores de la calcineurina, el metotrexato se usa a menudo como complemento de la profilaxis, administrándose típicamente los Días 1, 3, 6 y 11 después del trasplante.
Un anticuerpo anti-OX40L de la invención puede utilizarse como profilaxis en combinación con tacrolimus, ciclosporina, una combinación de tacrolimus y metotrexato, una combinación de ciclosporina y metotrexato, ciclofosfamida, micofenolato mofetilo o rapamicina, en el que la profilaxis con cualquiera de estos agentes se inicia antes o alrededor del momento del HSCT, o inmediatamente después del procedimiento de trasplante, por ejemplo dentro del período de 7 días antes hasta 7 días después del trasplante. A continuación, se puede administrar tacrolimus, ciclosporina o rapamicina a una dosis y una frecuencia terapéuticamente eficaces, por ejemplo diariamente, hasta 180 días después del trasplante. Un anticuerpo anti-OX40L de la invención puede administrarse simultáneamente, comenzando antes o alrededor del momento del HSCT, o inmediatamente después del procedimiento de trasplante, por ejemplo dentro del período de 7 días antes hasta 7 días después del trasplante. El anticuerpo anti-OX40L puede administrarse entonces a una dosis y frecuencia terapéuticamente eficaces, por ejemplo cada dos semanas o mensualmente, hasta 180 días después del trasplante. Bajo estas circunstancias, se esperaría que la actividad combinada del anticuerpo anti-OX40L y el agente profiláctico adicional mostrara un efecto sinérgico en la prevención del inicio y/o la gravedad de la EICH.
Concepto 116. Un método según el concepto 112 o el concepto 114, en el que el agente terapéutico adicional es un corticosteroide (por ejemplo, metilprednisolona).
En una realización, la enfermedad o afección mediada por OX40L es EICH o rechazo de trasplante, en particular EICH. En una realización, la enfermedad o afección mediada por OX40L es EICH o rechazo de trasplante, en particular EICH, y el agente terapéutico adicional es metilprednisolona.
En los casos en los que se produzca una EICH intercurrente (por ejemplo, incluso a pesar de la profilaxis), el tratamiento puede iniciarse inmediatamente después de la confirmación de la enfermedad de EICH de grado II o superior. Los corticosteroides sistémicos, tales como la metilprednisolona, son el tratamiento de elección de primera línea, administrados simultáneamente con la profilaxis continua con, por ejemplo, un inhibidor de la calcineurina tal como ciclosporina o tacrolimus.
Cuando el tratamiento de primera línea o la profilaxis no logran controlar la EICH, se puede intentar una “terapia de rescate”, en cuyo caso se pueden administrar inmunosupresores adicionales no utilizados anteriormente, tales como rapamicina o micofenolato mofetilo. Así, en una realización, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-OX40L de la invención a un paciente refractario a la profilaxis o al tratamiento con cualquiera de: rapamicina, tacrolimus, tacrolimus en combinación con metotrexato, ciclofosfamida, ciclosporina, ciclosporina en combinación con metotrexato, o corticosteroides (por ejemplo, metilprednisolona). En otra realización, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-OX40L de la invención a un paciente refractario a la profilaxis o al tratamiento con cualquiera de los agentes terapéuticos adicionales mencionados aquí. En otra realización, se administra un anticuerpo anti-OX40L de la invención como terapia de rescate.
Concepto 117. Un método para prolongar la supervivencia en un sujeto que tiene o está en riesgo de padecer una enfermedad o afección mediada por OX40L, mediante la administración de una combinación terapéutica o profiláctica de un anticuerpo anti-OX40L y un agente terapéutico adicional seleccionado independientemente del grupo que consiste en rapamicina (sirolimus), tacrolimus, ciclosporina, corticosteroides (por ejemplo, metilprednisolona), metotrexato, micofenolato mofetilo, anticuerpos anti-CD28, anticuerpos anti-IL12/IL-23 (por ejemplo, ustekinumab), anticuerpos anti-CD20 (por ejemplo, rituximab), anticuerpos anti-CD30 (por ejemplo, brentuximab), moléculas CTLA4-Fc (por ejemplo, abatacept), antagonistas del receptor CCR5 (por ejemplo, maraviroc), anticuerpos anti-CD40L, anticuerpos anti-VLA4 (por ejemplo, natalizumab), anticuerpos anti-LFA1, fludarabina, anticuerpos anti-CD52 (por ejemplo, alemtuzumab), anticuerpos anti-CD45, ciclofosfamida, globulinas antitimocitos, anticuerpos anti-C5 del complemento (por ejemplo, eculizumab), anticuerpos anti-integrina a4b7 (por ejemplo, vedolizumab), anticuerpos anti-IL6 (por ejemplo, tocilizumab), anticuerpos anti-IL2R (por ejemplo, basilixumab), anticuerpos anti-CD25 (por ejemplo, daclizumab), moléculas anti-TNFa/TNFa-Fc (por ejemplo, etanercept, adalimumab, infliximab, golimumab o certolizumab pegol) y Vorinostat.
En una realización, la enfermedad o afección mediada por OX40L es EICH o rechazo de trasplante, en particular EICH. Varios factores afectan la gravedad y la progresión de la enfermedad en la EICH, tales como el régimen de acondicionamiento previo al trasplante (por ejemplo, mieloablación por irradiación, quimioterapia preparatoria), el grado de compatibilidad entre el tejido del donante y del receptor (compatibilidad HLA, y/o la relación entre el donante y el receptor), y regímenes de tratamiento terapéutico o profiláctico.
En general, sin embargo, en primates, tal como el macaco rhesus que ha recibido trasplantes de células madre haploides, el tiempo medio de supervivencia (MST) después del trasplante y en ausencia de terapia es 8 días.
Concepto 118. Un método según el concepto 117, en el que la supervivencia aumenta al menos 7 días, o al menos 14 días, o al menos 20 días, o al menos 30 días o al menos 40 días, o al menos 50 días, o al menos 60 días, o al menos 70 días.
Concepto 119. Un método para aumentar el número de días libres de enfermedad o sin progresión de la enfermedad en un sujeto que tiene o está en riesgo de padecer una enfermedad o afección mediada por OX40L mediante la administración de una combinación terapéutica o profiláctica de un anticuerpo anti-OX40L y un agente terapéutico adicional seleccionado independientemente del grupo que consiste en rapamicina (sirolimus), tacrolimus, ciclosporina, corticosteroides (por ejemplo, metilprednisolona), metotrexato, micofenolato mofetilo, anticuerpos anti-CD28, anticuerpos anti-IL12/IL-23 (por ejemplo, ustekinumab), anticuerpos anti-CD20 (por ejemplo, rituximab), anticuerpos anti-CD30 (por ejemplo, brentuximab), moléculas CTLA4-Fc (por ejemplo, abatacept), antagonistas del receptor CCR5 (por ejemplo, maraviroc), anticuerpos anti-CD40L, anticuerpos anti-VLA4 (por ejemplo, natalizumab), anticuerpos anti-LFA1, fludarabina, anticuerpos anti-CD52 (por ejemplo, alemtuzumab), anticuerpos anti-CD45, ciclofosfamida, globulinas antitimocitos, anticuerpos anti-C5 del complemento (por ejemplo, eculizumab), anticuerpos anti-integrina a4b7 (por ejemplo, vedolizumab), anticuerpos anti-IL6 (por ejemplo, tocilizumab), anticuerpos anti-IL2R (por ejemplo, basilixumab), anticuerpos anti-CD25 (por ejemplo, daclizumab), moléculas anti-TNFa/TNFa-Fc (por ejemplo, etanercept, adalimumab, infliximab, golimumab o certolizumab pegol) y Vorinostat.
En una realización, la enfermedad o afección mediada por OX40L es EICH o rechazo de trasplante, en particular EICH. En seres humanos, la presencia de signos y síntomas de EICH aguda puede clasificarse por etapas y graduarse de acuerdo con una escala estandarizada, tal como la descrita en Przepiorka et al. En primates, como macacos rhesus, la presencia de signos y síntomas de EICH aguda puede clasificarse por etapas y graduarse de acuerdo con una escala estandarizada tal como se describe aquí en el Ejemplo 7.
Por lo tanto, el número de días libres de enfermedad puede medirse por la ausencia de síntomas de clasificación clínica. El número de días sin progresión de la enfermedad puede medirse como el número de días en los que la puntuación de clasificación clínica no cambia.
Concepto 120. Un método según el concepto 119, en el que el número de días libres de enfermedad o sin progresión de la enfermedad es al menos 7 días, o al menos 14 días, o al menos 21 días, o al menos 28 o al menos 40 días, o al menos 50 días, o al menos 60 días, o al menos 70 días.
Concepto 121. Un método según el concepto 120, en el que el número de días libres de enfermedad o sin progresión de la enfermedad es al menos 90 días, al menos 180 días o al menos 365 días.
Concepto 122. Un método para tratar o reducir el riesgo de rechazo de trasplante o EICH en un sujeto mediante la administración de una combinación terapéutica o profiláctica de un anticuerpo anti-OX40L y un agente terapéutico adicional seleccionado independientemente del grupo que consiste en rapamicina (sirolimus), tacrolimus, ciclosporina, corticosteroides (por ejemplo, metilprednisolona), metotrexato, micofenolato mofetilo, anticuerpos anti-CD28, anticuerpos anti-IL12/IL-23 (por ejemplo, ustekinumab), anticuerpos anti-CD20 (por ejemplo, rituximab), anticuerpos anti-CD30 (por ejemplo, brentuximab), moléculas CTLA4-Fc (por ejemplo, abatacept), antagonistas del receptor CCR5 (por ejemplo, maraviroc), anticuerpos anti-CD40L, anticuerpos anti-VLA4 (por ejemplo, natalizumab), anticuerpos antiLFA1, fludarabina, anticuerpos anti-CD52 (por ejemplo, alemtuzumab), anticuerpos anti-CD45, ciclofosfamida, globulinas antitimocitos, anticuerpos anti-C5 del complemento (por ejemplo, eculizumab), anticuerpos anti-integrina a4b7 (por ejemplo, vedolizumab), anticuerpos anti-IL6 (por ejemplo, tocilizumab), anticuerpos anti-IL2R (por ejemplo, basilixumab), anticuerpos anti-CD25 (por ejemplo, daclizumab), moléculas anti-TNFa/TNFa-Fc (por ejemplo, etanercept, adalimumab, infliximab, golimumab o certolizumab pegol) y Vorinostat, en el que la combinación da como resultado una mayor supervivencia en un modelo de macaco Rhesus de trasplante de células madre hematopoyéticas haploidénticas en comparación con el anticuerpo o el agente terapéutico adicional como monoterapia.
En una realización, el método es un método para prevenir una enfermedad o afección mediada por OX40L.
En una realización, la enfermedad o afección mediada por OX40L es EICH o rechazo de trasplante, en particular EICH. En una realización, la enfermedad o afección mediada por OX40L es EICH o rechazo de trasplante, en particular EICH, y el agente terapéutico adicional es una rapamicina (sirolimus). En una realización, la enfermedad o afección mediada por OX40L es EICH o rechazo de trasplante, en particular EICH, y el agente terapéutico adicional es tacrolimus. En una realización, la enfermedad o afección mediada por OX40L es EICH o rechazo de trasplante, en particular EICH, y el agente terapéutico adicional es una combinación de tacrolimus y metotrexato. En una realización, la enfermedad o afección mediada por OX40L es EICH o rechazo de trasplante, en particular EICH, y el agente terapéutico adicional es ciclofosfamida. En una realización, la enfermedad o afección mediada por OX40L es EICH o rechazo de trasplante, en particular EICH, y el agente terapéutico adicional es ciclosporina. En una realización, la enfermedad o afección mediada por OX40L es EICH o rechazo de trasplante, en particular EICH, y el agente terapéutico adicional es una combinación de ciclosporina y metotrexato. En una realización, la enfermedad o afección mediada por OX40L es EICH o rechazo de trasplante, en particular EICH, y el agente terapéutico adicional es micofenolato mofetilo.
El modelo de macaco Rhesus de trasplante de células madre hematopoyéticas haploidénticas puede ser como se describe en el aspecto 99 aquí.
Concepto 123. Un método según uno cualquiera de los conceptos 106, 109, 110, 117, 119 o 122, en el que la supervivencia aumenta al menos 7 días, o al menos 14 días, o al menos 21 días, o al menos 28 días, o al menos 40 días, o al menos 50 días, o al menos 60 días, o al menos 70 días, en comparación con el anticuerpo o el agente terapéutico adicional como monoterapia.
Concepto 124. Un método según uno cualquiera de los conceptos 106, 109, 110, 117, 119 o 122, en el que la supervivencia se duplica al menos, por ejemplo se triplica, en comparación con el anticuerpo o el agente terapéutico adicional como monoterapia.
Concepto 125. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, una composición para el uso, o el uso según cualquier concepto anterior, en el que el anticuerpo se une específicamente al OX40L humano (hOX40L).
El hOX40L puede ser como se describe en el aspecto 28 o el aspecto 30 descrito aquí.
En cualquiera de los conceptos proporcionados aquí, el anticuerpo anti-OX40L puede ser como se describe en otra parte aquí. En una realización, el anticuerpo anti-OX40L es como se describe en cualquiera de los aspectos 1 a 11, 13 a 27, 29, 31 a 43 o 45 descritos aquí. En otra realización, el anticuerpo anti-OX40L es como se describe en los aspectos 73 a 89, o como en cualquiera de los aspectos 95 a 102 descritos aquí. En otra realización, el anticuerpo anti-OX40L es como se describe en cualquiera de los conceptos 53 a 64 aquí anteriores. Otras propiedades de los anticuerpos anti-OX40L se describen en las páginas 86 a 89, en la sección titulada “Biespecíficos” que comienza en la página 90 aquí, en la sección titulada “Anticuerpos”, que comienza en la página 108 aquí, y en la sección titulada “Métodos de administración y dosificación”, a partir de la página 130 aquí.
Concepto 126. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, una composición para el uso, o el uso según el concepto 125, que compite por unirse a dicho hOX40L con un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en 02D10, 10A07, 09H04 y 19H01.
La competición entre anticuerpos se puede determinar como se describe en el aspecto 13 o el aspecto 73, por ejemplo como se determina mediante SPR, ELISA, HTRF o FACS. Se describen aquí métodos relacionados con los métodos de medida, incluso en los Ejemplos.
Concepto 127. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, una composición para el uso, o el uso según el concepto 126, que compite por unirse a dicho hOX40L con el anticuerpo 02D10, en el que el anticuerpo o fragmento comprende un dominio VH que comprende una HCDR3 que comprende el motivo VRGXYYY, en el que X es cualquier aminoácido.
Concepto 128. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, una composición para el uso, o el uso según cualquier concepto anterior, en el que el anticuerpo antagoniza la unión específica de OX40 a OX40L, por ejemplo según lo determinado usando SPR o ELISA.
El antagonismo y la inhibición pueden realizarse como se define en las páginas 94 a 95.
Concepto 129. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, una composición para el uso, o el uso según cualquier concepto anterior, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado, humano o completamente humano. Concepto 130. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, una composición para el uso, o el uso según cualquier concepto anterior, en el que el anticuerpo es un fragmento de un anticuerpo seleccionado de la lista de anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), intracuerpos, anticuerpos Fv monocatenarios (scFv), anticuerpos camelizados, fragmentos Fab, fragmentos F(ab’), Fv unidos por enlaces de disulfuro (sdFv), anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id), y fragmentos de unión a epítopos de los mismos.
Concepto 131. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, una composición para el uso, o el uso según cualquier concepto anterior, en el que el anticuerpo o fragmento permite más del 80% de quimerismo de donantes de células madre para el día 12 en un modelo de macaco Rhesus de trasplante de células madre hematopoyéticas haploidénticas.
Concepto 132. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, una composición para el uso, o el uso según cualquier concepto anterior, en el que el anticuerpo o fragmento se expresa como un conjunto transfectado de forma estable en Lonza GS-XceedTM a un nivel mayor que 1,5 g/l en un cultivo de sobrecrecimiento alimentado por lotes utilizando el sistema de alimentación Lonza versión 8 con un período de sobrecrecimiento de 14 días.
Concepto 133. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, una composición para el uso, o el uso según cualquier concepto anterior, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una HCDR3 de 16 a 27 aminoácidos y derivada de la recombinación de un segmento del gen VH humano, un segmento del gen D humano y un segmento del gen JH humano, en el que el segmento del gen JH humano es IGHJ6 (por ejemplo, IGHJ6*02). Concepto 134. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, una composición para el uso, o el uso según cualquier concepto anterior, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una CDR seleccionada de: a. la HCDR3 del anticuerpo 2D10 (Seq ID No: 40 o Seq ID No: 46);
b. la HCDR3 del anticuerpo 10A7 (Seq ID No:8 o SEQ ID No:14);
c. la HCDR3 del anticuerpo 09H04 (Seq ID No: 72 o Seq ID No: 78);
d. la HCDR3 del anticuerpo 19H01 (Seq ID No: 100 o Seq ID No: 106);
e. una CDR3 de cualquiera de los nanocuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de región variable de Seq ID Nos: 177 a 213;
f. una HCDR3 de cualquiera de los anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de región variable de Seq ID Nos: 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229 o 230; o
g. una HCDR3 de cualquiera de los anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de la región variable de Seq ID Nos: 232 o 234.
Concepto 135. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, una composición para el uso, o el uso según cualquier concepto anterior, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo comprende:
a. las CDR del anticuerpo 2D10 (Seq ID No:40 o Seq ID No:46 para CDRH3, SEQ ID No:38 o SEQ ID No:44 para CDRH2, SEQ ID No:36 o SEQ ID No:42 para CDRH1, SEQ ID No: 50 o SEQ ID No: 56 para CDRL1, SEQ ID No: 52 o SEQ ID No: 58 para CDRL2, y SEQ ID No: 54 o SEQ ID No: 60 para CDRL3);
b. las CDR del anticuerpo 10A7 (Seq ID No:8 o SEQ ID No:14 para CDRH3, SEQ ID No:6 o SEQ ID No:12 para CDRH2, SEQ ID No:4 o SEQ ID No:10 para CDRH1, SEQ ID No: 18 o SEQ ID No: 24 para CDRL1, SEQ ID No: 20 o SEQ ID No: 26 para CDRL2, y SEQ ID No: 22 o SEQ ID No: 28 para CDRL3);
c. las CDR del anticuerpo 09H04 (Seq ID No:72 o Seq ID No:78 para CDRH3, SEQ ID No:70 o SEQ ID No:76 para CDRH2, SEQ ID No:68 o SEQ ID No:74 para CDRH1, SEQ ID No: 82 o SEQ ID No: 88 para CDRL1, SEQ ID No: 84 o SEQ ID No: 90 para CDRL2, y SEQ ID No: 86 o SEQ ID No: 92 para CDRL3);
d. las CDR del anticuerpo 19H01 (Seq ID No: 100 o Seq ID No: 106 para CDRH3, SEQ ID No: 98 o SEQ ID No: 104 para CDRH2, SEQ ID No: 96 o SEQ ID No: 102 para CDRH1, SEQ ID No: 110 o SEQ ID No: 116 para CDRL1, SEQ ID No: 112 o SEQ ID No: 118 para CDRL2, y SEQ ID No: 114 o SEQ ID No: 120 para CDRL3);
e. las CDR de cualquiera de los nanocuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de la región variable de Seq ID Nos: 177 a 213;
f. las CDR de cadena pesada de cualquiera de los anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de Seq ID Nos: 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229 o 230, y las CDR de cadena ligera de cualquiera de los anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de Seq ID Nos: 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226 o 228; o
g. las CDR de cadena pesada de cualquiera de los anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de Seq ID Nos: 232 o 234, y las CDR de cadena ligera de cualquiera de los anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de Seq ID Nos:231 o 233.
Concepto 136. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, una composición para el uso, o el uso según cualquier concepto anterior, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo comprende los dominios VH y/o VL seleccionados de los siguientes:
a. los dominios VH y/o VL del anticuerpo 2D10 (Seq ID No: 34 para VH y/o Seq ID No: 48 para VL);
b. los dominios VH y/o VL del anticuerpo 10A7 (Seq ID No:2 para VH y/o Seq ID No:16 para VL);
c. los dominios VH y/o VL del anticuerpo 09H04 (Seq ID No:66 para VH y/o Seq ID No:80 para VL);
d. los dominios VH y/o VL del anticuerpo 19H01 (Seq ID No: 94 para VH y/o Seq ID No: 108 para VL);
e. un dominio VH de cualquiera de los nanocuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de la región variable de Seq ID N os:177 a 213;
f. un dominio VH de cualquiera de los anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de Seq ID Nos: 215, 217, 219, 221,223, 225, 227, 229 o 230, y un dominio VL de cualquiera de los anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de Seq ID Nos: 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226 o 228; o
g. un dominio VH de cualquiera de los anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de Seq ID Nos: 232 o 234, y un dominio VL de cualquiera de los anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de Seq ID Nos: 231 o 233.
Concepto 137. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, una composición para el uso, o el uso según cualquier concepto anterior, en el que el anticuerpo es oxelumab.
Concepto 138. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, una composición para el uso, o el uso según cualquier concepto anterior, en el que el sujeto es un primate.
El término “sujeto” puede ser otro sujeto como se describe aquí, por ejemplo como se describe en la página 104. En una realización, el primate es un mono macaco rhesus.
Concepto 139. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, una composición para el uso, o el uso según cualquier concepto anterior, en el que el sujeto es un ser humano.
En una realización, el sujeto es un paciente humano.
Concepto 140. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, una composición para el uso, o el uso según cualquier concepto anterior, en el que el sujeto está en riesgo de una enfermedad o afección mediada por OX40L.
En una realización, se puede identificar que un sujeto está “en riesgo de una enfermedad o afección mediada por OX40L” si se ha identificado previamente que el sujeto tiene un mayor riesgo, por ejemplo mediante genotipado y/o fenotipado, pero el sujeto aún no ha presentado síntomas o no se le diagnosticaría tal enfermedad o afección por cualquier método convencional. Por lo tanto, los métodos y usos descritos aquí pueden ayudar en la identificación temprana de pacientes que desarrollarán tales enfermedades o afecciones. En una realización, se previene la enfermedad o afección (es decir, el tratamiento es profiláctico).
En una realización, la enfermedad o afección mediada por OX40L es EICH o rechazo de trasplante, en particular EICH. En una realización particular, el sujeto está en riesgo de EICH o rechazo de trasplante cuando está en el preoperatorio de un trasplante. En particular, un sujeto está en riesgo de EICH o rechazo de trasplante cuando ha comenzado un régimen de acondicionamiento previo al trasplante (por ejemplo, mieloablación por irradiación, quimioterapia preparatoria), y cuando el grado de compatibilidad del tejido donante-receptor (compatibilidad HLA, y/o relación donante-receptor) no es 100%. Las terapias de trasplante potenciales se contemplan en el concepto 78 anterior.
Concepto 141. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, una composición para el uso, o el uso según el concepto 40, en el que el método, anticuerpo o fragmento para el uso, el uso, o la composición es para la prevención de la enfermedad o afección mediada por OX40L.
Concepto 142. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, una composición para el uso, o el uso según uno cualquiera de los conceptos 101 a 139, en el que el sujeto tiene una enfermedad o afección mediada por OX40L.
Un sujeto tiene una enfermedad o afección mediada por OX40L si el sujeto presenta síntomas que convencionalmente estarían asociados con dicha enfermedad o afección, o si al sujeto se le diagnosticaría tal enfermedad o afección por cualquier método convencional. En una realización, la enfermedad o afección mediada por OX40L es EICH o rechazo de trasplante, particularmente EICH, y se puede determinar que un sujeto tiene la enfermedad por cualquiera de los métodos mencionados en los conceptos 101 a 105 y 119 anteriores.
Concepto 143. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, una composición para el uso, o el uso según el concepto 142, en el que el método, anticuerpo o fragmento para el uso, la composición para el uso, o el uso es para el tratamiento de la enfermedad o afección mediada por OX40L.
En una realización, el tratamiento comienza cuando la enfermedad o afección mediada por OX40L ha sido diagnosticada como una enfermedad o afección confirmada.
En una realización, la enfermedad o afección mediada por OX40L es EICH o rechazo de trasplante, en particular EICH. La clasificación de EICH se puede determinar como se describe aquí (véanse los conceptos 101 a 105 y 119 aquí anteriormente). En una realización, el sujeto es un ser humano que tiene síntomas clínicos de EICH de Grado II. Concepto 144. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, una composición para el uso, o el uso según cualquier concepto anterior, en el que la enfermedad o afección mediada por OX40L se selecciona de una enfermedad o afección autoinmune, una enfermedad o afección inflamatoria sistémica, o rechazo de trasplante.
Concepto 145. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, una composición para el uso, o el uso según el concepto 144, en el que la enfermedad o afección mediada por OX40L se selecciona de enfermedad inflamatoria intestinal (EII), enfermedad de Crohn, reumatoide artritis, rechazo de trasplante, rechazo de trasplante alogénico, enfermedad de injerto contra hospedante (EICH), colitis ulcerosa, lupus eritematoso sistémico (LES), diabetes, uveítis, espondilitis anquilosante, hipersensibilidad por contacto, esclerosis múltiple, y aterosclerosis.
Concepto 146. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, una composición para el uso, o el uso según el concepto 145, en el que la enfermedad o afección mediada por OX40L es EICH o rechazo de trasplante.
Concepto 147. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, una composición para el uso, o el uso según el concepto 146, en el que la enfermedad o afección mediada por OX40L es EICH.
Concepto 148. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, una composición para el uso, o el uso según el concepto 146, en el que el trasplante es un trasplante de células, tejidos u órganos (por ejemplo, hígado, pulmón, corazón, riñón o intestino), o un trasplante de sangre (por ejemplo, autólogo o alogénico), por ejemplo cuando la sangre deriva de la médula ósea, deriva de la sangre del cordón (umbilical), o deriva de sangre periférica.
Concepto 149. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, una composición para el uso, o el uso según uno cualquiera de los conceptos 146 a 148, en el que el anticuerpo anti-OX40L o fragmento del mismo se administra antes del trasplante.
Concepto 150. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, una composición para el uso, o el uso según uno cualquiera de los conceptos 146 a 148, en el que el anticuerpo anti-OX40L o fragmento del mismo se administra después del trasplante.
Concepto 151. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, una composición para el uso, o el uso según el concepto 149 o el concepto 150, en el que el agente terapéutico adicional se administra después del trasplante. En una realización, el agente terapéutico adicional es rapamicina (sirolimus). En una realización, el agente terapéutico adicional es tacrolimus. En una realización, el agente terapéutico adicional es una combinación de tacrolimus y metotrexato. En una realización, el agente terapéutico adicional es ciclofosfamida. En una realización, el agente terapéutico adicional es ciclosporina. En una realización, el agente terapéutico adicional es una combinación de ciclosporina y metotrexato. En una realización, el agente terapéutico adicional es micofenolato mofetilo. En una realización, el agente terapéutico adicional es metilpredinsolona.
Concepto 152. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, una composición para el uso, o el uso según el concepto 149 o el concepto 150, en el que el agente terapéutico adicional se administra antes del trasplante.
En una realización, el agente terapéutico adicional es rapamicina (sirolimus). En una realización, el agente terapéutico adicional es tacrolimus. En una realización, el agente terapéutico adicional es una combinación de tacrolimus y metotrexato. En una realización, el agente terapéutico adicional es ciclofosfamida. En una realización, el agente terapéutico adicional es ciclosporina. En una realización, el agente terapéutico adicional es una combinación de ciclosporina y metotrexato. En una realización, el agente terapéutico adicional es micofenolato mofetilo.
Concepto 153. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-OX40L o un fragmento del mismo y un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable, y que comprende además un agente terapéutico adicional seleccionado independientemente del grupo que consiste en rapamicina (sirolimus), tacrolimus, ciclosporina, corticosteroides (por ejemplo, metilprednisolona), metotrexato, micofenolato mofetilo, anticuerpos anti-CD28, anticuerpos anti-IL12/IL-23 (por ejemplo, ustekinumab), anticuerpos anti-CD20 (por ejemplo, rituximab), anticuerpos anti-CD30 (por ejemplo, brentuximab), moléculas CTLA4-Fc (por ejemplo, abatacept), antagonistas del receptor CCR5 (por ejemplo, maraviroc), anticuerpos anti-CD40L, anticuerpos anti-VLA4 (por ejemplo, natalizumab), anticuerpos anti-LFA1, fludarabina, anticuerpos anti-CD52 (por ejemplo, alemtuzumab), anticuerpos anti-CD45, ciclofosfamida, globulinas antitimocitos, anticuerpos anti-C5 del complemento (por ejemplo, eculizumab), anticuerpos anti-integrina a4b7 (por ejemplo, vedolizumab), anticuerpos anti-IL6 (por ejemplo, tocilizumab), anticuerpos anti-IL2R (por ejemplo, basilixumab), anticuerpos anti-CD25 (por ejemplo, daclizumab), moléculas anti-TNFa/TNFa-Fc (por ejemplo, etanercept, adalimumab, infliximab, golimumab o certolizumab pegol) y Vorinostat.
En una realización, se proporciona una composición o kit para tratar y/o prevenir una afección o enfermedad mediada por OX40L, comprendiendo la composición o kit un anticuerpo o fragmento de la invención en combinación con un agente terapéutico adicional, opcionalmente en combinación con una etiqueta o instrucciones de uso para tratar y/o prevenir dicha enfermedad o afección en un ser humano; opcionalmente, en el que la etiqueta o las instrucciones comprenden un número de autorización de comercialización (por ejemplo, un número de autorización de la FDA o EMA); opcionalmente, en el que el kit comprende un dispositivo intravenoso o de inyección que comprende el anticuerpo o fragmento.
La composición puede ser como se describe en el aspecto 105, 106 o 107 aquí. Los excipientes para uso en formulaciones farmacéuticas son bien conocidos por los expertos, y pueden ser como se definen en la página 97 aquí, o en la sección titulada “Composiciones farmacéuticas” que comienza en la página 118 aquí, o en la sección titulada “Métodos de administración y dosificación” que comienza en la página 130 aquí.
Concepto 154. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, una composición para el uso, el uso o la composición según cualquier concepto anterior, en el que el agente terapéutico adicional se selecciona independientemente del grupo que consiste en rapamicina (sirolimus), tacrolimus, ciclosporina, corticosteroides (por ejemplo, metilprednisolona), metotrexato, micofenolato mofetilo, anticuerpos anti-CD28, moléculas CTLA4-Fc (por ejemplo, abatacept), anticuerpos anti-CD40L, anticuerpos anti-LFA1, anticuerpos anti-CD52 (por ejemplo, alemtuzumab), ciclofosfamida, y globulinas antitimocitos.
Otras combinaciones pueden ser con los fármacos antiinflamatorios descritos en el aspecto 46 aquí, o como se describe en el aspecto 103. Otras combinaciones son como se describe en los conceptos 81 a 83 aquí anteriormente, o en cualquiera de los conceptos 101 a 153 aquí anteriormente.
Concepto 155. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, una composición para el uso, el uso o la composición según cualquier concepto anterior, que comprende además administrar al ser humano una cantidad terapéuticamente eficaz, o una cantidad profilácticamente eficaz de un agente terapéutico adicional seleccionado independientemente del grupo que consiste en rapamicina, tacrolimus, ciclosporina, ciclofosfamida, corticosteroides (por ejemplo, metilprednisolona), metotrexato o micofenolato mofetilo, anticuerpos anti-CD28, moléculas CTLA4-Fc (por ejemplo, abatacept), y globulinas antitimocito.
Concepto 156. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, una composición para el uso, el uso o la composición según cualquier concepto anterior, que comprende además administrar al ser humano una cantidad terapéuticamente eficaz, o una cantidad profilácticamente eficaz de un agente terapéutico adicional seleccionado independientemente del grupo que consiste en rapamicina, tacrolimus, ciclosporina, ciclofosfamida, corticosteroides (por ejemplo, metilprednisolona), metotrexato y micofenolato mofetilo.
Concepto 157. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, una composición para el uso, el uso o la composición según cualquier concepto anterior, que comprende además administrar al ser humano una cantidad terapéuticamente eficaz, o una cantidad profilácticamente eficaz de un agente terapéutico adicional seleccionado independientemente del grupo que consiste en un inmunosupresor que modula la señalización de IL-2 (por ejemplo, tacrolimus, ciclosporina, rapamicina (sirolimus)), y anticuerpos anti-CD25 (por ejemplo, basilixumab, daclizumab).
Concepto 158. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, una composición para el uso, el uso o la composición según cualquier concepto anterior, que comprende además administrar al ser humano una cantidad terapéuticamente eficaz, o una cantidad profilácticamente eficaz de un agente terapéutico adicional seleccionado independientemente del grupo que consiste en inhibidores de la calcineurina (por ejemplo, tacrolimus, ciclosporina), inhibidores de mTOR (por ejemplo, rapamicina (sirolimus)), y agentes antiproliferativos (por ejemplo, micofenolato mofetilo, ciclofosfamida).
Concepto 159. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, una composición para el uso, el uso o la composición según cualquier concepto anterior, que comprende además administrar al ser humano una cantidad terapéuticamente eficaz o una cantidad profilácticamente eficaz de rapamicina.
Concepto 160. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, una composición para el uso, el uso o la composición según cualquier concepto anterior, que comprende además administrar al ser humano una cantidad terapéuticamente eficaz o una cantidad profilácticamente eficaz de tacrolimus.
Concepto 161. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, una composición para el uso, el uso o la composición según cualquier concepto anterior, que comprende además administrar al ser humano una cantidad terapéuticamente eficaz, o una cantidad profilácticamente eficaz de tacrolimus y metotrexato.
Concepto 162. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, una composición para el uso, el uso o la composición según cualquier concepto anterior, que comprende además administrar al ser humano una cantidad terapéuticamente eficaz o una cantidad profilácticamente eficaz de ciclosporina.
Concepto 163. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, una composición para el uso, el uso o la composición según cualquier concepto anterior, que comprende además administrar al ser humano una cantidad terapéuticamente eficaz, o una cantidad profilácticamente eficaz de ciclosporina y metotrexato.
Concepto 164. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, una composición para el uso, el uso o la composición según cualquier concepto anterior, que comprende además administrar al ser humano una cantidad terapéuticamente eficaz, o una cantidad profilácticamente eficaz de ciclofosfamida.
Concepto 165. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, una composición para el uso, el uso o la composición según cualquier concepto anterior, que comprende además administrar al ser humano una cantidad terapéuticamente eficaz, o una cantidad profilácticamente eficaz de micofenolato mofetilo.
Concepto 166. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, una composición para el uso, el uso o la composición según cualquier concepto anterior, que comprende además administrar al ser humano una cantidad terapéuticamente eficaz, o una cantidad profilácticamente eficaz de un corticosteroide (por ejemplo, metilprednisolona).
Concepto 167. Un método, un anticuerpo o fragmento para el uso, una composición para el uso, el uso o la composición según cualquier concepto anterior, en el que el agente terapéutico adicional se administra secuencial o simultáneamente con el anticuerpo o fragmento anti-hOX40L.
Como se explica en los ejemplos, los inventores idearon un conjunto de criterios que es particularmente útil para identificar anticuerpos y fragmentos de la invención, siendo estos criterios:
(a) la capacidad del anticuerpo o fragmento para unirse a hOX40L de la superficie celular en células CHO-S (opcionalmente transfectadas con OX40L humano de longitud completa) y/o unirse a hOX40L recombinante en un ensayo de HTRF;
(b) la capacidad del anticuerpo o fragmento para neutralizar el OX40 humano (por ejemplo, neutralizar la unión del OX40L humano al receptor OX40 humano) en un ensayo de HTRF de neutralización del receptor y/o un ensayo de neutralización del receptor de citometría de flujo; y
(c) la capacidad del anticuerpo o fragmento para unirse específicamente a OX40L humano y de mono rhesus (útil para que la PK, PD, eficacia y otros parámetros del anticuerpo o fragmento puedan evaluarse en el modelo rhesus como un sustituto para seres humanos).
Así, en un ejemplo de la invención, el anticuerpo o fragmento cumple los criterios (a), (b) y (c).
En un ejemplo, el criterio (a) se establece de modo que el anticuerpo o fragmento muestre <70% de unión del receptor por Fa Cs a hOX40L expresado por células CHO-S.
En un ejemplo, el criterio (a) se establece de modo que el anticuerpo o fragmento muestre <90% de unión del receptor a OX40L en el ensayo de HTRF.
En un ejemplo, el criterio (a) se establece de modo que el anticuerpo o fragmento muestre al menos un 20% de efecto en el ensayo de HTRF.
En un ejemplo, se usa OX40 en el criterio (b).
En una realización, el ensayo o prueba de un anticuerpo o fragmento de la invención se lleva a cabo a o sustancialmente a un pH de 7 (por ejemplo, para pruebas y ensayos in vitro) y a o sustancialmente a rtp.
Opcionalmente, el anticuerpo o fragmento se une específicamente a hOX40L con una afinidad (afinidad aparente, Kd) de menos de 1 microM, 1000 nM a 100 nM, 100 nM a 10 nM, 10 nM a 1 nM, 1000 pM a 500 pM, 500 pM a 200 pM, menos de 200 pM, 200 pM a 150 pM, 200 pM a 100 pM, 100 pM a 10 pM, 10 pM a 1 pM, por ejemplo en el intervalo de 1 mM a 1 pM (por ejemplo, 1 mM a 100 pM; 10 nM a 100 pM, 1 nM a 10 pM o 100 pM a 1 pM), según lo determinado por SPR, por ejemplo en las condiciones de SPR descritas aquí). Adicional o alternativamente, el anticuerpo o fragmento se une específicamente a OX40L de mono rhesus con una afinidad (afinidad aparente, Kd) de menos de 1 microM, 1000 nM a 100 nM, 100 nM a 10 nM, 10 nM a 1 nM, 1000 pM a 500 pm, 500 pm a 200 pm, menos de 200 pm, 200 pm a 150 pm, 200 pm a 100 pm, 100 pm a 10 pm, 10 pm a 1 pm, por ejemplo en el intervalo de 1 mM a 1 pM (por ejemplo, 1 mM a 100 pM, 10 nM a 100 pM, 1 nM a 10 pM o 100 pM a 1 pM), según lo determinado por SPR, por ejemplo en las condiciones de SPR descritas aquí). Dichas medidas de unión se pueden realizar usando una variedad de ensayos de unión conocidos en la técnica, por ejemplo usando resonancia de plasmones superficiales (SPR), tal como por Biacore™, o usando el ProteOn XPR36™ (Bio-Rad®), usando KinExA® (Sapidyne Instruments, Inc), o usando ForteBio Octet (Pall ForteBio Corp.).
La capacidad de unión, especificidad y afinidad de OX40L (Kd, Koff y/o Kon) se pueden determinar mediante cualquier método de rutina en la técnica, por ejemplo mediante resonancia de plasmones superficiales (SPR). El término “Kd”, como se usa aquí, se refiere a la constante de disociación de equilibrio de una interacción antígeno-anticuerpo particular.
En una realización, la resonancia de plasmones superficiales (SPR) se lleva a cabo a 25°C. En otra realización, la SPR se lleva a cabo a 37°C.
En una realización, la SPR se lleva a cabo a un pH fisiológico, tal como pH 7 o pH 7,6 (por ejemplo, usando disolución salina amortiguada con Hepes a pH 7,6 (también denominada HBS-EP)).
En una realización, la SPR se lleva a cabo a un nivel fisiológico de sal, por ejemplo NaCl 150 mM.
En una realización, la SPR se lleva a cabo a un nivel de detergente no superior al 0,05% en volumen, por ejemplo en presencia de P20 (polisorbato 20; por ejemplo, Tween-20™) al 0,05% y e Dt A 3 mM.
En un ejemplo, la SPR se lleva a cabo a 25°C o 37°C en un amortiguador a pH 7,6, NaCl 150 mM, detergente al 0,05% (por ejemplo, P20) y EDTA 3 mM. El amortiguador puede contener Hepes 10 mM. En un ejemplo, la SPR se lleva a cabo a 25°C o 37°C en HBS-EP. HBS-EP está disponible en Teknova Inc (California; número de catálogo H8022).
En un ejemplo, la afinidad del anticuerpo o fragmento se determina usando SPR
1. Acoplando IgG anti-ratón (u otra región constante de anticuerpo relevante humano, de rata o de vertebrado no humano compatible con la especie) (por ejemplo, Biacore™ BR-1008-38) a un chip biosensor (por ejemplo, chip GLM), tal como por acoplamiento de amina primaria;
2. Exponiendo el IgG anti-ratón (u otra especie de anticuerpo compatible) a un anticuerpo IgG de ensayo para capturar el anticuerpo de ensayo en el chip;
3. Pasando el antígeno de ensayo sobre la superficie de captura del chip a 1024 nM, 256 nM, 64 nM, 16 nM, 4 nM con 0 nM (es decir, amortiguador solo); y
4. Determinando la afinidad de la unión del anticuerpo de ensayo al antígeno de ensayo usando resonancia de plasmones superficiales, por ejemplo en una condición de SPR discutida anteriormente (por ejemplo, a 25°C en amortiguador fisiológico). SPR se puede llevar a cabo usando cualquier aparato SPR estándar, tal como por Biacore™, o usando el ProteOn XPR36™(Bio-Rad®).
La regeneración de la superficie de captura se puede realizar con glicina 10 mM a pH 1,7. Esto elimina el anticuerpo capturado, y permite que la superficie se use para otra interacción. Los datos de unión se pueden ajustar al modelo 1:1 inherente usando técnicas estándar, por ejemplo usando un modelo inherente al software de analisis ProteOn XPR36™.
En un ejemplo, el anticuerpo o fragmento de la invención está contenido en un recipiente médico, por ejemplo un vial, una jeringa, un recipiente intravenoso, o un dispositivo de inyección (por ejemplo, un dispositivo de inyección intraocular o intravítreo). En un ejemplo, el anticuerpo o fragmento está in vitro, por ejemplo en un recipiente estéril. En un ejemplo, la invención proporciona un kit que comprende el anticuerpo o fragmento de la invención, el envase, y las instrucciones de uso para tratar, prevenir o diagnosticar en un ser humano una enfermedad o afección mediada por OX40L. En un ejemplo, las instrucciones indican que el ser humano debe genotiparse para una secuencia variante de OX40L de la invención antes de administrar el anticuerpo o fragmento al ser humano. En un ejemplo, las instrucciones indican que el ser humano debe ser fenotipado para una variante de OX40L de la invención antes de administrar el anticuerpo o fragmento al ser humano. En un ejemplo, el ser humano es de etnia china (por ejemplo, Han o CHS), y las instrucciones están en chino (por ejemplo, mandarín).
En un ejemplo, el o los sitios de unión del anticuerpo o fragmento se seleccionan de una pluralidad (por ejemplo, una biblioteca) de sitios de unión. Por ejemplo, la pluralidad de sitios de unión comprende o consiste en una pluralidad de anticuerpos de 4 cadenas o fragmentos de los mismos, por ejemplo dAbs, Fabs o scFvs. Los métodos adecuados para producir una pluralidad de sitios de unión para el cribado incluyen presentación en fagos (que produce una biblioteca de presentación en fagos de sitios de unión a anticuerpos), presentación en ribosomas (que produce una biblioteca de presentación en ribosomas de sitios de unión a anticuerpos), presentación en levadura (que produce una biblioteca de presentación en levaduras de sitios de unión a anticuerpos), o la inmunización de un vertebrado no humano (por ejemplo, un roedor, por ejemplo un ratón o rata, por ejemplo un Velocimouse™, Kymouse™, Xenomouse™, Aliva Mouse™, HuMab Mouse™, Omnimouse™, Omnirat™ o MeMo Mouse™) con hOX40L o un epítopo de hOX40L y aislamiento de un repertorio de células productoras de anticuerpos (por ejemplo, un repertorio de células B, células plasmáticas o plasmablastos) y/o un repertorio de anticuerpos, fragmentos o sitios de unión aislados.
El término “epítopo” es una región de un antígeno que se une a un anticuerpo o fragmento. Los epítopos pueden definirse como estructurales o funcionales. Los epítopos funcionales son generalmente un subconjunto de los epítopos estructurales y tienen aquellos restos que contribuyen directamente a la afinidad de la interacción. Los epítopos también pueden ser conformacionales, es decir, compuestos por aminoácidos no lineales. En ciertas realizaciones, los epítopos pueden incluir determinantes que son agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, grupos fosforilo o grupos sulfonilo, y, en ciertas realizaciones, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, y/o características específicas de carga.
El término “aislado”, con referencia a cualquier aspecto de la invención, por ejemplo un anticuerpo o fragmento, significa que un anticuerpo o fragmento en cuestión, etc. (1) está libre de al menos algunas otras proteínas con las que normalmente se encontraría, (2) está esencialmente libre de otras proteínas de la misma fuente, por ejemplo de la misma especie, (3) es expresado por una célula de una especie diferente, (4) se ha separado de al menos alrededor del 50 por ciento de los polinucleótidos, lípidos, hidratos de carbono u otros materiales con los que está asociado en la naturaleza, (5) está asociado operativamente (mediante interacción covalente o no covalente) con un polipéptido con el que no está asociado en la naturaleza, o (6) no existe en la naturaleza. Típicamente, un anticuerpo, fragmento, etc. “aislado” constituye al menos alrededor del 5%, al menos alrededor del 10%, al menos alrededor del 25%, o al menos alrededor del 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% o >99% de una muestra determinada. El ADN genómico, ADNc, ARNm u otro ARN, de origen sintético, o cualquier combinación de los mismos, puede codificar dicho anticuerpo, fragmento, etc. aislado. Preferiblemente, el anticuerpo, fragmento, etc. aislado está sustancialmente libre de proteínas o polipéptidos u otros contaminantes que se encuentran en su entorno natural que podrían interferir con su uso terapéutico, de diagnóstico, profiláctico, de investigación u otro.
Por ejemplo, un anticuerpo “aislado” es aquel que se ha identificado, separado y/o recuperado de un componente de su entorno de producción (por ejemplo, de forma natural o recombinante). Preferiblemente, el polipéptido aislado está libre de asociación con todos los demás componentes de su entorno de producción, por ejemplo de modo que el anticuerpo se ha aislado según un estándar aprobado o aprobado por la FDA. Los componentes contaminantes de su entorno de producción, tales como los que resultan de las células transfectadas recombinantes, son materiales que normalmente interferirían con los usos terapéuticos, diagnósticos o de investigación del anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En realizaciones preferidas, el polipéptido se purificará: (1) hasta más del 95% en peso del anticuerpo según se determina, por ejemplo, mediante el método de Lowry, y en algunas realizaciones, a más del 99% en peso; (2) en un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras o reductoras usando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de las células recombinantes, ya que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Normalmente, sin embargo, un polipéptido o anticuerpo aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.
Inmunoconjugados
La invención abarca el anticuerpo o fragmento, como se define en las reivindicaciones, conjugado con un resto terapéutico (“inmunoconjugado”), tal como una citotoxina, un fármaco quimioterapéutico, un inmunosupresor o un radioisótopo. Los agentes de citotoxina incluyen cualquier agente que sea perjudicial para las células. En la técnica se conocen ejemplos de agentes de citotoxina y agentes quimioterapéuticos adecuados para formar inmunoconjugados; véase, por ejemplo, el documento WO 05/103081.
Biespecíficos
Los anticuerpos y fragmentos de la presente invención pueden ser monoespecíficos, biespecíficos o multiespecíficos. Los mAbs multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de un polipéptido diana, o pueden contener dominios de unión a antígeno específicos para más de un polipéptido diana. Véase, por ejemplo, Tutt et al., (1991) J. Immunol. 147:60-69. Los anticuerpos o fragmentos humanos anti-hOX40L pueden unirse o coexpresarse con otra molécula funcional, por ejemplo otro péptido o proteína. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo puede unirse funcionalmente (por ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más entidades moleculares, tal como otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo, para producir un anticuerpo biespecífico o multiespecífico con una segunda especificidad de unión.
Un formato de anticuerpo biespecífico ejemplar que se puede usar en el contexto de la presente invención implica el uso de un primer dominio CH3 de inmunoglobulina (Ig) y un segundo dominio CH3 de Ig, en el que el primer y el segundo dominio CH3 de Ig difieren entre sí en al menos un aminoácido, y en el que al menos una diferencia de aminoácidos reduce la unión del anticuerpo biespecífico a la Proteína A en comparación con un anticuerpo biespecífico que carece de la diferencia de aminoácidos. En una realización, el primer dominio CH3 de Ig se une a la Proteína A, y el segundo dominio CH3 de Ig contiene una mutación que reduce o anula la unión a la Proteína A, tal como una modificación H95R (por numeración de exón IMGT; H435R por numeración EU). El segundo CH3 puede comprender adicionalmente una modificación Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Otras modificaciones que se pueden encontrar dentro del segundo CH3 incluyen: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M y V821 (de IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M y V422I de EU) en el caso de los anticuerpos IgG1; N44S, K52N y V82I (IMGT; N384S, K392N y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG2; y Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q y V82I (de IMGT; Q355R, N3845, K392N, V397M, R409K, E419Q y V422i de e U) en el caso de los anticuerpos IgG4. Se contemplan variaciones en el formato de anticuerpo biespecífico descrito anteriormente dentro del alcance de la presente invención.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a OX40L del mismo comprende menos de seis CDR. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende o consiste en una, dos, tres, cuatro o cinco CDR seleccionadas del grupo que consiste en HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3. En realizaciones específicas, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende o consiste en una, dos, tres, cuatro o cinco CDR seleccionadas del grupo que consiste en las secuencias de HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 en el listado de secuencias (es decir, Seq ID No:4, Seq ID No:10, Seq ID No:36, Seq ID No:42, Seq ID No:68, Seq ID No:74, Seq ID No:96 o Seq ID No:102, en particular, Seq ID No:36 o Seq ID No:42 para h Cd r 1 ; Seq ID No:6, Seq ID No:12, Seq ID No:38, Seq ID No:44, Seq ID No:70, Seq ID No:76, Seq ID No:98 o Seq ID No:104, en particular Seq ID No:38 o Seq ID No:44 para HCDR2; Seq ID No:8, Seq ID No:14, Seq ID No:40, Seq ID No:46, Seq iD No:72, Seq ID No:78, Seq iD No:100 o Seq ID No:106, en particular Seq ID No:40 o Seq ID No:46 para HCDR3; Seq ID No:18, Seq ID No:24, Seq ID No:50, Seq ID No:56, Seq ID No:82, Seq ID No:88, Seq ID No:110 o Seq ID No:116, en particular Seq ID No:50 o Seq ID No:56 para LCDR1; Seq ID No:20, Seq ID No:26, Seq ID No:52, Seq ID No:58, Seq ID No:84, Seq ID No:90, Seq ID No:112 o Seq ID No:118, en particular Seq ID No:52 o Seq ID No:58 para LCDR2; y Seq ID No:22, Seq ID No:28, Seq ID No:54, Seq ID No:60, Seq ID No:86, Seq ID No:92, Seq ID No:114 o Seq ID No:120, en particular Seq ID No:54 o Seq ID No:60 para LCDR3).
En realizaciones específicas, un anticuerpo de la invención es un anticuerpo completamente humano, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo antagonista, un anticuerpo neutralizante de hOX40L, o cualquier combinación de los mismos, o la invención proporciona un fragmento de unión a hOX40L del mismo. En un ejemplo, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico que comprende dominios variables humanos y dominios constantes no humanos (por ejemplo, ratón, rata o conejo). En realizaciones particulares, el anticuerpo es un anticuerpo completamente humano, tal como un anticuerpo monoclonal completamente humano, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a hOX40L. En realizaciones preferidas, el anticuerpo es un anticuerpo antagonista. En realizaciones preferidas, el anticuerpo es un anticuerpo neutralizante.
En un ejemplo, el anticuerpo o fragmento es un anticuerpo o fragmento de tipo lambda (es decir, cuyos dominios variables son dominios variables lambda). Opcionalmente, el anticuerpo o fragmento también comprende dominios constantes lambda.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo compite (por ejemplo, de manera dependiente de la dosis) con OX40 o una proteína de fusión del mismo (por ejemplo, Fc:OX40), para unirse a hOX40L, tal como un hOX40L expresado en la superficie celular o un hOX40L soluble. En los Ejemplos de este documento se proporcionan ejemplos de ensayos de bloqueo competitivo.
En otro aspecto, se proporcionan aquí ácidos nucleicos aislados que codifican anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido hOX40L (por ejemplo, un hOX40L soluble o expresado en la superficie celular), un fragmento de polipéptido hOX40L, o un epítopo de hOX40L. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico codifica una cadena VH, una cadena VL, un dominio VH, un dominio VL, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 como se describe en el listado de secuencias (es decir, Seq ID No:30 o Seq ID No:62 para las cadenas VH; Seq ID No:32 o Seq ID No:64 para las cadenas VL; Seq ID No: Seq ID No:2, Seq ID No:34, Seq ID No:66 o Seq ID No:94, en particular Seq ID No:34 para los dominios VH; Seq ID No:16, Seq ID No:48, Seq ID No:80, o Seq ID No:108, en particular Seq ID No:48 para los dominios VL; Seq ID No:4, Seq ID No:10, Seq ID No:36, Seq iD No:42, Seq ID No:68, Seq ID No:74, Seq ID No:96 o Seq ID No:102, en particular, Seq ID No:36 o Seq ID No:42 para HCDR1; Seq ID No:6, Seq ID No:12, Seq ID No:38, Seq ID No:44, Seq iD No:70, Seq ID No:76, Seq ID No:98 o Seq ID No:104, en particular Seq ID No:38 o Seq ID No:44 para HCDR2; Seq ID No:8, Seq ID No:14, Seq ID No:40, Seq ID No:46, Seq ID No:72, Seq ID No:78, Seq ID No:100 o Seq ID No:106, en particular Seq ID No:40 o Seq iD No:46 para Hc d R3; Seq ID No:18, Seq ID No:24, Seq ID No:50, Seq ID No:56, Seq ID No:82, Seq ID No:88, Seq ID No:110 o Seq ID No:116, en particular Seq ID No:50 o Seq ID No:56 para LCDR1; Seq ID No:20, Seq ID No:26, Seq ID No:52, Seq ID No:58, Seq ID No:84, Seq ID No:90, Seq ID No:112 o Seq ID No:118, en particular Seq ID No:52 o Seq ID No:58 para LCDR2; y Seq ID No:22, Seq ID No:28, Seq ID No:54, Seq ID No:60, Seq ID No:86, Seq ID No:92, Seq ID No:114 o Seq iD No:120, en particular Seq ID No:54 o Seq ID No:60 para LCDR3).
En otro aspecto, se proporcionan aquí vectores y células hospedantes que comprenden ácidos nucleicos que codifican anticuerpos o fragmentos de la invención.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo se une específicamente a una o más variantes de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) de hOX40L. En un ejemplo de cualquier aspecto de la invención, el hOX40L es un trímero de monómeros.
En un aspecto, se proporciona aquí un método para disminuir (por ejemplo, en al menos un 20, 30, 40, 50 o 60%, o 70%, 80%, 90%, 95% o >90%) o inhibir completamente la unión de hOX40L a OX40 en un sujeto (por ejemplo, un sujeto humano), que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo o fragmento del mismo de la invención que se une específicamente a hOX40L (por ejemplo, un hOX40L soluble o expresado en la superficie celular).
En un aspecto, se proporciona aquí un método para tratar o prevenir una enfermedad o afección mediada por hOX40L en un sujeto (por ejemplo, un sujeto humano), comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo o fragmento del mismo de la invención que se une específicamente a hOX40L (por ejemplo, un hOX40L soluble o expresado en la superficie celular), en el que la enfermedad o afección es tratada o prevenida por el anticuerpo o fragmento. En un ejemplo, el método comprende disminuir o inhibir la actividad biológica de hOX40L, tal como la secreción de uno, más o todos de IL-2, IL-8, TNF alfa e interferón gamma, en el sujeto. En un ejemplo, la actividad biológica se selecciona de la secreción de uno, más o todos de IL-2, TNF alfa e interferón gamma. En un ejemplo, la actividad biológica se selecciona de la secreción de uno, más o todos de IL-8, CCL20 y RANTES.
En un aspecto, se proporciona aquí un método para disminuir o inhibir una actividad biológica de hOX40L, tal como la secreción de uno, más o todos de IL-2, IL-8, TNF alfa e interferón gamma, en un sujeto (por ejemplo, un ser humano sujeto), comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo o fragmento del mismo de la invención que se une específicamente a hOX40L (por ejemplo, un hOX40L soluble o expresado en la superficie celular), en el que la actividad biológica de hOX40L disminuye por el anticuerpo o fragmento. En un ejemplo, la actividad biológica se selecciona de la secreción de uno, más o todos de IL-2, TNF alfa e interferón gamma. En un ejemplo, la actividad biológica se selecciona de la secreción de uno, más o todos de IL-8, CCL20 y RANTES.
El término “alrededor de” o “aproximadamente” significa dentro del 20%, preferiblemente dentro del 10%, y más preferiblemente dentro del 5% (o 4%, o 3% o 2% o, en un ejemplo, 1% o menos) de un valor o intervalo dado.
Como se usa aquí, “administrar” o “administración” se refiere al acto de inyectar o administrar físicamente una sustancia tal como existe fuera del cuerpo (por ejemplo, un anticuerpo anti-hOX40L proporcionado aquí) a un paciente, tal como mediante administración intravenosa, intramuscular y/o cualquier otro método de administración física descrito aquí o conocido en la técnica. Cuando se trata una enfermedad, o un síntoma de la misma, la administración de la sustancia normalmente se produce después del inicio de la enfermedad o de los síntomas de la misma. Cuando se está previniendo una enfermedad, o los síntomas de la misma, la administración de la sustancia normalmente se produce antes de la aparición de la enfermedad o de los síntomas de la misma.
Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácidos nucleicos, las secuencias se alinean para lograr una comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir espacios en la secuencia de un primer aminoácido o secuencia de ácido nucleico para una alineación óptima con una segunda secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico). A continuación, los restos de aminoácidos o nucleótidos se comparan en las posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo resto de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = número de posiciones superpuestas idénticas/número total de posiciones x 100%). En una realización, las dos secuencias tienen la misma longitud.
La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias (por ejemplo, secuencias de aminoácidos o secuencias de ácidos nucleicos) también se puede lograr usando un algoritmo matemático. Un ejemplo preferido, no limitativo, de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264 2268, modificado como en Karlin y Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873 5877. Dicho algoritmo está incorporado en los programas Nb La ST y x BlAST de Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403. Las búsquedas de nucleótidos BLAST se pueden realizar con el conjunto de parámetros del programa de nucleótidos NBLAST, por ejemplo, para puntuación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias nucleotídicas homólogas a las moléculas de ácido nucleico de la presente invención. Las búsquedas de proteínas BLAST se pueden realizar con el conjunto de parámetros del programa XBLAST, por ejemplo, para una puntuación de 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a una molécula de proteína descrita aquí. Para obtener alineaciones con espacios con fines de comparación, se puede utilizar Gapped BLAST como se describe en Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:33893402. Alternativamente, puede usarse PSI BLAST para realizar una búsqueda iterativa que detecta relaciones distantes entre moléculas (Id.). Al utilizar los programas BLAST, Gapped BLAST y PSI Blast, se pueden usar los parámetros predeterminados de los respectivos programas (por ejemplo, de XBLAST y NBLAST) (véase, por ejemplo, National Center for Biotechnology Information (NCBI) en la web mundial, ncbi.nlm.nih.gov). Otro ejemplo preferido, no limitativo, de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller, 1988, CABIOS 4:11 17. Tal algoritmo está incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0) que es parte del paquete de software de alineación de secuencias GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, se puede usar una tabla de restos de peso PAM120, una penalización de longitud de espacio de 12, y una penalización de espacio de 4.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede determinar usando técnicas similares a las descritas anteriormente, con o sin permitir espacios. Al calcular el porcentaje de identidad, normalmente solo se cuentan las coincidencias exactas.
Como se usa aquí, un “antagonista” o “inhibidor” de hOX40L se refiere a un ligando (por ejemplo, anticuerpo o fragmento) que es capaz de inhibir o disminuir una o más de las actividades biológicas de hOX40L, tal como en una célula que expresa hOX40L o en una célula que expresa un ligando hOX40L. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, los anticuerpos de la invención son anticuerpos antagonistas que inhiben o disminuyen la secreción de CCL20, IL-8 y/o RANTES de una célula que tiene un OX40 expresado en la superficie celular cuando dicho anticuerpo se pone en contacto con dicha célula. En algunas realizaciones, un antagonista de hOX40L (por ejemplo, un anticuerpo antagonista de la invención) puede actuar, por ejemplo, inhibiendo o disminuyendo de otro modo la activación y/o las rutas de señalización celular de la célula que expresa OX40L, inhibiendo así una actividad biológica mediada por hOX40L de la célula con respecto a la actividad biológica mediada por hOX40L en ausencia de antagonista. En ciertas realizaciones, los anticuerpos proporcionados aquí son anticuerpos anti-hOX40L antagonistas totalmente humanos, preferiblemente anticuerpos anti-hOX40L antagonistas monoclonales totalmente humanos.
El término “anticuerpo” e “inmunoglobulina” o “Ig” se puede usar aquí de forma intercambiable. Un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une específicamente a un antígeno hOX40L puede reaccionar de forma cruzada con antígenos relacionados. Preferiblemente, un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une específicamente a un antígeno hOX40L no reacciona de forma cruzada con otros antígenos (pero puede opcionalmente reaccionar de forma cruzada con OX40L de una especie diferente, por ejemplo rhesus o murino). Un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une específicamente a un antígeno hOX40L puede identificarse, por ejemplo, mediante inmunoensayos, BIAcore™, u otras técnicas conocidas por los expertos en la materia. Un anticuerpo o un fragmento del mismo se une específicamente a un antígeno hOX40L cuando se une a un antígeno hOX40L con mayor afinidad que a cualquier antígeno de reactividad cruzada, según se determina mediante técnicas experimentales, tales como radioinmunoensayos (RIA) y ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA). Por lo general, una reacción específica o selectiva será al menos el doble de la señal o el ruido de fondo, y, más típicamente, más de 10 veces el fondo. Véase, por ejemplo, Paul, ed., 1989, Fundamental Immunology Segunda Edición, Raven Press, Nueva York, en las páginas 332-336, para una discusión sobre la especificidad de los anticuerpos.
Los anticuerpos de la invención incluyen, entre otros, anticuerpos sintéticos, anticuerpos monoclonales, anticuerpos producidos de forma recombinante, anticuerpos multiespecíficos (incluyendo anticuerpos biespecíficos), anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, intracuerpos, Fv monocatenarios (scFv) (por ejemplo, incluyendo monoespecíficos, biespecíficos, etc.), anticuerpos camelizados, fragmentos Fab, fragmentos F(ab’), Fv enlazados por disulfuro (sdFv), anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id), y fragmentos de unión a epítopos de cualquier de los anteriores. En particular, los anticuerpos de la presente invención incluyen moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, dominios de unión a antígeno o moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno hOX40L (por ejemplo, una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo anti-hOX40L). Los anticuerpos de la invención pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), cualquier clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2, en particular IgG4), o cualquier subclase (por ejemplo, IgG2a e IgG2b) de molécula de inmunoglobulina. En realizaciones preferidas, los anticuerpos hOX40L son completamente humanos, tales como anticuerpos monoclonales hOX40L completamente humanos. En ciertas realizaciones, los anticuerpos de la invención son anticuerpos IgG, o una clase (por ejemplo, IgG1 o IgG4 humana) o subclase de los mismos. En ciertas realizaciones, los anticuerpos de la invención comprenden una región constante gamma 4 humana. En otra realización, la región constante de la cadena pesada no se une a los receptores Fc-y, y por ejemplo, comprende una mutación Leu235Glu. En otra realización, la región constante de la cadena pesada comprende una mutación Ser228Pro para aumentar la estabilidad. En otra realización, la región constante de la cadena pesada es IgG4-PE.
La expresión “dominio de unión a antígeno”, “región de unión a antígeno”, “fragmento de unión a antígeno”, y términos similares, se refieren a la porción de un anticuerpo que comprende los restos de aminoácidos que interactúan con un antígeno y confieren al agente de unión su especificidad y afinidad por el antígeno (por ejemplo, las regiones determinantes de la complementariedad (CDR)). La región de unión al antígeno puede proceder de cualquier especie animal, tales como roedores (por ejemplo, conejo, rata o hámster) y seres humanos. Preferiblemente, la región de unión al antígeno será de origen humano.
Como se usa aquí, el término “composición” pretende abarcar un producto que contiene los ingredientes especificados (por ejemplo, un anticuerpo de la invención) en, opcionalmente, las cantidades especificadas, así como cualquier producto que resulte, directa o indirectamente, de la combinación de los ingredientes especificados en, opcionalmente, las cantidades especificadas.
En el contexto de un polipéptido, el término “derivado”, como se usa aquí, se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de un polipéptido hOX40L, un fragmento de un polipéptido hOX40L, o un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido hOX40L que se ha alterado por la introducción de sustituciones, supresiones o adiciones de restos de aminoácidos. El término “derivado”, como se usa aquí, también se refiere a un polipéptido hOX40L, un fragmento de un polipéptido hOX40L, o un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido hOX40L que se ha modificado químicamente, por ejemplo mediante la unión covalente de cualquier tipo de molécula al polipéptido. Por ejemplo, pero sin limitación, un polipéptido hOX40L, un fragmento de un polipéptido hOX40L, o un anticuerpo anti-hOX40L pueden modificarse químicamente, por ejemplo mediante glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos protectores/bloqueadores conocidos, escisión proteolítica, unión a un ligando celular u otra proteína, etc. Los derivados se modifican de una manera que es diferente de los péptidos o polipéptidos naturales o de partida, ya sea en el tipo o la ubicación de las moléculas unidas. Los derivados incluyen además la eliminación de uno o más grupos químicos que están naturalmente presentes en el péptido o polipéptido. Un derivado de un polipéptido hOX40L, un fragmento de un polipéptido hOX40L, o un anticuerpo anti-hOX40L puede modificarse químicamente mediante modificaciones químicas usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica, incluyenfo, entre otras, escisión química específica, acetilación, formulación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Además, un derivado de un polipéptido hOX40L, un fragmento de un polipéptido hOX40L, o un anticuerpo anti-hOX40L puede contener uno o más aminoácidos no clásicos. Un derivado de polipéptido posee una función similar o idéntica a la de un polipéptido hOX40L, un fragmento de un polipéptido hOX40L, o un anticuerpo anti-hOX40L descrito aquí.
La expresión “cantidad eficaz”, como se usa aquí, se refiere a la cantidad de una terapia (por ejemplo, un anticuerpo o una composición farmacéutica proporcionada aquí) que es suficiente para reducir y/o mejorar la gravedad y/o la duración de una enfermedad dada y/o un síntoma relacionado con la misma. Esta expresión también abarca una cantidad necesaria para la reducción o mejora del avance o la progresión de una enfermedad dada, la reducción o mejora de la recurrencia, el desarrollo o la aparición de una enfermedad dada, y/o para mejorar o potenciar el o los efectos profiláctico o terapéutico de otra terapia (por ejemplo, una terapia distinta del anticuerpo anti-hOX40L proporcionado aquí). En algunas realizaciones, la cantidad eficaz de un anticuerpo de la invención es de alrededor de 0,1 mg/kg (mg de anticuerpo por kg de peso del sujeto) a alrededor de 100 mg/kg. En ciertas realizaciones, una cantidad eficaz de un anticuerpo proporcionado en el mismo es alrededor de 0,1 mg/kg, alrededor de 0,5 mg/kg, alrededor de 1 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, alrededor de 10 mg/kg, alrededor de 15 mg/kg, alrededor de 20 mg/kg, alrededor de 25 mg/kg, alrededor de 30 mg/kg, alrededor de 35 mg/kg, alrededor de 40 mg/kg, alrededor de 45 mg/kg, alrededor de 50 mg/kg, alrededor de 60 mg/kg, alrededor de 70 mg/kg, alrededor de 80 mg/kg, alrededor de 90 mg/kg o alrededor de 100 mg/kg (o un intervalo de los mismos). En algunas realizaciones, “cantidad eficaz”, como se usa aquí, también se refiere a la cantidad de un anticuerpo de la invención para lograr un resultado específico (por ejemplo, la inhibición de una actividad biológica de hOX40L de una célula, tal como la inhibición de la secreción de CCL20, IL-8 o RANTES, o INF-g, TNF-a o IL-2, en particular INF-g, de la célula).
El término “epítopo”, como se usa aquí, se refiere a una región localizada en la superficie de un antígeno, tal como el polipéptido hOX40L o el fragmento del polipéptido hOX40L, que es capaz de unirse a una o más regiones de unión a antígeno de un anticuerpo, y que tiene actividad antigénicas o inmunogénica en un animal, preferentemente un mamífero, y lo más preferentemente en un ser humano, que es capaz de provocar una respuesta inmunitaria. Un epítopo que tiene actividad inmunogénica es una porción de un polipéptido que provoca una respuesta de anticuerpos en un animal. Un epítopo que tiene actividad antigénica es una parte de un polipéptido al que se une específicamente un anticuerpo, según se determina mediante cualquier método bien conocido en la técnica, por ejemplo mediante los inmunoensayos descritos aquí. Los epítopos antigénicos no necesitan ser necesariamente inmunogénicos. Los epítopos suelen consistir en agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, y tienen características estructurales tridimensionales específicas así como características de carga específicas. Una región de un polipéptido que contribuye a un epítopo puede ser aminoácidos contiguos del polipéptido, o el epítopo puede proceder de dos o más regiones no contiguas del polipéptido. El epítopo puede ser o no una característica superficial tridimensional del antígeno. En ciertas realizaciones, un epítopo de hOX40L es una característica superficial tridimensional de un polipéptido hOX40L (por ejemplo, en una forma trimérica de un polipéptido hOX40L). En otras realizaciones, un epítopo de hOX40L es una característica lineal de un polipéptido hOX40L (por ejemplo, en una forma trimérica o monomérica del polipéptido hOX40L). Los anticuerpos proporcionados aquí pueden unirse específicamente a un epítopo de la forma monomérica (desnaturalizada) de hOX40L, a un epítopo de la forma trimérica (nativa) de hOX40L, o tanto a la forma monomérica (desnaturalizada) como a la forma trimérica (nativa) de hOX40L. En realizaciones específicas, los anticuerpos proporcionados aquí se unen específicamente a un epítopo de la forma trimérica de hOX40L, pero no se unen específicamente a la forma monomérica de hOX40L.
El término “excipientes”, como se usa aquí, se refiere a sustancias inertes que se usan comúnmente como diluyentes, vehículos, conservantes, aglutinantes, o agentes estabilizadores para fármacos, e incluye, pero no se limita a, proteínas (por ejemplo, seroalbúmina, etc.), aminoácidos (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina, arginina, glicina, histidina, etc.), ácidos grasos y fosfolípidos (por ejemplo, alquilsulfonatos, caprilato, etc.), tensioactivos (por ejemplo, SDS, polisorbato, tensioactivo no iónico, etc.), sacáridos (por ejemplo, sacarosa, maltosa, trehalosa, etc.) y polioles (por ejemplo, manitol, sorbitol, etc.). Véase también, Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, Pa.
En el contexto de un péptido o polipéptido, el término “fragmento”, como se usa aquí, se refiere a un péptido o polipéptido que comprende menos de la secuencia de aminoácidos de longitud completa. Tal fragmento puede surgir, por ejemplo, de un truncamiento en el extremo amino, un truncamiento en el extremo carboxi, y/o una supresión interna de uno o más restos de la secuencia de aminoácidos. Los fragmentos pueden resultar, por ejemplo, del ayuste de ARN alternativo o de la actividad de la proteasa in vivo. En ciertas realizaciones, los fragmentos de hOX40L incluyen polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos de al menos 5 restos de aminoácidos contiguos, al menos 10 restos de aminoácidos contiguos, al menos 15 restos de aminoácidos contiguos, al menos 20 restos de aminoácidos contiguos, al menos 25 restos de aminoácidos contiguos, al menos 40 restos de aminoácidos contiguos, al menos 50 restos de aminoácidos contiguos, al menos 60 restos de aminoácidos contiguos, al menos 70 restos de aminoácidos contiguos, al menos 80 restos de aminoácidos contiguos, al menos 90 restos de aminoácidos contiguos, al menos 100 restos de aminoácidos contiguos, al menos 125 restos de aminoácidos contiguos, al menos 150 restos de aminoácidos contiguos, al menos 175 restos de aminoácidos contiguos, al menos 200 restos de aminoácidos contiguos, o al menos 250 restos de aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido hOX40L o un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido hOX40L. En una realización específica, un fragmento de un polipéptido hOX40L o un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno hOX40L retiene al menos 1, al menos 2, o al menos 3 funciones del polipéptido o anticuerpo.
Las expresiones “anticuerpo totalmente humano” o “anticuerpo humano” se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a un anticuerpo que comprende una región variable humana y, lo más preferiblemente, una región constante humana. En realizaciones específicas, las expresiones se refieren a un anticuerpo que comprende una región variable y una región constante de origen humano. Los anticuerpos anti-hOX40L “totalmente humanos”, en ciertas realizaciones, también pueden abarcar anticuerpos que se unen a polipéptidos hOX40L y están codificados por secuencias de ácido nucleico que son variantes somáticas naturales de la secuencia de ácido nucleico de inmunoglobulina de línea germinal humana. En una realización específica, los anticuerpos anti-hOX40L proporcionados aquí son anticuerpos completamente humanos. La expresión “anticuerpo completamente humano” incluye anticuerpos que tienen regiones variables y constantes correspondientes a secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana como describen Kabat et al. (Véase Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). En los Ejemplos aquí, por ejemplo, se proporcionan ejemplos de métodos para producir anticuerpos completamente humanos, pero se puede usar cualquier método conocido en la técnica.
La frase “anticuerpo humano recombinante” incluye anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula hospedante, anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos humanos combinatorios recombinantes, anticuerpos aislado de un animal (por ejemplo, un ratón o una vaca) que es transgénico y/o transcromosómico para genes de inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, Taylor, L. D. et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295), o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el ayuste de secuencias de genes de inmunoglobulina humana con otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes pueden tener regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (Véase Kabat, E. A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). En ciertas realizaciones, sin embargo, tales anticuerpos humanos recombinantes se someten a mutagénesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgénico para secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo), y por lo tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivan y están relacionadas con las secuencias de VH y VL de la línea germinal humana, pueden no existir naturalmente dentro del repertorio de la línea germinal del anticuerpo humano in vivo.
La expresión “proteína de fusión”, como se usa aquí, se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo y una secuencia de aminoácidos de un polipéptido o proteína heteróloga (es decir, un polipéptido o proteína que normalmente no forma parte del anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo no anti-antígeno hOX40L)). El término “fusión”, cuando se usa con respecto a hOX40L, o con un anticuerpo anti-hOX40L, se refiere a la unión de un péptido o polipéptido, o fragmento, variante y/o derivado del mismo, con un péptido o polipéptido heterólogo. Preferiblemente, la proteína de fusión retiene la actividad biológica del hOX40L o del anticuerpo antihOX40L. En ciertas realizaciones, la proteína de fusión comprende un dominio VH del anticuerpo anti-hOX40L, un dominio VL, VH CDR (una, dos o tres VH CDR), y/o VL CDR (una, dos o tres VL CDR), en la que la proteína de fusión se une específicamente a un epítopo de hOX40L.
La expresión “cadena pesada”, cuando se usa en referencia a un anticuerpo, se refiere a cinco tipos distintos, llamados alfa (a), delta (5), épsilon (s), gamma (g) y mu (g), según la secuencia de aminoácidos del dominio constante de la cadena pesada. Estos distintos tipos de cadenas pesadas son bien conocidos, y dan lugar a cinco clases de anticuerpos, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, respectivamente, que incluyen cuatro subclases de IgG, a saber, IgG1, IgG1, IgG3 e IgG4. Preferiblemente, la cadena pesada es una cadena pesada humana. En un ejemplo, la cadena pesada es un isotipo de IgG desactivado, por ejemplo una IgG4 desactivada. En ciertas realizaciones, los anticuerpos de la invención comprenden una región constante gamma 4 humana. En otra realización, la región constante de la cadena pesada no se une a los receptores Fc-y, y por ejemplo comprende una mutación Leu235Glu. En otra realización, la región constante de la cadena pesada comprende una mutación Ser228Pro para aumentar la estabilidad. En otra realización, la región constante de la cadena pesada es IgG4-PE.
El término “hospedante”, como se usa aquí, se refiere a un animal, preferiblemente un mamífero, y lo más preferible, un ser humano.
La expresión “célula hospedante”, como se usa aquí, se refiere a la célula sujeto particular transfectada con una molécula de ácido nucleico, y a la progenie o progenie potencial de tal célula. La progenie de tal célula puede no ser idéntica a la célula original transfectada con la molécula de ácido nucleico, debido a mutaciones o influencias ambientales que pueden ocurrir en generaciones sucesivas, o a la integración de la molécula de ácido nucleico en el genoma de la célula hospedante.
La expresión “agente inmunomodulador”, y variaciones de la misma, que incluyen, pero sin limitarse a, agentes inmunomoduladores, como se usa aquí, se refiere a un agente que modula el sistema inmunitario de un hospedante. En ciertas realizaciones, un agente inmunomodulador es un agente inmunosupresor. En otras ciertas realizaciones, un agente inmunomodulador es un agente inmunoestimulador. Según la invención un agente inmunomodulador usado en terapias combinadas de la invención no incluye un anticuerpo anti-hOX40L o un fragmento de unión a antígeno. Los agentes inmunomoduladores incluyen, pero no se limitan a, moléculas pequeñas, péptidos, polipéptidos, proteínas, proteínas de fusión, anticuerpos, moléculas inorgánicas, agentes miméticos, y moléculas orgánicas.
Como se usa aquí, la expresión “en combinación”, en el contexto de la administración de otras terapias, se refiere al uso de más de una terapia. El uso de la expresión “en combinación” no restringe el orden en que se administran las terapias a un sujeto con una enfermedad. Se puede administrar una primera terapia antes (por ejemplo, 1 minuto, 45 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas o 12 semanas), al mismo tiempo o después (por ejemplo, 1 minuto, 45 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas o 12 semanas) de la administración de un segunda terapia a un sujeto que tenía, tiene o es susceptible a una enfermedad mediada por hOX40L. Cualquier terapia adicional se puede administrar en cualquier orden con las otras terapias adicionales. En ciertas realizaciones, los anticuerpos de la invención se pueden administrar en combinación con una o más terapias (por ejemplo, terapias que no son los anticuerpos de la invención que se administran actualmente para prevenir, tratar, controlar y/o mejorar una enfermedad mediada por hOX40L). Los ejemplos no limitativos de terapias que se pueden administrar en combinación con un anticuerpo de la invención incluyen agentes analgésicos, agentes anestésicos, antibióticos, o agentes inmunomoduladores o cualquier otro agente enumerado en la Farmacopea de los EE. UU. y/o Physician’s Desk Reference.
Un anticuerpo “aislado” o “purificado” está, por ejemplo, sustancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes de la fuente celular o tisular de la que deriva el anticuerpo, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. El lenguaje “sustancialmente libre de material celular” incluye preparaciones de un anticuerpo en las que el anticuerpo se separa de los componentes celulares de las células de las que se aísla o se produce de forma recombinante. Por lo tanto, un anticuerpo que está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de anticuerpos que tienen menos de alrededor de 30%, 20%, 10% o 5% (en peso seco) de proteína heteróloga (también denominada aquí “proteína contaminante”). Cuando el anticuerpo se produce de forma recombinante, preferiblemente también está sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de alrededor del 20%, 10% o 5% del volumen de la preparación de proteína. Cuando el anticuerpo se produce mediante síntesis química, preferiblemente está sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos, es decir, se separa de los precursores químicos u otros productos químicos que están implicados en la síntesis de la proteína. Por consiguiente, dichas preparaciones del anticuerpo tienen menos de alrededor de 30%, 20%, 10%, 5% (en peso seco) de precursores químicos o compuestos distintos del anticuerpo de interés. En una realización preferida, los anticuerpos de la invención se aíslan o purifican.
Una molécula de ácido nucleico “aislada” es aquella que está separada de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural de la molécula de ácido nucleico. Además, una molécula de ácido nucleico “aislada”, tal como una molécula de ADNc, puede estar sustancialmente libre de otro material celular o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. En una realización específica, una molécula o moléculas de ácido nucleico que codifican un anticuerpo de la invención se aíslan o purifican.
La expresión “OX40L humano”, “hOX40L” o “polipéptido hOX40L”, y términos similares, se refieren a los polipéptidos (“polipéptidos”, “péptidos” y “proteínas” se usan indistintamente aquí) que comprenden la secuencia de aminoácidos en el listado de secuencias y polipéptidos relacionados, incluyendo variantes de SNP de los mismos. Los polipéptidos relacionados incluyen variantes alélicas (por ejemplo, variantes de SNP); variantes de ayuste; fragmentos; derivados; variantes de sustitución, eliminación e inserción; polipéptidos de fusión; y homólogos entre especies, preferiblemente, que conservan la actividad de hOX40L y/o son suficientes para generar una respuesta inmunitaria anti-hOX40L. También se incluyen formas solubles de hOX40L que son suficientes para generar una respuesta inmunológica antihOX40L. Como apreciarán los expertos en la técnica, un anticuerpo anti-hOX40L de la invención puede unirse a un polipéptido, fragmento polipeptídico, antígeno y/o epítopo de hOX40L, ya que un epítopo es parte del antígeno más grande, que es parte del fragmento polipeptídico que, a su vez, forma parte del polipéptido más grande hOX40L que puede existir en forma trimérica (nativa) o monomérica (desnaturalizada).
La expresión “numeración de Kabat” y términos similares se reconocen en la técnica, y se refieren a un sistema de numeración de restos de aminoácidos que son más variables (es decir, hipervariables) que otros restos de aminoácidos en las regiones variables de la cadena pesada de un anticuerpo, o un porción de unión a antígeno del mismo (Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190:382-391, y Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91 -3242).
Para la región variable de la cadena pesada, la región hipervariable normalmente oscila entre las posiciones de aminoácidos 31 a 35 para CDR1, las posiciones de aminoácidos 50 a 65 para CDR2, y las posiciones de aminoácidos 95 a 102 para CDR3.
La expresión “anticuerpo monoclonal” se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos homogéneos o sustancialmente homogéneos, y cada anticuerpo monoclonal reconocerá típicamente un solo epítopo en el antígeno. En realizaciones preferidas, un “anticuerpo monoclonal”, como se usa aquí, es un anticuerpo producido por un único hibridoma u otra célula, en el que el anticuerpo se une específicamente solo a un epítopo de hOX40L según lo determinado, por ejemplo, mediante ELISA u otro ensayo de unión a antígeno o de unión competitiva conocido en la técnica o en los Ejemplos proporcionados aquí. El término “monoclonal” no se limita a ningún método particular para producir el anticuerpo. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales de la invención se pueden producir mediante el método de hibridoma como se describe en Kohler et al.; Nature, 256:495 (1975), o puede aislarse de bibliotecas de fagos usando las técnicas que se describen aquí, por ejemplo. Otros métodos para la preparación de líneas celulares clonales y de anticuerpos monoclonales expresados por ellas son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Capítulo 11 en: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5.a ed., Ausubel et al., eds., John Wiley and Sons, Nueva York). Otros ejemplos de métodos para producir otros anticuerpos monoclonales se proporcionan en los Ejemplos aquí.
El término “natural” o “nativo”, cuando se usa con respecto a materiales biológicos tales como moléculas de ácido nucleico, polipéptidos, células hospedantes, y similares, se refiere a aquellos que se encuentran en la naturaleza y no son manipulados por un ser humano.
La expresión “farmacéuticamente aceptable”, tal como se usa aquí, significa estar aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal, o enumerado en la Farmacopea de los EE.UU., la Farmacopea Europea, u otra Farmacopea generalmente reconocida para uso en animales, y más particularmente en seres humanos.
“Anticuerpos policlonales”, tal como se usa aquí, se refiere a una población de anticuerpos generada en una respuesta inmunogénica a una proteína que tiene muchos epítopos, y, por lo tanto, incluye una variedad de anticuerpos diferentes dirigidos al mismo y a diferentes epítopos dentro de la proteína. Los métodos para producir anticuerpos policlonales son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Capítulo 11 en: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5.a ed., Ausubel et al., eds., John Wiley and Sons, Nueva York).
Como se usa aquí, el término “polinucleótido”, “nucleótido”, “ácido nucleico”, “molécula de ácido nucleico”, y otros términos similares, se usan de manera intercambiable, e incluyen ADN, ARN, ARNm y similares.
Como se usan aquí, los términos “prevenir”, “que previene” y “prevención” se refieren a la inhibición total o parcial del desarrollo, la recurrencia, el inicio o la propagación de una enfermedad mediada por hOX40L y/o un síntoma relacionado con la misma, como resultado de la administración de una terapia o combinación de terapias proporcionadas aquí (por ejemplo, una combinación de agentes profilácticos o terapéuticos, tal como un anticuerpo de la invención).
Como se usa aquí, la expresión “agente profiláctico” se refiere a cualquier agente que puede inhibir total o parcialmente el desarrollo, recurrencia, inicio o propagación de una enfermedad mediada por hOX40L y/o síntoma relacionado con la misma en un sujeto. En ciertas realizaciones, el término “agente profiláctico” se refiere a un anticuerpo de la invención. En ciertas otras realizaciones, el término “agente profiláctico” se refiere a un agente distinto de un anticuerpo de la invención. Preferiblemente, un agente profiláctico es un agente que se sabe que es útil o que se ha usado, o que se usa actualmente para prevenir una enfermedad mediada por hOX40L y/o un síntoma relacionado con ella, o que impide el inicio, el desarrollo, la progresión y/o la gravedad de una enfermedad mediada por hOX40L y/o un síntoma relacionado con ella. En realizaciones específicas, el agente profiláctico es un anticuerpo anti-hOX40L completamente humano, tal como un anticuerpo monoclonal anti-hOX40L completamente humano.
En una realización, la profilaxis previene la aparición de la enfermedad o afección o de los síntomas de la enfermedad o afección. En una realización, el tratamiento profiláctico evita el empeoramiento o la aparición de la enfermedad o afección. En una realización, el tratamiento profiláctico previene el empeoramiento de la enfermedad o afección.
En otra realización, un anticuerpo anti-OX40L de la invención se administra por vía intravenosa (por ejemplo, antes o simultáneamente con un trasplante, por ejemplo trasplante de sangre o de órganos). En otra realización, dicho anticuerpo se administra a una dosis de alrededor de 5-10 mg/kg (por ejemplo, alrededor de 8 mg/kg). En otra realización, dicho anticuerpo se administra a una dosis seleccionada de alrededor de 0,1 mg/kg, alrededor de 0,5 mg/kg, alrededor de 1 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, alrededor de 10 mg/kg, alrededor de 15 mg/kg, alrededor de 20 mg/kg, alrededor de 25 mg/kg, alrededor de 30 mg/kg, alrededor de 40 mg/kg, alrededor de 50 mg/kg, alrededor de 60 mg/kg, alrededor de 70 mg/kg, alrededor de 80 mg/kg, alrededor de 90 mg/kg, o alrededor de 100 mg/kg, en particular alrededor de 1 mg/kg, o alrededor de 3 mg/kg.
En otra realización, dicho anticuerpo se administra 1-4 días antes del trasplante (por ejemplo, de sangre u órganos), por ejemplo 1-3 días antes del trasplante o 1-2 días antes del trasplante. En otra realización, dicho anticuerpo se administra semanal, quincenal o mensualmente después del trasplante, por ejemplo quincenalmente. En una realización adicional, dicho anticuerpo se administra profilácticamente por vía intravenosa 1 -3 días antes del trasplante, a una dosis de alrededor de 5-10 mg/kg (por ejemplo, alrededor de 8 mg/kg), y después por vía intravenosa, cada dos semanas, a una dosis de alrededor de 5-10 mg/kg (por ejemplo, alrededor de 8 mg/kg).
En otra realización, el paciente es monitorizado periódicamente después del trasplante, para detectar la presencia de un biomarcador predictivo para el desarrollo de rechazo del trasplante o de EICH (por ejemplo, EICH aguda), y el anticuerpo anti-OX40L de la invención se administra una vez que los niveles del biomarcador son tales que se determina que el paciente corre el riesgo de desarrollar rechazo del trasplante o EICH (por ejemplo, EICH aguda). Esta estrategia evitaría la dosificación innecesaria del fármaco y la supresión innecesaria del sistema inmunitario. Los ejemplos de biomarcadores que pueden ser útiles como biomarcadores predictivos de la EICH aguda pueden ser los identificados en Levine et al., “A prognostic score for acute graft-versus-host disease based on biomarkers: a multicentre study”, Lancet Haematol 2015; 2:e21-29. Estos biomarcadores incluyen, pero no se limitan a, TNFR1, ST-2, elafina e IL2Ra y Reg3a.
Una región de hOX40L que contribuye a un epítopo puede ser aminoácidos contiguos del polipéptido, o el epítopo puede proceder de dos o más regiones no contiguas del polipéptido. El epítopo puede ser o no una característica superficial tridimensional del antígeno. Una región localizada en la superficie de un antígeno hOX40L que es capaz de provocar una respuesta inmunitaria es un epítopo de hOX40L. El epítopo puede ser o no una característica superficial tridimensional del antígeno.
Una “enfermedad mediada por hOX40L” y una “afección mediada por hOX40L” se usan indistintamente, y se refieren a cualquier enfermedad o afección que sea total o parcialmente causada por hOX40L, o que sea el resultado de la misma. En ciertas realizaciones, hOX40L se expresa de manera anómala (por ejemplo, altamente) en la superficie de una célula. En algunas realizaciones, hOX40L puede aumentar de forma anómala en un tipo de célula particular. En otras realizaciones, la señalización celular normal, aberrante o excesiva se produce mediante la unión de hOX40L a un ligando de hOX40L. En ciertas realizaciones, el ligando de hOX40L es OX40, por ejemplo que se expresa en la superficie de una célula, tal como una célula epitelial colónica. En ciertas realizaciones, la enfermedad mediada por hOX40L es una enfermedad inflamatoria intestinal (EII), tal como la enfermedad de Crohn (CD) o la colitis ulcerosa (CU). En otras realizaciones, la enfermedad mediada por hOX40L es la enfermedad de injerto contra hospedante (EICH). En otras realizaciones, la enfermedad mediada por hOX40L se selecciona de pioderma gangrenoso, arteritis de células gigantes, síndrome de Schnitzler, escleritis no infecciosa y uveítis (no infecciosa/autoinmune y/o sistémica). En ciertas realizaciones, una enfermedad o afección mediada por hOX40L se selecciona de una enfermedad o afección autoinmune, una enfermedad o afección inflamatoria sistémica, o rechazo de trasplantes; por ejemplo, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, rechazo de trasplantes, rechazo de trasplantes alogénicos, enfermedad de injerto contra hospedante (EICH), colitis ulcerosa, lupus eritematoso sistémico (LES), diabetes, uveítis, espondilitis anquilosante, hipersensibilidad por contacto, esclerosis múltiple y aterosclerosis, en particular EICH.
Las expresiones “receptor de hOX40L” o “receptor de unión de hOX40L” se usan indistintamente aquí, y se refieren a un polipéptido receptor que se une a hOX40L. En realizaciones específicas, el receptor de hOX40L es Hox40. En algunas realizaciones, el receptor de hOX40L se expresa en la superficie de una célula, tal como una célula epitelial colónica; o en tejido de injerto o de trasplante, o en tejido hospedante.
Como se usan aquí, los términos “sujeto” y “paciente” se usan indistintamente. Como se usa aquí, un sujeto es preferiblemente un mamífero, tal como un no primate (por ejemplo, vacas, cerdos, caballos, gatos, perros, ratas, etc.) o un primate (por ejemplo, mono y ser humano), más preferiblemente un ser humano. En una realización, el sujeto es un mamífero, preferiblemente un ser humano, que tiene una enfermedad mediada por hOX40L. En otra realización, el sujeto es un mamífero, preferiblemente un ser humano, con riesgo de desarrollar una enfermedad mediada por hOX40L.
Como se usa aquí, “sustancialmente todo” se refiere a al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 75%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 98%, al menos alrededor de 99%, o alrededor del 100%.
La expresión “sustancialmente libre de tensioactivos”, como se usa aquí, se refiere a una formulación de un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno hOX40L, conteniendo dicha formulación menos del 0,0005%, menos del 0,0003%, o menos del 0,0001% de tensioactivos, y/o menos del 0,0005%, menos del 0,0003%, o menos del 0,0001% de tensioactivos.
La expresión “sustancialmente libre de sal”, como se usa aquí, se refiere a una formulación de un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno hOX40L, conteniendo dicha formulación menos del 0,0005%, menos del 0,0003%, o menos del 0,0001% de sales inorgánicas.
El término “tensioactivo”, como se usa aquí, se refiere a sustancias orgánicas que tienen estructuras anfipáticas; es decir, están compuestas por grupos de tendencias de solubilidad opuestas, típicamente una cadena hidrocarbonada soluble en aceite y un grupo iónico soluble en agua. Los tensioactivos se pueden clasificar, según la carga del resto tensioactivo, en tensioactivos aniónicos, catiónicos, y no iónicos. Los tensioactivos se usan a menudo como agentes humectantes, emulsionantes, solubilizantes, y dispersantes para diversas composiciones farmacéuticas y preparaciones de materiales biológicos.
Como se usa aquí, el término “etiqueta” se refiere a cualquier tipo de resto que se une a, por ejemplo, un polipéptido y/o un polinucleótido que codifica un hOX40L o anticuerpo anti-hOX40L o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Por ejemplo, un polinucleótido que codifica un hOX40L, un anticuerpo anti-hOX40L o un fragmento de unión a antígeno del mismo, puede contener una o más secuencias nucleotídicas que codifican etiquetas adicionales que codifican, por ejemplo, un resto detectable o un resto que ayuda en la purificación por afinidad. Cuando se traducen, la etiqueta y el anticuerpo pueden estar en forma de una proteína de fusión. El término “detectable” o “detección”, con referencia a una etiqueta, se refiere a cualquier etiqueta que se pueda visualizar o en la que la presencia de la etiqueta se pueda determinar y/o medir de otro modo (por ejemplo, mediante cuantificación). Un ejemplo no limitativo de una etiqueta detectable es una etiqueta fluorescente.
Como se usa aquí, la expresión “agente terapéutico” se refiere a cualquier agente que se puede usar en el tratamiento, manejo o mejora de una enfermedad mediada por hOX40L y/o un síntoma relacionado con la misma. En ciertas realizaciones, la expresión “agente terapéutico” se refiere a un anticuerpo de la invención. En ciertas otras realizaciones, la expresión “agente terapéutico” se refiere a un agente distinto de un anticuerpo de la invención. Preferiblemente, un agente terapéutico es un agente que se sabe que es útil, o que se ha usado, o se está usando actualmente, para el tratamiento, manejo o mejora de una enfermedad mediada por hOX40L o uno o más síntomas relacionados con la misma. En realizaciones específicas, el agente terapéutico es un anticuerpo anti-hOX40L completamente humano, tal como un anticuerpo monoclonal anti-hOX40L completamente humano.
La combinación de terapias (por ejemplo, uso de agentes profilácticos o terapéuticos) que es más eficaz que los efectos aditivos de dos o más terapias individuales cualesquiera. Por ejemplo, un efecto sinérgico de una combinación de agentes profilácticos y/o terapéuticos permite el uso de dosis más bajas de uno o más de los agentes y/o la administración menos frecuente de dichos agentes a un sujeto con una enfermedad mediada por hOX40L. La capacidad de utilizar dosis más bajas de terapias profilácticas o terapéuticas y/o de administrar dichas terapias con menos frecuencia reduce la toxicidad asociada con la administración de dichas terapias a un sujeto sin reducir la eficacia de dichas terapias en la prevención, manejo, tratamiento o mejora de una enfermedad mediada por hOX40L. Además, un efecto sinérgico puede dar como resultado una eficacia mejorada de las terapias en la prevención, o en el manejo, tratamiento o mejora de una enfermedad mediada por hOX40L. Finalmente, el efecto sinérgico de una combinación de terapias (por ejemplo, agentes profilácticos o terapéuticos) puede evitar o reducir los efectos secundarios adversos o no deseados asociados con el uso de cualquier terapia individual.
En una realización, la combinación comprende un anticuerpo anti-OX40L de la invención y agentes terapéuticos adicionales seleccionados independientemente del grupo que consiste en rapamicina (sirolimus), tacrolimus, ciclosporina, corticosteroides (por ejemplo, metilprednisolona), metotrexato, micofenolato mofetilo, anticuerpos anti-CD28, anticuerpos anti-IL12/IL-23 (por ejemplo, ustekinumab), anticuerpos anti-CD20 (por ejemplo, rituximab), anticuerpos anti-CD30 (por ejemplo, brentuximab), moléculas CTLA4-Fc (por ejemplo, abatacept), antagonistas del receptor CCR5 (por ejemplo, maraviroc), anticuerpos anti-CD40L, anticuerpos anti-VLA4 (por ejemplo, natalizumab), anticuerpos anti-LFA1, fludarabina, anticuerpos anti-CD52 (por ejemplo, alemtuzumab), anticuerpos anti-CD45, ciclofosfamida, globulinas antitimocitos, anticuerpos anti-C5 del complemento (por ejemplo, eculizumab), anticuerpos anti-integrina a4b7 (por ejemplo, vedolizumab), anticuerpos anti-IL6 (por ejemplo, tocilizumab), anticuerpos anti-IL2R (por ejemplo, basilixumab), anticuerpos anti-CD25 (por ejemplo, daclizumab), anti-TNFa/moléculas TNFa-Fc (por ejemplo, etanercept, adalimumab, infliximab, golimumab o certolizumab pegol), y Vorinostat. En otra realización, la combinación comprende un anticuerpo anti-OX40L de la invención y otros agentes terapéuticos seleccionados independientemente del grupo que consiste en rapamicina (sirolimus), tacrolimus, ciclosporina, corticosteroides (por ejemplo, metilprednisolona), metotrexato, micofenolato mofetilo, anticuerpos anti-CD28, moléculas CTLA4-Fc (por ejemplo, abatacept), anticuerpos anti-CD40L, anticuerpos anti-LFA1, anticuerpos anti-CD52 (por ejemplo, alemtuzumab), ciclofosfamida y globulinas antitimocitos.
En algunas realizaciones, la combinación comprende un anticuerpo anti-OX40L de la invención y agentes terapéuticos adicionales seleccionados independientemente del grupo que consiste en inhibidores de calcineurina (por ejemplo, tacrolimus, ciclosporina), inhibidores de mTOR (por ejemplo, rapamicina (sirolimus)), y agentes antiproliferativos (por ejemplo, micofenolato mofetilo, ciclofosfamida).
En realizaciones adicionales, la combinación comprende un anticuerpo anti-OX40L de la invención y agentes terapéuticos adicionales seleccionados independientemente del grupo que consiste en inmunosupresores que modulan la señalización de IL-2 (por ejemplo, tacrolimus, ciclosporina, rapamicina (sirolimus), y anticuerpos anti-CD25 (por ejemplo, basilixumab, daclizumab).
Sin estar ligados por la teoría, se cree que el mecanismo de acción de un anticuerpo anti-OX40L de la invención es complementario a otros agentes terapéuticos que modulan la función inmune. En particular, los agentes que modulan la señalización de IL-2 o que inhiben la proliferación de células T mediada por IL-2/IL-2R pueden combinarse sinérgicamente con un anticuerpo anti-OX40L dando como resultado una mayor modulación inmune que la que se observaría con cualquier agente solo. Como se muestra en los Ejemplos 7 y 9 a continuación, tanto el tacrolimus como la rapamicina muestran actividad inmunomoduladora. Tanto el tacrolimus como la rapamicina son agentes que se sabe que modulan la señalización de IL-2. En particular, se sabe que la rapamicina actúa como un inhibidor de mTOR, que reduce la transcripción de IL-2 e IL2R, e inhibe la progresión del ciclo celular provocada por la activación de IL2R, pero puede haber otros mecanismos sobre la proliferación de células T mediante los cuales pueden funcionar los inhibidores de mTOR (Thomson et al., Nat. Rev. Immunol., 2009, 9(5), 324-337; Scheffert y Raza, J. Thorac. Dis., 2014, 6(8), 1039-1053). La Figura 6 aquí muestra que el mecanismo de un anticuerpo anti-OX40L es diferente con respecto a la población de Tscm para ambos agentes, y la Figura 7 muestra un efecto sinérgico sobre la supervivencia de un anticuerpo anti-OX40L de la invención en combinación con rapamicina. Por lo tanto, se piensa que otros agentes que tienen un mecanismo de acción similar a la rapamicina y/o el tacrolimus también darán como resultado un efecto sinérgico cuando se usan en combinación con los anticuerpos anti-OX40L de la invención.
En una realización, la combinación comprende un anticuerpo anti-OX40L de la invención y rapamicina (sirolimus).
En una realización, la combinación comprende un anticuerpo anti-OX40L de la invención y tacrolimus. En una realización, la combinación comprende un anticuerpo anti-OX40L de la invención y una combinación de tacrolimus y metotrexato. En otra realización, la combinación comprende un anticuerpo anti-OX40L de la invención y ciclosporina. En otra realización, la combinación comprende un anticuerpo anti-OX40L de la invención y ciclosporina y metotrexato. En otra realización, la combinación comprende un anticuerpo anti-OX40L de la invención y ciclofosfamida. En otra realización, la combinación comprende un anticuerpo anti-OX40L de la invención y micofenolato mofetilo.
Como se usa aquí, el término “terapia” se refiere a cualquier protocolo, método y/o agente que se puede usar en la prevención, manejo, tratamiento y/o mejora de una enfermedad mediada por hOX40L (por ejemplo, EII o EICH). En ciertas realizaciones, los términos “terapias” y “terapia” se refieren a una terapia biológica, terapia de apoyo, y/u otras terapias útiles en la prevención, manejo, tratamiento y/o mejora de una enfermedad mediada por hOX40L conocida por un experto en la técnica, tal como personal médico.
Como se usa aquí, los términos “tratar”, “tratamiento” y “tratando” se refieren a la reducción o mejora de la progresión, gravedad y/o duración de una enfermedad mediada por hOX40L (por ejemplo, EII o EICH) que resulta de la administración de una o más terapias (incluyendo, pero sin limitarse a, la administración de uno o más agentes profilácticos o terapéuticos, tal como un anticuerpo de la invención). En realizaciones específicas, dichos términos se refieren a la reducción o inhibición de la unión de hOX40L a OX40, la reducción o inhibición de la producción o secreción de CCL20 de una célula que expresa hOX40 o hOX40L, la reducción o inhibición de la producción o secreción de IL-8 de una célula que expresa hOX40 o hOX40L, la reducción o inhibición de la producción o secreción de RANTES de una célula que expresa hOX40 o hOX40L, y/o la inhibición o reducción de uno o más síntomas asociados con una enfermedad mediada por hOX40L, tales como EII o EICH. En realizaciones específicas, dichos términos se refieren a la reducción o inhibición de la unión de hOX40L a OX40, la reducción o inhibición de la producción o secreción de INF-g de una célula que expresa hOX40 o hOX40L, la reducción o inhibición de la producción o secreción de TNF-a de una célula que expresa hOX40 o hOX40L, la reducción o inhibición de la producción o secreción de IL-2 de una célula que expresa hOX40 o hOX40L, y/o la inhibición o reducción de uno o más síntomas asociados con una enfermedad mediada por hOX40L, tal como EII o EICH (en particular EICH). En un ejemplo, la célula es una célula humana. En realizaciones específicas, un agente profiláctico es un anticuerpo antihOX40L completamente humano, tal como un anticuerpo monoclonal anti-hOX40L completamente humano.
La expresión “región variable” o “dominio variable” se refiere a una porción de las cadenas OX40L y pesadas, normalmente alrededor de los 120 a 130 aminoácidos terminales en la cadena pesada y alrededor de 100 a 110 aminoácidos en la cadena ligera, que difieren ampliamente en secuencia entre los anticuerpos y se usan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. La variabilidad en la secuencia se concentra en aquellas regiones denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), mientras que las regiones más conservadas en el dominio variable se denominan regiones marco (FR). Las CDR de las cadenas OX40L y pesadas son las principales responsables de la interacción del anticuerpo con el antígeno. La numeración de las posiciones de aminoácidos que se usan aquí se realiza de acuerdo con el índice EU, como en Kabat et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest. (U.S. Department of Health and Human Services, Washington, D.C.), 5a ed. (“Kabat et al.”). En realizaciones preferidas, la región variable es una región variable humana.
Anticuerpos
Los anticuerpos de la invención incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos sintéticos, anticuerpos monoclonales, anticuerpos producidos de forma recombinante, anticuerpos multiespecíficos (incluyendo anticuerpos biespecíficos), anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, intracuerpos, Fv monocatenarios (scFv) (por ejemplo, incluyendo monoespecíficos, biespecíficos, etc.), anticuerpos camelizados, fragmentos Fab, fragmentos F(ab’), Fv enlazados por disulfuro (sdFv), anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id), y fragmentos de unión a epítopos de cualquier de los anteriores.
En particular, los anticuerpos proporcionados aquí incluyen moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno hOX40L. Las moléculas de inmunoglobulina proporcionadas aquí pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina. En una realización específica, un anticuerpo proporcionado aquí es un anticuerpo IgG, preferiblemente un IgG1 o IgG4. En ciertas realizaciones, los anticuerpos de la invención comprenden una región constante gamma 4 humana. En otra realización, la región constante de la cadena pesada no se une a los receptores Fc-y, y comprende por ejemplo una mutación Leu235Glu. En otra realización, la región constante de la cadena pesada comprende una mutación Ser228Pro para aumentar la estabilidad. En otra realización, la región constante de la cadena pesada es IgG4-PE.
Las variantes y derivados de anticuerpos incluyen fragmentos de anticuerpos que retienen la capacidad de unirse específicamente a un epítopo. Los fragmentos preferidos incluyen fragmentos Fab; Fab’ (un fragmento de anticuerpo que contiene un solo dominio anti-unión que comprende un Fab y una porción adicional de la cadena pesada a través de la región bisagra); F(ab’)2 (dos moléculas Fab’ unidas por enlaces de disulfuro entre cadenas en las regiones bisagra de las cadenas pesadas; las moléculas Fab’ pueden estar dirigidas hacia el mismo o diferentes epítopos); un Fab biespecífico (una molécula de Fab que tiene dos dominios de unión a antígeno, cada uno de los cuales puede estar dirigido a un epítopo diferente); una cadena de Fab monocatenario que comprende una región variable, también conocida como sFv; un Fv enlazado por disulfuro, o dsFv; un VH camelizado (la región determinante de unión a antígeno variable de una única cadena pesada de un anticuerpo en la que algunos aminoácidos en la interfase VH son los que se encuentran en la cadena pesada de los anticuerpos de camello de origen natural); un sFv biespecífico (una molécula de sFv o dsFv que tiene dos dominios de unión a antígeno, cada uno de los cuales puede estar dirigido a un epítopo diferente); un diacuerpo (un sFv dimerizado formado cuando el dominio VH de un primer sFv se ensambla con el dominio VL de un segundo sFv, y el dominio VL del primer sFv se ensambla con el dominio VH del segundo sFv; las dos regiones de unión a antígeno del diacuerpo pueden estar dirigidas hacia el mismo o diferentes epítopos); y un triacuerpo (un sFv trimerizado, formado de manera similar a un diacuerpo, pero en el que se crean tres dominios de unión a antígeno en un solo complejo; los tres dominios de unión a antígeno pueden estar dirigidos hacia el mismo o diferentes epítopos). Los derivados de anticuerpos también incluyen una o más secuencias de CDR de un sitio de combinación de anticuerpos. Las secuencias de CDR se pueden unir entre sí en un armazón cuando están presentes dos o más secuencias de CDR. En ciertas realizaciones, el anticuerpo a usar con la invención comprende un Fv monocatenario (“scFv”). Los scFv son fragmentos de anticuerpos que comprenden los dominios VH y VL de un anticuerpo, en el que estos dominios están presentes en una única cadena polipeptídica. En general, el polipéptido scFv comprende además un enlazador polipeptídico entre los dominios VH y VL que permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno. Para una revisión de los scFv, véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, Nueva York, págs. 269-315 (1994).
Los anticuerpos de la invención pueden ser de cualquier origen animal, incluyendo pájaros y mamíferos (por ejemplo, ser humano, murino, burro, oveja, conejo, cabra, conejillo de indias, camello, caballo, o pollo). En ciertas realizaciones, los anticuerpos de la invención son anticuerpos monoclonales humanos o humanizados. Como se usa aquí, los anticuerpos “humanos” incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana, e incluyen anticuerpos aislados de bibliotecas de inmunoglobulinas humanas, o de ratones que expresan anticuerpos de genes humanos.
En realizaciones preferidas, los anticuerpos de la invención son anticuerpos completamente humanos, tales como anticuerpos completamente humanos que se unen específicamente a un polipéptido hOX40L, un fragmento de polipéptido hOX40L o un epítopo de hOX40L. Dichos anticuerpos completamente humanos serían ventajosos sobre los anticuerpos completamente de ratón (u otros anticuerpos de especies no humanas completos o parciales), los anticuerpos humanizados o los anticuerpos quiméricos para minimizar el desarrollo de efectos secundarios no deseados o innecesarios, tales como respuestas inmunitarias dirigidas hacia anticuerpos no completamente humanos (por ejemplo, anticuerpos anti-hOX40L derivados de otras especies) cuando se administran al sujeto.
Los anticuerpos de la presente invención pueden ser monoespecíficos, biespecíficos, triespecíficos o de mayor multiespecificidad. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de un polipéptido hOX40L, o pueden ser específicos tanto para un polipéptido hOX40L como para un epítopo heterólogo, tal como un polipéptido heterólogo o un material de soporte sólido. En realizaciones preferidas, los anticuerpos proporcionados aquí son monoespecíficos para un epítopo dado de un polipéptido hOX40L, y no se unen específicamente a otros epítopos.
También se proporciona aquí una célula B (por ejemplo, una célula B inmortalizada) o un hibridoma que produce un anticuerpo o fragmento anti-hOX40L descrito aquí.
En ciertas realizaciones, se proporciona aquí un anticuerpo aislado que se une específicamente a un epítopo de hOX40L, en el que la unión al epítopo de hOX40L por parte del anticuerpo se bloquea competitivamente (por ejemplo, de manera dependiente de la dosis) por un anticuerpo o fragmento de la invención. El anticuerpo puede ser o no un anticuerpo totalmente humano. En realizaciones preferidas, el anticuerpo es un anticuerpo anti-hOX40L monoclonal completamente humano, e incluso más preferiblemente un anticuerpo anti-hOX40L antagonista monoclonal completamente humano. En los Ejemplos aquí se proporcionan ejemplos de ensayos de bloqueo competitivo que se pueden usar.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de la invención compite (por ejemplo, de manera dependiente de la dosis) con el receptor OX40 (o una proteína de fusión del mismo) para unirse al hOX40L expresado en la superficie celular. En otras realizaciones, el anticuerpo o fragmento de la invención compite (por ejemplo, de manera dependiente de la dosis) con el receptor OX40 (o una proteína de fusión del mismo) para unirse a hOX40L soluble. En los Ejemplos aquí se proporcionan ejemplos de ensayos de unión competitiva que se pueden usar. En una realización, el anticuerpo o fragmento inhibe parcial o completamente la unión de hOX40 a OX40L expresado en la superficie celular, tal como hOX40L. En otra realización, el anticuerpo inhibe parcial o completamente la unión de hOX40 a hOX40L soluble. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento inhibe parcial o completamente la secreción de CCL20, IL-8 y/o RANTES, o INF-g, TNF -a o IL-2, en particular INF-g de una célula que expresa OX40 en su superficie celular. En ciertas realizaciones, la célula que expresa OX40 es una célula epitelial colónica.
Preferiblemente, los anticuerpos de la invención son anticuerpos monoclonales completamente humanos, tales como anticuerpos antagonistas monoclonales completamente humanos, que se unen específicamente a hOX40L.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento proporcionado aquí se une a un epítopo de hOX40L, que es una característica superficial tridimensional de un polipéptido hOX40L (por ejemplo, en una forma trimérica de un polipéptido hOX40L). Una región de un polipéptido hOX40L que contribuye a un epítopo puede ser aminoácidos contiguos del polipéptido, o el epítopo puede proceder de dos o más regiones no contiguas del polipéptido. Un epítopo de hOX40L puede estar presente en (a) la forma trimérica (“un epítopo de hOX40L trimérico”) de hOX40L, (b) la forma monomérica (“un epítopo de hOX40L monomérico”) de hOX40L, (c) la forma trimérica y monomérica de hOX40L, (d) la forma trimérica, pero no la forma monomérica de hOX40L, o (e) la forma monomérica, pero no la forma trimérica de hOX40L.
Por ejemplo, en algunas realizaciones, el epítopo solo está presente o disponible para unirse en la forma trimérica (nativa), pero no está presente o disponible para unirse en la forma monomérica (desnaturalizada) por un anticuerpo anti-hOX40L. En otras realizaciones, el epítopo de hOX40L es una característica lineal del polipéptido hOX40L (por ejemplo, en una forma trimérica o monomérica del polipéptido hOX40L). Los anticuerpos proporcionados aquí pueden unirse específicamente a (a) un epítopo de la forma monomérica de hOX40L, (b) un epítopo de la forma trimérica de hOX40L, (c) un epítopo de la forma monomérica pero no trimérica de hOX40L, (d) un epítopo de la forma trimérica pero no monomérica de hOX40L, o (e) tanto la forma monomérica como la forma trimérica de hOX40L. En realizaciones preferidas, los anticuerpos proporcionados aquí se unen específicamente a un epítopo de la forma trimérica de hOX40L, pero no se unen específicamente a un epítopo de la forma monomérica de hOX40L.
La presente invención también proporciona anticuerpos que se unen específicamente a un epítopo de hOX40L, comprendiendo los anticuerpos derivados de los dominios VH, CDR de VH, dominios VL, y CDR de VL descritos aquí que se unen específicamente a un antígeno hOX40L. La presente invención también proporciona anticuerpos que comprenden derivados de anticuerpos descritos en los Ejemplos, en los que dichos anticuerpos se unen específicamente a un epítopo de hOX40L. Pueden usarse técnicas estándar conocidas por los expertos en la técnica para introducir mutaciones en la secuencia nucleotídica que codifica una molécula de la invención, incluyendo, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR, que da como resultado sustituciones de aminoácidos. Preferiblemente, los derivados incluyen menos de 25 sustituciones de aminoácidos, menos de 20 sustituciones de aminoácidos, menos de 15 sustituciones de aminoácidos, menos de 10 sustituciones de aminoácidos, menos de 5 sustituciones de aminoácidos, menos de 4 sustituciones de aminoácidos, menos de 3 sustituciones de aminoácidos, o menos de 2 sustituciones de aminoácidos, con respecto a la molécula original. En otra realización, los derivados tienen sustituciones de aminoácidos conservativas. En una realización preferida, los derivados tienen sustituciones de aminoácidos conservativas que se realizan en uno o más restos de aminoácidos no esenciales predichos. Alternativamente, las mutaciones pueden introducirse al azar a lo largo de toda o parte de la secuencia codificante, tal como por mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden examinarse en busca de actividad biológica para identificar mutantes que retengan la actividad. Después de la mutagénesis, la proteína codificada se puede expresar, y se puede determinar la actividad de la proteína.
En otra realización, un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo de hOX40L comprende una secuencia de aminoácidos de dominio variable que es al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos de dominio variable del listado de secuencias.
En realizaciones específicas, el anticuerpo es un anticuerpo antihumano completamente humano, tal como un anticuerpo monoclonal completamente humano. Los anticuerpos completamente humanos pueden producirse mediante cualquier método conocido en la técnica. Los métodos ejemplares incluyen la inmunización con un antígeno hOX40L (cualquier polipéptido hOX40L capaz de provocar una respuesta inmune, y opcionalmente conjugado con un portador) de animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces de producir un repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena; véase, por ejemplo, Jakobovits et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci., 90:2551; Jakobovits et al., (1993) Nature, 362:255 258 (1993); Bruggermann et al., (1993) Year in Immunol., 7:33. Otros métodos para producir anticuerpos anti-hOX40L completamente humanos se pueden encontrar en los Ejemplos proporcionados aquí.
Alternativamente, los anticuerpos completamente humanos se pueden generar a través del cribado in vitro de bibliotecas de anticuerpos de presentación en fagos; véase, por ejemplo, Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991). Se han descrito diversas bibliotecas de presentación de fagos que contienen anticuerpos, y se pueden preparar fácilmente por un experto en la técnica. Las bibliotecas pueden contener una diversidad de secuencias de anticuerpos humanos, tales como fragmentos Fab, Fv y scFv humanos, que pueden examinarse frente a una diana apropiada.
Los anticuerpos y fragmentos de la invención incluyen anticuerpos y fragmentos que se modifican químicamente, es decir, mediante la unión covalente de cualquier tipo de molécula al anticuerpo. Por ejemplo, pero sin limitación, los derivados de anticuerpos incluyen anticuerpos que se han modificado químicamente, por ejemplo mediante glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos protectores/bloqueadores conocidos, escisión proteolítica, unión a un ligando celular u otra proteína, etc. Cualquiera de las numerosas modificaciones químicas puede llevarse a cabo mediante técnicas conocidas, incluyendo, pero sin limitarse a, escisión química específica, acetilación, formulación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Además, el anticuerpo puede contener uno o más aminoácidos no clásicos.
La presente invención también proporciona anticuerpos que se unen específicamente a un antígeno hOX40L que comprende una región estructural conocida por los expertos en la técnica (por ejemplo, un fragmento humano o no humano). La región marco puede ser, por ejemplo, regiones marco naturales o de consenso. Lo más preferible, la región marco de un anticuerpo de la invención es humana (véase, por ejemplo, Chothia et al., 1998, J. Mol. Biol.
278:457-479, para obtener una lista de las regiones marco humanas. Véase también, Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest. (U.S. Department of Health and Human Services, Washington, D.C.), 5a ed.
En una realización específica, la presente invención proporciona anticuerpos que se unen específicamente a un antígeno hOX40L, comprendiendo dichos anticuerpos la secuencia de aminoácidos de una o más de las CDR en el listado de secuencias (es decir, Seq ID No:4, Seq iD No:10, Seq ID No:36, Seq ID No:42, Seq ID No:68, Seq ID No:74, Seq ID No:96 o Seq ID No:102, en particular, Seq ID No:36 o Seq ID No:42 para HCDR1; Seq ID No:6, Seq ID No:12, Seq ID No:38, Seq Id No:44, Seq ID No:70, Seq ID No:76, Seq iD No:98 o Seq ID No:104, en particular Seq ID No:38 o Seq ID No:44 para HCDR2; Seq ID No:8, Seq ID No:14, Seq ID No:40, Seq ID No:46, Seq ID No:72, Seq ID No:78, Seq ID No:100 o Seq ID No:106, en particular Seq ID No:40 o Seq ID No:46 para HCDR3; Seq ID No:18, Seq ID No:24, Seq ID No:50, Seq ID No:56, Seq ID No:82, Seq ID No:88, Seq ID No:110 o Seq ID No:116, en particular Seq ID No:50 o Seq ID No:56 para LCDR1 ; Seq ID No:20, Seq ID No:26, Seq ID No:52, Seq ID No:58, Seq ID No:84, Seq ID No:90, Seq ID No:112 o Seq ID No:118, en particular Seq ID No:52 o Seq ID No:58 para LCDR2; y Seq ID No:22, Seq ID No:28, Seq ID No:54, Seq ID No:60, Seq ID No:86, Seq ID No:92, Seq ID No:114 o Seq ID No:120, en particular Seq ID No:54 o Seq ID No:60 para LCDR3) y regiones marco humanas con una o más sustituciones de aminoácidos en uno, dos, tres o más de los siguientes restos: (a) restos estructurales raros que difieren entre el marco del anticuerpo murino (es decir, marco del anticuerpo donante) y el marco del anticuerpo humano (es decir, marco del anticuerpo aceptor); (b) restos de la zona de Vernier cuando se diferencia entre el marco del anticuerpo donante y el marco del anticuerpo aceptor; (c) restos de empaquetamiento entre cadenas en la interfaz VH/VL que difieren entre el marco del anticuerpo donante y el marco del anticuerpo aceptor; (d) restos canónicos que difieren entre las secuencias del marco del anticuerpo donante y las secuencias del marco del anticuerpo aceptor, particularmente las regiones marco cruciales para la definición de la clase canónica de los bucles de CDR del anticuerpo murino; (e) restos que son adyacentes a una CDR; (g) restos capaces de interaccionar con el antígeno; (h) restos capaces de interaccionar con la CDR; y (i) restos de contacto entre el dominio VH y el dominio VL. En ciertas realizaciones, los anticuerpos que se unen específicamente a un antígeno hOX40L que comprende las regiones marco humanas con una o más sustituciones de aminoácidos en uno, dos, tres o más de los restos identificados anteriormente son anticuerpos antagonistas de hOX40L.
La presente invención engloba anticuerpos que se unen específicamente a un antígeno hOX40L, comprendiendo dichos anticuerpos la secuencia de aminoácidos del dominio VH y/o dominio VL en el listado de secuencias (es decir, Seq ID No: 2, Seq ID No: 34, Seq ID No: 66 o Seq ID No: No: 94, en particular Seq ID No: 34 para dominios VH; Seq ID No: 16, Seq ID No: 48, Seq ID No: 80 o Seq iD No: 108, en particular Seq ID No: 48 para dominios VL) pero que tiene mutaciones (por ejemplo, una o más sustituciones de aminoácidos) en las regiones marco. En ciertas realizaciones, los anticuerpos que se unen específicamente a un antígeno hOX40L comprenden la secuencia de aminoácidos del dominio VH y/o dominio VL o un fragmento de unión al antígeno del mismo de un anticuerpo descrito en los Ejemplos con una o más sustituciones de restos de aminoácidos en las regiones marco de los dominios VH y/o VL.
En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados aquí reducen o inhiben la unión de hOX40L a hOX40, y/o reducen o inhiben la actividad biológica de hOX40L, tal como la secreción de CCL20, IL8 y/o RANTES, o INF-g, TNF-a o IL-2, en particular INF-g, en un sujeto (por ejemplo, un sujeto humano). En ciertas realizaciones, los anticuerpos proporcionados aquí, tal como un anticuerpo monoclonal humano anti-hOX40L, disminuyen o inhiben la unión de un hOX40L soluble o expresado en la superficie celular a hOX40, y/o disminuyen o inhiben la secreción de CCL20 y/o RANTES, o INF-g, TNF -a o IL-2, en particular INF-g después del contacto con un hOX40L soluble o expresado en la superficie celular, en un sujeto. La actividad de bloqueo de un anticuerpo proporcionado aquí de la unión de hOX40L a hOX40 puede detectarse usando un ensayo como se describe en los Ejemplos. La inhibición de la actividad biológica de las células que expresan OX40 por un anticuerpo hOX40L proporcionado aquí puede detectarse usando un ensayo como se describe en los Ejemplos.
La presente invención también proporciona proteínas de fusión ThF que comprenden un anticuerpo proporcionado aquí que se une específicamente a un antígeno hOX40L y un polipéptido heterólogo. En algunas realizaciones, el polipéptido heterólogo al que se fusiona el anticuerpo es útil para dirigir el anticuerpo a células que tienen hOX40L expresado en la superficie celular.
Conjugados de anticuerpos y proteínas de fusión
La siguiente discusión sobre conjugados y proteínas de fusión también se aplica a los fragmentos, por lo que la descripción que menciona anticuerpos también se puede aplicar, mutatis mutandis, a fragmentos de la invención.
En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención se conjugan o se fusionan de forma recombinante con un agente de diagnóstico, detectable, o terapéutico, o cualquier otra molécula. Los anticuerpos conjugados o fusionados de forma recombinante pueden ser útiles, por ejemplo, para monitorizar o pronosticar el inicio, desarrollo, progresión y/o gravedad de una enfermedad mediada por hOX40L como parte de un procedimiento de prueba clínica, tal como determinar la eficacia de una terapia particular.
Tal diagnóstico y detección se pueden lograr, por ejemplo, acoplando el anticuerpo a sustancias detectables que incluyen, entre otras, diversas enzimas, tales como, pero sin limitarse a, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; grupos prostéticos, tales como, pero sin limitarse a, estreptavidina/biotina y avidina/biotina; materiales fluorescentes, tales como, pero sin limitarse a, umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; materiales luminiscentes, tales como, pero sin limitarse a, luminol; materiales bioluminiscentes, tales como, pero sin limitarse a, luciferasa, luciferina y aecuorina; materiales radiactivos, tales como, pero sin limitarse a, yodo (131I, 125i, 123i y 121i), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (115In, 113In, 112In, y 111In), tecnecio (99Tc), talio (201Ti), galio (68Ga, 67Ga), paladio (103Pd), molibdeno (99Mo), xenón (133Xe), flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn, y 117Sn; y metales emisores de positrones usando diversas tomografías de emisión de positrones, e iones metálicos paramagnéticos no radiactivos.
La presente invención también engloba los usos de los anticuerpos de la invención conjugados o fusionados de forma recombinante con un resto terapéutico (o uno o más restos terapéuticos). El anticuerpo puede conjugarse o fusionarse de forma recombinante con un resto terapéutico, tal como una citotoxina, por ejemplo un agente citostático o citocida, un agente terapéutico o un ion metálico radiactivo, por ejemplo emisores alfa. Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para las células. Los restos terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo descarbacina); agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalán, carmustina (BCNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, y cisdiclorodiamina platino (II) (DDP), y cisplatino); antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina); antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina, y antramicina (AMC)); moléculas de auristatina (por ejemplo, auristatina PHE, briostatina 1, y solastatina 10; véase Woyke et al., Antimicrob. Agents Chemother. 46:3802-8 (2002), Woyke et al., Antimicrob. Agents Chemother. 45:3580-4 (2001), Mohammad et al., Anticancer Drugs 12:735-40 (2001), Wall etal., Biochem. Biophys. Res. Commun 266:76-80 (1999), Mohammad et al., Int. J. Oncol. 15:367-72 (1999); hormonas (por ejemplo, glucocorticoides, progestágenos, andrógenos, y estrógenos), inhibidores de enzimas reparadoras del ADN (por ejemplo, etopósido o topotecán), inhibidores de cinasas (por ejemplo, compuesto ST1571, mesilato de imatinib (Kantarjian et al., Clin Cancer Res. 8(7):2167-76 (2002)); agentes citotóxicos (por ejemplo, paclitaxel, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracindiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, y puromicina y análogos u homólogos de los mismos, y los compuestos descritos en las patentes U.S. Nos. 6.245.759, 6.399.633, 6.383.790, 6.335.156, 6.271.242, 6.242.196, 6.218.410, 6.218.372, 6.057.300, 6.034.053, 5.985.877, 5.958.769, 5.925.376, 5.922.844, 5.911.995, 5.872.223, 5.863.904, 5.840.745, 5.728.868, 5.648.239, 5.587.459); inhibidores de la farnesil transferasa (por ejemplo, R115777, BMS-214662, y los descritos, por ejemplo, por las patentes U.S. Nos. 6.458.935, 6.451.812, 6.440.974, 6.436.960, 6.432.959, 6.420.387, 6.414.145, 6.410.541, 6.410.539, 6.403.581, 6.399.615, 6.387.905, 6.372.747, 6.369.034, 6.362.188, 6.342.765, 6.342.487, 6.300.501, 6.268.363, 6.265.422, 6.248.756, 6.239.140, 6.232.338, 6.228.865, 6.228.856, 6.225.322, 6.218.406, 6.211.193, 6.187.786, 6.169.096, 6.159.984, 6.143.766, 6.133.303, 6.127.366, 6.124.465, 6.124.295, 6.103.723, 6.093.737, 6.090.948, 6.080.870, 6.077.853, 6.071.935, 6.066.738, 6.063.930, 6.054.466, 6.051.582, 6.051.574, y 6.040.305); inhibidores de la topoisomerasa (por ejemplo, camptotecina; irinotecán; SN-38; topotecán; 9-aminocamptotecina; GG-211 (GI 147211); DX-8951f; IST-622; rubitecán; pirazoloacridina; XR-5000; saintopina; UCE6; UCE1022; TAN-1518A, TAN 1518B, KT6006, KT6528, ED-110, NB-506, ED-110, NB-506, y rebecamicina); bulgareína; aglutinantes del surco menor del AND, tales como colorante Hoescht 33342 y colorante Hoechst 33258; nitidina; fagaronina; epiberberina; coralina; beta-lapachona; BC-4-1; bisfosfonatos (por ejemplo, alendronato, cimadronte, clodronato, tiludronato, etidronato, ibandronato, neridronato, olpandronato, risedronato, piridronato, pamidronato, zolendronato), inhibidores de la HMG-CoA reductasa (por ejemplo, lovastatina, simvastatina, atorvastatina, pravastatina, fluvastatina, estatina, cerivastatina, lescol, lupitor, rosuvastatina, y atorvastatina); oligonucleótidos antisentido (por ejemplo, los descritos en las patentes U.S. Nos. 6.277.832, 5.998.596, 5.885.834, 5.734.033, y 5.618.709); inhibidores de adenosina desaminasa (por ejemplo, fosfato de fludarabina, y 2-clorodesoxiadenosina); ibritumomab tiuxetan (Zevalin®); tositumomab (Bexxar®)) y sales, solvatos, clatratos y profármacos farmacéuticamente aceptables de los mismos.
Además, un anticuerpo de la invención se puede conjugar o fusionar de forma recombinante con un resto terapéutico o un resto de fármaco que modifica una respuesta biológica dada. Los restos terapéuticos o los restos de fármaco no deben interpretarse como limitados a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, el resto de fármaco puede ser una proteína, péptido o polipéptido que posea una actividad biológica deseada. Tales proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, toxina del cólera, o toxina de la difteria; una proteína, tal como factor de necrosis tumoral, interferón g, interferón a, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador tisular del plasminógeno, un agente apoptótico, por ejemplo TNF-g, AIM I (véase, por ejemplo, la Publicación Internacional No. WO 97/33899), AIM II (veáse la Publicación Internacional No. WO 97/34911), Ligando Fas (Takahashi et al., 1994, J. Immunol., 6:1567-1574), y VEGF (veáse la Publicación Internacional No. WO 99/23105), un agente antiangiogénico, por ejemplo angiostatina, endostatina, o un componente de la ruta de la coagulación (por ejemplo, factor tisular); o un modificador de la respuesta biológica, tal como, por ejemplo, una linfocina (por ejemplo, interferón gamma, interleucina-1 (“IL-1”), interleucina-2 (“IL-2”), interleucina-5 (“IL-5”), interleucina-6 (“IL-6”), interleucina-7 (“IL-7”), interleucina-9 (“IL-9”), interleucina-10 (“IL-10”), interleucina-12 (“IL-12”), interleucina-15 (“IL-15”), interleucina-23 (“IL-23”), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (“GM-CSF”), y factor estimulante de colonias de granulocitos (“G-CSF”)), o un factor de crecimiento (por ejemplo, hormona de crecimiento (“GH”)), o un agente de coagulación (por ejemplo, calcio, vitamina K, factores tisulares, tales como, pero sin limitarse a, factor de Hageman (factor XII), cininógeno de alto peso molecular (HMWK), precalicreína (PK), proteínas de coagulación - factores II (protrombina), factor V, XIIa, VIII, XIIIa, XI, XIa, IX, IXa, X, fosfolípido, y monómero de fibrina).
La presente invención engloba anticuerpos de la invención fusionados de forma recombinante o conjugarse químicamente (conjugaciones covalentes o no covalentes) con una proteína o polipéptido heterólogo (o un fragmento del mismo, preferiblemente con un polipéptido de alrededor de 10, alrededor de 20, alrededor de 30, alrededor de 40, alrededor de 50, alrededor de 60, alrededor de 70, alrededor de 80, alrededor de 90, o alrededor de 100 aminoácidos) para generar proteínas de fusión. En particular, la invención proporciona proteínas de fusión que comprenden un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención (por ejemplo, un fragmento Fab, fragmento Fd, un fragmento Fv, un fragmento F(ab)2, un dominio VH, una CDR de VH, un dominio VL, o una CDR de VL) y una proteína, polipéptido o péptido heterólogo. En una realización, la proteína, polipéptido o péptido heterólogo al que se fusiona el anticuerpo es útil para dirigir el anticuerpo hacia un tipo de célula particular, tal como una célula que expresa hOX40L o un receptor de hOX40L. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a un receptor de superficie celular expresado por un tipo de célula particular (por ejemplo, una célula inmunitaria) puede fusionarse o conjugarse con un anticuerpo modificado de la invención.
Una proteína conjugada o de fusión de la invención comprende un anticuerpo de la invención descrito aquí y un polipéptido heterólogo. En una realización, una proteína de fusión o conjugada de la invención comprende los dominios variables de un anticuerpo descrito en los Ejemplos y un polipéptido heterólogo.
Además, un anticuerpo de la invención se puede conjugar con restos terapéuticos, tal como un ion metálico radiactivo, tales como emisores alfa tales como 213Bi o quelantes macrocíclicos útiles para conjugar iones radiometálicos, incluyendo, pero sin limitarse a, 131In, 131Lu, 131Y, 131Ho, 131Sm, a polipéptidos. En ciertas realizaciones, el quelante macrocíclico es ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N’,N”,N”‘-tetraacético (DOTA), que se puede unir al anticuerpo a través de una molécula enlazadora. Tales moléculas enlazadoras se conocen comúnmente en la técnica, y se describen en Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4(10):2483-90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem.
10(4):553-7; y Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol., 26(8):943-50.
Además, los anticuerpos de la invención se pueden fusionar con secuencias marcadoras, tal como un péptido, para facilitar la purificación. En realizaciones preferidas, la secuencia de aminoácidos marcadora es un péptido de hexahistidina, tal como la etiqueta proporcionada en un vector pQE (QIAGEN, Inc.), entre otros, muchos de los cuales están disponibles comercialmente. Como se describe en Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824, por ejemplo, la hexahistidina proporciona una purificación conveniente de la proteína de fusión. Otras etiquetas peptídicas útiles para la purificación incluyen, pero no se limitan a, la etiqueta de hemaglutinina (“HA”), que corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de la gripe (Wilson et al, 1984, Cell 37:767), y la etiqueta “FLAG”.
Los métodos para fusionar o conjugar restos terapéuticos (incluyendo polipéptidos) con anticuerpos son bien conocidos; véase, por ejemplo, Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), págs. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery”, en Controlled Drug Delivery (2a ed.), Robinson et al (eds.), págs. 623­ 53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, en Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), págs. 475-506 (1985); “Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), págs. 303-16 (Academic Press 1985), Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58; patentes U.S. Nos. 5.336.603, 5.622.929, 5.359.046, 5.349.053, 5.447.851, 5.723.125, 5.783.181, 5.908.626, 5.844.095, y 5.112.946; EP 307.434; EP 367.166; EP 394.827; publicaciones PCT WO 91/06570, WO 96/04388, WO 96/22024, WO 97/34631, y WO 99/04813; Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 10535-10539, 1991; Traunecker et al., Nature, 331:84-86, 1988; Zheng etal., J. Immunol., 154:5590-5600, 1995; Vil etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:11337-11341, 1992.
Las proteínas de fusión pueden generarse, por ejemplo, a través de técnicas de transposición de genes, transposición de motivos, transposición de exones, y/o transposición de codones (denominados colectivamente como “transferencia de ADN”). La mezcla aleatoria de ADN se puede emplear para alterar las actividades de los anticuerpos de la invención (por ejemplo, anticuerpos con afinidades más altas y tasas de disociación más bajas). Véanse, en general, las patentes U.S. Nos. 5.605.793, 5.811.238, 5.830.721,5.834.252, y 5.837.458; Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotecnol. 8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2):76-82; Hansson et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76; y Lorenzo y Blasco, 1998, Biotechniques 24(2):308-313. Los anticuerpos, o los anticuerpos codificados, se pueden alterar sometiéndolos a mutagénesis aleatoria mediante PCR propensa a errores, inserción aleatoria de nucleótidos, u otros métodos, antes de la recombinación. Un polinucleótido que codifica un anticuerpo de la invención puede recombinarse con uno o más componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc. de una o más moléculas heterólogas.
Un anticuerpo de la invención también se puede conjugar con un segundo anticuerpo para formar un anticuerpo heteroconjugado, como se describe en la patente U.S. No. 4.676.980.
El resto terapéutico o el fármaco conjugado o fusionado de forma recombinante con un anticuerpo de la invención que se une específicamente a un antígeno hOX40L debe escogerse para lograr los efectos profilácticos o terapéuticos deseados. En ciertas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo modificado. Un médico u otro personal médico debe considerar lo siguiente al decidir qué resto terapéutico o fármaco conjugar o fusionar de forma recombinante con un anticuerpo de la invención: la naturaleza de la enfermedad, la gravedad de la enfermedad, y el estado del sujeto.
Los anticuerpos de la invención también se pueden unir a soportes sólidos, que son particularmente útiles para inmunoensayos o purificación del antígeno diana. Tales soportes sólidos incluyen, pero no se limitan a, vidrio, celulosa, poliacrilamida, nailon, poliestireno, cloruro de polivinilo o polipropileno.
Composiciones farmacéuticas
La siguiente discusión sobre las composiciones también se aplica a los fragmentos, por lo que la descripción que menciona anticuerpos también se puede aplicar, mutatis mutandis, a fragmentos de la invención.
Las formulaciones terapéuticas que contienen uno o más anticuerpos de la invención proporcionados aquí se pueden preparar para el almacenamiento mezclando el anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con vehículos, excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables opcionales (Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, Pa.), en forma de formulaciones liofilizadas o disoluciones acuosas. Los vehículos, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen amortiguadores tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos, tales como metil- o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de alrededor de 10 restos); proteínas, tal como seroalbúmina, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono, incluyendo glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; azúcares, tales como sacarosa, manitol, trehalosa, o sorbitol; contraiones formadores de sal, tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG).
Los anticuerpos de la invención proporcionados aquí también pueden, por ejemplo, formularse en liposomas. Los liposomas que contienen la molécula de interés se preparan mediante métodos conocidos en la técnica, tal como se describe en Epstein et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688; Hwang et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030; y patentes U.S. Nos.4.485.045 y 4.544.545. Los liposomas con tiempo de circulación mejorado se describen en la patente U.S. No. 5.013.556.
Inmunoliposomas particularmente útiles se pueden generar mediante el método de evaporación de fase inversa con una composición lipídica que contiene fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab’ de un anticuerpo proporcionado aquí se pueden conjugar con los liposomas como se describe en Martin et al. (1982) J. Biol. Chem. 257:286-288, a través de una reacción de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterapéutico (tal como doxorrubicina) está contenido opcionalmente dentro del liposoma; véase Gabizon et al., (1989) J. National Cancer Inst. 81(19): 1484.
Las formulaciones, tales como las descritas aquí, también pueden contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que se está tratando. En ciertas realizaciones, las formulaciones comprenden un anticuerpo de la invención y uno o más compuestos activos con actividades complementarias que no se afectan negativamente entre sí. Tales moléculas están adecuadamente presentes en combinación en cantidades que son eficaces para el fin pretendido. Por ejemplo, un anticuerpo de la invención se puede combinar con uno o más agentes terapéuticos. Dicha terapia combinada se puede administrar al paciente en serie, o simultáneamente, o en secuencia.
En una realización, la combinación comprende un anticuerpo anti-OX40L de la invención y otros agentes terapéuticos seleccionados independientemente del grupo que consiste en rapamicina (sirolimus), tacrolimus, ciclosporina, corticosteroides (por ejemplo, metilprednisolona), metotrexato, micofenolato mofetilo, anticuerpos anti-CD28, anticuerpos anti-IL12/IL-23 (por ejemplo, ustekinumab), anticuerpos anti-CD20 (por ejemplo, rituximab), anticuerpos anti-CD30 (por ejemplo, brentuximab), moléculas CTLA4-Fc (por ejemplo, abatacept), antagonistas del receptor CCR5 (por ejemplo, maraviroc), anticuerpos anti-CD40L, anticuerpos anti-VLA4 (por ejemplo, natalizumab), anticuerpos anti-LFA1, fludarabina, anticuerpos anti-CD52 (por ejemplo, alemtuzumab), anticuerpos anti-CD45, ciclofosfamida, globulinas antitimocitos, anticuerpos anti-C5 del complemento (por ejemplo, eculizumab), anticuerpos anti-integrina a4b7 (por ejemplo, vedolizumab), anticuerpos anti-IL6 (por ejemplo, tocilizumab), anticuerpos anti-IL2R (por ejemplo, basilixumab), anticuerpos anti-CD25 (por ejemplo, daclizumab), anti-TNFa/moléculas TNFa-Fc (por ejemplo, etanercept, adalimumab, infliximab, golimumab o certolizumab pegol) y Vorinostat. En otra realización, la combinación comprende un anticuerpo anti-OX40L de la invención y otros agentes terapéuticos seleccionados independientemente del grupo que consiste en rapamicina (sirolimus), tacrolimus, ciclosporina, corticosteroides (por ejemplo, metilprednisolona), metotrexato, micofenolato mofetilo, anticuerpos anti-CD28, moléculas CTLA4-Fc (por ejemplo, abatacept), anticuerpos anti-CD40L, anticuerpos anti-LFA1, anticuerpos anti-CD52 (por ejemplo, alemtuzumab), ciclofosfamida y globulinas antitimocitos.
En algunas realizaciones, la combinación comprende un anticuerpo anti-OX40L de la invención y agentes terapéuticos adicionales seleccionados independientemente del grupo que consiste en inhibidores de calcineurina (por ejemplo, tacrolimus, ciclosporina), inhibidores de mTOR (por ejemplo, rapamicina (sirolimus)), y agentes antiproliferativos (por ejemplo, micofenolato mofetilo, ciclofosfamida).
En realizaciones adicionales, la combinación comprende un anticuerpo anti-OX40L de la invención y agentes terapéuticos adicionales seleccionados independientemente del grupo que consiste en inmunosupresores que modulan la señalización de IL-2 (por ejemplo, tacrolimus, ciclosporina, rapamicina (sirolimus), y anticuerpos anti-CD25 (por ejemplo, basilixumab, daclizumab)
En una realización, la combinación comprende un anticuerpo anti-OX40L de la invención y rapamicina (sirolimus). En una realización, la combinación comprende un anticuerpo anti-OX40L de la invención y tacrolimus. En una realización, la combinación comprende un anticuerpo anti-OX40L de la invención y una combinación de tacrolimus y metotrexato. En otra realización, la combinación comprende un anticuerpo anti-OX40L de la invención y ciclosporina. En otra realización, la combinación comprende un anticuerpo anti-OX40L de la invención y ciclosporina y metotrexato. En otra realización, la combinación comprende un anticuerpo anti-OX40L de la invención y ciclofosfamida. En otra realización, la combinación comprende un anticuerpo anti-OX40L de la invención y micofenolato mofetilo.
Un anticuerpo de la invención también se puede atrapar en microcápsulas, preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo microcápsulas de hidroximetilcelulosa o de gelatina y microcápsulas de poli-(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas), o en macroemulsiones. Tales técnicas se describen en Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, Pa.
Las formulaciones a usar para la administración in vivo pueden ser estériles. Esto se logra fácilmente mediante filtración a través de, por ejemplo, membranas de filtración estériles.
También se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el antagonista, matrices las cuales están en forma de artículos moldeados, por ejemplo películas, o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) o poli(alcohol vinílico)), polilactidas (patente U.S. No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y L-glutamato de etilo, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico, tal como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas por copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida), y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Mientras que los polímeros tales como el etileno-acetato de vinilo y el ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos de tiempo más cortos. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante mucho tiempo, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a la humedad a 37°C, lo que da como resultado una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Se pueden diseñar estrategias racionales para la estabilización, dependiendo del mecanismo involucrado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces S-S intermoleculares a través del intercambio de tiodisulfuro, la estabilización puede lograrse modificando los restos de sulfhidrilo, liofilizando a partir de disoluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos apropiados, y desarrollando composiciones de matriz polimérica específicas.
Las composiciones farmacéuticas proporcionadas aquí contienen cantidades terapéuticamente eficaces de uno o más de los anticuerpos de la invención proporcionados aquí, y opcionalmente uno o más agentes profilácticos o terapéuticos adicionales, en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones farmacéuticas son útiles en la prevención, tratamiento, manejo o mejora de una enfermedad mediada por hOX40L, tal como una enfermedad inflamatoria intestinal, rechazo de trasplantes, EICH, o uno o más de los síntomas de las mismas.
Los vehículos farmacéuticos adecuados para la administración de los compuestos proporcionados aquí incluyen cualquier vehículo conocido por los expertos en la técnica como adecuado para el modo particular de administración.
Además, los anticuerpos de la invención pueden formularse como el único ingrediente farmacéuticamente activo en la composición, o pueden combinarse con otros ingredientes activos (tal como uno o más agentes profilácticos o terapéuticos).
Las composiciones pueden contener uno o más anticuerpos de la invención. En una realización, los anticuerpos se formulan en preparaciones farmacéuticas adecuadas, tales como disoluciones, suspensiones, comprimidos, comprimidos dispersables, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida o elixires para administración oral, o en disoluciones o suspensiones estériles para administración parenteral, así como preparación de parches transdérmicos e inhaladores de polvo seco. En una realización, los anticuerpos descritos anteriormente se formulan en composiciones farmacéuticas usando técnicas y procedimientos bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Ansel (1985) Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 4a ed., pág. 126).
En las composiciones, se mezclan concentraciones eficaces de uno o más anticuerpos o derivados de los mismos con un vehículo farmacéutico adecuado. Las concentraciones de los compuestos en las composiciones son eficaces para el suministro de una cantidad, tras la administración, que trata, previene o mejora una enfermedad mediada por hOX40L o un síntoma de la misma.
En una realización, las composiciones se formulan para la administración de dosis única. Para formular una composición, la fracción en peso del compuesto se disuelve, suspende, dispersa o mezcla de otro modo en un vehículo, seleccionado a una concentración eficaz, de manera que se alivie, prevenga o mejore uno o más síntomas de la afección tratada.
Un anticuerpo de la invención se incluye en el vehículo farmacéuticamente aceptable en una cantidad eficaz suficiente para ejercer un efecto terapéuticamente útil en ausencia de efectos secundarios indeseables en el paciente tratado. La concentración terapéuticamente eficaz se puede determinar empíricamente ensayando los compuestos en sistemas in vitro e in vivo usando métodos de rutina y extrapolándolos luego para dosificaciones para seres humanos.
La concentración de anticuerpo en la composición farmacéutica dependerá, por ejemplo, de las características fisicoquímicas del anticuerpo, el programa de dosificación y la cantidad administrada, así como de otros factores conocidos por los expertos en la técnica.
En una realización, una dosificación terapéuticamente eficaz produce una concentración sérica de anticuerpo de alrededor de 0,1 ng/ml a alrededor de 50-100 pg/ml. Las composiciones farmacéuticas, en otra realización, proporcionan una dosificación de alrededor de 0,001 mg a alrededor de 2000 mg de anticuerpo por kilogramo de peso corporal por día. Las formas unitarias de dosificación farmacéutica se pueden preparar para proporcionar desde alrededor de 0,01 mg, 0,1 mg o 1 mg hasta alrededor de 500 mg, 1000 mg o 2000 mg, y en una realización, desde alrededor de 10 mg hasta alrededor de 500 mg del anticuerpo y/o una combinación de otros ingredientes esenciales facultativos por unidad de dosificación.
El anticuerpo puede administrarse de una vez, o puede dividirse en varias dosis más pequeñas para administrarse a intervalos de tiempo. Se entiende que la dosificación precisa y la duración del tratamiento son una función de la enfermedad que se está tratando, y pueden determinarse empíricamente usando protocolos de ensayo conocidos o por extrapolación de datos de ensayo in vivo o in vitro. Cabe señalar que las concentraciones y los valores de dosificación también pueden variar con la gravedad de la afección a aliviar. Debe entenderse además que para cualquier sujeto particular, los regímenes de dosificación específicos pueden ajustarse con el tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los intervalos de concentración establecidos aquí son solo ejemplares, y no pretenden limitar el alcance o la práctica de las composiciones reivindicadas.
Al mezclar o añadir el anticuerpo, la mezcla resultante puede ser una disolución, suspensión, emulsión o similar. La forma de la mezcla resultante depende de una serie de factores, incluyendo el modo previsto de administración y la solubilidad del compuesto en el portador o vehículo seleccionado. La concentración eficaz es suficiente para mejorar los síntomas de la enfermedad, trastorno o afección tratada, y puede determinarse empíricamente.
Las composiciones farmacéuticas se proporcionan para la administración a seres humanos y animales en formas de dosificación unitaria, tales como comprimidos, cápsulas, píldoras, polvos, gránulos, disoluciones o suspensiones parenterales estériles, y disoluciones o suspensiones orales, y emulsiones de aceite en agua que contienen cantidades adecuadas de la compuestos o derivados farmacéuticamente aceptables de los mismos. El anticuerpo, en una realización, se formula y administra en formas de dosificación unitaria o formas de dosificación múltiple. Las formas de dosis unitaria, como se usan aquí, se refieren a unidades físicamente discretas adecuadas para sujetos humanos y animales, y envasadas individualmente como se conoce en la técnica. Cada dosis unitaria contiene una cantidad predeterminada del anticuerpo, suficiente para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con el portador, vehículo o diluyente farmacéutico requerido. Los ejemplos de formas de dosis unitaria incluyen ampollas y jeringas, y comprimidos o cápsulas envasados individualmente. Las formas de dosis unitaria se pueden administrar en fracciones o múltiplos de las mismas. Una forma de dosis múltiple es una pluralidad de formas de dosis unitarias idénticas empaquetadas en un solo recipiente para administrarse en forma de dosis unitaria separada. Los ejemplos de formas de dosis múltiple incluyen viales, botellas de comprimidos o cápsulas, o botellas de pintas o galones. Por lo tanto, la forma de dosis múltiple es un múltiplo de dosis unitarias que no están segregadas en el envase.
En realizaciones preferidas, uno o más anticuerpos anti-hOX40L de la invención están en una formulación farmacéutica líquida. Las composiciones farmacéuticamente administrables líquidas se pueden preparar, por ejemplo, disolviendo, dispersando o mezclando de otro modo un compuesto activo como se define anteriormente y adyuvantes farmacéuticos opcionales en un vehículo, tal como, por ejemplo, agua, disolución salina, dextrosa acuosa, glicerol, glicoles, etanol y similares, para formar así una disolución o suspensión. Si se desea, la composición farmacéutica a administrar también puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes solubilizantes, agentes amortiguadores del pH y similares, por ejemplo acetato, citrato de sodio, derivados de ciclodextrina, monolaurato de sorbitán, acetato de trietanolamina sódica, oleato de trietanolamina, y otros agentes similares.
Los métodos reales para preparar dichas formas de dosificación son conocidos, o serán evidentes, para los expertos en esta técnica; por ejemplo, véase Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, Pa.
Se pueden preparar formas de dosificación o composiciones que contienen anticuerpo en el intervalo de 0,005% a 100%, estando el resto formado por un vehículo no tóxico. Los métodos para la preparación de estas composiciones son conocidos por los expertos en la técnica.
Las formas de dosificación farmacéuticas orales son sólidas, en gel o líquidas. Las formas farmacéuticas sólidas son comprimidos, cápsulas, gránulos y polvos a granel. Los tipos de comprimidos orales incluyen pastillas masticables comprimidas, y comprimidos que pueden tener un recubrimiento entérico, un recubrimiento de azúcar o un recubrimiento de película. Las cápsulas pueden ser cápsulas de gelatina duras o blandas, mientras que los gránulos y los polvos se pueden proporcionar en forma no efervescente o efervescente con la combinación de otros ingredientes conocidos por los expertos en la técnica.
En ciertas realizaciones, las formulaciones son formas de dosificación sólidas. En ciertas realizaciones, las formulaciones son cápsulas o comprimidos. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener uno o más de los siguientes ingredientes o compuestos de naturaleza similar: un aglutinante; un lubricante; un diluyente; un deslizador; un agente disgregante; un agente colorante; un agente edulcorante; un agente saborizante; un agente humectante; un revestimiento emético; y un revestimiento de película. Los ejemplos de aglutinantes incluyen celulosa microcristalina, goma de tragacanto, disolución de glucosa, mucílago de goma arábiga, disolución de gelatina, melaza, polivinilpirrolidona, povidona, crospovidonas, sacarosa y pasta de almidón. Los lubricantes incluyen talco, almidón, estearato de magnesio o calcio, licopodio y ácido esteárico. Los diluyentes incluyen, por ejemplo, lactosa, sacarosa, almidón, caolín, sal, manitol y fosfato dicálcico. Los deslizantes incluyen, pero no se limitan a, dióxido de silicio coloidal. Los agentes disgregantes incluyen croscarmelosa sódica, glicolato de almidón sódico, ácido algínico, almidón de maíz, almidón de patata, bentonita, metilcelulosa, agar y carboximetilcelulosa. Los agentes colorantes incluyen, por ejemplo, cualquiera de los colorantes FD y C solubles en agua certificados aprobados, mezclas de los mismos; y colorantes FD y C insolubles en agua suspendidos en hidrato de alúmina. Los agentes edulcorantes incluyen sacarosa, lactosa, manitol y agentes edulcorantes artificiales tales como sacarina y cualquier número de sabores secados por atomización. Los agentes saborizantes incluyen sabores naturales extraídos de plantas, tales como frutas, y mezclas sintéticas de compuestos que producen una sensación agradable, tales como, entre otros, menta y salicilato de metilo. Los agentes humectantes incluyen monoestearato de propilenglicol, monooleato de sorbitán, monolaurato de dietilenglicol y polioxietilen laural éter. Los revestimientos eméticos incluyen ácidos grasos, grasas, ceras, goma laca, goma laca amoniacal y acetato-ftalatos de celulosa. Los recubrimientos de película incluyen hidroxietilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, polietilenglicol 4000 y acetatoftalato de celulosa.
Los anticuerpos de la invención se pueden proporcionar en una composición que los protege del entorno ácido del estómago. Por ejemplo, la composición se puede formular en un recubrimiento entérico que mantiene su integridad en el estómago y libera el compuesto activo en el intestino. La composición también se puede formular en combinación con un antiácido u otro ingrediente similar.
Cuando la forma de unidad de dosificación es una cápsula, puede contener, además del material del tipo anterior, un vehículo líquido tal como un aceite graso. Además, las formas de las unidades de dosificación pueden contener otros diversos materiales que modifican la forma física de la unidad de dosificación, por ejemplo, recubrimientos de azúcar y otros agentes entéricos. Los compuestos también se pueden administrar como componente de un elixir, suspensión, jarabe, oblea, espolvoreado, goma de mascar o similares. Un jarabe puede contener, además de los compuestos activos, sacarosa como agente edulcorante, y ciertos conservantes, colorantes y aromas.
El anticuerpo también se puede mezclar con otros materiales activos que no perjudiquen la acción deseada, o con materiales que complementen la acción deseada, tales como antiácidos, bloqueadores H2, y diuréticos. El ingrediente activo es un anticuerpo o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo como se describe aquí. Pueden incluirse concentraciones más altas, hasta alrededor de 98% en peso del ingrediente activo.
En todas las realizaciones, las formulaciones de comprimidos y cápsulas se pueden recubrir como saben los expertos en la técnica para modificar o mantener la disolución del ingrediente activo. Así, por ejemplo, se pueden recubrir con un recubrimiento digestible entéricamente convencional, tal como salicilato de fenilo, ceras y acetato-ftalato de celulosa.
En realizaciones preferidas, las formulaciones son formas de dosificación líquidas. Las formas de dosificación orales líquidas incluyen disoluciones acuosas, emulsiones, suspensiones, disoluciones y/o suspensiones reconstituidas a partir de gránulos no efervescentes, y preparaciones efervescentes reconstituidas a partir de gránulos efervescentes. Las disoluciones acuosas incluyen, por ejemplo, elixires y jarabes. Las emulsiones son de aceite en agua o de agua en aceite.
Los elixires son preparaciones hidroalcohólicas transparentes y edulcoradas. Los vehículos farmacéuticamente aceptables usados en elixires incluyen disolventes. Los jarabes son disoluciones acuosas concentradas de un azúcar, por ejemplo sacarosa, y pueden contener un conservante. Una emulsión es un sistema de dos fases en el que un líquido se dispersa en forma de pequeños glóbulos en otro líquido. Los vehículos farmacéuticamente aceptables usados en las emulsiones son líquidos no acuosos, agentes emulsionantes y conservantes. Las suspensiones usan agentes de suspensión y conservantes farmacéuticamente aceptables.
Las sustancias farmacéuticamente aceptables usadas en gránulos no efervescentes, para ser reconstituidos en una forma de dosificación oral líquida, incluyen diluyentes, edulcorantes y agentes humectantes. Las sustancias farmacéuticamente aceptables usadas en gránulos efervescentes, para ser reconstituidas en una forma de dosificación oral líquida, incluyen ácidos orgánicos y una fuente de dióxido de carbono. Los agentes colorantes y aromatizantes se usan en todas las formas de dosificación anteriores.
Los disolventes incluyen glicerina, sorbitol, alcohol etílico y jarabe. Los ejemplos de conservantes incluyen glicerina, metil- y propilparabeno, ácido benzoico, benzoato de sodio y alcohol. Ejemplos de líquidos no acuosos utilizados en emulsiones incluyen aceite mineral y aceite de semilla de algodón. Los ejemplos de agentes emulsionantes incluyen gelatina, goma arábiga, tragacanto, bentonita y tensioactivos tal como monooleato de polioxietilensorbitán. Los agentes de suspensión incluyen carboximetilcelulosa sódica, pectina, tragacanto, Veegum y goma arábiga. Los agentes edulcorantes incluyen sacarosa, jarabes, glicerina y agentes edulcorantes artificiales tal como la sacarina. Los agentes humectantes incluyen monoestearato de propilenglicol, monooleato de sorbitán, monolaurato de dietilenglicol, y polioxietilen lauril éter. Los ácidos orgánicos incluyen ácido cítrico y tartárico. Las fuentes de dióxido de carbono incluyen bicarbonato de sodio y carbonato de sodio. Los agentes colorantes incluyen cualquiera de los tintes FD y C solubles en agua certificados y aprobados, y mezclas de los mismos. Los agentes saborizantes incluyen sabores naturales extraídos de plantas, tales como frutas, y mezclas sintéticas de compuestos que producen una sensación de sabor agradable.
Para una forma de dosificación sólida, la disolución o suspensión, por ejemplo en carbonato de propileno, aceites vegetales o triglicéridos, se encapsula, en una realización, en una cápsula de gelatina. Tales disoluciones, y la preparación y encapsulación de las mismas, se describen en las patentes U.S. Nos.4.328.245; 4.409.239; y 4.410.545. Para una forma de dosificación líquida, la disolución, por ejemplo en un polietilenglicol, se puede diluir con una cantidad suficiente de un vehículo líquido farmacéuticamente aceptable, por ejemplo agua, para medir fácilmente la administración.
Alternativamente, las formulaciones orales líquidas o semisólidas se pueden preparar disolviendo o dispersando el compuesto activo o la sal en aceites vegetales, glicoles, triglicéridos, ésteres de propilenglicol (por ejemplo, carbonato de propileno) y otros vehículos similares, y encapsulando estas disoluciones o suspensiones en cubiertas de cápsulas de gelatina duras o blandas. Otras formulaciones útiles incluyen las expuestas en las patentes U.S. Nos. RE28,819 y 4.358.603. Brevemente, tales formulaciones incluyen, pero no se limitan a, aquellas que contienen un compuesto proporcionado aquí, un mono- o polialquilenglicol dialquilado, incluyendo, pero sin limitarse a, 1,2-dimetoximetano, diglima, triglima, tetraglima, polietilenglicol-350-dimetiléter, polietilenglicol-550-dimetiléter, polietilenglicol-750-dimetiléter, en los que 350, 550 y 750 se refieren al peso molecular medio aproximado del polietilenglicol, y uno o más antioxidantes, tal como hidroxitolueno butilado (BHT), hidroxianisol butilado (BHA), galato de propilo, vitamina E, hidroquinona, hidroxicumarinas, etanolamina, lecitina, cefalina, ácido ascórbico, ácido málico, sorbitol, ácido fosfórico, ácido tiodipropiónico y sus ésteres, y ditiocarbamatos.
Otras formulaciones incluyen, pero no se limitan a, disoluciones alcohólicas acuosas que incluyen un acetal farmacéuticamente aceptable. Los alcoholes usados en estas formulaciones son cualquier disolvente miscible en agua farmacéuticamente aceptable que tenga uno o más grupos hidroxilo, incluyendo, pero sin limitarse a, propilenglicol y etanol. Los acetales incluyen, pero no se limitan a, acetales de di(alquilo inferior) de aldehídos de alquilo inferior, tales como acetal dietílico del acetaldehído.
La administración parenteral, en una realización, caracterizada por la inyección, ya sea por vía subcutánea, intramuscular o intravenosa, también se contempla aquí. Los inyectables se pueden preparar en formas convencionales, ya sea como disoluciones o suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para disolución o suspensión en líquido antes de la inyección, o como emulsiones. Los inyectables, disoluciones y emulsiones también contienen uno o más excipientes. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, disolución salina, dextrosa, glicerol o etanol. Además, si se desea, las composiciones farmacéuticas a administrar también pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes amortiguadores del pH, estabilizantes, potenciadores de la solubilidad, y otros agentes, tales como, por ejemplo, acetato de sodio, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina y ciclodextrinas.
También se contempla aquí la implantación de un sistema de liberación sostenida o de liberación lenta, de modo que se mantenga un nivel constante de dosificación (véase, por ejemplo, la patente U.S. No. 3.710.795). Brevemente, un compuesto proporcionado aquí se dispersa en una matriz interna sólida, por ejemplo polimetacrilato de metilo, polimetacrilato de butilo, cloruro de polivinilo plastificado o no plastificado, nailon plastificado, tereftalato de polietileno plastificado, caucho natural, poliisopreno, poliisobutileno, polibutadieno, polietileno, copolímeros de etileno-acetato de vinilo, cauchos de silicona, polidimetilsiloxanos, copolímeros de carbonato de silicona, polímeros hidrófilos tales como hidrogeles de ésteres de ácido acrílico y metacrílico, colágeno, alcohol polivinílico reticulado y acetato de polivinilo parcialmente hidrolizado reticulado, que está rodeado por una membrana polimérica exterior, por ejemplo polietileno, polipropileno, copolímeros de etileno/propileno, copolímeros de etileno/acrilato de etilo, copolímeros de etileno/acetato de vinilo, cauchos de silicona, polidimetilsiloxanos, caucho de neopreno, polietileno clorado, cloruro de polivinilo, copolímeros de cloruro de vinilo con acetato de vinilo, cloruro de vinilideno, etileno y propileno, ionómero de tereftalato de polietileno, caucho de butilo, cauchos de epiclorhidrina, copolímero de etileno/alcohol vinílico, terpolímero de etileno/acetato de vinilo/alcohol vinílico, y copolímero de etileno/viniloxietanol, que es insoluble en fluidos corporales. El anticuerpo se difunde a través de la membrana polimérica externa en una etapa de control de la velocidad de liberación. La cantidad de anticuerpo contenido en dichas composiciones parenterales depende en gran medida de la naturaleza específica de las mismas, así como de la actividad del compuesto y las necesidades del sujeto.
Las preparaciones para administración parenteral incluyen disoluciones estériles listas para inyección, productos solubles secos estériles, tales como polvos liofilizados, listos para combinarse con un disolvente justo antes del uso, incluyendo comprimidos hipodérmicos, suspensiones estériles listas para inyección, productos insolubles secos estériles listos para ser combinado con un vehículo justo antes de su uso, y emulsiones estériles. Las disoluciones pueden ser acuosas o no acuosas.
Si se administran por vía intravenosa, los vehículos adecuados incluyen disolución salina fisiológica o disolución salina amortiguada con fosfato (PBS), y disoluciones que contienen agentes espesantes y solubilizantes, tales como glucosa, polietilenglicol y polipropilenglicol y mezclas de los mismos.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables usados en preparaciones parenterales incluyen vehículos acuosos, vehículos no acuosos, agentes antimicrobianos, agentes isotónicos, amortiguadores, antioxidantes, anestésicos locales, agentes de suspensión y dispersión, agentes emulsionantes, agentes secuestrantes o quelantes y otras sustancias farmacéuticamente aceptables.
Los ejemplos de vehículos acuosos incluyen inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de dextrosa isotónica, inyección de agua estéril, inyección de dextrosa y Ringer lactada. Los vehículos parenterales no acuosos incluyen aceites fijos de origen vegetal, aceite de semilla de algodón, aceite de maíz, aceite de sésamo y aceite de cacahuete. Se pueden añadir agentes antimicrobianos en concentraciones bacteriostáticas o fungistáticas a las preparaciones parenterales envasadas en envases de dosis múltiples que incluyen fenoles o cresoles, mercuriales, alcohol bencílico, clorobutanol, ésteres metílico y propílico de ácido p-hidroxibenzoico, timerosal, cloruro de benzalconio y cloruro de bencetonio. Los agentes isotónicos incluyen cloruro de sodio y dextrosa. Los amortiguadores incluyen fosfato y citrato. Los antioxidantes incluyen bisulfato de sodio. Los anestésicos locales incluyen hidrocloruro de procaína. Los agentes de suspensión y dispersión incluyen carboximetilcelulosa sódica, hidroxipropilmetilcelulosa y polivinilpirrolidona. Los agentes emulsionantes incluyen Polisorbato 80 (TWEEN® 80). Un agente secuestrante o quelante de iones metálicos incluye EDTA. Los vehículos farmacéuticos también incluyen alcohol etílico, polietilenglicol y propilenglicol para vehículos miscibles en agua; e hidróxido de sodio, ácido clorhídrico, ácido cítrico o ácido láctico para el ajuste del pH.
La concentración del compuesto farmacéuticamente activo se ajusta para que una inyección proporcione una cantidad eficaz para producir el efecto farmacológico deseado. La dosis exacta depende de la edad, el peso y el estado del paciente o del animal, como se sabe en la técnica.
Las preparaciones parenterales de dosis unitaria se pueden envasar en una ampolla, un vial o una jeringa con aguja. Todas las preparaciones para administración parenteral pueden ser estériles, como se sabe y practica en la técnica.
De manera ilustrativa, la infusión intravenosa o intraarterial de una disolución acuosa estéril que contiene un compuesto activo es un modo eficaz de administración. Otra realización es una disolución o suspensión acuosa u oleosa estéril que contiene un material activo inyectado según sea necesario para producir el efecto farmacológico deseado.
Los inyectables están diseñados para administración local y sistémica. En una realización, una dosificación terapéuticamente eficaz se formula para que contenga una concentración de al menos alrededor de 0,1% p/p hasta alrededor de 90% p/p o más, en ciertas realizaciones más de 1 % p/p del compuesto activo, al tejido o tejidos tratados.
El anticuerpo se puede suspender en forma micronizada o en otra forma adecuada. La forma de la mezcla resultante depende de una serie de factores, incluyendo el modo previsto de administración y la solubilidad del compuesto en el portador o vehículo seleccionado. La concentración eficaz es suficiente para mejorar los síntomas de la afección, y puede determinarse empíricamente.
En otras realizaciones, las formulaciones farmacéuticas son polvos liofilizados, que pueden reconstituirse para su administración como disoluciones, emulsiones y otras mezclas. También pueden reconstituirse y formularse como sólidos o geles.
El polvo liofilizado se prepara disolviendo un anticuerpo proporcionado aquí, o un derivado del mismo farmacéuticamente aceptable, en un disolvente adecuado. En algunas realizaciones, el polvo liofilizado es estéril. El disolvente puede contener un excipiente que mejora la estabilidad u otro componente farmacológico del polvo o disolución reconstituida, preparada a partir del polvo. Los excipientes que se pueden usar incluyen, pero no se limitan а, dextrosa, sorbital, fructosa, jarabe de maíz, xilitol, glicerina, glucosa, sacarosa u otro agente adecuado. El disolvente también puede contener un amortiguador, tal como citrato, fosfato sódico o potásico, u otro amortiguador conocido por los expertos en la técnica, en una realización, a un pH aproximadamente neutro. La filtración estéril posterior de la disolución, seguido de la liofilización en condiciones estándar conocidas por los expertos en la técnica, proporciona la formulación deseada. En una realización, la disolución resultante se repartirá en viales para liofilización. Cada vial contendrá una dosis única o múltiples dosis del compuesto. El polvo liofilizado se puede almacenar en condiciones apropiadas, tal como a alrededor de 4°C y temperatura ambiente.
La reconstitución de este polvo liofilizado con agua para inyección proporciona una formulación para uso en administración parenteral. Para la reconstitución, el polvo liofilizado se añade a agua estéril u otro vehículo adecuado. La cantidad precisa depende del compuesto seleccionado. Tal cantidad se puede determinar empíricamente.
Las mezclas tópicas se preparan como se describe para la administración local y sistémica. La mezcla resultante puede ser una disolución, suspensión, emulsiones o similares, y puede formularse como cremas, geles, ungüentos, emulsiones, disoluciones, elixires, lociones, suspensiones, tinturas, pastas, espumas, aerosoles, irrigaciones, pulverizaciones, supositorios, vendas, parches dérmicos, o cualquier otra formulación adecuada para la administración tópica.
Los anticuerpos de la invención se pueden formular como aerosoles para aplicación tópica, tal como por inhalación (véase, por ejemplo, las patentes U.S. Nos. 4.044.126, 4.414.209, y 4.364.923, que describen aerosoles para el suministro de un esteroide útil para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, particularmente asma). Estas formulaciones para administración a las vías respiratorias pueden estar en forma de aerosol o disolución para nebulizador, o como polvo microfino para insuflaciones, solas o en combinación con un vehículo inerte tal como lactosa. En tal caso, las partículas de la formulación tendrán, en una realización, diámetros de menos de 50 micrómetros; en una realización, de menos de 10 micrómetros.
Los compuestos se pueden formular para aplicación local o tópica, tal como para aplicación tópica en la piel y las membranas mucosas, tal como en el ojo, en forma de geles, cremas y lociones, y para aplicación en el ojo o para aplicación intracisternal o intraespinal. Se contempla la administración tópica para la administración transdérmica, y también para la administración en los ojos o mucosas, o para terapias de inhalación. También se pueden administrar disoluciones nasales del compuesto activo, solo o en combinación con otros excipientes farmacéuticamente aceptables.
Estas disoluciones, en particular las destinadas a uso oftálmico, pueden formularse como disoluciones isotónicas al 0,01%-10%, pH de alrededor de 5-7, con las sales apropiadas.
También se contemplan aquí otras vías de administración, tales como parches transdérmicos, incluyendo dispositivos iontoforéticos y electroforéticos, y administración rectal.
Los parches transdérmicos, incluyendo los dispositivos iontoforéticos y electroforéticos, son bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, dichos parches se describen en las patentes U.S. Nos. 6.267.983, 6.261.595, б. 256.533, 6.167.301,6.024.975, 6.010715, 5.985.317, 5.983.134, 5.948.433, y 5.860.957.
Por ejemplo, las formas de dosificación farmacéutica para administración rectal son supositorios rectales, cápsulas y comprimidos para efecto sistémico. Los supositorios rectales se usan aquí para referirse a cuerpos sólidos para la inserción en el recto que se funden o ablandan a la temperatura corporal liberando uno o más ingredientes farmacológica o terapéuticamente activos. Las sustancias farmacéuticamente aceptables utilizadas en los supositorios rectales son bases o vehículos y agentes para elevar el punto de fusión. Los ejemplos de bases incluyen manteca de cacao (aceite de teobroma), glicerina-gelatina, carbowax (polioxietilenglicol) y mezclas apropiadas de mono-, di- y triglicéridos de ácidos grasos. Pueden usarse combinaciones de las diversas bases. Los agentes para elevar el punto de fusión de los supositorios incluyen espermaceti y cera. Los supositorios rectales se pueden preparar ya sea por el método comprimido o por moldeo. El peso de un supositorio rectal, en una realización, es alrededor de 2 a 3 g.
Los comprimidos y cápsulas para administración rectal se pueden fabricar usando la misma sustancia farmacéuticamente aceptable y por los mismos métodos que para las formulaciones para administración oral.
Los anticuerpos y otras composiciones proporcionadas aquí también pueden formularse para dirigirse a un tejido, receptor u otra área particular del cuerpo del sujeto a tratar. Muchos de estos métodos de direccionamiento son bien conocidos por los expertos en la técnica. Todos estos métodos de direccionamiento se contemplan aquí para su uso en las presentes composiciones. Para ejemplos no limitativos de métodos de direccionamiento, véanse, por ejemplo, las patentes U.S. Nos. 6.316.652, 6.274.552, 6.271.359, 6.253.872, 6.139.865, 6.131.570, 6.120.751, 6.071.495, 6.060.082, 6.048.736, 6.039.975, 6.004.534, 5.985.307, 5.972.366, 5.900.252, 5.840.674, 5.759.542 y 5.709.874. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-hOX40L de la invención se dirigen (o se administran de otro modo) al colon, tal como en un paciente que tiene o está en riesgo de tener una EII. En algunas realizaciones, los anticuerpos antihOX40L de la invención se dirigen (o se administran de otro modo) al ojo, tal como en un paciente que tiene o está en riesgo de tener uveítis.
En una realización, las suspensiones de liposomas, incluyendo los liposomas dirigidos a tejidos, tales como los liposomas dirigidos a tumores, también pueden ser adecuados como vehículos farmacéuticamente aceptables. Estos se pueden preparar de acuerdo con métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las formulaciones de liposomas se pueden preparar como se describe en la patente U.S. No. 4.522.811. Brevemente, los liposomas, tales como vesículas multilaminares (MLV), se pueden formar secando fosfatidilcolina de huevo y fosfatidilserina de cerebro (proporción molar 7:3) en el interior de un matraz. Se añade una disolución de un compuesto proporcionado aquí en disolución salina amortiguada con fosfato que carece de cationes divalentes (PBS), y el matraz se agita hasta que se dispersa la película lipídica. Las vesículas resultantes se lavan para eliminar el compuesto no encapsulado, se sedimentan mediante centrifugación, y entonces se resuspenden en PBS.
Métodos de administración y dosificación
La presente invención proporciona además composiciones que comprenden uno o más anticuerpos o fragmentos de la invención para uso en la prevención, manejo, tratamiento y/o mejora de una enfermedad mediada por hOX40L (o síntoma de la misma). La discusión con respecto a los anticuerpos también se aplica, mutatis mutandis, a fragmentos de la invención. En una alternativa, la presente invención proporciona además composiciones que comprenden uno o más anticuerpos o fragmentos de la invención para uso en la prevención, manejo, tratamiento y/o mejora de una enfermedad mediada por OX40L (o síntoma de la misma) en un sujeto, en la que el OX40L no es humano (por ejemplo, canino, felino, equino, bovino, ovino o porcino), y el sujeto es respectivamente un perro, gato, caballo, vaca, oveja o cerdo.
En ciertas realizaciones, se proporcionan aquí composiciones que comprenden uno o más anticuerpos de la invención para uso en la prevención, manejo, tratamiento y/o mejora de una enfermedad mediada por hOX40L, tal como EII (por ejemplo, colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn), o un síntoma de la misma. Los síntomas de la EII pueden variar de leves a graves, y generalmente dependen de la parte del tracto intestinal involucrada. Los síntomas ejemplares de la EII incluyen calambres y dolor abdominal, diarrea sanguinolenta, urgencia intensa de defecar, fiebre, pérdida de apetito, pérdida de peso, anemia, fatiga y/o llagas en la parte inferior de las piernas, tobillos, pantorrillas, muslos y brazos. Ejemplos de complicaciones intestinales de la EII incluyen sangrado profuso de las úlceras, perforación o ruptura del intestino, estenosis y obstrucción, fístulas (conducto anormal) y enfermedad perianal, megacolon tóxico (por ejemplo, dilatación aguda no obstructiva del colon), y/o neoplasia (por ejemplo, cáncer de colon o intestino delgado). Las complicaciones extraintestinales ejemplares de la EII incluyen artritis, afecciones de la piel, inflamación del ojo, trastornos hepáticos y renales, y/o pérdida ósea. Cualquier combinación de estos síntomas puede prevenirse, controlarse, tratarse y/o mejorarse usando las composiciones y los métodos proporcionados aquí.
En ciertas realizaciones, se proporcionan aquí composiciones que comprenden uno o más anticuerpos de la invención para uso en la prevención, manejo, tratamiento y/o mejora de una enfermedad mediada por hOX40L, tal como EICH, o un síntoma de la misma. La EICH generalmente ocurre después de trasplantes de médula ósea (TMO) alogénicos o no relacionados.
En algunas realizaciones, la EICH es una EICH aguda. Los síntomas de la EICH aguda pueden ocurrir rápidamente, y pueden ser leves o graves. En ciertos casos, la EICH aguda se desarrolla dentro de los tres meses posteriores al trasplante, tal como cuando los recuentos sanguíneos se recuperan después del trasplante. En ciertos casos, la EICH aguda afecta la piel, el tracto gastrointestinal (GI) y/o el hígado. Por ejemplo, en algunos pacientes, la EICH cutánea aguda comienza con una erupción, por ejemplo en las palmas de las manos, las plantas de los pies o los hombros del paciente. Sin embargo, el sarpullido puede extenderse y causar picazón y dolor y/o ampollas y descamación. La EICH hepática aguda puede afectar las funciones normales del hígado, tales como las enzimas hepáticas, y, a su vez, puede causar ictericia. La EICH hepática aguda también puede hacer que el abdomen del paciente se inflame y duela si el hígado se agranda. Finalmente, los síntomas de la EICH intestinal aguda (o EICH del sistema digestivo) pueden incluir diarrea, mucosidad o sangre en las heces, calambres o dolor abdominal, indigestión, náuseas y/o pérdida de apetito. Otros síntomas generales de la EICH aguda pueden incluir anemia, febrícula, y/o una mayor propensión a las infecciones. Cualquier combinación de estos síntomas de EICH aguda puede prevenirse, controlarse, tratarse y/o mejorarse usando las composiciones y métodos proporcionados aquí.
En otras realizaciones, la EICH es una EICH crónica. La EICH crónica puede ocurrir desde alrededor de tres meses hasta alrededor de un año o más después del trasplante. La EICH crónica puede ser leve o grave, y generalmente incluye síntomas similares a los de la EICH aguda. La EICH crónica puede afectar la piel y el sistema digestivo, incluyendo el hígado, pero también puede afectar otros órganos y el sistema inmunitario (por ejemplo, haciendo que el paciente sea más propenso a las infecciones) o los tejidos conjuntivos. Los síntomas de la EICH crónica de la piel incluyen sarpullido, piel seca, piel tirante, picazón en la piel, oscurecimiento del color de la piel, engrosamiento de la piel, y/o puede afectar el cabello (por ejemplo, caída del cabello, encanecimiento) o las uñas (por ejemplo, uñas duras o quebradizas). La EICH intestinal crónica puede afectar el sistema digestivo, la boca, el esófago, el revestimiento del estómago y/o el revestimiento del intestino, y los síntomas pueden incluir diarrea, sequedad o dolor en la boca, dolor al tragar, baja absorción de nutrientes por el estómago, distensión abdominal, calambre. La EICH hepática crónica puede causar daño y cicatrización del hígado (cirrosis). La EICH crónica de los ojos puede afectar las glándulas que producen las lágrimas, lo que hace que los ojos se sequen, ardan y duelan, o dificulten la tolerancia a la luz brillante. La EICH pulmonar crónica puede causar dificultad para respirar, sibilancias, tos persistente, y/o ser más propenso a las infecciones de pecho. La EICH crónica afecta los tendones (por ejemplo, la inflamación) que conectan los músculos con los huesos, lo que provoca dificultad para enderezar o doblar los brazos y las piernas. Cualquier combinación de estos síntomas de EICH crónica puede prevenirse, controlarse, tratarse y/o mejorarse usando las composiciones y métodos proporcionados aquí.
En ciertas realizaciones, se proporcionan aquí composiciones que comprenden uno o más anticuerpos de la invención para uso en la prevención, manejo, tratamiento y/o mejora de una enfermedad mediada por hOX40L, tal como uveítis, o un síntoma de la misma.
En ciertas realizaciones, se proporcionan aquí composiciones que comprenden uno o más anticuerpos de la invención para uso en la prevención, manejo, tratamiento y/o mejora de una enfermedad mediada por hOX40L, tal como pioderma gangrenoso, arteritis de células gigantes, síndrome de Schnitzler o escleritis no infecciosa.
En ciertas realizaciones, se proporcionan aquí composiciones que comprenden uno o más anticuerpos de la invención para uso en la prevención, manejo, tratamiento y/o mejora de una enfermedad o afección mediada por hOX40L, seleccionada de una enfermedad o afección autoinmune, una enfermedad o afección inflamatoria sistémica, o rechazo de trasplantes; por ejemplo, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, rechazo de trasplantes, rechazo de trasplantes alogénicos, enfermedad de injerto contra hospedante (EICH), colitis ulcerosa, lupus eritematoso sistémico (LES), diabetes, uveítis, espondilitis anquilosante, hipersensibilidad por contacto, esclerosis múltiple y aterosclerosis, en particular EICH.
En una realización específica, una composición para uso en la prevención, manejo, tratamiento y/o mejora de una enfermedad mediada por hOX40L, comprende los sitios de unión de OX40L de un anticuerpo de la invención, por ejemplo un anticuerpo descrito en los Ejemplos.
En otra realización, una composición para uso en la prevención, manejo, tratamiento y/o mejora de una enfermedad mediada por hOX40L, que comprende uno o más anticuerpos que comprenden uno o más dominios VH que tienen una secuencia de aminoácidos de uno cualquiera del dominio VH en el listado de secuencias (es decir, Seq ID No:2, Seq ID No:34, Seq ID No:66 o Seq ID No:94, en particular Seq ID No:34). En otra realización, una composición para uso en la prevención, manejo, tratamiento y/o mejora de una enfermedad mediada por hOX40L, comprende uno o más anticuerpos que comprenden una o más VH CDR1 que tienen una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las VH CDR1 en el listado de secuencias (es decir, Seq ID No:4, Seq ID No: 10, Seq ID No: 36, Seq ID No: 42, Seq ID No: 68, Seq ID No: 74, Seq ID No: 96 o Seq ID No: 102, en particular, Seq iD No: 36 o Seq ID No: 42). En otra realización, una composición para uso en la prevención, manejo, tratamiento y/o mejora de una enfermedad mediada por hOX40L, comprende uno o más anticuerpos que comprenden una o más VH CDR2 que tienen una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las VH CDR2 en el listado de secuencias (es decir, Seq ID No:6, Seq ID No: 12, Seq ID No: 38, Seq ID No: 44, Seq ID No: 70, Seq ID No: 76, Seq ID No: 98 o Seq ID No: 104, en particular Seq ID No:38 o Seq ID No:44). En una realización preferida, una composición para uso en la prevención, manejo, tratamiento y/o mejora de una enfermedad mediada por hOX40L, comprende uno o más anticuerpos que comprenden una o más VH CDR3 que tienen una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las VH CDR3 en el listado de secuencias (es decir, Seq ID No:8, Seq ID No: 14, Seq ID No: 40, Seq ID No: 46, Seq ID No: 72, Seq ID No: 78, Seq ID No: 100 o Seq ID No: 106, en particular Seq ID No:40 o Seq ID No:46).
En otra realización, una composición para uso en la prevención, manejo, tratamiento y/o mejora de una enfermedad mediada por hOX40L, comprende uno o más anticuerpos que comprenden uno o más dominios VL que tienen una secuencia de aminoácidos de uno cualquiera del dominio VL en el listado de secuencias (es decir, Seq ID No: 16, Seq ID No: 48, Seq ID No: 80, o Seq ID No: 108, en particular Seq ID No: 48) (que comprende opcionalmente también el dominio VH afín como se expone en el listado de secuencias (es decir, Seq ID No: 2/16, Seq ID No: 34/48, Seq ID No: 66/80 o Seq ID No: 94/108, en particular Seq ID No: 34/48). En otra realización, una composición para uso en la prevención, manejo, tratamiento y/o mejora de una enfermedad mediada por hOX40L, comprende uno o más anticuerpos que comprenden una o más VL CDR1 que tienen una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las VL CDR1 en el listado de secuencias (es decir, Seq ID No: 18, Seq ID No: 24, Seq ID No: 50, Seq ID No: 56, Seq ID No: 82, Seq ID No: 88, Seq ID No: 110 o Seq ID No: 116, en particular Seq ID No: 50 o Seq ID No: 56). En otra realización, una composición para uso en la prevención, manejo, tratamiento y/o mejora de una enfermedad mediada por hOX40L, que comprende uno o más anticuerpos que comprenden una o más VL CDR2 que tienen una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las VL CDR2 en el listado de secuencias (es decir, Seq ID No: 20, Seq ID No: 26, Seq ID No: 52, Seq ID No: 58, Seq ID No: 84, Seq ID No: 90, Seq ID No: 112 o Seq iD No: 118, en particular Seq ID No: 52 o Seq ID No: 58). En una realización preferida, una composición para uso en la prevención, manejo, tratamiento y/o mejora de una enfermedad mediada por hOX40L, comprende uno o más anticuerpos que comprenden una o más VL CDR3 que tienen una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las VL CDR3 en el listado de secuencias (es decir, Seq ID No:22, Seq ID No:28, Seq ID No:54, Seq ID No:60, Seq ID No:86, Seq ID No:92, Seq ID No:114 o Seq ID No:120, en particular Seq ID No:54 o Seq ID No:60).
En otra realización, una composición para uso en la prevención, manejo, tratamiento y/o mejora de una enfermedad mediada por hOX40L, comprende uno o más anticuerpos que comprenden uno o más dominios VH que tienen una secuencia de aminoácidos de uno cualquiera de los dominios VH en el listado de secuencias (es decir, Seq ID No:2, Seq ID No:34, Seq ID No:66 o Seq ID No:94, en particular Seq ID No:34), y uno o más dominios VL que tienen una secuencia de aminoácidos de uno cualquiera de los dominios VL en el listado de secuencias (es decir, Seq ID No: 16, Seq ID No: 48, Seq ID No: 80 o Seq ID No: 108, en particular Seq ID No: 48).
En otra realización, una composición para uso en la prevención, manejo, tratamiento y/o mejora de una enfermedad mediada por hOX40L, que comprende uno o más anticuerpos que comprenden una o más VH CDR1 que tienen una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las VH CDR1 en el listado de secuencias (es decir, Seq ID No:4, Seq ID No:10, Seq ID No:36, Seq ID No:42, Seq ID No:68, Seq ID No:74, Seq ID No:96 o Seq ID No:102, en particular, Seq ID No: 36 o Seq ID No: 42), y una o más VL CDR1 que tienen una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las VL CDR1 en el listado de secuencias (es decir, Seq ID No: 18, Seq ID No: 24, Seq ID No: 50, Seq ID No:56, Seq ID No:82, Seq ID No:88, Seq ID No:110 o Seq iD No:116, en particular Seq ID No:50 o Seq ID No:56). En otra realización, una composición para uso en la prevención, manejo, tratamiento y/o mejora de una enfermedad mediada por hOX40L, comprende uno o más anticuerpos que comprenden una o más VH CDR1 que tienen una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las VH CDR1 en el listado de secuencias (es decir, Seq ID No:4, Seq ID No:10, Seq ID No:36, Seq ID No:42, Seq ID No:68, Seq ID No:74, Seq ID No:96 o Seq ID No:102, en particular, Seq ID No: 36 o Seq ID No: 42), y una o más VL CDR2 que tienen una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las VL CDR2 en el listado de secuencias (es decir, Seq ID No: 20, Seq ID No: 26, Seq ID No: 52, Seq ID No:58, Seq ID No:84, Seq ID No:90, Seq ID No:112 o Seq ID No:118, en particular Seq ID No:52 o Seq ID No:58). En otra realización, una composición para uso en la prevención, manejo, tratamiento y/o mejora de una enfermedad mediada por hOX40L, comprende uno o más anticuerpos que comprenden una o más VH CDR1 que tienen una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las VH CDR1 en el listado de secuencias (es decir, Seq ID No:4, Seq ID No:10, Seq ID No:36, Seq ID No:42, Seq ID No:68, Seq ID No:74, Seq ID No:96 o Seq ID No:102, en particular, Seq ID No: 36 o Seq ID No: 42), y una o más VL CDR3 que tienen una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las VL CDR3 que tienen una secuencia de aminoácidos de una VL CDR3 en el listado de secuencias (es decir, Seq ID No: 22, Seq ID No:28, Seq ID No:54, Seq ID No:60, Seq ID No:86, Seq ID No:92, Seq ID No:114 o Seq ID No:120, en particular Seq ID No:54 o Seq ID No:60).
Como se analiza con más detalle en otra parte aquí, una composición de la invención se puede usar sola o en combinación con otros compuestos o composiciones. Además, los anticuerpos pueden fusionarse de forma recombinante con un polipéptido heterólogo en el extremo N o C, o conjugarse químicamente (incluyendo conjugaciones covalentes y no covalentes) con polipéptidos u otras composiciones. Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención pueden fusionarse o conjugarse de forma recombinante con moléculas útiles como marcadores en ensayos de detección y con moléculas efectoras tales como polipéptidos heterólogos, fármacos, radionucleótidos o toxinas. Véanse, por ejemplo, las publicaciones PCT WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; la patente U.S. No. 5.314.995; y el documento EP 396.387.
En algunas realizaciones, se proporcionan aquí métodos para disminuir o inhibir la unión de hOX40L a un receptor de OX40L o ligando afín (por ejemplo, OX40) en un sujeto (por ejemplo, un sujeto humano), que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido hOX40L (por ejemplo, un hOX40L soluble o expresado en la superficie celular). En algunas realizaciones, la actividad biológica de hOX40L, tal como la secreción de CCL20, IL8 y/o RANTES, o INF-g, TNF-a o IL-2, en particular INF-g u otra citocina descrita aquí, también disminuye en el sujeto, por ejemplo disminuye en al menos un 10, 20, 30, 40, 50 o 60%, o 70%, o 80%, o 90% o 95% o >95%.
En ciertas realizaciones, se proporcionan aquí métodos para disminuir o inhibir una actividad biológica de hOX40L, tal como la secreción de interferón gamma, IL-2, CCL20, IL8 y/o RANTES u otra citocina, o INF-g, TNF-a o IL-2, en particular INF-g, en un sujeto (por ejemplo, un sujeto humano), que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido hOX40L (por ejemplo, un hOX40L expresado en la superficie celular), en el que la actividad biológica de hOX40L está disminuida por el anticuerpo.
En otras realizaciones, se proporcionan aquí métodos para disminuir o inhibir la unión de hOX40L a un receptor de OX40L o un ligando afín (por ejemplo, OX40) en una célula que tiene hOX40L expresado en la superficie celular, poniendo en contacto la célula con una cantidad eficaz de un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido hOX40L (por ejemplo, un hOX40L soluble o expresado en la superficie celular), tal como un polipéptido hOX40L, un fragmento de polipéptido hOX40L, o un epítopo de hOX40L. En algunas realizaciones, también se reduce en la célula una actividad biológica de hOX40L, tal como la secreción de interferón gamma, IL-2, CCL20, IL8 y/o RANTES, o INF-g, TNF -a o IL-2, en particular INF-g u otra citocina descrita aquí.
En ciertas realizaciones, se proporcionan aquí métodos para disminuir o inhibir una actividad biológica de hOX40L, tal como la secreción de interferón gamma, IL-2, CCL20, IL8 y/o RANTES u otra citocina descrita aquí, en una célula que tiene un receptor de hOX40L expresado en la superficie celular (tal como OX40), poniendo en contacto la célula con una cantidad eficaz de un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido hOX40L (por ejemplo, un hOX40L soluble o expresado en la superficie celular), en el que el anticuerpo disminuye la actividad biológica de hOX40L.
Los anticuerpos de la presente invención pueden usarse, por ejemplo, para purificar, detectar y dirigirse contra antígenos hOX40L, en métodos de diagnóstico y terapéuticos tanto in vitro como in vivo. Por ejemplo, los anticuerpos modificados tienen uso en inmunoensayos para medir cualitativa y cuantitativamente los niveles de hOX40L en muestras biológicas. Véase, por ejemplo, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988).
La invención también proporciona métodos para prevenir, controlar, tratar y/o mejorar una enfermedad mediada por hOX40L administrando a un sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo o una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de la invención. En un aspecto, un anticuerpo está sustancialmente purificado (es decir, sustancialmente libre de sustancias que limitan su efecto o producen efectos secundarios no deseados). En realizaciones preferidas, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal completamente humano, tal como un anticuerpo antagonista monoclonal completamente humano. El sujeto al que se administra una terapia es preferiblemente un mamífero, tal como un primate (por ejemplo, vacas, cerdos, caballos, gatos, perros, roedores, ratones o ratas) o un primate (por ejemplo, un mono, tal como un mono rhesus o cynomolgous, o un ser humano). En una realización preferida, el sujeto es un ser humano. En otra realización preferida, el sujeto es un bebé humano o un bebé humano nacido prematuramente. En otra realización, el sujeto es un ser humano con una enfermedad mediada por hOX40L.
Se conocen diversos sistemas de administración, y se pueden usar para administrar un agente profiláctico o terapéutico (por ejemplo, un anticuerpo de la invención), incluyendo, pero sin limitarse a, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar el anticuerpo, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu y Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987))), construcción de un ácido nucleico como parte de un vector retroviral u otro, etc. Los métodos para administrar un agente profiláctico o terapéutico (por ejemplo, un anticuerpo de la invención) o una composición farmacéutica incluyen, pero no se limitan a, la administración parenteral (por ejemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa y subcutánea), epidural, y mucosal (por ejemplo, vías intranasal y oral). En una realización específica, un agente profiláctico o terapéutico (por ejemplo, un anticuerpo de la presente invención) o una composición farmacéutica se administra por vía intranasal, intramuscular, intravenosa, o subcutánea. Los agentes profilácticos o terapéuticos o composiciones pueden administrarse por cualquier ruta conveniente, por ejemplo por infusión o inyección en bolo, por absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa intranasal, mucosa rectal e intestinal, etc.), y pueden ser administrados junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local. Además, también se puede emplear la administración pulmonar, por ejemplo mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y la formulación con un agente aerosolizante. Véanse, por ejemplo, las patentes U.S. Nos.
6.019.968, 5.985.320, 5.985.309, 5.934.272, 5.874.064, 5.855.913, 5.290.540, y 4.880.078; y Publicaciones PCT Nos. WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346, y WO 99/66903.
En una realización específica, puede ser deseable administrar un agente profiláctico o terapéutico, o una composición farmacéutica de la invención, localmente en el área que necesita tratamiento. Esto se puede lograr, por ejemplo, y sin limitación, por infusión local, por administración tópica (por ejemplo, por aerosol intranasal), por inyección, o por medio de un implante, siendo dicho implante de una estructura porosa, no porosa, o material gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas sialasticas, o fibras. Preferiblemente, cuando se administra un anticuerpo de la invención, se debe tener cuidado de usar materiales que no absorban el anticuerpo.
En otra realización, un agente profiláctico o terapéutico, o una composición de la invención, puede administrarse en una vesícula, en particular un liposoma (véase Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Treat et al., en Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, Nueva York, págs. 353-365 (1989); López-Berestein, ibíd., págs. 317-327; véase en general ibíd.).
En otra realización, un agente profiláctico o terapéutico, o una composición de la invención, puede administrarse en un sistema de liberación controlada o de liberación sostenida. En una realización, se puede usar una bomba para lograr una liberación controlada o sostenida (véase Langer, más arriba; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng.
14:20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). En otra realización, los materiales poliméricos se pueden usar para lograr la liberación controlada o sostenida de un agente profiláctico o terapéutico (por ejemplo, un anticuerpo de la invención) o una composición de la invención (véase, por ejemplo, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, Nueva York (1984); Ranger y Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; véase también Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7 1:105); patente U.S, No, 5.679.377; patente U.S, No, 5.916.597; patente U.S. No. 5.912.015; patente U.S. No. 5.989.463; patente U.S. No. 5.128.326; Publicación PCT No. WO 99/15154; y Publicación PCT No. WO 99/20253. Los ejemplos de polímeros usados en formulaciones de liberación sostenida incluyen, pero no se limitan a, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), poli(metacrilato de metilo), poli(ácido acrílico), poli(etileno-co-acetato de vinilo), poli(ácido metacrílico), poliglicolidas (PLG), polianhídridos, poli(N-vinilpirrolidona), poli(alcohol vinílico), poliacrilamida, poli(etilenglicol), polilactidas (PLA), poli(lactida-co-glicolidas) (PLGA), y poliortoésteres. En una realización preferida, el polímero usado en una formulación de liberación sostenida es inerte, libre de impurezas lixiviables, estable al almacenamiento, estéril, y biodegradable. En aún otra realización, un sistema de liberación controlada o sostenida se puede colocar cerca de la diana terapéutica, es decir, las fosas nasales o los pulmones, requiriendo así solo una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, más arriba, vol. 2, págs. 115-138 (1984)). Los sistemas de liberación controlada se discuten en la revisión de Langer (1990, Science 249:1527-1533). Puede usarse cualquier técnica conocida por un experto en la técnica para producir formulaciones de liberación sostenida que comprenden uno o más anticuerpos de la invención. Véanse, por ejemplo, la patente U.S. No. 4,526,938, publicación PCT WO 91/05548, publicación PCT WO 96/20698, Ning et al., 1996, “Intratumoral Radioimmunotherapy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel”, Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al., 1995, “Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions”, PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397, Cleek et al., 1997, “Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application”, Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854, y Lam et al., 1997, “Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery”, Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760.
En una realización específica, cuando la composición de la invención es un ácido nucleico que codifica un agente profiláctico o terapéutico (por ejemplo, un anticuerpo de la invención), el ácido nucleico se puede administrar in vivo para promover la expresión de su agente profiláctico o terapéutico codificado, construyéndolo como parte de un vector de expresión de ácido nucleico apropiado y administrándolo para que se vuelva intracelular, por ejemplo mediante el uso de un vector retroviral (véase la patente U.S. No. 4.980.286), o mediante inyección directa, o mediante el uso de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, una pistola de genes; Biolistic, Dupont), o recubriéndolo con lípidos o receptores de superficie celular o agentes de transfección, o administrándolo unido a un péptido similar a homeobox que se sabe que entra en el núcleo (véase, por ejemplo, Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868), etc. Alternativamente, un ácido nucleico puede introducirse intracelularmente e incorporarse dentro del ADN de la célula hospedante para su expresión mediante recombinación homóloga.
En una realización específica, una composición de la invención comprende uno, dos o más anticuerpos o fragmentos de la invención. En otra realización, una composición de la invención comprende uno, dos o más anticuerpos o fragmentos de la invención y un agente profiláctico o terapéutico distinto de un anticuerpo de la invención. Preferiblemente, se sabe que los agentes son útiles, o se han usado o se usan actualmente para la prevención, el manejo, el tratamiento y/o la mejora de una enfermedad mediada por hOX40L. Además de los agentes profilácticos o terapéuticos, las composiciones de la invención también pueden comprender un vehículo.
Las composiciones de la invención incluyen composiciones de fármacos a granel útiles en la fabricación de composiciones farmacéuticas (por ejemplo, composiciones que son adecuadas para administrar a un sujeto o paciente) que pueden usarse en la preparación de formas de dosificación unitaria. En una realización preferida, una composición de la invención es una composición farmacéutica. Tales composiciones comprenden una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de uno o más agentes profilácticos o terapéuticos (por ejemplo, un anticuerpo de la invención u otro agente profiláctico o terapéutico) y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas se formulan para que sean adecuadas para la vía de administración a un sujeto.
En una realización específica, el término “vehículo” se refiere a un diluyente, adyuvante (por ejemplo, adyuvante de Freund (completo e incompleto)), excipiente, o vehículo con el que se administra el agente terapéutico. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es un vehículo preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. Las disoluciones salinas y las disoluciones acuosas de dextrosa y glicerol también se pueden emplear como vehículos líquidos, particularmente para disoluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes amortiguadores del pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de disoluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida, y similares. La formulación oral puede incluir vehículos estándar tales como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Los ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados se describen en Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, Pa. Dichas composiciones contendrán una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz del anticuerpo, preferiblemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de vehículo para proporcionar la forma adecuada para la administración al paciente. La formulación debe adaptarse al modo de administración.
En una realización preferida, la composición se formula de acuerdo con los procedimientos de rutina como una composición farmacéutica adaptada para la administración intravenosa a seres humanos. Típicamente, las composiciones para administración intravenosa son disoluciones en amortiguador acuoso isotónico estéril. Cuando sea necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local, tal como lignocamne, para aliviar el dolor en el lugar de la inyección. Tales composiciones, sin embargo, pueden administrarse por una vía distinta a la intravenosa.
En general, los ingredientes de las composiciones de la invención se suministran por separado o mezclados en forma de dosificación unitaria, por ejemplo como un polvo liofilizado seco o un concentrado sin agua en un recipiente herméticamente cerrado, tal como una ampolla o un sobre, que indica la cantidad de agente activo. Cuando la composición se va a administrar por infusión, se puede dispensar con una botella de infusión que contiene disolución salina o agua estéril de grado farmacéutico. Cuando la composición se administra por inyección, se puede proporcionar una ampolla de agua estéril para inyección o disolución salina, para que los ingredientes se mezclen antes de la administración.
La invención también proporciona que un anticuerpo de la invención se envasa en un recipiente herméticamente cerrado, tal como una ampolla o un sobre, que indica la cantidad de anticuerpo. En una realización, el anticuerpo se suministra como un polvo seco esterilizado liofilizado o concentrado sin agua, en un recipiente herméticamente cerrado, y se puede reconstituir, por ejemplo, con agua o disolución salina a la concentración adecuada para la administración a un sujeto. Preferiblemente, el anticuerpo se suministra como un polvo liofilizado estéril seco en un recipiente herméticamente cerrado en una dosis unitaria de al menos 0,1 mg, al menos 0,5 mg, al menos 1 mg, al menos 2 mg o al menos 3 mg, y más preferiblemente al menos 5 mg, al menos 10 mg, al menos 15 mg, al menos 25 mg, al menos 30 mg, al menos 35 mg, al menos 45 mg, al menos 50 mg, al menos 60 mg, al menos 75 mg, al menos 80 mg, al menos 85 mg, al menos 90 mg, al menos 95 mg, o al menos 100 mg. El anticuerpo liofilizado se puede almacenar entre 2 y 8°C en su envase original, y el anticuerpo se puede administrar dentro de las 12 horas, preferiblemente dentro de las 6 horas, dentro de las 5 horas, dentro de las 3 horas, o dentro de 1 hora después de ser reconstituido. En una realización alternativa, un anticuerpo se suministra en forma líquida en un recipiente herméticamente cerrado que indica la cantidad y concentración del anticuerpo. Preferentemente, la forma líquida del anticuerpo se suministra en un recipiente herméticamente cerrado de al menos 0,1 mg/ml, al menos 0,5 mg/ml, o al menos 1 mg/ml, y más preferentemente al menos 5 mg/ml, al menos 10 mg/ml, al menos 15 mg/ml, al menos 25 mg/ml, al menos 30 mg/ml, al menos 40 mg/ml, al menos 50 mg/ml, al menos 60 mg/ml, al menos 70 mg/ml, al menos 80 mg/ml, al menos 90 mg/ml, o al menos 100 mg/ml.
Las composiciones de la invención se pueden formular como formas neutras o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las formadas con aniones, tales como los derivados de los ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y las formadas con cationes, tales como los derivados del sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc.
La cantidad de un agente profiláctico o terapéutico (por ejemplo, un anticuerpo de la invención) o una composición de la invención que será eficaz en la prevención, manejo, tratamiento y/o mejora de una enfermedad mediada por hOX40L puede determinarse mediante técnicas clínicas estándar.
Por consiguiente, una dosificación de un anticuerpo o una composición que da como resultado un título en suero de alrededor de 0,1 pg/ml a alrededor de 450 pg/ml, y en algunas realizaciones al menos 0,1 pg/ml, al menos 0,2 pg/ml, al menos 0,4 pg/ml, al menos 0,5 pg/ml, al menos 0,6 pg/ml, al menos 0,8 pg/ml, al menos 1 pg/ml, al menos 1,5 pg/ml, y preferiblemente al menos 2 pg/ml, al menos 5 pg/ml, al menos 10 pg/ml, al menos 15 pg/ml, al menos 20 pg/ml, al menos 25 pg/ml, al menos 30 pg/ml, al menos 35 pg/ml, al menos 40 pg/ml, al menos 50 pg/ml, al menos 75 pg/ml, al menos 100 pg/ml, al menos 125 pg/ml, al menos 150 pg/ml, al menos 200 pg/ml, al menos 250 pg/ml, al menos 300 pg/ml, al menos 350 pg/ml, al menos 400 pg/ml, o al menos 450 pg/ml, puede administrarse a un ser humano para la prevención, manejo, tratamiento y/o mejora de una enfermedad mediada por hOX40L. Además, se pueden emplear opcionalmente ensayos in vitro para ayudar a identificar intervalos de dosificación óptimos. La dosis precisa a emplear en la formulación también dependerá de la vía de administración y la gravedad de una enfermedad mediada por hOX40L, y debe decidirse según el juicio del médico y las circunstancias de cada paciente.
Las dosis eficaces pueden extrapolarse de las curvas dosis-respuesta derivadas de sistemas de ensayo de modelos animales o in vitro.
Para los anticuerpos de la invención, la dosis administrada a un paciente es normalmente de 0,1 mg/kg a 100 mg/kg del peso corporal del paciente. En algunas realizaciones, la dosis administrada al paciente es alrededor de 1 mg/kg a alrededor de 75 mg/kg del peso corporal del paciente. Preferiblemente, la dosis administrada a un paciente está entre 1 mg/kg y 20 mg/kg del peso corporal del paciente, lo más preferible 1 mg/kg a 5 mg/kg del peso corporal del paciente. Generalmente, los anticuerpos humanos tienen una vida media más prolongada dentro del cuerpo humano que los anticuerpos de otras especies, debido a la respuesta inmunitaria a los polipéptidos extraños. Por lo tanto, a menudo son posibles dosis más bajas de anticuerpos humanos y una administración menos frecuente. Además, la dosificación y la frecuencia de administración de los anticuerpos de la invención pueden reducirse mejorando la captación y la penetración tisular de los anticuerpos mediante modificaciones tales como, por ejemplo, lipidación.
En una realización, aproximadamente 100 mg/kg o menos, aproximadamente 75 mg/kg o menos, aproximadamente
50 mg/kg o menos, aproximadamente 25 mg/kg o menos, aproximadamente 10 mg/kg o menos, aproximadamente 5 mg/kg o menos, aproximadamente 1 mg/kg o menos, aproximadamente 0,5 mg/kg o menos, o aproximadamente 0,1 mg/kg o menos de un anticuerpo o fragmento de la invención se administra 5 veces, 4 veces, 3 veces, 2 veces o, preferiblemente, 1 vez, para controlar una enfermedad mediada por hOX40L. En algunas realizaciones, un anticuerpo de la invención se administra alrededor de 1 a 12 veces, pudiendo administrarse las dosis según sea necesario, por ejemplo semanal, quincenal, mensual, bimestral, trimestral, etc., según lo determine un médico. En algunas realizaciones, se puede administrar una dosis más baja (por ejemplo, 1-15 mg/kg) con mayor frecuencia (por ejemplo,
3-6 veces). En otras realizaciones, se puede administrar una dosis más alta (por ejemplo, 25-100 mg/kg) con menos frecuencia (por ejemplo, 1-3 veces). Sin embargo, como será evidente para los expertos en la técnica, otras cantidades y programas de dosificación se pueden determinar fácilmente y están dentro del alcance de la invención.
En una realización específica, aproximadamente 100 mg/kg, aproximadamente 75 mg/kg o menos, aproximadamente
50 mg/kg o menos, aproximadamente 25 mg/kg o menos, aproximadamente 10 mg/kg o menos, aproximadamente 5 mg/kg o menos, aproximadamente 1 mg/kg o menos, aproximadamente 0,5 mg/kg o menos, aproximadamente 0,1 mg/kg o menos de un anticuerpo o fragmento de la invención en una formulación de liberación sostenida se administra a un sujeto, preferiblemente un ser humano, para prevenir, controlar, tratar y/o mejorar una enfermedad mediada por hOX40L. En otra realización específica, aproximadamente 100 mg/kg, aproximadamente 75 mg/kg o menos, aproximadamente 50 mg/kg o menos, aproximadamente 25 mg/kg o menos, aproximadamente 10 mg/kg o menos, aproximadamente 5 mg/kg o menos, aproximadamente 1 mg/kg o menos, aproximadamente 0,5 mg/kg o menos, o aproximadamente 0,1 mg/kg o menos de bolo de un anticuerpo la invención no en una formulación de liberación sostenida se administra a un sujeto, preferiblemente un ser humano, para prevenir, controlar, tratar y/o mejorar una enfermedad mediada por hOX40L, y después de un cierto período de tiempo, aproximadamente 100 mg/kg, aproximadamente 75 mg/kg o menos, aproximadamente 50 mg/kg o menos, aproximadamente 25 mg/kg o menos, aproximadamente 10 mg/kg o menos, aproximadamente 5 mg/kg o menos, aproximadamente 1 mg/kg o menos, aproximadamente 0,5 mg/kg o menos, o aproximadamente 5 mg/kg o menos de un anticuerpo de la invención en una liberación sostenida se administra a dicho sujeto (por ejemplo, por vía intranasal o intramuscular) dos, tres o cuatro veces (preferiblemente una vez). De acuerdo con esta realización, un cierto período de tiempo puede ser 1 a 5 días, una semana, dos semanas, o un mes.
En algunas realizaciones, una dosis única de un anticuerpo o fragmento de la invención se administra a un paciente para prevenir, controlar, tratar y/o mejorar una enfermedad mediada por hOX40L dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce veces, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve, veinte, veintiuno, veintidós, veintitrés, veinticuatro, veinticinco o veintiséis, a intervalos cada dos semanas (por ejemplo, alrededor de 14 días), en el transcurso de un año, en el que la dosis se selecciona del grupo que consiste en alrededor de 0,1 mg/kg, alrededor de 0,5 mg/kg, alrededor de 1 mg/kg, alrededor de 5 mg/kg, alrededor de 10 mg/kg, alrededor de 15 mg/kg, alrededor de 20 mg/kg, alrededor de 25 mg/kg, alrededor de 30 mg/kg, alrededor de 35 mg/kg, alrededor de 40 mg/kg, alrededor de 45 mg/kg, alrededor de 50 mg/kg, alrededor de 55 mg/kg, alrededor de 60 mg/kg, alrededor de 65 mg/kg, alrededor de 70 mg/kg, alrededor de 75 mg/kg, alrededor de 80 mg/kg, alrededor de 85 mg/kg, alrededor de 90 mg/kg, alrededor de 95 mg/kg, alrededor de 100 mg/kg, o una combinación de los mismos (es decir, cada dosis mensual puede o no ser idéntica).
En otra realización, una dosis única de un anticuerpo de la invención se administra al paciente para prevenir, controlar, tratar y/o mejorar una enfermedad mediada por hOX40L dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, o doce veces a intervalos aproximadamente mensuales (por ejemplo, alrededor de 30 días) en el transcurso de un año, en el que la dosis se selecciona del grupo que consiste en alrededor de 0,1 mg/kg, alrededor de 0,5 mg/kg, alrededor de 1 mg/kg, alrededor de 5 mg/kg, alrededor de 10 mg/kg, alrededor de 15 mg/kg, alrededor de 20 mg/kg, alrededor de 25 mg/kg, alrededor de 30 mg/kg, alrededor de 35 mg/kg, alrededor de 40 mg/kg, alrededor de 45 m alrededor de 50 mg/kg, alrededor de 55 mg/kg, alrededor de
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mg/kg, alrededor de 65 mg/kg, alrededor de 70 m alrededor de 75 mg/kg, alrededor de 80 mg/kg, alrededor de 85 mg/kg, alrededor de 90 mg/kg, alrededor de 95 m alrededor de 100 mg/kg, o una combinación de los mismos (es decir, cada dosis mensual puede o no ser idéntica).
En una realización, una dosis única de un anticuerpo o fragmento de la invención se administra a un paciente para prevenir, controlar, tratar y/o mejorar una enfermedad mediada por hOX40L dos, tres, cuatro, cinco o seis veces alrededor de dos veces a intervalos aproximadamente bimensuales (por ejemplo, alrededor de 60 días) en el transcurso de un año, en el que la dosis se selecciona del grupo que consiste en alrededor de 0,1 mg/kg, alrededor de 0,5 mg/kg, alrededor de 1 mg/kg, alrededor de 5 mg/kg, alrededor de 10 mg/kg, alrededor de 15 mg/kg, alrededor de 20 mg/kg, alrededor de 25 mg/kg, alrededor de 30 mg/kg, alrededor de 35 mg/kg, alrededor de 40 mg/kg, alrededor de 45 mg/kg, alrededor de 50 mg/kg, alrededor de 55 mg/kg, alrededor de 60 mg/kg, alrededor de 65 mg/kg, alrededor de 70 mg/kg, alrededor de 75 mg/kg, alrededor de 80 mg/kg, alrededor de 85 mg/kg, alrededor de 90 mg/kg, alrededor de 95 mg/kg, alrededor de 100 mg/kg, o una combinación de los mismos (es decir, cada dosis bimensual puede o no ser idéntica).
En algunas realizaciones, una dosis única de un anticuerpo o fragmento de la invención se administra a un paciente para prevenir, controlar, tratar y/o mejorar una enfermedad mediada por hOX40L dos, tres o cuatro veces a intervalos de alrededor de cada tres meses (por ejemplo, alrededor de 120 días) en el transcurso de un año, en el que la dosis se selecciona del grupo que consiste en alrededor de 0,1 mg/kg, alrededor de 0,5 mg/kg, alrededor de 1 mg/kg, alrededor de 5 mg/kg, alrededor de 10 mg/kg, alrededor de 15 mg/kg, alrededor de 20 mg/kg, alrededor de 25 mg/kg, alrededor de 30 mg/kg, alrededor de 35 mg/kg, alrededor de 40 mg/kg, alrededor de 45 mg/kg, alrededor de 50 mg/kg, alrededor de 55 mg/kg, alrededor de 60 mg/kg, alrededor de 65 mg/kg, alrededor de 70 mg/kg, alrededor de 75 mg/kg, alrededor de 80 mg/kg, alrededor de 85 mg/kg, alrededor de 90 mg/kg, alrededor de 95 mg/kg, alrededor de 100 mg/kg, o una combinación de los mismos (es decir, cada dosis trimestral puede o no ser idéntica).
En ciertas realizaciones, la vía de administración de una dosis de un anticuerpo o fragmento de la invención a un paciente es intranasal, intramuscular, intravenosa, o una combinación de las mismas, pero también son aceptables otras vías descritas aquí. En ciertas realizaciones, la vía de administración es intraocular. Cada dosis puede administrarse o no por una vía de administración idéntica. En algunas realizaciones, un anticuerpo o fragmento de la invención puede administrarse a través de múltiples vías de administración simultáneamente o posteriormente a otras dosis del mismo o diferente anticuerpo o fragmento de la invención.
En ciertas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de la invención se administran de forma profiláctica o terapéutica a un sujeto. Los anticuerpos o fragmentos de la invención se pueden administrar de forma profiláctica o terapéutica a un sujeto para prevenir, disminuir o mejorar una enfermedad mediada por hOX40L o un síntoma de la misma.
Terapia génica
En una realización específica, los ácidos nucleicos o las secuencias nucleotídicas de la invención se administran para prevenir, controlar, tratar y/o mejorar una enfermedad mediada por hOX40L mediante terapia génica. La terapia génica se refiere a la terapia realizada mediante la administración a un sujeto de un ácido nucleico expresado o expresable. En una realización de la invención, los ácidos nucleicos producen su anticuerpo codificado, y el anticuerpo media un efecto profiláctico o terapéutico.
Puede usarse según la presente invención cualquiera de los métodos para la terapia génica disponibles en la técnica.
Uso diagnóstico de anticuerpos
Aunque los anticuerpos se mencionan con respecto a los usos de diagnóstico, esta descripción debe leerse también como aplicable, mutatis mutandis, a los fragmentos de la invención.
Los anticuerpos marcados o de la invención, y derivados y análogos de los mismos, que se unen específicamente a un antígeno hOX40L, pueden usarse con fines de diagnóstico para detectar, diagnosticar o controlar una enfermedad mediada por hOX40L. La invención proporciona métodos para la detección de una enfermedad mediada por hOX40L, que comprende: (a) analizar la expresión de un antígeno hOX40L en células o una muestra de tejido de un sujeto usando uno o más anticuerpos de la invención que se unen específicamente al antígeno hOX40L; y (b) comparar el nivel del antígeno hOX40L con un nivel de control, por ejemplo niveles en muestras de tejido normal (por ejemplo, de un paciente que no tiene una enfermedad mediada por hOX40L, o del mismo paciente antes del inicio de la enfermedad), por lo que un aumento en el nivel analizado del antígeno hOX40L en comparación con el nivel de control del antígeno hOX40L es indicativo de una enfermedad mediada por hOX40L.
La invención proporciona un ensayo de diagnóstico para diagnosticar una enfermedad mediada por hOX40L, que comprende: (a) analizar el nivel de un antígeno hOX40L en células o una muestra de tejido de un individuo usando uno o más anticuerpos de la invención que se unen específicamente a un antígeno hOX40L; y (b) comparar el nivel del antígeno hOX40L con un nivel de control, por ejemplo niveles en muestras de tejido normal, por lo que un aumento en el nivel del antígeno hOX40L analizado en comparación con el nivel de control del antígeno hOX40L es indicativo de una enfermedad mediada por hOX40L. Un diagnóstico más definitivo de una enfermedad mediada por hOX40L puede permitir a los profesionales de la salud emplear medidas preventivas o un tratamiento agresivo previo, evitando así el desarrollo o la progresión de la enfermedad mediada por hOX40L.
Los anticuerpos de la invención se pueden usar para ensayar los niveles de antígeno hOX40L en una muestra biológica usando métodos inmunohistológicos clásicos como se describe aquí o como conocen los expertos en la técnica (por ejemplo, véase Jalkanen et al., 1985, J. Cell. Biol. 101:976-985; y Jalkanen et al., 1987, J. Cell. Biol. 105:3087-3096). Otros métodos basados en anticuerpos útiles para detectar la expresión génica de proteínas incluyen inmunoensayos, tal como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y el radioinmunoensayo (RIA). Los marcadores del ensayo de anticuerpos adecuados se conocen en la técnica, e incluyen marcadores enzimáticos, tales como glucosa oxidasa; radioisótopos, tales como yodo (125I, 121I), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (121In), y tecnecio (99Tc); marcadores luminiscentes, tal como luminol; y marcadores fluorescentes, tales como fluoresceína y rodamina, y biotina.
Un aspecto de la invención es la detección y diagnóstico de una enfermedad mediada por hOX40L en un ser humano. En una realización, el diagnóstico comprende: a) administrar (por ejemplo, por vía parenteral, subcutánea o intraperitoneal) a un sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo marcado que se une específicamente a un antígeno hOX40L; b) esperar un intervalo de tiempo después de la administración, para permitir que el anticuerpo marcado se concentre preferentemente en los sitios del sujeto donde se expresa el antígeno hOX40L (y para que la molécula marcada no unida se elimine hasta el nivel del fondo); c) determinar el nivel del fondo; y d) detectar el anticuerpo marcado en el sujeto, de manera que la detección del anticuerpo marcado por encima del nivel del fondo indica que el sujeto tiene una enfermedad mediada por hOX40L. El nivel del fondo se puede determinar mediante diversos métodos, incluyendo la comparación de la cantidad de molécula marcada detectada con un valor estándar previamente determinado para un sistema en particular.
Se entenderá en la técnica que el tamaño del sujeto y el sistema de formación de imágenes usado determinarán la cantidad de un resto de formación de imágenes necesaria para producir imágenes de diagnóstico. En el caso de un resto de radioisótopo, para un sujeto humano, la cantidad de radiactividad inyectada oscilará normalmente de alrededor de 5 y 20 milicuries de 99Tc. Entonces, el anticuerpo marcado se acumulará preferentemente en la ubicación de las células que contienen la proteína específica. Las imágenes de tumores in vivo se describen en S. W. Burchiel et al., “Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragmentos”. (Capítulo 13 en Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer, S. W. Burchiel y B. A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982)).
Dependiendo de varias variables, incluyendo el tipo de marcador usado y el modo de administración, el intervalo de tiempo después de la administración para permitir que el anticuerpo marcado se concentre preferentemente en sitios del sujeto y para que el anticuerpo marcado libre se elimine al nivel del fondo es de 6 a 48 horas, o de 6 a 24 horas, o de 6 a 12 horas. En otra realización, el intervalo de tiempo que sigue a la administración es de 5 a 20 días, o de 5 a 10 días.
En una realización, la monitorización de una enfermedad mediada por hOX40L se lleva a cabo repitiendo el método para diagnosticar la enfermedad mediada por hOX40L, por ejemplo un mes después del diagnóstico inicial, seis meses después del diagnóstico inicial, un año después del diagnóstico inicial, etc.
La presencia de la molécula marcada puede detectarse en el sujeto usando métodos conocidos en la técnica para la exploración in vivo. Estos métodos dependen del tipo de marcador usado. Los expertos podrán determinar el método apropiado para detectar un marcador particular. Los métodos y dispositivos que se pueden usar en los métodos de diagnóstico de la invención incluyen, pero no se limitan a, tomografía computarizada (TC), escaneo de cuerpo completo, tal como tomografía por emisión de positrones (PET), resonancia magnética nuclear (RMN), y ecografía.
En una realización específica, la molécula se marca con un radioisótopo, y se detecta en el paciente usando un instrumento quirúrgico sensible a la radiación (Thurston et al., patente U.S. No. 5.441.050). En otra realización, la molécula se marca con un compuesto fluorescente, y se detecta en el paciente usando un instrumento de escaneo sensible a la fluorescencia. En otra realización, la molécula se marca con un metal emisor de positrones, y se detecta en el paciente mediante tomografía por emisión de positrones. En todavía otra realización, la molécula se marca con un marcador paramagnético, y se detecta en un paciente usando imágenes por resonancia magnética (IRM).
Métodos de producción de anticuerpos
Los anticuerpos y fragmentos de la invención que se unen específicamente a un antígeno (OX40L) pueden ser producidos por cualquier método conocido en la técnica para la síntesis de anticuerpos, en particular por síntesis química o, preferentemente, por técnicas de expresión recombinante. La práctica de la invención emplea, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales en biología molecular, microbiología, análisis genético, ADN recombinante, química orgánica, bioquímica, PCR, síntesis y modificación de oligonucleótidos, hibridación de ácidos nucleicos, y campos relacionados dentro del conocimiento de la técnica. Estas técnicas se describen en las referencias citadas aquí, y se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987, y actualizaciones anuales); Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987, y actualizaciones anuales) Gait (ed.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein (ed.) (1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Birren et al. (eds.) (1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Los anticuerpos policlonales que se unen específicamente a un antígeno pueden producirse mediante diversos procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede administrar un antígeno humano a diversos animales hospedantes, incluyendo, pero sin limitarse a, conejos, ratones, ratas, etc., para inducir la producción de sueros que contienen anticuerpos policlonales específicos para el antígeno humano. Se pueden usar diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica, según la especie hospedante, e incluyen, pero no se limitan a, el de Freund (completo e incompleto), geles minerales tal como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tal como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianinas de lapa californiana, dinitrofenol, y adyuvantes humanos potencialmente útiles tal como BCG (bacilo Calmette-Guerin) y corynebacterium parvum. Dichos adyuvantes también son bien conocidos en la técnica.
Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar usando una amplia variedad de técnicas conocidas en la técnica, incluyendo el uso de tecnologías de hibridomas, recombinantes, y de expresión en fagos, o una combinación de las mismas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se pueden producir usando técnicas de hibridoma, incluyendo las conocidas en la técnica y enseñadas, por ejemplo, en Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988); Hammerling et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563681 (Elsevier, N.Y., 1981). La expresión “anticuerpo monoclonal”, como se usa aquí, no se limita a los anticuerpos producidos a través de la tecnología de hibridomas. Otros métodos ejemplares para producir anticuerpos monoclonales se discuten aquí en otra parte, tal como por ejemplo, el uso de KM Mouse™. En los Ejemplos aquí se proporcionan métodos ejemplares adicionales para producir anticuerpos monoclonales.
Los métodos para producir y seleccionar anticuerpos específicos usando tecnología de hibridoma son rutinarios y bien conocidos en la técnica. Brevemente, los ratones pueden inmunizarse con un antígeno hOX40L, y una vez que se detecta una respuesta inmunitaria, por ejemplo se detectan anticuerpos específicos para el antígeno hOX40L en el suero del ratón, se recoge el bazo del ratón y se aíslan los esplenocitos. A continuación, los esplenocitos se fusionan mediante técnicas bien conocidas con cualquier célula de mieloma adecuada, por ejemplo células de la línea celular SP20 disponibles en la ATCC. Los hibridomas se seleccionan y clonan mediante dilución limitada.
Además, se puede utilizar una técnica RIMMS (inmunización repetitiva en múltiples sitios) para inmunizar a un animal (Kilptrack et al., 1997 Hybridoma 16:381-9. A continuación, los clones de hibridoma se analizan mediante métodos conocidos en la técnica, para detectar células que segregan anticuerpos capaces de unirse a un polipéptido de la invención. El líquido ascítico, que generalmente contiene altos niveles de anticuerpos, puede generarse inmunizando ratones con clones de hibridoma positivos.
En consecuencia, la presente invención proporciona métodos para generar anticuerpos mediante el cultivo de una célula de hibridoma que segrega un anticuerpo modificado de la invención, en los que, preferiblemente, el hibridoma se genera fusionando esplenocitos aislados de un ratón inmunizado con un antígeno hOX40L con células de mieloma, y analizando entonces los hibridomas resultantes de la fusión en busca de clones de hibridoma que segregan un anticuerpo capaz de unirse a un antígeno hOX40L.
Los fragmentos de anticuerpos que reconocen antígenos hOX40L específicos pueden generarse mediante cualquier técnica conocida por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los fragmentos Fab y F(ab’)2 de la invención se pueden producir por escisión proteolítica de moléculas de inmunoglobulina, usando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab’)2). Los fragmentos F(ab’)2 contienen la región variable, la región constante de la cadena ligera, y el dominio CH1 de la cadena pesada. Además, los anticuerpos de la presente invención también se pueden generar usando diversos métodos de presentación en fagos conocidos en la técnica.
Por ejemplo, los anticuerpos también se pueden generar usando diversos métodos de presentación en fagos. En los métodos de presentación en fagos, los dominios de anticuerpos funcionales se muestran en la superficie de las partículas de fagos que portan las secuencias polinucleotídicas que los codifican. En particular, las secuencias de ADN que codifican los dominios VH y VL se amplifican a partir de bibliotecas de ADNc de animales (por ejemplo, bibliotecas de ADNc humano o murino de tejidos afectados). El ADN que codifica los dominios VH y VL se recombina junto con un enlazador scFv mediante PCR, y se clona en un vector fagémido. El vector se somete a electroporación en E. coli, y la E. coli se infecta con fago auxiliar. Los fagos usados en estos métodos son típicamente fagos filamentosos que incluyen fd y M13, y los dominios VH y VL generalmente se fusionan de forma recombinante con el gen III o el gen VIII del fago. El fago que expresa un dominio de unión a antígeno que se une a un antígeno particular puede seleccionarse o identificarse con antígeno, por ejemplo usando antígeno marcado o antígeno unido o capturado a una superficie sólida o perla. Los ejemplos de métodos de presentación en fagos que se pueden usar para producir los anticuerpos de la presente invención incluyen los descritos en Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods 182:41-50; Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods 184:177-186; Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:952-958; Persic et al., 1997, Gene 187:9-18; Burton et al., 1994, Advances in Immunology 57:191-280; Solicitud PCT No. PCT/GB91/01134 (publicada como WO 1992001047); Publicaciones Internacionales Nos. WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/1 1236, WO 95/15982, WO 95/20401, y WO97/13844; y patentes U.S. Nos. 5.698.426, 5.223.409, 5.403.484, 5.580.717, 5.427.908, 5.750.753, 5.821.047, 5.571.698, 5.427.908, 5.516.637, 5.780.225, 5.658.727, 5.733.743 y 5.969.108.
Como se describe en las referencias anteriores, después de la selección de fagos, las regiones codificantes de anticuerpos del fago pueden aislarse y usarse para generar anticuerpos completos, incluyendo anticuerpos humanos, o cualquier otro fragmento de unión a antígeno deseado, y expresarse en cualquier hospedante deseado, incluyendo células de mamífero, células de insectos, células vegetales, levaduras, y bacterias, por ejemplo como se describe a continuación. También se pueden emplear técnicas para producir recombinantemente fragmentos Fab, Fab’ y F(ab’)2 uaando métodos conocidos en la técnica, tales como los descritos en la publicación PCT No. WO 92/22324; Mullinax et al., 1992, BioTechniques 12(6):864-869; Sawai et al., 1995, AJRI 34:26-34; y Better et al., 1988, Science 240: 1041 -1043.
Para generar anticuerpos completos, los cebadores de PCR, que incluyen secuencias nucleotídicas de VH o VL, un sitio de restricción, y una secuencia flanqueante para proteger el sitio de restricción, pueden usarse para amplificar las secuencias de VH o VL en clones scFv. Utilizando técnicas de clonación conocidas por los expertos en la técnica, los dominios VH amplificados por PCR se pueden clonar en vectores que expresan una región constante de VH, por ejemplo la región constante gamma 4 humana, y los dominios VL amplificados por PCR se pueden clonar en vectores que expresan una región constante de VL, por ejemplo las regiones constantes kappa o lambda humanas. Los dominios VH y VL también pueden clonarse en un vector que expresa las regiones constantes necesarias. Los vectores de conversión de cadena pesada y los vectores de conversión de cadena ligera se cotransfectan entonces en líneas celulares para generar líneas celulares estables o transitorias que expresan anticuerpos de longitud completa, por ejemplo IgG, usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica.
Para algunos usos, incluyendo el uso in vivo de anticuerpos en seres humanos y ensayos de detección in vitro, puede ser preferible usar anticuerpos humanos o quiméricos. Los anticuerpos completamente humanos son particularmente deseables para el tratamiento terapéutico de sujetos humanos. Los anticuerpos humanos pueden fabricarse mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica, incluyendo los métodos de presentación en fagos descritos anteriormente usando bibliotecas de anticuerpos derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana. Véanse también las patentes U.S. Nos. 4.444.887 y 4.716.111; y las Publicaciones Internacionales Nos. WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, y WO 91/10741.
En realizaciones preferidas, se producen anticuerpos humanos. Los anticuerpos humanos y/o los anticuerpos completamente humanos se pueden producir usando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo los ejemplos proporcionados aquí. Por ejemplo, ratones transgénicos que son incapaces de expresar inmunoglobulinas endógenas funcionales, pero que pueden expresar genes de inmunoglobulinas humanas. Por ejemplo, los complejos génicos de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada humana pueden introducirse aleatoriamente o mediante recombinación homóloga en células madre embrionarias de ratón. Alternativamente, la región variable humana, la región constante y la región de diversidad pueden introducirse en células madre embrionarias de ratón, además de los genes de cadena pesada y ligera humana. Los genes de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada de ratón pueden volverse no funcionales por separado o simultáneamente con la introducción de loci de inmunoglobulina humana mediante recombinación homóloga. En particular, la supresión homocigótica de la región JH impide la producción de anticuerpos endógenos. Las células madre embrionarias modificadas se expanden y microinyectan en blastocistos para producir ratones quiméricos. A continuación, los ratones quiméricos se cruzan para producir descendencia homocigótica que exprese anticuerpos humanos. Los ratones transgénicos se inmunizan de forma normal con un antígeno seleccionado, por ejemplo todo o una parte de un polipéptido de la invención. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno se pueden obtener a partir de ratones transgénicos inmunizados usando tecnología de hibridoma convencional. Los transgenes de inmunoglobulina humana albergados por los ratones transgénicos se reorganizan durante la diferenciación de las células B y, posteriormente, experimentan un cambio de clase y una mutación somática. Por lo tanto, usando tal técnica, es posible producir anticuerpos IgG, IgA, IgM e IgE terapéuticamente útiles. Para obtener una descripción general de esta tecnología para producir anticuerpos humanos, véase Lonberg y Huszar (1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93). Para una discusión detallada de esta tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos, y protocolos para producir dichos anticuerpos, véanse, por ejemplo, las publicaciones PCT Nos. WO 98/24893, WO 96/34096, y WO 96/33735; y las patentes U.S. Nos. 5.413.923, 5.625.126, 5.633.425, 5.569.825, 5.661.016, 5.545.806, 5.814.318, y 5.939.598. Otros métodos se detallan en los Ejemplos aquí. Además, empresas como Abgenix, Inc/Amgen. (Thousand Oaks, California), OMT (Paolo Alto, California), Argen-x (Breda, Países Bajos), Ablexis (San Francisco, California) o Harbor Antibodies (Cambridge, Mass.) se pueden utilizar para proporcionar anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno seleccionado usando una tecnología similar a la descrita anteriormente.
Un anticuerpo quimérico es una molécula en la que diferentes porciones del anticuerpo derivan de diferentes moléculas de inmunoglobulina. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos son conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Morrison, 1985 Science 229:1202; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214; Gillies et al., 1989, J. Immunol. Methods 125:191 -202; y las patentes U.S. Nos. 5.807.715, 4.816.567, 4.816.397, y 6.331.415.
Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo o su variante o fragmento del mismo que es capaz de unirse a un antígeno predeterminado y que comprende una región marco que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana y una CDR que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina no humana. Un anticuerpo humanizado comprende sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables (Fab, Fab’, F(ab’)2, Fabc, Fv) en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana (es decir, un anticuerpo donante), y todas o sustancialmente todas las regiones marco son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. Preferiblemente, un anticuerpo humanizado también comprende al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Normalmente, el anticuerpo contendrá tanto la cadena ligera como al menos el dominio variable de una cadena pesada. El anticuerpo también puede incluir las regiones CH1, bisagra, CH2, CH3 y CH4 de la cadena pesada. El anticuerpo humanizado se puede seleccionar de cualquier clase de inmunoglobulinas, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo, incluyendo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Normalmente, el dominio constante es un dominio constante de fijación del complemento en el que se desea que el anticuerpo humanizado muestre actividad citotóxica, y la clase es típicamente IgG1. Cuando tal actividad citotóxica no sea deseable, el dominio constante puede ser de la clase IgG2. En ciertas realizaciones, los anticuerpos de la invención comprenden una región constante gamma 4 humana. En otra realización, la región constante de cadena pesada no se une a los receptores Fc-y, y por ejemplo comprende una mutación Leu235Glu. En otra realización, la región constante de cadena pesada comprende una mutación Ser228Pro para aumentar la estabilidad. En otra realización, la región constante de cadena pesada es IgG4-PE. Los ejemplos de dominios constantes VL y VH que se pueden usar en ciertas realizaciones de la invención incluyen, pero no se limitan a, C-kappa y C-gamma-1 (nG1m), descritos en Johnson et al. (1997) J. Infect. Dis. 176, 1215-1224 y los descritos en la patente U.S. No. 5.824.307. El anticuerpo humanizado puede comprender secuencias de más de una clase o isotipo, y la selección de dominios constantes particulares para optimizar las funciones efectoras deseadas está dentro de los conocimientos habituales en la técnica. Las regiones marco y CDR de un anticuerpo humanizado no tienen por qué corresponder con precisión a las secuencias parentales, por ejemplo la CDR del donante o la región marco de consenso se pueden mutagenizar por sustitución, inserción o supresión de al menos un resto, de manera que el resto de CDR o del marco en ese sitio no corresponde ni al consenso ni al anticuerpo importado. Tales mutaciones, sin embargo, no serán extensas. Normalmente, al menos el 75% de los restos de anticuerpos humanizados corresponderán a los de las secuencias FR y CDR parentales, más a menudo el 90%, y lo más preferiblemente más del 95%. Los anticuerpos humanizados se pueden producir usando una variedad de técnicas conocidas en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, injerto de CDR (Patente Europea No. EP 239.400; Publicación internacional No. WO 91/09967; y patentes U.S. Nos.
5.225.539, 5.530.101, y 5.585.089), revestimiento o renovación de la superficie (Patentes Europeas Nos. EP 592.106 y EP 519.596; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28 (4/5): 489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7(6):805-814; y Roguska et al., 1994, PNAS 91:969-973), barajado de cadenas (patente U.S. No. 5.565.332), y las técnicas descritas en, por ejemplo, patente U.S. No. 6.407.213, patente U.S. No. 5.766.886, WO 9317105, Tan et al., J. Immunol. 169:111925 (2002)), Caldas et al., Protein Eng. 13(5):353-60 (2000), Morea et al., Methods 20(3):26779 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem. 272(16):10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng. 9(10):895904 (1996), Couto et al., Cancer Res. 55 (23 Supp):5973s-5977s (1995), Couto et al., Cancer Res. 55(8):1717-22 (1995), Sandhu J S, Gene 150(2):409-10 (1994), y Pedersen et al., J. Mol. Biol. 235(3):959-73 (1994). Véase también la publicación de patente U.S. No. US 2005/0042664 A1 (Feb. 24, 2005). A menudo, los restos del marco en las regiones marco se sustituirán por el resto correspondiente del anticuerpo donante de CDR para alterar, preferiblemente mejorar, la unión al antígeno. Estas sustituciones del marco se identifican mediante métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo mediante el modelado de las interacciones de los restos de CDR y del marco para identificar los restos del marco importantes para la unión al antígeno, y la comparación de secuencias para identificar los restos del marco inusuales en posiciones particulares. (Véase, por ejemplo, Queen et al., patente U.S. No. 5.585.089; y Reichmann et al., 1988, Nature 332:323).
Los anticuerpos de un solo dominio, por ejemplo los anticuerpos que carecen de las cadenas ligeras, se pueden producir mediante métodos bien conocidos en la técnica. Véase Riechmann et al., 1999, J. Immunol. 231:25-38; Nuttall et al., 2000, Curr. Farmacia Biotecnología. 1 (3):253-263; Muylderman, 2001, J. Biotechnol. 74(4):277302; patente U.S. No. 6.005.079; y Publicaciones Internacionales Nos. WO 94/04678, W o 94/25591, y WO 01/44301.
Además, los anticuerpos que se unen específicamente a un antígeno hOX40L pueden, a su vez, utilizarse para generar anticuerpos anti-idiotipo que “imitan” a un antígeno usando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. (Véase, por ejemplo, Greenspan & Bona, 1989, FASEB J. 7(5):437-444; y Nissinoff, 1991, J. Immunol., 147(8):2429-2438).
Kits
La invención también proporciona un paquete o kit farmacéutico o de diagnóstico que comprende uno o más recipientes rellenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención, tal como uno o más anticuerpos o fragmentos proporcionados aquí. Asociado opcionalmente con dicho recipiente o recipientes puede haber un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, aviso que refleja la aprobación de la agencia de fabricación, uso o venta para administración humana, por ejemplo un número de autorización.
La presente invención proporciona kits que pueden usarse en los métodos anteriores. En una realización, un kit comprende un anticuerpo de la invención, preferiblemente un anticuerpo purificado, en uno o más recipientes. En una realización específica, los kits de la presente invención contienen un antígeno hOX40L sustancialmente aislado como control. Preferiblemente, los kits de la presente invención comprenden además un anticuerpo de control que no reacciona con el antígeno hOX40L. En otra realización específica, los kits de la presente invención contienen un medio para detectar la unión de un anticuerpo modificado a un antígeno hOX40L (por ejemplo, el anticuerpo puede conjugarse con un sustrato detectable tal como un compuesto fluorescente, un sustrato enzimático, un compuesto radiactivo o un compuesto luminiscente, o un segundo anticuerpo que reconoce el primer anticuerpo puede conjugarse con un sustrato detectable). En realizaciones específicas, el kit puede incluir un antígeno hOX40L producido de forma recombinante o sintetizado químicamente. El antígeno hOX40L proporcionado en el kit también se puede unir a un soporte sólido. En una realización más específica, los medios de detección del kit descrito anteriormente incluyen un soporte sólido al que se une el antígeno hOX40L. Dicho kit también puede incluir un anticuerpo antihumano no unido marcado con un informador. En esta realización, la unión del anticuerpo al antígeno hOX40L puede detectarse mediante la unión de dicho anticuerpo marcado con un informador.
Las “sustituciones conservativas de aminoácidos” resultan de la sustitución de un aminoácido por otro que tiene propiedades estructurales y/o químicas similares, tal como la sustitución de una leucina por una isoleucina o valina, un aspartato por un glutamato, o una treonina por una serina. Por lo tanto, una “sustitución conservativa” de una secuencia de aminoácidos en particular se refiere a la sustitución de aquellos aminoácidos que no son críticos para la actividad polipeptídica, o a la sustitución de aminoácidos por otros aminoácidos que tienen propiedades similares (por ejemplo, ácidos, básicos, cargados positiva o negativamente, polares o no polares, etc.) de modo que la sustitución incluso de aminoácidos críticos no reduzca la actividad del péptido (es decir, la capacidad del péptido para penetrar la barrera hematoencefálica (BBB)). Las tablas de sustitución conservativa que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, cada uno de los siguientes seis grupos contiene aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí: 1) alanina (A), serina (S), treonina (T); 2) ácido aspártico (D), ácido glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); y 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W). (Véase también, Creighton, Proteins, W. H. Freeman and Company (1984)). En algunas realizaciones, las sustituciones, eliminaciones o adiciones individuales que alteran, añaden o eliminan un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos también pueden considerarse “sustituciones conservativas” si el cambio no reduce la actividad del péptido. Las inserciones o supresiones están típicamente en el intervalo de alrededor de 1 a 5 aminoácidos. La elección de los aminoácidos conservativos puede seleccionarse en función de la ubicación del aminoácido que se va a sustituir en el péptido, por ejemplo si el aminoácido está en el exterior del péptido y expuesto a disolventes, o en el interior y no expuesto a disolventes.
En realizaciones alternativas, se puede seleccionar el aminoácido que sustituirá a un aminoácido existente en función de la ubicación del aminoácido existente, es decir, su exposición a disolventes (es decir, si el aminoácido está expuesto a disolventes o está presente en la superficie externa del péptido o polipéptido en comparación con los aminoácidos localizados internamente no expuestos a disolventes). La selección de dichas sustituciones de aminoácidos conservativas es bien conocida en la técnica, por ejemplo como se describe en Dordo et al, J. Mol Biol, 1999, 217, 721 -739 y Taylor et al., J. Theor. Biol. 119 (1986); 205-218 y S. French y B. Robson, J. Mol. Evol., 19 (1983)171. En consecuencia, se pueden seleccionar sustituciones de aminoácidos conservativas adecuadas para aminoácidos en el exterior de una proteína o péptido (es decir, aminoácidos expuestos a un disolvente); por ejemplo, pero sin limitarse a, se pueden usar las siguientes sustituciones: sustitución de Y por F, T con S o K, P por A, E por D o Q, N por D o G, R por K, G por N o A, T por S o K, D por N o E, I por L o V, F por Y, S por T o A, R por K, G por N o A, K por R, A por S, K o P.
En realizaciones alternativas, también se pueden seleccionar sustituciones conservativas de aminoácidos que sean adecuadas para los aminoácidos del interior de una proteína o un péptido; por ejemplo, se pueden usar sustituciones conservativas adecuadas para los aminoácidos que se encuentran en el interior de una proteína o un péptido (es decir, los aminoácidos no están expuestos a un disolvente); por ejemplo, pero no limitado a, se pueden usar las siguientes sustituciones conservativas: cuando Y se sustituye con F, T por A o S, I por L o V, W por Y, M por L, N por D, G por A, T por A o S, D por N, I por L o V, F por Y o L, S por A o T y A por S, G, T o V. En algunas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos no conservativas también se engloban dentro del término de variantes.
Como se usa aquí, un “anticuerpo” se refiere a moléculas IgG, IgM, IgA, IgD o IgE, o fragmentos de anticuerpos específicos de antígeno de las mismas (incluyendo, pero sin limitarse a, un Fab, F(ab’)2, Fv, Fv enlazado por disulfuro, scFv, anticuerpo de dominio único, anticuerpo multiespecífico de conformación cerrada, scfv enlazado por disulfuro, diacuerpo), ya sea derivado de cualquier especie que produzca naturalmente un anticuerpo, o creado por tecnología de ADN recombinante; ya sea aislado de suero, células B, hibridomas, transfectomas, levaduras o bacterias. Los anticuerpos se pueden humanizar usando tecnología de rutina.
Como se describe aquí, un “antígeno” es una molécula que se une a un sitio de unión en un agente anticuerpo. Por lo general, los antígenos se unen a ligandos de anticuerpos, y son capaces de generar una respuesta de anticuerpos in vivo. Un antígeno puede ser un polipéptido, proteína, ácido nucleico u otra molécula o porción de la misma. La expresión “determinante antigénico” se refiere a un epítopo en el antígeno reconocido por una molécula de unión al antígeno, y más particularmente, por el sitio de unión al antígeno de dicha molécula.
Como se usa aquí, la expresión “fragmento de anticuerpo” se refiere a un polipéptido que incluye al menos un dominio variable de inmunoglobulina o una secuencia de dominio variable de inmunoglobulina, y que se une específicamente a un antígeno dado. Un fragmento de anticuerpo puede comprender un anticuerpo o un polipéptido que comprende un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo. En algunas realizaciones, un fragmento de anticuerpo puede comprender un anticuerpo monoclonal o un polipéptido que comprende un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal. Por ejemplo, un anticuerpo puede incluir una región variable de cadena pesada (H) (abreviada aquí como VH), y una región variable de cadena OX40L (L) (abreviada aquí como VL). En otro ejemplo, un anticuerpo incluye dos regiones variables de cadena pesada (H) y dos regiones variables de cadena OX40L (L). La expresión “fragmento de anticuerpo” abarca fragmentos de anticuerpos que se unen a antígenos (por ejemplo, anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos Fab y sFab, fragmentos F(ab’)2, Fd, fragmentos Fv, scFv, y fragmentos de anticuerpos de dominio (dAb) (véase, por ejemplo, de Wildt et al., Eur J. Immunol., 1996; 26(3):629-39)), así como anticuerpos completos. Un anticuerpo puede tener las características estructurales de IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (así como subtipos y combinaciones de los mismos). Los anticuerpos pueden ser de cualquier origen, incluyendo los de ratón, conejo, cerdo, rata y primate (primate humano y no humano), y anticuerpos primatizados. Los anticuerpos también incluyen midicuerpos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos y similares.
Como se usa aquí, “dominio variable de anticuerpo” se refiere a las porciones de las cadenas OX40L y pesada de moléculas de anticuerpo que incluyen secuencias de aminoácidos de regiones determinantes de complementariedad (CDR, es decir, CDR1, CDR2 y CDR3) y regiones marco (FR). VH se refiere al dominio variable de la cadena pesada. VL se refiere al dominio variable de la cadena ligera. De acuerdo con los métodos usados en esta invención, las posiciones de aminoácidos asignadas a las CDR y FR pueden definirse de acuerdo con Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 y 1991)) o según la nomenclatura IMGT.
Como se usa aquí, la expresión “sitio de unión del anticuerpo” se refiere a un polipéptido o dominio que comprende una o más CDR de un anticuerpo y es capaz de unirse a un antígeno. Por ejemplo, el polipéptido comprende una CDR3 (por ejemplo, HCDR3). Por ejemplo, el polipéptido comprende las CDR 1 y 2 (por ejemplo, HCDR1 y 2) o las CDR 1-3 de un dominio variable de un anticuerpo (por ejemplo, HCDR 1-3). En un ejemplo, el sitio de unión del anticuerpo lo proporciona un solo dominio variable (por ejemplo, un dominio VH o VL). En otro ejemplo, el sitio de unión comprende un par VH/VL, o dos o más de tales pares.
Como se usa aquí, “genotipado” se refiere a un procedimiento de determinación de la composición alélica específica de una célula y/o sujeto en una o más posiciones dentro del genoma, por ejemplo determinando la secuencia de ácido nucleico en esa posición. El genotipado se refiere a un análisis de ácido nucleico y/o análisis a nivel de ácido nucleico. Como se usa aquí, “fenotipado” se refiere a un procedimiento de determinación de la identidad y/o composición de un producto de expresión de una célula y/o sujeto, por ejemplo determinando la secuencia polipeptídica de un producto de expresión. El fenotipado se refiere a un análisis de proteínas y/o análisis a nivel de proteínas.
Como se usa aquí, los términos “tratar”, “tratamiento”, “tratando”, o “mejorar” se refieren a tratamientos terapéuticos, en los que el objetivo es revertir, aliviar, mejorar, inhibir, ralentizar o detener la progresión o la gravedad de un afección asociada con una enfermedad o trastorno. El término “tratar” incluye reducir o aliviar al menos un efecto adverso o síntoma de una afección, enfermedad o trastorno. El tratamiento generalmente es “eficaz” si se reducen uno o más síntomas o marcadores clínicos. Alternativamente, el tratamiento es “eficaz” si se reduce o detiene la progresión de una enfermedad. Es decir, el “tratamiento” incluye no solo la mejora de los síntomas o marcadores, sino también el cese, o al menos la ralentización, del progreso o el empeoramiento de los síntomas, en comparación con lo que se esperaría en ausencia de tratamiento. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, alivio de uno o más síntomas, disminución de la extensión de la enfermedad, estado estabilizado (es decir, no empeora) de la enfermedad, retraso o ralentización de la progresión de la enfermedad, mejora o paliación del estado de la enfermedad, remisión (ya sea parcial o total), y/o disminución de la mortalidad, ya sea detectable o no detectable. El término “tratamiento” de una enfermedad también incluye proporcionar alivio de los síntomas o efectos secundarios de la enfermedad (incluyendo el tratamiento paliativo). Para que el tratamiento sea eficaz, no se contempla una cura completa. En ciertos aspectos, el método puede incluir también la curación.
Como se usa aquí, la expresión “composición farmacéutica” se refiere al agente activo en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, por ejemplo un vehículo comúnmente usado en la industria farmacéutica. La frase “farmacéuticamente aceptable” se emplea aquí para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que, dentro del alcance del buen juicio médico, son adecuados para uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin una excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica, u otro problema o complicación, acorde con una proporción razonable de beneficio/riesgo.
Tal como se usa aquí, el término “administrar” se refiere a la colocación de un compuesto como se describe aquí en un sujeto mediante un método o ruta que da como resultado la administración al menos parcial del agente en un sitio deseado. Las composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos descritos aquí pueden administrarse por cualquier ruta apropiada que dé como resultado un tratamiento eficaz en el sujeto.
Se pueden administrar múltiples composiciones por separado o simultáneamente. La administración separada se refiere a las dos composiciones que se administran en momentos diferentes, por ejemplo al menos 10, 20, 30 o 10-60 minutos de diferencia, o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12 horas de diferencia. También se pueden administrar composiciones con un intervalo de 24 horas, o incluso con un intervalo mayor. Alternativamente, se pueden administrar dos o más composiciones simultáneamente, por ejemplo menos de 10 o menos de 5 minutos de diferencia. Las composiciones administradas simultáneamente pueden, en algunos aspectos, administrarse como una mezcla, con o sin un mecanismo de liberación en el tiempo similar o diferente para cada uno de los componentes.
Como se usa aquí, “número de autorización” o “número de autorización de comercialización” se refiere a un número emitido por una agencia reguladora cuando esa agencia determina que un producto y/o composición médica en particular puede comercializarse y/u ofrecerse para la venta en el área bajo la jurisdicción de la agencia. Como se usa aquí, “agencia reguladora” se refiere a una de las agencias responsables de evaluar, por ejemplo, la seguridad y eficacia de un producto médico y/o composición, y controlar las ventas/comercialización de dichos productos y/o composiciones en un área determinada. La Food and Drug Administration (FDA) en los EE.UU. y la Agencia Europea de Medicamentos (EPA) en Europa son solo dos ejemplos de dichas agencias reguladoras. Otros ejemplos no limitativos pueden incluir SDA, MPA, MHPRA, IMA, a Nm At , Hong Kong Department of Health-Drug Office, CDSCO, Medsafe, y KFDA.
Como se usa aquí, “dispositivo de inyección” se refiere a un dispositivo que está diseñado para realizar inyecciones, una inyección que incluye las etapas de acoplar temporalmente de forma fluida el dispositivo de inyección al tejido de una persona, típicamente el tejido subcutáneo. Una inyección incluye además administrar una cantidad de fármaco líquido en el tejido, y desacoplar o retirar el dispositivo de inyección del tejido. En algunas realizaciones, un dispositivo de inyección puede ser un dispositivo intravenoso o un dispositivo IV, que es un tipo de dispositivo de inyección usado cuando el tejido diana es la sangre dentro del sistema circulatorio, por ejemplo la sangre en una vena. Un ejemplo común, pero no limitativo, de un dispositivo de inyección es una aguja y una jeringa.
Como se usa aquí, un “amortiguador” se refiere a un agente químico que es capaz de absorber una cierta cantidad de ácido o base sin sufrir una fuerte variación en el pH.
Como se usa aquí, “envasado” se refiere a cómo se organizan y/o restringen los componentes en una unidad adecuada para su distribución y/o uso. El envasado puede incluir, por ejemplo, cajas, bolsas, jeringas, ampollas, viales, tubos, envasados de tipo concha, barreras y/o recipientes para mantener la esterilidad, etiquetado, etc.
Como se usa aquí, “instrucciones” se refiere a una presentación de material escrito, impreso o gráfico en el envase inmediato de un artículo, por ejemplo el material escrito que se muestra en un vial que contiene un agente farmacéuticamente activo, o detalles sobre la composición y el uso de un producto de interés incluido en un kit que contiene una composición de interés. Las instrucciones establecen el método del tratamiento que se prevé administrar o realizar.
Como se usa aquí, la expresión “que comprende” o “comprende” se usa en referencia a anticuerpos, fragmentos, usos, composiciones, métodos, y su o sus componentes respectivos, que son esenciales para el método o la composición, pero abiertos a la inclusión de elementos no especificados, esenciales o no.
La expresión “que consiste en” se refiere a anticuerpos, fragmentos, usos, composiciones, métodos, y componentes respectivos de los mismos como se describe aquí, que son exclusivos de cualquier elemento no mencionado en esa descripción de la realización.
Como se usa aquí, la expresión “que consiste esencialmente en” se refiere a los elementos requeridos para una realización dada. La expresión permite la presencia de elementos que no afectan materialmente las características básicas y novedosas o funcionales de esa realización.
Los términos singulares “un”, “una” y “el” incluyen referentes plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De manera similar, la palabra “o” pretende incluir “y”, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Aunque se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos aquí en la práctica o ensayo de esta descripción, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. La abreviatura, “por ejemplo”, deriva del latín exempli gratia, y se usa aquí para indicar un ejemplo no limitativo. Por lo tanto, la abreviatura “por ejemplo” es sinónimo de la expresión “por ejemplo”.
Las definiciones de términos comunes en biología celular y biología molecular se pueden encontrar en “The Merck Manual of Diagnosis and Therapy”, 19a edición, publicado por Merck Research Laboratories, 2006 (ISBN 0-911910­ 19-0); Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); Benjamin Lewin, Genes X, publicado por Jones & Bartlett Publishing, 2009 (ISBN-10: 0763766321); Kendrew et al. (eds.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8), y Current Protocols in Protein Sciences 2009, Wiley Intersciences, Coligan et al., eds.
A menos que se indique lo contrario, la presente invención se realizó usando procedimientos estándar, como se describe, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4 ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, USA (2012)); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., Nueva York, USA (1995); o Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques Vol.152, S. L. Berger y A. R. Kimmel Eds., Academic Press Inc., San Diego, USA (1987)); Current Protocols in Protein Science (CPPS) (John E. Coligan, et al., ed., John Wiley and Sons, Inc.), Current Protocols in Cell Biology (CPCB) (Juan S. Bonifacino et al. ed., John Wiley and Sons, Inc.), y Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique por R. Ian Freshney, editor: Wiley-Liss; 5a edición (2005), Animal Cell Culture Methods (Methods in Cell Biology, Vol. 57, Jennie P. Mather y David Barnes editores, Academic Press, 1a edición, 1998).
El uso de la palabra “un” o “uno”, cuando se usa junto con la expresión “que comprende”, en las reivindicaciones y/o la memoria descriptiva, puede significar “uno”, pero también es consistente con el significado de “uno o más, “al menos uno” y “uno o más de uno”. El uso del término “o” en las reivindicaciones significa “y/o”, a menos que se indique explícitamente que se refiere solo a alternativas o que las alternativas se excluyen mutuamente, aunque la descripción apoya una definición que se refiere solo a alternativas e “y/o.” A lo largo de esta solicitud, la expresión “alrededor de” se usa para indicar que un valor incluye la variación inherente de error para el dispositivo, empleándose el método para determinar el valor, o la variación que existe entre los sujetos de estudio.
Tal como se utiliza en esta memoria descriptiva y la o las reivindicaciones, las palabras “que comprende” (y cualquier forma de comprendiendo, tal como “comprender” y “comprende”), “que tiene” (y cualquier forma de que tiene, tal como “tener” y “tiene”), “que incluye” (y cualquier forma de que incluye, tal como “incluir” e “incluye”) o “que contiene” (y cualquier forma de que contiene, tal como “contener” y “contiene”) son inclusivos o abiertos, y no excluyen elementos adicionales no citados o etapas del método.
Cualquier parte de esta descripción puede leerse en combinación con cualquier otra parte de la descripción, a menos que se desprenda lo contrario del contexto.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Preparación de antígenos, procedimientos de inmunización, y generación de hibridomas
El siguiente ejemplo proporciona una descripción detallada de la generación e identificación de un panel de anticuerpos monoclonales antihumanos OX40L utilizando el sistema KyMouse™ (véase, por ejemplo, el documento WO2011/004192). Con este fin, se inmunizaron ratones modificados genéticamente que contenían una gran cantidad de genes de inmunoglobulina humana con OX40L humana recombinante soluble (comercial o de producción propia) u OX40L humana expresada en superficie que se presenta en células de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF). Se establecieron dviersos regímenes de inmunización, incluyendo las inyecciones intraperitoneales convencionales, así como un régimen de inmunización rápida en múltiples sitios, lo que reforzó a los animales durante varias semanas. Al final de cada régimen, se extrajo tejido linfoide secundario, tal como el bazo, y en algunos casos, los ganglios linfáticos. Los tejidos se prepararon en una suspensión de células individuales, y se fusionaron con células SP2/0 para generar una línea celular de hibridoma estable.
Materiales y métodos
Expresión de clonación y purificación de OX40L recombinante de Rhesus y humano
El ADNc que codifica el dominio extracelular de OX40L humano se clonó en un plásmido de expresión de pREP4 (Invitrogen) usando técnicas estándar de biología molecular. Las construcciones también contenían un motivo de péptido FLAG para ayudar a la purificación, y un motivo de cremallera de isoleucina para ayudar a la trimerización. Las construcciones se secuenciaron para asegurar su composición de secuencia correcta.
OX40L de Rhesus (Macaca mulata) se creó usando el plásmido OX40L humano creado anteriormente como molde y usando mutagénesis dirigida al sitio para introducir los cambios de aminoácidos.
OX40L humano y OX40L de mono Rhesus se expresaron transitoriamente para producir proteína recombinante usando línea celular adaptada a suspensión CHO-S Freestyle™ de Invitrogen. Los plásmidos se transfectaron en las células usando PEI (polietilenimina MW 40000), y se dejaron crecer durante un período de 13 días antes de recolectar el sobrenadante para la purificación. Las células se alimentaron durante el proceso de sobrecrecimiento con ActiCHO™ Feeds A y B de GE Healthcare, para ayudar a aumentar la productividad y promover la longevidad de las células. Durante el proceso de sobrecrecimiento, se tomaron muestras regularmente para monitorizar el crecimiento y la viabilidad de las células.
Las proteínas OX40L etiquetadas con FLAG se purificaron en un procedimiento de dos etapas; en primer lugar, los sobrenadantes de cultivo tisular clarificados procedentes de la expresión de CHO-S se purificaron usando cromatografía de afinidad anti-FLAG M2. Las fracciones eluidas que contenían la proteína OX40L se sometieron luego a cromatografía de exclusión por tamaños, y se evaluó la pureza mediante análisis SDS-PAGE, y se cuantificó mediante lectura en espectrofotómetro a OD280nm.
Expresión de clonación y purificación del receptor OX40 humano recombinante
El ADNc que codifica el dominio extracelular del receptor OX40 humano se clonó en un plásmido de expresión de pREP4 (Invitrogen) usando digestión y ligación con enzimas de restricción estándar. La construcción contenía una porción Fc humana para ayudar a la purificación. Las construcciones se secuenciaron para asegurar su composición de secuencia correcta.
El receptor OX40 humano se expresó de forma transitoria para producir proteína recombinante usando línea celular adaptada a suspensión CHO-S Freestyle™ de Invitrogen. Los plásmidos se transfectaron en las células usando PEI (polietilenimina MW 40000), y se dejaron crecer durante un período de 13 días antes de recolectar el sobrenadante para la purificación. Las células se alimentaron durante el proceso de sobrecrecimiento con ActiCHO™ Feeds A y B de GE Healthcare, para ayudar a aumentar la productividad y promover la longevidad de las células. Durante el proceso de crecimiento excesivo, se tomaron muestras regularmente para monitorizar el crecimiento y la viabilidad de las células.
La proteína receptora OX40 etiquetada con Fc se purificó en un procedimiento de dos etapas; en primer lugar, los sobrenadantes de cultivo tisular clarificados procedentes de la expresión de CHO-S se purificaron usando cromatografía de afinidad con proteína G. Las fracciones eluidas que contenían la proteína receptora OX40 se sometieron luego a cromatografía de exclusión por tamaños, y se evaluó la pureza mediante análisis SDS-PAGE, y se cuantificó mediante lectura en espectrofotómetro a OD280nm.
Generación de células MEF y CHO-S transfectadas de forma estable que expresan OX40L humano
Se optimizaron los codones de las secuencias OX40L humanas completas (Seq ID No: 173) para la expresión en mamíferos, y se clonaron en un vector de expresión bajo el promotor CMV flanqueado por secuencias repetidas terminales específicas de piggyBac en 3’ y 5’ que facilitan la integración estable en el genoma celular (véase: “A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications”; Yusa K, Zhou L, Li MA, Bradley A, Craig NL. Proc Natl Acad Sci USA. 25 de enero de 2011). Además, el vector de expresión contenía un casete de selección de puromicina o neomicina para facilitar la generación de líneas celulares estables. El plásmido de expresión hOX40L se cotransfectó con un plásmido que codifica la transposasa piggyBac en una línea celular de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) derivada de nuestro laboratorio (los embriones usados para generar esta línea se obtuvieron de un ratón hembra 129S5 cruzada con C57BL6) y células CHO-S usando el reactivo de transfección FreeStyle Max (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 24 horas después de la transfección, los medios se complementaron con G418 o neomicina, y se cultivaron durante al menos 2 semanas para seleccionar una línea celular estable, y los medios se cambiaron cada 3-4 días. La expresión de hOX40L se evaluó mediante citometría de flujo usando un anticuerpo conjugado anti-OX40L humano-PE (eBioscience). El medio MEF completo estaba formado por medio de Eagle modificado por Dulbecco (Gibco) suplementado con suero fetal bovino al 10% v/v (Gibco). El medio CHO-S completo estaba formado por medio CD-CHO suplementado con glutamax 8 mM (Gibco).
Generación de HT1080 que expresa OX40R y gen informador NF-Kappa
La secuencia completa del receptor OX40 humano se optimizó por codones (Seq ID No: 175) para la expresión en mamíferos y se clonó en un vector de expresión bajo el promotor CMV flanqueado por secuencias repetidas terminales específicas de piggyBac en 3’ y 5’ que facilitan la integración estable en el genoma celular (véase: “A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications” ; Yusa K, Zhou L, Li MA, Bradley A, Craig NL. Proc Natl Acad Sci USA. 25 de enero de 2011). Además, el vector de expresión contenía un casete de selección de puromicina para facilitar la generación de líneas celulares estables. El plásmido de expresión del receptor hOX40 se cotransfectó con un plásmido que codifica la transposasa piggyBac en células HT1080 (ATCC® CCL-121) usando el reactivo de transfección FreeStyle Max (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. 24 horas después de la transfección, el medio se complementó con puromicina y se cultivó durante al menos 2 semanas para seleccionar una línea celular estable, y el medio se intercambió cada 3-4 días. La expresión del receptor OX40 se evaluó mediante citometría de flujo usando un anticuerpo conjugado con anti-receptor OX40 humano-PE (R&D, clon 443318). Después de la generación de una línea celular estable que expresa el receptor OX40, las células se transfectaron con el plásmido pNiFty-2-SEAP (invivogen) que contenía 5 sitios de unión del factor de transcripción NFkB repetidos, seguido de fosfatasa alcalina segregada. Las células estables se seleccionaron con la adición de zeocina al medio, agregándose medio nuevo cada 3-4 días. El medio HT1080 completo estaba compuesto por MEM suplementado con suero fetal de ternero al 10%.
Preparación de células MEF para inmunizaciones de ratón:
Se eliminó el medio de cultivo celular, y las células se lavaron una vez con 1xPBS. Las células se trataron durante 5 minutos con tripsina para soltar las células de la superficie del cultivo de tejidos. Las células se recogieron, y la tripsina se neutralizó mediante la adición de medios completos que contenían suero fetal bovino (FCS) al 10% v/v. A continuación, las células se centrifugaron a 300 xg durante 10 minutos, y se lavaron con 25 ml de 1xPBS. Las células se contaron y se resuspendieron a la concentración adecuada en 1XPBS.
Procedimiento de vacunación:
Los Kymice transgénicos se inmunizaron con hOX40L en forma recombinante soluble, expresado por células CHO-S, o en forma unida a membrana, expresado por células MEF transfectadas de forma estable.
Al inmunizar con células, el adyuvante se mezcló con células en una relación 1:1 v/v, y se mezcló suavemente mediante pipeteo antes de inyectarlo por vía intraperitoneal. Al inmunizar con proteína, el adyuvante se mezcló con proteína en una relación 1:1 v/v, y se agitó repetidamente. Todos los ratones fueron sangrados antes de ser cebados, y después se revacunaron cada tres semanas. Se recogieron y analizaron al menos 3 sangrados en serie, separados por al menos 2 semanas, para determinar el título de IgG específico de hOX40L usando un ensayo basado en ELISA o citometría de flujo.
Determinación de títulos séricos por FACS usando hOX40L expresado por CHO-S
Células CHO-S que expresan hOX40L o células CHO-S no transfectadas, diluidas en amortiguador FACS (PBS 1% p/v de BSA 0,1% p/v de NaN3) se distribuyeron en una placa de fondo en V de 96 pocillos (Greiner) a una densidad de 1 x 105 células por pocillo. Las células se lavaron con 150 pl de PBS, y se centrifugaron a 300 xg durante 3 min. Se aspiró el sobrenadante, y se añadieron 150 pl de PBS. Esta etapa de lavado se repitió. Se preparó una titulación de suero de ratón, diluyendo las muestras en amortiguador FACS. A continuación, se añadieron 50 pl/pocillo de esta titulación a la placa de células. Para determinar el cambio en el nivel de actividad debido a la inmunización, el suero de cada animal antes de la inmunización se diluyó hasta 1 en 100 en amortiguador FACS, y se añadieron 50 pl/pocillo a las células. Se diluyó un anticuerpo de referencia adecuado (anticuerpo anti-OX40L MAB10541, R&D Systems) o un anticuerpo de control IgG 1 de ratón (Sigma) en amortiguador FACS (entre 1-9 pg/ml), y se añadieron 50 pl a las células. Las células se incubaron a 4°C durante 30 minutos. Las células se lavaron dos veces con 150 pl de PBS, centrifugando después de cada etapa de lavado y aspirando el sobrenadante (centrifugado a 300 xg durante 3 minutos). Para detectar la unión del anticuerpo, se diluyó IgG anti-ratón de cabra APC (Jackson ImmunoResearch) 1 en 500 en amortiguador FACS, y se añadieron 50 pl a las células. Las células se incubaron 30 minutos a 4°C en la oscuridad. Las células se lavaron dos veces con 150 pl de PBS, centrifugando después de cada etapa de lavado y aspirando el sobrenadante (centrifugando a 300 xg durante 3 minutos). Para fijar las células, se añadieron 100 pl de paraformaldehído al 2% v/v, y las células se incubaron durante 30 minutos a 4°C, las células se peletizaron mediante centrifugación a 300 xg, y las placas se resuspendieron en 50 pl de amortiguador FACS. La intensidad de la señal de APC (media geométrica) se midió mediante citometría de flujo usando un instrumento BD FACS Array.
Determinación de títulos séricos por inmunoensayo DELFIA usando hOX40L recombinante
Los títulos en muestras de suero de ratón se determinaron usando un protocolo ELISA de OX40L inverso. El anticuerpo de captura de IgG anti-ratón (Southern Biotech) (4 pg/ml diluido en PBS, 50 pl/pocillo) se adsorbió en placas de 96 pocillos con baja autofluorescencia y alta unión a proteínas (Costar) durante la noche a 4°C. El exceso de IgG se eliminó lavando con PBS-Tween (0,1% v/v), y los pocillos se bloquearon con seroalbúmina bovina al 1% p/v (BSA, Sigma) en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente, después de lo cual las placas se lavaron como se describió anteriormente. Se preparó una titulación de suero de ratón, diluyendo las muestras en diluyente reactivo (0,1% p/v BSA/PBS). A continuación, se añadieron 50 pl/pocillo de esta titulación a las placas ELISA. Para determinar el cambio en el nivel de actividad debido a la inmunización, el suero de cada animal antes de la inmunización se diluyó hasta 1 en 100 en diluyente reactivo, y se añadieron 50 pl/pocillo a la placa ELISA. Como control positivo para la unión de OX40L biotinilado, se añadió a las placas un anticuerpo anti-OX40L (MAB10541, R&D Systems) diluido a 1 pg/ml a 50 pl. El control de isotipo IgG1 de ratón (Sigma) se incluyó como control negativo, y se diluyó a 1 pg/ml en diluyente reactivo, y se añadieron 50 pl/pocillo a la placa ELISA. En algunos casos, la muestra de suero de un ratón inmunizado con un antígeno no relevante se diluyó 1 en 1000, y se añadieron 50 pl/pocillo a la placa ELISA. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante al menos 1 hora. Después de la incubación, las placas se lavaron como antes, para eliminar las proteínas no unidas. A continuación, se añadió a las placas OX40L biotinilado (100 ng/ml en diluyente de reactivo; 50 pl/pocillo), y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. El OX40L biotinilado no unido se eliminó lavando con PBS-Tween (0,1% v/v), mientras que el OX40L biotinilado restante se detectó mediante el conjugado de estreptavidina-Europium3+ (detección DELFIA®, PerkinElmer) diluido en amortiguador de ensayo DELFIA® (Perkin Elmer), o estreptavidina-HRP diluida en diluyente de reactivo.
En el caso de estreptavidina-HRP, las placas se lavaron como se describe anteriormente, y se añadieron 50 pl de TMB (Sigma) a la placa. Después, la reacción se detuvo añadiendo 50 pl de ácido sulfúrico 1M (Fluka analytic). La OD a 450 nm se midió en un lector de placas Envision (PerkinElmer).
En el caso de estreptavidina-Europium3, las placas se lavaron con TBS (disolución salina amortiguada con Tris)-Tween (0,1% v/v), y se añadieron a la placa 200 pl/pocillo de disolución DELFIA Enhancement (Perkin Elmer). La fluorescencia resuelta en el tiempo se midió a 615 nm en un lector de placas Envision (PerkinElmer). Los datos de fluorescencia se representaron como recuentos de europio.
Aislamiento y preparación de tejido murino:
Se extirparon los bazos de los ratones inmunizados, y se lavaron en 1xPBS y se mantuvieron en hielo hasta su posterior procesamiento. Los tejidos se prepararon en amortiguador que contenía 1xPBS (Invitrogen) y 3% de FBS inactivado por calor (Invitrogen). Los esplenocitos se dispersaron triturando el tejido a través de un filtro de 45 pm (BD Falcon) y enjuagando con 30 ml de FBS al 3%/amortiguador PBS, antes de centrifugar a 700 g durante 10 minutos a 4°C. Para eliminar los glóbulos rojos, los esplenocitos sedimentados se resuspendieron en 4 ml de amortiguador de lisis de glóbulos rojos (Sigma). Después de 4 minutos de incubación, la reacción de lisis se detuvo mediante adición de FBS al 3%/amortiguador PBS 1x. Los grupos de células se filtraron con un filtro de 45 pm. Los esplenocitos restantes se peletizaron para procedimientos posteriores.
Fusión de hibridoma
Para el experimento KM055, los esplenocitos peletizados avanzaron directamente hasta la fusión sin ninguna selección ni estimulación con CpG durante la noche. Para el experimento KM040, las células B se sometieron a un método de selección positiva usando el sistema de separación MACS®. Las células se resuspendieron en 80 pl de FBS al 3%/amortiguador PBS por 1 x 107 células, antes de añadir las microperlas anti-IgG 1 de ratón más anti-IgG2a+b de ratón (Miltenyi Biotec), y se incubaron durante 15 minutos a 4°C. A continuación, la mezcla de células/microperlas se aplicó a una columna LS previamente humedecida colocada en un separador magnético MACS, y se lavó con FBS al 3%/amortiguador PBS. Las células positivas para IgG se recogieron en la fracción unida a la columna marcada en FBS al 3%/amortiguador PBS.
Para el experimento KM040, las células B enriquecidas se trataron con CpG durante la noche (concentración final 25 pM), y al día siguiente se lavaron una vez en amortiguador de fusión BSA (D-sorbitol 0,3 M, acetato de calcio hidratado 0,11 mM, acetato de magnesio tetrahidratado 0,5 mM y 0,1% de BSA (v/p), ajustado a pH 7,2). Para el experimento KM055, los esplenocitos peletizados de la lisis de glóbulos rojos se lavaron una vez en amortiguador de fusión BSA el mismo día que se preparó el tejido. La fusion procedió de la misma manera para ambos experimentos después de este punto. Las células lavadas se resuspendieron en 200 pl de amortiguador de fusión BSA, y se determinó el recuento de células. Las células SP2/0 se trataron de la misma manera, pero se lavaron dos veces con amortiguador de fusión BSA. Las células B se fusionaron en una relación 3:1 con células de mieloma SP2/0 mediante electrofusión usando un manipulador de células BTX ECM 2001 Electro (Harvard Apparatus). Cada fusión se dejó durante la noche en medio de recuperación (Medio de Eagle modificado de Dulbecco - rico en glucosa (sin rojo fenol, sin L-G) que contenía OPI (Sigma), L-Glutamax (Gibco), 20% FBS (Gibco, probado por lotes para hibridoma) y 2-mercaptoetanol). El último día, las células se peletizaron y se resuspendieron en 1 parte de medio de recuperación por 9 partes de medio semisólido (ClonaCell-HY Hybridoma Selection Medium D, Stemcell Technologies), y después se sembraron en placas de petri de 10 cm. Las colonias se recogieron 12 días después en placas de 96 pocillos y se cultivaron durante otros 2-3 días antes de la selección.
Ejemplo 2
Detección de sobrenadante de hibridoma
Después de la generación de clones de hibridoma, el sobrenadante de hibridoma se evaluó en un cribado secuencial primario y secundario, y se seleccionaron los clones de hibridoma apropiados en función de criterios de unión de anticuerpos a hOX40L expresado en CHO y de actividad de neutralización del receptor (véanse detalles en materiales y métodos) (Tabla 1).
Para el cribado primario, los inventores idearon los siguientes criterios de selección: se seleccionaron pocillos que contenían clones de hibridoma si los anticuerpos presentes en el sobrenadante podían unirse a hOX40L presentado de forma nativa expresado en la superficie celular. Este ensayo se preparó sembrando células CHO-S que expresaban hOX40L en la superficie celular, seguido de incubación con sobrenadante de hibridoma, seguido de un anticuerpo de detección fluorescente. Se leyó la presencia de un anticuerpo anti-OX40L en el sobrenadante usando un lector de placas capaz de leer la fluorescencia adecuada. Además, los inventores evaluaron el sobrenadante de hibridoma para la unión a OX40L humano expresado de forma recombinante usando un ensayo HTRF (fluorescencia homogénea resuelta en el tiempo). Los inventores también determinaron si el sobrenadante de hibridoma tenía la capacidad de reducir la unión de OX40L recombinante humano a OX40R Fc humano. Los clones que cumplían con ciertos criterios de selección (véase la descripción más detallada a continuación), usando datos de los tres ensayos de cribado primario mencionados anteriormente, se seleccionaron y se hicieron pasar a un cribado secundario, en el que se determinó la capacidad de cada anticuerpo para neutralizar la unión de hOX40L a sus receptores, receptor OX40 (también conocido como CD134). Los inventores decidieron evaluar esto usando un ensayo HTRF de neutralización de receptores y un ensayo de neutralización de receptores basado en citometría de flujo. Por último, los inventores decidieron analizar el sobrenadante de hibridoma mediante SPR para evaluar la afinidad aparente de los anticuerpos por OX40L humano trimérico recombinante, así como la reactividad cruzada con OX40L de mono Rhesus.
Los anticuerpos se definieron como un acierto secundario cuando los anticuerpos en el sobrenadante del hibridoma se unieron a hOX40L, con alta afinidad aparente, y reaccionaron de forma cruzada con OX40L recombinante de mono Rhesus. Además, los anticuerpos en el sobrenadante tenían que mostrar la capacidad de neutralizar la unión de OX40L a su receptor, es decir, el receptor OX40 (también conocido como CD134) en un ensayo basado en HTRF o citometría de flujo.
Materiales y métodos
Cribado primario - Unión a OX40L humano expresado en células
Los sobrenadantes recogidos de las células de hibridoma se analizaron para evaluar la capacidad de los anticuerpos segregados para unirse a hOX40L expresado en la superficie de células CHO-S. Para determinar la unión de CHO-S hOX40L, las células se sembraron en placas de 384 pocillos tratadas con cultivo de tejido de fondo transparente (Costar o BRAND) a 2 x 104 células/pocillo en medio F12 (GIBCO) suplementado con FBS al 10% v/v (GIBCO), y se cultivaron durante la noche. Se retiraron los medios de cultivo de las placas de ensayo de 384 pocillos. Se añadieron a cada pocillo al menos 40 gl de sobrenadante de hibridoma o anticuerpo de referencia anti-OX40L humano de control positivo (a una concentración final de 1 gg/ml) o anticuerpo de control de isotipo IgG1 (denominado en algunos casos como Cm7, Sigma M9269, a una concentración final de 1 gg/ml) diluidos en medio de mantenimiento de hibridomas (HMM). El medio de mantenimiento de hibridomas estaba compuesto por Advanced DMEM (Gibco) suplementado con 1 x Glutamax (Gibco), 20% v/v FBS (Gibco), 0,05 mM b-mercaptoetanol, 1x suplemento HT (Gibco) y 1x penicilina /estreptomicina (Gibco). Las placas se incubaron durante 1 hora a 4°C. Se aspiró el medio de cultivo, y se añadieron 50 gl de anti-ratón de cabra Alexa Fluor 790 (Jackson ImmunoResearch, 115-655-071) a 1000 ng/ml suplementado con DRAQ5 0,2 gM (Biostatus) diluido en amortiguador FACS (PBS+1% p/v BSA+0,1% v/v NaN3). Las placas se incubaron nuevamente durante 1 hora a 4°C. Se aspiró el sobrenadante, y se añadieron 25 gl de paraformaldehído al 4% v/v, y las placas se incubaron 15 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron dos veces con 100 gl de PBS, y después se eliminó por completo el amortiguador de lavado. La intensidad de la fluorescencia se leyó escaneando placas utilizando un sistema de imágenes infrarrojas Odyssey (LI-COR®). La unión anti-ratón (canal de 800 nm) se normalizó al número de células (canal de 700 nm) según el algoritmo recomendado LI-COR®. El porcentaje de efecto se calculó como se detalla a continuación (Ecuación 1). La unión total se definió usando el anticuerpo de referencia a una concentración de ensayo final de 1 gg/ml. La unión no específica se definió usando el control de isotipo IgG 1 de ratón (Sigma) a una concentración de ensayo final de 1 gg/ml. Los pocillos se definieron como aciertos cuando el porcentaje de efecto fue mayor o igual a 5%.
Ecuación 1: Cálculo del porcentaje de efecto del cribado primario (LI-COR) y HTRF
(Usando valores de Resp del 800% (LI-COR) o relación 665/620nm (véase la Ecuación 2) (HTRF)
pocilio de muestra - unión no especifica
Porcentaje de efecto = ----- u-n-i -ó -n -- t-o -- ta-l ;-- ---- u-n-i — ó-n -- n -- o -- e-s-p -- e-c-i — fi-c-a -----
Unión no específica = valores de pocillos que contienen IgG1 de ratón de control de isotipo o HMM o amortiguador
Unión total (Unión HTRF y LICOR) = valores de pocillos que contienen anticuerpo de referencia Unión total (ensayo OX40L/OX40RFc) = OX40L y OX40RFc
Cribado primario: Unión a OX40L humano recombinante:
Paralelamente al cribado para la unión a OX40L expresado en CHO-S, también se analizaron los sobrenadantes recogidos de pocillos de hibridoma para evaluar la capacidad de los anticuerpos segregados para unirse a hOX40L expresado como una proteína recombinante (producida en nuestro laboratorio; véanse los detalles en el Ejemplo 1). La unión de anticuerpos segregados a hOX40L recombinante se identificó mediante formato de ensayo HTRF® (Homogeneous Time-Resolved Fluorescence, Cisbio) usando hOX40L biotinilado. Se transfirieron 5 pl de sobrenadante de hibridoma a una placa de poliestireno de superficie sin unión, de bajo volumen, de 384 pocillos, blanca (Greiner). Después, se añadieron 5 pl de hOX40L biotinilado (concentración de trabajo 20 nM) diluido en amortiguador h Tr F (PBS (Sigma) KF 0,53 M (Sigma) BSA al 0,1% p/v (Sigma). Se añadieron 5 pl de reactivos de detección combinados Streptavidin D2 (Cisbio) diluido 1:100 en amortiguador de ensayo HTRF para dilución final 1:400 e IgG anti-ratón de cabra (Southern Biotech) marcada con criptato de europio (Cisbio) diluido 1:100 en amortiguador de ensayo HTRF para dilución final 1:400. La concentración de IgG anti-ratón de cabra (Southern Biotech) marcada con criptato de europio dependía del lote, y en algunos casos se realizó una dilución de 1:1000 para lograr una concentración de ensayo final de 1:4000. Para ajustar el volumen total del ensayo a 20 pl, se añadieron 5 pl de amortiguador de ensayo HTRF a todos los pocillos. Para definir la unión no específica, la adición de anticuerpo de control positivo o medio de hibridoma se reemplazó por amortiguador de ensayo HTRF o HMM. La placa se dejó incubar en la oscuridad durante 3 horas antes de leer la fluorescencia resuelta en tiempo a longitudes de onda de emisión de 620 nm y 665 nm usando un lector de placas EnVision (Perkin Elmer). Más detalles de la tecnología de ensayo HTRF® se puede encontrar en Mathis (1995) Clinical Chemistry 41(9), 1391-1397. Los datos se analizaron calculando la relación 665/620 y el porcentaje de efecto para cada muestra de acuerdo con la Ecuación 2 y la Ecuación 1 respectivamente.
Ecuación 2: Cálculo de la relación 665/620
relación 665/620 = (valor de 665/620 de la muestra) x 10000
Para los clones derivados de KM040-1 y KM055-1, los inventores aplicaron un criterio de selección de un efecto mayor o igual al 20 por ciento para definir un pocillo como un acierto de la unión de hOX40L recombinante como se describe en la Tabla 1.
Cribado primario: ensayo de unión de OX40L humano/OX40R Fc humano:
Para determinar si los sobrenadantes recogidos de los pocillos de hibridoma inhibían la unión de OX40L a OX40RFc, se analizaron los anticuerpos segregados en un ensayo HTRF de unión de OX40L/OX40RFc. Se transfirieron 5 pl de sobrenadante de hibridoma a una placa de poliestireno de superficie sin unión, blanca, de 384 pocillos, de bajo volumen (Greiner). El OX40L biotinilado se diluyó en amortiguador de ensayo HTRF a una concentración de trabajo de 2,4 nM, y se añadieron 5 pl. A continuación, se diluyó OX40RFc a una concentración de trabajo de 4,8 nM, y se añadieron 5 pl. La unión no específica se definió reemplazando OX40RFc por amortiguador de ensayo o HMM. El criptato de estreptavidina (CISBIO) y anti-Fc humano D2 (CISBIO) se diluyeron en amortiguador de ensayo HTRF a una concentración de trabajo de 1:100 y 5 nM respectivamente. Las placas se cubrieron, se protegieron de la luz, y se incubaron a temperatura ambiente durante 3 horas antes de leer la fluorescencia resuleta en el tiempo a longitudes de onda de emisión de 620 nm y 665 nm usando un lector de placas EnVision (Perkin Elmer). Los datos se analizaron calculando la relación 665/620 y el porcentaje de efecto para cada muestra de acuerdo con la Ecuación 2 y la Ecuación 5 respectivamente.
Para los clones derivados de KM040-1 y KM055-1, los inventores aplicaron un criterio de selección menor o igual al 90 por ciento de la señal de ensayo de la unión Fc del receptor OX40 a OX40L, para definir un pocillo como un acierto como se describe en la Tabla 1.
Cribado secundario: Unión a OX40L humano recombinante y expresado en células
Para determinar si los pocillos seleccionados usando los criterios de selección de cribado primario tenían las características requeridas establecidas por los inventores, se realizó una serie de ensayos. Los clones de hibridoma seleccionados como aciertos del cribado primario se cultivaron durante 3 días, y los sobrenadantes recogidos de las células de hibridoma se analizaron para evaluar si los anticuerpos segregados que se unen a hOX40L expresado por CHO-S, en algunos casos se unen a células CHO-S no transfectadas, y si neutralizan la unión de OX40R Fc recombinante a CHO-S hOX40L, y la capacidad de neutralizar la unión de OX40R a hOX40L biotinilado recombinante.
Unión a hOX40L expresado por CHO-S y neutralización del receptor:
Células CHO-S que expresan hOX40L o células CHO-S no transfectadas, diluidas en amortiguador FACS (PBS 1% p/v de BSA 0,1% p/v de NaN3) se distribuyeron en una placa de fondo en V de 96 pocillos (Greiner) a una densidad de 1 x 105 células por pocillo. Las células se lavaron con 150 pl de PBS y se centrifugaron a 300 xg durante 3 min. Se aspiró el sobrenadante, y se añadieron 150 pl de PBS. Esta etapa de lavado se repitió.
Se añadieron 25 pl de sobrenadante de hibridoma o anticuerpo purificado del sobrenadante de hibridoma diluido en amortiguador FACS a las células lavadas, y se incubaron durante 10-15 minutos. El anticuerpo de referencia o el anticuerpo de control IgG 1 de ratón (Sigma) se diluyeron en amortiguador FACS a 20 pg/ml, y se añadieron 25 pl a las células. A continuación, se añadieron a los pocillos 25 pl de OX40R Fc humano (de nuestro laboratorio) diluido a 1000 ng/ml en amortiguador FACS. Las células se incubaron a 4°C durante 30 minutos.
Las células se lavaron dos veces con 150 pl de PBS, centrifugando después de cada etapa de lavado y aspirando el sobrenadante (centrifugando a 300 xg durante 3 minutos).
Para detectar la unión del anticuerpo y el receptor, se añadieron a las células 50 pl de anti-IgG-PE humano de cabra (Jackson ImmunoResearch) y APC anti-ratón IgG (Jackson ImmunoResearch) diluidos 1 en 500 en amortiguador FACS. Las células se incubaron 30 minutos a 4°C en la oscuridad.
Las células se lavaron dos veces con 150 pl de PBS, centrifugando después de cada etapa de lavado y aspirando el sobrenadante (centrifugando a 300 xg durante 3 minutos).
Para fijar las células, se añadieron 100 pl de paraformaldehído al 2% v/v, y las células se incubaron durante 30 minutos a 4°C, las células se peletizaron mediante centrifugación a 300 xg, y las placas se resuspendieron en 50 pl de amortiguador FACS. La intensidad de la señal de PE y APC (media geométrica) se midió mediante citometría de flujo usando un instrumento BD FACS Array.
El % de unión de control se calculó usando la fluorescencia geomedia como se describe en la ecuación 1, en la que la unión total se definió como anticuerpo de referencia a 10 pg/ml, y la unión no específica como anticuerpo IgG 1 de ratón a 10 pg/ml. El % de unión del receptor se calculó usando la Ecuación 3.
Ecuación 3: Porcentaje de unión del receptor (FACS)
Basado en la fluorescencia geomedia
valor de muestra - unión no específica
% de unión del receptor = ----u--ni -ó -n-- t-o--ta-l ;-- ---- u-n-i — ó-n -- n -- o -- e-s-p -- e-c-í 7 f 7 i . -c-a----x100
Unión no específica = Sin anticuerpo, sin receptor
Unión total = unión solo del receptor (OX40R) (sin inhibidor) control de isotipo a 10 pg/ml
Cribado secundario - neutralización de ligando/receptor de HTRF
Para determinar si los anticuerpos identificados a partir del cribado primario neutralizan la unión de OX40L a OX40RFc, se realizó un ensayo de unión de OX40L humano/OX40R Fc humano como se describe para el cribado primario. Las placas se dejaron incubar en la oscuridad durante 3 horas antes de leer la fluorescencia resulta en el tiempo a longitudes de onda de emisión de 620 nm y 665 nm usando un lector de placas EnVision (Perkin Elmer). Más detalles de la tecnología de ensayo HTRF® se puede encontrar en Mathis (1995) Clinical Chemistry 41(9), 1391-1397. Los datos se analizaron calculando delta F como se describe en la Ecuación 4, y el porcentaje de receptor para cada muestra según la Ecuación 5.
Ecuación 4: Cálculo de % DeltaF
% delta p (v^alor de relación 665 */620 nm de muestra) / -( \valor de relación 665 //620 nm de control no esp recí yfico) ^ 1 0 0
(relación de 665/620 nm de control no especifico)
Ecuación 5: Porcentaje de unión del receptor (HTRF)
Basado en el cálculo de % deltaF (Ecuación 4) o relación 665/620 (Ecuación 2)
valor de muestra - unión no específica
% de unión del receptor =
unión total - unión no específica x100
Unión no específica = HMM o amortiguador OX40L (sin receptor)
Unión total = receptor (OX40R) y OX40L (sin inhibidor)
Selección de criterios de acierto del cribado secundario:
Se seleccionó un panel de aciertos en base a ensayos de unión y neutralización. Los aciertos en el ensayo de unión de CHO-S OX40L fueron definidos por los inventores como unión significativa a células CHO-S OX40L y ninguna unión a células CHO-S por FACS. Los aciertos se definieron además por tener la capacidad de reducir significativamente la unión de OX40RFc a OX40L recombinante (HTRF) y reducir significativamente la unión de OX40RFc a hOX40L expresado en células CHO. Los datos se resumen en la Tabla 1. También se consideraron las medidas de afinidad aparente por SPR.
Ejemplo 3
Caracterización principal de anticuerpo
En base al cribado, los pocillos seleccionados se expandieron, y los anticuerpos quiméricos murinos/humanos se purificaron usando una purificación por cromatografía de afinidad basada en proteína G estándar (véase el método a continuación). Los anticuerpos se sometieron a diversos ensayos para evaluar su capacidad para bloquear la unión de hOX40L a su receptor OX40R, así como la capacidad de cada anticuerpo para unirse a OX40L humano y de mono Rhesus con una alta afinidad aparente. Para descifrar qué anticuerpos eran los mejores, los clones seleccionados se analizaron mediante el ensayo HTRF de OX40L/OX40RFc y la liberación de IL2 inducida por OX40L a partir de células T humanas primarias.
Tabla 1: Resumen principal de mAb
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Materiales y métodos:
Purificación de anticuerpos del sobrenadante de hibridoma:
Los anticuerpos se purificaron usando cromatografía de afinidad con Proteína G. Los anticuerpos se eluyeron del medio Proteína G usando el reactivo IgG Elute (Pierce), y los anticuerpos eluidos se cambiaron de amortiguador a PBS antes del uso. La pureza del anticuerpo se evaluó mediante análisis SDS-PAGE y se cuantificó mediante lectura de espectrofotómetro a DO280 nm.
La unión de anticuerpos purificados del sobrenadante de hibridoma se llevó a cabo como se describe aquí.
Neutralización de ligando/receptor HTRF:
Los siguientes métodos se llevaron a cabo con una titulación del inhibidor para establecer la potencia del clon medida por valores de IC50 en el ensayo. El anticuerpo purificado a partir de hibridoma se tituló diluyéndolo en amortiguador de ensayo HTRF, y 5 pl de esta titulación se transfirieron a una placa de poliestireno de superficie sin unión, de bajo volumen, de 384 pocillos, blanca (Greiner). El OX40L biotinilado se diluyó en amortiguador de ensayo HTRF a una concentración de trabajo de 2,4 nM, y se añadieron 5 gl. A continuación, se diluyó OX40RFc a una concentración de trabajo de 4,8 nM, y se añadieron 5 gl. La unión no específica se definió reemplazando OX40RFc por amortiguador de ensayo o HMM. El criptato de estreptavidina (CISBIO) y el anti-Fc humano D2 (CISBIO) se diluyeron en amortiguador de ensayo HTRF a una concentración de trabajo de 1:100 y 5 nM respectivamente. Las placas se cubrieron, se protegieron de la luz, y se incubaron a temperatura ambiente durante 3 horas antes de leer la fluorescencia resulta en el tiempo a longitudes de onda de emisión de 620 nm y 665 nm usando un lector de placas EnVision (Perkin Elmer). Los datos se analizaron calculando delta F como se describe en la Ecuación 4, y el porcentaje de receptor para cada muestra según la Ecuación 5 o, en algunos casos, la Ecuación 6. Los valores de IC50 se determinaron usando el software GraphPad Prism, ajustando la curva usando una ecuación logística de cuatro parámetros (Ecuación 7).
Ecuación 6: Porcentaje de unión del receptor (HTRF)
Basado en el cálculo de % DeltaF (Ecuación 8)
valor de muestra
% de unión del receptor = ----u--n-i — ó-n-- t-o--ta ;—l x100
Unión total = receptor (OX40R) y OX40L (sin inhibidor)
Ecuación 7: Cálculo logístico de cuatro parámetros
Y = Inferior (Superior-Inferior)/(1+10A((LogIC50-X)*pendiente de Hill))
X = logaritmo de la concentración.
Y = unión específica (ecuación 6)
Superior e Inferior = Mesetas en las mismas unidades que Y (unión específica)
Log ICso en las mismas unidades que X. Y comienza en la parte inferior y va hasta la parte superior con una forma sigmoidea. La unión específica disminuye a medida que aumenta X.
Perfilado de anticuerpos anti-OX40L recombinantes completamente humanos en el ensayo de neutralización de ligando/receptor de HTRF
Para determinar si la IgG purificada, completamente humana, expresada de forma recombinante, inhibe la unión de OX40L humano a OX40RFc, se llevó a cabo el siguiente método. Se probaron IgG completamente humana purificada u otro inhibidor para establecer la potencia del clon medida por valores de IC50 en el ensayo. Los anticuerpos expresados de forma recombinante y purificados se titularon diluyéndolos en amortiguador de ensayo HTRF, y se transfirieron 5 gl de esta titulación a una placa de poliestireno de superficie sin unión, de bajo volumen, de 384 pocillos, blanca (Greiner). El OX40L biotinilado se diluyó en amortiguador de ensayo HTRF a una concentración de trabajo de 2,4 nM, y se añadieron 5 gl. A continuación, se diluyó OX40RFc marcado directamente con AF647 a una concentración de trabajo de 10 nM, y se añadieron 5 gl. La unión no específica se definió reemplazando OX40RFc-AF647 por amortiguador de ensayo o HMM. El criptato de estreptavidina (CISBIO) se diluyó en amortiguador de ensayo HTRF a una concentración de trabajo de 1:100, y se añadieron 5 gl a todos los pocillos de la placa. Las placas se cubrieron, se protegieron de la luz, y se incubaron a temperatura ambiente durante 3 horas antes de leer la fluorescencia resuelta en el tiempo a longitudes de onda de emisión de 620 nm y 665 nm usando un lector de placas EnVision (Perkin Elmer). Los datos se analizaron calculando delta F como se describe en la Ecuación 4, y el porcentaje de receptor para cada muestra según la Ecuación 5 o, en algunos casos, la Ecuación 6. Los valores de IC50 se determinaron usando el software GraphPad Prism, ajustando la curva usando una ecuación logística de cuatro parámetros (Ecuación 7) (Figura 1).
Determinación del efecto de los anticuerpos anti-OX40L sobre la liberación de IL2 inducida por OX40L recombinante a partir de células T primarias aisladas
Se diluyó OX40L humano recombinante (de nuestro laboratorio) en medios de cultivo a una concentración de 400 ng/ml, y se añadieron 50 gl a una placa de 96 pocillos tratada con cultivo de tejido (Costar). Los anticuerpos anti-OX40L o el control de isotipo de especie apropiado (Sigma o de nuestro laboratorio) se titularon en medios de cultivo en una placa de 96 pocillos (greiner), y entonces se transfirieron 50 gl de la titulación a la placa de 96 pocillos que contenía 50 gl de OX40L. La titulación de anticuerpos se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente con el OX40L recombinante antes de añadir células T CD3 positivas.
Las PBMC se aislaron de las cámaras del sistema de leucorreducción (NHSBT) usando Ficoll-Paque plus (GE Healthcare) mediante centrifugación en gradiente de densidad. Las células CD3 positivas (células T) se aislaron de PBMC humanas mediante selección negativa usando microperlas magnéticas (Miltenyi Biotech) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Las células aisladas se centrifugaron a 300 xg/5 min, se resuspendieron en medios de cultivo (los medios de cultivo se definieron como RPMI (Gibco) FBS al 10% v/v o RPMI suero AB humano al 5% v/v), y se añadieron 50 gl de la suspensión celular a la placa de 96 pocilios que contenía el OX40L recombinante y la titulación de anticuerpos para lograr una concentración final de 2x105 células/pocillo.
Después, se añadieron 50 gl de PHA a 8 gg/ml a todos los pocillos para lograr una concentración de ensayo final de 2 gg/ml. Las células se incubaron a 372C durante 3 días antes de recolectar el sobrenadante y analizar la concentración de IL-2. La liberación máxima de IL-2 se definió mediante estimulación con OX40L en ausencia de inhibidor. La liberación mínima de IL-2 se definió únicamente por los medios de cultivo (sin OX40L).
Los niveles de IL-2 en los sobrenadantes se determinaron usando el kit ELISA de IL-2 humana Duoset (R & D) Systems) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El anticuerpo de captura de IL-2 (4 gg/ml diluido en PBS, 50 gl/pocillo) se adsorbió en placas de 96 pocillos con baja autofluorescencia y alta unión a proteínas (Costar) durante la noche a 4°C. El exceso de IgG se eliminó lavando con PBS-Tween, y los pocillos se bloquearon con seralbúmina bovina (BSA) al 1% en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente, después de lo cual las placas se lavaron como se describió anteriormente. A continuación, se añadieron 50 gl/pocillo de medio de cultivo acondicionado. Los estándares de IL-2 (de 2000 pg/ml, dilución 1:2) también se añadieron a las placas ELISA como control de ELISA, y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante al menos 1 hora.
Después de la incubación, las placas se lavaron como antes para eliminar las proteínas no unidas. A continuación, se añadió a las placas Ab de detección de IL-2 biotinilado (200 ng/ml en diluyente de reactivo (BSA al 0,1%/PBS); 50 gl/pocillo), y se incubó a RT durante 1 hora. El anticuerpo de detección no unido se eliminó lavando con PBS-Tween (0,1% v/v), mientras que el anticuerpo biotinilado restante se detectó mediante el conjugado de estreptavidina-Europium3+ (DELFIA® detección, PerkinElmer). La fluorescencia resuelta en el tiempo se midió a 615 nm en un lector de placas Envision (PerkinElmer). Los datos de fluorescencia se representaron gráficamente como recuentos de europio o como concentración de liberación de IL-2 calculada a partir de la curva estándar mediante regresión lineal según las recomendaciones del fabricante. Los valores de IC50 se determinaron usando el software GraphPad Prism, ajustando la curva usando una ecuación logística de cuatro parámetros (Ecuación 7).
Análisis de resonancia de plasmones superficiales:
El análisis de SPR se llevó a cabo utilizando el sistema de matriz ProteOn™ XPR36 (BioRad). Se inmovilizó IgG anti­ ratón (GE Healthcare BR-1008-38) en una superficie de biosensor GLM usando acoplamiento de amina, después se bloqueó la superficie usando etanolamina 1 M. Los anticuerpos de ensayo se capturaron en esta superficie, y se usó hOX40L recombinante (humana y rhesus) en una concentración única de 256 nM, los sensogramas de unión se referenciaron dos veces usando una inyección de amortiguador (es decir, 0 nM) para eliminar la desviación de línea base y los artefactos de inyección. Las afinidades aparentes para la interacción OX40L-anticuerpo se determinaron usando el modelo 1:1 inherente al software de análisis ProteOn XPR36. El ensayo se realizó usando HBS-EP (Teknova) como amortiguador de ejecución, y se llevó a cabo a 25°C.
Ejemplo 4
Recuperación de secuencias de candidatos de anticuerpos principales
Después de la selección y caracterización de los candidatos principales, sus dominios variables totalmente humanos se recuperaron mediante RT-PCR usando una mezcla de cebadores directos e inversos. Los anticuerpos se reformatearon en un esqueleto de IgG4 humano (IgG4-PE), y se expresaron mediante un sistema de expresión transitoria en células CHO-S. Se muestra un resumen de todas las secuencias en el Listado de secuencias.
Aislamiento de ARN de células de hibridoma:
El ARN total se extrajo de las células de hibridoma usando reactivo TRIzol™ (Invitrogen). La cantidad y calidad del ARN aislado se analizó espectrofotométricamente.
Recuperación del dominio variable del anticuerpo por RT-PCR:
Los clones seleccionados se usaron para preparar el ARN total, que se usó en una reacción de RT-PCR para recuperar las regiones V de la cadena pesada. Se usaron cebadores inversos específicos de IgG y conjuntos de cebadores directos específicos de la secuencia líder de Ig, o, alternativamente, cebadores inversos específicos de IgG y conjuntos de cebadores directos específicos de secuencia de la región no traducida (UTR) 5’ de Ig para las cadenas pesadas. Se usaron cebadores inversos específicos de la región constante kappa y conjuntos de cebadores directos específicos de la secuencia líder kappa, o alternativamente, cebadores inversos específicos de la región constante kappa y conjuntos de cebadores directos específicos de la secuencia 5’UTR kappa para las cadenas kappa de OX40L. Los productos de RT-PCR se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa, y el ADN del tamaño predicho se secuenció en las direcciones directa e inversa. Como alternativa, los productos de la RT-PCR se subclonaron en un vector de clonación, y el ADN de las colonias individuales se envió para la secuenciación.
Clonación de anticuerpos recombinantes
El ADN que codifica la región variable de cadena pesada de mAb 10A7 se clonó en un plásmido de expresión pREP4 (Invitrogen) en marco con la región constante de IgG1 humana, y el ADN que codifica la región variable de cadena ligera de mAb 10A7 se clonó en un plásmido de expresión pREP4 en marco con la región constante kappa humana usando digestión y ligación con enzimas de restricción estándar.
Las secuencias codificantes de la región variable de la cadena pesada de mAb 10A7 y 2D10 en marco con la región constante de IgG4-PE humana se optimizaron para los codones para la expresión en mamíferos, y se clonaron en un plásmido de expresión pXC-18.4 (Lonza), y las secuencias codificantes de la cadena ligera de mAb 10A7 y 2D10 en marco con la región constante de kappa humana se optimizaron para los codones para la expresión en mamíferos y se clonaron en un plásmido de expresión pXC-17.4 (Lonza) usando ligación y digestión con enzimas de restricción estándar. Para la expresión simultánea de las cadenas pesada y ligera, los vectores pXC-17.4 y pXC-18.4 se fusionaron en un solo vector usando digestión y ligación con enzimas de restricción estándar.
Todos los constructos se secuenciaron para asegurar su composición de secuencia correcta.
Expresión transitoria de anticuerpos anti-OX40L
Los anticuerpos se expresaron transitoriamente para producir proteína recombinante usando línea celular adaptada a suspensión CHO-S Freestyle™ de Invitrogen. Los plásmidos se transfectaron en las células usando PEI (polietilenimina MW 40000), y se dejaron crecer durante un período de 13 días antes de recolectar el sobrenadante para la purificación. Las células se alimentaron durante el proceso de sobrecrecimiento con ActiCHO™ Feeds A y B de GE Healthcare, para ayudar a aumentar la productividad y promover la longevidad de las células. Durante el proceso de sobrecrecimiento, se tomaron muestras regularmente para monitorizar el crecimiento y la viabilidad de las células.
Generación de Conjuntos Estables de Lonza
Para producir las cantidades en gramos necesarias para los estudios de toxicología, los anticuerpos anti-OX40L 10A7 y 2D10 se transfirieron al sistema Lonza GS Xceed para una expresión estable. La HC y la LC para cada anticuerpo se oprtimizaron primero para codones para la expresión en células CHO por Genewiz. El casete de HC (que contiene la región constante optimizada de IgG4PE) se clonó después en el vector pXC18.4 de Lonza, y el casete de LC (que contiene la región constante kappa optimizada) se clonó en el vector pXC17.4 de Lonza usando digestión y ligación con enzimas de restricción estándar. A continuación, se creó un vector de gen doble (DGV) que codificaba las secuencias HC y LC mediante digestión y ligación con enzimas de restricción, y se confirmó la secuencia antes de la expresión.
Antes de la creación del grupo estable; los vectores de un solo gen que codifican HC y LC por separado, así como el DGV que contiene ambos, se expresaron en la línea celular Lonza CHOK1SVKO transitoriamente usando PEI (polietilenimina PM 40000). Se dejó que las células crecieran demasiado durante un período de 13 días antes de recolectar el sobrenadante para la purificación. Durante este período, las células se alimentaron con ActiCHO™ Feeds A y B de GE Healthcare para ayudar a aumentar la productividad y promover la longevidad de las células. Durante el proceso de sobrecrecimiento, se tomaron muestras regularmente para monitorizar el crecimiento y la viabilidad de las células. Una vez que se confirmó la expresión transitoria y se analizó el material purificado, los anticuerpos se expresaron como grupos estables.
Los grupos estables se generaron utilizando los métodos y medios patentados de Lonza. Se crearon 4 grupos por anticuerpo, y se dejaron recuperar durante un período de 10 a 15 días. Después de que las células se recuperaron, los lotes de células previas a la siembra (PSS) se congelaron para su posterior recuperación y creación de MCB. A continuación, se establecieron sobrecrecimientos por lotes alimentados con matraces agitados a pequeña escala (50 ml) usando los medios patentados de Lonza. Se dejó que las células crecieran demasiado durante un período de 14 días. Durante este período, se monitorizó el crecimiento, la viabilidad y los niveles de glucosa de las células. Las células se suplementaron en consecuencia con el alimento patentado de Lonza y 400 g/l de glucosa. También se tomaron muestras durante todo el proceso para la cuantificación de muestras brutas. Al final del proceso de sobrecrecimiento, se recogió el sobrenadante para su purificación.
Los grupos estables se generaron usando los métodos y medios patentados de Lonza. Se crearon 4 grupos por anticuerpo y se dejaron recuperar durante un período de 10 a 15 días. Después de que las células se recuperaron, los lotes de células previas a la siembra (PSS) se congelaron para su posterior recuperación y creación de MCB. A continuación, se establecieron sobrecrecimientos por lotes alimentados con matraces agitados a pequeña escala (50 ml) usando los medios patentados de Lonza. Se dejó que las células crecieran demasiado durante un período de 14 días. Durante este período, se monnitorizó el crecimiento, la viabilidad y los niveles de glucosa de las células. Las células se suplementaron en consecuencia con el alimento patentado de Lonza y 400 g/l de glucosa. También se tomaron muestras durante todo el proceso para la cuantificación de muestras crudas. Al final del proceso de sobrecrecimiento, se recogió el sobrenadante para su purificación.
Mientras que 2D10 y 10A07 tenían una secuencia similar, los perfiles de expresión en los conjuntos estables de Lonza eran diferentes, 10A07 se expresaba en títulos muy bajos, mientras que 2D10 se expresaba en títulos mucho mayores (véase la Tabla 2) en condiciones óptimas cuando se usaban matraces de agitación en 4 conjuntos estables generados separados.
Tabla 2 (Concentración en mg/l)
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Después de la expresión, el anticuerpo que se usará en el modelo de EICH de macaco Rhesus se purificó mediante un procedimiento de purificación de dos etapas. Los anticuerpos se purificaron primero mediante cromatografía de afinidad MabSelect SuRe (GE Healthcare). Los anticuerpos se eluyeron del medio MabSelect SuRe usando el reactivo IgG Elute (Pierce), y los anticuerpos eluidos se dializaron en amortiguador de acetato de sodio (pH 5,5) antes de la segunda etapa de purificación. A continuación, los anticuerpos se purificaron mediante intercambio catiónico, y se eluyeron con cloruro de sodio en amortiguador de acetato de sodio. Los anticuerpos eluidos se dializaron en PBS. Los anticuerpos se cuantificaron mediante lectura de espectrofotómetro a OD280nm, y se ajustaron a la concentración deseada (10 mg/ml). La pureza del anticuerpo se evaluó mediante análisis SDS-PAGE y cromatografía de exclusión por tamaños. La concentración de endotoxina se midió con cartuchos de ensayo Endosafe PTS y LAL (Charles River Laboratories).
Ejemplo 5
Determinación del efecto de los anticuerpos anti-OX40L en la reacción de linfocitos mixtos de PBMC alogénicas
Las PBMC se aíslan de las cámaras del sistema de leucorreducción (NHSBT) mediante centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Paque plus (GE Healthcare). Las PBMC se preincuban con mitomicina C (Sigma) a 10 pg/ml en PBS durante una hora a 37°C. A continuación, las células se lavan 3 veces en PBS centrifugando a 300 xg durante 3 minutos, aspirando el sobrenadante después de cada lavado. Se añaden PBMC alogénicas (no tratadas con mitomicina C) a una placa de 96 pocillos en RPMI suplementado con FBS al 10% v/v a una concentración de 2x106/ml, 50 pl/pocillo. Los anticuerpos anti-OX40L se diluyen en medios de cultivo, y se añaden a una placa de 96 pocillos que contiene PBMC (no tratadas con mitomicina C), a 50 pl/pocillo. Después, las PBMC tratadas con mitomicina C se añaden a las PBMC alogénicas (no tratadas con mitomicina C) en una placa de 96 pocillos en una relación de células final en el intervalo de 1:1 a 4:1 con tratamiento con mitomicina C a tratamiento sin mitomicina C según el número de células/pocillo. Las células se incuban durante cinco días a 37°C/5% CO2. Después de cinco días, se miden TNF-a, IFN-g e IL-2 mediante duoset ELISA (R&D Systems) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La proliferación se mide por dilución CFSE de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
Las PBMC se aislaron de las cámaras del sistema de leucorreducción (NHSBT) mediante centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Paque plus (GE Healthcare). Las PBMC se preincubaron con mitomicina C (Sigma) a 10 pg/ml en PBS durante una hora a 37°C. A continuación, las células se lavaron 3 veces en PBS, centrifugando a 300 xg durante 3 minutos, aspirando el sobrenadante después de cada lavado. Los linfocitos T (células T), en algunos casos CD3 positivos y en otros casos CD4 y CD8 positivos, se aislaron de PBMC alogénicas mediante selección negativa usando microperlas magnéticas (Miltenyi Biotech) según las recomendaciones del fabricante. En algunos casos, se usaron PBMC no tratadas con mitomicina C, en lugar de células T. Las células aisladas se centrifugaron a 300 xg/5 min, se resuspendieron en medios de cultivo (los medios de cultivo se definieron como RPMI (Gibco) FBS al 10% v/v o RPMI suero AB humano al 5% v/v), y se añadieron 50 pl de la suspensión celular a la placa de 96 pocillos que contenía el OX40L recombinante y la titulación de anticuerpos para lograr una concentración final de 2x105 células/pocillo. Los anticuerpos anti-OX40L se diluyeron en medios de cultivo hasta una concentración de ensayo final de 100 nM, o, en algunos casos, se utilizó una titulación de anticuerpos. Los anticuerpos se añadieron a una placa de 96 pocillos que contenía células T o PBMC no tratadas con mitomicina C, a 50 pl/pocillo. A continuación, se añadieron PBMC tratadas con mitomicina C a células T o PBMC no tratadas con mitomicina C en una placa de 96 pocillos en una relación celular final en el intervalo de 1:1 a 4:1 de PBMC tratadas con mitomicina C a células T (o PBMC) en función del número de células/pocillo. Las células se incubaron durante cinco días a 37°C/5% CO2. Después de cinco días, se midió IFN-g mediante duoset ELISA (R&D Systems) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
Los anticuerpos anti-OX40L se definieron como inhibidores en MLR de PBMC/células T alogénicas, o en MLR de PBMC/PBMCI, cuando se produjo >20% de inhibición (véase la Ecuación 8) del factor de liberación (IFN-g), o se observaron con respecto a los pocillos de control en ausencia de anticuerpo. De cuatro experimentos realizados, un experimento fue un fracaso técnico, definido como ninguna respuesta de MLR (liberación de IFN-g) detectada entre donantes alogénicos. De los tres experimentos restantes, los tres mostraron inhibición (>20% de inhibición de la liberación del factor (IFN-g) observada con respecto a los pocillos de control en ausencia de anticuerpos) con 2D10, 10A07 y el control positivo 1; sin embargo, en uno de los tres experimentos, también se observó una inhibición significativa con el anticuerpo de control de isotipo (Figura 2). Para la MLR de PBMC/PBMC, se realizaron tres experimentos. De tres experimentos, dos se consideraron un fracaso técnico, ya que no hubo, o hubo una liberación baja, de IFN-g. Sin embargo, en otro experimento, 10A07 inhibió la liberación de IFN-g en comparación con el control de isotipo.
Ecuación 8: Porcentaje de inhibición (MLR)
Basado en valores de liberación de IFN-g o IL2 (pg/ml) determinados como se describe
valor de muestra - sin estímulo
% de inhibición = ------— Si — n — IgG -- -- s :-i-n-- e--st ;— ímu :-l-o------ x100
Sin estímulo = pocillos en los que solo se añaden células T o PBMC no tratadas con mitomicina C (PBMC no tratadas con mitomicina C)
Sin IgG = pocillos en los que se añaden células T o, en algunos casos, PBMC no tratadas con mitomicina C junto con PBMC tratadas con mitomicina C, pero sin IgG
Ejemplo 6
Determinación del efecto de los anticuerpos anti-OX40L en linfocitos T humanos primarios cebados con CD3 Para determinar si el anti-OX40L tenía la capacidad de inducir respuestas de células T en ausencia de OX40L, se realizó el siguiente ensayo usando el método adaptado de Wang et al., Hybridoma (Larchmt)., agosto de 2009; 28(4):269-76, en el que se describió un anticuerpo anti-OX40L agonista.
Un anticuerpo anti-CD3 humano de ratón (Becton Dickinson) se diluyó hasta 0,5 pg/ml en PBS estéril, y se añadieron 50 pl/pocillo a una placa estéril de alta unión, de 96 pocillos, y se incubó durante la noche a 4°C.
Después de la incubación durante la noche, la placa se lavó tres veces con 100 pl de PBS estéril.
Las células T (CD3 positivas) se aislaron de PBMC derivadas de cámaras del sistema de leucorreducción (NHSBT) como se describe en el Ejemplo 3. Después del aislamiento, las células se añadieron a pocillos en 100 pl para lograr una concentración final de 1 x103 células/pocillo.
Los anticuerpos de ensayo se diluyeron en RPMI+ FBS al 10%, y se añadieron 50 pl o 100 pl/pocillo a la placa celular para lograr una concentración de ensayo final de 10 pg/ml. En algunos casos, también se añadió a los pocillos un anticuerpo anti-CD28 humano de ratón (Becton Dickinson) a una concentración final de 1 pg/ml.
El ensayo se incubó durante 5 días. Después de 5 días, se determinaron los sobrenadantes de cosecha y los niveles de IFN-g en el sobrenadante como se describe en el Ejemplo 5.
El ensayo se realizó en cuatro donantes independientes, y no se observó ningún efecto de añadir 10A07 o 2D10 en formato IgG4PE (liberación de IFN-g) con respecto al observado con el control de isotipo IgG4PE humano.
Ejemplo 7
Modelo de enfermedad de injerto contra hospedante (EICH) de macaco Rhesus
La eficacia del anticuerpo 2D10 IgG4PE como monoterapia profiláctica para la prevención de la EICH se examinó en un modelo de macaco Rhesus de trasplante de células madre hematopoyéticas haploidénticas (HSCT). Se había descrito previamente que los monos sometidos a HSCT en este modelo tenían un tiempo de supervivencia de 6-8 días (Miller, Weston P., et al. “EICH after haploidentical transplantation: a novel, MHC-defined rhesus macaque model identifies CD28- CD8+ T cells as a reservoir of breakthrough T-cell proliferation during costimulation blockade and sirolimus-based immunosuppression.” Blood, 116, 24 (2010):5403-5418.)
Todos los trasplantes se realizaron entre pares de medio hermanos que no coinciden en un haplotipo MHC (“HCT haploidénticos”). Los animales receptores recibieron un acondicionamiento previo al trasplante previo a la mieloablación basado en irradiación usando un acelerador lineal. Tasa de dosis: 7cGy/min. Dosis: 1020 cGy, administrada en 4 fracciones. El animal donante de leucoféresis se sometió a movilización de GCSF, y se sometió a leucoféresis usando una máquina de aféresis Spectra Optia. La siguiente tabla da la dosis por kg de células nucleadas totales (TNC) dosis de células CD3+ y células CD34+ para los cuatro experimentos exitosos.
Tabla 3
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2D10 IgG4PE se dosificó a 10 mg/kg i.v. de acuerdo con una dosificación planificada programada para el Día -2, Día 5, Día 12, Día 19, Día 26, Día 33, Día 40, Día 47 después del trasplante. No se observaron efectos secundarios de dosificación adversos graves con ninguno de los animales como resultado de la administración de 2D10 IgG4PE.
Se tomaron muestras durante el curso del estudio para monitorizar el quimerismo de los donantes (Tabla 4), y también los recuentos de glóbulos blancos. El criterio de valoración primario se basó en la supervivencia, con una supervivencia de 15 días considerada como un signo de terapia profiláctica exitoso (y en comparación con la supervivencia documentada de 6-8 días sin profilaxis; Miller et al 2010, más arriba). Aunque se planeó la patología e histología completas con puntuaciones de clasificación de EICH, marcadores de proliferación y activación de células T (tales como Ki-67 y granzima B) y análisis de matriz de genes, no estaban disponibles para su inclusión en el momento de la redacción.
Los métodos para estos estudios son esencialmente como se describe en Miller WP et al., (2010) “EICH after haploidentical transplantation: a novel, MHC-defined rhesus macaque model identifies CD28- CD8+ T cells as a reservoir of breakthrough T-cell proliferation during costimulation blockade and sirolimus-based immunosuppression”, Blood 116:5403-5418.
Estadificación clínica de la EICH
La puntuación de los síntomas clínicos se basó en evaluaciones observacionales y química clínica, clasificadas de acuerdo con los criterios establecidos en la Tabla 5.
Histopatología
Los tejidos, incluyendo los de pulmón, hígado, piel y tracto gastrointestinal, se recogieron en la necropsia y se fijaron en formalina, y se embebieron en parafina. Las secciones se cortaron, se montaron en portaobjetos y se tiñeron con hematoxilina/eosina o con marcadores de células T para visualizar la infiltración tisular por linfocitos. Los portaobjetos preparados son leídos por un histopatólogo con experiencia específica en EICH usando un sistema de puntuación semicuantitativo.
Citometría de flujo
Se recogieron muestras longitudinales de sangre periférica, antes y después del trasplante de células madre hematopoyéticas y en la necropsia, para el análisis de citometría de flujo de los subconjuntos de linfocitos. Se recogieron tejidos de pulmón, hígado, colon, bazo y ganglios linfáticos (axilares e inguinales) en la necropsia, y se disociaron o digirieron enzimáticamente según fuera apropiado para el análisis posterior de infiltrados de linfocitos mediante citometría de flujo. Las muestras se analizaron mediante citometría de flujo multicolor usando un analizador de células LSRFortessa (BD Biosciences) usando las siguientes sondas marcadoras de linfocitos T: CD3 (marcador APC-Cy7; clon SP34-2, BD Biosciences), CD4 (marcador BV786; clon L200, BD Biosciences), CD8 (marcador BUV395; clon RPA-T8, BD Bioscences), CD28 (marcador PE-Cy7; clon CD28.2, eBioscience), CD95 (marcador BV605; clon DX2, Biolegend). Las poblaciones de células en proliferación se identificaron usando Ki-67 (marcador FITC, Dako). Los subcompartimentos de células T CD4+ o CD8+ se marcaron de la siguiente manera: células T sin tratamiento previo (CD28+/CD95-), células T de memoria central (CD28+/CD95+), células T de memoria efectoras (CD28-/CD95+).
La sangre se recogió en tubos con EDTA de sodio, y los glóbulos rojos se lisaron entonces con amortiguador de lisis que contenía cloruro de amonio. Los leucocitos restantes se lavaron con amortiguador de FACS (PBS con FBS al 2%), y se tiñeron con cóctel de anticuerpos (Tabla 7) durante 30 minutos a 4°C. Tras la tinción, las células se lavaron y fijaron en BD Stabilizing Fixative 1x. La adquisición de datos de flujo se realizó en un citómetro BD LSR Fortessa. Los datos se analizaron utilizando FloJo. Las células T se definieron como linfocitos CD14/CD20 CD3+.
Tabla 7. Lista de anticuerpos utilizados para el inmunofenotipado de células T por citometría de flujo
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Resultados:
1: Expansión de células T madre de memoria después del trasplante
En un modelo de primates no humanos de enfermedad aguda de injerto contra hospedante (EICH), el trasplante alogénico de células hematopoyéticas (HCT) da como resultado una expansión temprana de células T madre de memoria tanto CD4 como CD8 (Tscm: CD45RA+CCR7+CD95+) a costa de la reconstitución de células T sin tratamiento previo de buena fe (Tn: CD45RA+CCR7+CD95-) (Fig. 3). Estas células Tscm circulan en la sangre, y también residen tanto en órganos linfoides (ganglios linfáticos, bazo) como no linfoides (pulmón, hígado y colon).
2: 2D10 IgG4PE limita la expansión de Tscm
El tratamiento con el anticuerpo bloqueador anti-OX40L, 2D10 IgG4PE, da como resultado una supervivencia prolongada de los animales después de un HCT alogénico, y reduce los síntomas clínicos de la EICH aguda. Este retraso en la progresión de la EICH se asoció con una expansión limitada de Tscm CD4+ y la preservación de células Tn CD4+ (Fig. 4).
3: Las células Tscm CD4 expresan OX40 en su superficie
Como se muestra en la Figura 5, las Tscm CD4+ expresan OX40 en su superficie, pero las células T sin tratamiento previo no lo hacen. Además, el nivel de expresión de OX40 fue comparable entre Tscm CD4+ y células de memoria central (Tcm). Es importante señalar que la expresión de OX40 se detectó ampliamente en células Tscm CD4+. Se detectan en monos sin tratamiento previo antes del trasplante (tanto en la sangre como en los órganos linfoides), así como en productos de leucoféresis. Esta expresión también se observa en receptores de HCT alogénicos longitudinalmente después del trasplante.
4: Análisis comparativo de Tscm en animales tratados con 02D10 Ig4PE en comparación con las terapias estándar de EICH
La proporción de células Tscm post-HCT evidentes en la sangre periférica de monos rhesus que recibieron 02D10 IgG4PE se comparó con Tscm de grupos separados de animales a los que se les administró sirolimus (rapamicina) o una combinación de tacrolimus más metotrexato (Tac/MTX). Los resultados para las células Tscm CD4+ se muestran en la Figura 6a, y los resultados para las células Tscm CD8+ se muestran en la Figura 6b. Los datos indican que el tratamiento con el anticuerpo anti-OX40L 02D10 IgG4PE da como resultado una inhibición sostenida de la proporción de células Tscm en comparación con el tratamiento con sirolimus y Tac/MTX.
Conclusiones:
Un subconjunto de Tscm que expresa OX40 podría ser sensible al bloqueo de OX40L mediado por 2D10 IgG4PE. Este bloqueo puede controlar la expansión de Tscm, y por lo tanto limitar la progresión de la EICH aguda. La ruta de OX40 es un mecanismo potencialmente novedoso de regulación de Tscm, que se puede utilizar en la práctica clínica para tratar enfermedades inmunomediadas, o mejorar el resultado de la inmunoterapia adoptiva.
Quimerismo
El quimerismo de sangre periférica o de células T (CD3+/CD20-) se determinó usando marcadores de microsatélites ligados al MHC específicos del donante y del receptor divergentes, comparando las alturas de los picos de los amplicones específicos del donante y del receptor (Penedo MC et al., (2005) “Microsatellite typing of the rhesus macaque MHC region”, Imunogenetics 57: 198-209).
Tabla 5
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Se seleccionó un total de seis animales para recibir HSCT. De estos 6 animales, dos de los experimentos se consideraron un fracaso técnico, un animal experimentó una reactivación viral que puede haber dificultado el injerto y se observó que el quimerismo del donante aumentó inicialmente pero luego disminuyó, lo que indica que la segunda reconstitución fue una repoblación autóloga. Una sola lectura elevada de citomegalovirus (CMV) y de linfocriptovirus de macaco Rhesus (rhLCV) se observó al mismo tiempo que la caída del quimerismo y la repoblación autóloga. El segundo fracaso técnico fue el resultado del fallo de la máquina de aféresis para producir un producto adecuado para el trasplante. Como el animal receptor ya había sido irradiado, hubo que sacrificarlo. Los otros cuatro animales sobrevivieron hasta el criterio de valoración primario de 15 días, exhibiendo una supervivencia prolongada en comparación con los controles sin profilaxis tanto históricos como contemporáneos. La Tabla 6 a continuación describe el resumen de cada animal en este estudio.
Ejemplo 8
Farmacocinética
A los macacos Rhesus se les administró una dosis de 10 mg/kg de 2D10 o un anticuerpo de control de isotipo no funcional apropiado el Día 0. Se tomaron muestras después de 15 minutos, 1 hora, 8 horas, 24-36 horas, 72 horas, 96 horas, Día 8, Día 11, Día 15, Día 18, Día 22, Día 25. El Día 29, los animales recibieron 3 mg/kg de 2D10 o un anticuerpo de control de isotipo no funcional apropiado. Se tomaron muestras el Día 29 después de 15 minutos, 1 hora, 8 horas, y entonces 24-36 horas después del Día 29. Se continuaron tomando muestras el Día 32, Día 33, Día 36, Día 39, Día 43, Día 46, Día 50, Día 53, Día 57, Día 60, Día 64, Día 67 y Día 71.
Para determinar la PK, la IgG antihumana se diluye a 8 pg/ml en PBS y se adsorbe en placas de 96 pocillos autofluorescentes bajas y de alta unión a proteínas (Costar) durante la noche a 4°C. El exceso de IgG se elimina lavando con PBS-Tween, y los pocillos se bloquean con leche desnatada en polvo al 5% p/v (amortiguador de bloqueo) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del período de incubación, las placas se lavan. Las muestras de plasma se diluyen en amortiguador de bloqueo (diluciones múltiples). También se genera una curva patrón usando una titulación del anticuerpo anti-OX40L de control positivo diluido en amortiguador de bloqueo de 10 pg/ml (dilución 1 en 3). La titulación o la muestra de plasma diluida se añaden a la placa y se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, las placas se lavan, y el OX40L humano biotinilado se diluye hasta 500 ng/ml en amortiguador de bloqueo añadido durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, las placas se lavan, y se añade el conjugado de estreptavidina-Europium3+ (DELFIA® detección, PerkinElmer) diluido en amortiguador de ensayo DELFIA® (Perkin Elmer). A continuación, las placas se lavan 3 veces en disolución salina amortiguada Tris 0,1% de tween. Luego, se añade disolución de mejora DELFIA (Perkin Elmer) a la placa, y se mide la fluorescencia resuelta en el tiempo a 615 nm en un lector de placas Envision (PerkinElmer). La concentración de anticuerpo anti-OX40L en el plasma se calcula extrapolando los valores de fluorescencia de los pocillos de muestra a los obtenidos de la curva patrón generada a partir de la titulación del anticuerpo anti-OX40L de control positivo usando un algoritmo de ajuste de curva logística de cuatro parámetros.
Ejemplo 9
Modelo de macaco Rhesus (GvHD): efecto de la profilaxis combinada con 2D10 IqG4PE más rapamicina
Se realizó otro estudio de EICH en macaco rhesus para determinar el efecto de la profilaxis post-HSCT combinada con 2D10 IgG4PE y rapamicina. El estudio se realizó como se describe en el Ejemplo 7, con la dosificación siguiente: se administró 2D10 IgG4PE i.v. a 10 mg/kg el Día -2, el Día 5, el Día 12, el Día 19, el Día 26, el Día 33, el Día 40, el Día 47 y el Día 56 después del trasplante. La rapamicina se administró a una dosis de carga de 0,1 mg/kg i.m. el Día -14, seguido de dosis diaria de mantenimiento i.m. de 0,025 mg/kg hasta la finalización programada del estudio en el Día 100. La dosis de rapamicina se ajustó para mantener los niveles séricos mínimos dentro del intervalo 5-15 ng/ml.
Resultados:
La administración post-HSCT de 2D10 IgG4PE junto con rapamicina dio como resultado una supervivencia absoluta y exenta de EICH extendida (tiempo de supervivencia mediano, MST > 82 días; n=3) en comparación con los animales de control históricos que no recibieron tratamiento experimental post-HSCT (MST= 8 días, n=4; Furlan et al, Science Translational Medicine, Vol 7 (315); 315ra1910). El efecto de la dosificación combinada de 2D10 IgG4PE más rapamicina también pareció ser mayor que el efecto aditivo de cada molécula cuando se administró sola (Figura 7: MST para 2D10 IgG4PE y rapamicina post-HSCT fueron 19 y 17 días, respectivamente; ambos n-4). También se observa que Furlan et al describen un MST para la profilaxis combinada con tacrolimus más metotrexato de 49 días. Se espera que una combinación de tacrolimus más metotrexato y un anticuerpo anti-OX40L (tal como 2D10), o de hecho una combinación de tacrolimus y un anticuerpo anti-OX40L (tal como 2D10), también proporcione los resultados sinérgicos que se ven en este Ejemplo.
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Los datos entre paréntesis indican fallo experimental debido a infección (animal 1) o fallo técnico (animal 3).
Tabla 6
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Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Una combinación que comprende un anticuerpo o un fragmento del mismo, que se une específicamente a hOX40L, en la que el anticuerpo o fragmento comprende un dominio Vh que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; y un dominio Vl que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, en la que el anticuerpo es un anticuerpo IgG4,
y un agente terapéutico adicional seleccionado independientemente del grupo que consiste en rapamicina (sirolimus), tacrolimus, ciclosporina, corticosteroides (por ejemplo, metilprednisolona), basilixumab, y daclizumab.
2. Una combinación según la reivindicación 1, en la que el anticuerpo o fragmento comprende una primera y una segunda copias de dicho dominio Vh, y/o en la que el anticuerpo o fragmento comprende una primera y una segunda copias de dicho dominio Vl.
3. Una combinación según la reivindicación 1 o 2, en la que
(a) el anticuerpo o fragmento comprende una cadena ligera kappa; y/o
(b) la cadena ligera comprende una región constante de roedor, rata, ratón, ser humano, conejo, pollo, camélido, oveja, bovino, primate no humano, o tiburón; y/o
(c) el anticuerpo o fragmento comprende además regiones constantes de cadena ligera humana o humanizada, por ejemplo CL humana; y/o
(d) el anticuerpo o fragmento comprende una cadena ligera kappa que comprende una región constante seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de la región constante de cadena ligera kappa de Seq Id Nos: 136, 138, 140, 142 y 144; y/o
(e) el anticuerpo es un anticuerpo totalmente humano; y/o
(f) el anticuerpo comprende una región constante gamma 4 humana, opcionalmente una región constante de cadena pesada de SEQ ID No: 128.
4. Una combinación según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el anticuerpo o fragmento comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en la secuencia de SEQ ID No: 62, y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en la secuencia de SEC ID No: 64.
5. Una combinación según cualquier reivindicación anterior, formulada para administración parenteral seleccionada de administración intravenosa o subcutánea.
6. Un kit que comprende:
(i) un anticuerpo o fragmento del mismo como se define en cualquier reivindicación anterior; y
(ii) otro agente terapéutico seleccionado independientemente del grupo que consiste en rapamicina (sirolimus), tacrolimus, ciclosporina, corticosteroides (por ejemplo, metilprednisolona), basilixumab, y daclizumab.
7. Un kit según la reivindicación 6, en el que el kit comprende una etiqueta o instrucciones, en el que la etiqueta o las instrucciones son para uso para tratar y/o prevenir una afección o enfermedad mediada por hOX40L seleccionada de una enfermedad o afección autoinmune, una enfermedad o afección inflamatoria sistémica, o rechazo de trasplante; por ejemplo, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, rechazo de trasplantes alogénicos, enfermedad de injerto contra hospedante (EICH), colitis ulcerosa, lupus eritematoso sistémico (LES), diabetes, uveítis, espondilitis anquilosante, hipersensibilidad por contacto, esclerosis múltiples, y aterosclerosis, en particular EICH, opcionalmente,
en el que la etiqueta o las instrucciones comprenden un número de autorización de comercialización (por ejemplo, un número de autorización de FDA o EMA).
8. Un kit según una cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7, que comprende un dispositivo intravenoso o de inyección que comprende el anticuerpo o fragmento del mismo.
9. Una combinación como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para uso en el tratamiento y/o prevención de una enfermedad mediada por hOX40L seleccionada de una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria sistémica, o rechazo de trasplante.
10. Un anticuerpo o un fragmento del mismo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad mediada por hOX40L seleccionada de una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria sistémica, o rechazo de un trasplante en un sujeto,
en el que al sujeto también se le administra un agente terapéutico adicional seleccionado independientemente del grupo que consiste en rapamicina (sirolimus), tacrolimus, ciclosporina, corticosteroides (por ejemplo, metilprednisolona), basilixumab, y daclizumab.
11. Una combinación para uso según la reivindicación 9, o un anticuerpo o fragmento para uso según la reivindicación 10, en el que la enfermedad mediada por hOX40L se selecciona de enfermedad inflamatoria intestinal (EII), enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, rechazo de trasplantes alogénicos, enfermedad de injerto contra hospedante (EICH), colitis ulcerosa, lupus eritematoso sistémico (LES), diabetes, uveítis, espondilitis anquilosante, hipersensibilidad por contacto, esclerosis múltiple, y aterosclerosis.
12. Una combinación para uso según la reivindicación 9, o un anticuerpo o fragmento para uso según la reivindicación 10, en el que la enfermedad mediada por hOX40L es dermatitis.
13. Una combinación para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 9, 11 y 12, o un anticuerpo o fragmento para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que el anticuerpo o fragmento se administra por vía parenteral, por ejemplo por administración intravenosa o subcutánea.
14. Una combinación como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para uso en terapia.
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