DE69839060T2

DE69839060T2 - Vegi, ein inhibitor der angiogenese und des tumorwachstums

Info

Publication number: DE69839060T2
Application number: DE69839060T
Authority: DE
Inventors: Lu-Yuan Gaithersburg LI; Yifan Rockville ZHAI; Guo-Liang San Mateo YU; Jian Rockville NI; Marc E. Bethesda LIPPMAN; Craig A. Laytonsville ROSEN
Original assignee: Georgetown University; Human Genome Sciences Inc
Current assignee: Georgetown University; Human Genome Sciences Inc
Priority date: 1997-11-03
Filing date: 1998-11-02
Publication date: 2009-01-15
Anticipated expiration: 2018-11-03
Also published as: EP1042343A4; AU753157B2; EP1992633A1; CN1174993C; WO1999023105A1; CN1285845A; WO1999023105A9; MXPA00004256A; EP1042343A1; CA2309541C; JP4441112B2; KR20010031713A; JP2002502582A; ATE384732T1; DE69839060D1; EP1042343B1; ES2303358T3; CA2309541A1; AU1450099A; JP2009165466A

Description

Hintergrund der Erfindung
Unter normalen physiologischen Bedingungen unterziehen sich Menschen oder Tiere in sehr spezifisch eingeschränkten Situationen einer Angiogenese, der Entwicklung von neuen Blutgefäßen in ein Gewebe oder Organ. Zum Beispiel wird eine Angiogenese normalerweise in der Wundheilung und der embryonalen Entwicklung und Bildung des Corpus luteum, im Endometrium und der Plazenta beobachtet. Der Begriff „Endothel" bedeutet eine dünne Schicht von flachen epithelialen Zellen, die seröse Höhlen, Lymphgefäße und Blutgefäße auskleidet. Der Begriff „anti-angingen" oder „angingen-hemmende Aktivität" bedeutet die Fähigkeit eines Moleküls, die Angiogenese im Allgemeinen zu hemmen.
Es wird angenommen, dass sowohl die kontrollierte als auch die unkontrollierte Angiogenese auf ähnliche Weise verlaufen. Endothelzellen und Pericyten, die von einer Basalmembran umgeben sind, bilden Kapillar-Blutgefäße. Die Angiogenese beginnt mit der Erosion der Basalmembran durch Enzyme, die durch Endothelzellen und Leukocyten freigesetzt werden. Die Endothelzellen, die das Lumen der Blutgefäße auskleiden, ragen dann durch die Basalmembran heraus. Angiogene Stimulanzien induzieren, dass die Endothelzellen durch die erodierte Basalmembran wandern. Die wandernden Zellen bilden einen „Spross" aus dem Elternblutgefäß, wo sich die Endothelzellen einer Mitose unterziehen und proliferieren. Die endothelialen Sprosse verschmelzen miteinander, um Kapillarschleifen zu bilden, wobei das neue Blutgefäß gebildet wird.
Eine andauernde nicht-regulierte Angiogenese erfolgt in einer Vielzahl von Krankheitszuständen, Tumor-Metastasen, und abnormalem Wachstum durch Endothelzellen und trägt zum pathologischen Schaden bei, der in diesen Zuständen gesehen wird. Die diversen pathologischen Krankheitszustände, in denen eine nicht- regulierte Angiogenese vorhanden ist, sind zusammen als angingen-abhängige oder angingen-assoziierte Krankheiten gruppiert worden.
Während des Tumorwachstums proliferieren Endothelzellen, wandern in das Stroms ein, wandern zur Quelle des Angiogenese-Stimulus wie Krebszellen, interagieren mit perivaskulären Zellen und Stromazellen und bilden schlussendlich Kapillargefäße, die das Tumorgewebe mit dem Kreislauf verbinden (J. Folkman (1995) Nat. Med. 1: 27–31). Obwohl der zweifellos hoch-komplexe Mechanismus, der die Angiogenese reguliert, noch verstanden werden muss, wird es deutlich, dass die Initiierung oder Terminierung des Vorgangs ein Ergebnis eines Gleichgewichts zwischen positiven und negativen Regulatoren der Angiogenese ist. Eine Reihe von angiogenen Faktoren, die in Tumorgeweben oft deutlich hinaufreguliert sind, sind beschrieben worden, einschließlich einiger Mitglieder der Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Familie wie FGF-1 (G. Gimenez-Gallego et al. (1985) Science 230: 1385), FGF-2 (L. Schweigerer et al. (1987) Nature 325: 257) und jener der vaskulären endothelialen Zell-Wachstumsfaktor-Familie (VEGF) (D. W. Leung et al. (1989) Science 246: 1306) sowie der Rezeptoren dieser Wachstumsfaktoren (L. W. Burrus und B. B. Olwin (1989) J. Biol. Chem. 264: 18647; S. Wennstrom et al. (1991) Growth Factors 4: 197; B. Terman et al. (1992) Biochem. Biophys. Res. Comm. 187: 1579; C. de Vries et al., (1992) Science 255: 989). Alle hierin vorstehend und unten zitierten Dokumente sind hiermit in ihrer Gänze durch Bezugnahme eingeschlossen.
Einige Inhibitoren der Angiogenese sind auch berichtet worden, einschließlich Thrombospondin (D. J. Good et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6624), Angiostatin (M. S. O'Reilly et al. (1994) Cell 79: 315), Endostatin (M. S. O'Reilly et al. (1997) Cell 88: 277) und Blutplättchen-Faktor-4 (E. Maione et al. (199)] Science 247: 77). Es ist offensichtlich, dass die normale Angiogenese prompt aktiviert, wenn sie benötigt wird, und schnell beendet wird, wenn sie nicht länger gebraucht wird, wohingegen eine pathologische Angiogenese oft verlängert und schwer zu stoppen ist, sobald sie initiiert wird. Dies weist darauf hin, dass der negative Regulationsmechanismus, der in einem normalen Angiogenese-Vorgang wirkt, in einem pathologischen Angiogenese-Vorgang fehlt oder unterdrückt wird. Es ist nahegelegt worden, dass proteolytische Aktivitäten, die Angiogenese-Inhibitoren von einer Reihe von Vorläufern freisetzen, teilweise die Hinunterregulierung der Angiogenese bedingen, wie es durch die proteolytische Aktivierung von Angiostatin aus Plasminogen und jener von Endostatin aus Kollagen XVIII angezeigt wird (M. S. O'Reilly, (1997) Cell 88: 277). Viele der bekannten Angiogenese-Regulatoren sind pleiotrop und können auf andere Zelltypen sowie den einen, der die Regulatoren produziert, wirken, obwohl es denkbar ist, dass Endothelzellen autokrine Faktoren produzieren können, um einen Angiogenese-Vorgang zu unterdrücken oder das Ruhestadium eines reifen Gefäßsystems zu bewahren. Es sind früher keine solchen autokrinen Regulatoren der Angiogenese beschrieben worden. In dieser Anmeldung wird ein neuer autokriner negativer Regulator der Angiogenese, genannt Vaskulärer Endothelzell-Wachstumsinhibitor (VEGI) beschrieben, der spezifisch von Endothelzellen exprimiert wird.
Obwohl das Protein, das in dieser Anmeldung beschrieben ist, erstmals in EP 95903521.3 , angemeldet am 7. November, 1994, als TNF-gamma beschrieben wurde, wurde darin die angingen-hemmende Funktion des Proteins nicht offenbart. Das Protein wurde durch Konstruieren von acht cDNA-Genbanken unter Verwendung von RNA, die von verschiedenen Endothelzellen stammte, von denen 30000 exprimierte Sequenz-Tags (ESTs) hergestellt wurden, entdeckt. ESTs, die einmalig für Endothelzellen waren, wurden weiter auf Sequenzhomologie mit bekannten Proteinfamilien, insbesondere den Cytokinen, charakterisiert. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen von einer Gruppe von ESTs enthielten die Konsens-Aminosäuresequenz der Tumor-Nekrosefaktoren (TNFs). Um die Volllängen-cDNA-Clone zu erhalten, wurde eine menschliche Nabelvenen-Endothelzellen(HUVE)-Genbank unter Verwendung einer radioaktiv markierten Sonde von einem der anfänglichen Clone gescreent. Einige positive Clone wurden isoliert und sequenziert. Der längste cDNA-Clon enthielt eine Insertion von 4,5 Kilobasen, die einen offenen Leserahmen von 174 Aminosäuren und lange nicht-translatierte Regionen sowohl an den 3'- als auch den 5'-Enden codierte. Ein In-Rahmen-Stoppcodon stromaufwärts des vorhergesagten Startcodons wies darauf hin, dass die Translation nicht weiter stromaufwärts beginnen konnte. Das neue Protein zeigte 20–30% Sequenzhomologie zu menschlichem TNFα, TNFβ und dem Fas-Liganden. Ein Protein mit einem Molekulargewicht von 22 kD wurde in einem in vitro-Transkriptions- und Translations-Experiment unter Verwendung des cDNA-Clons als Matrize, übereinstimmend mit dem vorhergesagten offenen Leserahmen, produziert. Eine Hydrophobizitäts-Analyse des Proteins sagte eine hydrophobe 12- Aminosäuren-Region unmittelbar nach dem N-terminalen Segment von 14 nicht-hydrophoben Aminosäuren vorher. Dies ist übereinstimmend mit der Struktur eines Typ II-Transmembran-Proteins, ähnlich den TNFs (B. B. Aggarwal und K. Natarajan (1996) Eur. Cytokine News. 7: 93).
Eine neuere Northern-Analyse von Gesamt-RNA-Präparationen von 22 verschiedenen Typen von kultivierten Zellen von verschiedenen Linien wies darauf hin, dass Transkripte von diesem Protein nur in zwei Linien von Endothelzellen nachgewiesen werden können: in HUVE-Zellen und menschlichen venösen Endothelzellen einer frühen Passage. Die mRNA wurde in menschlichen venösen Endothelzellen einer späteren Passage nicht nachgewiesen, noch wurde sie in menschlichen arteriellen Zellen gesehen. In starkem Gegensatz dazu werden die TNF-Familienmitglieder vorwiegend in Immunzellen exprimiert (B. B. Aggarwal und K. Natarajan (1996), vorstehend). Zum Beispiel wird TNFα durch Macrophagen, Monocyten, Neutrophile und T-Zellen produziert, während TNFβ vorwiegend durch Mitogen-stimulierte T-Lymphocyten und Leukocyten produziert wird. In ähnlicher Weise werden die Liganden für Fas und andere TNF-Familienmitglieder, CD27, CD30, CD40, OX40 und 4-1BB, alle in Zelltypen im Immunsystem exprimiert. Unter Verwendung von Northern-Blots an mehreren Geweben wurde gefunden, dass das VEGI-Transkript in Plazenta, Lunge, Niere, Skelettmuskel, Gehirn, Leber, Thymus, Hoden, Ovar und peripheren Blutlymphocyten exprimiert wird.
Die vorliegende Erfindung identifiziert und beschreibt die neue Funktion dieses Proteins. Es ist gefunden worden, dass eine verkürzte Form des oben beschriebenen Proteins das Endothelzell-Wachstum hemmt. Das Protein wird daher Vaskulärer Endothelzell-Wachstumsinhibitor (VEGI) genannt. Eine verkürzte Version von VEGI, bestehend aus den Resten 39–174, entsprechend der mutmaßlichen extrazellulären Domäne, wurde in E. coli exprimiert, isoliert und in einer Vielfalt von zellulären Tests untersucht. Es wurde gefunden, dass die verkürzte Form von VEGI spezifisch die Proliferation von Endothelzellen hemmt, die Bildung von Kapillar-ähnlichen Röhren in einem in vitro-Modell hemmt und das Wachstum eines menschlichen Brustkrebs-Xenotransplantats in Brustgewebe-Kissen von weiblichen Nacktmäusen ohne Thymus hemmt.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beschreibt einen Inhibitor der Endothelzell-Proliferation im Allgemeinen und einen Inhibitor der Angiogenese im Besonderen und Verfahren zur Verwendung. Die vollständige Nucleotidsequenz von VEGI ist in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 26 gezeigt, und die codierte Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9 beziehungsweise SEQ ID NO: 27 gezeigt. Es wurde gefunden, dass eine verkürzte Form des Proteins, bestehend aus den Resten 39–174 (SEQ ID NO: 3), entsprechend der mutmaßlichen extrazellulären Domäne, spezifisch die Proliferation von Endothelzellen hemmt. Es wurde gefunden, dass VEGI die Bildung von Kapillar-ähnlichen Röhren in einem in vitro-Angiogenese-Modell hemmt. Schließlich wurde gefunden, dass VEGI das Wachstum von Xenotransplantat-Tumoren in Nacktmäusen ohne Thymus hemmt.
Daher beschreibt die vorliegende Erfindung einen Inhibitor der Angiogenese, wobei der Inhibitor VEGI-Polynucleotide, Polypeptide, wie hierin beschrieben, oder eine modifizierte Form von VEGI in einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel in einer pharmazeutisch verträglichen Menge umfasst.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch einen Beschleuniger der Angiogenese, wobei der Beschleuniger einen Antikörper, ein Antisense-Oligonucleotid, einen Antagonisten, ein Ribozym, einen Arzneistoff oder ein Agens, das die VEGI-Funktion reduziert oder eliminiert, in einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel in einer pharmazeutisch verträglichen Menge umfasst.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch ein Verfahren zum Hemmen der Angiogenese, das das Verabreichen einer Zusammensetzung, umfassend ein im Wesentlichen gereinigtes VEGI-Polynucleotide, ein Polypeptid, wie hierin beschrieben, oder eine modifizierte Form von VEGI in einer Dosierung, die ausreicht, um die Angiogenese zu hemmen, an einen Menschen oder ein Tier umfasst.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch ein Verfahren zum Beschleunigen der Angiogenese, das das Verabreichen einer Zusammensetzung, umfassend einen Antikörper, ein Antisense-Oligonucleotid, einen Antagonisten, ein Ribozym, einen Arzneistoff oder ein Agens, das die VEGI-Funktion reduziert oder eliminiert, an einen Menschen oder ein Tier umfasst.
In noch einer anderen Ausführungsform beschreibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Diagnose einer pathologischen Angiogenese, umfassend das Nachweisen des Vorliegens oder Fehlens von VEGI-Polypeptiden in einer Probe, wobei das Verfahren aus den Schritten besteht:

(i) Inkontaktbringen einer Probe von einem Individuum, das im Verdacht steht, eine pathologische Angiogenese aufzuweisen, mit Antikörpern, die spezifisch für VEGI-Polypeptide sind, wie hierin beschrieben; und
(ii) Nachweisen des Vorliegens oder Fehlens eines Komplexes, der zwischen VEGI und den Antikörpern gebildet wurde.

In noch einer anderen Ausführungsform beschreibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Diagnose einer pathologischen Angiogenese, umfassend das Nachweisen des Vorliegens oder Fehlens von VEGI-Polynucleotiden (vorzugsweise RNA) in einer Probe, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

(i) Inkontaktbringen einer Probe von einem Individuum, das im Verdacht steht, eine pathologische Angiogenese aufzuweisen, mit Oligonucleotiden, die spezifisch VEGI-Polynucleotide (z. B. RNA) binden; und
(ii) Nachweisen des Vorliegens oder Fehlens eines Duplex, der zwischen den VEG-Polynucleotiden oder den dafür spezifischen Oligonucleotiden gebildet wurde.

In einer anderen Ausführungsform beschreibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Diagnose einer pathologischen Angiogenese unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion, wobei das Verfahren das Gestalten von Primern unter Verwendung der Nucleotidsequenz von VEGI, wie in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 26 gezeigt, umfasst, die spezifisch eine Region von VEGI amplifizieren. Die Primer können verwendet werden, um VEGI-DNA oder VEGI-RNA zu amplifizieren, letztere nach Konvertieren der RNA in komplementäre DNA (cDNA) durch reverse Transkription der RNA. Der PCR-Test kann durch Vergleichen des amplifizierten Produkts mit einem Standard, der unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, hergestellt werden kann, quantitativ gemacht werden.
In noch einer anderen Ausführungsform beschreibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für den Nachweis von VEGI-Polynucleotiden in einer Probe, das ein Testen auf das Vorliegen oder Fehlen von VEGI-RNA oder -DNA in einer Probe durch Hybridisierungstests umfasst.
In einer weiteren Ausführungsform beschreibt die vorliegende Erfindung einen diagnostischen oder prognostischen Kit, umfassend Antikörper, die entsprechend gegen VEGI-Polynucleotide oder Polypeptide, wie hierin beschrieben, binden, Oligonucleotide, die an VEGI-DNA oder -RNA hybridisieren, und/oder PCR-Primer für die Amplifizierung der VEGI-DNA oder -RNA und Hilfsreagenzien, die für die Verwendung im Nachweisen des Vorliegens von VEGI in einer Probe geeignet sind. Da VEGI als ein Membranprotein wirken kann, kann eine natürlich existierende lösliche Form von Membran-gebundenem VEGI als sein Antagonist wirken, und Verfahren zum Nachweisen der löslichen Form sind in einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
In noch einer anderen Ausführungsform beschreibt die vorliegende Erfindung einen diagnostischen Test, umfassend das Nachweisen des Vorliegens einer Mutation in den VEGI-Polynucleotiden, die im Abfall oder Anstieg der VEGI-Expression oder -Funktion resultiert. Solch ein Test würde einen Hybridisierungstest, Restriktionskarten-Polymorphismus-Tests und eine Gensequenzierung einschließen, um ein paar zu nennen.
In noch einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Nucleinsäuremoleküls, umfassend ein Polynucleotid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

(a) einem Polynucleotid, das ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuren 1 bis 174 von SEQ ID NO: 2 umfasst;
(b) einem Polynucleotid, das ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuren 23 bis 174 von SEQ ID NO: 2 umfasst;
(c) einem Polynucleotid, das ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuren 39 bis 174 von SEQ ID NO: 2 umfasst;
(d) einem Polynucleotid, das ein Fragment des Polypeptids gemäß einem von (a) bis (c) mit Angiogenese-hemmender Aktivität codiert;
(e) einem Polynucleotid, das mit dem Komplement von SEQ ID NO: 1 hybridisiert, wobei das Polynucleotid ein Polypeptid mit Angiogenese-hemmender Aktivität codiert;
(f) einem Polynucleotid, das eine allelische Variante des Polynucleotids gemäß einem von (a) bis (e) codiert;
(g) einem Polynucleotid gemäß einem von (a) bis (f), das ein Polypeptid codiert, das ein Sekretionssignal umfasst; und
(h) dem komplementären Strang von einem der obigen (a) bis (g) eines Polypeptids, das durch ein Nucleinsäuremolekül, umfassend solch ein Polynucleotid, oder einen rekombinanten Vektor, umfassend solch ein Polynucleotid, codiert wird für die Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung oder Linderung von Krankheiten, die durch unkontrollierte Angiogenese vermittelt werden, wobei die Krankheit ein Mitglied der Gruppe ist, bestehend aus Teleangiektasie, Schuppenflechte, Sclerodermia, myokardiale Angiogenese, Plaque-Gefäßneubildung, Angiogenese ischämischer Gliedmaßen, Rubeose, neovaskuläres Glaukom, diabetische Retinopathie, retrolentale Fibroplasie und diabetische Gefäßneubildung.

In noch einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der oben erwähnten Nucleinsäuremoleküle, Polypeptide oder Vektoren für die Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung oder Besserung von Krankheiten wie Makuladegeneration.
In einer anderen Ausführungsform beschreibt die vorliegende Erfindung einen Repressor oder Inhibitor einer Krebs-Wachstums-Zusammensetzung, umfassend im Wesentlichen gereinigte VEGI-Polynucleotide oder Polypeptide, wie hierin beschrieben.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch ein Verfahren für den Nachweis und die Prognose von Krebs durch Nachweisen des Vorliegens oder Fehlens von VEGI-Polynucleotiden oder Polypeptiden, wie hierin beschrieben, in einer Probe oder den Nachweis einer Mutation in VEGI-Polynucleotiden, die die Expression oder Funktion von VEGI verändert.
In noch einer anderen Ausführungsform liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Testen von möglichen Agenzien oder Arzneistoffen auf eine angingen-hemmende Aktivität durch Testen, ob der Arzneistoff oder das Agens zum Hinaufregulieren der VEGI-Expression in der Lage ist oder nicht. Da VEGI wie andere angiogene Inhibitoren wahrscheinlich durch Proteasen aktiviert wird, die das Protein aus der Zellmembran freisetzen, würden Proteasen sowie andere Agenzien, die solch eine Aktivierung ermöglichen, wie Metallionen als Agenzien für ein Steigern der Expression von VEGI nützlich sein.
In einer anderen Ausführungsform liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Testen von möglichen Anti-Tumor-Agenzien oder Arzneistoffen durch Testen, ob das Arzneimittel oder Agens zum Hemmen der Angiogenese durch Hinaufregulieren der VEGI-Expression in der Lage ist oder nicht.
In noch einer anderen Ausführungsform liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Testen von möglichen Arzneistoffen oder eines Agens, die (das) die Angiogenese fördern (fördert), durch Testen, ob das Agens oder der Arzneistoff die VEGI-Funktion (z. B. Hemmung der Angiogenese) blockieren kann oder nicht. In diesem Fall können die Inhibierung von Proteasen, die VEGI aktivieren, wie oben diskutiert, oder Agenzien, die nötig sind für eine solche Aktivierung, oder Agenzien, die diese ermöglichen, wie Metallionen, verwendet werden, um VEGI hinunterzuregulieren, wodurch die Angiogenese hinaufreguliert wird.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 repräsentiert eine Northern Blot-Analyse von VEGI-Transkripten. Feld A, VEGI-Expression in menschlichen Zellen: Jurkat, menschliche T-Zell-Leukämie-Zelle; 1923, menschliche embryonale Nierenzelle; HL60, menschliche promyelocytische Leukämie; V. E, menschliche venöse Endothelzelle (10. Passage); A431, menschliches epidermoides Karzinom; V. E.-2, menschliche venöse Endothelzelle (20. Passage); Raji, menschliches Burkitt-Lymphom; A. E; menschliche Arterien-Endothelzelle; THP-1, menschliche monocytische Leukämie; CCD-29Lu, menschliches Lungenemphysem; CAMA1, Brustkrebs; AN3CA, uteriner Krebs; SK.UT.1, uteriner Krebs; MG63, Osteoblastom; HOS, Osteoblastom; MCF7, Brustkrebs; OVCAR-3, Ovarkrebs; CAOV-3, Ovarkrebs; HUVEC, menschliche Nabelvenen-Endothelzelle; AOSMIC, glatter Muskel. Die geschätzte Botschaftsgröße ist 6,5 kb. Feld B, VEGI-Expression in verschiedenen Typen von menschlichen Geweben: Drei getrennte Blots wurden durchgeführt. Positive Ergebnisse von jedem der drei Experimente sind gezeigt.
2 zeigt die Wirkung von VEGI auf die Proliferation einer Endothelzelle und von Brustkrebs-Zellen. Die Anzahl der Zellen ist gegen die VEGI-Konzentration aufgezeichnet, wie angezeigt. Die Inhibition des Wachstums von ABAE-Zellen (offene Kreise), aber nicht jene von MDA-MB231-(Dreiecke) oder MDA-MB-435-(Quadrate) Zellen ist gezeigt.
3 zeigt die Fähigkeit von VEGI, die Bildung von Kapillar-ähnlichen Röhren, durch ABAE-Zellen auf Kollagen-Gelen zu hemmen. Die p-Werte (t-Test), die über den Säulen angegeben sind, werden durch Vergleichen des Ausmaßes der Kapillar-ähnlichen Röhrenbildung durch ABAE-Zellen in der Anwesenheit von verschiedenen Konzentrationen von VEGI, wie angezeigt, mit jenem, wenn VEGI in den Kulturmedien fehlt, erhalten. Die Abundanz der Kapillar-ähnlichen Strukturen wird als Prozentsätze der weißen Gebiete gegenüber den gemessenen Gesamtgebieten gemessen.
4 zeigt die Inhibierung des Wachstums von menschlichen Brustkrebs-Xenotransplantat-Tumoren in Nacktmäusen ohne Thymus durch VEGI. Feld A: Diagramm der Größen der MDA-MB-231-Xenotransplantat-Tumore (mm²) als eine Funktion der Zeit nach der Beimpfung (Tage). Feld B: Diagramm der Größen der im-DA-MB-435-Xenotransplantat-Tumore (mm²) als eine Funktion der Zeit nach der Beimpfung (Tage). Offen Kreise, zusammen beimpft mit Vektor-transfizierten CHO-Zellen. Gefüllte Kreise, zusammen beimpft mit sezerniertem VEGI-transzifierten CHO-Zellen.
5A, 5B und 5C illustrieren die cDNA (SEQ ID NO: 8) und die entsprechende abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 9) des Polypeptids von VEGI-alpha der vorliegenden Erfindung. Die anfänglichen 27 Aminosäuren (unterstrichen) sind die mutmaßliche Leadersequenz. Die Standard-Ein-Buchstaben-Abkürzungen für Aminosäuren werden verwendet. Potenzielle Aspargin-verknüpfte Glycosylierungsstellen sind in den 5A, 5B und 5C mit einem fettgedruckten Aspargin-Symbol (N) in der VEGI-alpha-Aminosäuresequenz und einem fettgedruckten Rauten-Zeichen (#) über dem ersten Nucleotid, das jenen Aspargin-Rest in der VEGI-alpha-Nucleotidsequenz codiert, markiert. Potenzielle N-verknüpfte Glycosylierungssequenzen werden an den folgenden Stellen in der VEGI-alpha-Aminosäuresequenz gefunden: N-29 bis N-32 (N-29, Y-30, T-31, N-32) und N-125 bis D-128 (N-125, V-126, S-127, D-128). Potenzielle Proteinkinase C (PKC) Phosphorylierungsstellen sind in den 5A, 5B und 5C auch mit einem fettgedruckten Threonin-Symbol (T) in der VEGI-alpha-Aminosäuresequenz und einem Stern (*) über dem ersten Nucleotid, das jenen Threonin-Rest in der VEGI-alpha-Nucleotidsequenz codiert, markiert. Potenzielle PKC-Phosphorylierungssequenzen werden an den folgenden Stellen in der VEGI-alpha-Aminosäuresequenz gefunden: T-32 bis K-34 (T-32, N-33, K-34) und T-50 bis R-52 (T-50, F-51, R-52). Potenzielle Casein-Kinase II (CK2)-Phosphorylierungsstellen sind auch in den 5A, 5B und 5C mit einem fettgedruckten Serin- oder Threonin-Symbol (S oder T) in der VEGI-alpha-Aminosäuresequenz und einem Stern (*) über dem ersten Nucleotid, das den passenden Serin- oder Threonin-Rest in der VEGI-alpha-Nucleotidsequenz codiert, markiert. Potenzielle CK2-Phosphorylierungssequenzen werden an den folgenden Stellen in der VEGI-alpha-Aminosäuresequenz gefunden: S-83 bis E-86 (S-83, Y-84, P-85, E-86); S-96 bis E-99 (S-96, V-97, C-98, E-99); S115 bis E-118 (S-115, L-116, Q-117, E-118); S-130 bis D-133 (S-130, L-131, V-132, D-133); und T-135 bis D-138 (T-135, K-136, E-137, D-138). Potenzielle Myristylierungsstellen sind auch in den 5A, 5B und 5C mit einer doppelten Unterstreichung in der VEGI-alpha-Aminosäuresequenz markiert. Potenzielle Myristylierungssequenzen werden an den folgenden Stellen in der VEGI-alpha-Aminosäuresequenz gefunden: G-20 bis K-25 (G-20, L-21, A-22, F-23, T-24, K-25) und G-111 bis L-116 (G-111, A-112, M-113, F-114, S-115, L-116).
6A und 6B illustrieren die cDNA (SEQ ID NO: 26) und die korrespondierende abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 27) des Polypeptids des VEGI-beta der vorliegenden Erfindung. Die Standard-Ein-Buchstaben-Abkürzungen für Aminosäuren werden verwendet. Die Aminosäuren Methionin-1 bis Tryptophan-35 sind die vorhergesagte intrazelluläre Domäne. Die Aminosäure-Reste Alanin-36 bis Alanin-61 (unterstrichen) sind die mutmaßliche Transmembransequenz. Die Aminosäure-Reste Glutamin-62 bis Leucin-251 (unterstrichen) sind die mutmaßliche Transmembransequenz. Potenzielle Asparagin-verknüpfte Glycosylierungsstellen sind in den 6A und 6B mit einem fettgedruckten Asparagin-Symbol (N) in der VEGI-beta-Aminosäuresequenz und einem Rauten-Zeichen (#) über dem ersten Nucleotid, das jenen Asparagin-Rest in der VEGI-beta-Nucleotidsequenz codiert, markiert. Potenzielle N-verknüpfte Glycosylierungssequenzen werden an den folgenden Stellen in der VEGI-beta-Aminosäuresequenz gefunden: N-133 bis N-136 (N-133, Y-134, T-135, N-136) und N-229 bis D-232 (N-229, V-230, S-231, D-232). Potenzielle Proteinkinase C (PKC) Phosphorylierungsstellen sind in den 6A und 6B auch mit einem fettgedruckten Serin- oder Threonin-Symbol (S oder T) in der VEGI-beta-Aminosäuresequenz und einem Stern (*) über dem ersten Nucleotid, das jenen Threonin-Rest in der VEGI-beta-Nucleotidsequenz codiert, markiert. Potenzielle PKC-Phosphorylierungssequenzen werden an den folgenden Stellen in der VEGI-beta-Aminosäuresequenz gefunden: S-23 bis R-25 (S-23, C-24, R-25); S-32 bis R-34 (S-32, A-33, R-34); T-135 bis K-137 (T-135, N-136, K-137); und T-154 bis R-156 (T-154, F-155, R-156). Potenzielle Casein-Kinase II (CK2)-Phosphorylierungsstellen sind auch in den 6A und 6B mit einem fettgedruckten Serin- oder Threonin-Symbol (S oder T) in der VEGI-beta-Aminosäuresequenz und einem Stern (*) über dem ersten Nucleotid, das den passenden Serin- oder Threonin-Rest in der VEGI-beta-Nucleotidsequenz codiert, markiert. Potenzielle CK2-Phosphorylierungssequenzen werden an den folgenden Stellen in der VEGI-beta-Aminosäuresequenz gefunden: S-8 bis E-11 (S-8, F-9, G-10, E-11); S-187 bis E-190 (S-187, Y-188, P-189, E-190); S-200 bis E-203 (S-200, V-201, C-202, E-203); S-219 bis E-222 (S-219, L-220, Q-221, E-222); S-234 bis D-237 (S-234, L-235, V-236, D-237); und T-239 bis D-242 (T-239, K-240, E-241, D-242). Potenzielle Myristylierungsstellen sind auch in den 6A und 6B mit einer doppelten Unterstreichung in der VEGI-beta-Aminosäuresequenz markiert. Potenzielle Myristylierungssequenzen werden an den folgenden Stellen in der VEGI-beta-Aminosäuresequenz gefunden: G-6 bis E-11 (G-6, L-7, S-8, F-9, G-10, E-11); G-124 bis G-129 (G-124, L-125, A-126, F-127, T-128, K-129); und G-215 bis L-220 (G-215, A-216, M-217, F-218, S-219, L-220).
7 zeigt eine Analyse der VEGI-apha-Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 9). Alpha-, beta-, Kurven- und Spiralenregionen; Hydrophilie und Hydrophobie; amphipathische Regionen; flexible Regionen, antigener Index und Oberflächen-Wahrscheinlichkeit sind gezeigt, wie unter Verwendung der Standardparameter des vorgetragenen Computerprogramms vorhergesagt wurde. In der „antigenen Index- oder Jameson-Wolf" Graphik zeigen die positiven Peaks Stellen der hoch-antigenen Regionen des VEGI-Polypeptids an, d. h. Regionen, von denen Epitop-tragende Peptide der Erfindung erhalten werden können.
Detaillierte Beschreibung
Obwohl die DNA-Sequenz und die Aminosäuresequenz des hierin beschriebenen VEGI-Proteins in EO 95903521.3 als TNF-gamma beschrieben wurde, wurden die neue anti-angiogene Aktivität und die neue Endothelzell-hemmende Aktivität dieses Moleküls nicht offenbart.
Die vorliegende Erfindung beschreibt VEGI-Polynucleotide und Polypeptide, die das vaskuläre Endothelzell-Wachstum hemmen, und Verfahren für die Behandlung von Krankheiten und Vorgängen, die durch die Angiogenese vermittelt werden oder mit ihr assoziiert sind, durch Verabreichen dieser Polynucleotide und Polypeptide. Die beschriebenen VEGI-Polynucleotide oder Polypeptide können von Körperflüssigkeiten, einschließlich aber nicht limitiert auf Serum, Urin und Ascites, isoliert werden oder durch chemische oder biologische Verfahren (z. B. Zellkultur, rekombinante Genexpression) synthetisiert werden. Rekombinante Techniken schließen Gen-Amplifizierung von DNA-Quellen unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Gen-Amplifizierung von RNA-Quellen unter Verwendung der reversen Transkriptase/PCR ein. VEGI hemmt das Wachstum von Blutgefäßen in Gewebe wie nicht-vaskularisierte oder vaskularisierte Tumore. Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Protein, das ein Molekulargewicht von ungefähr 22 kD aufweist, und jede modifizierte Form davon des Proteins, einschließlich einer Verkürzung oder einer post-translationellen Modifizierung wie einer glycosylierten Form des Proteins, die zum Überwinden der angiogenen Aktivität von endogenen Wachstumsfaktoren in der Lage ist, aber nicht darauf limitiert. Die Nucleotidsequenz für VEGI ist in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 26 gezeigt, und die Aminosäuresequenz für VEGI ist in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9 beziehungsweise SEQ ID NO: 27 gezeigt. Eine aktive Form von VEGI umspannt die Aminosäuren 39–174 des Proteins, das in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist. Die natürliche Form von VEGI ist unbestimmt. Es ist möglich, dass die biologisch aktive Form dimer, trimer oder polymer sein kann. Die vorliegende Erfindung beschreibt auch jede allelische Variation der Sequenz und die spezifischen Epitope oder Domänen, die in den hierin beschriebenen VEGI-Polynucleotiden oder Polypeptiden enthalten sind, die in der Inhibierung der Angiogenese resultieren. Diese Sequenzen können verwendet werden, um anti-VEGI-Agenzien wie Antisense-Oligonucleotide zu gestalten oder um Antikörper zu produzieren, die die VEGI-Funktion hemmen, solche Sequenzen und Agenzien sind für die Linderung oder Verhinderung von angingen-assoziierten Krankheiten nützlich.
Obwohl die Sequenz des menschlichen VEGI gezeigt und beschrieben ist, wird verstanden, dass, da menschliches VEGI zum Inhibieren von bovinem und Maus-Endothelzell-Wachstum in der Lage ist, VEGI unter den Spezies gut konserviert ist. Die Sequenz von VEGI von anderen Spezies kann unter Verwendung der Sequenz- und Funktionsinformation, die in dieser Anmeldung offenbart ist, cloniert werden. Daher werden VEGI-Polynucleotide und Polypeptid-Sequenzen von anderen Spezies als dem Menschen auch für die Verwendung in den Verfahren und Verwendungen dieser Anmeldung in Betracht gezogen.
Die vorliegende Erfindung beschreibt zusätzlich isolierte Nucleinsäuremoleküle, umfassend Polynucleotide, die ein VEGI-Polypeptid codieren, das die Aminosäuresequenz aufweist, die in den 5A, 5B und 5C (SEQ ID NO: 9) gezeigt ist, die durch Sequenzieren einer clonierten cDNA (HUVE091) bestimmt wurde. Die beschriebenen VEGI-Polypeptide der vorliegenden Erfindung teilen Sequenzhomologie mit menschlichem VEGI (SEQ ID NO: 10), VEGI-beta (SEQ ID NO: 11), menschlichem Lymphotoxin-beta (SEQ ID NO: 12) und dem FAS-Liganden (SEQ ID NO: 13). Die Funktionen der VEGI-Polynucleotide oder Polypeptide schließen die Inhibierung der Angiogenese, als ein Cytokin-ähnliches Anti-Tumor-Molekül, als eine Behandlung für Arthritis durch die Inhibierung der Angiogenese und/oder Endothelzell-Proliferation, die mit einwanderndem Pannus in Knochen und Knorpel assoziiert ist, als ein Induktor von NF-NB und c-Jun-Kinase (JNK), als ein Induktor der Zelladhäsion und als ein Induktor der Apoptose ein, sind aber nicht darauf limitiert. Die Nucleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID NO: 8, wurde durch Sequenzieren eines cDNA-Clons (HUVE091) erhalten, der am 26. Oktober, 1994 bei der American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, hinterlegt und dem die Hinterlegungsnummer 75927 gegeben wurde. Das hinterlegte Plasmid ist im pBluescript SK(–) Plasmid (Stratagene, La Jolla, CA) enthalten.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch isolierte Nucleinsäuremoleküle, umfassend ein Polynucleotid (SEQ ID NO: 26), das das VEGI-beta-Polypeptid codiert, welches die Aminosäuresequenz, gezeigt in den 6A und 6B (SEQ ID NO: 27), aufweist, die durch Sequenzieren einer clonierten cDNA (HEMCZ56) bestimmt wurde. Das VEGI-beta-Polypeptid ist eine Spleißvariante des hierin offenbarten VEGI-Polypeptids. Die Nucleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 26 gezeigt ist, wurde durch Sequenzieren eines cDNA-Clons (HEMCZ56) erhalten, der am 9. Juli, 1998 bei der American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, hinterlegt und dem die Hinterlegungsnummer 203055 gegeben wurde. Das hinterlegte Plasmid ist im pBluescript SK(–) Plasmid (Stratagene, La Jolla, CA) enthalten.
Nucleinsäuremoleküle
Mit „Nucleotidsequenz" eines Nucleinsäuremoleküls oder Polynucleotids ist für ein DNA-Molekül oder Polynucleotid eine Sequenz von Desoxyribonucleotiden und für ein RNA-Molekül oder Polynucleotid die korrespondierende Sequenz von Ribonucleotiden (A, G, C und U) beabsichtigt, wo jedes Thymidin-Desoxyribonucleotid (T) in der beschriebenen Desoxyribonucleotidsequenz durch das Ribonucleotid Uridin (U) ersetzt ist.
Unter Verwendung der hierin gelieferten Information wie der Nucleotidsequenz in den 5A, 5B und 5C (SEQ ID NO: 8) oder der Nucleotidsequenz in den 6A und 6B (SEQ ID NO: 26) kann ein Nucleinsäuremolekül (d. h. Polynucleotid), das ein VEGI- oder VEGI-beta-Polypeptid codiert, unter Verwendung von Clonierungs- und Screening-Standardvorgehensweisen wie zum Beispiel jenen für die Clonierung von cDNAs unter Verwendung von mRNA als das Ausgangsmaterial erhalten werden. Zum Beispiel können Polynucleotide, die VEGI-Polypeptide codieren, routinemäßig von jeder Zell- oder Gewebequelle, die VEGI exprimiert, wie zum Beispiel menschlichen Nieren- und Nabelvenen-Endothelzellen erhalten werden. Illustrativ für die Erfindung wurden die Nucleinsäuremoleküle, die in den 5A, 5B und 5C (SEQ ID NO: 8) beschrieben sind, in einer cDNA-Genbank entdeckt, die von menschlichen Nabelvenen-Endothelzellen abgeleitet wurde. Der cDNA-Clon, der dem VEGI entspricht (Clon HUVE091), enthält einen offenen Leserahmen, der ein Protein von 174 Aminosäure-Resten codiert, von denen ungefähr die ersten 27 Aminosäurereste die mutmaßliche Leadersequenz sind, sodass das reife Protein 147 Aminosäuren umfasst. Das Protein zeigt den höchsten Grad der Homologie am C-Terminus zum Kaninchen-TNF-α (Ito, H., et al., DNA 5: 157–165 (1986); GenBank-Zugangsnr. M12846; SEQ ID NO: 14), mit 38% Identität und 58% Ähnlichkeit über eine 111 Aminosäuren-Ausdehnung. Die Sequenzen, die quer durch die Mitglieder der TNF-Familie konserviert sind, sind auch in VEGI konserviert.
Weiterhin können Polynucleotide, die ein VEGI-beta-Polypeptid codieren, routinemäßig von induzierten und ruhenden Endothelzellen, der Nabelvene, den Tonsillen und einigen anderen Zell- und Gewebetypen erhalten werden. Illustrativ für die Erfindung wurden die Nucleinsäuremoleküle, die in den 6A und 6B (SEQ ID NO: 26) beschrieben sind, in einer cDNA-Genbank entdeckt, die von induzierten Endothelzellen abgeleitet wurde. Der cDNA-Clon, der dem VEGI-beta entspricht (HEMCZ56), enthält einen offenen Leserahmen, der ein Protein von 251 Aminosäureresten enthält, von denen ungefähr die ersten 35 Aminosäure-Reste die mutmaßliche intrazelluläre Domäne sind und die Aminosäuren 36–61 die mutmaßliche Transmembran-Domäne sind und die Aminosäurereste 62–251 eine mutmaßliche extrazelluläre Domäne sind.
Die Aminosäurereste, die die extrazellulären, Transmembran- und intrazellulären Domänen ausmachen, sind durch Computeranalyse vorhergesagt worden. Daher können, wie ein Fachmann anerkennen würde, die Aminosäurereste, die diese Domänen ausmachen, in geringem Maß variieren (z. B. durch etwa 1 bis etwa 15 Aminosäurereste), abhängig von den Kriterien, die verwendet wurden, um jede Domäne zu definieren.
Die vorliegende Erfindung beschreibt eine isolierte Nucleinsäure (Polynucleotid), die das reife Polypeptid, das die abgeleitete Aminosäuresequenz der 5A, 5B und 5C (SEQ ID NO: 9) aufweist, oder das reife Polypeptid, das durch die cDNA des Clons, der HUVE091 bezeichnet wurde, hinterlegt als ATCC-Hinterlegungsnr. 75927 am 26. Oktober, 1994, codiert wurde, codiert.
Zusätzlich beschreibt die vorliegende Erfindung eine isolierte Nucleinsäure (Polynucleotid), die das reife Polypeptid, das die abgeleitete Aminosäuresequenz der 6A und 6B (SEQ ID NO: 27) hat, oder das reife Polypeptid, das durch die cDNA des Clons codiert wird, der HEMCZ56 bezeichnet wird, hinterlegt als ATCC-Hinterlegungsnr. 203055 am 9. Juli, 1998, codiert.
Mit einem „isolierten" Nucleinsäuremolekül(en) oder Polynucleotid wird ein Molekül, eine DNA oder RNA, das (die) von seiner (ihrer) natürlichen Umgebung entfernt worden ist, beabsichtigt. Zum Beispiel werden rekombinante DNA-Moleküle (Polynucleotide), die in einem Vektor enthalten sind, für die Zwecke der vorliegenden Erfindung als isoliert angesehen. Weitere Beispiele von isolierten DNA-Molekülen (Polynucleotiden) schließen rekombinante DNA-Moleküle, die in heterologen Wirtszellen aufrechterhalten werden, oder gereinigte (teilweise oder wesentlich) DNA-Moleküle in Lösung ein. isolierte RNA-Moleküle (Polynucleotide) schließen in vivo- oder in vitro-RNA-Transkripte der DNA-Moleküle (Polynucleotide) der vorliegenden Erfindung ein. Isolierte Nucleinsäuremoleküle oder Polynucleotide, wie in der vorliegenden Erfindung beschrieben, schließen weiterhin solche Moleküle ein, die synthetisch produziert wurden.
Die Polynucleotide, wie in der vorliegenden Erfindung beschrieben, können in der Form von RNA oder in der Form von DNA vorliegen, wobei die DNA cDNA, genomische DNA und synthetische DNA einschließt. Die DNA kann doppelsträngig oder einzelsträngig sein, und wenn sie einzelsträngig ist, kann sie der codierende Strang oder der nicht-codierende (antisense) Strang sein.
Isolierte Nucleinsäuremoleküle, wie in der vorliegenden Erfindung beschrieben, schließen die Polynucleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 8 offenbart ist und das reife VEGI-Polypeptid codiert, die Polynucleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 26 abgebildet ist und das reife VEGI-beta-Polypeptid codiert, die Polynucleotidsequenzen, die im hinterlegten Clon (HUVE091), der als ATCC-Hinterlegungsnr. 75927 hinterlegt ist, enthalten sind und das reife VEGI-beta-Polypeptid codieren, die Polynucleotidsequenzen, die im hinterlegten Clon (HEMCZ56), der als ATCC-Hinterlegungsnr. 203055 hinterlegt ist, enthalten sind und das reife VEGI-beta-Polypeptid codieren, und Polynucleotidsequenzen ein, die eine andere Sequenz umfassen als jene, die oben beschrieben wurden, aber die aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes dasselbe reife Polypeptid codiert wie die DNA von SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 26 oder die hinterlegte cDNA. Natürlich ist der genetische Code auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Daher würde es für einen Fachmann Routine sein, solche degenerierten Varianten herzustellen.
Die vorliegende Erfindung offenbart Nucleinsäuremoleküle, die eine reife Form des VEGI-Polypeptid-Proteins codieren. Die Aminosäuresequenz des vollständigen VEGI-Polypeptids schließt eine Leadersequenz und ein reifes Protein, wie in den 5A, 5B und 5C (SEQ ID NO: 9) und der SEQ ID NO: 2 gezeigt, ein. Gemäß der Signal-Hypothese haben Proteine, die durch Säugerzellen sezerniert werden, eine Signal- oder sekretorische Leadersequenz, die vom vollständigen Polypeptid gespalten wird, um eine sezernierte „reife" Form des Proteins zu produzieren, sobald der Export der wachsenden Proteinkette über das raue endoplasmatische Retikulum initiiert worden ist. Die meisten Säugerzellen und sogar Insektenzellen spalten die sezernierten Proteine mit derselben Spezifität. Dennoch ist in manchen Fällen die Spaltung eines sezernierten Proteins in manchen Fällen nicht gänzlich uniform, was in zwei oder mehreren reifen Arten des Proteins resultiert. Weiterhin ist es lange bekannt gewesen, dass die Spaltungsspezifität eines sezernierten Proteins schlussendlich durch die Primärstruktur des vollständigen Proteins bestimmt wird, das heißt, sie ist inhärent in der Aminosäuresequenz des Polypeptids. Daher offenbart die vorliegende Erfindung eine Nucleotidsequenz, die das reife VEGI-Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz hat, die durch den cDNA-Clon codiert wird, der in der ATCC-Hinterlegungsnr. 75927 enthalten ist. Mit dem „reifen VEGI-Polypeptid, das die Aminosäuresequenz hat, die durch den cDNA-Clon in der ATCC-Hinterlegungsnr. 75927 codiert wird" ist (sind) die reife(n) Form(en) des VEGI-Polypeptids gemeint, das (die) durch Expression des vollständigen offenen Leserahmens in einer Säugerzelle (z. B. COS-Zellen, wie unten beschrieben), der durch die menschliche DNA-Sequenz des hinterlegten Clons codiert wird, produziert werden.
Das Polynucleotid, das das reife Polypeptid der 6A und 6B (SEQ ID NO: 26) oder das reife Polypeptid codiert, das durch die hinterlegte cDNA (HEMCZ56) codiert wird, kann: nur die codierende Sequenz für das reife Polypeptid; die codierende Sequenz für das reife Polypeptid und eine zusätzliche codierende Sequenz wie eine Leader- oder sekretorische Sequenz oder eine Transmembransequenz oder eine Proproteinsequenz; die codierende Sequenz für das reife Polypeptid (und optional eine zusätzliche codierende Sequenz) und eine nicht-codierende Sequenz wie Introns oder eine nicht-codierende Sequenz 5' und/oder 3' der codierenden Sequenz für das reife Polypeptid einschließen, ist aber nicht darauf limitiert.
Die vorliegende Erfindung offenbart auch Polynucleotide, in denen die codierende Sequenz für das reife Polypeptid im selben Leserahmen an eine Polynucleotidsequenz fusioniert sein kann, die die Expression und Sekretion eines Polypeptids von einer Wirtszelle, zum Beispiel einer Leadersequenz unterstützt, die als eine sekretorische Sequenz für das Kontrollieren des Transports eines Polypeptids aus der Zelle wirkt. Das Polypeptid, das eine Leadersequenz hat, ist ein Präprotein, und die Leadersequenz kann durch die Wirtszelle gespalten werden, um die reife Form des Polypeptids zu bilden. Die Polynucleotide können auch ein Proprotein codieren, das das reife Protein plus zusätzliche 5'-Aminosäurereste ist. Ein reifes Protein, das eine Prosequenz hat, ist ein Proprotein und ist eine inaktive Form des Proteins. Sobald die Prosequenz gespalten wird, verbleibt ein aktives reifes Protein.
Daher kann zum Beispiel das Polynucleotid, wie in der vorliegenden Erfindung offenbart, ein reifes Protein oder ein Protein, das eine Prosequenz hat, oder ein Protein, das sowohl eine Prosequenz als auch eine Präsequenz (Leadersequenz) hat, codieren.
Das Polynucleotid, das in der vorliegenden Erfindung beschrieben wird, kann auch die codierende Sequenz, die im Rahmen an eine Markersequenz fusioniert ist, aufweisen, was die Reinigung des beschriebenen Polypeptids ermöglicht. Die Markersequenz kann ein Hexa-Histidin-Tag sein, das durch einen pQE-9-Vektor bereit gestellt wird, um die Reinigung des reifen Polypeptids, das im Fall eines bakteriellen Wirts an den Marker fusioniert ist, zu liefern, oder die Markersequenz kann zum Beispiel ein Hämagglutinin(HA)-Tag sein, wenn ein Säugerwirt, z. B. COS-7-Zellen, verwendet wird. Das HA-Tag entspricht einen Epitop, das vom Influenza-Hämagglutinin-Protein abgeleitet wurde (Wilson, I., et al., Cell, 37: 767 (1984)).
Daher umspannt der Begriff „Polynucleotid, das ein Polypeptid codiert" ein Polynucleotid, das nur die codierende Sequenz für das Polypeptid einschließt, sowie ein Polynucleotid, das eine zusätzliche codierende und/oder nicht-codierende Sequenz einschließt.
Die vorliegende Erfindung beschreibt weiterhin Varianten der hierin oben beschriebenen Polynucleotide, die Fragmente (d. h. Teile), Analoge und Derivate des Polypeptids, das die abgeleitete Aminosäuresequenz der 5A, 5B und 5C und 6A und 6B (SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 27) hat, und das Polypeptid codieren, das durch die cDNA der hinterlegten Clone codiert wird. Die Variante des Polynucleotids kann eine natürlich vorkommende allelische Variante des Polynucleotids oder eine nicht natürlich vorkommende Variante des Polynucleotids sein.
Daher beschreibt die vorliegende Erfindung auch Polynucleotide, die dasselbe reife Polypeptid, wie in (SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 9) gezeigt, oder das reife Polypeptid, das durch die cDNA des hinterlegten Clons HUVE091 codiert wird, sowie Varianten von solchen Polynucleotiden, wobei die Varianten ein Fragment, Derivat oder Analog des Polypeptids der 1A und B codieren, oder das Polypeptid codieren, das durch die cDNA des hinterlegten Clons HUVE091 codiert wird. Solche Nucleotidvarianten schließen Deletionsvarianten, Substitutionsvarianten und Additions- oder Insertionsvarianten ein.
Zusätzlich beschreibt die vorliegende Erfindung Polynucleotide, die das reife Polypeptid, wie in SEQ ID NO: 27 gezeigt, oder das reife Polypeptid, das durch die cDNA das hinterlegten Clons HEMCZ56 codiert wird, sowie Varianten von solchen Polynucleotiden, wobei die Varianten ein Fragment, Derivat oder Analog des Polypeptids von SEQ ID NO: 203055 codieren, oder das Polypeptid, das durch die cDNA des hinterlegten Clons HEMCZ56 codiert wird, codieren. Solche Nucleotidvarianten schließen Deletionsvarianten, Substitutionsvarianten und Additions- und Insertionsvarianten ein.
Wie hierin oben hingewiesen, kann das Polynucleotid eine codierende Sequenz aufweisen, die eine natürlich vorkommende allelische Variante der codierenden Sequenz, die in SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 8 gezeigt ist, oder der codierenden Sequenz des hinterlegten Clons HUVE091 ist, sein. Alternativ kann das Polynucleotid eine codierende Sequenz aufweisen, die eine natürlich vorkommende allelische Variante der codierenden Sequenz, die in SEQ ID NO: 26 gezeigt ist, oder der codierenden Sequenz des hinterlegten Clons HEMCZ56 ist, sein. Wie auf dem Fachgebiet bekannt ist, ist eine allelische Variante eine wechselnde Form einer Polynucleotidsequenz, die eine Substitution, Deletion oder Addition von einem oder mehreren Nucleotid(en) hat, die die Funktion des codierten Polypeptids nicht wesentlich verändert.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch Fragmente der hierin beschriebenen isolierten Nucleinsäuremoleküle. Mit einem Fragment eines isolierten Nucleinsäuremoleküls, das die Nucleotidsequenz der hinterlegten cDNAs (HUVE091 und HEMCZ56) oder die Nucleotidsequenz, die in den 5A, 5B und 5C (SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 8) und den 6A und 6B (SEQ ID NO: 26) gezeigt sind, oder den komplementären Strang dazu aufweist, sind Fragmente von mindestens 15 nt und mehr bevorzugt mindestens 20 nt, noch mehr bevorzugt mindestens 30 nt und noch mehr bevorzugt mindestens 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400 oder 500 nt Länge vorgesehen. Diese Fragmente haben zahlreiche Verwendungen, die diagnostische Sonden und Primer, wie hierin diskutiert, einschließen, aber nicht darauf beschränkt sind. Natürlich sind auch größere Fragmente mit 50–1500 nt Länge nützlich entsprechend der vorliegenden Erfindung, wie es auch Fragmente sind, die dem Großteil, wenn nicht der gesamten Nucleotidsequenz des hinterlegten cDNA-Clons HUVE091, des hinterlegten cDNA-Clons HEMCZ56, der Nucleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 8 offenbart ist, oder der Nucleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 27 offenbart ist, entsprechen. Mit einem Fragment von mindestens 20 nt Länge ist zum Beispiel ein Fragment vorgesehen, das 20 oder mehr zusammenhängende Basen von der Nucleotidsequenz der hinterlegten cDNA-Clone (HUVE091 und HEMCZ56), der Nucleotidsequenz, wie in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 26 gezeigt, einschließen.
In spezifischen Ausführungsformen codieren die Polynucleotid-Fragmente der Erfindung ein Polypeptid, das eine funktionelle Aktivität zeigt. Mit einem Polypeptid, das eine „funktionelle Aktivität" zeigt, ist ein Polypeptid gemeint, das in der Lage ist, eine oder mehrere bekannte funktionelle Aktivität(en) aufzuzeigen, die mit einem vollständigen oder reifen VEGI-Polypeptid assoziiert ist (sind). Solche funktionellen Aktivitäten schließen eine biologische Aktivität ((z. B. Inhibierung der Angiogenese, Inhibierung der Endothelzell-Proliferation, Induktion der Zelladhäsion, Antigenität [Fähigkeit, an einen anti-VEGI- und/oder anti-VEGI-beta-Antikörper zu binden (oder mit einem VEGI- und/oder VEGI-beta-Polypeptid um die Bindung zu konkurrieren)], Immunogenität (Fähigkeit, einen Antikörper herzustellen, der an ein VEGI- und/oder VEGI-beta-Polypeptid bindet), die Fähigkeit, Polymere mit anderen VEGI-Polypeptiden zu bilden, und Fähigkeit, einen Rezeptor oder Liganden für ein VEGI-Polypeptid (z. B. DR3) zu binden, ein, sind aber nicht darauf limitiert.
Die Erfindung beschreibt auch Nucleinsäuremoleküle, die Nucleotidsequenzen haben, die mit ausgedehnten Fragmenten von SEQ ID NO: 8 in Beziehung stehen, die von den folgenden verwandten cDNA-Clonen bestimmt worden sind: HUVE091 (SEQ ID NO: 15), HMPAP05 (SEQ ID NO: 16), HSXCA44 (SEQ ID NO: 17), HEMFG66 (SEQ ID NO: 18) und HELAM93 (SEQ ID NO: 19).
Die Erfindung beschreibt auch Nucleinsäuremoleküle, die Nucleotidsequenzen haben, die mit ausgedehnten Fragmenten von SEQ ID NO: 26 in Beziehung stehen, die von den folgenden verwandten cDNA-Clonen bestimmt worden sind: HUVE091P01 (SEQ ID NO: 28), HMPTI24R (SEQ ID NO: 29), HELM93R (SEQ ID NO: 30) und HEMFG66R (SEQ ID NO: 31).
In spezifischen Ausführungsformen umfassen oder alternativ bestehen die beschriebenen Polynucleotid-Fragmente aus ein(em) Polynucleotid, umfassend jeden Teil von mindestens 30 Nucleotiden, vorzugsweise mindestens 50 Nucleotiden von SEQ ID NO: 8 vom Nucleotidrest 1 bis 2442, vorzugsweise ausschließlich der Nucleotidsequenzen, die von den oben aufgelisteten cDNA-Clonen bestimmt wurden. Repräsentative Beispiele der beschriebenen VEGI-Polynucleotidfragmente schließen Fragmente ein, die die Nucleotide:
oder des komplementären Polynucleotid-Strangs dazu oder die cDNA, die im hinterlegten Clon HUVE091 enthalten ist, umfassen oder alternativ daraus bestehen.
In zusätzlichen spezifischen Ausführungsformen umfassen oder alternativ bestehen die beschriebenen Polynucleotid-Fragmente aus ein(em) Polynucleotid, das jeden Teil von mindestens 30 Nucleotiden, vorzugsweise mindestens 50 Nucleotiden der SEQ ID NO: 26 vom Nucleotidrest 1 bis 1116, vorzugsweise ausschließlich der Nucleotidsequenzen, die von den oben aufgelisteten cDNA-Clonen bestimmt wurden, umfasst.
Die Erfindung beschreibt auch Polynucleotide, die Polypeptide codieren, umfassend oder alternativ bestehend aus der (die) Aminosäuresequenz der Reste
Polynucleotide, die diese Polypeptide codieren, sind auch beschrieben.
Repräsentative Beispiele der beschriebenen VEGI-beta-Polynucleotidfragmente schließen Fragmente ein, die Nucleotide

oder des komplementären Polynucleotid-Strangs dazu oder die cDNA, die im hinterlegten Clon HEMCZ56 enthalten ist, umfassen oder alternativ daraus bestehen.
Bevorzugte Nucleinsäure-Fragmente, wie hierin beschrieben, schließen auch Nucleinsäuremoleküle ein, die eine oder mehrere der folgenden Domänen der potenziellen VEGI-Asparagin-verknüpften Glycosylierungsstellen N-29 bis N-32 (N-29, Y-30, T-31, N-32) und N-125 bis D-128 (N-125, V-126, S-127, D-128); der potenziellen Proteinkinase C (PKC)-Phosphorylierungsstellen T-32 bis K-34 (T-32, N-33, K-34) und T-50 bis R-52 (T-50, F-51, R-52); der potenziellen Casein-Kinase II (CK2)-Phosphorylierungsstellen S-83 bis E-86 (S-83, Y-84, P-85, E-86); S-96 bis E-99 (S-96, V-97, C-98, E-99); S-115 bis E-118 (S-115, L-116, Q-117, E-118); S-130 bis D-133 (S-130, L-131, V-132, D-133); und T-135 bis D-138 (T-135, K-136, E-137, D-138); und der potenziellen Myristylierungsstellen G-20 bis K-25 (G-20, L-21, A-22, F-23, T-24, K-25) und G-111 bis L-116 (G-111, A-112, M-113, F-114, S-115, L-116) der SEQ ID NO: 2 codieren.
Unter den beschriebenen Polynucleotiden sind jene, die durch codierende strukturelle oder funktionelle Eigenschaften von VEGI charakterisiert sind. Solche Polynucleotide codieren Aminosäurereste, die alpha-Helix und alpha-Helix-bildende Regionen („alpha-Regionen"), beta-Blatt und beta-Blatt-bildende Regionen („beta-Regionen"), Kurven- und Kurven-bildende Regionen („Kurvenregionen"), Spiralen- und Spiralen-bildende Regionen („Spiralenregionen"), hydrophile Regionen, hydrophobe Regionen, alpha-amphipathische Regionen, beta-amphipathische Regionen, Oberflächen-bildende Regionen und hoch-antigene Index-Regionen (d. h. die antigene Regionen von drei oder mehreren zusammenhängenden Aminosäureresten haben, wobei jede davon einen antigenen Index von größer oder gleich 1,5 hat) von VEGI umfassen. Bestimmte bevorzugte Regionen sind jene, die in 7 dargestellt sind, und schließen Regionen der vorher erwähnten Typen, die durch Analyse der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 9 dargestellt ist, unter Verwendung der Standardparameter des identifizierten Computerprogramms identifiziert wurden, ein sind aber nicht darauf limitiert, solche bevorzugten Regionen schließen ein; Garnier-Robson-alpha-Regionen, -beta-Regionen, -Kurvenregionen und -Spiralenregionen, Chou-Fasman-alpha-Regionen, -beta-Regionen und -Spiralenregionen, Kyte-Doolittle-hydrophile Regionen und hydrophobe Regionen, Eisenberg-alpha- und -beta-amphipathische Regionen, Karplus-Schulz flexible Regionen, Emini-Oberflächen-bildende Regionen und Jameson-Wolf-Regionen mit hoch-antigenem Index.
Daten, die VEGI-beta in einer Weise, wie oben für VEGI beschrieben, repräsentieren, können leicht unter Verwendung der in SEQ ID NO: 27 offenbarten Aminosäuresequenz hergestellt werden. Als solches treffen alle der oben aufgelisteten strukturellen oder funktionellen Eigenschaften von VEGI, die oben aufgelistet sind (d. h. Garnier-Robson-alpha-Regionen, -beta-Regionen, -Kurvenregionen und -Spiralenregionen, Chou-Fasman-alpha-Regionen, -beta-Regionen und -Spiralenregionen, Kyte-Doolittle-hydrophile Regionen und hydrophobe Regionen, Eisenberg-alpha- und -beta-amphipathische Regionen, Karplus-Schulz flexible Regionen, Emini-Oberflächen-bildende Regionen und Jameson-Wolf-Regionen mit hoch-antigenem Index, usw.) gleich gut auf VEGI und VEGI-beta zu.
Bestimmte bevorzugte Regionen in dieser Hinsicht sind in 7 dargelegt, können aber auch durch Verwenden einer tabellarischen Repräsentation der Daten, die in 7 präsentiert werden, repräsentiert oder identifiziert werden. Der DNA*STAR-Computer-Algorithmus, der verwendet wurde, um 7 herzustellen (eingestellt auf die ursprünglichen Standardparameter), wird die Daten in 7 leicht in solch einem tabellarischen Format präsentieren. Ein tabellarisches Format der Daten in 7 kann verwendet werden, um spezifische Grenzen einer bevorzugten Region leicht zu bestimmen.
Die oben erwähnten bevorzugten Regionen, die in 7 dargestellt sind, schließen Regionen der vorher erwähnten Typen, die durch Analyse der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 27 dargelegt ist, identifiziert wurden, ein, sind aber nicht darauf limitiert. Wie in 7 dargelegt, schließen solche bevorzugten Regionen Garnier-Robson-alpha-Regionen, -beta-Regionen, -Kurvenregionen und -Spiralenregionen, Chou-Fasman-alpha-Regionen, -beta-Regionen und -Spiralenregionen, Kyte-Doolittle-hydrophile Regionen und hydrophobe Regionen, Eisenberg-alpha- und -beta-amphipathische Regionen, Karplus-Schulz flexible Regionen, Emini-Oberflächen-bildende Regionen und Jameson-Wolf-Regionen mit hoch-antigenem Index ein.
Unter den stark bevorzugten Fragmenten in dieser Hinsicht sind jene, die Regionen von VEGI und/oder VEGI-beta umfassen, die einige strukturelle Eigenschaften wie einige (z. B. 1, 2, 3 oder 4) der Eigenschaften, die oben dargelegt sind, kombinieren.
Zusätzliche bevorzugte Nucleinsäure-Fragmente schließen Nucleinsäuremoleküle ein, die einen oder mehrere Epitop-tragende(n) Teil(e) des VEGI-Polypeptids codieren. Insbesondere schlossen solche Nucleinsäure-Fragmente Nucleinsäuremoleküle ein, codierend: ein Polypeptid, umfassend Aminosäurereste von etwa Thr-24 bis etwa Asn-32 in SEQ ID NO: 9; ein Polypeptid, umfassend Aminosäurereste von etwa Ile-37 bis etwa Ile-45 in SEQ ID NO: 9; ein Polypeptid, umfassend Aminosäurereste von etwa Met-54 bis etwa Arg-62 in SEQ ID NO: 9; ein Polypeptid, umfassend Aminosäurereste von etwa Gln-63 bis etwa Asp-71 in SEQ ID NO: 9; ein Polypeptid, umfassend Aminosäurereste von etwa Glu-57 bis etwa Gly-65 in SEQ ID NO: 9; ein Polypeptid, umfassend Aminosäurereste von etwa Val-80 bis etwa Thr-88 in SEQ ID NO: 9; ein Polypeptid, umfassend Aminosäurereste von etwa Leu-116 bis etwa Val-124 in SEQ ID NO: 9; und ein Polypeptid, umfassend Aminosäurereste von etwa Asp-133 bis etwa Phe-141 in SEQ ID NO: 9. Es ist durch die Analyse des Jameson-Wolf-antigenen Index, wie in 7 oben gezeigt, festgestellt worden, dass diese Polypeptidfragmente antigene Epitope des VEGI-Polypeptids tragen. Verfahren zum Bestimmen von anderen solchen Epitop-tragenden Teilen von VEGI sind unten im Detail beschrieben.
Petidfragmente, die die antigenen Epitope des VEGI-beta-Proteins tragen, können leicht durch einen Fachmann unter Verwendung der oben beschriebenen Analyse des Jameson-Wolf-antigenen Index, wie in 7 gezeigt, bestimmt werden. Verfahren für das Bestimmen von anderen solchen Epitop-tragenden Teilen von VEGI-beta sind unten im Detail beschrieben.
Die Erfindung beschreibt auch Polynucleotide, die vorzugsweise unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an einen Teil der Polynucleotidsequenz eines Polynucleotids, das VEGI codiert, wie oben beschrieben, hybridisieren, wie zum Beispiel den cDNA-Clon, der in der ATCC-Hinterlegungsnr. 75927 enthalten ist, den cDNA-Clon, der in der ATCC-Hinterlegung 203055 enthalten ist, oder ein VEGI-Polynucleotidfragment, wie hierin beschrieben. Mit „stringenten Hybridisierungsbedingungen" wird eine über Nacht-Inkubation bei 42°C in einer Lösung, umfassend: 50% Formamid, 5 × SSC (750 mM NaCl, 75 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5x Denhardt-Lösung, 10% Dextransulfat und 20 μg/ml denaturierte, geschnittene Lachssperma-DNA, gefolgt von Waschen der Filter in 0,1 × SSC bei etwa 65°C vorgesehen. Mit einem Polynucleotid, das an einen „Teil" eines Polynucleotids hybridisiert, ist ein Polynucleotid (entweder DNA oder RNA) vorgesehen, das an mindestens 15 Nucleotide (nt) und bevorzugter mindestens 20 nt, noch mehr bevorzugt mindestens 30 nt und noch mehr bevorzugt 30–70 oder 80–150 nt oder die gesamte Länge des Bezugs-Polynucleotids hybridisiert. Diese sind nützlich als diagnostische Sonden und Primer, wie oben und detaillierter unten diskutiert. Natürlich würde ein Polynucleotid, das nur an eine poly-A-Sequenz (wie den 3'-terminalen Poly-Bereich der VEGI-cDNA, die in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 26 gezeigt ist) oder an eine komplementäre Ausdehnung von T (oder U)-Resten hybridisiert, nicht in ein Polynucleotid eingeschlossen werden, das verwendet wird, um an einen Teil einer Nucleinsäure, wie hierin beschrieben, zu hybridisieren, weil solch ein Polynucleotid an jedes Nucleinsäuremolekül hybridisieren würde, das eine poly(A)-Ausdehnung oder das Komplement davon (z. B. praktisch jeder doppelsträngige cDNA-Clon, der unter Verwendung von Oligo-dT als ein Primer hergestellt wurde) enthält.
In bevorzugten Ausführungsformen codieren Polynucleotide, die an die hierin offenbarten Bezugs-Polynucleotide hybridisieren, Polypeptide, die entweder im Wesentlichen dieselbe biologische Funktion oder Aktivität wie das reife Polypeptid bewahren, das durch die Polynucleotidsequenzen, die in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8 und/oder SEQ ID NO: 26 offenbart sind, oder die cDNAs, die in der Hinterlegung enthalten sind, codiert wird.
Die vorliegende Erfindung beschreibt weiterhin Varianten der Nucleinsäuremoleküle, die hierin beschrieben sind, die Teile, Analoge oder Derivate des VEGI-Polypeptids codieren. Die Varianten können natürlich vorkommen, wie eine natürliche allelische Variante. Mit einer „allelischen Variante" ist eine von einigen wechselnden Formen eines Gens vorgesehen, die einen Locus auf einem Chromosom eines Organismus besetzt (Genes II, Lewin, B., Hrsg., John Wiley & Sons, New York (1985)). Nicht natürlich vorkommende Varianten können unter Verwendung von fachbekannten Mutagenese-Techniken produziert werden.
Solche Varianten schließen jene ein, die durch Nucleotid-Substitutionen, -Deletionen oder -Additionen der hierin beschriebenen Polynucleotidsequenzen (einschließlich der Fragmente) produziert werden. Die Substitutionen, Deletionen oder Additionen können ein oder mehrere Nucleotid(e) involvieren. Die Varianten können in den codierenden Regionen, nicht-codierenden Regionen oder beiden verändert werden. Änderungen in den codierenden Regionen können konservative oder nicht-konservative Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen oder -Additionen produzieren. Besonders bevorzugt unter diesen sind stille Substitutionen, Additionen und Deletionen, die die Eigenschaften und Aktivitäten des VEGI-Polypeptids oder von Teilen davon nicht ändern. Konservative Substitutionen sind in dieser Hinsicht auch besonders bevorzugt.
Weiterhin werden isolierte Nucleinsäuremoleküle beschrieben, die eine Polynucleotidsequenz umfassen, die mindestens 70% oder mindestens 80% identisch, bevorzugter mindestens 90% identisch und noch mehr bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% identisch zu einem Polypeptid ist, das eine Nucleotidsequenz hat, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einer Nucleotidsequenz, codierend das VEGI-Polypeptid, das die vollständige Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 9 (d. h. die Positionen –27 bis 147 der SEQ ID NO: 9) aufweist; (b) einer Nucleotidsequenz, codierend das VEGI-Polypeptid, das die vollständige Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 9 mit Ausnahme des N-terminalen Methionin (d. h. die Positionen –26 bis 147 der SEQ ID NO: 9) aufweist; (c) einer Nucleotidsequenz, codierend das reife VEGI-Polypeptid, das die Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 9, gezeigt als Positionen 1 bis 147 von SEQ ID NO: 9, aufweist; (d) einer Nucleotidsequenz, codierend die extrazelluläre Domäne des VEGI-Polypeptids, das die Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 9, gezeigt als Positionen 1 bis 147 der SEQ ID NO: 9, aufweist; (e) einer Nucleotidsequenz, codierend das VEGI-Polypeptid, das die vollständige Aminosäuresequenz, die durch den cDNA-Clon HUVE091 codiert wird, der in ATCC-Hinterlegungsnr. 75927 enthalten ist, aufweist; (f) einer Nucleotidsequenz, codierend das VEGI-Polypeptid, das die vollständige Aminosäuresequenz mit Ausnahme des N-terminalen Methionin, codiert durch den cDNA-Clon HUVE091, der in ATCC-Hinterlegungsnr. 75927 enthalten ist, aufweist; (g) einer Nucleotidsequenz, codierend das reife VEGI-Polypeptid, das die Aminosäuresequenz, die durch den cDNA-Clon HUVE091 codiert wird, der in ATCC-Hinterlegungsnr. 75927 enthalten ist, aufweist; (h) einer Nucleotidsequenz, codierend die extrazelluläre Domäne des VEGI-Polypeptids, das die Aminosäuresequenz, die durch den cDNA-Clon HUVE091 codiert wird, der in ATCC-Hinterlegungsnr. 75927 enthalten ist, aufweist; (i) einer Nucleotidsequenz, die ein hierin beschriebenes Polypeptidfragment codiert; und (j) einer Nucleotidsequenz, die komplementär zu einer der Nucleotidsequenzen gemäß obigen (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h) oder (i) ist. Die hierin beschriebenen Polypeptide schließen auch Polypeptide, die eine Aminosäuresequenz haben, die mindestens 80% identisch, bevorzugter mindestens 90% identisch und noch bevorzugter 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% identisch zu jenen ist, die oben gemäß (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i) oder (j) beschrieben sind, sowie Polypeptide, die eine Aminosäuresequenz mit mindestens 90% Ähnlichkeit und bevorzugter mindestens 95% Ähnlichkeit zu jenen oben haben, ein.
Die Erfindung beschreibt auch isolierte Nucleinsäuremoleküle, umfassend eine Polynucleotidsequenz, die mindestens 70% oder mindestens 80% identisch, bevorzugter mindestens 90% identisch und noch mehr bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% identisch zu einem Polynucleotid ist, das eine Nucleotidsequenz hat, die von der Gruppe ausgewählt wurde, bestehend aus: (a) einer Nucleotidsequenz, codierend das VEGI-beta-Polypeptid, das die vollständige Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 27 (d. h. die Positionen 1 bis 251 der SEQ ID NO: 27) aufweist; (b) einer Nucleotidsequenz, codierend das VEGI-beta-Polypeptid, das die vollständige Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 27 mit Ausnahme des N-terminalen Methionin (d. h. die Positionen 2 bis 251 der SEQ ID NO: 27) aufweist; (c) einer Nucleotidsequenz, codierend das reife VEGI-beta-Polypeptid, das die Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 27, gezeigt als Positionen 62 bis 251 von SEQ ID NO: 27, aufweist; (d) einer Nucleotidsequenz, codierend die intrazelluläre Domäne des VEGI-beta-Polypeptids, das die Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 27, gezeigt als Positionen 1 bis 35 der SEQ ID NO: 27, aufweist; (e) einer Nucleotidsequenz, codierend die extrazelluläre Domäne des VEGI-beta-Polypeptids, das die Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 27, gezeigt als Positionen 62 bis 251 der SEQ ID NO: 27, aufweist; (f) einer Nucleotidsequenz, codierend das VEGI-beta-Polypeptid, das die vollständige Aminosäuresequenz, die durch den cDNA-Clon HEMCZ56 codiert wird, der in ATCC-Hinterlegungsnr. 203055 enthalten ist, aufweist; (g) einer Nucleotidsequenz, codierend das VEGI-beta-Polypeptid, das die vollständige Aminosäuresequenz mit Ausnahme des N-terminalen Methionin, codiert durch den cDNA-Clon HEMCZ56, der in ATCC-Hinterlegungsnr. 203055 enthalten ist, aufweist; (h) einer Nucleotidsequenz, codierend das reife VEGI-beta-Polypeptid, das die Aminosäuresequenz, die durch den cDNA-Clon HEMCZ56 codiert wird, der in ATCC-Hinterlegungsnr. 203055 enthalten ist, aufweist; (i) einer Nucleotidsequenz, codierend die intrazelluläre Domäne des VEGI-beta-Polypeptids, das die Aminosäuresequenz, die durch den cDNA-Clon HEMCZ56 codiert wird, der in ATCC-Hinterlegungsnr. 203055 enthalten ist, aufweist; (j) einer Nucleotidsequenz, die die extrazelluläre Domäne des VEGI-beta-Polypeptids codiert, das die Aminosäuresequenz, die durch den cDNA-Clon HEMCZ56 codiert wird, der in ATCC-Hinterlegungsnr. 203055 enthalten ist, aufweist; und (k) einer Nucleotidsequenz, die komplementär zu einer der Nucleotidsequenzen gemäß obigen (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i) oder (j) ist. Die hierin beschriebenen Polypeptide schließen auch Polypeptide, die eine Aminosäuresequenz haben, die mindestens 80% identisch, bevorzugter mindestens 90% identisch und noch mehr bevorzugt 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% identisch zu jenen ist, die oben gemäß (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j) oder (k) beschrieben sind, sowie Polypeptide, die eine Aminosäuresequenz mit mindestens 90% Ähnlichkeit und bevorzugter mindestens 95% Ähnlichkeit zu jenen oben haben, ein.
Mit einem Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz hat, die mindestens zum Beispiel 95% „identisch" zu einer Bezugs-Nucleotidsequenz, wie hierin beschrieben, ist, ist vorgesehen, dass die Nucleotidsequenz des Polynucleotids identisch zu der Bezugssequenz ist, mit der Ausnahme, dass die Polynucleotidsequenz bis zu fünf Punkt-Mutationen pro 100 Nucleotide der Bezugs-Nucleotidsequenz, die das VEGI-Polypeptid codiert, einschließen kann. Mit anderen Worten, um ein Polynucleotid zu erhalten, das eine Nucleotidsequenz hat, die mindestens 95% identisch zu einer Bezugs-Nucleotidsequenz ist, können bis zu 5% der Nucleotide in der Bezugssequenz deletiert oder mit einem anderen Nucleotid substituiert sein, oder eine Zahl von Nucleotiden bis zu 5% der Gesamtnucleotide in der Bezugssequenz kann in die Bezugssequenz inseriert werden. Die Bezugs (Frage)-Sequenz kann die gesamte Nucleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 26 offenbart ist, oder jedes Fragment, wie hierin beschrieben, sein.
Ob ein bestimmtes Nucleinsäuremolekül mindestens 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% zum Beispiel identisch zu der Nucleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 26 gezeigt ist, oder zu der Nucleotidsequenz der hinterlegten cDNA-Clone ist, kann in der Praxis konventionell unter Verwendung von bekannten Computerprogrammen wie dem Bestfit-Programm (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) bestimmt werden. Bestfit verwendet den lokalen Homologie-Algorithmus von Smith und Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482–489 (1981), um das beste Segment der Homologie zwischen zwei Sequenzen zu finden. Wenn Bestfit oder irgendein anderes Sequenz-Alignmentprogramm verwendet wird, um zu bestimmen, ob eine bestimmte Sequenz zum Beispiel 95% identisch zu einer Bezugssequenz, wie hierin beschrieben, ist, werden die Parameter natürlich so eingestellt, dass der Prozentsatz der Identität über die gesamte Länge der Bezugs-Nucleotidsequenz berechnet wird und dass Lücken in der Homologie von bis zu 5% der Gesamtzahl von Nucleotiden in der Bezugssequenz erlaubt werden.
In einer bestimmten Ausführungsform wird die Identität zwischen einer Bezugs (Frage)-Sequenz (einer Sequenz, wie hierin beschrieben) und einer Subjekt-Sequenz, auch als ein globales Sequenzalignment bezeichnet, unter Verwendung des FASTDB-Computerprogramms, basierend auf dem Algorithmus von Brutlag et al. (Corp. App. Biosci. 6: 237–245 (1990)), bestimmt. Bevorzugte Parameter, die in einem FASTDB-Alignment der DNA-Sequenzen verwendet werden, um die Prozent-Identität zu berechnen, sind: Matrix = einheitlich, k-Tupel = 4, Fehlanpassungsstrafe = 1, Verbindungsstrafe = 30, Randomisierung-Gruppenlänge = 0, Grenzwert = 1, Lückenstrafe = 5, Lückengrößen-Strafe 0,05, Fenstergröße = 500 oder die Länge der Subjekt-Nucleotidsequenz, was immer kürzer ist. Gemäß dieser Ausführungsform wird, wenn die Subjekt-Sequenz aufgrund von 5'- oder 3'-Deletionen, nicht aufgrund von internen Deletionen kürzer als die Frage-Sequenz ist, eine manuelle Korrektur der Ergebnisse durchgeführt, um die Tatsache in Betracht zu ziehen, dass das FASTDB-Programm keine 5'- und 3'-Verkürzungen der Subjekt-Sequenz berücksichtig, wenn die Prozent-Identität berechnet wird. Für Subjekt-Sequenzen, die im Vergleich zu der Abfragesequenz an den 5'- oder 3'-Enden verkürzt sind, wird die Prozent-Identität durch Berechnen der Zahl der Basen der Abfragesequenz, die 5' und 3' der Gegenstandssequenz sind, die nicht passend/ausgerichtet sind, als ein Prozentsatz der Gesamtbasen der Abfragessequenz korrigiert. Eine Bestimmung, ob ein Nucleotid passend/ausgerichtet ist, wird durch die Ergebnisse des FASTDB-Sequenz-Alignments bestimmt. Dieser Prozentsatz wird dann von der prozentualen Identität subtrahiert, berechnet durch das obige FASTDB-Programm unter Verwendung der beschriebenen Parameter, um bei einem endgültigen prozentualen Identitätswert anzugelangen. Dieser korrigierte Wert ist, was für die Zwecke dieser Ausführungsform verwendet wird. Nur Basen außerhalb der 5'- und 3'-Basen der Gegenstandssequenz, durch das FASTDB-Alignment, wie gezeigt, die nicht passend/ausgerichtet mit der Abfragesequenz sind, werden zu Zwecken des manuellen Anpassens des prozentualen Identitätswerts berechnet. Zum Beispiel wird eine 90 Basen-Gegenstandssequenz mit einer 100-Basen-Abfragesequenz ausgerichtet, um die Prozent-Identität zu bestimmen. Die Deletionen treten am 5'-Ende der Gegenstandssequenz auf, und daher zeigt das FASTDB-Alignment keine Anpassung/Ausrichtung der ersten 10 Basen am 5'-Ende. Die 10 nicht-gepaarten Basen repräsentieren 10% der Sequenz (Zahl der Basen an den 5'- und 3'-Enden, die nicht passen/Gesamtzahl der Basen in der Abfragesequenz), daher werden 10% vom Prozent-Identitätswert, der durch das FASTDB-Programm berechnet wurde, subtrahiert. Wenn die verbleibenden 90 Basen perfekt passend waren, würde die endgültige prozentuale Identität 90% sein. In einem anderen Beispiel wird eine 90 Basen-Gegenstandssequenz mit einer 100 Basen-Abfragesequenz verglichen. Diesmal sind die Deletionen interne Deletionen, sodass es keine Basen 5' oder 3' der Gegenstandssequenz gibt, die nicht mit der Abfrage passend/ausgerichtet sind. In diesem Fall wird die Prozent-Identität, die durch FASTDB berechnet wird, nicht manuell korrigiert. Wieder werden nur Basen 5' und 3' der Subjekt-Sequenz, die nicht mit der Abfragesequenz passend/ausgerichtet sind, manuell korrigiert. Es werden keine anderen manuellen Korrekturen zu Zwecken dieser Ausführungsform gemacht.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch Polynucleotide, die mindestens eine 70% Identität, vorzugsweise mindestens 90% und bevorzugter mindestens eine 95% Identität mit einem Polynucleotid, das das Polypeptid von SEQ ID NO: 2 codiert, sowie Fragmente davon, wobei die Fragmente mindestens 30 Basen und vorzugsweise mindestens 50 Basen haben, und mit Polypeptiden, die durch solche Polynucleotide codiert werden, haben.
Die vorliegende Erfindung beschreibt weiterhin Polynucleotide, die mindestens eine 70% Identität, vorzugsweise mindestens 90% und mehr bevorzugt mindestens eine 95% Identität mit einem Polynucleotid, das das Polypeptid von SEQ ID NO: 27 codiert, sowie Fragmente davon, wobei die Fragmente mindestens 30 Basen und vorzugsweise mindestens 50 Basen haben, und mit Polypeptiden, die durch solche Polynucleotide codiert werden, haben.
Die vorliegende Anwendung beschreibt Nucleinsäuremoleküle, die mindestens, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% identisch mit der Polynucleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 26 gezeigt ist, oder mit der Nucleinsäuresequenz der hinterlegten cDNA-Clone sind, oder Fragmente davon, unabhängig davon, ob sie ein Polypeptid codieren, das eine funktionelle VEGI-Aktivität aufweist. Es wird jedoch bevorzugt, dass die beschriebenen Nucleinsäuremoleküle ein Polypeptid codieren, das eine funktionelle VEGI-Aktivität hat. Mit „ein Polypeptid, das eine funktionelle VEGI-Aktivität hat" sind Polypeptide vorgesehen, die eine ähnliche aber nicht notwendigerweise identische Aktivität zu der Aktivität des VEGI- und/oder VEGI-beta-Polypeptids, wie hierin beschrieben (entweder des Vollängen-Proteins oder vorzugsweise des reifen Proteins) zeigen, gemessen in einem bestimmten Immuntest und/oder biologischen Test. Zum Beispiel kann die VEGI-Aktivität durch Bestimmen der relativen Fähigkeit von VEGI, die FGF-2-induzierte Bildung einer Kapillar-ähnlichen tubulären Strukturbildung in Kulturen von ABAE-Zellen, wie im Detail in Beispiel 6 beschrieben, oder in einem Chorioallantois-Membran(CAM)-Angiogenese-Test, wie im Beispiel 10 beschrieben, und auf einige zusätzliche Wege, die in den verbleibenden Beispielen und auf dem Fachgebiet beschrieben werden, gemessen werden.
Natürlich wird ein Fachmann aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes sofort erkennen, dass eine große Zahl der Nucleinsäuremoleküle, die eine Sequenz haben, die mindestens 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% identisch ist mit der Nucleinsäuresequenz der hinterlegten cDNA oder der Nucleinsäuresequenz, die in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 26 offenbart ist, oder Fragmente davon, ein Polypeptid codieren werden, das eine „VEGI-Aktivität hat". Da in der Tat degenerierte Varianten dieser Nucleotidsequenzen alle dasselbe Polypeptid codieren, wird dies in vielen Fällen sogar ohne Durchführen des oben beschriebenen Tests für einen Fachmann klar. Es wird weiterhin auf dem Fachgebiet anerkannt werden, dass für solche Nucleinsäuremoleküle, die keine degenerierten Varianten sind, eine vernünftige Zahl auch ein Polypeptid, das eine VEGI-Aktivität hat, codieren wird. Dies ist, weil der Fachmann Aminosäure-Substitutionen genau kennt, die die Proteinfunktion entweder weniger wahrscheinlich oder nicht wahrscheinlich signifikant beeinflussen werden (z. B. Ersetzen einer aliphatischen Aminosäure mit einer zweiten aliphatischen Aminosäure). Zum Beispiel wird eine Richtlinie, wie phenotypisch stille Aminosäure-Substitutionen gemacht werden, in J. U. Bowie et al., „Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions," Science 247: 1306–1310 (1990) bereitgestellt, worin die Autoren hinweisen, dass Proteine überraschend tolerant gegenüber Aminosäure-Substitutionen sind.
Die Erfindung beschreibt isolierte Nucleinsäuremoleküle, umfassend ein Polynucleotid, das die Aminosäuresequenz eines VEGI-Polypeptids (z. B. eines hierin beschriebenen VEGI-Polypeptid-Fragments) codiert, das eine Aminosäuresequenz hat, die mindestens eine konservative Aminosäure-Substitution, aber nicht mehr als 50 konservative Aminosäure-Substitutionen, noch bevorzugter nicht mehr als 40 konservative Aminosäure-Substitutionen, noch bevorzugter nicht mehr als 30 konservative Aminosäure-Substitutionen und sogar noch mehr bevorzugt nicht mehr als 20 konservative Aminosäure-Substitutionen, 10–20 konservative Aminosäure-Substitutionen, 5–10 konservative Aminosäure-Substitutionen, 1–5 konservative Aminosäure-Substitutionen, 3–5 konservative Aminosäure-Substitutionen oder 1–3 konservative Aminosäuresubstitutionen enthält. Natürlich ist es in der Reihenfolge des ständig steigenden Vorzugs höchst bevorzugt, dass ein Polynucleotid, das die Aminosäuresequenz eines VEGI-Polypeptids codiert, eine Aminosäuresequenz aufweist, die nicht mehr als 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 oder 1 konservative Aminosäure-Substitution(en) enthält.
Vektoren und Wirtszellen
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch Vektoren, die die beschriebenen Polynucleotide einschließen, Wirtszellen, die mit den rekombinanten Vektoren gentechnisch manipuliert sind oder die anderweitig konstruiert sind, um die Polypeptide, wie hierin beschrieben, zu produzieren, und die Produktion der Polypeptide, wie hierin beschrieben, durch rekombinante Techniken.
Die Wirtszellen werden mit den beschriebenen Vektoren, die zum Beispiel ein Clonierungsvektor oder ein Expressionsvektor sein können, gentechnisch manipuliert (transduziert oder transformiert oder transfiziert). Der Vektor kann zum Beispiel in der Form eines Plasmids, eines viralen Partikels oder eines Phagen usw. vorliegen. Die manipulierten Wirtszellen können in konventionellen Nährmedien kultiviert werden, die, wie es für das Aktivieren der Promotoren, Selektieren von Transformanten oder Amplifizieren der VEGI-Gene geeignet ist, modifiziert werden. Die Kulturbedingungen wie Temperatur, pH-Wert und dergleichen sind jene, die früher mit der Wirtszelle, die für die Expression selektiert wurde, verwendet wurden, und werden für den Fachmann offensichtlich sein.
Die hierin beschriebenen Polynucleotide können für das Produzieren von Polypeptiden durch rekombinante Techniken angewendet werden. Daher kann das Polynucleotid zum Beispiel in jedem einer Vielfalt von Expressionsvektoren für das Exprimieren eines Polypeptids eingeschlossen sein. Solche Vektoren schließen chromosomale, nicht-chromosomale und synthetische DNA-Sequenzen, z. B. Derivate von SV40; bakterielle Plasmide; Phagen-DNA; Baculovirus; Hefe-Plasmide; Vektoren, die von Kombinationen von Plasmiden und Phagen-DNA stammen, virale DNA wie Vaccinia, Adenovirus, Geflügelpockenvirus und Pseudotollwut ein. Es kann jedoch jeder andere Vektor verwendet werden, solange er im Wirt replizierbar und lebensfähig ist.
Die geeignete DNA-Sequenz kann durch eine Vielfalt von Vorgehensweisen in den Vektor inseriert werden. Im Allgemeinen wird die DNA-Sequenz durch Vorgehensweisen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, in (eine) geeignete Restriktions-Endonucleasestelle(n) inseriert. Solche Vorgehensweisen und andere werden als innerhalb des Rahmens des Fachwissens des Fachmannes erachtet.
Die DNA-Sequenz im Expressionsvektor ist funktionell mit (einer) geeigneten Expressions-Kontrollsequenz(en) (Promotor) assoziiert, um die mRNA-Synthese zu lenken. Als repräsentative Beispiele solcher Promotoren können erwähnt werden: LTR- oder SV40-Promotor, das E. coli-lac oder -trp, der Phage-Lambda-P-Promotor und andere Promotoren, von denen bekannt ist, dass sie die Expression von Genen in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen oder ihren Viren kontrollieren. Der Expressionsvektor enthält auch eine Ribosomenbindungsstelle für die Translations-Initiierung und einen Transkriptions-Terminator. Der Vektor kann auch geeignete Sequenzen für das Verstärken der Expression einschließen.
Zusätzlich enthalten die Expressionsvektoren vorzugsweise ein oder mehrere selektierbare(s) Marker-Gen(e), um ein phänotypisches Merkmal für die Selektion von transformierten Wirtszellen zu liefern, wie die Dihydrofolat-Reduktase oder die Neomycin-Resistenz für eine eukaryontische Zellkultur oder wie die Tetracyclin- oder Ampicillin-Resistenz in E. coli.
Der Vektor, der die geeignete DNA-Sequenz, wie hierin oben beschrieben, sowie einen geeigneten Promotor oder eine Kontrollsequenz enthält, kann angewendet werden, um einen geeigneten Wirt zu transformieren, um dem Wirt das Protein exprimieren zu lassen.
Als repräsentative Beispiele von geeigneten Wirten können erwähnt werden: bakterielle Zellen wie E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; Pilzzellen wie Hefe; Insektenzellen wie Drosophila S2 und Sf9; Tierzellen wie CHO, COS oder Bowes-Melanom, Adenoviren, Pflanzenzellen usw. Die Auswahl eines geeigneten Wirts wird aus den Lehren hierin als im Rahmen des Fachmannes erachtet.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch rekombinante Konstrukte, umfassend eine oder mehrere der Sequenzen, die oben ausführlich beschrieben sind. Die Konstrukte umfassen einen Vektor wie einen Plasmid- oder viralen Vektor, in den eine Sequenz, wie hierin oben beschrieben, in einer Vorwärts- oder Rückwärtsorientierung inseriert worden ist. In einem bevorzugten Aspekt dieser Ausführungsform umfasst das Konstrukt weiterhin regulatorische Sequenzen, einschließlich zum Beispiel eines Promotors, der funktionell mit der Sequenz assoziiert ist. Große Mengen von geeigneten Vektoren und Promotoren sind Fachleuten bekannt und sind kommerziell erhältlich. Die folgenden Vektoren werden als Beispiel geliefert. Bakteriell: pHE4-5 (ATCC Hinterlegungsnr. 209311; und Variationen davon), pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBS, pD10, Phagescript, psiX174, pBluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia). Eukaryontisch: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). Es kann jedoch jedes andere Plasmid oder jeder Vektor verwendet werden, so lange sie im Wirt replizierbar und lebensfähig sind.
Die Promotorregionen können von jedem erwünschten Gen unter Verwendung von CAT(Chloramphenicol-Transferase)-Vektoren oder anderen Vektoren mit selektierbaren Markern ausgewählt werden. Zwei geeignete Vektoren sind PKK232-8 und PCM7. Besonders genannte bakterielle Promotoren schließen lacl, lacZ, T3, T7, gpt, lambda P, P und trp ein. Eukaryontische Promotoren schließen CMV-unmittelbar/früh, HSV-Thymidinkinase, frühes und spätes SV40, LTRs von Retroviren und Maus-Methallothionein-I ein. Die Auswahl des geeigneten Vektors und Promotors liegt wohl im Bereich des Fachwissens.
Die vorliegende Erfindung beschreibt Wirtszellen, die die oben beschriebenen Konstrukte enthalten. Die Wirtszelle kann eine höhere eukaryontische Zelle wie eine Säugerzelle oder eine niedrigere eukaryontische Zelle wie eine Hefezelle sein, oder die Wirtszelle kann eine prokaryontische Zelle wie eine bakterielle Zelle sein. Das Einbringen des Konstrukts in die Wirtszelle kann durch Calciumphosphat-Transfektion, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion oder Elektroporation erreicht werden. (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)).
Zusätzlich zum Beschreiben der Wirtszellen, die die hierin diskutierten Vektorkonstrukte enthalten, beschreibt die Erfindung auch primäre, sekundäre und immortalisierte Wirtszellen von Vertebraten-Ursprung, insbesondere von Säugerursprung, die manipuliert worden sind, um endogenes genetisches Material (z. B. die VEGI-codierende Sequenz) zu deletieren oder zu ersetzen und/oder um genetisches Material (z. B. heterologe Polynucleotidsequenzen) einzuschließen, das funktionell mit den hierin beschriebenen VEGI-Polynucleotiden assoziiert ist und das endogene VEGI-Polynucleotide aktiviert, ändert und/oder amplifiziert. Zum Beispiel können Techniken, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, verwendet werden, um heterologe Kontrollregionen (z. B. Promotor und/oder Enhancer) und endogene VEGI-Polynucleotidsequenzen durch homologe Rekombination (siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 5,641,670 , erteilt am 24. Juni, 1997; Internationale Veröffentlichung Nr. WO 96/29411 , veröffentlicht am 26. September, 1996; Internationale Veröffentlichung Nr. WO 94/12650 , veröffentlicht am 4. August, 1994; Koller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8932–8935 (1989); und Zijlstra et al., Nature 342: 435–438 (1989), die Offenbarungen von jedem, die durch Bezugnahme in ihrer Gänze inkorporiert sind) funktionell zu assoziieren.
Die Konstrukte in den Wirtszellen können auf konventionelle Weise verwendet werden, um das Genprodukt zu produzieren, das durch die rekombinante Sequenz codiert wird. Alternativ können die Polypeptide, wie hierin beschrieben, synthetisch durch konventionelle Peptid-Synthesegeräte produziert werden.
Reife Proteine können in Säugerzellen, Hefe, Bakterien oder anderen Zellen unter der Kontrolle von geeigneten Promotoren exprimiert werden. Zellfreie Translationssysteme können auch angewendet werden, um solche Proteine unter Verwendung von RNAs, die von den DNA-Konstrukten der vorliegenden Erfindung abgeleitet wurden, zu produzieren. Geeignete Clonierungs- und Expressionsvektoren für die Verwendung mit prokaryontischen und eukaryontischen Wirten sind in Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, Zweite Auflage, Cold Spring Habor, N. Y., (1989), dessen Offenbarung hiermit durch Bezugnahme inkorporiert wird, beschrieben.
Die Transkription der DNA, die die Polypeptide, wie hierin beschrieben, durch höhere Eukaryonten codieren, wird durch Inserieren einer Enhancersequenz in den Vektor erhöht. Enhancer sind cis-wirkende Elemente der DNA, normalerweise von etwa 10 bis 300 bp, die auf einen Promotor wirken, um seine Transkription zu erhöhen. Beispiele schließen den SV40-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs bp 100 bis 270, einen Cytomegalie-Virus früher Promotor-Enhancer, den Polyoma-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs und Adenovirus-Enhancer ein.
Im Allgemeinen werden rekombinante Expressionsvektoren Ursprünge der Replikation und selektierbare Marker, die die Transformation der Wirtszelle erlauben, z. B. das Ampicillin-Resistenzgen von E. coli und S. cerevisiae-TRP1-Gen, und einen Promotor einschließen, der von einem hoch-exprimierten Gen abgeleitet wurde, um die Transkription einer stromabwärts-liegenden Struktursequenz zu lenken. Solche Promotoren können von Operons abgeleitet werden, die glycolytische Enzyme wie unter anderen die 3-Phosphoglycerat-Kinase (PGK), den a-Faktor, die saure Phosphatase oder Hitzeschock-Proteine codieren. Die heterologe Struktursequenz wird in einer geeigneten Phase mit Translations-Start- und Stopp-Sequenzen und vorzugsweise einer Führungssequenz, die zum Lenken der Sekretion des translatierten Proteins in den periplasmatischen Raum oder das extrazelluläre Medium in der Lage ist, angeordnet. Optional kann die heterologe Sequenz ein Fusionsprotein codieren, einschließlich eines N-terminalen Identifikations-Peptids, das die erwünschten Charakteristika, zum Beispiel die Stabilisierung oder vereinfachte Reinigung des exprimierten rekombinanten Produkts verleiht.
Nützliche Expressionsvektoren für die bakterielle Verwendung werden durch Inserieren einer strukturellen DNA-Sequenz, die ein erwünschtes Protein zusammen mit geeigneten Translations-Start- und Stopp-Signalen in einer funktionellen Lesephase mit einem funktionellen Promotor codiert, konstruiert. Der Vektor wird einen oder mehrere phenotypische, selektierbare Marker und einen Ursprung der Replikation umfassen, um das Aufrechterhalten des Vektors sicherzustellen und, wenn gewünscht, eine Amplifizierung im Wirt zu liefern. Geeignete prokaryontische Wirte für die Transformation schließen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und verschiedene Spezies in der Gattung Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus ein, obwohl wahlweise auch andere angewendet werden können.
Als ein repräsentatives aber nicht-limitierendes Beispiel können nützliche Expressionsvektoren für die bakterielle Verwendung einen selektierbaren Marker und einen bakteriellen Ursprung der Replikation, der von kommerziell erhältlichen Plasmiden abgleitet wurde, umfassend genetische Elemente des wohlbekannten Clonierungsvektors pBR322 (ATCC 37017), umfassen. Solche kommerzielle Vektoren schließen zum Beispiel pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA) ein. Diese pBR322 „Gerüst"-Abschnitte werden mit einem geeigneten Promotor und der zu exprimierenden Struktursequenz kombiniert.
Nach der Transformation eines geeigneten Wirtsstamms und des Züchtens des Wirtsstamms zu einer geeigneten Zelldichte, wird der selektierte Promotor durch geeignete Mittel (z. B. Temperaturänderung oder chemische Induktion) induziert, und die Zellen werden für einen zusätzlichen Zeitraum kultiviert. Die Zellen werden typischerweise durch Zentrifugation geerntet, durch physikalische oder chemische Mittel zerstört, und der resultierende Rohextrakt wird für eine weitere Reinigung bewahrt.
Mikrobielle Zellen, die in der Expression des Proteins angewendet werden, können durch jedes konventionelle Verfahren, einschließlich Gefrier-Auftau-Zyklen, Bestrahlung, mechanische Zerstörung oder die Verwendung von Zell-lysierenden Agenzien zerstört werden, solche Verfahren sind Fachleuten wohlbekannt.
Verschiedene Säuger-Zellkultursysteme können auch angewendet werden, um ein rekombinantes Protein zu exprimieren. Beispiele von Säuger-Expressionssystemen schließen die COS-7-Linien von Affennieren-Fibroblasten, beschrieben durch Gluzman (Cell 23: 175 (1981)), und andere Zelllinien ein, die zum Exprimieren eines kompatiblen Vektors in der Lage sind, zum Beispiel die C127-, 3T3-, CHO-, HeLa- und BHK-Zelllinien. Säuger-Expressionsvektoren werden einen Ursprung der Replikation, einen geeigneten Promotor und Enhancer und auch jegliche nötige Ribosomen-Bindungsstellen, Polyadenylierungsstellen, Spleißungs-Donor- und Akzeptorstellen, transkriptionelle Terminierungssequenzen und 5'-flankierende nicht-transkribierte Sequenzen umfassen. DNA-Sequenzen, die von der SV40-Spleißung abgeleitet sind, und Polyadenylierungsstellen können verwendet werden, um die erforderlichen nicht-transkribierten genetischen Elemente zu liefern.
Die VEGI-Polypeptide können gewonnen und von den rekombinanten Zellkulturen durch Verfahren, einschließlich der Ammoniumsulfat- oder Ethanol-Präzipitation, Säureextraktion, Anionen- und Kationenaustausch-Chromatographie, Phosphocellulose-Chromatographie, hydrophoben Wechselwirkungs-Chromatographie, Affinitätschromatographie, Hydroxyapatit-Chromatographie und Lectin-Chromatographie, gereinigt werden. Protein-Rückfaltungsschritte können, wie benötigt, im Vervollständigen der Konfiguration des reifen Proteins verwendet werden. Schließlich kann eine Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) für die finalen Reinigungsschritte angewendet werden.
Die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Polypeptide können ein natürlich gereinigtes Produkt oder ein Produkt aus chemischen, synthetischen Vorgehensweisen sein oder durch rekombinante Techniken von einem prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt (zum Beispiel durch bakterielle, Hefe-, höhere Pflanzen-, Insekten- und Säugerzellen in Kultur) produziert werden. Abhängig vom Wirt, der in einer rekombinanten Produktions-Vorgehensweise angewendet wird, können die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Polypeptide glycosyliert sein oder können nicht-glycosyliert sein. Die in der Erfindung beschriebenen Polypeptide können auch einen Start-Methionin-Aminosäurerest einschließen.
Mindestens 15 VEGI-Expressionskonstrukte sind durch die Erfinder hierin hergestellt worden, um die Produktion von VEGI-Polypeptiden von einigen Größen und in einigen Systemen zu erleichtern. Von diesen sind vier konstruiert worden, die ein Volllängen-VEGI-Polypeptid codieren. Die Volllängen-Konstrukte sind: (i) pQE9TNFg-27/147, (ii) pQE70TNFg, (iii) pC1TNFg und pcDNA3TNFg. Im Fall des ersten aufgelisteten Expressionskonstrukts (pQE9TNFg-27/147) wurde das Konstrukt verwendet, um ein Volllängen-VEGI-Polypeptid mit einer N-terminalen sechs-Histidin-Aminosäure-Markierung gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 zu produzieren. Ein Volllängen-VEGI-Polypeptid, dem die Histidin-Markierung fehlt, wurde in Bakterien durch Verwenden des pQE70TNFg-Konstrukts produziert, im Wesentlichen wie es in Beispiel 1 gemacht wurde. Zusätzlich wurde ein Volllängen-VEGI-Polypeptid, dem eine Histidin-Markierung fehlt, in Säugerzellen durch Verwenden von entweder den pC1TNFg- oder pcDNA3TNFg-Konstrukten gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 produziert. Weiterhin wurde das reife VEGI-Polypeptid von Säugerzellen unter der Leitung des Interleukin (IL)-6-Signalpeptids von einem Konstrukt, bezeichnet pcDNA3/IL6TNFg-1/149, produziert und sezerniert.
Die verbleibenden VEGI-Expressionskonstrukte wurden verwendet, um verschiedene VEGI-Muteine von bakteriellen, baculoviralen und Säugersystemen zu exprimieren. Vier N-terminale Deletionsmutationen sind unter Verwendung des bakteriellen pQE60-Expressionsvektors hergestellt worden. Diese N-terminalen Deletionsmutations-Konstrukte sind: (i) pQE60TNFg-3/147 (was ein mögliches reifes VEGI-Polypeptid repräsentiert; das durch dieses Konstrukt exprimierte Polypeptid ist identisch zu den Aminosäureresten 107–251 des VEGI-beta von SEQ ID NO: 27), (ii) pQE60TNFg12/147 (was die Aminosäurereste 12–147 von SEQ ID NO: 9 und die Reste 116–251 von SEQ ID NO: 27 repräsentiert), (iii) pQE60TNFg22/147 (was die Aminosäurereste 22–147 und die Reste 126–251 von SEQ ID NO: 27 repräsentiert) und (iv) pQE60TNFg28/147 (was die Aminosäurereste 28–147 und die Reste 132–251 von SEQ ID NO: 27 repräsentiert). Jedes dieser Expressionskonstrukte kann verwendet werden, um ein VEGI-Polypeptid in einem bakteriellen System zu produzieren, das eine N-terminale Deletion von 25, 39, 49 beziehungsweise 55 Aminosäuren im Bezug auf das Volllängen-VEGI-Polypeptid oder eine N-terminale Deletion von 106, 115, 125 beziehungsweise 131 Aminosäuren im Bezug auf das Volllängen-VEGI-beta-Polypeptid zeigt.
Weitere bakteriellen N-terminale Deletionsmutations-Expressionskonstrukte sind hergestellt worden. Ein Konstrukt, genannt pHE4 VEGI T30-L174, ist unter Verwendung des bakteriellen Expressionsvektors pHE4 hergestellt worden, um die Aminosäuren Threonin-30 bis Leucin-174 der VEGI-Sequenz, die als Reste Threonin-3 bis Leucin-147 von SEQ ID NO: 9 offenbart sind, was genau den Aminosäureresten Threonin-107 bis Leucin-251 der VEGI-beta-Sequenzreste Threonin-107 bis Leucin-251 von SEQ ID NO: 27 entspricht, hergestellt worden. Zusätzliche hergestellte bakterielle Expressionskonstrukte schließen pQE9.VEGI.his.T28-L174, pHE4.VEGI.T28-L174, pHE4.VEGI.T51-L174 und pHE.VEGI.T58-L174 ein. Diese Konstrukte basieren auf entweder den pQE9- oder pHE4-bakteriellen Expressionsvektoren. Die Konstrukt-Bezeichnungen weisen auf den Expressionsvektor, den Gen-Namen und die Aminosäurereste, die durch das Konstrukt exprimiert werden, hin (z. B. weist pQE9.VEGI.T28-L174 darauf hin, dass der bakterielle pQE9-Expressionsvektor verwendet wird, um die Aminosäuren Threonin(T)-28 bis Leucin(L)-174 des VEGI zu exprimieren).
Ein VEGI-Expressionskonstrukt ist hergestellt worden, das verwendet werden kann, um ein sezerniertes reifes VEGI-Polypeptid von einem Säugersystem zu produzieren. Das Konstrukt ist pC1/IL6TNFg-3/147 bezeichnet worden. Es codiert das Signalpeptid des menschlichen IL-6-Gens, fusioniert mit der reifen VEGI-Sequenz. Ein ähnliches Konstrukt ist hergestellt worden, das das CK-b8-Signalpeptid (Aminosäuren –21 bis –1 der CK-b8-Sequenz, die in der veröffentlichten PCT-Anmeldung PCT/US95/09058; angemeldet am 23.06.1995; offenbart wurde), fusioniert mit dem Amino-Terminus der Aminosäuren 12–149 von VEGI (SEQ ID NO: 9; das heißt der Aminosäuren 116–251 von VEGI-beta (SEQ ID NO: 27)), im Zusammenhang mit dem pC4-Säuger-Expressionsvektor enthält. Dieses Konstrukt ist pC4/CK-b8TNFg12/147 bezeichnet worden. Eine Variante dieses Konstrukts ist hergestellt worden, die verwendet werden kann, um die Aminosäuren 12–147 von VEGI, fusioniert mit der menschlichen IgG-Fc-Region am VEGI-Carboxy-Terminus, zu exprimieren. Dieses Fusionsprotein wird auch unter der Leitung des CK-β8-Signalpeptids sezerniert und ist pC4/CK-β8TNFg12/147/Fc bezeichnet worden. Die Sequenz des menschlichen Fc-Teils des Fusionsmoleküls ist in SEQ ID NO: 25 gezeigt. Andere Sequenzen, die Fachleuten bekannt sind, könnten verwendet werden.
Die Aminosäuren –3 bis 147 von VEGI (SEQ ID NO: 9; die den Aminosäureresten 102–251 von VEGI-beta (SEQ ID NO: 27) entsprechen) können von einem Baculovirus-System durch Verwenden eines Konstrukts, bezeichnet pA2GPTNFg-3/147 exprimiert und sezerniert werden. Dieses Expressionskonstrukt codiert die reife VEGI-codierende Sequenz, an seinem Amino-Terminus fusioniert an das baculovirale GP-Signalpeptid.
Zwei retrovirale VEGI-Expressionskonstrukte sind auch hergestellt worden. Das erste davon ist pG1SamEN/TNFg-3/149 bezeichnet worden. Dieses Expressionskonstrukt kann verwendet werden, um das Volllängen-VEGI-Polypeptid von einem Säugersystem zu produzieren. Ein verwandtes Konstrukt, pG1SamEN/CK-β8TNFg12/149, ist hergestellt worden, das verwendet werden kann, um reifes VEGI-Polypeptid von einem Säugersystem unter der Leitung des CK-β8-Signalpeptids zu produzieren und zu sezernieren.
Weitere hierin beschriebene Polypeptide schließen Polypeptide ein, die mindestens 90% Ähnlichkeit, bevorzugter mindestens 95% Ähnlichkeit und noch mehr bevorzugt mindestens 96%, 97%, 98% oder 99% Ähnlichkeit zu jenen, die oben beschrieben sind, haben. Die in der Erfindung beschriebenen Polypeptide umfassen auch jene, die mindestens 80% identisch, bevorzugter mindestens 90% oder 95% identisch, noch mehr bevorzugt mindestens 96%, 97%, 98% oder 99% identisch mit dem Polypeptid, das durch die hinterlegte cDNA codiert wird, oder dem Polypeptid von SEQ ID NO: 9 sind, und schließen auch Teile solcher Polypeptide mit mindestens 30 Aminosäuren und bevorzugter mindestens 50 Aminosäuren ein.
Verfahren zum Herstellen der oben beschriebenen Rekombinante oder des Fusionsproteins sind auf dem Fachgebiet bekannt (Siehe z. B. Maniatis, Fitsch und Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982) oder DNA Cloning, Bände I und II (D. N. Glover Hrsg. (1985) für allgemeine Clonierungsverfahren) und schließen das Kultivieren von Wirtszellen, die stabil mit einem Expressionsvektor transformiert sind, der ein DNA-Fragment enthält, das ein Polypeptid codiert, wie in der vorliegenden Erfindung beschrieben, unter solchen Bedingungen ein, dass das DNA-Fragment exprimiert wird und die Rekombinante oder das Fusionsprotein produziert wird. Zusätzlich kann das Protein oder das Polynucleotid an andere oder Polypeptide fusioniert werden, die seine Funktion erhöhen oder seine Lokalisation in der Zelle beschreiben, wie eine Sekretionssequenz, wie in den Beispielen 1–3 dargelegt. Die Rekombinante oder das Fusionsprotein können durch Verfahren isoliert werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. Die transformierten Wirtszellen können verwendet werden, um die Wirksamkeit von Arzneistoffen oder Agenzien zu analysieren, die die VEGI-Funktion inhibieren oder aktivieren, wie Wirtsproteine oder chemisch abgeleitete Agenzien oder andere Proteine, die mit den VEGI-Polynucleotiden interagieren können, um die Expression des VEGI-Polypeptids hinunterzuregulieren oder zu verändern, oder ihre Fähigkeit, die Angiogenese zu hemmen, beeinflussen. Ein Verfahren für das Testen der Wirksamkeit eines anti-VEGI- oder anti-Angiogenese-Arzneistoffs oder Agens kann zum Beispiel die Blockade der Endothelzell-Wachstums-hemmenden Aktivität von VEGI sein. Das heißt, das Vorliegen von solch einem anti-VEGI-Agens würde zu einer niedrigeren Fähigkeit von VEGI führen, das Endothelzell-Wachstum zu hemmen. Als ein Ergebnis wird mehr VEGI benötigt werden, um eine vergleichbare Hemmung, die in der Abwesenheit des anti-VEGI-Agens beobachtet wird, zu erzielen. Andererseits kann das Vorliegen eines anti-angiogenen Agens die Fähigkeit von VEGI, das Endothelzell-Wachstum zu hemmen, steigern oder synergistisch dazu wirken. Folglich werden niedrigere Konzentrationen von VEGI benötigt werden, um eine ähnliche Hemmung, die in der Abwesenheit des Agens beobachtet wird, zu erreichen.
Polypeptide und Fragmente
Die vorliegende Erfindung beschreibt weiterhin ein isoliertes VEGI-Polypeptid, das die abgeleitete Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 9 hat oder das die Aminosäuresequenz, die durch die hinterlegte cDNA HUVE091 codiert wird, hat, sowie Fragmente, Analoge und Derivate eines solchen Polypeptids.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch ein VEGI-beta-Polypeptid, das die abgeleitete Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 27 hat oder das die Aminosäuresequenz hat, die durch die hinterlegte cDNA HEMCZ56 codiert wird, sowie Fragmente, Analoge und Derivate eines solchen Polypeptids.
Die beschriebenen Polypeptide und Polynucleotide werden vorzugsweise in einer isolierten Form geliefert und sind vorzugsweise zu einem Punkt im Bereich nahe der vollständigen (z. B. > 90% rein) oder der vollständigen (z. B. > 99% rein) Homogenität gereinigt. Der Begriff „isoliert" bedeutet, dass das Material von seiner ursprünglichen Umgebung (z. B. der natürlichen Umgebung, wenn es natürlich vorkommend ist) entfernt wird. Zum Beispiel ist ein natürlich vorkommendes Polynucleotid oder Polpeptid, das in einem lebenden Tier vorliegt, nicht isoliert, aber dasselbe Polynucleotid oder Polypeptid, das von manchen oder allen der zusammen vorliegenden Materialien im natürlichen System separiert ist, isoliert. Polypeptide, die teilweise oder wesentlich von einer rekombinanten Wirtszelle gereinigt worden sind, sind auch als ein „isoliertes Polypeptid" vorgesehen. Zum Beispiel kann eine rekombinant produzierte Version eines VEGI-Polypeptids durch das Einschritt-Verfahren, beschrieben von Smith und Johnson (Gene 67: 31–40 (1988)), wesentlich gereinigt werden. Solche Polynucleotide könnten Teil eines Vektors sein, und/oder solche Polynucleotide oder Polypeptide könnten Teil einer Zusammensetzung sein und trotzdem isoliert sein, da solch ein Vektor oder eine Zusammensetzung nicht Teil seiner natürlichen Umgebung ist. Isolierte Polypeptide und Polynucleotide, wie in der vorliegenden Erfindung beschrieben, schließen auch solche Moleküle ein, die natürlich oder synthetisch produziert werden. Polypeptide und Polynucleotide, wie in der Erfindung beschrieben, können auch von natürlichen oder rekombinanten Quellen unter Verwendung von anti-VEGI-Antikörpern, wie in der Erfindung beschrieben, in Verfahren, die auf dem Fachgebiet der Proteinreinigung wohlbekannt sind, gereinigt werden.
Die Begriffe „Fragment", „Derivat" und „Analog", wenn sie sich auf die Polypeptide von SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 27 und jene Polypeptide, die durch die hinterlegten cDNAs codiert werden, beziehen, bedeuten ein Polypeptid, das eine funktionelle VEGI-Aktivität bewahrt, d. h. eine oder mehrere funktionelle Aktivitäten zeigt, die mit einem Volllängen- und/oder reifen VEGI-Polypeptid, das in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 27 offenbart ist, und/oder durch einen oder beide der hinterlegten Clone (HUVE091 und HEMCZ56) codiert wird, assoziiert sind (ist). Als ein Beispiel können solche Fragmente, Derivate oder Analoge, die die erwünschte Immunogenität oder Antigenität haben, zum Beispiel in Immuntests, für eine Immunisierung, für die Hemmung der VEGI-Aktivität usw. verwendet werden. Daher ist im Besonderen ein VEGI-Fragment beschrieben, das durch einen Antikörper gebunden werden kann, der spezifisch die VEGI-Polypeptidsequenz bindet, die in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 27 offenbart ist und/oder die durch einen oder beide der hinterlegten Clone (HUVE091 und HEMCZ56) codiert wird.
Als ein anderes Beispiel werden VEGI-Fragmente, -Derivate oder -Analoge beschrieben, die eine biologische VEGI-Aktivität (z. B. ein reifes VEGI-Polypeptid oder die extrazelluläre Domäne eines VEGI-beta-Polypeptids) haben. VEGI-Fragmente, -Derivate und -Analoge, die eine erwünschte VEGI-Eigenschaft von Interesse (z. B. die Inhibierung der Zellproliferation, Tumorinhibierung, Inhibierung der Angiogenese, anti-Arthritis durch die Inhibierung der Angiogenese und/oder der Endothelzell-Proliferation, die mit einem einwandernden Pannus im Knochen und Knorpel assoziiert ist, ein Induktor von
und c-Jun-Kinase (JNK), ein Induktor der Zelladhäsion und als ein Induktor der Apoptose) bewahren oder denen sie alternativ fehlen, können als Induktor beziehungsweise Inhibitoren von solchen Eigenschaften und ihrer physiologischen Begleiterscheinungen verwendet werden.
Die Polypeptide, wie in der Erfindung beschrieben, können als ein Membran-gebundener Rezeptor vorliegen, der eine Transmembran-Region und eine intra- und extrazelluläre Region hat, oder sie können in löslicher Form vorliegen, in der die Transmembran-Domäne fehlt. Ein Beispiel einer solchen Form von VEGI ist die VEGI-beta-Polypeptidsequenz, die in SEQ ID NO: 27 gezeigt ist, die eine Transmembran-, intrazelluläre- und extrazelluläre Domäne enthält.
Es wird auf dem Fachgebiet anerkannt werden, dass manche Aminosäuresequenzen des VEGI-Polypeptids ohne signifikante Wirkung der Struktur oder Funktion des Proteins variiert werden können. Wenn solche Unterschiede in der Sequenz in Betracht gezogen werden, sollte man sich erinnern, dass es kritische Bereiche auf dem Protein geben wird, die die Aktivität bestimmen. Daher zieht die Erfindung weiterhin in Betracht, Variationen des VEGI-Polypeptids zu Verwenden, die eine wesentliche VEGI-Polypeptid-Aktivität zeigen oder die Regionen von VEGI wie die hierin offenbarten Polypeptidfragmente einschließen. Solche Variante schließen Deletionen, Insertionen, Inversionen, Wiederholungen und Typ-Substitutionen ein, die gemäß den allgemeinen Regeln, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, so ausgewählt werden, dass sie eine geringe Wirkung auf die Aktivität haben. Zum Beispiel wird eine Richtlinie geliefert, wie man phenotypisch stille Aminosäure-Substitutionen macht, in denen die Autoren darauf hinweisen, dass es zwei Haupt-Ansätze für das Untersuchen der Toleranz einer Aminosäuresequenz gegenüber einer Änderung gibt (Bowie et al., Science 247: 1306–1310 (1990)). Das erste Verfahren ist auf den Vorgang der Evolution angewiesen, in der Mutationen durch natürliche Selektion entweder angenommen oder abgestoßen werden. Der zweite Ansatz verwendet die Genmanipulation, um Aminosäureänderungen an spezifischen Positionen eines clonierten Gens einzubringen, und Selektionen oder Screening-Verfahren, um Sequenzen zu identifizieren, die die Funktionalität bewahren. Wie die Autoren angeben, haben diese Untersuchungen offenbart, dass Proteine überraschend tolerant gegenüber Aminosäure-Substitutionen sind. Die Autoren geben weiterhin an, welche Aminosäure-Änderungen wahrscheinlich an einer bestimmten Position des Proteins toleriert werden. Zum Beispiel erfordern die meisten verdeckten Aminosäurereste nicht-polare Seitenketten, wohingegen wenige Eigenschaften der Oberflächen-Seitenketten allgemein konserviert sind. Andere solche phenotypisch stille Substitutionen werden von Bowie und Mitarbeitern (vorstehend) und den darin zitierten Bezugnahmen beschrieben. Als konservative Substitutionen werden typischerweise der Austausch von einem durch ein anderes unter den aliphatischen Aminosäuren Ala, Val, Leu und Ile; Austausch der Hydroxylreste Ser und Thr, Austausch der sauren Reste Asp und Glu, Substitutionen zwischen den Amid-Resten Asn und Gin, Austausch der basischen Reste Lys und Arg und ein Austausch unter den aromatischen Resten Phe, Tyr gesehen.
Daher können das Fragment, Derivat oder Analog des Polypeptids von SEQ ID NO: 9 oder von SEQ ID NO: 27 oder jene, die durch die hinterlegten cDNAs codiert werden, (i) eines, in dem einer oder mehrere der Aminosäurereste mit einem konservierten oder nicht-konservierten Aminosäurerest (vorzugsweise einem konservierten Aminosäurerest) substituiert sind (ist), und solch ein substituierter Aminosäurerest kann oder kann nicht einer sein, der durch den genetischen Code codiert wird, oder (ii) eines, in dem einer oder mehrere der Aminosäurereste eine Substituent-Gruppe einschließt, oder (iii) eines, in dem die reife Form des VEGI-Polypeptids mit einer anderen Verbindung wie einer Verbindung, um die Halbwertszeit des Polypeptids zu verlängern (z. B. Polyethylenglycol), fusioniert ist, oder (iv) eines, in dem die zusätzlichen Aminosäuren an die obige Form des Polypeptids wie ein IgG-Fc-Fusionsregion-Peptid oder eine Führungs- oder sekretorische Sequenz oder eine Sequenz, die für die Reinigung der obigen Form des Polypeptids angewendet wird, oder eine Pro-Proteinsequenz fusioniert sind, sein. Solche Fragmente, Derivate und Analoge werden aus den Lehren hierin als im Rahmen von Fachleuten angesehen.

Daher kann das VEGI, wie in der vorliegenden Erfindung beschrieben, eine oder mehrere Aminosäure-Substitution(en), -Deletion(en) oder -Addition(en) entweder von natürlichen Mutationen oder menschlicher Manipulation einschließen. Wie angezeigt, sind Änderungen vorzugsweise von unwichtiger Art wie konservative Aminosäure-Substitutionen, die die Faltung oder Aktivität des Proteins nicht signifikant beeinflussen (siehe Tabelle 1). TABELLE 1. Konservative Aminosäure-Substitutionen.

Aromatisch	Phenylalanin Tryptophan Tyrosin
Hydrophob	Leucin Isoleucin Valin
Polar	Glutamin Asparagin
Basisch	Arginin Lysin Histidin
Sauer	Asparaginsäure Glutaminsäure
Klein	Alanin Serin Threonin Methionin Glycin

Die Erfindung zieht auch die Verwendung von Polypeptiden in Betracht, die die Aminosäuresequenz eines hierin beschriebenen VEGI-Polypeptids umfassen, aber eine Aminosäure haben, die mindestens eine konservative Aminosäure-Substitution aber nicht mehr als 50 konservative Aminosäure-Substitutionen, noch mehr bevorzugt nicht mehr als 40 konservative Aminosäure-Substitutionen, noch bevorzugter nicht mehr als 30 konservative Aminosäuresubstitutionen und sogar noch mehr bevorzugt nicht mehr als 20 konservative Aminosäure-Substitutionen im Vergleich zu der hierin beschriebenen VEGI-Polynucleotidsequenz enthält. Natürlich ist es in der Reihenfolge des ständig steigenden Vorzugs höchst bevorzugt, dass ein Peptid oder Polypeptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die die Aminosäuresequenz eines VEGI-Polypeptids umfasst, die mindestens eine aber nicht mehr als 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 oder 1 konservative Aminosäure-Substitution(en) enthält.
In weiteren spezifischen Ausführungsformen ist die Zahl der Substitutionen, Additionen oder Deletionen in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 27 einer Polypeptidsequenz, die durch die hinterlegten Clone codiert wird, und/oder eines der hierin beschriebenen Polypeptid-Fragmente (z. B. der extrazellulären Domäne oder intrazellulären Domäne) 75, 70, 60, 50, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 oder 150-50, 100-50, 50-20, 30-20, 20-15, 20-10, 15-10, 10-1, 5-10, 1-5, 1-3 oder 1-2.
Um die Charakteristika von VEGI-Polypeptiden zu verbessern oder zu ändern, kann eine Protein-Konstruktion angewendet werden. Die rekombinante DNA-Technologie, die Fachleuten bekannt ist, kann verwendet werden, um neue mutante Proteine oder Muteine zu bilden, einschließlich einzelner oder mehrerer Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen, -Additionen oder Fusionsproteine. Solche modifizierten Proteine können z. B. eine verstärkte Aktivität oder eine erhöhte Stabilität zeigen. Zusätzlich können sie zu höheren Erträgen gereinigt werden und eine bessere Löslichkeit als das entsprechende natürliche Polypeptid, zumindest unter bestimmten Reinigungs- und Lagerungsbedingungen zeigen.
Daher zieht die Erfindung auch VEGI-Derivate und -Analoge in Betracht, in denen ein oder mehrere Aminosäurerest(e) deletiert, zugefügt oder substituiert sind (ist), um VEGI-Polypeptide herzustellen, die für die Expression, das Vergrößern usw. in den ausgewählten Wirtszellen besser geeignet sind. Zum Beispiel können Cystein-Reste deletiert oder mit einem anderen Aminosäurerest substituiert werden, um Disulfidbrücken zu eliminieren; N-verknüpfte Glycosylierungsstellen können verändert oder eliminiert werden, um zum Beispiel die Expression eines homogenen Produkts zu erreichen, das leichter von Hefewirten, von denen bekannt ist, dass sie N-verknüpfte Stellen hyperglycosylieren, gewonnen und gereinigt wird. Bis jetzt wird eine Vielfalt von Aminosäure-Substitutionen an einer oder beiden der ersten oder dritten Aminosäure-Positionen auf irgendeiner oder mehreren der Glycosylierungs- Erkennungssequenzen in den VEGI-Polypeptiden, wie in der Erfindung beschrieben, und/oder eine Aminosäure-Deletion an der zweiten Position von irgendeiner oder mehreren solchen Erkennungssequenz(en) die Glycosylierung des VEGI-Polypeptids an der modifizierten Tripeptid-Sequenz verhindern (siehe z. B. Miyajimo et al., EMBO J 5(6): 1193–1197).
Aminosäuren in den in der vorliegenden Erfindung beschriebenen VEGI-Polypeptiden, die für die Funktion wesentlich sind, können durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren wie ortsgerichtete Mutagenese oder Alanin-Scanning-Mutagenese (Cunningham und Wells, Science 244: 1081–1085 (1989)) identifiziert werden. Das letztere Vorgehen bringt Einzel-Alanin-Mutationen an jedem Rest im Molekül ein. Die resultierenden mutanten Moleküle werden dann auf eine biologische Aktivität wie Rezeptorbindung oder in vitro-proliferative Aktivität getestet.
Von besonderem Interesse sind Substitutionen von geladenen Aminosäuren mit anderen geladenen oder neutralen Aminosäuren, die Proteine mit höchst wünschenswerten verbesserten Charakteristika wie einer geringeren Aggregation produzieren können. Die Aggregation kann nicht nur die Aktivität reduzieren sondern auch problematisch sein, wenn Arzneimittel hergestellt werden, weil Aggregate immunogen sein können (Pinckard, et al., Clin. Exp. Immunol. 2: 331–340 (1967); Robbins, et al., Diabetes 36: 838–845 (1987); Cleland, et al., Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10: 307–377 (1993)).
Da VEGI ein Mitglied der TNF-verwandten Proteinfamilie ist, werden, vielmehr um die biologischen Aktivitäten von VEGI zu modulieren als sie zu vollständig eliminieren, vorzugsweise Additionen, Substitutionen oder Deletionen in den Sequenzen gemacht, die die Aminosäuren in der konservierten TNF-ähnlichen Domäne codieren, d. h. in den Positionen 17–147 von SEQ ID NO: 9 oder den Positionen 121–251 der SEQ ID NO: 27, bevorzugter in den Resten in dieser Region, die nicht in allen Mitgliedern der VEGI-verwandten Polypeptid-Familie konserviert sind. Die vorliegende Erfindung zieht auch Polynucleotide in Betracht, die Nucleinsäuresequenzen umfassen, die die obigen VEGI-Varianten codieren.
Einige Aminosäuren des VEGI-Polypeptids sind quer durch die bekannten Mitglieder der TNF-verwandten Proteinfamilie hoch-konserviert. Durch das Einbringen einer spezifischen Mutation in VEGI in solche Reste sie Tyrosin-15 (wie in SEQ ID NO: 9 nummeriert), Leucin-35, Glycin-41, Tyrosin-43, Tyrosin-46, Glutamin- 48, Leucin-90, Leucin-116, Glycin-119, Asparaginsäure-120, Phenylalanin-141, Phenylalanin-142 und Leucin 147 ist es wahrscheinlich, dass eine merkliche Wirkung auf die biologische Aktivität beobachtet werden wird. Diese identischen Aminosäurereste sind natürlich in den entsprechenden Positionen von VEGI-beta, das in SEQ ID NO: 27 gezeigt ist, vorhanden.
Die vorliegende Erfindung zieht auch Fragmente der oben beschriebenen VEGI-Polypeptide in Betracht. Polypeptidfragmente, die in der vorliegenden Erfindung beschrieben sind, schließen Polypeptide ein, umfassend eine Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 9 enthalten ist, durch die cDNA codiert wird, die im hinterlegten Clon (HUVEO91) enthalten ist, oder durch Nucleinsäuren codiert wird, die (z. B. unter stringenten Hybridisierungsbedingungen) an die Nucleotidsequenz, die in den hinterlegten Clonen enthalten ist, die in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8 und/oder SEQ ID NO: 26 offenbart werden, oder den komplementären Strang dazu hybridisieren.
Polypeptidfragmente können „freistehend" oder in einem größeren Polypeptid umfasst sein, von dem das Fragment einen Teil oder eine Region, am meisten bevorzugt als eine einzelne fortlaufende Region bildet. Repräsentative Beispiele von Polypeptidfragmenten, die im Zusammenhang mit der Erfindung in Betracht gezogen werden, schließen zum Beispiel Fragmente ein, die etwa Aminosäurereste 1 bis 20, 21 bis 40, 41 bis 60, 61 bis 83, 84 bis 100, 101 bis 120, 121 bis 140, 141 bis 160, 160 bis 167, 161 bis 174, 161 bis 180, 181 bis 200, 201 bis 220, 221 bis 240, 241 bis 251 von SEQ ID NO: 9 und/oder SEQ ID NO: 27 umfassen oder alternativ daraus bestehen. Darüber hinaus können Polypeptidfragmente mindestens etwa 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 oder 150 Aminosäuren lang sein. In diesem Zusammenhang schließt „etwa" die besonders angeführten Bereiche, durch einige (d. h. 5, 4, 3, 2 oder 1) Aminosäuren größer oder kleiner, bei einem Extrem oder bei beiden Extremen ein.
In anderen Ausführungsformen sind die Fragmente oder Polypeptide, die im Zusammenhang mit der Erfindung in Betracht gezogen werden (d. h. jene, die hierin beschrieben sind), nicht mehr als 250, 225, 200, 185, 175, 170, 165, 160, 155, 150, 145, 140, 135, 130, 125, 120, 115, 110, 105, 100, 90, 80, 75, 60, 50, 40, 30 oder 25 Aminosäurereste lang.
Die Polypeptidfragmente, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung vorzugsweise Anwendung finden, umfassen die reife Domäne von VEGI (Aminosäurereste 1–147 von SEQ ID NO: 9), die intrazelluläre Domäne von VEGI-beta (Aminosäurereste 1–35 von SEQ ID NO: 27), die Transmembran-Domäne von VEGI-beta (Aminosäurereste 36–61 von SEQ ID NO: 27) und/oder die extrazelluläre Domäne von VEGI-beta (Aminosäurereste 62–251 von SEQ ID NO: 27), oder sie bestehen alternativ daraus.
In spezifischen Ausführungsformen umfassen Polypeptidfragmente, die im Zusammenhang der Erfindung in Betracht gezogen werden die Aminosäurereste Leucin-35 bis Valin-49, Tryptophan-104 bis Leucin-116, Glycin-119 bis Serin-127, Lysin-139 bis Leucin-147 von SEQ ID NO: 9, oder sie bestehen alternativ daraus. Diese Domänen sind Regionen von hoher Identität, die durch Vergleich der VEGI-Familienmitglieder-Polypeptide identifiziert wurde.
Unter den Fragmenten, die im Zusammenhang der Erfindung besonders bevorzugt sind, sind Fragmente, die durch strukturelle oder funktionelle Eigenschaften von VEGI charakterisiert sind. Solche Fragmente schließen Aminosäurereste, die alpha-Helix- und alpha-Helix-bildende Regionen („alpha-Regionen"), beta-Faltblatt- und beta-Faltblatt-bildende Regionen („beta-Regionen"), Kurven- und Kurven-bildende Regionen („Kurven-Regionen"), Spiralen- und Spiralen-bildende Regionen („Spiralen-Regionen), hydrophile Regionen, hydrophobe Regionen, alpha-amphipathische Regionen, beta-amphipathische Regionen, Oberflächen-bildende Regionen und Regionen mit einem hohen antigenen Index (d. h. Regionen von Polypeptiden, die aus Aminosäureresten bestehen, die einen antigenen Index von größer oder gleich 1,5 haben, identifiziert unter Verwendung der Standardparameter des Jameson-Wolf-Programms) von VEGI umfassen, ein. Bestimmte bevorzugte Regionen sind jene, die in 7 offenbart sind, und schließen Regionen der vorher erwähnten Typen, die durch Analyse der Aminosäuresequenz identifiziert wurden, die in den 5A, 5B und 5C und SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 9 gezeigt ist, ein, sind aber nicht darauf limitiert, solche bevorzugten Regionen schließen ein; Garnier-Robson-vorhergesagte alpha-Regionen, beta-Regionen, Kurven-Regionen und Spiralen-Regionen; Chou-Fasman-vorhergesagte alpha-Regionen, beta-Regionen, Kurven-Regionen und Spiralen-Regionen; Kyte-Doolittle-verhergesagte hydrophile und hydrophobe Regionen; Eisenberg-alpha- und -beta-amphipathische Regionen; Emini-Oberflächen-bildende Regionen; und Jameson-Wolf Regionen mit einem hohen antigenen Index, wie unter Verwendung der Standardparameter dieses Computerprogramms vorhergesagt. Polynucleotide, die diese Polypeptide codieren, werden auch in Betracht gezogen, dass sie im Zusammenhang der Erfindung Anwendung finden.
Zusätzlich schließen Analoge des beschriebenen Proteins ein Pro-Protein ein, das durch Spaltung des Pro-Protein-Teils aktiviert werden kann, um ein aktives reifes Polypeptid zu produzieren.
Die Erfindung zieht auch ein VEGI-Polypeptid (z. B. Fragment) in Betracht, umfassend oder alternativ bestehend aus ein(em) Epitop-tragenden Teil eines Polypeptids, wie in der Erfindung beschrieben. Das Epitop dieses Polypeptidteils ist ein immunogenes oder antigenes Epitop eines Polypeptids, wie in der Erfindung beschrieben. Ein „immunogenes Epitop" wird als ein Teil eines Proteins definiert, der eine Antikörperantwort hervorruft, wenn das ganze Protein das Immunogen ist. Auf der anderen Seite wird eine Region eines Proteinmoleküls, an die ein Antikörper binden kann, als ein „antigenes Epitop" definiert. Die Zahl der immunogenen Epitope eines Proteins ist im Allgemeinen weniger als die Zahl der antigenen Epitope (siehe zum Beispiel Geysen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998–4002 (1983)).
Über die Selektion von Peptiden oder Polypeptiden, die ein antigenes Epitop tragen (d. h. die eine Region eines Proteinmoleküls enthalten, an das ein Antikörper binden kann), ist auf dem Fachgebiet wohlbekannt, dass relativ kurze synthetische Peptide, die einen Teil einer Proteinsequenz imitieren, routinemäßig zum Hervorrufen eines Antiserums in der Lage sind, das mit dem teilweise imitierten Protein reagiert (siehe zum Beispiel Sutcliffe, J. G., et al., Science 219: 660–666 (1983)). Peptide, die zum Hervorrufen von Protein-reaktiven Seren in der Lage sind, werden häufig in der Primärsequenz eines Proteins repräsentiert, können durch einen Satz von einfachen chemischen Regeln charakterisiert werden und sind weder auf immundominante Regionen von intakten Proteinen (d. h. immunogene Epitope) noch auf die Amino- oder Carboxyl-Termini beschränkt. Ein antigenes Epitop-tragende Peptide und Polypeptide, wie in der Erfindung beschrieben, sind daher nützlich, um Antikörper, einschließlich monoclonaler Antikörper, die spezifisch an ein beschriebenes Polypeptid binden, zu züchten (siehe zum Beispiel Wilson et al., Cell 37: 767–778 (1984)).
Ein antigenes Epitop-tragende Peptide und Polypeptide, wie in der Erfindung beschrieben, enthalten vorzugsweise eine Sequenz von mindestens sieben, bevorzugter mindestens neun und am meisten bevorzugt zwischen etwa 15 und etwa 30 Aminosäuren, die in der Aminosäuresequenz eines Polypeptids, wie in der Erfindung beschrieben, enthalten sind. Nicht-limitierende Beispiele von antigenen Polypeptiden oder Peptiden, die verwendet werden können, um VEGI-spezifische Antikörper herzustellen, schließen ein: ein Polypeptid, umfassend die Aminosäurereste von etwa Thr-24 bis etwa Asn-32 in SEQ ID NO: 9; ein Polypeptid, umfassend die Aminosäurereste von etwa Ile-37 bis etwa Ile-45 in SEQ ID NO: 9; ein Polypeptid, umfassend die Aminosäurereste von etwa Met-54 bis etwa Arg-62 in SEQ ID NO: 9; ein Polypeptid, umfassend die Aminosäurereste von etwa Gln-63 bis etwa Asp-71 in SEQ ID NO: 9; ein Polypeptid, umfassend die Aminosäurereste von etwa Glu-57 bis etwa Gly-65 in SEQ ID NO: 9; ein Polypeptid, umfassend die Aminosäurereste von etwa Val-80 bis etwa Thr-88 in SEQ ID NO: 9; ein Polypeptid, umfassend die Aminosäurereste von etwa Leu-116 bis etwa Val-124 in SEQ ID NO: 9; und ein Polypeptid, umfassend die Aminosäurereste von etwa Asp-133 bis etwa Phe-141 in SEQ ID NO: 9. Es ist durch die Analyse des Jameson-Wolf antigenen Index, wie oben in 7 gezeigt, bestimmt worden, dass diese Polypeptidfragmente antigene Epitope des VEGI-Polypeptids tragen.
Ein Fachmann kann leicht antigene Regionen für VEGI-beta durch Verwenden der Daten, die durch eine DNA*STAR-Analyse der VEGI-beta-Polypeptidsequenz (SEQ ID NO: 27) unter Verwendung der Standardparameter hergestellt wurden, und Selektieren der Regionen mit einem hohen antigenen Index, wie oben beschrieben, bestimmen.
Die Epitop-tragenden Peptide und Polypeptide werden durch jedes konventionelle Mittel produziert (siehe zum Beispiel Houghten, R. A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5131–5135 (1985); und U.S.-Patent Nr. 4,631,211 an Houghten, et al. (1986)).
Epitop-tragende Peptide und Polypeptide, wie in der Erfindung beschrieben, haben Verwendungen, die das Induzieren von Antikörpern gemäß Verfahren, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind (siehe zum Beispiel Sutcliffe, et al., vorstehend; Wilson, et al., vorstehend; Chow, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 910–914; und Bittle, F. J., et al., J. Gen. Virol. 66: 2347–2354 (1985)), einschließen, sind aber nicht darauf beschränkt. Immunogene Epitop-tragende Peptide, wie in der Erfindung beschrieben, d. h. jene Teile des Proteins, die eine Antikörperantwort hervorrufen, wenn das ganze Protein das Immunogen ist, werden gemäß Verfahren identifiziert, die auf dem Fachgebiet bekannt sind (siehe zum Beispiel Geysen, et al., vorstehend). Noch weiter beschreibt U.S.-Patent Nr. 5,194,392 , erteilt an Geysen, ein allgemeines Verfahren zum Nachweisen oder Bestimmen der Sequenz von Monomeren (Aminosäuren oder anderen Verbindungen), die ein topologisches Äquivalent des Epitops (d. h. ein „Mimotop") ist, das komplementär zu einem bestimmten Paratop (einer Antigen-bindenden Stelle) eines Antikörpers von Interesse ist. Allgemeiner beschreibt U.S.-Patent Nr. 4,433,092 , erteilt an Geysen, ein Verfahren zum Nachweisen oder Bestimmen einer Sequenz von Monomeren, die ein topographisches Äquivalent eines Liganden ist, der komplementär zu der Liganden-Bindungsstelle eines bestimmten Rezeptors von Interesse ist (z. B. DR3). In ähnlicher Weise offenbart U.S.-Patent Nr. 5,480,971 , erteilt an Houghten und Mitarbeiter, über peralkylierte Oligopeptid-Gemische lineare C1-C7-Alkyl-peralkylierte Oligopeptide und Sätze und Genbanken von solchen Peptiden sowie Verfahren für das Verwendung solcher Oligopeptid-Sätze und Genbanken für das Bestimmen der Sequenz eines peralkylierten Oligopeptids, das vorzugsweise an ein Akzeptormolekül von Interesse bindet. Daher können Nicht-Peptid-Analoge der Epitop-tragenden Peptide, wie in der Erfindung beschrieben, auch routinemäßig durch diese Verfahren gemacht werden.
Wie ein Fachmann anerkennen wird, können VEGI- und/oder VEGI-beta-Polypeptide und die oben beschriebenen Epitop-tragenden Fragmente davon mit Teilen der konstanten Domäne von Immunglobulinen (IgG) kombiniert werden, was in chimeren Polypeptiden resultiert. Diese Fusionsproteine ermöglichen die Reinigung und zeigen eine verlängerte Halbwertszeit in vivo. Dies ist z. B. für chimere Proteine gezeigt worden, die aus den ersten zwei Domänen des menschlichen CD4-Polypeptids und verschiedenen Domänen der konstanten Regionen der schweren oder leichten Ketten von Säuger-Immunglobulinen bestehen ( EP A 394,827 ; Traunecker, et al., Nature 331: 84–86 (1988)). Fusionsproteine, die aufgrund des IgG-Teils eine Disulfid-verknüpfte dimere Struktur aufweisen, können auch wirksamer im Binden und Neutralisieren von anderen Molekülen als das monomere VEGI-Polypeptid oder das Proteinfragment alleine sein (Fountoulakis, et al., J. Biochem. 270: 3958–3964 (1995)). Als ein Beispiel ist hierin eine solche VEGI-Fc-Fusion produziert worden, wie oben beschrieben.
Fragmente (d. h. Teile) der oben beschriebenen VEGI-Polypeptide haben Verwendungen, die Zwischenstufen für das Produzieren von Volllängen-Polypeptiden einschließen, sind aber nicht darauf beschränkt.
Für viele Proteine, einschließlich der extrazellulären Domäne eines Membran-assoziierten Proteins oder der reifen Form(en) eines sezernierten Proteins, ist auf dem Fachgebiet bekannt, dass eine oder mehrere Aminosäure(n) vom N-Terminus oder C-Terminus ohne wesentlichen Verlust der biologischen Funktion deletiert werden können. Zum Beispiel berichteten Ron und Mitarbeiter (J. Biol. Chem., 268: 2984–2988 (1993)) modifizierte KGF-Proteine, die eine Heparin-Bindungsaktivität hatten, sogar wenn 3, 8 oder 27 N-terminale Aminosäurereste fehlten. Weiterhin haben einige Forscher von TNF-α-Muteinen berichtet, in denen zwei, vier oder sieben N-terminale Aminosäuren entfernt worden sind, was einen 2- bis 3-fachen Anstieg in der funktionellen Aktivität im Vergleich zum natürlich vorkommenden TNF-α-Polypeptid zeigte (Creasey, A. A., et al., Cancer Res. 47: 145–149 (1987); Sidhu, R. S. und Bollon, A. P. Anticancer Res. 9: 1569–1576 (1989); Kamijo, R., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 160: 820–827 (1989)). Weiterhin können noch andere funktionelle VEGI-Aktivitäten bewahrt werden, sogar wenn die Deletion von einer oder mehreren Aminosäure(n) vom N-Terminus oder C-Terminus eines Proteins in einer Modifizierung oder einem Verlust von einer oder mehreren biologischen Funktion(en) des Proteins resultiert.
Im vorliegenden Fall, da die in der Erfindung beschriebenen Proteine Mitglieder der TNF-Polypeptid-Familie sind, können Deletionen von N-terminalen Aminosäuren bis zum Leucin-Rest bei Position 35 von SEQ ID NO: 9 (der genau dem Leucin-Rest an Position 134 von SEQ ID NO: 27 entspricht) eine gewisse biologische Aktivität wie die Regulation von Wachstum und Differenzierung von vielen Typen von hämatopoietischen und endothelialen Zellen bewahren. Es würde nicht erwartet werden, dass Polypeptide, die weitere N-terminale Deletionen aufweisen, einschließlich des Leucin-36-Restes in SEQ ID NO: 9 (entsprechend dem Leucin-135 in SEQ ID NO: 27), solche biologischen Aktivitäten bewahren, weil bekannt ist, dass dieser Rest in TNF-verwandten Polypeptiden der Beginn der konservierten Domäne ist, die für biologische Aktivitäten erforderlich ist.
Sogar wenn die Deletion von einer oder mehreren Aminosäure(n) vom N-Terminus eines Volllängen-VEGI-Polypeptids in einer Modifizierung oder dem Verlust von einer oder mehreren biologischen Funktion(en) des Polypeptids resultiert, können dennoch andere biologische Aktivitäten noch bewahrt sein. Daher wird die Fähigkeit des verkürzten Polypeptids, Antikörper, die die Volllängen- oder reife Form des Polypeptids erkennen, zu induzieren und/oder daran zu binden, im Allgemeinen bewahrt werden, wenn weniger als die Mehrzahl der Reste des Volllängen- oder reifen Polypeptids vom N-Terminus entfernt werden. Ob ein bestimmtes Polypeptid, dem N-terminale Reste eines vollständigen Polypeptids fehlen, solche immunogenen Aktivitäten bewahrt, kann leicht durch Routineverfahren, die hierin beschrieben oder anderweitig auf dem Fachgebiet bekannt sind, bestimmt werden.
Dementsprechend zieht die vorliegende Erfindung weiterhin die Verwendung von Polypeptiden, von denen ein oder mehrere Rest(e) vom Amino-Terminus der in SEQ ID NO: 9 offenbarten Aminosäuresequenz des VEGI bis zum Leucin-Rest an Position Nummer 35 deletiert sind, und von Polynucleotiden, die solche Polypeptide codieren, in Betracht. Insbesondere zieht die vorliegende Erfindung die Verwendung von Polypeptiden in Betracht, umfassend die Aminosäuresequenz der Reste n¹-149 von SEQ ID NO: 9, wobei n¹ eine Ganzzahl im Bereich von –27 bis 35 ist, und 35 ist die Position des ersten Rests des N-Terminus des vollständigen VEGI-Polypeptids (gezeigt in SEQ ID NO: 9), von dem angenommen wird, dass er für die Regulierung von Wachstum und Differenzierung von vielen Typen von hämatopoietischen Zellen und Endothelzellen benötigt wird.
In spezifischen Ausführungsformen zieht die Erfindung die Verwendung von Polynucleotiden in Betracht, die Polypeptide codieren, umfassend oder alternativ bestehend aus der (die) Aminosäuresequenz der Reste:
Polynucleotide, die diese Polypeptide codieren, werden auch in Betracht gezogen, dass sie im Zusammenhang der Erfindung Anwendung finden.
Dementsprechend beschreibt die vorliegende Erfindung weiterhin Polypeptide, von denen ein oder mehrere Rest(e) vom Amino-Terminus der Aminosäuresequenz des VEGI-beta, gezeigt in SEQ ID NO: 27, bis zum Leucin-Rest an Position Nummer 134 deletiert wurden, und Polynucleotide, die solche Polypeptide codieren. Insbesondere beschreibt die vorliegende Erfindung Polypeptide, umfassend die Aminosäuresequenz der Reste n²-251 von SEQ ID NO: 27, wobei n² eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 134 ist, und 135 die Position des ersten Rests vom N-Terminus des vollständigen VEGI-beta-Polypeptids (gezeigt in SEQ ID NO: 27) ist, von dem angenommen wird, dass er für die Regulierung der Aktivität des Wachstums und der Differenzierung von vielen Typen von hämatopoietischen Zellen und Endothelzellen des VEGI-beta-Polypeptids benötigt wird.
In spezifischen Ausführungsformen beschreibt die Erfindung Polynucleotide, die Polypeptide codieren, umfassend oder alternativ bestehend aus der (die) Aminosäuresequenz der Reste:
Die Polynucleotide, die diese Polypeptide codieren, werden auch in Betracht gezogen, dass sie im Zusammenhang der Erfindung Anwendung finden.
Wie oben erwähnt, können andere biologische Aktivitäten noch bewahrt sein, sogar, wenn die Deletion von einer oder mehreren Aminosäure(n) vom N-Terminus eines Polypeptids in einer Modifikation oder dem Verlust von einer oder mehreren biologischen Funktion(en) des Polypeptids resultiert. Daher wird die Fähigkeit des verkürzten VEGI-Muteins, Antikörper, die die Volllängen- oder reife Form des Polypeptids erkennen, zu induzieren oder an sie zu binden, im Allgemeinen bewahrt werden, wenn weniger als die Mehrzahl der Reste des Volllängen- oder reifen Polypeptids vom N-Terminus entfernt werden. Ob ein bestimmtes Polypeptid, dem N-terminale Reste eines vollständigen Proteins fehlen, solche immunologischen Aktivitäten bewahrt, kann leicht durch hierin beschriebene oder anderweitig auf dem Fachgebiet bekannte Routineverfahren bestimmt werden. Es ist nicht unwahrscheinlich, dass ein VEGI-Mutein mit einer großen Zahl von deletierten N-terminalen Aminosäureresten gewisse biologische oder immunogene Aktivitäten bewahren kann. In der Tat können Peptide, die aus so wenig wie sechs VEGI-Aminosäureresten zusammengesetzt sind, oft eine Immunantwort hervorrufen.
Dementsprechend beschreibt die vorliegende Erfindung weiterhin Polypeptide, von denen ein oder mehrere Rest(e) vom Amino-Terminus der vorhergesagten reifen Aminosäuresequenz des VEGI, offenbart in SEQ ID NO: 9, bis zum Phenylalanin-Rest an der Position Nummer 142 von SEQ ID NO: 9 deletiert wurden, und Polynucleotide, die solche Polypeptide codieren. Insbesondere beschreibt die vorliegende Erfindung Polypeptide, umfassend die Aminosäuresequenz der Reste n³-147 von SEQ ID NO: 9, wobei n³ eine Ganzzahl im Bereich von 1 bis 169 ist, und 170 ist die Position des ersten Rests des N-Terminus des vollständigen VEGI-Polypeptids, von dem angenommen wird, dass er für die geringste immunogene Aktivität des VEGI-Polypeptids benötigt wird.
Spezieller beschreibt die Erfindung Polynucleotide, die Polypeptide codieren, umfassend oder alternativ bestehend aus der (die) Aminosäuresequenz der Reste von

der VEGI-Sequenz, die in den 5A, 5B und 5C gezeigt ist (die VEGI-Aminosäuresequenz, die in den 5A, 5B und 5C gezeigt ist, ist identisch zu jener in SEQ ID NO: 9, dennoch unterscheidet sich das Nummerierungsschema zwischen den Zweien; die Nummerierung der obigen Aminosäurereste reflektiert in diesem Fall jene der 5A, 5B und 5C). Die Polynucleotide, die diese Polypeptide codieren, werden auch in Betracht gezogen, dass sie im Zusammenhang der Erfindung Anwendung finden.
Dementsprechend beschreibt die vorliegende Erfindung weiterhin Polypeptide, von denen ein oder mehrere Rest(e) vom Amino-Terminus der vorhergesagten reifen Aminosäuresequenz des VEGI-beta, gezeigt in SEQ ID NO: 27, bis zum Phenylalanin-Rest an der Position Nummer 246 deletiert wurden, und Polynucleotide, die solche Polypeptide codieren. Insbesondere beschreibt die vorliegende Erfindung Polypeptide, umfassend die Aminosäuresequenz der Reste n⁴-251 von SEQ ID NO: 27, wobei n⁴ eine Ganzzahl im Bereich von 2 bis 246 ist, und 247 ist die Position des ersten Rests des N-Terminus des vollständigen VEGI-beta-Polypeptids, von dem angenommen wird, dass er mindestens für die immunogene Aktivität des VEGI-beta-Proteins benötigt wird.
Spezieller beschreibt die Erfindung Polynucleotide, die Polypeptide codieren,umfassend oder alternativ bestehend aus der (die) Aminosäuresequenz der Reste von

der VEGI-beta-Sequenz, die in SEQ ID NO: 27 gezeigt ist. Polynucleotide, die diese Polypeptide codieren, werden auch in Betracht gezogen, dass sie im Zusammenhang der Erfindung Anwendung finden.
In ähnlicher Weise sind viele Beispiele von biologisch funktionellen C-terminalen Deletions-Muteinen bekannt. Zum Beispiel zeigt Interferon-gamma durch Deletieren von 8 bis 10 Aminosäureresten vom Carboxy-Terminus des Proteins bis zu 10-mal höhere Aktivitäten (Dobeli, et al., J. Biotechnology 7: 199–216 (1988)). Weiterhin haben einige Forscher von biologisch inaktiven TNF-α-Muteinen berichtet, in denen so wenig wie zwei Aminosäuren vom C-Terminus entfernt worden waren (Carlino, J. A., et al., J. Biol. Chem. 262: 958–961 (1987); Creasey, A. A., et al., Cancer Res. 47: 145–149 (1987); Sidhu, R. S. und Bollon, A. P. Anticancer Res. 9: 1569–1576 (1989); Gase, K., et al., Immunology 71: 368–371 (1990)).
Im vorliegenden Fall können, da die oben beschriebenen VEGI-Proteine Mitglieder der TNF-Polypeptid-Familie sind, Deletionen der C-terminalen Aminosäuren bis zum Leucin an Position 146 von SEQ ID NO: 9 (das dem Leucin an Position 250 der SEQ ID NO: 27 entspricht) eine gewisse biologische Aktivität wie die Regulierung von Wachstum und Differenzierung von vielen Typen von hämatopoietischen Zellen und Endothelzellen beibehalten. Es würde nicht erwartet werden, dass Polypeptide, die weitere C-terminale Deletionen, einschließlich des Leucin-Rests an Position 146 von SEQ ID NO: 9 (oder des Leucin-Rests an Position 250 von SEQ ID NO: 27) haben, solche biologischen Aktivitäten beibehalten, weil es bekannt ist, dass dieser Rest in TNF-verwandten Polypeptiden der Beginn der konservierten Domäne ist, der für biologische Aktivitäten benötigt wird.
Sogar wenn die Deletion von einer oder mehreren Aminosäure(n) vom C-Terminus eines Proteins in einer Modifizierung oder dem Verlust von einer oder mehreren biologischen Funktion(en) des Proteins resultiert, können dennoch andere biologische Aktivitäten noch bewahrt sein. Daher wird die Fähigkeit des verkürzten Proteins, Antikörper zu induzieren oder daran zu binden, die die vollständige oder reife Form des Proteins erkennen, im Allgemeinen bewahrt werden, wenn weniger als die Mehrzahl der Reste des vollständigen oder reifen Proteins vom C-Terminus entfernt werden. Ob ein bestimmtes Polypeptid, dem C-terminale Reste eines vollständigen Proteins fehlen, solche immunologischen Aktivitäten bewahrt, kann leicht durch Routineverfahren, die hierin beschrieben und anderweitig auf dem Fachgebiet bekannt sind, bestimmt werden.
In zusätzlichen Ausführungsformen beschreibt die vorliegende Erfindung Polypeptide, von denen ein oder mehrere Rest(e) vom Carboxy-Terminus der Aminosäuresequenz des VEGI-Polypeptids, gezeigt in SEQ ID NO: 9, bis zum Leucin-Rest an der Position 146 von SEQ ID NO: 9 deletiert wurde(n), und Polynucleotide, die solche Polypeptide codieren. Insbesondere beschreibt die vorliegende Erfindung Polypeptide, die die Aminosäuresequenz der Reste -27-m¹ der Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 9 haben, wobei m¹ eine Ganzzahl im Bereich von 146 bis 147 ist, und der Rest 146 ist die Position des ersten Rests des C-Terminus des vollständigen VEGI-Polypeptids (gezeigt in SEQ ID NO: 9), von dem angenommen wird, dass er für die Regulierung von Wachstum und Differenzierung von vielen Typen von hämatopoietischen Zellen und Endothelzellen durch das VEGI-Polypeptid benötigt wird.
Spezieller beschreibt die Erfindung Polynucleotide, die Polypeptide codieren, die die Aminosäuresequenz der Reste –27–146 und –27–147 von SEQ ID NO: 9 haben.
Die vorliegende Erfindung offenbart auch Polypeptide, von denen ein oder mehrere Rest(e) vom Carboxy-Terminus der Aminosäuresequenz des VEGI-beta, gezeigt in SEQ ID NO: 27, bis zum Leucin-Rest an der Position 250 von SEQ ID NO: 27 deletiert wurde(n), und Polynucleotide, die solche Polypeptide codieren. Insbesondere offenbart die vorliegende Erfindung Polypeptide, die die Aminosäuresequenz der Reste 1-m² der Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 27 haben, wobei m² jede Ganzzahl im Bereich von 250 bis 251 ist, und der Rest 249 ist die Position des ersten Rests des C-Terminus des vollständigen VEGI-beta-Polypeptids (gezeigt in SEQ ID NO: 27), von dem angenommen wird, dass er für die Regulierung von Wachstum und Differenzierung von vielen Typen von hämatopoietischen Zellen und Endothelzellen benötigt wird.
Spezieller werden Polynucleotide offenbart, die Polypeptide codieren, die die Aminosäuresequenz der Reste 1–250 und 1–251 der SEQ ID NO: 27 haben.
Darüber hinaus sind Polypeptidfragmente offenbart, umfassend oder alternativ bestehend aus eine(r) oder mehrere(n) Aminosäure(n), die von sowohl den Amino- als auch den Carboxy-Termini von VEGI-alpha deletiert wurde(n), die allgemein beschrieben werden können, dass sie die Reste n¹-m¹ von SEQ ID NO: 9 haben, wobei n und m Ganzzahlen, wie oben beschrieben, sind. Die Erfindung offenbart weiterhin Polypeptide, von denen eine oder mehrere Aminosäure(n) von sowohl den Amino- als auch den Carboxy-Termini von VEGI-beta deletiert wurden, die allgemein beschrieben werden können, dass sie die Reste n²-m² von SEQ ID NO: 27 haben, wobei n² und m² Ganzzahlen, wie oben beschrieben, sind.
Wie oben erwähnt, können, sogar wenn die Deletion von einer oder mehreren Aminosäure(n) vom C-Terminus eines Polypeptids in einer Modifizierung oder dem Verlust von einer oder mehreren biologischen Funktion(en) des Polypeptids resultiert, andere biologische Aktivitäten noch bewahrt sein. Daher wird die Fähigkeit des verkürzten VEGI-Muteins, Antikörper zu induzieren und/oder daran zu binden, die das Volllängen- oder reife Polypeptid erkennen, im Allgemeinen bewahrt werden, wenn weniger als die Mehrzahl der Reste des vollständigen oder reifen Polypeptids vom C-Terminus entfernt werden. Ob ein bestimmtes Polypeptid, dem C-terminale Reste eines Volllängen-Polypeptids fehlen, solche immunologischen Aktivitäten bewahrt, kann leicht durch Routineverfahren, die hierin beschrieben und anderweitig auf dem Fachgebiet bekannt sind, bestimmt werden. Es ist nicht unwahrscheinlich, dass ein VEGI-Mutein mit einer großen Zahl von deletierten C-terminalen Aminosäureresten gewisse biologische oder immunogene Aktivitäten beibehalten kann. In der Tat können Peptide, die aus so wenig wie sechs VEGI-Aminosäureresten zusammengesetzt sind, oft eine Immunantwort hervorrufen.
Darüber hinaus werden Polypeptide, von denen ein oder mehrere Rest(e) vom Carboxy-Terminus der Aminosäuresequenz des VEGI, gezeigt in den 5A, 5B und 5C (oder in SEQ ID NO: 9), bis zum Serin-Rest an der Position Nummer 6 in den 5A, 5B und 5C (oder –22 in SEQ ID NO: 9) deletiert wurde(n), und Polynucleotide beschrieben, die solche Polypeptide codieren. Insbesondere werden Polypeptide beschrieben, umfassend die Aminosäuresequenz der Reste 1-m³ von SEQ ID NO: 9, wobei m³ eine Ganzzahl im Bereich von 6 bis 174 ist, und 6 ist die Position des ersten Rests des C-Terminus des vollständigen VEGI-Polypeptids, von dem angenommen wird, dass er für die geringste immunogene Aktivität des VEGI-alpha benötigt wird.
Spezieller werden Polynucleotide offenbart, die Polypeptide codieren, umfassend oder alternativ bestehend aus der (die) Aminosäuresequenz der Reste M1 bis L-173; M1 bis F-172; M-1 bis A-171; M1 bis

der Sequenz der VEGI-Sequenz, gezeigt in den 5A, 5B und 5C (die VEGI-Aminosäuresequenz, die in den 5A, 5B und 5C gezeigt ist, ist identisch zu jener in SEQ ID NO: 9, dennoch unterscheidet sich das Nummerierungsschema zwischen den Zweien; die Nummerierung der obigen Aminosäurereste reflektiert in diesem Fall jene der 5A, 5B und 5C).
Es werden auch Polypeptide beschrieben, von denen ein oder mehrere Aminosäure(n) von sowohl den Amino- als auch den Carboxy-Termini eines VEGI-Polypeptids deletiert wurde(n), was allgemein beschrieben werden kann, dass sie die Reste n³-m³ von SEQ ID NO: 9 aufweisen, wobei n³ und m³ Ganzzahlen, wie oben beschrieben, sind. Polynucleotide, die diese Polypeptide codieren, sind auch beschrieben.
Darüber hinaus werden Polypeptide, von denen ein oder mehrere Rest(e) vom Carboxy-Terminus der Aminosäuresequenz des VEGI-beta, gezeigt in SEQ ID NO: 27, bis zum Glycin-Rest an der Position Nummer 6 deletiert wurde(n), und Polynucleotide, die solche Polypeptide codieren, beschrieben. Insbesondere werden Polypeptide beschrieben, umfassend die Aminosäuresequenz der Reste 1-m⁴ von SEQ ID NO: 27, wobei m⁴ eine Ganzzahl im Bereich von 6 bis 250 ist, und 6 ist die Position des ersten Rests des C-Terminus des vollständigen VEGI-beta-Polypeptids, von dem angenommen wird, dass er für die geringste immunogene Aktivität des VEGI-beta-Proteins benötigt wird.
Spezieller werden Polynucleotide beschrieben, die Polypeptide codieren, umfassend oder alternativ bestehend aus der (die) Aminosäuresequenz der Reste

der Sequenz der VEGI-beta-Sequenz, die in SEQ ID NO: 27 gezeigt ist. Polynucleotide, die diese Polypeptide codieren, werden auch in Betracht gezogen.
Darüber hinaus werden Polypeptide beschrieben, von denen eine oder mehrere Aminosäure(n) von sowohl den Amino- als auch den Carboxy-Termini eines VEGI-beta-Polypeptids deletiert wurde(n), was allgemein beschrieben werden kann, dass sie die Reste n⁴-m⁴ von SEQ ID NO: 27 haben, wobei n⁴ und m⁴ Ganzzahlen sind, wie oben beschrieben. Polynucleotide, die diese Polypeptide codieren, werden auch in Betracht gezogen.
Darüber hinaus werden Polypeptidfragmente beschrieben, umfassend oder alternativ bestehend aus den (die) Aminosäure(n), die durch die allgemeine Formel m^x bis n^x beschrieben werden, wobei m und n irgendeinem der Aminosäurereste entsprechen, die oben für diese entsprechenden Symbole beschrieben wurden, und x repräsentiert irgendeine Ganzzahl. Polynucleotide, die diese Polypeptide codieren, werden auch in Betracht gezogen.
Es werden Nucleotidsequenzen beschrieben, die ein Polypeptid codieren, das aus einem Teil der vollständigen VEGI-Aminosäuresequenz besteht, die durch den cDNA-Clon codiert wird, der in der ATCC Hinterlegungsnr. 75927 enthalten ist, wobei dieser Teil 1 bis etwa 62 Aminosäuren vom Amino-Terminus der vollständigen Aminosäuresequenz, die durch den in der ATCC Hinterlegungsnr. 75927 enthaltenen cDNA-Clon codiert wird, oder etwa 1 Aminosäure vom Carboxy-Terminus ausschließt, oder irgendeine Kombination der obigen amino-terminalen und carboxy-terminalen Deletionen der vollständigen Aminosäuresequenz, die durch den in der ATCC Hinterlegungsnr. 75927 enthaltenen cDNA-Clon codiert wird. Polynucleotide, die alle der obigen deletions-mutanten Polypeptidformen codieren, werden daher auch beschrieben.
Eine Nucleotidsequenz wird beschrieben, die ein Polypeptid codiert, das aus einem Teil der vollständigen VEGI-beta-Aminosäuresequenz besteht, die durch den cDNA-Clon, der in der ATCC-Hinterlegungsnr. 203055 enthalten ist, codiert wird, wobei dieser Teil 1 bis etwa 134 Aminosäuren vom Amino-Terminus der vollständigen Aminosäuresequenz ausschließt, die durch den in der ATCC-Hinterlegungsnr. 203055 enthaltenen cDNA-Clon codiert wird, oder eine Reihe von Aminosäuren vom Amino-Terminus der vollständigen Aminosäuresequenz, die durch den in ATCC-Hinterlegungsnr. 203055 enthaltenen cDNA-Clon codiert wird (wobei die Zahl von einer Ganzzahl von 1 bis 134 ausgewählt wird) oder etwa 1 Aminosäure vom Carboxy-Terminus ausschließt, oder jede Kombination von den obigen amino-terminalen und carboxy-terminalen Deletionen der vollständigen Aminosäuresequenz, die durch den in ATCC-Hinterlegungsnr. 203055 enthaltenen cDNA-Clon codiert wird. Polynucleotide, die alle der obigen Polypeptide codieren, werden daher auch in Betracht gezogen.
Ein isoliertes VEGI-Polypeptid wird beschrieben, umfassend eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) der Aminosäuresequenz des Volllängen-VEGI-Polypeptids, das die vollständige Aminosäuresequenz hat, die in SEQ ID NO: 9 gezeigt ist (d. h. die Positionen –27 bis 147 von SEQ ID NO: 9); (b) der Aminosäuresequenz des Volllängen-VEGI-Polypeptids, das die vollständige Aminosäuresequenz hat, die in SEQ ID NO: 9 gezeigt ist, mit Ausnahme des N-terminalen Methionin (d. h. die Positionen –26 bis 147 von SEQ ID NO: 9); (c) der Aminosäuresequenz des vorhergesagten reifen VEGI-Polypeptids, das die Aminosäuresequenz an den Positionen 1–147 in SEQ ID NO: 9 hat; (d) der vollständigen Aminosäuresequenz, codiert durch den cDNA-Clon HUVEO91, enthalten in der ATCC-Hinterlegungsnr. 75927; (e) der vollständigen Aminosäuresequenz mit Ausnahme des N-terminalen Methionin, die durch den cDNA-Clon codiert wird, der in der ATCC-Hinterlegungsnr. 75927 enthalten ist; und (f) der vollständigen Aminosäuresequenz des vorhergesagten reifen VEGI-Polypeptids, das durch den cDNA-Clon HUVEO91 codiert wird, der in der ATCC-Hinterlegungsnr. 75927 enthalten ist. Die beschriebenen Polypeptide schließen auch Polypeptide, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, die mindestens 70% identisch, mindestens 80% identisch, bevorzugter mindestens 90% identisch und noch mehr bevorzugt 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% identisch ist mit jenen, die gemäß (a), (b), (c), (d), (e) oder (f) oben beschrieben sind, oder Fragmenten davon ein, wie hierin beschrieben.
Ein isoliertes VEGI-Polypeptid wird beschrieben, umfassend eine Aminosäuresequenz, die ausgewählt wurde aus der Gruppe, bestehend aus: (a) der Aminosäuresequenz des Volllängen-VEGI-beta-Polypeptids, das die vollständige Aminosäuresequenz hat, die in SEQ ID NO:27 gezeigt ist (d. h. die Positionen 1 bis 251 von SEQ ID NO: 27); (b) der Aminosäuresequenz des Volllängen-VEGI-beta-Polypeptids, das die vollständige Aminosäuresequenz hat, die in SEQ ID NO: 27 gezeigt ist, mit Ausnahme des N-terminalen Methionin (d. h. die Positionen 2 bis 251 von SEQ ID NO: 27); (c) der Aminosäuresequenz des vorhergesagten reifen VEGI-beta-Polypeptids, das die Aminosäuresequenz an den Positionen 62–251 in SEQ ID NO: 27 hat; (d) der vollständigen Aminosäuresequenz, codiert durch den cDNA-Clon HEMCZ56, enthalten in der ATCC-Hinterlegungsnr. 203055; (e) der vollständigen Aminosäuresequenz, ausschließlich des N-terminalen Methionins, die durch den cDNA-Clon HEMCZ56 codiert wird, der in der ATCC-Hinterlegungsnr. 203055 enthalten ist; und (f) der vollständigen Aminosäuresequenz des vorhergesagten reifen VEGI-Polypeptids, das durch den cDNA-Clon HEMCZ56 codiert wird, der in der ATCC-Hinterlegungsnr. 203055 enthalten ist. Die beschriebenen Polypeptide schließen auch Polypeptide, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, die mindestens 70% identisch, mindestens 80% identisch, bevorzugter mindestens 90% identisch und noch mehr bevorzugt 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% identisch mit jenen, die oben gemäß (a), (b), (c), (d), (e) oder (f) beschrieben sind, oder Fragmente davon ein, wie hierin beschrieben. In spezifischen Ausführungsformen sind diese Polypeptide mindestens 10 Aminosäuren, mindestens 15 Aminosäuren, mindestens 20 Aminosäuren, mindestens 25 Aminosäuren, mindestens 30 Aminosäuren und bevorzugter mindestens 50 Aminosäuren.
Mit einem Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz hat, die zum Beispiel mindestens 95% „identisch" mit einer Bezugs-Aminosäuresequenz eines VEGI-Polypeptids ist, ist vorgesehen, dass die Aminosäuresequenz des Polypeptids identisch zu der Bezugssequenz ist, mit der Ausnahme, dass die Polypeptidsequenz bis zu fünf Aminosäure-Änderungen pro 100 Aminosäuren der Bezugs-Aminosäure des VEGI-Polypeptids einschließen kann. Mit anderen Worten, um ein Polypeptid zu erhalten, das eine Aminosäuresequenz hat, die mindestens 95% identisch zu einer Bezugs-Aminosäuresequenz ist, können bis zu 5% der Aminosäurereste in der Bezugssequenz deletiert oder mit einer anderen Aminosäure substituiert werden, oder eine Zahl von Aminosäuren von bis zu 5% der Gesamt-Aminosäurereste in der Bezugssequenz kann in die Bezugssequenz inseriert werden. Diese Änderungen der Bezugssequenz können an den amino- oder carboxy-terminalen Positionen der Bezugs-Aminosäuresequenz oder irgendwo zwischen jenen terminalen Positionen, zwischengelagert entweder individuell unter den Resten in der Bezugssequenz oder in einer oder mehreren durchgehenden Gruppen innerhalb der Bezugssequenz auftreten.
Ob irgendein bestimmtes Polypeptid mindestens 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% identisch mit zum Beispiel der Aminosäuresequenz, die in den 5A, 5B und 5C (SEQ ID NO: 9) gezeigt ist, der Aminosäuresequenz, die durch den hinterlegten cDNA-Clon HUVEO91 codiert wird, oder Fragmenten davon ist, kann in der Praxis konventionell unter Verwendung von bekannten Computerprogrammen wie dem Bestfit-Programm (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) bestimmt werden. Wenn Bestfit oder irgendein anderes Sequenz-Alignmentprogramm verwendet wird, um zu bestimmen, ob eine bestimmte Sequenz zum Beispiel 95% identisch mit einer hierin beschriebenen Bezugssequenz ist, werden die Parameter natürlich so eingestellt, dass der Prozentsatz der Identität über die gesamte Länge der Bezugs-Aminosäuresequenz berechnet wird, und dass Lücken in der Homologie von bis zu 5% der Gesamtzahl von Aminosäureresten in der Bezugssequenz erlaubt sind.
In einer spezifischen Ausführungsform wird die Identität zwischen einer Bezugs (Frage)-Sequenz (einer Sequenz, wie hierin beschrieben) und einer Subjekt-Sequenz, auch als ein globales Sequenz-Alignment bezeichnet, unter Verwendung des FASTDB-Computerprogramms bestimmt, das auf dem Algorithmus von Brutlag et al. (Corp. App. Biosci. 6: 237–245 (1990)) basiert. Bevorzugte Parameter, die in einem FASTDB-Aminosäuren-Alignment verwendet werden, sind: Matrix = PAM 0, k-Tupel = 2, Fehlanpassungs-Strafe = 1, Verbindungsstrafe = 20, Randomisierungs-Gruppenlänge = 0, Grenzwert = 1, Fenstergröße = Sequenzlänge, Lückenstrafe = 5, Lückengröße-Strafe = 0,05, Fenstergröße = 500 oder die Länge der Subjekt-Aminosäuresequenz, welche immer kürzer ist. Wenn die Subjektsequenz aufgrund von N- oder C-terminalen Deletionen, nicht wegen interner Deletionen kürzer als die Abfrage-Sequenz ist, wird gemäß dieser Ausführungsform eine manuelle Korrektur der Ergebnisse gemacht, um die Tatsache zu berücksichtigen, dass das FASTDB-Programm N- und C-terminale Verkürzungen der Subjekt-Sequenz nicht berücksichtigt, wenn die globale Prozent-Identität berechnet wird. Für Subjektsequenzen, die an den N- und C-Termini im Vergleich zur Abfragesequenz verkürzt sind, wird die Prozent-Identität durch Berechnen der Zahl der Reste der Abfragesequenz, die N- und C-terminal der Subjektsequenz sind, die nicht mit einem korrespondierenden Subjektrest passend/ausgerichtet sind, als ein Prozentsatz der Gesamtbasen der Abfragesequenz korrigiert. Eine Bestimmung, ob ein Rest passend/ausgerichtet ist, wird durch die Ergebnisse des FASTDB-Sequenz-Alignments bestimmt. Dieser Prozentsatz wird dann von der Prozent-Identität subtrahiert, die durch das obige FASTDB-Programm unter Verwendung der beschriebenen Parameter berechnet wurde, um am finalen Prozent-Identitätswert anzugelangen. Dieser finale Prozent-Identitätswert ist, was für die Zwecke dieser Ausführungsform verwendet wird. Nur Reste zu den N- und C-Termini der Subjektsequenz, die nicht mit der Abfragesequenz passend/ausgerichtet sind, werden für die Zwecke des manuellen Anpassens des Prozent-Identitätswerts in Betracht gezogen. Das heißt, nur Abfrage-Rest-Positionen außerhalb der weitesten N- und C-terminalen Reste der Subjektsequenz. Zum Beispiel wird eine 90 Aminosäurerest-Subjektsequenz mit einer 100 Reste-Fragesequenz ausgerichtet, um die Prozent-Identität zu bestimmen. Die Deletion erfolgt am N-Terminus der Subjektsequenz, und daher zeigt das FASTDB-Alignment kein(e) Passen/Ausrichtung der ersten 10 Reste am N-Terminus. Die 10 ungepaarten Reste repräsentieren 10% der Sequenz (Zahl der Reste an den N- und C-Termini, die nicht passen/Gesamtzahl der Reste in der Abfragesequenz), daher werden 10% vom Prozent-Identitätswert, der durch das FASTDB-Programm berechnet wird, subtrahiert. Wenn die verbleibenden 90 Reste perfekt passend waren, würde die finale Prozent-Identität 90% sein. In einem anderen Beispiel wird eine 90 Reste-Subjektsequenz mit einer 100 Reste-Abfragesequenz verglichen. Dieses Mal sind die Deletionen interne Deletionen, daher sind keine Reste an den N- oder C-Termini der Subjektsequenz, die nicht mit der Abfragesequenz passend/ausgerichtet sind. In diesem Fall wird die Prozent-Identität, die durch FASTDB berechnet wurde, nicht manuell korrigiert. Wieder werden nur Reste-Positionen außerhalb der N- und C-terminalen Enden der Subjektsequenz, wie in der FASTDB-Ausrichtung gezeigt, die nicht mit der Abfragesequenz passend/ausgerichtet sind, manuell korrigiert. Keine anderen manuellen Korrekturen werden zu Zwecken dieser Ausführungsform gemacht.
Die beschriebenen Polypeptide schließen die Polypeptide von SEQ ID NO: 9 (insbesondere das reife Polypeptid) sowie Polypeptide ein, die mindestens 70% Ähnlichkeit (vorzugsweise mindestens 70% Identität) mit dem Polypeptid von SEQ ID NO: 9 und bevorzugter mindestens 90% Ähnlichkeit (bevorzugter mindestens 90% Identität) mit dem Polypeptid von SEQ ID NO: 9 und noch bevorzugter mindestens 95% Ähnlichkeit (noch mehr bevorzugt mindestens 95% Identität) mit dem Polypeptid von SEQ ID NO: 9 haben, und schließen auch Teile von solchen Polypeptiden ein, wobei solch ein Teil des Polypeptids im Allgemeinen mindestens 30 Aminosäuren und bevorzugter mindestens 50 Aminosäuren enthält.
Die beschriebenen Polypeptide schließen auch das Polypeptid von SEQ ID NO: 27 (insbesondere die extrazelluläre Domäne des Polypeptids) sowie Polypeptide ein, die mindestens 70% Ähnlichkeit (vorzugsweise mindestens 70% Identität) mit dem Polypeptid von SEQ ID NO: 27 und bevorzugter mindestens 90% Ähnlichkeit (bevorzugter mindestens 90% Identität) mit dem Polypeptid von SEQ ID NO: 27 und noch bevorzugter mindestens 95% Ähnlichkeit (noch mehr bevorzugt mindestens 95% Identität) mit dem Polypeptid von SEQ ID NO: 27 haben, und schließen auch Teile von solchen Polypeptiden ein, wobei solch ein Teil des Polypeptids im Allgemeinen mindestens 30 Aminosäuren und bevorzugter mindestens 50 Aminosäuren enthält.
Darüber hinaus schließen die beschriebenen Polypeptide Polypeptide ein, die mindestens 70% Ähnlichkeit, mindestens 90% Ähnlichkeit, bevorzugter mindestens 95% Ähnlichkeit und noch mehr bevorzugt mindestens 96%, 97%, 98% oder 99% Ähnlichkeit mit jenen Polypeptiden haben, die hierin beschrieben werden. Die beschriebenen Polypeptide umfassen auch jene, die mindestens 70% identisch, mindestens 80% identisch, bevorzugter mindestens 90% oder 95% identisch, noch mehr bevorzugt mindestens 96%, 97%, 98% oder 99% identisch mit den hierin offenbarten Polypeptiden sind. In spezifischen Ausführungsformen umfassen solche Polypeptide mindestens 30 Aminosäuren und bevorzugter mindestens 50 Aminosäuren.
Wie auf dem Fachgebiet bekannt, wird die „Ähnlichkeit" zwischen zwei Polypeptiden durch Vergleichen der Aminosäuresequenz und ihrer konservierten Aminosäure-Substitute von einem Polypeptid mit der Sequenz eines zweiten Polypeptids bestimmt. Mit „%-Ähnlichkeit" für zwei Polypeptide ist ein Ähnlichkeitswert vorgesehen, der durch Vergleich der Aminosäuresequenzen der zwei Polypeptide unter Verwendung des Bestfit-Programms (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) und der Standard-Einstellungen für das Bestimmen der Ähnlichkeit produziert wird. Bestfit verwendet den lokalen Homologie-Algorithmus von Smith und Waterman (Advances in Applied Mathematics 2: 482–489, 1981), um das beste Segment der Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen zu finden.
Wie hierin verwendet, bezieht sich eine Polypeptid- oder Aminosäuresequenz, „die abgeleitet ist von" der Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 27, auf ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz hat, die identisch mit jener eines Polypeptids ist, das in der Sequenz codiert wird, oder eines Teils davon, wobei der Teil aus mindestens 2–5 Aminosäuren und bevorzugter mindestens 8–10 Aminosäuren und noch bevorzugter mindestens 11–15 Aminosäuren besteht, oder der mit einem Polypeptid, das in der Sequenz codiert wird, immunologisch identifizierbar ist.
Es werden auch Fusionsproteine beschrieben, in denen das Volllängen-VEGI-Polypeptid oder Fragment, die Variante, das Derivat oder Analog davon an ein nicht-verwandtes Protein fusioniert ist. Diese Fusionsproteine können routinemäßig auf der Basis der hierin offenbarten VEGI-Nucleotid- und Polypeptidsequenzen gestaltet werden. Zum Beispiel können, wie ein Fachmann anerkennen wird, VEGI- und/oder VEGI-beta-Polypeptide und hierin beschriebene Fragmente (einschließlich Epitop-tragender Fragmente) davon, mit Teilen der konstanten Domäne von Immunglobulinen (IgG) kombiniert werden, was in chimeren(Fusions-)Polypeptiden resultiert. Diese Fusionsproteine ermöglichen die Reinigung und zeigen eine verlängerte Halbwertszeit in vivo. Dies ist z. B. für chimere Proteine gezeigt worden, die aus den ersten zwei Domänen des menschlichen CD4-Polypeptids und verschiedenen Domänen der konstanten Regionen der schweren oder leichten Ketten von Säuger-Immunglobulinen bestehen ( EP A 394,827 ; Traunecker, et al., Nature 331: 84–86 (1988)). Fusionsproteine, die aufgrund des IgG-Teils eine Disulfidverknüpfte chimere Struktur haben, können auch wirksamer im Binden und Neutralisieren anderer Moleküle als das monomere VEGI-Protein oder das Proteinfragment alleine sein (Fountoulakis, et al., J. Biochem. 270: 3958–3964 (1995)). Als ein Beispiel ist hierin solch eine VEGI-Fc-Fusion produziert worden, wie oben beschrieben. Zusätzliche Beispiele von VEGI-Fusionsproteinen sind die Fusion der VEGI-Polypeptidsequenz an jede Aminosäuresequenz, die dem Fusionsprotein erlaubt, auf der Zelloberfläche gezeigt zu werden; oder Fusionen an ein Enzym, fluoreszierendes Protein oder lumineszierendes Protein, das eine Markerfunktion liefert, sind aber nicht darauf limitiert.
Funktionelle Aktivitäten
Die funktionelle Aktivität von VEGI-Polypeptiden und Fragmenten, varianten Derivaten und Analogen davon können durch verschiedene Verfahren getestet werden.
Zum Beispiel können in einer Ausführungsform, wo man auf die Fähigkeit testet, ein Volllängen-VEGI-Polypeptid für die Bindung an einen anti-VEGI-Antikörper zu binden oder damit zu konkurrieren, verschiedene Immuntests verwendet werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, einschließlich kompetitive und nicht-kompetitive Testsysteme unter Verwendung von Techniken wie Radioimmun-Tests, ELISA (Enzym-gekoppelter Immunadsorptionstest), „Sandwich"-Immuntests, immunradiometrische Tests, Gel-Diffusions-Präzipitationsreaktionen, Immundiffusions-Tests, in situ-Immuntests (zum Beispiel unter Verwendung von Kolloidal-Gold-, Enzym- oder Radioisotop-Markierungen), Western Blots, Präzipitationsreaktionen, Agglutinationstests (z. B. Gelagglutinationstests, Hämagglutinationstests), Komplement-Fixierungstests, Immunfluoreszenz-Tests, Protein A-Tests und Immunelektrophorese-Tests usw., aber nicht limitiert darauf. In einer Ausführungsform wird die Antikörperbindung durch Nachweisen einer Markierung auf dem primären Antikörper nachgewiesen. In einer anderen Ausführungsform wird der primäre Antikörper durch Nachweisen der Bindung eines sekundären Antikörpers oder Reagenz an den primären Antikörper nachgewiesen. In einer weiteren Ausführungsform ist der sekundäre Antikörper markiert. Auf dem Fachgebiet sind viele Mittel für das Nachweisen der Bindung in einem Immuntest bekannt und liegen im Rahmen der vorliegenden Erfindung.
In einer anderen Ausführungsform, wo ein TNF-Ligand identifiziert wird, kann die Bindung z. B. durch auf dem Fachgebiet wohlbekannte Mittel getestet werden. In einer anderen Ausführungsform können physiologische Korrelate der VEGI-Bindung an seine Substrate (Signaltransduktion) getestet werden.
Zusätzlich können die hierin beschriebenen (siehe Beispiele 5–8 und 10) und anderweitig auf dem Fachgebiet bekannten Tests routinemäßig angewendet werden, um die Fähigkeit von VEGI-Polypeptiden und Fragmenten, varianten Derivaten und Analogen davon, eine VEGI-verwandte biologische Aktivität (z. B. die Zellproliferation, Angiogenese und Zelladhäsion in vitro oder in vivo zu inhibieren oder alternativ zu fördern) hervorzurufen, zu messen.
Andere Verfahren werden dem Fachmann bekannt sein und werden im Rahmen der Erfindung in Betracht gezogen.
Antikörper
Antikörper, die spezifisch ein oder mehrere Epitop(e) von VEGI oder Epitope von konservierten Varianten von VEGI oder Polypeptidfragmente von VEGI erkennen, können auch im Zusammenhang der Erfindung verwendet werden. Daher können die beschriebenen Polypeptide, ihre Fragmente oder andere Derivate oder Analoge davon oder Zellen, die sie exprimieren, als ein Immunogen verwendet werden, um Antikörper dagegen zu produzieren. Diese Antikörper können zum Beispiel polyclonale oder monoclonale Antikörper sein. Sie schließen auch chimere, Einzelketten- und humanisierte Antikörper sowie Fab-Fragmente, F(ab')-Fragmente, die Produkte einer Fab-Expressions-Genbank, anti-idiotypische Antikörper und Epitop-bindende Fragmente von irgendeinem der obigen ein. Verschiedene Vorgehensweisen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, können für die Produktion von solchen Antikörpern und Fragmenten verwendet werden.
Antikörper, die gegen die Polypeptide, die einer Sequenz, wie hierin beschrieben, entsprechen, hergestellt wurden, können durch direkte Injektion des Polypeptids in ein Tier oder durch Verabreichen der Polypeptide an ein Tier, vorzugsweise ein nicht-menschliches, erhalten werden. Der so erhaltene Antikörper wird dann die Polypeptide selbst binden. Auf diese Weise kann sogar eine Sequenz, die nur ein Fragment der Polypeptide codiert, verwendet werden, um Antikörper herzustellen, die die ganzen natürlichen Polypeptide binden. Solche Antikörper haben Anwendungen, die eine Isolierung des Polypeptids von Gewebe, das jenes Polypeptid exprimiert, einschließen, aber nicht darauf limitiert sind, und für den Nachweis von VEGI in einer biologischen Probe und können als Teil einer diagnostischen oder prognostischen Technik verwendet werden, wodurch Patienten auf abnormale Mengen von VEGI gestestet werden können. Solche Antikörper können auch in einem Verfahren der Hemmung der biologischen VEGI-Aktivität verwendet werden.
Für die Produktion von Antikörpern können verschiedene Wirtstiere durch Injektion mit VEGI-Polypeptid (z. B. einem, das einer funktionellen Domäne des Polypeptids, wie der extrazellulären Domäne entspricht) immunisiert werden. Solche Wirtstiere können Kaninchen, Mäuse und Ratten einschließen, um nur ein paar zu nennen, sind aber nicht darauf limitiert. Verschiedene Adjuvanzien können abhängig von der Wirtsspezies verwendet werden, um die immunologische Antwort zu steigern, einschließlich Freund's (komplett und inkomplett), Mineralgele wie Aluminiumhydroxid, Oberflächen-aktive Substanzen wie Lysolecithin, pluronische Polyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, Schlüsselloch-Schnecken-Hämocyanin, Dinitrophenol und potenziell nützlicher menschlicher Adjuvanzien wie BCG (Bacillus Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum, aber nicht darauf limitiert. Polyclonale Antikörper sind heterogene Populationen von Antikörpermolekülen, die von den Seren der immunisierten Tiere abgleitet wurden.
Monoclonale Antikörper, die homogene Populationen von Antikörpern gegen ein bestimmtes Antigen sind, können durch jede Technik, die die Produktion von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zelllinien in Kultur liefert, erhalten werden. Diese schließen die Hybridom-Technik von Kohler und Milstein (Nature 256: 495–497 (1975)); und U.S.-Patent Nr. 4,376,110 ), die menschliche B-Zell-Hybridom-Technik (Kosbor, et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026–2030 (1983) und die EBV-Hybridom-Technik (Cole, et al., Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., S. 77–96 (1985)) ein, sind aber nicht darauf limitiert. Solche Antikörper können von jeder Immunglobulin-Klasse sein, einschließlich IgG, IgM, IgE, IgA, IgD und jeder Unterklasse davon. Das Hybridom, das den beschriebenen mAb produziert, kann in vitro oder in vivo kultiviert werden. Die Produktion von hohen Titern von mAbs in vivo macht dies zum derzeit bevorzugten Verfahren der Produktion.
Zusätzlich können Techniken, die durch Spleißen der Gene von einem Maus-Antikörpermolekül mit geeigneter Antigenspezifität zusammen mit Genen von einem menschlichen Antikörpermolekül von geeigneter biologischer Aktivität für die Produktion von „chimeren Antikörpern" entwickelt wurden (Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 81: 6851–6855 (1984); Neuberger, et al., Nature 312: 604–608 (1984); Takeda, et al., Nature 314: 452–454 (1985)), verwendet werden. Ein chimerer Antikörper ist ein Molekül, in dem verschiedene Teile von verschiedenen Tierspezies stammen, wie jene, die eine variable Region, die von einem murinen mAb stammt, und eine menschliche Immunglobulin-konstante Region haben.
Für die in vivo-Verwendung von anti-VEGI in Menschen kann es bevorzugt sein, „humanisierte" chimere, monoclonale Antikörper zu verwenden. Solche Antikörper können unter Verwendung von genetischen Konstrukten produziert werden, die von Hybridomzellen abgleitet wurden, die die oben beschriebenen monoclonalen Antikörper produzieren. Verfahren zum Produzieren von chimeren Antikörpern sind auf dem Fachgebiet bekannt (Morrison, Science 229: 1202 (1985); Oi, et al., BioTechniques 4: 214 (1986); Cabilly, et al., U.S.-Patent Nr. 4,816,567 ; Taniguchi, et al., EP 171496 ; Morrison, et al., EP 173494 ; Neuberger, et al., WO 8601533 ; Robinson, et al., WO 8702671 ; Boulianne, et al., Nature 312: 643 (1984); Neuberger, et al., Nature 314: 268 (1985)).
Alternativ können Techniken, die für die Produktion von Einzelketten-Antikörpern beschrieben sind ( U.S.-Patent 4,946,778 ; Bird, Science 242: 423–426 (1988); Huston, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879–5883 (1988); und Ward, et al., Nature 334: 544546 (1989)), angepasst werden, um Einzelketten-Antikörper gegen VEGI-Polypeptide zu produzieren. Einzelketten-Antikörper werden durch Verknüpfen der Fragmente der Fv-Region der schweren und leichten Kette durch eine Aminosäurebrücken gebildet, was in einem Einzelketten-Polypeptid resultiert.
Antikörperfragmente, die spezifische Epitope erkennen, können durch bekannte Techniken hergestellt werden. Zum Beispiel schließen solche Fragmente: die F(ab')2-Fragmente, die durch Pepsin-Verdau des Antikörpermoleküls produziert werden können, und die Fab-Fragmente, die durch Reduzieren der Disulfidbrücken der F(ab')2-Fragmente hergestellt werden können, ein, sind aber nicht darauf limitiert. Alternativ können Fab-Expressions-Genbanken konstruiert werden (Huse, et al., Science 246: 1275–1281 (1989)), um eine schnelle und einfache Identifizierung von monoclonalen Fab-Fragmenten mit der erwünschten Spezifität zu ermöglichen.
Antikörper gegen das VEGI-Polypeptid können wiederum verwendet werden, um anti-idiotypische Antikörper, die den ObR „imitieren", unter Verwendung von Techniken, die Fachleuten wohlbekannt sind, herzustellen. (Siehe z. B. Greenspan & Bona, FASEB J. 7(5): 437–444; (1989) und Nissinoff, J. Immunol. 147(8): 2429–2438 (1991)). Zum Beispiel können Antikörper, die an die VEGI-extrazelluläre Domäne binden und die Bindung eines Liganden an das VEGI kompetitiv hemmen, verwendet werden, um anti-Idiotypen herzustellen, die die VEGI-extrazelluläre Domäne „imitieren" und daher den VEGI-Liganden binden und neutralisieren. Solche neutralisierenden anti-Idiotypen oder Fab-Fragmente von solchen anti-Idiotypen können in therapeutischen Regimes verwendet werden, um den VEGI-Liganden zu neutralisieren.
Daher können, wie oben offenbart, Fachleute unter Verwendung von Standard-Methoden monoclonale und polyclonale Antikörper gegen ein VEGI-Protein (oder Polypeptid), wie hierin beschrieben, züchten. Material und Verfahren zum Produzieren von Antikörpern sind auf dem Fachgebiet gut bekannt (siehe zum Beispiel Goding, in Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Kapitel 4, 1986). Zusätzlich kann das Polypeptid an andere Proteine oder Polypeptide fusioniert werden, die seine Antigenität erhöhen, wodurch höhere Titer der Antikörper produziert werden. Beispiele von solchen Proteinen oder Polypeptide schließen jegliche Adjuvanzien oder Trägerstoffe wie Aluminiumhydroxid ein. Diese Antikörper können in einer passiven Antikörpertherapie verwendet werden, in der Antikörper, die spezifisch VEGI binden, angewendet werden können, um angingen-abhängige Vorgänge wie die Reproduktion, Entwicklung, Wundheilung und Gewebereparatur, um ein paar zu nennen, zu modulieren.
Mit den Immun- und Kreislaufsystemen in Beziehung stehende und andere medizinische Störungen Die vorliegende Erfindung zeigt die Nützlichkeit von den hierin beschriebenen Molekülen in einem Verfahren zum Reduzieren von Symptomen einer angiogen-assoziierten Krankheit in einem Tier oder menschlichen Patienten durch Verabreichung einer wirksamen Menge von VEGI an den Patienten. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von einem Nucleinsäuremolekül, umfassend ein Polynucleotid, das von der Gruppe ausgewählt wird, bestehend aus:

(a) einem Polynucleotid, das ein Polypeptid codiert, umfassend die Aminosäuren 1 bis 174 von SEQ ID NO: 2;
(b) einem Polynucleotid, das ein Polypeptid codiert, umfassend die Aminosäuren 23 bis 174 von SEQ ID NO: 2;
(c) einem Polynucleotid, das ein Polypeptid codiert, umfassend die Aminosäuren 39 bis 174 von SEQ ID NO: 2;
(d) einem Polynucleotid, das ein Fragment des Polypeptids gemäß einem von (a) bis (c) codiert, das eine Angiogenese-hemmende Aktivität hat;
(e) einem Polynucleotid, das mit dem Komplement von SEQ ID NO: 1 hybridisiert, wobei das Polynucleotid ein Polypeptid codiert, das eine Angiogenese-hemmende Aktivität hat;
(f) einem Polynucleotid, das eine allelische Variante des Polynucleotids gemäß einem von (a) bis (e) codiert;
(g) einem Polynucleotid von einem gemäß (a) bis (f), das ein Polypeptid codiert, das ein Sekretionssignal umfasst; und
(h) dem komplementären Strang von einem von obigen (a) bis (g) eines Polypeptids, das durch ein Nucleinsäuremolekül, umfassend solch ein Polynucleotid, oder einen rekombinanten Vektor, umfassend solch ein Polynucleotid, codiert wird, für die Herstellung eines Arzneimittels für das Hemmen der Angiogenese.

Da die Angiogenese für das Überleben eines Tumors notwendig ist, kann das Hemmen oder Umkehren der Angiogenese den Tumor reduzieren oder eliminieren.
Wenn man einem Patienten VEGI bereitstellt, wird die Dosierung des verabreichten Agens von solchen Faktoren wie dem Alter, dem Gewicht, der Größe, dem Geschlecht, dem allgemeinen medizinischen Zustand, der früheren Krankengeschichte usw. des Patienten abhängig variieren. Im Allgemeinen ist es wünschenswert, dem Patienten eine Dosierung der obigen Verbindungen bereitzustellen, die im Bereich von etwa 1 pg/kg bis 10 mg/kg (Körpergewicht des Patienten) liegt, obwohl eine niedrigere oder höhere Dosierung verabreicht werden kann. Die Verwendung der vorliegenden Erfindung erwägt einzelne sowie mehrere Verabreichungen, die entweder simultan oder über einen ausgedehnten Zeitraum gegeben werden.
Die VEGI-Polynucleotide können durch Verwenden von Plasmiden oder viralen Vektoren wie Adenovirus oder Retrovirus, die VEGI-Polynucleotide, die in SEQ ID NO: 1 beschrieben sind, oder einen Teil davon enthalten, oder einer allelischen Form davon bereitgestellt werden. Die verwendeten Vektoren sind vorzugsweise zum Bereitstellen von VEGI-Polynucleotiden an eine Zelle in der Lage, sodass die Polynucleotide transkribiert und translatiert werden und ein VEGI-Polypeptid produziert wird. Die beschriebenen Polynucleotide können auch als DNA, als DNA, die in Liposomen eingekapselt ist, oder als DNA, die in Proteoliposomen, die virale Hüllenrezeptor-Proteine enthalten, eingefangen ist, verabreicht werden (Kanoda, Y. et al. (1989) Science 243: 375). Alternativ können die beschriebenen Polynucleotide zusammen mit einem Trägerstoff injiziert werden. Ein Trägerstoff kann ein Protein wie ein Cytokin, zum Beispiel Interleukin 2, oder ein Polylysin-Glycoprotein-Träger sein. Solche Trägerproteine und Vektoren und Verfahren der Verwendung derselben sind auf dem Fachgebiet bekannt (Siehe zum Beispiel Ascadi G. et al. Nature 1991, 352: 815). Zusätzlich können die beschriebenen Nucleotide auf winzige Goldkugeln beschichtet und die Kugeln zum Beispiel mit einer Gen-Pistole in die Haut eingebracht werden (Ulmer, J. B. et al. Science 1993, 259: 1745).
Alternativ können die VEGI-Polypeptide, wie hierin beschrieben, unter Verwendung von Formulierungsverfahren, die Fachleuten bekannt sind, in pharmazeutisch verträglichen Formulierungen bereitgestellt werden. Diese Formulierungen können durch Standardwege verabreicht werden. Im Allgemeinen können die Kombinationen auf topischem, transdermalem, intraperitonealem, oralem, rektalem oder parenteralem (z. B. intravenösem, subcutanem oder intramuskulärem) Weg verabreicht werden. Zusätzlich können die beschriebenen VEGI-Polypeptide in biologisch abbaubare Polymere inkorporiert werden, die in die Nähe implantiert werden, von wo die Arzneistoff-Abgabe erwünscht ist, oder so implantiert werden, dass das VEGI-Polypeptid langsam systemisch freigesetzt wird. Die biologisch abbaubaren Polymere und ihre Verwendung sind zum Beispiel im Detail in Brem et al., J. Neurosurg. 74: 441–446 (1991), beschrieben.
Die VEGI-Polypeptid-Formulierungen schließen jene ein, die für eine orale, rektale, ophtalmische (einschließlich intravitreal oder intracameral), nasale, topische (einschließlich buccal und sublingual), vaginale oder parenterale (einschließlich subcutan, intraperitoneal und epidural) Verabreichung geeignet sind. Die VEGI-Polypeptid-Formulierungen können bequem in Einheitsdosierungs-Form dargelegt werden und können durch konventionelle pharmazeutische Techniken hergestellt werden. Solche Techniken schließen den Schritt des In-Assoziation-Bringens des aktiven Bestandteils und des (der) pharmazeutischen Träger(s) oder des (der) Vehikel(s) ein. Im Allgemeinen werden die Präparate durch einheitliches und genaues In-Assoziation-Bringen des aktiven Bestandteils mit flüssigen Trägern oder fein geteilten festen Trägern oder beiden und dann, wenn nötig, Gestalten des Produkts hergestellt.
Formulierungen, die für die parenterale Verabreichung geeignet sind, schließen wässrige und nicht wässrige sterile Injektionslösungen, die Antioxidanzien enthalten können, Puffer und gelöste Stoffe, die die Formulierung im Bezug auf das Blut des beabsichtigten Patienten isoton machen; und wässrige und nicht-wässrige sterile Suspensionen ein, die suspendierende Agenzien und Verdickungsmittel einschließen können. Die Formulierungen können in Einheits-Dosis oder Mehrfach-Dosis-Behältnissen, zum Beispiel in versiegelten Ampullen und Flakons dargelegt werden und können in einem gefriergetrockneten (lyophilisierten) Zustand gelagert werden, der nur die Zugabe des sterilen flüssigen Trägers, zum Beispiel Wasser für Injektionen, unmittelbar vor der Verwendung erfordert. Improvisierte Injektionslösungen und Suspensionen können aus sterilen Pulvern, Granula und Tabletten der vorher beschriebenen Art hergestellt werden.
Bevorzugte Einheitsdosierungs-Formulierungen sind jene, die eine tägliche Dosis oder Einheit, tägliche Sub-Dosis, wie hierin oben vorgetragen, oder eine geeignete Fraktion davon des verabreichten Bestandteils enthalten. Es sollte verstanden werden, dass die Formulierungen für die Verwendung im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung zusätzlich zu den Bestandteilen, die oben besonders erwähnt wurden, andere konventionelle Agenzien im Fachgebiet bezüglich des Typs der in Frage stehenden Formulierung einschließen können.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von einem Nucleinsäuremolekül, umfassend ein Polynucleotid, das aus der Gruppe ausgewählt wurde, bestehend aus:

(a) einem Polynucleotid, das ein Polypeptid codiert, umfassend die Aminosäuren 1 bis 174 von SEQ ID NO: 2;
(b) einem Polynucleotid, das ein Polypeptid codiert, umfassend die Aminosäuren 23 bis 174 von SEQ ID NO: 2;
(c) einem Polynucleotid, das ein Polypeptid codiert, umfassend die Aminosäuren 39 bis 174 von SEQ ID NO: 2;
(d) einem Polynucleotid, das ein Fragment eines Polypeptids gemäß einem von (a) bis (c) codiert, das eine Angiogenese-hemmende Aktivität hat;
(e) einem Polynucleotid, das mit dem Komplement von SEQ ID NO: 1 hybridisiert, wobei das Polynucleotid ein Polypeptid codiert, das eine Angiogenese-hemmende Aktivität hat;
(f) einem Polynucleotid, das eine allelische Variante des Polynucleotids gemäß einem von (a) bis (e) codiert;
(g) einem Polynucleotid von einem gemäß (a) bis (f), das ein Polypeptid codiert, das ein Sekretionssignal umfasst; und
(h) dem komplementären Strang von einem von obigen (a) bis (g) eines Polypeptids, das durch ein Nucleinsäuremolekül, umfassend solch ein Polynucleotid, oder einen rekombinanten Vektor, umfassend solch ein Polynucleotid, codiert wird, für die Herstellung eines Arzneimittels zum Behandeln oder Bessern einer Krankheit, die durch unkontrollierte pathologische Angiogenese vermittelt wird.

Die erwogenen Krankheiten sind Teleangiektasie, Schuppenflechte, Sclerodermie, myokardiale Angiogenese, Plaque-Gefäßneubildung, Angiogenese ischämischer Gliedmaßen, Rubeosis, neovaskuläres Glaukom, diabetische Retinopathie, retrolentale Fibroplasie, diabetische Gefäßneubildung. Die hierin beschriebenen Krankheiten und Krankheitszustände schließen keine(n) Krebs oder Tumore irgendeiner Art ein.
In einer spezifischen Ausführungsform wird ein beschriebenes VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Polypeptid mit einer therapeutisch wirksamen Menge eines anderen Moleküls kombiniert, das die Angiogenese negativ reguliert, welches Blutplättchen-Faktor-4, Thrombospondin-1, Gewebeinhibitoren der Metalloproteasen (TIMP1 und TIMP2), Prolactin (16 kDa-Fragment), Angiostatin (38 kDa-Fragment von Plasminogen), löslicher bFGF-Rezeptor, transformierender Wachstumsfaktor β, Interferon alpha und plazentares Proliferin-verwandtes Protein sein kann, ist aber nicht darauf limitiert.
Augenerkrankungen, die mit einer Gefäßneubildung assoziiert sind, die mit den beschriebenen VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Polypeptiden behandelt werden können, schließen neovaskuläres Glaukom, diabetische Retinopathie, retrolentale Fibroplasie, Uveitis, Frühgeborenen-Retinopathie, Makuladegeneration und Hornhauttransplantat-Gefäßneubildung ein, sind aber nicht darauf limitiert. (Siehe z. B. Literaturübersichten von Waltman, et al., 1987 Am. J. Ophtal. 85: 704–710 und Gartner, et al., 1978, Surv. Ophtal. 22: 291–312.)
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Antagonisten eines VEGI-Polypeptids, das durch ein Polynucleotid, wie hierin oben erwähnt, codiert wird, das ein Antisense-Oligonucleotid oder Ribozym, das spezifisch für die RNA ist, die das VEGI-Polypeptid codiert, oder ein Antikörper, der an das VEGI-Polypeptid bindet und seine Aktivität hemmt oder eliminiert, in einem pharmazeutisch verträglichen Verdünner, ein einer pharmazeutisch verträglichen Menge für die Herstellung eines Arzneimittels für das Fördern der Angiogenese ist.
Die Konstruktion und Abgabe von Ribozymen und Antisense-Oligonucleotiden sind auf dem Fachgebiet bekannt (Siehe Usman N., et al. (1996) Curr. Opin. Struct. Biol. 6: 527–533 und Ho und Parkinson, (1997) Semin. Oncol. 24: 187–202) und können in Säugerzellen zum Beispiel durch Mischen mit Lipiden oder durch Verwenden eines viralen oder Plasmidvektors abgegeben werden. Krankheiten und Zustände, die erwogen werden, schließen Wundheilung, Magengeschwür, Frakturen, Keloide, Gefäßentwicklung, Hämatopoiese, Ovulation, Menstruation und Plazentation ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Zusätzliche illustrative Ausführungsformen
Darüber hinaus wird ein Verfahren zum Nachweisen des Vorliegens von VEGI-Polypeptide in einer Probe zum Zweck der Diagnose oder Prognose einer angingen-assoziierten Krankheit beschrieben. Unter Verwendung einer auf dem Fachgebiet gut bekannten Standardmethodik kann ein diagnostischer Test durch Beschichten von Antikörpern, die spezifisch für VEGI-Polypeptide sind, auf eine Oberfläche (d. h. eine feste Unterlage) zum Beispiel eine Mikrotiterplatte oder eine Membran (z. B. eine Nitrocellulosemembran) und Inkontaktbringen der beschichteten Oberfläche mit Serum, Gewebe oder einer anderen biologischen oder chemischen Probe, die von einer Person erhalten wurde, die im Verdacht steht, eine angiogen-assoziierte Krankheit zu haben, konstruiert werden. Das Vorliegen eines resultierenden Komplexes, der zwischen VEGI-Polypeptid in der Probe und den dafür spezifischen Antikörpern gebildet wurde, kann daher durch jedes der auf dem Fachgebiet üblichen bekannten Verfahren wie der fluoreszierenden Antikörper-Spektroskopie oder Kolorimetrie nachgewiesen werden. Diese Verfahren des Nachweises kann zum Beispiel für die Diagnose oder Prognose von Krebs verwendet werden.
Es wird auch ein diagnostischer Kit beschrieben, der Antikörper, die für VEGI-Polypeptide spezifisch sind, und Hilfsreagenzien, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind und die für die Verwendung im Nachweisen des Vorliegens von VEGI-Polypeptiden in einer Serum-, Gewebe- oder anderen Probe geeignet sind, enthält. In Erwägung gezogene Gewebeproben können vom Affen oder Menschen oder von anderen Säugern erhalten werden.
RNA, DNA oder andere Nucleotidsequenzen werden für die Verwendung im Nachweisen des Vorliegens oder Fehlens von VEGI-Polynucleotiden unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder der reversen Transkriptions-PCR (RT-PCR) beschrieben. Die DNA-Sequenz, die in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8 oder in SEQ ID NO: 26 gezeigt ist, kann zum Zweck des Nachweisens des Vorliegens, Fehlens oder Quantifizierens der Menge des VEGI-Polynucleotids durch Vergleich mit einem Standard verwendet werden, um Primer zu gestalten, die spezifisch die an die VEGI-Polynucleotidsequenz im Fall der PCR oder an eine VEGI-cDNA, die von der reversen Transkription einer RNA, die ein VEGI-Polypeptid codiert, produziert wird, binden. Die Primer können jede Länge im Bereich von 7–40 Nucleotiden, vorzugsweise 10–15 Nucleotiden, am meisten bevorzugt 18–25 Nucleotiden sein. Reagenzien und Kontrollen, die für PCR- und RT-PCR-Reaktionen notwendig sind, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Die amplifizierten Produkte können dann auf das Vorliegen oder Fehlen von VEGI-Polypeptidsequenzen zum Beispiel durch Gel-Fraktionierung mit oder ohne Hybridisierung, durch Radiochemie und immun-chemische Techniken analysiert werden. Dieses Verfahren ist vorteilhaft, weil nur eine kleine Probengröße benötigt wird, um eine ausreichende Menge an Matrizen-DNA herzustellen, mit der die PCR oder RT-PCR durchgeführt werden soll.
Darüber hinaus wird ein diagnostischer Kit beschrieben, der PCR- oder RT-PCR-Primer, die spezifisch für VEGI-Polynucleotide sind, und Hilfsreagenzien, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind und die für die Verwendung im Nachweisen des Vorliegens oder Fehlens von VEGI-Polynucleotiden oder zum Quantifizieren der Menge einer RNA, die ein VEGI-Polypeptid codiert, in einer Probe unter Verwendung von PCR oder RT-PCR geeignet sind, enthält. In Erwägung gezogene Proben können von Menschen oder anderen Säugern erhalten werden.
VEGI wird in menschlichen Nabelvenen-Endothelzellen, induzierten Endothelzellen, Makrophagen und in Substantia nigra-Gewebe exprimiert. Für eine Reihe von mit den Immun- und Kreislaufsystemen in Beziehung stehenden Störungen können wesentlich veränderte (erhöhte oder verminderte) Spiegel der VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Genexpression in den Immun- und Kreislaufsystemen, Gewebe oder anderen Zellen oder Körperfüssigkeiten (z. B. Seren, Plasma, Urin, Synovialflüssigkeit oder Spinalflüssigkeit), die von einem Individuum genommen wurden, das eine solche Störung aufweist, im Vergleich zu einem „Standard"-VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Genexpressionsspiegel, das heißt, dem VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Expressionsspiegel in den Immun- oder Kreislaufsystemen, Geweben oder Körperflüssigkeiten von einem Individuum, das die Störung der Immun- und Kreislaufsysteme nicht hat, nachgewiesen werden. Daher wird ein diagnostisches Verfahren beschrieben, das während der Diagnose einer Störung der Immun- und Kreislaufsysteme nützlich ist, das Messen des Expressionsspiegels des Gens, das das VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Protein im Gewebe der Immun- und Kreislaufsysteme oder in anderen Zellen oder einer Körperflüssigkeit von einem Individuum codiert, und Vergleichen des gemessenen Genexpressionsspiegels mit einem Standard-VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Genexpressionsspiegel, involviert, wobei ein Anstieg oder Abfall im Genexpressionsspiegel im Vergleich zum Standard hinweisend auf eine Störung der Immun- und Kreislaufsysteme ist.
Daher ist ein diagnostisches Verfahren offenbart, das während der Diagnose einer Störung der Immun- und Kreislaufsysteme nützlich ist, das das Messen des Expressionsspiegels des Gens, das das VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Protein im Gewebe der Immun- und Kreislaufsysteme oder in anderen Zellen oder einer Körperflüssigkeit von einem Individuum codiert, und Vergleichen des gemessenen Genexpressionsspiegels mit einem Standard-VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Genexpressionsspiegel involviert, wobei ein Anstieg oder Abfall im Genexpressionsspiegel im Vergleich zum Standard hinweisend auf eine Störung der Immun- und Kreislaufsysteme ist.
Wo eine Diagnose einer Störung in den Immun- und Kreislaufsystemen bereits gemäß konventionellen Verfahren gemacht worden ist, ist das hierin offenbarte Verfahren als ein prognostischer Indikator nützlich, wobei Patienten, die eine verminderte VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Genexpression zeigen, ein schlechteres klinisches Ergebnis im Vergleich zu Patienten erfahren werden, die das Gen in einem näher zum Standardspiegel liegenden Spiegel exprimieren.
Mit „Testen des Expressionsspiegel des Gens, das das VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Protein codiert" ist ein qualitatives oder quantitatives Messen oder Schätzen des Spiegels des VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Polypeptids oder des Spiegels der mRNA, die das VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Polypeptid codiert, in einer ersten biologischen Probe entweder direkt (z. B. durch Bestimmen oder Schätzen des absoluten Polypeptid-Spiegels oder mRNA-Spiegels) oder relativ (z. B. durch Vergleichen des VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Polypeptidspiegels oder mRNA-Spiegels in einer zweiten biologischen Probe) vorgesehen. Vorzugsweise wird der VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Polypeptidspiegel oder mRNA-Spiegel in der ersten biologischen Probe gemessen oder geschätzt und mit einem Standard-VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Polypeptidspiegel oder mRNA-Spiegel verglichen, wobei der Standard von einer zweiten biologischen Probe genommen wird, die von einem Individuum erhalten wurde, das die Störung nicht hat, oder der durch Mitteln der Spiegel einer Population von Individuen, die keine Störung der Immun- und Kreislaufsysteme haben, festgestellt wird. Wie es auf dem Fachgebiet anerkannt werden wird, kann, sobald ein Standard-VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Polypeptidspiegel oder mRNA-Spiegel bekannt ist, er wiederholt als ein Standard zum Vergleich verwendet werden.
Mit „biologischer Probe" ist jede biologische Probe vorgesehen, die von einem Individuum, einer Körperfüssigkeit, Zelllinie, Gewebekultur oder einer anderen Quelle erhalten wurde, die ein VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Polypeptid oder eine mRNA enthält. Wie angezeigt, schließen biologische Proben Körperflüssigkeiten (wie Seren, Plasma, Urin, Synovialflüssigkeit und Spinatflüssigkeit), die ein freies VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Polypeptid enthalten, Gewebe von Immun- und Kreislaufsystemen und andere Gewebequellen, von denen gefunden wurde, dass sie vollständige oder reife VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Polypeptide oder einen VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Rezeptor exprimieren, ein. Verfahren zum Erhalten von Gewebebiopsien und Körperflüssigkeiten von Säugern sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Wo die biologische Probe mRNA einschließen soll, ist eine Gewebebiopsie die bevorzugte Quelle.
Zelluläre Gesamt-RNA kann von einer biologischen Probe unter Verwendung jeder geeigneten Technik wie dem Einzelschritt-Guanidinium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Verfahren, beschrieben von Chomczynski und Sacchi (Anal. Biochem. 162: 156–159 (1987)), isoliert werden. Die Spiegel der mRNA, die das VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Polypeptid codiert, werden dann unter Verwendung irgendeines geeigneten Verfahrens getestet. Diese schließen Northern Blot-Analyse, S1-Nuclease-Kartieren, die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), reverse Transkription in Kombination mit der Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) und reverse Transkription in Kombination mit der Ligase-Kettenreaktion (RT-LCR) ein.
Das Testen der VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Polypeptidspiegel in einer biologischen Probe kann unter Verwendung von Antikörper-basierenden Techniken erfolgen. Zum Beispiel kann die VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Polypeptidexpression in Geweben mit klassischen immunhistologischen Verfahren (Jalkanen, M., et al., J. Cell. Biol. 101: 976–985 (1985); Jalkanen, M., et al., J. Cell. Biol. 105: 3087–3096 (1987)) untersucht werden. Andere Antikörper-basierende Verfahren, die für das Nachweisen der VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Polypeptid-Genexpression nützlich sind, schließen Immuntests wie des Enzym-verknüpften Immunabsorptions-Test (ELISA) und den Radioimmuntest (RIA) ein. Geeignete Antikörper-Test-Markierungen sind auf dem Fachgebiet bekannt und schließen Enzymmarkierungen wie Glucoseoxidase und Radioisotopen wie Iod (¹²⁵I, ¹²¹I), Kohlenstoff (¹⁴C), Schwefel (³⁵S), Tritium (³H), Indium (¹¹²In) und Technetium (^99mTc) und fluoreszierende Markierungen wie Fluorescein und Rhodamin und Biotin ein.
Zusätzlich zum Testen der VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Polypeptidspiegel in einer biologischen Probe, die von einem Individuum erhalten wurde, kann das VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Polypeptid auch in vivo durch Bildgebung nachgewiesen werden. Antikörper-Markierungen oder Marker für eine in vivo-Bildgebung des VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Polypeptids schließen jene ein, die durch Röntgen-Radiographie, NMR oder ESR nachweisbar sind. Für die Röntgen-Radiographie schließen geeignete Markierungen Radioisotope wie Barium oder Cäsium ein, die eine nachweisbare Strahlung emittieren, aber nicht erkennbar schädlich für das Subjekt sind. Geeignete Marker für NMR und ESR schließen jene mit einem nachweisbaren charakteristischen Spin wie Deuterium ein, das in den Antikörper durch Markieren von Nährstoffen für das relevante Hybridom inkorporiert werden können.
Ein VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Polypeptid-spezifischer Antikörper oder Antikörperfragment, das mit einer geeigneten nachweisbaren Bildgebungseinheit wie einem Radioisotop (zum Beispiel ¹³¹I, ¹¹²In, ^99mTc), einer röntgendichten Substanz oder einem Material markiert worden ist, das durch kernmagnetische Resonanz nachweisbar ist, wird in den Säuger, der auf eine Immunsystem-Störung untersucht werden soll, eingebracht (zum Beispiel parenteral, subcutan oder intraperitoneal). Es wird auf dem Fachgebiet verstanden werden, dass die Größe des Subjekts und das verwendete Bildgebungssystem die Menge der Bildgebungseinheit, die benötigt wird, um diagnostische Bilder zu produzieren, bestimmen werden. Im Fall einer radioaktiven Isotopen-Einheit wird für ein menschliches Subjekt die Menge der injizierten Radioaktivität normalerweise im Bereich von etwa 5 bis 20 Millicurie von ^99mTc liegen. Der markierte Antikörper oder das Antikörperfragment wird dann vorzugsweise an der Stelle der Zellen akkumulieren, die das VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Polypeptid enthält. Eine in vivo-Tumor-Bildgebung wird von Burchiel und Mitarbeitern beschrieben (Kapitel 13 in Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer, Burchiel, S. W. und Rhodes, B. A., Hrsg., Masson Publishing Inc. (1982)).
Wie oben angemerkt, sind die VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Polynucleotide und Polypeptide nützlich für die Diagnose von Zuständen, die eine abnormal hohe oder niedrige Expression von VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Aktivitäten involvieren. In Anbetracht der Zellen und Gewebe, wo VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta exprimiert wird, sowie der Aktivitäten, die durch VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta moduliert werden, ist es leicht ersichtlich, dass ein wesentlich veränderter (erhöhter oder verminderter) Spiegel der Expression von VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta in einem Individuum im Vergleich zum Standard- oder „normalen" Spiegel pathologische Bedingungen produziert, die mit den (dem) Körpersystem(en) in Beziehung stehen, in dem (denen) VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta exprimiert wird und/oder aktiv ist.
Die Moleküle, Verfahren und Kits, die hierin offenbart sind, sind auch nützlich für die Diagnose oder Behandlung von verschiedenen Erkrankungen in Säugern, vorzugsweise Menschen, die mit dem Immun- und Kreislaufsystem in Beziehung stehen. Solche Erkrankungen schließen Infektionen durch Bakterien, Viren und andere Parasiten, Immunschwächen, Entzündungskrankheiten, Lymph-Adenopathien, Autoimmunkrankheiten, Transplantat-Abstoßungskrankheit, und jede Fehlregulierung von Immun- und Kreislaufsystem-Zellfunktionen ein, einschließlich Autoimmunität, Leukämien, Lymphome, Immunsuppression, Immunität, humoraler Immunität, entzündlicher Krankheit des Verdauungssystems, Myelo-Suppression und dergleichen, aber nicht limitiert darauf.
Da VEGI-Polypeptide die Aktivierung von zellulärem
und c-jun N-terminaler Kinase (JNK) induzieren können, ist es auch nützlich im therapeutischen Regulieren solcher zellulärer und immun-systemischer Störungen wie Infektionen durch Bakterien, Viren und andere Parasiten, Immunschwächen, Entzündungskrankheiten, Lymphadenopathie, Autoimmunkrankheiten, Transplantat-Abstoßungen, Autoimmunität, Immunsuppression, entzündliche Darmerkrankung, Myelo-Suppression und verwandte Folgekrankheiten.
Da VEGI-alpha- und VEGI-beta zu der TNF-Superfamilie gehören, modulieren sie auch die Angiogenese. Zusätzlich, da VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Polypeptide die immun-Zellfunktionen hemmen, werden sie einen weiten Bereich von anti-inflammatorischen Aktivitäten haben. VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Polypeptide können als ein anti-Gefäßneubildungs-Agens angewendet werden, um die Einwanderung und Aktivierung von Wirts-Abwehrzellen, z. B. cytotoxischen T-Zellen und Makrophagen zu stimulieren. Fachleute werden viele Nicht-Krebs-Indikationen erkennen, wo eine Blutgefäß-Proliferation nicht erwünscht ist. VEGI-alpha- und VEGI-beta-Polypeptide können auch angewendet werden, um Wirts-Abwehrvorgänge gegen resistente chronische und akute Infektionen, zum Beispiel mycobakterielle Infektionen durch die Anziehung und Aktivierung von mikrobiziden Leukocyten zu verstärken. VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Polypeptide können auch angewendet werden, um die T-Zellproliferation durch die Hemmung der IL-2-Biosynthese für die Behandlung von T-Zelt-vermittelten Autoimmunkrankheiten zu hemmen. VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Polypeptide können auch angewendet werden, um die Wundheilung sowohl durch die Rekrutierung der Debris-Reinigung als auch Bindegewebe-fördernde Entzündungszellen zu stimulieren. Auf dieselbe Weise können VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Polypeptide auch angewendet werden, um andere fibrotische Störungen, einschließlich Leberzirrhose, Osteoarthritis und Lungenfibrose, zu behandeln. VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Polypeptide erhöhen auch das Vorliegen von Eosinophilen, die die ausgeprägte Funktion des Abtötens der Larven von Parasiten haben, die in Gewebe einwandern, wie bei Schistosomiasis, Trichinose und Milbenbefall. VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Polypeptide können auch angewendet werden, um die Hämatopoiese durch Regulieren der Aktivierung und Differenzierung von verschiedenen hämatopoietischen Vorläuferzellen zu regulieren, zum Beispiel um nach einer Chemotherapie reife Leukocyten aus dem Knochenmark freizusetzen, d. h. in der Stammzell-Mobilisierung. VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Polypeptide können auch angewendet werden, um eine Sepsis zu behandeln.
Es wird durch einen Fachmann auch anerkannt werden, dass, da die beschriebenen VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Polypeptide Mitglieder der TNF-Familie sind, die reife sezernierte Form des Proteins in löslicher Form von den Zellen, die VEGI exprimieren, durch proteolytische Spaltung freigesetzt werden kann. Daher wird das Polypeptid, wenn die reife Form oder die lösliche extrazelluläre Domäne von VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta aus einer exogenen Quelle zu Zellen, Geweben oder dem Körper eines Individuums zugefügt wird, seine physiologischen Aktivitäten auf seine Zielzellen jenes Individuums ausüben. Zellen, die dieses Typ II-Transmembran-Polypeptid exprimieren, können auch zu Zellen, Geweben oder dem Körper eines Individuums zugefügt werden, und diese zugefügten Zellen werden an Zellen binden, die den Rezeptor für VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta exprimieren, wodurch die Zellen, die die VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Polypeptide exprimieren, Aktivitäten (z. B. Regulierung des Endothelzell-Wachstums und der Regulierung) auf die Rezeptor-tragenden Zielzellen bewirken können.
Daher wird anerkannt werden, dass Zustände, die durch einen Abfall im Standard- oder normalen Spiegel der VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Aktivitäten in einem Individuum bewirkt werden, insbesondere Störungen der Immun- und Kreislaufsysteme durch Verabreichung eines VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Polypeptids (in der Form des reifen Polypeptids oder des extrazellulären Domäne-Polypeptids) behandelt werden können. Daher illustriert die Erfindung auch die Nützlichkeit von VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta in einem Verfahren der Behandlung eines Individuums, das einen erhöhten Spiegel der VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Aktivität benötigt, umfassend das Verabreichen eines Arzneimittels an solch ein Individuum, umfassend eine Menge eines isolierten VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Polypeptids der Erfindung, insbesondere einer reifen Form des VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Polypeptids der Erfindung, die wirksam ist, um den VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Aktivitätsspiegel in solch einem Individuum zu erhöhen.
Die Zelladhäsions-Aktivität von VEGI kann für die Wundheilung angewendet werden. VEGI hat eine starke Endothelzell-Proliferationswirkung, was ein Hinweis ist, dass VEGI eine Rolle in der Wundheilung spielt. Die Zell-adhäsiven Wirkungen von VEGI können auch eine Rolle in der Wundheilung spielen.
Das VEGI-Polypeptid ist durch seine Fähigkeit, die Aktivierung von T-Zellen zu stabilisieren, ein wichtiger Vermittler der Immunantwort. Dementsprechend kann dieses Polypeptid verwendet werden, um eine Immunantwort gegen eine Vielfalt von parasitischen, bakteriellen und viralen Infektionen zu stimulieren. VEGI-Polypeptide können Virus-infizierte Zellen lysieren und daher angewendet werden, um HIV-infizierte Zellen zu stoppen.

Das VEGI-Polypeptid kann auch angewendet werden, um Autoimmunkrankheiten wie Typ I-Diabetes durch Verstärken der T-Zell-proliferativen Antwort zu behandeln. Tabelle 2 Zusammenfassung der VEGI-Aktivität

Zelllinien	Quelle und Typ	Zytotoxizität	Proliferation	Differenzierung	Adhäsion
L929	Maus-Fibroblast	+	-	-	-
WEHI 164	Maus-Fibrosarkom Rattenniere	+++	-	-	-
NRK-54E	Epithel-ähnlich menschlich	+	-	-	-
THP-1	monocytische Leukämie menschlich	+	-	++	++
HL-60	promyelocytische Leukämie menschlich	-	-	-	++
Raji	Burkitt-Lymphom menschlich	-	-	-	-
Jurkat	T-Zell-Lymphom	++	-	-	-
Primär	HUVEC menschlich, arteriell	-	++	-	?
Primär	endothelial menschlich	+*	++	-	?
A-431	epidermoides Karzinom menschlich	++	-	-	-
293	embryonale Niere	-	++	-	-

Legende: * Nur bei einer hohen Dosis. Die Zahl von „+" weist auf den relativen Spiegel der Aktivitäten hin. „–„ weist auf keine nachgewiesene Aktivität im getesteten Konzentrationsbereich hin.

VEGI kann verwendet werden, um die Proliferation von Endothelzellen, zum Beispiel von Aorta-Endothelzellen zu hemmen. Bei Konzentrationen von bis zu 10 μg/ml kann VEGI das Wachstum von Endothelzellen beinahe vollständig hemmen, während es keine ersichtliche Wirkung auf das Wachstum von menschlichen Brustkrebs-Zellen hat. Als ein Ergebnis kann VEGI verwendet werden, um Krankheiten und Störungen zu behandeln, in denen die Hemmung des Endothelzell-Wachstums vorteilhaft ist.
VEGI-Polypeptide, wie hierin beschrieben, sind verwendet worden, um die Bildung von Kapillar-ähnlichen tubulären Strukturen, die durch Endothelzellen in vitro gebildet werden, zu reduzieren. VEGI-Polypeptide, wie hierin beschrieben, können verwendet werden, um die Bildung von Endothelzellen, die in Kapillar-ähnliche tubuläre Strukturen organisiert sind, als Antwort auf angiogenetische Faktoren wie FGF-2 zu hemmen. Darüber hinaus kann isoliertes VEGI, wie hierin beschrieben, auch verwendet werden, um das Wachstum und die Organisation von Endothelzellen in Kapillargefäße in einer modifizierten Hühnerembryo-Chorioallantoismembran (CAM) zu hemmen. Als ein Ergebnis kann VEGI, wie hierin beschrieben, verwendet werden, um die Bildung von Kapillaren oder Kapillar-ähnlichen Strukturen von Endothelzellen in vitro zu hemmen.
Die Polynucleotide und Polypeptide, wie hierin beschrieben, können als Forschungsreagenzien und Materialien für die Entdeckung von Behandlungen und Diagnostika für eine menschliche Krankheit angewendet werden.
Ein Verfahren zur Identifizierung des Rezeptors für VEGI wird auch in Betracht gezogen. Das Gen, das den Rezeptor codiert, kann durch zahlreiche Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, zum Beispiel Liganden-Schwenken und FACS-Sortieren (Coligan, et al., Current Protocols in Immun., 1(2), Kapitel 5, (1991)) identifiziert werden. Vorzugsweise wird ein Expressions-Clonieren angewendet, in dem polyadenylierte RNA von einer Zelle, die auf VEGI reagiert, hergestellt wird, und eine cDNA-Genbank, die von dieser RNA gebildet wird, wird in Pools geteilt und verwendet, um COS-Zellen oder andere Zellen, die nicht responsiv gegenüber VEGI sind, zu transfizieren. Die transfizierten Zellen, die auf Glas-Objektträgern gezüchtet werden, werden markiertem VEGI ausgesetzt. VEGI kann durch eine Vielfalt von Mitteln, einschließlich Iodierung oder Einschluss einer Erkennungsstelle für eine ortsspezifische Proteinkinase, markiert werden. Nach der Fixierung und Inkubation werden die Objektträger einer autoradiographischen Analyse unterzogen. Positive Pools werden identifiziert, und Sub-Pools werden hergestellt und unter Verwendung eines iterativen Sub-Poolens und Re-Screening-Vorgangs re-transfiziert, was schlussendlich einen einzelnen Clon ergibt, der den mutmaßlichen Rezeptor codiert.
Als ein alternativer Ansatz für die Rezeptor-Identifizierung kann markiertes VEGI mit Zellmembran- oder Extrakt-Präparationen, die das Rezeptormolekül exprimieren, Photoaffinitäts-verknüpft werden. Vernetztes Material wird durch PAGE gelöst und einem Röntgenfilm ausgesetzt. Der markierte Komplex, der den VEGI-Rezeptor enthält, dann ausgeschnitten, in Peptidfragmente gelöst und einem Protein-Mikrosequenzieren unterzogen werden. Die aus dem Mikrosequenzieren erhaltene Aminosäuresequenz würde verwendet werden, um einen Satz von degenerierten Oligonucleotid-Sonden zu gestalten, um eine cDNA-Genbank zu screenen, um das Gen zu identifizieren, das den mutmaßlichen Rezeptor codiert.
Die VEGI-Polypeptid-Zusammensetzung gemäß den Verwendungen der vorliegenden Erfindung wird in einer Weise formuliert und dosiert werden, die unter Berücksichtigung des klinischen Zustands des individuellen Patienten (besonders der Nebenwirkungen der Behandlung mit dem VEGI-Polypeptid alleine), der Stelle der Abgabe der VEGI-Polypeptid-Zusammensetzung, des Verfahrens der Verabreichung, des Zeitplans der Verabreichung und anderer Faktoren, die Praktikern bekannt sind, übereinstimmend mit guter medizinischer Praxis ist. Die „wirksame Menge" des VEGI-Polypeptids für die Zwecke hierin wird daher durch solche Berücksichtigungen bestimmt.
Die Antagonisten können in einer Zusammensetzung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, z. B. wie hierin nachstehend beschrieben, angewendet werden.
Die hierin beschriebenen VEGI-Polypeptide und Agonisten und Antagonisten können in Kombination mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger angewendet werden. Solche Zusammensetzungen umfassen eine therapeutisch wirksame Menge der Verbindung und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder ein Vehikel. Solch ein Träger schließt Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, Dextrose, Wasser, Glycerin, Ethanol und Kombinationen davon ein, ist aber nicht darauf limitiert. Die Formulierung sollte zum Weg der Verabreichung passen.
Eine pharmazeutische Packung oder ein Kit, umfassend ein oder mehrere Behälter, der (die) mit einem oder mehreren der Bestandteile der Arzneimittel gefüllt sind (ist), die gemäß der Erfindung hergestellt werden, wird auch beschrieben. Mit (einem) solchen Behälter(n) kann ein Hinweis in der Form, die durch eine Regierungsbehörde, die die Herstellung, Verwendung oder den Verkauf von Pharmazeutika oder biologischen Produkten reguliert, vorgeschrieben ist, verbunden sein, wobei der Hinweis die Zulassung der Herstellung, Verwendung oder des Verkaufs für eine menschliche Verabreichung durch die Behörde reflektiert. Zusätzlich können die Arzneimittel, die gemäß den Verwendungen der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, im Zusammenhang mit anderen therapeutischen Verbindungen angewendet werden.
Die Arzneimittel werden allgemein in einer solchen Weise gestaltet, dass sie in einfacher Weise wie durch die topischen, intravenösen, intraperitonealen, intramuskulären, subcutanen, intranasalen oder intradermalen Wege verabreicht werden können. Die Arzneimittel werden vorzugsweise so gestaltet, dass sie geeignet sind, um in einer Menge verabreicht zu werden, die zum Behandeln und/oder für die Prophylaxe der spezifischen Indikation wirksam ist. Im Allgemeinen sind sie geeignet, um in einer Menge von mindestens etwa 10 g/kg Körpergewicht verabreicht zu werden, und in den meisten Fällen werden sie in einer Menge, die 8 mg/kg Körpergewicht pro Tag nicht übersteigt, verabreicht. In den meisten Fällen ist die Dosierung von etwa 10 g/kg bis etwa 1 mg/kg Körpergewicht täglich, berücksichtigend die Wege der Verabreichung, Symptome, usw.
Verschiedene Abgabesysteme sind bekannt und können verwendet werden, um die hierin beschriebenen VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Polypeptide zu verabreichen, z. B. Einkapselung in Liposomen; Mikropartikel, Mikrokapseln, Rezeptor-vermittelte Endocytose (siehe z. B. Wu und Wu 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429–4432). Die Verfahren des Einbringens schließen topische, intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subcutane, intranasale, epidurale, ophtalmische und orale Wege ein, sind aber nicht darauf limitiert. Die Verbindungen können auf jedem praktischen Weg verabreicht werden, zum Beispiel durch Infusion oder Bolus-Injektion, durch Absorption durch epitheliale oder mucocutane Auskleidungen (z. B. orale Mucosa, rektale und intestinale Mucosa), und kann zusammen mit anderen biologisch aktiven Bestandteilen verabreicht werden.
In einer spezifischen Ausführungsform kann es wünschenswert sein, die Arzneimittel für die Verabreichung lokal an das Gebiet, das eine Behandlung benötigt, zu gestalten. Dies kann zum Beispiel durch lokale Infusion während einer Operation, topische Anwendung z. B. im Zusammenhang mit einem Wundverband, durch Injektion, durch einen Katheter, durch ein Suppositorium oder durch ein Implantat, wobei das Implantat aus einem porösen, nicht-porösen oder gel-artigen Material, einschließlich Membranen wie sialastischen Membranen oder Fasern besteht, erreicht werden, ist aber nicht darauf limitiert.
Eine topische Anwendung eines hierin beschriebenen VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Polypeptids für die Behandlung von zu mindestens manchen der hierin diskutierten Augenerkrankungen besteht aus einer wirksamen Menge des beschriebenen VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Polypeptids in einem ophtalmologisch verträglichen Träger wie gepufferter Kochsalzlösung, Mineralöl, Pflanzenölen (wie zum Beispiel Mais- oder Erdnuss-Ölen), Vaselin, Miglyol 182, Alkohollösungen oder Liposomen oder Liposom-ähnlichen Produkten. Jede dieser Zusammensetzungen kann auch Konservierungsstoffe, Antioxidanzien, Antibiotika, Immunsuppressiva und andere biologisch oder pharmazeutisch wirksame Mittel einschließen, die keinen schädlichen Effekt auf das beschriebene VEGI-alpha- und/oder VEGI-beta-Polypeptid ausüben.
Die VEGI-Polypeptide und Agonisten und Antagonisten, die Polypeptide sind, können auch in den Verwendungen der vorliegenden Erfindung durch Expression solcher Polypeptide in vivo angewendet werden, was oft als „Gentherapie" bezeichnet wird.
Daher können zum Beispiel Zellen von einem Patienten mit einem Polynucleotid (DNA oder RNA), das ein Polypeptid ex vivo codiert, konstruiert werden, wobei die konstruierten Zellen dann an einen Patienten, der mit dem Polypeptid behandelt werden soll, bereitgestellt werden. Solche Verfahren sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und sind aus den Lehren hierin offensichtlich. Zum Beispiel können Zellen durch die Verwendung eines retroviralen Partikels, das eine RNA enthält, die ein Polypeptid, wie hierin beschrieben, codiert, konstruiert werden.
In ähnlicher Weise können die Zellen in vivo für die Expression eines Polypeptids in vivo durch zum Beispiel auf dem Fachgebiet bekannte Vorgehensweisen konstruiert werden. Zum Beispiel kann eine Hersteller-Zelllinie für die Produktion eines retroviralen Partikels, das RNA enthält, die ein Polypeptid, wie hierin beschrieben, codiert, für das Konstruieren von Zellen in vivo und die Expression des Polypeptids in vivo an einen Patienten verabreicht werden. Diese und andere Verfahren für das Verabreichen eines Polypeptids, wie hierin beschrieben, durch solche Verfahren sollten für Fachleute aus den Lehren der vorliegenden Erfindung offensichtlich sein. Zum Beispiel kann das Expressionsvehikel für das Konstruieren von Zellen anders als ein Retrovirus sein, zum Beispiel ein Adenovirus, das verwendet werden kann, um nach Kombination mit einem geeigneten Abgabevehikel Zellen in vivo zu konstruieren.
Retroviren, von denen die hierin oben erwähnten retroviralen Plasmidvektoren abgeleitet werden können, schließen murines Moloney-Leukämievirus, Milznekrose-Virus, Retroviren wie Rous-Sarkoma-Virus, Harvey-Sarkoma-Virus, Vogelleukose-Virus, Gibbonaffen-Leukämievirus, menschliches Immunschwächevirus, Adenovirus, Myeloproliferatives Sarkomvirus und Brustdrüsentumor-Virus ein, sind aber nicht darauf beschränkt. In einer Ausführungsform wird der retrovirale Plasmidvektor vom murinen Moloney-Leukämievirus abgeleitet.
Der Vektor schließt einen oder mehrere Promotor(en) ein. Geeignete Promotoren, die angewendet werden können, schließen die retrovirale LTR; den SV40-Promotor und den menschlichen Cytomegalie-Virus (CMV)-Promotor, beschrieben durch Miller und Mitarbeiter (Biotechniques 7: 980–990 (1989)), oder jeden anderen Promotor (z. B. zelluläre Promotoren wie eukaryontische zelluläre Promotoren, einschließlich aber nicht limitiert auf die (der) Histon-, pol III- und b-Actin-Promotoren) ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Andere virale Promotoren, die angewendet werden können, schließen Adenovirus-Promotoren, Thymidinkinase (TK)-Promotoren und B19-Parvovirus-Promotoren ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Die Auswahl eines geeigneten Promotors wird aus den hierin enthaltenen Lehren für Fachleute offensichtlich sein.
Die Nucleinsäuresequenz, die das Polypeptid, wie hierin beschrieben, codiert, ist unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors. Geeigneten Promotoren, die angewendet werden können, schließen adenovirale Promotoren wie den adenoviralen späten Hauptpromotor oder heterologe Promotoren wie den Cytomegalievirus(CMV)-Promotor; den respiratorisches Syncytium-Virus(RSV)-Promotor; induzierbare Promotoren wie den MMT-Promotor, den Metallothionein-Promotor; Hitzeschock-Promotoren; den Albumin-Promotor; den ApoAI-Promotor; menschliche Globin-Promotoren, virale Thymidinkinase-Promotoren wie den Herpes simplex-Thymidinkinase-Promotor; retrovirale LTRs (einschließlich der hierin oben beschriebenen modifizierten retroviralen LTRs); den b-Actin-Promotor; und menschliche Wachstumshormon-Promotoren ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Der Promotor kann auch der natürliche Promotor sein, der das Gen kontrolliert, das das Polypeptid codiert.
Der retrovirale Plasmidvektor wird angewendet, um Verpackungszelllinien zu transduzieren, um Hersteller-Zelllinien zu bilden. Beispiele von Verpackungszelllinien, die transfiziert werden können, schließen die PE501-, PA317-, b-2-, b-AM-, PA12-, T19-14X-, VET-19-17-H2-, CRE-, β-CRIP-, GP + E-86-, GP + envAm12- und DAN-Zelllinien, beschrieben von Miller (Human Gene Therapy 1: 5–14 (1990)), was hierin durch Bezugnahme in seiner Gänze inkorporiert ist, ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Der Vektor kann die Verpackungszellen durch jedes auf dem Fachgebiet bekannte Mittel transduzieren. Solche Mittel schließen Elektroporation, die Verwendung von Liposomen und CaPO₄-Präzipitation ein, sind aber nicht darauf beschränkt. In einer Alternative kann der retrovirale Plasmidvektor in ein Liposom verkapselt oder an ein Lipid gekoppelt und dann an einen Wirt verabreicht werden.
Die Hersteller-Zelllinie stellt infektiöse retrovirale Vektorpartikel her, die die Nucleinsäuresequenz(en) einschließen, die die Polypeptide codieren (codiert). Solche retrovirale Vektorpartikel können dann angewendet werden, um eukaryontische Zellen entweder in vitro oder in vivo zu transduzieren. Die transduzierten eukaryontischen Zellen werden die Nucleinsäuresequenz(en) exprimieren, die das Polypeptid codieren (codiert). Eukaryontische Zellen, die transduziert werden können, schließen embryonale Stammzellen, embryonale Karzinomzellen so wie hämatopoietische Stammzellen, Hepatocyten, Fibroblasten, Myoblasten, Keratinocyten, Endothelzellen und bronchiale Epithelzellen ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Die Erfindung beschreibt auch ein Verfahren zum Screenen von Verbindungen, um jene zu identifizieren, die VEGI imitieren (Agonisten) oder die Wirkung von VEGI verhindern (Antagonisten). Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein in vitro-Verfahren zum Testen von möglichen Agenzien oder Arzneistoffen auf eine angingen-hemmende Aktivität, wobei das Verfahren das Messen der Fähigkeit des Agens oder Arzneistoffs umfasst, um die anti-angiogene Aktivität eines Polypeptids zu erhöhen, das durch ein Nucleinsäuremolekül codiert wird, umfassend ein Polynucleotid, das ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus:

(a) einem Polynucleotid, das ein Polypeptid codiert, umfassend die Aminosäuren 1 bis 174 von SEQ ID NO: 2;
(b) einem Polynucleotid, das ein Polypeptid codiert, umfassend die Aminosäuren 23 bis 174 von SEQ ID NO: 2;
(c) einem Polynucleotid, das ein Polypeptid codiert, umfassend die Aminosäuren 39 bis 174 von SEQ ID NO: 2;
(d) einem Polynucleotid, das ein Fragment des Polypeptids gemäß einem von (a) bis (c) codiert, das eine Angiogenese-hemmende Aktivität hat;
(e) einem Polynucleotid, das mit dem Komplement von SEQ ID NO: 1 hybridisiert, wobei das Polynucleotid ein Polypeptid codiert, das eine Angiogenese-hemmende Aktivität hat;
(f) einem Polynucleotid, das eine allelische Variante des Polynucleotids gemäß einem von (a) bis (e) codiert;
(g) einem Polynucleotid von einem gemäß (a) bis (f), das ein Polypeptid codiert, das ein Sekretionssignal umfasst; und
(h) dem komplementären Strang von einem der obigen (a) bis (g);

Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung ein in vitro-Verfahren zum Testen der Fähigkeit eines Arzneistoffes oder eines Agens, die Angiogenese zu fördern, wobei das Verfahren das Messen der Fähigkeit des Arzneistoffs oder Agens, die Funktion eines Polypeptids, das durch ein Nucleinsäuremolekül, umfassend ein Polynucleotid, wie hierin oben erwähnt, in einem in vitro-Test codiert wird, zu reduzieren oder zu eliminieren, umfasst.
Ein Beispiel eines solchen Verfahrens nützt die Fähigkeit von VEGI-Polypeptiden aus, die Proliferation von menschlichen Endothelzellen in der Anwesenheit des Co-Mitogens Con A signifikant zu stimulieren. Endothelzellen werden erhalten und in Kulturschalen mit 96 Vertiefungen mit flachen Boden (Costar, Cambridge, MA) in RPMI 1640, ergänzt mit 10% hitze-inaktiverem fötalem bovinem Serum (Hyclone Labs, Logan, UT), 1% L-Glutamin, 100 E/ml Penicillin, 100 g/ml Streptomycin, 0,1% Gentamycin (Gibco Life Technologies, Grand Island, NY), in der Anwesenheit von 2 g/ml Con A (Calbiochem, La Jolla, CA) kultiviert. Con A und die Verbindung, auf die gescreent werden soll, werden zu einem Endvolumen von 0,2 ml zugefügt. Nach 60 h bei 37°C werden die Kulturen mit 1 Ci[³H]Thymidin (5 Ci/mmol; 1 Ci = 37 BGq; NEN) für 12–18 h pulsiert und auf Glasfaserfilter (PhD; Cambridge Technology, Watertown, MA) geerntet. Die mittlere [³H]Thymidin-Inkorporierung (cpm) von Kulturen in dreifacher Ausführung wird unter Verwendung eines Flüssig-Szintillationszählers (Beckman Instruments, Irvine, CA) bestimmt. Eine signifikante [³H]-Thymidin-Inkorporation weist auf eine Stimulierung der Endothelzell-Proliferation hin.
Alternativ würde die Antwort eines bekannten "second messenger"-Systems nach der Interaktion der VEGI-Polypeptide und des Rezeptors gemessen und in der Anwesenheit oder Abwesenheit der Verbindung verglichen. Solche "second messenger"-Systeme schließen cAMP-Guanylatcyclase, Ionenkanäle oder Phosphoinositid-Hydrolyse ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Um auf Antagonisten zu testen, wird der oben beschriebene Test durchgeführt, in diesem Test wird jedoch VEGI zusammen mit der Verbindung, die gescreent werden soll, zugefügt, und die Fähigkeit der Verbindung, einen [³H]Thymidin'-Einbau in der Anwesenheit von VEGI-Polypeptiden zu hemmen, weist darauf hin, dass die Verbindung ein Antagonist von VEGI ist. Alternativ können VEGI-Antagonisten durch Kombinieren von VEGI und eines potenziellen Antagonisten mit membran-gebundenen VEGI-Rezeptoren oder rekombinanten Rezeptoren unter geeigneten Bedingungen für einen kompetitiven Inhibitionstest nachgewiesen werden. VEGI kann markiert werden, wie durch Radioaktivität, sodass die Zahl der VEGI-Moleküle, die an den Rezeptor gebunden sind, die Wirksamkeit des potenziellen Antagonisten bestimmen kann.
Alternativ wird eine Säugerzelle oder eine Membranpräparation, die den VEGI-Rezeptor exprimiert, mit markiertem VEGI in der Anwesenheit der Verbindung inkubiert. Die Fähigkeit der Verbindung, diese Interaktion zu verstärken oder zu blockieren, könnte dann gemessen werden.
Die Erfindung illustriert auch ein Verfahren zum Identifizieren eines Rezeptorproteins oder eines anderen Liganden-bindenden Proteins, das spezifisch an ein VEGI-Polypeptid (z. B. DR3) bindet. Zum Beispiel kann ein zelluläres Kompartment wie eine Membran oder eine Präparation davon von einer Zelle hergestellt werden, die ein Molekül exprimiert, das VEGI-Polypeptide bindet. Die Präparation wird mit markierten VEGI-Polypeptiden inkubiert, und Komplexe des VEGI-Polypeptids, die an den Rezeptor oder ein anderes Bindungsprotein gebunden sind, werden gemäß auf dem Fachgebiet bekannten Routineverfahren isoliert und charakterisiert. Alternativ kann das VEGI-Polypeptid an eine feste Unterlage gebunden sein, sodass von Zellen gelöste Bindungsmoleküle an die Säule gebunden und dann gemäß Routineverfahren eluiert und charakterisiert werden.
Im Test der Erfindung für Agonisten oder Antagonisten kann ein zelluläres Kompartment wie eine Membran oder eine Präparation davon von einer Zelle hergestellt werden, die ein Molekül exprimiert, das VEGI bindet, wie ein Molekül eines Signal- oder regulatorischen Signalwegs, der durch VEGI moduliert wird. Die Präparation wird mit markiertem VEGI-Polypeptid in der Abwesenheit oder der Anwesenheit eines Kandidatenmoleküls, das ein VEGI-Agonist oder -Antagonist sein kann, inkubiert. Die Fähigkeit des Kandidatenmoleküls, das Bindungsmolekül zu binden, wird in der verminderten Bindung des markierten Liganden reflektiert. Moleküle, die unnötig binden, d. h. ohne die Wirkungen von VEGI auf die Bindung des VEGI-Bindungsmoleküls zu induzieren, sind höchstwahrscheinlich gute Antagonisten. Moleküle, die gut binden und Wirkungen hervorrufen, die dieselben oder nahe verwandt zu VEGI sind, sind Agonisten.
VEGI-ähnliche Wirkungen von potenziellen Agonisten und Antagonisten können zum Beispiel durch Bestimmen der Aktivität eines "second messenger"-Systems nach der Interaktion des Kandidatenmoleküls mit einer Zelle oder einer geeigneten Zellpräparation und Vergleichen der Wirkung mit jener von VEGI oder von Molekülen, die dieselben Wirkungen wie VEGI hervorrufen, gemessen werden. "second messenger"-Systeme, die in dieser Hinsicht nützlich sein können, schließen "second messenger"-System der AMP-Guanylatcyclase, Ionenkanal oder Phosphoinositid-Hydrolyse ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Ein weiteres Beispiel eines Tests auf VEGI-Antagonisten ist ein kompetitiver Test, der das VEGI-Polypeptid und einen potenziellen Antagonisten mit membran-gebundenen VEGI-Rezeptormolekülen oder rekombinanten VEGI-Rezeptormolekülen unter geeigneten Bedingungen für einen kompetitiven Inhibitions-Test kombiniert. Das VEGI-Polypeptid kann markiert sein, wie durch Radioaktivität, sodass die Zahl der an das Rezeptormolekül gebundenen VEGI-Moleküle genau bestimmt werden kann, um die Wirksamkeit des potenziellen Antagonisten zu bewerten.
Potenzielle Antagonisten schließen kleine organische Moleküle, Peptide, Polypeptide und Antikörper ein, die an ein Polypeptid, wie hierin beschrieben, binden und dadurch seine Aktivität hemmen oder auslöschen. Potenzielle Antagonisten können auch kleine organische Moleküle, ein Peptid, ein Polypeptid wie ein nahe verwandtes Protein oder ein Antikörper sein, der dieselben Stellen auf einem Bindungsmolekül wie einem Rezeptormolekül bindet, ohne VEGI-induzierte Aktivitäten zu induzieren, wodurch die Aktion von VEGI durch das Ausschließen von VEGI von der Bindung verhindert wird.
Andere potenzielle Antagonisten schließen Antisense-Moleküle ein. Die Antisense-Technologie kann verwendet werden, um die Genexpression durch Antisense-DNA oder -RNA oder durch Dreifach-Helix-Bildung zu kontrollieren. Antisense-Techniken werden in einer Reihe von Untersuchungen (zum Beispiel Okano, J. Neurochem. 56: 560 (1991); „Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression." CRC Press, Boca Raton, FL (1988)) diskutiert. Die Dreifach-Helix-Bildung wird auch in einer Reihe von Untersuchungen diskutiert (zum Beispiel Lee, et al., Nucleic Acids Research 6: 3073 (1979); Cooney, et al., Science 241: 456 (1988); Dervan, et al., Science 251: 1360 (1991)). Die Verfahren basieren auf der Bindung eines Polynucleotids an eine komplementäre DNA oder RNA. Zum Beispiel kann der 5'-codierende Teil eines Polynucleotids, der das reife Polypeptid, wie hierin beschrieben, codiert, verwendet werden, um ein Antisense-RNA-Oligonucleotid von etwa 10 bis 40 Basenpaaren Länge zu gestalten. Ein DNA-Oligonucleotid wird so konstruiert, dass es komplementär zu einer Region des Gens ist, das in die Transkription involviert ist, wodurch die Transkription und die Produktion von VEGI verhindert wird. Das Antisense-RNA-Oligonucleotid hybridisiert in vivo an die mRNA und blockiert die Translation des mRNA-Moleküls in das VEGI-Polypeptid. Die oben beschriebenen Oligonucleotide können auch an Zellen abgegeben werden, sodass die Antisense-RNA oder -DNA in vivo exprimiert werden kann, um die Produktion des VEGI-Polypeptids zu inhibieren.
Antikörper, die spezifisch für VEGI-Polypeptide sind, können durch Bindung an VEGI und Abhalten desselben vom Binden an seinen Rezeptor als Antagonisten verwendet werden. Monoclonale Antikörper sind in dieser Hinsicht besonders wirksam. Antikörper, die für den VEGI-Rezeptor spezifisch sind, können jedoch bestimmte zelluläre Antworten vermitteln, die dazu tendieren, die Wirkungen von VEGI bei der Interaktion mit seinem Rezeptor zu agonisieren.
Potenzielle VEGI-Antagonisten schließen auch VEGI-Mutanten ein, die an den VEGI-Rezeptor binden und keine zweite Boten-Antwort auslösen, um den Rezeptor von seinem natürlichen Liganden wirksam zu blockieren. Spezifisch konstruierte Oligonucleotide und kleine Moleküle können auch an den VEGI-Rezeptor (z. B. DR3) binden und ihn von VEGI blockieren. Beispiele von kleinen Molekülen schließen kleine Peptide oder Peptid-ähnliche Moleküle ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Ein anderer potenzieller VEGI-Antagonist ist eine lösliche Form des VEGI-Rezeptors, der an VEGI bindet und ihn vom Interagieren mit membran-gebundenen VEGI-Rezeptoren abhält. Auf diese Weise werden die Rezeptoren nicht durch VEGI stimuliert.
Ein weiterer potenzieller VEGI-Antagonist ist ein Antisense-Konstrukt, das unter Verwendung der Antisense-Technologie hergestellt wird. die Antisense-Technologie kann verwendet werden, um die Genexpression durch die Bildung einer Dreifach-Helix oder Antisense-DNA oder -RNA zu kontrollieren, wobei beide Verfahren auf der Bindung eines Polynucleotids an DNA oder RNA basieren. Zum Beispiel wird der 5'-codierende Teil der Polynucleotidsequenz, die die reifen Polypeptide der vorliegenden Erfindung codiert, verwendet, um ein Antisense-RNA-Oligonucleotid von etwa 10 bis 40 Basenpaaren Länge zu gestalten. Ein DNA-Oligonucleotid wird gestaltet, um komplementär zu einer Region des Gens zu sein, das in die Transkription involviert ist (Dreifach-Helix – siehe Lee et al., Nucl. Acids Res., 6: 3073 (1979); Cooney et al., Science, 241: 456 (1988); und Dervan et al., Science, 251: 1360 (1991)), wodurch die Transkription und die Produktion von VEGI verhindert wird. Das Antisense-RNA-Oligonucleotid hybridisiert in vivo an die mRNA und blockiert die Translation des mRNA-Moleküls in das VEGI-Polypeptid (Antisense- Okano, J. Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)). Die oben beschriebenen Oligonucleotide können auch an Zellen abgegeben werden, sodass die Antisense-RNA oder -DNA in vivo exprimiert werden kann, um die Produktion von VEGI zu hemmen.
Die vorliegende Anwendung betrifft auch die Verwendung eines Antagonisten eines VEGI-Polypeptids, wie hierin oben beschrieben, der ein Antisense-Oligonucleotid oder ein Ribozym, das (der) spezifisch für eine RNA ist, die das VEGI-Polypeptid codiert, oder ein Antikörper, der an das VEGI-Polypeptid bindet und seine Aktivität inhibiert oder eliminiert, ist, in einem pharmazeutisch verträglichen Verdünner, in einer pharmazeutisch verträglichen Menge für die Herstellung eines Arzneimittels für das Behandeln oder Bessern von Krankheiten, die durch eine gehemmte Angiogenese vermittelt werden.
VEGI-Antagonisten werden als nützlich in Erwägung gezogen, um eine Kachexie zu behandeln, was ein Lipid-Bereinigungsdefekt ist, der aus einer systemischen Schwäche der Lipoproteinlipase resultiert, die durch VEGI unterdrückt wird. Die VEGI-Antagonisten werden auch als nützlich in Erwägung gezogen, um cerebrale Malaria zu behandeln, in der VEGI eine pathogene Rolle zu spielen scheint.
Die VEGI-Antagonisten werden auch als nützlich in Erwägung gezogen, um eine Transplantat-Abstoßung durch Verhindern der Stimulierung des Immunsystems in der Anwesenheit eines Transplantats durch VEGI zu verhindern.
Die VEGI-Antagonisten werden auch als nützlich in Erwägung gezogen, um Osteoporose zu behandeln, da VEGI eine Knochen-Resorption induzieren kann.
Antagonisten von VEGI werden auch als nützlich als Entzündungshemmer in Erwägung gezogen, da VEGI eine verstärkte Entzündungsantwort vermittelt.
Die Antagonisten werden auch als nützlich in Erwägung gezogen, um einen Endotoxin-Schock, auch als septischer Schock bezeichnet, zu behandeln. Dieser kritische Zustand resultiert aus einer übertriebenen Reaktion auf eine bakterielle oder andere Typen einer Infektion. Diese Reaktion führt zu erhöhten Spiegeln von VEGI, was den Schock und eine Gewebeverletzung bewirkt.
Ein diagnostischer Test wird auch zu illustrativen Zwecken beschrieben, der nützlich für das Nachweisen von veränderten Spiegeln des VEGI-Polypeptids in verschiedenen Geweben ist, da eine Überexpression der Proteine im Vergleich zu normalen Kontrollgewebe-Proben das Vorliegen einer Krankheit oder die Empfänglichkeit für eine Krankheit, zum Beispiel von cerebraler Malaria nachweisen kann. Tests, die verwendet werden, um Spiegel des VEGI-Polypeptids in einer Probe nachzuweisen, die von einem Wirt stammt, sind Fachleuten wohlbekannt und schließen Radioimmuntests, kompetitive Bindungstests, Western Blot-Analyse, ELISA-Tests und „Sandwich"-Test ein. Ein ELISA-Test (Coligan, et al., Current Protocols in Immunology, 1(2), Kapitel 6, (1991)) umfasst anfänglich das Herstellen eines Antikörpers, der spezifisch für das VEGI-Antigen ist, vorzugsweise eines monoclonalen Antikörpers. Zusätzlich wird ein Reporter-Antikörper gegen den monoclonalen Antikörper hergestellt. An den Reporter-Antikörper wird ein nachweisbares Reagenz wie Radioaktivität, Fluoreszenz oder in diesem Beispiel ein Meerrettich-Peroxidase-Enzym gebunden. Eine Probe wird von einem Wirt entfernt und auf einer festen Unterlage, z. B. einer Polystyrol-Schale inkubiert, die die Proteine in der Probe bindet. Alle freien Protein-Bindungsstellen auf der Schale werden dann durch Inkubieren mit einem nicht-spezifischen Protein wie BSA bedeckt. Als Nächstes wird der monoclonale Antikörper in der Schale inkubiert, währenddessen die monoclonalen Antikörper an alle VEGI-Polypeptide binden, die an der Polystyren-Schale gebunden sind. Jeder ungebundene monoclonale Antikörper wird mit Puffer ausgewaschen. Der Reporter-Antikörper, verknüpft mit der Meerrettich-Peroxidase, wird jetzt in die Schale platziert, was in der Bindung des Reporter-Antikörpers an jeden monoclonalen Antikörper, der an VEGI gebunden ist, resultiert. Nicht gebundener Peptid-Antikörper wird dann ausgewaschen. Peroxidase-Substrate werden dann zu der Schale zugefügt, und die Menge der entwickelten Farbe in einem bestimmten Zeitraum ist ein Maß für die Menge des VEGI-Polypeptids, das in einem Volumen einer Patienten-Probe verglichen gegen eine Standardkurve vorhanden ist.
Ein Konkurrenztest kann angewendet werden, in dem die Antikörper, die spezifisch für VEGI-Polypeptide sind, an eine feste Unterlage gebunden sind und markiertes VEGI und eine Probe, die vom Wirt stammt, wird über die feste Unterlage geführt, und die Menge der nachgewiesenen Markierung zum Beispiel durch Flüssig-Szintillationschromatographie mit einer Menge von VEGI in der Probe korreliert werden kann.
Ein „Sandwich"-Test ist ähnlich einem ELISA-Test. In einem „Sandwich"-Test wird VEGI über eine fest Unterlage geführt und bindet an einen Antikörper, der an eine feste Unterlage angeheftet ist. Ein zweiter Antikörper wird dann an das VEGI gebunden. Ein dritter Antikörper, der markiert und spezifisch für den zweiten Antikörper ist, wird dann über eine feste Unterlage passiert und bindet an den zweiten Antikörper, und eine Menge kann dann quantifiziert werden.
Die hierin beschriebenen Sequenzen sind auch für eine Chromosomen-Identifizierung wertvoll. Die Sequenz wird spezifisch angezielt und kann mit einer bestimmten Stelle auf einem individuellen menschlichen Chromosom hybridisieren. Darüber hinaus gibt es einen derzeitigen Bedarf für das Identifizieren von bestimmten Stellen auf dem Chromosom. Derzeit sind wenige Chromosomen-markierende Reagenzien basierend auf tatsächlichen Sequenzdaten (Wiederholungs-Polymorphismen) für das Markieren einer chromosomalen Lokalisation verfügbar. Das Kartieren von DNAs auf Chromosomen ist ein wichtiger erster Schritt im Korrelieren jener Sequenzen mit Genen, die mit einer Krankheit assoziiert sind.
Kurz, Sequenzen können durch Herstellen von PCR-Primern (vorzugsweise 15–25 bp) von der cDNA auf Chromosomen kartiert werden. Eine Computer-Analyse der 3'-nicht-translatierten Region der Sequenz wird verwendet, um schnell Primer auszuwählen, die nicht mehr als ein Exon in der genomischen DNA umspannen, wodurch der Amplifizierungsvorgang verkompliziert wird. Diese Primer werden dann für das PCR-Screenen von somatischen Zell-Hybriden, die individuelle menschliche Chromosomen enthalten, verwendet. Nur jene Hybride, die das menschliche Gen, das dem Primer entspricht, enthalten, werden ein amplifiziertes Fragment ergeben.
Das PCR-Kartieren von somatischen Zell-Hybriden ist ein schnelles Vorgehen für das Zuordnen einer bestimmten DNA zu einem bestimmten Chromosom. Unter Verwendung der vorliegenden Erfindung mit denselben Oligonucleotid-Primern kann eine Sub-Lokalisation mit Feldern von Fragmenten von spezifischen Chromosomen oder Pools von großen genomischen Clonen in einer analogen Weise erreicht werden. Andere Kartierungsstrategien, die in ähnlicher Weise verwendet werden können, um sein Chromosom zu kartieren, schließen in situ-Hybridisierung, Vorscreenen mit markierten Durchfluss-sortierten Chromosomen und Vorselektion durch Hybridisierung ein, um Chromosomen-spezifische cDNA-Genbanken zu konstruieren.
Die Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) eines cDNA-Clons an einen chromosomalen Metaphasen-Ausstrich kann verwendet werden, um eine genaue chromosomale Lokalisierung in einem Schritt bereit zu stellen. Diese Technik kann mit cDNA, die so kurz wie 50 oder 60 Basen ist, verwendet werden. Für eine Literaturübersicht dieser Technik siehe Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988).
Sobald eine Sequenz auf eine genaue chromosomale Lokalisierung kartiert worden ist, kann die physikalische Position der Sequenz auf dem Chromosom mit den genetischen Karten-Daten korreliert werden. Solche Daten werden zum Beispiel in V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (erhältlich online durch John Hopkins University Welch Medical Library) gefunden. Das Verhältnis zwischen Genen und Krankheiten, die auf dieselbe chromosomale Region kartiert worden sind, wird dann durch Verknüpfungs-Analyse identifiziert (Co-Vererbung von physikalisch angrenzenden Genen).
Als Nächstes ist es notwendig, die Unterschiede in der cDNA oder der genomischen Sequenz zwischen betroffenen und nicht-betroffenen Individuen zu bestimmen. Wenn eine Mutation in manchen oder allen der betroffenen Individuen aber in keinem der normalen Individuen beobachtet wird, dann ist die Mutation wahrscheinlich das verursachende Agens der Krankheit.
Mit der derzeitigen Auflösung der physikalischen Kartierungs- und genetischen Kartierungstechniken könnte eine cDNA, die genau an einer chromosomalen Region liegt, die mit der Krankheit assoziiert ist, eines von zwischen 50 und 500 potenziellen verursachenden Genen sein. (Dies setzt eine 1 Megabasen-Kartierungsauflösung und ein Gen pro 20 kb voraus).
Unter Ausnutzen der oben beschriebenen Techniken wurde mit sehr hoher Konfidenz bestimmt, dass die chromosomale Lokalisation von VEGI 9q32 ist. Frühere chromosomale Kartierungsuntersuchungen haben einige Entwicklungsdefekte mit Loci in diesem Gebiet von Chromosom 9 in Verbindung gebracht.
Beispiele
Unten sind Beispiele der vorliegenden Erfindung beschrieben, die nur zu illustrativen Zwecken bereitgestellt sind und nicht, um den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu limitieren. Angesichts der vorliegenden Offenbarung werden zahlreiche Ausführungsformen im Rahmen der Ansprüche für Fachleute offensichtlich werden.
Die vorliegende Erfindung wird mit Bezugnahme auf die folgenden Beispiele weiter beschrieben werden; dennoch muss verstanden werden, dass die vorliegende Erfindung nicht auf solche Beispiele limitiert ist. Alle Teile oder Menge, außer wenn anderweitig beschrieben, beziehen sich auf Gewicht.
Um das Verstehen der folgenden Beispiele zu erleichtern, werden bestimmte, häufig vorkommende Verfahren und/oder Begriffe beschrieben werden.
„Plasmide" werden durch ein kleines p, dem Großbuchstaben und/oder Nummern vorangehen oder folgen, bezeichnet. Die Ausgangsplasmide hierin sind entweder kommerziell erhältlich, auf einer uneingeschränkten Basis öffentlich erhältlich oder können von erhältlichen Plasmiden gemäß veröffentlichten Vorgehensweisen konstruiert werden, außer wenn es anderweitig angegeben ist. Zusätzlich sind äquivalente Plasmide zu jenen, die beschrieben sind, auf dem Fachgebiet bekannt und werden für den Fachmann offensichtlich sein.
„Verdau" von DNA bezieht sich auf die katalytische Spaltung der DNA mit einem Restriktionsenzym, das nur an bestimmten Sequenzen in der DNA wirkt. Die verschiedenen Restriktionsenzyme, die hierin verwendet werden, sind kommerziell erhältlich und ihre Reaktionsbedingungen, Co-Faktoren und anderen Voraussetzungen wurden verwendet, wie es einem Fachmann bekannt sein würde. Zu analytischen Zwecken wird typischerweise 1 μg des Plasmids oder des DNA-Fragments mit etwa 2 Einheiten des Enzyms in etwa 20 μl Pufferlösung verwendet. Zum Zweck des Isolierens von DNA-Fragmenten für die Plasmid-Konstruktion werden typischerweise 5 bis 50 μg DNA mit 20 bis 250 Einheiten des Enzyms in einem größeren Volumen verdaut. Geeignete Puffer und Substratmengen für bestimmte Restriktionsenzyme sind durch den Hersteller beschrieben. Inkubationszeiten von etwa 1 Stunde bei 37°C werden gewöhnlich verwendet, können aber übereinstimmend mit den Anweisungen des Vertreibers variieren. Nach dem Verdau wird die Reaktion direkt auf einem Polyacrylamid-Gel einer Elektrophorese unterzogen, um das erwünscht Fragment zu isolieren.
Die Größenauftrennung der gespaltenen Fragmente wird unter Verwendung von 8 Prozent Polyacrylamidgel durchgeführt, beschrieben von Goeddel, D. et al., Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980).
„Oligonucleotide" bezieht sich auf entweder ein einzelsträngiges Poly-Desoxynucleotid oder zwei komplementäre Polydesoxynucleotidstränge, die chemisch synthetisiert werden können. Solche synthetischen Oligonucleotide haben kein 5'-Phosphat und werden daher ohne Zugabe eines Phosphats mit einem ATP in der Anwesenheit einer Kinase nicht an ein anderes Oligonucleotid ligieren. Ein synthetisches Oligonucleotid wird an ein Fragment ligieren, das nicht dephosphoryliert worden ist.
„Ligierung" bezieht sich auf den Vorgang des Bildens von Phosphodiester-Bindungen zwischen zwei doppelsträngigen Nucleinsäurefragmenten (Maniatis, T., et al., ebd., S. 146). Außer wenn anderweitig geliefert, kann die Ligierung unter Verwendung von bekannten Puffern und Bedingungen mit 10 Einheiten der T4-DNA-Ligase („Ligase") pro 0,5 μg ungefähr äquimolarer Mengen der DNA-Fragmente, die ligiert werden sollen, erreicht werden.
Außer wenn anderweitig angemerkt, wurde die Transformierung durchgeführt, wie im Verfahren von Graham, F. und Van der Eb, A., Virology, 52: 456–457 (1973), beschrieben.
Beispiel 1: Bakterielle Expression und Reinigung von VEGI-Polypeptiden.
Ein Expressionsvektor, enthaltend eine Polynucleotid-Insertion, die eine 38 Aminosäuren-Deletion von der N-terminalen Sequenz des vorhergesagten Volllängen-VEGI-alpha-Polypeptids codiert, wurde konstruiert. Die DNA-Sequenz, die das N-terminal deletierte VEGI-alpha-Polynucleotid codiert, wurde unter Verwendung von PCR-Oligonucleotid-Primern amplifiziert, die spezifisch für die codierende Sequenz der VEGI-alpha-codierenden Sequenz sind. Zusätzliche Nucleotide, die Restriktionsstellen herstellen, um das Clonieren zu erleichtern, wurden an die 5'- beziehungsweise 3'-Sequenzen zugefügt. Die 5'-Oligonucleotid-Primer hatten die 5'-GCG CCA TGG CTC TGC ACT GGG AAC AT-3' (SEQ ID NO: 3) enthaltend eine Nco I-Restriktionsstelle, gefolgt von 18 Nucleotiden der codierenden Sequenz. Der 3'-Primer hat die Sequenz 5'-CGC AAG CTT CTA TAG TAA GAA GGC TCC-3' (SEQ ID NO: 4), enthält eine Hindill-Restriktionsstelle, gefolgt von 18 Nucleotiden, die komplementär zu den letzten 15 Nucleotiden der codierenden Sequenz sind, und das Stopp-Codon. Das amplifizierte VEGI-alpha-DNA-Produkt wurde nach dem Verdau mit den geeigneten Restriktionsenzymen und nachfolgender Ligierung in den Vektor pQE60 (Qiagen) cloniert. Das Ligierungsgemisch wurde in kompetente E. coli-Zellen (Stamm M15/rep4) transformiert. Clone, die die erwünschten Konstrukte enthalten, wurden zu einer optischen Dichte bei 600 nm von zwischen 0,4 und 0,6 gezüchtet. Dann wurde Isopropyl-B-D-thiogalactopyranosid (IPTG) zu einer Endkonzentration von 1 mM zugefügt, um die Expression des Proteins zu induzieren. Nach 3 Stunden wurden die Zellen geerntet, und Einschlusskörper wurden von den zerstörten Zellen gereinigt, und Protein wurde von den Einschlusskörpern in 8M Harnstoff gelöst. Das gelöste Protein wurde über eine PD-10-Säule in 2X phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) passiert, wodurch der Harnstoff entfernt, der Puffer ausgetauscht und das Protein rückgefaltet wurde. Das Protein wurde durch einen weiteren Schritt der Chromatographie, um Endotoxin zu entfernen, gereinigt. Es wurde gefunden, dass die resultierende VEGI-alpha-Polypeptid-Präparation durch SDS-PAGE mehr als 90% rein ist und < 10 EU Endotoxin/mg enthielt.
Zusätzlich wurde die DNA-Sequenz, die den Volllängen-VEGI-alpha-ORF codiert, ATCC Hinterlegungsnr. 75927, anfänglich unter Verwendung der PCR-Oligonucleotid-Primer, die den 5'- und 3'-Sequenzen des VEGI-alpha-Proteins entsprechen, amplifiziert. Zusätzliche Nucleotide, die VEGI-alpha entsprechen, wurden zu den 5'- beziehungsweise 3'-Sequenzen zugefügt. Der 5'-Oligonucleotid-Primer ist in SEQ ID NO: 13 gezeigt und hat die Sequenz 5'-GCG CGG ATC CAC CAT GAG ACG CTT TTT AAG CAA AGT C-3' die eine Bam HI Restriktionsenzymstelle, gefolgt von den ersten 24 Nucleotiden der VEGI-alpha-codierenden Sequenz, startend vom anfänglichen Methionin-Codon, enthält. Die 3'-Sequenz 5'-CGC GTC TAG ACT ATA GTA AGA AGG CTC CAA AGA AGG-3' (SEQ ID NO: 14) enthält Sequenzen, die zu einer Xba I-Stelle und 22 Nucleotiden von VEGI-alpha komplementär sind. Die Restriktionsenzymstellen korrespondieren mit den Restriktionsenzymstellen im bakteriellen Expressionsvektor pQE-9 (Qiagen). pQE-9 wurde dann mit Bam HI und Xba I verdaut. Die amplifizierten Sequenzen wurden in pQE-9 ligiert und wurden im Rahmen mit der Sequenz, die die Histidin-Markierung und RBS codiert, inseriert. Das Ligierungsgemisch wurde dann verwendet, um einen E. coli-Stamm, der von Qiagen unter dem Handelsnamen M15/rep 4 erhältlich ist, durch die Vorgehensweise, die in Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, Cold Spring Laborstory Press, (1989), beschrieben ist, zu transformieren. M15/rep 4 enthält mehrere Kopien des Plasmids pREP4, das den ladl-Repressor exprimiert, und verleiht auch eine Kanamycin-Resistenz (Kan^r). Transformanten wurden durch ihre Fähigkeit, auf LB-Platten zu wachsen, identifiziert, und Ampicillin/Kanamycin-resistente Kolonien wurden selektiert. Plasmid-DNA wurde isoliert und durch Restriktionsanalyse bestätigt. Clone, die die erwünschten Konstrukte erhalten, wurden über Nacht (O/N) in Flüssigkultur in LB-Medien, ergänzt mit sowohl Amp (100 μg/ml) als auch Kan (25 μg/ml), gezüchtet. Die O/N-Kultur wurde verwendet, um eine große Kultur in einem Verhältnis von 1:100 bis 1:250 zu beimpfen. Die Zellen wurden zu einer optischen Dichte 600 (O. D.₆₀₀) von zwischen 0,4 und 0,6 gezüchtet. IPTG („Isopropyl-B-D-thiogalactopyranosid") wurde dann zu einer Endkonzentration von 1 mM zugefügt. IPTG induziert durch Inaktivieren des lacl-Repressors das Bereinigen des P/O, was zu einer erhöhten Genexpression führt. Die Zellen wurden zusätzliche 3 bis 4 Stunden gezüchtet. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation geerntet. Das Zellpellet wurde im chaotropen Agens 6 M Guanidin-HCl gelöst (es wurde empirisch gefunden, dass Guanidin-HCl-Konzentrationen von größer oder gleich 2,5 M in einem höheren Spiegel der Reinheit des gewonnen rekombinanten Proteins resultieren). Nach der Klärung wurde das gelöste VEGI-alpha-Polypeptid von dieser Lösung durch Chromatographie auf einer Nickel-Chelat-Säule unter Bedingungen gereinigt, die eine feste Bindung durch die Proteine, die die 6-His-Markierung enthalten, ermöglichen (Hochuli, E. et al., J. Chromatography 441: 177–184 (1984)). Das VEGI-alpha-Polypeptid wurde durch einen zweiten Lauf auf der Nickel-Chelat-Säule weiter gereinigt. Das VEGI-alpha-Polypeptid (90% rein) wurde von der Säule in 6 M Guanidin-HCl, pH 5,0, eluiert und wurde zum Zweck der Renaturierung in PBS-Puffer dialysiert. Das Expressionsprodukt wurde durch SDS-PAGE einer Elektrophorese unterzogen.
Ein Fachmann wird erkennen, dass auch andere bakterielle Expressionsvektoren als pQE-9 verwendet werden können, um VEGI-Polypeptide zu exprimieren. Ein solcher bevorzugter bakterielle Expressionsvektor ist pHE4-5. pHE4-5 kann als pHE4-5/MPIFD23-Plasmid-DNA erhalten werden (dieses Konstrukt enthält eine nicht verwandte Insertion, die einen nicht verwandten ORF codiert). Das pHE4-5/MPIFD23-Plasmid wurde mit der American Type Culture Collection, 12301 Park Lawn Drive, Rockville, Maryland 20852, am 30. September, 1997 hinterlegt (Zugangsnr. 209311). Unter Verwendung der Nde I- und Asp 718-Restriktionsstellen, die die nicht-verwandte MPIF-ORF-Insertion flankieren, könnte ein Fachmann leicht aktuelle molekularbiologische Techniken verwenden, um den nicht-verwandten ORF im pHE4-5/MPIFD23-Plasmid mit dem VEGI-ORF oder Variationen davon der vorliegenden Erfindung zu ersetzen.
Beispiel 2: Clonierung und Expression des VEGI-Polypeptids unter Verwendung des Baculovirus-Expressionssystems.
Die DNA-Sequenz, die das Volllängen-VEGI-alpha-Polypeptid codiert„ ATCC Nr. 75927, wurde unter Verwendung der PCR-Oligonucleotid-Primer, die den 5'- und 3'-Sequenzen des Gens entsprechen, amplifiziert: Der 5'-Primer hat die Sequenz 5'-GCG CGG ATC CAC CAT GAG ACG CTT TTT AAG CAA AGT C-3' (SEQ ID NO: 15) und enthält eine Bam HI-Restriktionsenzymstelle (fettgedruckt), gefolgt von 24 Nucleotiden der VEGI-alpha-codierenden Sequenz (das Start-Codon für die Translation, „ATG", ist unterstrichen). Der 3'-Primer hat die Sequenz 5'-CGC GTC TAG ACT ATA GTA AGA AGG CTC CAA AGA AGG-3' (SEQ ID NO: 16) und enthält die Spaltungsstelle für die Restriktionsendonuclease Xba I und 22 Nucleotide, die komplementär zur 3'-nicht-translatierten Sequenz der VEGI-alpha-codierenden Sequenz sind. Die amplifizierten Sequenzen wurden von einem 1%-Agarosegel unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits („Geneclean", BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.) isoliert. Das Fragment wurde dann mit den Endonucleasen Bam HI und Xba I verdaut und dann wieder auf einem 1% Agarosegel gereinigt. Dieses Fragment wurde F2 bezeichnet.
Der Vektor pA2 (Modifizierung des oben diskutieren pVL941-Vektors) wurde für die Expression des VEGI-alpha-Polypeptids unter Verwendung des Baculovirus-Expressionssystems verwendet (für eine Literaturübersicht siehe: Summers, M. D. und Smith, G. E. 1987, A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin Nr. 1555). Dieser Expressionsvektor enthält den starken Polyhedrin-Promotor des nucleären Autographs californica Polyhedrosis-Virus (AcMNPV), gefolgt von den Erkennungsstellen für die Restriktionsendonucleasen Bam HI und Xba I. Die Polyadenylierungsstelle des Affenvirus SV40 wird für eine wirksame Polyadenylierung verwendet. Für eine einfache Selektion des rekombinanten Virus wurde das beta-Galactosidase-Gen von E. coli in derselben Orientierung wie der Polyhedrin-Promotor, gefolgt vom Polyadenylierungssignal des Polyhedrin-Gens, inseriert. Die Polyhedrin-Sequenzen wurden für die Zell-vermittelte homologe Rekombination von co-transfizierter viraler Wildtyp-DNA an beiden Seiten durch virale Sequenzen flankiert. Viele andere Baculovirus-Vektoren könnten anstelle von pA2 verwendet worden sein, wie pRG1, pAc373, pVL941 und pAcIM1 (Luckow, V. A. und Summers, M. D., Virology, 170: 31–39).
Das Plasmid wurde mit den Restriktionsenzymen Bam HI und Xba I verdaut und dann unter Verwendung von intestinaler Kälber-Phosphatase durch auf dem Fachgebiet bekannte Vorgehensweisen dephosphoryliert. Die DNA wurde dann von einem 1%-Agarosegel unter Verwendung des kommerziell erhältlichen Kits („Geneclean” BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.) isoliert. Diese Vektor-DNA wurde V2 bezeichnet.
Das Fragment F2 und das dephosphorylierte Plasmid V2 wurden mit der T4-DNA-Ligase ligiert. E. coli-XL1-blue-Zellen wurden dann transformiert. Die Sequenz des clonierten Fragments wurde durch DNA-Sequenzieren bestätigt.
5 μg des Plasmids pBac VEGI-alpha wurden mit 1,0 μg eines kommerziell erhältlichen linearisierten Baculovirus („BaculoGold-Baculovirus-DNA", Pharmingen, San Diego, CA.) unter Verwendung des Lipofektionsverfahrens (Felgner et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413–7417 (1987)) co-transfiziert.
1 μg BaculoGold-Virus-DNA und 5 μg des Plasmids pBac VEGI-alpha wurden in einer sterilen Vertiefung einer Microtiterplatte, enthaltend 50 μl serumfreies Grace-Medium (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) gemischt. Danach wurden 10 μl Lipofectin plus 90 μl Grace-Medium zugefügt, gemischt und für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde das Transfektionsgemisch tropfenweise zu den Sf9-Insektenzellen (ATCC CRL 1711), die in einer 35 mm-Gewebekulturschale mit 1 ml Grace-Medium ohne Serum ausgesät wurden, zugegeben. Die Platte wurde dann vor- und zurückgeschwenkt, um die neu zugefügte Lösung zu mischen. Die Platte wurde dann für 5 Stunden bei 27°C inkubiert. Nach 5 Stunden wurde die Transfektionslösung von der Platte entfernt, und 1 ml Grace-Insektenmedium, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum, wurde zugefügt. Die Platte wurde zurück in einen Brutschrank platziert und die Kultur bei 27°C für vier Tage fortgesetzt.
Nach vier Tagen wurde der Überstand gewonnen und ein Plaquetest durchgeführt, im Wesentlichen wie durch Summers und Smith (vorstehend) beschrieben. Als eine Modifizierung wurde ein Agarosegel mit „Blue Gal" (Life Technologies Inc., Gaithersburg) verwendet, das eine einfache Isolierung der blau gefärbten Plaques erlaubt. (Eine detaillierte Beschreibung eines „Plaque-Test" kann auch im Benutzerhandbuch für Insektenzellkultur und Baculovirologie, vertrieben durch Life Technologies Inc., Gaithersburg, Seite 9–10, gefunden werden).
Vier Tage nach der Reihenverdünnung wurde das Virus zu den Zellen zugefügt, blau gefärbte Plaques wurden mit der Spitze einer Eppendorf-Pipette gepickt. Der Agar, enthaltend die rekombinanten Viren, wurde dann ein einem Eppendorf-Röhrchen, enthaltend 200 μl Grace-Medium, resuspendiert. Der Agar wurde durch eine kurze Zentrifugation entfernt, und der Überstand, enthaltend das rekombinante Baculovirus, wurde verwendet, um Sf9-Zellen, die in 35 mm-Schalen ausgesät wurden, zu infizieren. Vier Tage später wurden die Überstände dieser Kulturschalen geerntet und dann bei 4°C gelagert.
Sf9-Zellen wurden in Grace-Medium, ergänzt mit 10% hitze-inaktiviertem FBS gezüchtet. Die Zellen wurden mit dem rekombinanten Baculovirus V-VEGI-alpha bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 2 infiziert. Sechs Stunden später wurde das Medium entfernt und mit SF900 II-Medium ohne Methionin und Cystein (Life Technologies Inc., Gaithersburg) ersetzt. 42 Stunden später wurden 5 μCi [³⁵S]-Methionin und 5 μCi [³⁵S]-Cystein (Amersham) zugefügt. Die Zellen wurden weiter für 16 Stunden inkubiert, bevor sie durch Zentrifugation geerntet und die markierten Proteine durch SDS-PAGE und Autoradiographie visualisiert wurden.
Beispiel 3: Expression von rekombinantem VEGI-alpha in Säugerzellen.
Die Dihydrofolatreduktase-negative(DHFR-)chinesische Hamsterover (CHO)-Zelllinie wurde von der American Type Culture Collection erworben. Das Clonieren der VEGI-alpha-cDNA in den pCl-chinesische Hamsterovar-Zell-Expressionsvektor wurde im Wesentlichen wie folgt ausgeführt. Die menschliche cDNA-Sequenz, die das Volllängen-VEGI-alpha-Polypeptid codiert, wurde unter Verwendung von Primern amplifiziert, die spezifisch für das 5'- und 3'-Ende der VEGI-alpha-codierenden Sequenz sind, (5-Primer: GCG gga tcc GCC ACC ATG AAC TCC TTC TCC ACA AGC GCC TTC GGT CCA GTT GCC TTC TCC CTG GGG CTG CTC CTG GTG TTG CCT OCT GCC TTC CCT GCC CCA GTT
GTG AGA C (SEQ ID NO: 5) enthaltend eine Bam HI-Restriktionsstelle, gefolgt von einer „Kozak"-Sequenz (Kleinbuchstaben oben) und den ersten 84 Basen der IL6-codierenden Sequenz und 13 Basen der VEGI-alpha-codierenden Sequenz; 3'-Primer: CGC gga tcc GAT ATT TGC TCT CCT CCT CA (SEQ ID NO: 6), enthaltend eine Bam HI-Restriktionsstelle), gefolgt von 17 Nucleotiden des nicht-translatierten Bereichs und einem Stopp-Codon. Das amplifizierte Fragment wurde gel-gereinigt und mit Bam HI verdaut. Der CHO-ZeII-Expressionsvektor (pCI) wurde mit Bam HI verdaut, gefolgt von einer Agarosegel-Reinigung. Die amplifizierte VEGI-alpha-codierende Sequenz wurde unter Verwendung der T4-DNA-Ligase in den gereinigten pCI-Vektor ligiert. HB101-Zellen wurden danach transformiert. Ein positiver Clon (pCIVEGI) wurde durch PCR-Screening/Enzym-Verdau identifiziert, und die DNA-Sequenz der Insertion wurde unter Verwendung des automatisierten DNA-Sequenzierens bestätigt. Die Selektion und Amplifizierung von stabilen CHO-Zellclonen wurde durchgeführt, wie früher durch R. Gentz, et al., Eur. LT. Biochemistry 210. 545 (1992) beschrieben. Stabile CHO-Transfektanten CHO-VEGI-alpha und der CHO-Vektor wurden in MEM – einem Medium, enthaltend 10% FCS (dialysiert), gehalten.
Die Expression des Plasmids VEGI-alpha-HA wird von einem Vektor, pcDNAI/Amp (Invitrogen), abgeleitet, enthaltend: 1) SV40-Replikationsursprung, 2) Ampicillin-Resistenzgen, 3) E. coli-Replikationsursprung, 4) CMV-Promotor, gefolgt von einer Polylinkerregion, einem SV40-Intron und einer Polyadenylierungsstelle. Ein DNA-Fragment, das den gesamten VEGI-alpha-Vorläufer codiert, und eine Hämagglutinin-Antigen (HA)-Markierung, im Rahmen fusioniert an sein 3'-Ende, wurde in die Polylinkerregion des Vektors cloniert. Daher ist die rekombinante Proteinexpression unter der Leitung des CMV-Promotors. Die HA-Markierung korrespondiert mit einem Epitop, das vom Influenza-Hämagglutinin-Protein abgeleitet wurde, wie früher beschrieben (I. Wilson, H. Niman, R. Heighten, A. Cherenson, M. Connolly und R. Lerner, 1984, Cell 37, 767). Die Fusion der HA-Markierung an unser Zielprotein ermöglicht den einfachen Nachweis des rekombinanten Proteins mit einem Antikörper, der das HA-Epitop erkennt.
Die Plasmid-Konstruktionsstrategie ist wie folgt beschrieben: Die DNA-Sequenz, die VEGI-alpha codiert, ATCC # 75927, wurde durch PCR an dem ursprünglichen EST-Clon unter Verwendung von zwei Primern konstruiert: der 5'-Primer (SEQ ID NO: 15) enthält eine Bam HI-Stelle, gefolgt von 24 Nucleotiden der VEGI-alpha-codierenden Sequenz, startend vom Start-Codon; die 3'-Sequenz 5'-CGC TCT AGA TCA AGC GTA GTC TGG GAC GTC GTA TGG ATA GTA AGA AGG CTC CAA AG-3' (SEQ ID NO: 17) enthält komplementäre Sequenzen zur Xba I-Stelle, ein Translations-Stoppcodon, eine HA-Markierung und die letzten 18 Nucleotide der VEGI-alpha-codierenden Sequenz (das Stopp-Codon nicht einschließend). Daher enthielt das PCR-Produkt eine Bam HI-Stelle, eine VEGI-alpha-codierende Sequenz, gefolgt von einer im Rahmen-fusionierten HA-Markierung, ein Translations-Stoppcodon benachbart zur HA-Markierung und eine Xba I-Stelle. Das PCR-amplifizierte DNA-Fragment und der Vektor pcDNAI/Amp wurden mit den Bam HI- und Xba I-Restriktionsenzymen verdaut und zusammen ligiert. Das Ligierungsgemisch wurde in den E. coli-Stamm SURF (erhältlich von Stratagene Cloning Systems, 11099 North Torreg Pines Road, La Jolla, CA 92037 ) transformiert, die transformierte Kultur wurde auf Ampicillin-Medien-Platten plattiert, und resistente Kolonien wurden selektiert. Die Plasmid-DNA wurde von den Transformanten isoliert und durch Restriktionsanalyse auf das Vorliegen des korrekten Fragments untersucht. Für die Expression der rekombinanten VEGI-alpha-Polypeptide wurden COS-Zellen durch das DEAE-DEXTRAN-Verfahren mit dem Expressionsvektor transfiziert. (J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laborstory Manual, Cold Spring Laborstory Press, (1989)). Die Expression des VEGI-alpha-HA-Proteins wurde durch radioaktives Markierungs- und Immunpräzipitationsverfahren nachgewiesen. (E. Harlow, D. Lane, Antibodies: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory Press, (1988)). Die Zellen wurden zwei Tage nach der Transfektion für 8 Stunden mit [³⁵S]-S-Cystein markiert. Die Kulturmedien wurden dann gewonnen, und die Zellen wurden mit einem Detergens (RIPA-Puffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 1% NP-40, 0,5% DOC, 50 mM Tris, pH 7,5; Wilson, I. et al., Ebd. 37: 767 (1984)) lysiert. Sowohl das Zell-Lysat als auch die Kulturmedien wurden mit einem HA-spezifischen monoclonalen Antikörper präzipitiert. Die präzipitierten Proteine wurden dann auf 15% SDS-PAGE-Gelen analysiert.
Beispiel 4: Expressionsmuster von VEGI in einer Vielfalt von Zellen und Zelltypen.
Die RNA-Blot-Analyse wurde ausgeführt, um die Spiegel der Expression von VEGI in menschlichen Geweben zu untersuchen. Zelluläre Gesamt-RNA-Proben wurden mit dem RNAzol^TM B-System (Biotecx Laborstories, Inc. 6023 South Loop Esst, Houston, TX 77033) isoliert. Etwa 2 μg Gesamt-RNA, die von jedem beschriebenen menschlichen Gewebe isoliert wurde, wurden auf einem 1% Agarose-Formaldehyd-Gel aufgetrennt und auf einen Nylon-Filter geblottet (Sambrook, Fritsch und Maniatis, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, (1989)). Die Markierungsreaktion wurde gemäß dem Stratagene Prime-It-Kit mit 50 ng VEGI-alpha-cDNA durchgeführt, um [³²P]-markierte VEGI-alpha-cDNA zu produzieren. Die markierte DNA wurde mit einer Select-G-50-Säule (5 Prime-3 Prime, Inc. 5603 Arapahoe Road, Boulder, CO 80303) gereinigt. Der Filter wurde dann mit einer radioaktiv markierten Volllängen-VEGI-alpha-Sonde bei 1 000 000 cpm/ml in 0,5 M NaPO₄, pH 7,4, und 7% SDS über Nacht bei 65°C hybridisiert. Nachdem er zweimal bei Raumtemperatur und zweimal bei 60°C mit 0,5 × SSC, 0,1% SDS gewaschen wurde, wurde der Röntgenfilm dann gegenüber dem Blot bei –70°C über Nacht mit einem intensivierenden Schirm ausgesetzt. Die Boten-RNA für VEGI-alpha ist in der Niere im Überfluss vorhanden.
VEGI wird spezifisch in Endothelzellen exprimiert, wie durch Northern Blot-Analyse von Gesamt-RNA-Präparaten von 22 verschiedenen Typen von kultivierten Zellen von verschiedenen Linien bestätigt wurde (1A). Die VEGI-Botschaft wurde nur in Primärkulturen von zwei Typen von Endothelzellen nachgewiesen: HUVE-Zellen und menschliche venöse Endothelzellen einer frühen Passage. Die mRNA wurde nicht in menschlichen venösen Endothelzellen einer späteren Passage nachgewiesen, noch wurde sie in menschlichen Arterien-Zellen gesehen. In starkem Kontrast dazu werden die TNF-Familienmitglieder vorwiegend in Immunzellen exprimiert (B. B. Aggarwal und K. Natarajan, vorstehend). Zum Beispiel wird TNF-α durch Makrophagen, Monocyten, Neutrophile und T-Zellen produziert, während TNF-β vorwiegend durch Mitogen-stimulierte T-Lymphocyten und Leukocyten produziert wird. In ähnlicher Weise werden die Liganden für Fas, CD27, CD30, CD40, OX40 und 4-1BB alle in Zelltypen im Immunsystem exprimiert.
Unter Verwendung von Northern Blots von mehreren Geweben wurde das VEGI-Transkript in Plazenta, Lunge, Niere, Skelettmuskel, Pankreas, Milz, Prostata, Dünndarm und Kolon exprimiert. Minimale Mengen des VEGI-Signals wurden in Herz, Gehirn, Leber, Thymus, Hoden, Ovar und peripheren Blutlymphocyten nachgewiesen (1B). Die Expression von VEGI in den meisten Hauptorganen legt nahe, dass das Genprodukt eine Rolle in der Funktion des normalen Gefäßsystems spielen kann.
Es wurden auch Northern Blot-Analysen durchgeführt, um den relativen Expressionsspiegel der VEGI-RNA im Bezug auf den Proliferationszustand von HUVEC-Zellkulturen zu bestimmen. In diesen Experimenten wurden identische Mengen von Gesamt-RNA, die von HUVEC-Zellen (15 μg) isoliert wurden, elektrophoretisch aufgetrennt und, wie oben beschrieben, geblottet. Die RNA wurde von Kulturen 1, 2, 3, 4, 6 und 7 Tage nach dem Aussäen isoliert. Die VEGI-RNA wurde in neu ausgesäten Kulturen (Tage 1, 2 und 3) nur in geringen Spiegeln gesehen. Die Expression der VEGI-RNA war jedoch offensichtlich, wenn die HUVEC-Zellen in den Kulturen begannen, die Konfluenz zu erreichen (Tage 4, 6 und 7). Diese Experimente weisen darauf hin, dass die VEGI-Expression ansteigt, sobald die Zellen in einer Kultur oder einem Gewebe beginnen, einen ruhenden Zustand mit keiner oder einer reduzierten Proliferation zu erreichen.
Beispiel 5: VEGI-vermittelte Hemmung der ABAE-Zellproliferation.
Die Zellen wurden in geeigneten Dichten ausgesät (ABAE-Zellen, 8000 ZellenNertiefung; MDA-MB-231, 2000 Zellen/Vertiefung; MDA-MB-435, 2000 Zellen/Vertiefung, Zellen in Dreifacher Ausführung in Platten mit 24 Vertiefungen. Die Kulturmedien enthielten IMEM (Gibco) und 10% FCS. FGF-2 (1 ng/ml) war in den Kulturmedien für die ABAE-Zellen vorhanden. Die Kulturen wurden bei 37°C, 5% CO₂ für 6 Tage gehalten. Die Zellen wurden trypsiniert, und die Zahl der Zellen wurde unter Verwendung eines Coulter-Zählers bestimmt. Ein Fünftel der Gesamtzahl der gewonnen ABAE-Zellen wurde verwendet, um den Vergleich mit den Krebszellen zu normalisieren.
Eine verkürzte Version von VEGI-alpha, entsprechend der mutmaßlichen extrazellulären Domäne, bestehend aus den Resten 38–174, wurde in E. coli exprimiert, wie oben beschrieben, gereinigt und in einer Vielfalt von zellulären Tests untersucht. Es wurde gefunden, dass das verkürzte Polypeptid spezifisch die Proliferation von Endothelzellen hemmt (2). Eine beinahe vollständige Hemmung des Wachstums von adulten bovinen Aorta-Endothel (ABAE)-Zellen wurde bei 10 mg/ml mit einem halbmaximalen Inhibitionskonzentrations-Wert (IC 50) von etwa 1 mg/ml (etwa 70 nM) erreicht. Die Aktivität des rekombinanten Polypeptids ist vergleichbar mit jener von Angiostatin, Endostatin und dem Blutplättchenfaktor 4. Im Gegensatz dazu hemmte das Polypeptid unter ähnlichen Versuchsbedingungen nicht das Wachstum von menschlichen Brustkrebszellen (MDA-MB-231 oder MDA-MB-435). Es wurde auch gefunden, dass die VEGI-alpha-Deletionsmutante eine geringe Wirkung auf die Proliferation von menschlichen T-Zell-Leukämiezellen (Jurkat), menschlichen Burkitt-Lymphomzellen (Raji), menschlichen monocytischen Leukämiezellen (THP-1) oder menschlichen promyelocytischen Leukämiezellen (HL60) hat. Die Mutante scheint an einen deutlichen Rezeptor zu binden, da keine Interaktion mit jeglichen untersuchten Mitgliedern der TNF-Rezeptor-Überfamilie, einschließlich TNFR1, TNFR2, Fas, DR3 und DR4 bemerkt wurde (G. J. Mazzei et al. (1995) J. Biol. Chem 270: 7205). Es ist gezeigt worden, dass einige TNF-Familienmitglieder, einschließlich TNF-α und des Fas-Liganden, durch Metalloproteasen von membrangebundenen Vorläufern aktiviert werden (M. Tanaka et al. (1996) Nat. Med. 2: 317; R. A. Black et al. (1997) Nature 385: 729).
Beispiel 6: VEGI-vermittelte Hemmung der Kapillar-ähnlichen Röhrenbildung.
Dieser Test wurde verwendet, um die relative Fähigkeit des verkürzten VEGI-alpha-Polypeptids, die FGF-2-induzierte Bildung von Kapillar-ähnlichen tubulären Strukturen in Kulturen von adulten bovinen Aorta-Endothel (ABAE)-Zellen zu hemmen, zu bestimmen. Dreidimensionale Kollagen-Gelplatten (24 Vertiefungen) wurden durch Zugabe von 0,5 ml gekühlter Lösung von 0,7 mg/ml Rattenschwanz-Typ I-Kollagen (Becton Dickinson Labwares, Redford, MA) zu jeder Vertiefung, enthalten 1 × DMEM, und Anpassen auf einen neutralen pH-Wert mit NaHCO₃ hergestellt. Nach der Bildung des Kollagengels (etwa 1–2 mm Dicke) wurden die ABAE-Zellen zu 5 × 10⁴ Zellen/Vertiefung ausgesät. Die Kulturen wurden in einem 5% CO₂-Brutschrank bei 100% Luftfeuchtigkeit bei 37°C in DMEM, enthaltend 10% Kälberserum (HyClone, Logan, UT), ergänzt mit L-Glutamin (2 mM), gezüchtet, bis die Kulturen Konfluenz erreichten. Das Medium wurde dann mit frischem Medium, enthaltend 20 ng/ml FGF-2, ersetzt. Die Wirkung von VEGI-alpha_12-147 als ein Inhibitor der FGF-2-induzierten Bildung von Kapillar-ähnlichen tubulären Strukturen wurde in ABAE-Kulturen durch Ergänzen des Kulturmediums mit 0,1, 0,3, 1, 3 oder 10 μg/ml von VEGI-alpha_12-147 analysiert. Alle Kulturen wurden dann bei 37°C für zusätzliche 48 Stunden gezüchtet und dann durch Fixierung mit kaltem Methanol (–20°C) beendet.
Die Abundanz der Kapillar-ähnlichen Strukturen, die durch ABAE-Zellen gebildet wurde, wurde durch Verwenden eines Kotron IBAS-Image-Analysegeräts, das mit einer Hamamatsu C2400-Videokamera und einem Zeiss-Axioshop-Mikroskop unterstützt wird, analysiert. Die Abundanz der Kapillar-ähnlichen Strukturen wurde als Prozentsätze von weißen Gebieten gegenüber den insgesamt gemessenen Gebieten gemessen. Als eine Kontrolle war der EC₅₀-Wert für den angiogenen Faktor FGF-2, die in vitro-Angiogenese zu stimulieren, etwa 5 ng/ml. Als eine weitere Kontrolle wurde eine maximal stimulierende Wirkung bei 10 ng/ml FGF-2 beobachtet.
Beispiel 7: VEGI-vermittelte Hemmung des Tumorwachstums.
Eine in vivo-Analyse der potenziellen Wirkung von VEGI-Polypeptiden auf die Angiogenese wurde unter Verwendung eines Xenotransplantat-Tumor-Modells durchgeführt. In diesem experimentellen Ansatz wurden eine Million menschliche Brustkarzinomzellen (MDA-MB-231 oder MDA-MB-435) in den Brustdrüsen-Fettposter von weiblichen Nacktmäusen entweder alleine oder gemischt mit chinesischen Hamsterovar (CHO)-Zellen, die mit einem VEGI-alpha-exprimierenden Säuger-Expressionsvektor transfiziert sind, oder CHO-Zellen, die nur mit dem CHO-Vektor transfiziert sind, injiziert (5 × 10⁶ Zellen pro Maus). Das exprimierte VEGI-Polypeptid bestand in diesen Experimenten aus dem Polypeptid, das als SEQ ID NO: 2 gezeigt ist, ausschließlich der N-terminalen 22 Aminosäuren. Die N-terminalen 22 Aminosäuren dieses VEGI-Muteins wurden durch das sekretorische Signalpeptid des menschlichen Interleukin-6 ersetzt (Hirano, T., et al., Nature 324: 73–76 (1986)).
Die anti-angiogene Aktivität des VEGI-Polypeptids, die in diesem Beispiel beobachtet wurde, weist darauf hin, dass VEGI-Polypeptide eine Hemmung des Tumorwachstums zeigen können. Die potenzielle Anti-Krebs-Aktivität von VEGI wurde unter Verwendung des oben beschriebenen Xenotransplantat-Tumor-Modells unter Verwendung von Brustkrebs-Zellen, die hoch tumorigen sind, wenn sie in die Brustdrüsen-Fettpolster von weiblichen Nachtmäusen ohne Thymus implantiert werden, untersucht. Die Transkription des Konstrukts in den Transfektanten wurde durch Northern Blot-Analyse bestätigt. Das konditionierte Medium der CHO-Zellen, die die sezernierte Form von VEGI-alpha überexprimierten, wurde konzentriert und teilweise gereinigt, und es wurde gefunden, dass es in der Lage ist, das ABAE-Zellwachstum zu hemmen, wohingegen jenes der Vektor-transfizierten oder der Volllängen-VEGI-transfizierten CHO-Zellen keine Wirkung hatte (Daten nicht gezeigt). Die potenzielle Anti-Krebs-Aktivität von VEGI-alpha wurde in einem menschlichen Brustkrebs-Xenotransplantat-Modell untersucht. Die mit löslichem VEGI-alpha-transfizierten CHO-Zellen und menschliche Brustkrebszellen (MDA-MB-231 oder MDA-MB-435) wurden in die Brustdrüsen-Fettposter co-injiziert, und das Wachstum der Xenotransplantat-Tumore wurde nach der Injektion überwacht.
CHO-Zellen, die das lösliche VEGI-alpha-Mutein überexprimieren, übten eine deutliche hemmende Wirkung auf das Wachstum von menschlichen Brustkrebs-Xenotransplantat-Tumoren aus, die durch MDA-MB-231-Zellen gebildet wurden (4A), wohingegen die Vektor-transfizierten CHO-Zellen keine Wirkung auf das Tumorwachstum zeigten. In ähnlicher Weise wurde eine signifikante Suppression des MDA-MB-435-Tumorwachstums in Nacktmäusen beobachtet (4B). In jedem Fall hatten die CHO-Zellen, die das Volllängen-VEGI-alpha überexprimierten, unter ähnlichen experimentellen Bedingungen keine Wirkung auf das Wachstum der Xenotransplantat-Tumore. Die Anti-Tumor-Wirkung des löslichen VEGI, die im Xenotransplantat-Modell beobachtet wurde, kann einer anti-angiogenen Wirkung auf die Endothelzellen des Tumor-Gefäßsystems zugeschrieben werden.
Mäuse, die mit menschlichen Brustkarzinom-Zellen und entweder VEGI-alpha-exprimierenden CHO-Zellen oder Vektor-transfizierten CHO-Zellen co-injiziert wurden, wurden dann zufällig angeordnet, und die Tumore wurden zweimal pro Woche gemessen. Die Tumorgröße wurde durch Messen der senkrechten Durchmesser mit einer Schublehre bewertet und durch Multiplizieren der Messungen der Durchmesser in zwei Dimensionen berechnet. Tumore wurden beginnen am Tag Null und ungefähr in 5 Tage-Intervallen über ungefähr 28 Tage gemessen. In jedem Fall blieben Tumore, die aus Brustkarzinom-Zellen resultierten, die mit VEGI-alpha- exprimierenden CHO-Zellen co-injiziert wurden, signifikant kleiner als jene, die aus Brustkarzinom-Zellen resultierten, die mit nur Vektor-CHO-Zellen co-injiziert wurden.
Basierend auf diesen Ergebnissen legen wir nahe, dass VEGI ein Endothelzell-spezifischer negativer Regulator der Angiogenese ist, der im Bewahren der reifen Gefäße oder der Terminierung eines Angiogenese-Vorgangs wirken kann. Das Endothel ist unter physiologischen Bedingungen mit etwa 1% der Endothelzellen, die eine Proliferation durchmachen, ein ruhendes Gewebe (J. Denekamp (1990) Cancer Metas. Rev. 9: 267). Der Mechanismus, der dem Bewahren des Ruhezustands des Endothels zugrunde liegt, ist noch nicht klar. Es ist vorstellbar, dass ein Selbst-Restriktionsmechanismus vorhanden ist, in dem die Endothelzellen einen Wachstums-Inhibitor produzieren, der auf die Endothelzellen selbst durch einen autokrinen Signalweg wirkt. VEGI kann in diesem wichtigen Mechanismus eine Rolle spielen.
Beispiel 8: Fähigkeit von rekombinantem VEGI-alpha, WEHI 164-, ABAE- und L929-Zellwachstum zu hemmen und die Zelladhäsion in HL-60-Zellen zu induzieren.
Die anhaftenden Zielzellen wurden von konfluenten Kulturen durch Trypsinieren in PBS hergestellt, und nicht anhaftenden Zielzellen wurden von stationären Kulturen geerntet und einmal mit Medium gewaschen. Die Zielzellen wurden zu 3 × 10⁵ Zellen/ml in Medium, enthaltend 10% FCS suspendiert. 0,1 ml-Aliquots wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mit flachem Boden, enthaltend 0,1 ml reihenverdünnte Testproben von Zellen (WEHI 164 und L929), dispensiert. Die Inkubation wurde für 70 Stunden fortgesetzt. TNF-α, TNF-β und bakteriell produziertes VEGI-alpha wurden in einer 0,5 μg/ml-Konzentration zugefügt. Die Cytotoxizitäts- und Proliferationsaktivität wurden unter Verwendung eines MTS-Tests quantifiziert, der durch die Zugabe von 20 μl einer MTS- und Phenazinmethosulfat(PMS)-Lösung zu jeder Vertiefung durchgeführt wurde. Nach einer drei Stunden-Inkubation wurde die OD bei 492 nm durch ein ELISA-Plattenlesegerät gemessen. Die OD₄₉₂ ist proportional zu der Zahl der lebensfähigen Zellen in den Vertiefungen. Der Prozentsatz der Cytotoxizität wurde wie folgt berechnet: %Cytotoxizitat = (100 – OD_{experimentekontell}/OD_Kontrolle) × 100. VEGI-alpha induzierte eine Morphologie-Änderung, die als dunkle runde Zellen auftrat (hinweisend auf abgetötete Zellen).
Ein verkürzte Form des VEGI-alpha-Polypeptids, bestehend aus den Aminosäuren 12–147 der vollständigen VEGI-alpha-Aminosäuresequenz, die als SEQ ID NO: 2 gezeigt ist, (bezeichnet VEGI-alpha_12-147 wurde auch verwendet, um die Wirkung von VEGI-alpha auf das Endothelzell-Wachstum zu untersuchen. Die Behandlung von adulten bovinen Aorta-Endothel (ABAE)-Zellen mit VEGI-alpha_12-147 resultierte in einer beinahe vollständigen Inhibition des Wachstums von Zellen in der ABAE-Kultur, nicht aber von Zellen in den Brustkrebs-Zelllinien MDA-MB-435 oder MDA-MB-231. Eine beinahe vollständige Inhibition des Wachstums der Endothelzellen wurde bei 10 μg/ml VEGI-alpha_39-174 mit einem Wert der halbmaximalen inhibitorischen Konzentration (IC₅₀) von ungefähr 1 μg/ml (ungefähr 70 nM) erreicht.
Um die Adhäsionsfähigkeit von VEGI-alpha zu testen, wurden HL-60-Zellen verwendet, und die Zelladhäsion und der Zell-zu-Zelt-Kontakt wurden durch Beobachtung unter dem Mikroskop gemessen und subjektiv durch zwei unabhängige Untersucher bewertet. In diesen Experimenten schien VEGI-alpha die Zelladhäsion zu induzieren. Kulturen, die nicht mit VEGI-alpha behandelt wurden, enthielten Zellen, die sich quer über die Kulturschale ausgebreitet hatten. Kulturen, die mit VEGI-alpha behandelt wurden, enthielten jedoch Zellen, die deutlich zusammen aggregiert waren.
Beispiel 9: Expression durch Gentherapie
Fibroblasten werden von einem Subjekt durch Hautbiopsie erhalten. Das resultierende Gewebe wird in ein Gewebekulturmedium platziert und in kleine Stücke geteilt. Kleine Stücke des Gewebes werden auf eine nasse Oberfläche einer Gewebekulturflache platziert, ungefähr 10 Stücke werden in jede Flasche platziert. Die Flasche wird umgedreht, fest verschlossen und bei Zimmertemperatur über Nacht belassen. Nach 24 Stunden bei Zimmertemperatur wird die Flasche umgedreht und die Stücke des Gewebes bleiben am Boden der Schale fixiert. Zu dieser Zeit werden frische Medien zugefügt (z. B. Ham-F12-Medien, ergänzt mit 10% FBS, Penicillin und Streptomycin). Die Kultur wird dann bei 37°C für ungefähr eine Woche inkubiert. Zu dieser Zeit werden frische Medien zugefügt und danach alle 2–3 Tage gewechselt. Nach zusätzlichen zwei Wochen in Kultur wird ein Monolayer von Fibroblasten aufgetreten sein. Der Monolayer wird trypsiniert und in größere Flaschen gemessen.
pMV-7 (Kirschmeier, P. T. et al., DNA, 7: 219–25 (1988)), das durch die langen terminalen Wiederholungen des murinen Moloney Sarkomvirus flankiert wird, wird mit EcoRI und Hind III verdaut und danach mit intestinaler Kälber-Phosphatase behandelt. Der lineare Vektor wird auf einem Agarosegel fraktioniert und unter Verwendung von Glasperlen gereinigt.
Die cDNA, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, wird unter Verwendung von PCR-Primern amplifiziert, die den 5'- beziehungsweise 3'-Endsequenzen entsprechen. Der 5'-Primer, enthaltend eine Eco RI-Stelle, und der 3'-Primer schließt eine Hind III-Stelle ein. Gleiche Mengen des linearen murinen Moloney-Sarkomvirus-Gerüsts und des amplifizierten EcoRI- und Hind III-Fragments werden in der Anwesenheit der T4-DNA-Ligase zusammengefügt. Das resultierende Gemisch wird unter Bedingungen gehalten, die für die Ligierung der zwei Fragmente geeignet sind. Das Ligierungsgemisch wird verwendet, um die Bakterien HB101 zu transformieren, die dann zum Zweck des Bestätigens, dass der Vektor das Gen von Interesse korrekt inseriert hatte, auf Agar, enthaltend Kanamycin, plattiert werden.
Die amphotropen pA317- oder GP + am12-Verpackungszellen werden in Gewebekultur zu einer konfluenten Dichte in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% Kälberserum (CS), Penicillin und Streptomycin gezüchtet. Der MSV-Vektor, enthaltend das Gen, wird dann zu den Medien zugefügt, und die Verpackungszellen werden mit dem Vektor transduziert. Die Verpackungszellen produzieren jetzt infektiöse virale Partikel, die das Gen enthalten (die Verpackungszellen werden jetzt als Hersteller-Zellen bezeichnet).
Frische Medien werden zu den transduzierten Hersteller-Zellen zugefügt, und danach werden die Medien von einer 10 cm-Platte von konfluenten Hersteller-Zellen geerntet. Die verbrauchten Medien, enthaltend die infektiösen viralen Partikel, werden durch einen Millipore-Filter gefiltert, um abgelöste Herstellerzellen zu entfernen. Diese Medien werden dann verwendet, um Fibroblastenzellen zu infizieren. Die Medien werden von einer sub-konfluenten Platte von Fibroblasten entfernt und schnell mit den Medien von den Herstellerzellen ersetzt. Die Medien werden entfernt und mit frischen Medien ersetzt. Wenn der Titer des Virus hoch ist, dann werden nahezu alle Fibroblasten infiziert werden und keine Selektion ist nötig. Wenn der Titer sehr niedrig ist, dann kann es notwenig sein, einen retroviralen Vektor zu verwenden, der einen selektierbaren Marker wie neo oder his aufweist.
Die konstruierten Fibroblasten werden dann entweder alleine oder, nachdem sie auf Cytodex 3-Mikroträgerkugeln zur Konfluenz gezüchtet worden sind, in den Wirt injiziert. Die Fibroblasten produzieren jetzt das Proteinprodukt.
Beispiel 10: Embryonale Hühner-Chorioallantois-Membran (CAM)-Angiogenese-Test
Der CAM-Test wurde im Wesentlichen ausgeführt, wie durch Nguyen und Mitarbeiter (Microvasc. Res. 47:31–40 (1994)) und Iruela-Arispe und Dvorak (Thromb. Haemost. 78: 672–677 (1997)) beschrieben. Das Verfahren basiert auf dem Wachstum von neuen Kapillargefäßen in ein Kollagen-Gelpellet, das direkt auf die Chorioallantois-Membran (CAM) platziert wird. Die angiogenen Faktoren FGF-2 (100 ng) oder VEGF (250 ng) wurden in Kollagen-Gelpellets eingebettet und in Kontakt mit der CAM platziert. Die Quantifizierung der Angiogenese in den Gels wurde 24 Stunden nach dem Platzieren der Gelpellets durch Verwenden eines Nikon-Fluoreszenzmikroskops ausgeführt. Die Bilder wurden unter Verwendung einer CCD-Sony-Kamera auf einen Power PC 100 AV transferiert. Die Fluoreszenz-Intensität wurde mit der NH Image 1.61 Software bewertet. Die Fluoreszenz-Intensität für die Positivkontrollen (die einen angiogenen Faktor alleine enthielten) wurden als die maximale angiogene Antwort angesehen und willkürlich bei 100 eingestellt. Aufgrund der Variabilität des Tests wurde eine Inhibition von mehr als 20% als signifikant angesehen.
Als eine experimentelle Bestimmung der Wirkung von VEGI-alpha auf die FGF-2 oder VEGF-induzierte Angiogenese wurde bakteriell produziertes VEGI-alpha (250 ng) mit entweder FGF-2 (100 ng) oder VEGF (250 ng) gemischt und in Kollagen-Gelpellets eingebettet. Die Pellets wurden dann in Kontakt mit der CAM platziert, wie oben beschrieben. VEGI-alpha hemmte deutlich das neue Kapillarwachstum in die Kollagen-Gele.
INDIKATIONEN, DIE EINEN HINTERLEGTEN MIKROORGANISMUS BETREFFEN (PCT Regel 13 bis)
INDIKATIONEN, DIE EINEN HINTERLEGTEN MIKROORGANISMUS BETREFFEN (PCT Regel 13 bis)
Sequenzprotokoll

Claims

In vitro-Verfahren zum Testen möglicher Agenzien oder Arzneistoffe für angiogen-inhibitorische Aktivität, wobei das Verfahren das Messen der Fähigkeit des Agens oder Arzneistoffs umfasst, die anti-angiogene Aktivität eines Polypeptids zu erhöhen, das von einem Nucleinsäuremolekül codiert wird, das ein Polynucleotid umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Polynucleotid, das ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuren 1 bis 174 von SEQ ID NO: 2 umfasst; (b) einem Polynucleotid, das ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuren 23 bis 174 von SEQ ID NO: 2 umfasst; (c) einem Polynucleotid, das ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuren 39 bis 174 von SEQ ID NO: 2 umfasst; (d) einem Polynucleotid, das ein Fragment des Polypeptids gemäß einem von (a) bis (c) mit Angiogenese-hemmender Aktivität codiert; (e) einem Polynucleotid, das mit dem Komplement von SEQ ID NO: 1 hybrisiert, wobei das Polynucleotid ein Polypeptid mit Angiogenese-hemmender Aktivität codiert; (f) einem Polynucleotid, das eine allelische Variante des Polynucleotids gemäß einem von (a) bis (e) codiert; (g) einem Polynucleotid gemäß einem von (a) bis (f), das ein Polypeptid codiert, das ein Sekretionssignal umfasst; und (h) dem komplementären Strang von einem der obigen (a) bis (g); in einem in vitro-Test.
In vitro-Verfahren zum Testen der Fähigkeit eines Arzneistoffs oder eines Agens Angiogenese zu fördern, wobei das Verfahren das Messen der Fähigkeit des Arzneistoffs oder des Agens in einem in vitro-Test umfasst, die Funktion eines Polypeptides zu reduzieren oder zu unterbinden, das von einem Nucleinsäuremolekül codiert wird, das ein Polynucleotid wie in einem von (a) bis (h) von Anspruch 1 definiert umfasst.
Verwendung eines Nucleinsäuremoleküls, das ein Polynucleotid wie in einem von (a) bis (h) von Anspruch 1 definiert umfasst, eines Polypeptides das von einem Nucleinsäuremolekül codiert wird, das ein Polynucleotid wie in einem von (a) bis (h) von Anspruch 1 definiert umfasst, oder eines rekombinanten Vektors, der ein Polynucleotid wie in einem von (a) bis (h) von Anspruch 1 definiert umfasst, für die Herstellung eines Arzneimittels zum Hemmen von Angiogenese.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei das Hemmen von Angiogenese das Hemmen von Angiogenese bei anderen Krankheiten als Krebs oder Tumore umfasst.
Verwendung eines Antagonisten des VEGI-Polypeptides, das von einem Polynucleotid wie in Anspruch 1 definiert codiert wird, der ein Antisense-Oligonucleotid oder ein Ribozym, das spezifisch für RNA ist, die das VEGI-Polypeptid codiert, oder ein Antikörper, der an das VEGI-Polypeptid bindet und dessen Aktivität hemmt oder unterbindet, ist, in einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel, in einer pharmazeutisch verträglichen Menge für die Herstellung eines Arzneimittels zum Fördern von Angiogenese.
Verwendung eines Nucleinsäuremoleküls, das ein Polynucleotid wie in einem von (a) bis (h) von Anspruch 1 definiert umfasst, eines Polypeptids, das von einem Nucleinsäuremolekül codiert wird, das ein Polynucleotid wie in einem von (a) bis (h) von Anspruch 1 definiert umfasst, oder eines rekombinanten Vektors, der ein Polynucleotid wie in einem von (a) bis (h) von Anspruch 1 definiert umfasst, für die Herstellung eines Arzneimittels zum Behandeln oder Lindern einer Erkrankung, die durch unkontrollierte Angiogenese vermittelt wird, wobei die Erkrankung zu der Gruppe gehört bestehend aus: (a) Telangiektasie; (b) Schuppenflechte; (c) Sclerodermia; (d) Myokardiale Angiogense; (e) Plaque-Gefäßneubildung; (f) Angiogenese ischämischer Gliedmaßen; (g) Rubeose; (h) Neovaskuläres Glaukom; (i) Diabetische Retinopathie; (j) Retrolentale Fibroplasie; (k) Diabetische Gefäßneubildung; (l) Uveitis; (m) Frühgeborenen-Retinopathie; (n) Makuladegeneration; (o) Hornhauttransplantat-Gefäßneubildung; (p) Transplantat-Wirt-Reaktion; (q) Entzündliche Darmerkrankung; und (r) Knochenmarksdepression.
Verwendung eines Antagonisten eines VEGI-Polypeptids, das von einem Polynucleotid wie in Anspruch 1 definiert codiert wird, der ein Antisense-Oligonucleotid oder ein Ribozym, das spezifisch für RNA ist, die das VEGI-Polypeptid codiert, oder ein Antikörper, der an das VEGI-Polypeptid bindet und dessen Aktivität hemmt oder unterbindet, ist, in einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel, in einer pharmazeutisch-verträglichen Menge für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Linderung von Erkrankungen, die durch gehemmte Angiogense vermittelt werden.