DE69534452T2

DE69534452T2 - Antivirales protein

Info

Publication number: DE69534452T2
Application number: DE69534452T
Authority: DE
Inventors: Jian Ni; Ping Feng; J. Patrick DILLON; Reiner Gentz
Original assignee: Human Genome Sciences Inc
Current assignee: Human Genome Sciences Inc
Priority date: 1995-12-19
Filing date: 1995-12-19
Publication date: 2006-06-22
Anticipated expiration: 2015-12-20
Also published as: EP0874864A1; ES2247594T3; EP0874864A4; WO1997022623A1; AU4692896A; DE69534452D1; EP0874864B1; ATE304551T1; JP2000508057A

Description

Diese Erfindung betrifft neu identifizierte Polynucleotide, Polypeptide, die durch solche Polynucleotide codiert werden, die Verwendung solcher Polynucleotide und Polypeptide sowie die Herstellung solcher Polynucleotide und Polypeptide. Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung wurde mutmaßlich als ein menschliches antivirales Protein identifiziert und insbesondere als ein Osteo-antivirales Protein, das hierin nachstehend gelegentlich als „OAP" bezeichnet wird. Die Erfindung betrifft ebenfalls die Hemmung der Wirkung solcher Polypeptide.
Der Prozess der embryonalen Knochenbildung umfasst die Erzeugung einer extrazellulären Matrix, die im Verlauf der Gewebereifung mineralisiert. Diese Matrix ist einer ständigen Umbildung im Verlauf des Lebens eines Individuums durch die kombinierten Wirkungen von Osteoblasten und Osteoclasten unterworfen. Es muss ein feines Gleichgewicht zwischen der Bildung der Matrix und der Resorption aufrechterhalten werden, da Störungen zu verschieden Knochenerkrankungen führen können.
Die extrazelluläre Matrix des Knochens besteht aus zwei Phasen, einer organischen und einer mineralischen Phase. Die organische Phase besteht vorwiegend aus Fibrillen des Kollagentyps I, die mit einer Zahl von Matrixproteinen assoziiert sind, die nicht Kollagen sind. Das Interesse an Proteinen des Knochens, die nicht Kollagen sind, wurde stark stimuliert, seit Urist zuerst aufzeigte, dass demineralisierte Knochenextrakte die ektopische Knochenbildung induzieren können (Urist, M.R., Science 150:893–899 (1965)). Von den nicht kollagenösen Proteinen des Knochens nimmt man heute an, dass sie an der Mineralisierung sowie an der örtlichen Regulation der Knochenzellenfunktion beteiligt sind (Heinegard, D. und Oldberg, A., Connective Tissue and Its Heritable Disorders (Royce, P.M. und Steinmann, B., Hrsg.), Seite 189–209, Wiley-Liss, New York (1993) und Von der Mark, K und Goodman, S., ibid.). In den letzten Jahren wurden eine Reihe von Proteinen des Knochens, die nicht Kollagen sind, isoliert und charakterisiert; darunter befinden sich Osteocalcin, Osteopontin, Osteonectin und das Knochen-Sialoprotein (Heinegard, D. und Oldberg, A., FASEB J. 3:2042–2051 (1985)).
Es wurde eine clonale knochenbildende Zelllinie (MN7) aus dem Knochenmarkstroma der erwachsenen Maus etabliert (Mathieu, E. et al., Calcif. Tissue Int. 50:362–371 (1992)). Diese Zellen durchlaufen unter geeigneten Bedingungen die typische Osteoblasten-Differenzierung in vitro und sind in der Lage, eine mineralisierte extrazelluläre Matrix zu bilden (Mathieu, E. und Merregaert, J., J. Bone Miner. Res. 9:183–192 (1994)).
Eine cDNA, die ein neues sekretorisches Protein der Maus (p85) codiert, wurde cloniert, charakterisiert und genetisch kartiert (Bhalerao, J. et al., J. Biol. Chem. 270 (27):16385–16394 (1995)). Die Volllängen-cDNA enthält ein offenes Leseraster von 1677 Bp, das ein Protein von 559 Aminosäuren codiert. Der Clon enthält ein hydrophobes Signalpeptid, das für ein sekretiertes Protein charakteristisch ist. Die Boten-RNA mit einer Länge von 1,9 kB wird in verschiedenen Geweben exprimiert wie z. B. der Leber, dem Herzen, der Lunge usw., wohingegen eine Spleiß-Variante in dem embryonalen Knorpel in der Haut vorliegt. Dieses Gen p85, als Ecm1 für extrazelluläres Matrixprotein 1 bezeichnet, kartiert auf dem Chromosom 3 der Maus in einem Bereich, der mehrere Genorte (Loci) enthält, die an Erkrankungen der Hautentwicklung beteiligt sind.
Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung weist die größte Aminosäuresequenz-Homologie mit einem Wachstumsfaktor, Ecm1, auf, und es wurde gezeigt, dass es eine antivirale Wirkung besitzt.
Gemäß eines Aspekts der vorliegenden Erfindung wird eine neues reifes Polypeptid gemäß Anspruch 10 bereit gestellt, sowie biologisch aktive und diagnostisch oder therapeutisch nützliche Fragmente, Analoga und Derivate gemäß Anspruch 10. Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung ist menschlichen Ursprungs.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden isolierte Nucleinsäuremoleküle bereit gestellt, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codieren, einschließlich mRNAs, cDNAs, genomische DNAs sowie Analoga und biologisch aktive und diagnostisch oder therapeutisch nützliche Fragmente gemäß Anspruch 1.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bereit gestellt, das ein reifes Polypeptid codiert, welches durch die DNA exprimiert wird, die in der ATCC-Hinterlegungs-Nr. 97302 enthalten ist.
Gemäß einem noch weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Polypeptids gemäß den Ansprüchen 8 und 9 bereit gestellt, und zwar durch rekombinante Verfahren, umfassend die Kultur rekombinanter prokaryontischer und/oder eukaryontischer Wirtszellen, die eine Nucleinsäuresequenz enthalten, welche ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, unter Bedingungen, die die Expression des Proteins und die anschließende Gewinnung des Proteins fördern.
Gemäß einem noch weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Verwendung solcher Polypeptide gemäß Anspruch 16 oder von Polynucleotiden, die solche Polypeptide codieren, für therapeutische Zwecke, zum Beispiel als ein antiviraler Faktor zur Behandlung einer Krankheit, die durch eine Infektion mit einem Virus verursacht wird, bereit gestellt.
Gemäß einem noch weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Antikörper gegen solche Polypeptide gemäß Anspruch 11 bereitgestellt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden OAP-Agonisten, die OAP nachbilden und an die OAP-Rezeptoren binden, und Antagonisten gegen solche Polypeptide gemäß den Ansprüchen 11–13, die verwendet werden können, um die Wirkung solcher Polypeptide zu hemmen, bereit gestellt.
Gemäß einem noch weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden diagnostische Testansätze zum Nachweis von Krankheiten oder von Empfänglichkeiten für Krankheiten bereitgestellt, die mit Mutationen in den Nucleinsäuresequenzen gemäß den Ansprüchen 17 und 18 in Beziehung stehen, welche ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codieren.
Gemäß einem noch weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Verwendung solcher Polypeptide oder von Polynucleotiden, die solche Polypeptide codieren, gemäß Anspruch 16 für in vitro-Zwecke, die mit der wissenschaftlichen Forschung in Beziehung stehen, wie zum Beispiel die Synthese von DNA und die Herstellung von DNA-Vektoren, bereit gestellt.
Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung sollten den Fachleuten aus den hierin angeführten Lehren offenbar sein.
Die folgenden Zeichnungen erläutern die Ausführungsformen der Erfindung und sind nicht dazu beabsichtigt, den Rahmen der Erfindung einzuschränken, wie er durch die Ansprüche umschlossen wird.
1 ist eine Darstellung der cDNA und der entsprechenden abgeleiteten Aminosäuresequenz des Polypeptids der vorliegenden Erfindung. Der unterstrichene Teil zeigt eine mögliche Leader-Sequenz an. Die Sequenzierung wurde unter der Verwendung eines automatisierten DNA-Sequenziergeräts, Modell 373 (Applied Biosystems, Inc.) durchgeführt.
2 ist ein Aminosäuresequenzvergleich zwischen dem Polypeptid der vorliegenden Erfindung (obere Zeile) und murinem Ecm1 (untere Zeile).
3 zeigt die strukturellen und funktionellen Eigenschaften des OAP, die durch die angezeigten Verfahren abgeleitet wurden, als Funktion der Aminosäuresequenz.
4 ist eine Darstellung, die zeigt, dass OAP Mäuse vor einer Infektion mit EMCV schützt. Wie in Beispiel 4 beschrieben, wurden Gruppen von je 10 acht Wochen alten männlichen A/J-Mäusen Kochsalz (Scheinansatz), murines IFN-gamma, 43 μg OAP oder 84 μg OAP injiziert und dann EMCV ausgesetzt. Die Überlebenden in jeder Gruppe in den anschließenden Tagen nach der Aussetzung gegenüber EMCV sind in der Darstellung abgebildet.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes Nucleinsäuremolekül (Polynucleotid) bereit gestellt, welches das reife Polypeptid codiert, das die abgeleitete Aminosäuresequenz der 1 besitzt (SEQ ID NO: 2).
Das Polynucleotid dieser Erfindung wurde in einer cDNA-Genbank entdeckt, die aus einer menschlichen Tumor-Bauchspeicheldrüse abgeleitet worden war. Es ist strukturell mit Ecm1 verwandt. Es enthält ein offenes Leseraster, das ein Protein von 540 Aminosäureresten codiert, von denen die ersten 19 Aminosäuren eine mögliche Leader-Sequenz darstellen, sodass das reife Protein 521 Aminsäuren umfasst. Das Protein weist auf Aminosäureebene den höchsten Grad an Homologie mit dem murinen Ecm1-Protein auf, und zwar mit 66,790 % Identität und 78,664 % Ähnlichkeit über die gesamte Länge der Aminosäuresequenz. Das Gen der vorliegenden Erfindung weist den höchsten Grad an Homologie auf Nucleotidebene ebenfalls mit dem murinen Ecm1-Protein auf, und zwar mit 80 % Identität und 80 % Ähnlichkeit über die gesamte Nucleotidsequenz. Das reife OAP-Protein besitzt ein vorhergesagtes Molekulargewicht von 59.182,10, einen molaren Extinktionskoeffizienten von annähernd 74.220 und einen isoelektrischen Punkt von 6,80.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden isolierte Polynucleotide bereitgestellt, die ein reifes Polypeptid codieren, das durch die DNA exprimiert wird, die in der ATCC-Hinterlegung Nr. 97302 enthalten ist, die bei der American Type Culture Collection, 12301 Park Lawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, am 25. September 1995 hinterlegt wurde. Das hinterlegte Material ist ein Plasmid, das die Volllängen-OAP-cDNA enthält, die in den Bluescript SK(-)-Vektor (Stratagene, La Jolla, CA) inseriert ist.
Die Hinterlegung erfolgte unter den Bedingungen des Budapester Vertrags über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für Zwecke des Patentverfahrens. Der Stamm wird unwiderruflich und ohne Einschränkung oder Bedingung für die Öffentlichkeit nach Erteilung des Patents freigegeben. Diese Hinterlegungen werden nur aus Gründen der Zweckmäßigkeit den Fachleuten bereitgestellt und stellen kein Eingeständnis dar, dass eine Hinterlegung nach 35 U.S.C. §112 erforderlich wäre. Die Sequenz der Polynucleotide, die in den hinterlegten Materialien enthalten ist, sowie die Aminosäuresequenzen der durch sie codierten Polypeptide stellen eine Kontrolle im Falle irgendeines Konflikts mit irgendeiner Beschreibung der Sequenzen hierin dar. Es kann eine Lizenz erforderlich sein, um die hinterlegten Materialien herzustellen, zu verwenden oder zu verkaufen, und hiermit wird eine solche Lizenz nicht gewährt. Ein Bezug auf „Polynucleotide" in dieser Beschreibung umfasst die DNA der Hinterlegung, auf die vorstehend Bezug genommen wurde.
Das Polynucleotid der vorliegenden Erfindung kann in Form von RNA oder in Form von DNA vorliegen, wobei die DNA cDNA, genomische DNA und synthetische DNA umfasst. Die DNA kann doppelsträngig oder einzelsträngig sein und, wenn sie einzelsträngig ist, kann es sich um den codierenden Strang oder um den nicht codierenden Strang (Antisense-Strang) handeln. Die codierende Sequenz, die das reife Polypeptid codiert, kann mit der codierenden Sequenz, die in 1 (SEQ ID NO: 1) gezeigt wird, identisch sein, oder es kann eine unterschiedliche codierende Sequenz sein, wobei diese codierende Sequenz als Folge der Redundanz oder der Degeneriertheit des genetischen Codes das gleiche reife Polypeptid wie die DNA in 1 (SEQ ID NO: 1) codiert.
Das Polynucleotid, das das reife Polypeptid der 1 (SEQ ID NO: 2) codiert, umfasst die codierende Sequenz des reifen Polypeptids; die codierende Sequenz des reifen Polypeptids und eine zusätzliche codierende Sequenz wie z. B. eine Leader- oder eine sekretorische Sequenz oder eine Proprotein-Sequenz; die codierende Sequenz des reifen Polypeptids (und gegebenenfalls eine zusätzliche codierende Sequenz) und nicht codierende Sequenzen wie z. B. Introns oder nicht codierende Sequenzen, die sich 5' und/oder 3' der codierenden Sequenz des reifen Polypeptids befinden.
Daher umfasst der Begriff „Polynucleotid, das ein Polypeptid codiert," ein Polynucleotid, das nur die codierende Sequenz des Polypeptids umfasst, sowie ein Polynucleotid, das zusätzliche codierende und/oder nicht codierende Sequenzen enthält.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Varianten der hierin vorstehend beschriebenen Polynucleotide, die Fragmente, Analoga und Derivate des Polypeptids codieren, das die abgeleitete Aminosäuresequenz der 1 (SEQ ID NO: 2) besitzt, gemäß Anspruch 1. Die Variante des Polynucleotids kann eine natürlich vorkommende allelische Variante des Polynucleotids sein oder eine nicht natürlich vorkommende Variante des Polynucleotids.
Daher umfasst die vorliegende Erfindung Polynucleotide, die das gleiche reife Polypeptid codieren, wie es in 1 (SEQ ID NO: 2) gezeigt wird, sowie gemäß Anspruch 1 Varianten solcher Polynucleotide, wobei die Varianten ein Fragment, ein Derivat oder ein Analog des Polypeptids der 1 (SEQ ID NO: 2) codieren. Solche Nucleotidvarianten umfassen Deletionsvarianten, Austauschvarianten und Additions- oder Insertionsvarianten.
Wie hierin vorstehend angezeigt, kann das Polynucleotid gemäß Anspruch 1 eine codierende Sequenz besitzen, die eine natürlich vorkommende allelische Variante der codierenden Sequenz darstellt, die in 1 (SEQ ID NO: 1) gezeigt wird. Wie im Fachgebiet bekannt ist, ist eine allelische Variante eine alternative Form einer Polynucleotidsequenz, die einen Austausch, eine Deletion oder eine Hinzufügung eines oder mehrerer Nucleotide enthalten kann, welcher die Funktion des codierten Polypeptids nicht wesentlich verändert.
Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls Polynucleotide gemäß Anspruch 1, in denen die codierende Sequenz des reifen Polypeptids im gleichen Leseraster mit einer Polynucleotidsequenz fusioniert sein kann, die bei der Expression und der Sekretion eines Polypeptids (in bzw.) aus einer Wirtszelle hilft, wie zum Beispiel eine Leader-Sequenz, die als eine sekretorische Sequenz zur Kontrolle des Transports eines Polypeptids aus der Zelle fungiert. Das Polypeptid, das eine Leader-Sequenz besitzt, ist ein Präprotein, und es kann die Leader-Sequenz besitzen, die durch die Wirtszelle abgespalten wird, um die reife Form des Polypeptids zu bilden. Die Polynucleotide können auch ein Proprotein codieren, wobei es sich um das reife Protein plus zusätzliche 5' gelegene Aminosäurereste handelt. Ein reifes Protein, das eine Prosequenz besitzt, ist ein Proprotein und stellt eine inaktive Form des Proteins dar. Nachdem die Prosequenz abgespalten wurde, verbleibt ein aktives reifes Protein. Somit kann zum Beispiel das Polynucleotid der vorliegenden Erfindung ein reifes Protein codieren oder ein Protein codieren, das eine Prosequenz besitzt, oder ein Protein codieren, das sowohl eine Prosequenz als auch eine Präsequenz (Leader-Sequenz) besitzt.
Die Polynucleotide gemäß Anspruch 1 können auch die codierende Sequenz enthalten, die im Leseraster mit einer Markierungssequenz fusioniert ist, welche die Reinigung des Polypeptids der vorliegenden Erfindung erlaubt. Die Markierungs-Sequenz kann eine Hexa-Histidin-Markierungssequenz sein, die durch den Vektor pQE-9 bereit gestellt wird, um die Reinigung des reifen Polypeptids, das mit der Markierungssequenz fusioniert ist, zu erlauben, im Falle eines bakteriellen Wirts, oder zum Beispiel kann die Markierungssequenz eine Hämagglutinin (HA)- Markierungssequenz sein, wenn ein Säugerwirt wie z. B. COS-7-Zellen verwendet wird. Die HA-Markierungssequenz entspricht einem Epitop, das aus dem Influenza-Hämagglutinin-Protein stammt (Wilson, I. et al., Cell 37:767 (1984)).
Der Begriff „Gen" bedeutet das Segment einer DNA, die an der Herstellung einer Polypeptidkette beteiligt ist; er umfasst Regionen, die der codierenden Region voran stehen und folgen (Leader und Trailer), sowie intervenierende Sequenzen (Introns) zwischen individuellen codierenden Segmenten (Exons).
Fragmente des Volllängen-Gens der vorliegenden Erfindung können als Hybridisierungssonden bei einer cDNA-Genbank verwendet werden, um die Volllängen-cDNA zu isolieren und um andere cDNAs zu isolieren, die eine hohe Sequenzähnlichkeit mit dem Gen oder eine ähnliche biologische Aktivität aufweisen. Sonden dieses Typs enthalten bevorzugt mindestens 30 Basenpaare und können zum Beispiel 50 oder mehr Basen enthalten. Die Sonde kann auch verwendet werden, um einen cDNA-Clon zu identifizieren, der einem Volllängen-Transkript entspricht, und um einen genomischen Clon oder Clone zu identifizieren, die das vollständige Gen enthalten, einschließlich regulatorischer und Promotor-Regionen sowie Exons und Introns. Ein Beispiel für eine Durchmusterung umfasst die Isolierung der codierenden Region des Gens unter Verwendung der bekannten DNA-Sequenz zur Synthese einer Oligonucleotid-Sonde. Markierte Oligonucleotide, die eine Sequenz besitzen, die zu der des Gens der vorliegenden Erfindung komplementär ist, werden verwendet, um eine Genbank menschlicher cDNA, genomischer DNA oder mRNA zu durchmustern, um zu bestimmen, mit welchen Mitgliedern der Genbank die Sonde hybridisiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Polynucleotide, die mit den hierin vorstehend beschriebenen Sequenzen hybridisieren, wenn mindestens 85 %, bevorzugt mindestens 90 % und noch bevorzugter mindestens 95 % Identität zwischen den Sequenzen besteht. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere Polynucleotide, die unter stringenten Bedingungen mit den hierin vorstehend beschriebenen Polynucleotiden hybridisieren. Wie er hierin verwendet wird, bedeutet der Begriff „stringente Bedingungen", dass die Hybridisierung nur stattfinden wird, wenn mindestens 95 % und bevorzugt mindestens 97 % Identität zwischen den Sequenzen besteht. Die Polynucleotide, die mit den hierin vorstehend beschriebenen Polynucleotiden hybridisieren, codieren in einer bevorzugten Ausführungsform Polypeptide, die entweder im Wesentlichen die gleiche biologische Funktion oder die gleiche Aktivität wie das reife Polypeptid beibehalten haben, das durch die cDNAs der 1 (SEQ ID NO: 1) codiert wird.
Daher zielt die vorliegende Erfindung auf Polynucleotide, die mindestens 85 % Identität, bevorzugt mindestens 90 % Identität und noch bevorzugter mindestens 95 % Identität mit einem Polynucleotid aufweisen, welches das Polypeptid der SEQ ID NO: 2 codiert, und Polynucleotide, die dazu komplementär sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Polypeptid, das die abgeleitete Aminosäuresequenz der 1 (SEQ ID NO: 2) besitzt, sowie Fragmente, Analoga und Derivate eines solchen Polypeptids gemäß Anspruch 1.
Die Begriffe „Fragment", „Derivat" und „Analog" bedeuten, wenn sie sich auf das Polypeptid der 1 (SEQ ID NO: 2) beziehen, ein Polypeptid, das im Wesentlichen die gleiche biologische Funktion oder die gleiche Aktivität wie ein solches Polypeptid beibehalten hat. Daher umfasst ein Analog ein Proprotein, das durch die Abspaltung des Proproteinanteils aktiviert werden kann, um eine aktives reifes Polypeptid herzustellen.
Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann ein rekombinantes Polypeptid sein, ein natürliches Polypeptid oder ein synthetisches Polypeptid, bevorzugt handelt es sich um ein rekombinantes Polypeptid.
Das Fragment, Derivat oder Analog des Polypeptids der 1 (SEQ ID NO: 2) kann (i) eines sein, in dem einer oder mehrere der Aminosäurereste durch einen konservierten oder einen nicht konservierten Aminosäurerest (bevorzugt einen konservierten Aminosäurerest) ausgetauscht worden ist, und ein solcher ausgetauschter Aminosäurerest kann oder kann nicht durch den genetischen Code codiert sein, oder (ii) eines sein, in dem einer oder mehrere der Aminsäurereste eine Substituentengruppe umfasst, oder (iii) eines sein, in dem das reife Polypeptid mit einer anderen Verbindung fusioniert ist, wie z. B. einer Verbindung, um die Halbwertszeit des Polypeptids zu erhöhen (zum Beispiel Polyethylenglycol), oder (iv) eines sein, in dem zusätzliche Aminosäuren mit dem reifen Polypeptid fusioniert sind, wie z. B. eine Leader- oder eine sekretorische Sequenz oder eine Sequenz, die zur Reinigung des reifen Polypeptids verwendet wird, oder eine Proprotein-Sequenz. Solche Fragmente, Derivate und Analoga gelten aus den hierin angeführten Lehren als im Rahmen der Kenntnisse der Fachleute befindlich.
In diesem Aspekt der Erfindung werden ebenfalls Fragmente bevorzugt, die durch strukturelle oder funktionelle Attribute des OAP charakterisiert sind. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung in dieser Hinsicht umfassen Fragmente, die Alpha-Helix- und Alpha-Helix-bildende Regionen („Alpha-Regionen"), Beta-Faltblatt- und Beta-Faltblatt-bildende Regionen („Beta-Regionen"), Schleifen- und Schleifen-bildende Regionen („Schleifen-Regionen"), Knäuel- oder Knäuel-bildende Regionen („Knäuel-Regionen"), hydrophile Regionen, hydrophobe Regionen, alpha-amphipathische Regionen, beta-amphipathische Regionen, flexible Regionen, Oberflächen-bildende Regionen und Regionen mit einem hohen Antigenindex des OAP enthalten.
Bestimmte bevorzugte Regionen in dieser Hinsicht sind in 3 angeführt und umfassen Regionen der vorstehend erwähnten Typen, die durch die Analyse der in 1 angeführten Aminosäuresequenz identifiziert wurden, sind aber nicht auf diese beschränkt. Wie in 3 angeführt, umfassen solche bevorzugten Regionen Alpha-Regionen, Beta-Regionen, Schleifen-Regionen und Knäuel-Regionen nach Garnier-Robson, Alpha-Regionen, Beta-Regionen und Schleifen-Regionen nach Chou-Fasman, hydrophile Regionen und hydrophile Regionen nach Kyte-Doolittle, alpha- und beta-amphipathische Regionen nach Eisenberg, flexible Regionen nach Karplus-Schulz, Oberflächen-bildende Regionen nach Emini und Regionen mit einem hohem Antigenindex nach Jameson-Wolf.
Die Polypeptide und die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung werden bevorzugt in einer isolierten Form bereit gestellt und sind bevorzugt bis zur Homogenität gereinigt.
Der Begriff „isoliert" bedeutet, dass das Material aus seiner ursprünglichen Umgebung entfernt wurde (z. B. der natürlichen Umgebung, wenn es natürlich vorkommt). Zum Beispiel ist ein natürlich vorkommendes Polynucleotid oder Polypeptid, das in einem lebenden Tier vorliegt, nicht isoliert, aber das gleiche Polynucleotid oder Polypeptid, das von einigen oder allen der zugleich vorliegenden Materialien in dem natürlichen System getrennt wurde, ist isoliert. Solche Polynucleotide können Teil eines Vektors sein, und/oder solche Polynucleotide oder Polypeptide können Teil einer Zusammensetzung sein, und sie gelten immer noch als isoliert, insofern, als dass ein solcher Vektor oder eine solche Zusammensetzung nicht Teil ihrer natürlichen Umgebung ist.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung umfassen das Polypeptid der SEQ ID NO: 2 (insbesondere das reife Polypeptid) sowie Polypeptide, die mindestens 80 % Ähnlichkeit (bevorzugt mindestens 80 % Identität) mit dem Polypeptid der SEQ ID NO. 2 aufweisen, und noch bevorzugter mindestens 90 % Ähnlichkeit (noch bevorzugter mindestens 90 % Identität) mit dem Polypeptid der SEQ ID NO. 2 aufweisen und noch stärker bevorzugt mindestens 95 % Ähnlichkeit (noch stärker bevorzugt mindestens 95 % Identität) mit dem Polypeptid der SEQ ID NO. 2 aufweisen, und umfassen auch Teile solcher Polypeptide, wobei ein solcher Teil des Polypeptids im Allgemeinen mindestens 30 Aminosäuren und noch bevorzugter mindestens 50 Aminosäuren enthält.
Wie im Fachgebiet bekannt ist, wird die „Ähnlichkeit" zwischen zwei Polypeptiden durch einen Vergleich der Aminosäuresequenz und ihrer konservierten Aminosäureaustausche eines Polypeptids mit der Sequenz eines zweiten Polypeptids bestimmt.
Fragmente oder Teile der Polypeptide der vorliegenden Erfindung können zur Herstellung des entsprechenden Volllängen-Polypeptids durch Peptidsynthese verwendet werden; daher können die Fragmente als Zwischenstufen zur Herstellung der Volllängen-Polypeptide verwendet werden. Fragmente oder Teile der Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um Volllängen-Polynucleotide der vorliegenden Erfindung zu synthetisieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Vektoren gemäß Anspruch 5, die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung umfassen, sowie Wirtszellen, die mit Vektoren der Erfindung genetisch verändert worden sind, und die Herstellung der Polypeptide der Erfindung durch rekombinante Verfahren.
Wirtszellen gemäß Anspruch 7 werden mit den Vektoren dieser Erfindung gentechnisch verändert (transduziert oder transformiert oder transfiziert), wobei es sich zum Beispiel um einen Clonierungsvektor oder um einen Expressionsvektor handeln kann. Der Vektor kann zum Beispiel in Form eines Plasmids, eines Viruspartikels, eines Phagen usw. vorliegen. Die veränderten Wirtszellen können in herkömmlichen Nährmedien kultiviert werden, die in geeigneter Weise zur Aktivierung von Promotoren, zur Selektion von Transformanten oder zur Amplifikation der Gene der vorliegenden Erfindung modifiziert wurden. Die Kulturbedingungen wie z. B. die Temperatur, der pH-Wert und ähnliches sind diejenigen, die zuvor bei der zur Expression ausgewählten Wirtszelle verwendet wurden, und sie werden den Fachleuten bekannt sein.
Die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können zur Herstellung von Polypeptiden durch rekombinante Verfahren verwendet werden. Daher kann zum Beispiel das Polynucleotid in irgendeinen aus einer Vielzahl von Expressionsvektoren zur Expression eines Polypeptids eingebaut werden. Solche Vektoren umfassen chromosomale, nicht chromosomale und synthetische DNA-Sequenzen, wie z. B. Derivate von SV40; bakterielle Plasmide; Phagen-DNA; Baculoviren; Hefe-Plasmide; Vektoren, die aus Kombinationen von Plasmid- und Phagen-DNA stammen; virale DNA wie z. B. von Vaccinia, Adenovirus, Geflügelpest und Pseudorabies. Es kann jedoch jeder andere Vektor verwendet werden, so lange er in dem Wirt replikations- und überlebensfähig ist.
Die geeignete DNA-Sequenz kann in den Vektor über eine Vielzahl von Verfahren eingebaut werden. Im Allgemeinen wird die DNA in (eine) geeignete Restriktionsendonuclease-Schnittstelle(n) durch Verfahren eingebaut, die im Fachgebiet bekannt sind. Solche Verfahren und andere gelten als im Rahmen der Kenntnisse der Fachleute befindlich.
Die DNA-Sequenz in dem Expressionsvektor ist funktionell mit (einer) geeigneten Expressions-Kontrollsequenz(en) (Promotor) verknüpft, um die mRNA-Synthese zu steuern. Als repräsentative Beispiele für solche Promotoren können erwähnt werden: LTR oder der SV40-Promotor, der lac- oder der trp-Promotor aus E. coli, der P_L-Promotor des Phagen Lambda und andere Promotoren, von denen bekannt ist, dass sie die Expression von Genen in prokaryontischen oder in eukaryontischen Zellen oder ihrer Viren steuern. Der Expressionsvektor enthält auch eine Ribosomen-Bindestelle zur Initiation der Translation und einen Transkriptions-Terminator. Der Vektor kann ebenfalls geeignete Sequenzen zur Amplifikation der Expression umfassen.
Darüber hinaus enthalten die Expressionsvektoren bevorzugt ein oder mehrere selektierbare Markergene, um ein phänotypisches Merkmal zur Selektion der transformierten Wirtszellen bereitzustellen, wie z. B. die Dihydrofolat-Reduktase oder die Neomycin-Resistenz für die eukaryontische Zellkultur oder wie z. B. die Tetracyclin- oder die Ampicillin-Resistenz für E. coli.
Der Vektor, der die geeignete DNA-Sequenz enthält, wie sie hierin vorstehend beschrieben wurde, sowie ein geeigneter Promotor oder eine Kontrollsequenz können dazu verwendet werden, einen geeigneten Wirt zu transformieren, um dem Wirt zu erlauben, das Protein zu exprimieren.
Als repräsentative Beispiele geeigneter Wirte können genannt werden: Bakterienzellen wie z. B. E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; Pilzzellen wie z. B. Hefe; Insektenzellen wie z. B. Drosophila S2 und Spodoptera Sf9; Tierzellen wie z. B. CHO, COS oder Bowes-Melanom; Pflanzenzellen usw. Die Selektion eines geeigneten Wirts gilt aus den hierin angeführten Lehren als im Rahmen der Kenntnisse der Fachleute befindlich.
Noch spezifischer umfasst die vorliegende Erfindung ebenfalls rekombinante Konstrukte, die eine oder mehrere der Sequenzen enthalten, die vorstehend ausführlich beschrieben wurden. Die Konstrukte umfassen einen Vektor wie z. B. ein Plasmid oder einen viralen Vektor, in den eine Sequenz der Erfindung in Vorwärts- oder in reverser Orientierung inseriert wurde. In einem bevorzugten Aspekt dieser Ausführungsform umfasst das Konstrukt zusätzlich regulatorische Sequenzen, umfassend zum Beispiel einen Promotor, der mit der Sequenz operativ verknüpft ist. Den Fachleuten sind große Zahlen an geeigneten Vektoren und Promotoren bekannt, und diese sind kommerziell erhältlich. Die folgenden Vektoren werden als Beispiele angeführt: bakterielle: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBS, pD10, Phagescript, PsiX174, pBluescript SK, pBSKS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene); pTRC99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia); eukaryontische: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene); pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). Es kann jedoch jedes andere Plasmid oder jeder andere Vektor verwendet werden, so lange diese im Wirt replikations- und überlebensfähig sind.
Die Promotorregionen können aus jedem gewünschten Gen unter Verwendung von CAT-(Chloramphenicol-Transferase) Vektoren oder aus anderen Vektoren mit selektierbaren Markern selektiert werden. Zwei geeignete Vektoren sind pKK232-8 und pCM7. Besonders benannte bakterielle Promotoren umfassen lacI, lacZ, T3, T7, gpt, Lambda-P_R, -P_L und trp. Eukaryontische Promotoren umfassen den sehr frühen CMV-Promotor, den HSV-Thymidinkinase-Promotor, den frühen und den späten SV40-Promotor, LTRs aus Retroviren und den Metallothionin-I-Promotor aus der Maus. Die Auswahl des geeigneten Vektors und Promotors ist den Fachleuten bekannt.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegenden Erfindung Wirtszellen, die die vorstehend beschriebenen Konstrukte enthalten. Bei der Wirtszelle kann es sich um eine höhere eukaryontische Zelle wie z. B. um eine Säugerzelle, oder um eine niedere eukaryontische Zelle wie z. B. um eine Hefezelle handeln, oder die Wirtszelle kann eine prokaryontische Zelle sein wie z. B. eine Bakterienzelle. Die Einbringung des Konstrukts in die Wirtszelle kann durch Calciumphosphat-Transfektion, durch DEAE-Dextran vermittelte Transfektion oder durch Elektroporation erfolgen (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)).
Die Konstrukte in den Wirtszellen können in der herkömmlichen Weise verwendet werden, um das Genprodukt herzustellen, das durch die rekombinante Sequenz codiert wird. Alternativ können die Polypeptide der Erfindung durch Synthese mit den üblichen Peptid-Synthesegeräten hergestellt werden.
Die reifen Proteine können in Säugerzellen, Hefe-, Bakterien- oder in anderen Zellen unter der Kontrolle der geeigneten Promotoren exprimiert werden. Es können ebenfalls zellfreie Translationssysteme verwendet werden, um solche Proteine unter Verwendung der RNAs herzustellen, die aus den DNA-Konstrukten der vorliegenden Erfindung abgeleitet wurden. Geeignete Clonierungs- und Expressionsvektoren zur Verwendung bei prokaryontischen und eukaryontischen Wirten werden durch Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) beschrieben, dessen Offenlegung hierin durch die Bezugnahme eingeschlossen ist.
Die Transkription der DNA, die die Polypeptide der vorliegenden Erfindung codiert, durch höhere Eukaryonten wird durch die Insertion einer Enhancer-Sequenz in den Vektor gesteigert. Enhancer sind in cis wirkende DNA-Elemente von gewöhnlich etwa 10 bis 300 Bp Länge, die auf einen Promotor wirken, um seine Transkription zu steigern. Beispiele umfassen den SV40-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs von den Bp 100 bis 270, den Enhancer des frühen Promotors des Cytomegalievirus, den Polyoma-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs und Adenovirus-Enhancer.
Im Allgemeinen werden die rekombinanten Expressionsvektoren Replikationsursprünge und selektierbare Marker enthalten, die die Transformation in der Wirtszelle erlauben, wie z. B. das Ampicillin-Resistenzgen aus E. coli und das TRP1-Gen aus S. cerevisiae, und einen Promotor, der von einem stark exprimierten Gen stammt, um die Transkription der stromabwärts gelegenen Struktursequenz zu steuern. Solche Promotoren können aus Operons abgeleitet werden, die unter anderem glycolytische Enzyme wie z. B. die 3-Phosphoglycerat-Kinase (PGK), den α-Faktor, die saure Phosphatase oder Hitzeschockproteine codieren. Die heterologe Struktursequenz wird in der geeigneten Phase mit Translations-Initiations- und -Terminations-Sequenzen und bevorzugt mit einer Leadersequenz zusammengefügt, die in der Lage ist, die Sekretion des translatierten Proteins in den periplasmatischen Raum oder in das extrazelluläre Medium zu steuern. Die heterologe Sequenz kann gegebenenfalls ein Fusionsprotein codieren, einschließlich eines N-terminalen Identifizierungs-Peptids, das die gewünschten Eigenschaften verleiht, wie z. B. die Stabilisierung oder die vereinfachte Reinigung des exprimierten rekombinanten Produkts.
Geeignete Expressionsvektoren zur Verwendung in Bakterien werden durch den Einbau einer Struktur-DNA-Sequenz, die ein gewünschtes Protein codiert, zusammen mit geeigneten Translations-Initiations- und Terminations-Signalen in funktionsfähigem Leseraster zu einem funktionellen Promotor konstruiert. Der Vektor umfasst einen oder mehrere phänotypisch selektierbare Marker und einen Replikationsursprung, um den Erhalt des Vektors zu sichern und, wenn gewünscht, die Amplifikation innerhalb des Wirts bereitzustellen. Geeignete prokaryontische Wirte zur Transformation umfassen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und verschiedene Arten aus den Gattungen Pseudomonas, Streptomyces und Straphylococcus, obwohl je nach Wahl auch andere verwendet werden können.
Als repräsentatives, aber nicht einschränkendes Beispiel können geeignete Expressionsvektoren zur Verwendung in Bakterien einen selektierbaren Marker und einen bakteriellen Replikationsursprung enthalten, die aus kommerziell erhältlichen Plasmiden stammen, welche genetische Elemente des wohlbekannten Clonierungsvektors pBR322 (ATCC 37017) umfassen. Solche kommerziellen Vektoren umfassen zum Beispiel pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA). Diese Abschnitte aus dem pBR322-„Rückgrat" werden mit einem geeigneten Promotor und der Struktursequenz, die exprimiert werden soll, kombiniert.
Nach der Transformation eines geeigneten Wirtsstammes und der Anzucht des Wirtsstammes bis zu einer geeigneten Zelldichte wird der ausgewählte Promotor durch geeignete Mittel (z. B. Temperaturerhöhung oder chemische Induktion) induziert, und die Zellen werden für einen weiteren Zeitraum kultiviert.
Die Zellen werden typischerweise durch Zentrifugation geerntet, durch physikalische oder durch chemische Mittel aufgebrochen, und der so erhaltene Rohextrakt wird für die weitere Reinigung zurück behalten.
Mikrobenzellen, die zur Expression von Proteinen verwendet werden, können durch jedes beliebige Verfahren aufgebrochen werden, einschließlich Einfrier-Auftau-Zyklen, Behandlung mit Ultraschall, mechanisches Aufbrechen oder Verwendung von Zellen lysierenden Mitteln; solche Verfahren sind den Fachleuten wohlbekannt.
Es können ebenfalls verschiedene Säuger-Zellkultur-Systeme verwendet werden, um das rekombinante Protein zu exprimieren. Beispiele für Säuger-Expressionssysteme umfassen die COS-7-Linie der Affennieren-Fibroblasten, die durch Gluzman, Cell 23:175 (1981) beschrieben wurde, und andere Zelllinien, die in der Lage sind, einen kompatiblen Vektor zu exprimieren, wie z. B. die C127-, 3T3-, CHO-, HeLa- und die BHK-Zelllinien. Säuger-Expressionsvektoren umfassen einen Replikationsursprung, einen geeigneten Promotor und Enhancer und ebenso alle notwendigen Ribosomen-Bindestellen, Polyadenylierungsstellen, Spleiß-Donor- und -Akzeptorstellen, Transkriptions-Terminations-Sequenzen und flankierende, nicht transkribierte 5'-Sequenzen. DNA-Sequenzen, die aus den SV40-Spleiß- und Polyadenylierungsstellen stammen, können dazu verwendet werden, die erforderlichen, nicht transkribierten genetischen Elemente bereitzustellen.
Das Polypeptid kann aus rekombinanten Zellkulturen gewonnen und gereinigt werden, und zwar durch Verfahren, umfassend Ammoniumsulfat- oder Ethanolfällung, Säureextraktion, Anionen- oder Kationen-Austauschchromatographie, Phosphocellulose-Chromatographie, hydrophobe Wechselwirkungs-Chromatographie, Affinitäts-Chromatographie, Hydroxylapatit-Chromatographie und Lectin-Chromatographie. Wenn nötig, können Schritte zur Protein-Rückfaltung durchgeführt werden, um die Konfiguration des reifen Proteins zu vervollständigen. Abschließend kann die Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) für die letzten Reinigungsschritte angewendet werden.
Bei den Polypeptiden der vorliegenden Erfindung kann es sich um ein natürliches gereinigtes Produkt handeln oder um ein Produkt eines chemischen Syntheseverfahrens, oder sie können durch rekombinante Verfahren aus einem prokaryontischen oder einem eukaryontischen Wirt (zum Beispiel durch Bakterien-, Hefe-, höhere Pflanzen-, Insekten- und Säugerzellen in Kultur) hergestellt werden. In Abhängigkeit von dem bei einem rekombinanten Herstellungsverfahren verwendeten Wirt können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung glycosyliert oder nicht glycosyliert vorliegen. Die Polypeptide der Erfindung können auch einen Initiations-Methionin-Aminosäurerest enthalten.
OAP kann als antivirales Mittel verwendet werden. Noch spezifischer kann OAP dazu verwendet werden, nekrotisierende Pankreatitis und Parotitis zu behandeln, die durch einige Mitglieder der Picorna-Virenfamilie verursacht werden. Wie man in Beispiel 4 und in 4 sieht, besitzt OAP eine antivirale Wirkung.
Die Polynucleotide und die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können auch als Reagenzien und Materialien zur Forschung für die Entdeckung von Behandlungsmöglichkeiten und als Diagnostika für menschliche Krankheiten verwendet werden.
Ein anderer potentieller Antagonist gemäß Anspruch 13 ist ein Antisense-Konstrukt, das unter Verwendung der Antisense-Technologie hergestellt wurde. Die Antisense-Technologie kann verwendet werden, um die Genexpression durch Bildung einer Dreifach-Helix oder von Antisense-DNA oder -RNA zu kontrollieren; beide Verfahren basieren auf der Bindung eines Polynucleotids an die DNA oder an die RNA. Zum Beispiel wird der codierende 5'-Anteil der Polynucleotidsequenz, der das reife Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, verwendet, um ein Antisense-RNA-Oligonucleotid von etwa 10 bis 40 Basenpaaren Länge zu entwerten. Ein DNA-Oligonucleotid wird so entworfen, dass es mit einer Region des Gens komplementär ist, die an der Transkription beteiligt ist (Dreifach-Helix – vergleiche mit Lee et al., Nucl. Acids Res. 6:3073 (1979); Cooney et al., Science 241:456 (1988) und Dervan et al., Science 251:1360 (1991)), wodurch die Transkription und die Produktion des OAP verhindert wird. Das Antisense-RNA-Oligonucleotid hybridisiert mit der mRNA in vivo und blockiert die Translation des mRNA-Moleküls in das OAP-Polypeptid (Antisense-Okano, J., Neurochem. 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)). Die vorstehend beschriebenen Oligonucleotide können auch in die Zellen eingebracht werden, so dass die Antisense-RNA oder -DNA in vivo exprimiert werden kann, um die Produktion von OAP zu hemmen.
Die Antagonisten können in einer Zusammensetzung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger gemäß Anspruch 14 angewendet werden, z. B. wie hierin nachstehend beschrieben wird.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung und die Agonisten und Antagonisten können in Kombination mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger angewendet werden. Solche Zusammensetzungen umfassen eine therapeutisch wirksame Menge des Polypeptids, des Agonisten oder des Antagonisten und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Excipienten. Solche Träger umfassen Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, Dextrose, Wasser, Glycerin, Ethanol und Kombinationen davon, sind aber nicht auf diese beschränkt. Die Formulierung sollte dem Weg der Verabreichung angemessen sein.
Die Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Packung oder ein Kit bereit, die/der einen oder mehrere Behälter umfasst, welche mit einem oder mit mehreren Bestandteilen der Arzneimittel der Erfindung gefüllt sind. Mit (einem) solchen Behälter(n) kann ein Informationsblatt verbunden sein, und zwar in der Form, wie sie durch eine Regierungsbehörde vorgeschrieben wird, die die Herstellung, die Verwendung oder den Verkauf von Arzneimitteln oder biologischen Produkten reguliert, wobei das Informationsblatt die Bewilligung der Behörde zur Herstellung, Verwendung oder zum Verkauf für die Verabreichung an Menschen widerspiegelt. Darüber hinaus können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung oder die Agonisten oder die Antagonisten in Verbindung mit anderen therapeutischen Verbindungen angewendet werden.
Die Arzneimittel können in zweckmäßiger Weise verabreicht werden, wie z. B. auf oralen, örtlichen, parenteralen, intravenösen, intraperitonealen, intramuskulären, subcutanen, intranasalen oder intradermalen Wegen. Die Arzneimittel werden in einer Menge verabreicht, die zur Behandlung und/oder zur Vorbeugung der spezifischen Indikation wirksam ist. Im Allgemeinen werden sie in einer Menge von mindestens etwa 10 μg/kg Körpergewicht verabreicht, und in den meisten Fällen werden sie in einer Menge verabreicht, die etwa 8 mg/kg Körpergewicht pro Tag nicht überschreitet. In den meisten Fällen reicht die Dosierung von etwa 10 μg/kg bis zu etwa 1 mg/kg Körpergewicht täglich, und zwar unter Berücksichtigung des Weges der Verabreichung, der Symptome usw.
Die OAP-Polypeptide und die Agonisten und die Antagonisten, bei denen es sich um Polypeptide handelt, können gemäß den Ansprüchen 15–18 ebenfalls durch die Expression solcher Polypeptide in vivo angewendet werden, was oft als „Gentherapie" bezeichnet wird.
Daher können zum Beispiel die Zellen eines Patienten mit einem Polynucleotid (DNA oder RNA), das ein Polypeptid codiert, ex vivo verändert werden, wobei die veränderten Zellen anschließend einem Patienten bereit gestellt werden, der mit dem Polypeptid behandelt werden soll. Solche Verfahren sind im Fachgebiet wohlbekannt und werden aus den hierin angeführten Lehren deutlich. Zum Beispiel können die Zellen durch die Verwendung eines retroviralen Plasmidvektors verändert werden, der eine RNA enthält, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert.
In ähnlicher Weise können Zellen in vivo zur Expression eines Polypeptids in vivo verändert werden, wie zum Beispiel durch im Fachgebiet bekannte Verfahren. Zum Beispiel wird eine Verpackungszelle mit einem retroviralen Plasmidvektor transduziert, der eine RNA enthält, welche ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, so dass die Verpackungszelle nun infektiöse Viruspartikel produziert, die das Gen von Interesse enthalten. Diese Produzentenzellen können einem Patienten zur Veränderung der Zellen in vivo und zur Expression des Polypeptids in vivo verabreicht werden. Diese und andere Verfahren zur Verabreichung eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung durch ein solches Verfahren sollten den Fachleuten aus den Lehren der vorliegenden Erfindung offenbar sein.
Retroviren, aus denen die retroviralen Plasmidvektoren, die hierin vorstehend erwähnt wurden, abgeleitet werden können, umfassen das Moloney-Maus-Leukämie-Virus, das Milznekrose-Virus, Retroviren wie z. B. das Rous-Sarkom-Virus, das Harvey-Sarkom-Virus, das Geflügel-Leukose-Virus, das Gibbonaffen-Leukämie-Virus, das menschliche Immunschwäche-Virus, das Adenovirus, das myeloproliferative Sarkom-Virus und den Mammakarzinomtumorvirus, sind aber nicht auf diese beschränkt. In einer Ausführungsform wird der retrovirale Plasmidvektor aus dem Moloney-Maus-Leukämie-Virus abgeleitet.
Der Vektor umfasst einen oder mehrere Promotoren. Geeignete Promotoren, die verwendet werden können, umfassen die retroviralen LTRs; den SV40-Promotor und den menschlichen Cytomegalievirus (CMV)-Promotor, der in Miller et al., Biotechniques, Bd. 7, Nr. 9, 980–990 (1989) beschrieben wurde, oder jeden beliebigen anderen Promotor (z. B. zelluläre Promotoren wie z. B. eukaryontische zelluläre Promotoren einschließlich, aber nicht beschränkt auf, den Histon-, den Pol III- und den β-Aktin-Promotor), sind aber nicht auf diese beschränkt. Andere virale Promotoren, die verwendet werden können, umfassen Adenovirus-Promotoren, Thymidinkinase (TK)-Promotoren und B19-Parvovirus-Promotoren, sind aber nicht auf diese beschränkt. Die Auswahl eines geeigneten Promotors wird den Fachleuten aus den hierin enthaltenen Lehren offenbar sein.
Die Nucleinsäuresequenz, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, steht unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors. Geeignete Promotoren, die verwendet werden können, sind Adenovirus-Promotoren wie z. B. der adenovirale späte Hauptpromotor oder heterologe Promotoren wie z. B. der Cytomegalievirus (CMV)-Promotor; der respiratorische Syncytial-Virus (RSV)-Promotor; induzierbare Promotoren wie z. B. der MMT-Promotor, der Metallothionin-Promotor; Hitzeschock-Promotoren; der Albumin-Promotor; der ApoAl-Promotor; menschliche Globin-Promotoren; virale Thymidinkinase-Promotoren wie z. B. der Herpes-Simplex-Thymidinkinase-Promotor; retrovirale LTRs (einschließlich der hierin vorstehend beschriebenen modifizierten retroviralen LTRs); der β-Aktin-Promotor und menschliche Wachstumshormon-Promotoren, sind aber nicht auf diese beschränkt. Bei dem Promotor kann es sich auch um den nativen Promotor handeln, der das Gen steuert, welches das Polypeptid codiert.
Der retrovirale Plasmidvektor wird dazu verwendet, Verpackungs-Zelllinien zu transduzieren, um Produzenten-Zelllinien herzustellen. Beispiele für Verpackungszellen, die transfiziert werden können, umfassen die PE501-, PA317-, ψ-2-, ψ-AM-, PA12-, T19-14X-, VT-19-17-H2-, ψCRE-, ψCRIP-, GP+E-86-, GP+envAm12- und DAN-Zelllinien, wie sie in Miller, Human Gene Therapy, Bd. 1, S. 5–14 (1990) beschrieben werden, das hierin vollständig durch Bezugnahme eingeschlossen ist, sind aber nicht auf diese beschränkt. Der Vektor kann die Verpackungszellen durch beliebige im Fachgebiet bekannte Mittel transduzieren. Solche Mittel umfassen die Elektroporation, die Verwendung von Liposomen und die CaPO₄-Präzipitation, sind aber nicht auf diese beschränkt. Bei einer Alternative kann der retrovirale Plasmidvektor in ein Liposom eingekapselt sein oder an ein Lipid gekoppelt sein und wird dann einem Wirt verabreicht.
Die Produzenten-Zelllinie erzeugt infektiöse retrovirale Vektorpartikel, die die Nucleinsäuresequenz(en) enthalten, die die Polypeptide codieren. Solche retroviralen Vektorpartikel können dann verwendet werden, um eukaryontische Zellen entweder in vitro oder in vivo zu transduzieren. Die transduzierten eukaryontischen Zellen werden die Nucleinsäuresequenz(en) exprimieren, die das Polypeptid codieren. Eukaryontische Zellen, die transduziert werden können, umfassen embryonale Stammzellen, embryonale Karzinomzellen sowie hämatopoietische Stammzellen, Leberzellen, Fibroblasten, Myoblasten, Keratinocyten, Endothelzellen und bronchiale Epithelzellen, sind aber nicht auf diese beschränkt.
Diese Erfindung betrifft auch die Verwendung des Gens der vorliegenden Erfindung als ein diagnostisches Mittel. Der Nachweis einer mutierten Form des Gens wird die Diagnose einer Krankheit oder einer Empfänglichkeit für eine Krankheit erlauben, die aus einer zu geringen Expression des OAP resultiert.
Individuen, die Mutationen in dem Gen der vorliegenden Erfindung tragen, können auf DNA-Ebene durch eine Vielzahl von Verfahren entdeckt werden. Die Nucleinsäuren zur Diagnose können aus den Zellen eines Patienten erhalten werden, einschließlich Blut, Urin, Speichel, Gewebebiopsie- und Autopsie-Material, sind aber nicht auf diese beschränkt. Die genomische DNA kann direkt zum Nachweis verwendet werden, oder sie kann enzymatisch unter Verwendung der PCR (Saiki et al., Nature 324:163–166 (1986)) vor der Analyse amplifiziert werden. RNA oder cDNA kann für den gleichen Zweck ebenfalls verwendet werden. Als Beispiel können PCR-Primer, die zur der Nucleinsäure, die OAP codiert, komplementär sind, dazu verwendet werden, Mutationen zu identifizieren und zu analysieren. Zum Beispiel können Deletionen und Insertionen durch eine Veränderung der Größe des amplifizierten Produkts im Vergleich zu dem normalen Genotyp nachgewiesen werden. Punktmutationen können durch Hybridisierung der amplifizierten DNA mit radioaktiv markierter RNA oder alternativ mit radioaktiv markierten Antisense-DNA-Sequenzen identifiziert werden. Vollständig gepaarte Sequenzen können von falsch gepaarten Duplexmolekülen durch Verdau mit RNase A oder durch Unterschiede in den Schmelztemperaturen unterschieden werden.
Sequenzunterschiede zwischen dem Referenz-Gen und den Genen, die Mutationen aufweisen, können durch das direkte DNA-Sequenzierungsverfahren enthüllt werden. Darüber hinaus können clonierte DNA-Segmente als Sonden verwendet werden, um spezifische DNA-Segmente nachzuweisen. Die Empfindlichkeit dieses Verfahrens wird stark erhöht, wenn es mit einer PCR kombiniert wird. Zum Beispiel wird ein Sequenzierungs-Primer zusammen mit einem doppelsträngigen PCR-Produkt oder mit einem einzelsträngigen Matrizen-Molekül verwendet, das durch eine modifizierte PCR erzeugt wurde. Die Bestimmung der Sequenz wird durch herkömmliche Verfahren mit radioaktiv markierten Nucleotiden oder durch automatische Sequenzierungsverfahren mit Fluoreszenz-Markierungen durchgeführt.
Genetische Untersuchungen, die auf Unterschieden in der DNA-Sequenz basieren, können durch den Nachweis einer Veränderung der elektrophoretischen Mobilität der DNA-Fragmente in Gelen mit oder ohne denaturierenden Agenzien durchgeführt werden. Kleine Sequenzdeletionen und -insertionen können durch hochauflösende Gelelektrophorese sichtbar gemacht werden. DNA-Fragmente mit unterschiedlichen Sequenzen können in denaturierenden Formamid-Gradienten- Gelen unterschieden werden, in denen die Beweglichkeiten der unterschiedlichen DNA-Fragmente in dem Gel an unterschiedlichen Positionen entsprechend ihrer spezifischen Schmelz- oder teilweisen Schmelztemperaturen verzögert sind (vergleiche z. B. mit Myers et al., Science 230:1242 (1985)).
Sequenzveränderungen an spezifischen Stellen können auch durch Nuclease-Schutz-Testansätze enthüllt werden, wie z. B. durch RNase- und S1-Schutz, oder durch das chemische Spaltungsverfahren (z. B. Cotton et al., PNAS, USA 85:4397–4401 (1985)).
Somit kann der Nachweis einer spezifischen DNA-Sequenz durch Verfahren wie z. B. der Hybridisierung, dem RNase-Schutz, der chemischen Spaltung, der direkten DNA-Sequenzierung oder der Verwendung von Restriktionsenzymen (z. B. Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus (RFLP)) und dem Southern-Blot genomischer DNA erreicht werden.
Neben der eher herkömmlichen Gelelektrophorese und der DNA-Sequenzierung können Mutationen ebenfalls durch in situ-Analyse nachgewiesen werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen diagnostischen Prozess gemäß Anspruch 18 zum Nachweis veränderter Spiegel des Polypeptids der vorliegenden Erfindung in verschiedenen Geweben, da eine Überexpression der Proteine im Vergleich zu normalen Kontrollgewebeproben die Anwesenheit von Knochenerkrankungen wie z. B. der Osteoporose nachweisen kann. Testansätze, die verwendet werden können, um das Polypeptid der vorliegenden Erfindung in einer Probe nachzuweisen, die aus einem Wirt stammt, sind den Fachleuten wohlbekannt und umfassen Radioimmun-Testansätze, kompetitive Bindungs-Testansätze, die Western-Blot-Analyse und bevorzugt den ELISA-Testansatz. Ein ELISA-Testansatz umfasst zuerst die Herstellung eines Antikörpers, der für das OAP-Antigen spezifisch ist, bevorzugt eines monoclonalen Antikörpers. Zusätzlich wird ein Reporter-Antikörper gegen den monoclonalen Antikörper hergestellt. Mit dem Reporter-Antikörper wird ein nachweisbares Reagenz wie z. B. eine radioaktive Substanz, eine fluoreszierende Substanz oder in diesem Beispiel das Enzym Meerrettich-Peroxidase verknüpft. Nun wird dem Wirt eine Probe entnommen und auf einem festen Träger inkubiert, wie z. B. einer Polystyrol-Schale, die die Proteine in der Probe bindet. Alle freien Proteinbindestellen in der Schale werden dann durch Inkubation mit einem unspezifischen Protein wie z. B. Rinderserumalbumin abgedeckt. Als Nächstes wird der monoclonale Antikörper in der Schale inkubiert, während dieses Zeitraums heften sich die monoclonalen Antikörper an alle Polypeptide der vorliegenden Erfindung an, die an der Polystyrol-Schale angeheftet sind. Alle ungebundenen monoclonalen Antikörper werden mit Puffer ausgewaschen. Nun wird der Reporter-Antikörper, der mit Meerrettich-Peroxidase verbunden ist, in die Schale gegeben, was zur Bindung des Reporter-Antikörpers an alle monoclonalen Antikörper führt, die an das Polypeptid der vorliegenden Erfindung gebunden sind. Dann werden nicht angeheftete Reporter-Antikörper ausgewaschen. Anschließend werden Peroxidase-Substrate der Schale zugegeben, und die Menge der Farbe, die sich in einem bestimmten Zeitraum entwickelt, stellt ein Maß für die Menge des Polypeptids der vorliegenden Erfindung dar, die in einem bestimmten Volumen einer Patientenprobe vorliegt, wenn sie mit einer Standard-Kurve verglichen wird.
Es kann ein Kompetitions-Testansatz verwendet werden, in dem die Antikörper, die für das Polypeptid der vorliegenden Erfindung spezifisch sind, an einen festen Träger angeheftet werden, und markiertes OAP und eine Probe, die aus dem Wirt stammt, werden über den festen Träger geleitet, und die Menge der nachgewiesenen Markierung, die an den festen Träger angeheftet ist, kann mit der Menge des Polypeptids der vorliegenden Erfindung in der Probe korreliert werden.
Die Sequenzen der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls zur Identifizierung von Chromosomen wertvoll. Die Sequenz ist gegen eine bestimmte Stelle auf einem individuellen menschlichen Chromosom gerichtet und kann mit dieser hybridisieren. Darüber hinaus besteht ein laufender Bedarf an der Identifizierung bestimmter Stellen auf den Chromosomen. Derzeit sind nur wenige Markierungsreagenzien, die auf den tatsächlichen Sequenzdaten basieren (Wiederholungssequenz-Polymorphismen), zur Markierung chromosomaler Orte verfügbar. Die Kartierung von DNAs auf Chromosomen gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein wichtiger erster Schritt bei der Korrelation dieser Sequenzen mit Genen, die mit Krankheiten assoziiert sind.
Kurzgefasst können Sequenzen auf Chromosomen durch die Herstellung von PCR-Primern (bevorzugt 15–25 Bp) aus der cDNA kartiert werden. Eine Computeranalyse der nicht translatierten 3'-Region des Gens wird verwendet, um rasch Primer auszuwählen, die nicht mehr als ein Exon in der genomischen DNA überspannen, was dem Amplifikationsvorgang komplizieren würde. Diese Primer werden dann zur PCR-Durchmusterung somatischer Zellhybride verwendet, die individuelle menschliche Chromosomen enthalten. Nur diejenigen Hybride, die das menschliche Gen enthalten, das den Primern entspricht, werden ein amplifiziertes Fragment liefern.
Die PCR-Kartierung somatischer Zellhybride ist ein schnelles Verfahren für die Zuordnung einer bestimmten DNA zu einem bestimmten Chromosom. Unter Anwendung der vorliegenden Erfindung mit den gleichen Oligonucleotid-Primern kann eine Sublokalisierung mit Reihen von Fragmenten spezifischer Chromosomen oder Sammlungen großer genomischer Clone in analoger Weise erreicht werden. Andere Kartierungsstrategien, die in ähnlicher Weise verwendet werden können, um ein Chromosom zu kartieren, umfassen die in situ-Hybridisierung, die Vordurchmusterung mit markierten und durch durchfluß-sortierten Chromosomen und die Vorauswahl durch Hybridisierung, um Chromsomen-spezifische cDNA-Genbanken zur konstruieren.
Die Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) eines cDNA-Clons mit einer Metaphase-Chromosomen-Spreizung kann dazu verwendet werden, einen präzisen chromosomalen Ort in einem Schritt zu lokalisieren. Dieses Verfahren kann mit einer cDNA verwendet werden, die nur 50 oder 60 Basen lang ist. Für eine Übersicht über dieses Verfahren vergleiche mit Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988).
Das OAP-Gen der vorliegenden Erfindung wurde auf dem menschlichen Chromosom 1q21 kartiert. Nachdem eine Sequenz erst einmal an einem präzisen chromosomalen Ort kartiert ist, kann die physikalische Position der Sequenz auf dem Chromosom mit genetischen Kartendaten korreliert werden. Solche Daten finden sich zum Beispiel in V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (online erhältlich durch die John Hopkins-Universität, Welch Medical Library). Die Beziehung zwischen Genen und Krankheiten, die in der gleichen chromosomalen Region kartiert wurden, wird dann durch Kopplungsanalyse (gemeinsame Vererbung physikalisch benachbarter Gene) identifiziert.
Als Nächstes ist es nötig, die Unterschiede in der cDNA oder in der genomischen Sequenz zwischen betroffenen und nicht betroffenen Individuen zu bestimmen. Wenn eine Mutation in einigen oder in allen betroffenen Individuen, aber nicht in irgendwelchen normalen Individuen beobachtet wird, dann stellt die Mutation wahrscheinlich die Ursache der Krankheit dar.
Bei der derzeitigen Auflösung der physikalischen Kartierungs- und der genetischen Kartierungs-Verfahren kann eine cDNA, die in einer chromosomalen Region präzise lokalisiert wurde, welche mit der Krankheit assoziiert ist, eines von 50 bis 500 möglichen verursachenden Genen sein. (Dies setzt eine Auflösung der Kartierung von 1 Megabase und ein e Gen pro 20 kB voraus).
Die Polypeptide, ihre Fragmente oder andere Derivate oder Analoga davon oder Zellen, die sie exprimieren, können als Immunogen verwendet werden, um Antikörper herzustellen gemäß Anspruch 11. Diese Antikörper können zum Beispiel polyclonale oder monoclonale Antikörper sein. Die vorliegende Erfindung umfasst auch chimäre, Einzelketten- und humanisierte Antikörper sowie Fab-Fragmente oder das Produkt einer Fab-Expressions-Bank. Zur Herstellung solcher Antikörper und Fragmente können verschiedene Verfahren angewendet werden, die im Fachgebiet bekannt sind.
Antikörper, die gegen die Polypeptide erzeugt wurden, die einer Sequenz der vorliegenden Erfindung entsprechen, können durch direkte Injektion der Polypeptide in ein Tier oder durch die Verabreichung der Polypeptide an ein Tier erhalten werden, bevorzugt handelt es sich nicht um Menschen. Der so erhaltene Antikörper wird dann an das Polypeptid selbst binden. Auf diese Weise kann sogar eine Sequenz, die nur ein Fragment der Polypeptide codiert, verwendet werden, um Antikörper herzustellen, die an die vollständigen nativen Polypeptide binden. Solche Antikörper können dann dazu verwendet werden, das Polypeptid aus dem Gewebe zu isolieren, welches das Polypeptid exprimiert.
Zur Herstellung monoclonaler Antikörper kann jedes beliebige Verfahren verwendet werden, das Antikörper liefert, die durch kontinuierliche Kultur von Zelllinien produziert werden. Beispiele umfassen das Hybridom-Verfahren (Köhler und Milstein, 1975, Nature 256:495–497), das Triom-Verfahren, das menschliche B-Zellen-Hybridom-Verfahren (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72) und das EBV-Hybridom-Verfahren, um menschliche monoclonale Antikörper herzustellen (Cole et al., 1985, in: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. S. 77–96).
Verfahren, die zur Herstellung von Einzelketten-Antikörpern beschrieben wurden (US-Patent 4,946,778), können angepasst werden, um Einzelketten-Antikörper gegen immunogene Polypeptidprodukte dieser Erfindung herzustellen. Es können ebenfalls transgene Mäuse verwendet werden, um humanisierte Antikörper gegen immunogene Polypeptidprodukte dieser Erfindung zu exprimieren.
Die vorliegende Erfindung wird nun weiter mit Bezugnahme auf die nachfolgenden Beispiele beschrieben; dies sollte jedoch so verstanden werden, dass die vorliegende Erfindung nicht auf solche Beispiele beschränkt ist. Alle Teile oder Mengen sind auf das Gewicht bezogen, sofern nicht anders angegeben.
Um das Verständnis der folgenden Beispiele zu erleichtern, werden bestimmte, häufig auftretende Verfahren und/oder Begriffe beschrieben.
„Plasmide" werden durch ein kleines p bezeichnet, dem Großbuchstaben und/oder Zahlen voran stehen oder folgen. Die Ausgangsplasmide hierin sind entweder kommerziell erhältlich, uneingeschränkt öffentlich erhältlich oder können aus erhältlichen Plasmiden gemäß veröffentlichten Verfahren konstruiert werden. Darüber hinaus sind Plasmide, die den beschriebenen äquivalent sind, im Fachgebiet bekannt und den Fachleuten offenbar.
„Verdau" der DNA bezieht sich auf die katalytische Spaltung der DNA mit einem Restriktionsenzym, das nur an bestimmten Sequenzen in der DNA wirkt. Die hierin verwendeten verschiedenen Restriktionsenzyme sind kommerziell erhältlich und ihre Reaktionsbedingungen, Kofaktoren und andere Erfordernisse wurden so verwendet, wie sie den Fachleuten bekannt sind. Für analytische Zwecke wird typischerweise 1 μg Plasmid oder DNA-Fragment zusammen mit etwa 2 Einheiten des Enzyms in etwa 20 μl Pufferlösung verwendet. Zum Zweck der Isolierung von DNA-Fragmenten zur Konstruktion von Plasmiden werden typischerweise 5 bis 50 μg DNA mit 20 bis 250 Einheiten Enzym in einem größeren Volumen verdaut. Geeignete Puffer- und Substratmengen für bestimmte Restriktionsenzyme sind durch den Hersteller spezifiziert. Üblicherweise werden Inkubationszeiten von etwa 1 Stunde bei 37 °C verwendet, aber diese können entsprechend den Angaben des Lieferanten variieren. Nach dem Verdau wird das Reaktionsgemisch direkt auf einem Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt, um das gewünschte Fragment zu isolieren.
Die Größentrennung der gespaltenen Fragmente wird unter Verwendung eines 8-prozentigen Polyacrylamidgels durchgeführt, wie durch Goeddel, D. et al., Nucleic Acids Res. 8:4057 (1980) beschrieben.
„Oligonucleotide" bezieht sich entweder auf ein einzelsträngiges Polydesoxynucleotid oder auf zwei komplementäre Polydesoxynucleotidstränge, die chemisch synthetisiert werden können. Solche synthetischen Oligonucleotide besitzen kein 5'-Phosphat und werden daher nicht mit einem anderen Oligonucleotid ohne die Zugabe eines Phosphatrestes mit einem ATP in Gegenwart einer Kinase ligieren. Ein synthetisches Oligonucleotid wird mit einem Fragment ligieren, das nicht dephosphoryliert wurde.
„Ligierung" bezieht sich auf den Vorgang der Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen zwei doppelsträngigen Nucleinsäurefragmenten (Maniatis, T. et al., Ibid., S. 146). Wenn nicht auf andere Weise bereitgestellt, kann die Ligierung unter Verwendung bekannter Puffer und Bedingungen mit 10 Einheiten T4-DNA-Ligase („Ligase") pro 0,5 μg in etwa äquimolaren Mengen der DNA-Fragmente durchgeführt werden, die ligiert werden sollen.
Wenn nicht anders angegeben, wurde die Transformation wie in dem Verfahren durchgeführt, das durch Graham, F. und Van der Eb, A. Virology 52:456–457 (1973) beschrieben wurde.
Beispiel 1
Clonierung und Expression von OAP unter Verwendung des Baculovirus-Expressionssystems
Die DNA-Sequenz, die das Volllängen-OAP-Protein, ATCC # 97302, codiert, wurde unter Verwendung von PCR-Oligonucleotid-Primern amplifiziert, die den 5'- und den 3'-Sequenzen des Gens entsprachen:
Der 5'-Primer besitzt die Sequenz
5' CGGGATCCGCCATCATGGGG ACCACAGCCAG 3' (SEQ ID NO: 3)
und enthält eine BamHI-Restriktionsenzymstelle (fett), der Nucleotide folgen, die einem effizienten Signal zur Initiation der Translation in eukaryontischen Zellen ähneln (Kozak, M., J. Mol. Biol. 196:947–950 (1987)) und die sich direkt vor dem Initiationscodon zur Translation „ATG" (unterstrichen) befinden.
Der 3'-Primer besitzt die Sequenz
5' GCTCTAGATCCAAGAGGTGTTT .AGTG 3' (SEQ ID NO: 4)
und enthält die Spaltungsstelle für die Restriktionsendonuclease XbaI und 18 Nucleotide, die zur nicht translatierten 3'-Sequenz komplementär sind. Die amplifizierten Sequenzen wurden aus einem 1 %igen Agarosegel unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits („Geneclean", BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.) isoliert. Das Fragment wurde dann mit den Endonucleasen BamHI und XbaI verdaut und erneut über ein 1 %iges Agarosegel gereinigt. Dieses Fragment wird als F2 bezeichnet.
Der Vektor pA2 (eine Modifikation des Vektors pVL941, der nachstehend diskutiert wird) wird zur Expression des OAP-Proteins unter Verwendung des Baculovirus-Expressionssystems verwendet (für eine Übersicht vergleiche mit: Summers, M.D. und Smith, G.E., 1987, A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station, Bulletin Nr. 1555). Dieser Expressionsvektor enthält den starken Polyhedrin-Promotor des Autographa californica-Kernpolyedervirus (AcMNPV), gefolgt von Erkennungsstellen für die Restriktionsendonucleasen BamHI und XbaI. Die Polyadenylierungsstelle des Affen-Virus SV40 wird zur effizienten Polyadenylierung verwendet. Zur leichten Selektion rekombinanter Viren wird das beta-Galactosidasegen aus E. coli in der gleichen Orientierung wie der Polyhedrin-Promotor inseriert, gefolgt von dem Polyadenylierungssignal des Polyhedrin-Gens. Die Polyhedrin-Sequenzen sind auf beiden Seiten von viralen Sequenzen für die zellvermittelte homologe Rekombination kotransfizierter viraler Wildtyp-DNA flankiert. Es können viele andere Baculovirus-Vektoren anstelle von pA2 verwendet werden, wie z. B. pAc373, pVL941 und pAcIM1 (Luckow, V.A. und Summers, M.D., Virology 170:31–39).
Das Plasmid wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und XbaI verdaut und dann unter Verwendung von Kälberdarm-Phosphatase durch im Fachgebiet bekannte Verfahren dephosphoryliert. Dann wurde die DNA aus einem 1 %igen Agarosegel unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits („Geneclean", BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.) isoliert. Diese Vektor-DNA wird als V2 bezeichnet.
Das Fragment F2 und das dephosphorylierte Plasmid V2 wurden mit T4-DNA-Ligase ligiert. Dann wurden E. coli HB101-Zellen transformiert und Bakterien identifiziert, die das Plasmid (pBacOAP) mit dem OAP-Gen enthielten; dies erfolgte unter Verwendung der Enzyme BamHI und XbaI. Die Sequenz des clonierten Fragments wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
Fünf μg des Plasmids pBacOAP wurden mit 1,0 μg einer kommerziell erhältlichen linearisierten Baculovirus-DNA („BaculoGold^TM-Baculovirus-DNA", Pharmingen, San Diego, CA) unter Verwendung des Lipofektionsverfahrens (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413–7417 (1987)) kotransfiziert.
1 μg BaculoGold^TM-Virus-DNA und 5 μg des Plasmids pBacOAP wurden in einer sterilen Vertiefung einer Mikrotiterplatte gemischt, die 50 μl serumfreies Grace-Medium (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) enthielt. Anschließend wurden 10 μl Lipofectin plus 90 μl Grace-Medium zugegeben, gemischt und 15 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Dann wurde das Transfektionsgemisch tropfenweise zu Sf9-Insektenzellen (ATCC CRL 1711) hinzu gegeben, die in einer 35 mm-Gewebekulturplatte mit 1 ml Grace-Medium ohne Serum ausgesät worden waren. Die Platte wurde hin- und herbewegt, um die neu hinzugefügte Lösung zu vermischen. Dann wurde die Platte 5 Stunden bei 27 °C inkubiert. Nach 5 Stunden wurde die Transfektionslösung von der Platte entfernt, und es wurde 1 ml Grace- Insektenmedium zugegeben, das mit 10 % fötalem Kälberserum ergänzt worden war. Die Platte wurde in den Inkubator zurückgestellt und die Kultur wurde vier Tage bei 27 °C weitergeführt.
Nach vier Tagen wurde der Überstand gesammelt, und es wurde ein Plaque-Testansatz durchgeführt, ähnlich wie durch Summers und Smith (vorstehend) beschrieben. Als Modifizierung wurde ein Agarosegel mit „Blue Gal" (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) verwendet, das eine leichte Isolierung der blaugefärbten Plaques erlaubt. (Eine genaue Beschreibung eines „Plaque-Testansatzes" findet sich auch in dem Anwender-Handbuch zur Insektenzellkultur und Baculovirologie, das durch Life Technologies Inc., Gaithersburg, verteilt wird, S. 9–10).
Vier Tage nach einer seriellen Verdünnung wurde das Virus den Zellen zugegeben, und die blaugefärbten Plaques wurden mit der Spitze einer Eppendorf-Pipette gepickt. Der Agar, der die rekombinanten Viren enthielt, wurde dann in einem Eppendorf-Röhrchen resuspendiert, das 200 μl Grace-Medium enthielt. Der Agar wurde durch eine kurze Zentrifugation entfernt, und der Überstand, der die rekombinanten Baculoviren enthielt, wurde verwendet, um Sf9-Zellen zu infizieren, die in 35 mm-Schalen ausgesät worden waren. Vier Tage später wurden die Überstände dieser Kulturschalen geerntet und dann bei 4 °C aufbewahrt.
Sf9-Zellen wurden in Grace-Medium angezogen, das mit 10 % durch Hitze inaktiviertem FBS ergänzt worden war. Die Zellen wurden mit dem rekombinanten Baculovirus V-OAP mit einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 2 infiziert. Sechs Stunden später wurde das Medium entfernt und durch SF900 II-Medium ohne Methionin und Cystein ersetzt (Life Technologies Inc., Gaithersburg). 42 Stunden später wurden 5 μCi ³⁵S-Methionin und 5 μCi ³⁵S-Cystein (Amersham) zugegeben. Die Zellen wurden weitere 16 Stunden inkubiert, bevor sie durch Zentrifugation geerntet wurden, und dann wurden die markierten Proteine durch SDS-PAGE und Autoradiographie analysiert.
Der Überstand (1000 ml), der Baculoviren enthielt, die OAP exprimierten, wurde ohne Verdünnung auf eine HS-50-Säule (1,0 × 10 cm, Perseptive Biosystems), die mit 0,02 M Bis-Tris, pH 6,0, das 10 % Glycerin und 0,02 M NaCl enthielt (Lösemittel A), äquilibriert worden war, mit einer Flussrate von 8 ml/min aufgetragen. Dann wurden die Proteine unter Verwendung eines Gradienten von 10 % Lösemittel B (Lösemittel A, das 2 M NaCl enthielt) bis zu 30 % B eluiert. Der vereinigte Peak enthielt 11 mg OAP in einer Reinheit von über 80 %.
Beispiel 2
Die Expression des rekombinanten OAP in COS-Zellen
Das Plasmid OAP HA ist von dem Vektor pcDNAI/Amp (Invitrogen) abgeleitet, der enthält: (1) den SV40-Replikationsursprung, (2) das Ampicillin-Resistenzgen, (3) den E. coli-Replikationsursprung, (4) den CMV-Promotor, gefolgt von einer Polylinkerregion, einem SV40-Intron und einer Polyadenylierungsstelle. Ein DNA-Fragment, das den vollständigen OAP-Vorläufer und eine HA-Markierungssequenz, die im Leseraster mit seinem 3'-Ende fusioniert worden war, codiert, wurde in die Polylinker-Region des Vektors cloniert, daher wird die Expression des rekombinanten Proteins durch den CMV-Promotor gesteuert. Die HA-Markierungssequenz entspricht einem Epitop, das aus dem Influenza-Hämagglutinin-Protein stammt, wie vor kurzem beschrieben wurde (I. Wilson, H. Niman, R. Heighten, A. Cherenson, M. Connolly und R. Lerner, Cell 37:767 (1984)). Die Fusion der HA-Markierungssequenz mit dem Zielprotein erlaubt den leichten Nachweis des rekombinanten Proteins mit einem Antikörper, der das HA-Epitop erkennt.
Die Strategie zur Konstruktion des Plasmids erfolgte, wie nachstehend beschrieben:
Die DNA-Sequenz, die OAP, ATCC # 97302, codiert, wurde durch PCR unter Verwendung von zwei Primern konstruiert: Der 5'-Primer,
5' GCGCGGATCCACCATGGGGACCAGCCAGA 3' (SeQ ID NO: 5)
enthält eine BamHI-Stelle, der 18 Nucleotide der OAP codierenden Sequenz ab dem Beginn des Initiationscodons folgen; die 3'-Sequenz, 5'-
GCGCTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTATTCTTCCTTGGGCTC3' (SEQ ID NO: 6)
enthält komplementäre Sequenzen zu einer XbaI-Stelle, einen Translations-Stoppcodon, der HA-Markierungssequenz und den letzten 15 Nucleotiden der OAP codierenden Sequenz (ausschließlich des Stoppcodons). Daher enthält das PCR-Produkt eine BamHI-Stelle, die OAP codierende Sequenz, die von einer HA-Markierungssequenz gefolgt wird, welche im Leseraster fusioniert wurde, ein Translations-Terminations-Stoppcodon, das sich neben der HA-Markierungssequenz befindet, und eine XbaI-Stelle. Das durch PCR amplifizierte DNA-Fragment und der Vektor pcDNAI/Amp wurden mit den Restriktionsenzymen BamHI und XbaI verdaut und dann ligiert. Das Ligierungsgemisch wurde in den E. coli-Stamm SURE (erhältlich von Stratagene Cloning Systems, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037) transformiert, die transformierte Kultur wurde auf Platten mit Ampicillin-Medium plattiert und die resistenten Kolonien wurden selektiert. Die Plasmid-DNA wurde aus den Transformanten isoliert und durch Restriktionsanalyse auf die Anwesenheit des korrekten Fragments hin untersucht. Zur Expression des rekombinanten OAP wurden COS-Zellen mit dem Expressionsvektor durch das DEAE-DEXTRAN-Verfahren transfiziert (J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989)). Die Expression des OAP-HA-Proteins wurde durch radioaktive Markierung und durch das Immunpräzipitationsverfahren (E. Harlow, D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)) nachgewiesen. Die Zellen wurden für 8 Stunden 2 Tage nach der Transfektion mit ³⁵S-Cystein markiert. Dann wurde das Kulturmedium gesammelt und die Zellen wurden mit Detergenz lysiert (RIPA-Puffer: 150 mM NaCl, 1 % NP-40, 0,1 % SDS, 1 % NP-40, 0,5 % DOC, 50 mM Tris, pH 7,5) (Wilson I. et al., Ibid. 37:767 (1984)). Sowohl das Zelllysat als auch das Kulturmedium wurden unter Verwendung eines HA-spezifischen monoclonalen Antikörpers präzipitiert. Die präzipitierten Proteine wurden auf 15 %igen SDS-PAGE-Gelen analysiert.
Beispiel 3
Die Expression durch die Gentherapie
Durch Hautbiopsie werden aus einem Individuum Fibroblasten erhalten. Das so erhaltene Gewebe wird in Gewebekulturmedium platziert und in kleine Stücke zerteilt. Kleine Brocken des Gewebes werden auf die feuchte Oberfläche einer Gewebekulturflasche platziert, es werden etwa 10 Stücke in jede Flasche gegeben. Die Flasche wird mit der Oberseite nach unten gestellt, fest verschlossen und über Nacht bei Zimmertemperatur belassen. Nach 24 Stunden bei Zimmertemperatur wird die Flasche umgedreht und die Gewebebrocken bleiben an dem Boden der Flasche fixiert, und es wird frisches Medium (z. B.: Ham-F12-Medium, mit 10 % FBS, Penicillin und Streptomycin) zugegeben. Dieses wird dann bei 37 °C für etwa eine Woche inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wird frisches Medium zugegeben und anschließend alle paar Tage ausgewechselt. Nach zwei weiteren Wochen in Kultur erscheint eine einzellige Schicht von Fibroblasten. Die einzellige Schicht wird mit Trypsin behandelt und in größere Flaschen aufgeteilt.
pMV-7 (Kirschmeier, P.T. et al., DNA 7:219-25 (1988), das durch die langen terminalen Wiederholungssequenzen des Moloney-Maus-Sarkom-Virus flankiert wird, wird mit EcoRI und HindIII verdaut und anschließend mit Kälberdarm-Phosphatase behandelt. Der lineare Vektor wird auf einem Agarosegel aufgetrennt und unter Verwendung von Glaskügelchen gereinigt.
Die cDNA, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, wird unter Verwendung von PCR-Primern amplifiziert, die den 5'- beziehungsweise den 3'-Endsequenzen entsprechen. Der 5'-Primer enthält eine EcoRI-Stelle und der 3'-Primer enthält weiterhin eine HindIII-Stelle. Gleiche Mengen des linearen Moloney-Maus-Sarkom-Virus-Grundgerüsts und des amplifizierten EcoRI-HindIII-Fragments werden in Gegenwart von T4-DNA-Ligase zusammen gegeben. Das so erhaltene Gemisch wird unter Bedingungen inkubiert, die für eine Ligierung der beiden Fragmente geeignet sind. Das Ligierungsgemisch wird verwendet, um HB101-Bakterien zu transformieren, welche dann auf Agar plattiert werden, der Kanamycin enthält, und zwar zum Zwecke der Bestätigung, dass der Vektor das Gen von Interesse korrekt inseriert enthält.
Die amphotrophen pA317- oder GP+am12-Verpackungszellen werden in Gewebekultur in Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10 % Kälberserum (CS), Penicillin und Streptomycin bis zur konfluenten Dichte angezogen. Der MSV-Vektor, der das Gen enthält, wird dann dem Medium zugegeben, und die Verpackungszellen werden mit dem Vektor transduziert. Die Verpackungszellen stellen nun infektiöse Viruspartikel her, die das Gen enthalten (die Verpackungszellen werden nun als Produzentenzellen bezeichnet).
Den transduzierten Produzentenzellen wird frisches Medium zugegeben und anschließend wird das Medium aus einer 10 cm-Platte konfluenter Produzentenzellen geerntet. Das verbrauchte Medium, das die infektiösen Viruspartikel enthält, wird durch einen Millipore-Filter filtriert, um abgelöste Produzentenzellen zu entfernen, und dieses Medium wird dann dazu verwendet, Fibroblastenzellen zu infizieren. Das Medium wird aus einer noch nicht konfluenten Platte mit Fibroblasten entfernt und rasch durch das Medium der Produzentenzellen ersetzt. Dieses Medium wird entfernt und durch frisches Medium ersetzt. Wenn der Titer des Virus hoch ist, sind praktisch alle Fibroblasten infiziert, und es ist keine Selektion erforderlich. Wenn der Titer sehr niedrig ist, ist es nötig, einen retroviralen Vektor zu verwenden, der einen selektierbaren Marker besitzt, wie z. B. neo oder his.
Die veränderten Fibroblasten werden dann in den Wirt injiziert, entweder alleine oder nachdem sie bis zur Konfluenz auf Cytodex 3-Mikroträgerkügelchen angezogen wurden. Die Fibroblasten stellen nun das Proteinprodukt her.
Beispiel 4
Antivirale Wirkung von OAP
Mehrere Mitglieder der Picornaviren-Familie verursachen akute nekrotisierende Pankreatitis und Parotitis in Mäusen (Barger, M.T. und Craighead, J.E., 1991; Babu, P.G., Huber, S.A., Craighead, J.E., 1986; Blay, R., Simpson, K., Leslie, K. und Huber, S.A., 1989; Campbell, I.L. et al., 1985). Die tatsächliche Pathogenese der durch das Virus indizierten Veränderungen ist unbekannt; obwohl allgemein angenommen wird, dass immunpathogene Mechanismen beteiligt sind (Barger, M.T. und Craighead, J.E., 1991). Eine schützende Wirkung vor einer nachfolgenden Infektion mit EMCV wurde in Mäusen aufgezeigt (Barger, M.T. und Craighead, J.E., 1991). Das vorliegende Experiment zeigt die antivirale Wirkung einer OAP-Behandlung im Verlauf einer EMCV-Infektion in Mäusen unter Verwendung ähnlicher Verfahren.
Mäuse
Männliche, 8 bis 10 Wochen alte A/J-Mäuse, die vom Jackson-Labor (Bar Harbor, ME) bezogen wurden, wurden in Käfiggruppen von zehn Tieren bei Zimmertemperatur mit alternierenden 12-stündigen Licht- und Dunkelperioden gehalten. Die Tiere hatten freien Zugang zu Nahrung und Wasser. Es gab keine speziellen Nahrungszusammenstellungen.
Virus
Der Variantenstamm E des EMCV wurde von ATCC (Rockville, Maryland) bezogen und in L929-Zellen über direkte Infektion vermehrt. Die Virustiter des Plaqueüberstandes wurden mit L929-Zellen ausgetestet und die TCID50-Werte wurden, wie vorstehend beschrieben, bestimmt.
Infektionsprotokoll
Vor der Durchführung der Schutzexperimente wurde die Dosis an EMCV bestimmt, die erforderlich ist, 50 % der Tiere zu töten („LD50"). Typischerweise tötet eine EMCV-Infektion die Tiere nach 7 bis 10 Tagen. 10 Infektionseinheiten EMCV, die in diesen Experimenten verwendet wurden, waren wirksam, 50 % der Tiere bis zum Tag 7 zu töten. Um die optimalen Dosen an murinem IFN-gamma und an alpha:beta-Interferon zu bestimmen, die einen Schutz vor den durch EMCV induzierten pathologischen Wirkungen erbrachten, wurden Gruppen von zehn Tieren, die in dem gleichen Käfig gehalten wurden, vorbehandelt, und zwar pro Tier mit 1000 Einheiten murinem IFN-gamma oder einem alpha:beta-Interferon-Gemisch, darauf erfolgte die intraperitoneale (i.p.) Beimpfung mit 10 Infektionseinheiten EMCV in Hank balancierter Salzlösung (HBSS). Parallel dazu, wurden die doppelte Anzahl an Tieren auf die gleiche Weise mit Kochsalzlösung oder mit etwa 500 IFN äquivalenten Einheiten OAP vorbehandelt, darauf erfolgte 24 Stunden später die Beimpfung mit EMCV. Die Tiere wurden danach 10 Tage auf Anzeichen einer mit EMCV in Beziehung stehendern Pathologie beobachtet.
Analyse
4 zeigt in graphischer Darstellung die Wirkungen einer Aussetzung gegenüber EMCV für jede Gruppe der Mäuse. Diese Darstellung der Zahl der überlebenden Mäuse in jeder Gruppe an den Tagen 1–10 nach der Aussetzung gegenüber EMCV zeigt, dass OAP Mäuse vor EMCV mindestens so gut wie murines IFN schützt. Alle Mäuse, die mit der Dosis OAP behandelt worden waren, und diejenigen, die mit mIFN behandelt worden waren, überlebten bis nach Tag 10, wohingegen alle zum Schein injizierten Mäuse bis dahin gestorben waren.
Es sind zahlreiche Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung im Hinblick auf die vorstehenden Lehren möglich, und daher kann, im Rahmen der angehängten Ansprüche, die Erfindung in anderer Weise als speziell beschrieben durchgeführt werden.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Polynucleotid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (a) Polynucleotiden, die zumindest die reife Form des Polypeptids codieren, das die abgeleitete, wie in SEQ ID NO: 2 dargestellte Aminosäuresequenz hat; (b) Polynucleotiden, die ein Polypeptid codieren, das die Aminosäuren 20 bis 540 von SEQ ID NO: 2 umfasst; (c) Polynucleotiden, die ein Polypeptid codieren, das die Aminosäuren 1 bis 540 von SEQ ID NO: 2 umfasst; (d) Polynucleotiden, die die in SEQ ID NO: 1 dargestellte codierende Sequenz haben, die zumindest die reife Form des Polypeptids codiert; (e) Polynucleotiden, umfassend die in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nucleotide 82 bis 1701; (f) Polynucleotiden, umfassend die in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nucleotide 139 bis 1701; (g) Polynucleotiden, die das Polypeptid codieren, das die Aminosäuresequenz von zumindest der reife Form des Polypeptids hat, das durch die in ATCC 97302 enthaltene cDNA codiert wird; (h) Polynucleotiden, die die codierende Sequenz der in ATCC 97302 enthaltenen cDNA haben, die zumindest die reife Form des Polypeptids codiert; (i) Polynucleotiden, die die codierende Sequenz der in ATCC 97302 enthaltenen cDNA haben; (j) Polynucleotiden, die ein erstes Polypeptid codieren, das zumindest zu 80% mit einem zweiten Polypeptid identisch ist, das von einem Polynucleotid nach einem der Punkte (a) bis (h) codiert wird, wobei das erste Polypeptid antivirale Aktivität gegen EMCV hat; und (k) Polynucleotiden, deren komplementärer Strang mit einem in einem der Punkte (a) bis (h) definierten Polynucleotid hybridisiert und zumindest zu 85% damit identisch ist, wobei die Polynucleotide ein Polypeptid codieren, das antivirale Aktivität gegen EMCV hat; oder der komplementäre Strang eines solchen Polynucleotids.
Polynucleotid nach Anspruch 1, das DNA ist.
DNA nach Anspruch 2, die genomische DNA ist.
Polynucleotid nach Anspruch 1, das RNA ist.
Vektor, der das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 enthält.
Vektor nach Anspruch 5, in dem das Polynucleotid funktionell mit Expressionskontrollsequenzen verbunden ist, die eine Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen erlauben.
Wirtszelle, die den Vektor nach Anspruch 5 oder 6 enthält.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das durch das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert wird, umfassend: Züchten der Wirtszelle nach Anspruch 7 und Gewinnen des durch das Polynucleotid codierten Polypeptids aus der Kultur.
Verfahren zur Herstellung von Zellen, die in der Lage sind, ein Polypeptid, das durch das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert wird, zu exprimieren, umfassend das genetische Verändern von Zellen mit dem Vektor nach Anspruch 5 oder 6.
Polypeptid, das die Aminosäuresequenz hat, die von einem Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert wird, oder das durch das Verfahren nach Anspruch 8 erhältlich ist.
Antikörper, der spezifisch an das Polypeptid nach Anspruch 10, das antivirale Aktivität gegen EMCV hat, bindet.
Nucleinsäuremolekül, das spezifisch an ein Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 hybridisiert und das zumindest zu 90% mit dem Polynucleotid identisch ist.
Antagonist/Inhibitor des Rezeptors für das Polypeptid nach Anspruch 10, wobei der Antagonist/Inhibitor eine Antisense-DNA oder -RNA ist, die spezifisch mit einem Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 hybridisiert und zumindest zu 90% damit identisch ist, oder der ein Antikörper ist, der spezifisch für das Polypeptid nach Anspruch 10 ist.
Arzneimittel, umfassend das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das Polypeptid nach Anspruch 10 oder eine DNA, die das Polypeptid codiert und in der Lage ist, es in vivo zu exprimieren, oder den Antagonisten/Inhibitor nach Anspruch 13, und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Diagnostische Zusammensetzung, umfassend das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 12 oder den Antikörper nach Anspruch 11.
Verwendung des Polypeptids nach Anspruch 10, des Polynucleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder des Vektors nach Anspruch 5 oder 6 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer durch Infektion mit einem Virus verursachten Krankheit.
Verfahren zur Diagnose einer Krankheit oder einer Anfälligkeit für eine Krankheit, die mit dem Polypeptid nach Anspruch 10 in Bezug steht, umfassend die ex vivo-Bestimmung einer Mutation in einer Nucleinsäuresequenz, die das Polypeptid codiert.
Diagnostisches Verfahren, umfassend das Analysieren auf die Anwesenheit des Polypeptids nach Anspruch 10 in einer von einem Wirt stammenden Probe.