ES2247594T3 - Proteina antivirica. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBE UN POLIPEPTIDO OAP Y DNA (RNA) QUE CODIFICA TAL POLIPEPTIDO Y UN PROCEDIMIENTO PARA PREPARAR TAL POLIPEPTIDO POR TECNICAS RECOMBINANTES. TAMBIEN SE DESCRIBEN PROCEDIMIENTOS PARA UTILIZAR TAL POLIPEPTIDO COMO UN AGENTE ANTIVIRICO, PARA ESTIMULAR LA DIFERENCIACION EN EL CRECIMIENTO DE OSTEOBLASTOS Y OSTEOCLASTOS, QUE SES PUEDEN UTILIZAR PARA PROMOVER LA CURACION DE FRACTURAS OSEAS Y LA FORMACION DE NOVO DE HUESO Y CONTRA LA OSTEOPOROSIS. TAMBIEN SE DESCRIBEN AGONISTAS Y ANTAGONISTAS DEL POLIPEPTIDO DE LA PRESENTE INVENCION QUE PUEDEN SER UTILIZADOS PARA TRATAR OSTEODISTROFIA, OSTEOHIPERTROFIA, OSTEOMA POR OSTEOPETROSIS, OSTEOPOROSIS Y OSTEOBLASTOMA. ENSAYOS DE DIAGNOSTICO PARA IDENTIFICAR MUTACIONES EN SECUENCIAS DE ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICAN UN POLIPEPTIDO DE LA PRESENTE INVENCION.

Description

Proteína antivírica.

Esta invención se refiere a polinucleótidos identificados recientemente, a polipéptidos codificados por tales polinucleótidos, al uso de tales polinucleótidos y polipéptidos, así como a la producción de tales polinucleótidos y polipéptidos. El polipéptido de la presente invención se ha identificado supuestamente como una proteína humana antivírica y, en particular, como una osteoproteína antivírica, denominada a veces en esta memoria, de aquí en adelante "OAP". La invención también se refiere a la inhibición de la acción de tales polipéptidos.

El procedimiento de formación de huesos embrionarios implica la creación de una matriz extracelular que se mineraliza durante el curso de la maduración del tejido. Esta matriz está sometida a una remodelación constante durante toda la vida de un individuo, mediante la acción combinada de los osteoblastos y los osteoclastos. Se debe mantener un equilibrio cuidadoso entre la formación y la resorción de la matriz se debe mantener, ya que los cambios pueden dar como resultado enfermedades óseas.

La matriz extracelular del hueso consiste en dos fases, una fase orgánica y una fase mineral. La fase orgánica consiste principalmente en las fibrillas de colágeno de tipo I que están asociadas con una cantidad de proteínas no colagenosas de la matriz. Se ha estimulado mucho el interés en las proteínas no colagenosas del hueso desde que Urist mostró en primer lugar que extractos óseos desmineralizados podían inducir la formación ósea ectópica (Urist, M.R., Science, 150:893-899 (1965)). Las proteínas no colagenosas del hueso se cree ahora que están implicadas en la mineralización así como en la regulación local de la función hueso-célula (Heinegard, D. y Oldberg, A., Connective Tissue and Its Heritable Disorders (Royce, P.M. y Steinmann, B., compiladores), páginas 189-209, Wiley-Liss, Nueva York (1993), y Von der Mark, K. y Goodman, S., mencionado antes). En los últimos años, se ha aislado una variedad de proteínas no colagenosas del hueso y se han caracterizado; entre éstas se encuentra la osteocalcina, la osteopontina, la osteonectina y la sialoproteína ósea (Heinegard, D. y Oldberg, A., FASEB J., 3:2042-2051 (1985)).

Se ha establecido una línea celular osteogénica clónica (MN7) procedente del estroma de la médula ósea de ratones adultos (Mathieu, E. y col., Calcif. Tissue Int., 50:362-371 (1992)). Estas células, bajo condiciones adecuadas, sufren una diferenciación osteoblástica típica in vitro y son capaces de formar una matriz extracelular mineralizada (Mathieu, E. y Merregaert, J., J. Bone Miner. Res., 9:183-192 (1994)).

Un ADNc que codifica una nueva proteína secretora de ratón (p85), se ha clonado, caracterizado y cartografiado genéticamente (Bhalerao, J. y col., J. Biol. Chem., 270 (27):16385-16394 (1995)). El ADNc de longitud completa contiene un marco de lectura abierto de 1677 pb que codifica una proteína de 559 aminoácidos. El clon contiene un péptido señal hidrófobo, característico de una proteína secretada. El mensaje de 1,9 kb se expresa en diversos tejidos, tales como el hígado, el corazón, los pulmones, etc., aunque una variante por corte y empalme, estaba presente en el cartílago embrionario en la piel. Este gen p85, denominado Ecm1 para la proteína 1 de la matriz extracelular, se cartografía en el cromosoma 3 de ratón en una región que contiene varios locis implicados en enfermedades del desarrollo de la piel.

El polipéptido de la presente invención tiene la mayor homología en la secuencia de aminoácidos con un factor de crecimiento, Ecm1, y se ha observado que tiene una actividad antivírica.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un nuevo polipéptido maduro, de acuerdo con la reivindicación 10, así como fragmentos, análogos y derivados, biológicamente activos o útiles en la terapia y el diagnóstico, de acuerdo con la reivindicación 1. El polipéptido de la presente invención es de origen humano.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican un polipéptido de la presente invención que incluyen ARNm, ADNc, ADN genómico así como análogos y fragmentos biológicamente activos y útiles en la terapia y en el diagnóstico, de acuerdo con la reivindicación 1.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona una molécula aislada de ácido nucleico que codifica un polipéptido maduro expresado por el ADN contenido en el depósito de ATCC, nº 97302.

De acuerdo con todavía otro aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para producir tal polipéptido, de acuerdo con las reivindicaciones 8 y 9, mediante técnicas recombinantes que comprenden el cultivo de células recombinantes, hospedadoras, procariotas o eucariotas, que contienen una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de la presente invención, bajo condiciones que favorecen la expresión de dicha proteína y la posterior recuperación de dicha proteína.

De acuerdo con todavía otro aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para utilizar tal polipéptido, de acuerdo con la reivindicación 16, o un polinucleótido que codifica tal polipéptido para fines terapéuticos, por ejemplo, como un factor antivírico para tratar una enfermedad causada por la infección con un virus.

De acuerdo con todavía otro aspecto de la presente invención, se proporcionan anticuerpos contra dichos polipéptidos, de acuerdo con la reivindicación 11.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporcionan agonistas de OAP que imitan a OAP y se unen a receptores de OAP y los antagonistas de tales polipéptidos, de acuerdo con las reivindicaciones 11-13, que se pueden utilizar para inhibir la acción de tales polipéptidos.

De acuerdo con todavía otro aspecto de la presente invención, se proporcionan ensayos de diagnóstico para detectar enfermedades o la susceptibilidad a enfermedades relacionadas con mutaciones en las secuencias de ácido nucleico, de acuerdo con las reivindicaciones 17 y 18, que codifican un polipéptido de la presente invención.

De acuerdo con aún otro aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para utilizar tales polipéptidos, o polinucleótidos que codifican tales polipéptidos, de acuerdo con la reivindicación 16, para fines in vitro relacionados con la investigación científica, por ejemplo, la síntesis de ADN y la preparación de vectores de ADN.

Estos y otros aspectos de la presente invención serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la siguiente memoria descriptiva.

Los siguientes dibujos son ilustrativos de las realizaciones de la invención y no pretenden limitar el alcance de la invención contenido en las reivindicaciones.

La Figura 1 es una ilustración del ADNc y de la secuencia correspondiente de aminoácidos deducidos del polipéptido de la presente invención. La parte subrayada es indicativa de una supuesta secuencia líder. La secuenciación se realizó empleando un secuenciador de ADN automático 373 (Applied Biosystems, Inc.).

La Figura 2 es una comparación de la secuencia de aminoácidos entre el polipéptido de la presente invención (línea superior) y Ecm1 de múridos (línea inferior).

La Figura 3 muestra las características estructurales y funcionales de OAP, deducidas por las técnicas indicadas, como una función de la secuencia de aminoácidos.

La Figura 4 es un gráfico que muestra que OAP protege a los ratones de la infección con EMCV. Tal y como se describe en el Ejemplo 4, a los grupos de 10 ratones A/J machos con ocho semanas de edad, se les inyectó solución salina (simulación), IFN-gamma de múrido, 43 \mug de OAP o 84 \mug de OAP y a continuación se les expuso a EMCV. Los supervivientes de cada grupo en los días sucesivos a la exposición a EMCV se representan en el gráfico.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un ácido nucleico aislado (polinucleótido) que codifica el polipéptido maduro que tiene la secuencia de aminoácidos deducida de la Figura 1 (SEQ ID NO:2).

El polinucleótido de esta invención se descubrió en una genoteca de ADNc obtenida a partir de tumor pancreático humano. Está relacionado estructuralmente con la Ecm1. Contiene un marco de lectura abierto que codifica una proteína de 540 residuos de aminoácidos de los cuales, los 19 primeros residuos de aminoácidos son la supuesta secuencia líder, de modo que la proteína madura comprende 521 aminoácidos. La proteína muestra el mayor grado de homología con la Ecm1 de múridos a nivel de aminoácidos, con 66,790% de identidad y 78,664% de similitud sobre toda la extensión de aminoácidos. El gen de la presente invención muestra el mayor grado de homología a nivel de nucleótidos también con la Ecm1 de múridos, con 80% de identidad y 80% de similitud sobre toda la secuencia de nucleótidos. La proteína OAP madura tiene un peso molecular pronosticado de 59182,10, un coeficiente de extinción molar de aproximadamente 74220 y un punto isoeléctrico de 6,80.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporcionan polinucleótidos aislados que codifican un polipéptido maduro expresado por el ADN contenido en la ATCC nº de orden 97302, depositado en la "American Type Culture Collection", 12301 Park Lawn Drive, Rockville, Maryland 20852, EE.UU., el 25 de septiembre de 1995. El material depositado es un plásmido que contiene el ADNc de longitud completa de OAP, insertado en un vector pBluescript SK(-) (Stratagene, La Jolla, CA).

El depósito se ha realizado bajo las condiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a efectos de Procedimientos de Patentes. La cepa estará a disposición del público irrevocablemente y sin restricciones o condiciones tras la publicación de una patente. Estos depósitos se ofrecen exclusivamente como un factor de comodidad a los expertos en la técnica y no constituyen admisión de que se requiera un depósito bajo 35 U.S.C. \NAK 122. La secuencia de los polinucleótidos contenida en los materiales depositados, así como la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos codificados por los mismos, actúan como control en caso de cualquier conflicto con cualquier descripción de secuencia en esta memoria. Puede ser necesaria una licencia para fabricar, usar o vender los materiales depositados y el presente documento no concede licencia alguna. Las referencias a "polinucleótidos" en toda esta memoria descriptiva incluyen el ADN del depósito al que se ha hecho referencia anteriormente.

El polinucleótido de la presente invención puede estar en forma de ARN o en forma de ADN, en donde dicho ADN incluye ADNc, ADN genómico y ADN sintético. El ADN puede ser monocatenario o bicatenario y si es monocatenario puede ser la hebra codificadora o la hebra no codificadora (antiparalela). La secuencia codificadora que codifica el polipéptido maduro puede ser idéntica a la secuencia codificadora mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO:1) o puede ser una secuencia codificadora diferente cuya secuencia codificadora codifique el mismo polipéptido maduro que el ADN de la Figura 1 (SEQ ID NO:1), como resultado de la redundancia o la degeneración del código genético.

El polinucleótido que codifica el polipéptido maduro de la Figura 1 (SEQ ID NO:2) incluye la secuencia codificadora del polipéptido maduro, la secuencia codificadora del polipéptido maduro y una secuencia codificadora adicional, tal como una secuencia líder o secretora o una secuencia de proproteína; la secuencia codificadora del polipéptido maduro (y, opcionalmente, la secuencia codificadora adicional) y la secuencia no codificadora, tal como los intrones o la secuencia no codificadora 5' y/o 3' de la secuencia codificadora del polipéptido maduro.

Por tanto, la expresión "polinucleótido que codifica un polipéptido" abarca un polinucleótido que incluye sólo la secuencia codificadora del polipéptido, así como un polinucleótido que incluye la secuencia codificadora adicional y/o la secuencia no codificadora.

La presente invención se refiere adicionalmente a variantes de los polinucleótidos descritos en esta memoria anteriormente, que codifican fragmentos, análogos y derivados del polipéptido que tienen la secuencia de aminoácidos deducida de la Figura 1 (SEQ ID NO:2), de acuerdo con la reivindicación 1. La variante del polinucleótido puede ser una variante alélica del polinucleótido presente en la naturaleza o una variante del polinucleótido que no está presente en la naturaleza.

Por ello, la presente invención incluye polinucleótidos que codifican el mismo polipéptido maduro, tal y como se muestra en la Figura 1 (SEQ ID NO:2), así como variantes de acuerdo con la reivindicación 1, de tales polinucleótidos, codificando dichas variantes un fragmento, un derivado o un análogo del polipéptido de la Figura 1 (SEQ ID NO:2). Tales variantes de nucleótidos incluyen variantes por deleción, variantes por sustitución y variantes por adición o inserción.

Tal y como se ha indicado anteriormente, el polinucleótido según la reivindicación 1, puede tener una secuencia codificadora que es una variante alélica presente en la naturaleza de la secuencia codificadora mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO:1). Tal y como se conoce en la técnica, una variante alélica es una forma alternativa de una secuencia de polinucleótidos que puede tener una sustitución, una deleción o una adición de uno o de varios nucleótidos que no altera sustancialmente la función del polipéptido codificado.

La presente invención también incluye polinucleótidos de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la secuencia codificadora del polipéptido maduro se puede fusionar en el mismo marco de lectura, con una secuencia de polinucleótido que ayuda en la expresión y en la secreción de un polipéptido desde una célula hospedadora, por ejemplo, una secuencia líder que actúa como una secuencia secretora para controlar el transporte de un polipéptido desde la célula. El polipéptido que tiene una secuencia líder es una preproteína y la célula hospedadora puede cortar la secuencia líder para formar la forma madura del polipéptido. Los polinucleótidos también pueden codificar una proproteína que es la proteína madura más residuos de aminoácidos adicionales en 5'. Una proteína madura que tiene una prosecuencia es una proproteína y es una forma inactiva de la proteína. Una vez que se corta la prosecuencia, queda una proteína madura activa. Por tanto, por ejemplo, el polinucleótido de la presente invención puede codificar una proteína madura o una proteína que tenga una prosecuencia o una proteína que tenga ambas, una prosecuencia y una presecuencia (secuencia líder).

Los polinucleótidos de acuerdo con la reivindicación 1, también pueden tener la secuencia codificadora fusionada en marco de lectura con una secuencia marcadora que permite la purificación del polipéptido de la presente invención. La secuencia marcadora puede ser una marca de hexa-histidina proporcionada por un vector pQE-9 para facilitar la purificación del polipéptido maduro fusionado con el marcador, en el caso de un hospedador bacteriano o, por ejemplo, la secuencia marcadora puede ser una marca de hemaglutinina (HA) cuando se emplea un hospedador de mamífero, p. ej., células COS-7. La marca de HA se corresponde con un epítopo obtenido a partir de la proteína hemaglutinina de la gripe (Wilson, I., y col., Cell, 37:767 (1984)).

El término "gen" significa el segmento de ADN implicado en la producción de una cadena polipeptídica; incluye regiones que preceden y que siguen a la región codificadora (líder y de cola), así como secuencias que se interponen (intrones) entre segmentos individuales que codifican (exones).

Los fragmentos del gen de longitud completa de la presente invención se pueden utilizar como una sonda para la hibridación de una genoteca de ADNc, para aislar el ADNc de longitud completa y para aislar otros ADNc que tienen una alta similitud de secuencia con el gen o una actividad biológica similar. Las sondas de este tipo tienen preferentemente al menos 30 bases y pueden contener, por ejemplo, 50 bases o más. La sonda también se puede utilizar para identificar un clon de ADNc que se corresponde con un transcrito de longitud completa y un clon o clones genómicos que contienen el gen completo, incluyendo las regiones reguladoras y promotoras, exones e intrones. Un ejemplo de un rastreo comprende aislar la región codificadora del gen empleando la secuencia de ADN conocida para sintetizar una sonda de oligonucleótidos. Los oligonucleótidos marcados que tienen una secuencia complementaria a la del gen de la presente invención, se emplean para escrutar una genoteca de ADNc humano, ADN genómico o ARNm para determinar qué miembros de la genoteca se hibridan con la sonda.

La presente invención se refiere adicionalmente a polinucleótidos que se hibridan con las secuencias descritas anteriormente, si tienen una identidad de al menos 85%, preferentemente al menos 90% y más preferentemente al menos 95% entre las secuencias. La presente invención se refiere particularmente a polinucleótidos que se hibridan bajo condiciones rigurosas con los polinucleótidos descritos anteriormente en esta memoria. Tal y como se emplea en esta memoria, la expresión "condiciones rigurosas" significa que la hibridación tendrá lugar si existe una identidad de al menos 95% y preferentemente de al menos 97% entre las secuencias. Los polinucleótidos que se hibridan con los polinucleótidos descritos anteriormente, en una realización preferida codifican polipéptidos que conservan sustancialmente la misma función biológica o la misma actividad que el polipéptido maduro codificado por los ADNc de la Figura 1 (SEQ ID NO:1).

Por tanto, la presente invención se dirige a polinucleótidos que tienen una identidad de al menos 85%; preferentemente al menos 90% y más preferentemente al menos 95% con un polinucleótido que codifica el polipéptido de la SEQ ID NO:2 y polinucleótidos complementarios al mismo.

La presente invención se refiere adicionalmente a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos deducida de la Figura 1 (SEQ ID NO:2), así como a fragmentos, análogos y derivados de tal polipéptido, de acuerdo con la reivindicación 1.

Los términos, "fragmento", "derivado" y "análogo", cuando hacen referencia al polipéptido de la Figura 1 (SEQ ID NO:2), significan un polipéptido que conserva esencialmente la misma función biológica o la misma actividad que tal polipéptido. Por ello, un análogo incluye una proproteína que se puede activar mediante escisión de la parte de proproteína para producir un polipéptido maduro y activo.

El polipéptido de la presente invención puede ser un polipéptido recombinante, un polipéptido natural o un polipéptido sintético, preferentemente un polipéptido recombinante.

El fragmento, el derivado o el análogo del polipéptido de la Figura 1 (SEQ ID NO:2) puede ser (i) uno en el que uno o varios de los residuos de aminoácidos estén sustituidos por un residuo de aminoácido conservado o no conservado (preferentemente, un residuo de aminoácido conservado) y dicho residuo de aminoácido sustituido puede ser o no uno codificado por el código genético, o (ii) uno en el que uno o varios de los residuos de aminoácidos incluyen un grupo sustituyente, o (iii) uno en el que el polipéptido maduro está fusionado con otro compuesto, tal como un compuesto para incrementar la semivida del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol), o (iv) uno en el que los aminoácidos adicionales se fusionan con el polipéptido maduro, tal como una secuencia líder o secretora o una secuencia que se emplea para purificar el polipéptido maduro o una secuencia de proproteína se considera que tales fragmentos, derivados y análogos están dentro del alcance de los expertos en la técnica a partir de las enseñanzas de esta memoria.

También se prefiere en este aspecto de la invención los fragmentos caracterizados por atributos estructurales o funcionales de OAP. Las realizaciones preferidas de la invención en este sentido, incluyen fragmentos que comprenden las regiones de hélice alfa y las formadoras de hélice alfa ("regiones alfa"), las regiones de lámina beta y las formadoras de lámina beta ("regiones beta"), las regiones de giro y las formadoras de giro ("regiones de giro") y las regiones en espiral y formadoras de espiral ("regiones en espiral"), regiones hidrófilas, regiones hidrófobas, regiones alfa-anfipáticas, regiones beta-anfipáticas, regiones flexibles, regiones formadoras de superficie y regiones de alto índice antigénico de OAP.

Ciertas regiones preferidas en este sentido se muestran en la Figura 3, e incluyen, sin estar limitadas a las mismas, regiones de los tipos mencionados anteriormente identificadas por análisis de la secuencia de aminoácidos descrita en la Figura 1. Tal y como se muestra en la Figura 3, tales regiones preferidas incluyen las regiones alfa, las regiones beta, las regiones de giro y las regiones en espiral Garnier-Robson, las regiones alfa, las regiones beta y las regiones de giro Chou-Fasman, las regiones hidrófilas Kyte-Doolittle, las regiones alfa y beta anfipáticas Eisenberg, las regiones flexibles Karplus-Schulz, las regiones formadoras de superficie Emini y las regiones de alto índice antigénico Jameson-Wolf.

Los polipéptidos y los polinucleótidos de la presente invención se proporcionan preferentemente en forma aislada y preferentemente se purifican hasta homogeneidad.

El término "aislado" significa que el material se retira de su entorno original (p. ej., el entorno natural si está presente en la naturaleza). Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido presente en la naturaleza, en un animal vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido o polipéptido, separado de alguno o de todos los materiales coexistentes en el sistema natural, está aislado. Tales polinucleótidos pueden formar parte de un vector y/o tales polinucleótidos o polipéptidos pueden formar parte de una composición e incluso estar aislados si dicho vector o composición no forma parte de su entorno natural

Los polipéptidos de la presente invención incluyen el polipéptido de SEQ ID NO:2 (en particular el polipéptido maduro) así como polipéptidos que tienen una similitud de al menos 80% (preferentemente una identidad de al menos 80%) con el polipéptido de SEQ ID NO:2 y más preferentemente una similitud de al menos 90% (más preferentemente una identidad de al menos 90%) con el polipéptido de SEQ ID NO:2 y aún más preferentemente una similitud de al menos 95% (aún más preferentemente una identidad de al menos 95%) con el polipéptido de SEQ ID NO:2 y también incluye porciones de tales polipéptidos conteniendo dicha porción del polipéptido generalmente al menos 30 aminoácidos y más preferentemente al menos 50 aminoácidos.

Tal y como se conoce en la técnica, la "similitud" entre dos polipéptidos se determina comparando la secuencia de aminoácidos y sus aminoácidos sustitutos conservados de un polipéptido, con la secuencia de un segundo polipéptido.

Los fragmentos o las porciones de los polipéptidos de la presente invención se pueden emplear para producir el polipéptido correspondiente de longitud completa mediante síntesis peptídica; por ello, los fragmentos se pueden emplear como intermediarios para producir los polipéptidos de longitud completa. Los fragmentos o las porciones de los polinucleótidos de la presente invención se pueden utilizar para sintetizar polinucleótidos de longitud completa de la presente invención.

La presente invención también se refiere a vectores según la reivindicación 5, que incluyen polinucleótidos de la presente invención, a células hospedadoras que se preparan por ingeniería genética con vectores de la invención y a la producción de polipéptidos de la invención mediante técnicas recombinantes.

Las células hospedadoras de acuerdo con la reivindicación 7, se preparan por ingeniería genética (transducidas o transformadas o transfectadas) con los vectores de esta invención que pueden ser, por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de un plásmido, una partícula vírica, un fago, etc. Las células hospedadoras sometidas a ingeniería genética se pueden cultivar en medios nutrientes convencionales, modificados tal y como sea adecuado para activar los promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes de la presente invención. Las condiciones del cultivo, tales como la temperatura, el pH y similares son las empleadas previamente en la célula hospedadora seleccionada para la expresión y serán evidentes para el experto ordinario en la técnica.

Los polinucleótidos de la presente invención se pueden emplear para producir polipéptidos mediante técnicas recombinantes. Por tanto, por ejemplo, el polinucleótido puede estar incluido en uno cualquiera entre una variedad de vectores de expresión para expresar un polipéptido. Tales vectores incluyen secuencias de ADN cromosómicas, no cromosómicas y sintéticas, p. ej., derivados de SV40; plásmidos bacterianos; ADN de fagos; baculovirus; plásmidos de levadura; vectores obtenidos a partir de combinaciones de plásmidos y ADN de fagos, ADN vírico tal como el de virus vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar y el virus de la seudo rabia. Sin embargo, se puede utilizar cualquier otro vector siempre que sea replicable y viable en el hospedador.

La secuencia adecuada de ADN se puede insertar en el vector según una variedad de procedimientos. En general, la secuencia de ADN se inserta en un(os) sitio(s) adecuado(s) para endonucleasa de restricción mediante procedimientos conocidos en la técnica. Tales procedimientos y otros están al alcance de los expertos en la técnica.

La secuencia de ADN en el vector de expresión está ligada funcionalmente a una(s) secuencia (s) adecuada(s) de control de la expresión (promotor) para dirigir la síntesis del ARNm. Como ejemplos representativos de tales promotores, se pueden mencionar: el promotor de LTR o de SV40, E. coli, lac o trp, el promotor P_{L} del fago lambda y otros promotores conocidos para controlar la expresión de genes en células procariotas y eucariotas o sus virus. El vector de expresión también contiene un sitio de unión al ribosoma para la iniciación de la traducción y un terminador de la transcripción. El vector también puede incluir las secuencias adecuadas para amplificar la expresión.

Además, los vectores de expresión contienen preferentemente uno o varios genes de marcadores seleccionables, para proporcionar un rasgo fenotípico para seleccionar células hospedadoras transformadas, tales como la reductasa de dihidrofolato o la resistencia a neomicina para el cultivo de células eucariotas o la resistencia a tetraciclina o a ampicilina en E. coli.

El vector que contiene la secuencia de ADN adecuada tal y como se ha descrito anteriormente, así como un promotor adecuado o una secuencia de control, se puede emplear para transformar un hospedador adecuado para permitir que el hospedador exprese la proteína.

Como ejemplos representativos de hospedadores adecuados se pueden mencionar: células bacterianas, tales como E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium, células de hongos, tales como levadura; células de insectos, tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células animales, tales como CHO, COS o melanoma de Bowes; células vegetales, etc. La selección de un hospedador adecuado está al alcance de los expertos en la técnica, a partir de las enseñanzas de esta memoria.

Más particularmente, la presente invención también incluye estructuras artificiales recombinantes que comprenden una o varias de las secuencias tal y como se ha descrito ampliamente arriba. Las estructuras artificiales comprenden un vector, tal como un plásmido o un vector vírico, en el que se ha insertado una secuencia de la invención, con orientación hacia delante o inversa. En un aspecto preferido de esta realización, la estructura artificial comprende adicionalmente secuencias reguladoras que incluyen por ejemplo, un promotor, ligado funcionalmente a la secuencia. Los expertos en la técnica conocen muchos vectores y promotores adecuados y están a disposición comercial. Los siguientes vectores se proporcionan a modo de ejemplo; bacterianos: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBS, pD10, phagescript, psiX174, pBluescript SK, pBSKS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene); pTRC99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia); eucarióticos: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). Sin embargo, se puede utilizar cualquier otro plásmido o vector mientras que sea replicable y viable en el hospedador.

Las regiones promotoras se pueden seleccionar a partir de cualquier gen deseado empleando vectores CAT (transferasa de cloramfenicol) u otros vectores con marcadores seleccionables. Dos vectores adecuados son pKK232-8 y pCM7. Promotores bacterianos mencionados en particular son lacI, lacZ, T3, T7, gpt, lambda P_{R}, P_{L} y trp. Los promotores eucarióticos incluyen el temprano inmediato de CMV, la quinasa de timidina de HSV, el SV40 temprano y tardío, las LTRs de retrovirus y la metalotioneína -I de ratón. La selección del vector y del promotor adecuados es bien conocida por el experto en la técnica.

En otra realización, la presente invención se refiere a células hospedadoras que contienen las estructuras artificiales descritas anteriormente. La célula hospedadora puede ser una célula eucariótica superior, tal como una célula de mamífero o una célula eucariótica inferior, tal como una célula de levadura, o la célula hospedadora puede ser una célula procariótica, tal como una célula bacteriana. La introducción de la estructura artificial en la célula hospedadora se puede efectuar mediante transfección con fosfato cálcico, transfección mediada con DEAE-dextrano, o electroporación (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology (1986)).

Las estructuras artificiales en las células hospedadoras se pueden utilizar de forma convencional para producir el producto génico, codificado por la secuencia recombinante. Alternativamente, los polipéptidos de la invención se pueden producir sintéticamente con sintetizadores convencionales de péptidos.

Las proteínas maduras se pueden expresar en células de mamíferos, en levaduras, bacterias u otras células bajo el control de los promotores adecuados. Los sistemas de traducción exentos de células también se pueden emplear para producir tales proteínas, empleando ARNs obtenidos a partir de las estructuras artificiales de ADN de la presente invención. La clonación adecuada y los vectores de expresión para emplear con hospedadores procarióticos y eucarióticos están descritos por Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), cuya descripción se incorpora en esta memoria como referencia.

La transcripción del ADN que codifica los polipéptidos de la presente invención en eucariontes superiores se incrementa insertando una secuencia de potenciador en el vector. Los potenciadores son elementos del ADN que funcionan en cis, generalmente desde aproximadamente 10 hasta 300 pb que funcionan sobre un promotor para incrementar su transcripción. Ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación, pb 100 hasta 270, un potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicación y los potenciadores de adenovirus.

Generalmente, los vectores de expresión recombinantes incluirán orígenes de replicación y marcadores seleccionables que permiten la transformación de la célula hospedadora, p. ej., el gen de resistencia a la ampicilina de E. coli y el gen TRP1 de S. cerevisiae y un promotor obtenido a partir de un gen altamente expresado, para dirigir la transcripción de una secuencia estructural aguas abajo. Tales promotores se pueden obtener a partir de operones que codifican enzimas glicolíticas, tales como la quinasa de 3-fosfoglicerato (PGK), el factor \alpha, la fosfatasa ácida o las proteínas de choque térmico, entre otras. La secuencia estructural heteróloga se ensambla en la fase adecuada con secuencias de iniciación y de terminación de la traducción y, preferentemente, una secuencia líder capaz de dirigir la secreción de la proteína traducida al espacio periplásmico o al medio extracelular. Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar una proteína de fusión que incluye un péptido de identificación del extremo N-terminal que imparte las características deseadas, p. ej., la estabilización o la purificación simplificada del producto recombinante expresado.

Los vectores de expresión útiles para uso bacteriano se construyen insertando una secuencia de ADN estructural que codifica una proteína deseada junto con señales adecuadas de inicio y de terminación de la traducción, en fase de lectura capaces de funcionar con un promotor funcional. El vector comprenderá uno o varios marcadores seleccionables fenotípicamente y un origen de replicación para asegurar el mantenimiento del vector y para, si es deseable, proporcionar una amplificación dentro del hospedador. Los hospedadores procarióticos adecuados para la transformación incluyen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y diversas especies de los géneros seudomonas, estreptomicetos y estafilococos, aunque también se pueden escoger otras.

Como ejemplo representativo pero no limitativo, los vectores de expresión útiles para uso bacteriano pueden comprender un marcador seleccionable y un origen de replicación bacteriano obtenido a partir de plásmidos disponibles comercialmente que comprenden elementos genéticos del vector de clonación bien conocido pBR322 (ATCC 37017). Tales vectores comerciales incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, EE.UU.). Estas secciones del "elemento principal" de pBR322 se combinan con un promotor adecuado y se expresa la secuencia estructural.

Después de la transformación de una cepa hospedadora adecuada y del crecimiento de la cepa hospedadora hasta una densidad celular adecuada, el promotor seleccionado se induce por medios adecuados (p. ej., cambio de temperatura o inducción química) y las células se cultivan durante un periodo adicional.

Las células se recolectan típicamente por centrifugación, se rompen por medios físicos o químicos y los extractos en bruto resultantes se conservan para una posterior purificación.

Las células microbianas empleadas en la expresión de proteínas se pueden romper mediante cualquier método convencional, incluyendo los ciclos de congelación-descongelación, los ultrasonidos, la rotura mecánica o el uso de agentes para lisis celular, tales métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica.

Se pueden emplear diversos sistemas de cultivo de células de mamífero para expresar la proteína recombinante. Ejemplos de sistemas de expresión de mamíferos incluyen las líneas celulares COS-7 de fibroblastos de riñón de mono, descritas por Gluzman, Cell, 23:175 (1981) y otras líneas celulares capaces de expresar un vector compatible, por ejemplo, las líneas celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamíferos comprenderán un origen de replicación, un promotor y un potenciador adecuados y también cualquier sitio necesario de unión a ribosomas, sitio de poliadenilación, sitios de donante y aceptor de corte y empalme, secuencias de terminación de la transcripción y secuencias no transcritas que flanquean en 5'. Las secuencias de ADN obtenidas a partir de los sitios de corte y empalme de SV40 y de poliadenilación se pueden utilizar para proporcionar los elementos genéticos no transcritos necesarios.

El polipéptido se puede recuperar y purificar desde los cultivos de células recombinantes por métodos que incluyen la precipitación con sulfato de amonio o etanol, la extracción con ácidos, la cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, la cromatografía con fosfocelulosa, la cromatografía de interacción hidrófoba, la cromatografía de afinidad, la cromatografía en hidroxiapatito y la cromatografía de lectina. Las etapas del replegado de proteínas se pueden utilizar, cuando es necesario, para completar la configuración de la proteína madura. Finalmente, la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) se puede emplear para las etapas finales de la purificación.

Los polipéptidos de la presente invención pueden ser un producto purificado de forma natural o un producto de procedimientos sintéticos químicos o estar producidos por técnicas recombinantes a partir de un hospedador procariótico o eucariótico (por ejemplo, mediante células bacterianas, de levadura, de vegetales superiores, de insectos y de mamíferos en cultivo). Dependiendo del hospedador empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención se pueden glicosilar o pueden estar no glicosilados. Los polipéptidos de la invención también pueden incluir un residuo inicial del aminoácido metionina.

La OAP se puede emplear como agente antivírico. Más particularmente, OAP se puede emplear para tratar la pancreatitis necrotizante y la parotitis causada por diversos miembros de la familia picornavirus. Tal y como se observa en el Ejemplo 4 y en la Figura 4, OAP tiene un efecto antivírico.

Los polinucleótidos y los polipéptidos de la presente invención también se pueden emplear como reactivos en investigación y como materiales para descubrir tratamientos y diagnósticos para enfermedades humanas.

Otro antagonista potencial según la reivindicación 13, es una estructura artificial antiparalela preparada empleando la tecnología antiparalela. La tecnología antiparalela se puede utilizar para controlar la expresión génica mediante la formación de una hélice triple o ADN o ARN antiparalelo, estando ambos métodos basados en la ligación de un polinucleótido al ADN o al ARN. Por ejemplo, la parte codificante en 5' de la secuencia de polinucleótidos, que codifica los polipéptidos maduros de la presente invención, se emplea para diseñar un oligonucleótido de ARN antiparalelo de aproximadamente 10 a 40 pares de bases de longitud. Un oligonucleótido de ADN se diseña para que sea complementario a una región del gen implicado en la transcripción (triple hélice - véase, Lee y col., Nucl. Acids Res., 6:3073 (1979); Cooney y col., Science, 241:456 (1988); y Dervan y col., Science, 251:1360 (1991)), evitando de este modo la transcripción y la producción de OAP. El oligonucleótido de ARN antiparalelo se hibrida con el ARNm in vivo y bloquea la traducción de la molécula de ARNm al polipéptido OAP (Antisense - Okano, J. Neurochem., 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)). Los oligonucleótidos descritos anteriormente también se pueden entregar a células en las que el ARN o el ADN antiparalelo se pueda expresar in vivo para inhibir la producción de OAP.

Los antagonistas se pueden emplear en una composición con un vehículo farmacéuticamente aceptable, según la reivindicación 14, p. ej., tal y como se describe a continuación en esta memoria.

Los polipéptidos de la presente invención y los agonistas y los antagonistas, se pueden emplear junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido, agonistas o antagonistas, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Dicho vehículo incluye, pero no está limitado a los mismos, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. La formulación debe acomodarse al modo de administración.

La invención también proporciona un envase o un estuche farmacéutico que comprende uno o varios recipientes rellenos con uno o varios de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención. Asociado con dicho(s)
recipiente(s) puede haber una información, en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regule la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos o biológicos, reflejando dicha información que la agencia ha aprobado la fabricación, el uso o la venta para administración a humanos. Además, los polipéptidos de la presente invención o los agonistas o los antagonistas, se pueden emplear junto con otros compuestos terapéuticos.

Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar de una forma conveniente tal como la vía oral, tópica, parenteral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal o intradérmica. Las composiciones farmacéuticas se administran en una cantidad que es eficaz para tratar y/o para la profilaxis de la indicación específica. En general se administran en una cantidad de al menos aproximadamente 10 \mug/kg de peso corporal y en la mayoría de los casos, se administrarán en una cantidad que no exceda aproximadamente 8 mg/kg de peso corporal al día. En la mayoría de los casos, la dosificación es desde aproximadamente 10 \mug/kg hasta aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal diario, teniendo en cuenta las vías de administración, los síntomas, etc.

Los polipéptidos de OAP y los agonistas y antagonistas que son polipéptidos, también se pueden emplear según las reivindicaciones 15-18, expresando tales polipéptidos in vivo, a lo que frecuentemente se hace referencia como "terapia génica".

Por tanto, por ejemplo, las células de un paciente se pueden someter a ingeniería genética con un polinucleótido (ADN o ARN) que codifica un polipéptido ex vivo, proporcionando las células sometidas a ingeniería genética a un paciente que se va a tratar con el polipéptido. Tales métodos son bien conocidos en la técnica y son evidentes por las enseñanzas de esta memoria. Por ejemplo, las células se pueden someter a ingeniería genética mediante el uso de un vector plasmídico de retrovirus que contiene ARN que codifica un polipéptido de la presente invención.

De forma similar, las células se pueden someter a ingeniería genética in vivo para la expresión de un polipéptido in vivo mediante, por ejemplo, procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, una célula de encapsidación se transduce con un vector plasmídico retrovírico que contiene ARN que codifica un polipéptido de la presente invención, de modo que la célula de encapsidación produce ahora las partículas víricas infecciosas que contienen el gen de interés. Estas células productoras se pueden administrar a un paciente para someter a someter a ingeniería genética las células in vivo y para expresar el polipéptido in vivo. Estos y otros métodos para administrar un polipéptido de la presente invención mediante dicho método, deben ser evidentes para los expertos en la técnica a partir de las enseñanzas de la presente invención.

Los retrovirus a partir de los cuales se pueden obtener los vectores plasmídicos retrovíricos mencionados anteriormente, incluyen, pero sin estar limitados a los mismos, el virus de la leucemia de múridos de Moloney, el virus de la necrosis del bazo, retrovirus tales como el virus del sarcoma de Rous, el virus del sarcoma de Harvey, el virus de la leucosis aviar, el virus de la leucemia de simios gibones, el virus de la inmunodeficiencia humana, adenovirus, el virus mieloproliferativo del sarcoma y el virus de tumor mamario. En una realización, el vector plasmídico retrovírico se obtiene a partir del virus de la leucemia de múridos de Moloney.

El vector incluye uno o varios promotores. Los promotores adecuados que se pueden emplear incluyen, pero no están limitados a los mismos, la LTR retrovírica; el promotor de SV40; y el promotor de citomegalovirus humano (CMV) descrito en Miller y col., Biotechniques, vol. 7, nº 9, 980-990 (1989) o cualquier otro promotor (p. ej., promotores celulares tales como promotores de células eucarióticas que incluyen, pero no están limitados a los mismos, los promotores de la histona, de pol III y de la \beta-actina). Otros promotores víricos que se pueden emplear incluyen, pero no están limitados a los mismos, los promotores de adenovirus, los promotores de la quinasa de timidina (TK) y los promotores B19 de parvovirus. La selección de un promotor adecuado será evidente para los expertos en la técnica a partir de las enseñanzas contenidas en esta memoria.

La secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido de la presente invención está bajo el control de un promotor adecuado. Los promotores adecuados que se pueden emplear incluyen, pero no están limitados a los mismos, los promotores de adenovirus, tales como el promotor tardío principal adenovírico; o promotores heterólogos, tales como el promotor de citomegalovirus (CMV); el promotor del virus respiratorio sincitial (VRS); los promotores inducibles, tales como el promotor de MMT, el promotor de la metalotioneína; los promotores de choque térmico; el promotor de la albúmina; el promotor de ApoAI; los promotores de la globina humana; los promotores de la quinasa de timidina vírica, tales como el promotor de la quinasa de timidina del Herpes simplex; las LTRs retrovíricas (que incluyen las LTRs retrovíricas modificadas, descritas anteriormente); el promotor de la \beta-actina; y los promotores de la hormona de crecimiento humano. El promotor también puede ser el promotor natural que controla el gen que codifica el polipéptido.

El vector plasmídico retrovírico se emplea para transducir las líneas celulares de encapsidación para formar líneas celulares productoras. Ejemplos de células de encapsidación que se pueden transfectar incluyen, sin estar limitadas a las mismas, las líneas celulares PE501, PA317, \Psi-2, \Psi-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, \PsiCRE, \PsiCRIP, GP+E-86, GP+envAm12 y DAN, tal y como se describen en Miller, Human Gene Therapy, vol. 1, págs. 5-14 (1990), que se incorpora a esta memoria como referencia en su totalidad. El vector puede transducir las células de encapsidación mediante cualquier medio conocido en la técnica. Tales medios incluyen, pero no están limitados a los mismos, la electroporación, el uso de liposomas y la precipitación con CaPO_{4}. En una alternativa, el vector plasmídico retrovírico se puede encapsular en un liposoma o acoplar a un lípido y administrarlo a continuación a un hospeda-
dor.

La línea celular productora genera partículas del vector retrovírico infeccioso que incluyen la(s) secuencia(s) de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos. Tales partículas del vector retrovírico se pueden emplear a continuación para transducir células eucarióticas tanto in vitro como in vivo. Las células eucarióticas transducidas expresarán la(s) secuencia(s) de ácidos nucleicos que codifican el polipéptido. Las células eucarióticas que se pueden transducir incluyen, pero no están limitadas a las mismas, células pluripotenciales embrionarias, células de carcinoma embrionario, así como células pluripotenciales hematopoyéticas, hepatocitos, fibroblastos, mioblastos, queratinocitos, células endoteliales y células epiteliales bronquiales.

Esta invención también se relaciona con el uso del gen de la presente invención como un agente de diagnóstico. La detección de una forma mutada del gen permitirá un diagnóstico de una enfermedad o una susceptibilidad a una enfermedad, que es el resultado de la infraexpresión de OAP.

Los individuos portadores de mutaciones en el gen de la presente invención se pueden detectar a nivel de ADN mediante una variedad de técnicas. Los ácidos nucleicos para diagnóstico se pueden obtener a partir de células de un paciente que incluyen, pero no están limitadas a las mismas, sangre, orina, saliva, material tisular de biopsias y autopsias. El ADN genómico se puede utilizar directamente para la detección o se puede amplificar enzimáticamente empleando la PCR (Saiki y col., Nature, 324:163-166 (1986)) antes del análisis. El ARN o el ADNc también se puede utilizar para el mismo fin. A modo de ejemplo, los cebadores de la PCR complementarios al ácido nucleico que codifica OAP, se pueden utilizar para identificar y analizar mutaciones. Por ejemplo, las deleciones y las inserciones se pueden detectar por un cambio en el tamaño del producto amplificado, comparando con el genotipo normal. Las mutaciones puntuales se pueden identificar hibridando el ADN amplificado con ARN radiomarcado o alternativamente, secuencias de ADN antiparalelo radiomarcadas. Las secuencias perfectamente emparejadas se pueden distinguir de los dúplex desemparejados mediante una digestión con ARNasa A o por diferencias en las temperaturas de fusión.

Las diferencias entre las secuencias del gen de referencia y los genes que tienen mutaciones, se pueden revelar por el método de secuenciación directa de ADN. Además, los segmentos de ADN clonados, se pueden emplear como sondas para detectar segmentos de ADN específicos. La sensibilidad de este método está muy potenciada cuando se combina con PCR. Por ejemplo, un cebador de la secuenciación se emplea con el producto bicatenario de la PCR o una molécula molde monocatenaria generada con una PCR modificada. La determinación de la secuencia se realiza por procedimientos convencionales con nucleótidos radiomarcados o mediante procedimientos de secuenciación automática con marcas fluorescentes.

Los ensayos genéticos basados en las diferencias de la secuencia de ADN se pueden realizar por detección de una alteración en la movilidad electroforética de los fragmentos de ADN en geles, con o sin agentes desnaturalizantes. Pequeñas deleciones e inserciones en la secuencia se pueden visualizar mediante electroforesis en gel de alta resolución. Los fragmentos de ADN de secuencias diferentes se pueden distinguir sobre geles desnaturalizantes con gradiente de formamida en los que las movilidades de los diferentes fragmentos de ADN se retrasan en el gel en distintas posiciones, según sus temperaturas de fusión o de fusión parcial específicas (véase, p. ej., Myers y col., Science, 230:1242 (1985)).

Los cambios de la secuencia en posiciones específicas también se pueden revelar por ensayos de protección con nucleasas, tales como protección con ARNasa y S1 o el método de ruptura química (p. ej., Cotton y col., PNAS, USA, 85:4397-4401 (1985)).

Por tanto, la detección de una secuencia de ADN específica se puede conseguir por métodos tales como la hibridación, la protección con ARNasa, la ruptura química, la secuenciación directa del ADN o el uso de enzimas de restricción (p. ej., polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP)) y la transferencia de tipo Southern del ADN genómico.

Además de la electroforesis en gel y la secuenciación del ADN más convencionales, las mutaciones también se pueden detectar por análisis in situ.

La presente invención también se refiere a un procedimiento para diagnóstico, según la reivindicación 18, para detectar niveles alterados del polipéptido de la presente invención en diferentes tejidos, puesto que con una sobreexpresión de las proteínas comparando con las muestras de tejidos testigos normales, se puede detectar la presencia de enfermedades óseas, por ejemplo, osteoporosis. Los ensayos empleados para detectar niveles del polipéptido de la presente invención en una muestra obtenida a partir de un hospedador, son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen los radioinmunoensayos, los ensayos de ligación competitiva, los análisis de transferencia de tipo Western y preferentemente un ensayo ELISA. Un ensayo ELISA comprende inicialmente la preparación de un anticuerpo específico para el antígeno OAP, preferentemente un anticuerpo monoclonal. Además, se prepara un anticuerpo informador contra el anticuerpo monoclonal. Al anticuerpo informador se fija un reactivo detectable, tal como radiactividad, fluorescencia o en este ejemplo una enzima peroxidasa de rábano picante. A continuación se retira una muestra del hospedador y se incuba sobre un soporte sólido, p. ej., una placa de poliestireno, que se une a las proteínas en la muestra. Cualquier sitio libre de unión a proteínas sobre la placa se cubre después incubando con una proteína no específica, tal como seroalbúmina bovina. A continuación, el anticuerpo monoclonal se incuba en la placa y mientras que esto dura, los anticuerpos monoclonales se fijan a cualquiera de los polipéptidos de la presente invención fijados a la placa de poliestireno. Todos los anticuerpos monoclonales no unidos se retiran por lavado con tampón. El anticuerpo informador ligado a la peroxidasa de rábano picante se coloca entonces en la placa, dando como resultado la unión del anticuerpo informador a cualquier anticuerpo monoclonal unido al polipéptido de la presente invención. El anticuerpo informador no fijado se retira a continuación por lavado. Los sustratos de la peroxidasa se añaden entonces a la placa y la cantidad de color mostrado en un periodo de tiempo dado, es una medida de la cantidad del polipéptido de la presente invención, presente en un volumen dado de muestra del paciente, cuando se compara con una curva patrón.

Se puede emplear un ensayo competitivo en el que los anticuerpos específicos del polipéptido de la presente invención se fijan a un soporte sólido y se hace pasar la OAP marcada y una muestra obtenida a partir del hospedador, sobre el soporte sólido y la cantidad de marca detectada fijada al soporte sólido se puede correlacionar con una cantidad del polipéptido de la presente invención en la muestra.

Las secuencias de la presente invención también son valiosas para la identificación de cromosomas. La secuencia está específicamente dirigida y se puede hibridar con una posición particular en un cromosoma humano individual. Además, existe una necesidad real de identificar sitios particulares en el cromosoma. Actualmente, están disponibles pocos reactivos que marquen cromosomas, basados en datos de la secuencia real (polimorfismos repetidos) para marcar una posición cromosómica. El cartografiado de ADNs en cromosomas de acuerdo con la presente invención es una primera etapa importante en la correlación de tales secuencias con genes asociados con enfermedades.

En suma, las secuencias se pueden cartografiar en cromosomas preparando cebadores para la PCR (preferentemente, 15-25 pb) a partir del ADNc. El análisis por ordenador de la región 3' no traducida del gen, se emplea para seleccionar cebadores rápidamente que no abarquen más de un exón en el ADN genómico, complicando de este modo el proceso de amplificación. Estos cebadores se emplean entonces para escrutar con PCR los híbridos de células somáticas que contienen cromosomas humanos individuales. Sólo los híbridos que contienen el gen humano correspondiente al cebador, proporcionarán un fragmento amplificado.

El cartografiado con PCR de híbridos de células somáticas es un procedimiento rápido para asignar un ADN particular a un cromosoma particular. Empleando la presente invención con los mismos cebadores de oligonucleótidos, se puede conseguir la sublocalización con paneles de fragmentos de cromosomas específicos o con conjuntos de grandes clones genómicos de una forma análoga. Otras estrategias de cartografiado que se pueden utilizar de forma similar para cartografiar sus cromosomas incluyen la hibridación in situ, el escrutinio previo con cromosomas marcados, clasificados según el flujo y la preselección mediante hibridación para construir genotecas de ADNc específicas de cromosomas.

La hibridación in situ con fluorescencia (FISH) de un clon de ADNc con una extensión cromosomal en metafase, se puede utilizar para proporcionar una posición cromosómica precisa en una etapa. Esta técnica se puede utilizar con ADNc que tiene al menos 50 o 60 bases. Para una revisión de esta técnica, véase Verma y col., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, Nueva York (1988).

El gen de OAP de la presente invención se ha cartografiado en el cromosoma humano 1q21. Una vez que se ha cartografiado una secuencia en una posición cromosómica precisa, la posición física de la secuencia sobre el cromosoma se puede correlacionar con datos del mapa genético. Tales datos se encuentran, por ejemplo, en V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (a disposición en línea a través de la "Welch Medical Library" de la Universidad Johns Hopkins ). La relación entre los genes y las enfermedades que se han cartografiado en la misma región cromosómica, se identifican a continuación mediante análisis de ligación (co-herencia de genes físicamente adyacentes).

A continuación, es necesario determinar las diferencias en la secuencia de ADNc o genómico entre los individuos afectados y los no afectados. Si se observa una mutación en algunos o en todos los individuos afectados, pero no se observa en ningún individuo normal, entonces la mutación probablemente sea el agente causante de la enfermedad.

Con la resolución actual del cartografiado físico y de las técnicas de cartografiado genético, un ADNc localizado precisamente en una región cromosómica asociada con la enfermedad, podría ser uno entre 50 y 500 genes causantes potenciales. (Esto supone una resolución del cartografiado de 1 megabase y un gen por 20 kb).

Los polipéptidos, sus fragmentos u otros derivados o análogos de los mismos, o las células que los expresan, se pueden utilizar como un inmunógeno para producir anticuerpos de acuerdo con la reivindicación 1. Estos anticuerpos pueden ser, por ejemplo, anticuerpos policlonales o monoclonales. La presente invención también incluye anticuerpos quiméricos, monocatenarios y humanizados, así como fragmentos Fab o el producto de una genoteca de expresión de Fab. Se pueden utilizar diversos procedimientos conocidos en la técnica para la producción de tales anticuerpos y fragmentos.

Los anticuerpos generados contra los polipéptidos que se corresponden con una secuencia de la presente invención, se pueden obtener mediante inyección directa de los polipéptidos en un animal o administrando los polipéptidos a un animal, preferentemente uno que no sea humano. El anticuerpo así obtenido se unirá a continuación al polipéptido por sí mismo. De este modo, incluso una secuencia que codifica sólo un fragmento de los polipéptidos, se puede utilizar para generar anticuerpos que se unen a todos los polipéptidos naturales. Tales anticuerpos se pueden utilizar a continuación para aislar el polipéptido del tejido que expresa este polipéptido.

Para la preparación de anticuerpos monoclonales, se puede utilizar cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos por cultivos continuos de líneas celulares. Los ejemplos incluyen la técnica del hibridoma (Kohler y Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de linfocito B humano (Kozbor y col., 1983, Immunology Today, 4:72) y la técnica de EBV-hibridoma para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole y col., 1985, en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. págs. 77-96).

Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (documento de patente de EE.UU. nº 4.946.778) se pueden adaptar para producir anticuerpos de cadena sencilla para productos inmunogénicos de polipéptidos de esta invención. También los ratones transgénicos se pueden utilizar para expresar anticuerpos humanizados para los productos inmunogénicos de los polipéptidos de esta invención.

La presente invención se describe adicionalmente haciendo referencia a los siguientes ejemplos, sin embargo, se debe tomar nota de que la presente invención no está limitada a dichos ejemplos. Todas las partes o cantidades, a no ser que se indique de otro modo, son en peso.

Para facilitar la comprensión de los siguientes ejemplos, se describirán ciertos métodos y/o términos que están presentes frecuentemente.

Los "plásmidos" se designan con una letra p minúscula precedida y/o seguida de letras mayúsculas y/o números. Los plásmidos de partida en esta memoria están disponibles comercialmente, están disponibles al público en una base sin restricciones o se pueden construir a partir de plásmidos disponibles según procedimientos publicados. Además, se conocen en la técnica plásmidos equivalentes a los descritos y será evidente para los expertos.

La "digestión" de ADN se refiere a la rotura catalítica del ADN con una enzima de restricción que actúa sólo en ciertas secuencias en el ADN. Las diversas enzimas de restricción empleadas en esta memoria están a disponibles comercialmente y sus condiciones de reacción, sus cofactores y otros requerimientos se emplearon tal y como se conocen en la técnica. Para fines analíticos, se emplea típicamente 1 \mug de plásmido o de fragmento de ADN con aproximadamente 2 unidades de enzima en aproximadamente 20 \mul de solución tampón. Para aislar fragmentos de ADN para la construcción de plásmidos, se digieren típicamente 5 a 50 \mug de ADN con 20 a 250 unidades de enzima en un volumen mayor. Los tampones adecuados y las cantidades de sustrato para las enzimas de restricción particulares son especificados por el fabricante. El tiempo de incubación de aproximadamente 1 hora a 37ºC se emplea generalmente, pero puede variar de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la digestión, la reacción se somete directamente a electroforesis sobre un gel de poliacrilamida para aislar el fragmento deseado.

La separación por tamaños de los fragmentos escindidos se realiza empleando gel de poliacrilamida al 8 por ciento descrito por Goeddel, D. y col., Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980).

"Oligonucleótidos" se refiere a un polidesoxinucleótido monocatenario o a dos hebras complementarias de polidesoxinucleótidos que se pueden sintetizar químicamente. Tales oligonucleótidos sintéticos no tienen 5' fosfato y, por tanto, no se ligan con otro oligonucleótido sin añadir un fosfato con un ATP en presencia de una quinasa. Un oligonucleótido sintético se ligará con un fragmento que no se ha desfosforilado.

La "ligación" se refiere al procedimiento de formación de enlaces fosfodiéster entre dos fragmentos de ácido nucleico bicatenarios (Maniatis T. y col., mencionado antes, pág. 146). A no ser que se indique de otro modo, la ligación se puede realizar empleando tampones conocidos con 10 unidades de ligasa T4 de ADN ("ligasa") por 0,5 \mug de cantidades aproximadamente equimolares de los fragmentos de ADN que se van a ligar.

A no ser que se indique de otro modo, la transformación se realizó tal y como se ha descrito en el método de Graham, F. y Van der Eb, A., Virology, 52:456-457 (1973).

Ejemplo 1 Clonación y expresión de OAP empleando el sistema de expresión de baculovirus

La secuencia de ADN que codifica la proteína OAP de longitud completa, ATCC nº 97302, se amplificó empleando cebadores de oligonucleótidos para PCR correspondientes a las secuencias 5' y 3' del gen.

El cebador 5' tiene la secuencia 5'CGGGATCCGCCATCATGGGGACCACAGCCAG 3' (SEQ ID NO:3) y contiene un sitio para la enzima de restricción de BamHI (en negrita) seguido de nucleótidos que se parecen a una señal eficaz para la iniciación de la traducción en células eucarióticas (Kozak, M., J. Mol. Biol., 196:947-950 (1987) justo delante del codón de iniciación de la traducción "ATG" (subrayado).

El cebador 3' tiene la secuencia 5'GCTCTAGATCCAAGAGGTGTTTAGTG 3' (SEQ ID NO:4) y contiene el sitio de corte de la endonucleasa de restricción XbaI y 18 nucleótidos complementarios a la secuencia 3' no traducida. Las secuencias amplificadas se aislaron de un gel de agarosa al 1% empleando un equipo de reactivos disponible comercialmente ("Geneclean", BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.). El fragmento se digirió a continuación con las endonucleasas BamHI y XbaI y después se purificó de nuevo sobre un gel de agarosa al 1%. Este fragmento se denomina F2.

El vector pA2 (modificación del vector pVL941, descrito a continuación) se emplea para la expresión de la proteína OAP empleando el sistema de expresión de baculovirus (para una revisión, véase: Summers, M.D. y Smith, G.E. 1987, A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin nº 1555). Este vector de expresión contiene el promotor fuerte de la poliedrina del virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (VPNAcM) seguido de los sitios de reconocimiento para las endonucleasas de restricción BamHI y XbaI. El sitio de poliadenilación del virus de simios (SV)40 se emplea para una poliadenilación eficaz. Para una selección cómoda del virus recombinante, el gen de la beta- galactosidasa de E. coli, se inserta con la misma orientación que el promotor de poliedrina, seguido por la señal de poliadenilación del gen de poliedrina. Las secuencias de la poliedrina están flanqueadas en ambos lados por secuencias víricas para la recombinación homóloga mediada por células con el ADN vírico de tipo silvestre cotransfectado. Se pueden emplear muchos otros vectores de baculovirus en lugar de pA2, tales como pAc373, pVL941 y pAcIM1 (Luckow, V.A. y Summers, M.D., Virology, 170:31-39).

El plásmido se digirió con las enzimas de restricción BamHI y XbaI y a continuación se desfosforiló empleando fosfatasa intestinal de ternera, mediante procedimientos conocidos en la técnica. El ADN se aisló a continuación a partir de un gel de agarosa al 1%, empleando el equipo de reactivos disponible comercialmente ("Geneclean" BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.). Este vector de ADN se denominó V2.

El fragmento F2 y el plásmido desfosforilado V2 se ligaron con la ligasa T4 de ADN. Las células de E. coli HB101 se transformaron a continuación y se identificaron las bacterias que contenían el plásmido (pBacOAP) con el gen OAP, empleando las enzimas BamHI y XbaI. La secuencia del fragmento clonado se confirmo por secuenciación del
ADN.

Se cotransfectaron 5 \mug del plásmido pBacOAP con 1,0 \mug de un baculovirus linealizado a disposición comercial ("BaculoGold® baculovirus DNA", Pharmingen, San Diego, CA.), empleando el método de la lipofección (Felgner y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413-7417 (1987)).

Se mezcló 1 \mug de ADN del virus BaculoGold® con 5 \mug del plásmido pBacOAP en un pocillo estéril de una placa de microtitulación que contenía 50 \mul de medio Grace exento de suero (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD). Después se añadieron 10 \mul de Lipofectina más 90 \mul de medio Grace, se mezcló y se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, la mezcla de transfección se añadió gota a gota a las células Sf9 de insecto (ATCC CRL 1711) sembradas en una placa de cultivo de tejidos de 35 mm con 1 ml de medio Grace sin suero. La placa se sacudió hacia delante y hacia atrás para mezclar la disolución recientemente añadida. La placa se incubó después durante 5 horas a 27ºC. Después de 5 horas, la disolución de la transfección se retiró de la placa y se añadió 1 ml de medio de insecto de Grace suplementado con 10% de suero de ternera fetal. La placa se devolvió al interior del incubador y se continuó cultivando a 27ºC durante cuatro días.

Después de cuatro días, se recogió el material sobrenadante y se realizó un ensayo en placa similar al descrito por Summers y Smith (véase arriba). Como modificación, se empleó un gel de agarosa con "Blue Gal" (Life Technologies Inc., Gaithersburg), el cual permitía un aislamiento cómodo de las placas teñidas de azul. (Una descripción detallada de un "ensayo en placa" también se puede encontrar en la guía del usuario para el cultivo de células de insecto y baculovirología, distribuida por Life Technologies Inc., Gaithersburg, páginas 9-10).

Cuatro días después de la dilución en serie, el virus se añadió a las células y las placas teñidas de azul se seleccionaron con la punta de una pipeta Eppendorf. El agar que contenía los virus recombinantes se resuspendió a continuación en un tubo Eppendorf que contenía 200 \mul de medio Grace. El agar se retiró con una breve centrifugación y el material sobrenadante que contenía el baculovirus recombinante se empleó para infectar células Sf9 sembradas en placas de 35 mm. Cuatro días después se recolectó el material sobrenadante de estas placas de cultivo y se almacenó a 4ºC.

Las células Sf9 se dejaron crecer en medio Grace suplementado con FBS al 10% termoinactivado. Las células se infectaron con el baculovirus recombinante V-OAP con una multiplicidad de infección (MOI) de 2. Seis horas más tarde, se retiró el medio y se sustituyó con medio SF900 II menos metionina y cisteína (Life Technologies Inc., Gaithersburg). Cuarenta y dos horas después, se añadieron 5 \muCi de ^{35}S-metionina y 5 \muCi de ^{35}S-cisteína (Amersham). Las células se incubaron adicionalmente durante 16 horas antes de recolectarlas por centrifugación y las proteínas marcadas se visualizaron mediante SDS-PAGE y autorradiografía.

El material sobrenadante (1000 ml) que contenía OAP expresada por baculovirus se aplicó sin dilución a una columna HS-50 (1,0 x 10 cm, perseptive Biosystems) equilibrada con Bis-Tris 0,02 M, pH 6,0, que contenía glicerol al 10% y NaCl 0,02 M (Disolvente A) con un caudal de 8 ml/min. Las proteínas se eluyeron a continuación empleando un gradiente desde 10% de Disolvente B (Disolvente A que contenía NaCl 2 M) hasta 30% de B. El pico reunido contenía 11 mg de OAP que tenía una pureza superior a 80%.

Ejemplo 2 Expresión de OAP recombinante en células COS

La expresión del plásmido, OAP HA se consigue a partir de un vector pcDNAI/Amp (Invitrogen) que contenía: 1) el origen de replicación de SV40, 2) el gen de resistencia a la ampicilina, 3) el origen de replicación de E. coli, 4) el promotor de CMV seguido de una región polienlazadora, un intrón de SV40 y un sitio de poliadenilación. Un fragmento de ADN que codifica el precursor completo de OAP y una marca HA fusionada en marco de lectura con su extremo 3', se clonó en la región polienlazadora del vector, con lo que la expresión de la proteína recombinante está bajo la dirección del promotor de CMV. La marca HA se corresponde con un epítopo obtenido a partir de la proteína hemaglutinina de la gripe, tal y como se ha descrito previamente (I. Wilson, H. Niman, R. Heighten, A. Cherenson, M. Connolly y R. Lerner, 1984, Cell, 37:767 (1984)). La infusión de la marca HA a la proteína diana permite una detección cómoda de la proteína recombinante con un anticuerpo que reconoce el epítopo de HA.

La estrategia de construcción del plásmido se describe del modo siguiente:

La secuencia de ADN que codifica OAP, ATCC nº 97302, se construyó con PCR, empleando dos cebadores: el cebador 5' 5'GCGCGGATCCACCATGGGGACCACAGCCAGA 3' (SEQ ID NO:5) contiene un sitio BamHI seguido de 18 nucleótidos de la secuencia que codifica OAP comenzando por el codón de iniciación; la secuencia 3' 5'GCGCTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTATTCTTCCTTGGGCTC3' (SEQ ID NO:6) contiene secuencias complementarias a un sitio XbaI, el codón de detención de la traducción, la marca HA y los 15 últimos nucleótidos de la secuencia codificadora de OAP (sin incluir el codón de detención). Por tanto, el producto de la PCR contiene un sitio BamHI, una secuencia codificadora de OAP seguida de una marca HA fusionada en marco de lectura, un codón de detención de terminación de la traducción, siguiendo a la marca HA y un sitio XbaI. El fragmento de ADN amplificado con la PCR y el vector, pcDNAI/Amp, se digirieron con las enzimas de restricción BamHI y XbaI y se ligaron. La mezcla de ligación se transformó en la cepa de E. coli SURE (a disposición en Stratagene Cloning Systems, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037), el cultivo transformado se extendió sobre placas con medio con ampicilina y se seleccionaron las colonias resistentes. El ADN plasmídico se aisló a partir de transformantes y se examinó mediante análisis de restricción en busca de la presencia del fragmento correcto. Para la expresión de la OAP recombinante, se transfectaron células COS con el vector de expresión por el método DEAE-Dextrano (J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989)). La expresión de la proteína HA de OAP se detectó por radiomarcación y el método de inmunoprecipitación (E. Harlow, D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; (1988)). Las células se marcaron durante 8 horas con ^{35}S-cisteína, dos días después de la transfección. Los medios de cultivo se recogieron a continuación y las células se lisaron con detergente (tampón RIPA NaCl 150 mM, NP-40 1%, SDS 1%, NP-40 1%, DOC 0,5%, Tris 50 mM, pH 7,5) (Wilson, I., y col., mencionado anteriormente, 37:767 (1984)). El material del lisado celular y los medios de cultivo se precipitaron con un anticuerpo monoclonal específico de HA. Las proteínas precipitadas se analizaron sobre geles de SDS-PAGE al 15%.

Ejemplo 3 Expresión mediante terapia génica

Los fibroblastos se obtienen a partir de un individuo mediante biopsia de la piel. El tejido resultante se coloca en un medio de cultivo para tejidos y se separa en pequeñas partes. Se colocan pedazos pequeños del tejido se colocan sobre una superficie húmeda de un matraz para cultivo de tejidos, aproximadamente se colocan diez pedazos en cada matraz. El matraz se pone boca arriba y boca abajo, se sella firmemente y se deja a temperatura ambiente durante una noche. Después de 24 horas a temperatura ambiente, el matraz se invierte y los pedazos de tejido se quedan fijos en la base del matraz y se añade medio de nuevo aporte (p. ej., medio F12 de Ham con 10% de FBS, penicilina y estreptomicina). Este se incuba a continuación a 37ºC durante aproximadamente una semana. En ese momento, se añade medio de nuevo aporte y se cambia subsecuentemente cada varios días. Después de dos semanas más en cultivo, emerge una monocapa de fibroblastos. La monocapa se tripsiniza y se disemina en matraces mayo-
res.

pMV-7 (Kirschmeier, P.T. y col., DNA, 7:219-25 (1988) flanqueado por las repeticiones terminales largas del virus del sarcoma de múridos de Moloney, se digiere con EcoRI y HindIII y se trata posteriormente con fosfatasa intestinal de ternera. El vector lineal se fracciona sobre gel de agarosa y se purifica empleando perlas de vidrio.

El ADNc que codifica un polipéptido de la presente invención se amplifica empleando cebadores de PCR que se corresponden con las secuencias de los extremos 5' y 3', respectivamente. El cebador 5' que contiene un sitio EcoRI y el cebador 3' incluye adicionalmente un sitio HindIII. Cantidades iguales del elemento principal lineal del virus del sarcoma de múridos de Moloney y el fragmento amplificado EcoRI y HindIII, se añaden juntos, en presencia de ligasa T4 de ADN. La mezcla resultante se mantiene bajo condiciones adecuadas para la ligación de los dos fragmentos. La mezcla de ligación se emplea para transformar bacterias HB101, que se colocan después sobre agar que contiene kanamicina para confirmar que el vector tenía el gen de interés insertado de forma adecuada.

Las células pA317 anfotróficas o GP-am12 de encapsidación se dejan crecer en cultivo de tejidos hasta densidad confluente en medio Eagle modificado con Dulbecco (DMEM) con 10% de suero de ternera (CS), penicilina y estreptomicina. El vector MSV que contiene el gen se añade a continuación al medio y las células de encapsidación se transducen con el vector. Las células de encapsidación producen ahora partículas víricas infecciosas que contienen el gen (las células de encapsidación se denominan ahora células productoras).

Se añade medio de nuevo aporte a las células productoras transducidas y subsecuentemente, se cosecha el medio desde una placa de 10 cm de células productoras confluentes. El medio agotado que contiene las partículas víricas infecciosas, se filtra a través de un filtro Millipore para retirar las células productoras desprendidas y este medio se emplea a continuación para infectar células fibroblastos. El medio se retira de una placa subconfluente de fibroblastos y se sustituye rápidamente con el medio de las células productoras. Este medio se retira y se sustituye con medio de nuevo aporte. Si el título del virus es alto, entonces virtualmente todos los fibroblastos estarán infectados y no será necesaria una selección. Si el título es muy bajo, entonces es necesario emplear un vector retrovírico que tenga un marcador seleccionable, tal como neo o his.

A continuación, los fibroblastos sometidos a ingeniería genética se inyectan en el hospedador, de forma aislada o después de haber crecido hasta confluencia sobre perlas microsoportes cytodex 3. Los fibroblastos producen ahora el producto proteico.

Ejemplo 4 Efecto antivírico de OAP

Diversos miembros de la familia picornavirus producen pancreatitis aguda necrosante y parotitis en ratones (Barger, M.T. y Craighead, J.E., 1991; Babu, P.G., Huber, S.A. Craighead, J.E., 1986; Blay, R., Simpson K., Leslie, K. y Huber, S.A. 1989; Campbell, I.L. y col., 1985). La patogénesis real de los cambios inducidos por los virus no se conoce; aunque se asume generalmente que están implicados mecanismos inmunopatógenos (Barger, M.T. y Craighead, J.E., 1991). Un efecto protector contra una posterior infección con EMCV se ha mostrado en ratones (Burger, M.T. y Craighead, J.E., 1991). El presente experimento muestra el efecto antivírico del tratamiento con OAP sobre el curso de la infección con EMCV en el ratón empleando métodos similares.

Ratones

Ratones A/J machos, de 8 a 10 semanas de edad, comprados al laboratorio Jackson (Bar Harbor ME) se mantuvieron en grupos enjaulados de 10 animales a temperatura ambiente, con periodos alternos de 12 horas de luz y oscuridad. Los animales tenían acceso a comida y bebida a discreción. No había disposiciones especiales sobre la dieta.

Virus

La cepa de la variante E de EMCV se obtuvo de la ATCC (Rockville, Maryland) y se multiplicó en células L929 mediante infección directa. Los títulos víricos del material sobrenadante de las placas se sometieron a ensayo en células L929 y los valores de TCID50 se calcularon tal y como se ha descrito anteriormente.

Protocolo de la infección

Antes de realizar los experimentos de protección, se determinó la dosis requerida de EMCV para matar al 50% de los animales ("LD50"). Típicamente, la infección con EMCV mata los animales a los siete o diez días. Diez unidades infecciosas de EMCV empleadas en estos experimentos eran eficaces para matar 50% de los animales el día siete. Para determinar las dosis óptimas de IFN-gamma e interferón alfa:beta de múridos, para conseguir una protección contra los efectos patológicos inducidos por EMCV, se trataron previamente grupos de diez animales puestos en la misma jaula, cada animal, con 1000 unidades de IFN-gamma o mezcla de interferón alfa:beta de múridos, seguido de inoculación intraperitoneal (i.p.) con 10 unidades infecciosas de EMCV en solución salina equilibrada con Hank (HBSS). De forma paralela, se trataron previamente números por duplicado de animales del mismo modo con solución salina o con aproximadamente 500 unidades equivalentes a IFN de OAP, seguido de inoculación de EMCV 24 horas después. Los animales se observaron 10 días después en busca de señales de patología relacionada con EMCV.

Análisis

La Figura 4 describe gráficamente los efectos de la exposición a EMCV sobre cada grupo de ratones. Este gráfico de la cantidad de ratones supervivientes en cada grupo, los días 1-10 después de la exposición a EMCV, muestra tanto los ratones protegidos con OAP frente a EMCV como con IFN de múridos. Todos los ratones tratados con cualquier dosis de OAP y los tratados con mIFN, sobreviven más del día 10, mientras que los ratones inyectados de forma simulada, murieron.

Son posibles numerosas modificaciones y variaciones de la presente invención, de cara a las enseñanzas anteriores y, por ello, dentro del alcance de las reivindicaciones anejas, la invención se puede poner en práctica de una forma distinta a la descrita en particular.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: NI, Jian

\hskip3.9cm

DILLON, Patrick J.

\hskip3.9cm

Gentz, Reiner L.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TITULO DE LA INVENCIÓN: Osteoproteína antivírica

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 7

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: Carella, Byrne, Bain, Gilfillan, Cecchi, Stewart & Olstein

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 6 Becker Farm Road

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Roseland

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: NJ

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 07068-1739

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: Compatible con PC IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERADOR: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release nº 1.0, Versión nº 1.30

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Ferraro, Gregory D

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE INSCRIPCIÓN: 36.134

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

REFERENCIA/NÚMERO DE ORDEN: 325800-486

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 201-994-1700

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 201-994-1744

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1816 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 82..1701

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

\vskip1.000000\baselineskip

1

2

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 540 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

\vskip1.000000\baselineskip

3

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGGATCCGC CATCATGGGG ACCACAGCCA G

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTCTAGATC CAAGAGGTGT TTAGTG

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGCGGATCC ACCATGGGGA CCACAGCCAG A

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 55 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGCTCTAGA TCAAGCGTAG TCTGGGACGT CGTATGGGTA TTCTTCCTTG GGCTC

\hfill

55

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 559 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:

\vskip1.000000\baselineskip

5

6

Claims (18)

1. Un polinucleótido seleccionado entre el grupo consistente en

(a) polinucleótidos que codifican al menos la forma madura del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos deducida tal y como se describe en SEQ ID NO:2;

(b) polinucleótidos que codifican un polipéptido que comprende los aminoácidos 20 a 540 de SEQ ID NO:2;

(c) polinucleótidos que codifican un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 540 de SEQ ID NO:2;

(d) polinucleótidos que tienen la secuencia codificadora tal y como se describe en SEQ ID NO:1 que codifican al menos la forma madura del polipéptido;

(e) polinucleótidos que comprenden los nucleótidos 82 a 1701 descritos en SEQ ID NO:1;

(f) polinucleótidos que comprenden los nucleótidos 139 a 1701 descritos en SEQ ID NO:1;

(g) polinucleótidos que codifican el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de al menos la forma madura del polipéptido codificado por el ADNc contenido en ATCC 97302;

(h) polinucleótidos que tienen la secuencia codificadora del ADNc contenido en ATCC 97302 que codifica al menos la forma madura del polipéptido;

(i) polinucleótidos que tienen la secuencia codificadora del ADNc contenido en ATCC 97302;

(j) polinucleótidos que codifican un primer polipéptido que es idéntico al menos un 80% a un segundo polipéptido codificado por un polinucleótido de uno cualquiera de los apartados (a) hasta (h), en donde dicho primer polipéptido tiene actividad antivírica contra EMCV; y

(k) polinucleótidos cuya hebra complementaria se hibrida y es idéntico al menos un 85% a un polinucleótido tal y como se ha definido en uno cualquiera de los apartados (a) hasta (h), en donde dichos polinucleótidos codifican un polipéptido que tiene actividad antivírica contra EMCV;

o la hebra complementaria de dicho polinucleótido.

2. El polinucleótido según la reivindicación 1, que es ADN.

3. El ADN según la reivindicación 2, que es ADN genómico.

4. El polinucleótido según la reivindicación 1, que es ARN.

5. Un vector que contiene el polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. El vector según la reivindicación 5, en el que el polinucleótido está ligado funcionalmente a secuencias de control de la expresión que permiten la expresión en células hospedadoras procarióticas o eucarióticas.

7. Una célula hospedadora que contiene el vector de la reivindicación 5 o 6.

8. Un procedimiento para producir un polipéptido codificado por el polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende: cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 7 y recuperar dicho polipéptido codificado por dicho polinucleótido del cultivo.

9. Un procedimiento para producir células capaces de expresar un polipéptido codificado por el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende células diseñadas por ingeniería genética con el vector de la reivindicación 5 o 6.

10. Un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o que es obtenible por el procedimiento de la reivindicación 8.

11. Un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido según la reivindicación 10, que tiene actividad antivírica contra EMCV.

12. Una molécula de ácido nucleico que se hibrida específicamente con un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y que es idéntica al menos un 90% a dicho polinucleótido.

13. Un antagonista/inhibidor del receptor del polipéptido según la reivindicación 10, en donde el antagonista/inhibidor es un ADN o ARN antiparalelo que se hibrida específicamente con un polinucleótido y que es idéntico al menos un 90% a este polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o un anticuerpo específico del polipéptido según la reivindicación 10.

14. Una composición farmacéutica que comprende el polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el polipéptido según la reivindicación 10, o un ADN que codifica y que es capaz de expresar dicho polipéptido in vivo o el antagonista/inhibidor según la reivindicación 13, y opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable.

15. Una composición de diagnóstico, que comprende el polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 12 o el anticuerpo según la reivindicación 11.

16. Uso del polipéptido según la reivindicación 10, el polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o el vector según la reivindicación 5 o 6, para la preparación de una composición farmacéutica para tratar una enfermedad causada por la infección con un virus.

17. Un procedimiento para diagnosticar una enfermedad o una susceptibilidad a una enfermedad relacionada con el polipéptido según la reivindicación 10, que comprende determinar ex vivo una mutación en una secuencia de ácidos nucleicos que codifica dicho polipéptido.

18. Un procedimiento de diagnóstico, que comprende analizar la presencia del polipéptido según la reivindicación 10, en una muestra obtenida a partir de un hospedador.