ES2264564T3 - Factor de crecimiento htter36. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION EXPONE POLIPEPTIDOS DEL FACTOR DE CRECIMIENTO HTTER36 Y POLINUCLEOTIDOS QUE CODIFICAN TALES POLIPEPTIDOS. SE PROPORCIONA IGUALMENTE UN PROCEDIMIENTO PARA LA PRODUCCION DE DICHOS POLIPEPTIDOS POR TECNICAS RECOMBINANTES ASI COMO USOS TERAPEUTICOS DE LOS POLIPEPTIDOS, QUE INCLUYEN LA ESTIMULACION DEL CRECIMIENTO Y DIFERENCIACION CELULARES, LA OSTEOFORMACION Y LA CURACION DE HERIDAS. SE REVELAN IGUALMENTE ANTAGONISTAS CONTRA DICHO POLIPEPTIDO Y SU USO COMO TERAPIA PARA EL TRATAMIENTO DE NEOPLASIAS Y PARA PREVENIR LA FORMACION DE MOLECULAS DE MATRIZ EXTRACELULAR EN EL HIGADO Y EL PULMON. SE EXPONEN IGUALMENTE ENSAYOS DIAGNOSTICOS PARA DETECTAR NIVELES ALTERADOS DEL POLIPEPTIDO DE LA PRESENTE INVENCION Y MUTACIONES EN LA SECUENCIA DEL ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICAN LOS POLIPEPTIDOS DE LA PRESENTE INVENCION.

Description

Factor de crecimiento HTTER36.

Este invento se refiere a polinucleótidos recién identificados, polipéptidos codificados por dichos polinucleótidos, el uso de dichos polinucleótidos y polipéptidos, y también la producción de dichos polinucleótidos y polipéptidos. El polipéptido del presente invento ha sido supuestamente identificado como un factor de crecimiento transformante humano. Más particularmente, el polipéptido del presente invento ha sido supuestamente identificado como un miembro de la superfamilia de factores beta de crecimiento transformante, y a él se hace a veces referencia como "HTTER36". El invento también se refiere a la inhibición de la acción de dichos polipéptidos.

Este invento se refiere a unas moléculas polinucleotídicas y polipeptídicas que están estructural y funcionalmente relacionadas con el factor beta de crecimiento transformante (TGF-\beta; del inglés, transforming growth factor \beta). La familia de factores beta de crecimiento transformante, de factores de crecimiento peptídicos, incluye cinco miembros, denominados TGF-\beta1 a TGF-\beta5, todos los cuales forman homodímeros de aproximadamente 25 kDa. La familia de TGF-\beta pertenece a una superfamilia extendida y mayor de moléculas de señalización peptídicas que incluye la sustancia inhibidora mulleriana [R. L. Cate et al., Cell, 45: 685-698 (1.986)], decapentaplegic [R. W. Padgett et al., Nature, 325: 81-84 (1.987)], factores morfogénicos óseos [J. M. Wozney et al., Science, 242: 1.528-1.534 (1.988)], vg1 [D. L. Weeks y D. A. Melton, Cell, 51: 861-867 (1.987)], activinas [W. Vale et al., Nature, 321: 776-779 (1.986)] e inhibinas [A. J. Mason et al., Nature, 318: 659-663 (1.985)]. Estos factores son similares al TGF-\beta en cuanto a su estructura global pero sólo comparten aproximadamente un 25% de identidad de aminoácidos con las proteínas de TGF-\beta y entre sí. Se piensa que todas estas moléculas desempeñan importantes funciones en la modulación del crecimiento, el desarrollo y la diferenciación. La proteína del presente invento, PGF, retiene los siete restos de cisteína conservados en el dominio activo C-terminal de TGF-\beta.

El TGF-\beta fue originalmente descrito como un factor que inducía la proliferación de fibroblastos renales normales de rata en agar blando en presencia de factor de crecimiento epidérmico [A. B. Roberts et al., PNAS USA, 78: 5.339-5.343 (1.981)]. Se ha mostrado posteriormente que TGF-\beta ejerce varios efectos diferentes en una diversidad de células. Por ejemplo, el TGF-\beta puede inhibir la diferenciación de ciertas células de origen mesodérmico [J. R. Florini et al., J. Biol. Chem., 261: 16.509-16.513 (1.986)], inducir la diferenciación de otras [S. M. Seyedine et al., PNAS USA, 82: 2.267-2.271 (1.985)] e inhibir potentemente la proliferación de diversos tipos de células epiteliales (R. F. Tucker, Science, 226: 705-707 (1.984)]. Esta última actividad ha conducido a la especulación de que un papel fisiológico importante del TGF-\beta es mantener el estado de crecimiento reprimido de muchos tipos de células. En consecuencia, es más probable que las células que pierden la capacidad para responder a TGF-\beta presenten un crecimiento incontrolado y se vuelvan tumorigénicas. En realidad, ciertos tumores, tales como los retinoblastomas, carecen de receptores detectables de TGF-\beta en su superficie celular y no responden a TGF-\beta, mientras que las células correspondientes normales expresan receptores en su superficie durante su crecimiento y son fuertemente inhibidas por TGF-\beta [A. Kim Chi et al., Science, 240: 196-198 (1.988)].

Más específicamente, el TGF-\beta1 estimula el crecimiento de fibroblastos renales normales de rata, independiente del anclaje [Roberts et al., PNAS USA, 78: 5.339-5.343 (1.981)]. Desde entonces, se ha mostrado que es un regulador mutifuncional del crecimiento y la diferenciación celulares [Sporn et al., Science, 233: 532-534 (1.986)], siendo capaz de diversos efectos tales como inhibir el crecimiento de varias líneas celulares de cáncer humano [Roberts et al., PNAS USA, 82: 119-123 (1.985)], queratinocitos de ratón [Coffey et al., Cancer Res., 48: 1.596-1.602 (1.988) y linfocitos T y B [Kehrl et al., J. Exp. Med., 163: 1.037-1.050 (1.986)]. También inhibe la proliferación precoz de células progenitoras hematopoyéticas [Goey et al., J. Immunol., 143: 877-880 (1.989)], estimula la inducción de la diferenciación de células mesenquimales de músculo de rata y la subsiguiente producción de macromoléculas específicas de cartílago [Seyedine et al., J. Biol. Chem., 262: 1.946-1.949 (1.986)], causa una síntesis y una secreción aumentadas de colágeno [Ignotz et al., J. Biol. Chem., 261: 4.337-4,345 (1.986)], estimula la formación de hueso [Noda et al., Endocrinology, 124: 2.991-2.995 (1.989)] y acelera la cicatrización de heridas por incisión [Mustoe et al., Science, 237: 1.333-1.335 (1.987)].

Además, el TGF-\beta1 estimula la formación de moléculas de matriz extracelular en el hígado y el pulmón. Cuando los niveles de TGF-\beta1 son superiores a los normales, tiene lugar la formación de fibra en la matriz extracelular del hígado y el pulmón, lo que puede ser mortal. Se producen niveles elevados de TGF-\beta1 a causa de la quimioterapia y el trasplante de médula ósea como un intento de tratar cánceres, tal como, por ejemplo, el cáncer de mama.

Se aisló una segunda proteína, denominada TGF-\beta2, de diversas fuentes, incluyendo hueso desmineralizado, una línea celular de adenocarcinoma prostático humano [Ikeda et al., Bio. Chem., 26: 2.406-2.410 (1.987)]. El TGF-\beta2 compartía varias similitudes funcionales con TGF-\beta1. Se sabe ahora que estas proteínas son miembros de una familia de proteínas moduladoras del crecimiento relacionadas que incluye TGF-\beta3 [Ten-Dijke et al., PNAS USA, 85: 4.715-4.719 (1.988)], la sustancia inhibidora mulleriana y las inhibinas. El polipéptido del presente invento ha sido supuestamente identificado como un miembro de esta familia de proteínas moduladoras del crecimiento relacionadas.

De acuerdo con un aspecto del presente invento, se proporcionan nuevos polipéptidos maduros. Los polipéptidos del presente invento son de origen humano.

De acuerdo con otro aspecto del presente invento, se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican los polipéptidos del presente invento, incluyendo mRNAs, cDNAs y DNAs genómicos.

De acuerdo con otro aspecto del presente invento, se proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido maduro expresado por el cDNA humano contenido en el nº de depósito 97349 de la ATCC.

De acuerdo con aún un aspecto más del presente invento, se proporcionan procedimientos para producir dicho polipéptido mediante técnicas recombinantes, que comprenden cultivar células huésped procarióticas y/o eucarióticas recombinantes que contienen una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido del presente invento.

De acuerdo con aún un aspecto más del presente invento, se proporcionan procedimientos para utilizar dichos polipéptidos, o dichos polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos, para estimular el crecimiento y la diferenciación celulares.

De acuerdo con aún un aspecto más del presente invento, se proporcionan también sondas de ácido nucleico que comprenden moléculas de ácido nucleico de longitud suficiente para hibridarse específicamente con secuencias de ácido nucleico del presente invento.

De acuerdo con aún un aspecto más del presente invento, se proporcionan anticuerpos contra dichos polipéptidos.

De acuerdo con aún otro aspecto del presente invento, se proporcionan antagonistas de dichos polipéptidos, que pueden ser utilizados para inhibir la acción de dichos polipéptidos, por ejemplo, en el tratamiento de una neoplasia de células cuyo crecimiento es estimulado por el polipéptido del presente invento, y evitar la formación de moléculas de matriz extracelular en el hígado y el pulmón.

De acuerdo con aún otro aspecto del presente invento, se proporcionan ensayos diagnósticos para detectar enfermedades relacionadas con la sobreexpresión del polipéptido del presente invento y mutaciones en las secuencias de ácido nucleico que codifican dicho polipéptido.

De acuerdo con aún un aspecto más del presente invento, se proporciona un procedimiento para utilizar dichos polipéptidos, o dichos polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos, con fines in vitro relacionados con investigación científica, síntesis de DNA y fabricación de vectores de DNA.

Estos y otros aspectos del presente invento deberían ser evidentes para los expertos en la técnica a partir de las presentes enseñanzas.

Los dibujos siguientes son ilustrativos de realizaciones del invento y no están destinados a limitar el alcance del invento como es abarcado por las reivindicaciones:

La Figura 1 representa la secuencia de cDNA y la correspondiente secuencia deducida de aminoácidos de HTTER36. Se usan las abreviaturas estándares de una letra para los aminoácidos. Se ha subrayado la supuesta secuencia señal.

La Figura 2 es una ilustración de la homología comparativa de secuencias de aminoácidos entre HTTER36 (línea superior) y el supuesto factor beta de crecimiento trasnformante, "GDF-3", de Mus musculus (ID. SEC. nº 9).

De acuerdo con un aspecto del presente invento, se proporciona un ácido nucleico (polinucleótido) aislado que codifica el polipéptido maduro que tiene la secuencia deducida de aminoácidos de la Figura 1 (ID. SEC. nº 2).

El polinucleótido de este invento se descubrió en un banco de cDNA de tumores testiculares humanos. Está estructuralmente relacionado con la superfamilia de genes de TGF-\beta. Contiene un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido de 364 aminoácidos de los cuales, los 16 primeros aminoácidos son una supuesta secuencia líder, los 234 aminoácidos siguientes son una prosecuencia y los 114 últimos aminoácidos son la región activa. HTTER36 muestra el mayor grado de homología con GDF-3 a nivel de aminoácidos, con 69% de identidad y 80% de similitud.

Los 16 primeros aminoácidos representan una supuesta porción transmembrana de la que se piensa que es necesaria para dirigir el polipéptido a zonas diana particulares para llevar a cabo funciones biológicas como las descritas más adelante. La porción transmembrana puede ser también escindida del polipéptido.

De acuerdo con otro aspecto del presente invento, se proporcionan polinucleótidos aislados que codifican un polipéptido maduro expresado por el cDNA humano contenido en el nº de depósito 97349 de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC; del inglés, American Type Culture Collection), 12301 Park Lawn Drive, Rockville, Maryland 20852, EE.UU., el 28 de Noviembre de 1.995. El material depositado es un plásmido pBluescript SK(+) que contiene el cDNA de HTTER36 de longitud completa, al que se hizo referencia como "PF230" cuando se depositó.

El depósito se ha hecho bajo los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos con fines de Procedimiento de Patente. La cepa será irrevocablemente, y sin restricción ni condición, liberada al público tras la publicación de una patente. Se puede requerir una licencia para usar o vender los materiales depositados, y dicha licencia no es por ello concedida. Las referencias a "polinucleótidos" a lo largo de esta memoria descriptiva incluyen el DNA del depósito al que se hizo referencia anteriormente.

El polinucleótido del presente invento puede estar en forma de RNA o en forma de DNA, DNA que incluye cDNA, DNA genómico y DNA sintético. El DNA puede ser de cadena doble o cadena sencilla y, si es una cadena sencilla, puede ser la cadena codificadora o la cadena no codificadora (antisentido). La secuencia de codificación que codifica el polipéptido maduro puede ser idéntica a la secuencia de codificación mostrada en la Figura 1 (ID. SEC. nº 1) o puede ser una secuencia de codificación diferente que, como resultado de la redundancia o degeneración del código genético, codifica el mismo polipéptido maduro que el DNA de la Figura 1 (ID. SEC. nº 1).

El polinucleótido que codifica el polipéptido maduro de la Figura 1 (ID. SEC. nº 2) puede incluir, pero no se limita a: sólo la secuencia de codificación del polipéptido maduro; la secuencia de codificación del polipéptido maduro y una secuencia de codificación adicional tal como una secuencia líder o secretora o una secuencia de proproteína; la secuencia de codificación del polipéptido maduro (y, opcionalmente, una secuencia de codificación adicional) y una secuencia no codificadora, tal como intrones o una secuencia no codificadora 5' y/o 3' de la secuencia de codificación del polipéptido maduro.

Por lo tanto, la expresión "polinucleótido que codifica un polipéptido" abarca un polinucleótido que incluye sólo la secuencia de codificación del polipéptido así como un polinucleótido que incluye una secuencia codificadora y/o no codificadora adicional.

El presente invento describe además variantes de los polinucleótidos anteriormente descritos que codifican fragmentos, compuestos análogos y derivados del polipéptido que tiene la deducida secuencia de aminoácidos de la Figura 1 (ID. SEC. nº 2). La variante del polinucleótido puede ser una variante alélica del polinucleótido presente en la naturaleza o una variante del polinucleótido no presente en la naturaleza.

Por lo tanto, el presente invento describe polinucleótidos que codifican un polipéptido maduro igual al mostrado en la Figura 1 (ID. SEC. nº 2) así como variantes de dichos polinucleótidos, variantes que codifican un fragmento, derivado o compuesto análogo del polipéptido de la Figura 1 (ID. SEC. nº 2). Dichas variantes nucleotídicas incluyen variantes por deleción, variantes por sustitución y variantes por adición o inserción.

Como se conoce en la técnica, una variante alélica es una forma alternativa de una secuencia polinucleotídica, que puede tener una sustitución, deleción o adición de uno o más nucleótidos que no altera sustancialmente la función del polipéptido codificado.

El presente invento también incluye polinucleótidos cuya secuencia de codificación del polipéptido maduro puede estar fusionada en el mismo marco de lectura con una secuencia polinucleotídica que facilita la expresión y secreción de un polipéptido por una célula huésped, tal como, por ejemplo, una secuencia líder que actúa como una secuencia secretora para controlar el transporte de un polipéptido por la célula. El polipéptido que tiene una secuencia líder es una preproteína y puede tener la secuencia líder escindida por la célula huésped para formar la forma madura del polipéptido. Los polinucleótidos pueden codificar también una proproteína que sea la proteína madura más restos de aminoácido 5' adicionales. Una proteína madura que tiene una prosecuencia es una proproteína y es una forma inactiva de la proteína. Una vez que la prosecuencia es escindida, queda una proteína madura activa. De este modo, por ejemplo, el polinucleótido del presente invento puede codificar una proteína madura o una proteína que tiene una prosecuencia o una proteína que tiene tanto una prosecuencia como una presecuencia (secuencia líder).

Los polinucleótidos del presente invento pueden tener también la secuencia de codificación fusionada en marco de lectura con una secuencia marcadora que permite la purificación del polipéptido del presente invento. En el caso de un huésped bacteriano, la secuencia marcadora puede ser una etiqueta de hexahistidina proporcionada por un vector pQE para permitir la purificación del polipéptido maduro fusionado con el marcador, o, por ejemplo, cuando se usa un huésped mamífero, por ejemplo, células COS-7, la secuencia marcadora puede ser una etiqueta de hemaglutinina (HA). La etiqueta de HA corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de influenzavirus [I. Wilson et al., Cell, 37: 767 (1.984)].

El término "gen" significa el segmento de DNA implicado en la producción de una cadena polipeptídica; incluye regiones que preceden y siguen a la región de codificación (líder y remolque) así como secuencias intermedias (intrones) entre segmentos de codificación individuales (exones).

Pueden utilizarse fragmentos del gen HTTER36 de longitud completa como sondas de hibridación para un banco de cDNA, para aislar el gen de longitud completa y para aislar otros genes que tengan una elevada similitud de secuencia con el gen o una actividad biológica similar. Las sondas de este tipo tienen preferiblemente al menos 15 bases y más preferiblemente al menos 30 bases, y, aún más preferiblemente, pueden contener, por ejemplo, al menos 50 bases o más. La sonda puede ser también utilizada para identificar un clon de cDNA que corresponda a un transcrito de longitud completa, y un clon o clones genómicos que contengan el gen HTTER36 completo incluyendo regiones reguladoras y promotoras, exones e intrones. Un ejemplo de una exploración comprende aislar la región de codificación del gen usando la secuencia de DNA conocida para sintetizar una sonda oligonucleotídica. Se utilizan oligonucleótidos marcados que tienen una secuencia complementaria a la del gen del presente invento, para explorar un banco de cDNA, DNA genómico o mRNA humanos con objeto de determinar con qué miembros del banco se hibrida la sonda.

El presente invento se refiere además a polinucleótidos que se hibridan con las secuencias anteriormente descritas si hay al menos 90%, y más preferiblemente al menos 95%, de identidad entre las secuencias. El presente invento se refiere particularmente a polinucleótidos que se hibridan bajo condiciones rigurosas con los polinucleótidos anteriormente descritos. Como se usa aquí, la expresión "condiciones rigurosas" significa que sólo se producirá la hibridación si hay al menos 95%, y preferiblemente al menos 97%, de identidad entre las secuencias. Los polinucleótidos que se hibridan en una realización preferida con los polinucleótidos anteriormente descritos codifican polipéptidos que conservan sustancialmente la misma actividad o función biológica que el polipéptido maduro codificado por el cDNA de la Figura 1 (ID. SEC. nº 1).

De esta manera, el presente invento se dirige a polinucleótidos que tienen al menos 90%, y más preferiblemente al menos 95%, de identidad con un polinucleótido que codifica el polipéptido de la ID. SEC. nº 2 y a polinucleótidos complementarios de los mismos, y a polipéptidos codificados por dichos polinucleótidos.

El presente invento se refiere además a un polipéptido que tiene la secuencia deducida de aminoácidos de la Figura 1 (ID. SEC. nº 2), así como a fragmentos, compuestos análogos y derivados de dicho polipéptido.

Las expresiones "fragmento", "derivado" y "compuesto análogo", cuando hacen referencia al polipéptido de la Figura 1 (ID. SEC. nº 2), significan un polipéptido que conserva esencialmente la misma actividad o función biológica que dicho polipéptido. De esta manera, un compuesto análogo incluye una proproteína que puede ser activada por escisión de la porción proproteínica para producir un polipéptido maduro activo.

El polipéptido del presente invento puede ser un polipéptido recombinante, un polipéptido natural o un polipéptido sintético, preferiblemente un polipéptido recombinante.

El fragmento, derivado o compuesto análogo del polipéptido de la Figura 1 (ID. SEC. nº 2) puede ser (i) uno en que uno o más de los restos de aminoácido están sustituidos por un resto de aminoácido conservado o no conservado (preferiblemente un resto de aminoácido conservado) y dicho resto de aminoácido sustituido puede ser o no uno codificado por el código genético, o (ii) uno en que uno o más de los restos de aminoácido incluyen un grupo sustituyente, o (iii) uno en que el polipéptido maduro esta fusionado con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la semivida del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol), o (iv) uno en que los aminoácidos adicionales están fusionados con el polipéptido maduro, tal como una secuencia líder o secretora o una secuencia que se emplea para la purificación del polipéptido maduro o una secuencia proproteínica. Se considera que dichos fragmentos, derivados y compuestos análogos están dentro del alcance de los expertos en la técnica a partir de las presentes enseñanzas.

Los polipéptidos y polinucleótidos del presente invento son preferiblemente proporcionados en forma aislada y, preferiblemente, son purificados hasta homogeneidad.

El término "aislado" significa que el material es separado de su ambiente original (por ejemplo, el ambiente natural si está presente en la naturaleza). Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido que se encuentra en la naturaleza y está presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido o polipéptido, separado de algunos o todos los materiales coexistentes en el sistema natural, está aislado. Dichos polinucleótidos podrían ser parte de un vector y/o dichos polinucleótidos o polipéptidos podrían ser parte de una composición y aún así estar aislados ya que dicho vector o composición no es parte de su ambiente natural.

Los polipéptidos del presente invento incluyen el polipéptido de la ID. SEC. nº 2 (en particular, el polipéptido maduro) así como polipéptidos que tienen al menos 90% de similitud (más preferiblemente, al menos 90% de identidad) con el polipéptido de la ID. SEC. nº 2 y, aún más preferiblemente, al menos 95% de similitud (aún más preferiblemente, al menos 95% de identidad) con el polipéptido de la ID. SEC. nº 2.

Como se sabe en la técnica, la "similitud" entre dos polipéptidos se determina comparando la secuencia de aminoácidos y sus sustitutos de aminoácido conservados de un polipéptido con la secuencia de un segundo polipéptido.

Pueden emplearse fragmentos o porciones de los polipéptidos del presente invento para producir el correspondiente polipéptido de longitud completa mediante síntesis peptídica; por lo tanto, los fragmentos pueden ser empleados como productos intermedios para producir los polipéptidos de longitud completa. Pueden utilizarse fragmentos o porciones de los polinucleótidos del presente invento para sintetizar polinucleótidos de longitud completa del presente
invento.

El presente invento también se refiere a vectores que incluyen polinucleótidos del presente invento, células huésped que están genéticamente diseñadas con vectores del invento, y la producción de polipéptidos del invento mediante técnicas recombinantes.

Las células huésped son genéticamente diseñadas (transducidas o transformadas o transfectadas) con los vectores de este invento, los cuales pueden ser, por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de un plásmido, una partícula vírica, un fago, etc. Las células huésped diseñadas pueden ser cultivadas en medios nutritivos convencionales modificados, según sea apropiado, para la activación de promotores, selección de transformantes o multiplicación de los genes del presente invento. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son las previamente usadas con la célula huésped seleccionada para expresión y serán evidentes para el técnico generalmente experto.

Los polinucleótidos del presente invento pueden ser empleados para producir polipéptidos mediantes técnicas recombinantes. De esta manera, por ejemplo, el polinucleótido puede ser incluido en cualquiera de los diversos vectores de expresión para la expresión de un polipéptido. Dichos vectores incluyen secuencias de DNA cromosómico, no cromosómico y sintético, por ejemplo, derivados de SV40; plásmidos bacterianos; DNA de fago; baculovirus; plásmidos de levadura; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y DNA de fago, y DNA vírico tal como de virus vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar y virus de la seudorrabia. Sin embargo, puede utilizarse cualquier otro vector con tal que sea replicable y viable en el huésped.

La secuencia de DNA apropiada puede ser insertada en el vector mediante diversos procedimientos. En general, la secuencia de DNA es insertada en un(os) sitio(s) para endonucleasa de restricción apropiado(s) mediante procedimientos conocidos en la técnica. Se considera que dichos procedimientos y otros están dentro del alcance de los expertos en la técnica.

La secuencia de DNA en el vector de expresión está operativamente unida a una(s) apropiada(s) secuencia(s) de control de la expresión (promotor) para dirigir la síntesis de mRNA. Como ejemplos representativos de dichos promotores, pueden mencionarse: el promotor de SV40 o LTR, el operón lac o trp de E. coli, el promotor P_{L} del fago lambda y otros promotores conocidos por controlar la expresión de genes en células procarióticas o eucarióticas o sus virus. El vector de expresión también contiene un sitio de unión al ribosoma para el inicio de la traducción, y un terminador de la transcripción. El vector también puede incluir secuencias apropiadas para multiplicar la expresión.

Además, los vectores de expresión contienen preferiblemente uno o más genes marcadores seleccionables que proporcionan un rasgo fenotípico para la selección de las células huésped transformadas, tal como dihidrofolato reductasa o resistencia a neomicina para un cultivo de células eucarióticas, o tal como resistencia a tetraciclina o ampicilina en E. coli.

El vector que contiene la apropiada secuencia de DNA, como la anteriormente descrita, así como una apropiada secuencia promotora o de control, puede ser empleado para transformar un huésped apropiado con objeto de permitir que el huésped exprese la proteína.

Como ejemplos representativos de huéspedes apropiados, pueden mencionarse: células bacterianas, tales como E. coli, Streptomyces y Salmonella typhimurium; células fúngicas, tales como levaduras; células de insecto, tales como S2 de Drosophila y Sf9 de Spodoptera; células de animal, tales como CHO, COS y melanoma de Bowes; adenovirus; células vegetales; etc. Se considera que la selección de un huésped apropiado está dentro del alcance de los expertos en la técnica a partir de las presentes enseñanzas.

Más particularmente, el presente invento también incluye construcciones recombinantes que comprenden una o más de las secuencias anteriormente descritas en términos generales. Las construcciones comprenden un vector, tal como un plásmido o vector viral, en el que se ha insertado una secuencia del invento en orientación directa o inversa. En un aspecto preferido de esta realización, la construcción comprende además secuencias reguladoras que incluyen, por ejemplo, un promotor operativamente unido a la secuencia. Los expertos en la técnica conocen un gran número de vectores y promotores adecuados, y estos son comercialmente asequibles. Los vectores siguientes se proporcionan a modo de ejemplo: Bacterianos: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBS, pD10, Phagescript, psiX174, pBluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia); Eucarióticos: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). Sin embargo, puede utilizarse cualquier otro plásmido o vector con tal que sea replicable y viable en el huésped.

Pueden seleccionarse regiones promotoras de cualquier gen deseado utilizando vectores de CAT (cloranfenicol transferasa) u otros vectores con marcadores seleccionables. pKK232-8 y pCM7 son dos vectores apropiados. Los promotores bacterianos mencionados particulares incluyen lacl, lacZ, T3, T7, gpt, lambda P_{R}, P_{L} y trp. Los promotores eucarióticos incluyen el promotor precoz inmediato de CMV, de timidina quinasa de HSV, los promotores precoz y tardío de SV40, de LTRs de retrovirus, y de metalotioneína I de ratón. La selección del vector y el promotor apropiados está dentro del nivel de la experiencia normal en la técnica.

En otra realización, el presente invento se refiere a células huésped que contienen las construcciones anteriormente descritas. La célula huésped puede ser una célula eucariótica superior, tal como una célula de mamífero, o una célula eucariótica inferior, tal como una célula de levadura, o la célula huésped puede ser una célula procariótica, tal como una célula bacteriana. La introducción de la construcción en la célula huésped puede ser efectuada mediante transfección con fosfato cálcico, transfección mediada por DEAE-dextrano, o electroporación [L. Davis, M. Dibner e I. Battey, ``Basic Methods in Molecular Biology (1.986)].

Las construcciones en células huésped pueden ser utilizadas de una manera convencional para producir el producto génico codificado por la secuencia recombinante. Alternativamente, los polipéptidos del invento pueden ser sintéticamente producidos mediante sintetizadores peptídicos convencionales.

Las proteínas maduras pueden expresarse en células de mamífero, levaduras, bacterias u otras células bajo el control de promotores apropiados. Pueden emplearse también sistemas de traducción exentos de células para producir dichas proteínas utilizando RNAs derivados de las construcciones de DNA del presente invento. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición, Cold Spring Harbor, New York, EE.UU. (1.989), cuyo descripción se incorpora aquí por referencia, describen vectores de clonación y expresión apropiados para uso con huéspedes procarióticos y eucarióticos.

La transcripción del DNA que codifica los polipéptidos del presente invento por eucariontes superiores resulta aumentada al insertar una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos de DNA de acción en cis, normalmente de aproximadamente 10 a 300 pares de bases (bp; del inglés, base pairs), que actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación (100 a 270 bp), un promotor/potenciador precoz del citomegalovirus, el potenciador del poliomavirus en el lado tardío del origen de replicación, y potenciadores del adenovirus.

Generalmente, los vectores de expresión recombinantes incluirán orígenes de replicación y marcadores seleccionables que permitan la transformación de la célula huésped, tales como, por ejemplo, el gen de resistencia a ampicilina de E. coli y el gen TRP1 de S. cerevisiae, y un promotor derivado de un gen muy expresado para dirigir la transcripción de una secuencia estructural cadena abajo. Dichos promotores pueden proceder de operones que codifican enzimas glicolíticas tales como, entre otras, 3-fosfoglicerato quinasa (PGK; del inglés, 3-phosphoglycerate kinase), factor alfa, fosfatasa ácida y proteínas de choque térmico. La secuencia estructural heteróloga se ensambla en la fase apropiada con secuencias de iniciación y terminación de la traducción y, preferiblemente, una secuencia líder capaz de dirigir la secreción de la proteína traducida al espacio periplásmico o el medio extracelular. Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar una proteína de fusión que incluya un péptido de identificación N-terminal que imparta unas características deseadas, tales como, por ejemplo, una estabilización o una purificación simplificada del producto recombinante expresado.

Los vectores de expresión útiles para uso bacteriano se construyen al insertar una secuencia de DNA estructural que codifica una proteína deseada junto con señales adecuadas de iniciación y terminación de la traducción en fase de lectura operativa con un promotor funcional. El vector comprenderá uno o más marcadores fenotípicos seleccionables y un origen de replicación para asegurar el mantenimiento del vector y para proporcionar, si fuera deseable, la multiplicación dentro del huésped. Los huéspedes procarióticos adecuados para transformación incluyen E. coli, Bacillus subtilis Salmonella typhimurium y diversas especies de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus, aunque también pueden emplearse otros huéspedes como cuestión de elección.

Como un ejemplo representativo aunque no restrictivo, los vectores de expresión útiles para uso bacteriano pueden comprender un marcador seleccionable y un origen de replicación bacteriano derivado de plásmidos comercialmente asequibles que comprenden elementos genéticos del bien conocido vector de clonación pBR322 (ATCC 37017). Dichos vectores comerciales incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y GEM1 (Promega Biotec, Madison, Wisconsin, EE.UU.). Estas secciones de "columna vertebral" de pBR322 se combinan con un promotor apropiado y la secuencia estructural que se va a expresar.

Después de la transformación de una cepa huésped adecuada y el crecimiento de la cepa huésped hasta una densidad celular apropiada, el promotor seleccionado es inducido por medios apropiados (por ejemplo, cambio de temperatura o inducción química) y las células son cultivadas durante un período adicional.

Las células son típicamente recolectadas por centrifugación y son rotas por medios físicos o químicos, y el extracto crudo resultante es conservado para una purificación ulterior.

Las células microbianas empleadas en la expresión de proteínas pueden ser rotas mediante cualquier método conveniente, incluyendo ciclos de congelación-descongelación, sonicación, rotura mecánica o uso de agentes para lisis celular, métodos que son bien conocidos por los expertos en la técnica.

También pueden emplearse diversos sistemas de cultivo de células de mamífero para que se exprese la proteína recombinante. Los ejemplos de sistemas de expresión de mamífero incluyen las líneas COS-7 de fibroblastos renales de mono, descritas por Gluzman, Cell, 23: 175 (1.981), y otras líneas celulares capaces de expresar un vector compatible, tales como, por ejemplo, las líneas celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamífero comprenderán un origen de replicación, un promotor y un potenciador adecuados, y también cualesquier sitios de unión al ribosoma, sitios de poliadenilación, sitios dadores y aceptores de corte y empalme, secuencias de terminación de la transcripción y secuencias no transcritas flanqueadoras 5' necesarios. Pueden utilizarse secuencias de DNA derivadas del sitio de corte y empalme de SV40, y sitios de poliadenilación para proporcionar los elementos genéticos no transcritos requeridos.

Los polipéptidos pueden ser recuperados y purificados de los cultivos de células recombinantes mediante métodos que incluyen precipitación con sulfato amónico o etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía sobre fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía sobre hidroxilapatito y cromatografía sobre lectina. Pueden utilizarse operaciones de replegadura proteica, según sean necesarias, para completar la configuración de la proteína madura. Finalmente, puede emplearse una cromatografía de alta eficacia en fase líquida (HPLC; del inglés, high performance liquid chromatography) para las operaciones de purificación finales.

Los polipéptidos del presente invento pueden ser un producto naturalmente purificado, o un producto de procedimientos sintéticos químicos, o producidos mediante técnicas recombinantes a partir de un huésped procariótico o eucariótico (por ejemplo, por células de bacterias, de levaduras, de plantas superiores, de insectos y de mamíferos en cultivo). Dependiendo del huésped empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos del presente invento pueden estar glicosilados o pueden estar no glicosilados. Los polipéptidos del invento también pueden incluir un resto inicial de aminoácido metionina.

Los polinucleótidos y polipéptidos del presente invento pueden ser empleados como reactivos y materiales de investigación para el descubrimiento de tratamientos y diagnósticos de enfermedades humanas.

La especificidad de HTTER36 para células diana puede ser explotada como un mecanismo para destruir la célula diana. Por ejemplo, puede copularse (mediante una gran variedad de métodos) HTTER36 o formas solubles del mismo con moléculas tóxicas: por ejemplo, un producto radiofarmacéutico que inactiva células diana. Estas fusiones de factor de crecimiento-toxina matan la célula diana [y, en ciertos casos, las células vecinas mediante una diversidad de efectos "espectador" (en inglés, "bystander")]. Mesri et al., J. Biol. Chem. 268: 4.853-62 (1.993), han publicado un ejemplo reciente de dichos genes de fusiones toxínicas. Pueden también encapsularse HTTER36 y fragmentos solubles del mismo y moléculas relacionadas en liposomas y pueden conjugarse con anticuerpos que reconozcan y se unan a antígenos tumoral o celularmente específicos, lo que proporcionaría un medio para el "reconocimiento" de células.

De esta misma manera, pueden emplearse HTTER36 y fragmentos solubles del mismo como compuestos antineoplásicos ya que miembros de esta familia ejercen efectos antiproliferativos sobre células transformadas. Para uso in vivo, el polipéptido objetivo puede ser administrado de diversas maneras que incluyen, pero no se limitan a, inyección, infusión, administración tópica, administración parenteral, etc. La administración puede ser en cualquier vehículo fisiológicamente aceptable, incluyendo disolución salina tamponada con fosfato, disolución salina, agua esterilizada, etc.

Un tratamiento significativo en que están implicados HTTER36 y fragmentos solubles del mismo se refiere a la cicatrización de heridas. Las composiciones del presente invento pueden ser empleadas para tratar una gran variedad de heridas, incluyendo sustancialmente todas las heridas cutáneas, heridas corneales y lesiones en los órganos huecos con revestimiento epitelial del organismo. Las heridas adecuadas para el tratamiento incluyen las que resultan de traumas tales como quemaduras, abrasiones y cortes, así como las de procedimientos quirúrgicos tales como incisiones quirúrgicas e injertos de piel. Otros estados adecuados para tratamiento con el polipéptido del presente invento incluyen estados crónicos, tales como úlceras crónicas, úlceras diabéticas, y otros estados no cicatrizantes (tróficos).

Pueden incorporarse HTTER36 y fragmentos solubles del mismo a vehículos fisiológicamente aceptables para aplicación al área afectada. La naturaleza de los vehículos puede variar en gran medida y dependerá de la prevista zona de aplicación. Para aplicación a la piel, se prefiere normalmente una base para cremas o ungüentos; las bases adecuadas incluyen lanolina, Silvadene (Marion; particularmente para el tratamiento de quemaduras), Aquaphor (Duke Laboratories, South Norwalk, Connecticut, EE.UU.) y similares. Si se deseara, sería posible incorporar composiciones que contienen HTTER36 a vendajes y otras vendas para heridas, para proporcionar una exposición continua de la herida al péptido. También pueden utilizarse aplicaciones en aerosol.

La concentración de HTTER36 en la composición de tratamiento no es crítica pero debería ser la suficiente para inducir la proliferación de células epiteliales. Las composiciones pueden ser aplicadas tópicamente a la zona afectada, típicamente como gotas oculares para el ojo o como cremas, ungüentos o lociones para la piel. En el caso de los ojos, es deseable un tratamiento frecuente, aplicándose normalmente en intervalos de 4 horas o menos. Para la piel, es deseable mantener continuamente la composición de tratamiento sobre la zona afectada durante la cicatrización, con aplicaciones de la composición de tratamiento de dos a cuatro veces al día o más frecuentemente.

La cantidad empleada del polipéptido objetivo variará con el modo de administración, el empleo de otros compuestos activos, y similares, estando generalmente en el intervalo de aproximadamente 1 \mug a 100 \mug. El polipéptido objetivo puede ser empleado con un vehículo fisiológicamente aceptable, tal como disolución salina, disolución salina tamponada con fosfato, o similar. La cantidad de compuesto empleada será determinada empíricamente basándose en la respuesta de las células in vitro y en la respuesta de animales experimentales a los polipéptidos objetivos o a formulaciones que contengan los polipéptidos objetivos.

Pueden emplearse HTTER36 y fragmentos solubles del mismo para estimular el crecimiento de fibroblastos renales normales de rata, independiente del anclaje.

Pueden emplearse HTTER36 y fragmentos solubles del mismo como reguladores multifuncionales del crecimiento y la diferenciación celulares, siendo capaces de efectos diversos tales como inhibir el crecimiento de varias líneas celulares de cáncer humano, y de linfocitos T y B.

También pueden emplearse HTTER36 y fragmentos solubles del mismo para inhibir la proliferación precoz de células progenitoras hematopoyéticas, estimular la inducción de la diferenciación de células mesenquimales de músculo de rata y estimular la producción de macromoléculas específicas de cartílago, causando una síntesis y una secreción aumentadas de colágeno.

También pueden emplearse HTTER36 y fragmentos solubles del mismo para estimular la formación de hueso.

Este invento describe un método de exploración de compuestos para identificar compuestos antagonistas del polipéptido del presente invento. Como un ejemplo, se incuba una preparación de células o membranas de mamífero que expresan un receptor de HTTER36 con un compuesto potencial y se mide la capacidad del compuesto para generar una segunda señal desde el receptor para determinar si es un antagonista eficaz. Dichos sistemas de segundo mensajero incluyen, pero no se limitan a, cAMP guanilato ciclasa, canales iónicos e hidrólisis de fosfoinositida. Los antagonistas eficaces son también determinados mediante el método anterior en que se detecta un compuesto antagonista que se une al receptor pero no provoca una respuesta de segundo mensajero, bloqueando por ello el receptor de HTTER36.

Otro ensayo para identificar posibles antagonistas específicos para los receptores del polipéptido del presente invento es un ensayo competitivo que comprende aislar membranas plasmáticas que sobreexpresan un receptor del polipéptido del presente invento, por ejemplo, células de carcinoma A431 humano. Se añade una muestra de ensayo sucesivamente diluida en un medio (el volumen es aproximadamente 10 microlitros) que contiene ^{125}I-HTTER36 10 nM a cinco microgramos de la membrana plasmática en presencia del posible compuesto antagonista y se incuba la mezcla durante 4 horas a 4ºC. Las mezclas de reacción son diluidas y son hechas pasar inmediatamente a través de un filtro Millipore. Luego se lavan rápidamente los filtros y se mide la radiactividad unida en un contador de radiación gamma. Luego se mide la cantidad de HTTER36 unido. Se lleva también a cabo un ensayo testigo en ausencia del compuesto para determinar si los antagonistas reducen la cantidad de HTTER36 unido.

Los posibles compuestos antagonistas incluyen un anticuerpo.

Los antagonistas pueden ser empleados para tratar neoplasias, por ejemplo, cánceres y tumores, en células cuyo crecimiento es estimulado por el polipéptido del presente invento.

Los antagonistas pueden ser también empleados para evitar la estimulación de la formación de moléculas de matriz extracelular en el hígado y el pulmón.

Los polipéptidos del presente invento o los compuestos antagonistas pueden ser empleados en combinación con un vehículo farmacéutico adecuado. Dichas composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido o el compuesto, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Dicho vehículo incluye, pero no se limita a, disolución salina, disolución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. La formulación debería ajustarse al modo de administración.

El invento también proporciona un conjunto o sistema farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas del invento. Asociado con dicho(s) recipiente(s)
puede haber un aviso en la forma prescrita por el organismo gubernativo que regula la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos o biológicos, aviso que refleja la aprobación de la fabricación, el uso o la venta para administración a seres humanos por parte del organismo. Además, los polipéptidos o compuestos del presente invento pueden ser empleados junto con otros compuestos terapéuticos.

Las composiciones farmacéuticas pueden ser administradas de una manera conveniente, tal como por vía oral, tópica, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal o intradérmica. Las composiciones farmacéuticas son administradas en una cantidad que es eficaz para el tratamiento y/o la profilaxis del estado específico. En general, son administradas en una cantidad de al menos aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal y, en la mayoría de los casos, serán administradas en una cantidad no superior a aproximadamente 8 mg/kg de peso corporal por día. En la mayoría de los casos, la dosificación diaria es de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal teniendo en cuenta las vías de administración, los síntomas, etc.

Los polipéptidos, y los antagonistas que son polipéptidos, pueden ser también empleados de acuerdo con el presente invento mediante la expresión de dichos polipéptidos in vivo, a lo que a menudo se hace referencia como "terapia génica".

De esta manera, por ejemplo, pueden diseñarse células de un paciente con un polinucleótido (DNA o RNA) que codifica un polipéptido ex vivo, proporcionándose luego las células diseñadas a un paciente que va a ser tratado con el polipéptido. Dichos métodos son bien conocidos en la técnica y son evidentes a partir de las presentes enseñanzas. Por ejemplo, pueden diseñarse células mediante el uso de un vector plasmídico retrovírico que contenga RNA que codifique un polipéptido del presente invento.

Similarmente, pueden diseñarse células in vivo para la expresión de un polipéptido in vivo mediante, por ejemplo, procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, una célula empaquetadora es transducida con un vector plasmídico retrovírico que contiene RNA que codifica un polipéptido del presente invento, para que la célula empaquetadora produzca ahora partículas víricas infecciosas que contienen el gen de interés. Éstas células productoras pueden ser administradas a un paciente para el diseño de células in vivo y la expresión del polipéptido in vivo. Estos y otros métodos para administrar un polipéptido del presente invento mediante dicho método deberían ser evidentes para los expertos en la técnica a partir de las enseñanzas del presente invento.

Los retrovirus de los cuales pueden proceder los vectores plasmídicos retrovíricos anteriormente mencionados incluyen, pero no se limitan a, el virus de la leucemia murina de Moloney, el virus de la necrosis esplénica, retrovirus tales como el virus del sarcoma de Rous, el virus del sarcoma de Harvey, el virus de la leucosis aviar, el virus de la leucemia del gibón, el virus de la inmunodeficiencia humana, adenovirus, el virus del sarcoma mieloproliferativo y el virus del tumor mamario. En una realización, el vector plasmídico retrovírico procede del virus de la leucemia murina de Moloney.

El vector incluye uno o más promotores. Los promotores adecuados que pueden emplearse incluyen, pero no se limitan a, la LTR retrovírica, el promotor de SV40, y el promotor del citomegalovirus (CMV) humano descrito por Miller et al., Biotechniques, volumen 7, nº 9, 980-990 (1.989), o cualquier otro promotor (por ejemplo, promotores celulares tales como promotores celulares eucarióticos que incluyen, pero no se limitan a, los promotores de histona, pol III y \beta-actina). Otros promotores virales que pueden ser empleados incluyen, pero no se limitan a, promotores de adenovirus, promotores de timidina quinasa (TK; del inglés, thymidine kinase) y promotores del parvovirus B19. La selección de un promotor adecuado será evidente para los expertos en la técnica a partir de las enseñanzas aquí contenidas.

La secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido del presente invento está bajo el control de un promotor adecuado. Los promotores adecuados que pueden emplearse incluyen, pero no se limitan a, promotores adenovíricos, tal como el promotor tardío principal adenovírico; y promotores heterólogos, tal como el promotor del citomegalovirus (CMV); el promotor del virus sincitial respiratorio (RSV; del inglés, respiratory syncytial virus); promotores inducibles, tal como el promotor de MMT, el promotor de metalotioneína; promotores de choque térmico; el promotor de la albúmina; el promotor de ApoAI; promotores de globina humana; promotores de timidina quinasa vírica, tal como el promotor de la timidina quinasa del virus herpex símplex; LTRs retrovíricas (incluyendo las LTRs retrovíricas modificadas anteriormente descritas); el promotor de \beta-actina; y promotores de la hormona del crecimiento humana. El promotor también puede ser el promotor nativo que controla el gen que codifica el polipéptido.

El vector plasmídico retrovírico se emplea para transducir líneas celulares empaquetadoras para formar líneas celulares productoras. Los ejemplos de células empaquetadoras que pueden ser transfectadas incluyen, pero no se limitan a, las líneas celulares PE501, PA317, psi-2, psi-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, psi-CRE, psi-CRIP, GP+E-86, GP+envAM12 y DAN, como describe Miller en "Human Gene Therapy", volumen 1, páginas 5-14 (1.990), que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. El vector puede transducir las células empaquetadoras por cualquier medio conocido en la técnica. Dichos medios incluyen, pero no se limitan a, electroporación, uso de liposomas y precipitación con Ca-PO_{4}. En una alternativa, el vector plasmídico retrovírico puede ser encapsulado en un liposoma, o copulado con un lípido, y ser luego administrado a un huésped.

La línea celular productora genera partículas retrovíricas infecciosas vector que incluyen la(s) secuencia(s) de ácido nucleico que codifica(n) los polipéptidos. Dichas partículas retrovíricas vector pueden ser luego empleadas para transducir células eucarióticas, sea in vitro o sea in vivo. Las células eucarióticas transducidas expresarán la(s) secuencia(s) de ácido nucleico que codifica(n) el polipéptido. Las células eucarióticas que pueden ser transducidas incluyen, pero no se limitan a, células pluripotenciales embrionarias y células de carcinoma embrionario, así como células pluripotenciales hematopoyéticas, hepatocitos, fibroblastos, mioblastos, queratinocitos, células endoteliales y células epiteliales bronquiales.

Este invento también se refiere al uso del gen del presente invento como un elemento diagnóstico. La detección de una forma mutada del gen del presente invento permitirá el diagnóstico de una enfermedad o la susceptibilidad a una enfermedad que resulta de una subexpresión del polipéptido del presente invento, por ejemplo, una incorrecta cicatrización de heridas y un incorrecto funcionamiento neurológico.

Los individuos que portan mutaciones en el gen humano del presente invento pueden ser detectados a nivel de DNA mediante una diversidad de técnicas. Los ácidos nucleicos para el diagnóstico pueden obtenerse de unas células del paciente, tal como de sangre, orina, saliva, biopsia tisular y material de autopsia. El DNA genómico puede ser utilizado directamente para la detección o puede ser multiplicado enzimáticamente usando una reacción en cadena de la polimerasa (PCR; del inglés, polymerase chain reaction) [Saiki et al., Nature, 324: 163-166 (1.986)] antes del análisis. Puede también utilizarse RNA o cDNA con el mismo fin. Como un ejemplo, pueden utilizarse cebadores de PCR complementarios del ácido nucleico que codifica un polipéptido del presente invento, para identificar y analizar mutaciones del mismo. Por ejemplo, pueden detectarse deleciones e inserciones por un cambio en el tamaño del producto multiplicado en comparación con el genotipo normal. Pueden identificarse mutaciones puntuales al hibridar el DNA multiplicado con RNA radiomarcado o, alternativamente, con secuencias de DNA antisentido radiomarcadas. Las secuencias perfectamente apareadas pueden distinguirse de los dúplex desapareados por digestión con RNasa A o por diferencias en las temperaturas de fusión.

Las diferencias de secuencia entre el gen de referencia y los genes que tienen mutaciones pueden revelarse mediante el método de secuenciación directa de DNA. Además, pueden emplearse segmentos de DNA clonados, como sondas, para detectar segmentos de DNA específicos. La sensibilidad de este método resulta fuertemente potenciada cuando se combina con la PCR. Por ejemplo, se usa un cebador de secuenciación con un producto de PCR de doble cadena o una molécula molde de cadena sencilla generada mediante una PCR modificada. La determinación de la secuencia es llevada a cabo mediante procedimientos convencionales con nucleótidos radiomarcados o mediante procedimientos de secuenciación automática con etiquetas fluorescentes.

Puede llevarse a cabo un ensayo genético basado en diferencias en las secuencias de DNA, mediante la detección de una alteración en la movilidad electroforética de fragmentos de DNA en geles con o sin agentes desnaturalizantes. Pueden visualizarse pequeñas deleciones e inserciones en la secuencia mediante una electroforesis de alta resolución en gel. Los fragmentos de DNA de secuencias diferentes pueden distinguirse en geles con formamida desnaturalizante en gradiente ya que las movilidades de los diferentes fragmentos de DNA resultan retardadas en el gel, en diferentes posiciones, de acuerdo con sus temperaturas de fusión específica o fusión parcial [véase, por ejemplo, Myers et al., Science, 230: 1.242 (1.985)].

Los cambios de secuencia en posiciones específicas pueden también revelarse mediante ensayos de protección de nucleasas, tal como la protección de RNasa y S1, o mediante el método de escisión química [por ejemplo, Cotton et al., PNAS USA, 85: 4.397-4.401 (1.985)].

De este modo, la detección de una secuencia de DNA específica puede ser llevada a cabo mediante métodos tales como hibridación, protección de RNasa, escisión química, secuenciación directa de DNA o el uso de enzimas de restricción [por ejemplo, polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP; del inglés, restriction fragment length polymorphisms)], y transferencia Southern de DNA genómico.

Además de por la electroforesis en gel y la secuenciación de DNA más convencionales, las mutaciones pueden ser también detectadas por análisis in situ.

El presente invento también se refiere a ensayos diagnósticos para detectar niveles alterados del polipéptido del presente invento en diversos tejidos ya que una sobreexpresión de las proteínas en comparación con muestras de tejidos testigo normales permite detectar la presencia de ciertos estados morbosos, tales como neoplasia, trastornos cutáneos, trastornos oculares e inflamación. Los ensayos utilizados para detectar niveles del polipéptido del presente invento en una muestra procedente de un huésped son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen radioinmunoensayos, ensayos de unión competitiva, análisis por transferencia Western y, preferiblemente, un ensayo de inmunosorción con enzimas ligadas (ELISA; del inglés, enzyme-linked immunosorption assay). Un ensayo ELISA comprende inicialmente preparar un anticuerpo específico para un antígeno del polipéptido del presente invento, preferiblemente un anticuerpo monoclonal. Además, se prepara un anticuerpo informador contra el anticuerpo monoclonal. Al anticuerpo informador se fija un reactivo detectable, tal como un agente radiactivo, un agente fluorescente o, en este ejemplo, una enzima peroxidasa de rábano picante. Luego se extrae una muestra de un huésped y se incuba sobre un soporte sólido, por ejemplo, una placa de poliestireno, que se une a las proteínas de la muestra. Luego se cubren todos los sitios ligantes de proteína libres de la placa mediante incubación con una proteína inespecífica, tal como albúmina sérica bovina. A continuación, se incuba el anticuerpo monoclonal en la placa durante un tiempo que permite que los anticuerpos monoclonales se fijen a los polipéptidos del presente invento fijados a la placa de poliestireno. Todo anticuerpo monoclonal no unido es eliminado por lavado con tampón. Luego se pone en la placa el anticuerpo informador unido a peroxidasa de rábano picante, lo que da lugar a la unión del anticuerpo informador a todo anticuerpo monoclonal unido a polipéptidos del presente invento. El anticuerpo informador no fijado es luego eliminado por lavado. Luego se añaden sustratos de peroxidasa a la placa, y la cantidad de color desarrollado en un período de tiempo dado, cuando se compara con una curva patrón, es una medida de la cantidad de proteína presente en un volumen dado de muestra de paciente.

Puede también emplearse un ensayo competitivo para determinar los niveles del polipéptido del presente invento en una muestra procedente de los huéspedes. Dicho ensayo comprende aislar membranas plasmáticas que sobreexpresan el receptor para el polipéptido del presente invento. Luego se añade a las membranas plasmáticas una muestra de ensayo que contiene los polipéptidos del presente invento que han sido marcados y se incuba la mezcla durante un período de tiempo establecido. A la mezcla de reacción también se añade una muestra procedente de un huésped de la que se sospecha que contiene el polipéptido del presente invento. Luego se hacen pasar las mezclas de reacción a través de un filtro que es rápidamente lavado y se mide después la radiactividad unida para determinar la cantidad de competición por los receptores y, por lo tanto, la cantidad de los polipéptidos del presente invento en la muestra.

Los anticuerpos específicos para HTTER36 pueden ser utilizados para el diagnóstico y la terapia del cáncer ya que muchos tipos de células cancerosas suprarregulan a diversos miembros de esta superfamilia durante el proceso de neoplasia o hiperplasia. Estos anticuerpos se unen a, e inactivan, HTTER36. Los anticuerpos monoclonales contra HTTER36 (y/o sus miembros familiares) tienen utilidad clínica tanto para el diagnóstico como para la terapia de ciertos trastornos que incluyen (pero no se limitan a) anormalidades de crecimiento hiperplásico y neoplásico. La suprarregulación de la expresión de factores de crecimiento por tejidos neoplásicos forma la base de una diversidad de ensayos séricos que permiten detectar aumentos de factor de crecimiento en la sangre de pacientes afectados. Estos ensayos se aplican típicamente no sólo en escenarios de diagnóstico sino también en escenarios de pronóstico (para detectar la presencia de células tumorales ocultas después de una cirugía, quimioterapia, etc.).

Además, las células malignas que expresan el receptor de HTTER36 pueden ser detectadas utilizando HTTER36 marcado en un ensayo de unión a receptor, o mediante el uso de anticuerpos contra el propio receptor de HTTER36. Las células pueden distinguirse de acuerdo con la presencia y la densidad de receptores para HTTER36, lo que proporciona un medio para predecir la susceptibilidad de dichas células a las actividades biológicas de HTTER36.

Las secuencias del presente invento son también valiosas para la identificación de cromosomas. La secuencia se dirige específicamente a, y puede hibridarse con, una posición concreta de un cromosoma humano individual. Además, actualmente existe la necesidad de identificar sitios concretos del cromosoma. Pocos reactivos de marcación cromosómica basados en datos de secuencias reales (polimorfismos de repetición) están actualmente disponibles para la marcación de una posición cromosómica. El mapeo de DNAs en cromosomas de acuerdo con el presente invento es una primera operación importante en cuanto a correlacionar esas secuencias con genes asociados con una enfermedad.

En resumen, las secuencias pueden ser mapeadas en cromosomas preparando cebadores de PCR (preferiblemente de 15-25 bp) a partir del cDNA. Se utiliza un análisis informático de la región no traducida 3' del gen para seleccionar rápidamente cebadores que no abarquen más de un exón en el DNA genómico, lo que complicaría el proceso de multiplicación. Luego se utilizan estos cebadores para la exploración, por PCR, de híbridos de células somáticas que contienen cromosomas humanos individuales. Sólo los híbridos que contengan el gen humano que corresponde al cebador producirán un fragmento multiplicado.

El mapeo de híbridos de células somáticas por PCR es un procedimiento rápido para asignar un DNA particular a un cromosoma particular. Utilizando el presente invento con los mismos cebadores oligonucleotídicos, puede llevarse a cabo una sublocalización con grupos de fragmentos de cromosomas específicos o colecciones de clones genómicos grandes de una manera análoga. Otras estrategias de mapeo que pueden ser similarmente utilizadas para mapear su cromosoma incluyen hibridación in situ, preexploración con cromosomas seleccionados en flujo y marcados y preselección por hibridación para construir bancos de cDNA específico de cromosoma.

Puede utilizarse la hibridación in situ con fluorescencia (FISH; del inglés, fluorescence in situ hybridization) de un clon de cDNA con una extensión cromosómica en metafase, para proporcionar una localización cromosómica precisa en una operación. Esta técnica puede utilizarse con un cDNA tan pequeño como aquél de 50 ó 60 bases. Para una revisión de esta técnica, véase Verma et al., "Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques", Pergamon Press, New York, EE.UU. (1.988).

Una vez que una secuencia ha sido mapeada en una posición cromosómica precisa, la posición física de la secuencia en el cromosoma puede ser correlacionada con datos de mapas genéticos. Dichos datos se encuentran, por ejemplo, en V. McKusick, "Mendelian Inheritance in Man" (asequible en Internet del Johns Hopkins University Welch Medical Library). Luego se identifica la relación entre genes y enfermedades que han sido mapeadas en la misma región cromosómica, por medio de un análisis de ligamientos (herencia conjunta o genes físicamente adyacentes).

A continuación, es necesario determinar las diferencias en la secuencia genómica o de cDNA entre individuos afectados y no afectados. Si se observa una mutación en algunos o todos los individuos afectados pero no en los individuos normales, es probable entonces que la mutación sea el agente causativo de la enfermedad.

Con la actual resolución de las técnicas de mapeo físico y mapeo genético, un cDNA precisamente localizado en una región cromosómica asociada con la enfermedad podría ser uno de entre 50 y 500 posibles genes causativos (esto supone una resolución de mapeo de 1 megabase y un gen por 20 kb).

Los polipéptidos, sus fragmentos u otros derivados, o los compuestos análogos de los mismos, o las células que los expresan pueden utilizarse como inmunógenos para producir anticuerpos contra ellos. Estos anticuerpos pueden ser, por ejemplo, anticuerpos policlonales o monoclonales. El presente invento también incluye anticuerpos quiméricos, de cadena única y humanizados, así como fragmentos Fab o el producto de un banco de expresión de Fab. Para la producción de dichos anticuerpos y fragmentos, pueden usarse diversos procedimientos conocidos en la técnica.

Los anticuerpos generados contra los polipéptidos que corresponden a una secuencia del presente invento pueden ser obtenidos por inyección directa de los polipéptidos a un animal o por administración de los polipéptidos a un animal, preferiblemente no humano. El anticuerpo así obtenido se unirá entonces a los propios polipéptidos. De esta manera, incluso una secuencia que sólo codifique un fragmento de los polipéptidos puede ser utilizada para generar anticuerpos que se unan a los polipéptidos nativos completos. Dichos anticuerpos pueden ser luego utilizados para aislar el polipéptido del tejido que expresa ese polipéptido.

Para la preparación de anticuerpos monoclonales puede utilizarse cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos mediante cultivos continuos de líneas celulares. Los ejemplos incluyen la técnica del hibridoma (Kohler y Milstein, 1.975, Nature, 256: 495-497), la técnica del trioma, la técnica del hibridoma con células B humanas (Kozbor et al., 1.983, Immunology Today 4: 72), y la técnica del hibridoma-virus de Epstein-Barr para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., 1.985, en ``Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., páginas 77-96).

Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena única (Patente de EE.UU. nº 4.946.778) pueden ser adaptadas para producir anticuerpos de cadena única contra productos polipeptídicos inmunogénicos de este invento. Además, pueden usarse ratones transgénicos para que expresen anticuerpos humanizados contra productos polipeptídicos inmunogénicos de este invento.

El presente invento será adicionalmente descrito con referencia a los ejemplos siguientes; sin embargo, ha de entenderse que el presente invento no se limita a tales ejemplos. A menos que se especifique otra cosa, todas las partes y cantidades son en peso.

Con objeto de facilitar la comprensión de los ejemplos siguientes, se describirán ciertos métodos y/o términos que aparecen frecuentemente.

Los "plásmidos" son designados mediante una letra p minúscula precedida y/o seguida por letras mayúsculas y/o números. Los presentes plásmidos de partida son comercialmente asequibles o son públicamente asequibles sobre una base no restringida, o pueden ser construidos a partir de plásmidos disponibles de acuerdo con procedimientos publicados. Además, plásmidos equivalentes a los descritos son conocidos en la técnica y serán evidentes para el técnico de experiencia normal.

La "digestión" de DNA se refiere a la escisión catalítica del DNA con una enzima de restricción que sólo actúa sobre ciertas secuencias del DNA. Las diversas enzimas de restricción aquí utilizadas son comercialmente asequibles, y sus condiciones de reacción, cofactores y otros requisitos se utilizaron del modo conocido por el técnico de experiencia normal. Para fines analíticos, se usa típicamente 1 \mug de plásmido o fragmento de DNA con aproximadamente 2 unidades de enzima en aproximadamente 20 \mul de disolución tampón. Con el fin de aislar fragmentos de DNA para la construcción de plásmidos, se someten típicamente de 5 a 50 \mug de DNA a digestión con de 20 a 250 unidades de enzima en un volumen mayor. Los tampones y cantidades de sustrato apropiados para las enzimas de restricción concretas vienen especificados por el fabricante. Se usan normalmente tiempos de incubación de aproximadamente 1 hora a 37ºC, pero pueden variar de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Después de la digestión, la mezcla de reacción es sometida directamente a electroforesis sobre un gel de poliacrilamida para aislar el fragmento
deseado.

La separación de los fragmentos escindidos, por tamaños, es llevada a cabo utilizando un gel de poliacrilamida al 8 por ciento de la manera descrita por D. Goeddel et al., Nucleic Acids Res., 8: 4.057 (1.980).

"Oligonucleótidos" se refiere a un polidesoxinucleótido de cadena sencilla o dos cadenas polidesoxinucleotídicas complementarias que se pueden sintetizar químicamente. Dichos oligonucleótidos sintéticos no tienen fosfato 5' y, por lo tanto, no se ligarán con otro oligonucleótido sin que se añada un fosfato con un ATP en presencia de una quinasa. Un oligonucleótido sintético se ligará con un fragmento que no haya sido desfosforilado.

La "ligación" se refiere al proceso de formación de enlaces fosfodiéster entre dos fragmentos de ácido nucleico de cadena doble (T. Maniatis et al., ib., página 146). A menos que se disponga otra cosa, la ligación puede ser llevada a cabo usando tampones y condiciones conocidos con 10 unidades de DNA ligasa de T4 ("ligasa") por 0,5 \mug de cantidades aproximadamente equimolares de los fragmentos de DNA que se van a ligar.

A menos que se afirme otra cosa, la transformación fue llevada a cabo del modo descrito en el método de F. Graham y A. Van der Eb, Virology, 52: 456-457 (1.973).

Ejemplo 1 Expresión bacteriana y purificación de HTTER36 maduro

La secuencia de DNA que codifica HTTER36, ATCC nº 97349, fue inicialmente multiplicada utilizando cebadores oligonucleotídicos de PCR correspondientes a las secuencias 5' de la proteína HTTER36 procesada y las secuencias vector 3' con respecto al gen HTTER36. Se añadieron nucleótidos adicionales correspondientes a HTTER36 a las secuencias 5' y 3', respectivamente. El cebador oligonucleotídico 5' tiene la secuencia 5' GAAAGGATCCGCAGCCA
TCCCTGTCCCCAAACTTTCTTGT 3' (ID. SEC. nº 3) y contiene un sitio para la enzima de restricción BamHI (en letra negrita) seguido de 18 nucleótidos de la secuencia de codificación de HTTER36 a partir del nucleótido 791 de la Figura 1 (ID. SEC. nº 1). La secuencia 3', 5' TCCTTCTATTCAAGCTTCTGACATCCTACCCACACCCACA 3' (ID. SEC. nº 4), contiene secuencias complementarias de un sitio Hind III y va seguida de 15 nucleótidos de HTTER36 comenzando en el nucleótido 1.121, y un codón de parada. Los sitios para enzimas de restricción corresponden a los sitios para enzimas de restricción del vector de expresión bacteriano pQE-9 (Qiagen, Inc., Chatsworth, California, 91311, EE.UU.). pQE-9 codifica resistencia a antibióticos (Amp^{r}), un origen bacteriano de replicación (ori), un promotor/operador (P/O) regulable por IPTG, un sitio de unión al ribosoma (RBS; del inglés, ribosome binding site), una etiqueta de 6-His y sitios para enzimas de restricción. pQE-9 fue luego sometido a digestión con BamHI e Hind III. Las secuencias multiplicadas fueron ligadas en pQE-9 y fueron insertadas en marco con la secuencia que codifica la etiqueta de histidina y el RBS. La mezcla de ligación fue luego utilizada para transformar la cepa DH5 alfa de E. coli (Gibco BRL) mediante el procedimiento descrito por J. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1.989). Se identificaron los transformantes por su capacidad para crecer en placas LB y se seleccionaron las colonias resistentes a ampicilina/kanamicina. El DNA plasmídico fue aislado y fue confirmado por análisis de restricción. Los clones que contenían las construcciones deseadas fueron dejados crecer durante la noche (O/N; del inglés, overnight) en un cultivo líquido en medio LB complementado tanto con Amp (100 \mug/ml) como con Kan (25 \mug/ml). El cultivo O/N fue utilizado para inocular un cultivo grande en una relación de 1:100 a 1:250. Las células fueron cultivadas hasta una densidad óptica 600 (DO^{600}) de entre 0,4 y 0,6. Luego se añadió IPTG (isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosido) hasta una concentración final de 1 mM. El IPTG induce al inactivar el represor lacI, despejando el P/O que conduce a una expresión génica aumentada. Las células fueron cultivadas durante un periodo extra de 3 a 4 horas. Las células fueron luego recolectadas por centrifugación. El sedimento celular fue solubilizado en el agente caotrópico guanidina\cdotHCl 6 molar. Después del aclaramiento, el HTTER36 solubilizado fue purificado de esta disolución por cromatografía en una columna de quelato de níquel bajo unas condiciones que permiten una fuerte fijación por proteínas que contienen la etiqueta de 6-His [E. Hochuli et al., J. Chromatography 411: 177-184 (1.984)]. El HTTER36 (pureza de 85%) fue eluido de la columna con guanidina\cdotHCl 6 molar, pH de 5,0, y, con el fin de renaturalización, la disolución fue ajustada a guanidina\cdotHCl 3 molar, fosfato sódico 100 mM, glutatión (reducido) 10 molar y glutatión (oxidado) 2 molar. Después de una incubación en esta disolución durante 12 horas, la proteína fue dializada frente a fosfato sódico 10 molar.

Ejemplo 2 Clonación y expresión de HTTER36 usando el sistema de expresión baculovírico

La secuencia de DNA que codifica la proteína HTTER36, ATCC nº 97349, es multiplicada utilizando cebadores oligonucleotídicos de PCR correspondientes a las secuencias 5' y 3' del gen.

Los cebadores usados son:

5' CAGGGATCCGCCATCATGCTTCGTTTCTTGCCAGA 3' (ID. SEC. nº 5) contiene el sitio Bam HI subrayado, una señal eficaz para el inicio de la traducción en células eucarióticas, un codón de inicio (letra negrita) y 17 bp de la secuencia de codificación de HTTER36. El cebador 3' tiene la secuencia 5' CTTCGGTACCCATTTCTGACATCCTA
CCCACAC 3' (ID. SEC. nº 6) y contiene el sitio Asp718 subrayado y 23 nucleótidos complementarios del extremo 3' de la secuencia de HTTER36 comenzando en el nucleótido 1.126.

Las secuencias multiplicadas son aisladas en un gel de agarosa al 1% usando un sistema comercialmente asequible ("Geneclean", BIO 101 Inc., La Jolla, California, EE.UU.). El fragmento es luego sometido a digestión con las endonucleasas BamHI y Asp718 y es luego purificado de nuevo en un gel de agarosa al 1%. Este fragmento es denominado F2.

Se usa el vector pA2 (modificación del vector pVL941, discutido más adelante) para la expresión de la proteína HTTER36 usando el sistema de expresión baculovírico (para una revisión, véase M. D. Summers y G. E. Smith, 1.987, "A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures", Texas Agricultural Experimental Station Bulletin nº 1.555). Este vector de expresión contiene el potente promotor de la poliedrina del virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcMNPV), seguido de los sitios de reconocimiento para las endonucleasas de restricción. Se utiliza el sitio de poliadenilación del virus 40 de simios (SV40; del inglés, simian virus 40) para una poliadenilación eficaz. Para una sencilla selección del virus recombinante, se inserta el gen de beta-galactosidasa de E. coli con la misma orientación que el promotor de la poliedrina, seguido de la señal de poliadenilación del gen de la poliedrina. Las secuencias de poliedrina están flanqueadas en ambos lados por secuencias virales para la recombinación homóloga celularmente mediada de DNA viral de tipo silvestre cotransfectado. Podrían usarse muchos otros vectores baculovíricos, tales como pAc373, pRG1, pVL941 y pAcIM1 (V. A. Luckow y M. D. Summers, Virology, 170: 31-39).

El plásmido es sometido a digestión con las enzimas de restricción BamHI y Asp718 y es luego desfosforilado usando fosfatasa intestinal de ternera mediante procedimientos conocidos en la técnica. El DNA es luego aislado en un gel de agarosa al 1% usando el sistema comercialmente asequible ("Geneclean", BIO 101 Inc., La Jolla, California, EE.UU.). Este vector es denominado V2.

El fragmento F2 y el plásmido V2 desfosforilado son ligados con DNA ligasa de T4. Luego se transforman células E. coli HB101 y se identifican las bacterias que contienen el plásmido (pBacHTTER36) con el gen HTTER36 usando las enzimas de restricción BamHI y Asp718. La secuencia del fragmento clonado es confirmada por secuenciación de DNA.

Se cotransfectan 5 \mug del plásmido pBacHTTER36 con 1,0 \mug de un baculovirus linealizado comercialmente asequible ("DNA baculovírico BaculoGold™", Pharmingen, San Diego, California, EE.UU.) usando el método de lipofección [Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7.413-7.417 (1.987)].

Se mezclan 1 \mug de DNA vírico BaculoGold™ y 5 \mug del plásmido pBacHTTER36 en un pocillo estéril de una placa de microtitulación que contiene 50 \mul de medio de Grace exento de suero (Life Technologies Inc., Gaithersburg, Maryland, EE.UU.). Luego se añaden 10 \mul de lipofectina más 90 \mul de medio de Grace, se mezcla todo y se realiza una incubación durante 15 minutos a temperatura ambiental. Luego se añade gota a gota la mezcla de transfección a las células Sf9 de insecto (ATCC CRL 1711) sembradas en una placa para cultivo tisular de 35 mm con 1 ml de medio de Grace sin suero. La placa es sometida a un movimiento de vaivén para mezclar la disolución recién añadida. La placa es luego incubada durante 5 horas a 27ºC. Después de 5 horas, se retira la disolución de transfección de la placa y se añade 1 ml de medio de Grace para insectos complementado con suero de ternera fetal al 10%. Se pone de nuevo la placa en una incubadora y se continúa el cultivo a 27ºC durante cuatro días.

Después de cuatro días, se recoge el sobrenadante y se lleva a cabo un ensayo de placas similar al descrito por Summers y Smith (supra). Se usa un gel de agarosa con "Blue Gal" (Life Technologies Inc., Gaithersburg) como una modificación, lo que permite un sencillo aislamiento de las placas teñidas de azul (puede también hallarse una descripción detallada de un "ensayo de placas" en la guía de usuario para cultivo de células de insecto y baculovirología distribuida por Life Technologies Inc., Gaithersburg, páginas 9-10).

Cuatro días después de la dilución sucesiva, se añade el virus a las células y se recogen las placas teñidas de azul con la punta de una pipeta Eppendorf. El agar que contiene los virus recombinantes es luego resuspendido en un tubo Eppendorf que contiene 200 \mul de medio de Grace. El agar es eliminado mediante una breve centrifugación, y el sobrenadante que contiene el baculovirus recombinante es usado para infectar células Sf9 sembradas en placas de 35 mm. Cuatro días más tarde, los sobrenadantes de estas placas de cultivo son recolectados y son luego guardados a 4ºC.

Se cultivan células Sf9 en medio de Grace complementado con suero bovino fetal (FBS; del inglés, fetal bovine serum) térmicamente inactivado, al 10%. Las células son infectadas con el baculovirus recombinante V-HTTER36 con una multiplicidad de infección (MOI; del inglés, multiplicity of infection) de 2. Seis horas más tarde, el medio es retirado y es sustituido por medio SF900 II menos metionina y cisteína (Life Technologies Inc., Gaithersburg). 42 horas más tarde, se añaden 185.000 Bq de ^{35}S-metionina y 185.000 Bq de ^{35}S-cisteína (Amersham). Las células son adicionalmente incubadas durante 16 horas antes de que sean recolectadas por centrifugación, y las proteínas marcadas son visualizadas por electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE; del inglés, sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) y autorradiografía.

Ejemplo 3 Expresión de HTTER36 recombinante en células CHO

Se usa pC1 para la expresión de la proteína HTTER36. El plásmido pC1 es un derivado del plásmido pSV2-dhfr (nº de acceso 37146 de la ATCC). Ambos plásmidos contienen el gen dhfr de ratón bajo el control del promotor precoz de SV40. Pueden seleccionarse células de ovario de hámster chino u otras células que carecen de actividad dihidrofolato y son transfectadas con estos plásmidos, mediante el cultivo de las células en un medio selectivo (alpha minus MEM, Life Technologies) complementado con el agente quimioterapéutico metotrexato. La multiplicación de los genes DHFR en células resistentes al metotrexato (MTX) está bien documentada (véanse, por ejemplo, F. W. Alt, R. M. Kellems, J. R. Bertino y R. T. Schimke, 1.978, J. Biol. Chem. 253: 1.357-1.370; J. L. Hamlin y C. Ma, 1.990, Biochem. et Biophys. Acta, 1.097: 107-143; y M. J. Page y M. A. Sydenham, 1.991, Biotechnology, volumen 9, 64-68). Las células cultivadas en concentraciones crecientes de MTX desarrollan resistencia al fármaco al sobreproducir la enzima diana, DHFR, como resultado de la multiplicación del gen DHFR. Si un segundo gen está ligado al gen dhfr, resulta normalmente comultiplicado y sobreexpresado. El estado de la técnica es desarrollar líneas celulares que lleven más de 1.000 copias de los genes. Posteriormente, cuando el metotrexato es retirado, las líneas celulares contienen el gen multiplicado integrado en el(los) cromosoma(s).

El plásmido pN346 contiene, para la expresión del gen de interés, un potente promotor de la repetición terminal larga (LTR; del inglés, long terminal repeat) del virus del sarcoma de Rous (Cullen et al., Molecular and Cellular Biology, Marzo de 1.985, 438-447) más un fragmento aislado del potenciador del gen precoz inmediato del citomegalovirus (CMV) humano (Boshart et al., Cell 41: 521-530, 1.985). Cadena abajo del promotor, están los siguientes sitios de escisión por enzima de restricción única que permiten la integración de los genes: BamHI, PvuII y NruI. Detrás de estos sitios de clonación, el plásmido contiene codones de parada de la traducción en los tres marcos de lectura seguidos del intrón 3' y el sitio de poliadenilación del gen de preproinsulina de rata. Pueden también usarse otros promotores muy eficaces para la expresión, tales como, por ejemplo, el promotor de \beta-actina humana, los promotores precoces o tardíos de SV40 y las repeticiones terminales largas de otros retrovirus, por ejemplo, HIV y HTLVI. Para la poliadenilación del mRNA pueden también usarse otras señales, por ejemplo, de los genes de la hormona del crecimiento humana o de la globina humana.

Las líneas celulares estables que llevan un gen de interés integrado en el cromosoma pueden ser también seleccionadas tras cotransfección con un marcador seleccionable tal como gpt, G418 o higromicina. Al principio es ventajoso usar más de un marcador seleccionable, por ejemplo, G418 más metotrexato.

El plásmido pN346 fue sometido a digestión con la enzima de restricción BamHI y fue luego desfosforilado usando fosfatasa intestinal de ternera mediante procedimientos conocidos en la técnica. El vector fue luego aislado en un gel de agarosa al 1%.

La secuencia de DNA que codifica HTTER36, ATCC nº 97349, fue multiplicada usando cebadores oligonucleotídicos de PCR que correspondían a las secuencias 5' y 3' del gen.

El cebador 5' tiene la secuencia 5' ACAGCGGATCCAGCCACC ATGCTTCGTTTCTTGCCA 3' (ID. SEC. nº 7) y contiene un sitio para la enzima de restricción BamHI (en letra negrita) seguido de una señal eficaz para la traducción (M. Kozak, supra) más los 18 primeros nucleótidos del gen (el codón de iniciación para la traducción, "ATG", está subrayado.

El cebador 3' tiene la secuencia 5' TCCTTCGGATCCCATTTCT GACATCCTACCCACACCCACA 3' (ID. SEC. nº 8) y contiene el sitio de escisión para la endonucleasa de restricción BamHI y 29 nucleótidos complementarios de la secuencia 3' traducida y no traducida del gen.

Los fragmentos multiplicados fueron aislados en un gel de agarosa al 1% del modo anteriormente descrito y fueron luego sometidos a digestión con la endonucleasa BgIII y purificados de nuevo después en un gel de agarosa al 1%.

El fragmento aislado y el vector desfosforilado fueron luego ligados con DNA ligasa de T4. Luego se transformaron células E. coli HB101 y se identificaron las bacterias que contenían el plásmido pN346 insertado en la orientación correcta usando la enzima de restricción BamHI. La secuencia del gen insertado fue confirmada por secuenciación de DNA.

Transfección de células CHO-dhfr

Para la transfección, se usaron células de ovario de hámster chino que carecen de una enzima DHFR activa. Se cotransfectaron 5 \mug del plásmido de expresión N346 con 0,5 \mug del plásmido pSVneo usando el método de la lipofectina (Felgner et al., supra). El plásmido pSV2-neo contiene un marcador seleccionable dominante, el gen neo de Tn5 que codifica una enzima que confiere resistencia a un grupo de antibióticos, incluido G418. Las células fueron sembradas en alpha minus MEM complementado con 1 mg/ml de G418. Después de 2 días, las células fueron tratadas con tripsina, sembradas en placas para clonación de hibridomas (Greiner, Alemania) y cultivadas durante 10-14 días. Después de este periodo, se trataron clones individuales con tripsina y se sembraron luego en placas Petri de 6 pocillos usando diferentes concentraciones de metotrexato (25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM). Los clones que crecieron en las mayores concentraciones de metotrexato fueron luego transferidos a nuevas placas de 6 pocillos que contenían concentraciones de metotrexato aún mayores (500 nM, 1 \muM, 2 \muM, 5 \muM). Se repitió el mismo procedimiento hasta que los clones crecieron en una concentración de 100 \muM.

La expresión del producto génico deseado fue analizada por transferencia Western y SDS-PAGE.

Ejemplo 4 Expresión por terapia génica

Se obtienen fibroblastos de un sujeto mediante una biopsia de piel. El tejido resultante es puesto en un medio para cultivo tisular y dividido en trozos pequeños. Se ponen pequeños pedazos del tejido en una superficie húmeda de un matraz para cultivo tisular; se ponen aproximadamente diez trozos en cada matraz. El matraz es puesto boca abajo, cerrado herméticamente y dejado a temperatura ambiental durante la noche. Después de 24 horas a temperatura ambiental, se invierte el matraz y los pedazos de tejido quedan fijados al fondo del matraz, y se añade medio fresco (por ejemplo, medio F12 de Ham con FBS al 10%, penicilina y estreptomicina). Luego se incuba el conjunto a 37ºC durante aproximadamente una semana. Tras este tiempo, se añade medio fresco que es posteriormente cambiado cada varios días. Después de dos semanas adicionales en cultivo, surge una monocapa de fibroblastos. La monocapa es tratada con tripsina y pasada a una escala superior usando matraces mayores.

pMV-7 [P. T. Kirschmeier et al., DNA, 7: 219-25 (1.988)] flanqueado por las repeticiones terminales largas del virus del sarcoma murino de Moloney es sometido a digestión con EcoRI y HindIII y es posteriormente tratado con fosfatasa intestinal de ternera. El vector lineal es fraccionado en un gel de agarosa y es purificado usando glóbulos de vidrio.

El cDNA que codifica un polipéptido del presente invento es multiplicado usando cebadores de PCR que corresponden a las secuencias terminales 5' y 3', respectivamente. El cebador 5' contiene un sitio EcoRI y el cebador 3' incluye además un sitio HindIII. Se añaden a la vez cantidades iguales de la "columna vertebral" lineal del virus del sarcoma murino de Moloney y del fragmento EcoRI e HindIII multiplicado, en presencia de DNA ligasa de T4. La mezcla resultante es mantenida bajo unas condiciones apropiadas para la ligación de los dos fragmentos. La mezcla de ligación es usada para transformar bacterias HB101, las cuales son luego sembradas en agar que contiene kanamicina con el fin de confirmar que el vector tiene el gen de interés correctamente insertado.

Las células empaquetadoras PA317 o GP+am12 anfotrópicas son hechas crecer en cultivo tisular hasta una densidad confluente en medio Eagles modificado de Dulbecco (DMEM) con suero fetal al 10%, penicilina y estreptomicina. Luego se añade el vector MSV que contiene el gen al medio y se transducen las células empaquetadoras con el vector. Las células empaquetadoras producen ahora partículas víricas infecciosas que contienen el gen (se hace ahora referencia a las células empaquetadoras como "células productoras").

Se añade medio fresco a las células productoras transducidas y posteriormente se recolecta el medio de una placa de 10 cm de células productoras confluentes. El medio agotado, que contiene las partículas víricas infecciosas, es filtrado a través de un filtro Millipore para eliminar células productoras sueltas, y este medio es luego usado para infectar fibroblastos. El medio de una placa subconfluente de fibroblastos es separado y es rápidamente sustituido por el medio de las células productoras. Este medio es separado y es sustituido por medio fresco. Si el título del virus es elevado, casi todos los fibroblastos estarán entonces infectados y no se requerirá selección alguna. Si el título es muy bajo, será entonces necesario usar un vector retrovírico que tenga un marcador seleccionable, tal como neo o his.

Los fibroblastos creados son luego inyectados al huésped, solos o después de haber sido cultivados hasta confluencia sobre glóbulos microportadores Cytodex 3. Los fibroblastos producen ahora el producto proteico.

Son posibles numerosas modificaciones y variaciones del presente invento a la luz de las anteriores enseñanzas y, por lo tanto, dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, el invento puede ser llevado a la práctica de forma distinta a la particularmente descrita.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i)

SOLICITANTE: SOPPET, DANIEL

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(ii)

TÍTULO DEL INVENTO: FACTOR DE CRECIMIENTO HTTER36

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 9

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(iv)

DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: CARELLA, BYRNE, BAIN, GILFILLAN, CECCHI, STEWART & OLSTEIN

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 6 BECKER FARM ROAD

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(C)

CIUDAD: ROSELAND

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(D)

ESTADO: NEW JERSEY

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(E)

PAÍS: EE.UU.

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(F)

CÓDIGO POSTAL: 07068-1739

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(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: disquete

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(B)

ORDENADOR: Compatible con ordenador personal IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

SOFTWARE: PatentIn, emisión nº 1.0, versión nº 1.30

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(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

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(viii)

INFORMACIÓN SOBRE EL ABOGADO/AGENTE DE PATENTES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Ferraro, Gregory D.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 36,134

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 325800-513

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 201-994-1700

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 201-994-1744

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1.212 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 41..1.132

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 1:

2

3

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 364 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 2:

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 40 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAAAGGATCC GCAGCCATCC CTGTCCCCAA ACTTTCTTGT

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 40 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCTTCTATT CAAGCTTCTG ACATCCTACC CACACCCACA

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 35 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGGGATCCG CCATCATGCT TCGTTTCTTG CCAGA

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTCGGTACC CATTTCTGAC ATCCTACCCA CAC

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACAGCGGATC CAGCCACCAT GCTTCGTTTC TTGCCA

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 40 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCTTCGGAT CCCATTTCTG ACATCCTACC CACACCCACA

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 366 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 9:

5

Claims (16)

1. Un polinucleótido aislado, seleccionado del grupo que consiste en:

(a)

polinucleótidos que codifican al menos la forma madura del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la ID. SEC. nº 2;

(b)

polinucleótidos que tienen la secuencia de nucleótidos de la ID. SEC. nº 1, que codifican al menos la forma madura del polipéptido;

(c)

polinucleótidos que codifican el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de al menos la forma madura del polipéptido codificado por el cDNA contenido en ATCC 97349;

(d)

polinucleótidos que tienen la secuencia de codificación del cDNA contenido en ATCC 97349 que codifica al menos la forma madura del polipéptido;

(e)

polinucleótidos que tienen al menos 90% de identidad con un polinucleótido como el definido en cualquiera de (a) a (d) y que codifican un polipéptido que es capaz de estimular la diferenciación celular; y

(f)

polinucleótidos que codifican un polipéptido que es capaz de estimular la diferenciación celular y que es al menos 90% idéntico a un polipéptido codificado por un polinucleótido de cualquiera de (a) a (d);

o la cadena complementaria de dicho polinucleótido.

2. El polinucleótido de la Reivindicación 1, que es DNA.

3. El DNA de la Reivindicación 2, que es DNA genómico.

4. El polinucleótido de la Reivindicación 1, que es RNA.

5. Un vector que contiene el polinucleótido de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4.

6. El vector de la Reivindicación 5, en el que el polinucleótido está operativamente unido a secuencias de control de la expresión que permiten la expresión en células huésped procarióticas o eucarióticas.

7. Una célula huésped genéticamente diseñada con el vector de la Reivindicación 5 ó 6.

8. Un procedimiento para producir un polipéptido codificado por el polinucleótido de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4, que comprende: cultivar la célula huésped de la Reivindicación 7 y recuperar del cultivo el polipéptido codificado por dicho polinucleótido.

9. Un procedimiento para producir células capaces de expresar un polipéptido codificado por el polinucleótido de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4, que comprende diseñar genéticamente células con el vector de la Reivindicación 5 ó 6.

10. Un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4 o es obtenible mediante el procedimiento de la Reivindicación 8.

11. Un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de la Reivindicación 10.

12. Un antagonista/inhibidor del polipéptido de la Reivindicación 10, que es un anticuerpo específico.

13. Una composición farmacéutica que comprende el polinucleótido de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4, el polipéptido de la Reivindicación 10 o un DNA que codifica y es capaz de expresar dicho polipéptido in vivo o el antagonista/inhibidor de la Reivindicación 12 y, opcionalmente, un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. Una composición diagnóstica que comprende el polinucleótido de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4.

15. Uso del antagonista/inhibidor de la Reivindicación 12 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de la neoplasia o para evitar la formación de moléculas de matriz extracelular en el hígado o el pulmón.

16. Un procedimiento diagnóstico que comprende analizar una muestra procedente de un huésped en cuanto a la presencia del polipéptido de la Reivindicación 10.