MXPA97009237A

MXPA97009237A - Factor de crecimiento alfa hi transformado

Info

Publication number: MXPA97009237A
Application number: MXPA/A/1997/009237A
Authority: MX
Inventors: Wei Yingfei; D Adams Mark; S Meissner Paul; A Fuldner Rebecca
Original assignee: Human Genome Sciences Inc
Priority date: 1995-06-06
Filing date: 1997-11-28
Publication date: 1998-10-15

Abstract

La presente invención describe los polipéptidos del factor del crecimiento alfa HII transformado y los polinucleótidos que codifican para tales polipéptidos. También se proporciona un procedimiento para producir tales polipéptidos por técnicas recombinantes y los usos terapéuticos de los polipéptidos, los cuales padecimientos neurológicos, tratar padecimientos oculares, tratar padecimiento del riñón e hígado y estimular la embriogénesis y angiogénesis. También se describen antagonistas contra talpolipéptido y su uso como agente terapéutico para tratar la neoplasia. También se describen los ensayos de diagnóstico para detectar niveles alterados del polipéptido de la presente invención y mutaciones en las secuencias deácido nucleico que codifican para los polipéptidos de la presente invención.

Description

FACTOR DEL CRECIMIENTO ALFA Hl TRANSFORMADO Esta invención se relaciona con polinucleótidos recientemente identificados, polipéptidos codificados por tales polinucleótidos, el uso de tales polinucleótidos y polipéptidos, asi como la producción de tales polinucleótidos y polipéptidos. El polipéptido de la presente invención ha sido tentativamente identificado como un factor del crecimiento alfa transformado homólogo, humano. De manera más particular, el polipéptido de la presente invención ha sido identificado tentativamente como factor del crecimiento alfa HII transformado, algunas veces referido aqui posteriormente como "TGFa-HI". La invención también se relaciona con la inhibición de la acción de tales polipéptidos. El crecimiento y diferenciación celular parece ser iniciada, promovida, mantenida y regulada por una multiplicidad de factores estimuladores, inhibidores y sinérgicos y hormonas. La alteración y/o rompimiento del mecanismo de homeóstasis celular parece ser una causa fundamental de enfermedades relacionadas con el crecimiento, incluyendo la neoplasia. Los factores que modulan el crecimiento están implicados en una amplia variedad de procesos patológicos y fisiológicos incluyendo la transducción de señales, comunicación celular, crecimiento y desarrollo, embriogénesis, respuesta inmune, hematopoyesis, sobrevivencia y diferenciación celular, inflamación, reparación y remodelación de tejidos, . aterosclerosis y cáncer. El factor del crecimiento epidérmico (EGF), factor del crecimiento alfa transformado (TGFa), betacelulina, amfirregulina, y factor del crecimiento de vaccinia entre otros factores son proteínas que modulan el crecimiento y diferenciación producidas por una variedad de tipos de células ya sea bajo condiciones fisiológicas normales o en respuesta a estímulos exógenos y son miembros de la familia del EGF. Esos factores peptidicos del crecimiento tienen influencia sobre las células dañadas a través de mecanismos autocrinos y paracrinos. También juegan papeles importantes en la cicatrización normal de heridas en tejidos tales como la piel, cornea y tracto gastrointestinal y todos comparten una homología de secuencia de aminoácidos sustancial, incluyendo la colocación conservada de tres hebras disulfuro intracadena. Además, todos los factores de esta familia se unen a un receptor glicoproteico transmembranal de un peso molecular de 170,000 y activan la actividad de la tirosina cinasa en el dominio citoplásmico del receptor (Buhro w, S.A. et al., J. Bio. Chem., 25:7824-7826 (1983)). Los receptores son expresados por muchos tipos de células incluyendo los queratinocitos de la piel, fibroblastos, células endoteliales vasculares y células epiteliales del tracto Gl. Esos factores peptidicos del crecimiento son sintetizados por varias células implicadas en la cicatrización de heridas incluyen las plaquetas, queratinocitos y macrófagos activados. Esos factores del crecimiento también han sido implicados tanto en la estimulación del crecimiento como en la diferenciación de ciertas células, por ejemplo, en la neoplasia y la inhibición de otros tipos de células. La betacelulina es una glicoproteina de 32 kilodaltons que parece ser procesada a partir de un precursor transmembranal más grande por escisión proteolitica. El dominio carboxilo terminal de la betacelulina tiene una similitud de secuencia del 50% con la del factor del crecimiento a transformado de rata. La betacelulina es un potente mitógeno de las células epiteliales del pigmento retinal y las células del músculo liso vascular. La amfirregulina es un factor regulador del crecimiento celular bifuncional que exhibe una potente actividad inhibidora sobre la sintesis del ADN en células neoplásticas, promueve además el crecimiento de ciertas células normales. Se han asignado una amplia variedad de usos para la amfirregulina, incluyendo el tratamiento de heridas y cánceres. Por ejemplo, la amfirregulina tiene efectos antiproliferativos potentes in vitro sobre varios linajes de células cancerosas de origen epitelial. La amfirregulina también induce la proliferación de los fibroblastos del prepucio humano como se muestra en la Solicitud de Patente Estadounidense No. 5,115,096. El TGFa tiene efectos biológicos pleiotrópicos. La producción de ciertos miembros del TGFa es sintetizada por un número de fibroblastos oncogénicamente transformados (Ciardiello et al., J. Cell. Biochem., 42:45-57 (1990)), asi como por una variedad de tumores, incluyendo carcinomas renal, de mama y escamosos, melanomas y glioblastomas (Derynck, R. et al., Cáncer Res., 47:707-712 (1987)). Existen evidencias directas de que la expresión del TGFa puede ser un factor que contribuye a la conversión de una célula normal a su contraparte tumorigénica analizando ratones transgénicos en los cuales las células tumorales expresan altos niveles de TGFa. Los animales transgénicos con TGFa presentan una variedad de lesiones neoplásticas dependiendo de la cepa de ratón y la elección del promotor que regula la expresión del TGFa (Sandgren, et al., Cell, 61:1121-1135 (1990)). El TGFa también juega un papel en el desarrollo embriónico normal y fisiología adulta (Derynck, R. Adv.

Cáncer Res., 58:27-5 (1992)). El TGFa ha sido expresado en muchos tejidos incluyendo la piel, cerebro, mucosa gastrointestinal y macrófagos activados. En consecuencia, el TGFa es -un factor importante en el control del crecimiento de las células epiteliales y tiene un papel en la cicatrización de heridas. También se ha encontrado que el TGFa es angiogénico (Scgreiber, et al., Science, 232:1250-1253 (1986) ) . El polipéptido de la presente invención ha sido identificado tentativamente como factor del crecimiento TGFa-HI transformado. Esta identificación se ha hecho como resultado de la homología de las secuencias de aminoácidos con el TGFa humano. De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporcionan polipéptidos maduros novedosos, asi como fragmentos, análogos y derivados de los mismos biológicamente activos y útiles en diagnóstico o terapéuticamente útiles. Los polipéptidos de la presente invención son de origen humano. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican para los polipéptidos de la presente invención, incluyendo ARNm, ADN, ADNc, ADN genómico asi como los análogos y fragmentos de los mismos biológicamente activos útiles en diagnóstico o terapéuticamente útiles. De acuerdo con un aspecto más de la presente invención, se proporcionan los procesos para producir tal polipéptido por técnicas recombinantes que comprenden cultivar células huésped procarióticas y/o eucarióticas recombinantes, que contienen una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido de la presente invención. De acuerdo con un aspecto más de la presente invención, se proporcionan los procesos para utilizar tales polipéptidos, o polinucleótidos que codifican para tales polipéptidos para propósitos terapéuticos, por ejemplo, para estimular la cicatrización de heridas, para restablecer las funciones neurológicas normales después de un trauma o demencia del SIDA, para tratar padecimiento oculares, para hacer blanco en ciertas células, para tratar padecimientos del riñon e higado y para promover el desarrollo folicular del pelo, para estimular la angiogénesis para el tratamiento de quemaduras, úlceras e incisiones cornéales y para estimular la embriogénesis. De acuerdo con otro aspecto más de la presente invención, también se proporcionan sondas de ácido nucleico que comprenden moléculas de ácido nucleico de suficiente longitud para hibridarse especificamente a las secuencias de ácido nucleico de la presente invención. De acuerdo con un aspecto más de la presente invención, se proporcionan anticuerpos contra tales polipéptidos. De acuerdo con un aspecto más de la presente invención, se proporcionan agonistas para el polipéptido de la presente invención.

De acuerdo con otro aspecto más de la presente invención, se proporcionan antagonistas para tales polipéptidos, los cuales pueden ser usados para inhibir la acción de tales polipéptidos, por ejemplo, en el tratamiento de la inflamación corneal, neoplasia, por ejemplo, tumores y cánceres y para psoriasis. De acuerdo con otro aspecto aún más de la presente invención, se proporcionan ensayos de diagnóstico para detectar enfermedades relacionadas con la sobreexpresión del polipéptido de la presente invención y mutaciones en las secuencias de ácido nucleico que codifican para tal polipéptido. De acuerdo con un aspecto más de la presente invención, se proporciona un proceso para utilizar tales polipéptidos, o polinucleótidos que codifican para tales polipéptidos, para propósitos in vitro relacionados con la investigación científica, sintesis de ADN y manufactura de vectores de ADN. Esos y otros aspectos de la presente invención serán evidentes a aquellos expertos en la técnica a partir de las enseñanzas de la presente. Los siguientes dibujos son ilustrativos de las modalidades de la invención y no pretenden limitar el alcance de la invención abarcada por las reivindicaciones.

La Figura 1 describe la secuencia de ADNc en la secuencia de aminoácidos deducida correspondiente del TGFa- HI. Se usaron las abreviaciones estándar de una letra para los aminoácidos. La secuencia de señal putativa ha sido subrayada y la porción soluble putativa ha sido subrayada con una doble linea. La Figura 2 es una ilustración de la homología de secuencia de aminoácidos comparativa entre la amfirregulina humana, betacelulina humana, factor del crecimiento epidérmico humano, herregulina humana y TGFa-HI (quinto renglón) . Las áreas sombreadas denotan el motivo del EGF conservado, el cual se muestra conservado en el polipéptido de la presente invención. De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un ácido nucleico (polinucleótido) aislado que codifica para el polipéptido maduro que tiene la secuencia de aminoácidos deducida de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2) o para el polipéptido maduro codificado por el ADNc de la clona depositada como Depósito ATCC No. 97161, con la American Type Culture Collection, 12301 Parklaw Drive, Rockville, Maryland 20852, Estados Unidos de América, el 24 de Mayo de 1995. Un polinucleótido que codifica para un polipéptido de la presente invención puede obtenerse del cerebro humano y el tejido cerebral en la primer etapa. El polinucleótido de esta invención fue descubierto en una biblioteca de ADNc derivada de un embrión de ocho semanas de edad. Este está estructuralmente relacionado con la familia del gen del TGFa. Contiene un marco de lectura abierta que codifica para un polipéptido de 380 aminoácidos, el cual exhibe una homología significativa con un número de miembros de la familia del gen del TGFa/ esos miembros incluyen al TGFa en sí así como a otros miembros tales como la amfirregulina y cripto. Además, los seis residuos de cisteína que se encuentran en todos los miembros en un motivo característico están conservados en el TGFa-Hl . El polipéptido de longitud completa de la presente invención como se expone en la Figura 1 (SEQ ID NO: 2) tiene una secuencia de señal putativa que comprende el aminoácido 1 hasta el aminoácido 39 de la Figura 1 (SEQ ID NO:2), la cual ayuda en la secreción del polipéptido de la célula. El polipéptido es procesado adicionalmente en donde el aminoácido 40 hasta el aminoácido 266 de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2) son escindidos del polipéptido puesto que está porción de aminoácidos es una secuencia precursora putativa. Además, del aminoácido 317 hasta el aminoácido 380 representa una porción transmembranal putativa, la cual se piensa es necesaria para dirigir el polipéptido a lugares objetivo particulares para llevar a cabo las funciones biológicas descritas aquí posteriormente. La porción transmembranal también puede ser escindida del polipéptido de modo que la porción ' soluble putativa del polipéptido de la presente invención comprende del aminoácido 267 hasta el aminoácido 316 de la Figura 1 (SEQ ID NO:2) . El polinucléotido de la presente invención puede estar en forma de ARN o en forma de ADN, ADN el cual incluye al ADNc, ADN genómico, y ADN sintético. El ADN puede ser de doble hebra o de una sola hebra, y si es de una sola hebra puede ser la hebra codificadora o la hebra no codificadora (antisentido) . La secuencia codificadora que codifica para el polipéptido maduro puede ser idéntica a la secuencia codificadora mostrada en la Figura 1 (SEQ. ID. NO:l) o a la de la clona depositada o puede ser una secuencia codificadora diferente, secuencia codificadora la cual, como resultado de la redundancia o degeneración del código genético, codifica para el mismo polipéptido maduro que el ADN de la Figura 1 (SEQ. ID. NO:l) o el ADNc depositado. El polinucléotido que codifica para el polipéptido maduro de la Figura 1 (SEQ. ID. NO: 2) o para el polipéptido maduro codificado por el ADNc depositado puede incluir, pero no se limita a: únicamente la secuencia codificadora para el polipéptido maduro/ la secuencia codificadora para el polipéptido maduro y la secuencia codificadora adicional tal como una secuencia líder o secretora o una secuencia de proproteína/ la secuencia codificadora para el polipéptído maduro (y opcionalmente una secuencia codificadora adicional) y la secuencia no codificadora, tales como intrones o secuencias no codificadoras 5' y/o 3' de la secuencia codificadora para el polipéptido maduro. De este modo, el término "polinucléotido que codifica para un polipéptido" abarca un polinucléotido el cual incluye únicamente secuencias codificadoras para el polipéptido asi como un polinucléotido el cual incluye secuencias codificadoras y/o no codificadoras adicionales. La presente invención se relaciona además con las variantes de los polinucléotidos descritos aquí anteriormente, los cuales codifican para fragmentos, análogos y derivados del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos deducida de la Figura 1 (SEQ. ID. NO: 2) o el polipéptido codificado por el ADNc de la clona depositada. La variante del polinucléotido puede ser una variante alélica del polinucléotido que se encuentre en la naturaleza o una variante no natural de polinucléotido. De este modo, la presente invención incluye los polinucléotidos que codifican para el mismo polipéptido maduro como se muestra en la Figura 1 (SEQ. ID. NO: 2) o el mismo polipéptido maduro codificado por el ADNc de la clona depositada así como las variantes de tales polinucléotidos cuyas variantes codifican para un fragmento, derivado o análogo del polipéptido de la Figura 1 (SEQ. ID. NO: 2) o el polipéptido codificado por el ADNc de la clona depositada. Tales variantes nucleotídicas incluyen variantes de supresión, variantes de sustitución y variantes de adición o inserción. Como se indicó anteriormente, el polinucléotido puede tener una secuencia codificadora que es una variante alélica natural de la secuencia codificadora mostrada en la Figura 1 (SEQ. ID. N0:1) o la secuencia codificadora de la clona depositada. Como se sabe en la técnica, una variante alélica es una forma alternativa de una secuencia polinucleotídica que puede tener una sustitución, supresión o adición de uno o más nucleótidos, los cuales no alteran sustancialmente la función del polipéptido codificado. La presente invención también incluye polinucléotidos, en donde la secuencia codificadora para el polipéptido maduro puede estar fusionada en el mismo marco de lectura a una secuencia polinucleotídica que ayuda a la expresión y secreción de un polipéptido de una célula huésped, por ejemplo, una secuencia líder la cual funciona como secuencia secretora para controlar el transporte de polipéptido de la célula. El polipéptido que tiene una secuencia líder es una preproteína y puede tener la secuencia líder escindida por la célula huésped para formar la forma madura del polipéptido. Los polinucléotidos pueden también codificar para una proteína la cual es la proteína madura más aminoácidos residuales 5' adicionales. Una proteína madura que tiene una prosecuencia es una proproteína y es un forma inactiva de la proteína. Una vez que la prosecuencia es escindida, permanece una proteína madura activa. De este modo, por ejemplo, el polinucléotido de la presente invención puede codificar para una proteína madura, o para una proteína que tiene una prosecuencia o para una proteína que tiene tanto una prosecuencia como una presecuencia (secuencia líder) . Los polinucléotídos de la presente invención también puede tener la secuencia codificadora fusionada en el marco a una secuencia marcadora la cual permite la purificación del polipéptido de la presente invención. La secuencia marcadora puede ser una marca de hexahistidina suministrada por un vector pQE-9 para proporcionar la purificación del polipéptido maduro fusionado al marcador en el caso de un huésped bacteriano, o, por ejemplo, la secuencia marcadora puede ser una marca de hemaglutinina (HA) cuando se usa un huésped mamífero, por ejemplo células C0S-7. La marca HA corresponde a un epitopo derivado de la proteína de la hemaglutinina de la influenza (Wilson, I., et al., Cell, 37:767 (1984)). El término "gen" significa el segmento de ADN implicado en la producción de una cadena polipeptídica/ este incluye las regiones que preceden y siguen a la región codificadora (líder y trasera) asi como las secuencias interventoras (intrones) entre los segmentos codificadores individuales (exones) . Los fragmentos del gen del TGFa-HI de longitud completa pueden ser usados como sonda de hibridación para una biblioteca de ADNc para aislar el gen de longitud completa y para aislar otros genes que tienen una alta similitud de secuencia con el gen o actividad biológica similar. Las sondas de este tipo preferiblemente tienen al menos 30 bases y pueden contener, por ejemplo, 50 o más bases. La sonda también puede ser usada para identificar una clona de ADNc que corresponde a una transcripto de longitud completa y una clona o clonas genómicas que contengan el gen del TGFa-HI completo, incluyendo las regiones reguladora y promotora, exones, e intrones. Un ejemplo de una selección comprende aislar la región codificadora del gen usando la secuencia de ADN conocida para sintetizar una sonda oligonucleotídica. Los oligonucleótidos marcados que tienen una secuencia complementaria a la del gen de la presente invención se usaron para seleccionar una biblioteca de ADNc humano, ADN genómico o ARNm para determinar cuáles miembros de la biblioteca se hibridan a la sonda. La presente invención se relaciona además con los polinucléotidos que se hibridan a las secuencias descritas aquí anteriormente si existe al menos 70%, de manera preferible al menos 90%, y de manera más preferible al menos 95% de identidad entre las secuencias. La presente invención se relaciona particularmente con los polinucléotidos que se hibridan bajo condiciones estrictas a los polinucleótidos descritos aquí anteriormente. Como se usa aquí, el término "condiciones estrictas" significa que la hibridación ocurrirá únicamente si existe al menos 95% y de manera preferible al menos 97% de identidad entre las secuencias. Los polinucléotidos que se hibridan a los polinucléotidos descritos aquí anteriormente en una modalidad preferida codifican para polipéptidos los cuales retienen sustancialmente la misma función o actividad biológica que el polipéptido maduro codificado por los ADNc de la Figura 1 (SEQ. ID. NO:l) o los ADNc depositados. De manera alternativa, el polinucléotido puede tener al menos 20 bases. De manera preferible 30 bases, y de manera más preferible al menos 50 bases, el cual se hibrida a un polinucléotido de la presente invención y que tiene una identidad hasta ahora, como se describió aquí anteriormente, y que puede o no retener la actividad. Por ejemplo, tales polinucléotidos pueden ser empleados como sondas para el polinucléotido de la SEQ. ID. NO:l, por ejemplo, para recuperar el polinucléotido o como una sonda de diagnóstico o como un cebador de PCR. De este modo, la presente invención está dirigida a polinucleótidos que tiene al menos una identidad del 70%, de manera preferible al menos 90% y de manera más preferible al menos 95% de identidad con el polinucléotido que codifica para el polipéptido de la SEQ. ID. NO: 2, asi como los fragmentos del mismo, fragmentos los cuales tienen al menos 30 bases y de manera preferible al menos 50 bases y con los polipéptidos codificados por tales polínucléotidos. Los depósitos a los que se hace referencia aqui serán mantenidos bajo los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para propósitos de Procedimientos de Patentes. Esos depósitos se proporcionan únicamente por conveniencia para aquellos expertos en la técnica y no se admite que se requiera un depósito bajo 35 U.S.C. § 112. La secuencia de los polinucléotidos contenidos en los materiales depositados, así como la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos codificados por estos, se incorporan aquí como referencia y están bajo control en el caso de cualquier conflicto con alguna descripción de las secuencias de la presente. Puede requerirse una licencia para hacer, usar o vender los materiales depositados, y tal licencia no es otorgada por la presente. La presente invención se relaciona además con un polipéptido el cual tiene la secuencia de aminoácidos deducida de la Figura 1 (SEQ. ID. NO: 2) o que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc depositado, así como fragmentos, análogos y derivados de tal polipéptido. Los términos "fragmento", "derivado" y "análogo" cuando se refieren al polipéptido de la Figura 1 (SEQ. ID. NO: 2) o que son codificados por el ADN depositado, significan un polipéptido que retiene esencialmente la misma función o actividad biológica que tal polipéptido. De este modo, un análogo incluye una proproteina la cual puede ser activada mediante la escisión de una porción de la proproteina para producir un polipéptido maduro activo. El polipéptido de la presente invención puede ser un polipéptido recombinante, un polipéptido natural o un polipéptido sintético, de manera preferible un polipéptido recombinante. El fragmento, derivado o análogo del polipéptido de la Figura 1 (SEQ. ID. NO: 2) o que es codificado por el ADNc depositado puede ser (i) uno en el cual uno o más de los aminoácidos residuales estén sustituidos con un aminoácido residual conservado o no conservado (de manera preferible un aminoácido residual conservado) y tal aminoácido residual sustituido puede o no ser uno codificado por el código genético, o (ii) uno en el cual uno o más de los aminoácidos residuales incluye un grupo sustituyente, o (iii) uno en el cual el polipéptido maduro está fusionado con otro compuesto, tal compuesto incrementa la vida media del polipéptido (por ejemplo, polietilen glicol), o (iv) uno en el cual los aminoácidos adicionales están fusionados el polipéptido maduro, tal como una secuencia líder o secretora o una secuencia la cual se emplea para la purificación del polipéptido maduro o una secuencia de proteína. Se considera que tales fragmentos, derivados y análogos están dentro del alcance de aquellos expertos en la técnica a partir de las enseñanzas de la presente. Los polipéptidos y polinucléotidos de la presente invención se proporcionan preferiblemente en una forma aislada, y de manera preferible se purifican hasta la homogeneidad. El término "aislado" significa que el material es removido de su ambiente original (por ejemplo, el ambiente natural si este se encuentra en la naturaleza) . Por ejemplo, un polinucléotido o polipéptido natural presente en un animal viviente no es aislado, pero el mismo polinucléotido o polipéptido, separado de alguno o todos los materiales coexistentes en el sistema natural, es aislado. Tales polinucleótidos podrían ser parte de un vector y/o tales polinucléotidos o polipéptidos podrían ser parte de una composición, y aún ser aislados dado que tal vector o composición no es parte de su ambiente natural. Los polipéptidos de la presente invención incluyen el polipéptido de la SEQ. ID. NO: 2 (en particular el polipéptido maduro) así como los polipéptidos que tienen al menos 70% de similitud (de manera preferible al menos 70% de identidad) con el polipéptido de la SEQ. ID. NO: 2 y de manera más preferible ~ al menos 90% de similitud (de manera más preferible al menos 90% de identidad) con el polipéptido de la SEQ. ID. NO: 2 y de manera aún más preferible al menos 95% de similitud (de manera aún más preferible al menos 95% de identidad) con el polipéptido de la SEQ. ID. NO: 2 y también incluyen las porciones de tales polipéptidos con tal porción del polipéptido conteniendo generalmente al menos 30 aminoácidos y de manera más preferible al menos 50 aminoácidos. Como se sabe en la técnica la "similitud" entre dos polipéptidos se determina comparando la secuencia de aminoácidos y sus aminoácidos sustitutos conservados de un polipéptido con la secuencia de un segundo polipéptido. Los fragmentos o porciones de los polipéptidos de la presente invención pueden emplearse para producir el polipéptido de longitud completa correspondiente por síntesis peptídica/ por lo tanto, los fragmentos pueden emplearse como intermediarios para producir los polipéptidos de longitud completa. Los fragmentos o porciones de los polinucleótidos de la presente invención pueden usarse para sintetizar los polinucleótidos de longitud completa de la presente invención.

La presente invención también se relaciona con vectores los cuales incluyen los polinucleótídos de la presente invención, las células huésped diseñadas genéticamente con los vectores de la invención y la producción de los polipéptidos de la invención por técnicas recombinantes. Las células huésped se diseñan (transducen o transforman o transfectan) genéticamente con los vectores de esta invención los cuales pueden ser, por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de un plásmido, una partícula viral, un fago, etc. Las células huésped diseñadas pueden ser cultivadas en medios nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para activar los promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes de la presente invención. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, pH y similares, son aquellas previamente usadas con las células huésped seleccionadas para la expresión, y serán evidentes a aquellos expertos en la técnica. Los polipéptidos de la presente invención pueden emplearse para producir polipéptidos por técnicas recombinantes. De este modo, por ejemplo, el polinucleótido puede ser incluido en cualquiera de una variedad de vectores de expresión para expresar un polipéptido. Tales vectores incluyen secuencias de ADN cromosomal, no cromosomal y sintéticas, por ejemplo, derivadas de SV40/ plásmidos bacterianos/ ADN de fago/ baculovirus/ plásmidos de levadura/ vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fago, ADN viral tal como el de vaccinia, adenovirus, virus de la viruela, y pseudorabies. Sin embargo, puede usarse cualquier otro vector en tanto sea duplicable y viable en el huésped. La secuencia de ADN apropiada puede ser insertada en el vector por una variedad de procedimientos. En general, la secuencia de ADN es insertada en un sitio de endonucleasa de restricción apropiado por los procedimientos conocidos en la técnica. Se considera que tales procedimientos y otros están dentro del alcance de aquellos expertos en la técnica. La secuencia de ADN en el vector de expresión está ligado operativamente a una secuencia (promotora) de control de la expresión apropiada para dirigir la síntesis de ARNm. Como ejemplos representativos de tales promotores, pueden mencionarse: el promotor LTR o SV40, el lac o trp de E. coli, el promotor Pt, del fago lambda y otros promotores que se sabe controlan la expresión de los genes en células procarióticas o eucarióticas o sus virus. El vector de expresión también contienen un sitio de unión ribosomal para iniciar la traducción y un terminador de la transcripción. El vector también puede incluir secuencias apropiadas para amplificar la expresión. Además, los vectores de expresión preferiblemente contienen uno o más genes marcadores seleccionables para proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de las células huésped transformadas tales como la resistencia a dihidrofolato reductasa o neomicina para los cultivos de células eucarióticas, o tales como la resistencia a la tetraciclina o ampicilina en E. coli. El vector que contiene la secuencia de ADN apropiada como se mencionó aquí anteriormente, así como una secuencia promotora o de control apropiada, pueden emplearse para transformar un huésped apropiado para permitir que el huésped exprese la proteína. Como ejemplos representativos de los huéspedes apropiados, pueden mencionarse: células bacterianas, tales como E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium/ células de fungo, tales como levaduras/ células de insecto tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9/ células animales tales como CHO, COS o melanoma de Bowes/ adenovirus/ células de plantas, etc. Se considera que la selección de un huésped apropiado está dentro del alcance de aquellos expertos en la técnica a partir de las enseñanzas de la presente. De manera más particular, la presente invención también incluye constructos recombinantes que comprenden una o más de las secuencias ampliamente descritas anteriormente. Los constructos comprenden un vector, tal como un plásmido o vector viral, en el cual se ha insertado una secuencia de la invención, en una orientación hacia adelante o invertida. En un aspecto preferido de esta modalidad, el constructo comprende además secuencias reguladoras, incluyendo, por ejemplo, un promotor, ligado de manera operable a la secuencia. Un gran número de vectores y promotores adecuados son conocidos por aquellos expertos en la técnica, y se encuentran comercialmente disponibles. Los siguientes vectores se proporcionan a manera de ejemplo/ Bacterianos: PQE70, PQE60, pQE-9 (Qiagen), pBS, pDlO, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNHlda, pNH18A, pNH46A (Stratagene)/ ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia)/ Eucarióticos: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia) . Sin embargo, pueden usarse cualesquier otros plásmidos o vectores en tanto sean duplicables y viables en el huésped. Las regiones promotoras pueden seleccionarse de cualquier gen deseado usando vectores CAT (cloranfenicol transferasa) u otros vectores con marcadores seleccionables. Dos vectores apropiados son el pKK232-8 y el pCM7. Los promotores bacterianos particularmente nombrados incluyen al lacl, lacZ, T3, T7, gpt, lambda PR, P y trp. Los promotores eucarióticos incluyen al CMV primario inmediato, timidina cinasa de HSV, SV40 primario y tardío, el LTR de retrovirus, y etalotioneína I de ratón. La selección del vector y promotor apropiado también está dentro del nivel de un experto en la técnica. En una modalidad más, la presente invención se relaciona con células huésped que contienen los constructos descritos anteriormente. La célula huésped puede ser una célula eucariótica superior, tal como una célula de mamífero, u una célula eucariótica inferior, tal como una célula de levadura, o la célula huésped puede ser una célula procariótica, tal como una célula bacteriana. La introducción del constructo en la célula huésped puede efectuarse por transfección con fosfato de calcio, transfección medida por DEAE-Dextran, o electroporación (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Métodos Básicos en Biología Molecular, (1986)). Los constructos en las células huésped pueden usarse de manera convencional para producir el producto genético codificado por la secuencia recombinante. De manera alternativa, los polipéptidos de la invención pueden ser producidos sintéticamente * or sintetizadores peptídicos convencionales . Las proteínas maduras pueden ser expresadas en células de mamífero, levadura, bacteria u otras células bajo el control de los promotores apropiados. También pueden emplearse sistemas de traducción libres de células para producir tales proteínas usando ARN derivados de los constructos de ADN de la presente invención. Los vectores de clonación y expresión apropiados para usarse con los huéspedes procarióticos y eucarióticos se describen en Sambrook, et al., Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio, Segunda Edición, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), la descripción del cual se incorpora aqui como referencia. La transcripción del ADN que codifica para los polipéptidos de la presente invención por eucariotes superiores se incrementa insertando una secuencia amplificadora en el vector. Los amplificadores son elementos que actúan en la posición cis del ADN, usualmente alrededor de 10 a 300 pb que actúan sobre un promotor para incrementar su transcripción. Los ejemplos incluyen el amplificador de SV40 en el lado final del origen de duplicación de 100 a 270 pb, un amplificador del promotor primario del citomegalovirus, el amplificador del polioma en el lado final del origen de duplicación, y amplificadores de adenovirus. J De manera general, los vectores de expresión recombinantes incluirán los orígenes de duplicación y marcadores seleccionables que permitan la transformación de la célula huésped, por ejemplo, el gen de resistencia a la ampicilina de E. coli y el gen TRP1 de S. cerevisiae, y un promotor derivado de un gen altamente expresado para dirigir la transcripción de una secuencia estructural corriente abajo. Tales promotores pueden derivarse de operones que codifican para enzimas glicolíticas tales como la 3-fosfoglicerato cinasa (PGK) , factor a, fosfatasa acida, o proteínas de choque térmico, entre otras. Las secuencias estructurales heterólogas se montan en la fase apropiada con secuencias de inicio y terminación de la traducción, y de manera preferible, una secuencia líder capaz de dirigir la secreción de la proteína traducida en el espacio periplásmico o medio extracelular. Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar para una proteína de fusión incluyendo un péptido de identificación N-terminal que imparte las características deseadas, por ejemplo, estabilización o purificación simplificada del producto recombinante expresado. Los vectores de expresión útiles para uso bacteriano se construyen insertando una secuencia de ADN estructural que codifica para una proteína deseada junto con señales de inicio y terminación de la traducción adecuadas en la fase de lectura operable con un promotor funcional. El vector comprenderá uno o más marcadores seleccionables, fenotipicos, y un origen de duplicación para asegurar el mantenimiento del vector y para, si es deseable, proporcionar amplificación dentro de huésped. Las células procarióticas adecuadas para la transformación incluyen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y varias especies dentro del género Pseudomonas, Streptomyces, y Straphylococcus, aunque también pueden emplearse otros como materia de elección, Como un ejemplo representativo pero no limitante, los vectores de expresión útiles para uso bacteriano pueden comprender un marcador seleccionable y un origen de duplicación bacteriano derivado de plásmidos comercialmente disponibles que comprende elementos del vector de clonación pBR322 (ATCC 37017) bien conocido. Tales vectores comerciales incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suiza) y GEMÍ (Promega Biotec, Madison, Wl, USA) . Esas secciones del "esqueleto" del pBR322 se combinan con un promotor apropiado y la secuencia estructural a ser expresada. Después de la transformación de una cepa huésped adecuada y el crecimiento de la cepa huésped a una densidad celular apropiada, el promotor seleccionado es inducido por medios apropiados (por ejemplo, desviación de la temperatura o inducción química) y las células se cultivan durante un periodo adicional. Las células se cosechan típicamente por centrifugación, se rompen por medios físicos o químicos, y el extracto crudo resultante se retiene para purificación adicional.

Las células microbianas empleadas en la expresión de las proteínas pueden ser rotas por cualquier método conveniente, incluyendo el ciclo de congelamiento-descongelamiento, sonicación, rompimiento mecánico, o el uso de agentes usantes de células, tales métodos son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. También pueden emplearse varios sistemas de cultivo de células de mamífero para expresar la proteína recombinante. Los ejemplos de sistemas de expresión de mamífero incluyen los linajes COS-7 de los fibroblastos de riñon de mono, descritos por Gluz an, Cell, 23:175 (1981), y otros linajes celulares capaces de expresar un vector compatible, por ejemplo, los linajes celulares C127, 3T3, CHO, HeL y BHK. Los vectores de expresión de mamífero comprenderán un origen de duplicación, un promotor y amplificador adecuados, y también cualesquier sitios de unión ribosomal necesarios, un sitio de poliadenilación, sitios donadores y receptores de empalmes, secuencias de terminación transcripcional, y secuencias no transcriptas flanqueantes 5' . Las secuencias de ADN derivadas del empalme de SV40, y los sitios de poliadenilación pueden usarse para proporcionar los elementos genéticos no transcriptos requeridos. Los polipéptidos pueden ser recuperados y purificados de los cultivos celulares recombinantes por métodos que incluyen precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción acida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía sobre fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía sobre hidroxilapatita y cromatografía sobre lectina. Pueden usarse pasos de replegamiento de proteína, según sea necesario, para completar la configuración de la proteína madura. Finalmente, puede emplearse cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) para los pasos de purificación finales. Los polipéptidos de la presente invención pueden ser un producto purificado naturalmente, o un producto de procedimientos sintéticos químicos, o producido por técnicas recombinantes a partir de un huésped procariótico o eucariótico, (por ejemplo, por células bacterianas, de levadura, plantas superiores, insecto y mamífero en cultivo) . Dependiendo del huésped empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden estar glicosilados o pueden no estar glicosilados. Los polipéptidos de la invención también pueden incluir un aminoácido residual metionina inicial. Los polinucléotidos y polipéptidos de la presente invención pueden emplearse como reactivos y materiales de investigación para descubrir tratamientos y diagnósticos para enfermedades humanas.

Los polipéptidos de la presente invención pueden emplearse para la caracterización de receptores. La familia de receptores del EGF comúnmente incluye cuatro receptores EGF, denotados como EGFR1, EGFR2, EGFR3 y EGFR4. El receptor EGFR2 también puede ser referido como ERB-2 y esta molécula es útil para una variedad de indicaciones de diagnóstico y terapéuticas (Prigent, S.A., y Lemoine, N.R., Pro Growth Factor Res., 4:1-24 (1992)). El polipéptido TGFa-HI es probablemente un ligando para uno o más de esos receptores así como para un receptor del tipo EGF recientemente identificado aún. El uso del TGFa-HI puede ayudar a la identificación, caracterización y clonación de tales receptores. Por ejemplo, el gen del receptor EGF representa el homólogo celular del oncogen v-erb-B del virus de la eritroblastosis de las aves. La sobreexpresión del receptor EGF o la supresión de los segmentos reguladores de cinasa de la proteína puede llevar a cabo la transformación tumorigénica de las células (Manjusri, D. et al., Human Cytokines, 364 y 381 (1991)). Los polipéptidos de la presente invención también pueden emplearse para reestablecer o aumentar las funciones neurológicas disminuidas como resultado de un trauma u otras patologías dañinas (tales como la demencia del SIDA, demencia senil, etc) . Se ha encontrado que el TGFa y sus homólogos son el ligando más abundante para el receptor EGF/TGFa en muchas partes del cerebro (Kaser, et al., Brain Res Mol Brain Res: 16:316-322, (1992)). Parece haber una distribución muy dispersa del TGFa en varias regiones del cerebro en contraste con el EGF el cual está únicamente presente en áreas más pequeñas, más discretas, sugiriendo que el TGF-alfa puede jugar un papel fisiológico en los tejidos cerebrales. Esos numerosos sitios receptores para el TGFa en el cerebro sugieren que el TGF tiene una utilidad importante en la promoción de la diferenciación y función celular del cerebro normal. En consecuencia, en casos en donde el funcionamiento neurológico está disminuido, la administración del polipéptido de la presente invención puede estimular al cerebro y aumentar las funciones fisiológicas apropiadas. El TGFa-HI o la forma soluble del mismo también pueden emplearse para tratar padecimientos oculares, por ejemplo, inflamación corneal. Una variedad de experimentos han implicado a miembro de la familia del gen del TGFa en tales patologías. Un artículo reciente resume algunos de los datos relacionados con el papel que juegan esos factores de crecimiento en las enfermedades de los ojos (Mann et al Cell 72:249-261 (1993)). Experimentos recientes han mostrado que un número de ratones que carecen del gen del TGFa presentaron inflamación corneal debida a una infiltración de leucocitos y otras células a la sustancia propia de los ojos.

Además, la especificidad de los factores del crecimiento TGFa para sus células objetivo puede explotarse como mecanismo para destruir la célula objetivo. Por ejemplo, el TGFa-HI o las formas solubles del mismo pueden acoplarse (por una amplia variedad de métodos) a moléculas tóxicas: por ejemplo, un radiofármaco que inactive las células objetivo.

Esas soluciones de factor de crecimiento-toxina mataran a la célula objetivo (y en ciertos casos a las células vecinas por una variedad de efectos sobre el "espectador") . Un ejemplo reciente de tales genes de fusión con toxina es el publicado por Mesri, et al., J. Biol. Chem. 268:4853-62 (1993). El TGFa-HI y las moléculas relacionados también pueden ser encapsuladas en liposomas y pueden ser conjugados con anticuerpos los cuales reconocen y se unen al tumor o los antígenos específicos de la célula, proporcionando por lo tanto medios para "hacer blanco" en las células. De esta misma manera el TGFa-HI puede ser empleado como un compuesto antineoplástico, puesto que los miembros de la familia TGF muestran efectos antiproliferativos sobre las célula transformadas. Para su uso in vivo, el polipéptido objetivo puede ser administrado en una variedad de formas incluyendo, pero, sin limitarse a, inyección, infusión, tópicamente, parenteralmente, etc. La administración puede ser en cualquier portador fisiológicamente aceptable, incluyendo solución salina amortiguada con fosfato, solución salina, agua esterilizada, etc. También puede emplearse el fragmento polipeptidico del TGFa-HI para tratar ciertos padecimientos del riñon, puesto que se ha encontrado que ha habido expresión de esos factores del crecimiento en el riñon. De este modo, esos factores pueden ser necesarios para el mantenimiento fisiológico apropiado de este órgano. Los tratamientos también pueden estar relacionados con la regeneración del hígado o disfunción del hígado, puesto que el TGFa-HI y sus homólogos y el . factor del crecimiento de los hepatocitos activan la regeneración del hepatocito después de la hepatectomia parcial y después de la necrosis celular hepática aguda (Masu ara, M. Et al, Hepatology 16:1241-1249 (1992)). Un tratamiento significativo que implica al TGFa-HI se relaciona con la cicatrización de heridas. Las composiciones de la presente invención pueden ser empleadas para tratar una amplia variedad de heridas incluyendo sustancialmente todas las heridas cutáneas, heridas cornéales, y daños a los órganos huecos revestidos de epitelio del cuerpo. Las heridas adecuadas para el tratamiento incluyen a aquellas resultantes de traumas tales como quemaduras, abrasiones y cortaduras, así como de procedimientos quirúrgicos tales como incisiones quirúrgicas e injertos de piel. Otras condiciones adecuadas para el tratamiento con el polipéptido de la presente invención incluyen condiciones crónicas, tales como úlceras crónicas, úlceras diabéticas y otras condiciones (tróficas) sin cicatrización. El TGFa-HI o el fragmento soluble del mismo pueden ser incorporados en portadores fisiológicamente aceptables para aplicarse al área afectada. La naturaleza de los portadores puede variar ampliamente y dependerá de la localización pretendida para la aplicación. Para la aplicación a la piel, usualmente se prefiere una crema o base de ungüento/ las bases adecuadas incluyen lanolina, Silvadene (Marión) (particularmente para el tratamiento de quemaduras), Aquaphor (Duke Laboratories, South Norwalk, Conn.), y similares. Si se desea, podría ser posible incorporar composiciones que contengan el TGFa-HI en vendajes u otros apositos para heridas para proporcionar una exposición continua de la herida al péptido. Las aplicaciones en aerosol también pueden encontrar uso. A concentración de TGFa-HI en la composición de tratamiento no es crítica pero deberá ser suficiente para inducir la proliferación de las células epiteliales. Las composiciones pueden aplicarse tópicamente al área afectada, típicamente como gotas oftálmicas al ojo o como cremas, ungüentos o lociones a la piel. En el caso de los ojos, el tratamiento frecuente es deseable, siendo aplicado de manera usual a intervalos de 4 horas o menos. En la piel, es deseable mantener continuamente la composición de tratamiento sobre el área afectada durante la cicatrización, con aplicaciones de la composición de tratamiento de dos a cuatro veces al día o más frecuentemente. La cantidad empleada del polipéptido objetivo variará con la forma de administración, el empleo de otros compuestos activos, y similares, estando de manera general en el intervalo de aproximadamente 1 µg a 100 µg. El polipéptido objetivo puede ser empleado con un portador fisiológicamente aceptable, tal como solución salina, solución salina amortiguada con fosfato, o similares. La cantidad de compuesto empleado se determinará empíricamente, en base a la respuesta de las células in vitro y la respuesta de los animales experimentales a los polipéptidos objetivo o formulaciones que contienen los polipéptidos objetivo. El TGFa-HI o su fragmento soluble del mismo pueden emplearse en la modulación de la angiogénesis, resorción ósea, respuesta inmune y funciones efectoras sinápticas y neuronales. El TGFa-HI también puede usarse en la modulación de la cascada del ácido araquidónico. El TGFa-HI o el fragmento soluble del mismo también pueden emplearse para aplicaciones relacionadas con la diferenciación terminal. Muchos factores TGFa y sus homólogos, inducen la diferenciación terminal en sus células objetivo. Esta propiedad puede ser explotada in vivo administrando el factor e induciendo la muerte de la célula objetivo. Este régimen está bajo consideración para padecimientos relacionados con la hiperproliferación de tipos celulares médicamente indeseables tales como cánceres o otros padecimiento proliferativos (por ejemplo, inflamación, psoriasis, etc.). Además de la administración in vivo, existen una variedad de situaciones en donde la administración in vitro puede ser garantizada, por ejemplo, la médula ósea puede ser purgada de poblaciones de células indeseables in vitro tratando las células con factores del crecimiento y/o derivados de los mismos. Las aplicaciones están también relacionados con la alopecia, caída del pelo y otras condiciones de la piel que afectan al desarrollo folicular del pelo. Varias lineas de evidencia implican la participación de los factores del crecimiento TGFa en tales condiciones. Como se describió anteriormente, los ratones "noqueados" diseñados para que contengan una mutación nula en el gen del TGFa presentan anormalidades relacionadas con la síntesis cuantitativa y cualitativa del pelo. Además, estudios de mapeo en ratones han mostrado que algunas mutaciones afectan al mapa del crecimiento del pelo en el lugar del gen TGFa (Mann et al, Cell 73:249-261 (1993)). Las aplicaciones tópicas o sistémicas del TGFa-HI o derivados del mismo pueden emplearse para tratar algunas formas de alopecia y caída del pelo en las reivindicaciones que caen dentro del alcance de esta invención. Ciertas patologías de enfermedades pueden ser aliviadas parcial o completamente por la administración clínica sistémica del factor del crecimiento TGFa-HI. Esta administración puede ser en forma de terapia genética (véase más adelante) / o a través de la administración de péptidos o proteínas sintetizadas a partir de constructos recombinantes de ADN de TGFa-HI o de síntesis química de péptidos (Woo, et al., Protein Engineering 3:29-37 (1989). Esta invención proporciona un método de selección de los compuestos para identificar compuestos agonistas o antagonistas para el polipéptido de la presente invención. Como un ejemplo, una preparación de células o membrana de mamífero que exprese un receptor de TGFa-HI se incuba con un compuesto potencial y se mide la capacidad del compuesto para generar una segunda señal del receptor para determinar si es un agonista efectivo. Tales segundos sistemas de mensajero incluyen pero no se limitan a, AMPc guanilato ciclasa, canales iónicos o hidrólisis de fosfoinositido. Los antagonistas efectivos se determinan por los métodos anteriores en donde se detecta un compuesto antagonista que se une al receptor pero no produce una segunda respuesta de mensajero para bloquear por lo tanto el receptor del TGFa-HI . Otro ensayo para identificar antagonistas potenciales específicos para los receptores del polipéptido de la presente invención es un ensayo competitivo el cual comprende aislar membranas plasmáticas sobre las cuales se expresa un receptor para el polipéptido de la presente invención, por ejemplo, células de carcinoma humano A431. La muestra de prueba se diluye en serie en un medio (en volúmenes de aproximadamente 10 microlitros) que contienen 125I-TGFa-HI 10 nM agregada a cinco microgramos de la membrana plasmática en presencia del compuesto antagonista potencial e incubada durante 4 horas a 4°C. Las mezclas de reacción se diluyen e inmediatamente se hacen pasar a través de un filtro millipore. Los filtros se lavan a continuación rápidamente y la radioactividad unida se mide en un contador gamma. A continuación se mide la cantidad de TGFa-HI unido. También se efectúa un ensayo de control en ausencia del compuesto para determinar si los antagonistas reducen la cantidad de TGFa-HI unido.

Los compuestos antagonistas potenciales incluyen un anticuerpo, o en algunos casos, un oligopéptido, el cual se une al polipéptido. De manera alternativa, un antagonista potencial puede ser una proteina estrechamente relacionada que se una al receptor que es una de las formas inactivas del polipéptido y por lo tanto prevenga la acción del polipéptido de la presente invención. Otro compuesto antagonista es un constructo antisentido preparado usando la tecnología antisentido. La tecnología antisentido puede usarse para controlar la expresión del gen a través de la formación de una triple hélice o ADN o ARN antisentido, métodos ambos de los cuales se basan en la unión de un polinucleótido al ADN o ARN. Por ejemplo, la porción codificadora 5' de la secuencia polinucleotídica, la cual codifica para los polipéptidos maduros de la presente invención, se usa para diseñar un oligonucleótido de ARN antisentido de aproximadamente 10 a 40 pares de base de longitud. El oligonucleótido de ADN se diseña de modo que sea complementario a una región del gen implicado en la transcripción (triple hélice - véase Lee et al., Nucí. Acids REs., 6:3073 (1979)/ Cooney et al, Science, 241:456 (1988)/ y Dervan et al., Science, 251:1360 (1991)), previniendo por lo tanto a transcripción y producción del polipéptido de la presente invención. El oligonucleótido de ARN antisentido se híbrida al ARNm in vivo y bloque la traducción de la molécula de ARNm en el polipéptido de la presente invención (Antisentido - Okano, J. Neurochem., 56:560 (1991), Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Ratón, FL (1988)). Los oligonucleótidos descritos anteriormente también pueden ser liberados a células de modo que el ARN o ADN antisentido pueda expresarse in vi vo para inhibir la producción del polipéptido de la presente invención. Los compuestos antagonistas incluyen una molécula pequeña la cual se une al polipéptido de la presente invención y bloquea su acción en el receptor de modo que la actividad biológica normal es prevenida. Las moléculas pequeñas también pueden unirse al receptor del polipéptido para prevenir la unión. Los ejemplos de moléculas pequeñas incluyen pero no se limitan a péptidos pequeños o moléculas similares a péptidos. Los antagonistas pueden emplearse para tratar la neoplasia, por ejemplo, cánceres y tumores. Es sabido que la inhibición de la secreción o producción de miembros de la familia del EGF por células tumorales en ratones causa regresión de los tumores. Los antagonistas de los polipéptidos de la presente invención también pueden usarse terapéuticamente para el tratamiento de ciertos padecimientos de la piel, por ejemplo, psoriasis,. Se han encontrado niveles elevados de expresión de los miembros de esta familia de factores del crecimiento en biopsias de piel tomadas de enfermedades tales como lesiones psoriáticas (Cook, et al., Cáncer Research, 52:3224-3227 1992)). Los antagonistas pueden ser empleados en una composición con un portador farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, como se describe aquí más adelante. Los polipéptidos de la presente invención o compuestos agonistas o antagonistas pueden emplearse en combinación con un portador farmacéuticamente adecuado. Tales composiciones comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido o compuesto, y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Tales portadores incluyen pero no se limitan a solución salina, solución salina amortiguada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. La formulación deberá ajustarse al modo de administración. La invención también proporciona un paquete o equipo farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención. Asociada con tales recipientes puede estar una nota en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regule la manufactura, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos/ nota la cual refleja la aprobación por la agencia de la manufactura, uso o venta para administración en humanos.

Además, los polipéptidos o compuestos de la presente invención pueden emplearse en conjunto con otros compuestos terapéuticos. Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse en una forma conveniente tal como por las rutas oral, tópica, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal o intradérmica. Las composiciones farmacéuticas se administran en una cantidad que es efectiva para tratar y/o la profilaxis de la indicación específica. En general, se administran en una cantidad de al menos aproximadamente 10 µg/kg de peso corporal y en la mayoría de los casos se administraran en una cantidad que no exceda de 8 mg/kg de peso corporal por día. En la mayoría de los casos la dosis es de aproximadamente 10 µg/kg hasta aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal diariamente, tomando en cuenta las rutas de administración, síntomas, etc. Los polipéptidos, y agonistas y antagonistas, los cuales son polipéptidos, también pueden emplearse de acuerdo con la presente invención por la expresión de tales polipéptidos in vi vo, la cual con frecuencia se llama "terapia genética". De este modo, por ejemplo, las células de un paciente pueden ser alteradas con un polinucleótido (ADN o ARN) que codifique para un polipéptido ex vi vo, con las células alteradas siendo proporcionadas entonces a un paciente a ser tratado con el polipéptido. Tales métodos son bien conocidos en la técnica y son evidentes a partir de las enseñanzas de la presente. Por ejemplo, las células pueden ser diseñadas o alteradas mediante el uso de un vector plasmídico retroviral que contenga el ARN que codifica para un polipéptido de la presente invención. De manera similar, las células pueden ser diseñadas o alteradas in vivo para la expresión de un polipéptido in vi vo por, por ejemplo, los procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se transduce una célula empacada con un vector plasmídico retroviral que contiene el ARN que codifica para un polipéptido de la presente invención de modo que la célula empacada ahora produzca partículas virales infecciosas que contienen el gen de interés. Las células productoras pueden administrarse a un paciente para alterar células in vivo y la expresión del polipéptido in vivo . Esos y otros métodos de administración de un polipéptido de la presente invención por tales métodos serán evidentes a aquellos expertos en la técnica a partir de las enseñanzas de la presente invención. Los retrovirus a partir de los cuales los vectores plasmídicos retrovirales mencionados aquí anteriormente pueden derivarse incluyen, pero no se limitan a, Virus de la Leucemia Murina de Moloney, Virus de la Necrosis del Bazo, retrovirus tales como el Virus del Sarcoma de Rous, Virus del Sarcoma de Harvey, virus de la leucosis de las .aves, virus de la leucemia del simio gibón, virus de la inmunodeficiencia humana, adenovirus, Virus del Sarcoma Mieloproliferativo, y virus del tumor de mama. En una modalidad, el vector plas idico retroviral se deriva del Virus de la Leucemia Murina de Moloney. El vector incluye uno o más promotores. Los promotores adecuados que pueden ser empleados incluyen, pero no se limitan a, el LTR retroviral, el promotor de SV40/ y el promotor del citomegalovirus (CMV) humano descrito en Miller, et al., Biotechniques, Vol. 7, No. 9, 980-990 (1989), o cualquier otro promotor (por ejemplo, promotores celulares tales como promotores celulares eucarióticos, incluyendo, pero sin limitarse a, la histona, pol III, y promotores de ß-actina) . Otros promotores virales que pueden emplearse incluyen, pero no se limitan a promotores de adenovirus, promotores de timidina cinasa (TK) , y promotores del parvovirus B19. La selección de un promotor adecuado será evidente para aquellos expertos en la técnica a partir de las enseñanzas contenidas en la siguiente. La secuencia de ácido nucleico que codifica para los polipéptidos de la presente invención está bajo el control de un promotor adecuado. Los promotores adecuados que pueden emplearse incluyen, pero no se limitan a, promotores adenovirales, tales como el promotor tardío mayor/ o promotores heterólogos, tales como el promotor del citomegalovirus (CMV) / el promotor del virus sincitial respiratorio (RSV) / promotores inducibles, tales como el promotor MMT, el promotor de la etalotioneína/ promotores del choque térmico/ promotores de albúmina/ el promotor ApoAI/ promotores de globina humana/ promotores de timidina cinasa viral, tales como el promotor de la timidina cinasa del Herpes Simplex/ LTR retrovirales (incluyendo los LTR retrovirales modificados descritos aquí anteriormente)/ el promotor de ß-actina/ y promotores de la hormona del crecimiento humano. Los promotores también pueden ser el promotor nativo que controla al gen que codifica para el polipéptido. El vector plasmidico retroviral se emplea para transducir los linajes celulares empacados para formar linajes celulares productores. Los ejemplos de células empacadas que pueden ser transfectadas incluyen, pero no se limitan a, el PE501, PA307, ?-2, ?-AM, PA12, T19-14X, VT-19- 17-H2, ?CRE, ?CRIP, GP+E-86, GP+envAml2, y linajes celulares DAN como se describe en Miller, Human Gene Therapy, Vol 1, páginas 5-14 (1990), la cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad. El vector puede transducir las células empacadas a través de cualesquier medios conocidos en la técnica. Tales medios incluye, pero no se limitan a, electroporación, el uso de liposomas, y precipitación con CaP04. En una alternativa, el vector plasmídico retroviral puede ser encapsulado en un liposoma, o acoplado a un lípido y a continuación administrado a un huésped. El linaje celular productor genera partículas de vector retroviral infecciosas, las cuales incluyen las secuencias de ácido nucleico que codifican para los polipéptidos. Tales partículas de vector retroviral pueden entonces ser empleadas, para transducir células eucarióticas, ya sea in vi tro o in vi vo. Las células eucarióticas transducidas expresaran la secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido. Las células eucarióticas que pueden ser transducidas incluyen, pero no se limitan a, células no diferenciadas embriónicas, células de carcinoma embriónico, así como células no diferenciadas hematopoyéticas, hepatocitos, fibroblastos, mioblastos, queratinocitos, células endoteliales, y células de epitelio bronquial. Esta invención también se relaciona con el uso de gen de la presente invención como diagnóstico. La detección de una forma mutante del gen de la presente invención permitirá un diagnóstico de una enfermedad o una susceptibilidad a una enfermedad que resulta de la baja expresión del polipéptido de la presente invención por ejemplo, cicatrización de heridas inapropiada, funcionamiento neurológico inapropiado, padecimientos oculares, padecimientos del riñon e hígado, desarrollo folicular del pelo, angiogénesis y embriogénesis. Los individuos que contienen mutaciones en el gen humano de la presente invención pueden ser detectados a nivel de ADN por una variedad de técnicas. Los ácidos nucleicos para diagnóstico pueden obtenerse de células de un paciente, tales como el de la sangre, orina, saliva, material de biopsia o autopsia. El ADN genómico puede usarse directamente para la detección o puede amplificarse enzimáticamente usando PCR (Saiki et al., Nature, 324:163-166 (1986)) antes del análisis. El ARN o ADNc también puede ser usado para el mismo propósito. Como un ejemplo, los cebadores de PCR complementarios al ácido nucleico que codifica para un polipéptido de la presente invención pueden usarse para identificar y analizar mutaciones de los mismos. Por ejemplo, las supresiones e inserciones pueden ser detectadas por un cambio en el tamaño del producto amplificado en comparación con el genotipo normal. Las mutaciones puntuales pueden ser identificadas hibridando el ADN amplificado a ARN marcado radioactivamente o de manera alternativa, secuencias de ADN antisentido marcadas radioactivamente. Las secuencias perfectamente equiparadas pueden ser distinguidas de los dúplex no equiparables por digestión con RNasa A o por diferencias en la temperaturas de fusión.

Las diferencias de secuencia entre el gen de referencia y los genes que tienen mutaciones pueden ser reveladas por el método de secuenciamiento del ADN directo. Además, los segmentos de ADN clonados pueden ser empleados como sondas para detectar segmentos de ADN específicos. La sensibilidad de este método aumenta en gran medida cuando se combina con la PCR. Por ejemplo, un cebador de secuenciamiento es usado con un producto de la PCR de doble hebra o una molécula patrón de una sola hebra generada por una PCR modificada. La determinación de la secuencia se efectúa por procedimientos convencionales con nucleótidos marcados radioactivamente o por procedimientos de secuenciamiento automático con marcas fluorescentes. Las pruebas genéticas basadas en las diferencias de secuencia de ADN pueden lograrse mediante la detección de la alteración de la movilidad electroforética de fragmentos de ADN en geles con o sin agentes desnaturalizantes. Las supresiones e inserciones de secuencias pequeñas pueden visualizarse por electroforesis en gel de alta resolución. Los fragmentos de ADN de diferentes secuencias pueden ser distinguidos en geles de gradiente de formaldehído, desnaturalizantes, en los cuales las movilidades de los diferentes fragmentos de ADN son retardadas en el gel en diferentes posiciones de acuerdo a sus temperaturas de fusión o fusión parcial específicas (véase, por ejemplo, Myers et al . , Science. 230:1242 (1985)). Los cambios de secuencia en lugares específicos también pueden ser revelados por ensayos de protección con nucleasa, tales como la protección con RNasa y SI y el método de escisión química (por ejemplo, Cotton et al . , PNAS, EUA, 85:4397-4401 (1985)). De este modo, la detección de una secuencia de ADN específica puede lograrse por métodos tales como la hibridación, protección con RNasa, escisión química, secuenciamiento de ADN directo o el uso de enzimas de restricción, (por ejemplo, Polimorfismo de la Longitud del Fragmento de Restricción (RFLP) ) y manchado Southern del ADN genómico, Además de la electroforesis en gel más convencional y el secuenciamiento del ADN, las mutaciones también pueden ser detectadas por análisis in si tu . La presente invención también se relaciona con ensayos de diagnóstico para detectar niveles alterados del polipéptido de la presente invención en varios tejidos puesto que una sobreexpresión de las proteínas comparada con las muestras de tejido control normal puede detectar la presencia de ciertas condiciones de enfermedad tales como neoplasia, padecimientos de la piel, padecimientos oculares e inflamación. Los ensayos usados para detectar los niveles de polipéptido de la presente invención en una muestra derivada de un huésped son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica e incluyen los radioinmunoensayos, ensayos de unión competitiva, análisis de Manchas Western y de manera preferible un ensayo de ELISA. Un ensayo de ELISA comprende inicialmente preparar un anticuerpo específico para un antígeno del polipéptido de la presente invención, de manera preferible un anticuerpo monoclonal. Además se prepara un anticuerpo reportero contra el anticuerpo monoclonal. Para que el anticuerpo reportero se una a un anticuerpo detectable tal como la radioactividad, fluorescencia o en este ejemplo una enzima peroxidasa de rábano. Ahora se remueve una muestra de un huésped y se incuba sobre un soporte sólido, por ejemplo un disco de poliestireno, que une las proteínas en la muestra. Cualesquier sitios de unión de proteína libres sobre el disco son cubiertos entonces por incubación con una proteína no específica tal como la sero albúmina bovina. A continuación, el anticuerpo monoclonal se incuba en el disco tiempo durante el cual los anticuerpos monoclonales se unen a cualesquier polipéptidos de la presente invención unidos al disco de poliestireno. Todo el anticuerpo monoclonal no unido se lava con amortiguador. El anticuerpo reportero unido a la peroxidasa de rábano se coloca ahora en el disco dando como resultado la unión del anticuerpo reportero a cualquier anticuerpo monoclonal unido a los polipéptidos de la presente invención. El anticuerpo reportero no unido se lava a continuación. A continuación se agregan sustratos de peroxidasa al disco y se mide la cantidad de color desarrollado en un periodo de tiempo dado que es una medida de la cantidad de proteína presente en un volumen dado de muestra de paciente cuando se compara contra una curva estándar. También puede emplearse un ensayo competitivo para determinar los niveles de polipéptido de la presente invención en una muestra derivada de los huéspedes. Tal ensayo comprende aislar las membranas plasmáticas que sobreexpresan al receptor del polipéptido de la presente invención. A continuación se agrega una muestra de prueba que contiene los polipéptidos de la invención que han sido marcados, a las membranas plasmáticas y a continuación se incuba durante un periodo de tiempo fijo. También se agrega a la mezcla de reacción una muestra derivada de un huésped la cual se sospecha contiene el polipéptido de la presente invención. Las mezclas de reacción se hacen pasar entonces a través de un filtro el cual se lava rápidamente y se mide la radiactividad unidad para determinar el grado de competencia por los receptores y por lo tanto la cantidad de polipéptidos de la presente invención en la muestra. Los anticuerpos específicos para el TGFa-HI pueden usarse para el diagnóstico y terapia del cáncer, puesto que muchos tipos de células cancerosas regulan excesivamente varios miembros de la familia del TGFa durante el proceso de la neoplasia o hiperplasia. Esos anticuerpos se unen e inactivan al TGFa-HI . Los anticuerpos monoclonales contra el TGFa-HI (y/o sus miembros de la familia) están en uso clínico tanto para el diagnóstico como para la terapia de ciertos padecimientos incluyendo (pero sin limitarse a) anormalidades hiperplásticas y de crecimiento neoplástico. La regulación excesiva o ascendente de la expresión del factor del crecimiento por los tejidos neoplásticos forman la base para una variedad de ensayos en suero los cuales detectan incrementos en el factor del crecimiento en la sangre de pacientes afectados. Esos ensayos se aplican típicamente no solo en instalaciones de diagnóstico, sino que se aplican en instalaciones de pronóstico también (para detectar la presencia de células tumorales ocultas después de la cirugía, quimioterapia, etc.). Además, las células malignas que expresan el receptor del TGFa-HI pueden ser detectadas usando TGFa-HI marcado en un ensayo de unión de receptor, o mediante el uso de anticuerpos para el receptor del TGFa-HI en sí. Las células pueden ser distinguidas de acuerdo con la presencia y densidad de los receptores por el TGFa-HI, proporcionando por lo tanto un medio para predecir la susceptibilidad de tales células a las actividades biológicas del TGFa-HI. Las secuencias de la presente invención son también valiosas para la identificación de cromosomas. La secuencia está dirigida al blanco específicamente y puede hibridarse con una localización particular sobre un cromosoma humano individual. Además existe la necesidad actual de identificar sitios particulares sobre el cromosoma. Pocos reactivos que marquen cromosomas basados en los datos de secuencia actuales (polimorfismos repetidos) están actualmente disponibles para marcar lugares cromosómicos. La elaboración del mapa de los ADN para los cromosomas de acuerdo a la presente invención es un primer paso importante para correlacionar aquellas secuencias con los genes asociados con la enfermedad. De manera breve, las secuencias pueden trazarse en cromosomas preparando cebadores de PCR (preferiblemente de 15-25 pb) del ADNc. El análisis por computadora de la región no traducida 3* del gen se usa para seleccionar rápidamente los cebadores que no abarcan más de un exón en el ADN genómico, complicando de este modo el proceso de amplificación. Esos cebadores se usan entonces para seleccionar por PCR híbridos de células somáticas que contienen cromosomas humanos individuales. Únicamente aquellos híbridos que contiene el gen humano que corresponde al cebador producirán un fragmento amplificado.

El trazado por PCR de los híbridos de células somáticas es un procedimiento rápido para asignar un ADN particular a un cromosoma particular. Usando la presente invención con los mismos cebadores oligonucleotídicos, puede lograrse las subclonación con paneles de fragmentos de cromosomas específicos o grupos grandes de clonas genómicas en una forma análoga. Otras estrategias de trazado que pueden emplearse de igual modo para trazar el mapa para su cromosoma incluyen la hibridación in situ, preselección con cromosomas clasificados por flujo, marcados, y preselección por hibridación de bibliotecas de ADNc específicas para construir cromosomas . La hibridación in si tu, por fluorescencia (FISH) de una clona de ADNc a una metafase cromosomal difusa puede usarse para proporcionar la localización cromosomal precisa en un paso. Esta técnica puede usarse con ADNc tan cortos como de 50 ó 60 bases. Para una revisión de esta técnica, véase Verma et al., Cromosomas Humanos: un Manual de las Técnicas Básicas, Pergamon Press, New York (1988). Una vez que se ha trazado el mapa de la secuencia para un lugar cromosomal preciso, la posición física de la secuencia sobre el cromosoma puede correlacionarse con los datos del mapa genético. Tales datos se encuentran, por ejemplo, en V. McKusick, Mendelian Inhetritance in Man (disponible en línea a través de la Biblioteca Médica Welch de la Universidad Johns Hopkins) . La relación entre los genes y las enfermedades que han sido trazados en la misma región cromosomal se identifica entonces a través de análisis de enlaces (herencia de genes físicamente adyacentes) . A continuación, es necesario determinar las diferencias en el ADNc o la secuencia genómica entre los individuos afectados y no afectados. Si se observa una mutación en algunos o todos los individuos afectados pero no en ningún individuo normal, entonces la mutación probablemente sea el agente causal de la enfermedad. Con la resolución actual y las técnicas de mapeo fisiológicamente y mapeo genético, un ADNc localizado de manera precisa en la región cromosomal asociada con la enfermedad podría ser uno de entre 50 y 500 genes causales potenciales. (Esto presupone una resolución del trazado del mapa de 1 megabase y de un gen por 20 kb) . Los polipéptidos, sus fragmentos u otros derivados, o análogos de los mismos, o células que los expresan pueden usarse como inmunógeno para producir anticuerpos para estos. Esos anticuerpos pueden ser, por ejemplo, anticuerpos policlonales o monoclonales. La presente invención también incluye anticuerpos quiméricos, de una sola cadena y humanizados, así como fragmentos Fab, o el producto de una biblioteca de expresión de Fab. Pueden usarse varios procedimientos conocidos en la técnica para la producción de tales anticuerpos y fragmentos. Los anticuerpos generados contra los polipéptidos que corresponden a una secuencia de la presente invención pueden obtenerse por inyección directa de los polipéptidos en un animal o mediante la administración de los polipéptidos a un animal, preferiblemente no humano. El anticuerpo así obtenido se unirá entonces a los polipéptidos en sí. De esta manera, puede usarse aún una secuencia que codifica únicamente para un fragmento de los polipéptidos para generar anticuerpos que se unen a los polipéptidos nativos completos. Tales anticuerpos pueden usarse entonces para aislar el polipéptido del tejido que expresa tal polipéptido. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, puede usarse cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos por cultivos continuos de linajes celulares. Los ejemplos incluyen la técnica del hibridoma (Kohler y Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), la técnica del trio a, la técnica del hibridoma de células B humanas (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72), y la técnica del hibridoma EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Colé, et al., 1985, en Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96).

Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de una sola cadena (Patente Estadounidense No, 4,946,778) pueden adaptarse para producir anticuerpos de una sola cadena para los productos polipeptídicos inmunogénicos de esta invención. También, pueden usarse ratones transgénicos para expresar anticuerpos humanizados para los productos polipeptídicos inmunogénicos de esta invención. La presente invención se describirá mejor con referencia a los siguientes ejemplos/ sin embargo, debe comprenderse que la presente invención no se limita a tales ejemplos. Todas las partes o cantidades, a menos que se especifique otra cosa, están en peso. Para facilitar la comprensión de los siguiente ejemplos se describirán ciertos métodos y/o términos que ocurren con frecuencia. . Los "plásmidos" se designan con una p minúscula precedida y/o seguida por letras mayúsculas y/o números. Los plásmidos de partida de la presente están comercialmente disponibles, públicamente disponibles en una base no restringida, o pueden construirse a partir de plásmidos disponibles de acuerdo a los procedimientos publicados. Además, los plásmidos equivalentes a aquellos descritos son conocidos en la técnica y serán evidentes a aquellos expertos en la técnica.

La "digestión" del ADN se refiere a la escisión catalítica del ADN con una enzima de restricción que actúa únicamente en ciertas secuencias en el ADN. Las diferentes enzimas de restricción usadas aquí se encuentran comercialmente disponibles y sus condiciones de reacción, cofactores y otros requerimientos se usaron como es sabido por un experto en la técnica. Para propósitos analíticos, se usó típicamente 1 µg de plásmido o fragmentos de ADN con aproximadamente 2 unidades de enzima en aproximadamente 20 µl de solución amortiguadora. Para el propósito de aislar los fragmentos de ADN para la construcción del plásmido, se digirieron típicamente de 5 a 50 µg de ADN con 20 a 250 unidades de enzima en un volumen más grande. Las cantidades de amortiguadores y sustrato apropiadas para las enzimas de restricción particulares fuero las especificadas por el fabricante. De manera ordinaria se usaron tiempos de incubación de aproximadamente 1 a 37°C, pero pueden variar de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Después de la digestión la reacción se sometió a electroforesis directamente sobre un gel de poliacrilamida para aislar el fragmento deseado. La separación por tamaño de los fragmentos escindidos se efectuó usando el gel de poliacrilamida al 8 por ciento descrito por Goeddel, D. et al., Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980).

Por "oligonucleótidos" se refiere ya sea a un polidesoxinucleótido de una sola hebra o dos hebras de polidesoxinucleótido complementarias las cuales pueden ser sintetizadas químicamente. Tales oligonucleótidos sintéticos no tienen fosfato 5' y de este modo no se ligarán a otro oligonucleótido sin agregar un fosfato como un ATP en presencia de una cinasa. Un oligonucleótido sintético se ligará a un fragmento que no ha sido desfosforilado. La "ligación" se refiere al proceso de formar enlaces fosfodiéster entre los fragmentos de ácido nucleico de dos hebras (Maniatis, T., et al., Id., p. 146). A menos que se establezca otra cosa, la ligación puede efectuarse usando los amortiguadores y condiciones conocidas con 10 unidades de ADN ligasa T4 ("ligasa") por 0.5 µg de cantidades aproximadamente equimolares de los fragmentos de ADN a ser ligados. A menos que se establezca otra cosa, la transformación se efectuó como se describe en el método de Graham, F. y Van der Eb, A., Virology, 52:456-457 (1973).

Ejemplo 1 Expresión Bacteriana y Purificación dß la Forma Soluble dßl TGFa-HI La secuencia de ADN que codifica para el TGFa-HI, ATCC # 97161, se amplificó inicialmente usando cebadores oligonucleotídicos de la PCR que corresponden a las secuencias 5' de la proteína TGFa-HI procesada (menos la secuencia peptídica de señal) y las secuencias del vector 3' al gen del TGFa-HI. Se agregaron los nucleótidos adicionales que corresponden al TGFa-HI a las secuencias 5' y 3' respectivamente. El cebador oligonucleotídíco 5' tiene la secuencia 5* CCCGGATCCGCACGAGACATACCTTGTCCG 3' (SEQ ID NO: 3) que contiene un sitio de enzimas de restricción BamHl (en negrillas) seguido por 21 nucleótidos de la secuencia que codifica para el TGFa-HI comenzando desde el aminoácido terminal presumido del codón proteico procesado. La secuencia 3' 5' GGGAAGCTTTTAATACTGAAATCGTACAGGAC 3' (SEQ ID NO: 4) contiene secuencias complementarias para un sitio Hind III y está seguida por 23 nucleótidos del TGFa-HI . Los sitios de la enzima de restricción corresponden a los sitios de la enzima de restricción en el vector de expresión bacteriano pQE-9 (Qiagen, Inc. Chatsworth, CA, 91311) . El pQE-9 codifica para la resistencia a antibióticos (Ampc) , un origen de duplicación bacteriano (ori), un operador del promotor regulable por IPTG (P/0), un sitio de unión ribosomal (RBS), una marca de 6-His y sitios de la enzima de restricción. El pQE-9 se digirió entonces con Ba Hl y HindIII. Las secuencias amplificadas se ligaron al pQE-9 y se insertaron en el marco con la secuencia que codifica para la marca de histidina y el RBS. La mezcla de ligación se usó entonces para transformar la cepa de E. coli M15/rep 4 (Qiagen, Inc.) por el procedimiento descrito en Sambrook, J. et al., Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio, Cold Spring Laboratory Press, (1989) . La M15/rep4 contiene copias múltiples del plásmido pREP4, el cual expresa el represor lacl y también confiere resistencia a la kanamicina (Kanr) . Los transformantes fueron identificados por su capacidad para crecer sobre placas de LB y se seleccionaron las colonias resistentes a la ampicilina/kanamicina. El plásmido de ADN fue aislado y confirmado por análisis de restricción. Las clonas que contenían los constructos deseados se hicieron crecer durante la noche (O/N) en cultivo liquido en medio LB suplementado tanto con Amp (100 ug/ml) y Kan (25 ug/ml) . Los cultivos O/N se usaron para inocular un cultivo grande a una relación de 1:100 a 1:250. Las células se hicieron crecer hasta una densidad óptica de 600 (D.O.600) de entre 0.4 y 0.6. A continuación se agregó IPTG ("Isopropil-B-D-tiogalacto piranósido") a una concentración final de 1 mM. El IPTG induce por inactivación al represor lacl, que elimina el P/0 que conduce a la expresión incrementada del gen. Las células se hicieron crecer durante 3 a 4 horas extra. Las células se cosecharon a continuación por centrifugación. El sedimento celular se solubilizó en el agente caotrópico Guanidina HCl 6 Molar. Después de la clarificación, el TGFa-HI solubilizado fue purificado de esta solución por cromatografía sobre una columna de quelato de níquel bajo condiciones que permiten una fuerte unión por las proteínas que contienen la marca 6-His (Hochuli, E. et al., J. Chromatography 411:177-184 (1984)). El TGFa-HI (85 % puro) fue eluido de la columna en guanidina HCl 5 molar, pH 5.0 y para los propósitos de renaturalización se ajustó a guanidina HCl 3 molar, fosfato de sodio lOO M, glutatión 10 molar (reducido) y glutatión 2 molar (oxidado) . Después de la incubación en esta solución por 12 horas la proteína se dializó en fosfato de sodio 10 molar.

Ejemplo 2 Clonación y expresión del TGFa-HI soluble usando ßl sistema de expresión dß baculovirus La secuencia de ADN que codifica para la proteína TGFa-HI, ATCC # 97161, se amplificó usando los cebadores oligonucleotídicos de PCR que corresponden a las secuencias ' y 3' del gen para la expresión de primer aminoácido de la Figura 1 hasta el extremo del dominio activo son: Se usaron tres juegos de cebadores: El primer juego de cebadores es, 5' CGCGGATCCGCCATCATGGGCGCCGCAGCCGC 3' (SEQ ID NO: 5) y 5* GCGTCTAGACTAGTATAGAACACTGTAGTCC 3* (SEQ ID NO: 6)/ El segundo juego de cebadores es: 5' CGCGGATCCAGTTTATATTGGAAACCACATGCC 3* (SEQ ID NO: 7) 5' GCGTCTAGACTAATAGAGAATACTAAAGTC 3' (SEQ ID NO: 8), esos cebadores se usaron para expresar el dominio activo putativo (soluble)/ Todos los cebadores 5' tienen un sitio de enzima de restricción BamHl (en negrillas) seguido por nucleótidos que se asemejan a una señal eficiente para el inicio de la traducción en células eucarióticas (Kozak, M., J. Mol. Biol., 196:947-950 (1987) (el codón de inicio de la traducción es "ATG") . Las secuencias del cebador 3' contienen el sitio escindido para la endonucleasa de restricción Xbal y tiene nucleótidos complementarios para el dominio soluble del TGFa 3' del gen de TGFa-HI . Las secuencias amplificadas fueron aisladas de un gen de agarosa el 1% usando un equipo comercialmente disponible ("Geneclean", BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.). El fragmento fue digerido entonces con las endonucleasas BamHl y Xbal y a continuación purificados nuevamente sobre un gel de agarosa al 1%. Este fragmento se designó como F2. Se usó el vector pA2 (modificación del vector pVL941, discutido más adelante) para la expresión de la proteína TGFa-HI usando el sistema de expresión de baculovirus (para una revisión véase/ Summers, M. D. y Smith, G. E. 1987, A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No. 1555) . Este vector de expresión contiene el promotor de polihedrina fuerte del virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcMNPV) seguido por los sitios de reconocimiento para las endonucleasas de restricción. Se usó el sitio de poliadenilación del virus de simio (SV)40 para la poliadenilación eficiente. Para una selección fácil del virus recombinante se insertó el gen de la beta-galactosidasa de E.coli en la misma orientación que el promotor de la polihedrina seguido por la señal de poliadenilacíón del gen de la polihedrina. Las secuencias de la polihedrina fueron flanqueadas en ambos lados por secuencias virales para la recombinación homologa mediada por la célula de ADN viral del tipo natural cotransfectado. Podrían usarse muchos otros baculovirus en lugar del pRGl tales como el pAc373, pVL941 y pAcIMl (Luckow, V. A. y Summers, M. D., Virology, 170:31-39) . El plásmido fue digerido con las enzimas de restricción BamHl y Xbal y a continuación se fosforiló usando fosfatasa intestinal de carnero por los procedimientos conocidos en la técnica. A continuación se aisló el ADN de un gel de agarosa al 1% usando el equipo comercialmente disponible ("Geneclean" BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.). El ADN del vector se designó como V2. El fragmento F2 y el plásmido desfosforilado V2 se ligaron con ADN ligasa T4. A continuación se transformaron células de E.coli HB101 y bacterias identificadas que contenían el plásmido (pBacTGFa-HI) con el gen del TGFa-HI usando las enzimas de restricción Ba Hl y Xbal. La secuencia del fragmento clonado se identificó por secuenciamiento del ADN.

Se cotransfectaron 5 µg de plásmido pBacTGFa-HI con 1.0 µg de un baculovirus linealizado comercialmente disponible ("ADN de baculovirus "BaculoGoldMR", Pharmingen, San Diego, CA. ) usando el método de lipofección (Felgner et al. Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 84:7413-7417 (1987)). lµg de ADN de virus BaculoGoldMR y 5µg del plásmido pBacTGFa-HI se mezclaron en un pozo estéril de una placa icrotituladora que contenía 50 µl de medio de Grace libre de suero (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) . Posteriormente se agregaron 10 µl de Lipofectina más 90 µl de medio de Grace, se mezcló e incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación se agregó la mezcla de transfeccíón gota a gota a células de insecto Sf9 (ATCC CRL 1711) sembradas en una placa de cultivo tisular de 35 mm con 1 ml de medio de Grace sin suero. La placa se agitó hacia atrás y hacia adelante para mezclar la solución nuevamente agregada. La placa se incubó a continuación durante 5 horas a 27°C. 5 horas después se removió la solución de transfección de la placa y se agregó 1 ml de medio de insecto de Grace suplementado con 1% de suero de carnero fetal al 10%. La placa se colocó nuevamente en un incubador y se continuó cultivando a 27°C durante cuatro días. Cuatro días después se efectuó el ensayo de la placa de manera similar a lo descrito por Summers y Smith (supra) . Como una modificación se usó un gel de agarosa con "Azul Gal" (Life Technologies Inc., Gaithersburg), la cual permitió un aislamiento fácil de las placas reñidas de azul. (Una descripción detallada de un "ensayo de placa" también puede encontrarse en la guía del usuario para el cultivo de células de insecto y baculovirología distribuido por Life Technologies Inc., Gaithersburg, páginas 9-10). Cuatro días después de la dilución en serie, se agregó el virus a las células y las placas teñidas de azul se extrajeron con la punta de una pipeta de Eppendorf. El agar que contenía los virus recombinantes fue suspendida entonces en un tubo de Eppendorf que contenía 200 µl de medio de Grace. El agar fue removido mediante una breve centrifugación y el sobrenadante que contenía el baculovirus recombinante se usó para infectar células Sf9 sembradas en discos de 35 mm. Cuatro días más tarde se cosecharon los sobrenadantes de esos discos de cultivo y a continuación se almacenaron a 4°C. Las células Sf9 se hicieron crecer en medio de Grace suplementado con 10% de FBS inactivado por calor. Las células fueron infectadas con el baculovirus recombinante V-TGFa-HI a una multiplicidad de infección (MOI) de 2. Seis horas más tarde se removió el medio y se colocó nuevamente con medio SF900 II menos metionina y cisteína (Life Technologies Inc., Gaithersburg). 42 horas después se agregaron 5 µCi de J5S-metionina y 5 µCi de i:'S cisteína (Amersham) . Las células se incubaron adicionalmente durante 16 horas antes de ser cosechadas por centrifugación y las proteínas marcadas se visualizaron por SDS-PAGE y autorradiografía.

Ejemplo 3 Expresión del TGFa-HI Recombinante en células COS La expresión del plásmido, TGFa-HI HA se derivó de un vector pcDNA3/Amp (Invitrogen) que contenía: 1) el origen de duplicación del SV40, 2) el gen de resistencia a la ampicilina, 3) el origen de duplicación de E.coli, 4) el promotor CMV seguido por una región polienlazante, un intrón de SV40 y un sitio de poliadenilación. Se clonó un fragmento de ADN que codifica para el precursor del TGFa-HI completo y una marca de HA fusionada en el marco en su extremo 3' en una región polienlazante del vector, por lo tanto, la expresión de la proteína recombinante fue dirigida bajo el promotor de CMV. La marca de HA corresponde a un epitopo derivado de la proteína hemaglutinina de la influenza como se describió anteriormente (I. Wilson, H. Niman, R. Heighten, A Cherenson, M. Connolly, y R. Lerner, 1984, Cell 37:767, (1984)). La infusión de la marca de HA a la proteína objetivo permite la fácil detección de la proteína recombinante con un anticuerpo que reconoce el epitopo HA. La estrategia de construcción del plásmído se describe como sigue: La secuencia de ADN que codifica para el TGFa-HI, ATCC # 97161, se construyó por PCR sobre el EST original clonado usando dos cebadores: el cebador 5' 5' CGCGGATCCGCCATCATGGTGCTGTGGGAGTCC 3' (SEQ ID NO: 12) que 'contiene un sitio BamHl (en negrillas) seguido por 18 nucleótidos de la secuencia que codifica para el TGFa-HI comenzando desde el codón de inicio/ la secuencia 3' 5' GCGCTCGAGGTATAGAACACTGTAGTCC 3' (SEQ ID NO: 13) que contiene las secuencias complementarias para un sitio Xhol, los últimos 19 nucleótidos del dominio TGFa y un sitio Xhol. El vector pCDNA3/Am? contiene los sitios de clonación Ba Hl/Xhol, los cuales llevan el inserto de la PCR en el marco con la marca HA 3' seguida por un codón de alto. Por lo tanto, el producto de la PCR contiene un sitio BamHl, la secuencia codificadora de 936 pares de bases y un sitio Xhol. El fragmento de ADN amplificado por PCR y el vector, pcDNA3/Amp, se digirieron con enzima de restricción BamHl y Xhol y se ligaron. La mezcla de ligación se transformó en la cepa de E. coli SURE (disponible de Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037), el cultivo transformado se cultivó en placas de medios con ampicilina y se seleccionaron las colonias resistentes. El ADN del plásmido se aisló de los transformantes y se examinó por análisis de restricción para la presencia del fragmento correcto. Para la expresión del TGFa-HI recombinante, se transfectaron células COS con el vector de expresión por el método de DEAE-DEXTRAN (J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio, Cold Spring Laboratory Press, (1989)).

La expresión de la proteina TGFa-HI HA fue detectada por el método de marcado radioactivo e inmunoprecipitación (E.

Harlow, D. Lañe, Anticuerpos: Un Manual de Laboratorio, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)). Las células se marcaron durante 8 horas con 35S-cisteina dos días después de la transfección. A continuación se recolectaron los medios de cultivo y las células se Usaron con detergente (amortiguador RIPA (NaCl 150 mM, NP-40 al 1%, SDS al 0.1%, NP-40 al 1%, DOC al 0.5%, Tris 50mM, pH 7.5) (Wilson, I. et al., Id. 37:767 (1984)). Ambos lisados celular y medio de cultivo se precipitaron con anticuerpo monoclonal específico para HA. Las proteínas precipitadas se analizaron sobre geles de PAGE con 15% de SDS.

Ejemplo 4 Expresión Via Terapia Genética Se obtuvieron fibroblastos de un sujeto por biopsia cutánea. El tejido resultante se colocó en medio de cultivo tisular y se separó en pequeñas piezas. Los pequeños trozos de cultivo se colocaron sobre una superficie húmeda de una matraz de cultivo tisular, se colocaron aproximadamente diez piezas en cada matraz. El matraz se volteó hacia abajo, se cerró herméticamente y se dejó a temperatura ambiente durante la noche. 24 horas después a temperatura ambiente, el matraz se invirtió y los trozos de tejido permanecieron fijos al fondo del matraz y se agregó medio fresco (por ejemplo, medio F12 de Ham, con 10% de FBS, penicilina y estreptomicina. Este se incubó a continuación a 37°c durante aproximadamente una semana. En ese momento, se agregó medio fresco y posteriormente se cambió diariamente. Después de dos semanas adicionales en cultivo, emergió una monocapa de fibroblastos. La monocapa se tripsinizó y se escaló a matraces más grandes . El pMV-7 (Kischmeier, P. T. et al, ADN, 5:219-25 (1988)) flanqueado por las repeticiones terminales largas del virus del sarcoma murino de Moloney, se digirió con EcoRI y HindIII y posteriormente se trató con fosfatasa intestinal de carnero. El vector lineal se fraccionó sobre gel de agarosa y se purificó, usando perlas de vidrio. El ADNc que codifica para un polipéptido de la presente invención se amplificó usando cebadores de PCR que corresponden a las secuencias del extremo 5' y 3' respectivamente. El cebador 5' que contiene un sitio EcoRI y el cebador 3' incluyen además un sitio HindIII. Se agregaron cantidades iguales del esqueleto lineal del virus del sarcoma murino de Moloney y el fragmento de EcoRI y HindIII amplificados, juntos, en presencia de ADN ligasa T4. La mezcla resultante se mantuvo bajo condiciones apropiadas para la ligación de los dos fragmentos. La mezcla de ligación se usó para transformar bacterias HB101, las cuales se cultivaron entonces en agar que contenía kanamicina con el propósito de confirmar que el vector tenía el gen de interés insertado apropiadamente. El pA317 anfotrópico o las células empacadas GP+aml2 se hicieron crecer en cultivo tisular hasta una densidad confluente en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) con 10% de suero de carnero (CS), penicilina y estreptomicina. El vector MSV que contiene el gen se agregó entonces al medio y las células empacadas se transdujeron con el vector. Las células empacadas producen ahora partículas virales que contienen el gen (las células empacadas son ahora referidas como células productoras) .

Se agregaron medios frescos a las células productoras transducidas, y posteriormente se cosecharon los medios de una placa de 10 cm de células productoras confluentes. Los medios usados, que contenían las partículas virales infecciosas, se filtraron a través de un filtro de millipore para remover las células productoras desprendidas y estos medios se usaron entonces para infectar células de fibroblasto. Se removieron los medios de una placa subconfluente de fibroblastos y se reemplazaron inmediatamente con los medios de las células productoras. Estos medios se removieron y reemplazaron con medios frescos. Si el título de virus es alto, entonces virtualmente todos los fibroblastos serán infectados y no se requerirá selección. Si el título es muy bajo, entonces será necesario usar un vector retroviral que tenga un marcador seleccionable, tal como el neo o his. Los fibroblastos alterados o diseñados se inyectaron entonces en el huésped, ya sea solos o después de haber crecido hasta la confluencia sobre células microportadoras citodex 3. Los fibroblastos producen ahora el producto proteico. Son posibles numerosas modificaciones y variaciones de la presente invención en el uso y las enseñanzas anteriores y, por lo tanto, dentro del alcance de las reivindicaciones anexas, la invención puede practicarse de otro modo al particularmente descrito.

LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: MEISSNER, ET AL. (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: Factor del Crecimiento aHI Transformado (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 8 (iv) DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA: (A) DIRECCIÓN: CARELLA, BYRNE, BAIN, GILFILLAN, CECCHI, STEWART & OLSTEIN (B) CALLE: 6 BECKER FARM ROAD (C) CIUDAD: ROSELAND (D) ESTADO: NEW JERSEY (E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL: 07068 (v) FORMA LEGIBLE EN COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: DISCO FLEXIBLE DE 3.5 PULGADAS (B) COMPUTADORA: IBM PS/2 (C) SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS (D) SOFTWARE: WORD PERFECT 5.1 (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: (A) NUMERO DE SOLICITUD: 08/468,846 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: Junio 6 de 1995 (C) CLASIFICACIÓN: (vii) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR: (A) NUMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: (viii) INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE: (A) NOMBRE: FERRARO, GREGORY D. (B) NUMERO DE REGISTRO: 36,134 (C) REFERENCIA/NUMERO DE DOCUMENTO: 325800-465 (ix) INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN: (A) TELEFONO: 201-994-1700 (B) TELEFAX: 201-994-1744 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:l: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1565 PARES DE BASES (B) TIPO: ACIDO NUCLEICO (C) HEBRA: SENCILLA (D) TOPOLOGÍA: LINEAL (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:l: TGGGCGCGCG GCTGGATGCC CCCGGCCTGC GGCTCCCTGC GCTTCCCGCC GTGGAGGGGC 60 ACCAGTCATG GGCGCCGCAG CCGCTGAGGC GCCGCTCCGG CTGCCTGCCG CGCCTCCGCT 120 CGCCTTCTGC TGCTACACGT CGGTGCTTCT GCTCTTCGCC TTCTCTCTGC CCGGGAGCCC 180 CGCGTCCAAC CAGCCCCCGG GTGGTGGCGG CGGCAGCGGC GGGGACTGTC CCGGCGGCAA 240 AGGCAAGAGC ATCAACTGCT CAGAATTAAA TGTGAGGGAG TCTGACGTAA GAGTTTGTGA 300 TGAGTCATCA TGTAAATATG GAGGAGTCTG TAAAGAAGAT GGAGATGGTT TGAAATGTGC 360 ATGCCAATTT CAGTGCCATA CAAATTATAT TCCTGTCTGT GGATCAAATG GGGACACTTA 420 TCAAAATGAA TGCTTTCTCA GAAGGGCTGC TTGTAAGCAC CAGAAAGAGA TAACAGTAAT 480 AGCAAGAGGA CCATGCTACT CTGATAATGG ATCTGGATCT GGAGAAGGAG AAGAGGAAGG 540 GTCAGGGGCA GAAGTTCACA GAAAACACTC CAAGTGTGGA CCCTGCAAAT ATAAAGCTGA 600 GTGTGATGAA GATGCAGAAA ATGTTGGGTG TGTATGTAAT ATAGATTGCA GTGGATGCAG 660 TTTTAATCCT GTGTGTGCTT CTGATGGGA3 TTCCTATAAC AATCCCTGTT TTGTTCGAGA 720 AGCATCTTGT ATAAAGCAAG AACAAATTGA TATAAGGCAT CTTGGTCATT GCACAGATAC 780 AGATGACACT AGTTTGTTGG GMAGAñAGA TGATGGACTA CAATATCGAG CAGATGTGAA 840 AGATGCTAGT GATCAAAGAG AAGATGTTTA TATTGGAAAC CACATGCCTT GCCCTGAAAA 900 CCTCAATGGT TACTGCATCC ATGGAAAATG TGAATTCATA TATTCTACTC AGAAGGCTTC 960 TTGTAGATGT GAATCTGGCT ACACTGGACA GCACTGTGAA AAGACAGACT TTAGTATTCT 1020 CTATGTAGTG CCAAGTAGGC AAAAGCTCAC TCATGTTCTT ATTGCAGCAA TTATTGGAGC 1080 TGTACAGATT GCCATCATAG TAGCAATTGT AATGTGCATA ACAAGAAAAT GCCCCAAAAA 1140 CAATAGAGGA CGTCGACAGA AGCAAAACCT AGGTCATTTT ACTTCAGATA CGTCATCCAG 1200 AATGGTTTAA ACTGATGACT TTTATATGTA CACTGACCAT GTGATGTACA TTTATTATGT 1260 CTTTTTTTAA AGAATGGAAA TATTTATTTC AGAGGCCTTA TTTTTGGACA TTTTTAGTGT 1320 AGTACTGTTG GCTCGTATTT AGAATATTCA GCTACGACAG TTTTGGACTG TTTAGTAGTC 1380 TTTGTTTTAT GTTTTTAAAT ACAGAAATTG CTTTCACAAA TTTGTACCAC ATGGTAATTC 14 0 TAAGACTTGT TCTTTACCCA TGGAATGTAA TATTTTTCCA AAGATGGACT ACTTCACAAA 1500 TGGTTATAAA GTCATATCCA CTTCTTCCAC AATGACCACA GCAAATGACC AAGCATGAAC 1560 TAAAG 1565 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 380 PARES DE BASES (B) TIPO: AMINOÁCIDO (C) HEBRA: I (D) TOPOLOGÍA: LINEAL (ii) TIPO DE MOLÉCULA: PROTEINA (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2: Met Gly Ala Ala Ala Ala Glu Ala Pro Leu Arg Leu Pro Ala Ala -35 -30 -25 Pro Pro Leu Ala Phe Cys Cys Tyr Thr Ser Val Leu Leu Leu Phe -20 -15 -10 Ala Phe Ser Leu Pro Gly Ser Arg Ala Ser Asn Gln Pro Pro Gly -5 1 5 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Asp Cys Pro Gly Gly Lys Gly Lys 10 15 20 Ser lie Asn Cys Ser Glu Leu Asn Val Arg Glu Ser Asp Val Arg 25 30 35 Val Cys Asp Glu Ser Ser Cys Lys Tyr Gly Gly Val Cys Lys Glu 40 45 50 Aap Gly Asp Gly Leu Lys Cys Ala Cys Gln Phe Gln Cys His Thr 55 60 65 Asn Tyr lie Pro Val Cys Gly Ser Asn Gly Asp Thr Tyr Gln Asn 70 75 80 Glu Cys Phe Leu Arg Arg Ala Ala Cys Lys His Gln Lys Glu He 85 90 95 Thr Val He Ala Arg Gly Pro Cys Tyr Ser Asp Asn Gly Ser Gly 100 105 110 Ser Gly Glu Gly Glu Glu Glu Gly Ser Gly Ala Glu Val His Arg 115 120 125 Lys His Ser Lys Cys Gly Pro Cys Lys Tyr Lys Ala Glu Cys Asp 130 135 140 Glu Asp Ala Glu Asn Val Gly Cys Val Cys Asn He Asp Cys Ser 145 150 155 Gly Tyr Ser Phe Asn Pro Val Cys Ala Ser Asp Gly Ser Ser Tyr 160 165 170 Asn Asn Pro Cys Phe Val Arg Glu Ala Ser Cys He Lys Gln Glu 175 180 185 Gln He Asp He Arg His Leu Gly His Cys Thr Asp Thr Asp Asp 190 195 200 Thr Ser Leu Leu Gly Lys Lys Asp Aap Gly Leu Gln Tyr Arg Pro 205 210 215 Asp Val Lys Asp Ala Ser Asp Gln Arg Glu Asp Val Tyr He Gly 220 225 230 Asn His Met Pro Cys Pro Glu Asn Leu Asn Gly Tyr Cys He His 235 240 245 Gly Lys Cys Glu Phe He Tyr Ser Thr Gln Lys Ala Ser Cys Arg 250 255 260 Cys Glu Ser Gly Tyr Thr Gly Gln His Cys Glu Lys Thr Asp Phe 265 270- 275 Ser He Leu Tyr Val Val Pro Ser Arg Gln Lys Leu Thr His Val 280 285 290 Leu He Ala Ala He He Gly Ala Val Gln He Ala He He Val 295 300 305 Ala He Val Met Cys He Thr Arg Lys Cys Pro Lys Asn Asn Arg 310 315 320 Gly Arg Arg Gln Lys Gln Asn Leu Gly His Phe Thr Ser Asp Thr 325 330 335 Ser Ser Arg Met Val 340 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 PARES DE BASES (B) TIPO: ACIDO NUCLEICO (C) HEBRA: SENCILLA (D) TOPOLOGÍA: LINEAL (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3: CCCGGATCCG CACGAGACAT ACCTTGTCCG 30 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 32 PARES DE BASES (B) TIPO: ACIDO NUCLEICO (C) HEBRA: SENCILLA (D) TOPOLOGÍA: LINEAL (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4: GGGAAGCTTT TAATACTGAA ATCGTACAGG AC 32 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 32 PARES DE BASES (B) TIPO: ACIDO NUCLEICO (C) HEBRA: SENCILLA (D) TOPOLOGÍA: LINEAL (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5: CGCGGATCCG CCATCATGGG CGCCGCAGCC GC 32 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 31 PARES DE BASES (B) TIPO: ACIDO NUCLEICO (C) HEBRA: SENCILLA (D) TOPOLOGÍA: LINEAL (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6: GCGTCTAGAC TAGTATAGAA CACTGTAGTC C 31 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 33 PARES DE BASES (B) TIPO: ACIDO NUCLEICO (C) HEBRA: SENCILLA (D) TOPOLOGÍA: LINEAL • (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7: CGCGGATCCA GTTTATATTG GAAACCACAT GCC 33 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 PARES DE BASES (B) TIPO: ACIDO NUCLEICO (C) HEBRA: SENCILLA (D) TOPOLOGÍA: LINEAL (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8: GCGTCTAGAC TAATAGAGAA TACTAAAGTC 30 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende un miembro seleccionado del grupo que consiste de: (a) un polinucleótido que codifica para el polipéptido expuesto en la Figura 1/ (b) un polinucleótido que codifica para el polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 380 de la Figura 1/ (c) un polinucleótido que codifica para el polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 316 de la Figura 1/ (d) un polinucleótido que codifica para el polipéptido que comprende los aminoácidos 267 a 316 de la Figura 1/ (e) un polinucleótido que codifica para el polipéptido que comprende los aminoácidos 40 a 316 de la Figura 1/ y (f) un polinucleótido capaz de hibridarse a y que es al menos 70% idéntico al polinucleótido de (a) , (b) , (c), (d) o (e); y (h) un fragmento polipeptídico del polinucleótido de (a), (b) , (c) , (d) o (f) .

2. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polinucleótido es ADN.

3. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque codifica para el polipéptido que comprende los aminoácidos 267 a 316 como se expone en la Figura 1.

4. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende un miembro seleccionado del grupo que consiste de: (a) un polinucleótido el cual codifica para un polipéptido maduro que tiene la secuencia de aminoácidos expresada por el ADN contenido en el Depósito ATCC No. 97161; (b) un polinucleótido capaz de hibridarse a y que es al menos 70% idéntico al polinucleótido de (a) / y (c) un fragmento polinucleotídico del polinucleótido de (a) o (b) .

5. Un vector, caracterizado porque contiene el ADN de conformidad con al reivindicación 2.

6, Una célula huésped, caracterizada porque es transformada o transfectada con el vector de conformidad con la reivindicación 5.

7. Un proceso para producir un polipéptido, caracterizado porque comprende: expresar de la célula huésped de conformidad con al reivindicación 6 el polipéptido codificado por tal ADN.

8. Un proceso para producir células capaces de expresar un polipéptido que comprende células diseñadas o alteradas genéticamente con el vector de conformidad con la reivindicación 5.

9. Un polipéptido, caracterizado porque comprende un miembro seleccionado del grupo que consiste de: (a) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos deducida de la Figura 1; (b) un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 380 como se expone en la Figura 1/ (c) un polipéptido que comprende los aminoácidos 267 a 316 como se expone en la Figura 1/ (d) un polipéptido que comprende los aminoácidos 40 a 316 como se expone en la Figura 1; (e) un polipéptído que comprende los aminoácidos 1 a 316 como se expone en la Figura 1/ (f) fragmentos, análogos y derivados del polipéptido de (a), (b) , (c) , (d) o (e) / y (g) un polipéptido codificado por el ADNc del Depósito ATCC No. 97161 y fragmentos, análogos y derivados de tal polipéptido.

10. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque comprende del aminoácido 267 al aminoácido 316 de la Figura 1.

11. Un anticuerpo caracterizado porque es contra el polipéptido de conformidad con la reivindicación 9.

12. Un compuesto, caracterizado porque inhibe la activación del polipéptido de conformidad con al reivindicación 9.

13. Un compuesto, caracterizado porque activa el polipéptido de conformidad con la reivindicación 9.

14. Un método para el tratamiento de un paciente que tiene necesidad del TGFa-HI caracterizado porque comprende: administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido de conformidad con la reivindicación 9.

15. Un método para el tratamiento de un paciente que tiene necesidad del TGFa-HI caracterizado porque comprende: administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido de conformidad con la reivindicación 12.

16. El método de conformidad con al reivindicación 14, caracterizado porque la cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido se administra proporcionando al paciente el ADN que codifica para el polipéptido y expresando tal polipéptido in vivo.

17. Un proceso para identificar compuestos activos como agonistas del polipéptido de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque comprende: poner en contacto una mezcla de reacción que contiene un tipo de célula que expresa un receptor del TGFa-HI y un compuesto a ser seleccionado/ y determinar si el compuesto genera una señal del receptor para identificar si el compuesto es un agonista efectivo. —

18. Un proceso para identificar compuestos activos como antagonistas del polipéptido de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque comprende: poner en contacto una mezcla de reacción que contiene un tipo de célula que expresa el receptor del TGFa-HI y un compuesto a ser seleccionado/ y detectar la ausencia de una señal generada del receptor después de la unión del compuesto para identificar si el compuesto es un antagonista efectivo.

19. Un proceso para diagnosticar una enfermedad o una susceptibilidad a una enfermedad, caracterizado porque comprende : determinar una mutación en el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1.

20. Un proceso de diagnóstico, caracterizado porque comprende : analizar la presencia del polipéptido de conformidad con la reivindicación 9 en una muestra derivada del huésped.