EP1027076A2 - Verwendung von vektoren wie adenoviren und/oder adeno-assoziierten viren und/oder retroviren und/oder herpes-simplex-viren und/oder liposomen und/oder plasmiden als vehikel für genetische information zur befähigung von säugetierzellen mittel, zur behandlung von knochenpathologien zu produzieren - Google Patents

Verwendung von vektoren wie adenoviren und/oder adeno-assoziierten viren und/oder retroviren und/oder herpes-simplex-viren und/oder liposomen und/oder plasmiden als vehikel für genetische information zur befähigung von säugetierzellen mittel, zur behandlung von knochenpathologien zu produzieren

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EP1027076A2
EP1027076A2 EP98959810A EP98959810A EP1027076A2 EP 1027076 A2 EP1027076 A2 EP 1027076A2 EP 98959810 A EP98959810 A EP 98959810A EP 98959810 A EP98959810 A EP 98959810A EP 1027076 A2 EP1027076 A2 EP 1027076A2
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EP
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bone
vectors
cells
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viruses
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Application number
EP98959810A
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Axel Wilhelm August Baltzer
Christian Lattermann
Janey Desales Whalen
Paul David Robbins
Christopher Howard Evans
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Original Assignee
University of Pittsburgh
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • vectors such as adenoviruses and / or adeno-associated viruses and / or retroviruses and / or herpes simplex viruses and / or liposomes and / or piasmids as vehicles for genetic information to enable mammalian cells to produce agents for the treatment of bone pathogens.
  • the invention relates to the use of adenoviruses and / or adeno-associated viruses and / or retroviruses and / or herpes simplex viruses and / or liposomes and / or piasmids as vectors, respective vehicles for genetic information to enable mammalian cells to be therapeutically enabled, to produce proteins, effective as medicinal products, for correcting bone pathologies at the cellular level.
  • the enzyme activity of the luciferase after intraosseous vector application of Ad-Luc is shown in FIG. 4. It demonstrates that transgene expression persists in the bones and muscles over the entire course of the examination interval of 21 days. Transgene expression from the liver (2 days) and draining lymph nodes (14 days) is transient and does not reach the level of enzyme activity in the area of the injection.
  • luciferase activity was found in the bone and bone marrow, as well as in the defect-filling connective tissue and in the surrounding muscle tissue at the injection site. 5 days after the transduction there was a slight luciferase activity in the liver which disappeared completely after 10 days. No luciferase activity could be found in the contralateral femur, the lungs and the spleen (Fig. 8).

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Abstract

Offenbart wird die Verwendung von Vektoren wie Adenoviren und/oder Adeno-assoziierten Viren und/oder Retroviren und/oder Herpes-Simplex-Viren und/oder Liposomen und/oder Plasmiden als säugerzellenstimulierendes Mittel zur Herstellung von therapeutischen, als Arzneimittel wirkenden Proteinen auf zellulärem Niveau zur genetischen Behandlung von Knochenpathologien.

Description

Verwendung von Vektoren wie Adenoviren und/oder Adeno-assoziierten Viren und/oder Retroviren und/oder Herpes Simplex Viren und/oder Liposomen und/oder Piasmiden als Vehikel für genetische Information zur Befähigung von Säugetierzellen Mittel zur Behandlung von Knochenpathoiogien zu produzieren.
Die Erfindung betrifft die Verwendung von Adenoviren und/oder Adeno-assoziierten Viren und/oder Retroviren und/oder Herpes Simplex Viren und/oder Liposomen und/oder Piasmiden als Vektoren, respective Vehikel für genetische Information, um Säugetierzellen auf genetischem Wege zu befähigen therapeutische, als Arzneimittel wirksame Proteine zur Korrektur von Knochenpathologien, auf zellulärer Ebene, herzustellen.
Bei Adenoviren handelt es sich um einfache, aus Doppelstrang DNA und Proteinen aufgebaute DNA-Viren, von den einige humanpatogen sind, Infektionen des Auges und des Respirationstraktes verursachen. Viele Arten induzieren Tumore in Versuchstieren, die nicht dem natürlichen Wirt entsprechen oder können Zellen in vitro transformieren. Adenovirale Vektoren sind veränderte Adenoviren, die die Fähigkeit zur Replikation in vivo und ihre typische Pathogenität eingebüßt haben.
Auch das Adeno-assoziierte Virus ist als solches bekannt und wird beispielsweise zur Markierung von Zellen eingesetzt, wie in der WO 95/14232 näher beschrieben.
Unter Retroviren im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man RNA Viren der Klasse 6, die einsträngige Ribonukleinsäure (RNA) und das Enzym reverse Transkriptase enthalten. Mit Hilfe dieses Enzyms wird die in die Wirtszelle gelangene RNA in DNA übersetzt, um mitsamt zusätzlicher repetitiver Sequenzen anschließend in das Wirtsgenom integriert und als sogenanntes Provirus mit ihm repliziert zu werden. Retroviren, die als Vektoren in der Gentechnologie eingesetzt werden, sind replikationsdefizient und apathogen bezüglich ihrer typischen Pathogenität.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein genetisches Behandlungsverfahren für im einzelnen weiter unten aufgeführte Knochenpathologien bereitzustellen, welches ein spezielles Mittel beinhaltet, um Säugetierzellen zur Herstellung von therapeutischen Proteinen zu befähigen. Die Übertragung der genetischen Information wird durch spezielle Vektoren ermöglicht.
Die Erfindung betrifft somit die Verwendung von Vektoren wie Adenoviren und/oder Adeno-assoziierten Viren und/oder Retroviren und/oder Herpes-Simplex Viren und/oder Liposomen und/oder Piasmiden als säugerzellenstimulierendes Mittel zur Herstellung von therapeutischen, als Arzneimittel wirkenden Proteinen auf zellulärem Niveau, zur Behandlung von Knochenpathologien.
Nach einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den Adenoviren um adenovirale Vektoren. Dies sind von den derzeit über 40 bekannten humanen Adenovirentypen, wie beispielsweise Ad2 und Ad5, die, zum Vektor transformiert, erfindungsgemäß eingesetzt werden können. Diese werden dahingehend verändert, daß sie Ihre Fähigkeit zur Replikation in vivo und ihre Pathogenität dadurch einbüßen, daß die essentielle E-1 -Sequenz entfernt worden ist. Anstelle der E1 -Sequenz und der nicht essentiellen E3-Sequenz wird bei adenoviralen Vektoren die cDNA eingebaut, die für die therapeutischen Gene und Markergene kodiert. Die cDNA wird bei Eindringen des Virus in die Zelle im Nucleus episomal abgelagert. Über den gängigen Protein-Synthese-Apparat der Zellen werden dann die kodierten Substanzen produziert und exprimiert.
Nach einer anderen besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den Adeno-assoziierten Viren um ein Adeno-assozierte virale Vektoren. Beispiele hierfür sind das adenoassoziierte Virus vom Wildtyp, welches im Journal of Virology Februar 1983, Vol. 45, S. 555-564, insbesondere Fig. 1 bis 4 und den Abschnitten Materials and Methods und Results, worauf ausdrücklich Bezug genommen wird, beschrieben ist.
Rekombinante Retroviren, die zur Zeit als Vektoren in humanen Gentherapie- Versuchen benutzt werden stammen sämtlich vom Wild-Typ des Moloney Murinen Leukämie (MoMuLV) Retrovirus ab. Die rekombinanten Viren sind strukturell mit dem Wild-Typ des Retrovirus identisch, tragen aber ein genetisch verändertes Genom, das für die therapeutischen Gene, bzw. die Markergene kodiert. Rekombinante Retroviren können sich in vivo nicht mehr selbst replizieren, sind jedoch noch infektiös und integrieren das Genom in die DNA der Zielzellen. Die pathogenen viralen Gene sind komplett entfernt.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Vektoren um Herpes-Simplex Virus Vektoren. Dies sind neurotrope humane Viren, die auch reife Neuronen befallen, und als Wildtyp-Virus eine Infektion vom latenten Typ verursachen können. Als virale Vektoren werden beispielsweise das Herpes Simplex Virus -1 in einer replikationsdefizienten, apathogen Form genutzt. Ein besonderer Vorteil des Herpes Simplex Virus Vektors ist es, auch besonders große fremde cDNA-Fragmente zu integrieren.
Nach einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den Liposomen um liposomale Vektoren, die die genetische Information für Wachstumsfaktoren oder Zytokine, bzw. deren Inhibitoren enthalten und auf Säugetierzellen übertragen können. Es wird bezüglich der liposomalen Vektoren auf die Veröffentlichung von Gao und Huang in Biochem Biophys Res Commun 179:280 bis 285, 1991 verwiesen.
Nach einer anderen besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den Piasmiden um solche, die die genetische Information für Wachstumsfaktoren oder Zytokine, bzw. deren Inhibitoren enthalten und auf Säugetierzellen übertragen können. Es wird bezüglich als Vektoren benutzten Plasmide auf die Veröffentlichung von Smith, Shepherd, et al. in Gene Therapy 3:190 bis 200, 1996 verwiesen. Bei dem erfindungsgemäß beschriebenen Verfahren werden auf zellulärem Niveau therapeutische Proteine erzeugt, bei denen es sich um Wachstumshormone, Zytokine oder Zytokininhibitoren handelt. Hier sind beispielhaft genannt: Transforming growth factor-ß (TGF-ß) z.B. TGF-ß 1-5, Bone morphogenetic proteins (BMP) z.B. BMP-2-7, respektive osteogenic protein-1 (OP-1) z.B. OP- 1 , Insulin like growth factor (IGF) z.B. IGF-1 und -2, fibroblast growth factor (FGF) z.B. FGF-1 und -2, Platelet derived growth factor (PDGF), Tumor-Nekrosis-Faktor (TNF) zum Beispiel TNF-ß oder TNF-α, lnterleukin-6-inhibitoren, Macrophage-colony stimulating factor (M-CSF)-Inhibitoren, Granulcyte/Macrophage-colony stimulating factor (GM- CSF)-lnhibitoren, Interleukine wie lnterleukin-4, lnterleukin-10 und lnterleukin-13.
Nach einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den Säugetierzellen um tierische oder menschliche Zellen, insbesondere Knochenzellen, Knochenmarkszellen, Bindegewebszellen und/oder Muskelzellen.
Nach einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Vektoren, die zur Produktion der Arzneimittel durch die transfizierten Zellen führen, parenterai appliziert.
Nach einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Vektoren, die zur Produktion der Arzneimittel durch die transfizierten Zellen führen, intraossär appliziert.
Nach einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Vektoren, die zur Produktion der Arzneimittel durch die transfizierten Zellen führen, lokal an den Ort der Knochenpathologie appliziert.
Nach einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, im nachfolgenden ex vivo Verfahren genannt, werden zur weiteren Behandlung Säugetierzellen dem Körper entnommen, dann in vitro mittels der vorgenannten Vektoren transduziert, in einem geeigneten Medium kultiviert und autolog reimplantiert, wonach am Ort der Knochenpathologie diese Säugetierzellen die als Arzneimittel wirksamen, therapeutischen Proteine produzieren. Nach einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den Knochenpathologien um Osteoporose, lokalen oder systemischen Knochenmasseverlust, Knochensubstanzverlust oder Knochenstrukturstörungen, Knochenbrüche mit Knochensubstanzverlust, Defektfrakturen, oder Pseudathrosen, Knochendefektzustände nach Operationen, Morbus Sudek, Knochensubstanzverlust bei Endoprothesenlockerungen, periartikuläre Osteolysen bei Erkrankungen des rheumatischen Formenkreises z.B. bei der rheumatoiden Arthritis und/oder Osteonekrosen.
Nach einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann als Knochenpathologie auch das Einheilen von Transplantaten, insbesondere ligamentärer, knöchenen oder tendinösen Transplantaten eingesetzt, z.B. in der Knie- und Schulterchirurgie, beschleunigt werden.
Nach einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird zur Verbesserung des Knochenaufbaus die genetische Information (cDNA) der therapeutisch wirksamen Proteine Bone Morphogenetic Proteins 2 - 7 (BMP 2 - 7), Transforming growth factor-ß (TGF-ß), Fibroplast growth factors (FGFs), Insulin-like growth factors (IGFs), Platelet derived growth factors (PDGFs), sowie Vascular Endothelial growth factor (VEGF) verwandt, oder die cDNA von Zytokinen oder Zytokininhibitoren, z.B. Interleukin-I Rezeptor Antagonist Protein (IL-1Ra) oder Tumor Nekrosis Faktor-α (TNF-α)-lnhibitoren.
Nach einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird zur Reduktion des Knochenabbaus die genetische Information (cDNA) zur Bildung von Zytokininhibitoren, z. B. lnterleukin-1 Rezeptor Antagonist (IL-1Ra) und sTNFαR (löslichem Tumor Nekrose Faktor α Rezeptor) und lnterleukin-6-lnhibitoren oder resorptionshemmende Zytokine wie lnterleukin-10, eingesetzt.
Die vorliegende Erfindung wird nun durch Figuren näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 eine Auftragung der Produktion des therapeutischen Proteins IL-1 Ra pro 50.000 Zellen nach 48 h [in pg] für mit MFG transduzierten osteoblastäre Zellen (Proben 1 - 6, Werte von durchschnittlich 9111 ,5 pg) gegenüber nicht transduzierten osteoblastären Zellen (Kontrolle 1a - 3a, Werte um 0 pg) und retroviralen LacZ transduzierten osteoblastären Zellen (Kontrolle 1b - 3b, Werte um 0 pg). Die Messung erfolgte durch ELISA Analyse.
Fig. 2 eine Auftragung der spontanen Produktion von Alkalischer Phosphatase (ALP) durch humane osteoblastäre Zellen (HOB) (9,5 Units pro 1.000.000 Zellen), ebenso wie die positiven Kontrollen, die mit murinen Osteogenensis imperfecta Stammzellen (OIM) nach Stimulation mit BMP-2 (30 Units pro 1.000.000 Zellen) durchgeführt wurden. Die Negativ-Kontrollen mit immortalisierten synovialen Fibroblasten (HIG-82) produzieren keine Alkalische Phosphatase. Auch im azellulären Nährmedium (keine Zellen = no cells) ist keine ALP vorhanden.
Fig. 3 eine Auftragung der Abnahme des Trockengewichtes der Humeri, Tibiae und Fibulae in mg bei weißen Balb/C Mäusen durch eine Ovarektomie (OVX) 12 Tage postoperativ, im Vergleich zu simuliert operierten Mäusen (sham). Durch intraossäre Applikation von 109 pfu Ad-IL-1Ra (OVX-IL-1Ra) ließ sich der Knochenmasseverlust im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe (OVX-LacZ) um etwa 50% reduzieren.
Fig. 4 eine Auftragung der Expression des Markerenzyms Luciferase [Units/g] in der weißen Balb/C Maus im Knochengewebe, Muskelgewebe, Lymphknotengewebe, sowie leicht und transient auch in der Leber, nach intraossär/intramuskulärer Transduktion der Femora mit 109 pfu Ad-Luc. Lunge und Milz werden von den adenoviralen Vektoren offenbar nicht erreicht und zeigen keine Enzym-Expression. In Knochen und Muskulatur dauert die Enzymexpression für den gesamten Untersuchungszeitraum von 21 Tagen an, in der Leber ist eine Expression nur für die Dauer von fünf Tagen feststellbar, in den drainierenden Leisteniymphknoten für die Dauer von 14 Tagen. Es kann somit außerhalb des Applikationsbereiches eine geringe und zeitlich stark limitierte Transgen-Expression angenommen werden.
Fig. 5 den systemischen Nachweis von transgenem IRAP (lnterleukin-1 Rezeptor Antagonist Protein) über einen Verlauf von 12 Tagen in weißen Balb/C Mäusen, um die Güte verschiedener Applikationsformen von Ad-IL-1Ra, bei systemischen Knochenerkrankungen zu testen. Nach intrafemoraler Applikation (♦) von 109 pfu Ad- IL-IRa finden sich positive systemische IRAP-Spiegel für die gesamte Untersuchungsdauer von 12 Tagen mit maximalen Werten am 3. Tag von nahezu 100 pg/ml. Im Gegensatz dazu werden durch intravenöse Gabe von Ad-IL-1Ra (•) geringere Werte bis zu 32 pg/ml, bei einer maximalen Expressionsdauer von 3 Tagen erreicht. In der Negativ-Kontrolle, die mit 109 pfu des nicht therapeutischen Markergens Ad-LacZ (A) durchgeführt wurde konnte systemisch kein Nachweis für transgene IL-1Ra Spiegel geführt werden.
Fig. 6 die im Urin ausgeschiedene Menge an Desoxypyridinoline-Crosslinks [nM], nach Ovarektomie (OVX) bzw. simulierter Ovarektomie (sham) bei weißen Balb/C Mäusen. Es wird deutlich, daß nach Ovarektomie mehr Desoxypyridinoline- Crosslinks im Urin ausgeschieden werden, die als direkter osteoklastärer Aktivitätsparameter gelten.
Fig. 7 eine 50-fach vergrößerte Ansicht eines Paraffinschnittes der intrafemoralen Cavität von Balb/C Mäusen nach intraossärer Transduktion mit 109 pfu adenoviraler Vektoren, die für LacZ (ß-Galaktosidase) kodieren. Morphologisch sind vor vor allem ruhende Osteoblasten (lining osteoblasts) aber auch Knochenmarkzellen transduziert. Diese Zellen sind mittels Pfeilen markiert. Fig. 8 eine Auftragung der Expression des transgenen Enzyms Luciferase [Units/μl] nach Injektion von 1010 pfu Ad-Luc in den femoralen Defekt beim weißen Neuseeland Hasen. Das Verteilungsmuster der Enzymaktivität verdeutlicht, daß nach lokaler Vektoren-Applikation in den Knochendefekt die Expression der Transgene offenbar hauptsächlich aus lokalen Gewebestrukturen erfolgt. Knochen, Defekt- /Narbengewebe und Muskulatur exprimieren das Transgen mit hohen Expressionswerten (bis zu 70.000 Units/100 μl im Muskel). Kein Nachweis einer Transgenaktivität findet sich in der Lunge, der Milz und in contralateralen, muskuloskelettären Gewebeproben (nicht graphisch dargestellt). Lediglich in der Leber läßt sich eine transiente, schwache Transgenaktivität für 5 Tage nachweisen. Die Genexpression war im Knochen für insgesamt 42 Tage am längsten nachweisbar, im Defekt-füllenden Gewebe und in der Muskulatur war nach 15, bzw, 26 Tagen keine Genexpression mehr nachweisbar.
Fig. 9 eine 50-fache Vergrößerung eines entkalkten Paraffinschnittes aus dem Bereich des femoralen Defektes am weißen Neuseeland-Hasen. Morphologisch sind neben Bindegewebszellen auch Adipozyten und möglicherweise Stammzellen transduziert. Auch hier sind diese Zellen durch Pfeile markiert.
Fig.10 eine 20-fache Vergrößerung eines entkalkten Paraffinschnittes aus dem Bereich des Defektrandes beim femoralen Defektmodell am weißen Neuseeland- Hasen. Histomorphologisch sind neben ruhenden Osteoblasten, die durch Pfeile angedeutet sind, auch Bindegewebszellen der angrenzenden Narbe transduziert.
Fig. 11 exemplarisch anhand von drei Röntgenaufnahmen den Heilungsverlauf des femoralen Defektes beim weißen Neuseelandhasen, 5 Wochen nach intraläsionaler Transduktion mit 2 x 1010 pfu adenoviraler Vektoren, welche für BMP-2 kodieren. Deutlich ist in allen drei Fällen ein nahezu vollständige Füllung der Defektkammer mit mineralisierten Knochen zu erkennen. Fig. 12 exemplarisch anhand von drei Röntgenaufnahmen den Heilungsverlauf des femoralen Defektes beim weißen Neuseelandhasen, 5 Wochen nach intraläsionaler Transduktion mit 2 x 1010 pfu adenoviraler Vektoren, welche für das nicht therapeutische Markergen Luciferase kodieren. Es sind deutliche ossäre Substanzdefekte in der Defektkammer zu sehen. Der Vergleich mit dem Heilungsverlauf nach Applikation therapeutischer Vektoren (Fig. 11) zeugt von einer guten Wirksamkeit des transgenen BMP-2.
Fig. 13 eine Produktion von humanen IL-1 Ra Osteoblastzellen im Anschluß an eine in vitro Transduktion mit Ad-IRAP nach einer multiplicity of infection von 1000. Der höchste Grad an Expression wurde 3 Wochen nach der Transduktion gefunden. Die Genexpression war in vitro für 72 Tage nachweisbar.
Die vorliegende Erfindung wird nun weiterhin durch Ausführungsbeispiele näher erläutert, wobei Prozentangaben jeweils sich auf Gewichtsprozentangaben beziehen.
Anwendunqsbeispiel 1 :
In vitro Evaluation einer Osteoporose Therapie mit retroviraien Vektoren anhand humaner osteoblastärer Zellpopulationen.
Material und Methodik
Als Grundlage der Zellxkulturen diente humaner spongiöser Knochen, der von informierten Patienten mit therapeutischer radialer oder ulnarer Resektionsosteotomie gewonnen wurde. Zellen mit arth rotischen, oft mit nekrotischen Veränderungen versehenen Hüftköpfen waren nur schwer zu kultivieren und hatten lediglich eine kurze Überlebenszeit in vitro.
Isolierung der Zellen
Nach Entfernung der cortikalen Anteile wurde der verbleibende spongiöse Knochen mit Stücken von etwa 1mm3 zerteilt und nachfolgend in Kultur genommen. Fragmente mit verbliebenen cortikalen Anteilen wurden über Nacht mit 0,1% Collagenase (Seromed, Berlin) in 25 cm2 Zellkulturflaschen (Nunc, Dänemark) behandelt. Anschließend wurde die Collagenaselösung entfernt und die Spongiosafragmente 3 mal mit PBS (Seromed, Berlin) gewaschen. Die durch den Collagenaseverdau freigesetzten Bindegewebszellen wurden dadurch quantitativ entfernt. Die Knochenfragmente wurde anschließend in Nährmedium (RPMI Medium 1640 (CibcoBRL, Grand Island, NY, USA)) mit 10 % fetalem Kälber Serum (FBS) und 1 %iger Penicillin/Streptomycinlösung (CibcoBRL, Grand Island, NY, USA)) kultiviert. Die Kultivierung der Zellen erfolgte im Inkubator bei 37 °C unter 5 %iger Kohlendioxidbegasung. Nach etwa 16 bis 20 Tagen begannen die Zellen die Oberfläche der Spongiosa sowie den Boden der Kulturflaschen zu besiedeln. Die Zellen erreichten nach weiteren 3 Wochen Konfiuenz und wurden nach Trypsinierung mit 2 ml Trypsin (Trypsin, 0,25 % (CibcoBRL, Grand Island, NY, USA)) mit den entsprechenden Analysen auf Zellkulturflaschen und Zellkulturschalen aufgeteilt.
Produktion der Virus-Partikel
Die Produktions-Zellinien für die retroviralen Partikel basieren auf einem Derivat der NIH3T3 Zellinie (CRIP). Die Zellinie enthält gentechnisch integrierte virale env und gag Gene. Diese erlauben die Produktion von retroviralen Viren aus den Proviren MFG-IRAP und BAG. MFG-IRAP und CRIP-BAG sind in der Publikation von G. Bandara et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:10764 bis 10768 (1993) unter dem Titel Intraarticular expression of bioiogically active interleukin-1-receptor-antagonist protein by ex vivo gene transfer beschrieben. Beide Zellinien produzieren amphotropische retrovirale Partikel, weisen also ein breite Wirtsspezifität auf. MFG- IRAP trägt die cDNA des humanen Interleukin-I Rezeptor Antagonist (hlL-1 Ra).
BAG trägt das bakterielle ß-Galaktosinase Gen (LacZ) und ein Neomycin Resistenz Gen {neoR), welches eine Selektion der transfizierten Zelle ermöglicht. Als Promotor für die hlL-1 Ra-cDNA und LacZ dient der virale long terminal repeat (LTR). Die CRIP-Zellen werden in (DMEM)-Medium (CibcoBRL, Grand Island, NY, USA), 10 % FBS (CibcoBRL, Grand Island, NY, USA) und 1 % HEPES (CibcoBRL, Grand Island, NY, USA) im Inkubator bei 37 °C und 5 % Kohlendioxidbegasung kultiviert.
Der Virus enthaltende Überstand wurde täglich aus konfluenten Kulturen gesammelt. Nach Filtration durch einen 0,45 μm feinen Spritzenfilter (Sartorius AG, Deutschland) wurde die Vektorensuspension bei -80 °C bis zur Benutzung aufbewahrt. MFG und BAG stammen beide vom Moloney Murinen Leukämie Virus (MoMuLV, wie von P. Wehling et al. in Spine 21 : 931-935 (1996) sowie S. Wells et al. in Gene Therapy 2: 512-520 (1995) beschrieben). MFG wurde als Vektor bereits in verschiedenen gentherapeutischen Versuchen eingesetzt, einschließlich einem humanen Phase-I Versuch bei der Rheumatoiden Arthritis. Beide Retroviren sind nicht mehr autonom replikationskompetent, das heißt, daß eine selbständige Vermehrung des Retrovirus in vivo nicht möglich ist.
Transduktion
Die osteoblastären Zellen wurden mittels Trypsin-Verdau aus den Zellkulturflaschen gelöst und in 12 well plates Zellkulturschalen mit 30.000 Zellen pro Schale ausgebracht. Nach Erreichen von etwa 80 % Konfluenz wurde das Nährmedium entfernt und die Zellen zweimal mit 3 ml physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Die Transduktion wurde mit 1 ml viralem Überstand bei einer Viruskonzentration von 1 x 106 Partikeln Retrovirus pro ml Virusüberstand durchgeführt und mit einem kationischen Polymer, das heißt einem Copolymeren aus N,N,N',N'-Tetramethyl-1 ,6- hexandiamin und 1 ,3-Dibrompropan von der Abbott-Corporation unter der Bezeichnung Polybrene®, welches unter anderem von Aldrich vertrieben wird als Promotor moduliert. Während der ersten Stunde der Transduktion wurden die Zellkulturschalen bei Raumtemperatur langsam zentrifugiert und bei etwa 500 RPM und dann über Nacht unter Zellkulturbedingungen inkubiert. Nach 48 Stunden wurde das Nährmedium ausgetauscht. Der Überstand der MFG-IRAP transduzierten Zellen wurde gesammelt und für spätere IL-1Ra-Quantifizierung bei -80 °C eingefroren.
Nachweis der LacZ-Transfektion
48 Stunden nach Transduktion wurden die Zellen fixiert und die LacZ-Expression mittels X-gal Färbung wie folgt präpariert. Die Zellen wurden zunächst mit 1 ml PBS- Lösung (Seromed, Deutschland) gewaschen, anschließend mit Lösung 1 (1 ml 0,5 %ige Gluturaldehyd in 49 ml PBS (Roth GmbH, Deutschland)) über 10 min bei Raumtemperatur fixiert. Nachfolgend wurden die Zellkulturschalen zweimal für je 10 min mit Lösung 2 (1 ml PBS-Lösung in 1mM Magnesiumchlorid) gewaschen. Danach wurde Lösung 2 durch die Substrat-Lösung (Lösung 3) bestehend aus 1500 μl 5 mM K3Fe(CN)6 und 5 mM K4Fe(CN)6, 30 μl 1 M MgCI2, 750 μl 1 mg/ml 5- Brom-4.chlor-3-indolyl-ß-D-galactpyranosid (X-gal) und 27 ml PBS ausgetauscht und über Nacht in den Zellkulturschalen belassen. Am nächsten Morgen wurde Lösung 3 durch PBS ersetzt und die typischen Blaufärbungen der Zellen lichtmikroskopisch quantifiziert.
Quantifizierung der IL-1Ra Expression
IL-1Ra wurde durch einen kommerziellen ELISA-Kit (Biosource, USA) gemäß Herstellerinformationen bestimmt.
Bestimmung der Alkalischen Phosphatase
Die Bestimmung der Aktivität der Alkalischen Phosphatase (ALP) wurde bei den Zellkulturen in der ersten Passage durchgeführt. Immortalisierte synoviale Fibroblasten (HIG-82) dienten als negative Kontrollen; immortalisierte Knochmarksstammzellen von Osteogenesis inperfecta Mäusen (OIM), welche zuvor mit rekombinanten BMP-2 stimuliert wurden, dienten als positive Kontrollen. Alle Zellkulturen wurden einem dreimaligem Gefrier-Tau-Zyklus bei -80 °C unterworfen, um die Zellmembranen zu zerstören. Die geplatzten Zellen wurden dann bis zur weiteren Analyse bei einer Temperatur von -80 °C gelagert. Die Aktivität der Alkalischen Phosphatase wurde mit einem kommerziellen Analyse Kit der Sigma Diagnostics (Dorset, United Kingdom) nach Herstellerangaben analysiert und photometrisch bei einer Wellenlänge von 405 nm nach 1 , 2 und 30 min bestimmt an einem UV-Max Gerät der Firma Molecular Devices, USA.
Ergebnisse
X-gal Färbung
Die Transduktion von retro-LacZ wurde simultan in drei Zellkulturschalen durchgeführt. In allen Zellkulturschalen wurde durch die X-gal Färbung eine Blaufärbung von Zellen erreicht. Der Anteil transduzierter Zellen an der Gesamtzellzahl betrug gemäß lichtmikroskopischer Quantifizierung 60 %. Es wurde keine Selektion transduzierter Zellen durchgeführt.
Gen-Expression
In 6 Zellkulturschalen wurde eine Transduktion der Zellen mit retro-IRAP durchgeführt. Der Überstand aus allen 6 Zellen ergab in der Analyse mittel ELISA, daß die Zellpopulationen mit der cDNA für hlL-1 Ra transduziert und das Transgen mit durchschnittlich 9111 ,5 pg pro 50.000 Zellen und 48 Stunden bei einer Standardabweichung von 522,4 pg exprimiert wurde. Die ELISA-Analyse des Überstandes der drei Kulturschalen mit nicht transduzierten Zellkulturen, soweit die Analyse des Überstandes der mit retroviralem LacZ transduzierten Zellen, ergaben negative Werte, wie Fig. 1 zeigt.
ASSAY für Alkalische Phosphatase
Alkalische Phosphatase (ALP) ist einer der ersten Marker, der bereits durch unreife Osteoblasten und während des osteoblastären Reifungsprozesses synthetisiert wird. Die in diesem Versuch benutzten Zellpopulationen exprimierten spontan alkalische Phosphatase mit einem Mittelwert von 9,5 Units pro 1.000.000 Units bei einer Standardabweichung von 0,7 Units. Die als negative Kontrolle dienenden immortalisierten synovialen Fibroblasten (HIG-82) exprimierten keine ALP, im Gegensatz zu den BMP-2 stimulierten immortalisierten OIM-Zellen, die als positive Kontrollen dienten. Als Kontroll-Zellpopulationen wählte man OIM- und HIG-82- Zellen, da die Potenz der OIM-Zellen nach Stimulation mit rhBMP-2 ALP zu synthetisieren bekannt ist. Aufgrund ihrer Fähigkeit, ALP zu synthetisieren wurden die Zellen als osteoblastäre Zellpopulation eingestuft. Die Ergebnisse des ALP- Aktivitäts Tests werden in Fig. 2 dargestellt.
Anwendungsbeispiel 2:
Einsatz von adenoviralen Vektoren zur Entwicklung einer Therapie der Östrogenmangel-bedingten Osteoporose im Modell der Balb/C Maus
Die Grundlage dieser Versuche ist das bekannte Wissen, daß ein Östrogenmangel über eine systemische Erhöhung der Zytokine lnterleukin-1 und TNFa zu einer Aktivierung von Osteoklasten führt, die durch eine gesteigerte ossäre Resorption einen generalisierten Knochenmasseverlust verursachen. Die Theorie hinter den Versuchen zur Evaluation einer Osteoporose-Therapie am Modell der Balb/C Maus ist, daß bekanntermaßen nach Ovarektomie ein generalisierter Knochenmasseverlust auftritt, der nach etwa zwei Wochen sein Maximum erreicht. Es soll versucht werden mittels Einsatz adenoviraler Vektoren, die für IL-1 Ra kodieren den Knochenmasseverlust partiell zu verhindern. Ein solches genetisches Verfahren zur Therapie des Östrogenmangel-bedingten Knochenmasseverlustes ist bislang weder beschrieben, noch experimentell evaluiert.
Alle Versuchstiere waren zum Zeitpunkt der Experimente einheitlich 6 Wochen alt. Es wurden insgesamt fünf verschiedene Versuchsreihen durchgeführt.
Erstens wurde die Ausscheidung von Desoxy-Pyridinoline Crosslinks im Urin nach Ovarektomie (OVX) und nach simulierter Ovarektomie (sham) nach 2 Tagen gemessen. Die Analyse der Crosslinks erfolgte mittels kommerziellem Kit der Firma Metra Biosystems, Inc. (CA, USA) gemäß den Herstellerangaben. Diese Versuchsreihe diente zur Evaluation der Ovarektomie-Wirkung auf die Knochenresorption und zur Testung der Eignung dieser Analyse zur Differenzierung des Knochenmasseverlustes nach Behandlung mit therapeutischen Vektoren.
Zweitens wurde mit adenoviralen Vektoren, die für das Markergen LacZ kodieren (Ad-LacZ) getestet, ob eine Transduktion von Knochen und Knochenmark durch adenovirale Vektoren überhaupt möglich ist. Die Applikation der Vektoren erfolgte intrafemoral, duch einen transcutanen, intercondylären Zugang, der es ermöglichte 100μl eine Suspension mit physiologischer Kochsalzlösung und 109 pfu Ad-LacZ intraossär zu applizieren. Kontrollen wurden mit Instillation physiologischen Kochsalzlösung ohne Vektoren durchgeführt. Die immunhistochemische Färbemethode (LacZ Färbung ist in diesen Antrag mehrfach beschrieben) ermöglicht die farbliche Darstellung der erfolgreich transduzierten Zellen durch intensive Blaufärbung der LacZ exprimierenden Zellen.
In einer dritten Versuchsreihe wurde am Modell der Balb/C Maus durch die Administration von adenoviralen Markern, die für das Marker-Enzym Luciferase kodieren die Dauer der Genexpression und die intracorporale Distribution der Vektoren nach intraossärer Vektoren-Applikation untersucht. Je drei Mäuse wurden am Tag 2, 14 und 21 nach der Vektoren-Applikation getötet und verschiedene Gewebetypen im Bereich der Injektion, sowie verschiedene innere Organe zur Analyse auf Expression des Transgens. Diese wurde photometrisch mit dem Autolumat® LB953 der Firma Berthold, Deutschland, wie im Anwendungsbeispiel 3 beschrieben, auf Enzymaktivität der transgenen Luciferase durchgeführt.
Viertens wurde die in den Experimenten gängigerweise durchgeführte intraossäre Vektoren-Applikation mit der parenteralen Vektoren-Applikation verglichen, um die Dauer und Intensität systemischer Transgen-Level in beiden Verfahren zu untersuchen. Die intaossäre Applikation der Vektoren wurde wie vorbeschrieben intafemoral durchgeführt, während die parenterale Injektion in den bei Mäusen großzüglig angelegten Sinus retroorbitalis erfolgte. Die systemischen IL-1Ra Spiegel wurden im Serum der Mäuse nach wiederholten Blutabnahmen aus dem Sinus retroorbitalis bestimmt. Die Blutabnahmen erfolgten vor der Vektoren-Applikation, sowie an den Tagen 1 , 2, 3, 5 ,9 und 12 nach Injektion der Vektoren. Die Analyse der IL-1 Ra Spiegel erfolgte mittels kommerzieller ELISA-Kits nach den Angaben des Herstellers.
In einem fünften Schritt wurde der Effekt des adenoviral transferierten, therapeutisch wirksamen IL-1Ra auf den Ovarektomie-induzierten Knochenmasseverlust untersucht. Dazu wurden vier Gruppen mit je mindestens 8 Mäusen gebildet, wobei in zwei Gruppen eine Ovarektomie durchgeführt wurde und die Mäuse entweder den therapeutischen Vektor Ad-IL-1 Ra oder den nicht-therapeutischen Markergen-Vektor Ad-LacZ erhielten. Auf gleiche Weise wurden die beiden verbleibenden Gruppen behandelt, jedoch wurde anstelle der Ovarektomie lediglich eine simulierte Operation (sham) durchgeführt. Die Analyse erfolgte durch Messung des Gesamt- Trockengewichtes der nicht manipulierten Humeri, Tibiae und Fibulae um die systemische Wirkung der Vektoren-Applikation evaluieren zu können. Das Trockengewicht wurde nach Exartikulation und vollständigem Entfleischen der Knochen, sowie einer Behandlung der Knochen in einem 90%igen Aceton-Alkohol- Bad in mg gemessen.
Ergebnisse
Die Analyse der Ausscheidung der Desoxy-Pyridinoline-Crosslinks im Urin bestätigt, wie in Figur 6 demonstriert, daß es nach Ovarektomie zu einer Erhöhung der osteoblastären Aktivität mit zunehmender Knochenresorption kommt. Das Ovarektomie-Modell an der Balb/C Maus ist offenbar für die Bestimmung des Knochenmasseverlustes und geeignet für die Evaluation einer genetischen Therapie der Östrogenmangel-bedingten Osteoporose.
Wie in der Figur 7 demonstriert, werden nach intraossärer Applikation von adenoviralen Vektoren eine Reihe unterschiedlicher Zelltypen erfolgreich transduziert (Pfeile). Nach immunhistochemischer X-gal Färbung, die eine Darstellung der Zellen ermöglicht, welche das Transgen exprimieren, werden überwiegend Osteoblasten transduziert, aber auch Zellen des Knochenmarkes. Da Osteoblasten unter der Einwirkung von geeigneten Wachstumsfaktoren eine Ausreifung zum Osteocyten durchlaufen, ist wegen der großen Stabilität und dem immunologisch priviligierten Sitz dieser Zellen mit einer verlängerten Expression von Transgenen zu rechnen.
Die Enzym-Aktivität der Luciferase nach intraossärer Vektoren-Applikation von Ad- Luc wird in Figur 4 dargestellt. Sie demonstrier, daß über den gesamten Verlauf des Untersuchungsintervalles von 21 Tagen die Transgen-Expression in Knochen und Muskulatur persistiert. Die Transgen-Expression aus Leber (2 Tage) und drainierenden Leistelymphknoten (14 Tage) ist transient und erreicht nicht die Höhe der Enzymaktivität im Bereich der Injektion.
Der Vergleich der, in diesen Versuchsreihen bevorzugt angewandten intrafemoralen Vektor-Applikation, mit einer intravenösen Vektor-Applikation wird in Figur 5 präsentiert. Die Figur zeigt, daß die intrafemorale Applikationsform der intravenösen Applikationsform sowohl in der Intensität der Expression von Transgenen, als auch in der Dauer der Expression überlegen ist.
Die Figur 3 demonstriert anhand der Trockengewichte [mg] der Humeri, Tibiae und Fibulae, daß sich der Ovarektomie-induzierte Knochenmasseverlust, hier als Gewicht mineralisierten Knochens ausgedrückt, durch eine genetische Therapie mit adenoviralen Vektoren, die für IL-1 Ra kodieren um etwa 50% reduzieren läßt. Anwendunqsbeispiel 3:
Beschleunigung des Knochenwachstums durch Einsatz von adenoviralen Vektoren, welche für Wachstumsfaktoren kodieren, am Modell des weißen Neuseeland-Hasen.
Material und Methodik
Tiere:
Weibliche weiße Neuseelandhasen mit einem Alter von mehr als 6 Monaten und einem Gewicht von 4,3 bis 5 kg wurden in der Studie eingesetzt. Bei allen Tieren wurden chirurgische Defekte in Oberschenkelknochen derart erstellt, daß diese ohne eine Behandlung nach 9 Wochen noch nicht heilten.
Chirurgisches Verfahren
Nach Einleiten einer allgemeinen Narkose mit Ketaminhydrochlorid (Ketaject®) (40 mg/kg/M) und Xylasin (Xyla-ject®) (3 mg/kg/M) i.m., wurden beide Oberschenkel des Hasens rasiert, mit Isopropyl-Alkohol desinfiziert und in einer sterilen Weise vorbereitet. Eine allgemeine Anästhesie wurde eingeleitet, unter Verwendung von Isofluran 0,8 bis 1 ,5 % (AErrane®) ergänzt, mit 50 bis 100 % Sauerstoff und 50 % Distickstoffoxid. Eine zusätzliche Lokalanästhesie mit 2 % Lidocain wurde eingesetzt, während das Periost von den Femora abgelöst wurde, da dieses Verfahren Bewegungen der Hasen selbst unter allgemeiner Anästhesie bewirkte. Es erfolgte eine longitudinale Präparation der Weichteile. Die gesamte Diaphyse der Femora wurde freipräpariert und die Periostschicht vollständig entfernt. Eine 7 Loch DCP- Platte (Firma Synthes, Colorado, USA) wurde dann über den lateralen Femora plaziert und mit selbstschneidenden 2,7 mm Schrauben fixiert. Ein exakter Defekt von 1,3 cm wurde mittels einer Kugelfräse erzeugt. Um die Osteosynthese von den enormen Biegekräften beim „Kicken" der Hasen postoperativ zu schützen, wurden 3 Cerclage-Drähte benutzt, um eine zusätzliche Fixierung über der Platte an den distalen und proximalen Enden der Femora zu bewirken. Um Knochenfragmente und Knochenmarksanteile vollständig zu entfernen, wurde mehrfach mit physiologischer Kochsalzlösung gespült. Durch Refixation der Muskulatur um den femoralen Defekt wurde eine Defekt-Kammer geschaffen. Alle Weichteilschichten wurden peinlich genau geschlossen und die Haut intrakutan vernäht. Kein weiteres Schienen oder Gipsen war notwendig. Vektoren
Für die Transduktion der Zellen wurden rekombinante Adenoviren der ersten Generation (E1\ E3') deletär benutzt, von denen einer das LacZ-Gen (Ad-LacZ) und der andere das Luciferase-Gen trug (Ad-Luc). In jedem Fall wurde die Genexpression durch einen humanen early promoter angeregt. Bei jedem Defekt wurden 0,5 ml einer Suspension von 1 x 1010 particels von adenoviralen Vektoren, entweder in Suspension mit einer physiologischer Kochsalzlösung oder mit gereinigtem Kollagengel (Vitrogen Collagen Corporation, Palo Alto, Californien, USA) injiziert. Die kontralateralen femoralen Defekte erhielten entweder 0,5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung oder 0,5 ml Kollagengel ohne Viruspartikel.
Zur Herstellung der Vektoren Ad-LacZ und Ad-Luc wurden 293-Zellen propagiert. Dieses Verfahren wird von Graham et al. in J. Gen Virol 36:59-72 (1977) beschrieben. Die 293-Zellen werden jeweils für 2 Stunden mit einer multiplicy of infection (m.o.i.) von 10 mit Adenoviren transfiziert. Die Zellen werden geerntet, nachdem sie 36 bis 48 Stunden nach der Infektion abgekratzt und in 5 ml einer 50 mM Tris-Cl (pH 7,5) und 200 mM Natriumchlorid resuspendiert werden. Nach 5 Frier- Tau-Zyklen wurden die Viren mittels 2 Cäsiumchlorid-Schritt-Gradienten (4 °C, 30.000 rpm, 1 Stunde) gereinigt. Ad-LacZ wurde gegen 10 % Glyzerindialysepuffer (100 mM Natriumchlorid, 10 mM Tris-Cl, pH 7,5; 1 mM Magnesiumchlorid, 10 % v/v Glyzerin) dialysiert, wie von Mittereder et al. im J. Virol 70:7498-7509 (1996) beschrieben und Ad-Luc wurde gegen 3 % Saccarosedialysepuffer (150 mM Natriumchlorid, 10 mM Tris-Cl, pH 7,5; 10 mM Magnesiumchlorid, 3 % v/v Saccarose dialysiert. Jeder der Vektoren wurde durch seine optische Dichte bei 260 nm titriert. Beide Viren wurden aufbewahrt bis zum Einsatz bei einer Konzentration von 7 x 1012 Partikeln pro ml bei -80 °C.
Gruppen, Datensammlung und Analyse
Gruppe 1: Der femorale Defekt wurde bei 4 Hasen erzeugt, die mit 0,5 %iger physiologischer Kochsalzlösung behandelt wurden, die 1 x 1010 Partikel Ad-LacZ enthielt. Zwei Hasen wurden nach zwei Tagen getötet, zwei weitere Hasen wurden 12 Tage nach der Operation getötet. Gruppe 2: Vier Hasen wurden mit einem 0,5 ml einer Mischung von Kollagengel (Vitrogen ) mit 1 x 1010 Partikeln von Ad-LacZ behandelt. Die Hasen wurden gemäß dem Zeitplan von Gruppe 1 getötet.
Knochenmark, kortikaler und trabakulärer Knochen, Narbengewebe, welches den Defekt ausfüllt und Muskel, wurden auf Genexpression mittels der X-gal Färbung bei allen Hasen der Gruppe 1 und 2 analysiert. Um zu bestimmen, ob eine systemische Streuung der Vektoren stattgefunden hat, wurden Gewebe von der Milz, der Leber und Lunge entnommen, ebenso wie Knochen, Knochenmark und Muskel von den kontralateralen unbehandelten segmentalen Defekten. Alle Gewebeteile wurden in 10 % Formaldehydlösung für 24 Stunden fixiert, dann in 20 % EDTA dekalzifiziert, innerhalb von 2 bis 3 Wochen bei einem wöchentlichen Austausch des EDTA. Nach Einbetten des demineralisierten Gewebes in Paraffin wurden Blöcke geschnitten und die Gewebeabschnitte mit X-gal und Eosin angefärbt. Die transduzierten Zellen wurden histomorphologisch durch einen unabhängigen Pathologen beurteilt.
Gruppe 3: Acht Hasen der Gruppe 3 wurden mit 0,5 ml einer Mischung von physiologischer Kochsalzlösung mit 1 x 1010 Partikeln von Ad-Luc behandelt. Die Hasen wurden 2, 5, 10 und 14 Tage nach der Operation eingeschläfert. Es wurden Gewebeproben vom trabekulären und kortikalen Knochen, der die Defekt-Kammer umgab, vom Bindegewebe, das die Defekt-Kammer ausfüllte und vom Muskel, der den femoralen Defekt umgab, entnommen. Um eine systemische Distribution der Vektoren zu überprüfen, wurden Proben von Lunge, Leber und Milz ebenso analysiert wie muskulo-skelettäre Proben des nicht-transduzierten contralateralen Defekts. Alle Gewebeproben wurden homogenisiert und nach Zugabe von 0,1 ml physiologischer Kochsalzlösung dreimal einem Frier-Tau-Zyklus unterzogen, um die Zellen zu zerstören. Die Zellen wurden dann bei -80 °C aufbewahrt bis die Messung der Luciferaseaktivität erfolgte. Nach dem letzten Auftauen wurden die Proben bei 10.000 rpm (5600 x g) für 5 Minuten zentrifugiert und die überstehende Lösung für die Messung der Luciferaseaktivität zurückgehalten. Die Luciferaseaktivität wurde bei Raumtemperatur mittels eines AutoLumat® LB953 der Firma Berthold, Deutschland gemäß den Hinweisen des Herstellers gemessen. Ergebnisse
X-gal Färbung
Die histomorphologische Analyse zeigte, daß die Produktion von Ad-LacZ, welches entweder in physiologischer Kochsalzlösung oder in Kollagengel suspendiert war, zu einer lokalen Transduktion von Knochen, Knochenmark, Narbengewebe und Kallusgewebe führte sowie zu einer Transduktion des Muskels, welcher die Injektionsstelle umgab (Fig. 9 bis 10 ). Demgegenüber wurden keine LacZ+ Zellen in der Lunge, der Leber oder Milz oder in dem kontralateralen femoralen Defekt gefunden. Bei Verwendung von Kollagengel als Träger für den Adeno Virus zeigte die histologische Untersuchung des Defektes und des Narbengewebes, weiches die Öffnung ausfüllte, selbst 12 Tage nach der Operation eine nicht-resorbierte feste Kollagenstruktur. Hieraus kann man nur schließen, daß das Adeno Virus durch das Gel verkapselt worden ist und deshalb keine Möglichkeit hatte zu transduzieren. Die histologische Analyse zeigte keinen Nachweis für eine lokale Entzündung.
Luciferase Assay
Ein verschieden hoher Gehalt an Luciferaseaktivität wurde im Knochen und im Knochenmark gefunden, ebenso wie im defekt-füllenden Bindegewebe, im umliegenden Muskelgewebe an der Injektionsstelle. 5 Tage nach der Transduktion war eine leichte Luciferaseaktivität in der Leber festzustellen, welche vollständig nach 10 Tagen verschwand. Keine Luciferaseaktivität konnte im kontralateralen Femur, der Lunge und der Milz gefunden werden (Fig. 8 ).
Radiologischer Heilungsverlauf nach Gabe therapeutischer Gene
Nachdem die Vorversuche, mit denen der Nachweis der Transduzierbarkeit der verschiedenen muskulo-skelettären Gewebestrukturen geführt und die Dauer der Expression von Transgenen bestimmt wurde, gezeigt hatten, daß das femorale Defektmodell am weißen Neuseelandhasen geeignet ist die Wirkung therapeutischer Gene auf die Defektheilung zu evaluieren, wurden nach dem gleichen Modell je vier und sechs Hasen mit 1x107 pfu Ad-TGF-ß, bzw. 2x1010 pfu Ad-BMP-2 transduziert, simultan mit je vier bzw. fünf gleichaltrigen Kontrollhasen, die mit dem nichttherapeutischen Markergen Ad-Luc transduziert wurden. Röntgenkontrollen erfolgten nach der ersten Kontrolluntersuchung eine Woche postoperativ in zweiwöchentlichen Abständen. Wie in Figur 11 und 12 dargestellt war bereits nach 5 Wochen in der Ad- BMP-2 behandelten Gruppe ein deutlicher Mineralisationsvorsprung im Vergleich zur Kontrollgruppe sichtbar. Die radiologische Abschlußuntersuchung in der 12. Woche ergab bei allen 6 Verum-Hasen eine gute knöcherne Durchbauung der femoralen Defektkammer, bei mangelhafte Durchbauung bis hin zur Pseudarthrose in der nicht- therapierten Kontrollgruppe. Ein ähnlicher Trend war auch in der mit Ad-TGF-ß therapierten Gruppe zu sehen. Der radiologiche Heilungsverlauf zeigte im Vergleich zur Kontrollgruppe deutlich mehr mineralisierte Substanz in der femoralen Defektkammer, jedoch ohne die Ausildung einer radiologisch sichtbaren Ossifikation im Sinne einer cortico-trabekulären Ausreifung. Dieses Ergebnis blib bis zur 16 postoperativen Woche unverändert.
Zusammenfassend ist zu schließen, daß Ad-BMP-2 eine stimulierende Wirkung auf die Ossifikation im femoralen Defekt hatte, Ad-TGF-b fördert vermutlich mehr eine unspezifische Mineralisation des Gewebes ohne zu einer letztendlichen Ausreifung des Knochens zu führen. Eine Kombination beider Vektoren könnte ggf. zu einer weiteren Beschleunigung der Knochenbruchheilung in Defektsituationen führen.
Biomechanik
12 Wochen nach Operation und Injektion der viralen Vektoren in den Defekt wurden die sechs mit Ad-BMP-2 behandelten Hasen (2 x 1010 pfu), sowie 5 Kontroll-Hasen, die lediglich 2 x 1010 pfu des Markergens Ad-Luc erhalten hatten getötet. Die operierten Femora wurden weitgehend entfleischt, unter Schonung aller auch ektoper Knochenbrücken. Dann erfolgte die vorsichtige Metallentfernung. Dabei zeigte sich, daß ein Femur der Kontrollgruppe in bindegewebiger Pseudoarthrose geheilt war, ein zweiter Femur der Kontrollgruppe wis lediglich eine so dünne Knochenbrücke auf, daß diese auch bei sehr vorsichtiger Präparation brach. Dieser Femur wurde daher aus der Auswertung ausgeschlossen. Nach Entfernung sämtlichen Metalls wurden die Präparate bis zur weiteren Analyse bei -80 °C eingefroren.
Die biomechanische Analyse erfolgte im Drei-Punkte-Biege-Verfahren um die Biegungssteifigkeit und die maximale Biegungskraft der Femora zu bestimmen. Die Femora wurden bis 24 Stunden vor den Tests gefroren gelagert und dann im Kühlschrank langsam aufgetaut. Jeder Femur wurde im Drei-Punkte-Biegungs- System plaziert, das eine freie Biegestrecke von 4,5 cm gewährleistete. Die Lastaufnahme erfolgte in posterior-anteriorer Richtung, wobei die Last am Mittelpunkt der freien Biegestrecke übertragen wurde, die jeweils etwa den Mittelpunkt der Diaphysen darstellt.
Die Tests wurden mit dem Instron 8500 servo-hydralic testing System (Instron Corp., Canton, MA) durchgeführt, es wurde ein Instron 2500 Ibf Lastaufnahme Zelle verwandt. Die Deformation der Femora wurde mit dem internen LVDT-System gemessen. Die Daten wurden mittels Instron's MAX Software erhoben und mit Hilfe des Software-Programms MS-Excel analysiert.
Es wurde eine maximale Verbiegung von 1 cm angewandt, bei einer Beigerate von 0,5 cm/min. oder 0,0833 mm/sec. Bei Fraktur der Femora war der Test beendet.
Die mit Ad-BMP-2 behandelte Verumgruppe unterschied sich von der Kontrollgruppe signifikant (p=0,036) bezüglich der Steifigkeit und auch bezüglich der aufgewandten Kraft (p=0,0055).
Einzelmessungen:
Steifigkeit Kraft
Ad-BMP-2 Kontrolle Ad-BMP-2 Kontrolle
75.6000 80.8000 195.0000 102.0000
118.0000 64.0000 131.6000 103.2000
99.6000 53.2000 171.2000 82.0000
79.6000 0.0000 227.6000 0.0000
97.6000 206.4000
45.6000 92.4000
Die biomechanische Analyse nach dem Drei-Punkte-Biegungsverfahren läßt darauf schließen, daß durch den Einsatz der adenoviralen Vektoren, die für BMP-2 kodieren und so auf zellulärem Niveau zu einer Produktion des als Arzneimittel wirksamen Proteins führen, eine Beschleunigung der Knochen-Defektheilung erreicht werden kann.
Histomorphometrie
Wie in den vorbeschriebenen Versuchen wurde auch hier das femorale Defektmodell am weißen Neuseeland-Hasen genutzt. 16 Wochen nach der Operation der Tiere und nach Injektion 107 pfu adenoviraler Vektoren, deren cDNA für das potentiell therapeutische TGF-beta kodiert (Ad-TGF-beta) wurden die vier Tiere getötet und präpariert. Als Kontrollgruppe dienten 4 weiße Neuseelandhasen, die lediglich 107 pfu eines Markergens erhielten (Ad-Luc).
Die Bildanalyse wurde wie folgt am digitalisierten histologischen Schnitt vorgenommen. Die Bilder wurden mit einem 2-fachen Bandenfilter geschärft, um die blau gefärbten, knöchernen Areale zu definieren (Trichrome-Färbung). Knöcherne Areale wurden mittels Farbwürfel-Technik (3 x 3 Pixel) definiert, nachdem eine Standardisierung gegen den normalen corticalen Knochen außerhalb des Defektes vorgenommen worden war. Die vormaligen Defektgrenzen wurden digital markiert und das ehemalige Defektareal (area of interest = AOI) auf Intensität der Blaufärbung analysiert. Es wurden vier unterschiedliche Messungen vorgenommen:
1. Absolute Knochenmasse in der AOI
2. Mittlere Lichtintensität - die Messung der Intensität der Färbung ermöglicht dabei Rückschlüsse auf die Qualität des neugebildeten Knochens.
3. Masse mineralisierten Gewebes im Verhältnis zur Defektgröße in Prozent
4. IOD (integrated optical density), entspricht der mittleren optischen Lichtintensität pro gemessener Fläche
Als AOIs wurden folgende analysierte Zonen bestimmt:
1. Das gesamte Areal vom distalen bis zum proximalen Schraubenloch
2. Knochenneubildung entlang der entfernten DCP-Platte
3. Knochenneubildung der der entfernten DCP-Platte gegenüberliegenden Corticalis
4. Summe der Defektränder
Die Gesamtmasse der Mineralisation im Defektbereich war in der Verumgruppe, die mit Ad-TGF-beta behandelt worden war mehr als doppelt so hoch als in der Kontrollgruppe (19,5 +/- 10,7 mm2 versus 9,04 +/- 4,3 mm2), jedoch nicht signifikant unterschiedlich. Noch deutlicher waren die Unterschiede unter Berücksichtigung der Fläche und der Lichtintensität (IOD) (1754,0 +/- 906,0 mm2 versus 557,7 +/- 138,0 mm2). Auch hierbei war der Unterschied im t-Test für unverbundene Stichproben jedoch nicht signifikant, was sich durch die große Streuung bei geringen Fallzahlen erklärt.
Die Ergebnisse deuten jedoch dennoch darauf hin, daß TGF-beta, auf zellulärer Ebene produziert und exprimiert, einen positiven Einfluß auf die Mineralisation und Ossifikation nach Defektfrakturen hat. Durch die Nutzung der Technik des Gentransfers mit nachfolgender Expression des Wachstumsfaktors, die, wie in den Vorversuchen beschrieben ein überwiegend lokales Verfahren darstellt, könnten möglicherweise insbesondere die bekannten Nebenwirkungen einer systemischen TGF-beta Applikation vermieden werden.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von Vektoren wie Adenoviren und/oder Adeno-assoziierten Viren und/oder Retroviren und oder Herpes-Simplex-Viren und/oder Liposomen und/oder Piasmiden als säugerzellenstimulierendes Mittel zur Herstellung von therapeutischen, als Arzneimittel wirkenden Proteinen auf zellulärem Niveau zur genetischen Behandlung von Knochenpathologien.
2. Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Adenoviren um adenovirale Vektoren handelt.
3. Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Adeno-assoziierten Viren um ein Adeno-assozierte virale Vektoren handelt.
4. Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Retroviren um retrovirale Vektoren handelt.
5. Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Liposomen um liposomale Vektoren handelt, die die genetische Information für Wachstumsfaktoren oder Zytokine, bzw. deren Inhibitoren enthalten.
6. Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Piasmiden um solche handelt, die die genetische Information für Wachstumsfaktoren oder Zytokine, bzw. deren Inhibitoren enthalten
7. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den therapeutischen Proteinen um Wachstumshormone, Zytokine oder Zytokininhibitoren handelt.
8. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den zu stimulierenden Säugerzellen um tierische oder menschliche Zellen handelt, insbesondere Knochenzellen, Knochenmarkszellen, Bindegewebszellen und/oder Muskelzellen.
9. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Vektoren, die zur Produktion der Arzneimittel durch die transfizierten Zellen führen, parenteral appliziert werden.
10. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Vektoren, die zur Produktion der Arzneimittel durch die transfizierten Zellen führen, intraossär appliziert werden.
11. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Vektoren, die zur Produktion der Arzneimittel durch die transfizierten Zellen führen, lokal an den Ort der Knochenpathologie appliziert werden.
12. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß zur Behandlung Säugerzellen dem Körper entnommen, dann in-vitro mittels der vorgenannten Vektoren transfiziert, in einem geeigneten Medium kultiviert und reimplantiert werden, um dann am Ort der Knochenpathologie, die als Arzneimittel wirksamen therapeutischen Proteine nach genetischer Manipulation der Zielzellen zu produzieren.
13. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüchen 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Knochenpathologien um Osteoporose, lokalen oder systemischen Knochenmasseverlust, Knochensubstanzverlust oder Knochenstrukturstörungen, Knochenbrüche mit Knochensubstanzverlust, Defektfrakturen, oder Pseudarthrosen, Knochendefektzustände nach Operationen, Morbus Sudek, Knochensubstanzverlust bei Endoprothesenlockerungen, periartikuläre Osteolysen bei Erkrankungen des rheumatischen Formenkreises und/oder Osteonekrosen handelt.
14. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Knochenpathologie auch das Einheilen von Transplantaten, insbesondere ligamentärer, knöchener oder tendinöser Transplantate, z.B. in der Knie- und Schulterchirurgie, einschließt.
15. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 - 14, dadurch gekennzeichnet, daß zur Verbesserung des Knochenaufbaus die genetische Information (cDNA) der therapeutischen Proteine BMP 2 - 7 und/oder FGFs und/oder IGFs und/oder PDGFs und/oder VEGF und/oder TGF-ß verwandt wird oder die cDNA von Zytokinen oder Zytokininhibitoren, z.B. hlL-1 Ra oder TNF-α-lnhibitoren.
16. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 - 14, dadurch gekennzeichnet, daß zur Reduktion des Knochenabbaus die genetische Information (cDNA) zur Bildung von Zytokininhibitoren, z. B. hlL-1Ra und sTNFαR und lnterleukin-6 Inhibitoren oder resorptionshemmende Zytokine wie lnterieukin-10, eingesetzt werden.
17. Verfahren zur Behandlung von Knochenpathologien unter Verwendung von Vektoren wie Adenoviren und/oder Adeno-assoziierten Viren und/oder Retroviren und/oder Herpes-Simplex-Viren und/oder Liposomen und/oder Piasmiden als säugerzellenstimulierendes Mittel zur Herstellung von therapeutischen Proteinen auf zellulärem Niveau gemäß irgendeinem der vorstehenden Ansprüche 1 bis 16.
EP98959810A 1997-10-29 1998-10-29 Verwendung von vektoren wie adenoviren und/oder adeno-assoziierten viren und/oder retroviren und/oder herpes-simplex-viren und/oder liposomen und/oder plasmiden als vehikel für genetische information zur befähigung von säugetierzellen mittel, zur behandlung von knochenpathologien zu produzieren Ceased EP1027076A2 (de)

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CA (1) CA2308511C (de)
WO (1) WO1999021589A2 (de)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1027076A2 (de) 1997-10-29 2000-08-16 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Verwendung von vektoren wie adenoviren und/oder adeno-assoziierten viren und/oder retroviren und/oder herpes-simplex-viren und/oder liposomen und/oder plasmiden als vehikel für genetische information zur befähigung von säugetierzellen mittel, zur behandlung von knochenpathologien zu produzieren
WO2001082973A2 (en) * 2000-04-28 2001-11-08 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Viral and non-viral vectors as vehicles for delivering transgenes for treating bone pathologies
US6579522B1 (en) 2000-06-27 2003-06-17 Genvec, Inc. Replication deficient adenoviral TNF vector
AU2002243307A1 (en) * 2000-11-08 2002-07-24 Tissuegene, Inc. Gene therapy using tgf-beta
DE60143964D1 (de) * 2001-02-06 2011-03-10 Sydney Children S Hospitals Network Randwick And Westmead Incorporating The Royal Alexandra Hospital Arzneimittel zur behandlung von osteonekrose und zur versorgung von patienten mit risiko für die entstehung von osteonekrose
US20030086903A1 (en) 2001-11-02 2003-05-08 Genvec, Inc. Therapeutic regimen for treating cancer
US20090104155A1 (en) * 2006-04-21 2009-04-23 Goodrich Laurie R Treatment of connective tissue disorders
US8138160B2 (en) 2006-08-03 2012-03-20 Warsaw Orthopedic, Inc. Reagents, methods and systems to suppress pro-inflammatory cytokines
WO2018125970A1 (en) * 2016-12-30 2018-07-05 Salk Institute For Biological Studies Synthetic adenoviruses targeting bone tissue and uses thereof
US20200230213A1 (en) * 2017-10-03 2020-07-23 The Johns Hopkins University Lung cell treatments to prevent or treat disease

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5032407A (en) 1987-01-16 1991-07-16 Ohio University Edison Animal Biotechnology Center Gene transfer using transformed, neodetermined, embryonic cells
EP0378576B1 (de) 1987-09-11 1995-01-18 Whitehead Institute For Biomedical Research Transduktionsveränderte fibroblasten und ihre anwendung
US6090790A (en) * 1989-12-14 2000-07-18 Eriksson; Elof Gene delivery by microneedle injection
US5670488A (en) 1992-12-03 1997-09-23 Genzyme Corporation Adenovirus vector for gene therapy
US5168050A (en) * 1990-05-24 1992-12-01 Genentech, Inc. Mammalian expression of the bone morphogenetic protein-2b using bmp2a/bmp2b fusion
US5618531A (en) 1990-10-19 1997-04-08 New York University Method for increasing the viability of cells which are administered to the brain or spinal cord
JP3249516B2 (ja) 1990-10-31 2002-01-21 ソマティクス セラピー コーポレイション 遺伝子治療のためのレトロウイルスのベクター
US5858355A (en) 1990-12-20 1999-01-12 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education IRAP gene as treatment for arthritis
US5674844A (en) 1991-03-11 1997-10-07 Creative Biomolecules, Inc. Treatment to prevent loss of and/or increase bone mass in metabolic bone diseases
US5789543A (en) 1993-12-30 1998-08-04 President And Fellows Of Harvard College Vertebrate embryonic pattern-inducing proteins and uses related thereto
DE4339352A1 (de) 1993-11-18 1995-05-24 Univ Ludwigs Albert Verfahren zur Markierung von Zellen, mit diesem Verfahren markierte Zellen, Verwendung des Wildtyp-Adeno-assoziierten Virus zur Markierung von Zellen und Testkits zum Nachweis des Wildtyp-Adeno-assoziierten Virus in Zellen
US5763416A (en) 1994-02-18 1998-06-09 The Regent Of The University Of Michigan Gene transfer into bone cells and tissues
US5942496A (en) 1994-02-18 1999-08-24 The Regent Of The University Of Michigan Methods and compositions for multiple gene transfer into bone cells
GB9407135D0 (en) * 1994-04-11 1994-06-01 Aberdeen University And Plasma Treatment of osteoporosis
US5665350A (en) 1994-11-23 1997-09-09 University Of Massachusetts Medical Center Cell cycle dependent transplantation and ex vivo gene therapy
CA2206305A1 (en) * 1994-11-29 1996-06-06 Peter Neville Goodfellow Sox-9 gene and protein and use in the regeneration of bone or cartilage
US5719131A (en) 1994-12-09 1998-02-17 Genzyme Corporation Cationic amphiphiles containing dialkylamine lipophilic groups for intracellular delivery of therapeutic molecules
US5948767A (en) 1994-12-09 1999-09-07 Genzyme Corporation Cationic amphiphile/DNA complexes
US5910487A (en) 1994-12-09 1999-06-08 Genzyme Corporation Cationic amphiphiles and plasmids for intracellular delivery of therapeutic molecules
US5650096A (en) 1994-12-09 1997-07-22 Genzyme Corporation Cationic amphiphiles for intracellular delivery of therapeutic molecules
US5767099A (en) 1994-12-09 1998-06-16 Genzyme Corporation Cationic amphiphiles containing amino acid or dervatized amino acid groups for intracellular delivery of therapeutic molecules
US5854202A (en) * 1995-01-24 1998-12-29 Dedhar; Shoukat Peptide fragments of calreticulin, peptide mimetics thereof, and pharmaceutical compostions comprising same
US5824655A (en) 1995-02-15 1998-10-20 The University Of Utah Anti-transforming growth factor-β gene therapy
ATE304551T1 (de) * 1995-12-19 2005-09-15 Human Genome Sciences Inc Antivirales protein
NZ334103A (en) 1996-08-13 2000-09-29 Zymogenetics Inc an expression vector used to transform or transfect a host cell to make a thrombopoietin polypeptide, the cultured yeast cell thereof and the thrombopoietin polypeptide
IT1285790B1 (it) * 1996-09-24 1998-06-24 Angeletti P Ist Richerche Bio Adenovirus difettivi ricombinanti che codificano per mutanti di interleuchina 6 umana (hil-6) con attivita' antagonista o
US5912239A (en) 1997-04-04 1999-06-15 Genzyme Corporation Imidazole-containing cationic amphiphiles for intracellular delivery of therapeutic molecules
US5981275A (en) 1997-04-14 1999-11-09 Genzyme Corporation Transgene expression system for increased persistence
US5948925A (en) 1997-05-06 1999-09-07 Genzyme Corporation Cationic amphiphiles containing linkers derived from neutral or positively charged amino acids
US5952516A (en) 1997-05-08 1999-09-14 Genzyme Corporation Cationic amphiphiles containing multiplesteroid lipophilic groups
EP0890639A3 (de) 1997-07-09 2001-10-10 Gesellschaft für biotechnologische Forschung mbH (GBF) BPM2-induziertes cDNA und seine Verwendung
EP1027076A2 (de) 1997-10-29 2000-08-16 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Verwendung von vektoren wie adenoviren und/oder adeno-assoziierten viren und/oder retroviren und/oder herpes-simplex-viren und/oder liposomen und/oder plasmiden als vehikel für genetische information zur befähigung von säugetierzellen mittel, zur behandlung von knochenpathologien zu produzieren

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO9921589A3 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO1999021589A3 (de) 1999-10-14
WO1999021589A2 (de) 1999-05-06
AU750803B2 (en) 2002-07-25
CA2308511A1 (en) 1999-05-06
US7105494B1 (en) 2006-09-12
CA2308511C (en) 2016-01-19
AU1557999A (en) 1999-05-17

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