JPH10509873A

JPH10509873A - 治療薬

Info

Publication number: JPH10509873A
Application number: JP8517929A
Authority: JP
Inventors: アンソニークープマン，ペーター; ネビルグッドフェロー，ペーター
Original assignee: University of Queensland UQ
Current assignee: University of Queensland UQ
Priority date: 1994-11-29
Filing date: 1995-11-29
Publication date: 1998-09-29
Also published as: US6143878A; EP0797663A1; EP0797663A4; US6737413B2; US6316597B1; CA2206305A1; US20020055480A1; WO1996017057A1

Abstract

(57)【要約】（ｉ）図１または図８ａに示されるヌクレオチド配列のひとつ、（ｉｉ）（ｉ）の配列のひとつに相補的である配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）による配列からの変異度が２１％までの配列で、標準的なハイブリダイゼーション条件下でこれらのハイブリダイズすることができ、SOX-9型のポリペプチドをコードする配列、からなる群から選択されるSox-9遺伝子をコードするＤＮＡ配列からなる単離ＤＮＡ分子。図１または図８ａに示されるアミノ酸配列のひとつ、および上記配列と９３．５％から１００％の相同性を有するSOX-9型ポリペプチドからなる組換えたんぱく質。

Description

【発明の詳細な説明】名称治療薬本発明は、哺乳類の骨格発達に関与すると考えられ、また遺伝的骨格疾患症候群である弯曲肢骨異形成症(Campomelic Dysplasia，ＣＤ)、またさらに弯曲低身長(campomelic dwarfism)、または弯曲症候群(campomelic syndrome)に関係する、Sox-9(ヒトにおいてはSOX-9)遺伝子に関する。発明の分野ＣＤは、10,000件の正常出産あたり、0.05から2.2件の罹患がある骨軟骨異形成症である。この疾患は、他の骨格の欠陥を伴う先天性の弯曲と長骨の傾斜とを特徴とする。肩甲骨は非常に小さく、骨盤と脊椎とが変化を示す。通常、肋骨が一対欠損している。下頸椎の重度の異常が見られる。肩甲骨の内部は低形成(hyp oplastic)である。口蓋裂，小顎症，平坦な顔貌および高血圧も特徴である。耳についての様々な欠陥が認められ、蝸牛殻，槌骨，砧骨，あぶみ骨および鼓室に欠陥が認められる。大半の患者は、生後数月内に、気管支軟骨の低形成(Lee et al.，1972，Am.J.Dis.Child，124，485-496)および小胸郭(Houston et al.，198 3，Am.J.Med.Genet.，15，3-28)による呼吸困難のために死亡する。ヒトのSOX-9遺伝子は、ＣＤの遺伝子座である第１７染色体のＣＭＰＤ１領域の中にマッピングされている。ＣＭＰＤ１の染色体位置は、第１７染色体を含む、三つの独立した、見かけ上均衡なデノボな相互転座を基にしていた(Tommerup et al.，1993，Nature Genet .，4，170-174)。三つ全ての転座は、17qw24およびq25の間に切断点があり、成長ホルモン座(GH)に遠位であるがチミジンキナーゼ(TK-1)に近位である。このマッピングにより、以前はＣＭＰＤ１候補であったHOＸ２とCOL１A１とが排除された。現在、ＣＤ患者のDNAでSOX-9遺伝子内の突然変異が発見されており(Foster et al.，Nature，in press; Wagner et al.，Cell in press)、SOX-9遺伝子が骨格の発達に関与することを証明している。興味深いことに、ＣＤはしばしば性転換を伴う(Hovmoller et al.，1977，Hereditas，86，51-62)。ＣＤおよびＸＹ核型の３３例中、２１例が女性(phenotypic females)であり、２例が中性(intersexes)であった(Houston et al.，1983 上記)。この相関性は、ＣＭＰＤ１座位、またはその近辺における常染色体の性転換座ＳＲＡ１を否定するものである。ＣＤに罹患した家族，兄弟において、そして時折りある近親婚においてＣＤが繰り返し見られることから、ＣＤが常染色体劣性遺伝子病として遺伝するものであると考えられた。しかし、全部で５つの独立したデノボの染色体再配列がＣＤに相関することは、これが優性の通常は致死性の突然変異であるというひとつの証拠となる(Tommerup et al.，1993、上記)。これで、ＣＤに罹患した母と娘の例を説明できるが、これらの患者における症状が軽度であることは、別の突然変異を示している可能性もある(Lynch et al.，1993．J.Med.Genet.，30，683-686 )。げっ歯類のSox-9は、マウス第１１染色体の遠位にマッピングされている。この領域は、マウス突然変異短尾(Tail-short)の座など様々な疾患の遺伝子座を含有する。上記のTommerup et al.，1993では、ＣＤとマウス第11染色体のGhとTk-1との間にマップする突然変異短尾(Ts)(Buchberg et al.，1992，Mammal．Genome，3, S162-181)の間の類似性に気付いた。突然変異短尾(Ts)に性転換は伴わなかった。ＣＤと突然変異短尾(Ts)の双方に同じ遺伝子が関与しているのかどうかについては、まだ明らかではない。この二つの表現型間の類似性から、ヒトの突然変異は胚盤胞段階(blastocyst stage)において同型接合性致死性であり、異型接合は弯曲表現型になるという興味深い可能性が浮上した。突然変異短尾(Ts)は、マウスの発達上の突然変異であって、Morgan，1950，J. Hered.，41，208-215 により初めて報告された。この突然変異は半優性である。同型接合体は着床前または直後に胚盤胞段階において死ぬ(Paterson，1980，J.E xpt.Zool.，211，247-256)。異型接合体は短く縮れた尾と多数の他の骨格欠陥を有する。症状は多様であるが、典型的な異常が報告されている(Deol，1961，Pro c.R.Soc.Lon.B.，155，78-95)。短く縮れた尾は、尾椎の数が少ないことと尾椎の異常形とが原因である。椎骨融合および異常下顎結合(dyssmphysis)も仙骨前および仙骨部分に起こる。上腕骨，頸骨，さらに、程度は低いが大腿骨およびとう骨も短くなり、一部のケースでは弯曲している。一般に足の変形も見られる。これらの骨の異常形成には、指の母指三指節の癒着，鎌状変形(falciform )，様々な指と他の部分との癒着が含まれる。さらに、過剰の肋骨，肋骨の癒着，および様々な頭骨異常がみられる。突然変異短尾(Ts)およびＣＤにおいて、骨格系に対する影響が明らかであるが、基となる欠陥の性質に関してはいくらかの議論の余地がある。突然変異短尾(T s)は、骨格異常の最初の兆候が出現する２日前、すなわち、９日目に出現する貧血と一般的な発育遅滞とを伴う(Deol,1961、上記)。ＣＤは、血液欠陥と異常筋系とを伴っており(Rodiguez,1993，Am.J.Med.Genet.，46，185-192)、鳥類および両生類の胚中において神経系に作用する催奇形物質によって模倣されている(R oth，1991，Paedr.Radiol.，21，220-225)。 SOX-9は、哺乳類のY連鎖する精巣決定因子Sryに関係する転写因子の一群をコードする。1990年のY連鎖する精巣決定遺伝子（ヒトではＳＲＹ、マウスではSry ）のクローニング(Gubbay et al.，1990，Nature．346，245-250; Sinclair et al.，1990，Nature 346．240-244)、および、これに続くその発現が染色体的にメスである（ＸＸ）マウスにおけるオスの発達を引き起こすに十分である、ということの証明(Koopman et al.，1991，Sry.Nature，351，117-121)は、位置クローニング(positional cloning)と発生生物学との突破口となった。Sryのたんぱく質産物は、幾つかの他のたんぱく質中において、特に、核たんぱく質の移動度の高い基(high mobility group、HMG)中において既に検出されている(Jantzen e t al.，1990，Nature,344，830-836)、７９アミノ酸モチーフを含有する。幾つかの既知の配列特異的ＤＮＡ結合性たんぱく質は、類似のモチーフを有する。SR Y が配列特異的にＤＮＡに直接結合するという最近の知見(Giese et al.，1992 ，Science，255，453-456)は、Sry が転写因子として働くという主張を支持するものである。ヒトSRYのHMGボックス領域に相当するプローブをマウスＤＮＡのサザンブロット(Southern blots)とハイブリダイズさせると、マウスSry を示す強くハイブリダイズしたＹ特異的バンド以外にも多数のバンドが観察された(Gubbay et al.， 1990、上記)。これらの追加的なバンドは、ＸＸメスおよびＸＹオスの双方のＤＮＡ中に存在し、HMG ボックスによりSry と関連する遺伝子が常染色体および／またはＸ染色体上に存在することを示唆している。実際に、Sry由来のHM GボックスプローブでｃＤＮＡライブラリーをスクリーンニングすると、４クラスのハイブリダイズするクローンが得られるが、これらのいずれもＹ連鎖しない。これらのクローンの配列決定をした結果、これらが互いに（HMGボックス領域のアミノ酸ホモロジーは78-98%）、Sryと（77-82%）と同様に、高度に関係することが示された。これらとＨＭＧボックスを含む他の哺乳類遺伝子との関連性は、これより低い（HMG ボックス領域のアミノ酸ホモロジーは約５０%）。これらＹ連鎖しないSryの相同染色体は、Sox 遺伝子と命名された（Sry型HMGボックス遺伝子）。Sryと同様に、Sox 遺伝子も、転写因子をコードすると考えられるマウス遺伝子の明瞭な一群を表す。SRY HMG ボックスに対する抗体を使用したウエスタンブロット(Western blotting)から、SOX 遺伝子の数が５０もある可能性が示される。 Sox-1 から-4までを複製した遺伝子に相当するｃＤＮＡクローンが、性的結合後(dpc)８．５日のマウス胚ライブラリーから単離され(Gubbay et al.，1990, S upra)、これらが哺乳類の胚において発生の決定に関与すると推論された。これらの遺伝子は、始めＣＮＳ全体について発現されたが、後に、発生中の目や耳などの神経組織サブセットに限定されるようになった。Sox-1 から-3が中枢神経系の発生の指定に関与するようである。Sox-4 は、Ｔリンパ球における転写アクチベーターとして作用する(van de Wetering et al.，1993，EMBO J.,12, 3847-38 54)。Sox-5 は、精子形成における関与を示唆するように、大人の精巣中の丸い精細胞において段階特異的に発現され、また、ビトロにおいて(in vitro)ＤＮＡと結合することが示されている(Danny et al.，1992．EMBO J.,11, 3705-3712) 。Danny et al.，1992，Nucleic Acid Res.，20，2887では、二つのさらなるSox 配列、Sox-6 およびSox-7 を同定しているが、相当するｃＤＮＡはまだクローニングされておらず、その発現もまだ確認されていない。さらに別の１０種類のマウスSox遺伝子群が同定されている。Sryおよび既知の Sox遺伝子のＨＭＧボックスの端に存在する、非常に保存性の高い領域に相当する分解プライマーが作成された。性的結合後(dpc)１１．５日のマウス胚から総ＲＮＡを得て、分解プライマーを使用して逆転写ポリメラーゼチェイン反応( ＲＴ−ＰＣＲ)をおこなった。ＰＣＲ産物はクローニングして配列決定され、Sox -8，-9，-10，-11，-12，-13および-14と呼ばれる７種類の新たな遺伝子が判明した(Wright et al.，1993，Nucleic Acids Res.，21，744)。さらに、三種類の Sox 配列（Sox-16，-17および-18）もマクロファージおよび筋肉ｃＤＮＡから単離された（Layfield et al.，未発表データ）。HMG ボックスに関するマウスSox 遺伝子系統の配列比較から、Sox遺伝子が７つのはっきりしたサブグループに別れることが示された。すなわち、ＡはSry、ＢはSox-1，-2，-3および-14、ＣはS ox-4，-11 および-12、DはSox-5，-6および-13、E はSox-8，-9および-10、Ｆは Sox-7，-17および-18、ＧはSox-15および-16である。この構造別のサブグループ分けが、これらの遺伝子の機能を反映するかどうかは調査しなければならない。しかし、発生に関する遺伝子のＨＯＸやＰａｘ群と同様に、Sox遺伝子は、主要な発生遺伝子群であるというあらゆる所見がある。多くの哺乳類以外の種族のゲノム中に多数のSox遺伝子が存在するという発見により、Sox遺伝子が発生において重要な役割を果たしているという結論は、さらに裏付けを得ている。６つのSry関連配列が、小型の背黒カモメLarus Fuscus において報告されており、アメリカワニにおいて９つ、トカゲにおいて５つ、ニワトリにおいて８つ、ショウジョウバエにおいて７つ、カエルにおいて３つ報告されている(Griffiths，1991,Phil Trans．Roy.Soc.Lond.B.，244,123-128;Denn y et al.，1992 Nucleic Acids Res上記,Coriat et al.，1993，PCR Meth.App. ，2，218-222)。Sox遺伝子はそのクラスの哺乳類内に広く存在する。最近、Sox- 3 が、有袋動物(Foster and Graves，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,91,1927- 1931)からクローンされ、１２種類のヒトのＳＯＸ遺伝子が同定された(Denny e t al.，1992，Nucleic Acids Res.，上記、Farr et al.，1993，Mammal.Genome ，4，577-584;Goze et al.，1993，Nucleic Acids Res.,21; 2943;Stevanovic e t al.,1993，Human Mol.Genet.，3，2013-2018)。また、Sinclair et al.,（1990，Nature,346,240-244）、Koopman et al.(199 1，Nature，351，117-121)およびGoodfellow & Lovell-Badge(1993，Ann.Rev.Ge net.，27，71-92)においても、ＳＲＹが哺乳類において精巣発達の優性誘発因子であることを確認している。ＳＲＹの発見以来、関連するＨＭＧボックスをコードする多くの他の遺伝子が同定されている。ＳＲＹの同定およびクローニングは、染色体再配列の患者を含む、性転換症候群の患者のゲノム調査に基づいている。ヒトＹ染色体上のＳＲＹのほかにも、少なくとも５つの常染色体上および１つのＸ連鎖する遺伝座が、ＸＹ女性化性転換および精巣の発達不全にリンクしていた(Bernstein,R，et al.，1980，J.Med.Ge net.，17，291-300; Pelletier，J. et al.，1991，Nature，353，431-434; Ben net，C.P．et al.，1993，J.Med.Genet．30，518-520; Wilkie，A.O.M.et al.， 1993，Am.J.Med.Genet，46,597-600; Bardoni，B．et al.，1994，Nat. Genet， 7，497-501; Luo，X．et al.，1994，Cell，77，481-490)。これらの染色座のうち４座は、稀な染色体再配列の研究により明らかにされた。Ｘ染色体短腕の複製がＸＹ女性化発達を引き起こしている(Bernstein，R．et al.，1980、上記)。これらの患者における性転換は、Xp21の160kb領域にマッピングされるＤＳＳ(量感受性性転換遺伝子、dosage sensitive sex reversal gene)の活性な複製が2 つ存在することが原因である(Bardoni，B，et al.，1994、上記)。染色体9pおよび10q上の常染色体座が、ＸＹ女性における染色体欠損に関連していた(Bennett，C.P．et al.，1993、上記、Wilkie，A.O.M，et al.，1993、上記)。これらの例における性転換は、量感受性遺伝子(dosage sensitive gene)についてのモノソミー(monosomy)が原因であるのか、この欠損が劣性突然変異を出現させているのかは解明されていない。第三の常染色体座ＳＲＡ１は、第１７染色体上にあり(Tommerup，N．et al.，1993、上記)、この場合、性転換はＣＤを伴う。ＣＤの診断は単純なものではない。最も際立った症状は長骨の先天的な弯曲と傾斜である。しかし、このタイプの弯曲は他の骨格形成不全でもみられる(M cKusick，V.A.，1992，Mendelian Inheritance in Man.，The Johns Hopkins Pr ess，Baltimore)。他の症状としては、様々な骨および軟骨形成に関連する骨格奇形が含まれるであろう。通常、患者は呼吸不全により生後１週間に死亡するが、症状の重度は様々で、少数の患者では程度が軽く、存命して成人する場合もある。ＣＤの際立った特徴は性転換を伴うことである。現在までに、１２１例のＣＤが報告されている。核型分析をおこなった症例のうち、２４例が４６，ＸＹ女性、１４例が４６，ＸＹ男性、３４例が４６，ＸＹ女性（ある段階の生殖欠陥を有する）、および２例がＸＹ核型で性器不明瞭であった(T ommerup，N．et al.，1993、上記、Young，I.D．et al.，1992，J．Med．Genet ，29，251-252、Houston，C.S.，et al.，1983、上記)。核型分析を実施していない残りの４７例においては、性比が３１対１６と女性に偏っていた。組織学的調査を実施したいくつかの性転換例では性器発育異常が示され、ＣＤの原因となっている遺伝子が精巣の形成にも関与することを示唆している。ＣＤの遺伝パターンは明らかではない。多くの研究者が常染色体劣性遺伝の可能性が最も大きいとしている(Cremin．B.J.，et al.，1973，Lancet，1 488-489 )が、様々な浸透度の常染色体優性遺伝からこのパターンを識別することは困難である。同様に、近接遺伝子症候群(contiguous gene syndrome)において、骨の形成異常および性転換が、単一の遺伝子または連鎖する一対の遺伝子の突然変異が原因であるかどうかは明らかではない。ＣＤおよび性転換に随伴する５つの染色体再配列が報告され、これがヒトの第１７染色体の長腕(the long arm)の原因である遺伝子の位置を決めた(Tommerup，N．et al.，1983、上記、Young，I.D． et al.，1992、上記、Maraia，R．et al.，1991，Clin.Genet，39，401-408)。最近、Tommerup et al.，1993 では、この位置が17q24.1-q25.1で、ＧＨとＴＫとをフランキングマーカー(flanking markers)として有することを明らかにした。この20Mb領域にわたり細かく分析したマップが、ゲノム全体の放射線ハイブリッド(radiation hybrid)のパネルを使用して構築されている。このマップは、ある46XY,t(2;17)(q35;q23-24)性転換弯曲肢骨異形成症の患者(患者E)において、転座切断点の位置を特定するのに使用された(Young，I.D．et al.，1992、上記) 。発明の概要現在、Sox-9およびSOX-9遺伝子のＤＮＡ配列が解明され、これにより、これらの遺伝子にコードされる組換えたんぱく質の作成が容易となったことが知られている。以下に示すように、骨または軟骨の再形成において、これらの配列および／または組換えたんぱく質と組み合わせて単離されたＤＮＡ分子を治療的に使用することできる。このように、ある側面において、本発明は、 (i) 図1 に示されるヌクレオチド配列、 (ii) (i)による配列に相補的な配列、および (iii) (i)または(ii)による配列からの変異度が２１％までの配列で、その配列が標準的なハイブリダイゼーション条件下においてハイブリダイズし、SOX-9型のポリペプチドをコードする配列からなるグループより選択されるＤＮＡ配列からなる、単離ＤＮＡ分子を提供する。別の側面においては、本発明は、 (a) 図８ａに記載のヌクレオチド配列、 (b) (a)による配列に相補的な配列、および (c) (a)または(b)による配列からの変異度が18% までの配列で、その配列が標準的なハイブリダイゼーション条件下においてハイブリダイズし、SOX-9型のポリペプチドをコードする配列からなるグループより選択されるＤＮＡ配列からなる、単離ＤＮＡ分子を提供する。本発明はさらに、以下に記載の通り、Sox-9遺伝子およびSOX-9遺伝子の双方によりコードされる組換えたんぱく質を提供する。上記のSox-9配列（ｉｉｉ）および上記のSOX-9配列（ｃ）は、そのようなハイブリッドがSambrook et al.,（1989，In Moleculr Cloning: A Laboratory Manu al Cold Spring Harbour Laboratory Press，New York; 特に9.31から9.59項）に記載の標準的なハイブリダイゼーション法により、または直接的な配列比較により単離できることから、図１および８ａに記載のＤＮＡ配列のハイブリッドに相当する。上記配列のハイブリッドは、 (i) 好ましくは分解物で、そのスパンが少なくとも上記の関連するＤＮＡ配列のフラグメントであるプライマーを設計し、 (ii) このようなプライマーを使用して、オリジナルのｃＤＮＡライブラリーまたは本明細書に記載の適切なソースに由来するＲＮＡのpoly Ａ⁺ ＲＮＡ、または総ＲＮＡのいずれから逆転写されたｃＤＮＡのいずれかから上記の少なくとも一つのフラグメントを増幅する段階を含む方法により作成することができる。組換えたんぱく質は、 (ａ) SOX-9型の組換えたんぱく質、またはその生物学的フラグメントをコードするＤＮＡ配列を適切な発現ベクターに連結して発現構築物(expression constr uct)を作成し、 (ｂ) その表現構築物を適切な宿主細胞(host cell)に感染させ、 (ｃ) 組換えたんぱく質を発現し、 (ｄ) 組換えたんぱく質を単離する段階を含む方法により作成することができる。ベクターは原核生物または真核生物の表現ベクター(a prokaryotic or a euka ryotic expression vector)でもよい。適切には、ベクターは原核生物の表現ベクター(a prokaryotic expression ve ctor)である。好ましくは、ベクターはpTrcHisAである。組換えタンパク質発現のための宿主細胞は、原核生物または真核生物である。適切には、宿主細胞は原核生物である。好ましくは、その細菌は大腸菌である。適切には、細胞はEscherichia coilである。または、宿主細胞は、酵母またはバキュロウイルス(baculovirus)でもよい。当業者には、Sambrook et al.,（1989上記、特に１６および１７項）に記載の例についての標準的な方法を使用して、組換えたんぱく質を容易に作成することができる。さらに別の側面において、本発明は、上記のＤＮＡ分子またはたんぱく質を骨または軟骨の欠陥を有する対象に投与することにより、骨または軟骨を再生する方法を提供する。好ましくは、ＤＮＡ分子またはたんぱく質は、ひざ，指関節，肘または靭帯などの組織に直接注入される。このように、本発明の化合物は、疾患，退化または怪我や、例えば、「テニス肘」や類似の苦痛原因などの反復的な緊張により生じる物理的ストレスを原因とする軟骨または骨の損傷を治療する治療薬として使用できる。さらに本発明の治療薬は、標的となる特定の組織への適切なドラッグデリバリーシステム(drug delivery system)の一部としても使用することができる。本発明の化合物の他の治療における応用的使用用途には、以下のものが含まれる。１．人，家畜，飼い馴らされた動物またはその他のあらゆる動物種において、軟骨および／または骨の骨折，変質，摩耗または退化，遺伝または感染性疾患，消耗，物理的ストレス(例えばスポーツ選手や肉体労働者における)，事故または他のあらゆる原因による損傷の状態を改善するための骨および／または軟骨の復旧，再生または修復における使用。２．商業上または他のあらゆる目的での成長促進を得るための家畜，飼い馴らされた動物またはその他のあらゆる動物種における骨発育の促進。３．人，家畜，飼い馴らされた動物，またはその他のあらゆる動物種における、新生物または過形成の骨または軟骨治療。４．商業上または他のあらゆる目的での成長遅延を得るための家畜，飼い馴らされた動物またはその他のあらゆる動物種における骨構成部分の発育の抑制。５．人を含むあらゆる動物種における他の全ての目的での軟骨および／または骨の質的または量的変更。広い意味では、Sox-9，SOX-9遺伝子またはそのたんぱく質産物についての可能性のある用途は、ふたつのカテゴリーに分類される。（１）骨および／または軟骨の分化および／または成長の促進と、（２）骨および／または軟骨の分化および／または成長の抑制とである。このように、遺伝子またはそのたんぱく質産物（またはどちらかのあらゆる部分またはどちらかの部分の組み合わせ）を、治療薬として評することができる。このように、治療薬は、単独または他のあらゆる分子と組み合わせたSox-9，SOX-9ＤＮＡ，ＤＮＡフラグメント、単独または他のあらゆる分子と組み合わせたSox-9，SOX-9たんぱく質，たんぱく質フラグメント、単独または他のあらゆる分子と組み合わせたSox-9，SOX-9に対する抗体、(単独または他のあらゆる分子と組み合わせた)Sox-9，SOX-9の配列に相当するセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドでもよい。この治療薬の投与方法は、意図する使用用途、治療する種属によって異なる(Muligan， 1993，Science，260，926-932; Morgan et al.，1993，Ann.Rev.Biochem.，62， 191-217を参照)。このような方法には以下のものが含まれる。（ｉ）注射による治療薬の局所適用(Wolff et al.，1990，Science，247，1465 -1468)，外科的移植，点滴または他のあらゆる方法。この方法は特定の骨，軟骨または骨または軟骨領域に作用が限定される場合に有用であろう。この方法は治療の有効性を高める目的で、また、注射，外科的移植，点滴または他のあらゆる方法による治療薬に反応性の細胞の局所適用と組み合わせることもできる。この方法はまた、注射，外科的移植，点滴または他のあらゆる方法による他の因子または治療薬の作用に必要な因子の局所適用と組み合わせることもできる。（ii）ＤＮＡ，オリゴヌクレオチド(oligonucleotides)(Calabretta et al.，1 993，Cancer Treat．Rev.，19，169-179)，ＲＮＡまたはたんぱく質の単独またはリポソーム(Zhu et al.，2993，Science，261，209-212)，ウイルスキャプシッド(Viral capsids)またはナノパーティクル(nanoparticles)(Bertling et al. ，1991，Biotech．Appl．Biochem.，13，390-405)または他のあらゆるデリバリーのメディエーター(mediator)と組み合わせた注射による一般的な全身デリバリー。この方法は、作用を特定の組織または体の部分を標的とするようにしたか否か、そして意とする結果がSox-9 またはSOX-9遺伝子またはたんぱく質活性の促進または阻害または抑制であるかにかかわらず、全ての目的における使用（上記１〜５）において利点があるだろう。特異的な標的化が必要とされる場合、これは薬剤を標的分子(いわゆる魔法の弾丸アプローチで、例えば、抗体を使用する)に連結させる、または注射，外科的移植または他のあらゆる方法による他の因子または治療薬の活性に必要な因子，または治療薬に反応性の細胞を局所投与することによって達成される。（iii） Sox-9またはSOX-9(遺伝子またはたんぱく質)のこれらの細胞中における発現および活性を高めるためのエックスビボ(ex vivo)においてトランスフェクション(例えばリン酸カルシウム存在下、Chen et al.，1987，Mol．Cell Bioc hem.，7，2745-2752 または、カチオン脂質およびポリアミン存在下、Rose et a l.，1991，Biotech.，6,742-751)，感染，インジェクション，エレクトロポーレーション(Shigekawa et al.，1988，BioTech.,6，742-751)または他のあらゆる方法による感染によって改良された細胞の、注射，移植または他のあらゆる方法。改良は、プラスミド(plasmid)，バクテリオファージ(bacteriophage)，コスミッド(cosmid)，ウイルス(アデノウイルス(adenoviral)やレトロウイルス(retrov iral)など)Muligan，1993，Science，260，926-932、Miller,1992，Nature，357 ，455-460、Salmons et al.，1993，Hum.Gen.Ther.，4，129-141)または他のベクターまたはリポソームなど一時変異のための他の薬剤(Zhu et al，1993，Scie nce，261，209-212)，ウイルスキャプシッド(Viral capsids)，またはナノパーティクル(nanoparticles)(Bertling et al，1991，Biotech．Appl.Biochem.，13 ，390-405)または他のあらゆる変異媒介物により媒介させることができる。遺伝子または遺伝子産物のデリバリービヒクルとしての細胞の利用は、Barr et al. ，1991，Science，254，1509-1512およびDhawan et al.，1991，Science 254，1 509-1512 に記載されている。処理された細胞は、あらゆる栄養，成長因子，基質または処置対象中でこれらが生存することを援助する他の薬剤と組み合わせて、デリバリーすることができる。実験予備的検討驚くべきことに、軟骨形成の初期段階において、初期に間充織(mesenchyme)が密集している場所でSox-9の発現が顕著であることが発見されている。したがって、これはSox-9遺伝子産物が、軟骨形成に関与する他の遺伝子の発現をこれらの遺伝子の転写因子として働いて規制している可能性を提起するものである。以下に検討するように、Sox-9はマウス胚において、ヒアリン軟骨を形成するために密集している間充織細胞において非常に強く発現されるが、軟骨形成が完了すると発現が停止し、これは骨形成における限定的な役割と一致している。 Sox-9の発現と染色体マッピングの結果からは、骨突然変異短尾においてこの遺伝子が欠損している可能性が示唆される。胚形成期間中、遺伝子スイッチは未分化の細胞を適当な発生経路につかせるように作用する。これらのスイッチを形成する主要制御遺伝子が、我々が胚発生の制御様式を解明できる鍵なのであるが、哺乳類において同定されているこういった遺伝子はわずかである。その一例はＭｙｏＤ１遺伝子で、これは単独で筋肉の表現型を作成するに必要な全ての遺伝子の発現を活性化することができる。ＭｙｏＤ１・ｃＤＮＡを未分化の線維芽細胞(fibroblasts)へ導入すると、この細胞は筋芽細胞(my oblasts)に変換される(Davis，1987，Cell 51 987-1000)。この他の発生のスイッチ遺伝子には上記のＹ連鎖の精巣決定因子(test is determini ng factor)Ｓｒｙがある。Ｓｒｙは別の生殖腺内の細胞が分化して精巣を形成するように導く働きがある。その後の男性化発生は精巣の成熟細胞で産生されるシグナルによるものである。ＳｒｙおよびＭｙｏＤ１は、他の筋肉特異的遺伝子のプロモーター内においてある部位に結合し、引き続き転写を活性化することが証明されている(Piette，1990，Nature，345，353-355; Lassar, 1989，Cell 58， 823-831)。Ｓｒｙは性決定経路内の下流にある遺伝子の転写を活性化すると推定されているが、これらの遺伝子はまだ同定されていない。骨形成において、大半の骨では、始めにヒアリン軟骨(hyaline cartilage)の枠組の基礎が築かれる。このプロセスにおいて、間充織が密集して骨の概形を決め、軟骨芽細胞がこの構造物内で分化して、この種類の軟骨に特徴的な細胞外基質たんぱく質(extracellular matrix proteins)が合成される。これらの軟骨模型はその後の骨化の過程においてカルシウム塩が沈着するにつれて骨に変化する。マウスSox-9遺伝子の特性付けマウス胚ｃＤＮＡライブラリーをSox-9 ＨＭＧボックスプローブでスクリーニングすると、三つの不完全であるが重複するクローンが確認された。複合ｃＤＮＡ分子のヌクレオチド、および椎定されるアミノ酸配列を図１に示す。２２４９塩基対の配列には、最初のメチオニンコドンから５０７個のアミノ酸のたんぱく質をコードする可能性のあるオープンリーディングフレームが存在した。ＨＭＧボックスの上流に別の三つのＡＵＧコドンがあったが、これらの最後のもの（ポジション２６、図１）のみが、翻訳開始のための強いコンセンサス配列(consensus sequence)を伴っていた(Kozak，1989，J.Cell Biol.，108，229) 。コーディング配列の末端に続いて複数の終止コドン(stop codons)（図示せず）と、推定によるポリアデニル化信号(poly-adenylation signal)ＡＡＴＴＡＡＡが、ポリＡテイル(poly-A-tail)の１４塩基上流に存在する。ｃＤＮＡとゲノムＤＮＡテンプレートから得たSox-9 PCR 産物のサイズの比較、およびSox-9ゲノムクローンのシークエンシング(sequencing)から二つのイントロンが明らかになり、そのひとつはＨＭＧボックスドメインを遮断していた（図1）。これは、マウスでは、Sox遺伝子群全てについてのイントロンの最初の報告であるが、ヒトおよびニワトリでは、Sox-9相同体中の同じ位置にイントロンが既に同定されている。ＨＭＧボックス方向へのSox-9 ｃＤＮＡの3'配列は、グルタミンとプロリンとの残基数が多いが、これは既知のＲＮＡポリメラーゼII転写ファクターの活性化ドメインにおける一般的な特徴である(van de Wetering，1991，EMBO J.，10，1 23-132．Mermod，1989，Cell，58，741-753; Courey，1988，Cell，55，887-898 ; Clerc，1988，Genes Dev.，2，1570-1581; Scheidereit，1988，Nature，336 ，551-557; Muller，1988，Nature，336，544-551; Norman，1988，Cell, 55，9 89-1003)。Sox-9たんぱく質のこのドメインは酵素ＧＡＬ４アッセイを使用したインビトロにおいて、転写活性因子(transcriptional activator)として機能することが現在では証明されている(Lillie，1989，Nature 338 39-44)。Sox-9のオープンリーディングフレームの全体、アミノ酸ポジション３２９から５０７による推定上の活性ドメインのいずれかを含むＧＡＬ４／Sox-9融合たんぱく質の発現を目的としたベクターで感染させることにより、ＣＡＴレポーター遺伝子の転写が活性化された（データは表示せず）。マウス胚形成期におけるSox-9の発現 Sox-9の発現を、ポリＡ⁺ＲＮＡのノーザンブロッティング(Nothern blotting) により、全胚中において調査した。mＲＮＡの大きさは約５．５kbで、ｃＤＮＡクローンのいずれにも存在せず、翻訳されない５'配列の領域がかなりの領域であることが示された。Sox-9 mＲＮＡの発現は８．５dpc から１３．５dpcまで検出され、１２．５dpcで最大となった（図2）。ウォールマウントインシトウーハイブリダイゼーション(Wholemount in s itu hybridization)の結果、頭部，第一鰓裂(first branchial arch)，およびより成熟した突起状体節(mature rostral somites)の間充織に、９dpcおいてSox-9 の発現が示された（図３ａ）。この段階において、平衡胞中と前後軸のほぼ中央の位置で数体節分の長さにわたって脊髄を被覆する体表面外胚葉細胞の散乱した集団中において、より強い発現が起こる。この後者の染色(staining)の重要性が明らかではないが、少なくとも１３．５dpcまで継続し、軸の伸長に伴って尾の方向に徐々に移動する。１０dpcにおいて、強い染色が顔面および第一鰓裂中胚葉(first branchial arch mesoderm)に観察され（図３ｂ）、発現は全体節に広がる。しかし、成熟度の低い尾体節においては、染色部は各体節内の離れた細胞集団中において見られ、これは体幹の軟骨を生み出す硬節コンパートメントにおける発現と一致した。より成熟した吻側体節中においては硬節遊走の証拠を得られた。強い染色は平衡胞(otocysts)中で持続した。心臓の筒状の構造中において、ある程度のシグナルが観察された。興味深いことに、前および中脳の脳室細胞は陽性であったが、中枢神経系のより未熟な領域（後脳および脊髄を含む）は陰性であった。脳室細胞のこの染色は、さらに後の段階では尾の方向に移動し、１１．５pdcまでに尾に到達した（図３ｈ参照）。１０．５pdcにおいて、強い染色が鼻孔陥入周辺の中胚葉中に観察された（図3 c参照）。強い染色の密集が第一および第二鰓裂、および肢芽中に観察された。肢芽密集は、非常に短期の間に強いSox-9発現を獲得し（１０pdc において染色は観察されていない）、胚のアルシアンブルー(alcian blue)染色による判断では、明らかにこれらの部位における軟骨の沈着に先行している（図３ｄ）。この所見は、Sox-9は、おそらく軟骨細胞分化の結果として存在するのではなく、これを引き起こすものであることを示す。前肢芽中では、二つの別個であるが重複する密集、そのうちより近位のものはおそらく上腕骨の密集であったが、実際に存在した。この段階において、Sox-9陽性の硬節細胞が吻側体節から移動しているのがはっきりと見られたが（図３ｃ）、尾体節の範囲内に留まった。平衡胞中の発現は１０から１０．５pdcにおいて減少し、その後も減少し続けた。後芽の後方の尾部領域内の脊索中に染色がはっきりと出現した。これより前部の染色は存在しても、胚中の脊索の深さまでで観察されていたであろう。四肢の発生に伴うSox-9発現のパターンは、後日、さらに複雑なものとなった。１１．５pdcまでに、より遠位の密集が進行してとう骨，尺骨およびあぶみ骨底密集を形成した（図３ａ）。さらに、肩甲骨に相当するはっきりした帯が、So x-9に対する強い陽性を示した。 Sox-9発現と骨格発生の間の相関は、１２．５pdcにおいて最も大きくなり（図３ｆ）、この時点において、アルシアンブルー染色で可視化された骨構造の大半において染色が観察された（図３ｇ）。Sox-9発現は、発生中の椎骨，肋骨，長骨，指および頭軟骨中において観察された。１２．５pdcにおいて、指が形成しているような部位において、Sox-9発現の範囲はアルシアンブルー染色の範囲よりも広く、Sox-9は軟骨細胞中のみならずその密集した間充織始原細胞中においても発現されるという示唆を強く裏付けるものである。この段階において、脊髄の室細胞中における発現は背部から観察した時に、二本の平行するストライプとしてはっきりと目で確認された（図３ｈ）。１３．５pdcまでに、Sox-9染色は軟骨形成がまだ進行中である尾先椎骨，指先，肋骨および鼻軟骨まで確認され、軟骨形成が終了した部位、例えば、四肢の長骨や指の基部などではもはや観察さなかった（図３ｉ）。顕著な染色が触毛中でも観察された。脊髄の脳室細胞の染色は、この時期までには、前および後肢の中間点より後部に観察されるのみとなり、明らかに前から後ろ方向に退行していた。実験的骨折はSox-9の発現を誘発する Sox-9アンチセンスプローブを使用したウォールマウントインシトゥーハイブリダイゼーション(wholemount in situ hybridization)の結果、(Nakase，et al .，1995，J.Bone and Min．Res.，9，651-659)に記載の方法に従ったマウス骨の実験的骨折に引き続き、手術８日後に、強いSox-9発現が軟骨細胞中に得られたが（図４）、対照軟骨細胞においてはSox-9の発現は検出されなかった（データ表示せず）。これらの結果は、Sox-9遺伝子発現は実験的骨折により一時的に誘発されたものであることを示す。連鎖分析種間戻し交雑法(the interspecific backcross method)を使用して、Sox-9は第１１染色体の遠位にマッピングされた。連鎖分析により、マーカーD11Mit10から１８．０±５．４cMまたは、マーカーD11Mit36から２６．５±６．３cMの位置が示唆された（図５）。この戻し交雑における組み換え体の第１１染色体のハロタイプ分析は、Sox-9がM11Mit10の遠位に位置することを示している。この領域に位置する既知のマウスの発生に関する突然変異には、神経学上の突然変異であるジャクソン−シェーカー(Jackson-shaker，(js))，ティータリング(teetering ,(tn))および小脳アウトフロー変性(cerebellar outflow degeneration,(cod)) がある（図５）（Buchberg，1992、上記）。この領域における突然変異の中で、短尾(Ts)については先に述べている。ホモ接合体Ｔｓ未分化胚芽細胞は生長できないが、ヘテロ接合体は生き残り、小型で尾椎の数が少ないことと異常形態とが原因である短く縮れた尾を有し、上記のような様々な骨格異常を示す。骨格異常には、椎骨癒着(vertebral fusion)および線維軟骨結合不全(dyssymphyses)、上腕骨，けい骨，大腿骨および頸骨の形態異常，指の母指三指節および癒着，過剰の肋骨および肋骨の癒着、および様々な頭骨異常がある。脊索、神経管および心臓も奇形である。Ｔｓマウスに観察される骨格の異常は、全て発生中にSox-9が発現された組織内にある。マッピングと発現についてのデータを鑑みると、Sox- 9が短尾マウスにおける遺伝子欠陥を引き起こしている可能性が非常に高い。マウスの胚発生期間中における骨格形成にSox-9が関与することは証明されている。Sox-9は、骨の成分が軟骨として敷設されている部位において強く発現される。我々の観察結果は、Sox-9の発現が軟骨細胞の分化の結果ではなくてむしろその原因であることを示唆している。第一に、Sox-9発現はすべての骨格要素中において軟骨の沈着以前に起こっている。Sox-9発現は最初に発見された硬節細胞、すなわち体幹軟骨を生み出す始原細胞のマーカーである。指において、Sox-9は軟骨基質が既に敷設された領域よりも広範囲にわたって発現され、このことは、Sox-9 は、始めは低密度で充填される始原細胞中で発現が始まり、密集プロセスの期間中ずっと発現されることを示している。第二に、Sox-9の発現が軟骨の沈着の直後に停止する。すなわち、１３．５pdc までに長い四肢の骨および指の近位端中における染色は見えなくなるが、尾および指先など軟骨形成が継続する部位では残っていた。Sox-9発現の期間が短いことは、Sox-9が軟骨形成の開始に寄与し、密集が完了して軟骨特異的なたんぱく質合成が開始すれば、もはや必要でないことを示唆する。一時的なSox-9発現は密接に関係する精巣決定遺伝子Ｓｒｙのそれと類似しており、Sox-9が発現されるところの間充織細胞の運命を決定する遺伝子スイッチの役割を果たす可能性を示唆するものである。第三に、Sox遺伝子群の他のいくつかの遺伝子の産物がそうであるように、Sox -9は転写因子として機能すると考えられる。Sox-9はＨＭＧボックス（部位特異的なＤＮＡ結合性ドメインとして働くことが知られているモチーフ）を有しており、我々はすでに、そのカルボキシ末端がレポーター遺伝子の転写を活性化する能力があることを明らかにしている。したがって、Sox-9は軟骨形成経路中の下流の遺伝子を活性化すると考えられる。このような遺伝子には、骨形態形成たんぱく質群のたんぱく質などの制御分子（Kingsleyによる総説、1994，Trends Gen et.，10，16-21）、または軟骨の主成分であるσ１（ＩＩ）コラーゲンなどの構造遺伝子がある。発生中の骨格中および脊索，中枢神経系および心臓などの他の組織中における Sox-9の発現パターンは、Ｔｓ胚中で起こる欠陥と相関する。加えて、マウスのS ox-9はＴｓの遺伝子座にマッピングされる。総合すると、これらのデータはSox- 9を遺伝子欠陥尾短(Ts)を関連付けるものである。我々のデータで、Ｔｓマウスにおける骨格欠陥を即座に説明することができるが、Sox-9における欠陥でＴｓ胚の示す貧血(anaemid)をいかに説明できるのかは明らかでない（Deol，1961、上記）。我々は、初期の血島(blood islands)の減少したＴｓマウスでは、卵黄嚢(yolk sac)中においてSox-9の発現を検出できなかった。この突然変異が半優性であるのはハプロインサフィシャンシー(haploinsufficency)のためである可能性があり、この場合、正常な成長のための十分な産物を産生するためには、２つの機能的遺伝子コピー(functional copies)が必要とされる。しかし、未分化胚芽細胞Ｔｓホモ接合体が生存できないことは、Ｔｓ欠陥の原因となる遺伝子が未分化胚芽期に異常な発現を必ずしていることを意味するが、４dpcにおいて未分化胚芽細胞中におけるSox-9の発現は検出されなかった。４dpc より以前においては、Sox-9が発現している可能性がある。または、欠陥が突然変異対立遺伝子に指定される過剰発現または不適切な発現の結果である可能性がある。数種類の骨格以外の組織において、発生の過程および成長後にSox-9の発現が観察された。ある組織では、これは軟骨細胞(chandrocytes)の存在を反映するものである可能性がある。脳および脊髄においては、分裂速度の速い脳室域のニューロン(neurones)において、Sox-9の発現が明らかである。弯曲肢骨異形成症の共通する症状は精神の発達遅延で、このことは発生期の中枢神経系、そしておそらくは成長後の脳中において観察される発現が機能上重要であることを示唆している。我々はさらに、マウス胎児の生殖隆起および早期の生殖腺におけるSox-9 の発現を観察した。ＸＹ性転換がしばしば弯曲肢骨異形成症に随伴することから (Hovmoller,1977、上記)、少なくとも人間においては、Ｙ連鎖に関連するＳｒｙと同様に、Sox-9も性の決定に寄与するはずである。Sox-9およびＳｒｙが同じ型の細胞で発現されるかどうか、また、Sox-9がＳｒｙと相互作用し、競合し、またはその下流で作用するのか否かは不明である。Ｔｓマウスでは性転換は見つかっていない。そして、Ｔｓに寄与する突然変異対立遺伝子は性転換表現型の原因ではない可能性がある。性決定および神経および骨格発生におけるSox-9の役割を解明するために、形質転換マウスにおける機能獲得および喪失分析(Goin-and loss-of-function analyses)が必要であろう。ヒトのSOX-9 予備的検討上記の転座点(translocation breakpoint)に隣接して、ヒトSOX-9が見いだされている。臨床的に歪曲肢骨が確認されるが細胞学的に検出される染色体配列のない患者中のSOX-9の突然変異分析(Mutation analysis)およびシークエンシング(sequencing)では、以下に記載するような幾つかの突然変異が確認されている。３人の患者についての詳細なデータによると、２人については新たな(de no vo)な突然変異が確認され、そのうち一人はＸＹ女性であって、これはこの遺伝子内の突然変異がＣＤとSOX逆転を引き起こすことを証明するものである。 17q24.1-q25.1の高解像度マップの作成放射線ハイブリッドマッピングにより、異なるタイプのマーカーを単一のマップに統合できるようになった(Walter，M.A．et al.，1993，Trends in Genetics ，9，352-356、Walter，M.A．et al.，1994，Nature Genet.，7，22-28)。我々は、ＤＮＡサンプルをＰＣＲを使用してスクリーニングした。このＤＮＡサンプルは、第１７染色体のＧＨからＴＫの領域にかけて合計３８のＳＴＳマーカーを有し、１２９の全ゲノム放射線融合ハイブリッドのパネルから得たものである。これらのマーカーは、２６個のマイクロサテライトと、２個の性格のはっきりしないＤＮＡマーカーと、１０遺伝子とが含まれる。マーカーとして使用した遺伝子のひとつであるSOX-9については、我々はすでに第１７染色体の長腕に位置することを確認している（未公表データ、図８参照）。同様のマーカーを、マウスＬ細胞と性転換ＣＤ患者Ｅから得た線維芽細胞とを融合させて作成した体細胞ハイブリッドＢ１に対して試した。このハイブリッドＢ１は相互転座染色体の非存在下、ヒトの転座染色体2pter-q35:17q23-qterおよび親細胞株から得た正常第１７染色体を保持している。Ｂ１に存在する第１７染色体マーカーは、切断点より遠位（すなわち、切断点と第１７染色体の長碗の端との間）に位置するはずであり、ハイブリッドから欠落するマーカーは切断点より近位に位置するはずである。この分析により、マイクロサテライトマーカーであるＤ１７Ｓ９７０が切断点に最も近位のマーカーであり、SOX-9が最も近い遠位のマーカーであると推定された（図６）。ＧＨとＴＫの間のおよその距離を２０Mbとすると、放射線ハイブリッドマップを使用した場合、Ｄ１７Ｓ９７０とSOX-9の距離は１−２Mbと算定される。ＹＡＣ contigの作成および転移決断点の正確な位置決定切断点に近傍のマーカーを使用して、ＩＣＲＦ(Lehrach，H．et al.，1990，I n Genome Analysis Volumel: Genetic and Physical Mapping（Davies，K.E． & Tilghman，S.H.編 pp 39-81，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold S pring Harbor）およびＣＥＰＨＹＡＣライブラリー(Cohen．D．et al.，1993, J.Nature，336，698-701)をスクリーニングした。Genethon and Whitehead/MIT Genome Center マッピングプロジェクトの一部として、ＣＥＰＨライブラリーをスクリーニングするために、近傍のＳＴＳマーカーの一つ(D17S970)およびこの領域に存在するもうひとつのマーカー(D17S949)はすでに使用されている。これらのスクリーニングにおいて同定されたＹＡＣの大きさを決定し、ＳＴＳ含有物に基づいてＹＡＣ contigが作成された（図７）。ＹＡＣの端から得たプローブを単離し、もとのハイブリッドＢ１ＤＮＡおよび他のＹＡＣで検定しcontig を確認した。SOX-9プローブにより同定されたＩＣＲＦＹＡＣＤ０２９２は、ハイブリッドＢ１ＤＮＡとハイブリダイズしないエンドクローンであるD0292R とを与えた。この結果より、転移切断点がSOX-9とD0292Rの間の領域にあることが判明した。パルスフィールドゲル電気泳動(pulsed-fields gel electrophores is)によるD0292の分析より、これらのマーカーが１０５から１２０ｋｂ離れていることが分かった（データは表示せず）。ＩＣＲＦ第１７染色体コスミド(cosmid)ライブラリーを、この領域にかかるＹＡＣの一つ(946E12)に由来するinter-AluＰＣＲ産物を使用してスクリーニングすることにより、SOX-9とD0292Rの間の領域のコスミドcontigを作成した（Lehra ch．H，et al.，1990、上記）。inter-Alu 陽性コスミドを転移切断点に近傍のマーカーと検定したところ、これらはコスミドウォークの開始点となった。単離したコスミド末端を用いてcontigを組み立て、ＹＡＣ Alu-ＰＣＲ陽性コスミドセットから重複するコスミドを同定した（図７）。エンドクローンをもとのハイブリッドＢ１上にマッピングしたところ、ＢａｍＨＩ消化ＤＮＡ(BamHI digeste d DNA)のサザンブロット上で、これらの一つが、患者EとハイブリッドＢ１とにおける切断点を検出した（データは表示せず）。この切断点とSOX-9のオープンリーディングフレームとの距離は８８kbである。 SOX-9遺伝子の特性付けＳＯＸＡＨＭＧボックスプローブで高ストリージェンシー(high stringency) において精巣ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、新しいSOX遺伝子を同定することを目的とする実験の一環において、ヒトSOX-9遺伝子に相当する転写物が単離された（Stevanovic，M．et al.，1993、上記）。マウスSOX-9HMG ボックス領域を含む既公表の部分配列(Wright，E.M．et al.，1993 、上記)との類似性に基づいて、この単離されたｃＤＮＡは、SOX-9であると同定された。我々は、３つの別個のライブラリーから単離されたｃＤＮＡクローンから得た配列を用いて、３９３４bp の合成転写物(composite transcript)を組み立てた（図８ａ）。この配列に相当するゲノムＤＮＡとの比較から、その境界に標準的なスプライス・サイト・ジャンクションを有する２つのイントロン（図８ａおよび８ｂ）の存在が判明した。SOX-9は、イントロンを有することが報告された初めてのSOX遺伝子であり、ゲノムレベルで研究された他のSOX／Sox 遺伝子（SRY、SOX-3およびSOX-4およびSox-4）は、単一のエキソン遺伝子(exon genes) である（Sinclair,A.H．et al.，1990、上記、Stevanovic，M．et al.，1993、上記、Farr，C.J．et al.，1993、上記、Schilham，M.W．et al.，1993，Nuclei c Acid Res.，21，2009）。合成ｃＤＮＡ配列の３′領域には、末端ポリアデノシン領域から１９bp 上流に位置する潜在ポリアデニル化シグナル(polyadenylat ion signal)が含まれる。このｃＤＮＡ配列は、ポリ（Ａ）領域におけるゲノム配列と異なり、クローン化されたｃＤＮＡがSOX-9転写物の３′末端を含有することを示している。合成ｃＤＮＡは、HMG ボックスと３つの潜在開始コドンとを有するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有している。最も５′側のメチオニンを翻訳開始点とすると、５０９アミノ酸からなるポリペプチドが予測される（図８ａ）。このメチオニンは、インフレーム(in-frame)終止コドンの１２５bp下流にあり、クローン化されたｃＤＮＡ配列内に完全なＯＲＦが含まれることを強く示唆している。SOX-9 ｃＤＮＡプローブを使用したノーザンブロット分析によると、成人の精巣，成人の心臓および胎脳から得た全細胞質ＲＮＡ中から、約４．５ｋｂの転写物が検出される（データは表示せず）。ノーザンブロットで観察されたｃＤＮＡ配列の長さと転写物の大きさの間の約６００bpの差は、まだ同定されない転写物の５′非コード配列およびポリアデニル化によって説明できる。アミノ酸１０４から１８２のSOX-9たんぱく質ＨＭＧボックスドメインは、ＳＲＹＨＭＧボックスと７１％の類似性があり、たんぱく質のＣ末端三分の一には、プロリンとグルタミンとに富む領域があり、これは、一部の転写ファクター中に存在する活性化ドメインと類似する(Mitchell，P.J．et al.，1989，Science，245，371-378)。ＤＮＡおよびたんぱく質配列データベースの検索とその後のSOX-9 ＨＭＧボックスの配列作成とによれば、マウスのSox-9，Sox-8およびSox-10は、それぞれ１００％，９８％および９３％の予測アミノ酸との相同性で、最も関連する配列であると確認された。ＨＭＧボックスの外側の配列を使用した同様の検索では、マウスSox-9は別として、データベース中に有意義な共通性はまったく検出されなかった。ヒトおよびマウスの予想たんぱく質には９６％の相同性があり、これらの差は主に保存的置換によるものであるが、マウスSOX-9とニワトリSOX-9との間のアミノ酸相同性(93.4%の相同性)，およびヒトSOX-9とニワトリSOX-9との間のアミノ酸相同性( 93.4%の相同性)において、最小限の修正があった。ＤＮＡレベルでは、ヒトSOX-9 遺伝子の予想される各コーディング領域と本明細書に記載のマウスSox-9 との配列比較から、これらの配列には９１．３％の相同性がある。一方、これらの予想されるコーディング領域とニワトリのSox-9のそれとの配列の比較(GenBank Accession No.U12533)は、ＤＮＡレベルの相同性が低いことを示している(マウス×ニワトリ：79.3%、ヒト×ニワトリ：82.4%)。これらのデータは、Sox-9遺伝子においては、あるクラスの脊椎内の相同性のほうが異なるクラス間の相同性よりも大きいことを示唆するものである。しかし、コーディング領域は、いくつかの異なるサブ領域にそれぞれ分けることができる (マウスSox-9構造の概略図を示した図９を参照)。これらの中には、Sox遺伝子グループを定義づけている保存性の高い領域(Goodfellow and Lovell-Badge，1993 ，Annu.Rev．Genet.，27，71-92)であるＨＭＧボックス（ｎｔ６０８−８４３、図９）があるが、この領域は全てのSox遺伝子群の間で６０％を越える相同性を示す。この領域の外の配列が、各Sox遺伝子のそれぞれの特徴を与えている。別の領域は、プロリン（Ｐ），グルタミン（Ｑ）およびアラニン（Ａ）残基のみからなる短いstrechである（nt 1322-1430、図９）。このような領域は、多くの遺伝子において見つかっており、しばしば転写活性化因子として作用するたんぱく質領域を伴う。遺伝子の残りの部分は、とりあえずａ，ｂ，ｃとする３つの領域にさらに分けることができる（図９）。これらの領域はマウスSox-9とヒトのSOX-9との間で相同性が高い（哺乳類同等物）（表１）。反対に、それぞれの哺乳類のニワトリの Sox-9の領域間の相同性は低い（表１）。マウスとヒトSox-9間の相同性が非常に高く、Sox-9に対して有意な相同性を示す他の遺伝子がないので、当業者は、これらの哺乳類Sox-9遺伝子またはその一部（好ましくは１５単位より大きい長さ）を使用する他の哺乳類Sox-9相同体を生成する手段として、高ストリージェンシ−ライブラリースクリーニング（Samb rook et al.，1989、上記）を使用することができる。単一染色体体細胞(monochromosomal somatic cell)ハイブリッド・マッピング・パネルを使用した第一のSOX-9の位置特定に続き、第１７染色体欠損ハイブリッドを使用した第二の位置決定により、この遺伝子が17q23-qterにマッピングされた（図８記号説明参照）。この位置は、蛍光インシトゥー(in situ)ハイブリダイゼーションにより、さらに17q24 に絞り込まれた。 SOX-9の突然変異分析放射線ハイブリッド・パネルを使用してマッピングしたＢ１中のSOX-9の並置と転移切断点とによって、我々は、臨床的に歪曲肢骨異形成が確認されるが細胞学上では染色体異常が検出されない患者から得たＤＮＡサンプル中のこの遺伝子の突然変異について、テストをすることを思いついた。最初のスクリーニングは、一本鎖コンフォーメーション多形(single-strand conformation polyporphism 、SSCP)アッセイを使用して行った。約１５０bpの重複フラグメント中の既知のコーディング配列とイントロ／エキソン継ぎ目とを増幅するようにプライマーを設計した。変更を有するＳＳＣＰパターン（独自のＳＳＣＰ型）を与えたフラグメントをプラスミドベクター(plasmid vectors)中にクローニングし、配列決定した。９人の患者サンプルを調査したところ、これらのサンプルから６種類のヘテロ接合体突然変異が得られた。つぎに３人の患者について詳細に記載する。患者Ｓ.Ｈ.(４６,ＸＸ女性)(ECACC No.DD1813)。この患者は満期で出産され、以下の典型的なＣＤの特徴を備えていた。すなわち、小顎症，肩甲骨低形成，両側内反馬足，頸椎低形成，長骨および肋骨１１対の弯曲である。この患者での独自のSOX-9 ＳＳＣＰ型のクローニングとシークエンシングの結果、シチジン(cytidine)がチミジン(thymidin)に塩基置換され( ヌクレオチド５８３)、これが予想による５０９のアミノ酸配列中のアミノ酸ポジション１９５に終止コドンを導入することになっていることが判明した（図１０）。この患者の両親について、SOX-9のこの位置についてＳＳＣＰでスクリーニングしたところ、どちらも異常な変化を示さなかった（図１０）。さらに、１００人を超える健常者から得たＤＮＡサンプルを、SOX-9のこの位置についてＳＳＣＰでスクリーニングした。どの健常者においても異常な変化は見られなかった。これは新たな(de novo)突然変異である。患者Ａ.Ｈ.(４６,ＸＹ女性)(NIGMS No.GM01737)。この性転換患者は満期で出産され、短く弯曲した四肢，小肩甲骨および特徴的な顔貌を含む全てのＣＤ症状があった(Hoefnagel，D．et al.，1978，Clinic al Genetics，13，489-499)。正常な女性性器を有し、生殖腺は相当数の生殖細胞を有するが未分化であった。この患者への独自のＳＳＣＰ型のクローニングとシークエンシング（図１０）とより、SOX-9の２６１から２６３のコドン内に含まれる一連の６つのＧｓ(ヌクレオチド７８３から７８８)内への１つのＧの挿入が確認された。結果として起こるフレームシフトにより、未熟状態で終止コドンが導入され、正常な５０９アミノ酸たんぱく質ではなく２９４アミノ酸たんぱく質が翻訳されることとなる。この患者の親のＤＮＡは入手できなかった。健常者にこの突然変異が起こる可能性を調査するために、ＣＤでない１００人を超える者においてSOX-9のこの領域についてＳＳＣＰが行われた。患者Ａ.Ｈ.の独自の型に相当する変化は見出せなかった。患者Ｇ.(４６,ＸＹ女性)。短四肢と先天性頸部嚢水腫との超音波検査所見が得られた後、この胎児は１７週で中絶された。臨床および放射線検査上の特徴には、小顎症，四肢の弯曲，肩甲骨低形成，臀部脱臼および１１対の肋骨があった。正常な女性性器があり、卵巣は組織学上正常であり、卵母細胞を有した。この患者から得た独自のＳＳＣＰ型中に検出された突然変異は、予想されるたんぱく質配列のアミノ酸２８６(ヌクレオチド８５８)の後に４個の塩基対が挿入された結果であることが判明した（図８ａ）。このフレームシフトにより、患者Ａ.Ｈ.におけるのと同じ位置に未熟のままの終止が導入される。両親に対するSOX-9のこの領域についてのＳＳＣＰ分析の結果によって、正常なSOX-9変化が判明した（図１０）。この突然変異は新たなもの(de novo)である。我々はＣＤと常染色体ＸＹ性転換との双方を有する患者から得たものについて切断点を特定するために、位置クローニングアプローチを用いた。ＳＲＹ関連遺伝子であるSOX-9のオープンリーディングフレームは、第１７染色体上の切断点より８８ｋｂ遠位に位置する。我々は、調査した歪曲肢骨異形成症の患者９人中６人において、SOX-9の一つの対立遺伝子中に突然変異を発見した。ここに詳細に記載した３つの突然変異は、遺伝子の機能を破壊すると予想された。２つの突然変異はフレームシフトを引き起こし、これが未熟なままで鎖を終結させて、そのたんぱく質の三分の一を欠損させることになり、一つの突然変異は未熟なままでの終結を引き起こし、これが予想される長さの40%にたんぱく質を短くする結果となる。これらの突然変異の二種類について、１００人を超える健常者の対照集団をスクリーニングしたが、いずれも検出されなかった。二人の患者の両親のＳＳＣＰ分析の結果、彼らの子供に存在した突然変異がないことが判明した。性転換ＣＤ患者において突然変異が新たに(de novo)出現していることは、SOX-9中の変化が歪曲肢骨異形成症および常染色体性転換の原因であることを立証するものである。転座切断点(translocation breakpoint)とSOX-9との正確な関係は、現在のところ不明である。成人の精巣，成人の心臓，胎児脳中のSOX-9転写物は約４．５ｋｂである。しかし、精巣，胎児の脳，および線維肉腫ｃＤＮＡライブラリーから単離されたｃＤＮＡは、転写物の３−９kbをカバーし、約６００bpの翻訳されない配列が説明できないままに残される。SOX-9のゲノムの配列は、５′末端が第１７染色体の動原体(centromere)の方向に向いており、切断点に最も近くなるようになっている。一つ以上のエキソン(exons)が既知のエキソンに向かって５' に存在する可能性、およびこれらが転座により遮断される可能性がある。または、クロマチンドメイン(chromatin domains)による干渉(Dillon，N．et a l.，1994，Current Opinion in Genetics and Development，4，260-264)などのより微妙なメカニズムにより、転座が発現を妨害するのかもしれない。このような広範囲ポジション作用(long-range position effect)は、Ｓｒｙについて証明されている。この場合、小精巣決定領域の外側のＹ染色体成分の欠損がＳｒｙ発現を妨害し、ＸＹ女性性転換を引き起こす(Capel，B．et al.，1993，Nat.Gen et，5，301-307)。離れた位置におこった転座によって影響を受ける遺伝子について、他の例が報告されている(Tommerup，N.，1993，J.Med.Genet.，30，713-7 27)。ＣＤ転座患者の数例が幼児期まで生存し、こういった患者における疾患の程度が軽度であることは、際立った現象である(Mansour，S.，1994，Msc Thesis (Clinical Genetics)，University of London)。歪曲肢骨異形成症はこれまで、常染色体劣性またはＸ連鎖疾患であるとさえされてきたが、優性疾患との一致性のほうが高い例も２〜３ある（Bianchine，J.W ．et al.，1971，Lacet，1，1017-1018、Thurmon，T.F．et al.，1973，J．Ped. ，83，841-843、Lynch，S.A．et al.，1993、上記）。我々の結果は、ＣＤが常染色体優性疾患であるという意見を裏付けるものである。我々は、SOX-9 オープンリーディングフレームの７０％超にわたりＳＳＣＰを実施したにもかかわらず、すべての患者において、両方のSOX-9対立遺伝子中に突然変異を検出できなかった。まだ検出していない一般的な作用のない対立遺伝子がある可能性はあるが、この突然変異の頻度は無関係の患者中に見いだされるほど高かったことはありそうにない。これらの突然変異体中で予測される遺伝子の機能の喪失と両方の対立遺伝子に突然変異がないことは、この優性性が機能の獲得よりもハプロインサフィシャンシー(hapoli-insufficiency)によるものであることを示唆している。量感受性(Dosage sensitioity)というのは、制御遺伝子においてしばしばみられる特徴で、哺乳類の経路を含むいくつかの性決定システムについて報告されている(Bardoni，B．et al.，1994、上記、Parkhurst，S.M．et al.，1994，Science ，264，924-932)。 SOX-9の突然変異についての常染色体優性の予測は、モノソミー(monosomy)１７ｑをもたらす欠損がＣＤを引き起こすというものである。このような欠損は、おそらく致死性を伴うために非常に稀であり、ほぼ必ず環状染色体を伴って報告されていた。興味深いことに、ある環状染色体を伴わない１７ｑ欠損の報告では、患者は、下肢の傾斜などＣＤに起こる多くの身体的特徴を示した(Bridge J ．et al.，1985，Am.J.Med.Genet，21，225-229)。ＣＤと診断された症例は、「非弯曲肢骨型(acampomelic)」弯曲肢骨異形成症や長骨および短骨変種の示唆を含み、随伴する表現型の範囲が広く程度が多様である(McKusick，V.A.，1992、上記)。ＣＤと診断された全ての例において、SOX-9の寄与の度合いを調べることは興味深い。骨格構造上の疾患の臨床症状の不均一性および多様性は、SOX-9が他の骨格形成不全に関与する可能性を残すものである。ＳＲＹとの類似性より、SOX遺伝子が発生制御経路において転写因子として作用する可能性が示唆されてきた。SOX／Soxたんぱく質には、配列特異的結合を示したものがあり(Harley，V.R．et al.，1992，Science，255，453-456、Denny， P．et al.，1992，EMBO J，11，3705-3712、van de Wetering，M．et al.，1993 ，EMBO J．12，3847-3854)、いくつかの転写因子に存在する活性化ドメインと同じように、Ｃ末端の第三SOX-9たんぱく質は、プロリン(proline-)およびグルタミン(glitamine-)を多量に含有する領域がある(Mitchell，P.J．et al.，1989， Science，245，371-378)。この報告に記載の患者中に存在する突然変異配列から翻訳される産物中において、この領域が欠落していると考えられる。上述のように、マウスSox-9の発現パターンは、間充織細胞(mesenchymal cell)の軟骨細胞( chondrocytes)への分化の制御における役割と一致する。４６，ＸＹ個体において、男性から女性への性転換を引き起こすSox-9中の突然変異は、性決定経路においてＳＲＹの前または後で作用している。ＳＲＹに突然変異を有する４６，ＸＹの表現型の患者は、通常は、完全な生殖腺発育不全の女性である。数例において、ＳＲＹ突然変異が遺伝していることが見いだされ、この例では、正常男性とＸＹ女性が同じ家族に存在した。これらの所見は、ＳＲＹ機能を混乱させる遺伝子がある場合、男性または女性のいずれかとなり、おそらく間性の発生はないことを示唆するものである。ＣＤ患者における、ＣＤ患者の示す性的表現分布では、部分的男性化が含まれており、性決定経路中でＳＲＹに次ぐ役割を有するSOX-9と盾循していない。性決定において量感受性の役割を有することが判明した哺乳類の遺伝子は、S OX-9が最初ではない。ＤＳＳは４６，ＸＹ個体中にコピー二部で存在する場合に、様々な程度の男性化を伴って、男性から女性への性転換を引き起こす。ＤＳＳがない場合は、ＳＲＹの存在下での男性発生に矛盾がないが、これが４６，ＸＸ個体における女性発生と矛盾がないかどうかは不明である。骨形成におけるSOX- 9の重要性ゆえに、SOX-9についての無染色体性(nallisomy)は致命的なものになりうる。SOX-9の一染色体性(monosomy)は卵巣の発達とは矛盾せず(Bridge，J．e t al.，1985、上記)、SOX-9を含む領域を有する１７ｑのトリソミーは性転換を伴わなかった(Lenzini，E，et al.，1988，Ann．Genet，31，175-180)。ＣＤに伴う性転換の多様性の原因は、まだ判明していない。骨格異常の重度と性転換の頻度のあいだには明らかな相関関係はない（Mansour，S.，1994、上記）。ＸＹ個体における性転換の有無は、突然変異の種類により決定する可能性があり、また、他の遺伝子座の対立遺伝子の違いにある可能性もある。性決定におけるSOX-9の量感受性およびＳＲＹとの配列の類似性は、この二種類の遺伝子の考えられる進化上の関係を示唆するものである。始原の量依存性性決定システム(primordial dosage dependent sex determination system)が、SO X-9の変化または別のSOX遺伝子により優性の誘導システムに進化していったと考えるのが妥当である(Foster，J.W.，et al.，1994、上記)。突然変異を起こした遺伝子は構造的に発現され、これにより、これが存在する場合、男性発生が起こるのに必要な閾値まで投与量を引き上げることで優性の誘導因子として機能している可能性がある。ＳＲＹの性決定機能が、発生中の生殖隆起中のpre-Setoil細胞において発現されることを示唆する多数の間接的な証拠がある(Goodfellow．P.N．et al.，1993 ，Ann.Rev.Genet.，27，71-92)。これらの細胞において、SOX-9が必要とされるはずであり、完全な細胞機能を得るにはＳＲＹとSOX-9の相互作用が必要である可能性がある。別の可能性として、精巣を形成するために、ＳＲＹを発現するプレセルトーリ(pre-Sertoli)細胞と相互作用するタイプの細胞中においてSOX-9の発現が必要であることが考えられる。間充織細胞は、生殖隆起のもとになる中腎臓から遊走することと、精巣の形成にこれらの遊走細胞が必要であること(Wheat er,P.R．et al.，1979，Functional Histology(Churchill Li vingstone，Edinburgh)とが判明しており、このことでＣＤと性転換との接点を解明できるかもしれない。SOX-9をＣＤおよび常染色体性転換の双方において突然変異している遺伝子として同定することは、骨形成と性決定の研究に新たな方法を提供するものである。表注記表１示される図は完全なニワトリの配列を入手できないため、ヌクレオチド４８４ −６０７について示したものである。カッコ内の数字は本発明において記載のマウスSox-9配列中のヌクレオチドを示す。図１マウスSox-9のｃＤＮＡのヌクレオチドと予測アミノ酸の配列。始めのメチオニンコドン(methionine codon)から得た５０７アミノ酸からなるたんぱく質をコードする可能性のあるオープンリーディングフレームが、２２４９塩基対配列から明らかになった。ＨＭＧボックス（囲み内）の上流に５つのメチオニンコドン（イタリック体で表示）が存在するが、翻訳を開始するための強いコンセンサス配列を伴うのは、このうち４番目のもののみである(Kozak，1989 ，J，Cell Biol.，108，229)。これらの５つのメチオニンコドンは、ヒトSox-9 相同体（SOX-9）配列中にも全て保存されており、ここでもこれらインフレーム終止コドンに先導される（Foster et al.，印刷中）。グルタミンおよびプロリンを多量に含む領域がアミノ酸３３９から５０７に存在する。コーディング配列の末端に続いて複数の終止コドン（マークせず）が存在し、推定のポリアデニル化シグナルが小文字で示されている。イントロンの位置は矢印で記される。これらはｃＤＮＡとゲノムＤＮＡの配列を比較して決定された。方法：λgt１０１０dpc（Clontech社）およびλSHIox 11.5 dpc(Invitrogen社) マウス胚ｃＤＮＡライブラリーおよびλＦＩＸＩＩマウス１２９ＳＶゲノムライブラリー(Gubbay et al.，1990，Nature，346，245-250)を、Sox-9 ＨＭＧボックスを使用してSox-9クローンについてスクリーニングし(Wright et al.，199 3，Nucleic Acids Research，21，744)、次いで、高ストリンジェント条件下(hi ghly stringent conditions)で非ボックスプローブについてスクリーニングした。ｃＤＮＡクローンの配列は、nested deletions中の両方の鎖から得た。シークエンシングはＵＳＢシークエンスキットを使用して実施し、結果はＰＲＩＳＭレディ・リアクション・ダイデオキシ・ターミネーター・サイクル・シークエンシング・キット(Ready Reaction DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit) 、およびアプライド・バイオシステム・ＤＮＡシークエンシング・システム(App lied Biosystems DNA Sequencing System)を使用して確認した。図２マウス胚におけるSox-9発現のノーザンブロット分析。 8.5，9.5，10.5，11.5，12.5および13.5pdcの全胚から単離したポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを、Sox-9 特異的プローブ(上パネル)およびグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Gapdh、下パネル）とハイブリダイズさせた。方法：ファルマシア・クイックプレップ・ｍＲＮＡピュリフィケーション・キット(Pharmacia QuickPrep mRNA Purification kit)を使用して、全胚からポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを得た。ノーザンブロット分析(Sambrook et al.，1989，J.Molecul ar Cloning: A Laboratory Manual．2nd Edition，Cold Spring Hargbor Press ，Cold Spring Harbor)は、１レーン当たり約０．５μｇの各ｍＲＮＡサンプルを使用して行った。オートラジオグラフィーに続いて、メンブラン(membranes) からSox-9プローブを除去して、³²Ｐ標識Gapdhプローブと再度ハイブリダイズさせ、各レーンのｍＲＮＡの相対濃度を示した。転写サイズは、ＧＩＢＣＯ-ＢＲＬ 0.24-9.5kbＲＮＡラダー(ladder)と比較することにより測定した。図３発生中の胚におけるSox-9の発現と軟骨基質の沈着を示す、Wholemountインシトゥー(in situ)ハイブリダイゼーションと、アリシアンブルー軟骨染色。ａ．第一鰓裂(b1)，吻側体節(so)，平衡胞(oc)および脊髄(se)を被覆する一部の体表面外胚葉細胞中にSox-9の発現を示す９．５dpc の全胚。ｂ．尾体節(so)と前脳の脳室細胞(vc)内とに発現を示す１０dpc胚の部分図。ｃ．肢芽(lb)と第二鯉裂(b2)内とにおける発現の開始を示す１０．５dpc全胚。ｄ．アリシアンブルー染料で染色された１０．５dpc胚。この段階においては、軟骨は存在しないことから、軟骨形成に先立ってSox-9発現がおこることが確認される。ｅ．肢芽中における発現の進行および肩甲骨(s)および骨盤(p)の発生開始を示す１１．５dpc。ｆ．大半の骨格構造中に染色部を示す１２．５dpcの胚。ｇ．この段階における軟骨骨格を示すアリシアンブルーで染色した１２．５ dpcの胚，平衡胞，指(d)，肋骨(r)が示される。ｈ．脊髄の室細胞(vc)における発現を示す１２．５dpcの胚の背面からの図。平衡胞も示される。ｉ．発現が、指の先端，尾の先端(t)にまで達したことを示す１３．５dpcの胚の部分図、そこにおいてまだ軟骨が活発に敷設されているが、より成熟した軟骨ではスイッチが切られている。この段階においては、染色は触毛(v)にも見られる。方法：ＨＭＧボックスまたはポリＡテイル配列を一切含まず、３′からＨＭＧボックスまでのSox-9遺伝子配列のサブクローンから作成したアンチセンス(antise nse)およびセンス（図示せず）ＲＮＡプローブを使用した、Wholemountインシトゥー(in situ)ハイブリダイゼーションを、Wilkinson et al.，1993，Methods E nzymol.，225，361-373 に従って実施した。１０．５および１２．５dpc全胚中の軟骨細胞を、Ojeda et al.，1970，Stain．Technol.，45，137-138を改良した方法により染色した。染色した標本は、コダックエクタクロム(Kodak E ktachrome)フィルムを使用して、オリンパス双眼立体顕微鏡上で写真撮影をした。図４マウスSox-9遺伝子配列のサブクローンより作成したアンチセンスＲＮＡプローブ（図示せず）を使用した、実験的骨折から８日後のマウス骨切片中の軟骨細胞のWholemountインシトゥー(in situ)ハイブリダイゼーション。図５ Sox-9のマッピング。種間戻し交雑連鎖の分析データと、一倍体分析の組み合わせから示されたマーカーD11Mit10およびD11Mit36に関するSox-9のおよその位置とを、マウス第11染色体マップのコンセンサス連鎖マップ上において、バーＡとＢとで示す(Buchberg et al.，1993，Mammal.Genome.,4，S164-S175)。ＡはD1 1Mit10に関係する位置であり、ＢはD11Mit36に関係する位置である。Sox-9と短尾(Ts)との相対的位置は、別個の戻し交雑における異なるマーカーに対して相対的にマッピングされたので、正確に示すことはできない。神経学上突然変異であるジャクソンシェーカー(Jackson shaker(js))、ティータリング(teetering(tn) )、および小脳アウトフロー変質(Cerebellar outflow degeneration(Cod))も示した。動原体からの遺伝子上距離はセンチモーガン(centi Morgans)で示した。方法：遺伝子特異的、単一コピーｃＤＮＡプローブが、Sox-9 ３′からＨＭＧボックスまでの領域から単離され、このプローブを使用して二種類のマウス種Mus sretus とMus musculus domesticusとの間の制限酵素切断フラグメント長の変異種を、Pvull 酵素を使用して同定した（データは表示せず）。マッピングは種間戻し交雑後代マウスのサブセット中で、既知のマーカーに関するこれらの変異種の分離を分析することでおこなった(The European Backcross Collaborative Gr oup，1994，Human Mol.Genet.，3，621-627)。図６患者Ｅにおける転座点にまたがる17q放射線ハイブリッドマップ。ＳＴＳマーカーは、ゲノムＤＮＡを表す黒線上に縦に記載される。転座点の近傍のマーカーを示す。下は、ＰＣＲによってＢ１ハイブリッド上で検定した近傍のＳＴＳマーカーD17S970とSOX-9とのそれぞれその有無を示している。Ｂ１は患者Ｅの転座染色体2pter-q35:17q23-qterを含むＬ−ＭＴｋ体細胞ハイブリッド、ＰＣＴＢＡ1.8はヒト第１７染色体のみを含むマウス体細胞ハイブリッド、ＨＦＬはヒト線維芽細胞、Ｌ−Ｍはマウス線維芽細胞である。方法：全ゲノム照射および融合ハイブリッド(WG-RH)は、Ａ２３ハムスター線維芽細胞と照射処理(irradiated)(6000 rad)HFL ヒト線維芽細胞(Waler,M.A．et a l.，1994、上記)を融合して作成した。ＳＴＳの順番は、ＲＦＭＡＰプログラムにより決定した(Boehnke，M．et al.，1991，Am.J.Hum.Genet，49，1174-1188) 。ＰＣＲ反応は、５０ナノグラムのゲノムＤＮＡ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂(ＳＯＸ−９プライマーの場合は、２．５ｍＭのＭｇＣｌ₂)、５０ｍＭのＫＣｌ、０．１％Triton-X100、10mM Tris-Cl(pH8.5)、１．５ＵＴａｑポリメラーゼおよび１μM の各プライマーを使用しておこなった。加熱サイクル条件は、摂氏９４度で３０秒間、摂氏５５度で３０秒間、摂氏７２度で６０秒間、そして摂氏７２度で５分間である。各ＷＧ−ＲＨ中における各ＳＴＳの有無は、平衡臭化物で染色したアガロースゲルでの電気泳動により測定した。プライマー配列は、他のプライマー配列は、ゲノムデータベースから入手できる（ＧＤＢ）。図７患者Ｅの転座点の領域についての、第１７染色体放射線ハイブリッドマップ、ＹＡＣコンティグおよびコスミドコンティグ間の関係。マーカーは、ゲノムＤＮＡを表す黒線上に縦に記載される。ＹＡＣは下に位置する。黒線は確認された内部のマーカーを示し、破線はＹＡＣ範囲の可能性のある部分を示す。示されたサイズは、ＹＡＣ全体、およびキメラ化(chimerism)のために存在する第１７染色体以外の配列を含む可能性がある。コスミドウォークは、ゲノムＤＮＡの転座領域の拡大部の下に示した。SOX-9の構造および方向を示す。ＩＣＲＦR eference Library ＹＡＣおよびコスミド（Lehrach,H．et a l.，1990、上記）をそのようにして示した、他の全てのＹＡＣは、Centre d'Etu de du Polymorphisme Humainによるものである（Cohen，D．et al.，1993、上記）。方法：ＹＡＣおよびコスミドは、vectoretteＰＣＲ(Riley，J．et al.，1990，N eucleic Acid Res.，18，2887-2890)により、公表されているＹＡＣプライマーおよびコスミドベクター(Lawrist4)プライマーＬＡＷ４Ｌ、CGCCTCGAGGTGGCTTAT CGおよびＬＡＷ４Ｒ、ATCATACACATACGATTTAGGTGACを使用して単離された。図８ａ Sox-9のヌクレオチドおよび予測アミノ酸配列。数字付与は、オープンリーディングフレームの１番目のメチオニンコドンのＡに基づいている。インフレーム５′終止コドンおよび予測される最終終止(termi nation stop)コドンは、太文字である。ＨＭＧボックスは囲みの中、プロリン(p roline-)とグルタミンを多量に含む領域は下線を付す。イントロンの位置は矢印で示し、考えられるポリアデニル化シグナルは太文字のイタリック体で示した。図８ｂ SOX-9遺伝子のゲノム構造。黒線は、ゲノムＤＮＡを示す。SOX-9エキソン(exons)は囲みを付し、ＨＭＧボックスは斜線を付している。イントロンの位置を示す。方法：始めのｃＤＮＡクローンは、ラムダｇｔ１０ヒト精巣ライブラリー(Clont ech)を、SOX-Aボックスプローブ（Stevanovic，M．et al.，1993、上記）を使用してスクリーニングすることにより得た。複合転写物は、三つの重複するクローン、およびさらにHT1080（線維肉腫）ｃＤＮＡライブラリー(D.L.Simmons の好意による)およびヒト胎児脳ライブラリー(HGMP Resource Center,Harrow)から得たクローンから決定した。シークエンシングは、ジデオキシ・チェイン・ターミネーション(dideoxy chain termination)法を使用しておこなった。イントロン／エキソン境界は、ゲノムとｃＤＮＡクローンとの制限マッピング(restric tion mapping)、およびゲノムとｃＤＮＡ配列の比較によって決定した。最初にS OX-9 cＤＮＡの第１７染色体に対する位置決定は、体細胞ハイブリッドパネルを探索しておこなった。続く17q23-qterの位置決定は、PCTBA1.8，TRID62,PLT8,PJ T2A1およびＤＣＲ１(Black,D.M．et al.，1993，E.Am.J.Hum.Genet.，52，702-7 10)などの第１７染色体欠損ハイブリッドパネルを使用しておこない、17q24への絞り込みは、正常ヒト分裂中期拡散に対する蛍光インシトゥー(in situ)ハイブリダイゼーションによって行った。図９マウスSox-9遺伝子構造のダイアグラム。線上の数字は、図１に示したＤＮＡ配列に関係するマウスSox-9 遺伝子のヌクレオチドポジションを示す。この遺伝子は、５′非翻訳領域(nts 1-301)，領域A （nts 302-607），ＨＭＧボックス(nt 608-843)，領域Ｂ(nts 844-1321)，Ｐ／Ｑ／Ａを多量に含む領域(nts 1322-1429)，領域Ｃ(nts 1430-1822)および３′非翻訳領域(nts 1823-2249)からなる。図１０弯曲肢骨異形成症化における、一本鎖高次構造多形(Single-strand conformat ion polymorphism、SSCP)およびSOX-9の配列分析。図１０ａＨＭＧボックス(密な斜線)を示すSOX-9オープンリーディングフレーム(斜線の囲み)。数字は、一番目のメチオニンのＡから始まるヌクレオチド配列を示し、ヌクレオチド４３１と６８５との後にイントロンが存在する。黒い線は独自のＳＳＣＰ高次構造に生じるＯＲＦ領域を示す。突然変異の位置は矢印で示す。図１０ｂ（ａ）に示されるプライマーを使用したＳＳＣＰ。レーン１は患者ＤＮＡである。患者Ｓ．Ｈ，およびＧに関しては、レーン２および３はそれぞれ父親と母親のＤＮＡである。患者Ａ．Ｈ，に関しては、レーン２，３は無関係（正常）な個体のＤＮＡである。図１０ｃ正常および突然変異患者対立遺伝子のシークエンシングゲル(sequencing gel) 。それぞれ突然変異の位置を示す。患者Ｓ．Ｈ，およびＡ．Ｈ，についての配列は、コード鎖である。患者Ｇの配列は非コード鎖である。方法：プライマー配列： PCR(10μl)は、図１に記載のとおりで、非放射活性dCTP濃度を１／１０に低下し、０．０５μlの「α−33P」dCTP(1000-3000Ci mmol^-1、10 mCi ml^-1)および０．２μＭの各プライマーを使用しておこなった。反応は、摂氏９４度で３０秒間、摂氏６５度（534-661および836-1018）または摂氏７０度で３０秒間、摂氏７２度で４５秒間を３５サイクルした。ＰＣＲ産物は、１０μの０．２％ＳＤＳ、２０ｍＭＥＤＴＡ、次いで１０μｌの９５％ホルムアルデヒド、２０ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％ブロモフェノールブルー、０．０５％キシレンサイアノール(xylene cyanol)を添加して、摂氏１００度で５分間加熱して変性させた。２ μｌを６％アクリルアミド: ビスアクリルアミド(37.5:1)、５％グリセロールゲルにかけた。電気泳動を、２５Ｗ，摂氏４度でおこなった。複製反応によって得たＰＣＲ産物は、さらにクローニングされ、それぞれ少なくとも１０クローンをジデオキシ・チェイン・ターミネーション法(the didecxy chain termination m ethod)、またはダイデオキシ・ターミネーター・サイクル・シークエンシング(A BI)(DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing)によりシークエンシングした。１２染色体８マイクロサテライトマーカー（ヘテロ接合対度 >70%）を使用した各群のＤＮＡプロファイリングの結果、親と子供の間に不一致の結果はなかった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者グッドフェロー，ペーターネビル英国，ロンドン，エヌダブリュー３４エックスユー，ベルサイズパークアントリムロード，アントリムマンションズ 56

Claims

【特許請求の範囲】１．単離ＤＮＡ分子であり、以下の群より選択されるＤＮＡ配列からなる、ＤＮＡ分子。（ｉ）図１に表示されるヌクレオチド配列（ｉｉ）（ｉ）による配列に相補的な配列（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）による配列からの変異度が２１％までの配列で、標準的なハイブリダイゼーション条件下でこれらのハイブリダイズすることができ、SOX-9型のポリペプチドをコードする配列２．単離ＤＮＡ分子であり、以下の群より選択されるＤＮＡ配列からなる、ＤＮＡ分子。（ａ）図８ａに表示されるヌクレオチド配列（ｂ）（ａ）による配列に相補的な配列（ｃ）（ａ）または（ｂ）による配列からの変異度が１８％までの配列で、標準的なハイブリダイゼーション条件下でこれらのハイブリダイズすることができ、SOX-9型のポリペプチドをコードする配列３．請求項１に記載のＤＮＡ配列によりコードされる、組換えたんぱく質。４．請求項２に記載のＤＮＡ配列によりコードされる、組換えたんぱく質。５．図１に示されるアミノ酸配列、および前記配列と９３．５％から１００％の同一性を有するSOX-9型ポリペプチドからなる、組換えたんぱく質。６．図８ａに示されるアミノ酸配列、および前記配列と９３．５％から１００％の同一性を有するポリペプチドからなる、組換えたんぱく質。７．請求項１に記載のＤＮＡ分子を投与することによる、骨または軟骨の再生方法。８．請求項２に記載のＤＮＡ分子を投与することによる、骨または軟骨の再生方法。９．請求項３に記載の組換えたんぱく質を投与することによる、骨または軟骨の再生方法。１０．請求項４に記載の組換えたんぱく質を投与することによる、骨または軟骨の再生方法。