DE69737660T2

DE69737660T2 - Tumorsupressorgen aus basalzellkarzinom

Info

Publication number: DE69737660T2
Application number: DE69737660T
Authority: DE
Inventors: Michael Frederick Dean; Heidi Hahn; Carol Wicking; Jeffrey Christiansen; Peter G. Zaphiropoulos; Mae R. Gailani; Susan Shanley; Abirami Frederick CHIDAMBARAM; Igor Vorechovsky; Erika Holmberg; Anne Birgitte Unden; Susan Gillies; Kylie Negus; Ian Smyth; Carol Pressman; David J. New Haven LEFFELL; Bernard Frederick GERRARD; Alisa Bethesda GOLDSTEIN; Brandon Wainwright; Rune Toftgard
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1996-05-17
Filing date: 1997-05-16
Publication date: 2008-02-28
Anticipated expiration: 2017-05-17
Also published as: AU725404B2; EP0964925B1; JP2002504805A; EP0964925A2; DE69737660D1; ATE360690T1; AU3131497A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft den Bereich der Onkologie. Insbesondere betrifft diese Erfindung die Entdeckung eines Tumorsuppressorgens, das an der Ätiologie des Nävusbasalzellenkarzinomsyndroms (NBCCS) und verschiedener Krebsarten, einschliesslich Basalzellkarzinomen, beteiligt ist.
Es wird vermutet, dass viele Krebsarten durch eine Reihe genetischer Veränderungen verursacht werden, die zu einer progressiven Störung der normalen Zellwachstumsmechanismen führen (Nowell (1976) Science 194:23, Foulds (1958) J. Chronic Dis. 8:2). Insbesondere die Deletion oder Multiplikation von Kopien ganzer Chromosomen oder Chromosomensegmente oder spezifischer Regionen des Genoms sind verbreitet (siehe z. B. Smith et al. (1991) Breast Cancer Res. Treat. 18: Suppl. 1:5-14; van de Vijer & Nusse (1991) Biochim. BiophysActa. 1072: 33-50; Sato et al. (1990) Cancer Res. 50: 7184-7189). Insbesondere die Amplifikation oder Deletion von DNA-Sequenzen, die Protoonkogene bzw. Tumorsuppressorgene enthalten, sind häufig charakteristisch für die Tumorgenese. Dutrillauy et al. (1990) Cancer Genet. Cytogenet. 49: 203-217.
Ein Krebssyndrom, das ganz offensichtlich durch genetische Faktoren verursacht wird, ist das Nävusbasalzellkarzinomsyndrom (NBCCS). Das Nävusbasalzellkarzinomsyndrom, auch als Gorlin-Syndrom und Basalzellnävussyndrom bekannt, ist eine autosomale dominante Störung, die für Krebs und Entwicklungsdefekte prädisponiert (Gorlin (1995) Dermatologic Clinics 13: 113-125). Seine Prävalenz beträgt schätzungsweise 1 pro 56.000, und 1-2 % der Medulloblastome und 0,5 % der Basalzellkarzinome (BCCs) sind dem Syndrom zuzuschreiben (Springate (1986)). Pediatr. Surg. 21: 908-910; Evans et al. (1991) British J. Cancer. 64: 959-961). Neben den Basalzellkarzinomen (BCCs) und Medulloblastomen besteht bei NBCCS-Patienten ausserdem ein erhöhtes Risiko von Ovarialfibromen, Meningiomen, Fibrosarkomen, Rhabdomyosarkomen, Kardialfibromen und Ovarialdermoiden (Evans et al. (1991) supra., Evans et al. (1993) J. Med. Genet. 30: 460-464; Gorlin (1995) supra.).
Nicht-neoplastische Merkmale, einschliesslich odontogener Keratozysten (die im zweiten und dritten Lebensjahrzehnt aggressiver sind), pathognomonischer dyskeratotischer Dellenbildung der Hände und Füsse und progressiver intrakranialer Verkalkung (normalerweise evident ab der zweiten Dekade), sind sehr häufig. Es treten eine Vielzahl von Defekten des Skeletts auf (Gorlin)1995) supra.; Shanley et al. (1994) Am. J. Med. Genet. 50: 282-290), einschliesslich Anomalien der Rippen, der Wirbelsäule und der Schultern, Pectus excavatum, Pollex rigidus und Polydaktylie. Zu den Gesichtsschädel- und Hirnabnormitäten gehören Gaumenspalte, charakteristische grobe Gesichter, Strabismus, Dysgenese der Corpus callosum, Makrozephalie und prominente Stirn (Gorlin (1995) supra.). Generalisiertes übermässiges Wachstum (Bale et al. (1991) Am. J. Med. Genet. 40: 206-210) und eine akromegalische Erscheinung sind verbreitet, aber die Wachstumshormon- und IGF1-Spiegel sind nicht erhöht.
Die Folgen für die betroffene Person können schwerwiegend sein, hauptsächlich wegen der grossen Menge von Basalzellkarzinomen, die während eines Lebens eine Zahl von 500 erreichen können (Shanley et al. (1994) supra). Die Expression vieler Merkmale des Syndroms ist variabel, aber die Schwere ist tendenziell innerhalb der Familien vererbbar (Anderson et al. (1967) Am. J. Hum. Genet., 19: 12-22). Diese Variation zwischen Familien kann auf spezifische phänotypische Effekte verschiedener Mutationen, Modifikatorgene oder Umweltfaktoren hindeuten (die Exposition gegenüber der Sonneneinstrahlung spielt wahrscheinlich eine Rolle für das Alter beim Ausbruch und Auftreten von Basalzellkarzinomen). Ein Drittel bis die Hälfte der Patienten hat keine betroffenen Verwandten und ist vermutlich das Produkt neuer Keimzellmutationen (Gorlin (1995) supra.). Einseitige und segmentale NBCCS werden somatischer Mutation in einer Zelle des frühen Embryos zugeschrieben (Gutierrez und Mora (1986) J. Am. Acad. Dermatol. 15: 1023-1029).
Das NBCCS-Syndrom wurde einem oder mehreren Genen auf dem Chromosom 9q22-31 zugeordnet (Gailani et al. (1992) Cell 69: 11-117; Reis et al. (1992) Lancet 339: 617; Farndon et al. (1992) Lancet 339: 581-2). Ausserdem wurde nachgewiesen, dass bei einem hohen Prozentsatz der Basalzellkarzinome und anderer mit der Störung verbundener Tumoren dieselbe Region entfernt ist (Gailani et al. (1992) supra.), was vermuten lässt, dass das NBCCS-Gen als Tumorsuppressor fungiert. Die Inaktivierung des/der NBCCS-Gene(s) ist möglicherweise notwendig oder sogar ausreichend für die Entwicklung von Basalzellkarzinomen (Shanley et al. (1995) Hum. Mol. Genet. 4: 129-133; Gallani et al. (1996) J. Natl. Canc. Inst. 88: 349-354).
Seit der ursprünglichen Zuordnung des Gens im Jahr 1992 haben Kopplungsstudien die NBCCS-Region auf ein 4cM-Intervall zwischen D95180 und D95196 eingeengt (Goldstein et al. (1994) Am. J. Hum. Genet. 54: 865-773; Wicking et al. (1994) Genomics 22: 505-511). Bei der berichteten Rekombination unter Einbeziehung eines nicht betroffenen Individuums wurde das Gen versuchsweise proximal zu D9S287 angeordnet (Farndon et al. (1994) Genomics 23: 486-489). Die 9q22-Region ist jedoch sehr genreich und enthielt offensichtlich mindestens zwei Tumorsuppressorgene. Ausserdem wiesen Harshman et al. (1995) (Hum. Mol. Genet. 4: 1259-1266) nach, dass unterschiedliche Methoden der Identifikation von cDNAs aus einer Genomregion zu einer überraschend unterschiedlichen Anordnung von Kandidatengenen führen. Daher war vor diese Erfindung das spezifische NBCCS-Gen unbekannt.
Reparaturgene (PTC-Gene) von wirbellosen Tieren und Wirbeltieren sind in WO 96/11260 vorgesehen. Gemäss der Zusammenfassung legt dieses Dokument Reparaturgene, einschliesslich Reparaturgenen von Maus und Mensch, sowie Methoden zur Isolierung der betreffenden Gene offen, wobei die Gene von verschiedenen Arten oder aus derselben Familien stammen können. In der Zusammenfassung wird ausgeführt, dass die Möglichkeit der Erklärung der Embryonalentwicklung, der Zellregulierung in Verbindung mit der Signalumwandlung durch das in der Referenz offengelegte Reparaturgen, der Identifikation des Agonisten und Antagonisten der Signalumwandlung, der Identifikation der Liganden für die Bindung mit Reparaturgenen, der Isolierung der Lianden und der Analyse der Transkriptions- und Expressionslevel der durch die Referenz offengelegten Reparaturgene besteht, da man die Expression des PTC-Gens regulieren kann.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung stellt eine Nukleinsäuresequenz (z. B. eine cDNA) zur Verfügung, die mit dem Nävusbasalzellkarzinomsyndrom (NBCCS) und verschiedenen Krebsarten, einschliesslich verschiedener sporadischer Basalzellkarzinome (BCCs), assoziiert ist. Das hierin offengelegte NBCCS-Gen scheint ein Tumorsuppressorgen zu sein und ist ein Homolog des gepatchten (PTC)-Gens der Drosophila. Das humane NBCCS-Gen wird hierin deshalb auch als humanes GEPATCHTES (PCT) Gen bezeichnet.
Das Fehlen, die partielle Inaktivierung (z. B. durch Haploinsuffizienz oder Mutation), die vollständige Inaktivierung oder in sonstiger Weise veränderte Expression des NBCCS (PTC) Gens verursacht oder erzeugt eine Prädisposition für NBCCS und/oder für den Ausbruch des Basalzellkarzinoms. In einer bevorzugten Verwirklichung stellt diese Erfindung eine isolierte humane Nukleinsäure zur Verfügung, die ein (PTC)-Protein des Nävusbasalzellkarzinomsyndroms (NBCCS) codiert, wobei die besagte Nukleinsäure die bei den Nukleotiden 442 bis 4329 von SEQ ID NO: 1 dargelegte Sequenz aufeist.
In einer anderen Verwirklichung sieht diese Erfindung Vektoren vor, die die oben beschriebene Nukleinsäure umfassen. Die Vektoren enthalten vorzugsweise die oben beschriebene Nukleinsäure, die operativ (unter der Kontrolle eines Promoters) verbunden ist; entweder konstitutiv oder induzierbar. Der Vektor kann auch ein Initiations- und ein Terminationskodon umfassen.
Diese Erfindung sieht ebenfalls ein isoliertes humanes NBCCS (PTC) Polypeptid vor, wobei das besagte Polypeptid durch SEQ ID NO: 1 codiert ist.
In einer anderen Verwirklichung sieht diese Erfindung pharmakologische Zusammensetzungen vor, die einen pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff und ein Molekül umfassen, das aus der Gruppe ausgewählt wurde, die aus einem Vektor, der SEQ ID NO:60 codiert, oder einem Polypeptid mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO:60 besteht.
Schliesslich sieht diese Erfindung ausserdem therapeutische Methoden vor. Diese umfassen Methoden zur Behandlung des Basalzellkarzinom- und/oder Nävusbasalzellkarzinomsyndroms und/oder der durch Sonneneinstrahlung bewirkten Keratosis in einem Säugetier. Die Methoden können die Transfektion von Zellen des Säugetiers mit einem Vektor, der ein Polypeptid des Nävusbasalzellkarzinomsyndroms (NBCCS) exprimiert, umfassen, so dass die Zellen ein hierin beschriebenes funktionales NBCCS-Polypeptid exprimieren. Die Transfektion kann in vivo oder ex vivo erfolgen. Nach der Ex-vivo-Transfektion wird vorzugsweise die Reinfusion der Zelle in den Organismus vorgenommen, wie hierin beschrieben. Bei anderen Methoden wird dem Säugetier eine therapeutisch wirksame Dosis einer Zusammensetzung verabreicht, die ein NBCCS (PTC) Polypeptid und einen pharmakologischen Trägerstoff umfasst, die hierin beschrieben sind. Die Methoden werden vorzugsweise an Säugetieren wie Mäusen, Ratten, Kaninchen, Schafen, Ziegen, Schweinen und noch besser an Primaten einschliesslich menschlichen Patienten durchgeführt.
Definitionen
Die Begriffe „isoliert", „gereinigt" oder „biologisch rein" beziehen sich auf Material, das tatsächlich oder im Wesentlichen frei von Begleitbestandteilen ist, die in seinem ursprünglichen Zustand normalerweise zu finden sind.
Der Begriff „Nukleinsäure" bezieht sich auf ein Desoxyribonukleotid- oder Ribonukleotidpolymer in ein- oder zweisträngiger Form und umfasst, sofern keine sonstige Beschränkung vorliegt, bekannte Analoga natürlicher Nukleotide, die in ähnlicher Weise funktionieren können wie natürlich vorkommende Nukleotide.
Die Begriffe „Polypeptid", „Peptid" und „Protein" werden hierin wechselweise zur Bezeichnung eines Polymers von Aminosäureresten verwendet. Die Begriffe gelten für Aminosäurepolymere, bei denen ein oder mehrere Aminosäurereste ein künstliches chemisches Analogon einer entsprechenden natürlich vorkommenden Aminosäure darstellen, sowie für natürlich vorkommende Aminosäurepolymere.
Ein „Label" ist eine Zusammensetzung, die durch spektroskopische, photochemische, biochemische, immunochemische oder chemische Mittel nachweisbar ist. Nützliche Labels sind beispielsweise ³²P, Fluoreszenzfarbstoffe, elektronendichte Reagenzien, Enzyme (die z. B. häufig in einem ELISA-Kit verwendet werden), Bitoin, Dioxigenin oder Haptene und Proteine, für die Antiseren oder monoklonale Antikörper zur Verfügung stehen (z. B. kann das Peptid von SEQ ID NO 1 beispielsweise durch Einbringung eines Radiolabels in das Peptid nachweisbar gemacht und zum Nachweis von Antikörpern verwendet werden, die spezifisch mit dem Peptid reagieren).
Der Begriff „rekombinant" gibt bei Verwendung in Bezug auf eine Zelle oder eine Nukleinsäure oder einen Vektor an, dass die Zelle oder die Nukleinsäure oder der Vektor durch Einbringung einer heterologen Nukleinsäure oder die Veränderung einer nativen Nukleinsäure modifiziert wurde oder dass die Zelle von einer entsprechend modifizierten Zelle abgeleitet wurde. So exprimieren rekombinante Zellen z. B. Gene, die in der nativen (nicht rekombinanten) Form der Zelle nicht zu finden sind, oder exprimieren native Gene, die in sonstiger Weise abnorm exprimiert, zu gering oder überhaupt nicht exprimiert sind.
Der Begriff „identisch" im Kontext zweier Nukleinsäuren oder Polypeptidsequenzen bezieht sich auf Reste in beiden Sequenzen, die gleich sind, wenn sie auf maximale Entsprechung ausgerichtet sind. Das optimale Alignment der Sequenzen zu Vergleichszwecken kann z. B. durch den Smith-Waterman-Algorithmus (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482, durch den Needleman-Wunsch-Algorithmus (1970) J. Mol. Biol. 48:443, durch die Ähnlichkeitssuchmethode von Pearson und Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, durch computerunterstützte Implementierungen dieser Algorithmen (GAP, BESTFIT, FASIA und TFASTA in dem Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wisconsin, USA) oder durch Inspektion durchgeführt werden.
Ein zusätzlicher Algorithmus, mit dem sich die Ähnlichkeit der Sequenz bestimmen lässt, ist der BLAST-Algorithmus, der bei Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 beschrieben wird. Software zur Durchführung von BLAST-Analysen ist öffentlich über das National Center for Biotechnology Infor mation (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) verfügbar. Bei diesem Algorithmus werden zuerst High Scoring Segment Pairs (HSPs) durch Identifikation kurzer Worte der Länge W in der Abfragesequenz identifiziert, die einem Grenzscore T mit positivem entweder entsprechen oder genügen, wenn sie mit einem Wort gleicher Länge in einer Datenbanksequenz abgeglichen werden. T wird als Grenzscore des Nachbarworts bezeichnet (Altschul et al., supra.). Diese anfänglichen Nachbarworttreffer fungieren als Seeds zur Initiierung von Suchen nach längeren HSPs, die sie enthalten. Die Worttreffer werden in beiden Richtungen entlang jeder Sequenz erweitert, solange der kumulative Alignment-Score vergrössert werden kann. Die Erweiterung der Worttreffer in jeder Richtung wird in folgenden Fällen angehalten: wenn der kumulative Alignment-Score um die Grösse X von seinem maximal erreichten Wert abfällt; wenn der kumulative Score aufgrund der Akkumulation einer oder mehrerer Rest-Alignments mit negativem Punktwert auf null oder darunter sinkt; oder wenn das Ende der Sequenz erreicht ist. Die Parameter W, T und X des BLAST-Algorithmus bestimmen die Sensitivität und Geschwindigkeit des Alignments. Das BLAST-Programm verwendet standardmässig eine Wortlänge (W) von 11, die BLOSUM62 Scoring-Matrix (siehe Henikoff und Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919), Alignments (B) von 50, eine Erwartung (E) von 10, M=5, N=4 und einen Vergleich beider Stränge.
Der BLAST-Algorithmus führt eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen durch; siehe Z. B. Karlin und Altschul (1993) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787. Ein Mass der Ähnlichkeit, das der BLAST-Algorithmus zur Verfügung stellt, ist die kleinste Summenwahrscheinlichkeit (P(N)); diese gibt die Wahrscheinlichkeit an, mit der eine Übereinstimmung zwischen zwei Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen zufällig eintreten würde. Eine Nukleinsäure wird z. B. als einem NBCCS-Gen oder einer cDNA ähnlich angesehen, wenn die kleinste Summenwahrscheinlichkeit in einem Vergleich der Testnukleinsäure mit einer NBCCS-Nukleinsäure (z. B. SEQ ID Nr.: 1, 58 oder 59) geringer als ca. 1, vorzugsweise geringer als ca. 0,1, noch besser geringer als ca. 0,01 und am besten geringer als ca. 0,001 ist.
Der Begriff „substantielle Identität" und „substantielle Ähnlichkeit" im Kontext eines Polypeptids bedeutet, dass ein Polypeptid eine Sequenz mit mindestens 70 % Sequenzidentität mit einer Referenzsequenz oder vorzugsweise 80 % oder besser 85 % Sequenzidentität mit der Referenzsequenz oder am besten 90 % Identität gegenüber einem Vergleichsfenster von ca. 10-20 Aminosäureresten umfasst. Wenn ein Peptid eine immunologische Reaktion mit Antikörpern eingeht, die gegen ein zweites Peptid erzeugt werden, ist dies ein Hinweis darauf, dass die beiden Polypeptidsequenzen substantiell identisch sind. So ist ein Polypeptid substantiell identisch mit einem zweiten Polypeptid, wenn z. B. die beiden Peptide nur durch eine konservative Substitution voneinander abweichen.
Es deutet darauf hin, dass zwei Nukleinsäuresequenzen substantiell identisch sind, wenn das Polypeptid, das die erste Nukleinsäure codiert, eine immunologische Kreuzreaktion mit dem durch die zweite Nukleinsäure codierten Polypeptid eingeht.
Ein weiterer Hinweis darauf, dass die beiden Nukleinsäuresequenzen substantiell identisch sind, liegt vor, wenn die beiden Moleküle unter stringenten Bedingungen miteinander hybridisieren.
Der Begriff „substantielle Bindung" bezieht sich auf die komplementäre Hybridisierung zwischen einer Sonden-Nukleinsäure und einer Ziel-Nukleinsäure und umfasst geringfügige Mismatches, die durch Reduzierung der Stringenz der Hybridisierungsmedien ausgeglichen werden können, um den gewünschten Nachweis der Ziel-Polynukleotidsequenz zu erreichen.
Die Wendung „hybridisiert spezifisch mit" bezieht sich auf das Binden, Duplexen oder Hybridisieren eines Moleküls mit nur einer bestimmten Nukleinsäuresequenz unter stringenten Bedingungen, wenn diese Sequenz in einem komplexen Gemisch (z. B. einer gesamtzellulären) DNA oder RNA vorhanden ist. Der Begriff „stringente Bedingungen" bezieht sich auf Bedingungen, unter denen eine Sonde mit ihrer Zielsubstanz hybridisieren wird, aber nicht mit anderen Sequenzen. Stringente Bedingungen sind sequenzabhängig und unterscheiden sich je nach den Umständen. Längere Sequenzen hybridisieren spezifisch bei höheren Temperaturen. Generell werden stringente Bedingungen so gewählt, dass sie ca. 5 °C unter dem thermischen Schmelzpunkt (Tm) der spezifischen Sequenz bei einer bestimmten Innenstärke und einem bestimmten pH-Wert liegen. Der Tm ist die Temperatur (bei definierter Innenstärke, bestimmtem pH und bestimmter-Nukleinsäurekonzentration), bei der 50 % der Sonden komplementär zu der Zielsequenz mit der Zielsequenz bei Gleichgewicht hybridisieren. (Da die Zielsequenzen bei Tm generell im Überschuss vorhanden sind, werden bei Gleichgewicht 50 der Sonden belegt). Im Allgemeinen liegen stringente Bedingungen vor, wenn die Salzkonzentration weniger als ca. 1,0 M Na-Ionen und im Normalfall ca. 0,01 bis 1,0 M Na-Ionen (oder andere Salze) bei pH 7,0 bis 8,3 beträgt und die Temperatur mindestens ca. 30 °C bei kurzen Sonden (z. B. 10 bis 50 Nukleotide) und mindestens ca. 60 °C bei langen Sonden (z. B. mehr als 50 Nukleotide) beträgt. Stringente Bedingungen können ebenfalls durch Zugabe von Destabililatoren wie Formamid erreicht werden.
Die Wendungen „geht eine spezifische Bindung mit einem Protein ein" oder „spezifisch immunoreaktiv mit" bezeichnen bei Bezug auf einen Antikörper eine Bindungsreaktion, die entscheidend für die Präsenz des Proteins in Gegenwart einer heterogenen Population von Proteinen und anderen biologischen Stoffen ist. Unter bestimmten Immunoassay-Bedingungen gehen die spezifizierten Antikörper daher vorzugsweise eine Bindung mit einem bestimmten Protein ein und verbinden sich nicht in erheblicher Menge mit anderen in der Probe vorhandenen Proteinen. Für die spezifische Bindung an ein Protein unter diesen Bedingungen ist ein Antikörper erforderlich, der aufgrund seiner Spezifität für ein bestimmtes Protein gewählt wird. Für die Auswahl von Antikörpern, die eine spezifische Immunreaktion mit einem bestimmten Protein eingehen, kann eine Vielzahl von Immunoassay-Formaten kann verwendet werden. Z. B. werden Festphasen-ELISA-Immunoassays routinemässig für die Auswahl monoklonaler Antikörper verwendet, die spezifisch immunoreaktiv mit einem Protein sind. Eine Beschreibung der Immunoassay-Formate und Bedingungen, die für die Bestimmung der spezifischen Immunoreaktivität verwendet werden können, sind zu finden in Harlow und Lane (1988) Antibodies, A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York.
Bei der Beschreibung eines Proteins bezeichnet der Begriff „konservative Substitution" eine Veränderung der Aminosäurezusammensetzung des Proteins, die die Aktivität des Proteins nicht wesentlich verändert. „Konservativ modifizierte Variationen" einer bestimmten Aminosäuresequenz beziehen sich daher auf Aminosäuresubstitutionen derjenigen Aminosäuren, die nicht kritisch für die Proteinaktivität oder Substitution von Aminosäuren durch andere Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften sind (z. B. sauer, basisch, positiv oder negativ geladen, polar oder nicht polar usw.), so dass auch Substitutionen kritischer Aminosäuren die Aktivität nicht wesentlich verändern. Konservative Substitutionstabellen, die funktionell ähnliche Aminosäuren zur Verfügung stellen, sind in Fachkreisen allgemein bekannt. Die folgenden sechs Gruppen enthalten jeweils Aminosäuren, die konservative Substitutionen für eine andere Aminosäure darstellen:

1) Alanin (A), Serin (S), Threonin (T);
2) Asparaginsäure (D), Glutaminsäure (E);
3) Asparagin (N), Glutamin (Q);
4) Arginin (R), Lysin (K);
5) Isoleucin (I), Leucin (L), Methionin (M), Valin (V) und
6) Phenylalanin (F), Tryosin (Y), Tryptophan (W).

Siehe auch Creighton (1984) Proteins, W. H. Freeman and Company. Ausserdem werden individuelle Substitutionen, Deletionen oder Additionen, die eine einzelne Aminosäure oder einen geringen Prozentsatz von Aminosäuren in einer codierten Sequenz verändern, hinzufügen oder entfernen, auch als „konservativ modifizierte Variationen" bezeichnet.
Die Begriffe humanes „PTC-Gen" oder humanes „NBCCS-Gen" oder „humane cDNA" werden wechselweise verwendet, um das hierin offengelegte humane Homolog des gepatchten (PTC)-Gens der Drosophila zu bezeichnen. Wie nachstehend erklärt, ist das humane PTC-Gen ein Tumorsuppressorgen, das auch an der Ätiologie des Nävusbasalzellkarzinomsyndroms beteiligt ist.
Der hierin verwendete Begriff „Genprodukt" bezieht sich auf eine Nukleinsäure, deren Präsenz, Fehlen, Menge oder Nukleinsäuresequenz die Präsenz, das Fehlen, die Menge oder die Nukleinsäurezusammensetzung des Gens angibt. Genprodukte enthalten daher ein mRNA-Transkript, eine revers von einer mRNA transkribierte cDNA, eine von dieser cDNA transkribierte RNA, eine von der cDNA amplifizierte DNA, eine von der amplifizierten DNA transkribierte RNA oder Subsequenzen irgendwelcher dieser Nukleinsäuren, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Von dem Gen exprimierte Polypeptide oder Subsequenzen derselben sind ebenfalls Genprodukte. Die jeweilige Art des Genprodukts ist aus dem Kontext der Begriffsverwendung ersichtlich.
„Abnormes PTC- (oder NBCCS-)Gen" oder „abnorme cDNA" bezieht sich auf ein NBCCS-Gen oder eine cDNA, die ein nicht funktionales NBCCS-Polypeptid oder ein NBCCS-Polypeptid mit substantiell reduzierter Funktionalität codieren. Nicht funktionale NBCCS-Polypeptide oder NBCCS-Polypeptide mit reduzierter Funktionalität sind durch eine Prädisposition (d. h. eine erhöhte Wahrscheinlichkeit im Vergleich zu der normalen Population) für das oder den Ausbruch des Nävusbasalzellkarzinomsyndroms gekennzeichnet. Ebenso bezieht sich „abnormes PTC- (oder NBCCS-)Genprodukt" auf eine Nukleinsäure, die ein nicht funktionales NBCCS-Polypeptid oder ein NBCCS-Polypeptid mit reduzierter Funktionalität codiert, oder das nicht funktionale NBCCS-Polypeptid oder das NBCCS-Polypeptid mit reduzierter Funktionalität selbst. Abnorme NBCCS-(PTC)-Gene oder -Genprodukte umfassen z. B. NBCCS-Gene oder Subsequenzen, die durch Mutationen (z. B. Insertionen, Deletionen, Punktmutationen usw.), Splicing-Fehler, vorzeitig endende Kodons, fehlende Initiatoren usw. verändert wurden. Abnorme NBCCS-Polypeptide umfassen Polypeptide, die durch abnorme NBCCS-Gene oder Nukleinsäure-Genprodukte oder Subsequenzen derselben exprimiert werden. Zur abnormen Expression von NBCCS-Genen gehörte die Unterexpression (im Vergleich zur „normalen" gesunden Population) von NBCCS z. B. durch partielle oder komplette Inaktivierung, Haploinsuffizienz usw.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt eine integrierte Rahmenkarte der NBCCS-Region. Aufgrund von Kopplungs- und Tumordeletionsstudien wird NBCCS zwischen D9S196 und D9S180 eingeordnet, aber die Studien widersprechen sich im Hinblick darauf, ob das Gen proximal oder distal zu D9S287 liegt. Die Reihenfolge der sechs polymorphen Marker D9S197, D9S196-D9S280-FACC-D9S287-D9S180 wird von genetischen Kopplungsdaten abgeleitet (Farndon et al., 1994; Pericak-Vance et al., 1995). D9S196 und D9S197 zeigen keine messbare Rekombination. Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE) und FISH ergeben eine Mindestdistanz von 2 Mb zwischen D9S196 und D9S180. Schlüsselinformationen über YAC, BAC und Cosmid-Contigs in der NBCCS-Region werden dargestellt. Insgesamt wurden 22 überlappende YACs und über 800 Cosmids aus dieser Region isoliert. BAC und Cosmid-Contigs, die über 1,2 Mb abdecken, wurden der Genomdatenbank übermittelt.
2 zeigt eine Karte des PTC-Locus. Das Gen liegt auf 4 überlappenden Cosmids, einschliesslich 226G7, 42H11, 55A16 und 96F9 (LL09NCO1, 96-Well-Koordinaten). Die codierenden Exons des Gens werden als ausgefüllte Felder und die nicht codierenden (unübersetzten) Exons als offene Felder dargestellt. Splice-Varianten der nicht codierenden 5'-Region des Gens zeigen mindestens zwei alternative erste Exons und möglicherweise ein drittes alternatives Exon (siehe Beispiel 2).
3 enthält eine Karte der Promoter-Region des NBCCS (PTC) Gens.
In 4 ist die Abtrennung einer vorzeitigen Terminationsmutation von PTC in einem NBCCS-Stammbaum dargestellt. Die Mutation C1081T (Q210X), die bei diesem Stamm die Abtrennung vornimmt, erzeugt eine Bfal-Stelle. PCR mit flankierenden Primern erzeugt ein 260 bp Produkt mit NBCCS-Merkmalen. (5B). Die Patientin war heterozygot für eine Einstrang-Konformations-Polymorphismus-Variante (SSCP) in Exon 12, die bei ihren Eltern nicht vorhanden war, und die Sequenzierung eines PCR-Produkts aus Genom-DNA zeigte zwei Sequenzen nach Basis 2000, die ausserhalb des Rahmens lagen. Der abnorme Konformer wurde sequenziert (SEQ ID NO: 56) und enthielt eine 1 bp Insertion, die neun Aminosäuren abwärts zu einem vorzeitigen Stopp führte. Die Sequenzen von PCR-Produkten beider Eltern waren normal.
6 zeigt eine UVB-induzierte Mutation von PTC bei einem sporadischen Basalzellkarzinom. (6A) CC-TT-Mutation in dem restlichen Allel mit Allelverlust der NBCCS-Region. Diese DNA-Veränderung, die zu einem vorzeitigen Stopp führt, ist typisch für die UVB-Mutagenese. (6B) Die konstitutionelle DNA der Patientin weist eine normale Sequenz auf.
7 zeigt eine PTC-Deletion bei einem sporadischen BCC. ( 7A) Eine 14 bp Deletion in dem restlichen Allel eines Tumors mit Allelverlust der NBCCS-Region. Trotz der Tatsache, dass dieser Tumor von der Nase, einem der Sonneneinstrahlung stark ausgesetzten Bereich, entfernt wurde, kann die Mutation nicht spezifisch mit der UV-Bestrahlung in Zusammenhang gebracht werden. (7B) Die konstitutionelle DNA wies normale Sequenz auf.
8 zeigt die Nukleotidsequenz (SEQ ID NO:1) der humanen PTCcdNA (Genbank Accession No. U43148). Die PTC-Sequenz einschliesslich des offenen Leserasters und der flankierenden 5'- und 3'-Sequenzen wird dargestellt. Die entsprechende Aminosäuresequenz wird in SEQ ID NO:60 dargestellt.
9 zeigt Mutationen im humanen PTC-Gen in DNA, die von desmoplastischen Medulloblastomen D322, D292 und D86 erzielt wurde. 9A: Mikrosatellit D9S302 zeigt Heterozygositätsverlust in Tumor D322. Bei diesem Tumor weist das verbleibende Allel von Exon 6 eine veränderte Mobilität auf. Die DNA-Sequenzierung zeigt die Deletion eines einzelnen Basenpaars in der Tumor-DNA, die zu einer Frameshift und daraus resultierenden Trunkierung des PTC-Proteins führt. 96 zeigt SSCP-Varianten in Exon 10 in Tumor D292 ohne Allelverlust von Chromosom 9q. Die Sequenzierung des veränderten Allels zeigt eine Insertion von vier Basenpaaren an Position 1393. 9C zeigt die Sequenzierung von Exon 10 in Tumor D86. Dieser Tumor mit Heterozygositätsverlust weist eine „In-frame"-Deletion von sechs Basenpaaren an Position 1444 auf (CTG GGC). Dies führt zu einer Deletion von zwei Aminosäuren (Glycin und Leucin) in Transmembranregion 3.
10 zeigt PTC-mRNA-Level, die unter Verwendung einer in Beispiel 5 beschriebenen semi-quantitativen PT-PCR-Methode bestimmt wurden. 250 ng RNA in 10 μl wurden in Gegenwart von je 40 pg der Standard- RNAs mit internen Deletionen für PTC, β₂-Mikroglobin und GAPDH revers transkribiert. Die cDNAs wurden dann mit Primern für PTC und die Housekeeping-Gene amplifiziert. Die Produkte wurden getrennt und auf einem ABI 373 A Sequenzierer quantifiziert. Die Expressionslevel der drei Gene wurden als Verhältnis der Signale der Probe (rechte Peaks) zu den spezifischen Standards (linke Peaks) bestimmt. 10A: PTC-mRNA-Expression in zwei repräsentativen Tumoren der klassischen MB-Variante; 10B: Expression bei desmoplastischen MBs; 10C: Expression in adultem humanem Cerebellum.
11 ist eine schematische Darstellung des PTC-Proteins mit der Lokalisierung der angegebenen Keimlinienmutationen. Die mutmasslichen Transmembranbereiche werden mit „TM1" bis „TM12" bezeichnet; die schraffierten Felder stellen zwei mutmassliche extrazelluläre Schleifen dar. Ein Sternchen (*) bezeichnet eine Missense-Mutation; ein Dreieck
bezeichnet eine Nonsense- oder Frameshift-Mutation; und eine Raute (♦) bezeichnet mutmassliche Splicing-Varianten. Offene Felder entsprechen Exons, die relevante Bereiche codieren.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Diese Erfindung betrifft die Entdeckung eines Tumorsuppressorgens, das mit der Enstehung des Nävusbasalzellenkarzinomsyndroms (NBCCS) assoziiert ist. Ausserdem betrifft diese Erfindung die Entdeckung, dass verschiedene Krebsarten, einschliesslich sporadischer Basalzellkarzinome (BCCs), bei somatischem Verlust beider Kopien desselben Gens entstehen können.
Das Nävusbasalzellkarzinomsyndrom, auch als Gorlin-Syndrom und Basalzellnävussyndrom bekannt, ist eine autosomale dominante Störung, die für Krebs und Entwicklungsdefekte prädisponiert (Gorlin (1995) Dermatologic Clinics 13: 113-125). Seine Prävalenz beträgt schätzungsweise 1 pro 56.000, und 1-2 der Medulloblastome und 0,5 % der Basalzellkarzinome (BCCs) sind dem Syndrom zuzuschreiben (Springate (1986) J. Pediatr. Surg. 21: 908-910; Evans et al. (1991) British J. Cancer. 64: 959-961). Neben den Basalzelikarzinomen (BCCs) und Medulloblastomen besteht bei NBCCS-Patienten ausserdem ein er höhtes Risiko von Ovarialfibromen, Meningiomen, Fibrosarkomen, Rhabdomyosarkomen, Kardialfibromen und Ovarialdermoiden (Evans et al. (1991) supra., Evans et al. (1993) J. Med. Genet. 30: 460-464; Gorlin (1995) supra.).
Die Folgen für die betroffene Person können schwerwiegend sein, hauptsächlich wegen der grossen Menge von Basalzellkarzinomen, die während eines Lebens eine Zahl von 500 erreichen können (Shanley et al. (1994) supra). Die Expression vieler Merkmale des Syndroms ist variabel, aber die Schwere ist tendenziell innerhalb der Familien vererbbar (Anderson et al. (1967) Am. J. Hum. Genet., 19: 12-22). Diese Variation zwischen Familien kann auf spezifische phänotypische Effekte verschiedener Mutationen, Modifikatorgene oder Umweltfaktoren hindeuten (die Exposition gegenüber der Sonneneinstrahlung spielt wahrscheinlich eine Rolle für das Alter beim Ausbruch und Auftreten von Basalzellkarzinomen). Ein Drittel bis die Hälfte der Patienten hat keine betroffenen Verwandten und ist vermutlich das Produkt neuer Keimzellmutationen (Gorlin (1995) supra.). Einseitige und segmentale NBCCS werden somatischer Mutation in einer Zelle des frühen Embryos zugeschrieben (Gutierrez und Mora (1986) supra.).
I. Verwendungen der NBCCS (PTC) cDNA
Wie oben angegeben, ist das NBCCS-Gen dieser Erfindung ein Tumorsuppressorgen. Defekte in der Expression dieses Gens sind mit dem Ausbruch verschiedener Krebsarten verbunden, insbesondere dem sporadischen Basalzellkarzinom in Körperzellen. Erbliche Defekte in der Expression des NBCCS-Gens sind ein Kausalfaktor in der Ätiologie des NBCCS und seinen begleitenden Entwicklungsabnormitäten (siehe nachstehendes Beispiel 2).
Während angenommen wird, dass Basalzellkarzinome und viele Merkmale des NBCCS auf homozygote Inaktivierung des PTC hervorgerufen werden, führt man generalisierte oder symmetrische Merkmale wie übermässiges Wachstum, Makrozephalie und Dysmorphologie des Gesichts auf Haploinsuffizienz oder andere Mechanismen der partiellen Geninaktivierung zurück.
Der Nachweis einer fehlerhaften NBCCS (PTC) Genepression ist eindeutig von klinischem Wert. Die Präsenz eines NBCCS (PTC) Gens, einer cDNA, mRNA, eines Proteins oder einer Subsequenz des Gens, einer cDNA oder eines Proteins in einer biologischen Probe ist nützlich, z. B. als Marker zur Bewertung der RNA-Transkription und/oder -Translation in vivo und/oder in situ bei der Krebsdiagnose (wie beim Nachweis oder der Überprüfung des Basalzellkarzinoms), bei der NBCCS- oder BCC-Prophylaxe als Hinweis auf eine erbliche Prädilektion für NBCCS oder BCC oder bei der forensischen DNA-Analyse wie dem genetischen Fingerabdruck. NBCCS cDNA voller Länge, einzelne Exons oder Subsequenzen derselben sind ebenfalls nützlich als Sonden (insbesondere mit Label) für den Nachweis der Präsenz oder Nichtpräsenz und/oder die Quantifizierung normaler oder abnormer (z. B. verkürzter oder mutierter) NBCCS (PTC) DNA oder RNA in einer biologischen Probe. Die markierten Sonden können ebenfalls nützlich sein, wie bei der Fluoreszenz-Karyotypisierung als Marker des NBCCS-Gens. Da die NBCCS cDNA oder Subsequenzen derselben hierin dargestellt sind, um das humane Chromosom 9q22.3 zuzuordnen, können Fachleute das Gen, die cDNA oder Subsequenzen als Sonde verwenden, um zu bewerten, ob grobe Chromosomenabnormitäten in dieser Region von Chromosom 9 vorhanden sind. Dies ist z. B. nützlich für das In-utero-Screening eines Fötus zur Untersuchung auf das Vorliegen von Chromosomenabnormitäten, insbesondere auf eine Prädilektion von NBCCS oder Basalzellkarzinomen.
Ebenso können die durch die NBCCS cDNA codierten Proteine als Diagnosemarker für NBCCS und/oder Basalzellkarzinome verwendet werden. Die Proteine oder Subsequenzen derselben können des Weiteren als Antigene zur Erzeugung von Anti-NBCCS-Proteinantikörpern verwendet werden. Die Antikörper sind nützlich für Immunoassays zum Nachweis der normalen und abnormen Expression von NBCCS-Proteinen und für die Isolierung von NBCCS-Polypeptiden (wie bei der Affinitätschromatographie).
Vektoren, die die NBCCS-Proteine codieren, sind nützlich für die Expression dieser Proteine, um Immungene für die Antikörperproduktion zur Verfügung zu stellen. Vektoren, die die NBCCS-Proteine codieren, sind ausserdem nützlich für die In-vitro- oder In-vivo-Transformation der Zellen zur Expression der NBCCS-Proteine. Die In-vivo-Transforrnation von Zellen zur Expression der heterologen NBCCS-Gene kann verwendet werden, um die defiziente Expression des NBCCS-Proteins auszugleichen.
Zellen und/oder Gewebe, die das NBCCS-(PTC)-Gen exprimieren, können zur Überwachung der Expressionslevel der NBCCS-Polypeptide in einer breiten Vielzahl von Kontexten verwendet werden. Wenn z. B. die Auswirkungen eines Medikaments auf die NBCCS-Expression bestimmt werden müssen, wird das Medikament dem (zur NBCCS-Expression) transformierten Organismus, Gewebe oder der Zelle verabreicht. Die Expressionslevel oder Expressionsprodukte werden laut der nachstehenden Beschreibung analysiert, und die Ergebnisse werden mit den Ergebnissen der ähnlich, jedoch ohne das getestete Medikament, behandelten Organismen, Gewebe oder Zellen verglichen.
II. Das NBCCS-(PTC)-Gen
A) Das humane PTC-Gen
SEQ ID NO:1 liefert Nukleinsäure- und Polypeptidsequenzlisten für die humane PTC cDNA dieser Erfindung. Die gezeigte Sequenz der humanen PTC besteht aus einem Open-Reading-Frame von 3888 Nukleotiden, die auf dem Ende 5' bzw. dem Ende 3' von den Nukleotiden 441 und 2240 flankiert werden (SEQ ID NO: 1, 8.). Der Open-Reading-Frame der humanen PTC cDNA codiert für ein putatives Protein von 1296 Aminosäuren. Der Open-Reading-Frame beginnt mit einem ATG-Kodon, das einen moderaten Match für die translationale Start-Consensus-Sequenz bei Wirbeltieren (GAGGCTATGT (SEQ ID NO: 6) in PTC gegenüber GCCGCCATGG (SEQ ID NO: 7) aufweist (Kozak (1991) J. Biol. Chem. 266: 19867-19870)). Dieses Kodon codiert für die erste Aminosäure einer humanen Form des PTC-Proteins, das aus 1296 Aminosäuren mit einem relativen Molekulargewicht (M_r) von 131 × 10³ besteht. Es weist 61 % Sequenzidentität zu seinem Drosophila-Pendant auf. Der Open-Reading-Frame erstreckt sich weitere 354 Nukleotide das ATG-Kodon aufwärts (beginnend am Basenpaar 88 der in 8 gezeigten Sequenz). Die unübersetzte Region 3' enthält ein vorschriftsmässiges Polyadenylationssignal (AATAAA (SEQ ID NO: 8)) sowie mRNA-destabilisierende Motive (ATTTA (SEQ ID NO: 9)). Dies sind die lokalisierten Nukleotide 1401 bzw. die Nukleotide 547, 743 und 1510 nach dem Terminationskodon. Ein zweites humanes PTC-Protein enthält einen Open-Reading-Frame, der sich bis zu dem Ende 5' fortsetzt und durch Upstream-Sequenzen initiiert werden kann.
B) Isolierung von cDNA und/oder Sonden
Die Nukleinsäuren (z. B. NBCCS cDNA oder Subsequenzen (Sonden)) der vorliegenden Erfindung werden durch In-vitro-Methoden geklont oder amplifiziert, z. B. durch Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR), Ligase-Ketten-Reaktion (LCR), das Transkription-basierte Amplifikationssystem (TAS), das selbstunterhaltende Sequenzreplikationssystem (SSR). In Fachkreisen ist eine grosse Vielzahl von Klon- und In-vitro-Amplifikationsmethoden bekannt. Beispiele dieser Techniken und hinreichende Anleitungen für Fachleute zur Durchführung von Klonverfahren sind zu finden bei: Berger und Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology 151 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning – A Laboratory Manual (2nd ed.) vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY, (Sambrook et al.); Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, ein Joint-Venture zwischen Green Publishing Associates, Inc. und John Wiley & Sons, Inc. (1994 Supplement) (Ausubel); Cashion et al., US-Patent-Nr. 5.017.478 ; und Carr, europäische Patent-Nr. 0.246.864 . Beispiele für Techniken, die als hinreichende Anleitung für In-Vitro-Amplifikationsmethoden für Fachleute dienen können, sind zu finden bei Berger, Sambrook und Ausubel sowie Mullis et al., (1987) US-Patent-Nr. 4.683.202 ; PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis et al. eds.) Academic Press Inc. San Diego CA (1990) (Innis); Arnheim & Levinson (1. Oktober 1990) C&EN 36-47; The Journal of NIH Reseach (1991) 3: 81-94; (Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173; Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874; Lomell et al. (1989) J. Clin. Chem., 35: 1826; Landegren et al., (1988) Science, 241; 1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology, 8: 291-294; Wu und Wallace (1989) Gene, 4: 560, und Barringer et al. (1990) Gene, 89: 117.
In einer bevorzugten Verwirklichung kann die humane NBCCS (PTC) cDNA durch routinemässige Klonmethoden isoliert werden. Die in SEQ ID NO: 1 bereitgestellte cDNA-Sequenz kann zur Bereitstellung von Sonden verwendet werden, die in einer Genom-DNA-Probe spezifisch zu dem NBCCS-Gen oder in einer Gesamt-RNA-Probe zu der NBCCS mRNA hybridisieren (z. B. in einem Southern Blot). Sobald die Ziel-NBCCS-Nukleinsäure identifiziert ist (z. B. in einem Southern Blot), kann sie gemäss Standardmethoden, die in Fachkreisen bekannt sind, isoliert werden (siehe z. B. Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning; A Laborstory Manual, end Ed., Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laborstory; Berger und Kimmel (1987) Methods in Enzymology, Vol. 152: Guide to Molecular Cloning Techniques, San Diego: Academic Press, Inc.; oder Ausubel et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York). Methoden zum Screening humaner cDNA-Bibliotheken auf das NBCCS-Gen werden in Beispiel 1 zur Verfügung gestellt.
In einer anderen bevorzugten Verwirklichung kann die humane PTC cDNA durch Amplifikationsmethoden wie die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) isoliert werden. Tabelle 2 stellt Primer zur Verfügung, die für die Amplifikation aller 21 Exons der cDNA geeignet sind. Ausserdem werden geeignete PCR-Protokolle in Beispiel 2 zur Verfügung gestellt.
III. Expression von NBCCS-Polypeptiden
A) Chemische De-novo-Analyse
Die NBCCS-Proteine oder Subsequenzen derselben können unter Verwendung standardisierter chemischer Peptidsynthesemethoden synthetisiert werden. Wenn die gewünschten Subsequenzen relativ kurz sind (z. B. wenn eine bestimmte Antigendeterminante gewünscht wird), kann das Molekül als einzelnes angrenzendes Polypeptid synthetisiert werden. Wenn grössere Moleküle gewünscht sind, können die Subsequenzen separat (in einer oder mehreren Einheiten) synthetisiert und dann durch Kondensation des Aminoterminus eines Moleküls mit dem Carboxylterminus des anderen Moleküls verschmolzen werden, wodurch eine Peptidbindung hergestellt wird.
Die Festphasensynthese, bei der die C-terminale Aminosäure der Sequenz mit einem unlöslichen Träger verbunden wird, gefolgt von der sequentiellen Addition der restlichen Aminosäuren in der Sequenz, ist die bevorzugte Methode für die chemische Synthese der Polypeptide dieser Erfindung. Techniken für die Festphasensynthese werden beschrieben von Barany und Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis; S. 3-284 in The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part A., Merrifield et al. J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2156 (1963), und Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., Pierce Chem. Co., Rockford, III. (1984).
A) Rekombinante Expression
In einer bevorzugten Verwirklichung werden die NBCCS-Proteine oder Subsequenzen derselben unter Verwendung der rekombinanten DNA-Methodik synthetisiert. Generell wird dabei eine DNA-Sequenz erzeugt, die das Fusionsprotein codiert, die DNA in einer Expressionskassette unter der Kontrolle eines bestimmten Promoters eingeordnet, das Protein in einer Wirtszelle exprimiert, das exprimierte Protein isoliert und bei Bedarf das Protein renaturiert.
Die DNA-Codierung der NBCCS-Proteine oder Subsequenzen dieser Erfindung kann durch jede oben beschriebene geeignete Methode vorbereitet werden, z. B. einschliesslich Klonen und Restriktion geeigneter Sequenzen oder direkter chemischer Synthese durch Methoden wie die Phosphotriester-Methode von Narang et al., Meth. Enzymol. 68: 90-99 (1979); die Phosphodiester-Methode von Brown et al., Meth. Enzymol. 68: 109-151 (1979); die Diethylphosphoramidit-Methode von Beaucage et al., Tetra Lett., 22: 1859-1862 (1981); und die Feste-Träger-Methode von US-Patent Nr. 4.458.066 .
Durch die chemische Synthese wird ein einsträngiges Oligonukleotid erzeugt. Dieses kann durch Hybridisierung mit einer Komplementärsequenz oder durch Polymerisation mit einer DNA-Polymerase unter Verwendung des Einzelstrangs als Schablone in eine zweisträngige DNA umgewandelt werden. Fachleute würden erkennen, dass die chemische DNA-Synthese zwar auf Sequenzen von ca. 100 Basen begrenzt ist, längere Sequenzen aber durch die Verbindung kürzerer Sequenzen erzielt werden können.
Alternativ können Subsequenzen geklont und die entsprechenden Subsequenzen unter Verwendung geeigneter Restriktionsenzyme gespalten wer den. Die Fragmente können dann zu der gewünschten DNA-Sequenz verbunden werden.
In einer Verwirklichung können die NBCCS-Proteine dieser Erfindung unter Verwendung von DNA-Amplifikationsmethoden wie Polymerase-Kettenreaktion (PCR) geklont werden. So wird z. B. die Nukleinsäuresequenz oder -subsequenz unter Verwendung eines Sense-Primers, der eine Restriktionsstelle (z. B. NdeI) enthält, und eines Antisense-Primers, der eine andere Restriktionsstelle (z. B. HindIII) enthält, PCR-verstärkt. Dadurch wird eine Nukleinsäure erzeugt, die die gewünschte NBCCS-Sequenz oder -Untersequenz codiert und terminale Restriktionsstellen aufweist. Diese Nukleinsäure lässt sich dann leicht in einen Vektor einbinden, der eine Nukleinsäure enthält, die das zweite Molekül codiert und die geeigneten entsprechenden Restriktionsstellen aufweist. Geeignete PCR-Primer lassen sich von Fachleuten unter Verwendung der Sequenzinformationen ermitteln, die in SEQ ID NO: 1 zur Verfügung gestellt werden. Geeignete Restriktionsstellen lassen sich ausserdem zu der Nukleinsäure, die das NBCCS-Protein oder die Proteinsubsequenz codiert, durch ortsspezifische Mutagenese addieren. Das Plasmid, das die NBCCS-Sequenz oder -Subsequenz enthält, wird mit der geeigneten Restriktionsendonuklease gespalten und dann in den Vektor eingebunden, der das zweite Molekül nach Standardmethoden codiert.
Die Nukleinsäuresequenzen, die NBCCS-Proteine codieren, können in einer Vielzahl von Wirtszellen exprimiert werden, darunter E. coli, andere bakterielle Wirtszellen, Hefe und verschiedene höhere eukaryotische Zellen wie COS, CHO und HeLa-Zelllinien und Myelom-Zelllinien. Da die NBCCS-Proteine typischerweise in Eukaryoten zu finden sind, wird eine Eukaryoten-Wirtszelle bevorzugt. Das rekombinante Proteingen wird operativ mit den geeigneten Expressionskontrollsequenzen für jeden Wirt verbunden. Bei E. coli kann dies ein Promoter wie der T7-, TRP- oder Lambda-Promoter, eine Ribosomenbindungsstelle und vorzugsweise ein Transkriptionsterminationssignal sein. Bei eukaryotischen Zellen umfassen die Kontrollsequenzen einen Promoter und vorzugsweise einen Enhancer, der von Immunoglobulingenen, SV40, Cytomegalovirus usw. abgeleitet wird, und eine Polyadenylationssequenz und können Splice-Donor- und -Akzeptorsequenzen enthalten.
Die Plasmide der Erfindung können durch bekannte Methoden wie Kalziumchloridtransformation bei E. coli und Kalziumphosphatbehandlung oder Elektroporation bei Säugetierzellen in die gewählte Wirtszelle übertragen werden. Die durch die Plasmide transformierten Zellen können nach Antibiotikaresistenz gewählt werden, die durch auf den Plasmiden enthaltene Gene verliehen wird, wie z. B. das amp-, gpt-, neo- und hyg-Gen.
Sobald sie exprimiert sind, können die rekombinanten NBCCS-Proteine nach Standardverfahren gereinigt werden, z. B. durch Ammoniumsulfatpräzipitation, Affinitätssäulen, Säulenchromatographie, Gelelektrophorese und Ähnliches (siehe generell R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982), Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N.Y. (1990). Substantiell reine Zusammensetzungen mit einer Homogenität von mindestens ca. 90 bis 95 % und einer Homogenität von 98 bis 99 % oder mehr werden weitaus bevorzugt. Sobald sie nach Wunsch teilweise oder auf Homogenität gereinigt sind, können die Polypeptide verwendet werden (z. B. Immungene für die Antikörperproduktion).
Fachleute würden erkennen, dass das/die NBCCS-Protein(e) nach der chemischen Synthese, biologischen Expression oder Reinigung eine Konformation besitzen kann/können, die sich wesentlich von den nativen Konformationen der Polypeptide unterscheidet, aus denen das NBCCS-Protein besteht. In diesem Fall ist es möglicherweise erforderlich, das Polypeptid zu denaturieren und zu reduzieren und anschliessend die Neufaltung des Polypeptids in die bevorzugte Konformation zu bewirken. Methoden zur Reduktion und Denaturierung von Proteinen und zur Auslösung der Neufaltung sind Fachleuten allgemein bekannt (siehe Debinski et al. (1993) J. Biol. Chem., 268: 14065-14070; Kreitman und Pastan (1993) Bioconjug. Chem., 4: 581-585; und Buchner et al., (1992) Anal. Biochem., 205: 263-270). Debinski et al. beschreiben z. B. die Denaturierung und Reduktion von Inclusion-Body-Proteinen in Guanidin-DTE. Das Protein wird dann in einem Redox-Puffer, der oxidiertes Glutathion und L-Arginin enthält, neu gefaltet.
Fachleute würden erkennen, dass Modifikationen der NBCCS-Proteine vorgenommen werden können, ohne ihre biologische Aktivität zu verrin gern. Einige Modifikationen können durchgeführt werden, um das Klonen, die Expression oder die Inkorporation des Zielmoleküls in ein Fusionsprotein zu erleichtern. Solche Modifikationen sind Fachleuten allgemein bekannt und umfassen z. B. ein am Aminoterminus addiertes Methionin, um eine Initiationsstelle bereitzustellen, oder an jedem Terminus angebrachte zusätzliche Aminosäuren (z. B. Polt-His), um zweckmässig angeordnete Restriktionsstellen oder Terminationskodons oder Reinigungssequenzen zu erzeugen.
IV. NBCCS-(PTC)-Therapeutika
A) Pharmazeutische Zusammensetzungen
Die NBCCS-Polypeptide dieser Erfindung sind nützlich für die parenterale, topische, orale oder lokale Verabreichung, z. B. durch Aerosol oder transdermal, zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können abhängig von der Verabreichungsmethode in einer Vielzahl von Darreichungsformen verabreicht werden. Geeignete Darreichungsformen für die orale Verabreichung sind z. B. Pulver, Tabletten, Pillen, Kapseln und Pastillen. Selbstverständlich müssen die NBCCS-Polypeptide bei oraler Verabreichung vor Verdauung geschützt werden. Dies wird im Allgemeinen entweder dadurch erreicht, dass das Protein einen Komplex mit einer Zusammensetzung bildet und so resistent gegen Hydrolyse durch Säuren und Enzyme wird oder dass das Protein in einem hinreichend resistenten Träger wie einem Liposom verpackt wird. Mittel zum Schutz der Proteine vor Verdauung sind in Fachkreisen allgemein bekannt.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung sind besonders nützlich für die topische Verabreichung zur Behandlung von Basalzellkarzinomen oder ihren Vorläufern und von Keratosen, die durch Sonneneinstrahlung bewirkt werden. In einer anderen Verwirklichung sind die Zusammensetzungen nützlich für die parenterale Verabreichung, wie z. B. die intravenöse Verabreichung oder die Verabreichung in eine Körperhöhle oder einen Organhohlraum. Die Zusammensetzungen zur Verabreichung umfassen üblicherweise eine Lösung des NBCCS-Polypeptids, das in einem pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff, vorzugsweise einem wässrigen Trägerstoff, gelöst ist. Es kann eine Viel zahl wässriger Trägerstoffe verwendet werden, z. B. gepufferte Kochsalzlösung und Ähnliches. Diese Lösungen sind steril und im Allgemeinen frei von unerwünschten Substanzen. Diese Zusammensetzungen können durch herkömmliche, allgemein bekannte Sterilisationstechniken sterilisiert werden. Die Zusammensetzungen können bei Bedarf pharmazeutisch akzeptable Hilfsstoffe enthalten, um den physiologischen Bedingungen nahe zu kommen, wie z. B. pH-Einsteller und -Puffer, Mittel zur Anpassung der Toxizität und Ähnliches, z. B. Natriumacetat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Kalziumchlorid, Natriumlactat und Ähnliches. Die Konzentration des chimären Moleküls in diesen Formulierungen kann sehr unterschiedlich sein und wird vorwiegend auf der Grundlage der Flüssigkeitsvolumen, Viskositäten, des Körpergewichts und Ähnlichem entsprechend der jeweiligen Verabreichungsart und den Bedürfnissen des Patienten gewählt.
So würde eine typische pharmazeutische Zusammensetzung für die intravenöse Verabreichung ca. 0,1 bis 10 mg pro Patient pro Tag betragen. Dosierungen von 0,1 bis ca. 100 mg pro Patient pro Tag können verwendet werden, insbesondere wenn das Medikament an einer isolierten Stelle und nicht in den Blutkreislauf verabreicht wird, z. B. in eine Körperhöhle oder einen Organhohlraum. Bei der topischen Verabreichung sind wesentlich höhere Dosierungen möglich. Die tatsächlichen Methoden der Zubereitung von Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung sind Fachleuten bekannt oder für sie offensichtlich und werden ausführlicher in Veröffentlichungen wie Reminington's Pharmaceutical Science, 15. ed., Mack Publishing Company, Esston, Pennsylvania (1980), beschrieben.
Die Zusammensetzungen, die die gegenwärtigen NBCCS-Polypeptide enthalten, können zu Therapiezwecken verabreicht werden. In therapeutischen Anwendungen werden Zusammensetzungen einem Patienten, der an einer Erkrankung leidet (z. B. NBCCS oder Basalzellkarzinom) in einer ausreichenden Menge verabreicht, um die Erkrankung und ihre Komplikationen zu heilen oder zumindest teilweise zum Stillstand zu bringen. Eine angemessene Menge, um dies zu erreichen, wird als „therapeutisch wirksame Dosis" definiert. Die zu diesem Zweck wirksamen Dosen hängen von der Schwere der Erkrankung und dem allgemeinen Gesundheitszustand des Patienten ab.
Einzel- oder Mehrfachdosen der Zusammensetzungen können abhängig von der erforderlichen und vom Patienten vertragenen Dosierung und Häufigkeit verabreicht werden. Auf jeden Fall sollte die Zusammensetzung eine ausreichende Menge der Proteine dieser Erfindung für eine wirksame Behandlung des Patienten zur Verfügung stellen.
Zu den verschiedenen Verwendungszwecken der NBCCS-Polypeptide der vorliegenden Erfindung gehört eine Vielzahl von Erkrankungszuständen, die durch das Nävusbasalzellkarzinomsyndrom und/oder Basalzellkarzinome verursacht werden. Zu den bevorzugten Anwendungen gehören die Behandlung des NBCCS, insbesondere die Behandlung der charakteristischen Entwicklungsanomalien des NBCCS, und die Behandlung von Krebserkrankungen, insbesondere Basalzellkarzinomen.
B) Zelttransformation und Gentherapie
Die vorliegende Erfindung stellt verpackbare humane NBCCS-(PTC)-Nukleinsäuren (cDNAs) für die Zelttransformation in vitro und in vivo zur Verfügung. Die verpackbaren Nukleinsäuren können in eine Reihe bekannter Vektoren zur Transfektion und Transformation der Zielzellen und -organismen laut nachstehender Beschreibung eingefügt werden. Die Nukleinsäuren werden ex vivo oder in vivo durch Interaktion des Vektors und der Zielzelle in Zellen transfiziert. Die NBCCS cDNA exprimiert dann unter der Kontrolle eines Promoters das NBCCS-Protein und lindert dadurch die Auswirkungen der fehlenden NBCCS-Gene oder der partiellen Inaktivierung des NBCCS-Gens oder der abnormen Expression des NBCCS-Gens.
Solche Gentherapieverfahren wurden verwendet, um die erworbenen oder ererbten genetischen Defekte, Krebserkrankungen und Vireninfektionen in einer Reihe von Zusammenhängen zu korrigieren. Die Möglichkeit der Expression künstlicher Gene bei Menschen erleichtert die Prävention und/oder die Heilung vieler wichtiger Erkrankungen des Menschen, darunter viele Erkrankungen, die mit anderen Therapien nicht behandelbar sind. Die In-vivo-Expression der cholesterinregulierenden Gene, die selektiv die Replikation des HIV-Virus blockieren, und der tumorsuppressiven Gene bei menschlichen Patienten verbessert beispielsweise dramatisch die Behandlung von Herzerkrankungen, AIDS bzw. Krebs. Eine Übersicht der Gentherapieverfahren sind zu finden bei Anderson, Science (1992) 256:808-813; Nabel und Feigner (1993) TIBTECH 11: 211-217; Mitani und Caskey (1993) TIBTECH 11: 162-166; Mulligan (1993) Science 926-932; Dillon (1993) TIBTECH 11: 167-175; Miller (1992) Nature 357: 455-460; Van Brunt (1988) Biotechnology 6(10): 1149-1154; Vigne (1995) Restorative Neurology and Neuroscience 8: 35-36; Kremer und Perricaudet (1995) British Medical Bulletin 51 (1) 31-44; Haddada et al. (1995) in Current Topics in Microbiology and Immunology, Doerfler und Böhm (Hrsg.) Springer-Verlag, Heidelberg, Deutschland; und Yu et al., Gene Therapy (1994) 1:13-26.
Die Zuführung des Gens oder des genetischen Materials in die Zelle ist der erste kritische Schritt in der Krankheitsbehandlung durch Gentherapie. Fachleuten sind eine grosse Zahl von Zuführungsmethoden bekannt. Zu diesen Methoden gehören z. B. die liposomenbasierte Genzuführung (Debs und Zhu (1993) WO 93/24640 ; Mannino und Gould-Fogerite (1988) BioTechniques 6(7): 682-691; Rose US-Pat. Nr. 5.279.833 ; Brigham (1991) WO 91/06309 ; und Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7414) und replikationsdefekte retrovirale Vektoren, die eine therapeutische Polynukleotidsequenz als Bestandteil des retroviralen Genoms enthalten (siehe z. B. Miller et al. (1990) Mol. Cell Biol. 10:4239 (1990); Kolberg (1992) J. NIH Res. 4:43 und Cometta et al. Hum. Gene Ther. 2:215 (1991)). Umfassend verwendet werden die retroviralen Vektoren auf der Basis des murinen Leukämie-Virus (MuLV), des Gibbonaffen-Leukämie-Virus (GaLV, des simianen Immundefizienz-Virus (SIV), des humanen Immundefizienz-Virus (HIV) und Kombinationen derselben. Siehe z. B. Buchscher et al. (1992) J. Virol. 66(5) 2731-2739; Johann et al. (1992) J. Virol. 66 (5): 1635-1640 (1992); Sommerfelt et al., (1990) Virol. 176:58-59; Wilson et al. (1989) J. Virol. 63:2374-2378; Miller et al.,). Virol. 65:2220-2224 (1991), Wong-Staat et al., PCT/US94/05700 , und Rosenburg und Fauci (1993) in Fundamental Immunology, Third Edition, Paul (Hrsg.), Raven Press, Ltd., New York und die darin enthaltenen Referenzen, und Yu et al., Gene Therapy (1994) supra).
AAV-basierte Vektoren werden ebenfalls für die Transduktion von Zellen mit Zielnukleinsäuren verwendet, z. B. bei der In-vitro-Produktion von Nukleinsäuren und Peptiden und In-vivo- und Ex-vivo-Gentherapieverfahren. Ei ne Übersicht der AAV-Vektoren ist zu finden bei West et al. (1987) Virology 160: 38-47; Carter et al. (1989) US-Patent Nr. 4.797.368; Carter et al. WO 93/24641 (1993); Kotin (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Muzyczka (1994) J. Clin. Invest. 94:1351 und Samulski (supra). Die Konstruktion der rekombinanten AAV-Vektoren ist in einer Reihe von Veröffentlichungen beschrieben, darunter Lebkowski, US-Pat. Nr. 5.173.414; Tratschin et al. (1985) Mol. Cell Biol. 5(11):3251-3260; Tratschin et al. (1984) Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081; Hermonat und Muzycka (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470; McLaughlin et al. (1988) und Samulski et al. (1989) J. Virol. 63:03822-3828. Zu den Zelllinien, die durch rAAV transformiert werden können, gehören auch die bei Lebkowski et al. (1988), Mol. Cell. Biol. 8: 3988-3996, beschriebenen Zelllinien.
A) Ex-vivo-Zelltransformation
Die Ex-vivo-Zelltransformation für Diagnose, Forschung oder Gentherapie (z. B. über Reinfusion der transformierten Zellen in den Wirtsorganismus) ist in Fachkreisen bekannt. In einer bevorzugten Verwirklichung werden die Zellen von dem Versuchsorganismus isoliert, mit dem NBCCS-Gen oder der cDNA dieser Erfindung transfiziert und zurück in den Versuchsorganismus (z. B. den Patienten) reinfundiert. Fachleuten sind verschiedene Zelltypen bekannt, die für die Ex-vivo-Transformation geeignet sind. Besonders bevorzugte Zellen sind Progenitor- oder Stammzellen (eine Erörterung, wie Zellen von Patienten isoliert und kultiviert werden können, ist z. B. zu finden bei Freshney et al., Culture of Animal Cells, a Manual of Basis Technique, third edition, Wiley-Liss, New York (1994)) und den darin zitierten Referenzen).
Wie oben angegeben, codiert die verpackbare Nukleinsäure in einer bevorzugten Verwirklichung ein NBCCS-Polypeptid unter der Kontrolle eines aktivierten oder konstitutiven Promoters. Die transformierte(n) Zelle(n) exprimieren das funktionale NBCCS-Polypeptid, das die Effekte einer defizienten oder abnormen NBCCS-Genexpression abschwächt.
In einer besonders bevorzugten Verwirklichung werden Stammzellen in Ex-vivo-Verfahren für die Zelltransformation und Gentherapie verwendet. Die Verwendung von Stammzellen hat den Vorteil, dass sie in vitro in andere Zellty pen differenziert oder in ein Säugetier (z. B. den Zellenspender) eingeführt werden können, wo sie sich in das Knochenmark einfügen. Methoden zur In-vivo-Differenzierung von CD34⁺-Zellen in klinisch wichtige Immunzellarten unter Verwendung von Cytokinen wie GM-CSF, IFN-γ und TNF-α sind bekannt (siehe Inaba et al. (1992) J. Exp. Med. 176: 1693-1702 und Szabolcs et al. (1995) 154: 5851-5861).
Stammzellen werden zur Transduktion und Differenzierung unter Verwendung bekannter Methoden isoliert. Beispielsweise werden bei Mäusen Knochenmarkszellen durch Töten der Maus und Zerschneiden der Beinknochen mit einer Schere isoliert. Die Stammzellen werden aus den Knochenmarkszellen durch Waschen der Knochenmarkszellen mit Antikörpern erzielt, die ungewünschte Zellen wie z. B. CD4⁺ und CDB⁺ (T-Zellen; CD45⁺ (panB-Zellen), GR-1 (Granulozyten) und Ia^d (differenzierte Antigen-präsentierende Zellen) binden. Ein Beispiel dieses Protokolls ist zu finden bei Inaba et al. (1992) J. Exp. Med. 176: 1693-1702.
Bei Menschen werden Knochenmarksaspirationen von Darmbeinkämmen durchgeführt, z. B. unter Vollnarkose im Operationssaal. Die Knochenmarksaspirationen weisen eine Menge von ca. 1.000 ml auf und werden von den posterioren Darmbeinen und Darmbeinkämmen gesammelt. Wenn die Gesamtzahl der gesammelten Zellen weniger als ca. 2 × 10⁸/kg beträgt, wird eine zweite Aspiration unter Verwendung von Brustbein und anterioren Darmbeinkämmen zusätzlich zu den posterioren Kämmen vorgenommen. Während der Operation werden zwei Einheiten bestrahlter gepackter Erythrozyten als Ersatz des durch Aspiration entnommenen Knochenmarks verabreicht. Die humanen hämatopoetischen Progenitor- und Stammzellen sind durch die Präsenz eines membranständigen Antigens CD34 gekennzeichnet. Dieses Antigen wird z. B. zur Reinigung auf Affinitätssäulen verwendet, die CD34 binden. Nachdem das Knochenmark gewonnen wurde, werden die mononuklearen Zellen mittels Ficoll-Dichtegradient-Zentrifugierung von den anderen Komponenten getrennt. Dies wird mittels einer halbautomatischen Methode unter Verwendung eines Zellseparators durchgeführt (z. B. Baxter Fenvall CS3000+ oder Terumo-Maschine). Die leichten Zellen, die zumeist aus mononuklearen Zellen zusammengesetzt sind, werden gesammelt und in Plastikflaschen 1,5 Stunden bei 37 °C inkubiert. Die anhaften den Zellen (Monozyten, Makrophagen und B-Zellen) werden weggeworfen. Die nicht anhaftenden Zellen werden dann gesammelt und mit einem monoklonalen Anti-CD34-Antikörper (z. B. dem murinen Antikörper 9C5) 30 Minuten bei 4 °C bei schonender Rotation inkubiert. Die Schlusskonzentration des Anti-CD34-Antikörpers beträgt 10 μg/ml. Nach zwei Wäschen werden paramagnetische Mikrosphären (DynaBeads, geliefert von Baxter Immunotherapy Group, Santa Ana, Kalifornien), die mit dem Schaf-Anti-Maus-IgG-(Fc)-Antikörper beschichtet sind, in einem Verhältnis von 2 Zellen/Perle zu der Zellsuspension hinzugefügt. Nach einer weiteren Inkubationsphase von 30 Minuten bei 4 °C werden die Rosettenzellen mit magnetischen Perlen mit einem Magneten gesammelt. Chymopapain (geliefert von Baxter Immunotherapy Group, Santa Ana, Kalifornien) in einer Endkonzentration von 200 U/ml wird hinzugefügt, um die Perlen von den CD34⁺-Zellen zu lösen. Alternativ und vorzugsweise kann ein Isolationsverfahren mit Affinitätssäule verwendet werden, das eine Bindung mit CD34 oder mit den an CD34 gebundenen Antikörpern eingeht (siehe die nachstehenden Beispiele). Siehe Ho et al. (1995) Stem Cells 13 (suppl. 3): 100-105. Siehe auch Brenner (1993) Journal of Hematotherapy 2: 7-17.
In einer anderen Verwirklichung werden hämatopoetische Stammzellen von fetalem Nabelschnurblut isoliert. Yu et al. (1995) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 699-703) beschreiben eine bevorzugte Methode der Transduktion von CD34⁺-Zellen aus menschlichem Nabelschnurblut unter Verwendung retroviraler Vektoren.
B) In vivo Umwandlung
Vektoren (z.B. Retroviren, Adenoviren, Liposome, usw.), die therapeutische Nukleinsäuren enthalten, können direkt für die Umsetzung von Zellen in vivo an den Organismus verabreicht werden. Die Verabreichung erfolgt auf einem beliebigen der normalerweise für die Einführung eines Moleküls in ultimative Berührung mit Blut oder Gewebezellen benutzten Wege. Die verpackten Nukleinsäuren werden auf geeignete Weise, vorzugsweise mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern, verabreicht. Geeignete Verabreichungsmethoden, wie verpackte Nukleinsäuren, sind verfügbar und den Fachkundigen gut vertraut, und obschon mehr als ein Weg benutzt werden kann, um eine bestimmte Verbindung zu vera breichen, kann ein besonderer Weg oft eine unverzüglichere und wirksamere Reaktion bewirken als ein anderer Weg.
Pharmazeutisch annehmbare Träger hängen teilweise von der besonderen, verabreichten Verbindung, sowie von der besonderen, für die Verabreichung der Verbindung benutzten Methode ab. Dementsprechend gibt es eine grosse Vielzahl von geeigneten Rezepturen pharmazeutischer Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung.
Für die orale Verabreichung geeignete Rezepturen können bestehen aus (a) flüssigen Lösungen, wie eine wirksame Menge der verpackten Nukleinsäure suspendiert in Lösungsmitteln wie Wasser, Salzlösung oder PEG 400; (b) Kapseln, Beuteln oder Tabletten, die jeweils eine vorbestimmte Menge des aktiven Bestandteils als Flüssigkeiten, Feststoffe, Granulate oder Gelatine enthalten; (c) Suspensionen in einer geeigneten Flüssigkeit; und (d) geeigneten Emulsionen. Tablettenformen können eine oder mehrere von Laktose, Sucrose, Mannitol, Sorbitol, Kalziumphosphaten, Maisstärke, Kartoffelstärke, mikrokristalline Zellulose, Akazia, Gelatine, kolloidales Siliziumdioxin, croscarmelloses Natrium, Talk, Magnesiumstearat, Stearinsäure und andere Arzneistroffträger, Farbstoffe, Füllstoffe, Bindemittel, Lösungsmittel, Pufferwirkstoffe, Befeuchtungsmittel, Konservierungsmittel, Aromastoffe, Färbemittel, Auflösungsmittel und pharmazeutisch verträgliche Träger umfassen. Pastillenformen können den aktiven Bestandteil in einem Aroma enthalten, gewöhnlich Sucrose und Akazia oder Tragacanth, sowie Pastillen, die den aktiven Wirkstoff in einer inerten Basis wie Gelatine und Glycerin oder Sucrose und Akazia-Emulsionen, Gels und ähnliches enthalten, und die, zusätzlich zum aktiven Bestandteil, in der Fachwelt bekannte Träger enthalten.
Die verpackten Nukleinsäuren können, allein oder in Kombination mit anderen, geeigneten Bestandteilen, in Aerosolformen aufbereitet werden (d.h. sie können „vernebelt" werden), um durch Inhalieren verabreicht zu werden. Aerosolrezepturen können in unter Druck stehende, akzeptable Treibmittel eingesetzt werden, wie Dichlorodifluoromethan, Propan, Stickstoff und dergleichen.
Geeignete Formulierungen für rektale Verabreichung umfassen zum Beispiel Zäpfchen, die aus der verpackten Nukleinsäure mit einer Suppositorienbasis bestehen. Geeignete Suppositorienbasen umfassen natürliche oder synthetische Triglyceride oder Paraffin-Kohlenwasserstoffe. Zudem können auch rektale Gelatinekapseln benutzt werden, die aus einer Kombination aus der verpackten Nukleinsäure mit einer Basis bestehen, die zum Beispiel flüssige Triglyceride, Polyäthylen-Glycole und Paraffin-Kohlenwasserstoffe umfasst.
Für paraenterale Verabreichung geeignete Rezepturen wie zum Beispiel durch intraartikulare (in die Gelenke), intravenöse, intramuskuläre, intraperitoneale und subkutane Wege, umfassen wässerige und nicht-wässerige, isotonische sterile Injektionslösungen, die Antioxidantien, Puffer, Bakteriostaten und Solute enthalten, welche die Rezeptur mit dem Blut des beabsichtigten Empfängers isotonisch machen, sowie wässerige und nicht-wässerige Suspensionen, die Suspensionswirkstoffe, Lösungsvermittler, Verdickungsmittel, Stabilisatoren und Konservierungsmittel enthalten können. In der Praxis dieser Erfindung können Zusammensetzungen zum Beispiel durch intravenöse Infusion, oral, topisch, intraperitoneal, intravesikal oder intrathekal verabreicht werden. Die Formulierungen von verpackter Nukleinsäure können in versiegelten Behältern mit Einzeldosen oder Mehrfachdosen wie Ampullen oder Glasfläschchen angeboten werden.
Injektionslösungen und Suspensionen können aus sterilen Pulvern, Granulaten und Tabletten der weiter oben beschriebenen Art zubereitet werden. Durch die verpackte Nukleinsäure wie vorstehend beschrieben im Zusammenhang mit der ex vivo-Therapie übertragene Zellen können auch intravenös oder parenteral verabreicht werden, wie weiter oben beschrieben wurde.
Die dem Patienten im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verabreichte Dosis sollte genügend sein, um beim Patienten im Lauf der Zeit eine nützliche therapeutische Reaktion zu bewirken. Die Dosis wird durch die Wirksamkeit des angewendeten, besonderen Vektors und durch das Körpergewicht oder die Oberfläche des behandelten Patienten bestimmt. Die Grösse der Dosis hängt auch vom Vorhandensein, der Beschaffenheit und dem Ausmass allfälliger Nebenwirkungen ab, die mit der Verabreichung eines bestimmten Vek tors, oder dem übertragenen Zelttyp bei einem bestimmten Patienten verknüpft sind.
Bei der Bestimmung der wirksamen Dosis des zu verabreichenden Vektors bei der Behandlung oder Prophylaxe NBCCS Vorliebe oder Beginn oder Basalzellkarzinom-Vorliebe oder Beginn beurteilt der Arzt die zirkulierenden Plasmaspiegel des Vektors, die Toxizitäten des Vektors, den Forschritt der Krankheit und die Produktion von Anti-Vektor-Antikörpern. Im allgemeinen ist das Dosisäquivalent einer nackten Nukleinsäure von einem Vektor ungefähr 1 μg bis 100 μg bei einem typischen, 70 kg schweren Patienten und Dosen von Vektoren, die einen retroviralen Partikel enthalten, werden so berechnet, dass sie eine äquivalente Menge therapeutischer Nukleinsäure ergeben.
Für die Verabreichung können Inhibitoren und übertragene Zellen der vorliegenden Erfindung mit einer Rate verabreicht werden, die durch die LD-50 des Inhibitors, Vektors oder übertragenen Zelltyps und die Nebenwirkungen des Inhibitors, Vektors oder Zelltyps bei verschiedenen Konzentrationen bestimmt wird, die bei der Masse und dem allgemeinen Gesundheitszustand des Patienten angewendet werden. Die Verabreichung kann durch einzelne oder aufgeteilte Dosen erfolgen.
Bei einer bevorzugten Verkörperung werden vor der Infusion Blutproben entnommen und für die Analyse aufbewahrt. Zwischen 1 × 10⁸ und 1 × 10¹² umgesetzte Zellen werden während 60-200 Minuten intravenös eingegeben. Die Vitalzeichen und die Sauerstoffsättigung durch Impuls-Oximetrie werden streng überwacht. Blutproben werden 5 Minuten und 1 Stunde nach der Infusion entnommen und für die anschliessende Analyse aufbewahrt. Die Leukopherese, Übertragung und Reinfusion können alle 2 bis 3 Monate wiederholt werden. Nach der ersten Behandlungen können die Infusionen nach Wunsch des Klinikers ambulant vorgenommen werden. Wenn die Reinfusion ambulant ausgeführt wird, dann wird der Teilnehmer während mindestens 4, vorzugsweise aber 8 Stunden nach der Therapie überwacht.
Die übertragenen Zellen werden für die Reinfusion nach den etablierten Methoden zubereitet. Siehe Abrahamsen et al. (1991) J. Clin. Apheresis, 6:48-53, Carter et al. (1988) J. Clin. Apheresis, 4:113-117; Aebersold et al. (1988) J. Immunol. Meth., 112: 1-7; Muul et al. (1987) J. Immunol. Methods 101:171-181 und Carter et al. (1987) Transfusion 27: 362-365. Nach einer Periode von ungefähr 2-4 Wochen in der Kultur sollte die Zellzahl zwischen 1 × 10⁸ und 1 × 10¹² betragen. Die Wachstumseigenschaften der Zellen variieren diesbezüglich von Patient zu Patient und von Zelttyp zu Zelttyp. Ungefähr 72 Stunden vor der Reinfusion der übertragenen Zellen wird eine Aliquote für die Analyse des Phänotyps und des Prozentsatzes der Zellen, die den therapeutischen Wirkstoff ausdrücken, ausgeführt.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele werden nur zur Illustration, nicht aber zur Einschränkung der vorliegenden Erfindung, angeboten.
Beispiel 1
Klonen eines menschlichen Patch-Homologs
Dieses Beispiel beschreibt die Isolation einer vollständigen menschlichen PATCHEDcDNA-Sequenz, die ein putatives Protein von 1172 Aminosäuren codiert und 61% Sequenzidentität zum GEPATCHTEN Drosophila-Protein zeigt. Drosophi/a Patched (ptc) ist ein Segment-Polaritätsgen, das für die korrekte Musterung der Larvensegmente und Bildscheiben während der Entwicklung der Fliege nötig ist (Nakano et al. (1989) Nature 341: 508-13; Hooper et al. (1989) Cell 59: 751-765). Gestützt auf genetische Studien ist Patched eine Komponente des Signalisierungspfades des Morphogens Igel (Basler et al. (1994) Nature 368: 208-214); Capdevila et al. (1994) EMBO J. 13: 71-82; Ingham (1991) Nature 353: 184-187). Da Patched ein putatives, membranspannendes Protein ist, und in Igel-responsiven Zellen ausgedrückt wird, wurde vorgeschlagen, dass es der Ige/-Rezeptor ist (Ingham (1991) s. oben).
Bei Wirbeltieren wurden mehrere Igel-Homologe identifiziert. Die am besten charakterisierten davon, Sonic Hedgehog, war in der dorsal-ventralen Musterung des neuralen Rohrs (Roelink et al. (1994) Cell 76: 761-775; Roelink (1995) Cell 81: 445-455), bei der Differenzierung von Somiten (Johnson et al. (1994) Cell 79: 1165-1173) und bei der Festlegung der anterior-posterioren Achse der Gliedknospe (Riddle et al. (1993) Cell, 75: 1401-1416) impliziert. Die biochemische Grundlage der Hedgehog-Signalisierung bei Wirbeltieren wird weiterhin nur wenig verstanden und wurde weitgehend durch das Fehlen eines bewiesenen Rezeptors für das Molekül behindert.
Experimentelle Verfahren
Cosmid-Isolation
Bei dieser Studie benutzte Cosmide wurden aus einer menschlichen Chromosom 9-spezifischen genomischen Cosmid-Bibliothek (LL09NCO1"P", Biomedical Sciences Division, Lawrence Livermore National Laborstory, Livermore, CA 94550), durch Screening mit dem YAC-Klon ICI-2ef8 (UK Human Genome Mapping Project Resource Centre) isoliert. Dieser Klon enthält den Mikrosatelliten-Marker D9S287, der auf Chromosom 9q22.3 lokalisiert wurde (Povey et al. (1994) Ann. Hum. Genet. 58: 177-250). Für die Isolation von YAC DNA wurde eine Hybridisierung durchgeführt, wie von Vorechovsky et al. (1994) Genomics, 21: 517-24 beschrieben wird. Die Isolation der Cosmide wurde durch Hybridisierung zu YAC ICI-2ef8 bestätigt, gelöst mit Hilfe von Impulsfeld-Gel-Elektrophorese. Das 96 Schalen-Plattenformat der Cosmidklone, die PTC enthalten, ist 42HI1, 96F9, 218A8, 226G7.
Durchsicht der Bibliothek
Menschliche cDNA-Klone wurden unter Benutzung von Standardverfahren aus einer fötalen Gehirn cDNA-Bibliothek im Lambda ZAPII-Phasen-Vektor isoliert (Stratagene, La Jolla, Kalifornien, USA). Die Sonden wurden mit [³²P]dCTP durch Random-Priming (Redisrime^TM, Amersham) etikettiert. Positive Klone wurden durch Verwendung des 704 Helfer Phase/pBluescript^TM Exzisionssystems (Rapid Excision Kit^TM, Stratagene) gerettet und sequenziert. Mäuse-Genom-Klone wurden aus einer 129SV Lambda Fix II^TM Bibliothek (Stratagene) isoliert. Phase DNA wurde mit EcoRI geschnitten und mit PTC spezifischen Sonden hybridisiert. Mäuse-cDNA-Klone wurden aus einer in Lambda gt10 kon struierten 11.5 dpc Mausembryo (Schweizer Männchen) Bibliothek isoliert. Die Hybridisierung wurde bei 55°C durchgeführt. Positive Klone wurden in mit NotI verdautem pBluescript^TM IISK subgeklont.
Sequenzierung
Schablonen für die Sequenzierung wurden aus Übernacht-Kulturen von geretteten cDNA-Klonen und/oder in pBluescript^TMKS(+) mit einem Plasmid-Reinigungs-Kit (Qiagen) subgeklonten EcoRI Cosmid-Fragmenten präpariert. Die Sequenzierung wurde mit dem Taq Terminator Zyklus Sequenzierungs-Kit (Applied Biosystems) gemäss den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Sequenzierungsreaktionen wurden auf einem automatisierten Sequenzierer ABI 373A aufgelöst. Die Sequenzanalyse wurde mit der GCG-Software durchgeführt. BLAST-Suchen wurden mit dem NCBI-Netzwerkservice durchgeführt. PTC-Sequenzen wurden unter Zugriff Nr. U43148 in GENBANK deponiert.
Northern-Hybridisierung
Der Ausdruck menschlicher PTC mRNA wurde durch Northern-Hybridisierung von menschlichen Gewebe-Blots (Clontech) mittels [³²P]dCTP etikettierten cDNA-Sonden untersucht. Die Hybridisierungslösung enthielt 5× SSPE, 10× Denhardt's Lösung, 100 mg/ml denaturiert, gescherte Heringspermien-DNA, 50% Formamid und 2% SDS. Waschungen wurden bei 60°C mit 2× SSC und 0.1% SDS durchgeführt.
Chromosomale Lokalisierung
Die chromosomale Lokalisierung menschlicher PTC wurde durch PCR-Analyse von DNA-Platten identifiziert, die aus menschlichen Hamster-Hybridzellen gewonnen wurden. Die Platte bestand aus beiden ganzen Chromosom 9 Hybriden und Löschungshybriden von 9q22.3. Die benützten Primer waren PTC1 (5'-TTG CAT AAC CAG CGA GTCT-3' (SEQ-ID NR: 2)) und PTC2 (5'-CAA ATG TAC GAG CAC TTC AAGG-3' (SEQ NR: 3)). Mäuse-Ptc wurde mit Hilfe von interspezifischem Backcross-Mapping kartiert. Die Platten wurden vom Jackson Laborstory (Bar Harbor, ME) geliefert und sind die BSB Platte von einer Kreuzung (C576L/6J × M. spretus) × C576L/6J und eine ähnliche BSS Platte, bestehend aus DNA von der reziproken Rückkreuzung (C576L/6JEi × SPRET/Ei) × SPRET/Ei. Die Kartierung wurde mittels SSCP (Einzelstrang-Konformierungs-Polymorphismus) Analyse mit den Primern W18F3 (5'-CTG TCA AGG TGA ATG GAC-3' (SEQ ID NR: 4) und W18R3 (5'-GGG GTT ATT CTG TAA AAGG-3' (SEQ NR: 5)) durchgeführt. PCR Reaktionen wurden unter Anwesenheit von [³²P]dCTP durchgeführt. Die Proben wurden auf einem 6% Acrylamidgel (2.6% Vernetzung) bei 4°C bei 70 Watt in 1.5 Stunden aufgelöst. Die genetische Verknüpfung wurde durch Segregationsanalyse durchgeführt.
In situ Hybridisierung
Ganz montierte in situ-Hybridisierung an Mäuse-Embryonen und anschliessende Sektionierung wurde so durchgeführt, wie von Christiansen, et al. (1995) Mech. Dev. 51: 341-350 beschrieben. Die Mäuse-Ptc-Sonde war ein 706 bp Not1/PstI cDNA-Fragment vom 5'-Ende des Gens, subgeklont in pBluescriptII SK. Die Sonde wurde mit SACII linearisiert, der Überhang durch Brütung mit 5 U/mg Klenow bei 22°C während 15 Minuten und Antisense-RNA synthetisiert durch Abschreiben mit T7 RNA Polymerase abgestumpft.
Resultate und Diskussion
Klonen eines menschlichen PTC Homologs
Bei dieser Studie benutzte Cosmide wurden mittels des YAC-Klons ICI-2ef8 aus einer menschlichen Chromosom 9-spezifischen Cosmidbibliothek isoliert. Dieser Klon enthält den Mikrosatelliten-Marker D9S287, der auf Chromosom 9q22.3 lokalisiert wurde. Die Sequenzierung eines 1.8 kb EcoRI-Fragments von Cosmid 42HII ergab einen offenen Ableserahmen mit einer signifikanten Homologie zu den 3 Strängen des Drosophila ptc Proteins. Durch Verwendung des 1.8 kb EcoRI-Fragments als Sonde wurden die vollständigen menschlichen und parziellen Mäuse-PCT cDNA-Sequenzen isoliert.
Die Sequenz der menschlichen PTCdDNA besteht aus einem offenen Ableserahmen von 3888 Nukleotiden: ebenfalls sequenziert wurden 441 und 2240 Nukleotide am 5'-Ende und beziehungsweise am 3'-Ende (SEQ ID NR: 1; 8). Der offene Ableserahmen von menschlicher PTC cDNA codiert für eine putatives Protein von 1296 Aminosäuren. Dieser offene Ableserahmen beginnt mit einem ATG-Codon, das eine mässige Übereinstimmung für die translationale Start-Konsenssequenz bei Wirbeltieren (GAGGCTAUGT (SEQ ID NR: 6) in PTC gegenüber GCCGCCAUGG (SEQ ID NR: 7) hat (Kozak (1991) ). Biol. Chem., 266: 19867-19870). Wenn man annimmt, dass dieser Codon für die erste Aminosäure des Proteins codiert, dann besteht menschliche ptc aus 1296 Aminosäuren mit einem relativen Molekulargewicht (Mr) von 131 × 10³. Es zeigt 61 % Sequenzidentität zu seinem Drosophila-Gegenstück. Vor der ATG erstreckt sich der offene Ableserahmen über weitere 354 Nukleotide (beginnend beim Basenpaar 88 der in der 8 gezeigten Sequenz). Die 3' unübersetzte Region enthält ein kanonisches Polyadenylationssignal (AATAAA (SEQ ID NR: 8), sowie mRna destabilisierende ATTTA (SEQ ID NR: 9) Motive.
Es wird ein alternatives Transkript beobachtet, das vom Exon 3 zum Exon 2a spleisst. Der offene Ableserahmen endet im Exon 2a (siehe SEQ ID NR: 59), enthält aber keine AUG. Exon 2 kann an eines von drei verschiedenen ersten Exons anspleissen. Exon 1b (siehe SEQ ID NR: 58) ist homolog zum beschriebenen ersten Exon der Mäuse-mRNA und hat ein ATG gefolgt von ORF. Exon 1a hat ORF durch die ganze Länge und einen potentiellen Spleiss-Akzeptor-Ort (siehe, z.B. SEQ ID NR: 58). Exon 3 enthält die erste ATG im Rahmen für alle Iranskripts, ausser derjenigen, die in Exon 1b beginnt. Eine Karte der Promoter-Region von NBCCS (PCT) wird in 3 gezeigt.
Die Hydropathie-Analyse (Kyte et al. (1982) J. Mol. Biol., 157: 105-32) des ganzen offenen Ableserahmens menschlicher PTC sagt das Vorhandensein von acht hydrophoben Hauptsträngen voraus. Die Verteilung der hydrophoben Blöcke wird zwischen Spezies bemerkenswert gut erhalten, was darauf hindeutet, dass menschliche PTC, wie das Drosophila-Gegenstück, ein integrales Membranprotein ist.
Chromosomale Lokalisierung von PTC
Die chromosomale Lokalisierung der menschlichen PTC auf 9q22.3 wurde durch PCR-Analyse von Chromosom 9-Hybriden und Löschungshybriden von 9q22.3, menschlichen Hamster-Hybrid-DNA-Platten bestätigt. Die verwendeten Primer (PTC1, PTC2) wurden aus einer Sequenz eines 1.8 kb EcoRI-Fragments von Cosmid 42HII abgeleitet. Primer PTC1 wird von einer Exon-Sequenz und PTC2 aus einer Intron-Sequenz abgeleitet. Alle DNA-Hybridisierungs- und cDNA-Sequenzierungsdaten deuten darauf hin, dass menschliche PTC ein einzelnes Kopie-Gen ist. Mäuse-Ptc kartiert auf eine kurze Region von Chromosom 13, nahe am Mäuse-Facc-Lokus (keine Rekombination aus 188 Meiosen). Diese Region enthält die Maus-Mutationen gebogener Schwanz (f) und Purkinje-Zeltdegeneration (pcd) und ist synthetisch mit menschlichem 9q22-q31. Bei beiden f und pcd kommen eine abnormale Entwicklung der Zellen der Knochen und des Gehirns vor und könnten allelisch zu Ptc sein.
Ausdruck von PTC
Die Northern Blot-Analyse zeigte in allen untersuchten menschlichen Geweben fünf unterschiedliche PTC-Transkripts. Der Ausdruck dieser Transkripts scheint differenziell geregelt zu sein. Während der Maus-Embryogenese wird der Ausdruck von Ptc zuerst bei E 8.0 dpc in ventralem neuroepithelialem Gewebe in zwei getrennten Bereichen entlang der Mittellinie erkannt. Der Ausdruck bleibt in ventralen neuralen Zellen bis 9.5 dpc bestehen und wird auch in lateralen, den neuralen Tubus umgebenden Mesenchymen festgestellt. Ptc Transkription wird in den Somiten kurz nach dem Zeitpunkt ihres Auftretens festgestellt und folgt einem rostro-kaudalen Expressionsgradienten. Somiten-Expression ist auf epitheliale Zellen innerhalb der medialen Aspekte eines jeden Somiten beschränkt. Expression von Ptc wird auch im posterioren Ektoderm eines jeden Gliedknotens von 10.0 dpc bis 12.5 dpc erkannt. Diese Region entspricht dem Oberflächen-Ektoderm, das die ZPA abdeckt. Andere Orte von Ptc-Ausdruck während dieser Periode beinhalten die inneren Oberflächen der brachialen Bogen seitlich der oropharyngealen Region, Zellen, welche die Placoden der Vibrissae und die genitale Eminenz umringen.
Das Ausdrucksmuster von Ptc deutet auf eine enge Beziehung zwischen Ptc und der Igel-Morphogenfamilie. Diese Beziehung wurde ursprünglich in Drosophila bestimmt (Ingham et al. (1991) Nature, 353: 184-187). Bei Wirbeltieren war der am besten charakterisierte Igel-Homolog, Sonic Hedgehog, an der Induktion der Bodenplatten- und Motor-Neuronen innerhalb des ventralen neuralen Tubus (Jessell et al. (1990) Harvey Lect., 86: 87-128; Yamada et al. (1993), 73: 673-686) und der Differenzierung von Sklerotom innerhalb der Somiten beteiligt (Pourquie et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5242-5246). Im Gliedknoten löst die Sonic Hedgehog-Expression in der menenchymalen „Zone polarisierender Aktivität" anterior-posterior-Musterung des Glieds aus (Riddle et al. (1993) Cell, 75: 1401-1418). Unsere Daten zeigen, dass Wirbeltier-PTC in allen grösseren Zielgeweben von Sonic Hedgehog, wie dem ventralen neuralen Tubus, Somiten und die Zone polarisierender Aktivität im Gelenkknoten umringenden Geweben ausgedrückt wird. Die beeindruckende räumliche Komplementarität und zeitliche Koinzidenz der Sonic Hedgehog- und Ptc-Expressionsmuster deuten darauf hin, dass beide Gene Mitglieder eines gemeinsamen Signalisierungspfades sein könnten.
Die Lokalisierung von PTC in der das nevoide Basalzellenkarzinom-Syndrom enthaltenden Region ist faszinierend. NBCCS ist eine autosomale dominante Störung, welche betroffene Personen anfällig für Basalzellenkarzinome der Haut, Medullablastome und verschiedene andere Tumore macht (Gorlin (1987) Medicine (Baltimore) 66: 98-113). Kürzliche genetische Studien haben das Gen für das nevoide Basalzellenkarzinomsyndrom am Chromosom 9q22.3, zwischen den Markern Fanconi-Anämiekomplementierungsgruppe A (Farndon et al. (1994) Genomics, 23: 486-489) und D9S287 (Periçak-Vance (1995) Ann. Hum. Genet., 59: 347-365) angeordnet. Verschiedene Beweisketten deuten darauf hin, dass PTC ein Kandidatengen für nevoides Basalzellenkarzinomsyndrom ist. Ptc Expression ist verträglich mit den kongenitalen Defekten, die gewöhnlich bei NBCCS-Patienten festgestellt werden. Häufige Symptome bei Neugeborenen und Kleinkindern sind Entwicklungsanomalien der Wirbelsäule und Rippen (Gorlin (1987) s. oben). Diese Missbildungen könnten auf einen PTC-Mangel zurückzuführen sein, der räumlich und zeitlich mit der Entwicklung des neuralen Tubus und der Somiten zusammen fällt. Zudem ist Ptc-Expression im die ZPA umgebenden Oberfächen-Ektoderm konsistent mit oft bei Patienten mit NBCCS beobachteten Gliederanomalien (Gorlin, (1987 S. oben). PTC-Expression bei allen erwachsenen Geweben deutet auf eine pleiotropische Rolle von PTC in den erwachsenen Signaltransduktionspfaden hin. Defekte in diesen Signalisierungspfaden könnten die Ursache für die postnatal sich entwickelnden Symptome sein.
Beispiel 2
Mutationen des menschlichen Homologs von Drosophila, gepatcht in Nevoidem Basalzellenkarzinom
Das nevoide Basalzellenkarzinomsyndrom [NBCCS] ist eine autonome dominante Störung, die durch vielfache Basalzellenkarzinome (BBC), Grübchen der Handflächen und Fusssohlen, Keratozysten der Wange und einer Vielzahl anderer Tumore und Entwicklungsabnormitäten charakterisiert ist. NBCCS wurde auf Chromosom 9q22.3 kartiert und beide familiären und sporadischen BCC zeigten einen Verlust von Heterozygosität für Marker in dieser Region, was damit übereinstimmt, dass das Gen ein Tumorunterdrücker ist. Das Beispiel 1 beschreibt die Isolation einer menschlichen Sequenz (PTC) mit starker Homologie zum Drosophila-Segment-Polaritätsgen. Dieses Beispiel zeigt, dass menschliche PTC in vielen bei NBCCS-Patienten betroffenen Geweben zum Ausdruck kommt. Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus-Analyse und Sequenzierung zeigten bei Patienten mit dem Syndrom und in verwandten Tumoren Mutationen von PTC auf. Die Daten zeigen, dass menschliche PTC auch ein NBCCS-Gen ist und dass eine Reduktion der Expression dieses Gens zu den beim Syndrom beobachteten Entwicklungsanomalien führt und dass der vollständige Verlust der gepatchten Funktion zur Umwandlung gewisser Zelltypen führt.
Experimentelle Verfahren
Probanden und Proben
DNA-Proben wurden von 363 Einzelpersonen in 128 NBCCS-Stämmen gesammelt. Die Patienten wurden von einem klinischen Genetiker untersucht und die Diagnose des Gorlin-Syndroms beruhte auf mindestens zwei hauptsächlichen Merkmalen des Syndroms, z.B. Wangenzysten, Grübchen in den Handballen, mehrfache Basalzellenkarzinome und eine Familiengeschichte des typischen Gorlin-Syndroms. Lymphoblastoidzellenlinien wurden von mindestens einem betroffenen Angehörigen von 82 Stämmen gemacht. Es wurden 252 Basalzellenkarzinome entweder frisch oder als in Paraffin eingebettete Proben entnommen.
Kurze Tandem-Wiederholungs-Polymorphismen
Für die Verknüpfungsanalyse und Tumorlöschungsstudien wurden PCR-Reaktionen in 50 μl-Volumina durchgeführt, die 100 ng Schablonen-DNA, 200 M dNTPs, 1.5 MM MgCl₂, 0.5 mM Spermidin, 10 pM eines jeden Primers, I Ci³²P dCTP (Amersham, Arlington Heights, Illinois, USA) und 1.25 Einheiten Taq-Polymerase (Promega, Madison, Wisconsin, USA) in Promega-Puffer (10 mM TrisHCl, pH 9, 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100^TM) enthielten. Ein Ericomp Dual Block^TM Thermozykler wurde mit den folgenden Parametern für 25 Zyklen eingestellt: 94°C, 1 mm, 55°C, 30 sec, 72°C, 2 min. Die PCR-Produkte wurden auf 5% Polyacrylamid-Gels analysiert. Autoradiographie wurde bei –70°C mit Kodak-XAR^TM-Film ausgeführt. Loci in der NBCCS-Region, die getippt wurden, werden in der 1 gezeigt und Primer-Sequenzen sind von der Genomdatenbank erhältlich (http://gdbw-www.gdb.orq).
Impulsfeld-Gel-Elektrophorese (PFGE)
Kultivierte Lymphoblastoidzellen wurden in LMP-Agarose (Bio Rad, Hercules California, USA) mit einer Konzentration von ungefähr 2 × 10⁶/220- 1 Block eingebettet und DNA wurde nach Standardmethoden extrahiert (Sambrook et al. s. oben). Vierteisblöcke wurden mit SacII, MiuI, NotI, BssHI und Sfil unter vom Hersteller (New England Biolabs, Beverly, Massachusetts, USA) empfohlenen Bedingungen verdaut. Die Elektrophorese wurde mit dem Bio Rad CHEF 11 Apparat durchgeführt, wobei 1% Agarosegel mit einer Laufzeit von 20 Stunden bei 200 Volt mit einer Impulszeit von 75 Sekunden verwendet wurde. Für eine höhere Auflösung der Fragmente unter 500 kb wurde eine Impulszeit von 25 Sekunden benutzt.
Die Übertragung auf Nylonmembranen (Du Pont Gene Screen Plus^TM, Du Pont, Boston, Massachusetts, USA) wurde gemäss den Anweisungen des Herstellers nach Einwirkung von UV (6-7 mW/cm²) während 2 Minuten auf das Gel ausgeführt. Die Sonden wurden auf eine spezifische Aktivität von ungefähr 10⁹DPM/g mit dCT³²P (Amersham) nach der zufällig geprimten Synthesemethode (Boehringer Mannheim Kit, Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, Indiana, USA) etikettiert. Die Hybridisierung wurde während 18 Stunden bei 65°C in 0.5 M Natriumphosphat, 7% SDS, 1% BSA, 1mM EDTA und 200 μg/ml Heringsspermien durchgeführt. Für Proben, die repetitive Sequenzen enthalten, wurde gescherte, sonizierte menschliche Plazenta-DNA (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA) zur Hybridisierungslösung hinzu gegeben (500 μg/ml) und mit der Probe bei 65°C während 45 Minuten vor der Hybridisierung zum Filter präassoziiert. Die Filter wurden in 0.1 × SSC mit 1% SDS bei 65°C ausgewaschen und einem Autoradiographie-Film mit einem Intensifierungsschirm bei –70°C während dem Zeitraum von 12 Stunden bis 3 Tagen ausgesetzt. Proben, die Fragmente ähnlicher Grösse auf verschiedenen Blots feststellten, wurden direkt, durch Konmigrierung von Fragmenten durch Hybridisierung auf den gleichen Blot für konmigrierende Fragmente verglichen. Die Blots wurden in 0.4N NaOH während 30 Minuten bei Raumtemperatur abgestreift.
Cosmidklone wurden durch Nick-Translation mit Biotin-11-dUTP, Dioxigenin-11-dUTP oder beidem markiert und auf Metaphase- und Interphase-Chromosome unter Unterdrückungsbedingungen hybridisiert. Biotynilierte Sonden wurden mit 5 μg/ml Fluoreszin-Isothicyanat (FITC) konjugierter Avidin-DCS festgestellt. Dioxigenin-etikettierte Sonden wurden mit 2 μg/ml Anti-Dioxigenin Fab konjugiert zu Rhodamin festgestellt. Die Chromosome wurden mit 200 ng/ml 4,6-Diamino-2-Phenylindol-Dihydrochlorid (DAPI) gegengefärbt. Die Bilder wurden mit einem Mikroskop gewonnen, das an eine gekühlte CCD-Kamera gekoppelt war. Die digitalisierten Bilder wurden verarbeitet, pseudogefärbt und verschmolzen und die Distanzen zwischen den Signalen wurden gemessen.
Cosmid- und BAC-Screening
Eine gerasterte Chromosom 9 Cosmidbibliothek (LL09NCO1) wurde auf Nylonfilter (Gene Screen Dupont Plus, Du Pont Co.) repliziert und gemäss den Empfehlungen des Human Genome Center, Lawrence Livermore National Laborstory, gesiebt. Positive Koordinaten wurden auf einzelne Kolonien ausgestreckt und es wurde durch PCR oder Hybridisierung bestätigt, dass sie die entsprechenden Marker enthalten. Gerasterte BAC-Filter wurden durch Hybridisierung gemäss den Empfehlungen des Herstellers (Research Genetics, Huntsville, Alabama, USA) gesiebt. Wegen der geringen Möglichkeit von Chimerismus in Cosmiden und BACS wurden Fragmente von den Enden von Cotings mit einem Panel von menschlichen somatischen Hamster-Zellhybriden kartiert, um deren Lokalisierung auf dem Chromosom 9q22 zu bestätigen.
Isolation von cDNAs
Es wurden vier Methoden angewendet, um Kandidaten-cDNA zu isolieren. Direkte cDNA-Selektion (Parimoo et al. (1991) Proc,. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9623-9627) wurde an zwei Pools von Cosmiden und BAC angewendet. Nach zwei Selektionsrunden wurden die PCR-Produkte grössenfraktioniert und in PCRII geklont (Invitrogen, Leek NV, Niederlande). Transformanten wurden in 96 Beckenplatten gerastert und Replikafilter wurden mit genomischer Schablonen-DNA geprüft, um cDNA zu identifizieren, die die korrekte genomische Region hybridisierten.
Exon-Trapping wurde mit der von Buckler et al (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 4005-4009 entwickelten und später von Church et al. (1994) Nature Genetics 6: 98. BamHI/GbIII modifizierten Methode durchgeführt. Bam-HI/GbIII Verdauungen von PoIIs von 5 oder 8 Cosmiden wurden in den BamHI-Ort des Spleissvektors pSPL3b geklont (Burn et al. (1995) Gene, 161: 183-187). Gefangene DNA wurden sequenziert und durch Hybridisierung zu den Cosmiden, von denen sie abgeleitet wurden, zurück in die NBCCS-Kandidatenregion zurück kartiert.
Für HTF Inselklonen wurden YAC durch gepulste Gel-Elektrophorese grössenfraktioniert, vom Gel ausgeschnitten und mit BssHII verdaut. Anschliessend wurden Vectorette-Linker hinzugefügt und PCR-Vergrösserung mit einem Vectorette-Primer und einem 5' Alu Primer (Valdes et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sc!., 91: 5377-5381) ausgeführt. Nach einer anfänglichen Denaturierung bei 100°C während 5 Minuten wurden 30 Vergrösserungszyklen ausgeführt mit Denaturierung während 1 min bei 98°C, Anlassen während 1 min bei 60°C und Erweiterung während 3 min bei 72°C. Zehn Einheiten Taq Polymerase wurden in einem gesamten Volumen von 100 μl benutzt, das aus 50 mM KCl, 10 mM Tris pH 9, 2 mM MgCl₂, 0.1 % Triton und 200 μM dNTP besteht. Die PCR Produkte wurden auf einem 1% Agarosegel elektrophoretisiert, um deren Grösse zu bestimmen, und anschliessend durch ein Schrotgewehrverfahren in den PGEM T-Vektor (Promega) geklont.
Für die Sequenzprobenentnahme wurden die Enden von Chromosom 9-spezifischen Subklonen direkt sequenziert (Smith et al. (1994) Nature Genetics 7: 40-47. Die Sequenzierung wurde auf einem ABI 373 DNA Sequenzierer durchgeführt. Die resultierenden Endsequenzen wurden manuell beschnitten, auf einfache Sequenzwiederholungen überprüft und benützt, um die DNA-Sequenzdatenbanken zu durchsuchen. Es wurden beide Nukleotid- und Aminosäuresuchen durchgeführt. Zudem wurden Sequenzen durch GRAIL auf potenzielle Codierungsregionen untersucht (Uberbacher und Mural (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 11261-11265.
Mit den oben beschriebenen Methoden gewonnene kurze cDNA-Fragmente wurden durch Siebung von Gehirn- und epidermischen cDNA-Bibliotheken und schnelle Verstärkung von cDNA-Enden erweitert (Marathon Kit, Palo Alto, Kalifornien, USA).
Intron-/Exon-Struktur des menschlichen gepatchten Gens
Oligonukleotide wurden in die cDNA des menschlichen gepatchten Gens überspannenden Intervallen von ungefähr 150 bp gewählt. PCR-Produkte wurden aus den Cosmiden 226G7, 42H11, 55A16 oder 96F9 generiert. Reaktionen wurden in einem Volumen von 50 μl durchgeführt, das 25 pmol von verschiedenen Oligonukleotidkombinationen, 200 μmol dNTPs, 1.5 mM, oder 1.85 mM, oder 2.2 mM MgCl₂, 5 U Taq Polymerase enthält und für 35 Zyklen von 94°C während 30 s, 55°C während 30s und 72°C während 2.5 min vergrössert wird. Einige Proben wurden durch Langstecken-PCR mit Hilfe des Expansions-Lang-Schablonen PCR-Systems (Boehringer Mannheim) gemäss den Anweisungen des Herstellers vergrössert. PCR-Produkte wurden auf einem 1% Agarosegel aufgelöst und mit einem DNA-Reinigungskit isoliert (Jetsorb, Genomed, Bad Oeynhausen, Deutschland). Die Sequenzierung von PCR-Fragmenten wurde mit dem Taq Dyedeoxy Terminator Cycle Sequenzierungskit (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien, USA) durchgeführt. Sequenzierungsreaktionen wurden auf einem automatisierten Sequenzierer ABI 373A durchgeführt. Die Positionen von Intronen wurden durch vorausgesagte Spleiss-Spender- oder Spleiss-Akzeptororte aufgelöst.
Mutationserkennung
Eine kombinierter SSCP (Orita et al. (1989) Ann. Hum. Genet. 59: 347-365) und Heteroduplex-Analyse (White et al. (1992) Genomics, 12: 301-306) Ansatz wurde mittels optimierten Bedingungen benutzt (Glavac und Dean, Hum. Mutation, 2: 404-414). DNA-Proben (100 ng) wurden in einem PCR-Puffer vergrössert, der 1.5 mM MgCl und ³²P-dCTP enthielt, während 35 Zyklen bei 94°C, 30 sec, 55°C, 30 sec, 72°C, 30 sec vergrössert. Die Produkte wurden 1:3 in Stoplösung verdünnt, bei 95°C während 3 min denaturiert und 3μl direkt auf Gels geladen. Die benutzten Gel-Rezepturen waren 1) 6% Acrylamid:Bis (2.6% Vernetzung), 10% Glyzerin, Raumtemperatur, 45W; 2) 6% Acrylamid:Bis (2.6% Vernetzung), 4 60W; 3) 10% Acrylamid:Bis (1.3% Vernetzung) 10% Glyzerin4, 60W; 4) 0.5X MDE (ATGC Corp., Malvern, PA), 10% Glyzerin4, 50W. Die Gels liefen während 3-16 Stunden (3000Vh/100 bp), getrocknet und während 2-24 Stunden Röntgenfilm ausgesetzt. Heteroduplexe wurden aus der doppelsträngigen DNA am Unterteil der Gels identifiziert und SSCPs von der einzelsträngigen Region.
Proben, die Abweichung zeigten, wurden mit anderen Familienangehörigen verglichen, um die Segregation der Allele oder zu der normalen DNA vom gleichen Patienten im Fall von Tumoren zu beurteilen. PCR-Produkte mit SSCP oder heteroduplexen Varianten wurden mit alkaliner Garnelen-Phosphatase und Exonuklease behandelt (United States Biochemical) und mit AmplitaqFS^TM (Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut, USA) zyklus-sequenziert. Die Produkte wurden auf einem DNA-Sequenzierer Applied Biosystems Modell 373 analysiert.
Resultate und Diskussion
Feinkartierung durch Verknüpfungs- und Tumor-Löschungs-Studien
Seit der ursprünglichen Kartierung des Gens im Jahr 1992 haben Verknüpfungsstudien die NBCCS-Region auf ein 4 cM-Intervall zwischen D9S180 und D9S196 eingeengt (Goldstein et al. (1994) s. oben; Wicking et al. (1994) Genomics, 22: 505-511). Farndon et al. (1994) s. oben berichteten über Rekombination, an dem ein nicht betroffenes Individuum beteiligt war, was das Gen in die Nähe von D9S287 platzierte.
Die vorliegenden Experimente identifizierten eine Rekombination zwischen D9S287 und FACC in der Familie von drei Generationen. Das rekombinierende Individuum war eine 1.5 Jahre alte weibliche Person, von der man auf der Basis von Makrocephalie, Strabismus und frontaler Beulung annahm, dass sie betroffen war. Einige der Schlüsselmerkmale des Syndroms wie Basalzellkarzinome, Kieferzysten und Grübchen in den Handballen fehlten. Aber diese Merkmale haben eine altersabhängige Expression und deren Vorhandensein bei einem jungen Kind ist nicht zu erwarten. Unter der Annahme, dass sie das Gen trägt, platzierte die Rekombination in dieser Familie die NBCCS in die Nähe von D9S287.
Der allelische Verlust in BCCs stimmte bei der Platzierung des Gens zwischen D9S196 und D9S180 mit der Verknüpfungskartierung überein. Die meisten erblichen Tumore mit allelischem Verlust löschten die gesamte Region zwischen den flankierenden Markern. Jedoch zeigte ein erbliches Herzfibrom Verlust bei D9S287, aber nicht bei D9S280 beim nicht krankheitstragenden Allel, was darauf hindeutet, dass das Gen distal zu D9S280 angeordnet ist. Bei sporadischen BCCs wurden vier Tumore gefunden, welche D9S287 behielten und weitere distale Marker verloren, aber auch zwei Tumore, welche den proximalen Marker D9S280, aber nicht D9S287 verloren.
Es können mehrere Hypothesen angeboten werden, um die Diskrepanz bei der Tumor-Löschungs-Kartierung und zwischen Tumorlöschungen und Verknüpfungsstudien zu erklären. Es könnte auch ein anderes Gen als NBCCS für den allelischen Verlust bei einigen sporadischen Tumoren verantwortlich sein. NBCCS ist beinahe sicher das Ziel des allelischen Verlusts bei erblichen Tumoren, weil diese Tumore immer die Kopie des NBCCS-Gens vom nicht betroffenen Elternteil verlieren und die geerbte Mutation behalten (Bonifas et al. (1994) Hum. Mol. Genet., 3: 447-448). Wenn ein zweiter Locus den allelischen Verlust antreiben würde, dann würden die Allele vom betroffenen Elternteil und dem nicht betroffenen Elternteil mit gleicher Häufigkeit verloren gehen. Es kann jedoch zwei verschiedene Tumorunterdrücker auf dem Chromosom 9q geben, die beide bei Basalzellenkarzinomen wichtig sind. Zum Beispiel sind das APC-Gen und das MCC-Gen beide beim Dickdarmkrebs mutiert und liegen innerhalb von 1 Mb von einander entfernt auf dem Chromosom 5q (Hampton et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 8249-8253). Die Beobachtung eines klar unterschiedenen Musters von Allelenverlust, an dem D9S180, aber nicht D9S287 beteiligt ist, bei einem schuppenförmigen Zellenkarzinom der Haut unterstützt das Vorhandensein von mehr als einem Tumorunterdrücker in der 9q22.3-Region. Zudem wurde ein vermutlicher Tumorunterdrücker bei Blasenkrebs auf 9q21-31 kartiert und kann vom NBCCS-Gen verschieden sein (Knowles et al. (1995) Br. J. Urol. 75: 57-66).
Eine zweite Möglichkeit ist, dass bei einigen Tumoren Regionen auf beiden Seiten von D9S287 gelöscht werden, aber dass die proximaleren Löschungen mit den zur Verfügung stehenden Markern nicht immer erkannt werden. Es wurden nämlich zwei Tumore beobachtet, die Marker sowohl proximal als auch distal zu D9S127 löschten, was möglicherweise ein genetische Instabilität bei Tumorzellen anzeigt. Schliesslich könnte NBCCS ein grosses Gen sein, das sich auf beide Seiten des D9S287 Locus erstreckt. Zusammenfasst lassen die hierin angegebenen Daten vermuten, dass der wahrscheinlichste Sitz des NBCCS-Gens zwischen den Markern D9S280 und D9S287 liegt. Trotzdem wurde, wegen den Diskrepanzen bei den Tumorlöschungen, eine physkalische Kartierung und eine cDNA-Isolierung von der ganzen Region zwischen D9S196 und D9S180 durchgeführt.
Physikalische Kartierung
Neunundzwanzig YAC aus dieser Region wurden von der CEPH megaYAC Bibliothek erhalten. Achtzehn bildeten ein überlappendes Contic zwischen D9S196 und D9S180 mit mindestens zweifacher Redundanz. Gestützt auf dieses Contic war die minimale Distanz zwischen den flankierenden Markern 1.5 Mb, aber virtuell alle grossen YAC hatten, beurteilt durch STS-Gehalt, interne Löschungen. Zusätzliche YAC wurden von der ICI-Bibliothek erhalten, um in Bereichen Redundanz zu erhalten, die scheinbar löschungsanfällig waren. Cosmid und BAC-Contigs wurden um bekannte STS und Gene herum konstruiert und zusätzliche Cosmids aus der Region wurden durch Hybridisierung von YAC auf die Lawrence Livermore gerasterte Cosmid-Bibliothek isoliert. Insgesamt wurden mehr als 800 für diese Region spezifische Cosmids in 96-Mulden-Rasterplatten gerastert und es wurden 1.5 Mb abdeckende Cosmids konstruiert (siehe 1). Wegen den Löschungen in YACs und einigen Lücken im Cosmid und BAC Contig wurden Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE) und FISH angewendet, um die Klonregionen zu integrieren. Gestützt auf die Grössen von Restriktionsfragmenten in dieser Region und FISH-Schätzungen wurde die physische Distanz von D9S180 bis D9S196 auf nicht weniger als 2 Mb geschätzt.
Isolation von cDNA
Harshman et al. (1995) s. oben zeigten, dass verschiedene Methoden der Identifizierung von cDNA aus einer Region eine überraschend verschiedene Anordnung von Kandidatengenen ergeben. Es wurden verschiedene Methoden verwendet, um Gene zu finden, die auf das Chromosom 9q22 kartieren, einschliesslich Probensequenzierung von Cosmiden, Exon-Trapping, HTF-Insel-Klonen und direkte Auswahl von cDNA aus BAC und Cosmiden. Zusätzlich wurden Gene, von denen bekannt ist, dass sie in diesem generellen Gebiet liegen, durch Verwendung von aus zwei NBCCS-Patienten mit sichtbaren 9g22-Löschungen gemachten somatischen Zelthybriden, (dem NIGMS-Repositorium unterbreitet), YAC Contigs und FISH feiner kartiert. Zehn Gene, zehn EST mit Sequenzen in GENBANK und 31 anomyme ausgewählte cDNA-Fragmente, HTF-Insel-Klon und gefangene Exone mit bekannter Homologie wurden identifiziert (Tabelle 1).
Untersuchung von Patienten für Germline-Löschung oder Umlagerungen
Da sich das Chromosom 9q22 sehr genreich erwies, wurde ein Versuch unternommen, das NBCCS-Gen genauer zu lokalisieren, indem bei Patienten submikroskopische Umlagerungen gesucht wurden. Es wurden fünfzehn die Region zwischen D9S196 und D9S180 umfassende Cosmide in Intervallen von ungefähr 100-200 kb auf PFGE-Blots von 82 nicht verwandten NBCCS-Patienten hybridisiert. Zudem wurden Proben von Genen, von denen bekannt ist, dass sie auf das Intervall kartieren, wie auch diejenigen, die im Lauf der Studie identifiziert wurden, in die Analyse eingeschlossen. Bei drei Patienten wurden PFGE-Varianten mit Proben von innerhalb des Fanconi's Anämie-Komplementierungsgruppe C (FACC)-Gens identifiziert. Alle drei waren heterozygot für SacII-Bänder, die ungefähr 30 kb kürzer als normal sind (310 gegenüber 280 kb). Die Auflösungsgrenze von PFGE war ungefähr 10 kb, so dass es nicht möglich war zu ermitteln, ob die scheinbar identische Variante der SacII-Bänder genau die gleiche Grösse hatten. Andere Restriktionsenzyme, einschliesslich NotI, BssHII, Mlul, Sfil und NruI zeigten keine Variantenbänder. Die Variationen stimmten bei diesen Patienten nicht mit Germline-Löschungen überein, aber es war vorstellbar, dass sie durch Punktmutationen verursacht wurden, die neue Restriktionsstellen oder andere kleine Veränderungen wie die rekurrenten Inversionen schaffen, die im F8C Gen vieler Bluter beobachtet werden (Lakich et al. (1993) Nat. Genetics, 5: 236-241).

Die Beschaffenheit der diese Veränderungen an PFGE verursachenden DNA-Veränderungen wurde noch nicht ermittelt, aber die Daten, die sie mit der Krankheit in Verbindung bringen, sind überzeugend. Die Familien von zwei der Patienten mit Variationen standen nicht für die Studie zur Verfügung. Jedoch war der dritte Patient ein sporadischer Fall von NBCCS, und kein Elternteil hatte SacII Veränderung. Das Auffinden dieser Variante bei einem Patienten, aber nicht bei den Eltern, könnte als das Ergebnis einer Hypermutabilität einer CG-reichen Region nahe an FACC interpretiert werden, aber es wurde keine Variation in dieser Region in PFGE-Blots von über 100 normalen Chromosomen identifiziert. Tabelle 1. cDNA Klone aus der NBCCS-Region auf Chromosom 9q22.3

Klon-Bezeichnung^a	Klon-Typ^b
Vorher auf Chromosom 9q kartierte und mit somatischen Zelthybriden, PFGE und YAC Contigs feiner kartierte cDNA.
FACC	Gen
NCBP	Gen
HSD17B3	Gen
TMOD	Gen
XPA	Gen
SYK	Gen
WI-11139	EST (R14225)
WI-11414	EST (T88697)
WI-8684	EST (R14413)
D9S1697	EST(R06574)
D9S1145	EST (enthält R17127 und 238405)
Neue Klone oder vorher nicht auf das Chromosom 9q kartierte Klone, die durch Probensequenzierung, Exon-Trapping, HTF-Inselklonen oder cDNA Selektion identifiziert wurden.
ZNF169	Gen
FBP1	Gen
PTC	Gen
Coronin Homolog	Gen
2F1a	EST(R39928)
2F1b	EST(T11435)
11F21	EST(Z43835)
31F3	EST(R16281)
yo20g05.s1	EST (Merck EST)
plus 31 anonyme, ausgewählte cDNA-Fragmente, Insel-Klone und gefangene Exone von YACs und Cosmid-Pools^c
^a Für bekannte Gene und anonyme cDNAs, die der Genomdatenbank (http://gdbwww.dgw.org/gdb) unterbreitet wurden, wird die genormte Lokus-Nomenklatur verwendet. Bei EST ohne GDB-Nummer bedeutet WI einen Whitehead-Institut-Klon (http://www-genome.wi.mit.edu). ^b NCHR-Akzessionsnummern werden, wo verfügbar, für anonyme EST in Klammern angegeben. Zusätzliche Informationen können unter http://www.ncgr.org/gsdb erhalten werden. ^c Es werden zusätzliche Sequenzdaten erforderlich sein, um abzuklären, ob einige der anonymen cDNA verschiedene Abschnitte der gleichen Gene darstellen.

Evaluation von PTC als Kandidatengen
Da in der FACC-Region Varianten-PFGE-Bänder und ein Rekombinant identifiziert wurden und auch Tumorlöschungsstudien auf einen möglichen Standort in der Nähe dieses Markers schliessen liessen, wurden Kandidaten-cDNA, die auf diesen Bereich kartierten, untersucht. FACC selbst wurde nicht als Kandidat betrachtet, weil heterozygote Mutationen in diesem Gen nicht NBCCS verursachen (Strathdee et al. (1992) Nature, 356: 763-767). FACC und PTC (ein neuartiges Gen mit starker Homologie zu Drosophila patched) hybridisierte zum gleichen 650 kb NotI-Fragment und 675 kb und 1000 kb (parziell) Mlul-Fragmenten. Mäuse-Interspezies-Rückkreuzungs-Analyse bestimmte, dass es keine Rekombinationen zwischen den PTG und FACC-Genen aus 190 Meiosen gibt. PTC und D9S287 waren beide auf ICI YAC 2EF8 vorhanden und, da sie eine Grösse von 3050 kb haben, deuten sie stark darauf hin, dass PTC zwischen D9S287 und FACC liegt.
Für die Suche nach Mutationen im PTC-Gen wurden die Intron-/Exon-Grenzen aus genomischen Klonen und Langstrecken-PCR-Produkten bestimmt. PTC besteht aus 21 Exonen und das Gen erstreckt sich über ungefähr 34 kb (2). Panels von nicht verwandten NBCCS-Patienten und BCCs wurden durch einsträngige Konformations-Polymorphismus(SSCP)-Analyse untersucht (für die Verstärkung von PTC-Exonen verwendete Primer sind in der Tabelle 2 angegeben). Patienten, die Variationen zeigten, wurden mit nicht betroffenen Individuen der gleichen Rasse verglichen und nur bei betroffenen Individuen angetroffene Variationen wurden durch DNA-Sequenzierung weiter charakterisiert. Von den bei nicht verwandten Patienten identifizierten Mutationen waren vier Löschungen oder Einfügungen, die Rahmenverschiebungen bewirkten und zwei waren Punktmutationen, die zu vorzeitigen Stopps führten (Tabelle 3, 4 und 5). Eine zusätzliche Feststellung, die die Beziehung zwischen Mutationen in PTC und der Krankheit bestätigt, war die Identifizierung einer Rahmenverschiebungs-Mutation bei einer sporadischen NBCCS-Patientin, die bei keinem ihrer unbetroffenen Elternteile vorhanden war (5).

Um die Rolle von PTC bei Neoplasie zu untersuchen wurden mit dem Syndrom zusammenhängende Tumore auf Mutationen untersucht. Zwei sporadi sche Basalzellenkarzinome mit allelischem Verlust der NBCCS-Region hatten inaktivierende Mutationen des verbleibenden Allels (6 und 7). Ein von der Wange entfernter Tumor hatte eine CC- bis TT-Veränderung, die für eine UVB-Mutagenese typisch ist. Der zweite Tumor von der Nase hatte eine 14 bp – Erschöpfung, eine Mutation, die nicht mit einem spezifischen Umgebungsunfall in Zusammenhang gebracht werden kann. Es wurden noch keine Mutationen bei sporadischen BCC identifiziert, die nicht einen allelischen Verlust des Chromosoms 9q22 aufweisen, und es können bei diesen Neoplasmen andere Pathogenesearten wirksam sein. Tabelle 3. Mutationen im PTC-Gen

Probentyp	Erbschaft	Exon	Mutationstyp	Bezeichnung
NBCCS	F	5	vorzeitiger Stopp	C1081T
NBCCS	F	6	37 bp Löschung	del 804-840
NBCCS	F	8	vorzeitiger Stopp	G1148A
NBCCS	F	12	2 bp Einfügung	2047insCT
NBCCS	S	12	1 bp Einfügung	2000insC
NBCCS	S	14	1 bp Löschung	2583delC
BCC	S	5	vorzeitiger Stopp	CC1081TT
BCC	S	15	14 bp Löschung	del2704-2717
^a NBCCS, Germline-Mutationen bei einem Patienten mit dem Syndrom, BCC,somatische Mutation in einem Basalzellenkarzinom ^b F, familiär, 5, sporadisch

Diskussion
Diese Beispiele liefern starke Beweise, dass Mutationen der NBCCS-Gene (PTC), der menschliche Homolog von Drosophila patched, das nevoide Basalzellensyndrom verursachte. Veränderungen, von denen vorausgesagt wurde, dass sie das PTC-Gen inaktivieren, wurden bei sechs nicht verwandten NBCCS-Patienten gefunden. Rahmenschiebungs-Mutationen wurden bei zwei sporadischen Patienten gefunden, jedoch nicht bei deren Eltern, und somatische Mutationen wurden in zwei sporadischen Tumoren der im Syndrom beobachteten Typen festgestellt. Kein bekannter menschlicher Tumorunterdrücker hat Sequenzähn lichkeit zu PTC und Funktionalitäts-PTC kann einen neuen Typen des Neoplasieverwandten Gens darstellen.
Das Drosophila patched Gen in Differenzierung und Entwicklung
Das patched Gen ist ein Teil eines Signalisierungspfades, der von Fliegen zu Säugetieren bewahrt wird. Das Drosophila Gen codiert ein Transmembran-Glydoprotein, das bei der Segmentpolarität eine Rolle spielt (Hooper und Scott (1989) Cell 59: 751-765; Nakano et al. (1989) Nature 341: 508-513). Viele Allele von ptc produzieren einen embrionischen tödlichen Phänotyp mit spiegelbildlicher Duplikation von Segmentgrenzen und Löschung des Rests der Segmente (Nusslein-Volhard et al. (1980) Nature 287: 795-801), aber hypomorphe Allele erzeugen lebensfähige Erwachsene mit Überwachstum des anterioren Abteils des Flügels, Verlust von costalen Strukturen und Flügel-Venendefekten (Phillips et al. (1990) Development 110: 105-114). Genetische und funktionale Studien haben gezeigt, dass eine der Wildtypenfunktionen von ptc transkriptionale Repression von Mitgliedern der Wnt und TGF-b-Genfamilien ist (Ingham et al. (1991) Curr. Opinion Genet. Develop. 5: 492-498; Capdevila et al. (1994) EMBO J. 13: 71-82. Der Mechanismus dieser Repression ist unbekannt, und es können viele andere dahinter liegende Ziele von ptc existieren.
Der Wirkung von ptc widersetzt sich die Wirkung von Angehörigen der Hedgehog-Genfamilie. Studien in Drosophila haben nachgewiesen, dass Hedgehog (hh) ein sekretiertes Glycoprotein ist, das wirkt, um beide ptc-repressiblen Gene und ptc selbst transkriptional zu aktivieren (Tabata und Kornbernc (1994) Cell, 76: 89-102; Basler und Stuhl (1994) Nature, 368: 208-214). So resultiert bei einem bestimmten Zelltyp die Aktivität von Zielgenen aus einem Gleichgewicht zwischen Hedgehog-Signalisierung von angrenzenden Zellen und ptc-Aktivierung.
Säugetier-Homologe von patched
Das menschliche Homolog (PTC) von Drosophila ptc dieser Erfindung zeigt nicht mehr als 67% Identität auf der Nukleotidebene und 61% Identität auf der Aminosäurenebene zum Drosophila-Gen. Deshalb wäre die Identifizierung ei nes menschlichen Homologs, entweder durch Anwendung eines Hybridisierungsansatzes oder durch Screening einer Expressionsbibliothek mit Antikörpern zum Fliegenprotein schwierig gewesen. Die vorliegenden Daten weisen stark darauf hin, dass patched ein Einzelkopie-Gen bei Säugetieren ist.
Die Analyse von fötalen Gehirn-cDNA-Klonen und RACE-Experimente haben das Vorhandensein von zwei verschiedenen 5'-Enden für das menschliche PTC-Gen aufgezeigt (3). Die beiden menschlichen Sequenzen divergieren von der Mäuse PTC cDNA (vom 8 dpc Embryo RNA) an der gleichen Stelle, und der Maus-N-Terminus passt genauer zu den Drosophila und C. elegans-Proteinen. Die Analyse der davor liegenden genomischen Sequenz des C. egans-Gens konnte keine Homologie zu den beiden alternativen menschlichen Enden aufzeigen. Die Daten weisen darauf hin, dass es mindestens drei verschiedene Formen von PTC-Protein in Säugetierzellen gibt, nämlich die durch die Mäuse-Sequenz repräsentierte Vorfahrenform und die zwei menschlichen Formen. Das erste Inframe-Methionin-Codon für eine der menschlichen Formen ist das 3. Exon, was darauf deutet, dass diese Form der mRNA entweder ein N-terminal abgeschnittenes Protein codiert, oder ein alternatives Initiations-Codon benutzt. Die zweite menschliche Form enthält einen offenen Ableserahmen, der sich durch das 5'-Ende erstreckt und durch davor liegende Sequenzen eingeleitet worden sein kann, die noch nicht isoliert wurden. Die Identifizierung verschiedener potenzieller Formen des PTC-Proteins bietet einen Mechanismus, durch den ein einzelnes PTC-Gen möglicherweise auf verschiedenen Pfaden eine Rolle spielen könnte. Es wird wichtig sein, die Regulierung der verschiedenen Spleissungsformen von Ptc mRNA zu bestimmen, da dadurch erkannt werden könnte, welche Rolle scheinbar die Gene sowohl bei der Embryoentwicklung und der Wachstumskontrolle von adulten Zellen spielen können.
Bei erwachsenen Menschen ist PTC umfangreich ausgedrückt. Reichliche Transkription wird in den Nieren, Leber, Lunge, Gehirn, Herz, Skelettmuskein, Pankreas und Haut festgestellt. Während der Entwicklung von Mäusen wird Ptc zuerst bei 8.0 dpc in ventralem Neuroepithalgewebe in zwei separaten Bereichen entlang der Mittellinie ausgedrückt. Am Tag 9.5 werden Transkripte auch im den neuralen Tubus umgebenden Mesenchym festgestellt. Expression ist in den entwickelnden Somiten in einem rostral-caudalen Gradienten sichtbar. Vom Tag 10.0 bis 12.5 ist das Transkript im posterioren Ektoderm eines jeden Gliedknotens vorhanden. Andere Expressionsorte während dieser Periode umfassen die inneren Oberflächen der pharingealen Bögen, Zellen die die Placode der Vibrissae umfassen und der genitalen Eminenz.
Mehrere Homologe von Drosophila Hedgehog (hh) wurden bei Wirbeltieren identifiziert und scheinen, wie das Drosophila-Gen, während der Entwicklung an der Musterorganisation beteiligt zu sein. Am umfangreichsten wurde davon Sonic Hedgehog (Shh) studiert. Bei Mäusen wird die Expression von Shh normalerweise im Notochord und der überhängenden Bodenplattenregion des neuralen Tubus erkannt (Echelard et al. (1993) Cell 75: 1417-30). Ausser der Beteiligung an der Mittellinien-Signalisierung bei Wirbeltieren wird Shh auch in einer Anzahl anderer Gewebe ausgedrückt, einschliesslich den sich entwickelnden Gliedern, wo es scheint, dass Shh normalerweise die Aktivität der Zone polarisierender Aktivität (ZPA) vermittelt.
Die Expression von Mäuse-Ptc wird auch bei einer Vielzahl von Geweben festgestellt, von denen bekannt ist, dass sie auf Shh-Signalisierung ansprechen. Eine detaillierte Expressionsanalyse hat gezeigt, dass das Ausdrucksmuster Veränderungen in der Shh-Expression eng folgt, so dass die Transkripte meistens in angrenzenden, nicht überlappenden Geweben gefunden werden. Ptc kann für die Shh-Signalisierung erforderlich sein und hh/ptc-Wechselwirkungen scheinen Anzeichen eines angrenzenden hh-Signals zu sein. Wenn dementsprechend die Beziehung zwischen bekannten Orten von Ptc-Expression und dem NBCCS-Phänotyp interpretiert wird, kann es wertvoll sein, das Ausdrucksmuster der Hedgehog-Genfamilienangehörigen zu betrachten, da sie viel detaillierter bei Wirbeltieren charakterisiert wurden als ptc, besonders in adulten Geweben.
Währenddem klar ist, dass Ptc genetisch und funktional auf hh-Signalisierung reagiert, wird es durch seine Struktur kein offensichtlicher hh-Rezeptor. Hingegen wurde vorgeschlagen, dass Ptc ein Transporter sein könnte und dass die Substrate Moleküle sind, die die Transkription von Zielgenen regulieren.
Die Rolle von PTC bei Neoplasie
Die in dieser Studie vorgelegten Daten deuten stark darauf hin, dass das NBCCS-Gen als Tumorsuppressor funktioniert. Diese Beispiele zeigen, dass dem NBCCS-Phänotyp unterliegende Germline-Mutationen inaktivierend sind, und darum erbliche Tumore keine funktionale Kopie des Gens haben. Zudem liefern diese Beispiele den ersten direkten Beweis dafür, dass sporadische Basalzellenkarzinome (BCC) mit somatischem Verlust beider Kopien des Gens auftreten können. Die Rolle von PTC bei anderen, mit dem Syndrom zusammenhängenden Tumoren muss noch erforscht werden.
Dass zwei bekannte Ziele von ptc-Repression bei Drosophila Genfamilien repräsentieren, die bei der Kommunikation von Zelle zu Zelle und Zellsignalisierung involviert sind, ergibt einen möglichen Mechanismus, durch den ptc als Tumorunterdrücker wirken könnte. Der ptc-Pfad war kürzlich in Tumorigenese durch das Klonen des Pankreas-Tumorgens, DPC4, impliziert, (Hahn et al. (1996) Science 271: 350-353), was Sequenzähnlichkeit zu Drosophila mad (Mutter gegen dpp) aufzeigt.
Die Ursprungszelle von BCC wurde reichlich debattiert und die gegenwärtige Theorie postuliert eine Vorfahren-„Stammzelle", die langsam zykliert, aber ein grosses Vermehrungspotenzial aufweist (Miller (1991) ). Am. Acad. Dermatol. 24: 161-175). Durch gelegentliche Zellteilung werden „transiente vergrössernde Zellen" gebildet, die sich weiter vermehren, bevor terminale Differenzierung erfolgt. Die Expression von patched und Hedgehog Genfamilienangehörigen in der Haut ist nicht bekannt. Bei Drosophila wird ptc in Membranregionen festgestellt, die zelladhesiven Anschlüssen gleichen und es kolokalisiert mit PS2-Integrinen, was vermuten lässt, dass das menschliche Homolog normalerweise gestützt auf die Wechselwirkungen zwischen Zelle und Zelle eine Rolle bei der epidemialen Differenzierung spielen kann. Die korrekte Lokalisierung des Drosophila ptc-Proteins auf diese Regionen hängt auch von der Wechselwirkung dieser Zellen in einer polarisierten Vorfahrenform in einem epithelialen Blatt ab, eine Beobachtung, die auch eine Rolle für ptc in zelladhesiven Strukturen unterstützt (Capdevila et al. (1994) Development 120: 987-998). Die vorliegende Feststellung deutet darauf hin, dass BCCs keine intrazellulare Signalisierung ha ben, was zu einer Überexpression der proliferativen und Zell-Zell-Kommunikationsgene, verbunden mit Hedgehog-Signalisierung, führt. Wenn anderseits PTC eine direkte Rolle bei den Interaktionen von Zelle zu Zelle haben, kann die Proliferation aus einer Zerschlagung auf dieser Ebene entstehen.
Die Rolle von PTC bei Entwicklungsanomalien

Durch Analogie zur embryonischen Expression von Ptc bei der Maus können viele Merkmale von NBCCS mit den vermutlichen Expressionsorten von PTC im sich entwickelnden menschlichen Embryo korreliert werden (Tabelle 4). Zum Beispiel sind die Skelettanomalien, welche die Rippen, Wirbelsäulen und Schultern betreffen, sehr wahrscheinlich auf eine Zerrüttung der PTC-Expression im Sklerotom zurückzuführen. Im Maus-Embryo wird die Ptc-Expression in den ventral-medialen Zellen der Somiten festgestellt, einer Region, die anschliessend Sklerotom bildet (Hahn et al. (1996) s. oben; Goodrich et al. (1996) Genes Dev. 10: 301-12). Zudem kann Shh an der Induktion von Sklerotom durch Langstrecken-Signalisierung vom Notochord aus beteiligt sein (Fan et al. (1995) Cell 81: 457-465). Tabelle 4. Maus-Ptc-Expression und menschlicher NBCCS-Phänotyp

Expressionsort bei der Maus	NBCCS-Phänotyp
Pharingeale Bögen	Missgestaltungen des Gesichts, Kieferzysten (Dentailamina-Derivativ)
Neuraler Tubus	Dysgenese des Corpus Callosum Augenanomalien
Somiten	Spina bifida Vertebrale Fusion Rippenanomalien
Gelenkknoten	Kurze vierte Metacarpale Polydactylie

Die bei einem Teilsatz von NBCCS-Patienten beobachtete Polydactylie kann wahrscheinlich mit der Expression von Ptc im entwickelnden Mäuse-Glied korreliert werden (Hahn et al. (1996) oben; Goodrich et al. (1996) oben). Wäh rend die tatsächlichen Mechanismen noch unbekannt bleiben, scheint klar, dass die anterior-posterior-Musterung des Glieds durch Shh-Signalisierung von der ZPA kontrolliert wird. Im frühen Maus-Gliedknoten korreliert Ptc-Expression mit Shh, während in den späteren Stadien die Expression in der Peripherie der digitalen Kondensationen in Zellen festgestellt wird, die an diejenigen angrenzen, die Indischen Hedgehog (Ihh) ausdrücken (Goodrich et al (1996) s. oben). Deshalb kann die in NBCCS vorhandene Polydactylie auf die Störung der Gliedmusterung durch die Modulation von PTC zurückzuführen sein. Ähnlich ist das Auftreten von unbeweglichen Daumen bei einem kleinen Prozentsatz von NBCCS-Patienten mit einer Abänderung zur Wildtypen-PTC-Funktion konsistent.
Craniofaziale Dysmorphologie korreliert mit einem Ausdruck von PTC in den pharyngealen Bögen und abgeleiteten Strukturen. Die Kiefer-Keratozysten und Zahnmissbildungen, die verbreitete Merkmale von NBCCS sind, können sehr wahrscheinlich durch die beobachtete Expression von ptc in der Zahnknospe und im Emailknoten erklärt werden (Vaahtokari et al. (1996) MOD, 54: 39-43; Goodrich et al. (1996) s. oben). Die Pathogenese von Kieferzysten steht nahezu sicher im Zusammenhang mit embryologischen dentalen Vorläufern. Es wird angenommen, dass die epitheliale Auskleidung von Keratozysten von aberranten Derivativen der dentalen Lamina, dem Vorläufer der Zahnknospen, stammen. Die Vorfahrenzellen könnten während der Entwicklung der Lamina abnorm migriert haben oder im passenden Entwicklungsstadium nicht umhüllt haben.
Die neurologischen Komponenten von NBCCS wie Agenese des Corpus Collosum, retinale Colobomas und möglicherweise Strabismus und Macrozephalie sind mit der Expression von Ptc im entwickenden Gehirn und Nervensystem konsistent. Mentale Retardation, die gelegentlich beim Syndrom festgestellt wird, kann durch kontinuierliche Genlöschungen verursacht werden.
Unter dem klassischen Zweitreffermodell für die Wirkung von Tumorunterdrückern (Knudson (1971) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 68: 820-823) stellt das Auffinden von Entwicklungsdefekten in einem durch hemizygose Inaktivierung dieses Gentyps verursachten Syndrom ein Paradox dar, weil man glaubt, dass der Verlust von nur gerade einer Kopie wenig oder gar keinen Einfluss auf die Zellfunktion hat. Es ist möglich, dass einige der diskreten Defekte in NBCCS (z.B. spina bifida occulta, bifide Rippen und Kieferzysten) durch einen Zweitreffer-Mechanismus erklärt werden können. Wie die Neoplasmen bei Krebsveranlagungssyndromen sind viele dieser Defekte mehrfach und treten in einem Zufallsmuster auf, aber isolierte Defekte des gleichen Typs werden gelegentlich in der allgemeinen Bevölkerung festgestellt. Diese Anomalien könnten durch homozygose Inaktivierung von PTC in einer frühen Vorfahrenzelle des relevanten Gewebes verursacht sein, die abnormale Migration oder Differenzierung oder vielleicht das Ausbleiben eines programmierten Zelttodes verursachen kann. Alle Verluststudien haben nämlich gezeigt, dass Keratozysten des Kiefers klonale Abnormitäten sind, die bei homozygoser Inaktivierung des NBCCS-Gens auftreten (Levanat et al. (1996) Nat. Genetics 12: 85-87). Jedoch widersprechen generalisierte oder symmetrische Merkmale wie Überwachstum, Makrozephalie und Gesichts-Dysmorphologie nahezu sicher dem Zweitreffer-Paradigma und werden wahrscheinlich durch eine Störung eines dosierungsempfindlichen Pfades während der embryonalen Entwicklung verursacht. Gestützt auf diese Beobachtungen würde eine Voraussage darin bestehen, dass eine heterozygote „Knock-out"-Maus relativ milde Entwicklungsanomalien zeigen würde und dass UV-Bestrahlung der Haut multiple Basalzellenkarzinome hervorrufen würde.
Phänotypische Variation bei NBCCS
NBCCS ist eine Erkrankung mit nahezu 100% Penetranz, aber viele Merkmale zeigen eine variable Expression. Ein interessantes Korrelat bei Drosophila ist, dass für nicht letale Allele homozygote Fliegen eine auffallende Variabilität der Expression phänotypischer Merkmale zeigen. Da diese Fliegen isogen sind, können die phänotypischen Unterschiede nicht durch andere, darunter liegende Mutationen oder modifizierende Gene erklärt werden (Phillips et al. (1990) s. oben). Vermutlich ist die Variabilität ein stochastischer Effekt.
Dass es bei den menschlichen NBCCS-Phänotypen innerhalb der Familien mehr Ähnlichkeit gibt als zwischen Familien (Anderson et al. (1967) s. oben) deutet darauf hin, dass es einen gewissen Grad von Genotyp/Phänotyp-Korrelation geben kann. Gegenwärtig gibt es keine definierten Muster der Mutationsverteilung bei NBCCS und es wird vorausgesagt, dass alle bisher gefundenen Mutationen eine Beschneidung des PTC-Proteins verursachen. In Familien mit BRCA 1-Abschluss-Mutationen kommt Eierstockkrebs häufiger vor bei Patienten 5'-Mutationen, vielleicht, weil mutante Peptide einige Wildtyp-Funktion in einigen Zelttypen, aber nicht in anderen, behalten können (Gayther et al. (1995) Nature Genetics 11: 428-433).
Beispiel 3
Charakterisierung von PTCH GermLine-Mutationen in NBCCS
Materialien und Methoden
DNA-Extraktion
Odontogenetisches Keratozystengewebe wurde in 200 μl STE-Puffer (50mM NaCl; 10 mM Tris-HCl pH 8.0; 1mM ETDA) eingesetzt, der 0.5% w/v SDS, 14 μg/μl Proteinase K enthielt, und wurde bei 37°C 24 Stunden lang bebrütet. Nach der Inaktivierung der Proteinase K bei 95°C während 15 Minuten wurde eine Probe von 1-5 μl (ungefähr 25ng DNA) direkt für PCR benutzt. Konstitutionelle DNA wurde aus peripheren Blutlymphozyten oder Mundhöhlen-Epithelzellen mittels Standard-DNA-Extraktionsverfahren gewonnen. Ungefähr 25 ng DNA wurden direkt für PCR verwendet.
Genbank-Akzessionsnummern
DNA-Sequenzdaten für das PTCH-Gen sind unter den Akzessionsnummern U43148 und U59464 verfügbar. Die in diesem Beispiel benutzte Nukleotidnummerierung entspricht der Sequenz U43148, wogegen die Aminosäurerest-Nummerierung U59464 entspricht.
PCR-SSCP-Analyse des PTCH-Gens
Jedes der 23 Exone, die das gepatchte Gen enthalten, wurden mit den Primern und den in Hahn et al. (1996) s. oben beschriebenen Anlassbedingungen vergrössert. Kurz gesagt, wurden ungefähr 25 ng Ziel-DNA in 30 μl 1×PCR Reaktionspuffer vergrössert, der 50mM KCl; 10 mM Tris-HCl (pH 9.0); 1.5 mM MgCl₂; 0.1% v/v Triton X-100; je 200 μM dATP, dGTP, dTTP, 20 μM dCTP; 10 Picomol von jedem Primer; 1.0 μCi [a³²P-dCTP] und 1.0 Einheit Taq DNA-Polymerase (Promega, UK) enthält. Nach 35 Vergrösserungszyklen wurden 5 μl PCR-Produkt zu 35 μL 10 mM EDTA, 0.1% w/v SDS hinzugefügt. 2 μl davon wurden zu 2 μl Ladepuffer hinzugefügt, der 95% v/v deionisiertes Formamid/20mM ETDA/0.05% w/v Bromophenolblau/0.05% w/v Xylencyanol enthält, während 5 Minuten auf 100°C erhitzt, auf Eis abgeschreckt und auf 1×TBE/6% w/v nicht denaturierendes Polyacrylamidgel (5%C) geladen, das (5%C) v/v Glycerin enthält. Elektrophorese war bei 350V während 18 Stunden. Die Gels wurden unter Vakuum getrocknet und während 16 Stunden bei Raumtemperatur mit Intensivierungsschirmen autoradiographiert.
Restriktions SSCP
Durch Vergrösserung von Exonen 14 und 17 gewonnene PCR-Produkte wurden vor der SSCP-Analyse mit Alul und beziehungsweise HinfI restriktions-enzym-verdaut. Ein Aliquot von 10 μl PCR-Produkt wurde in einem gesamten Volumen von 20 μl 1X Reaktionspuffer gemäss den Anweisungen des Herstellers verdaut. 2 μl restriktktionsenzymverdautes PCR-Produkt wurde mit 2 μl Ladepuffer gemischt und der SSCP-Analyse unterworfen, wie oben beschrieben wurde.
DNA-Sequenzierung von PTCH-Exonen
Exonische PCR-Produkte, die veränderte Mobilitäten durch SSCP-Analyse zeigten, wurden mit im Handel erhältlichen Säulen gereinigt (Wizard^TM PCR-Säulen, Promega). PCR-Produkte wurden elutiert in 20 μl TE und 2 μl für DNA Thermosequenase^TM (Amersham International plc) Zyklussequenzierung nach Angaben des Herstellers benutzt. Sequenzierungsprimer wurden end-etikettiert mit γ^32P ^A-TP (3000 Ci/mmol) unter Verwendung von T4 Polynukieotid-Kinease. DNA-Sequenzierungsreaktionen wurden fraktioniert in 6% w/v Polyacrylamid/8M Harnstoff/1×TBE-Gels während 2 Stunden bei 2000 V. Die Gels wurden unter Vakuum getrocknet und während 8 Stunden bei Raumtemperatur mit Intensivierungsschirmen autoradiographiert.
Ergebnisse
Keratozysten-DNA von insgesamt 16 NBCCS-Patienten wurden mittels SSCP-PCR untersucht. 10 einzelne exonische PCR-Produkte, die veränderte elektrophoretische Mobilitäten zeigten, wurden erkannt und durch DNA-Analyse weiter analysiert. Zudem wurden auch Variantenbänder in mehrfachen Proben (d.h. die auf gewöhnliche Polymorphismen deuten) in PCR-Produkten gesehen, die 4 Exone umfassen.
Vier Mutationen wurden erkannt nach direkter DNA-Sequenzierung von PCR verstärkten Exonen, die SSCP-Variantenbänder aufweisen. In den restlichen 6 Varianten-PCR-Produkten konnten keine Mutationen entdeckt werden. Darum wurden alle 23 Exone von den Proben, in denen keine Mutation identifiziert wurde, verstärkt und gesamthaft sequenziert. Jedoch wurde mit dieser Methode nur eine zusätzliche Mutation erkannt.
Exon 5 693 insC
Es wurde bei einem 42 Jahre alten NBCCS-Patienten eine einzelne Cytosin-Restinsertion in Position 693 entdeckt. Diese führt eine Rahmenschiebungs-Mutation ein durch Schaffung eines vorzeitigen Stopcodons beim Aminosäurerest 252. Diese Mutation schafft auch einen BstNI Restriktionsenzymort. DNA vom Patienten und 4 nicht betroffenen Familienmitgliedern wurde vergrössert und restriktionsenzymverdaut mit BstNI. Wie vorausgesagt, wurde nur das Produkt vom NBCCS-Patienten vom Restriktionsenzym geschnitten.
Exon 17 2988 delBbp
Nach Hinfl Restriktionsenzymverdauung von Exon 17 PCR-Produkten und SSCP-Analyse wurden 2 Variantenbänder festgestellt. Direkte DNA-Zyklus-Sequenzierung dieser Amplicons zeigte 2 Mutationen auf. Eine 8bp-Löschung wurde in DNA von einem 12 Jahre alten NBCCS-Patienten erkannt. Diese Rahmenverschiebungsmutation führt ein Stopcodon beim Aminosäurerest 1141 ein. Der Patient hatte Makroenzephalie, Hypertelorismus, suraorbitale Grate, Prognathismus, plantare, aber nicht palmare Grübchen und eine zusätzliche Brustwarze. Zudem war beim Patienten im Alter von 10 Jahren 3 maxillare und mandibulare odontogene Keratozysten operativ entfernt worden.
Exon 17 3014 insA
Eine Adenosininsertion bei Basis 3014 wurde bei einem 19 Jahre alten weiblichen NBCCS-Patienten erkannt. Dies bewirkt eine Rahmenverschiebungsmutation (Thyrosin bis STOP) Codon bei Aminosäurerest 1009. Dieser Patient hatte frontale Beulen, Hypertelorismus, Falx-Kalzifikation, bifide 3., 4., 5. und 6. Rippen und hatte sich einer Enukleation von 5 maxillaren und mandibularen odontogenen Keratozysten unterzogen.
Exon 21 3538 delG
Eine Guanosinbasislöschung im Rest 3538 wurde bei einem 39 Jahre alten NBCCS-Patienten erkannt. Diese Rahmenverschiebungsmutation führt ein Stopcodon beim Aminosäurenrest 1190 ein. Die kausale Beschaffenheit der Mutation wurde durch Analyse von DNA vom Vater der Probandin bewiesen, von dem sie die Krankheit geerbt hatte. Direkte DNA-Sequenzierung von Exon 21 vom Vater zeigte auch eine Guanosinbasenlöschung beim Rest 3538 auf.
Exon 22 G4302T
Direkte DNA-Sequenzierung von 23 Exonen von einem 30 Jahre alten NBCCS-Patienten zeigte eine G-T-Substitution beim Nukleotid 4302 auf. Dies verursacht eine Glutaminsäure zu Aspartinsäure (E – D) Substitution beim Aminosäurerest 1438. Es wurde bestätigt, dass der Patient ein NBCCS-Fall ist und dass bei ihm 11 Basalzellenkarzinome entfernt wurden.
PTCH Gen-Polymorphismen
Die Erfinder beobachteten durch Verwendung der beschriebenen SSCP-Bedingungen Polymorphismen in von Exonen 6, 11, 14 und 15 vergrösserten PCR-Produkten. Keine DNA-Sequenzänderungen wurden nach der Analyse der exonischen Sequenzen erkannt. Darum ist es wahrscheinlich, dass diese intronische DNA-Sequenzpolymorphismen darstellen. Zudem wurde ein exonischer DNA-Sequenzpolymorphismus (C306T) im Exon 2 aufgedeckt. Diese Basensubstitution wurde auch in DNA vom Probanden LDI-1 beobachtet, bei dem bereits eine „kausative" 3528deIG-Mutation identifiziert wurde, sowie andere, nicht verwandte NBCCS-Patienten.
Bei diesem Beispiel identifizierten die Erfinder 5 neuartige Germline-Mutationen von Patienten mit der NBCC-Zelle, was übereinstimmt mit der Rolle von Patched als menschliches Tumor-Suppressorgen. Vier Mutationen verursachen Rahmenverschiebungs- oder non-sense-Mutationen, die ein abgeschnittenes PTCH-Protein zur Folge haben. Die fünfte Mutation ist eine Substitution von Glutamin- zu Aspartinsäure nahe am 3'-Carboxyl-Terminus des PTCH-Proteins. Dies war die einzige Rasenänderung, die nach direkter DNA-Sequenzierung aller 23 PTC-Exone vom Patienten Nr. 5 erkannt wurde. Obschon dies eine konservative Aminosäurensubstitution darstellt und deshalb ein Poiymorphismus und nicht eine Mutation sein kann, wird dieser Glutaminsäurerest zwischen menschlichen, Mäuse- und Hühner-PTCH-Proteinen erhalten und ist wahrscheinlich funktional wichtig.
Beispiel 4
Mutationen des PTCH-Gens in NBCCS definieren klinischen Phänotvp
Das Beispiel 3 definierte Mutation in Individuen mit NBCC-Symdrom. In diesem Beispiel werden weitere Mutationen identifiziert.
Materialien und Methoden
Die Patienten wurden nach den Kriterien von Shanley et al. (1994) diagnostiziert. Siebzig NBCCS-Patienten wurden durch Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus (SSCP)- und Heteroduplex-Analyse, wie vorher beschrieben wurde (Hahn et al., s. oben) mit Primern für alle codierenden Exone ausser Exon 1b (Alternatives erstes Exon), vollständig analysiert. Primersequenzen waren wie weiter oben und von Hahn et al. (1996) beschrieben mit Ausnahme der Exone 12, 12b und 20. Exon 12b ist ein zusätzliches Exon, das aus der Entdeckung resultiert, dass Exon 12 (Hahn et al. 1996) aus zwei verschiedenen Exonen besteht. Das PTC-Gen besteht deshalb aus 23 codierenden Exonen. Wo möglich wurde DNA auch von den Eltern von Fällen analysiert, bei denen PTC-Mutationen gefunden wurden, um auf molekularer Ebene zu bestimmen, ob die Mutation sporadisch oder familiär war. Proben, die SSCP-Varianten zeigten, wurden sequenziert wie früher beschrieben wurde (Wickering et al. (1997) Am. J. Hum. Genet. 60: 21-26).
Vaterschaftstests wurden mit Mikrosatellitenmarkern bei den Eltern der acht sporadischen Fälle mit Fluoreszenzprimern und Genescan durchgeführt.
Ergebnisse
PTCH-Mutationen wurden in insgesamt 32 NBCCS-Fällen identifiziert. Achtundzwanzig davon werden im Beispiel 3 beschrieben. Dieses Beispiel stellt vier neuartige Mutationen vor (Tabelle 5): Von diesen sind drei Rahmenverschiebungsmutationen und eine ist eine putative Spleissungsvariante. Die Erfinder haben deshalb PTCH-Mutationen in 32/70 (46%) NBCCS-Fällen durch die Analyse aller Exone ausser Exon 1b erkannt. Die Mehrzahl davon (27/32, 84%) sind Protein terminierende Mutationen. Zudem wurden acht sporadische Fälle durch die Abwesenheit der relevanten, mit der Krankheit zusammenhängenden Mutation bei beiden Eltern identifiziert (Tabelle 6). Vaterschaftstests wurden in acht Fällen mit Mikrosatellitenmarkern durchgeführt und bei keinem wurde eine Inkonsistenz identifiziert.
Dieses Beispiel stellt acht Individuen mit NBCCS vor, bei denen die Erfinder nachgewiesen haben, dass sie Mutationen im PTCH-Gen tragen. In allen Fällen trug der Elternteil die krankheitsbezogene Mutation nicht und eine Nicht-Vaterschaft wurde durch die Analyse von hoch informativen MIkrosatellitenmarkern als unwahrscheinlich nachgewiesen. Zudem berichten die Erfinder über vier NBCCS-Individuen mit Germline-PTCH-Mutationen. Drei von vier davon würden eine vorzeitige Proteinabschneidung zur Folge haben.

Die Fähigkeit, den diagnostischen Status von Verwandten von NBCCS Fällen durch DNA-Analyse zu bestätigen, ermöglicht eine weitere Definiti an der klinischen und radiologischen Kriterien, die für die Diagnose von NBCCS benutzt werden. Von den acht NBCCS-Individuen, bei denen in dieser Studie nachgewiesen wurde, dass sie neue Mutationen im PTCH-Gen haben, stellten nur zwei (JRN250, DD25) gestützt auf klinische und radiologische Untersuchung bei der Eltern klar sporadische Fälle dar. In einem Fall (JHK551) wurde kein Elternteil untersucht. In allen anderen Fällen zeigte mindestens ein Elternteil ein mit NBCCS assoziiertes Merkmal wie multiple BCCS, einen hoch gebogenen Gaumen oder Makrozephalie. Tabelle 5. PTCH Mutationen bei NBCCS-Individuen

Patient	Exon	Mutation	Wirkung auf die Codierung
JK211	12	1711insC	Rahmenverschiebung, Abschnitt
M6229	12	1639insA	Rahmenverschiebung, Abschnitt
CW424	16	2707delC	Rahmenverschiebung, Abschnitt
NB88	Intron 17	3157-2A->G	Putative Spleissungsvariante

Tabelle 6. Mutationen von PTCH bei NBCSS-Patienten

Patient	Mutation	Wirkung	Elterlicher Phänotyp
DD25	C2050T	Unsinn	Beide Eltern klinisch und radiologisch negativ, aber multiple BCC in Geschichte von Grossmutter.
JHG547	C391T	Unsinn	Vater hatte> 10 BCCS von der 6. Dekade, aber radiologisch negativ. Mutter klinisch und radiologisch negativ.
BK273	244delCT	Rahmenv.	Vater hat hohen gebogenen Gaumen, Makrozephalie und dichte falzine Kalzifizierung (Alter 53) aber unter dem maximalen biparietalen Durchmesser. Die Mutter klinisch und radiologisch negativ.
JHK551	271 insA	Rahmenv.	Negative Familiengeschichte, aber kein Elternteil untersucht.
JRN250	929delC	Rahmenv.	Beide Eltern klinisch und radiologisch negativ.
MP264	2183delTC	Rahmenv.	Vater hat hohen gebogenen Gaumen, Makrozephalie und drei „Grübchen" auf den Fusssohlen, aber radiologisch negativ. Mutter klinisch und radiologisch negativ.

Fortsetzung

Patient	Mutation	Wirkung	Elterlicher Phänotyp
KS356	2583delC	Rahmenv.	Vater hat drei unbestätigte BCC (Alter 65), aber radiologisch negativ. Mutter klinisch negativ. Keine radiologischen Untersuchungen.
3K211	1711insC		Vater hat hohen gebogenen Gaumen und hatte ungefähr 20 BCC (ab Alter 70), aber auch multiple Solar-Keratosen, Keratokanthome und schwammige Zellkarzinome. Er ist radiologisch negativ. Mutter klinisch und radiologisch negativ.

Beispiel 5
Medulloblastome der desmoplastischen Variante tragen Mutation des menschlichen Ptc-Gens
Bei diesem Beispiel entdeckten die Erfinder nicht konservative PTC-Mutationen in drei von 11 sporadischen Fällen von desmoplastischen Medulloblastomen (Mb), aber keine bei 57 Tumoren mit klassischer (nicht desmoplastischer) Histologie. Diese Feststellungen deuten darauf hin, dass PTC ein Tumorsuppressorgen repräsentiert, das bei der Entwicklung der desmoplastischen Varianten von MB mitwirkt.
Materialien und Methoden
Patient und Tumore, Zellenlinien
Es wurden insgesamt 68 Medulloblastom-Proben analysiert. 64 Proben wurden aus MB-Tumoren gewonnen und 4 aus den vorher beschriebenen Medulloblastom-Zellenlinien D283Med, D341Med, Daoy und MHH-MED-1 (Pietsch et al. (1994) Cancer Res. 54: 3278-3287). Bei zwei Patienten waren die Erfinder imstande, sowohl die primären als auch die rekurrierenden Tumore zu studieren.
Konstitutionelle DNA aus peripheralem Blut war bei 40 Patienten erhältlich. DNA-Proben aus peripheralem Blut von gesunden kaukasischen Freiwilligen wurden zur Kontrolle verwendet. Es wurde eine Probe von normalem Cerebellum analysiert. Dieses Biopsiemuster stammte von einem erwachsenen Patienten mit cerebellarer vaskulärer Missbildung und wurde nach der histopathologischen Prüfung als normal befunden. Das Alter der Patienten reichte von 1 Monat bis 59 Jahren. Davon waren 46 männlich und 20 weiblich. Keiner der Patienten hatte klinische Anzeichen von NBCCS oder Verwandte ersten Grades mit NBCCS. Alle Tumore wurden nach der revidierten WHO-Klassifikation von Hirntumoren mit standardmässigen histologischen Methoden, einschliesslich HE und Reticulinflecken und immuno-histochemischen Reaktionen (Kleinhues et al. (1993) Histological typing of tumours of the central nervous system, Springer Verlag, New York) diagnostiziert. Die Differenzierung wurde durch Immunofärbung für embryonale neurale Zelladhäsion Molekül (NCAM), neuron-spezifische Enolase, Synaptophysin und glialsaures fibrillares Protein beurteilt. Gefrorene Tumorproben wurden im Zeitpunkt der chirurgischen Resektion gewonnen, schnappgefroren in flüssigem Stickstoff und bei –80°C gelagert.
DNA-Extraktion, LOH-Analyse
Tumorsegmente wurden nach sorgfältiger Untersuchung für die Extraktion von entsprechenden gefrorenen Abschnitten von DNA ausgewählt, um kontaminierende neurotische Trümmer oder normales zerebrales Gewebe auszuschliessen und um die histologischen kennzeichnenden Eigenschaften der Tumore zu bestimmen. DNA wurde durch Standard-Proteinase-K-Verdauung und Phenol-Chloroform-Extraktion (Albrecht et al. 1994) extrahiert. Der Verlust von Heterozygosität wurde durch Mikrosatellitenanalyse mit den Markern D9S287 und D9S197 bestimmt, die mit dem PTC-Gen leicht verknüpft waren und mit zwei zusätzlichen Markern auf 9q (D9S302, D9S303), im wesentlichen so, wie vorher beschrieben wurde (Albrecht et al., (1994) Neuropathol. Appl. Neurobiol. 20: 74-81; Kraus et al. (1996) Int. J. Cancer 67: 11-15).
SSCP-Analyse und DNA-Sequenzierung
Die SSCP-Analyse der Exone 2-22 wurde mit Hilfe von 22 Primerpaaren (frühere Beispiele und Hakin et al., 1996) durchgeführt. PCR enthaltend 50 mM KCl, 1.0-2.5 mM MgCl₂, 10 mM Tris-HCl (pH 8.5), 0.01% w/v Gelatine und 200 mM einer jeden dNTP, 2 μM der Primer und 0.25 Einheiten Taq-Polymerase (Gibco-BRL) auf einem Uno Thermoblock^TM Zykler (Biometra). Die Produkte wurden auf Polyacrylamid-Gels mit verschiedenen Acrylamid-Konzentrationen und Acrylamid-Bisacrylamid-Verhältnissen analysiert. Die Gelzusammensetzung und Elektrophoresebedingungen wurden für jedes einzelne Primerpaar optimiert. Die Einzel- und Doppelstränge wurden durch Silberfärbung visualisiert, wie vorher beschrieben wurde (Albrecht et al., 1994). PCR-Produkte, die eine Gelmobilitätsverschiebung zeigten, wurden aus dem nassen Gel ausgeschnitten, eluiert (Koch et al., 1996) und nochmals durch PCR mit den gleichen Primern vergrössert. Die entstehenden Produkte wurden mit Spin-Säulen (Qiagen^TM quick sein) gereinigt und 20 ng benützt für Zyklussequenzierung mit dem Fluoreszenz-Dideoxy-Terminatorkit (ABI). Die Produkte wurden auf einem DNA-Sequenzierer Applied Biosystems Modell 373A analysiert.
Isolation von RNA, quantitative RT-PCR für PTCN mRNA.
Die totale zelluläre RNA wurde durch Lysis in Guanidium Isothiocyanat und Ultrazentrifugierung durch ein Zäsiumchloridkissen (Koch et al., 1996) oder Extraktion mit dem Trizol^TM Reagens (Gibco-BRL) nach den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Es wurden wiederum Proben durch Histologie gefrorener Schnitte voruntersucht, um das histopathologische Aussehen des Musters zu dokumentieren. Kontaminierende restliche genomische DNA wurde durch Verdauung mit RNAse-freier DNAse (Boehringer) entfernt. RNA Standards mit internen Löschungen für menschliche PTC und den haushaltenden Genen β₂-microglobulin und GAPDH wurden durch in vitro-Mutagenese und in vitro-Transkription (Norton und Pease (1991) in – Direct Mutagenese-A practical Approach, McPherson, ed., S. 217-247 (IRL Press, Oxford) generiert. Um eine semiquantitative Beurteilung zu erzielen, wurden vorevaluierte Mengen der spezifischen Standards-RNA, welche den äquimolaren Bereich der entsprechenden mRNA-Transkripte überdeckten, zu den MB Proben-RNA hinzugefügt, die dann mit Hilfe des SuperScript^TM Vorverstärkungssystems (Gibco-BRL) umgekehrt transkribiert wurden mit Zufalls-Hexameren als Primer in einem endgültigen Volumen von 10 μl. 0.5 μl der cDNA wurden als Schablone in RT-PCR-Reaktionen für die Verstärkung von PTCN und die haushaltenden Gene verwendet. Die verwendeten Primer waren: PTCN, 5'ACATGTACAACAGGCAGTGG-3 [SEQ ID NR: 61] und 5'-GCAAGGAGGTTTACCTAGG-3' [SEQ ID NR. 62], Produktgrösse, wilder Typ 192bp, Standard 182 bp; GAPDH, 5'-TGCCAAGGCTGTGGGCAAGG-3' [SEQ ID NR.63] und 5'-GCTTCACCACCTTCTTGATG-3' [SEQ ID NR:64] Produktgrösse, wilder Typ 152bp, Standard 142bp, β₂-microglobulin, 5'-GCTGTGACAAAGTCACATGG-3' [SEQ ID NR:65] und 5'-GATGCTGCTTACATGTCTCG-3' [SEQ ID NR. 66], Produktgrösse, wilder Typ 148bp, Standard 130bp. Einer der Primer für jedes Gen wurde mit einem fluoreszierenden Farbstoff etikettiert. Alle Primer wurden aus angrenzenden Exonen ausgewählt, welche die intronischen Sequenzen übergreifen, um von restlicher genomischer DNA verursachte Signale der cDNA-Produktgrösse zu vermeiden. Die PCR-Produkte wurden abgetrennt und auf einem DNA-Sequenzierer Applied Biosystems Modell 373 mit der Genescan-Software (ABI) analysiert. Die Expressionsniveaus der einzelnen Gene wurden aus den Signalverhältnissen der Proben zu den Standards berechnet. Die relative Expression von PTCH mRNA zu den haushaltenden Genen wurde als das Verhältnis der entsprechenden Expressionsniveaus definiert (10).
Das menschliche PTCH-Gen erstreckt sich über 34 kB und hat mindestens 23 Exone. Die SSCP-Untersuchung von DNA-Proben von 68 sporadischen MB zeigte bei 6 Proben Bandverschiebungen auf (Tabelle 7). Drei von diesen wurden als stille Polymorphismen identifiziert. Bei drei Tumoren wurden die Varianten in der entsprechenden Germline-DNA oder in normalen Kontroll-DNA-Proben nicht gefunden. Zwei Mutationen in den Exonen 6 beziehungsweise 10 bewirkten eine Rahmenverschiebung mit vorzeitigem Abschnitt des Proteins (Tabelle 7 und 9). Die dritte Mutation (D86) war ein Sechsbasenpaar in Rahmenlöschung im Exon 10, die die Löschung von zwei Aminosäuren in der Transmembranregion 3 auslöste. Die Löschung kann signifikante strukturelle Veränderungen des PTCH Proteins zur Folge haben und kann zu einem Funktionsverlust führen. Das war bei den Tumoren D86 und D322 der Fall, die LOH wie auch mutierte PTC-Allele zeigten. Im Fall D292, ohne erkennbare LOH bei 9q, wurde nur eine einzelne SSCP-Bandverschiebung (im Exon 10) festgestellt. Mutationen des anderen Allels können vorhanden sein, wurden aber möglicherweise von der SSCP-Untersuchung wegen der beschränkten Empfindlichkeit von SSCP nicht erkannt. Es wurden nur die codierenden Exone untersucht, so dass Mutationen in anderen Regionen wie regulatorischen Bereichen mit diesem Ansatz nicht identi fiziert worden wären. Eine systematische Sequenzierungsanalyse könnte zusätzliche PTCH-Mutationen in Mb aufdecken.

Bei diesem Beispiel wurden Mutationen in einer verschiedenartigen histopathologischen Variante oder Medulloblastomen (Mb), den so genannten modularen oder „desmoplastischen" MB, festgestellt. Gemäss der WHO-Klassifikation ist diese Variante durch Inseln niedrigerer Zellularität, umgeben von dicht gepackten, hoch proliferativen Zellen gekennzeichnet, die ein dichtes interzellulares Reticulin-Fasernetz erzeugen. Die häufigere „klassische" MB hat dieses nodulare Aussehen und Reticulinmuster nicht. Tabelle 7. Mutationelle Analyse des PTCH-Gens in Medulloblastomen

a. Mutationen
Tumor	MB-Variante	Ater/Geschl.	LOH auf 9q	Exon	Nukleotidänderung	Proteinänderung
D 86	Desomoplastisch	4 J., männlich	ja	10	1444de16	del Glv-Leu
D292	Desomoplastisch	1 J., weiblich	nein	10	1393insTGCC	Rahmenversch.
D322	Desomoplastisch	51 J., männlich	ja	6	887delG Abschn.	Rahmenversch.
b. Polymorphismen
Tumor	MB-Variante	Alter/Geschl.	LOH auf 9q	Exon	Nukleotidänderung	Proteinänderung
D230 11	klassisch	13 J., weiblich	nein	13	C2037T	nein
D338	klassisch	13 J., männlich	n.z.	2	C306T	nein
D358	klassisch	10 J., weiblich	n.z.	2	C306T	nein

Tabelle B. Expression des PTCH-Gens in Medulloblastomen

Muster	MB-Subtyp	LOH auf 9q	PTCH Mutation erkannt durch SSCP	mRNA-Expression Verhältnis PTCH/GAPDH	mRNA-Expression Verhältnis PTCH/β2-microglobulin
D 338	klassisch	n.z.*	nein	5.8 (3.9-7.4)**	10.3 (8.2-14.2)
D 230 II	klassisch	nein	nein	1.7	n.z.
D 286	klassisch	n.z.	nein	1.2	n.z.
D 245 II	klassisch	nein	nein	0.7	n.z.
D 446	klassisch	nein	nein	0.8(0.8-2.8)	1.5 (1.0-1.8)
D 447	klassisch	nein	nein	0.6	n.z.

D 86	desmoplastisch	ja	ja, Exon 10	3.6 (1.4-5.4)	2.6 (1.7-3.9)
D 292	desmoplastisch	nein	ja, Exon 10	0.6 (0.6-0.6)	0.3(0.3-0.4)
D 322	desmoplastisch	ja	ja, Exon 6	1.1	n.z.
D 448	desmoplastisch	ja	nein	4.3 (3.3-5.5)	2.9 (2.5-3.6)
D 398	desmoplastisch	nein	nein	26.5 (22.4-30.0)	18.4 (12.0-24.4)
D 444	desmoplastisch	ja	nein	4.1 (3.7-4.7)	4.5 (3.3-5.5)
D 365***	desmoplastisch	n.z.	nein	0.3 (0,2-0.4)	0.1 (0.1-0.2)

Cerebellum	-	n.z.	n.z.	2.5 (1.55-3.64)	1.76 (1.42-2.9)
* n.z. nicht analysiert; Mittelwert und Bereich der relativen Expression (analysiert durch semi-quantitative RT-PCR); * D365, Zellenlinie Daoy

Beispiel 6
Die meisten Germ Line-Mutationen im NBCCS-Gen führen zu einer vorzeitigen Termination des PATCHED-Proteins
Bei diesem Beispiel untersuchten die Erfinder DNA-Proben von 71 nicht verwandten Individuen auf Mutationen in den PTCH-Exonen mit Hilfe der Einstrang-Konformations-Polymorphismus-Analyse (SSCP). Insgesamt wurden durch direkte Sequenzerung von PCR-Produkten 28 Mutationen identifiziert und charakterisiert. Die Mehrzahl dieser Mutationen (86%) führen zu einer vorzeitigen Abschneidung des PTCH-Proteins. Eine Analyse des Phänotypen bei Individuen mit abschneidenden Mutationen ergaben keine nennenswerte Korrelation zwischen Genotyp und Phänotyp bei NBCCS.
Materialien und Methoden Probanden und Proben
Die Patienten, von denen die meisten aus Australien und Neuseeland stammten, wurden nach den Kriterien in Shanley et al. (1994) s. oben diagnostiziert. Von den 71 analysierten NBCCS-Patienten zeigten 25 klare familiäre Präsentation und 46 sind scheinbar sporadisch.
SSCP Analyse
Es wurde eine kombinierte SSCP- und Heteroduplex-Analyse durchgeführt wie vorstehend beschrieben wurde (Hahn et al. (1996) s. oben). DNA von 71 nicht verwandten NBCCS-Individuen wurde mit Primern auf alle ausser Exon 1b (alternatives erstes Exon, homolog zu Mäuse-Exon 1), 12 und 20 (für welches annehmbare Primer noch nicht erhältlich sind) des menschlichen PTCH-Gens vergrössert. Die Primersequenzen und Bedingungen waren so, wie weiter oben beschrieben wurde, sowie nach (Hahn et al. (1996) s. oben).
Sequenzierung
DNA von Proben, die SSCP-Varianten zeigten, wurden nochmals für eine automatisierte Sequenzierung mit PCR Spinclean^TM-Säulen (Progen Industries) vergrössert und gereinigt. Die DNA-Konzentration wurde durch Agarosegel-Elektrophorese sicher bestimmt und für jeden Sequenzierungsdurchlauf 25-35 ng Produkt wurden benützt. Die Zyklussequenzierung wurde mit Hilfe der FA Polymerase und farbetikettierten Terminatorchemie (Perkin Elmer Cetus) durchgeführt und Muster wurden auf einem Elektrophoreseapparat PEC 373A analysiert. Wo Mutationen durch manuelle Sequenzierung bestätigt wurden, wurden die Produkte in GEM-T-Vektor (Promega) verbunden und die entstehenden Klone wurden mit einem T7 Sequenzierungskit (Pharmacia) sequenziert.
Southern-Analyse
Wie vorher beschrieben (Chennevix-Trench et al. 1992) wurden mit EcoR1 und HindIII Restriktionsenzymen Southern-Blots angefertigt und mit PTCH cDNA-Sonden 136 und 16C hybridisiert.
Statistische Analyse
Für die Untersuchung von Genotyp-Phänotyp-Assoziazionen wurde die lineare Regressionsanalyse benutzt.
Ergebnisse
Identifizierung von PTCH-Mutationen
DNA von 71 Individuen mit NBCCS wurden mit einer kombinierten SSCP/Heteroduplex-Analyse auf Mutationen im PTC-Gen untersucht. Gestützt auf eine Sequenzierung von Proben, die SSCP-Variation zeigen, wurden 28 putative, mit der Krankheit zusammenhängende Mutationen voll charakterisiert (Tabelle 9). Währenddem eine Mutation, nämlich eine CT-Löschung bei der Nukleotidposition 244, bei 3 scheinbar nicht verwandten Individuen beobachtet wurde, wurden alle anderen Mutationen nur in einer einzelnen NBCCS-Familie erkannt. Es wurde keine Clusterbildung von Mutationen beobachtet, wobei Mutationen in den meisten Exonen und in Positionen identifiziert wurden, die allen grossen Bereichstypen des PTC-Proteins entsprechen (11).
Von den meisten (24/28, 86%) der erkannten Mutationen wird vorausgesagt, dass sie, entweder durch Einführung eines Stopcodons oder durch Rahmenverschiebung durch Einfügung oder Löschung, eine Abschneidung des PTCH-Proteins zur Folge haben (Tabelle 9). Von zwei Mutationen wurde vorausgesagt, dass sie aufgrund der Tatsache, dass eine davon einen Konsens-3'-Spleissort verändert, Spleissungsvarianten sind, wogegen die andere eine Einfügung von 21 bp in Intron 10, 8bp vor dem Start von Exon 11, bewirkte. Von dieser zweiten Mutation wurde angenommen dass sie,, gestützt auf die Tatsache, dass sie die Verzweigungsstelle von der Position 27 um 48bp vor der 3'-Spleissungsstelle verschiebt, aberrante Spleissung verursacht. Diese 7bp Konsenssequenz befindet sich generell ungefähr 18 bis 37 bp vor der Spleissstelle, und deren Lage wird als wichtig für die Spleissungsreaktion betrachtet. Die beiden übrigen Mutationen sind Missense-Mutationen, die beide Reste mit Transmembran-Bereichen im PTCH-Protein verändern. Eine (PP) ist eine Transversion von TAT zu TAT beim Nukleotid 1525, die im vierten Transmembranbereich ein Tyrosin gegen ein Apartat austauscht. Die andere (RS) ist eine Transversion eines GGC zu CGC beim Nukleotid 3193, die ein Arginin gegen ein Glycin im neunten Transembranbereich des PTCH-Proteins austauscht.
Zusätzlich zu krankheitsbezogenen Mutationen waren mehrere Varianten, gestützt auf ihr Vorhandensein bei nicht betroffenen Individuen oder die Feststellung, dass die darunter liegenden Sequenzänderungen die codierten Aminosäuren nicht veränderten, designierte Polymorphismen. Bei Proben, bei denen keine SSCP-Variation gefunden wurde, wird die Sequenz der einzelnen PTC-Gene gegenwärtig bestimmt. DNA von 38 Patienten, bei denen keine Mutation in SSCP gefunden wurde, wurde ebenfalls durch Southern-Analyse mit Proben, die das Gen übergreifen, untersucht. Bei zwei Patienten wurden Varianten festgestellt. In jedem Fall wurde ein zusätzliches Band (3, bzw. 3.75 kb) auf HindIII-Blots gesehen. Bei diesen Individuen waren auf EcoRI, BamHI und PST I Digests keine Varianten vorhanden. Darum ist es unwahrscheinlich, dass die auf HindIII-Blots festgestellten grobe Umstellungen darstellen. Die Wahrscheinlichkeit, dass min destens eine dieser Varianten eine krankheitsbezogene Punktmutation ist, wird durch deren Segregation mit Krankheit in einer Familie vergrössert. Im Fall der zweiten Variante standen keine Familienangehörigen zur Verfügung. Die darunter liegenden Mutationen müssen bei diesen Individuen noch ermittelt werden.
Analyse de Genotyp-Phanotyp-Assoziationen
Obschon von den meisten der bis heute gefundenen Mutationen vorausgesagt wird, dass sie das Protein beschneiden, muss immer noch ermittelt werden, ob alle dessen Funktion entfernen. Um sich damit zu befassen, wurde, gestützt auf die 24 Familien mit proteinbeschneidenden Mutationen, eine vorläufige Analyse der Genotyp-Phänotyp-Assoziationen bei diesem komplexen Syndrom durchgeführt. Es wurden verschiedene Aspekte des NBCCS-Phänotyps als ungefähre Parameter der Schwere der Krankheit benutzt. Die Erfinder untersuchten die Anzahl der grösseren Merkmale (BCC, Kieferzysten, Grübchen und falzine Kalzifizierung), die bei Individuen im Zeitpunkt der Diagnose festgestellt wurden, das Alter, in dem beim Individuum BCC auftrat und das Alter, in dem Kieferzysten beobachtet wurden. Unter 20 Jahre alte Probanden wurden wegen der altersabhängigen Expression dieser Merkmale nicht in die Studie eingeschlossen. Auf ähnliche Weise wurde die Analyse des Alters beim Auftreten von BCC auf Australasische Patienten beschränkt, um den Einfluss der Ultraviolett-Exposition auf die Förderung der Entwicklung von BCC zu begrenzen. Wenn bekannt war, dass eine Mutation bei einer Anzahl Individuen in einer Familie vorhanden ist, wurden die phänotypischen Daten von allen relevanten Familienangehörigen gemittelt. Es wurde keine Korrelationen zwischen dem Alter des Auftretens von BCC (R² = 0.001) oder Kieferzysten (R² d = 0.023) oder der Anzahl grösserer Merkmale (R = 0.015) und der Nukleotidposition der Mutation festgestellt, was anzeigt, dass mindestens für diese Merkmale keine klare Korrelation zwischen dem Phänotyp und der Lage der abschneidenden Mutation besteht. Obschon es wegen der kleinen Anzahl der Mutationen vom letztgenannten Typ nicht angemessen war, statistische Analysen zu benutzen, um abschneidende Mutationen mit Missense und Spleissungsvarianten zu vergleichen, zeigen die Individuen, welche die Erfinder mit Missense- und Spleissungsmutationen analysiert haben, einen klassischen NBCCS-Phänotyp und könnten nicht als nur in mildem Ausmasse betroffen klassifiziert werden.
Die Phänotypen von Individuen in den drei Familien, die eine gemeinsame Mutation (244delCT) teilen, wurden bewertet und es zeigte sich, dass sie beträchtlich variieren. Alle fünf betroffenen Angehörigen der Familie CB hatten eine Spalte oder einen sehr hoch gebogenen Gaumen, aber das wurde bei den HC- oder BK-Familien nicht beobachtet, die beide den typischen Bereich von NBCC-Merkmalen aufweisen. Das lässt vermuten, dass die molekulare Beschaffenheit der PTC-Mutation nicht ganz für den Phänotyp in NBCCS verantwortlich ist. Interessanterweise trägt BK eine neue Mutation von PTC, darum muss diese Mutation mindestens zwei Mal aufgetreten sein.

Die Erfinder haben Mutationen im PTC-Gen bei 28 nicht verwandten Individuen mit NBCCS gefunden und keinen Beweis für eine Assoziation zwischen Genotyp und Phänotyp festgestellt. Bei 24 Familien mit proteinbeschneidenden Mutationen wurde keine signifikante Korrelation zwischen Phänotyp und Lage der abschneidenden Mutation gefunden. Das weicht von Brust- und Eierstockkrebs ab, wo 3' Mutationen im BRCA 1-Gen weniger wahrscheinlich für Eierstockkrebs anfällig machen als 5'-Mutationen, vermutlich wegen restlicher Aktivität von aus 3'-Mutationen entstehenden Proteinen. Tabelle 9. Germ-Line-Mutationen im PTC-Gen bei NBCCS-Individuen

PATIENT^a	EXON	MUTATION	WIRKUNG AUF CODIERUNG^c
	Unsinn
PP (S)	11	G1525T	D-Y bei d513
RS (S)	18	G3193C	G-R bei 1069
JHG (S)	3	C391T	R-X bei 135
JM (F)	8	G1148Ad	W-X bei 387
TM (S)	10	G1368A	W-X bei 460
DD (S)	13	C2050T	Q-X bei 688
BH (S)	13	C2068T	Q-X bei 694
PB (F)	17	C3015A	Y-X bei 1009
Einfügungen, Löschungen und Duplizierungen
HC, CB(F); BK(S)^c	2	244delCT	Rahmenverschiebung
JHK (S)	2	271insA	Rahmenverschiebung

Fortsetzung

GS (S)	3	464insAC	Rahmenverschiebung
MC (F)	8	804del37d	Rahmenverschiebung
JRN (S)	6	929delC	Rahmenverschiebung
DS (F)	10	1370de176	Rahmenverschiebung
PATIENT^a	EXON	MUTATION	WIRKUNG AUF CODIERUNG^c
CM (S)	11	1497dup8	Rahmenverschiebung
MP (F)	13	2183delTC	Rahmenverschiebung
TH (F)	14	2320insA	Rahmenverschiebung
LK (S)	14	2392delA	Rahmenverschiebung
DC (S)	15	2574delA	Rahmenverschiebung
KS (S)^c	15	2583delC^d	Rahmenverschiebung
WS (F)	15	2596komplex^f	Rahmenverschiebung
DE (F)	16	2748ins C	Rahmenverschiebung
JRD (F)	16	2749dup7	Rahmenverschiebung
JW (S)	19	3352delAT	Rahmenverschiebung
Spleissung
AE (F)	Intron 7	A1055-2C	3' Spleissstelle
IMc (S)	Intron 10	1493-8ins21	Putative Spleissungsvariante
Polymorphismen^g
	2	A oder T bei 312	Keine Veränderung I108
	3	T oder C bei 417	Keine Veränderung T143
	4	A oder G bei 588	Keine Veränderung E200
	5	A oder G bei 723	Keine Veränderung T245
	7	T oder C bei 1023	Keine Veränderung G345
	Intron 10	G oder C bei 1493-39
	Intron 11	A oder T bei 1591+29
	Intron 18	delTT bei 3294+27
	22	T oder C dbei 3933	Keine Veränderung 11315
^aS = sporadische Mutation; F = familiäre Mutation ^b = Gemäss Genbank-Eintragung U43148. ^c = Gemäss Genbank-Eintragung U59464. ^d = Wie vorher berichtet von Hahn et al., 1996. ^e = Sporadische Fälle, bei denen Eltern analysiert wurden und keine Mutation festgestellt wurde. ^f = Komplexer Mechanismus, bei dem Einfügung und Löschung auftritt. ^g = Polymorphismen in Exons 3, 4 und 7 sind selten.

Claims

Isoliertes NBCCS Polypeptid, codiert von einem Tumorsuppressorgen, das mit dem Nävusbasalzellkarzinomsyndrom (NBCCS) und verschiedenen Krebsarten, einschliesslich verschiedener sporadischer Basalzellkarzinome (BCCs), assoziiert ist, wobei das Polypeptid die Aminosäuresequenz SEQ ID NO:60 aufweist.
Isolierte Nukleinsäure, die ein Tumorsuppressorgen codiert, das mit dem Nävusbasalzellkarzinomsyndrom (NBCCS) und verschiedenen Krebsarten, einschliesslich verschiedener sporadischer Basalzellkarzinome (BCCs), assoziiert ist, wobei die Nukleinsäure ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:60 aufweist.
Nukleinsäure nach Anspruch 2, wobei die Nukleinsäure die bei den Nukleotiden 442 bis 4329 der SEQ ID NO:1 dargelegte Sequenz aufweist.
Rekombinanter Vektor, eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 2 oder 3 umfassend.
Wirtszelle, welche die Nukleinsäuren eines der Ansprüche 2 oder 3 oder den Vektor nach Anspruch 4 exprimiert.
Zusammensetzung zur Behandlung eines Nävusbasalzellkarzinomsyndroms (NBCCS) und verschiedener Krebsarten, einschliesslich verschiedener sporadischer Basalzellkarzinome (BCCs), in einem Säugetier, wobei die Zusammensetzung umfasst: (a1) das Polypeptid nach Anspruch 1; oder (a2) die Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 2 oder 3; oder (a3) den Vektor nach Anspruch 4; und (b) einen pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei der pharmazeutisch akzeptable Trägerstoff für die topische oder parenterale Verabreichung an das.Säugetier geeignet ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 6 oder 7, wobei das Säugetier ein Mensch ist.
Verwendung eines isolierten Polypeptids, das von einem Tumorsuppressorgen codiert ist, das mit dem Nävusbasalzellkarzinomsyndrom (NBCCS) und verschiedenen Krebsarten, einschliesslich verschiedener sporadischer Basalzellkarzinome (BCCs), assoziiert ist, für die Herstellung eines Medikaments zur Milderung eines Symptoms des Nävusbasalzellkarzinomsyndroms, oder eines Basalzellkarzinoms oder einer durch Sonneneinstrahlung bewirkten Keratosis in einem Säugetier, wobei das Polypeptid die Aminosäuresequenz SEQ ID NO:60 aufweist.
Verwendung einer isolierten Nukleinsäure, die ein Tumorsuppressorgen codiert, das mit dem Nävusbasalzellkarzinomsyndrom (NBCCS) und verschiedenen Krebsarten, einschliesslich sporadischer Basalzellkazinome (BCCs), assoziiert ist, für die Herstellung eines Medikaments zur Milderung eines Symptoms das Nävusbasalzellkarzinom syndroms oder eines Basalzellkarzinoms oder einer durch Sonneneinstrahlung bewirkten Keratosis in einem Säu-getier, wobei die Nukleinsäure einen Codierungsbereich umfasst, der ein Polypeptid mit SEQ ID NO:60 codiert.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei die Nukleinsäure die Sequenz der Nukleotide 442 bis 4329 der SEQ ID NO:1 aufweist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei das Säugetier ein Mensch ist.