DE60031418T2 - 15571, ein neues gpcr-ähnliches molekül der secretin-ähnlichen familie und dessen verwendungen - Google Patents

15571, ein neues gpcr-ähnliches molekül der secretin-ähnlichen familie und dessen verwendungen Download PDF

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft neue GPCR-ähnliche Nukleinsäuresequenzen und Proteine. Es werden auch Vektoren, Wirtszellen und Rekombinationsverfahren zur Herstellung und Verwendung der neuen Moleküle bereitgestellt.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) machen eine Hauptproteinklasse aus, die zur Signaltransduktion in einer Zelle verantwortlich ist (Strosberg (1991) Eur. J. Biochem. 196: 1–10; Kerlavage (1991) Curr. Opin. Struct. Biol. 1: 394–401; Probst et al. (1992) DNA Cell Biol. 11: 1–20; Savarese et al. (1992) Biochem. 283: 1–9). GPCRs haben drei Strukturdomänen: eine aminoterminale extrazelluläre Domäne; eine Transmembrandomäne, die sieben Transmembran-Segmente enthält, und zwar drei extrazelluläre Schleifen und drei intrazelluläre Schleifen, sowie eine carboxyterminale Domäne. Bei der Bindung eines Liganden an einen extrazellulären Abschnitt eines GPCR wird ein Signal in der Zelle transduziert, wodurch eine Änderung der biologischen oder physiologischen Eigenschaft der Zelle erfolgt. GPCRs zusammen mit G-Proteinen und Effektoren (durch G-Proteine modulierte intrazelluläre Enzyme und Kanäle), sind die Komponenten eines modularen Signalsystems, das die Stufe der intrazellulären zweiten Messenger mit den intrazellulären Eingängen verbindet.
  • GPCR-Gene und Genprodukte sind potentielle Krankheitserreger (Spiegel et al. (1993) J. Clin. Invest. 92: 1119–1125; McKusick et al. (1993) J. Med. Genet. 30: 1–26). Spezifische Defekte im Rhodopsingen und dem V2 Vasopressinrezeptorgen verursachen verschiedene Formen von Retinitis pigmentosum (Nathans et al. (1992) Annu. Rev. Genet. 26: 403–424) und nephrogenem Diabetes insipidus (Holtzman et al. (1993) Hum. Mol. Genet. 2: 1201–1204). Diese Rezeptoren sind für das Zentralnervensystem und für periphere physiologische Prozesse sehr wichtig. Evolutionsanalysen legen nahe, dass sich der Vorläufer dieser Proteine ursprünglich in Zusammenhang mit komplexen Körperebenen und Nervensystemen entwickelte.
  • Neben einer Variabilität unter Individuen in Bezug auf ihre Reaktionen auf Drogen bzw. Medikamente entstehen einige definierbare Krankheiten aus Störungen der Rezeptorfunktion oder Rezeptor-Effektor-Systeme. Der Verlust eines Rezeptors in einem hochspezialisierten Signalsystem kann eine relativ eingeschränkte phänotypische Störung verursachen, wie die genetische Defizienz des Androgen-Rezeptors bei dem Testikelfeminisierungssyndrom (Griffin et al. (1995) The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Diseases 7: 2967–2998). Defizienzen von häufiger verwendeten Signalsystemen haben ein breiteres Wirkspektrum wie es bei Myasthenia gravis oder einigen Formen von insulinresistem Diabetes mellitus beobachtet wird, die aus einer Autoimmun-Abreicherung cholinerger Nikotinrezeptoren bzw. Insulinrezeptoren hervorgehen. Eine Läsion einer Komponente eines Signalwegs, der in vielen Rezeptoren verwendet wird, kann eine generalisierte Endokrinopathie verursachen. Heterozygote Defizienz in G5, dem G-Protein, das die Adenylylcyclase in allen Zellen aktiviert, verursacht multiple endokrine Störungen; die Krankheit wird als Pseudohypoparathyreoidismus Typ 1a bezeichnet (Spiegel et al. (1995) The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Diseases 7: 3073–3089). Eine homozygote Defizienz in G5 wäre wahrscheinlich letal.
  • Die Expression aberranter oder ektoper Rezeptoren oder Kopplungsproteine kann potentiell zu Überempfindlichkeit, Unterempfindlichkeit oder anderen bedauerlichen Reaktionen führen. Zu den interessantesten und signifikantesten Ereignissen gehört das Erscheinen aberranter Rezeptoren als Produkte von Onkogenen, die ansonsten normale Zellen in maligne Zellen überführen. Nahezu jeder Typ Signalsystem kann onkogenes Potential haben. G-Proteine können selbst onkogen sein, wenn sie entweder überexprimiert werden oder durch Mutation konstitutiv aktiviert werden (Lyons et al. (1990) Science 249: 655–659). Insbesondere der Calcitonin-Rezeptor ist ein Ziel zur Behandlung der Paget-Krankheit des Knochens; der Rezeptor für glucagonähnliches Peptid 1 ist ein Ziel für nichtinsulinabhängigen Diabetes mellitus; das Parathyroid-Hormon ist an der Calcium-Homöostase beteiligt. Antagonisten des Parathyroidhormonrezeptors sind von potentiellem klinischen Nutzen bei der Behandlung von Hyperparathyreoidismus und kurzfristig hyperkalzämischen Zuständen.
  • Die GPCR-Protein-Superfamilie kann in fünf Familien unterteilt werden: Familie I, Rezeptoren, die durch Rhodopsin- und den β2-adrenergen Rezeptor typisiert wird, und die derzeit durch mehr als 200 einzelne Mitglieder veranschaulicht wird (Dohlman et al. (1991) Annu. Rev. Biochem. 60: 653–688); Familie II, die Parathyroidhormon/Calcitonin/Sekretinrezeptorfamilie/Klasse B sekretinähnliche Familie (Juppner et al. (1991) Science 254: 1024–1026; Lin et al. (1991) Science 254: 1022–1024); Familie III, die Familie der metabotropen Glutamatrezeptoren (Nakanishi (1992) Science 258 597: 603); Familie IV, die cAMP-Rezeptorfamilie, wichtig bei der Chemotaxis und Entwicklung von D. discoideum (Klein et al. (1988) Science 241: 1467–1472); und Familie V, Pilzpaarungs-Pheromonrezeptoren, wie STE2 (Kurjan (1992) Annu. Rev. Biochem. 61: 1097–1129).
  • G-Proteine veranschaulichen eine Familie von heterotrimeren Proteinen, bestehend aus α-, β- und γ-Untereinheiten, die Guaninnukleotide binden. Diese Proteine sind gewöhnlich an Zelloberflächenrezeptoren gebunden, beispielsweise Rezeptoren, die sieben Transmembransegmente enthalten. Nach der Ligandenbindung an den GPCR wird eine Konformationsänderung an das G-Protein übertragen, was bewirkt, dass die α-Untereinheit ein gebundenes GDP-Molekül gegen ein GTP-Molekül austauscht und von den βγ-Untereinheiten dissoziiert. Die GTP-gebundene Form der α-Untereinheit wirkt gewöhnlich als effektormodulierende Einheit, die die Produktion von zweiten Messengern, wie cAMP (beispielsweise durch Aktivierung der Adenylcyclase), Diacylglycerin oder Inositolphosphaten, herbeiführt. Bei Menschen sind mehr als 20 verschiedene Typen von α-Untereinheiten bekannt. Diese Untereinheiten assoziieren mit einem kleineren Pool von β- und γ-Untereinheiten. Beispiele für Säugetier-G-Proteine umfassen Gi, Go, Gq, Gs und Gt. G-Proteine sind in Lodish et al. (1995) Molecular Cell Biology (Scientific American Books Inc., New York, N.Y.) gründlich beschrieben, dessen Inhalt hier durch Bezugnahme aufgenommen ist. GPCRs, G-Proteine und G-Protein-gebundene Effektor- und Zweitmessenger-Systeme wurden beschrieben von Watson et al., Hrsg. (1994) The G-Protein Linked Receptor Fact Book (Academic. Press, NY).
  • GPCRs sind ein Hauptziel für die Medikamentenwirkung und -entwicklung. Für das Gebiet der pharmazeutischen Entwicklung ist es folglich wertvoll, vorher unbekannte GPCRs zu identifizieren und charakterisieren. Die vorliegende Erfindung fördert den Stand der Technik durch Bereitstellung vorher unidentifizierter GPCR-ähnlicher Sequenzen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Es werden isolierte Nukleinsäuremoleküle, die den GPCR-ähnlichen Nukleinsäuresequenzen entsprechen, bereitgestellt. Zudem sind Aminosäuresequenzen einbegriffen, die den Polynukleotiden entsprechend. Die vorliegende Erfindung stellt insbesondere isolierte Nukleinsäuremoleküle bereit, umfassend Nukleotidsequenzen, die die in Seq.-ID.-Nr. 2 gezeigte Aminosäuresequenz codieren, oder die Nukleotidsequenz, die die DNA-Sequenz codiert, welche in einem Bakterienwirt bei der ATCC unter der Zugangs-Nr. PTA-1660 hinterlegt ist. Zudem werden GPCR-ähnliche Polypeptide bereitgestellt, deren Aminosäuresequenz durch ein hier beschriebenes Nukleinsäuremolekül codiert wird, wie die in der Seq.-ID.-Nr. 1 gezeigte Sequenz.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch Vektoren und Wirtszellen zur rekombinanten Expression der hier beschriebenen Nukleinsäuremoleküle bereit, sowie Verfahren zur Herstellung dieser Vektoren und Wirtszellen und zu ihrer Verwendung zur Produktion der erfindungsgemäßen Polypeptide oder Peptide durch Rekombinationstechniken.
  • Die erfindungsgemäßen GPCR-ähnlichen Moleküle werden bei der Identifikation von Verbindungen verwendet, die als Agonisten und Antagonisten wirken und die die Expression der neuen Rezeptoren modulieren. Zudem sind die Verbindungen, die die Expression der Rezeptoren zur Behandlung und Diagnose von GPCR-verwandten Störungen modulieren, ebenfalls umfasst. Die Moleküle eignen sich zur Behandlung von Immun-, hämatologischen, fibrotischen, hepatischen und respiratorischen Störungen, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf atopische Zustände, wie Asthma und Allergie, einschließlich allergischer Rhinitis, Psoriasis, die Wirkungen von Pathogeninfektion, chronische Entzündungserkrankungen, organspezifische Autoimmunität, Transplantatabstoßung, Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit, cystische Fibrose und Leberfibrose. Störungen, die mit den folgenden Zellen oder Geweben einhergehen, sind ebenfalls umfasst: Lymphknoten; Milz; Thymus; Gehirn; Lunge, Skelettmuskel; fötale Leber; Mandeln, Kolon; Herz; Leber, mononukleäre periphere Blutzellen (PBMC); CD34+; Knochenmarkzellen; Neugeborenen-Nabelschnur-Blut (CB CD34+); Leukozyten aus G-CSF-behandelten Patienten (mPB-Leukozyten); CD14+-Zellen; Monozyten; Leber-Sternzellen; fibrotische Leber; Niere, Rückenmark; und Haut- und Lungenfibroblasten.
  • Folglich stellt in einem Aspekt diese Erfindung isolierte Nukleinsäuremoleküle bereit, die GPCR-ähnliche Proteine codieren. Die Erfindung betrifft auch isolierte oder rekombinante GPCR-ähnliche Proteine und Polypeptide.
  • Antikörper und Antikörper-Fragmente, die selektiv die GPCR-ähnlichen Polypeptide binden, werden bereitgestellt. Solche Antikörper eignen sich zum Nachweisen der Anwesenheit von Rezeptorprotein in Zellen oder Geweben. Antikörper können ebenfalls zum Bestimmen der Rezeptorexpression in Krankheitszuständen verwendet werden, zur Bestimmung normaler und aberranter subzellulärer Lokalisierung der Zellen in verschiedenen Geweben in einem Organismus. Antikörper eignen sich auch als diagnostische Werkzeuge als immunologischer Marker für aberrantes Rezeptorprotein.
  • Bei einer Ausführungsform können diese Verwendungen in einem therapeutischen Zusammenhang verwendet werden, wobei die Behandlung das Modulieren der Rezeptorfunktion beinhaltet. Es kann ein Antikörper verwendet werden, beispielsweise zum Blockieren der Ligandenbindung. Antikörper können hergestellt werden gegen spezifische Fragmente, die Stellen enthalten, welche für die Funktion erforderlich sind, oder gegen intakten Rezeptor, der mit einer Zelle assoziiert ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch einen Diagnosetest zum Identifizieren der Anwesenheit oder Abwesenheit einer genetischen Läsion oder Mutation bereit, die durch mindestens einen der nachstehenden Punkte gekennzeichnet ist: (1) aberrante Modifikation eines Gens, das ein GPCR-ähnliches Protein codiert (2) Fehlregulation eines Gens, das ein GPCR-ähnliches Protein codiert; und (3) aberrante posttranslationale Modifikation eines GPCR-ähnlichen Proteins, wobei eine Wildtypform eines Gens ein Protein mit einer GPCR-ähnlichen Aktivität codiert.
  • Bei einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung bereit, die an die Aktivität eines GPCR-ähnlichen Moleküls bindet oder diese moduliert. Im Allgemeinen umfassen solche Verfahren das Messen einer biologischen Aktivität eines GPCR-ähnlichen Proteins in der Gegenwart und Abwesenheit einer Testverbindung und Identifizieren dieser Verbindungen, die die Aktivität der GPCR-ähnlichen Proteins verändern.
  • Die Erfindung betrifft auch Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, die die Expression der GPCR-ähnlichen Gene durch Messen der Expression der GPCR-ähnlichen Sequenzen in der Anwesenheit und Abwesenheit der Verbindung moduliert.
  • Andere Eigenschaften und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden eingehenden Beschreibung und Ansprüche offensichtlich.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 stellt die Vollängen-Nukleotid-(Seq.-ID.-Nr. 1) und die Aminosäure-(Seq.-ID.-Nr. 2)Sequenzen für Klon 15771 bereit. Die Position jeder der sieben Transmembran-Domänen TM I–VII ist als umrahmte Sequenz wie folgt aufgeführt: TM I, 772–793; TM II, 807–826; TM III, 836–855; TM IV, 887–904; TM V, 925–947; TM VI, 1021–1040; und TM VII, 1048–1066.
  • 2 zeigt ein Alignment der Sequenz, die den Bereich der sieben Transmembrandomänen (7tm) von h15571 umfasst, und der folgenden humanen GPCRs der sekretinähnlichen Familie der Klasse B: CD97R (Leukozytenantigen CD97, Swiss-Prot Zugangsnummer P48960) (Seq.-ID.-Nr. 9); CGRR (ein Rezeptor für Calcitoningen-verwandtes Peptid Typ 1; Swiss-Prot Zugangsnummer Q16602) (Seq.-ID.-Nr. 10); CRF1 (Rezeptor 1 für Corticotropin freisetzenden Faktor; Swiss-Prot Zugangsnummern P34998 und Q13008) (Seq.-ID.-Nr. 11); CRF2 (Rezeptor 2 für Corticotropin freisetzenden Faktor; Swiss-Prot Zugangsnummern Q13324, Q99431, und 043461) (Seq.-ID.-Nr. 12); CTR (Calcitonin-Rezeptor, Swiss-Prot Zugangsnummer P30988) (Seq.-ID.-Nr. 13); EMR1 (Zelloberflächen-Glycoprotein EMR1; Swiss-Prot Zugangsnummer Q14246) (Seq.-ID.-Nr. 14); GIPR (glucoseabhängiger insulinotroper Polypeptid-Rezeptor; Swiss-Prot Zugangsnummern P48546, Q16400, und Q14401) (Seq.-ID.-Nr. 15); GLRP (Rezeptor für glucagonähnliches Peptide 1; Swiss-Prot Zugangsnummern P43220 und Q99669) (Seq.-ID.-Nr. 16); GLR (Glucagon-Rezeptor; Swiss-Prot Zugangsnummer P47871) (Seq.-ID.-Nr. 17); GRFR (Rezeptor für Wachstumshormon-freisetzendes Hormon; Swiss-Prot Zugangsnummern Q02643 und Q99863) (Seq.-ID.-Nr. 18); PACR (Rezeptor für Hypophysen-Adenylatcyclase aktivierendes Polypeptid-Typ I; Swiss-Prot Zugangsnummer P41586) (Seq.-ID.-Nr. 19); PTR2 (Parathyroidhormon-Rezeptor; Swiss-Prot Zugangsnummer P49190) (Seq.-ID.-Nr. 20); PTRR (Rezeptor für Parathyroidhormon/parathyroidhormonverwandtes Peptid; Swiss-Prot Zugangsnummer Q03431) (Seq.-ID.-Nr. 21) SCRC (Sekretin-Rezeptor; Swiss-Prot Zugangsnummern P47872, Q13213 und Q12961) (Seq.-ID.-Nr. 22); VIPR (Rezeptor für Hypophysen-Adenylatcyclase aktivierendes Polypeptid Typ II; Swiss-Prot Zugangsnummer P32241 und Q15871) (Seq.-ID.-Nr. 23); und VIPS (Rezeptor für Hypophysen-Adenylatcyclase aktivierendes Polypeptid Typ III; Swiss-Prot Zugangsnummern P41587, Q15870, und Q13053) (Seq.-ID.-Nr. 24).
  • 3 zeigt eine Analyse der h15571 GPCR-ähnlichen Aminosäuresequenz: αβ-Turn- und Helix-Bereiche, Hydrophilie und amphipathische Bereiche flexible Bereiche, antigener Index und Oberflächenwahrscheinlichkeits-Plot.
  • 4 zeigt die Expression von h15571 in verschiedenen Geweben und Zelltypen relativ zur Expression in humanen CD3+-Zellen.
  • 5 zeigt die Expression von h15571 in verschiedenen Geweben und Zelltypen relativ zur Expression in ruhenden humanen CD3+-Zellen.
  • 6 zeigt die Expression von h15571 in normaler Leber und fibrotischen Leberproben relativ zu aktivierten normalen humanen Leberhepatozyten (NHLH-aktiviert).
  • 7 zeigt die Expression von h15571 in Lebersternzellen und Fibroblasten relativ zu ruhenden CD3+-Zellen.
  • 8 stellt die Expression von h15571 in normalen Leber gegenüber fibrotischen Leberproben und Lebersternzellen in ihrem ruhenden, durchlaufenen, ruhenden und serumaktivierten Zustand der Expression in Hepatozyten 24 Std. nach der TGF-β-Behandlung gegenüber.
  • 9 zeigt die Ratten-15571-Expression in verschiedenen Geweben, einschließlich fibrotischer Leberproben, die durch Gallengang-Ligation (BDL) und Schweineserum-Injektion (Serum) induziert wurde, relativ zu Kontrollen (602-5, eine normale Rattenleber).
  • 10 zeigt die Ratten-15571-Expression in Leberzellproben nach der Behandlung mit Tetrachlorkohlenstoff (CCl4) relativ zu Kontrollen 602-5.
  • EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt GPCR-ähnliche Moleküle bereit. Diese Moleküle als Teil der Erfindung sind durch die Ansprüche definiert. Moleküle, die sich herstellen lassen, die nicht durch die Ansprüche definiert sind, bilden keinen Teil der Erfindung. Sie sind lediglich für Veranschaulichungszwecke beschrieben "GPCR-ähnliche Moleküle" soll für eine neue Humansequenz stehen, die als h15571 bezeichnet wird. Diese Vollängen-Gensequenzen werden als "GPCR-ähnliche" Sequenzen bezeichnet, was anzeigt, dass sie Sequenzähnlichkeit mit GPCR-Genen teilen. Isolierte Nukleinsäuremoleküle, die die Nukleinsäuresequenzen umfassen, die das h15571-Polypeptid codieren, deren Aminosäuresequenz in Seq.-ID.-Nr. 2 gegeben ist, werden bereitgestellt. Eine Nukleotid-Sequenz, die das h15571-Polypeptid codiert, ist in der Seq.-ID.-Nr. 1 offenbart. Die Sequenzen sind Mitglieder der sekretinähnlichen Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren.
  • Die Sekretin/VIP (vasoaktive intestinales Polypeptid)-Familie umfasst Rezeptoren für Peptide, wie Sekretin, Glucagon, glucagonähnliches Peptid 1 (GLP-1), gastrisches inhibitorisches Peptid, Parathyroidhormon, VIP, Hypophysen-Adenylatcyclase aktivierendes Polypeptid (PACAP), Calcitonin und wachstumshormon-freisetzendes Hormon. VIP hat eine breites Profil physiologischer Wirkungen. In der Periphery induziert VIP die Relaxierung der glatten Muskeln, hemmt die Sekretion in bestimmten Geweben, wie Magen, stimuliert die Sekretion in Geweben, wie dem intestinalen Epithel, Pankreas und Gallenblase und moduliert die Aktivität von Zellen im Immunsystem. Im Zentralnervensystem hat VIP einen breiten Bereich an exzitatorischen und inhibitorischen Wirkungen.
  • Mitglieder der sekretinähnlichen Familie der Klasse B der GPCRs (Juppner et al. (1991) Science 254: 1024–1026; Hamann et al., (1996) Genomics 32: 144–147) umfassen: Calcitonin-Rezeptor, Calcitonin-Gen-verwandter Peptidrezeptor, Rezeptor für Cortocitropin-freisetzenden Faktor der Typen 1 und 2, Rezeptor für Magen-Inhibitor-Polypeptid, Glucagon-Rezeptor, Rezeptor für glucagonähnliches Peptid 1, Rezeptor für hormonfreisetzendes Hormon, Parathyroidhormon/Parathyroidhormon-verwandtes Peptid der Typen 1 und 2, Rezeptor für Hypophysen-Adenylatcyclase-aktivierendes Polypeptid, Sekretin-Rezeptor, Rezeptor für vasoaktives intestinales Peptid der Typen 1 und 2, Rezeptor für diuretisches Insektenhormon, den mutmaßlichen Caenorhabditis elegans-Rezeptor C 13B9.4 (Swiss-Prot Zugangsnummer Q09460), den mutmaßlichen Caenorhabditis elegans-Rezeptor ZK 64.3 (Swiss-Prot Zugangsnummern P30650 und P30649), humanes Leukozyten-Antigen CD97 (ein Protein, das an seinem N-terminalen Abschnitt 3 EGF-ähnliche Domänen enthält) (Swiss-Prot Zugangsnummer P48960) und Maus-Zelloberflächen-Glycoprotein F4/80 (Maus-EMR1 Hormonrezeptor, der an seinem N-terminalen Bereich 7 EGF-ähnliche Domänen enthält) (GenBank Zugangsnummer X93328), humanes EMR1 (EMR1-Hormonrezeptor, der 6 EGF-ähnliche Domänen enthält) (GenBank Zugangsnummer X81479), BAI1 (ein gehirnspezifisches p53-Zielgen, das die Wiederholungen des Thrombospondin Typ 1 enthält) (GenBank Zugangsnummer AB005297, GPR56 (GenBank Zugangsnummer AF106858), HE6 (ein Humanrezeptor mit einem aminoterminalen Bereich mit Identität zu hochglycosylierten mucinähnlichen Zelloberflächen-Molekülen) (GenBank Zugangsnummer X81892), Alpha-Latroxin-Rezeptoren, und MEGF2 (ein Humanprotein, das EGF-ähnliche Motive enthält) (GenBank Zugangsnummer AB011536).
  • Die erfindungsgemäßen rezeptorähnlichen Proteine wirken als GPCR-ähnliche Proteine, die an Signalwegen beteiligt sind. "Signalweg", wie es hier verwendet wird, betrifft die Modulation (beispielsweise Stimulation oder Hemmung) einer Zellfunktion/Aktivität beim Binden eines Liganden an das GPCR-ähnliche Protein. Beispiele für solche Funktionen umfassen die Mobilisierung der intrazellulären Moleküle, die an einem Signaltransduktionsweg beteiligt sind, beispielsweise Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2), Inositol-1,4,5-triphosphat (IP3) und Adenylatcyclase, Polarisation der Plasmamembran; Produktion oder Sekretion von Molekülen, Veränderung der Struktur einer Zellkomponente; Zellproliferation, beispielsweise DNA-Synthese; Zellwanderung; Zelldifferenzierung und Zellüberleben.
  • Die Reaktion, die durch die erfindungsgemäßen rezeptorähnlichen Proteine vermittelt wird, hängt von der Art der Zelle ab. In einigen Zellen kann beispielsweise die Bindung eines Liganden an das rezeptorähnliche Protein eine Aktivität, wie die Freisetzung von Verbindungen, Regulation eines Kanals, Zelladhäsion, Wanderung, Differenzierung usw. über Phosphatidylinositol oder cyclisches AMP (cAMP)-Metabolismus und Umsatz stimulieren, wohingegen in anderen Zellen die Bindung des Liganden ein anderes Ergebnis hervorbringt. Ungeachtet der zellulären Aktivität/Reaktion, die durch das rezeptorähnliche Protein moduliert wird, ist es allgemein, dass das Protein ein GPCR-ähnliches Protein ist und mit den G-Proteinen wechselwirkt, so dass in einer Reihe von intrazellulären Signaltransduktionswegen, beispielsweise durch Phosphatidylinositol- oder cAMP-Metabolismus und Umsatz in einer Zelle, ein oder mehrere sekundäre Signale erzeugt werden.
  • "Phosphatidylinositol-Umsatz und Metabolismus", wie es hier verwendet wird, betrifft Moleküle, die an dem Umsatz und Metabolismus von Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) beteiligt sind, sowie die Aktivitäten dieser Moleküle. PIP2 ist ein Phospholipid, das man im cytosolischen Blättchen der Plasmamembran findet. Die Bindung des Liganden an den Rezeptor aktiviert in einigen Zellen das Plasmamembranenzym Phospholipase C, das wiederum PIP2 hydrolysieren kann, so dass 1,2-Diacylglycerin (DAG) und Inositol-1,4,5-triphosphat (IP3) erhalten wird. IP3 kann direkt nach seiner Bildung zur Oberfläche des endoplasmatischen Retikulum diffundieren, wo es an den IP3-Rezeptor binden kann, beispielsweise ein Calciuimkanalprotein, das eine IP3-Bindungsstelle enthält. Die IP3-Bindung kann die Öffnung des Kanals induzieren, so dass Calciumionen in das Cytoplasma freigesetzt werden können. IP3 kann auch durch eine spezifische Kinase phosphoryliert werden, so dass man Inositol-1,3,4,5-tetraphosphat (IP4) erhält, ein Molekül, das den Calciumeintritt in das Cyytoplasma aus dem extrazellulären Medium verursacht. IP3 und IP4 können anschließend sehr schnell in die inaktiven Produkte Inositol-1,4-bisphosphat (IP2) bzw. Inositol-1,3,4-triphosphat hydrolysiert werden. Diese inaktiven Produkte können durch die Zelle rezykliert werden, so dass PIP2 synthetisiert wird. Die andere zweite Messenger, die durch Hydrolyse von PIP2 erzeugt wird, nämlich 1,2-Diacylglycerin (DAG), bleibt in der Zellmembran, wo es das Enzym Proteinkinase C aktivieren kann. Die Proteinkinase C befindet sich gewöhnlich löslich im Cytoplasma der Zelle, aber bei einem Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration kann dieses Protein zur Plasmamembran wandern, wo es durch DAG aktiviert wird. Die Aktivierung der Proteinkinase C in verschiedenen Zellen führt zu verschiedenen Zellreaktionen, wie die Phosphorylierung der Glycogensynthase oder die Phosphorylierung verschiedener Transkriptionsfaktoren, beispielsweise NF-κB. Der Begriff "Phosphatidylinositol-Aktivität", wie er hier verwendet wird, betrifft eine Aktivität von PIP2 oder einer seiner Metabolite.
  • Ein weiterer Signalweg, bei dem die rezeptorähnlichen Proteine beteiligt sein können, ist der Umsatzweg von cyclischem AMP (cAMP). "cAMP-Umsatz und Metabolismus" wie es hier verwendet wird, betrifft die Moleküle, die am Umsatz und Metabolismus von cAMP beteiligt sind, sowie die Aktivitäten dieser Moleküle. Zyklisches AMP ist ein zweiter Messenger, der bei der Reaktion auf die ligandeninduzierte Stimulation bestimmter G-Protein-gekoppelter Rezeptoren produziert wird. Bei dem cAMP-Signalweg kann die Bindung eines Liganden an einen GPCR zur Aktivierung des Enzyms Adenylatcyclase führen, das die Synthese von cAMP katalysiert. Das neu synthetisierte cAMP kann wiederum eine cAMP-abhängige Proteinkinase aktivieren. Diese aktivierte Kinase kann ein über Spannung ausgelöstes Kaliumkanalprotein oder ein dazu gehöriges Protein phosphorylieren und dazu führen, dass sich der Kaliumkanal während eines Aktionspotentials nicht öffnen kann. Die Unfähigkeit des Kaliumkanals zur Öffnung bewirkt eine Abnahme des Ausstroms von Kalium, der normalerweise die Membran einer Nervenzelle repolarisiert, was zu einer verlängerten Membrandepolarisation führt.
  • Die offenbarte Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen zur Modulation, Diagnose und Behandlung von Immun-, hämatologischen, fibrotischen, Entzündungs-, Leber- und Atemstörungen. Solche Immunstörungen umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf chronische Entzündungserkrankungen und Störungen, entzündliche Darmerkrankung, wie Morbus Crohn und Colitis ulcerosa, rheumatoide Arthritis, einschließlich Lyme-Erkrankung, insulinabhängige Diabetes, organspezifische Autoimmunkrankheit, einschließlich Multipler Sklerose, Hashimoto-Thyroiditis und Grave-Krankheit, Kontakt-Dermatitis, Psoriasis, Transplantat-Abstoßung, Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit, Sarkoidose, atopische Leiden, wie Asthma und Allergie, einschließlich allergischer Rhinitis, Magen-Darm-Allergien, einschließlich Nahrungsmittel-Allergien, Eosinophilie, Bindehautentzündung, glomeruläre Nephritis, bestimmte pathogene Anfälligkeiten, wie helminthische (beispielsweise Leishmaniose), bestimmte virale Infektionen, wie u.a. HIV, HBV, HCV und Bakterieninfektionen, einschließlich Tuberkulose und lepromatöser Leprosie.
  • Atemstörungen umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf Apnoe, Asthma, insbesondere Bronchialasthma, Berilium-Erkrankung, Bronchiektase, Bronchitis, Bronchopneumonie, cycstische Fibrose, Diphtherie, Dyspnoe, Emphyseme, chronische obstruktive Lungenerkrankung, allergische bronchopulmonäre Aspergillose, Pneumonie, akutes pulmonäres Ödem, Pertussis, Pharyngitis, Atelektase, Wegener-Granulomatose, Legionärs-Krankheit, Pleuritis, rheumatisches Fieber und Sinusitis.
  • Fibrotische Störungen oder Krankheiten umfassen Fibrose im Allgemeinen, beispielsweise chronische obstruktive Lungenerkrankung; ideopathische Lungenfibrose, Glomerulofibrose mit Halbmondbildung; Sarcoidose; cystische Fibrose; Fibrose/Zirrhose, einschließlich Zirrhose, die auf chronischen Alkoholismus folgt, Zirrhose, die auf Hepatitis Typ B oder Typ C folgt, und primäre biliäre Zirrhose; die nachstehend erörterten Lebererkrankungen, insbesondere Leberfibrose und andere fibrotische Erkrankungen; sowie bei der Behandlung von Verbrennungen und Narben.
  • Krankheiten, die die Leber betreffen, umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, Leberverletzung; Gelbsucht und Cholestase, wie Bilirubin- und Gallenbildung; Leberversagen und Zirrhose, wie Zirrhose, Pfortader-Hypertonie, einschließlich Ascites, portosystemische Shunts und Splenomegalie; Infektionskrankheiten, wie virale Hepatitis, einschließlich einer Hepatitis A-E-Infektion und Infektion durch andere Hepatitis-Viren, klinikopathologische Syndrome, wie der Carrier-Zustand, asymptomatische Infektion, akute virale Hepatitis, chronische virale Hepatitis, und fulminante Hepatitis; Autoimmun-Hepatitis; medikamenten- und toxin-induzierte Lebererkrankung, wie die Alkohol-Lebererkrankung; angeborene Fehler des Metabolismus und pädiatrische Lebererkrankungen, wie Hämochromatose, Wilson-Krankheit, a1-Antitrypsin-Defizienz und neonatale Hepatitis; intrahepatische Erkrankungen des Gallentrakts, wie sekundäre biliäre Zirrhose, primäre biliäre Zirrhose, primäre sklerosierende Cholangitis und Anomalien des Gallenbaums; Kreislaufstörungen, wie gestörter Blutfluss in die Leber, einschließlich der Leberarteriengefährdung und Obstruktion und Thrombose der Pfortader, gestörter Blutfluss durch die Leber, einschließlich passivem Blutstau, und centrilobulärer Nekrose und Peliosis-Hepatitis, Obstruktion des Lebervenenausstroms, einschließlich Lebervenenthrombose (Budd-Chiari-Syndrom) und Venenverschluss-Krankheit; Lebererkankung, die bei Schwangerschaft vorkommt, wie Präeklampsie und Eklampsie, akute Fettleber bei Schwangerschaft und intrahepatische Cholestase bei Schwangerschaft; Leberkomplikationen von Organ- oder Knochenmarktransplantation, wie Medikamenten-Toxizität nach der Knochenmark-Transplantation, Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung und Leberabstoßung und nichtimmunologische Schädigung von Leber-Allotransplantaten; Tumore und Tumor-Leiden, wie noduläre Hyperplasien, Adenomas und maligne Tumore, einschließlich primärem Karzinom der Leber und metastatische Tumore.
  • Hämatologische Störungen umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf Anämien, einschließlich durch Chemotherapie induzierte Anämie, Sichelzellen- und hämolytische Anämie, Hämophilien, einschließlich der Typen A und B, Leukämien, Thalassämien, Spherocytose, Von Willebrand-Erkrankung, chronische granulomatöse Erkrankung, Glucos-6-phosphat-dehydrogenase-Defizienz, Thrombose, Gerinnungsfaktor-Anomalien und Defizienzen, einschließlich Defizienzen von Faktor VIII und IX, Hämarthrose, Hämatemese, Hämatome, Hämaturie, Hämochromatose, Hämoglobinurie, hämolytisch-urämisches Syndrom, Thrombocytopenien, einschließlich durch Chemotherapie induzierte Thrombocytopenie, HIV-assoziierte Thrombocytopenie, hämorrhagische Telangieektasie, idiopathische thrombocytopenische Purpura, thrombotische Mikroangiopathie, Hämosiderose, durch Chemotherapie induzierte Neutropenien. Andere Störungen umfassen Polycythemien, einschließlich Polycythemia vera, sekundäre Polycythemie, und relative Polycythemie, Neutropenien, einschließlich durch Chemotherapie induzierte Neutropenie, chronisch idiopathische Neutropenie, Felty-Syndrom, Neutropenien, die aus akuten Infektionskrankheiten hervorgehen, Lymphom oder aleukämische lymphozytische Leukämie mit Neutropenie, myelosdysplastisches Syndrom, durch rheumatische Krankheit induzierte Neutropenien, wie systemischer Lupus erythematodes, rheumatoide Arthritis und Polymyositis.
  • Eine neue Human-GPCR-ähnliche Sequenz, die als h15571 bezeichnet wird, wird bereitgestellt. Diese Gensequenz ist im Begriff "GPCR-ähnliche" Moleküle oder Sequenzen, wie er hier verwendet wird, eingeschlossen. Die GPCR-ähnlichen Sequenzen werden bei der Modulation einer GPCR-ähnlichen Funktion verwendet. Mit "Modulation" ist die Aufwärtsregulation oder Abwärtsregulation einer Reaktion gemeint. D.h. die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen beeinträchtigen die angezielte Aktivität entweder auf positive oder negative Weise.
  • Das GPCR-ähnliche Gen, der bezeichnete Klon h15571, wurde in menschlichen Thymus- und Milz-cDNA-Banken identifiziert. Der Klon h15571 codiert ein etwa 6,09 kb mRNA-Transkript mit der entsprechenden cDNA, die in der Seq.-ID.-Nr. 1 offenbart ist. Dieses Transkript hat ein 4014-Nukleotide langes offenes Leseraster (Nukleotide 366–4379 von Seq.-ID.-Nr. 1), das ein 1338 Aminosäuren langes Polypeptid codiert (Seq.-ID.-Nr. 2). Die Vollängen-Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz sind in der 1 gezeigt.
  • Eine Analyse des Vollängen-h15571-Polypeptids (Seq.-ID.-Nr. 2) sagt voraus, dass die N-terminalen 33 Aminosäuren ein Signalpeptid veranschaulichen. Somit hat das reife Polypeptid mutmaßlich 1305 Aminosäuren Länge (aa 34–1338 von Seq.-ID.-Nr. 2). Die Transmembrandomänen (TM) an den folgenden Positionen der in der Seq.-ID.-Nr. 2 offenbarten Sequenz, wurden durch MEMSAT vorhergesagt, sowie durch Alignment mit Mitgliedern der sekretinähnlichen Familie der GPCRs und optische Begutachtung; TM I, 772–793, TM II, 807–826; TM III, 836–855; TM IV, 887–904; TM V, 925–947; TM VI, 1021–1040 und TM VII, 1048–1066. Die 7 TM-Domänen sind als umrahmte Sequenzen in der 1 gezeigt. Auf der Basis der vorhergesagten Positionen von TM I–VII sind die vorhergesagten Positionen der N-terminalen extrazellulären Domäne (EC), der extrazellulären Schleifen (EL) I–III, der intrazellulären Schleifen (IL) I–III, und der C-terminalen intrazellulären Domäne (IC) wie in der Sequenz in Seq.-ID.-Nr. 2 gezeigt; EC, etwa aa 34–771; EL I etwa aa 827–835; EL II etwa aa 905–924; EL III, etwa aa 1041–1048; IL I, etwa aa 794–806; IL II, etwa aa 856–886; IL III, etwa aa 948–1020; und IC etwa aa 1067–1338. Eine Prosite-Programm-Analyse erfolgte zur Vorhersage verschiedener Stellen in dem h15571-Protein. N-Glycosylierungsstellen wurden vorhergesagt bei aa 84–87, 101–104, 162–165, 207–210, 275–278, 336–339, 436–439, 602–605, 659–662, 690–693, 737–740 und 794–797. Eine Glycosaminoglycan-Bindungsstelle wurde bei aa 684–687 vorhergesagt. Proteinkinase C Phosphorylierungsstellen wurden bei aa 40–42, 43–45, 253–255, 338–340, 400–402, 598–600, 660–662, 698–700, 797–799, 801–803, 865–867, 976–978, 997–999, 1041–1043, 1079–1081, 1116–1118, 1233–1235, 1279–1281, und 1290–1292 vorhergesagt. Caseinkinase II Phosphorylierungsstellen wurden bei aa 69–72, 108–111, 231–234, 456–459, 1225–1228, und 1251–1254 vorhergesagt. N-Myristoylierungsstellen wurden bei aa 36–41, 53–58, 80–85, 98–103, 126–131, 145–150, 165–170, 295–300, 319–324, 392–397, 555–560, 566–571, 682–687, 722–727, 763–768, 825–830, 900–905, 961–966, 990–995, 1016–1021, 1055–1060, 1150–1155, 1163–1168, 1206–1211, 1220–1225, 1232–1237, 1255–1260, 1270–1275, 1304–1309, 1318–1323 und 1325–1330 vorhergesagt. Amidierungsstellen wurden bei aa 4–7, 668–671, und 1178–1181 vorhergesagt. Eine prokaryotische Membran-Lipoproptein-Lipid-Bindungsstelle wurde bei aa 676–686 vorhergesagt. Eine RGD-Zellbindungssequenz wurde bei aa 362–364 vorhergesagt.
  • Domänen-Übereinstimmungen mit HMMER 2.1.1 (Washington University School of Medicine) zeigten die Anwesenheit mehrerer Schlüsselproteindomänen. Eine Suche der HMM-Datenbank mittels Pfam (Proteinfamilie) ergab die Anwesenheit von 5 leucinreichen Wiederholungsdomänen, die sich bei aa 85–108, 109–132, 133–156, 157–180 und 604–630 befinden. Eine leucinreiche C-terminale Wiederholungsdomäne wurde bei aa 190–240 identifiziert. Eine Immunoglobulindomäne wurde bei aa 261–330 identifiziert. Eine Latrophilin/CL-1-ähnliche GPS-Donmäne wurde bei aa 706–758 identifiziert. Eine Suche der HMM-Datenbank mittels SMART (Simple Modular Architecture Research Tool) ergab die folgenden Domänenübereinstimmungen: vier leucinreiche Typical-2-Subfamilien-Wiederholuingsdomänen wurden identifiziert, die sich bei aa 82–106, 107–130, 131–154 und 155–178 befinden.
  • Zwei leucinreiche SDS22-ähnliche Subfamilien-Wiederholungsdomänen wurden identifiziert, die sich bei aa 107–128 und 131–157 befinden. Eine leucinreiche Wiederholungsdomäne des Ribonucleaseinhibitortyps wurde bei aa 131–157 identifiziert. Eine leucinreiche C-terminale Wiederholungsdomäne wurde bei aa 190–240 identifiziert. Eine Immunuglobulin C-2 Typ-Domäne wurde bei aa 259–335 identifiziert. Eine Immunoglobulin 3-C-Domäne wurde bei aa 253–346 identifiziert. Eine Hormonrezeptordomäne wurde bei aa 349–426 identifiziert. Eine Domäne des G-Protein-gekoppelten Rezeptors wurde bei aa 706–758 identifiziert.
  • Die ProDom-Analyse zeigt, dass das h15571-Polypeptid Regionen aufweist, die Ähnlichkeit mit anderen GPCRs aufweisen, die Aminosäurereste 367–1077 zeigen etwa 33% Identität mit Abschnitten einer Konsensussequenz für Familie II-GPCRs, einschließlich Calcitonin-Rezeptor (CALR), Rezeptor für Corticotrophin-freisetzenden Faktor (CRFR) und Parathyroidhormon/Parathyroidhormon-verwandter Rezeptor (PTRR). Die ProDOM-Analyse zeigt auch, dass das h15571-Polypeptid Regionen aufweist, die Ähnlichkeit mit mehreren anderen Proteinen aufweisen. Die Aminosäurereste 84–131, 85–155, 110–179 und 134–187 teilen etwa 43%, 36%, 34% und 24% Identität mit den Aminosäureresten 26–73, 3–73, 4–73, bzw. 4–57 einer Konsensussequenz für die EGF-ähnliche Domäne des Ratten-MEGF5-Glycoproteins. Die Aminosäurereste 89–237 teilen etwa 30% Identität mit einer Konsensussequenz für eine Familie, die die CYAA-, ESA8- und CD14-Proteine vereint. Die Aminosäurereste 182–356 teilen etwa 21% Identität mit einem Protein, das von C. elegans YK6G3.3 codiert wird, das auch mehrere leuicinreiche Wiederholungen aufweist. Die Aminosäurereste 88–221 teilen etwa 32% Identität mit einem leucinreichen Wiederholungsprotein. Die Aminosäurereste 37–176 teilen etwa 23% Identität mit dem C. elegans-C44H4.1-Protein (Zugangsnummer CABD1867). Die Aminosäurereste 180–237 und 860–883 teilen eine Identität von etwa 37% bzw. 45% mit den Aminosäureresten 4–64 und 166–186 des Human-KIAA0644-Protein.
  • Die 10 zeigt ein Alignment von 7 Transmembran-(7 TM)-Domänen von h15571 mit mehreren Mitgliedern der sekretinähnlichen Familie von GPCRs der Klasse B. Auf der Basis der Sequenzhomologie der 7 TM-Domänen scheint h15571 mit einer Subfamilie der sekretinähnlichen Familie der GPCRs der Klasse B verwandt zu sein. Die Mitglieder dieser Subfamilie teilen ähnliche Sequenzen in den 7 TM-Domänen, die sich von anderen Mitgliedern der sekretinähnlichen Familie unterscheiden. Diese Subfamilie umfasst CD97, EMR1, BAI1, GPR56, HE6, Alpha-Latrotoxin-Rezeptoren, MEGF2, und zwei mutmaßliche GPCRs, die durch Sequenzieren des C. elegans-Genoms (GenBankTM Zugangsnummern Z54306 und U39848) identifiziert wurden. Die Mitglieder dieser Subfamilie sind zudem durch die Anwesenheit eines extrem großen N-terminalen extrazellulären Bereichs gekennzeichnet (der beispielsweise mehrere hundert Aminosäurereste enthält, beispielsweise mindestens 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, oder 1000 oder mehr Aminosäurereste). Die Mitglieder dieser Molekülfamilie teilen auch eine Box mit vier konservierten Cysteinresten im N-Terminus von TM I, der der vorgegebene Bereich der proteolytischen Spaltung für mindestens zwei Mitglieder ist. CD97 und der Latrotoxin-Rezeptor. Es gibt zudem eine Zelladhäsionsdomäne (beispielsweise mucinähnliche, thrombospondinähnliche, EGF-ähnliche oder lektinähnliche), die man im N-Terminus der Mitglieder dieser Subfamilie vorfindet. Siehe Liu et al., (1999) Genomics 55: 296–305. h15571 teilt mit anderen Mitgliedern dieser Subfamilie einen großen N-terminalen extrazellulären Bereich (etwa 738 aa Reste), unterscheidet sich aber durch die Anwesenheit von zwei der vier konservierten Cystein-Reste in dem N-Terminus von TM I. Zudem wurde keine bekannte Zelladhäsionsdomäne in dem N-Terminus von h15571 beobachtet. Der 7 TM-Bereich von h15571 (von etwa aa 772 bis etwa 1066 von Seq.-ID.-Nr. 2) zeigt die höchste Homologie (etwa 19,4%) zum CD97-7 TM-Bereich.
  • Ein Plasmid, das das h15571-cDNA-Insert enthält, wurde bei der American Typ-Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia am 5. April 2000 hinterlegt und mit der Zugangsnummer PTA-1660 bezeichnet. Diese Hinterlegung wird unter den Maßgaben des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren beibehalten. Diese Hinterlegung erfolgte lediglich der Einfachheit halber für den Fachmann und nicht als Zugeständnis, dass eine Hinterlegung unter 35 U.S.C. § 112 erforderlich ist.
  • Die erfindungsgemäßen GPCR-ähnlichen Sequenzen sind Mitglieder einer Molekülfamilie (die "Familie der sekretinähnlichen Rezeptoren") mit konservierten funktionellen Eigenschaften. Der Begriff "Familie" oder "Subfamilie" bedeutet, wenn er sich auf Proteine und Nukleinsäuremoleküle der Erfindung bezieht, zwei oder mehr Proteine- oder Nukleinsäuremoleküle mit einer hinreichenden Aminosäure- oder Nukleotidsequenzidentität, wie hier definiert. Solche Familienmitglieder können natürlich vorkommen und können entweder von der gleichen oder verschiedenen Arten stammen. Eine Familie kann beispielsweise ein erstes Protein von Mausursprung und ein Homologon dieses Proteins von Humanursprung enthalten, sowie ein zweites anderes Protein von Humanursprung und ein Maushomologon dieses Proteins. Mitglieder einer Familie können. auch gemeinsame funktionelle Eigenschaften aufweisen.
  • GPCR-ähnliche Polypeptide, deren Aminosäuresequenz hinreichend identisch ist zur Aminosäuresequenz von Seq.-ID.-Nr. 2, können hergestellt werden. Der Begriff "hinreichend identisch" bezieht sich hier auf eine erste Aminosäure- oder Nukleotidsequenz, die eine hinreichende oder minimale Zahl identischer oder äquivalenter (beispielsweise mit einer ähnlichen Seitenkette) Aminosäurereste oder Nukleotide zu einer zweiten Aminosäure- oder Nukleotidsequenz enthält, dass die ersten und zweiten Aminosäure- oder Nukleotidsequenzen eine gemeinsame Strukturdomäne (beispielsweise eine leucinreiche Wiederholungsdomäne, Immunglobulindomäne, Transmembran-Rezeptordomäne, G-Protein-Rezeptor-Domäne, usw.) und/oder gemeinsame funktionelle Aktivität haben. Die Aminosäure- oder Nukleotidsequenzen, die eine gemeinsame Strukturdomäne mit mindestens etwa 45%, 55%, 60% oder 65% Identität, vorzugsweise mindestens etwa 70%, 75%, 80% Identität, stärker bevorzugt mindestens etwa 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Identität enthalten, werden hier als hinreichend identisch definiert.
  • Zur Bestimmung der prozentualen Identität von zwei Aminosäuresequenzen oder zwei Nukleinsäuren, werden die Sequenzen für optimale Vergleichszwecke ausgerichtet. Die prozentuale Identität zwischen den beiden Sequenzen ist eine Funktion der Zahl der identischen Positionen, die den Sequenzen gemeinsam ist (d.h. prozentuale Identität = Anzahl der identischen Positionen/Gesamtzahl der Positionen (beispielsweise überlappende Positionen) × 100). Bei einer Ausführungsform haben die beiden Sequenzen die gleiche Länge. Die prozentuale Identität zwischen den beiden Sequenzen kann mittels Techniken bestimmt werden, die den nachstehend beschriebenen ähneln, und zwar mit oder ohne Zulassung von Lücken. Bei der Berechnung der prozentualen Identität werden üblicherweise genaue Übereinstimmungen gezählt.
  • Die Bestimmung der prozentualen Identität zwischen zwei Sequenzen kann bewerkstelligt werden mit einem mathematischen Algorithmus. Ein bevorzugtes nicht-einschränkendes Beispiel für einen mathematischen Algorithmus, der zum Vergleich der beiden Sequenzen verwendet wird, ist der Algorithmus von Karlin und Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264, modifiziert wie bei Karlin und Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873–5877. Ein solcher Algorithmus geht ein in die NBLAST- und XBLAST-Programme von Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403. BLAST-Nukleotid-Suchen können mit dem NBLAST-Programm, Score = 100, Wortlänge = 12, durchgeführt werden, so dass man Nukleotidsequenzen erhält, die zu den erfindungsgemäßen GPCR-ähnlichen Nukleinsäuremolekülen homolog sind. Die BLAST-Protein-Suchen können mit dem XBLAST-Programm, Score = 50, Wortlänge = 3, durchgeführt werden, so dass Aminosäuresequenzen erhalten werden, die zu den erfindungsgemäßen GPCR-ähnlichen Proteinmolekülen homolog sind. Zur Gewinnung Alignments mit Lücken für Vergleichszwecke kann Gapped BLAST wie beschrieben in Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389, verwendet werden. Alternativ kann PSI-BLAST verwendet werden, damit man eine wiederholte Suche durchführt, die entfernte Beziehungen zwischen Molekülen erfasst. Siehe Altschul et al. (1997), siehe oben. Bei der Verwendung von BLAST-, Gapped BLAST- und PSI-BLAST-Programmen, können die Vorgabe-Parameter der jeweiligen Programme (beispielsweise XBLAST und NBLAST) verwendet werden. Siehe http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Ein weiteres nicht-einschränkendes Beispiel für einen mathematischen Algorithmus, der zum Vergleichen von Sequenzen herangezogen wird, ist der Algorithmus von Myers und Miller (1988) CABIOS 4: 11–17. Ein solcher Algorithmus geht in das ALIGN-Programm (Version 2.0) ein, das Teil der GCG-Sequenz-Alignment-Software-Packung ist. Bei der Verwendung des ALIGN-Programms zum Vergleichen von Aminosäuresequenzen. kann eine PAM 120 Gewichtsrest-Tabelle ein Gap-Längen-Penalty von 12 und ein Gap-Penalty von 4 verwendet werden. Ein zusätzliches bevorzugtes Programm ist das Pairwise Alignment-Programm (Sequenz-Explorer), das Vorgabe-Parameter verwendet.
  • Folglich lassen sich isolierte GPCR-ähnliche Proteine und Polypeptide mit einer GPCR-ähnlichen Proteinaktivität herstellen. Wie hier austauschbar verwendet wird betreffen eine "GPCR-ähnliche Protein-Aktivität", "biologische Aktivität eines GPCR-ähnlichen Proteins" oder "funktionelle Aktivität eines GPCR-ähnlichen Proteins" eine Aktivität, die von einem GPCR-ähnlichen Protein-, Polypeptid- oder einem Nukleinsäuremolekül auf einer GPCR-ähnlichen reaktiven Zelle, wie in vivo oder in vitro bestimmt, gemäß den Standard-Teststechniken ausgeführt wird. Eine GPCR-ähnliche Aktivität kann eine direkte Aktivität, wie eine Assoziation mit oder eine enzymatische Aktivität auf einem zweiten Protein oder eine indirekte Aktivität, wie eine Zellsignalaktivität, vermittelt durch Wechselwirkung des GPCR-ähnlichen Proteins mit einem zweiten Protein, sein. Bei einer bevorzugten Ausführungsform beinhaltet die GPCR-ähnliche Aktivität zumindest eine oder mehrere der folgenden Aktivitäten (1) Modulieren (d.h. Stimulieren und/oder Steigern oder Hemmen) der Zellproliferation, Differenzierung, und/oder Funktion (in den Zellen und Organen, in denen es exprimiert wird, beispielsweise Lymphknoten; Milz; Thymus; Gehirn; Lunge, Skelettmuskel; fötale Leber; Mandel; Kolon; Herz; Leber; mononukleäre periphere Blutzellen (PBMC); CD34+; Knochenmarkzellen; Nabelschnurblut von Neugeborenen (CB CD34+); Leukozyten aus G-CSF-markierten Patienten (mPB-Leukozyten); CD14+-Zellen; Monozyten; Lebersternzellen; fibrotische Leber; Niere; Rückenmark; Haut- und Lungenfibroblasten und die Zelllinien K562, HEK293, Jurkat und HL60; (2) Modulieren einer GPCR-ähnlichen Reaktion; (3) Modulieren einer Entzündungs- oder Immunreaktion; (4) Modulieren einer Atemreaktion; und (5) Binden eines GPCR-ähnlichen Rezeptorliganden.
  • Ein "isoliertes" oder "gereinigtes" GPCR-ähnliches Nukleinsäuremolekül oder Protein oder ein biologisch aktiver Abschnitt davon, ist im Wesentlichen frei von anderem Zellmaterial oder Kulturmedium, wenn es durch Rekombinationstechniken erzeugt wird, oder im Wesentlichen frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien, wenn es chemisch synthetisiert wird. Eine "isolierte" Nukleinsäure ist vorzugsweise frei von Sequenzen (vorzugsweise Protein-codierenden Sequenzen), die natürlicherweise die Nukleinsäure flankieren (d.h. Sequenzen, die sich am 5'- und 3'-Ende der Nukleinsäure befinden) in der genomischen DNA des Organismus, aus dem die Nukleinsäure hergeleitet ist. Für erfindungsgemäße Zwecke schließt "isoliert" bei Bezugnahme auf Nukleinsäuremoleküle isolierte Chromosomen aus. In verschiedenen Ausführungsformen kann das isolierte GPCR-ähnliche Nukleinsäuremolekül weniger als etwa 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb der Nukleotidsequenzen enthalten, die das Nukleinsäuremolekül in der genomischen DNA der Zelle, aus der die Nukleinsäure hergeleitet ist, natürlicherweise flankieren. Ein GPCR-ähnliches Protein, das im Wesentlichen frei von Zellmaterial ist, umfasst Präparate des GPCR-ähnlichen Proteins mit weniger als etwa 30%, 20%, 10% oder 5% (bezogen auf das Trockengewicht) an Nicht-GPCR-ähnlichem Protein (das hier auch als "kontaminierendes Protein" bezeichnet wird). Wird das GPCR-ähnliche Protein oder der biologisch aktive Abschnitt davon rekombinant produziert, veranschaulicht das Kulturmedium weniger als etwa 30%, 20%, 10% oder 5% des Volumens des Proteinpräparates. Wird das GPCR-ähnliche Protein durch chemische Synthese produziert, haben die Proteinpräparate vorzugsweise weniger als etwa 30%, 20%, 10% oder 5% (bezogen auf das Trockengewicht) an chemischen Vorstufen oder Nicht-GPCR-ähnlichen Chemikalien.
  • 1. Isolierte Nukleinsäuremoleküle
  • Isolierte Nukleinsäuremoleküle, die die Nukleinsäuresequenzen umfassen, die GPCR-ähnliche Proteine und Polypeptide oder biologisch aktive Abschnitte davon umfassen, sowie Nukleinsäuremoleküle, die zur Verwendung als Hybridisierungssonden ausreichen, zur Identifikation GPCR-ähnlicher codierender Nukleinsäuren (beispielsweise GPCR-ähnlicher mRNA) und Fragmente zur Verwendung als PCR-Primer für die Amplifikation oder Mutation von GPCR-ähnlichen Nukleinsäuremolekülen eignen, können hergestellt werden. Der Begriff "Nukleinsäuremolekül", wie er hier verwendet wird, soll DNA-Moleküle (beispielsweise cDNA oder genomische DNA) und RNA-Moleküle (beispielsweise mRNA) und Analoga der DNA oder RNA, die mit den Nukleotid-Analoga erzeugt werden, umfassen. Das Nukleinsäuremolekül kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein, ist aber vorzugsweise doppelsträngige DNA.
  • Nukleotidsequenzen, die die erfindungsgemäßen GPCR-ähnlichen Proteine codieren, umfassen die Sequenz, die in Seq.-ID.-Nr. 1 offenbart ist, die Nukleotidsequenz des cDNA-Inserts des Plasmids, das bei der ATCC als Patenthinterlegung Nr. PTA-1660 hinterlegt ist (die "cDNA von ATCC PTA-1660"), und Komplemente davon. "Komplement" soll eine Nukleotidsequenz bedeuten, die hinreichend komplementär ist zu einer gegebenen Nukleotidsequenz, so dass sie an die gegebene Nukleotidsequenz hybridisieren kann und dadurch einen stabilen Doppelstrang bildet. Die entsprechende Aminosäuresequenz für das Polypeptid, das durch diese Nukleotidsequenzen codiert wird, ist in der Seq.-ID.-Nr. 2 offenbart.
  • Nukleinsäuremoleküle, die Fragmente dieser GPCR-ähnlichen Nukleotidsequenzen sind, lassen sich ebenfalls herstellen. "Fragment" soll einen Abschnitt der Nukleotidsequenz bedeuten, der ein GPCR-ähnliches Protein codiert. Ein Fragment einer GPCR-ähnlichen Nukleotidsequenz kann einen biologisch aktiven Abschnitt eine GPCR-ähnlichen Proteins codieren, oder es kann ein Fragment sein, das als Hybridisierungssonde für PCR-Primer mit den nachstehend beschriebenen Verfahren verwendet werden kann. Ein biologisch aktiver Abschnitt eines GPCR-ähnlichen Proteins kann hergestellt werden durch Isolieren eines Abschnitt von einer der erfindungsgemäßen GPCR-ähnlichen Nukleotidsequenzen, die den codierenden Bereich des GPCR-ähnlichen Proteins exprimieren (beispielsweise durch rekombinante Expression in vitro), und Bestimmen der Aktivität des codierenden Abschnitts des GPCR-ähnlichen Proteins. Nukleinsäuremoleküle, die Fragmente einer GPCR-ähnlichen Nukleotidsequenz sind, umfassen mindestens etwa 15, 20, 50, 75, 100, 200, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5250, 5500, 5750, oder 6000 Nukleotide, oder bis zu der Anzahl der Nukleotide, die in einer hier offenbarten GPCR-ähnlichen Vollängen-Nukleotidsequenz (6090 Nukleotide für die h15571-Sequenz, die in Seq.-ID.-Nr. 1 offenbart sind) je nach der beabsichtigten Verwendung zugegen sind.
  • Ein Fragment einer GPCR-ähnlichen Nukleotidsequenz, die einen biologisch aktiven Abschnitt eines erfindungsgemäßen GPCR-ähnlichen Proteins codiert, codiert mindestens etwa 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300 durchgehende Aminosäuren oder bis zur Gesamtzahl der Aminosäuren, die in einem erfindungsgemäßen GPCR-Ähnlichen Volllängen-Polypeptid zugegen ist (1338 Aminosäuren für das Volllängen-h15571-Protein, das in der Seq.-ID.-Nr. 2 offenbart ist). Fragmente einer GPCR-ähnlichen Nukleotidsequenz, die sich als Hybridisierungssonden für PCR-Primer eignen, brauchen im Allgemeinen keinen biologisch aktiven Abschnitt eines GPCR-ähnlichen Proteins zu codieren.
  • Nukleinsäuremoleküle, die Varianten der hier offenbarten GPCR-ähnlichen Nukleotidsequenzen sind, können auch hergestellt werden. "Varianten" der GPCR-ähnlichen Nukleotidsequenzen umfassen solche Sequenzen, die die hier offenbarten GPCR-ähnlichen Proteine codieren, die sich aber aufgrund der Degeneration des genetischen Codes konservativ unterscheiden. Diese natürlich vorkommenden allelischen Varianten lassen sich durch Verwendung bekannter Molekularbiologietechniken, wie Polymerasekettenreaktion (PCR) und Hybridisierungstechniken (wie nachstehend erläutert) identifizieren. Variante Nukleotidsequenzen umfassen auch synthetisch hergeleitete Nukleotidsequenzen, die beispielsweise durch Verwendung von stellengerichteter Mutagenese hergeleitet wurden, die aber immer noch die GPCR-ähnlichen Proteine codieren, die in der vorliegenden Erfindung offenbart sind, wie nachstehend erläutert. Erfindungsgemäße Nukleotidsequenzvarianten haben gewöhnlich mindestens etwa 45%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, oder 99% Identität zu einer bestimmten hier offenbarten Nukleotidsequenz. Eine variante GPCR-ähnliche Nukleotidsequenz codiert ein GPCR-ähnliches Protein, dessen Aminosäuresequenz mindestens etwa 45%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Identität zur Aminosäuresequenz des hier offenbarten GPCR-ähnlichen Proteins aufweist.
  • Neben der in Seq.-ID.-Nr. 1 gezeigten GPCR-ähnlichen Nukleotidsequenz und der Nukleotidsequenz der cDNA von ATCC PTA-1660, geht der Fachmann davon aus, dass die DNA-Sequenz-Polymorphismen, die zu Änderungen in den Aminosäuresequenzen der GPCR-ähnlichen Proteine führen, in einer Population existieren können (beispielsweise der menschlichen Bevölkerung). Ein solcher genetischer Polymorphismus in einem GPCR-ähnlichen Gen kann unter Individuen in einer Population aufgrund natürlicher alleischer Variation bestehen. Ein Allel ist ein Gen aus einer Gruppe von Genen, die alternativ bei einem gegebenen genetischen Locus vorkommen. Wie hier verwendet, betreffen die Begriffe "Gen" und "rekombinantes Gen" Nukleinsäuremoleküle, die ein offenes Leseraster umfassen, das ein GPCR-ähnliches Protein codiert, vorzugsweise ein GPCR-ähnliches Säugetier-Protein. Wie hier verwendet, betrifft der Ausdruck "allelische Variante" eine Nukleotidsequenz, die an einem GPCR-ähnlichen Locus vorkommt, oder ein Polypeptid, das durch die Nukleotidsequenz codiert wird. Solche natürlichen allelischen Variationen können gewöhnlich zu einer 1–5%igen Varianz der Nukleotidsequenz des GPCR-ähnlichen Gens führen.
  • Nukleinsäuremoleküle, die GPCR-ähnliche Proteine aus anderen Arten (GPCR-ähnliche Homologa) codieren, die eine Nukleotidsequenz haben, die sich von der der hier offenbarten GPCR-ähnlichen Sequenzen unterscheiden, beispielsweise Nukleinsäuremoleküle, die den natürlichen allelischen Varianten und Homologa der menschlichen GPCR-ähnlichen cDNA der Erfindung entsprechen, können auf der Basis ihrer Identität zur hier offenbarten menschlichen GPCR-ähnlichen Nukleinsäure mittels Human-cDNA oder einem Abschnitt davon, als Hybridisierungssonde gemäß den Standard-Hybridisierungstechniken unter Stringenten Hybridisierungsbedingungen wie nachstehend offenbart, isoliert werden.
  • Neben den natürlich vorkommenden allelischen Varianten der GPCR-ähnlichen Sequenzen, die in der Population vorkommen können, ist sich der Fachmann darüber bewusst, dass sich Änderungen durch Mutation in die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen einbringen lassen, was somit zu Änderungen in der Aminosäuresequenz der codierten GPCR-ähnlichen Proteine führt, ohne dass die biologische Aktivität der GPCR-ähnlichen Proteine geändert wird. Somit kann ein isoliertes Nukleinsäuremolekül erzeugt werden, das ein GPCR-ähnliches Protein mit einer Sequenz hervorbringt, die sich von der von Seq.-ID.-Nr. 2 unterscheidet, indem eine oder mehrere Nukleotidsubstitutionen, Additionen, oder Deletionen in die hier offenbarte entsprechende Nukleotidsequenz eingebracht wird, so dass eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, Additionen oder Deletionen in das codierte Protein eingebracht werden. Mutationen können durch Standard-Techniken eingebracht werden, wie stellengerichtete Mutagenese und PCR-vermittelte Mutagenese. Solche varianten Nukleotidsequenzen sind ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfasst.
  • Konservative Aminosäuresubstitutionen können beispielsweise vorzugsweise aus einer oder mehreren vorhergesagten, vorzugsweise nichtessentiellen Aminosäureresten hergestellt werden. Ein "nichtessentieller" Aminosäurerest kann aus der Wildtyp-Sequenz eines GPCR-ähnlichen Proteins verändert werden (beispielsweise die Sequenz von Seq.-ID.-Nr. 2), ohne dass die biologische Aktivität verändert wird, wohingegen ein "essentieller" Aminosäurerest für die biologische Aktivität erforderlich ist. Bei einer "konservativen Aminosäuresubstitution" ist der Aminosäurerest durch einen Aminosäurerest mit einer ähnlichen Seitenkette ersetzt. Familien von Aminosäureresten mit ähnlichen Seitenketten wurden im Stand der Technik definiert. Diese Familien umfassen Aminosäuren mit basischen Seitenketten (beispielsweise Lysin, Arginin, Histidin), sauren Seitenketten (beispielsweise Asparaginsäure, Glutaminsäure), ungeladenen polaren Seitenketten (beispielsweise Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein), nichtpolaren Seitenketten (beispielsweise Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan), betaverzweigten Seitenketten (beispielsweise Threonin, Valin, Isoleucin) und aromatischen Seitenketten (beispielsweise Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Histidin). Solche Substitutionen werden nicht für konservierte Aminosäurereste oder für Aminosäurereste, die in einem konservierten Motiv liegen, vorgenommen, wie die 7 Transmembranrezeptor-Domänen (d.h., TM I, 772–793, TM II, 807–826; TM III, 836–855; TM IV, 887–904; TM V, 925–947; TM VI 1021–1040 und TM VII, 1048–1066 von Seq.-ID.-Nr. 2), wohingegen solche Reste für die Proteinaktivität essentiell sind.
  • Alternativ können variante GPCR-ähnliche Nukleotidsequenzen hergestellt werden, indem Mutationen statistisch entlang der gesamten GPCR-ähnlichen codierenden Sequenz eingebracht werden, wie durch Sättigungsmutagenese, und die resultierenden Mutanten können auf GPCR-ähnliche biologische Aktivität untersucht werden, damit Mutanten identifiziert werden, die die Aktivität behalten. Nach der Mutagenese kann das codierte Protein rekombinant exprimiert werden, und die Aktivität des Proteins kann mittels Standard-Assay-Techniken bestimmt werden.
  • Die erfindungsgemäßen GPCR-ähnlichen Nukleotidsequenzen und Fragmente und Varianten davon können als Sonden und/oder Primer zur Identifikation und/oder Klonierung GPCR-ähnlicher Homologa in anderen Zelltypen verwendet werden, beispielsweise aus anderen Geweben, sowie GPCR-ähnlichen Homologa aus anderen Säugetieren. Solche Sonden können zum Nachweisen von Transkripten oder genomischen Sequenzen verwendet werden, die die gleichen oder identischen Proteine codieren. Diese Sonden können als Teil eines diagnostischen Test-Kits zum Identifizieren von Zellen oder Geweben verwendet werden, die ein GPCR-ähnliches Proteins fehlexprimieren, wie durch Messen der Spiegel einer GPCR-ähnlichen codierenden Nukleinsäure in einer Probe von Zellen aus einem Individuum, beispielsweise Nachweisen von GPCR-ähnlichen mRNA-Spiegeln oder Bestimmen, ob ein genomisches GPCR-ähnliches Gen mutiert oder deletiert ist.
  • Auf diese Weise können Verfahren, wie PCR, Hybridisierung und dergleichen zur Identifikation solcher Sequenzen mit wesentlicher Identität zu den erfindungsgemäßen Sequenzen verwendet werden. Siehe beispielsweise Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.) und Innis et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY).
  • Bei einem Hybridisierungsverfahren kann die gesamte bekannte GPCR-ähnliche Nukleotidsequenz oder ein Teil davon zum Screening von cDNA- oder genomischen Banken verwendet werden. Verfahren zur Konstruktion solcher cDNA- und genomischen Banken sind im Stand der Technik allgemein bekannt und sind offenbart in Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.). Die so genannten Hybridisierungssonden können genomische DNA-Fragmente, cDNA-Fragmente, RNA-Fragmente oder andere Oligonukleotide sein, und sie können mit einer nachweisbaren Gruppe markiert sein, wie 32P, oder einem anderen nachweisbaren Marker, wie anderen Radioisotopen, einer fluoreszierenden Verbindung, einem Enzym oder einem Enzym-Cofaktor. Sonden für die Hybridisierung können durch Markieren von synthetischen Oligonukleotiden auf der Basis der hier offenbarten bekannten GPCR-ähnlichen Nukleotidsequenz hergestellt werden. Degenerierte Primer, die auf der Basis der konservierten Nukleotide oder Aminosäurereste in einer bekannten GPCR-ähnlichen Nukleotidsequenz oder codierten Aminosäuresequenz entwickelt werden, können zusätzlich verwendet werden. Die Sonde umfasst gewöhnlich einen Nukleotidsequenzbereich, der unter stringenten Bedingungen an mindestens 12, vorzugsweise etwa 25, stärker bevorzugt etwa 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350 oder 400 aufeinander folgende Nukleotide einer erfindungsgemäßen GPCR-ähnlichen Nukeotidsequenz oder ein Fragment oder eine Variante davon hybridisiert. Die Herstellung der Sonden zur Hybridisierung ist im Stand der Technik allgemein bekannt und in Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York) offenbart.
  • Ein vorher unidentifiziertes GPCR-ähnliches Nukleinsäuremolekül hybridisiert unter stringenten Bedingungen an eine Sonde, die ein Nukleinsäuremolekül ist, umfassend eine der erfindungsgemäßen GPCR-ähnlichen Nukleinsäuresequenzen oder ein Fragment davon. Das vorher unbekannte GPCR-ähnliche Nukleinsäuremolekül ist mindestens etwa 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 oder 6000 Nukleotide lang und hybridisiert unter stringenten Bedingungen an eine Sonde, d.h. an ein Nukleinsäuremolekül, das eine der hier offenbarten GPCR-ähnlichen Nukleotidsequenzen oder ein Fragment davon umfasst.
  • Folglich ist ein isoliertes zuvor unbekanntes GPCR-ähnliches Nukleinsäuremolekül etwa 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, oder 1400 Nukleotide lang und hybridisiert unter stringenten Bedingungen an eine Sonde, d.h. an ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen, vorzugsweise die codierende Sequenz, die in der Seq.-ID.-Nr. 1 offenbart ist, die cDNA von ATCC PCTA-1660 oder ein Komplement, Fragment oder eine Variante davon.
  • Der Begriff "hybridisiert unter stringenten Bedingungen" soll Bedingungen zum Hybridisieren und Waschen beschreiben, unter denen Nukleotidsequenzen mit mindestens etwa 60%, 65%, 70%, vorzugsweise 75% Identität zueinander gewöhnlich aneinander hybridisiert bleiben. Solche stringenten Bedingungen sind dem Fachmann bekannt und befinden sich in Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York (1989)), 6.3.1–6.3.6. Ein bevorzugtes, nicht einschränkendes Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen in 6 × Natriumchlorid/Natriumcitrat (SSC) bei etwa 45 EC, gefolgt von einem oder mehreren Waschschritten in 0,2 × SSC, 0,1% SDS ei 50–65 EC. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfassen die stringenten Bedingungen eine Hybridisierung in 6 × SSC bei 42 EC, gefolgt von einem Waschritt in 1 × SSC bei 55 EC. Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das unter stringenten Bedingungen an eine erfindungsgemäße GPCR-ähnliche Sequenz hybridisiert, entspricht vorzugsweise einem natürlich vorkommenden Nukleinsäuremolekül. Wie hier verwendet betrifft ein "natürlich vorkommendes" Nukleinsäuremolekül ein RNA- oder DNA-Molekül mit einer Nukleinsäuresequenz, die in der Natur vorkommt (d.h. sie codiert ein natürliches Protein).
  • Antisense-Nukleinsäuremoleküle, d.h. Moleküle, die zu einer Sense-Nukleinsäure komplementär sind, die ein Protein codieren, beispielsweise komplementär zum codierenden Strang eines doppelsträngigen cDNA-Moleküls oder komplementär zu einer mRNA-Sequenz, können ebenfalls hergestellt werden. Folglich kann eine Antisense-Nukleinsäure eine Wasserstoffbrückenbindung zu einer Sense-Nukleinsäure bilden. Die Antisense-Nukleinsäure kann komplementär sein zu einem gesamten GPCR-ähnlichen codierenden Strang oder nur zu einem Anteil davon, beispielsweise zum gesamten proteincodierenden Bereich oder einem Teil davon (oder zum offenen Leseraster). Ein Antisense-Nukleinsäure-Molekül kann antisense zu einem nicht-codierenden Bereich des codierenden Strangs einer Nukleotidsequenz sein, die ein GPCR-ähnliches Protien codiert. Die nicht-codierenden Bereiche sind die 5'- und 3'-Sequenzen, die den codierenden Bereich flankieren und die nicht zu Aminosäuren translatiert werden.
  • Bei gegebener Sequenz des codierenden Stranges, die ein hier offenbartes GPCR-ähnliches Protein codiert (beispielsweise die Sequenz des codierenden Stranges von Seq.-ID.-Nr. 1) können die Antisense-Nukleinsäuren gemäß den Basenpaarungs-Regeln von Watson und Crick aufgebaut sein. Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann komplementär sein zum gesamten codierenden Bereich der GPCR-ähnlichen mRNA, ist aber stärker bevorzugt ein Oligonukleotid, das nur zu einem Teil des codierenden oder nicht-codierenden Bereichs der GPCR-ähnlichen mRNA antisense ist. Das Antisense-Oligonukleotid kann beispielsweise zu dem Bereich komplementär sein, der die Translationsstartstelle der GPCR-ähnlichen mRNA umgibt. Ein Antisense-Oligonukleotid kann beispielsweise etwa 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Nukleotide lang sein. Eine Antisense-Nukleinsäure kann mittels chemischer Synthese und enzymatischen Ligationsverfahren des Standes der Technik hergestellt werden.
  • Eine Antisense-Nukleinsäure (beispielsweise ein Antisense-Oligonukleotid) kann beispielsweise chemisch synthetisiert werden, wobei natürlich vorkommende Nukleotide oder verschiedentlich modifizierte Nukleotide verwendet werden, die so ausgelegt sind, dass sie die biologische Stabilität der Moleküle steigern, oder dass sie die physikalische Stabilität des Doppelstranges steigern, der sich zwischen den Antisense- und Sense-Nukleinsäuren bildet, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf beispielsweise Phosphorthioat-Derivate und Acridin-substituierte Nukleotide. Alternativ kann die Antisense-Nukleinsäure biologisch hergestellt werden mit einem Expressionsvektor, in den eine Nukleinsäure in Antisense-Orientierung einkloniert wurde (d.h. RNA, transkribiert aus der insertierten Nukleinsäure, hat Antisense-Orientierung zu einer Ziel-Nukleinsäure von Interesse, wie es weiter in dem folgenden Unterabschnitt beschrieben ist).
  • Bei therapeutischer Verwendung werden die Antisense-Nukleinsäuremoleküle gewöhnlich an ein Individuum verabreicht oder in situ erzeugt, so dass sie mit der zellulären mRNA und/oder genomischen DNA hybridisieren oder daran binden, die ein GPCR-ähnliches Protein codiert, wodurch die Expression des Proteins gehemmt wird, beispielsweise durch Hemmen der Transkription und/oder Tranlation. Ein Beispiel für einen Verabreichungsweg für Antisense-Nukleinsäuremoleküle beinhaltet die direkte Injektion an einer Gewebestelle. Alternativ können die Antisense-Nukleinsäuremoleküle so modifiziert werden, dass sie selektierte Zellen anzielen, und dann systemisch verabreicht werden. Antisense-Moleküle, können beispielsweise an Peptide oder Antikörper gebunden sein, damit sie einen Komplex bilden, der spezifisch an Rezeptoren oder Antigene bindet, die auf einer selektierten Zelloberfläche exprimiert werden. Die Antisense-Nukleinsäuremoleküle können mit den hier beschriebenen Vektoren ebenfalls an Zellen abgegeben werden. Zur Erzielung ausreichender intrazellulärer Konzentrationen der Antisense-Moleküle, sind Vektorkonstrukte, in denen das Antisense-Nukleinsäuremolekül unter der Kontrolle eines starken Pol II- oder Pol III-Promotor steht, bevorzugt.
  • Ein Antisense-Nukleinsäuremolekül kann ein enantiomeres Nukleinsäuremolekül sein. Ein α-anomeres Nukleinsäuremolekül bildet spezifische doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA, in der im Gegensatz zu den üblichen β-Einheiten die Stränge parallel zu einander verlaufen (Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 6625–6641). Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann ebenfalls ein 2'-o-Methylribonukleotid (Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 6131–6148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analogon (Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215: 327–330) umfassen.
  • Ribozyme, d.h. katalytische RNA-Moleküle mit Ribonukleaseaktivität, die eine einzelsträngige Nukleinsäure, wie mRNA, spalten können, zu der sie einen komplementären Bereich aufweisen, lassen sich herstellen. Ribozyme (beispielsweise Hammerkopf-Ribozyme (beschrieben in Haselhoff und Gerlach (1988) Nature 334: 585–591)) können zur katalytischen Spaltung GPCR-ähnlicher mRNA-Transkripte verwendet werden, wodurch die Translation der GPCR-ähnlichen mRNA gehemmt wird. Ein Ribozym mit Spezifität für eine GPCR-ähnliche codierende Nukleinsäure kann auf der Basis der Nukleotidsequenz einer hier offenbarten GPCR-ähnlichen cDNA entwickelt werden (beispielsweise Seq.-ID.-Nr. 1) Siehe beispielsweise Cech et al., US-Patent Nr. 4,987,071; und Cech et al., US-Patent Nr. 5,116,742. Alternativ kann die GPCR-ähnliche mRNA zur Selektion einer katalytischen RNA mit einer spezifischen Ribonukleaseaktivität aus einem Pool aus RNA-Molekülen verwendet werden. Siehe beispielsweise Bartel und Szostak (1993) Science 261: 1411–1418.
  • Nukleinsäuremoleküle, die eine dreifache Helixstruktur bilden, können ebenfalls hergestellt werden. Beispielsweise kann die GPCR-ähnliche Genexpression gehemmt werden durch Anzielen von Nukleinsäuresequenzen, die zum regulatorischen Bereich des GPCR-ähnlichen Protein komplementär sind (beispielsweise der GPCR-ähnliche Promotor und/oder Enhancer), so dass dreifache Helixstrukturen erzeugt werden, die die Transkription des GPCR-ähnlichen Gens in Zielzellen hemmen. Siehe im Allgemeinen Helene (1991) Anticancer Drug Des. 6(6): 569; Helene (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660: 27 und Maher (1992) Bioassays 14 (12): 807.
  • Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können an der Baseneinheit, Zuckereinheit oder am Phosphatgerüst modifiziert werden, so dass beispielsweise die Stabilität, Hybridisierung oder Löslichkeit des Moleküls verbessert wird. Das Desoxyribose-Phosphatgerüst der Nukleinsäuren kann derart modifiziert werden, dass Peptid-Nukleinsäuren erzeugt werden (siehe Hyrup et al., (1996) Bioorganic & Medicinal Chemistry 4: 5). Wie hier verwendet, betreffen die Begriffe "Peptid-Nukleinsäuren" oder "PNAs" Nukleinsäure-Mimetika, beispielsweise DNA-Mimetika, in denen das Desoxyribosephosphatgerüst durch ein Pseudopeptid-Gerüst ersetzt ist und nur die vier natürlichen Nukleobasen behalten werden. Das neutrale Gerüst der PNAs ermöglicht die spezifische Hybridisierung an DNA und RNA unter Bedingungen niedriger Ionenstärke. Die Synthese von PNA-Oligomeren kann mit Standard-Festphasen-Peptidsyntheseprotokollen wie beschrieben durchgeführt werden, wie beispielsweise beschrieben in Hyrup et al., (1996), siehe oben; Perry-O'-Keefe et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14670.
  • PNAs eines GPCR-ähnlichen Moleküls können in therapeutischen und diagnostischen Anwendungen verwendet werden. PNAs können beispielsweise als Antisense- oder Antigen-Mittel für die sequenzspezifische Modulation der Genexpresseion verwendet werden, beispielsweise durch Induzieren der Transkriptions- oder Translationsarretierung oder Hemmen der Replikation. PNAs können auch beispielsweise bei der Analyse von Einzelbasis-Paarmutationen in einem Gen verwendet werden durch beispielsweise PNA-gerichtetes PCR-Clamping; als künstliche Restriktionsenzyme bei Verwendung in Kombination mit anderen Enzymen, beispielsweise S1-Nuklease (Hyrup (1996), siehe oben); oder als Sonden oder Primer für DNA-Sequenz und Hybridisierung (Hyrup (1996), siehe oben; Perry-O'Keefe et al. (1996), siehe oben).
  • PNAs eines GPCR-ähnlichen Moleküls lassen sich modifizieren, beispielsweise zum Steigern ihrer Stabilität, Spezifität, oder der Zellaufnahme, indem lipophile oder andere Helfergruppen an die PNA gebunden werden, durch die Bildung von PNA-DNA-Chimären, oder durch die Verwendung von Liposomen oder durch andere Techniken der Medikamentenaufnahme des Standes der Technik. Die Synthese von PNA-DNA-Chimären kann durchgeführt werden, wie beschrieben in Hyrup (1996), siehe oben; Finn et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24 (17): 3357–53; Mag et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 5973; und Peterson et al. (1975) Bioorganic Med. Chem. Lett. 5: 1119.
  • II. Isolierte GPCR-ähnliche Proteine und Anti-GPCR-ähnliche Antikörper
  • GPCR-ähnliche Proteine sind ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfasst. "GPCR-ähnliches Protein" soll ein Protein bedeuten, das die in Seq.-ID.-Nr. 2 offenbarte Aminosäuresequenz umfasst.
  • "Fragmente" oder "biologisch aktive Abschnitte" umfassen Polypeptidfragmente, die sich zur Verwendung als Immunogene eignen, um Anti-GPCR-ähnliche Antikörper hervorzurufen. Fragmente umfassen Peptide, die die Aminosäuresequenzen umfassen, welche hinreichend identisch sind zu der Aminosäuresequenz eines GPCR-ähnlichen Proteins oder davon hergeleitet sind, oder ein Partiallängenprotein der Erfindung und mit mindestens einer Aktivität eines GPCR-ähnlichen Proteins, das aber weniger Aminosäuren als das hier offenbarte Vollängen-GPCR-ähnliche Protein (Seq.-ID.-Nr. 2) enthält. Gewöhnlich umfassen biologisch aktive Abschnitt eine Domäne oder ein Motiv mit mindestens einer Aktivität des GPCR-ähnlichen Proteins. Ein biologisch aktiver Abschnitt eines GPCR-ähnlichen Proteins kann ein Polypeptid sein, das beispielsweise 10, 25, 50, 100 oder mehr Aminosäuren lang ist. Solche biologisch aktiven Abschnitte können durch Rekombinationstechniken hergestellt werden und auf ein oder mehrere funktionelle Aktivitäten eines nativen GPCR-ähnlichen Proteins untersucht werden. Wie hier verwendet umfasst ein Fragment mindestens 7 durchgehende Aminosäuren der Seq.-ID.-Nr. 2.
  • Biologisch aktive Fragmente (Peptide, die beispielsweise 5, 7, 10, 12, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 oder mehr Aminosäuren lang sind) können beispielsweise eine Domäne oder ein Motiv umfassen, beispielsweise leucinreiche Wiederholungen und leucinreiche C-terminale Domänen, Latrophilin/CL-1-ähnliche GPS-Domäne, Immunglobulin-Domäne, 7 Transmembran-Rezeptor-Domänen und Stellen für die Glycosilierung, Protein-Kinase-C-Phosphorylierung, Caseinkinase-II-Phosphorylierung, Glycosaminoglycanbindung, Amidierung, N-Myristoylierung, prokaryotische Membranlipoproteinlipidbindung und RGD-Zell-Bindung. Weiterhin mögliche Fragmerte umfassen Stellen, die wichtig sind für zelluläres und subzelluläres Targetting. Fragmente können beispielsweise in einer oder beiden Richtungen von der funktionellen Stelle verlaufen, so dass 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 oder bis zu 100 Aminosäuren umfasst werden. Weiter können Fragmente Subfragmente der vorstehend genannten spezifischen Domänen umfassen, wobei die Subfragmente die Funktion der Domäne beibehalten, von denen sie hergeleitet sind. Solche Domänen oder Motive und ihre Subfragmente können mit Hilfe von routinemäßigen computerisierten Homologie-Suchverfahren identifiziert werden.
  • Fragmente mit immunogenen Eigenschaften lassen sich ebenfalls herstellen. Diese enthalten einen Epitop-tragenden Abschnitt der erfindungsgemäßen GPCR-ähnlichen Polypeptide. Diese epitoptragenden Peptide eignen sich zur Erzeugung von Antikörpern, die spezifisch an ein GPCR-ähnliches Polypeptid oder einen Bereich oder Fragment binden. Diese Peptide können zumindest 10, 12, mindestens 14 oder zwischen mindestens etwa 15 bis etwa 30 Aminosäuren enthalten. Nicht-einschränkende Beispiele für antigene Polypeptide, die sich zur Erzeugung von Antikörpern verwenden lassen, umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf Peptide, die von einer extrazellulären Stelle hergeleitet sind. Bereiche mit einem hohen Antigenitätsindex sind in der 3 für das h15571-Polypeptid gezeigt. Intrazelluläre hergestellte Antikörper ("Intrakörper") sind ebenfalls umfasst, die intrazelluläre Peptidbereiche erkennen. Die Epitop-tragenden GPCR-ähnlichen Polypeptide können durch beliebige herkömmliche Maßnahmen erzeugt werden (Houghten, R. A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5131–5135). Simultane multiple Peptidsynthese ist in US-Patent Nr. 4,631,211 beschrieben.
  • "Varianten" steht für Proteine oder Polypeptide mit einer Aminosäuresequenz, die mindestens 45%, 55%, 60%, 65%, vorzugsweise etwa 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, oder 99% identisch zur Aminosäuresequenz von Seq.-ID.-Nr. 2 ist. Varianten umfassen auch Polypeptide, die von dem cDNA-Insert des Plasmids codiert werden, das bei der ATCC als Patenthinterlegung Nr. PTA-1660 hinterlegt ist, oder Polypeptide, die von einem Nukleinsäuremolekül codiert werden, das an das Nukleinsäuremolekül von Seq.-ID.-Nr. 1 oder ein Komplement davon unter stringenten Bedingungen hybridisiert. Solche Varianten behalten die funktionelle Aktivität der erfindungsgemäßen GPCR-ähnlichen Proteine. Varianten umfassen Polypeptide, deren Aminosäuresequenz sich aufgrund natürlicher allelischer Variation der Mutagenese unterscheidet.
  • GPCR-ähnliche Chimären oder Fusionsproteine können ebenfalls hergestellt werden. Wie hier verwendet umfasst ein GPCR-ähnliches "chimäres Protein" oder ein "Fusionsprotein" ein GPCR-ähnliches Polypeptid, das funktionsfähig an ein nicht-GPCR-ähnliches Polypeptid gebunden ist. Ein "GPCR-ähnliches Polypeptid" betrifft ein Polypeptid, dessen Aminosäuresequenz einem GPCR-ähnlichen Protein entspricht, wohingegen ein "nicht-GPCR-ähnliches Polypeptid" ein Polypeptid betrifft, dessen Aminosäuresequenz einem Protein entspricht, das nicht wesentlich identisch zu dem GPCR-ähnlichen Protein ist, beispielsweise ein Protein, das sich von dem GPCR-ähnlichen Protein unterscheidet, und das vom gleichen oder einem anderen Organismus stammt. In einem GPCR-ähnlichen Fusionsprotein kann das GPCR-ähnliche Polypeptid dem gesamten GPCR-ähnlichen Protein oder einem Teil davon entsprechen, vorzugsweise mindestens einem biologisch aktiven Anschnitt eines GPCR-ähnlichen Protein. In dem Fusionsprotein bedeutet der Begriff "funktionsfähig gebunden", dass das GPCR-ähnliche Polypeptid und das nicht-GPCR-ähnliche Polypeptid im Leseraster aneinander gebunden sind. Das nicht-GPCR-ähnliche Polypeptid kann an den N-Terminus oder C-Terminus des GPCR-ähnlichen Polypeptids gebunden sein.
  • Ein geeignetes Fusionsprotein ist ein GST-GPCR-ähnliches Fusionsprotein, in dem die GPCR-ähnlichen Sequenzen an den C-Terminus der GST-Sequenzen gebunden sind. Solche Fusionsproteine können die Reinigung rekombinanter GPCR-ähnlicher Proteine erleichtern.
  • Das Fusionsprotein ist ein GPCR-ähnliches Immunglobulin-Fusionsprotein, in dem das gesamte GPCR-ähnliche Protein oder ein Teil davon an Sequenzen gebunden ist, die von einem Mitglied der Immunglobulinfamilie hergeleitet sind. Die GPCR-ähnlichen Immunglobulin-Fusionsproteine können in pharmazeutische Zusammensetzungen eingebracht werden und an ein Individuum verabreicht werden, damit eine Wechselwirkung zwischen einem GPCR-ähnlichen Ligand und einem GPCR-ähnlichen Protein auf der Oberfläche einer Zelle gehindert wird, wodurch die GPCR-ähnliche vermittelte Signaltransduktion in vivo unterdrückt wird. Die GPCR-Immunglobulin-Fusionsproteine lassen sich zum Beeinflussen der biologischen Verfügbarkeit eines GPCR-ähnlichen verwandten Liganden verwenden. Die Hemmung der GPCR-ähnlichen Ligand/GPCR-ähnlichen Wechselwirkung kann therapeutisch geeignet sein, und zwar zur Behandlung proliferativer und differentieller Störungen und zum Modulieren (beispielsweise Fördern oder Hemmen) des Zellüberlebens. Darüber hinaus können die GPCR-ähnlichen Immunglobulin-Fusionsproteine als Immunogene zur Produktion von Anti-GPCR-ähnlichen Antikörpern in einem Individuum, so dass GPCR-ähnliche Liganden gereinigt werden, und in Screening-Tests verwendet werden, damit Moleküle identifiziert werden, die die Wechselwirkung eines GPCR-ähnlichen Proteins mit einem GPCR-ähnlichen Ligand hemmen.
  • Ein GPCR-ähnliches chimäres oder Fusionsprotein wird durch Standard-DNA-Rekombinationstechniken produziert. DNA-Fragmente, die verschiedene Polypeptidsequenzen codieren, können im Leseraster aneinander ligiert werden, oder das Fusionsgen kann beispielsweise mit automatischen DNA-Synthesegeräten synthetisiert werden. Alternativ kann die PCR-Amplifikation der Genfragmente mit Ankerprimern durchgeführt werden, die komplementäre Überhänge zwischen den aufeinanderfolgenden Genfragmenten erzeugen, die anschließend hybridisiert und erneut amplifiziert werden können, so dass eine chimäre Gensequenz erzeugt wird (siehe beispielsweise Ausubel et al., Hrsg. (1995) Current Protocols in Molecular Biology) (Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY). Darüber hinaus kann eine ein GPCR-ähnliches Protein codierende Nukleinsäure in einen kommerziell erhältlichen Expressionsvektor kloniert werden, so dass sie im Leseraster an eine existierende Bindungseinheit gebunden wird.
  • Varianten der GPCR-ähnlichen Proteine können entweder als GPCR-ähnliche Agonisten (Mimetika) oder als GPCR-ähnliche Antagonisten wirken. Varianten des GPCR-ähnlichen Proteins können durch Mutagenese erzeugt werden, beispielsweise durch eine bestimmte Punktmutation oder eine Verkürzung des GPCR-ähnlichen Proteins. Ein Agonist des GPCR-ähnlichen Proteins kann im Wesentlichen die gleichen oder ein Teil der biologischen Aktivitäten der natürlich vorkommenden Form des GPCR-ähnlichen Proteins beibehalten. Ein Antagonist des GPCR-ähnlichen Proteins kann eine oder mehrere Aktivitäten der natürlich vorkommenden Form des GPCR-ähnlichen Proteins hemmen, beispielsweise durch kompetitive Bindung an ein stromabwärts oder stromaufwärts gelegenes Mitglied einer zellulären Signalkaskade, die das GPCR-ähnliche Protein enthält. Somit können spezifische Effekte durch die Behandlung mit einer Variante mit eingeschränkter Funktion ausgelöst werden. Die Behandlung eines Individuums mit einer Variante mit einer Teilmenge an biologischen Aktivitäten der natürlich vorkommenden Form des Proteins kann weniger Nebenwirkungen in einem Individuum im Vergleich zur Behandlung mit der natürlich vorkommenden Form der GPCR-ähnlichen Proteine haben.
  • Varianten eines GPCR-ähnlichen Proteins, die entweder als GPCR-ähnliche Agonisten oder als GPCR-ähnliche Antagonisten wirken, können durch Screening kombinatorischer Banken von Mutanten identifiziert werden, beispielsweise Verkürzungsmutanten, eines GPCR-ähnlichen Proteins für die Aktivität des GPCR-ähnlichen Protein-Agonist oder Antagonist. Ein Variegationsbank von GPCR-ähnlichen Varianten wird durch kombinatorische Mutagenese auf dem Nukleinsäureniveau erzeugt und wird von einer Variegations-Genbank codiert. Eine Variegationsbank GPCR-ähnlicher Varianten kann beispielsweise durch enzymatisches Ligieren eines Gemischs synthetischer Oligonukleotide in Gensequenzen hergestellt werden, so dass ein degenerierter Satz potentieller GPCR-ähnlicher Sequenzen als einzelne Polypeptide exprimierbar ist, oder alternativ als Satz größerer Fusionsproteine (beispielsweise Phagen-Display), die den Satz der GPCR-ähnlichen Sequenzen enthalten. Es gibt eine Reihe von Verfahren, die zur Produktion von Banken aus potentiellen GPCR-ähnlichen Varianten aus einer degenerierten Oligonukleotid-Sequenz verwendet werden können. Die chemische Synthese einer degenerierten Gensequenz kann in einem DNA-Syntheseautomaten durchgeführt werden, und das synthetische Gen dann in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert werden. Die Verwendung eines degenerierten Satzes von Genen ermöglicht die Bereitstellung in einem Gemisch sämtlicher Sequenzen, die den gewünschten Satz an potentiellen GPCR-ähnlichen Sequenzen codieren. Verfahren zur Synthese degenerierter Oligonukleotide sind im Stand der Technik bekannt (siehe beispielsweise Narang (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323: Itakura et al., (1984) Science 198: 1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11: 477).
  • Zudem können Banken von Fragmenten einer ein GPCR-ähnliches Protein codierenden Sequenz verwendet werden, um eine variegierte Population von GPCR-ähnlichen Fragmenten zum Screening und zur anschließenden Selektion von Varianten eines GPCR-ähnlichen Proteins zu erzeugen. Eine Bank codierender Sequenzfragmente kann erzeugt werden durch Behandeln eines doppelsträngigen PCR-Fragmentes einer GPCR-ähnlichen codierenden Sequenz mit einer Nuklease unter Bedingungen, bei denen ein Einzelstrangbruch nur einmal pro Molekül erfolgt, Denaturieren der doppelsträngigen DNA, Renaturieren der DNA, so dass doppelsträngige DNA entsteht, die Sense/Antisense-Paare verschiedener Einzelstrangbruch-Produkte umfasst, Entfernen der einzelsträngigen Abschnitte aus den reformierten Doppelsträngen durch Behandlung mit S1-Nuklease und Ligieren der resultierenden Fragmentbank in einen Expressionsvektor. Durch dieses Verfahren kann man eine Expressionsbank herleiten, die N-terminate und interne Fragmente verschiedener Größen des GPCR-ähnlichen Proteins codiert.
  • Es gibt mehrere Techniken im Stand der Technik zum Screening von Genprodukten kombinatorischer Banken, die durch Punktmutationen oder Verkürzung hergestellt wurden, und zum Screening von cDNA-Banken auf Genprodukte mit einer ausgewählten Eigenschaft. Solche Techniken lassen sich an das rasche Screening der Genbanken anpassen, die durch die kombinatorische Mutagenese GPCR-ähnlicher Proteine erzeugt werden. Die am weitesten verbreiteten Techniken, die für eine Hochdurchsatz-Analyse zugänglich sind, zum Screening großer Genbanken umfassen gewöhnlich das Klonieren der Genbank in replizierbare Expressionsvektoren, Transformieren geeigneter Zellen mit der resultierenden Vektorbank und Exprimieren der kombinatorischen Gene unter Bedingungen, in denen der Nachweis einer gewünschten Aktivität die Isolation des Vektors erleichtert, der das Gen codiert, dessen Produkt nachgewiesen wurde. Recursive-Ensemble-Mutagenese (REM), eine Technik, die die Häufigkeit funktioneller Mutanten in den Banken steigert, kann in Kombination mit den Screening-Tests verwendet werden, zur Identifikation GPCR-ähnlicher Varianten (Arkin und Yourvan (1992) Proc Natl. Acad. Sci. USA 89; 7811–7815; Delgrave et al. (1983) Protein Engineering 6(3): 327–331).
  • Ein isoliertes GPCR-ähnliches Polypeptid oder Fragmente davon können mittels Standard-Techniken für polyklonale und monoklonale Antikörper-Präparation als Immunogen zum Erzeugen von Antikörpern verwendet werden, die GPCR-ähnliche Proteine binden. Das Volllängen-GPCR-ähnliche Protein kann verwendet werden, oder alternativ stellt die Erfindung antigene Peptidfragmente von GPCR-ähnlichen Proteinen zur Verwendung als Immunogene bereit. Das antigene Peptid eines GPCR-ähnlichen Proteins umfasst mindestens 8, vorzugsweise 10, 15, 20 oder 30 Aminosäurereste der Aminosäuresequenz, die in Seq.-ID.-Nr. 2 gezeigt ist, und es umfasst ein Epitop eines GPCR-ähnlichen Proteins, so dass ein Antikörper, der gegen das Peptid erzeugt wird, einen spezifischen Immunkomplex mit dem GPCR-ähnlichen Protein bildet. Bevorzugte Epitope, die von dem antigenen Peptid umfasst sind, sind Bereiche eines GPCR-ähnlichen Proteins, die sich auf der Oberfläche des Proteins befinden, beispielsweise hydrophile Bereiche.
  • Folglich betrifft ein weiterer Aspekt der Erfindung anti-GPCR-ähnliche polyklonale und monoklonale Antikörper, die an ein GPCR-ähnliches Protein binden. Polyklonale anti-GPCR-ähnliche Antikörper lassen sich herstellen durch Immunisieren eines geeigneten Individuums (beispielsweise Kaninchen, Ziege, Maus oder ein anderes Säugetier) mit einem GPCR-ähnlichen Immunogen. Der anti-GPCR-ähnliche Antikörper-Titer in dem immunisierten Individuum kann über die Zeit durch Standard-Techniken überwacht werden, wie mit einem Enzymimmuntest (ELISA) mittels immobilisiertem GPCR-ähnlichen Protein. Geeignete Zeit nach der Immunisierung, beispielsweise wenn die Titer der anti-GPCR-ähnlichen Antikörper am höchsten sind, können antikörperproduzierende Zellen aus dem Individuum erhalten werden und zur Herstellung monoklonaler Antikörper durch Standard-Techniken verwendet werden, wie durch Hybridom-Technik, die ursprünglich von Köhler und Milstein (1975) Nature 256: 495–497, beschrieben wurde, Human-B-Zell-Hybridomtechnik (Kozbor et al. (1983) Immunol. Today 4: 72), EBV-Hybridom-Technik (Cole et al., (1985) in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Hrsg. Reisfeld und Sell (Alan R. Liss. Inc. New York, NY), S. 77–96) oder Triom-Techniken. Die Technologie zum Erzeugen von Hybridomas ist bekannt (siehe im Allgemeinen Coligan et al., Hrsg. (1994) Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons, Inc., New York, NY); Galfre et al., (1977), Nature 266: 55052; Kenneth (1980) in Monoclonal Antibodies: A New Dimension in Biological Analyses (Plenum Publishing Corp. NY; und Lerner (1981) Yale J. Biol. Med. 54: 387–402).
  • Alternativ zur Herstellung monoklonaler antikörpersezernierender Hybridome kann ein Anti-GPCR-ähnlicher Antikörper identifiziert und isoliert werden, indem eine rekombinante kombinatorische Immunglobulinbank (beispielsweise eine Antikörper-Phagen-Display-Bank) mit einem GPCR-ähnlichen Protein gescreent wird, wodurch Immunglobulinbankmitglieder isoliert werden, die das GPCR-ähnliche Protein binden. Kits zum Erzeugen und Screening von Phage-Display-Banken sind kommerziell erhältlich (beispielsweise das Rekombinante Phagen-Antikörper-System von Pharmacia, Katalog Nr. 27-9400-01; und der Phage-Display-Kit SurfZAP9 von Stratagene, Katalog Nr. 240612). Zusätzliche Beispiele für Verfahren und Reagenzien, die besonders zugänglich sind für die Verwendung bei der Erzeugung und Screening einer Antikörper-Display-Bank, können beispielsweise gefunden werden in U.S. Pat. Nr. 5,223,409; PCT Veröffentlichungen Nr. WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; 93/01288; WO 92/01047; 92/09690; und 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9: 1370–1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3: 81–85; Huse et al. (1989) Science 246: 1275–1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12: 725–734.
  • Rekombinante Anti-GPCR-ähnliche Antikörper, wie chimäre und humanisierte monoklonale Antikörper, die menschliche und nicht-menschliche Abschnitte umfassen, die mit Standard-DNA-Rekombinationstechniken hergestellt werden können, sind im Schutzbereich der Erfindung. Diese chimären und humanisierten monoklonalen Antikörper können durch rekombinante DNA-Techniken des Standes der Technik produziert werden, beispielsweise mittels Verfahren, die in den PCT Veröffentlichungen Nr. WO 86/101533 und WO 87/02671; europäische Patentanmeldungen Nr. 184,187, 171,496, 125,023, und 173,494; U.S. Patent Nr. 4,816,567 und 5,225,539; europäische Patentanmeldung 125,023; Better et al. (1988) Science 240: 1041–1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439–3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139: 3521–3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214–218; Nishimura et al. (1987) Canc. Res. 47: 999–1005; Wood et al. (1985) Nature 314: 446–449; Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553–1559); Morrison (1985) Science 229: 1202–1207; Oi et al. (1986) Bio/Techniques 4: 214; Jones et al. (1986) Nature 321: 552–525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239: 1534; und Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141: 4053–4060 beschrieben sind.
  • Vollständig menschliche Antikörper sind besonders gewünscht für die therapeutische Behandlung von Humanpatienten. Solche Patienten können produziert werden mittels transgener Mäuse, die keine endogenen schwere- und leichte-Ketten-Gene von Immunglobulinen exprimieren können, die aber die Gene für die humane schwere und leichte Kette exprimieren können. Siehe beispielsweise Lonberg und Huszar (1995) Int. Rev. Immunol. 13: 65–93); und U.S. Patent Nr. 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661,016; und 5,545,806. Firmen, wie Abgenix, Inc. (Fremont, CA) können außerdem dazu angehalten werden humane Antikörper bereitzustellen, die gegen ein ausgewähltes Antigen gerichtet sind, wobei eine ähnliche Technik wie oben beschrieben eingesetzt wird.
  • Vollständig menschliche Antikörper, die ein ausgewähltes Epitop erkennen, können mit einer Technik erzeugt werden, die eine Technik verwendet, die als "gesteuerte Selektion" bezeichnet wird. In diesem Ansatz wird ein selektierter Nicht-menschlicher monoklonaler Antikörper, beispielsweise ein Maus-Antikörper zum Steuern der Selektion eines vollständig menschlichen Antikörpers verwendet, der das gleiche Epitop erkennt. Diese Technologie ist in Jespers et al. (1994) Bio/Technology 12: 899–903 beschrieben.
  • Ein anti-GPCR-ähnlicher Antikörper (beispielsweise ein monoklonaler Antikörper) kann zur Isolation GPCR-ähnlicher Proteine durch Standard-Techniken verwendet werden, wie Affinitätschromatographie oder Immunfällung. Ein anti-GPCR-ähnlicher Antikörper kann die Reinigung des natürlichen GPCR-ähnlichen Protein aus Zellen und von rekombinant erzeugtem GPCR-ähnlichem Protein erleichtern, das in Wirtszellen exprimiert wird. Darüber hinaus kann ein anti-GPCR-ähnlicher Antikörper zum Nachweisen des GPCR-ähnlichen Proteins verwendet werden (beispielsweise in einem Zelllysat oder Zellüberstand), damit die Abundanz und das Expressionsmuster des GPCR-ähnlichen Proteins untersucht wird. Anti-GPCR-ähnliche Antikörper können diagnostisch zur Überwachung der Proteinmengen in Gewebe als Teil eines klinischen Testverfahrens verwendet werden, beispielsweise um die Effizienz eines gegebenen Behandlungsschemas zu bestimmen. Der Nachweis kann erleichtert werden durch Koppeln des Antikörpers an eine nachweisbare Substanz. Beispiele für nachweisbare Substanzen beinhalten verschiedene Enzyme, prosthetische Gruppen, fluoreszierende Materialien, lumineszierende Materialien, biolumineszierende Materialien und radioaktive Materialien. Beispiele für geeignete Enzyme umfassen Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase, β-Galactosidae oder Acetylcholinesterase; Beispiele für geeignete prosthetische Gruppen umfassen Streptavidin und Avidin/Biotin; Beispiele für geeignete fluoreszierende Materialien umfassen Umbelliferon, Fluorescein, Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin, Dichlortriazinylaminfluorescein, Dansylchlorid oder Phycoerythrin; ein Beispiel für ein lumineszierendes Material umfasst Luminol; Beispiele für biolumineszierende Materialien umfassen Luciferase, Luciferin und Sequorin; und Beispiele für geeignete radioaktive Materialien umfassen 125I, 131I, 35S oder 3H.
  • Zudem kann ein Antikörper (oder ein Fragment davon) an eine therapeutische Einheit konjugiert werden, wie ein Cytotoxin, ein therapeutischen Mittel oder ein radioaktives Metallion. Ein Cytotoxin oder cytotoxisches Mittel umfasst jedes beliebige Mittel, das den Zellen schadet. Beispiele umfassen Taxol, Cytochalasin, B, Gramicidin D, Ethidiumbromid, Emetin, Mitomycin, Etoposid, Tenoposid, Vincristin, Vinblastin, Colchicin, Doxorubicin, Daunorubicin, Dihydroxyanthracindion, Mitoxantron, Mithramycin, Actinomycin D, 1-Dehydrotestosteron, Glucocorticoide, Procain, Tetracain, Lidocain, Propanolol, und Puromycin und Analoga und Homologa davon. Therapeutische Mittel umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf Antimetabolite (beispielsweise Methotrexat, 6-Mercaptopurin, 6-Thioguanin, Cytarabin, 5-Fluoruracil Decarbazin), Alkylierungsmittel (beispielsweise Mechlorethamin, Thioepachlorambucil, Melphalan, Carmustin (BSNU) und Lomustin (CCNU), Cyclophosphamid, Busulfan, Dibromomannitol, Streptozotocin, Mitomycin C, und cis-Dichlordiaminplatin (II) (DDP) Cisplatin), Anthracycline (beispielsweise Daunorubicin (vorher Daunomycin) und Doxorubicin), Antibiotika (beispielsweise Dactinomycin (vorher Actinomycin), Bleomycin, Mithramycin, und Anthramycin (AMC)), und anti-mitotische Mittel (beispielsweise Vincristin und Vinblastin). Die Konjugate können zur Modifikation einer gegebenen biologischen Reaktion verwendet werden, die Medikamenteneinheit soll nicht auf klassische chemische Therapeutika eingeschränkt sein. Die Medikamenteneinheit kann beispielsweise ein Protein oder Polypeptid sein, das die gewünschte biologische Aktivität besitzt. Zu diesen Proteinen gehören beispielsweise ein Toxin, wie Abrin, Ricin A, Pseudomonas-Exotoxin, oder Diphtherie-Toxin; ein Protein, wie Tumornekrosefaktor alpha, Tumornekrosefaktor beta, alpha-Interferon, beta-Interferon, Nervenwachstumsfaktor, von Blutplättchen hergeleiteter Wachstumsfaktor, Gewebe-Plasminogenaktivator; oder Modifikatoren der biologischen Reaktion, wie beispielsweise Lymphokine, Interleukin-1 ("IL-1"), Interleukin-2 ("IL-2"), Interleukin-6 ("IL-6"), Granulocyten-Makrophagen-Koloniestimulierender Faktor ("GM-CSF"), Granulocyten-Koloniestimulierender Faktor ("G-CSF"), oder andere Wachstumsfaktoren.
  • Techniken zum Konjugieren einer solchen therapeutischen Einheit an Antikörper sind bekannt, siehe z.B. Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (Hrsg.), S. 243–56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2. Aufl.), Robinson et al. (Hrsg.), S. 623–53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And clinical Applications, Pinchera et al. (Hrsg.), S. 475–506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (Hrsg.), S. 303–16 (Academic Press 1985) und Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119–58 (1982). Alternativ kann ein Antikörper unter Bildung eines Antikörper-Heterokonjugats an einen zweiten Antikörper konjugiert werden, wie von Segal im U.S.-Patent Nr. 4,676,980 beschrieben.
  • III. Rekombinante Expressionsvektoren und Wirtszellen
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Vektoren, vorzugsweise Expressionsvektoren, die eine Nukleinsäure enthalten, die ein GPCR-ähnliches Protein (oder einen Teil davon) codiert. "Vektor" betrifft ein Nukleinsäuremolekül, das eine andere Nukleinsäure, an die es gebunden ist, transportieren kann, wie ein "Plasmid", eine zirkuläre, doppelsträngige DNA-Schleife, in die zusätzliche DNA-Segmente ligiert werden können, oder ein viraler Vektor, wobei zusätzliche DNA-Segmente in das virale Genom ligiert werden können. Die Vektoren eignen sich zur autonomen Replikation in einer Wirtszelle oder können in das Genom einer Wirtszelle nach Einbringen in die Wirtszelle integriert werden und werden dadurch zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert (z.B. nichtepisomale Säugervektoren). Expressionsvektoren können die Expression von Genen, mit denen sie betriebfähig verbunden sind, steuern. Im Allgemeinen haben bei DNA-Rekombinationstechniken verwendbare Vektoren oft die Form von Plasmiden (Vektoren). Die Erfindung soll jedoch solche anderen Formen von Expressionsvektoren, wie virale Vektoren (z.B. replikationsdefiziente Retroviren, Adenoviren und adenoassoziierte Viren) beinhalten, die gleichwertigen Funktionen dienen.
  • Die erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektoren umfassen eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in einer für die Expression der Nukleinsäure in einer Wirtszelle geeigneten Form. Dies bedeutet, dass die rekombinanten Expressionsvektoren eine oder mehrere Regulationssequenzen enthalten, die auf Basis der Wirtszellen, die für die Expression verwendet werden sollen, ausgewählt werden und mit der zu exprimierenden Nukleinsäure betriebsfähig verbunden sind. "Betriebsfähig verbunden" soll bedeuten, dass die Nukleotidsequenz von Interesse mit der (den) Regulationssequenz(en) auf eine Weise verbunden ist, welche die Expression der Nukleotidsequenz (z.B. in einem In-vitro-Transkriptions-/Translationssystem oder in einer Wirtszelle, wenn der Vektor in die Wirtszelle eingebracht wird) gestattet. Der Begriff "Regulationssequenz" soll Promotoren, Enhancer und andere Expressionssteuerungselemente (z.B. Polyadenylierungssignale) umfassen. Siehe zum Beispiel Goeddel (1990) in Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Diego, CA). Regulationssequenzen beinhalten solche, die eine konstitutive Expression einer Nukleotidsequenz in vielen Typen von Wirtszellen steuern, und solche, die eine Expression der Nukleotidsequenz nur in bestimmten Wirtszellen steuern (z.B. gewebespezifische Regulationssequenzen). Der Fachmann erkennt, dass die Gestaltung des Expressionsvektors von Faktoren abhängen kann, wie der Auswahl der zu transformierenden Wirtszelle, dem gewünschten Spiegel der Proteinexpression usw. Die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren können in Wirtszellen eingebracht werden, um dadurch Proteine oder Peptide, einschließlich Fusionsproteinen oder -peptiden, zu produzieren, die von Nukleinsäuren, wie hier beschrieben, codiert werden (z.B. GPCR-ähnliche Proteine, mutierte Formen GPCR-ähnlicher Proteine, Fusionsproteine usw.).
  • Die erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektoren können für die Expression von GPCR-ähnlichem Protein in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen gestaltet werden. Die Expression von Proteinen in Prokaryoten erfolgt am häufigsten in E. coli mit Vektoren, die konstitutive oder induzierbare Promotoren enthalten, welche die Expression von entweder Fusions- oder Nicht-Fusionsproteinen steuern. Fusionsvektoren fügen einem darin codierten Protein einer Reihe von Aminosäuren, gewöhnlich am amino-Terminus des rekombinanten Proteins, hinzu. Übliche Fusionsexpressionsvektoren sind u.a. pGEX (Pharmacia Biotech Inc.; Smith und Johnson (1988) Gene 67: 31–40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), die Glutathion-S-transferase (GST), Maltose-E-bindendes Protein bzw. Protein A an das rekombinante Zielprotein fusionieren. Beispiele für geeignete induzierbare Nicht-Fusions-E.-coli-Expressionsvektoren sind u.a. pTrc (Amann et al. (1988) Gene 69: 301–315) und pET11d (Studier et al. (1990) in Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Diego, CA), S. 60–89). Strategien zur Maximierung der Expression von rekombinantem Protein in E. coli können in Gottesman (1990) in Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, CA), S. 119–128 und Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20: 2111–2118 gefunden werden. Die Zielgenexpression von dem pTrc-Vektor basiert auf der Transkription von einem Hybrid-trp-lac-Fusionspromotor durch die RNA-Polymerase des Wirts.
  • Geeignete eukaryotische Wirtszellen sind u.a. Insektenzellen (Beispiele für Baculovirus-Vektoren, die für die Expression von Proteine in kultivierten Insektenzellen (z.B. Sf9-Zellen) erhältlich sind, beinhalten die pAc-Reihe (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3: 2156–2165) und die pVL-Reihe (Lucklow und Summers (1989) Virology 170: 31–39)); Hefezellen (Beispiele für Vektoren für die Expression in der Hefe S. cerevisiae sind u.a. pYepSec1 (Baldari et al. (1987) EMBO J. 6: 229–234), pMFa (Kudjan und Herskowitz (1982) Cell 30: 933–943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54: 113–123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) und pPicZ (Invitrogen Corporation, San Diego, CA)); oder Säugerzellen (Säugerexpressionsvektoren sind u.a. pCDM8 (Seed (1987) Nature 329: 840) und pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6: 187: 195)). Geeignete Säugerzellen sind u.a. Chinesischer-Hamster-Ovarzellen (CHO) oder SV40-transformierte Affennierenzellen (COS). In Säugerzellen werden die Steuerfunktionen für den Expressionsvektor oft durch virale Regulationselemente bereitgestellt. Zum Beispiel stammen allgemein verwendete Promotoren von Polyoma, Adenovirus 2, Cytomegalievirus und Simian Virus 40. Weitere geeignete Expressionssysteme sowohl für prokaryotische als auch eukaryotische Zellen siehe in den Kapiteln 16 und 17 von Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A Laboratory Manual (2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY). Siehe Goeddel (1990) in Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Diego, CA). Alternativ kann der rekombinante Expressionsvektor in vitro transkribiert und translatiert werden, zum Beispiel unter Verwendung von T7-Promotor-Regulationssequenzen und T7-Polymerase.
  • Die Begriffe "Wirtszelle" und "rekombinante Wirtszelle" werden hier austauschbar verwendet. Es ist selbstverständlich, dass diese Begriffe nicht nur die bestimmte Gegenstandszelle betreffen, sondern auch die Nachkommenschaft oder potenzielle Nachkommenschaft einer solchen Zelle. Weil bestimmte Modifikationen in folgenden Generationen entweder aufgrund von Mutation oder Umwelteinflüssen auftreten können, kann diese Nachkommenschaft tatsächlich nicht mit der Elternzelle identisch sein, ist aber immer noch im Umfang des Begriffs, wie hier verwendet, enthalten.
  • Bei einer Ausführungsform ist der Expressionsvektor ein rekombinanter Säuger-Expressionsvektor, der gewebespezifische Regulationselemente umfasst, welche die Expression der Nukleinsäure bevorzugt in einem bestimmten Zelltyp steuern. Geeignete gewebespezifische Promotoren sind u.a. der Albumin-Promotor (z.B. leberspezifischer Promotor; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1: 268–277), lymphoidspezifische Promotoren (Calame und Eaton (1988) Adv. Immunol. 43: 235–275), insbesondere Promotoren von T-Zell-Rezeptoren (Winoto und Baltimore (1989) EMBO J. 8: 729–733) und Immunglobulinen (Banerji et al. (1983) Cell 33: 729–740; Queen und Baltimore (1983) Cell 33: 741–748), neuronenspezifische Promotoren (z.B. der Neurofilament-Promotor; Byrne und Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473–5477), pankreasspezifische Promotoren (Edlund et al. (1985) Science 230: 912–916), und brustdrüsenspezifische Promotoren (z.B. der Molke-Promotor; U.S.-Patent Nr. 4,873,316 und europäische Patentanmeldungsveröffentlichung Nr. 264,166). Entwicklungsregulierte Promotoren sind ebenfalls umfasst, zum Beispiel der Maus-Homöobox-(Hox-)Promotor (Kessel und Gruss (1990) Science 249: 374–379), der α-Fetoprotein-Promotor (Campes und Tilghman (1989) Genes Dev. 3: 537–546) und dergleichen.
  • Die Erfindung stellt ferner einen rekombinanten Expressionsvektor bereit, der ein erfindungsgemäßes DNA-Molekül umfasst, das in den Expressionsvektor in Anstisense-Orientierung kloniert ist. D.h., das DNA-Molekül ist mit einer Regulationssequenz in einer Weise betriebsfähig verbunden, welche die Expression (durch Transkription des DNA-Moleküls) eines RNA-Moleküls gestattet, das eine Antisense-mRNA zu GPCR-ähnlicher mRNA ist. Regulationssequenzen, die mit einer in Antisense-Orientierung klonierten Nukleinsäure betriebsfähig verbunden sind, können so ausgewählt sein, dass sie die kontinuierliche Expression des Antisense-RNA-Moleküls in einer Vielzahl von Zelltypen steuern, zum Beispiel virale Promotoren und/oder Enhancer, oder die Regulationssequenzen können so ausgewählt sein, dass sie die konstitutive, gewebespezifische oder zelltypspezifische Expression von Antisense-RNA steuern. Der Antisense-Expressionsvektor kann die Form eines rekombinanten Plasmids, Phagemids oder eines attenuierten Virus haben, worin Antisense-Nukleinsäuren unter der Kontrolle einer hocheffizienten Regulationsregion produziert werden, deren Aktivität durch den Zelltyp bestimmt werden kann, in den der Vektor eingebracht wird. Siehe eine Erläuterung der Regulation der Genexpression unter Verwendung von Antisense-Genen in Weintraub et al. (1986) Reviews – Trends in Genetics, Bd. 1(1).
  • Vektor-DNA kann in prokaryotische oder eukaryotische Zellen über herkömmliche Transformations- oder Transfektionstechniken eingebracht werden. Wie hier verwendet, sollen die Begriffe "Transformation" und "Transfektion" eine Mehrzahl im Stand der Technik anerkannte Techniken zum Einbringen von fremder Nukleinsäure (z.B. DNA) in eine Wirtszelle betreffen, einschließlich Calciumphosphat- oder Calciumchlorid-Copräzipitation, DEAE-Dextran-vermittelter Transfektion, Lipofektion oder Elektroporation. Geeignete Verfahren zum Transformieren oder Transfizieren von Wirtszellen lassen sich in Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY) und anderen Laborhandbüchern finden.
  • Es ist bekannt, dass zur stabilen Transfektion von Säugerzellen je nach dem verwendeten Expressionsvektor und der verwendeten Transfektionstechnik nur eine kleine Fraktion von Zellen die fremde DNA in ihr Genom integrieren kann. Um diese Integranten zu identifizieren und zu selektieren, wird gewöhnlich ein Gen, das einen selektierbaren Marker (z.B. Resistenz gegen Antibiotika) codiert, zusammen mit dem Gen von Interesse in die Wirtszellen eingebracht. Bevorzugte selektierbare Marker sind u.a. solche, die Resistenz gegen Arzneistoffe, wie G418, Hygromycin und Methotrexat, verleihen. Nukleinsäure, die einen selektierbaren Marker codiert, kann in eine Wirtszelle auf dem gleichen Vektor wie demjenigen, der ein GPCR-ähnliches Protein codiert, oder als getrennter Vektor eingebracht werden. Zellen, die mit der eingebrachten Nukleinsäure stabil transfiziert sind, können mittels Arzneistoffselektion identifiziert werden (z.B. überleben Zellen, die das selektierbare Markergen aufgenommen haben, während die anderen Zellen absterben).
  • Eine erfindungsgemäße Wirtszelle, wie eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle in Kultur, kann zur Produktion (d.h. Expression) von GPCR-ähnlichem Protein verwendet werden. Folglich stellt die Erfindung ferner Verfahren zur Produktion von GPCR-ähnlichem Protein unter Verwendung der erfindungsgemäßen Wirtszellen bereit. Bei einer Ausführungsform umfasst das Verfahren das Züchten der erfindungsgemäßen Wirtszelle, in die ein rekombinanter Expressionsvektor, der ein GPCR-ähnliches Protein codiert, eingebracht wurde, in einem geeigneten Medium, so dass GPCR-ähnliches Protein produziert wird. Bei einer anderen Ausführungsform umfasst das Verfahren ferner das Isolieren von GPCR-ähnlichem Protein aus dem Medium oder der Wirtszelle.
  • Die erfindungsgemäßen Wirtszellen können auch zur Produktion nicht-menschlicher transgener Tiere verwendet werden. Zum Beispiel ist bei einer Ausführungsform eine erfindungsgemäße Wirtszelle eine nicht-menschliche befruchtete Oocyte oder eine nicht-menschliche embryonale Stammzelle, in die GPCR-ähnliche codierende Sequenzen eingebracht wurden. Solche Wirtszellen können dann zur Herstellung nicht-menschlicher transgener Tiere, in die exogene GPCR-ähnliche Sequenzen in ihr Genom eingebracht wurden, oder homolog rekombinanter Tiere, in denen endogene GPCR-ähnliche Sequenzen verändert wurden, verwendet werden. Solche Tiere eignen sich zur Untersuchung der Funktionen und/oder der Aktivität GPCR-ähnlicher Gene und Proteine und zur Identifikation und/oder zur Untersuchung von Modulatoren von GPCR-ähnlicher Aktivität. Wie hier verwendet, ist ein "transgenes Tier" ein nicht-menschliches Tier, vorzugsweise ein Säuger, stärker bevorzugt ein Nager, wie eine Ratte oder Maus, wobei eine oder mehrere der Zellen des Tieres ein Transgen enthalten. Weitere Beispiele für transgene Tiere umfassen nicht-menschliche Primaten, Schafe, Hunde, Kühe, Ziegen, Hühner, Amphibien usw. Ein Transgen ist exogene DNA, die in das Genom einer Zelle integriert ist, aus der sich ein transgenes Tier entwickelt, und die im Genom des reifen Tieres verbleibt, wodurch die Expression eines codierten Genprodukts in einem oder mehreren Zelltypen oder Geweben des transgenen Tieres gesteuert wird. Wie hier verwendet, ist ein "homolog rekombinantes Tier" ein nicht-menschliches Tier, vorzugsweise ein Säuger, stärker bevorzugt eine Maus, worin ein endogenes GPCR-ähnliches Gen durch homologe Rekombination zwischen dem endogenen Gen und einem exogenen DNA-Molekül, das in eine Zelle des Tieres, z.B. eine embryonale Zelle des Tieres, vor der Entwicklung des Tieres eingebracht wird, verändert wird.
  • Ein erfindungsgemäßes transgenes nicht-menschliches Tier kann hergestellt werden, indem eine GPCR-ähnlich-codierende Nukleinsäure, z.B. mittels Mikroinjektion, in die männlichen Pronuklei einer befruchteten Oocyte eingebracht wird und man die Oocyte sich in einem pseudoträchtigen weiblichen Leihtier entwickeln lässt. Die GPCR-ähnliche cDNA-Sequenz kann als Transgen in das Genom eines nicht-menschlichen Tieres eingebracht werden. Alternativ kann ein Homolog des GPCR-ähnlichen Gens aus Maus auf Basis von Hybridisierung isoliert und als Transgen verwendet werden. Intronsequenzen und Polyadenylierungssignale können ebenfalls in das Transgen eingebracht werden, um die Effizienz der Expression des Transgens zu erhöhen. (Eine) gewebespezifische Regulationssequenz(en) kann (können) mit dem GPCR-ähnlichen Transgen betriebsfähig verbunden werden, um die Expression des GPCR-ähnlichen Proteins auf bestimmte Zellen zu regulieren. Verfahren zur Erzeugung von transgenen Tieren mittels Embryo-Manipulation und Mikroinjektion, insbesondere von Tieren wie Mäusen, sind im Stand der Technik üblich geworden und sind zum Beispiel in den U.S.-Patenten Nr. 4,736,866, 4,870,009, und 4,873,191 und in Hogan (1986) Manipulating the Mouse Embryo (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1986) beschrieben. Ähnliche Verfahren werden zur Produktion anderer nicht-menschlicher transgener Tiere verwendet. Ein transgenes Gründertier kann aufgrund des Vorliegens des GPCR-ähnlichen Transgens in seinem Genom und/oder der Expression von GPCR-ähnlicher mRNA in Geweben oder Zellen der Tiere identifiziert werden. Ein transgenes Gründertier kann dann zur Züchtung weiterer Tiere, die das Transgen tragen, verwendet werden. Außerdem können transgene Tiere, die ein Transgen tragen, das ein GPCR-ähnliches Gen codiert, ferner mit anderen transgenen Tieren, die andere Transgene tragen, gezüchtet werden.
  • Zur Schaffung eines homolog rekombinanten Tieres stellt man einen Vektor her, der mindestens einen Teil eines GPCR-ähnlichen Gens oder ein Homolog des Gens enthält, in das eine Deletion, Addition oder Substitution eingeführt wurde, um dadurch das GPCR-ähnliche Gen zu verändern, z.B. funktionell zu zerstören. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird der Vektor derart gestaltet, dass nach homologer Rekombination das endogene GPCR-ähnliche Gen funktionell zerstört ist (d.h. kein funktionelles Protein mehr codiert; auch als "Knock-out"-Vektor bezeichnet). Alternativ kann der Vektor derart gestaltet sein, dass nach homologer Rekombination das endogene GPCR-ähnliche Gen mutiert oder anderweitig verändert ist, aber immer noch funktionelles Protein codiert (z.B. kann die stromaufwärts gelegene regulatorische Region verändert werden, um dadurch die Expression des endogenen GPCR-ähnlichen Proteins zu verändern). In dem homologen Rekombinationsvektor ist der veränderte Abschnitt des GPCR-ähnlichen Gens an seinen 5'- und 3'-Enden von zusätzlicher Nukleinsäure des GPCR-ähnlichen Gens flankiert, um das Auftreten von homologer Rekombination zwischen dem exogenen GPCR-ähnlichen Gen, das sich auf dem Vektor befindet, und einem endogenen GPCR-ähnlichen Gen in einer embryonalen Stammzelle zu ermöglichen. Die zusätzliche flankierende GPCR-ähnliche Nukleinsäure ist von ausreichender Länge für eine erfolgreiche homologe Rekombination mit dem endogenen Gen. Üblicherweise sind mehrere Kilobasen flankierender DNA (sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende) in dem Vektor enthalten (eine Beschreibung homologer Rekombinationsvektoren siehe z.B. in Thomas und Capecchi (1987) Cell 51: 503). Der Vektor wird in eine embryonale Stammzelllinie (z.B. mittels Elektroporation) eingebracht, und Zellen, in denen das eingebrachte GPCR-ähnliche Gen mit dem endogenen GPCR-ähnlichen Gen homolog rekombiniert hat, werden selektiert (siehe z.B. Li et al. (1992) Cell 69: 915). Die selektierten Zellen werden dann in eine Blastozyste eines nicht-menschlichen Tieres (z.B. einer Maus) injiziert, um Aggregationschimären herzustellen (siehe z.B. Bradley (1987) in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, Hrsg. Robertson (IRL, Oxford S. 113–152). Ein chimärer nicht-menschlicher Embryo kann dann in ein geeignetes pseudoträchtiges weibliches Leihtier implantiert und ausgetragen werden. Nachkommen, die die homolog rekombinierte DNA in ihren Keimzellen tragen, können zur Züchtung von Tieren verwendet werden, bei denen alle Zellen des Tieres die homolog rekombinierte DNA mittels Keimlinientransmission des Transgens tragen. Verfahren zur Konstruktion von homologen Rekombinationsvektoren und homolog rekombinierten Tieren sind weiter in Bradley (1991) Current Opinion in Bio/Technology 2: 823–829 und in den PCT-Veröffentlichungen Nr. WO 90/11354, WO 91/01140, WO 92/0968 und WO 93/04169 beschrieben.
  • Bei einer anderen Ausführungsform können transgene nicht-menschliche Tiere produziert werden, die ausgewählte System enthalten, die eine gesteuerte Expression des Transgens gestatten. Ein Beispiel für ein solches System ist das cre/loxP-Rekombinase-System des Bakteriophagen P1. Eine Beschreibung des cre/loxP-Rekombinase-Systems siehe z.B. bei Lakso et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6232–6236. Ein weiteres Beispiel für ein Rekombinase-System ist das FLP-Rekombinase-System von Saccharomyces cerevisiae (O'Gorman et al. (1991) Science 251: 1351–1355). Wenn ein cre/loxP-Rekombinase-System zur Steuerung der Expression des Transgens verwendet wird, sind Tiere erforderlich, die Transgene enthalten, die sowohl die Cre-Rekombinase als auch ein ausgewähltes Protein codieren. Solche Tiere können durch Konstruktion von "doppelt"-transgenen Tieren, z.B. durch Paarung von zwei transgenen Tieren, von denen eines ein Transgen enthält, das ein ausgewähltes Protein codiert, und das andere ein Transgen enthält, das eine Rekombinase codiert, bereitgestellt werden.
  • Klone der hier beschriebenen nicht-menschlichen transgenen Tiere können auch gemäß den in Wilmut et al. (1997) Nature 385: 810–813 und den PCT- Veröffentlichungen Nr. WO 97/07668 und WO 97/07669 beschriebenen Verfahren produziert werden.
  • IV. Pharmazeutische Zusammensetzungen
  • Die erfindungsgemäßen GPCR-ähnlichen Nukleinsäuremoleküle, GPCR-ähnlichen Proteine und Modulatoren davon (z.B. Anti-GPCR-ähnlich-Antikörper) (hier auch als "Wirkstoffe" bezeichnet) können in für die Verabreichung geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen eingebracht werden. Solche Zusammensetzungen umfassen gewöhnlich das Nukleinsäuremolekül, Protein oder Modulatoren davon (z.B. Antikörper oder kleines Molekül) und einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Wie hier verwendet, soll die Ausdrucksweise "pharmazeutisch verträglicher Träger" jedes und alle Lösungsmittel, Dispergiermedien, Überzüge, antibakterielle und fungizide Mittel und absorptionsverzögernde Mittel beinhalten, die mit pharmazeutischer Verabreichung kompatibel sind. Die Verwendung solcher Medien und Mittel für pharmazeutische Wirkstoffe ist im Stand der Technik bekannt. Ausgenommen insoweit, als irgendein herkömmliches Medium oder Mittel mit dem Wirkstoff unverträglich ist, wird ihre Verwendung in den Zusammensetzungen in Betracht gezogen. Ergänzende Wirkstoffe können ebenfalls in die Zusammensetzungen eingebracht werden.
  • Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen eignen sich zur Behandlung einer der hier erläuterten Störungen. Die Zusammensetzungen werden in therapeutisch wirksamen Mengen bereitgestellt. Mit "therapeutisch wirksamen Mengen" soll eine Menge gemeint sein, die ausreicht, um die gewünschte Antwort zu modulieren. Wie hier definiert, reicht eine therapeutisch wirksame Menge an Protein oder Polypeptid (d.h. eine wirksame Dosierung) von etwa 0,001 bis 30 mg/kg Körpergewicht, bevorzugt von etwa 0,01 bis 25 mg/kg Körpergewicht, stärker bevorzugt von etwa 0,1 bis 20 mg/kg Körpergewicht und noch stärker bevorzugt von etwa 1 bis 10 mg/kg, 2 bis 9 mg/kg, 3 bis 8 mg/kg, 4 bis 7 mg/kg oder 5 bis 6 mg/kg Körpergewicht.
  • Der Fachmann erkennt, dass bestimmte Faktoren die Dosierung beeinflussen können, die zur wirksamen Behandlung eines Individuums benötigt wird, einschließlich der Schwere der Erkrankung oder Störung, früherer Behandlungen, des allgemeinen Gesundheitszustands und/oder des Alters des Patienten und anderer vorliegender Erkrankungen, aber nicht darauf beschränkt. Außerdem kann eine Behandlung eines Individuums mit einer therapeutisch wirksamen Menge eines Proteins, Polypeptids oder Antikörpers eine einzige Behandlung oder vorzugsweise eine Reihe von Behandlungen beinhalten. Bei einem bevorzugten Beispiel wird ein Individuum mit Antikörper, Protein, oder Polypeptid im Bereich zwischen etwa 0,1 bis 20 mg/kg Körpergewicht einmal pro Woche für zwischen etwa 1 bis 10 Wochen, bevorzugt zwischen 2 bis 8 Wochen, stärker bevorzugt zwischen etwa 3 bis 7 Wochen und noch stärker bevorzugt für etwa 4, 5, oder 6 Wochen behandelt. Man erkennt ebenfalls, dass die wirksame Dosierung des zur Behandlung verwendeten Antikörpers, Proteins oder Polypeptids über den Verlauf einer bestimmten Behandlung zunehmen oder abnehmen kann. Änderungen in der Dosierung können sich aus Ergebnissen diagnostischer Tests, wie hier beschrieben, ergeben oder daraus ersichtlich werden.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst Mittel, die die Expression oder Aktivität modulieren. Ein Mittel kann zum Beispiel ein kleines Molekül sein. Zum Beispiel sind solche kleine Moleküle u.a., sind aber nicht beschränkt auf Peptide, Peptidomimetika, Aminosäuren, Aminosäureanaloga, Polynukleotide, Polynukleotidanaloga, Nukleotide, Nukleotidanaloga, organische oder anorganische Verbindungen (d.h. einschließlich heteroorganischer und organometallischer Verbindungen) mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 10000 Gramm pro Mol, organische oder anorganische Verbindungen mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 5000 Gramm pro Mol, organische oder anorganische Verbindungen mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 1000 Gramm pro Mol, organische oder anorganische Verbindungen mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 500 Gramm pro Mol und Salze, Ester und andere pharmazeutisch verträgliche Formen solcher Verbindungen.
  • Es ist selbstverständlich, dass geeignete Dosen niedermolekularer Mittel von einer Reihe von Faktoren innerhalb der Kenntnis des durchschnittlichen Facharztes, -veterinärs oder -forschers abhängen. Die Dosis (Dosen) des kleinen Moleküls variieren zum Beispiel je nach der Identität, Größe und dem Zustand des behandelten Individuums oder der behandelten Probe, wobei sie weiterhin von dem Weg abhäng(t/en), auf dem die Zusammensetzung verabreicht werden soll, wenn anwendbar, und der Wirkung, von der der behandelnde Arzt wünscht, dass das kleine Molekül sie auf die erfindungsgemäße Nukleinsäure oder das erfindungsgemäße Polypeptid ausübt. Beispielhafte Dosen sind u.a. Milligramm- oder Mikrogramm-Mengen des kleinen Moleküls pro Kilogramm Individuum- oder Probengewicht (z.B. etwa 1 Mikrogramm pro Kilogramm bis etwa 500 Milligramm pro Kilogramm, etwa 100 Mikrogramm pro Kilogramm bis etwa 5 Milligramm pro Kilogramm oder etwa 1 Mikrogramm pro Kilogramm bis etwa 50 Mikrogramm pro Kilogramm. Es ist ferner selbstverständlich, dass geeignete Dosen eines kleinen Moleküls von der Stärke des kleinen Moleküls in Bezug auf die zu modulierenden Expression oder Aktivität abhängt. Solche geeigneten Dosen können unter Verwendung der hier beschriebenen Tests bestimmt werden. Wenn eines oder mehrere dieser kleinen Moleküle einem Tier (z.B. einem Menschen) verabreicht werden soll(en), um die Expression oder Aktivität eines erfindungsgemäßen Polypeptids oder einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure zu modulieren, kann ein Arzt, Veterinär oder Forscher zum Beispiel zunächst eine relativ niedrige Dosis verschreiben, wobei er anschließend die Dosis steigert, bis eine angemessene Antwort erhalten wird. Zusätzlich ist selbstverständlich, dass der spezifische Dosisspiegel für ein bestimmtes Tierindividuum von einer Mehrzahl von Faktoren abhängt, einschließlich der Aktivität der spezifischen eingesetzten Verbindung, des Alters, Körpergewichts, des allgemeinen Gesundheitszustands, des Geschlechts und der Ernährung des Individuums, des Verabreichungszeitpunkts, des Verabreichungswegs, der Ausscheidungsrate, irgendeiner Arzneistoffkombination und des Grads der zu modulierenden Expression oder Aktivität.
  • Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung wird so formuliert, dass sie mit ihrem beabsichtigten Verabreichungsweg kompatibel ist. Beispiele für Verabreichungswege sind u.a. parenterale, z.B. intravenöse, intradermale, subkutane, orale (z.B. Inhalation), transdermale (topische), transmukosale und rektale Verabreichung. Lösungen oder Suspensionen, die zur parenteralen, intradermalen oder subkutanen Applikation verwendet werden, können die folgenden Komponenten enthalten: ein steriles Verdünnungsmittel, wie Wasser zur Injektion, Salzlösung, feste Öle, Polyethylenglycole, Glycerin, Propylenglycol oder andere synthetische Lösungsmittel; antibakterielle Mittel, wie Benzylalkohol oder Methylparabene; Antioxidantien, wie Ascorbinsäure oder Natriumbisulfit; Chelatisierungsmittel, wie Ethylendiamintetraessigsäure; Puffer, wie Acetate, Citrate oder Phosphate, und Mittel zum Einstellen der Tonizität, wie Natriumchlorid oder Dextrose. Der pH kann mit Säuren oder Basen, wie Salzsäure oder Natriumhydroxid, eingestellt werden. Die parenterale Zubereitung kann in Ampullen, Einmalspritzen oder Mehrfachdosisgefäße aus Glas oder Kunststoff eingeschlossen werden.
  • Für eine injizierbare Verwendung geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen beinhalten sterile wässrige Lösungen (wenn wasserlöslich) oder Dispersionen und sterile Pulver zur sofortigen Zubereitung steriler injizierbarer Lösungen oder Dispersionen. Zur intravenösen Verabreichung sind geeignete Träger u.a. physiologische Kochsalzlösung, bakteriostatisches Wasser, Cremophor EL9 (BASF; Parsippany, NJ) oder phsophatgepufferte Kochsalzlösung (PBS). In allen Fällen muss die Zusammensetzung steril sein und sollte in dem Maße flüssig sein, dass sie leicht gespritzt werden kann. Sie muss unter den Herstellungs- und Lagerungsbedingungen stabil und gegen die verunreinigende Wirkung von Mikroorganismen, wie Bakterien und Pilzen, konserviert sein. Der Träger kann ein Lösungsmittel oder ein Dispersionsmedium sein, das zum Beispiel Wasser, Ethanol, Polyol (zum Beispiel Glycerin, Propylenglycol und flüssigen Polyetheylenglycol und dergleichen) und geeignete Gemische davon enthält. Die geeignete Fließfähigkeit kann zum Beispiel durch Verwendung eines Überzugs, wie Lecithin, durch Aufrechterhalten der erforderlichen Partikelgröße im Fall einer Dispersion und durch Verwendung oberflächenaktiver Mittel beibehalten werden. Verhinderung der Wirkung von Mikroorganismen kann durch verschiedene antibakterielle und fungizide Mittel erreicht werden, zum Beispiel Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Ascorbinsäure, Thimerosal und dergleichen. In vielen Fällen ist bevorzugt, isotonische Mittel, zum Beispiel Zucker, Polyalkohole, wie Mannitol, Sorbitol, Natriumchlorid, in die Zusammensetzung einzuschließen. Eine verlängerte Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann durch Hinzufügen eines Mittels, das die Absorption verzögert, zum Beispiel Aluminiummonostearat und Gelatine, in die Zusammensetzung herbeigeführt werden.
  • Sterile injizierbare Lösungen können durch Einbringen des Wirkstoffs (z.B. eines GPCR-ähnlichen Proteins oder Anti-GPCR-ähnlich-Antikörpers) in der erforderlichen Menge in ein geeignetes Lösungsmittel mit einem oder einer Kombination von vorstehend aufgezählten Inhaltsstoffen, wie erforderlich, gefolgt von Filtersterilisation, hergestellt werden. Im Allgemeinen werden Dispersionen durch Einbringen des Wirkstoffs in ein steriles Vehikel, das ein basisches Dispersionsmedium und die erforderlichen anderen Inhaltsstoffe aus den vorstehend aufgelisteten enthält, hergestellt. Im Fall steriler Pulver zur Herstellung steriler injizierbarer Lösungen sind die bevorzugten Herstellungsverfahren Vakuumtrocknen und Gefriertrocknen, wodurch ein Pulver des Wirkstoffs plus eines beliebigen zusätzlichen gewünschten Inhaltsstoffs aus einer zuvor sterilfiltrierten Lösung davon erhalten wird.
  • Orale Zusammensetzungen enthalten gewöhnlich ein inertes Verdünnungsmittel oder einen essbaren Träger. Sie können in Gelatinekapseln eingeschlossen oder zu Tabletten verpresst werden. Zum Zweck der oralen therapeutischen Verabreichung kann der Wirkstoff mit Excipienten zusammengebracht und in Form von Tabletten, Pastillen oder Kapseln verwendet werden. Orale Zusammensetzungen können auch unter Verwendung eines flüssigen Trägers zur Verwendung als Mundspülung hergestellt werden, wobei die Verbindung in dem flüssigen Träger oral appliziert und verteilt und ausgespuckt oder verschluckt wird. Pharmazeutisch verträgliche Bindemittel und/oder Hilfsstoffmaterialien können als Teil der Zusammensetzung eingeschlossen werden. Die Tabletten, Pillen, Kapseln, Pastillen und dergleichen können jeden der folgenden Inhaltsstoffe oder Verbindungen ähnlicher Art enthalten: ein Bindemittel, wie mikrokristalline Cellulose, Tragant oder Gelatine; einen Excipienten, wie Stärke oder Lactose, ein Sprengmittel, wie Alginsäure, Primogel oder Maisstärke; ein Schmiermittel, wie Magnesiumstearat oder Sterotes; ein Gleitmittel, wie kolloidales Siliziumdioxid; einen Süßstoff, wie Saccharose oder Saccharin; oder einen Geschmacksstoff, wie Pfefferminz, Methylsalicylat oder Orangengeschmack. Zur Verabreichung mittels Inhalation werden die Verbindungen in Form eines Aerosolsprays aus einem Druckbehälter oder Spender, der ein geeignetes Treibmittel, z.B. ein Gas, wie Kohlendioxid, enthält, oder einem Vernebler zugeführt.
  • Eine systemische Verabreichung kann auch durch transmukosale oder transdermale Maßnahmen erfolgen. Zur transmukosalen oder transdermalen Verabreichung werden Durchdringungsmittel, die für die zu durchdringende Schranke geeignet sind, in der Formulierung verwendet. Solche Durchdringungsmittel sind im Stand der Technik allgemein bekannt und beinhalten zum Beispiel zur transmukosalen Verabreichung Detergentien, Gallensalze und Fusidsäurederivate. Die transmukosale Verabreichung kann durch Verwendung von Nasensprays oder Suppositorien erreicht werden. Zur transdermalen Verabreichung werden die Wirkstoffe zu Einreibemitteln, Salben, Gelen oder Cremes, wie im Stand der Technik allgemein bekannt, formuliert. Die Verbindungen können auch in Form von Suppositorien (z.B. mit herkömmlichen Suppositorienbasen, wie Kakaobutter und anderen Glyceriden) oder Rückhaltklistieren zur rektalen Verabreichung hergestellt werden.
  • Bei einer Ausführungsform werden die Wirkstoffe mit Trägern hergestellt, die die Verbindung vor schneller Beseitigung aus dem Körper schützen, wie eine Formulierung mit kontrollierter Freisetzung, einschließlich Implantaten und mikroeingekapselten Zuführungssystemen. Biologisch abbaubare, biologisch verträgliche Polymere können verwendet werden, wie Ethylenvinylacetat, Polyanhydride, Polyglycolsäure, Kollagen, Polyorthoester und Polymilchsäure. Verfahren zur Herstellung solcher Formulierungen sind für den Fachmann ersichtlich. Die Materialien können auch von Alza Corporation und Nova Pharmaceuticals, Inc., kommerziell bezogen werden. Liposomale Suspensionen (einschließlich Liposomen, die mit monoklonalen Antikörpern gegen virale Antigene zu infizierten Zellen gesteuert werden) können ebenfalls als pharmazeutisch verträgliche Träger verwendet werden. Diese können gemäß dem Fachmann bekannten Verfahren, wie zum Beispiel im U.S.-Patent Nr. 4,522,811 beschrieben, hergestellt werden.
  • Es ist besonders vorteilhaft, wenn orale oder parenterale Zusammensetzungen zur leichten Verabreichung und gleichmäßigen Dosierung in Dosierungseinheitsform formuliert werden. Dosierungseinheitsform, wie hier verwendet, betrifft physikalisch getrennte Einheiten, die sich als einzelne Dosierungen für das zu behandelnde Individuum eignen, wobei jede Einheit eine festgelegte Menge an Wirkstoff enthält, die so berechnet ist, dass sie die gewünschte therapeutische Menge in Verbindung mit dem erforderlichen pharmazeutischen Träger erzeugt. Je nach dem Typ und der Schwere der Erkrankungen ist etwa 1 μg/kg bis etwa 15 mg/kg (z.B. 0,1 bis 20 mg/kg) Antikörper eine anfängliche Kandidatendosis zur Verabreichung an den Patienten, ob beispielsweise durch eine oder mehrere getrennte Verabreichungen oder mittels kontinuierlicher Infusion. Eine übliche Tagesdosis kann je nach den vorstehend erwähnten Faktoren von etwa 1 μg/kg bis etwa 100 mg/kg oder mehr reichen. Für wiederholte Verabreichungen über mehrere Tage oder länger wird je nach dem Zustand die Behandlung aufrechterhalten, bis eine gewünschte Unterdrückung von Erkrankungssymptomen auftritt. Andere Dosierungsschemata können jedoch geeignet sein. Das Voranschreiten dieser Therapie wird durch herkömmliche Techniken und Assays leicht überwacht. Ein beispielhaftes Dosierungsschema ist in WO 94/04188 offenbart. Die Spezifizierung für die erfindungsgemäßen Dosierungseinheitsformen werden von den einzigartigen Merkmalen des Wirkstoffs und der besonderen therapeutischen Wirkung, die erzielt werden soll, und den Beschränkungen, die dem Stand der Technik der Compoundierung eines solchen Wirkstoffs zur Behandlung von Individuen innewohnen, bestimmt und hängen direkt davon ab.
  • Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können in Vektoren eingebracht und als Gentherapievektoren verwendet werden. Gentherapievektoren können einem Individuum beispielsweise durch intravenöse Injektion, lokale Verabreichung (U.S.-Patent Nr. 5,328,470) oder durch stereotaktische Injektion (siehe z.B. Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3054–3057) zugeführt werden. Die pharmazeutische Zubereitung des Gentherapievektors kann den Gentherapievektor in einem annehmbaren Verdünnungsmittel enthalten oder eine Matrix mit langsamer Freisetzung umfassen, in die der Genzuführungsvektor eingebettet ist. Wenn der vollständige Genzuführungsvektor intakt aus rekombinanten Zellen produziert werden kann, z.B. retrovirale Vektoren, kann die pharmazeutische Zubereitung alternativ eine oder mehrere Zellen enthalten, die das Genzuführungssystem enthält/enthalten.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können in einen Behälter, eine Packung oder einen Spender zusammen mit Anleitungen für die Verabreichung eingeschlossen werden.
  • V. Erfindungsgemäße Verwendungen und Verfahren
  • Die hier beschriebenen Nukleinsäuremoleküle, Proteine, Proteinhomologa und Antikörper können bei einem oder mehreren der folgenden Verfahren eingesetzt werden: (a) Screening-Assays; (b) Nachweis-Assays (z.B. Chromosomenkartierung, Gewebetypisierung, forensische Biologie); (c) prädiktive Medizin (z.B. diagnostische Assays, prognostische Assays, Überwachung klinischer Studien und Pharmakogenomik); und (d) Verfahren zur (z.B. therapeutischen und prophylaktischen) Behandlung. Die erfindungsgemäßen isolierten Nukleinsäuremoleküle können zur Expression von GPCR-ähnlichem Protein (z.B. über einen rekombinanten Expressionsvektor in einer Wirtszelle bei Gentherapieanwendungen), zum Nachweis von GPCR-ähnlicher mRNA (z.B. in einer biologischen Probe) oder einer genetischen Läsion in einem GPCR-ähnlichen Gen und zur Modulierung von GPCR-ähnlicher Aktivität verwendet werden. Zusätzlich können die GPCR- ähnlichen Proteine zum Screening von Arzneistoffen oder Verbindungen, die die Immunantwort modulieren, sowie zur Behandlung von Störungen verwendet werden, die durch unzureichende oder übermäßige Produktion von GPCR-ähnlichem Protein oder Produktion von GPCR-ähnlichen Proteinformen gekennzeichnet sind, die eine verringerte oder aberrante Aktivität verglichen mit dem GPCR-ähnlichen Wildtypprotein besitzen. Außerdem können die erfindungsgemäßen Anti-GPCR-ähnlich-Antikörper zum Nachweis und zur Isolation von GPCR-ähnlichen Proteinen und zur Modulation von GPCR-ähnlicher Aktivität verwendet werden.
  • A. Screening-Assays
  • Die Erfindung stellt ein Verfahren (hier auch als "Screening-Assay" bezeichnet) zur Identifikation von Modulatoren, d.h. Kandidaten- oder Testverbindungen oder -mitteln (z.B. Peptiden, Peptidomimetika, kleinen Molekülen oder anderen Arzneistoffen), bereit, die an GPCR-ähnliche Proteine binden oder eine stimulatorische oder inhibitorische Wirkung zum Beispiel auf die GPCR-ähnliche Expression oder GPCR-ähnliche Aktivität haben.
  • Die erfindungsgemäßen Testverbindungen können unter Verwendung jedes der in Stand der Technik bekannten zahlreichen Ansätze bei kombinatorischen Bibliothekverfahren erhalten werden, einschließlich biologischer Bibliotheken, räumlich ansteuerbarer paralleler Festphasen- oder Flüssigphasenbibliotheken, synthetischer Bibliothekverfahren, die eine Dekonvolution erfordern, des "eine-Perle-eine-Verbindung"-Bibliothekverfahrens und synthetischer Bibliothekverfahren unter Verwendung von Affinitätschromatographie-Selektion. Der biologische Bibliothek-Ansatz ist auf Peptid-Bibliotheken beschränkt, während die anderen vier Ansätze auf Peptid-, Nicht-Peptid-Oligomer- oder kleine Molekülbibliotheken anwendbar sind (Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145).
  • Beispiele für Verfahren zur Synthese von Molekülbibliotheken können im Stand der Technik gefunden werden, zum Beispiel in: DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422; Zuckermann et al. (1994). J. Med. Chem. 37: 2678; Cho et al. (1993) Science 261: 1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061; und Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 1233.
  • Bibliotheken von Verbindungen können in Lösung (z.B. Houghten (1992) Bio/Techniques 13: 412–421) oder auf Perlen (Lam (1991) Nature 354: 82–84), Chips (Fodor (1993) Nature 364: 555–556), Bakterien (U.S.-Patent Nr. 5,223,409), Sporen (U.S.-Patente Nr. 5,571,698; 5,403,484; und 5,223,409), Plasmiden (Cull et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865–1869) oder Phagen (Scott und Smith (1990) Science 249: 386–390; Devlin (1990) Science 249: 404–406; Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378–6382; und Felici (1991) J. Mol. Biol. 222: 301–310) bereitgestellt werden.
  • Die Bestimmung der Fähigkeit der Testverbindung, an das GPCR-ähnliche Protein zu binden, kann beispielsweise durch Koppeln der Testverbindung mit einer Radioisotop- oder enzymatischen Markierung erreicht werden, so dass Bindung der Testverbindung an das GPCR-ähnliche Protein oder einen biologisch aktiven Teil davon durch Nachweisen der markierten Verbindung in einem Komplex bestimmt werden kann. Zum Beispiel können Testverbindungen mit 125I, 35S, 14C oder 3H entweder direkt oder indirekt markiert werden, und das Radioisotop kann durch direktes Zählen der Radioemission oder durch Szintillationszählung nachgewiesen werden. Alternativ können die Testverbindungen beispielsweise mit Meerrettichperoxidase, alkalischer Phosphatase oder Luciferase enzymatisch markiert und die enzymatische Markierung kann durch Bestimmung der Umwandlung eines geeigneten Substrats in Produkt nachgewiesen werden.
  • Auf ähnliche Weise kann man die Fähigkeit des GPCR-ähnlichen Proteins, an ein GPCR-ähnliches Zielmolekül zu binden oder damit zu wechselwirken, bestimmen. Unter "Zielmolekül" wird ein Molekül verstanden, an das ein GPCR-ähnliches Protein in der Natur bindet oder mit dem es wechselwirkt. Bei einer bevorzugten Ausführungsform kann die Fähigkeit des GPCR-ähnlichen Proteins, an ein GPCR-ähnliches Zielmolekül zu binden oder damit zu wechselwirken, durch Überwachen der Aktivität des Zielmoleküls bestimmt werden. Zum Beispiel kann die Aktivität des Zielmoleküls durch Nachweisen der Induktion eines zellulären Second Messengers des Ziels (z.B. von intrazellulärem Ca2+, Diacylglycerin, IP3 usw.), Nachweisen der katalytischen/enzymatischen Aktivität des Ziels an einem geeigneten Substrat, Nachweisen der Induktion eines Reportergens (z.B. eines auf GPCR-ähnlich responsiven Regulationselements, das mit einer Nukleinsäure betriebsfähig verbunden ist, die einen nachweisbaren Marker codiert, z.B. Luciferase) oder Nachweisen einer zellulären Antwort, zum Beispiel Zelldifferenzierung oder Zellproliferation, überwacht werden.
  • Bei noch einer anderen Ausführungsform ist ein erfindungsgemäßer Assay ein zellfreier Assay, der das In-Kontakt-Bringen eines GPCR-ähnlichen Proteins oder eines biologisch aktiven Teils davon mit einer Testverbindung und Bestimmen der Fähigkeit der Testverbindung, an das GPCR-ähnliche Protein oder den biologisch aktiven Abschnitt davon zu binden, umfasst. Das Binden der Testverbindung an das GPCR-ähnliche Protein kann entweder direkt oder indirekt, wie vorstehend beschrieben, bestimmt werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform beinhaltet der Assay das In-Kontakt-Bringen des GPCR-ähnlichen Proteins oder eines biologisch aktiven Abschnitts davon mit einer bekannten Verbindung, die an GPCR-ähnliches Protein bindet, unter Bildung eines Assay-Gemischs, In-Kontakt-Bringen des Assay-Gemischs mit einer Testverbindung und Bestimmen der Fähigkeit der Testverbindung, verglichen mit der bekannten Verbindung bevorzugt an GPCR-ähnliches Protein oder einen biologisch aktiven Abschnitt davon zu binden.
  • Bei einer anderen Ausführungsform ist ein Assay ein zellfreier Assay, der das In-Kontakt-Bringen von GPCR-ähnlichem Proteins oder einem biologisch aktiven Abschnitt davon mit einer Testverbindung und Bestimmen der Fähigkeit der Testverbindung, die Aktivität. des GPCR-ähnlichen Proteins oder des biologisch aktiven Abschnitts davon zu modulieren (z.B. zu stimulieren oder zu hemmen), umfasst. Das Bestimmen der Fähigkeit der Testverbindung, die Aktivität eines GPCR-ähnlichen Proteins zu modulieren, kann zum Beispiel erreicht werden, indem die Fähigkeit des GPCR-ähnlichen Proteins, an ein GPCR-ähnliches Zielmolekül zu binden, wie vorstehend beschrieben, zur Bestimmung der direkten Bindung ermittelt wird. Bei einer alternativen Ausführungsform kann das Bestimmen der Fähigkeit der Testverbindung, die Aktivität eines GPCR-ähnlichen Proteins zu modulieren, durch Bestimmen der Fähigkeit des GPCR-ähnlichen Proteins, weiterhin ein GPCR-ähnliches Zielmolekül zu modulieren, erreicht werden. Zum Beispiel kann die katalytische/enzymatische Aktivität des Zielmoleküls an einem geeigneten Substrat, wie vorstehend beschrieben, bestimmt werden.
  • Bei noch einer anderen Ausführungsform umfasst der zellfreie Assay das In-Kontakt-Bringen des GPCR-ähnlichen Proteins oder des biologisch aktiven Abschnitts davon mit einer bekannten Verbindung, die ein GPCR-ähnliches Protein bindet, unter Bildung eines Assay-Gemischs, das In-Kontakt-Bringen des Assay-Gemischs mit einer Testverbindung und das Bestimmen der Fähigkeit der Testverbindung, bevorzugt an ein GPCR-ähnliches Zielmolekül zu binden oder dessen Aktivität zu modulieren.
  • Bei den vorstehend genannten Assays kann es wünschenswert sein, entweder ein GPCR-ähnliches Protein oder sein Zielmolekül zu immobilisieren, um die Trennung koplexierter von unkomplexierten Formen von einem oder beiden Proteinen zu erleichtern sowie die Automatisierung des Assays zu ermöglichen. Bei einer Ausführungsform kann ein Fusionsprotein bereitgestellt werden, das eine Domäne hinzufügt, die es einem oder beiden Proteinen gestattet, an eine Matrix gebunden zu werden. Zum Beispiel können Glutathion-S-transferase/GPCR-ähnlich-Fusionsproteine oder Glutathion-S-transferase/Ziel-Fusionsproteine an Glutathion-Sepharose-Perlen (Sigma Chemical, St. Louis, MO) oder Glutathion-derivatisierte Mikrotiterplatten adsorbiert werden, die dann mit der Testverbindung oder der Testverbindung und entweder dem nicht-adsorbierten Zielprotein oder dem GPCR-ähnlichen Protein zusammengebracht werden, und das Gemisch unter Bedingungen inkubiert wird, die zur Komplexbildung führen (z.B. bei physiologischen Bedingungen hinsichtlich Salz und pH). Nach der Inkubation werden die Perlen oder die Mikrotiterplatten-Vertiefungen gewaschen, um alle ungebundenen Komponenten zu entfernen, und die Komplexbildung wird entweder direkt oder indirekt, zum Beispiel wie vorstehend beschrieben, gemessen. Alternativ können die Komplexe von der Matrix dissoziiert werden, und der Spiegel an GPCR-ähnlicher Bindung oder Aktivität kann unter Verwendung von Standardtechniken bestimmt werden.
  • Andere Techniken zur Immobilisierung von Proteinen an Matrices können ebenfalls bei den erfindungsgemäßen Screening-Assays verwendet werden. Zum Beispiel kann entweder das GPCR-ähnliche Protein oder sein Zielmolekül unter Verwendung von Konjugation von Biotin und Streptavidin immobilisiert werden. Biotinylierte GPCR-ähnliche Moleküle oder Zielmoleküle können aus Biotin-NHS (N-Hydroxysuccinimid) unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Techniken (z.B. Biotinylierungskit, Pierce Chemicals, Rockford, IL) hergestellt und in den Vertiefungen von Streptavidin-beschichteten Platten mit 96 Vertiefungen (Pierce Chemicals) immobilisiert werden. Alternativ können mit GPCR-ähnlichem Protein oder Zielmolekülen reagierende Antikörper, die aber die Bindung des GPCR-ähnlichen Proteins an sein Zielmolekül nicht behindern, an die Vertiefungen einer Platte derivatisiert werden, und ungebundenes Ziel- oder GPCR-ähnliches Protein kann durch Antikörperkonjugation in den Vertiefungen eingefangen werden. Verfahren zum Nachweis solcher Komplexe zusätzlich zu den vorstehend für die GST-immobilisierten Komplexe beschriebenen umfassen immunologischen Nachweis von Komplexen unter Verwendung von Antikörpern, die mit dem GPCR-ähnlichen Protein oder dem Zielmolekül reagieren, sowie Enzym-verknüpfte Assays, die auf dem Nachweis einer enzymatischen Aktivität in Verbindung mit dem GPCR-ähnlichen Protein oder den Zielmolekül beruhen.
  • Bei einer anderen Ausführungsform werden Modulatoren der GPCR-ähnlichen Expression bei einem Verfahren identifiziert, bei dem eine Zelle mit einer Kandidatenverbindung in Kontakt gebracht und die Expression von GPCR-ähnlicher mRNA oder GPCR-ähnlichem Protein in der Zelle, bezogen auf die Expression von GPCR-ähnlicher mRNA oder GPCR-ähnlichem Protein in eine Zelle in Abwesenheit der Kandidatenverbindung, bestimmt wird. Wenn die Expression größer (statistisch signifikant größer) in Anwesenheit der Kandidatenverbindung als in ihrer Abwesenheit ist, wird die Kandidatenverbindung als Stimulator von GPCR-ähnlicher mRNA- oder Proteinexpression identifiziert. Wenn die Expression kleiner (statistisch signifikant kleiner) in Anwesenheit der Kandidatenverbindung als in ihrer Abwesenheit ist, wird die Kandidatenverbindung alternativ als Inhibitor von GPCR-ähnlicher mRNA- oder Proteinexpression identifiziert. Der Spiegel der GPCR-ähnlichen mRNA- oder Proteinexpression in den Zellen kann durch hier beschriebene Verfahren zum Nachweis von GPCR-ähnlicher mRNA oder GPCR-ähnlichem Protein bestimmt werden.
  • Unter noch einem anderen Aspekt der Erfindung können die GPCR-ähnlichen Proteine als "Köderproteine" in einem Two-Hybrid-Assay oder Three-Hybrid-Assay (siehe z.B. U.S.-Patent Nr. 5,283,317; Zervos et al. (1993) Cell 72: 223–232; Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 12046–12054; Bartel et al. (1993) Bio/Techniques 14: 920–924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8: 1693–1696; und PCT-Veröffentlichung Nr. WO 94/10300) zur Identifikation anderer Proteine verwendet werden, die an GPCR-ähnliches Protein binden oder damit wechselwirken ("GPCR-ähnlich-Bindungsproteine" oder "GPCR-ähnlich-Bp") und die GPCR-ähnliche Aktivität modulieren. Solche GPCR-ähnlich-Bindungsproteine sind wahrscheinlich ebenfalls an der Weiterleitung von Signalen durch die GPCR-ähnlichen Proteine beteiligt, beispielsweise als stromaufwärts oder stromabwärts gelegene Elemente des GPCR-ähnlichen Wegs.
  • Diese Erfindung betrifft ferner neue Mittel, die durch die vorstehend beschriebenen Screening-Assays identifiziert werden, und ihre Verwendungen für Behandlungen, wie hier beschrieben.
  • B. Nachweisassays
  • Abschnitte oder Fragmente der hier identifizierten cDNA-Sequenzen (und die entsprechenden vollständigen Gensequenzen) können auf vielerlei Weise als Polynukleotidreagenzien verwendet werden. Zum Beispiel können diese Sequenzen zum: (1) Kartieren ihrer jeweiligen Gene auf einem Chromosom; (2) Identifizieren eines Individuums anhand einer winzigen biologischen Probe (Gewebetypisierung); und (3) Beitragen zur forensischen Identifikation einer biologischen Probe verwendet werden. Diese Anwendungen sind in den nachstehend Unterabschnitten beschrieben.
  • I. Chromosomenkartierung
  • Die erfindungsgemäßen isolierten vollständigen oder partiellen GPCR-ähnlichen Gensequenzen können zur Kartierung ihrer jeweiligen GPCR-ähnlichen Gene auf einem Chromosom verwendet werden, wodurch die Lokalisierung von Genregionen, die mit genetischer Erkrankung einhergehen, vereinfacht wird. Eine Computeranalyse GPCR-ähnlicher Sequenzen kann dazu verwendet werden, schnell PCR-Primer (vorzugsweise 15–25 bp Länge) auszuwählen, die nicht mehr als ein Exon in der genomischen DNA überspannen, wodurch der Amplifikationsvorgang vereinfacht wird. Diese Primer können dann für das PCR-Screening somatischer Zellhybriden verwendet werden, die einzelne menschliche Chromosomen enthalten. Nur solche Hybriden, die das menschliche Gen enthalten, das den GPCR-ähnlichen Sequenzen entspricht, ergibt ein amplifiziertes Fragment.
  • Somatisch Zellhybriden werden durch Fusion somatischer Zellen von verschiedenen Säugern (z.B. Menschen- und Mäusezellen) hergestellt. Wenn Hybriden aus menschlichen und Mäusezellen wachsen und sich teilen, verlieren sie nach und nach menschliche Chromosomen in zufälliger Reihenfolge, behalten aber die Mäusechromosomen. Unter Verwendung von Medien, in denen Mäusezellen nicht wachsen können (weil ihnen ein bestimmtes Enzym fehlt), menschliche Zellen aber wachsen können, wird das eine menschliche Chromosom, welches das Gen enthält, das das benötigte Enzym codiert, beibehalten. Unter Verwendung verschiedener Medien können Paneele von Hybridzelllinien etabliert werden. Jede Zelllinie in einem Paneel enthält entweder ein einziges menschliches Chromosom oder eine kleine Anzahl menschlicher Chromosomen und einen vollen Satz von Mäusechromosomen, was leichtes Kartieren einzelner Gene auf spezifischen menschlichen Chromosomen gestattet (D'Eustachio et al. (1983) Science 220: 919–924). Somatische Zellhybriden, die nur Fragmente menschlicher Chromosomen enthalten, können unter Verwendung menschlicher Chromsomen mit Translokationen und Deletionen ebenfalls hergestellt werden.
  • Weitere Kartierungsstrategien, die ebenso zur Kartierung einer GPCR-ähnlichen Sequenz auf ihrem Chromosom verwendet werden können, sind u.a. In-situ-Hybridisierung (in Fan et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6223–27 beschrieben), Vorscreening mit markierten Durchfluss-sortierten Chromosomen und Vorauswahl mittels Hybridisierung an chromsomenspezifische cDNA-Bibliotheken. Ferner kann Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (FISH) einer DNA-Sequenz an eine Metaphasenchromsomenspreitung zur Bereitstellung dazu verwendet werden, eine genaue chromosomale Lokalisierung in einem Schritt bereitzustellen. Eine Übersicht über diese Technik siehe in Verma et al. (1988) Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques (Pergamon Press, NY). Die FISH-Technik kann mit einer DNA-Sequenz mit nur 500 oder 600 Besen verwendet werden. Bei Klonen, die größer als 1000 Basen sind, ist es jedoch wahrscheinlicher, dass sie an eine einzige chromosomale Stelle mit für einen leichten Nachweis ausreichender Signalintensität binden. Vorzugsweise reichen 1000 Basen und stärker bevorzugt 2000 Basen aus, um gute Ergebnisse in einer vernünftigen Zeitdauer zu erhalten.
  • Reagenzien zur Chromsomenkartierung können einzeln verwendet werden, um ein einziges Chromosom oder eine einzige Stelle auf diesem Chromosom zu markieren, oder Paneele von Reagenzien können zur Markierung mehrerer Stellen und/oder mehrerer Chromosomen verwendet werden. Reagenzien, die nicht-codierenden Regionen der Gene entsprechen, sind tatsächlich zu Kartierungszwecken bevorzugt. Bei codierenden Sequenzen ist die Wahrscheinlichkeit größer, dass sie innerhalb von Genfamilien konserviert sind, wodurch die Möglichkeit von Kreuzhybridisierungen während der Chromsomenkartierung erhöht wird.
  • Eine andere Strategie zur Kartierung der chromosomalen Stelle GPCR-ähnlicher Gene verwendet erfindungsgemäße GPCR-ähnliche Polypeptide und Fragmente und Sequenzen und dafür spezifische Antikörper. Diese Kartierung kann durchgeführt werden, indem das Vorliegen eines GPCR-ähnlichen Polypeptids in Mitgliedern eines Paneels von somatischen Zellhybriden zwischen Zellen einer ersten Tierspezies, von der das Protein stammt, und Zellen einer zweiten Tierspezies spezifisch nachgewiesen wird und anschließend bestimmt wird, welche(s) somatische Zellhybrid(en) das Polypeptid exprimier(t/en), und das (die) Chromosom(en) der ersten Tierspezies, die es enthält, beobachtet wird (werden). Beispiele für diese Technik siehe in Pajunen et al. (1988) Cytogenet. Cell Genet. 47: 37–41 und Van Keuren et al. (1986) Hum. Genet. 74: 34–40. Alternativ kann das Vorliegen eines GPCR-ähnlichen Polypeptids in den somatischen Zellhybriden durch Untersuchen einer Aktivität oder Eigenschaft des Polypeptids, zum Beispiel der enzymatischen Aktivität, bestimmt werden, wie in Bordelon-Riser et al. (1979) Somatic Cell Genetics 5: 597–613 und Owerbach et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 5640–5644 beschrieben.
  • Nachdem eine Sequenz auf einer präzisen chromosomalen Stelle kartiert worden ist, kann die physikalische Position der Sequenz auf dem Chromosom mit Genkartendaten korreliert werden. (Solche Daten sind beispielsweise in V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man, online über Johns Hopkins University Welch Medical Library erhältlich, zu finden). Die Beziehung zwischen Genen und Erkrankung, die auf die gleiche chromosomale Region kartiert worden sind, kann dann mittels Linkage-Analyse (gemeinsamer Vererbung physikalisch benachbarter Gene), die z.B. in Egeland et al. (1987) Nature 325: 783–787 beschrieben ist, identifiziert werden.
  • Außerdem können Unterschiede in den DNA-Sequenzen zwischen Individuen, die von einer Erkrankung, die mit dem GPCR-ähnlichen Gen einhergeht, betroffen oder nicht betroffen sind, bestimmt werden. Wenn eine Mutation bei einigen oder allen der betroffenen Individuen, aber in keinem nicht betroffenen Individuum beobachtet wird, dann ist die Mutation wahrscheinlich die Ursache der bestimmten Erkrankung. Ein Vergleich betroffener und nicht-betroffener Individuen beinhaltet gewöhnlich zunächst das Suchen nach strukturellen Veränderungen in den Chromosomen, wie Deletionen oder Translokationen, die aus Chromosomenspreitungen sichtbar oder unter Verwendung von PCR auf Basis dieser DNA-Sequenz nachweisbar sind. Schließlich kann eine vollständige Sequenzierung von Genen aus mehreren Individuen durchgeführt werden, um das Vorliegen einer Mutation zu bestätigen und Mutationen von Polymorphismen zu unterscheiden.
  • 2. Gewebetypisierung
  • Die erfindungsgemäßen GPCR-ähnlichen Sequenzen können auch dazu verwendet werden, Individuen anhand winziger biologischer Proben zu identifizieren. Das Militär der Vereinigten Staaten zieht beispielsweise die Verwendung von Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP) zur Identifizierung seines Personals in Betracht. Bei dieser Technik wird die genomische DNA eines Individuums mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen gespalten und auf einem Southern-Blot sondiert, so dass einzigartige Banden für die Identifikation erhalten werden. Die erfindungsgemäßen Sequenzen eignen sich als zusätzliche DNA-Marker für RFLP (z.B. im U.S.-Patent Nr. 5,272,057 beschrieben).
  • Ferner können die erfindungsgemäßen Sequenzen zur Bereitstellung einer alternativen Technik zur Bestimmung der tatsächlichen DNA-Sequenz ausgewählter Abschnitte des Genoms eines Individuums Base für Base verwendet werden. So können die erfindungsgemäßen GPCR-ähnlichen Sequenzen zur Herstellung von zwei PCR-Primern vom 5'- und 3'-Ende der Sequenz verwendet werden. Diese Primer können zur Amplifizierung der DNA eines Individuums und zu ihrer anschließenden Sequenzierung verwendet werden.
  • Paneele entsprechender DNA-Sequenzen von Individuen, die auf diese Weise hergestellt werden, können einzigartige Individuenidentifikationen bereitstellen, weil jedes Individuum aufgrund allelischer Unterschieden einen einzigartigen Satz solcher DNA-Sequenzen besitzt. Die erfindungsgemäßen GPCR-ähnlichen Sequenzen stellen in einzigartiger Weise Teile des menschlichen Genoms dar. Eine allelische Variation tritt in gewissem Grad in den codierenden Regionen dieser Sequenzen und in einem höheren Grad in den nicht-codierenden Regionen auf. Es wird geschätzt, dass die allelische Variation zwischen einzelnen Menschen mit einer Frequenz von etwa einmal pro jeweils 500 Basen auftritt. Jede der hier beschriebenen Sequenzen kann in gewissem Grad als Standard verwendet werden, gegen den die DNA aus einem Individuum zu Identifikationszwecken abgeglichen werden kann. Die nicht-codierenden Sequenzen einer Nukleotidsequenz, die die in SEQ ID NR: 1 gezeigte Sequenz umfasst, kann leicht eine positive Individuenidentifikation mit einem Paneel von etwa 10 bis 1000 Primern bereitstellen, die jeweils eine nicht-codierende amplifizierte Sequenz von 100 Basen ergeben. Wenn eine vorhergesagte codierende Sequenz, wie diejenige in SEQ ID NR: 1, verwendet wird, beträgt eine angemessenere Anzahl von Primern zur positiven Individuenidentifikation 500 bis 2000.
  • 3. Verwendung partieller GPCR-ähnlicher Sequenzen in der forensischen Biologie
  • Auf DNA basierende Identifikationstechniken können auch in der forensischen Biologie verwendet werden. Auf diese Weise kann PCR-Technologie zur Amplifikation von DNA-Sequenzen verwendet werden, die von sehr kleinen biologischen Proben, wie Geweben, z.B. Haar oder Haut, oder Körperflüssigkeiten, z.B. Blut, Speichel oder Samen, entnommen werden, die an einem Tatort gefunden werden. Die amplifizierte Sequenz kann dann mit einem Standard verglichen werden, wodurch die Identifikation des Ursprungs der biologischen Probe möglich ist.
  • Die erfindungsgemäßen Sequenzen können dazu verwendet werden, Polynukleotidreagenzien, z.B. PCR-Primer, bereitzustellen, die zu spezifischen Loci im menschlichen Genom gesteuert werden, was die Zuverlässigkeit von DNA-basierten forensischen Identifikationen verstärken kann, indem beispielsweise ein anderer "Identifikationsmarker", der für ein bestimmtes Individuum einzigartig ist, bereitgestellt wird. Wie vorstehend erwähnt, kann als genaue Alternative zu Mustern, die durch von Restriktionsenzymen erzeugte Fragmente gebildet werden, die tatsächliche Basensequenzinformation zur Identifikation verwendet werden. Sequenzen, die zu nicht-codierenden Regionen einer Sequenz, die die in SEQ ID NR: 1 gezeigte Sequenz umfasst, zielgesteuert werden, sind für diese Verwendung besonders geeignet, weil eine größere Anzahl an Polymorphismen in den nicht-codierenden Regionen auftritt, wodurch es leichter wird, Individuen aufgrund dieser Technik zu unterscheiden. Beispiele für Polynukleotidreagenzien sind u.a. die GPCR-ähnlichen Sequenzen oder Teile davon, z.B. Fragmente, die von den nicht-codierenden Regionen von Sequenzen stammen, die die in SEQ ID NR: 1 gezeigte Sequenz umfassen, und eine Länge von mindestens 20 oder 30 Basen haben.
  • Die hier beschriebenen GPCR-ähnlichen Sequenzen können ferner zur Bereitstellung von Polynukleotidreagenzien, z.B. markierten oder markierbaren Sonden, verwendet werden, die zum Beispiel bei einer In-situ-Hybridisierungstechnik zur Identifikation eines spezifischen Gewebes verwendet werden können. Dies kann in Fällen sehr nützlich sein, in denen ein forensischer Pathologe vor einem Gewebe unbekannten Ursprungs steht. Paneele solcher GPCR-ähnlichen Sonden können zur Identifikation von Gewebe hinsichtlich der Spezies und/oder des Organtyps verwendet werden.
  • Auf ähnliche Weise können diese Reagenzien, z.B. GPCR-ähnliche Primer oder Sonden, für das Screening von Gewebekultur hinsichtlich Kontamination (d.h. für das Screening im Hinblick auf das Vorliegen eines Gemischs verschiedener Zelltypen in einer Kultur) verwendet werden.
  • C. Prädiktive Medizin
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch das Gebiet der prädiktiven Medizin, wobei diagnostische Assays, prognostische Assays, Pharmakogenomik und Überwachung klinischer Studien zu prognostischen (prädiktiven) Zwecken verwendet werden, um dadurch ein Individuum prophylaktisch zu behandeln. Diese Anwendungen sind in den nachstehenden Unterabschnitten beschrieben.
  • 1. Diagnostische Assays
  • Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft diagnostische Assays zum Nachweis von GPCR-ähnlicher Protein- und/oder Nukleinsäureexpression sowie GPCR-ähnlicher Aktivität im Rahmen einer biologischen Probe. Ein beispielhaftes Verfahren zum Nachweis der An- oder Abwesenheit GPCR-ähnlicher Proteine in einer biologischen Probe beinhaltet das Gewinnen einer biologischen Probe von einem Testindividuum und In-Kontakt-Bringen der biologischen Probe mit einer Verbindung oder einem Mittel, die/das in der Lage ist, GPCR-ähnliches Protein oder Nukleinsäure (z.B. mRNA, genomische DNA), die GPCR-ähnliches Protein codiert, nachzuweisen, so dass das Vorliegen von GPCR-ähnlichem Protein in der biologischen Probe nachgewiesen wird. Mit einer biologischen Probe von dem Testindividuum erhaltene Ergebnisse können mit Ergebnissen verglichen werden, die mit einer biologischen Probe von einem Kontrollindividuum erhalten werden.
  • Ein bevorzugtes Mittel zum Nachweis GPCR-ähnlicher mRNA oder genomischer DNA ist eine markierte Nukleinsäuresonde, die an GPCR-ähnliche mRNA oder genomische DNA hybridisieren kann. Die Nukleinsäuresonde kann zum Beispiel eine GPCR-ähnliche Volllängennukleinsäure, wie die in SEQ ID NR: 1 gezeigte Volllängensequenz, oder ein Teil davon sein, wie ein Nukleinsäuremolekül mit mindestens 15, 30, 50, 100, 250 oder 500 Nukleotiden Länge und ausreichend, um unter stringenten Bedingungen an GPCR-ähnliche mRNA oder genomische DNA spezifisch zu hybridisieren. Weitere geeignete Sonden für die Verwendung in den erfindungsgemäßen diagnostischen Assays sind hier beschrieben.
  • Ein bevorzugtes Mittel zum Nachweis von GPCR-ähnlichem Protein ist ein Antikörper, der in der Lage ist, an GPCR-ähnliches Protein zu binden, vorzugsweise ein Antikörper mit einer nachweisbaren Markierung. Die Antikörper können polyklonal oder stärker bevorzugt monoklonal sein. Ein intakter Antikörper oder ein Fragment davon (z.B. Fab oder F(abN)2) kann verwendet werden. Der Begriff "markiert" im Hinblick auf die Sonde oder den Antikörper soll direkte Markierung der Sonde oder des Antikörper durch Koppeln (d.h. physikalisches Verbinden) einer nachweisbaren Substanz mit der Sonde oder dem Antikörper sowie indirekte Markierung der Sonde oder des Antikörper mittels Reaktivität mit einem anderen Reagenz, das direkt markiert ist, beinhalten. Beispiele für direkte Markierung sind u.a. der Nachweis eines primären Antikörpers unter Verwendung eines fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörpers und Endmarkierung einer DNA-Sonde mit Biotin, so dass sie mit fluoreszenzmarkiertem Streptavidin nachgewiesen werden kann.
  • Der Begriff "biologische Probe" soll Gewebe, Zellen und biologische Flüssigkeiten, die von einem Individuum isoliert wurden, sowie Gewebe, Zellen und Flüssigkeiten, die in einem Individuum vorliegen, einschließen. D.h. das erfindungsgemäße Nachweisverfahren kann zum Nachweis von GPCR-ähnlicher mRNA, GPCR-ähnlichem Protein oder GPCR-ähnlicher genomischer DNA in einer biologischen Probe in vitro sowie in vivo verwendet werden. Zum Beispiel beinhalten In-vitro-Techniken zum Nachweis von GPCR-ähnlicher mRNA Northern-Hybridisierungen und In-situ-Hybridisierungen. In-vitro-Techniken zum Nachweis von GPCR-ähnlichem Protein beinhalten Enzym-verknüpfte Immunosorbent-Assays (ELISAs), Western-Blots, Immunfällungen und Immunfluoreszenz. In-vitro-Techniken zum Nachweis von GPCR-ähnlicher genomischer DNA beinhalten Southern-Hybridisierungen. Ferner beinhalten In-vivo-Techniken zum Nachweis von GPCR-ähnlichem Protein das Einbringen eines markierten Anti-GPCR-ähnlich-Antikörper in ein Individuum. Der Antikörper kann beispielsweise mit einem radioaktiven Marker markiert werden, dessen Anwesenheit und Stelle in einem Individuum durch Standardbildgebungstechniken nachgewiesen werden kann.
  • Bei einer Ausführungsform enthält die biologische Probe Proteinmoleküle des Testindividuums. Alternativ kann die biologische Probe mRNA-Moleküle aus dem Testindividuum oder genomische DNA-Moleküle aus dem Testindividuum enthalten. Bevorzugte biologische Proben sind Fibroblastenproben, insbesondere Haut- und Lungenfibroblasten, fibrotische Proben, insbesondere fibrotische Leberproben und Lebersternzellen, die auf herkömmliche Weise von einem Individuum isoliert werden.
  • Die Erfindung umfasst auch Kits zum Nachweis des Vorliegens GPCR-ähnlicher Proteine in einer biologischen Probe (einer Testprobe). Solche Kits können dazu verwendet werden zu bestimmen, ob ein Individuum an einer Störung leidet, die mit einer aberranten Expression von GPCR-ähnlichem Protein einhergeht (z.B. einer immunologischen Störung), oder einem erhöhten Risiko unterliegt, eine solche Störung zu entwickeln. Zum Beispiel kann das Kit eine markierte Verbindung oder ein markiertes Mittel, die/das in der Lage ist, GPCR-ähnliches Protein oder GPCR-ähnliche mRNA in einer biologischen Probe nachzuweisen, und Mittel zur Bestimmung der Menge eines GPCR-ähnlichen Proteins in der Probe (z.B. einen Anti-GPCR-ähnlich- Antikörper oder eine Oligonukleotidsonde, die an DNA, die ein GPCR-ähnliches Protein codiert, z.B. SEQ ID NR: 1, bindet) umfassen. Kits können auch Anweisungen enthalten, um feststellen, dass das getestete Individuum an einer Störung leidet, die mit einer aberranten Expression von GPCR-ähnlichen Sequenzen einhergeht, oder einem erhöhten Risiko unterliegt, eine solche Störung zu entwickeln, wenn die Menge an GPCR-ähnlichem Protein oder GPCR-ähnlicher mRNA über oder unter einem normalen Spiegel liegt.
  • Bei Kits auf Antikörperbasis kann das Kit zum Beispiel Folgendes umfassen: (1) einen ersten Antikörper (der z.B. an einen festen Träger gebunden ist), der an GPCR-ähnliches Protein bindet; und gegebenenfalls (2) einen zweiten unterschiedlichen Antikörper, der an GPCR-ähnliches Protein oder den ersten Antikörper bindet und mit einem nachweisbaren Mittel konjugiert ist. Bei Kits auf Oligonukleotidbasis kann das Kit zum Beispiel Folgendes umfassen: (1) ein Oligonukleotid, z.B. ein nachweisbar markiertes Oligonukleotid, das mit einer GPCR-ähnlichen Nukleinsäuresequenz hybridisiert, oder (2) ein Primerpaar, das zur Amplifikation eines GPCR-ähnlichen Nukleinsäuremoleküls geeignet ist.
  • Das Kit kann auch z.B. ein pufferndes Mittel, ein Konservierungsmittel oder ein proteinstabilisierendes Mittel umfassen. Das Kit kann auch zum Nachweis des nachweisbaren Mittel benötigte Komponenten enthalten (z.B. ein Enzym oder ein Substrat). Das Kit kann auch eine Kontrollprobe oder eine Reihe von Kontrollproben umfassen, die getestet und mit der enthaltenen Testprobe verglichen werden können. Jede Komponente des Kits ist gewöhnlich in einem einzelnen Behälter eingeschlossen, und sämtliche verschiedenen Behälter befinden sich innerhalb eines einzigen Paktes zusammen mit Anweisungen, um zu beobachten, ob das getestete Individuum an einer Störung leidet, die mit einer aberranten Expression von GPCR-ähnlichen Proteinen einhergeht, oder einem Risiko unterliegt, eine solche Störung zu entwickeln.
  • 2. Weitere diagnostische Assays
  • Unter einem anderen Aspekt beinhaltet die Erfindung ein Verfahren zur Analyse einer Mehrzahl von Fangsonden. Das Verfahren kann z.B. zur Analyse der Genexpression verwendet werden. Das Verfahren beinhaltet: Bereitstellen eines zweidimensionalen Arrays mit einer Mehrzahl Adressen, wobei jede Adresse der Mehrzahl hinsichtlich ihrer Position von jeder anderen Adresse der Mehrzahl unterscheidbar ist und jede Adresse der Mehrzahl eine einzigartige Fangsonde, z.B. ein Nukleinsäure- oder Peptidsequenz, besitzt; In-Kontakt-Bringen des Arrays mit einer, vorzugsweise gereinigten, GPCR-ähnlichen Nukleinsäure, einem, vorzugsweise gereinigten, GPCR-ähnlichen Polypeptid, oder einem GPCR-ähnlich-Antikörper und dadurch Untersuchen der Mehrzahl an Fangsonden. Die Bindung (z.B. Hybridisierung im Fall einer Nukleinsäure) an eine Fangsonde an einer Adresse der Mehrzahl wird z.B. durch ein Signal nachgewiesen, das von einer Markierung erzeugt wird, die an die GPCR-ähnliche Nukleinsäure, das GPCR-ähnliche Polypeptid oder den GPCR-ähnlich-Antikörper gebunden ist. Die Fangsonden können ein Satz von Nukleinsäuren aus einer ausgewählten Probe sein, z.B. einer Probe von Nukleinsäuren, die von eine(m/r) Kontroll- oder unstimulierten Gewebe oder Zelle stammt.
  • Das Verfahren kann das In-Kontakt-Bringen der GPCR-ähnlichen Nukleinsäure, des GPCR-ähnlichen Polypeptids oder des GPCR-ähnlich-Antikörpers mit einem ersten Array, der eine Mehrzahl an Fangsonden besitzt, und einem zweiten Array, der eine andere Mehrzahl an Fangsonden besitzt, beinhalten. Die Ergebnisse jeder Hybridisierung können verglichen werden, z.B. um Unterschiede in der Expression zwischen einer ersten und einer zweiten Probe zu analysieren. Die erste Mehrzahl an Fangsonden kann von einer Kontrollprobe stammen, z.B. einer Wildtyp-, normalen oder nicht- erkrankten, nicht-stimulierten Probe, z.B. einer biologischen Flüssigkeit, einer Gewebe- oder Zellprobe. Die zweite Mehrzahl von Fangsonden kann von einer experimentellen Probe stammen, z.B. einer Mutantentyp-, Risiko-, erkrankten oder gestörten oder stimulierten Probe, z.B. einer biologischen Flüssigkeit, einer Gewebe- oder Zellprobe.
  • Die Mehrzahl von Fangsonden kann eine Mehrzahl von Nukleinsäuresonden sein, die jeweils mit einem Allel einer erfindungsgemäßen GPCR-ähnlichen Sequenz spezifisch hybridisieren. Solche Verfahren können zum Diagnostizieren eines Individuum, z.B. zur Untersuchung des Risikos für eine Erkrankung oder Störung, zur Unersuchung der Eignung einer ausgewählten Behandlung für ein Individuum, zur Untersuchung, ob ein Individuum eine Erkrankung oder Störung hat, verwendet werden. So codiert zum Beispiel die in SEQ ID NR: 1 dargestellte h15571-Sequenz ein GPCR-ähnliches Polypeptid, das mit Leberfunktion einhergeht, und eignet sich somit zur Untersuchung von Leberstörungen.
  • Das Verfahren kann zum Nachweis von Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs) verwendet werden, wie nachstehend beschrieben.
  • Unter einem weiteren Aspekt beinhaltet die Erfindung ein Verfahren zur Analyse einer Mehrzahl an Sonden. Das Verfahren eignet sich z.B. zur Analyse der Genexpression. Das Verfahren beinhaltet: Bereitstellen eines zweidimensionalen Arrays mit einer Mehrzahl von Adressen, wobei jede Adresse der Mehrzahl hinsichtlich ihrer Position von jeder anderen Adresse der Mehrzahl unterscheidbar ist, die eine einzigartige Fangsonde besitzt, wobei z.B. die Fangsonden von einer Zelle oder einem Individuum stammen, die ein erfindungsgemäßes GPCR-ähnliches Polypeptid exprimieren, oder einer Zelle oder einem Individuum, in der/dem eine GPCR-ähnlich-vermittelte Antwort hervorgerufen wurde, z.B. durch Kontakt der Zelle mit einer erfindungsgemäßen GPCR-ähnlichen Nukleinsäure oder einem erfindungsgemäßen GPCR-ähnlichen Protein oder durch Verabreichen einer erfindungsgemäßen GPCR-ähnlichen Nukleinsäure oder eines erfindungsgemäßen GPCR-ähnlichen Proteins an die Zelle oder das Individuum; In-Kontakt-Bringen des Arrays mit einer oder mehreren Abfragesonden, wobei eine Abfragesonde eine Nukleinsäure, ein Polypeptid oder ein Antikörper sein kann (bei denen es sich vorzugsweise nicht um eine erfindungsgemäße GPCR-ähnliche Nukleinsäure, ein erfindungsgemäßes GPCR-ähnliches Polypeptid oder einen erfindungsgemäßen GPCR-ähnlich-Antikörper handelt); Bereitstellen eines zweidimensionalen Arrays mit einer Mehrzahl an Adressen, wobei jede Adresse der Mehrzahl von jeder anderen Adresse der Mehrzahl hinsichtlich ihrer Position unterscheidbar ist und jede Adresse der Mehrzahl eine einzigartige Fangsonde aufweist, wobei die Fangsonden z.B. von einer Zelle oder einem Individuum sind, die/das keine erfindungsgemäße GPCR-ähnliche Sequenz exprimiert (oder sie nicht so stark exprimiert wie im Fall der Mehrzahl an GPCR-ähnlich-positiven Fangsonden), oder von einer Zelle oder einem Individuum, in der/dem keine GPCR-ähnlich-vermittelte Antwort hervorgerufen wurde (oder in einem geringeren Ausmaß hervorgerufen wurde als in der ersten Probe); In Kontakt-Bringen des Arrays mit einer oder mehreren Abfragesonden (die vorzugsweise nicht eine erfindungsgemäße GPCR-ähnliche Nukleinsäure, ein erfindungsgemäßes GPCR-ähnliches Polypeptid oder ein erfindungsgemäßer GPCR-ähnlich-Antikörper sind) und dadurch Untersuchen der Mehrzahl an Fangsonden. Die Bindung, z.B. Hybridisierung im Fall einer Nukleinsäure, an eine Fangsonde an einer Adresse der Mehrzahl wird z.B. durch ein Signal nachgewiesen, das von einer an die Nukleinsäure, das Polypeptid oder den Antikörper gebundenen Markierung erzeugt wird.
  • Unter einem anderen Aspekt umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Analyse einer erfindungsgemäßen GPCR-ähnlichen Sequenz z.B. zur Analyse des Struktur, Funktion oder Verwandtschaft mit anderen Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen. Das Verfahren beinhaltet: Bereitstellen einer GPCR-ähnlichen Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz, z.B. der in SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 2 dargestellten h15571-Sequenz oder eines Teils davon, Vergleichen der GPCR-ähnlichen Sequenz mit einer oder mehreren, vorzugsweise einer Mehrzahl an Sequenzen aus einer Sammlung von Sequenzen, z.B. einer Nukleinsäure- oder Proteinsequenz-Datenbank, um dadurch die erfindungsgemäße GPCR-ähnliche Sequenz zu analysieren.
  • Das Verfahren kann die Untersuchung der Sequenzidentität zwischen einer erfindungsgemäßen GPCR-ähnlichen Sequenz, z.B. der h15571-Sequenz, und einer Datenbank-Sequenz umfassen. Das Verfahren kann durch Zugriff auf die Datenbank an einer zweiten Stelle, z.B. über das Internet, durchgeführt werden.
  • Unter einem anderen Aspekt beinhaltet die Erfindung einen Satz von Oligonukleotiden, der sich z.B. zur Identifikation von SNPs oder zur Identifikation spezifischer Allele einer erfindungsgemäßen GPCR-ähnlichen Sequenz, z.B. der h15571-Sequenz, eignet. Der Satz beinhaltet eine Mehrzahl an Oligonukleotiden, die jeweils ein unterschiedliches Nukleotid an einer Abfrageposition, z.B. einem SNP oder der Stelle einer Mutation, besitzen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind die Oligonukleotide der Mehrzahl in ihrer Sequenz (mit Ausnahme von Unterschieden in der Länge) zueinander identisch. Die Oligonukleotide können mit verschiedenen Markierungen versehen werden, so dass ein Oligonukleotid, das mit einem Allel hybridisiert, ein Signal liefert, das von einem Oligonukleotid unterscheidbar ist, das an ein zweites Allel hybridisiert.
  • 3. Prognostische Assays
  • Die hier beschriebenen Verfahren können ferner als diagnostische oder prognostische Assays verwendet werden, um Individuen zu identifizieren, die eine Erkrankung oder Störung haben, die mit GPCR-ähnlichem Protein, GPCR-ähnlicher Nukleinsäureexpression oder GPCR-ähnlicher Aktivität einhergeht, oder ein Risiko besitzen, eine solche Erkrankung oder Störung zu entwickeln. Prognostische Assays können zu prognostischen oder prädiktiven Zwecken verwendet werden, um dadurch ein Individuum vor dem Einsetzen einer Störung, die durch ein GPCR-ähnliches Protein, die Expression einer GPCR-ähnlichen Nukleinsäure oder eine GPCR-ähnliche Aktivität gekennzeichnet ist oder damit einhergeht, prophylaktisch zu behandeln.
  • So stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit, wobei eine Testprobe von einem Individuum erhalten und GPCR-ähnliches Protein oder GPCR-ähnliche Nukleinsäure (z.B. mRNA, genomische DNA) nachgewiesen wird, wobei das Vorliegen von GPCR-ähnlichem Protein oder GPCR-ähnlicher Nukleinsäure für ein Individuum diagnostisch ist, das eine Erkrankung oder Störung hat, die mit aberranter GPCR-ähnlicher Expression oder Aktivität einhergeht, oder ein Risiko besitzt, eine solche Erkrankung oder Störung zu entwickeln. Wie hier verwendet, betrifft eine "Testprobe" eine biologische Probe, die von einem Individuum von Interesse erhalten wird. Zum Beispiel kann eine Testprobe eine biologische Flüssigkeit (z.B. Serum), eine Zellprobe oder Gewebe sein.
  • Ferner stellt die vorliegende Erfindung unter Verwendung der hier beschriebenen prognostischen Assays Verfahren bereit um zu bestimmen, ob einem Individuum ein spezifisches Mittel (z.B. an Agonist, Antagonist, Peptidomimetikum, Protein, Peptid, eine Nukleinsäure, ein kleines Molekül oder ein anderer Arzneistoffkandidat) oder eine Klasse von Mitteln (z.B. Mittel eines Typs, der die GPCR-ähnliche Aktivität senkt) verabreicht werden kann, um eine Erkrankung oder Störung, die mit aberranter GPCR-ähnlicher Expression oder Aktivität einhergeht, wirksam zu behandeln. Auf diese Weise wird eine Testprobe erhalten, und GPCR-ähnliches Protein oder GPCR-ähnliche Nukleinsäure wird nachgewiesen. Das Vorliegen von GPCR-ähnlichem Protein oder GPCR-ähnlicher Nukleinsäure ist diagnostisch für ein Individuum, dem das Mittel zur Behandlung einer Störung, die mit aberranter GPCR-ähnlicher Expression oder Aktivität einhergeht, verabreicht werden kann.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren können auch zum Nachweis genetischer Läsionen oder Mutationen in einem GPCR-ähnlichen Gen verwendet werden, wodurch bestimmt wird, ob ein Individuum mit dem geschädigten Gen ein Risiko für eine Störung besitzt, die durch aberrante Zellproliferation und/oder -differenzierung gekennzeichnet ist. Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhalten die Verfahren das Nachweisen der An- oder Abwesenheit einer genetischen Läsion oder Mutation, die durch mindestens eines aus einer Veränderung, die die Unversehrtheit eines Gens, das ein GPCR-ähnliches Protein codiert, beeinträchtigt, oder einer Fehlexpression des GPCR-ähnlichens Gen gekennzeichnet ist, in einer Probe von Zellen des Individuums. Zum Beispiel können solche genetischen Läsionen oder Mutationen durch Bestätigen des Vorliegens von mindestens einem der Folgenden nachgewiesen werden: (1) einer Deletion von einem oder mehreren Nukleotiden aus einem GPCR-ähnlichen Gen; (2) einer Addition von einem oder mehreren Nukleotiden zu einem GPCR-ähnlichen Gen; (3) einer Substitution von einem oder mehreren Nukleotiden eines GPCR-ähnlichen Gens; (4) einer chromosomalen Umlagerung eines GPCR-ähnlichen Gens; (5) einer Veränderung im Spiegel eines Boten-RNA-Transkripts eines GPCR-ähnlichen Gens; (6) einer aberranten Modifikation eines GPCR-ähnlichen Gens, wie des Methylierungsmusters der genomischen DNA; (7) des Vorliegens eines Nicht-Wildtyp-Spleißmusters eines Boten-RNA-Transkripts eines GPCR-ähnlichen Gens; (8) eines Nicht-Wildtyp-Spiegels eines GPCR-ähnlichen Proteins; (9) eines Allelverlusts eines GPCR-ähnlichen Gens; und (10) einer unangemessenen posttranslationalen Modifikation eines GPCR-ähnlichen Proteins. Wie hier beschrieben, gibt es eine große Zahl von im Stand der Technik bekannten Assaytechniken, die zum Nachweis von Läsionen in einem GPCR-ähnlichen Gen verwendet werden können. Jeder Zelltyp oder jedes Gewebe, zum Beispiel, Lebersternzellen, Haut- und Lungenfibroblasten, fibrotische Gewebe, insbesondere fibrotische Lebergewebe, in denen GPCR-ähnliche Proteine exprimiert werden, können in den hier beschriebenen prognostischen Assays verwendet werden.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen beinhaltet der Nachweis der Läsion die Verwendung einer Sonde/eines Primers in einer Polymerasekettenreaktion (PCR) (siehe z.B. die U.S.-Patente Nr. 4,683,195 und 4,683,202), wie Anker-PCR oder RACE-PCR, oder alternativ in einer Ligationskettenreaktion (LCR) (siehe z.B. Landegran et al. (1988) Science 241: 1077–1080; und Nakazawa et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 360–364), wobei die Letztere besonders geeignet zum Nachweis von Punktmutationen in dem GPCR-ähnlichen Gen sein kann (siehe z.B. Abravaya et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23: 675–682). Es wird vorausgesetzt, dass PCR und/oder LCR für die Verwendung als erster Amplifikationsschritt in Verbindung mit jeder der hier beschriebenen, zum Nachweis von Mutationen verwendeten Techniken wünschenswert sein kann.
  • Alternative Amplifikationsverfahren beinhalten die selbsterhaltende Sequenzreplikation (Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874–1878), das Transkriptions-Amplifikationssystem (Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173–1177), Q-Beta-Replicase (Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6: 1197) oder jedes andere Nukleinsäureamplifikationsverfahren, gefolgt von Nachweis der amplifizierten Moleküle unter Verwendung von Techniken, die dem Fachmann bekannt sind. Diese Nachweisschemata sind besonders zum Nachweis von Nukleinsäuremolekülen geeignet, wenn diese Moleküle in sehr kleiner Anzahl vorliegen.
  • Bei einer alternativen Ausführungsform können Mutationen in einem GPCR-ähnlichen Gen aus einer Probenzelle durch Veränderungen in den Restriktionsenzmyspaltungsmustern von isolierter Testproben- und Kontroll-DNA, die mit einer oder mehreren Restriktionsendonukleasen gespalten wird, identifiziert werden. Außerdem kann die Verwendung sequenzspezifischer Ribozyme (siehe z.B. U.S.-Patent Nr. 5,498,531) verwendet werden, um das Vorliegen spezifischer Mutationen anhand der Entwicklung oder des Verlusts einer Ribozymspaltstelle zu bewerten.
  • Bei anderen Ausführungsformen können genetische Mutationen in einem GPCR-ähnlichen Molekül durch Hybridisieren einer Probe und von Kontroll-Nukleinsäuren, z.B. DNA oder RNA, an hochdichte Arrays, die Hunderte oder Tausende von Oligonukleotidsonden enthalten, identifiziert werden (Cronin et al. (1996) Human Mutation 7: 244–255; Kozal et al. (1996) Nature Medicine 2: 753–759). Bei noch einer anderen Ausführungsform kann jede von einer Vielzahl im Stand der Technik bekannter Sequenzierungsreaktionen dazu verwendet werden, das GPCR-ähnliche Gen direkt zu sequenzieren und Mutationen durch Vergleichen der Sequenz des GPCR-ähnlichen Probengens mit der entsprechenden Wildtyp- (Kontroll-) Sequenz nachzuweisen. Beispiele für Sequenzierungsreaktionen sind u.a. solche, die auf Techniken basieren, die von Maxim und Gilbert ((1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560) oder Sanger ((1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463) entwickelt wurden. Es wird ebenfalls in Betracht gezogen, das jedes einer Reihe von automatisierten Sequenzierverfahren verwendet werden kann, wenn die diagnostischen Assays durchgeführt werden ((1995) Bio/Techniques 19: 448), einschließlich Sequenzierung mittels Massenspektrometrie (siehe z.B. PCT-Veröffentlichung Nr. WO 94/16101; Cohen et al. (1996) Adv. Chromatogr. 36: 127–162; und Griffin et al. (1993) Appl. Biochem. Biotechnol. 38: 147–159).
  • Andere Verfahren zum Nachweis von Mutationen in dem GPCR-ähnlichen Gen beinhalten Verfahren, bei denen ein Schutz vor Spaltungmitteln zum Nachweis fehlgepaarter Basen in RNA/RNA- oder RNA/DNA-Heteroduplexen verwendet wird (Myers et al. (1985) Science 230: 1242). Siehe auch Cotton et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4397; Saleeba et al. (1992) Methods Enzymol. 217: 286–295. Bei einer bevorzugten Ausführungsform kann die Kontroll-DNA oder -RNA zum Nachweis markiert werden.
  • Bei noch einer anderen Ausführungsform setzt die Fehlpaarungsspaltreaktion eine oder mehrere "DNA-Fehlpaarungsreparatur"-Enzyme, die fehlgepaarte Basenpaare in doppelsträngiger DNA erkennen, in definierten Systemen zum Nachweis und zur Kartierung von Punktmutationen in GPCR-ähnlichen cDNAs ein, die aus Proben von Zellen erhalten werden. Siehe z.B. Hsu et al. (1994) Carcinogenesis 15: 1657–1662. Einer beispielhaften Ausführungsform zufolge wird eine auf einer GPCR-ähnlichen Sequenz, z.B. einer GPCR-ähnlichen Wildtyp-Sequenz, basierende Sonde mit einer cDNA oder einem anderen DNA-Produkt aus (einer) Testzelle(n) hybridisiert. Der Duplex wird mit einem DNA-Fehlpaarungsreparaturenzym behandelt, und die Spaltprodukte, wenn vorhanden, können anhand von Elektrophoreseprotokollen oder dergleichen nachgewiesen werden. Siehe z.B. U.S.-Patent Nr. 5,459,039.
  • Bei anderen Ausführungsformen werden Veränderungen in der elektrophoretischen Mobilität zur Identifikation von Mutationen in GPCR-ähnlichen Genen verwendet. Zum Beispiel kann Einzelstrang-Konformationspolymorphismus (single-strand conformation polymorphism, SSCP) dazu verwendet werden, Unterschiede in der elektrophoretischen Mobilität zwischen mutierten und Wildtyp-Nukleinsäuren nachzuweisen (Orita et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2766; siehe auch Cotton (1993) Mutat. Res. 285: 125–144; Hayashi (1992) Genet. Anal. Tech. Appl. 9: 73–79). Die Empfindlichkeit des Assays kann durch Verwendung von RNA (anstelle von DNA), in der die Sekundärstruktur empfindlicher gegenüber einer Veränderung in der Sequenz ist, verstärkt werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform verwendet das Gegenstandsverfahren eine Heteroduplexanalyse, um doppelsträngige Heteroduplexmoleküle auf Basis von Veränderungen in der elektrophoretischen Mobilität aufzutrennen (Keen et al. (1991) Trends Genet. 7: 5).
  • Bei noch einer anderen Ausführungsform wird die Bewegung von mutierten oder Wildtypfragmenten in Polyacrylamidgelen, die einen Gradienten eines Denaturierungsmittels enthalten, unter Verwendung von denaturierender Gradientengelelektrophorese (DGGE) untersucht (Myers et al. (1985) Nature 313: 495). Wird DGGE als Analyseverfahren verwendet, wird die DNA modifiziert, um zu gewährleisten, dass sie nicht vollständig denaturiert, zum Beispiel durch Hinzufügen einer GC-Klammer von etwa 40 bp aus einer hochschmelzenden GC-reichen DNA mittels PCR. Bei einer anderen Ausführungsform wird ein Temperaturgradient anstelle eines denaturierenden Gradienten zur Identifikation von Unterschieden in der Beweglichkeit von Kontroll- und Proben-DNA eingesetzt (Rosenbaum und Reissner (1987) Biophys. Chem. 265: 12753).
  • Beispiele für andere Techniken zum Nachweis von Punktmutationen sind u.a., sind aber nicht beschränkt auf selektive Oligonukleotid-Hybridisierung, selektive Amplifikation oder selektive Primerextension. Zum Beispiel können Oligonukleotid-Primer, in die die bekannte Mutation zentral eingebracht wurde, hergestellt und dann mit der Ziel-DNA unter Bedingungen hybridisiert werden, die nur dann eine Hybridisierung gestatten, wenn eine perfekte Übereinstimmung vorgefunden wird (Saiki et al. (1986) Nature 324: 163); Saiki et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6230). Solche allelspezifischen Oligonukleotide werden an PCR-amplifizierte Ziel-DNA oder eine Reihe verschiedener Mutationen hybridisiert, wenn die Oligonukleotide an die Hybridisierungsmembran gebunden und mit markierter Ziel-DNA hybridisiert werden.
  • Alternativ kann eine allelspezifische Amplifikationstechnologie, die auf selektiver PCR-Amplifikation beruht, in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Als Primer für die spezifische Amplifikation verwendete Oligonukleotide können die Mutation von Interesse in der Mitte des Moleküls, so dass die Amplifikation auf einer differenziellen Hybridisierung beruht (Gibbs et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 2437–2448), oder am äußersten 3'-Ende eines Primers tragen, an dem unter geeigneten Bedingungen eine Fehlpaarung die Polymeraseextension verhindern oder verringern kann (Prossner (1993) Tibtech 11: 238). Zusätzlich kann es wünschenswert sein, eine neue Restriktionsstelle in die Region der Mutation einzubringen, um einen auf Spaltung basierenden Nachweis zu erzeugen (Gasparini et al. (1992) Mol. Cell Probes 6: 1). Es wird vorausgesetzt, dass bei bestimmten Ausführungsformen eine Amplifikation auch unter Verwendung von Taq-Ligase zur Amplifikation durchgeführt werden kann (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189). In solchen Fällen erfolgt eine Ligation nur, wenn eine perfekte Paarung am 3'-Ende der 5'-Sequenz vorliegt, wodurch es möglich wird, das Vorliegen einer bekannten Mutation an einer spezifischen Stelle durch Überprüfen des Vorliegens oder Fehlens von Amplifikation nachzuweisen.
  • Die hier beschriebenen Verfahren können zum Beispiel unter Verwendung vorgepackter diagnostischer Kits durchgeführt werden, die mindestens eine hier beschriebene Sondennukleinsäure oder ein hier beschriebenes Antikörperreagenz umfassen, die geeigneterweise z.B. in klinischen Umfeldern auf diagnostizierte Patienten angewendet werden können, die Symptome oder eine Familiengeschichte einer Erkrankung oder Krankheit, an der ein GPCR-ähnliches Gen beteiligt ist, aufweisen.
  • 4. Pharmakogenomik
  • Mittel oder Modulatoren, die eine stimulatorische oder inhibitorische Wirkung auf eine GPCR-ähnliche Aktivität (z.B. GPCR-ähnliche Genexpression) haben, wie mit einem hier beschriebenen Screening-Assay identifiziert, können an Individuen verabreicht werden, um Störungen, die mit aberranter GPCR-ähnlicher Aktivität einhergehen, (prophylaktisch oder therapeutisch) zu behandeln sowie den Phänotyp einer Immunantwort zu modulieren. In Verbindung mit einer solchen Behandlung kann die Pharmakogenomik (d.h. die Untersuchung der Beziehung zwischen den Genotyp eines Individuums und der Antwort des Individuums auf eine fremde Verbindung oder einen fremden Arzneistoff) in Betracht gezogen werden. Unterschiede im Stoffwechsel von Therapeutika können zu schwerer Toxizität oder Therapieversagen führen, indem die Beziehung zwischen der Dosis und der Blutkonzentration des pharmakologischen Wirkstoffs verändert wird. Somit gestattet die Pharmakogenomik des Individuums die Auswahl von Wirkstoffen (z.B. Arzneistoffen) für prophylaktische oder therapeutische Behandlungen auf Basis der Berücksichtigung des Genotyps des Individuums. Eine solche Pharmakogenomik kann ferner dazu verwendet werden, geeignete Dosierungen und Therapieschemata zu bestimmen. Folglich kann die Aktivität eines GPCR-ähnlichen Proteins, die Expression einer GPCR-ähnlichen Nukleinsäure oder der Mutationsgehalt GPCR-ähnlicher Gene in einem Individuum bestimmt werden, um dadurch (ein) geeignete(s) Mittel zur therapeutischen oder prophylaktischen Behandlung des Individuums auszuwählen.
  • Die Pharmakogenomik beschäftigt sich mit klinisch signifikanten erblichen Variationen in der Antwort auf Arzneistoffe aufgrund von veränderter Arzneistoffdisposition und anomaler Wirkung bei betroffenen Personen. Siehe z.B. Linder (1997) Clin. Chem. 43(2): 254–266. Im Allgemeinen lassen sich zwei Typen pharmakogenetischer Zustände unterscheiden. Genetische Zustände, die als einzelner Faktor übertragen werden, der die Weise, in der Arzneistoffe auf den Körper wirken, verändert, werden als "veränderte Arzneistoffwirkung" bezeichnet. Genetische Zustände, die als Einzelfaktoren übertragen werden, die die Weise verändern, auf die der Körper auf Arzneistoffe einwirkt, werden als "veränderter Arzneistoffmetabolismus" bezeichnet. Diese pharmakogenetischen Zustände können entweder als seltene Defekte oder Polymorphismen auftreten. Zum Beispiel ist die Glucose-6-phosphatdehydrogenase-Defizienz (G6PD) eine übliche vererbte Enzymopathie, bei der die hauptsächliche klinische Komplikation eine Hämolyse nach Aufnahme oxidativer Arzneistoffe (Antimalariamittel, Sulfonamide, Analgetika, Nitrofurane) und Verzehr von Fava-Bohnen ist.
  • Unterschiede im Stoffwechsel von Therapeutika können zu schwerer Toxizität oder Therapieversagen durch Veränderung des Verhältnisses zwischen der Dosis und der Blutkonzentration des pharmakologischen Wirkstoffs führen. So kann ein Arzt oder Kliniker in Betracht ziehen, Kenntnisse, die in relevanten pharmakogenomischen Studien erhalten wurden, anzuwenden, um zu bestimmen, ob ein erfindungsgemäßes GPCR-ähnliches Molekül oder ein erfindungsgemäßer GPCR-ähnlicher Modulator verabreicht werden soll, sowie um die Dosierung und/oder das Therapieschema der Behandlung mit einem erfindungsgemäßen GPCR-ähnlichen Molekül oder erfindungsgemäßen GPCR-ähnlichen Modulator maßzuschneidern.
  • Ein pharmakogenomischer Ansatz zur Identifikation von Genen, die eine Arzneistoffantwort vorhersagen, der als "genomweite Assoziation" bekannt ist, beruht hauptsächlich auf einer hochauflösenden Karte des menschlichen Genoms, die aus bereits bekannten, mit Genen zusammenhängenden Markern besteht, (z.B. einer "biallelischen" Genmarkerkarte, die aus 60000–100000 polymorphen oder variablen Stellen auf dem menschlichen Genom besteht, von denen jede zwei Varianten aufweist). Eine derartige hochauflösende Genkarte kann mit einer Karte des Genoms von jedem einer statistisch signifikanten Anzahl von Patienten verglichen werden, die an einer Phase-II/III-Arzneistoffstudie teilnehmen, um Marker zu identifizieren, die mit einer besonderen beobachteten Arzneistoffantwort oder einer Nebenwirkung zusammenhängen. Alternativ kann eine derartige hochauflösende Karte aus einer Kombination einiger zehn Millionen bekannter Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs) im menschlichen Genom erzeugt werden. Wie hier verwendet, ist "SNP" eine allgemeine Veränderung, die in einer einzelnen Nukleotidbase in einer DNA-Abfolge vorkommt. Zum Beispiel kann ein SNP einmal alle 1000 Basen der DNA auftreten. Ein SNP kann an einem Erkrankungsprozess beteiligt sein, die große Mehrheit kann jedoch nicht mit Erkrankung zusammenhängen. Liegt eine Genkarte auf Basis des Auftretens solcher SNPs vor, können Individuen je nach einem besonderen Muster der SNPs in ihrem individuellen Genom derart in genetische Kategorien gruppiert werden, dass Behandlungsschemata auf Gruppen genetisch ähnlicher Individuen zugeschnitten werden können, wobei Vererbungsgänge, die solchen genetisch ähnlichen Individuen gemeinsam sein können, berücksichtigt werden.
  • Alternativ kann ein Verfahren, das als "Kandidatengen-Ansatz" bezeichnet wird, zur Identifikation von Genen verwendet werden, die eine Arzneistoffantwort vorhersagen. Diesem Verfahren zufolge können, wenn ein Gen, das das Ziel eines Arzneistoffs (z.B. ein erfindungsgemäßes GPCR-ähnliches Protein) codiert, bekannt ist, alle üblichen Varianten des Gens in der Population recht leicht identifiziert werden, und es kann bestimmt werden, ob der Besitz einer Version des Gens gegenüber einer anderen mit einer bestimmten Arzneistoffantwort einhergeht.
  • Alternativ kann ein Verfahren, das als "Genexpressionsprofiluntersuchung" bezeichnet wird, zur Identifikation von Genen verwendet werden, die eine Arzneistoffantwort vorhersagen. Zum Beispiel kann die Genexpression eines Tieres nach einer Dosis eines Arzneistoffs (z.B. eines erfindungsgemäßen GPCR-ähnlichen Moleküls oder GPCR-ähnlichen Modulators) einen Hinweis darauf geben, ob mit Toxizität zusammenhängende genetische Wege angeschaltet wurden.
  • Information, die aus mehr als einem der vorstehenden pharmakogenomischen Ansätze erzeugt wird, kann zur Bestimmung geeigneter Dosierungs- und Behandlungsschemata zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung eines Individuums verwendet werden. Diese Kenntnis, wird sie auf Dosierung oder Arzneistoffauswahl angewandt, kann nachteilige Reaktionen oder Therapieversagen vermeiden und so die therapeutische oder prophylaktische Wirksamkeit verstärken, wenn ein Individuum mit einem erfindungsgemäßen GPCR-ähnlichen Molekül oder GPCR-ähnlichen Modulator, wie einem durch einen der hier beschriebenen beispielhaften Screening-Assays identifizierten Modulator, behandelt wird.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner Verfahren zur Identifikation neuer Mittel oder Kombinationen bereit, die auf der Identifikation von Mitteln basieren, welche die Aktivität von einem oder mehreren Genprodukten modulieren, die von einem oder mehreren der erfindungsgemäßen GPCR-ähnlichen Gene codiert werden, wobei diese Produkte mit einer Resistenz der Zellen gegen ein Therapeutikum einhergehen können. Genauer gesagt, kann die Aktivität der Proteine, die von den erfindungsgemäßen GPCR-ähnlichen Genen codiert werden, als Basis zur Identifikation von Mitteln zur Überwindung von Arzneistoffresistenz verwendet werden. Durch Blockierung der Aktivität von einem oder mehreren der Resistenzproteine werden Zielzellen, z.B. Lebersternzellen, empfänglich für eine Behandlung mit einem Mittel, gegen den die unmodifizierten Zielzellen resistent waren.
  • Eine Überwachung des Einflusses von Mitteln (z.B. Arzneistoffen) auf die Expression oder Aktivität eines GPCR-ähnlichen Proteins kann in klinischen Studien ausgeübt werden. Zum Beispiel kann die Wirksamkeit eines Mittels, die durch einen Screening-Assay, wie hier beschrieben, bestimmt wird, zur Erhöhung der GPCR-ähnlichen Genexpression, Proteinspiegel oder zur Nach-oben-Regulation von GPCR-ähnlicher Aktivität in klinischen Studien von Individuen überwacht werden, die verringerte GPCR-ähnliche Genexpression, Proteinspiegel oder nach unten regulierte GPCR-ähnliche Aktivität zeigen. Alternativ kann die Wirksamkeit eines Mittels, die durch einen Screening-Assay bestimmt wurde, zur Senkung der GPCR-ähnlichen Genexpression, Proteinspiegel oder zur Nach-unten-Regulation von GPCR-ähnlicher Aktivität in klinischen Studien von Individuen überwacht werden, die erhöhte GPCR-ähnliche Genexpression, Proteinspiegel oder nach oben regulierte GPCR-ähnliche Aktivität zeigen. In solchen klinischen Studien kann die Expression oder Aktivität eines GPCR-ähnlichen Gens und vorzugsweise anderer Gene, die zum Beispiel bei einer GPCR-ähnlich-assoziierten Störung impliziert sind, als "Ablesung" oder Marker für den Phänotyp einer bestimmten Zelle verwendet werden.
  • Als veranschaulichende Ausführungsform ist die Aktivität arzneistoffmetabolisierender Enzyme eine Hauptdeterminante sowohl der Intensität als auch der Dauer der Arzneistoffwirkung. Die Entdeckung genetischer Polymorphismen arzneistoffmetabolisierender Enzyme (z.B. von N-Acetyltransferase 2 (NAT 2) und den Cytochrom-P450-Enzymen CYP2D6 und CYP2C19) lieferte eine Erklärung dafür, warum einige Patienten nicht die erwarteten Arzneistoffwirkungen erhalten oder eine übermäßige Arzneistoffreaktion und schwerwiegende Toxizität zeigen, nachdem sie die Standard- und sichere Dosis eines Arzneistoffs eingenommen haben. Diese Polymorphismen werden in der Population in zwei Phänotypen exprimiert, dem übermäßigen Metabolisierer (extensive metabolizer, EM) und dem schlechten Metabolisierer (poor metabolizer, PM). Die Prävalenz von PM unterscheidet sich zwischen unterschiedlichen Populationen. Zum Beispiel ist das Gen, das CYP2D6 codiert, hochpolymorph, und mehrere Mutationen wurden bei PM identifiziert, die sämtlich zum Fehlen von funktioneller CYP2D6 führen. Schlechte Metabolisierer von CYP2D6 und CYP2C19 erleiden recht häufig eine übermäßige Arzneistoffantwort und Nebenwirkungen, wenn sie Standarddosen erhalten. Wenn ein Metabolit die wirksame therapeutische Einheit ist, zeigt ein PM keine Therapieantwort, wie für die analgetische Wirkung von Codein, die von seinem durch CYP2D6 gebildeten Metaboliten Morphin vermittelt wird, demonstriert wurde. Das andere Extrem sind die so genannten ultraschnellen Metabolisierer, die nicht auf Standarddosen reagieren. Vor kurzem wurde identifiziert, dass die molekulare Basis auf CYP2D6-Genamplifikation beruht.
  • So können die Aktivität von GPCR-ähnlichem Protein, die Expression von GPCR-ähnlicher Nukleinsäure oder der Mutationsgehalt von GPCR-ähnlichen Genen in einem Individuum bestimmt werden, um dadurch (ein) geeignete(s) Mittel zur therapeutischen oder prophylaktischen Behandlung des Individuums auszuwählen. Zusätzlich können pharmakogenetische Studien dazu verwendet werden, die Genotypisierung polymorpher Allele, die arzneistoffmetabolisierende Enzyme codieren, auf die Identifikation des Arzneistoffreaktionsphänotyps eines Individuums anzuwenden. Dieses Wissen, wenn es auf die Dosierung oder Arzneistoffauswahl angewendet wird, kann nachteilige Reaktionen oder Therapieversagen vermeiden und so die therapeutische oder prophylaktische Wirksamkeit verstärken, wenn ein Individuum mit einem GPCR-ähnlichen Modulator, wie einem durch einen der hier beschriebenen beispielhaften Screening-Assays identifiziertem Modulator, behandelt wird.
  • 5. Überwachung von Wirkungen während klinischer Studien
  • Die Überwachung des Einflusses von Mitteln (z.B. Arzneistoffen, Verbindungen) auf die Expression oder Aktivität GPCR-ähnlicher Gene (z.B. die Fähigkeit, aberrante Zellproliferation und/oder -differenzierung zu modulieren) kann nicht nur beim grundlegenden Arzneistoff-Screening, sondern auch in klinischen Studien angewendet werden. Zum Beispiel kann die Wirksamkeit eines Mittels, wie durch einen Screening- Assay, wie hier beschrieben, bestimmt, zur Erhöhung oder Verringerung der GPCR-ähnlichen Genexpression, Proteinspiegel oder Proteinaktivität in klinischen Studien von Individuen, die erhöhte oder verringerte GPCR-ähnliche Genexpression, Proteinspiegel oder Proteinaktivität zeigen, überwacht werden. In solchen klinischen Studien kann die GPCR-ähnliche Expression oder Aktivität und vorzugsweise diejenige anderer Gene, die zum Beispiel bei einer zellulären Proliferationsstörung impliziert wurden, als Marker für die Immunreaktionsfähigkeit einer bestimmten Zelle verwendet werden.
  • Zum Beispiel und nicht als Beschränkung können Gene identifiziert werden, die in Zellen durch Behandlung mit einem Mittel (z.B. einer Verbindung, einem Arzneistoff oder kleinen Molekül) moduliert werden, das GPCR-ähnliche Aktivität moduliert (wie z.B. in einem hier beschriebenen Screening-Assay identifiziert). So können zur Untersuchung der Wirkung von Mitteln gegen Zellproliferationsstörungen, zum Beispiel in einer klinischen Studie, Zellen isoliert und RNA präpariert und hinsichtlich der Spiegel der Expression GPCR-ähnlicher Gene und anderer Gene, die bei der Störung impliziert sind, analysiert werden. Die Genexpressionsspiegel (d.h. ein Genexpressionsmuster) können mittels Northern-Blot-Analyse oder RT-PCR, wie hier beschrieben, oder alternativ durch Messen der Menge an produziertem Protein durch eines der Verfahren, wie hier beschrieben, oder durch Messen der Spiegel der Aktivität GPCR-ähnlicher Gene oder anderer Gene quantifiziert werden. Auf diese Weise kann das Genexpressionsmuster als Marker dienen, der auf die physiologische Antwort der Zellen auf das Mittel hinweist. Also kann dieser Reaktionszustand vor und zu verschiedenen Zeitpunkten während einer Behandlung des Individuums mit dem Mittel bestimmt werden.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Überwachung der Wirksamkeit einer Behandlung eines Individuums mit einem Mittel (z.B. einem Agonisten, Antagonisten, Peptidomimetikum, Protein, Peptid, einer Nukleinsäure, einem kleinen Molekül oder einem anderen Arzneistoffkandidaten, der durch die hier beschriebenen Screening-Assays identifiziert wird) bereit, umfassend die Schritte (1) Gewinnen einer Vorverabreichungsprobe von einem Individuum vor der Verabreichung des Mittels; (2) Nachweisen des Spiegels der Expression eines GPCR-ähnlichen Proteins, einer GPCR-ähnlichen mRNA oder genomischen DNA in der Vorverabreichungsprobe; (3) Gewinnen von einer oder mehreren Nachverabreichungsproben von dem Individuum; (4) Nachweisen des Spiegels der Expression oder Aktivität des GPCR-ähnlichen Proteins, der GPCR-ähnlichen mRNA oder genomischen DNA in den Nachverabreichungsproben; (5) Vergleichen des Spiegels der Expression oder Aktivität des GPCR-ähnlichen Proteins, der GPCR-ähnlichen mRNA oder genomischen DNA in der Vorverabreichungsprobe mit dem GPCR-ähnlichen Protein, der GPCR-ähnlichen mRNA oder genomischen DNA in der Nachverabreichungsprobe oder den Nachverabreichungsproben; und (vi) Verändern der Verabreichung des Mittels an das Individuum folgerichtig, um die gewünschte Wirkung, d.h. zum Beispiel eine Zunahme oder Abnahme in der Expression oder Aktivität eines GPCR-ähnlichen Proteins, herbeizuführen.
  • C. Behandlungsverfahren
  • Die vorliegende Erfindung stellt sowohl prophylaktische als auch therapeutische Verfahren zur Behandlung eines Individuums bereit, das ein Risiko für eine Störung, die mit aberranter GPCR-ähnlicher Expression oder Aktivität einhergeht, hat (oder empfänglich dafür ist) oder eine solche Störung hat. Außerdem finden die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen Anwendung bei der Modulation der Behandlung der hier beschriebenen Störungen. So sind hier Therapien für Immun-, entzündliche, hämatologische, fibrotische, hepatische und respiratorische Störungen; Störungen, die mit den folgenden Zellen oder Geweben zusammenhängen: Lymphknoten; Milz; Thymus; Gehirn; Lunge; Skelettmuskulatur; fetaler Leber; Mandel; Colon; Herz; Leber; mononukleären Zellen aus peripherem Blut (PBMC); CD34+; Knochenmarkszellen; neonatalem Nabelschnurblut (CB-CD34+); Leukozyten aus G-CSF-behandelten Patienten (mPB-Leukozyten); CD14+-Zellen; Monozyten; Lebersternzellen; fibrotische Leber-; Nieren-; Rückenmarks-; und Haut- und Lungenfibroblasten; mit umfasst.
  • 1. Prophylaktische Verfahren
  • Unter einem Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Vorbeugung einer Erkrankung oder eines Zustands, der mit aberranter GPCR-ähnlicher Expression oder Aktivität einhergeht, in einem Individuum durch Verabreichen eines Mittels, das GPCR-ähnliche Expression oder mindestens eine GPCR-ähnliche Genaktivität moduliert, an das Individuum bereit. Individuen mit einem Risiko für eine Erkrankung, die durch aberrante GPCR-ähnliche Expression oder Aktivität verursacht wird oder zu der aberrante GPCR-ähnliche Expression oder Aktivität beiträgt, können zum Beispiel durch jeden oder eine Kombination von diagnostischen oder prognostischen Assays, wie hier beschrieben, identifiziert werden. Die Verabreichung eines prophylaktischen Mittels kann vor der Manifestation von Symptomen, die für die GPCR-ähnliche Aberranz charakteristisch sind, erfolgen, so dass eine Erkrankung oder Störung verhindert oder alternativ in ihrem Voranschreiten verzögert wird. Je nach dem Typ der GPCR-ähnlichen Aberranz kann zum Beispiel ein GPCR-ähnlich-Agonisten- oder GPCR-ähnlich-Antagonistenmittel zur Behandlung des Individuums verwendet werden. Das angemessene Mittel kann auf Basis von hier beschriebenen Screening-Assays ermittelt werden.
  • 2. Therapeutische Verfahren
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft Verfahren zur Modulation der GPCR-ähnlichen Expression oder Aktivität zu therapeutischen Zwecken. Das erfindungsgemäße Modulationsverfahren umfasst das In-Kontakt-Bringen einer Zelle mit einem Mittel, das eine oder mehrere der Aktivitäten von mit der Zelle zusammenhängender GPCR-ähnlicher Proteinaktivität moduliert. Ein Mittel, das GPCR-ähnliche Proteinaktivität moduliert, kann ein Mittel sein, wie hier beschrieben, wie eine Nukleinsäure oder ein Protein, ein natürlich vorkommender Erkennungsligand eines GPCR-ähnlichen Proteins, ein Peptid, ein GPCR-Peptidomimetikum oder ein anderes kleines Molekül. Bei einer Ausführungsform stimuliert das Mittel eine oder mehrere der biologischen Aktivitäten von GPCR-ähnlichem Protein. Beispiele für solche stimulatorischen Mittel beinhalten aktives GPCR-ähnliches Protein und ein Nukleinsäuremolekül, das ein GPCR-ähnliches Protein codiert und in die Zelle eingebracht wurde. Bei einer anderen Ausführungsform hemmt das Mittel eine oder mehrere der biologischen Aktivitäten von GPCR-ähnlichem Protein. Beispiel für solche inhibitorischen Mittel sind u.a. Antisense-GPCR-ähnlich-Nukleinsäuremoleküle und Anti-GPCR-ähnlich-Antikörper.
  • Die Modulationsverfahren können in vitro (z.B. durch Kultivieren der Zelle mit dem Mittel) oder alternativ in vivo (z.B. durch Verabreichen des Mittels an ein Individuum) durchgeführt werden. Als solche stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Behandlung eines Individuums bereit, das von einer Erkrankung oder Störung betroffen ist, die durch aberrante Expression oder Aktivität eines GPCR-ähnlichen Proteins oder Nukleinsäuremoleküls gekennzeichnet ist. Bei einer Ausführungsform umfasst das Verfahren das Verabreichen eines Mittels (z.B. eines durch einen hier beschriebenen Screening-Assay identifizierten Mittels) oder einer Kombination von Mitteln, das GPCR-ähnliche Expression oder Aktivität moduliert (z.B. nach oben oder nach unten reguliert). Bei einer anderen Ausführungsform umfasst das Verfahren das Verabreichen eines GPCR-ähnlichen Proteins oder Nukleinsäuremoleküls als Therapie, um verringerte oder aberrante GPCR-ähnliche Expression oder Aktivität zu kompensieren.
  • Eine Stimulation der GPCR-Aktivität ist in Situationen wünschenswert, in denen ein GPCR-ähnliches Protein anomal nach unten reguliert ist und/oder in denen eine erhöhte GPCR-ähnliche Aktivität wahrscheinlich eine günstige Wirkung hat. Dagegen ist eine Hemmung der GPCR-ähnlichen Aktivität in Situationen wünschenswert, in denen die GPCR-ähnliche Aktivität anomal nach oben reguliert ist und/oder in denen eine verringerte GPCR-ähnliche Aktivität wahrscheinlich eine günstige Wirkung hat.
  • Diese Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht, die nicht als beschränkend aufgefasst werden sollen.
  • EXPERIMENTELLER TEIL
  • Beispiel 1: Isolation von h15571
  • Der Klon h15571 wurde aus menschlichen Thymus- und Milz-cDNA-Bibliotheken isoliert. Der identifizierte Klon h15571 codiert ein Transkript von etwa 6,09 Kb (entsprechend der in SEQ ID NR: 1 dargestellten cDNA). Die Nukleotide 366–4014 dieses Transkripts stellen einen offenen Leserahmen dar, der ein vorhergesagtes Polypeptid aus 1338 Aminosäuren codiert (SEQ ID NR: 2).
  • Eine Analyse der GPCR-ähnlichen h15571-Aminosäuresequenz hinsichtlich physikalisch-chemischer Merkmale, wie αβ-Turn- und Knäuelregionen, Hydrophilie, amphipathischer Regionen, flexibler Regionen, Antigenindex und Oberflächenwahrscheinlichkeitsplot, ist in 3 dargestellt.
  • Eine Suche in den Nukleotid- und Protein-Datenbanken zeigte, dass h15571, hauptsächlich im C-terminalen Abschnitt, Ähnlichkeit mit anderen Sequenzen hat. Die größte Ähnlichkeit besteht zu der menschlichen cDNA DKFZp434C211 (GenBank-Zugangsnr. AL110244). Die Nukleotide 2986–5685 von SEQ ID NR: 1 haben etwa 99,4% Sequenzidentität mit dieser cDNA, wie durch globales paarweises Alignment bestimmt wurde. Diese cDNA codiert ein hypothetisches uncharakterisiertes Protein (GenBank-Zugangsnr. CAB53694) mit 100% Identität zu den Aminosäureresten 999–1338 der SEQ ID NR: 2, des durch h15571 codierten Proteins, wie durch lokales paarweises Alignment (BESTFIT) bestimmt wurde. Lokales paarweises Alignment (unter Verwendung von BESTFIT) des h15571-Polypeptids deutet darauf hin, dass dieses Protein Sequenzähnlichkeit mit anderen GPCR-Proteinen besitzt. Genauer gesagt, haben die Aminosäurereste 695–944 der SEQ ID NR: 2 etwa 41,6% Ähnlichkeit und 30,5% Identität mit den Aminosäureresten 2411–2646 einer Vorstufe eines Rezeptors mit sieben Transmembransegmenten der Maus (GenBank-Zugangsnr. AAC68836); die Aminosäurereste 689–946 der SEQ ID NR: 2 haben etwa 37,7% Ähnlichkeit und 30,5% Identität mit menschlichem MEGF2, einen Protein mit sieben Transmembransegmenten (GenBank-Zugangsnr. BAA32464); und die Aminosäurereste 703–946 der SEQ ID NR: 2 haben etwa 37,8% Ähnlichkeit und 25,2% Identität mit den Aminosäureresten 703–946 von MEGF2 der Ratte, einem Protein mit sieben Transmembransegmenten (GenBank-Zugangsnr. ABB32459).
  • Beispiel 2: Analyse der h115571-Expression
  • Gesamt-RNA wurde aus verschiedenen menschlichen Geweben durch ein Ein-Schritt-Extraktionsverfahren hergestellt, wobei RNA STAT-60 nach den Anweisungen des Herstellers (TelTest, Inc) verwendet wurde. Jede RNA-Präparation wurde mit DNase I (Ambion) bei 37°C für 1 Stunde behandelt. Es wurde festgestellt, dass die DNAse-I-Behandlung beendet war, wenn die Probe mindestens 38 PCR-Amplifikationszyklen benötigte, um einen Schwellenwert der Fluoreszenz zu erreichen, wobei β-2-Mikroglobulin als interne Amplikonreferenz verwendet wurde. Die Unversehrtheit der RNA-Proben nach DNase-I-Behandlung wurde durch Agarosegelelektrophorese und Ethidiumbromidfärbung bestätigt.
  • Nach Phenolextraktion wurde cDNA aus der Probe unter Verwendung des SUPERSCRIPTTM Choice-Systems nach den Anweisungen des Herstellers (GibcoBRL) hergestellt. Eine negative Kontrolle von RNA ohne reverse Transkriptase wurde für jede RNA-Probe schein-revers transkribiert.
  • Die Expression der neuen GPCR-ähnlichen h15571-Gensequenz wurde mittels TaqMan® quantitativer PCR (Perkin Elmer Applied Biosystems) in cDNA gemessen, die aus den folgenden normalen menschlichen Geweben: Lymphknoten, Milz, Thymus, Gehirn, Lunge, Skelettmuskulator, fetaler Leber, Mandel, Colon, Herz und normaler und fibrotischer Leber; den folgenden Primärzellen: ruhenden und Phytohämaglutinin-(PHA-)aktivierten mononukleären Zellen aus peripherem Blut (PBMC); ruhenden und PHA-aktivierten CD3+-Zellen, CD4+- und CD8+-T-Zellen; Th1- und Th2-Zellen, die sechs oder 48 Stunden mit Anti-CD3-Antikörper stimuliert wurden; ruhenden und Lipopolysaccharid-(LPS-)aktivierten CD19+-B-Zellen; ruhenden und LPS-aktivierten CD19+-Zellen aus Mandel; CD34+-Zellen aus mobilisiertem peripherem Blut (mPB-CD34+), adultem ruhendem Knochenmark (ABM-CD34+), G-CSF-mobilisiertem Knochenmark (mBM-CD34+) und neonatalem Nabelschnurblut (CB-CD34+); G-CSF-mobilisierten peripheren Blutleukozyten (mPB-Leukozyten) und CD34–-Zellen, die aus mPB-Leukozyten gereinigt wurden (mPB-CD34–); CD14+-Zellen; Granulozyten; Lebersternzellen, die in serumfreiem oder fetales Rinderserum (FBS) enthaltendem Medium gehalten wurden; ruhende und aktivierte (Phorbol-12-myristat-13-acetat (TPA) und Ionomycin) normale menschliche Leberhepatozyten (NHLH); und Fibroblasten (NHDF, normale menschliche Hautfibroblasten; NHLF, normale menschlichge Lungenfibroblasten), die scheinstimuliert oder mit transformierendem Wachstumsfaktor β (TGF-β) stimuliert wurden, hergestellt wurde. Transformierte menschliche Zelllinien beinhalteten K526, eine Erythroleukämie; HL60, eine akute promyelozytäre Leukämie; Jurkat, eine T-Zellleukämie; HEK293, epitheliale Zellen aus embryonaler Niere, die mit Adenovirus-5-DNA transformiert sind; und hepatozelluläre Hep3B-Leberkarzinomzellen, die in normaler (HepB-Normoxie) oder verringerter Sauerstoffspannung (Hep3B-Hypoxie) kultiviert oder scheinstimuliert oder mit TGF-β stimuliert wurden.
  • Sonden wurden mithilfe der PrimerExpress-Software (PE Biosystems) auf Basis der h15571-Sequenz gestaltet. Die Primer und Sonden für die Expressionsanalyse von h15571 und β-2 Mikroglobulin waren wie folgt:
  • Figure 01120001
  • Die h15571-Sequenzsonde wurde unter Verwendung von FAM (6-Carboxyfluorescein) markiert, und die β2-Mikroglobulin-Referenzsonde wurde mit einem anderen Fluoreszenzfarbstoff, VIC, markiert. Die unterschiedliche Markierung der GPCR-ähnlichen Zielsequenz und des internen Referenzgens ermöglichte somit eine Messung in der gleichen Vertiefung. Vorwärts- und Rückwärtsprimer und die Sonden sowohl für β2-Mikroglobulin als auch die h15571-Zielsequenz wurden zu dem TaqMan®-Universal-PCR-Master-Mix (PE Applied Biosystems) hinzugegeben. Obwohl die endgültige Konzentration von Primer und Sonde variieren konnte, war jede innerhalb eines gegebenen Experiments konsistent. Ein übliches Experiment enthielt 200 nM Vorwärts- und Rückwärtsprimer plus 100 nM Sonde für β2-Mikroglobulin und 600 nM Vorwärts- und Rückwärtsprimer plus 200 nM Sonde für die h15571-Zielsequenz. TaqMan-Matrixexperimente erfolgten an einem ABI PRISM 7700-Sequenznachweissystem (PE Applied Biosystems). Die Thermocycler-Bedingungen waren wie folgt: Halten für 2 min bei 50°C und 10 min bei 95°C, gefolgt von Zweistufen-PCR für 40 Zyklen bei 95°C für 15 s, gefolgt von 60°C für 1 min.
  • Das folgende Verfahren wurde dazu verwendet, die h15571-Expression in den verschiedenen Geweben in Bezug auf die β2-Mikroglobulin-Expression im gleichen Gewebe zu berechnen. Der Schwellenzyklus-(Ct-)Wert ist als der Zyklus definiert, bei dem eine statistisch signifikante Zunahme der Fluoreszenz nachgewiesen wird. Ein niedrigerer Ct-Wert zeigt eine höhere mRNA-Konzentration an. Der Ct-Wert der h15571-Sequenz wird durch Subtrahieren des Ct-Werts des β2-Mikroglobulin-Gens, um einen ΔCt-Wert zu erhalten, unter Verwendung der folgenden Formel: ΔCt = Cth15571 – Ctβ2-Mikroglobulin normiert. Die Expression wird dann gegen eine cDNA-Probe kalibriert, die einen vergleichsweise niedrigen Spiegel der Expression der h15571-Sequenz zeigt. Der ΔCt-Wert für die Kalibratorprobe wird dann von ΔCt für jede Gewebeprobe gemäß der folgenden Formel: ΔΔCt = ΔCt-Probe – ΔCt-Kalibrator subtrahlert. Die relative Expression wird dann unter Verwendung der durch 2–ΔΔCt gegebenen arithmetischen Formel berechnet. Die Expression der h15571-Zielsequenz in jedem der getesteten Gewebe wurde dann graphisch dargestellt, wie nachstehend eingehender erläutert.
  • 4 zeigt die Expression von h15571, die in einem breiten Paneel von Geweben und Zelllinien, wie vorstehend beschrieben, bestimmt wurde, in Bezug auf die Expression in CD3+-T-Zellen. Die Ergebnisse zeigen eine signifikante Expression in Lunge, Skelettmuskulatur, Colon, fibrotischer Leber und in der K562-Zelllinie; eine mäßige Expression in Gehirn und in den HEK293- und Jurkat-Zelllinien; und eine niedrige Expression in Lymphknoten, Milz, Thymus, fetaler Leber, Mandel, Herz, normaler Leber und CB-CD34+-Zellen.
  • 5 zeigt die Expression von h15571 in verschiedenen Geweben und Zelllinien, wie vorstehend beschrieben, bezogen auf die Expression in ruhenden CD3+-Zellen. Die Ergebnisse zeigen eine signifikante Expression in normalen menschlichen Haut- und Lungenfibroblasten und in Lebersternzellen, die an Leberfibrose beteiligt sind.
  • Die hohe Expression, die in fibrotischen Leberproben beobachtet wurde, wurde in einem Vergleich der h15571-Expression in dreizehn fibrotischen Leberproben mit sechs normalen Leberproben erneut untersucht (siehe 6). Die sechs Proben, die von Patienten ohne histologischen oder klinischen Hinweis auf Lebererkrankung genommen wurden, zeigten minimale Expression von h15571. Die dreizehn Proben von Patienten mit histologisch definierter Leberfibrose gemischter Ätiologien, einschließlich chronischer alkoholinduzierter Fibrose, kryptogener Fibrose und primärer Gallenerkrankung, zeigen eine Nach-oben-Regulation von h15571 in unterschiedlichem Grad.
  • Isolierte Zellen aus dieser Studie wurden zur Lokalisierung der Expression von h15571 auf die Zellbestandteile der Leber oder infiltrierende Entzündungszellen verwendet. Es wurde beobachtet, dass die h15571-Expression auf Sternzellen und Fibroblasten (NHDF = normale menschliche Hautfibroblasten; NHLF = normale menschliche Lungenfibroblasten) beschränkt war. Es wurde beobachtet, dass eine Aktivierung mit entweder transformierendem Wachstumsfaktor β (TGF-β) oder fetalem Rinderserum (FBS) die Expression von h15571 in diesen Zellen weiter erhöhte (7).
  • Die Nach-oben-Regulation von h15571 in fibrotischen Leberproben und die scheinbare Lokalisierung der h15571-Expression auf aktivierte Sternzellen wurde unter Verwendung ähnlicher TaqMan®-PCR-Assays weiter untersucht. 8 zeigt die Expression von h15571, wie in mehreren Proben von Gewebe und Lebersternzellen bestimmt, bezogen auf die Expression in Hepatozyten 24 Stunden nach Behandlung mit TGF (Hep-3-Zellen). Die Expression ist in den menschlichen fibrotischen Leberproben klar erhöht, wobei eine niedrige Expression in menschlichem Herzgewebe und eine nicht-nachweisbare Expression in normalen menschlichen Leber-, Gehirn- und Nierengeweben beobachtet wird. Ferner wird h15571 in normalen Hepatozyten und in solchen, die mit PMA oder TGF-β behandelt wurden, nicht exprimiert. Die relative Expression in Lebersternzellen hängt von ihrem physiologischen Zustand ab. So zeigen quieszente Sternzellen Hintergrundexpressionsspiegel, während passagierte Sternzellen (vollständig aktivierte Sternzellen, die einer längeren Kultur unterworfen wurden), ruhende Sternzellen und Sternzellen, die aus ihrem Ruhezustand mit fetalem Rinderserum (FBS) reaktiviert wurden, hohe Expressionsspiegel besitzen.
  • Erhöhte Expressionsspiegel in menschlichen fibrotischen Leberproben und in aktivierten Sternzellen deuten auf eine potenzielle Rolle von h15571 bei Leberfibrose. Diese potenzielle Rolle wurde unter Verwendung von Ratten und drei Modellen der Leberfibrose weiter untersucht: Gallengangligation (siehe Kossakowska et al. (1998) Amer. J. Pathol. 153 (6): 1895), ein auf Chirurgie basierendes Modell; Schweineseruminjektion (Paronetto und Popper (1966) Amer. J. Pathol. 49: 1087, ein auf Immunologie basierendes Modell; und Tetrachlorkohlenstoff-(CCl4-)Behandlung, ein auf Toxizität basierendes Modell. 9 zeigt die Expression von Ratten-15571, die in mehreren Geweben bestimmt wurde. Eine signifikante Expression wird in Hirn- und Lungenproben und eine mäßige Expression in Rückenmarksproben beobachtet. Die Expression in normalen Leber-, Milz-, Nieren-, Dünndarm- und Muskelproben ist jedoch niedrig oder sogar nicht-nachweisbar. Bezogen auf normale Leber, ist die h15571-Expression bei Ratten erhöht, die einer Scheinoperation unterzogen wurden (d.h. Kontrollratten, die chirurgischen Verfahren, wie Anästhesie, aber ohne Gangligation, ausgesetzt wurden), und ist in Lebern von Ratten, deren Gallengang 14 Tage lang ligiert wurde, deutlich erhöht. Die Expression ist auch in fibrotischen Lebern von Ratten, die 7 Wochen lang mit Schweineserum behandelt wurden, 24 Stunden nach der letzten Seruminjektion erhöht, obwohl die Wirkung weniger drastisch ist, als bei einer Gallengangligation beobachtet.
  • 10 zeigt die Expression von Ratten-15571 in Rattenleberproben von mit CCl4 behandelten Ratten. Dieses toxizitätsbasierte Modell zeigt eine variable Expression, aber keine eindeutige Demonstration einer Nach-oben-Regulation des h15571-Gens.
  • Insgesamt zeigen diese TaqMan®-Assays eine signifikante Expression von h15571 in menschlicher Lunge, Gehirn, Skelettmuskulatur, Colon, Herz und insbesondere in Leberfibrosebiopsien. Die Expression ist hoch in aktivierten Lebersternzellen, TGF-beta-behandelten normalen menschlichen Lungenfibroblasten und TGF-beta-behandelten normalen menschlichen Hautfibroblasten. Von besonderer Bedeutung ist die niedrige Expression in normaler menschlicher Leber und die nicht-nachweisbare Expression in normalen menschlichen Hepatozyten. Zwei Rattenmodelle der Leberfibrose bestätigen, dass die Expression dieses Gens in fibrotischen Lebergeweben von behandelten Tieren, verglichen mit unbehandelten Kontrolltieren, erhöht ist.
  • Das h15571-Protein, ein Sekretin-ähnliches/GPCR-ähnliches Protein, besitzt eine beschränkte Expression, so dass hohe mRNA-Spiegel nur in aktivierten Lebersternzellen, aber nicht in quieszenten Zellen nachgewiesen werden. Die Expression in fibrotischen Lebern ist verglichen mit normalen Lebern erhöht und in normalen menschlichen Hepatozyten und aktivierten Hepatozyten nicht nachweisbar. Diese Daten deuten auf eine Rolle von h15571 beim Vorgang der Fibrose der Leber.
  • Beispiel 3: In situ-Expression von h15571
  • Die Expression von h15571 wurde auch durch In-situ-Hybridisierung von Ribosonden an zelluläre mRNAs in den folgenden menschlichen Geweben untersucht: normale Leber, fibrotische Leber, normale fetale Leber, Niere, Colon-Adenokarzinom, Lunge und Skelettmuskulatur. Sense- und Antisense-Ribosonden (RNA-Transkripte) von cDNA, die h15571 codierte, wurden unter Verwendung von 35S-dUTP, T3-Polymerase und T7-Polymerase sowie Standard-In-vitro-Transkritionsreaktionsreagenzien erzeugt.
  • Sechs-μm-Abschnitte von kryokonserviertem menschlichem Gewebe wurden unter Verwendung eines Cryostats hergestellt und an Glasobjektträger gebunden, vorhybridisiert und mit Sense- und Antisense-h15771-Ribosonden gemäß Standardprotokollen hybridisiert. Objektträger, die hybridisierte Gewebe und Ribosonden enthielten, wurden (gemäß Standardverfahren) ausgiebig gewaschen, in NTB-2-Photoemulsion getaucht und zwei Wochen lang exponiert. Die Objektträger wurden entwickelt und mit Hämatoxylin gegengefärbt, um zur Identifikation verschiedener Subtypen von Leukozyten beizutragen. Die Daten wurden als Bilder dieser Gewebeschnitte, wie unter einem Mikroskop unter Verwendung von Hell- und Dunkelfeld sichtbar gemacht, aufgezeichnet. Die Daten zweier getrennter Experimente sind in der nachstehenden Tabelle I zusammengefasst.
  • Hohe Spiegel der h15571-Expression wurden in einigen fibrotischen adulten Lebern und in Skelettmuskulatur bei zwei getrennten Experimenten nachgewiesen. In den fibrotischen Leberproben, die eine h15571-Expression zeigen, wurde die Aktivität stetig in mesenchymalen Zellen nachgewiesen, die die fibrotischen Septen begrenzten.
  • Genauer gesagt, scheint die Expression von h15571 innerhalb aktivierter Sternzellen lokalisiert zu sein.
  • Diese Sternzellen sind ein Typ der Myofibroblasten, von denen angenommen wird, dass sie die architektonischen Veränderungen vermitteln, die Leberfibrose verursachen. So verursachen aktivierte Sternzellen Leberfibrose, und es sind diese Zellen, die hohe Spiegel von h15571 in fibrotischen Leberproben exprimieren. Keine Expression von h15571 wurde in Gewebe von: normaler Leber, normaler fetaler Leber, Niere, Colon-Adenokarzinom und Lunge nachgewiesen.
  • Die signifikante und bemerkenswert konsistente Expression von h15571 in Skelettmuskulatur ist ein Hinweis auf die Verwandtschaft von Skelettmuskulatur und Sternzellen. Myofibroblasten sind ein Zelltyp, der mit glatter Muskulatur gemeinsame Eigenschaften hat, wie Kontraktionsfähigkeit. Beide Typen von Zellen/Geweben exprimieren das Protein alpha-Aktin, einen Vermittler der Kontraktionsfähigkeit. Veränderungen in dieser Eigenschaft können zur Leberfibrose beitragen.
  • Tabelle 1: Expressionsanalyse von menschlichem 15571 mittels In-situ-Hybridisierung
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  • Figure 01190001
  • Alle in dieser Beschreibung erwähnten Veröffentlichungen und Patentanmeldungen zeigen die Stufe des Fachmanns, den diese Erfindung betrifft.
  • Der Fachmann erkennt viele Äquivalente der hier beschriebenen spezifischen Ausführungsformen der Erfindung oder kann diese nur unter Verwendung von Routineexperimenten sicherstellen.
  • SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (27)

  1. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: a) einem Nukleinsäuremolekül, das die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1, das cDNA-Insert des Plasmids, das bei der ATCC unter der Patenthinterlegungsnummer PTA-1660 hinterlegt ist, oder ein Komplement davon umfasst, und b) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder eine Aminosäuresequenz umfasst, die von dem cDNA-Insert des Plasmids kodiert wird, das bei der ATCC under der Patenthinterlegungsnummer PTA-1660 hinterlegt ist.
  2. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, das ferner Vektor-Nukleinsäuresequenzen umfasst.
  3. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, das ferner Nukleinsäuresequenzen umfasst, die für ein heterologes Polypetid kodieren.
  4. Wirtszelle, die das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 enthält.
  5. Wirtszelle nach Anspruch 4, die eine Säuger-Wirtszelle ist.
  6. Nicht-menschliche Säuger-Wirtzelle, die das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 enthält.
  7. Isoliertes Polypeptid, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder eine Aminosäuresequenz umfasst, die von dem cDNA-Insert des Plasmids kodiert wird, das bei der ATCC unter der Patenthinterlegungsnummer PTA-1660 hinterlegt ist.
  8. Polypeptid nach Anspruch 7, das aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder einer Aminosäuresequenz besteht, die von dem cDNA-Insert des Plasmids kodiert wird, das bei der ATCC unter der Patenthinterlegungsnummer PTA-1660 hinterlegt ist.
  9. Polypeptid nach Anspruch 7, das ferner heterologe Aminosäuresequenzen umfasst.
  10. Antikörper, der selektiv an ein Polypeptid nach Anspruch 8 bindet.
  11. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder eine Aminosäuresequenz umfasst, die von dem cDNA-Insert des Plasmids kodiert wird, das bei der ATCC unter der Patenthinterlegungsnummer PTA-1660 hinterlegt ist, umfassend ein Kultivieren der Wirtszelle nach Anspruch 4 unter Bedingungen, bei denen das Nukleinsäuremolekül exprimiert wird.
  12. Verfahren zum Nachweis des Vorliegens eines Polypeptids nach Anspruch 8 in einer Probe, umfassend: a) In-Kontakt-Bringen der Probe mit einer Verbindung, die selektiv an ein Polypeptid nach Anspruch 8 bindet, und b) Bestimmen, ob die Verbindung an das Polypeptid in der Probe bindet, wobei die Verbindung, die an das Polypeptid bindet, ein Antikörper ist.
  13. Kit, der eine Verbindung, die selektiv an ein Polypeptid nach Anspruch 8 bindet, und Anweisungen für eine Verwendung umfasst, wobei die Verbindung, die an das Polypeptid bindet, ein Antikörper ist.
  14. Verfahren zum Nachweis des Vorliegens eines Nukleinsäuremoleküls nach Anspruch 1 in einer Probe, umfassen die Schritte: a) In-Kontakt-Bringen der Probe mit einer Nukleinsäuresonde oder einem Primer, die/der selektiv mit dem Nukleinsäuremolekül hybridisiert, und b) Bestimmen, ob die Nukleinsäuresonde oder der Primer an ein Nukleinsäuremolekül in der Probe bindet.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Probe mRNA-Moleküle umfasst und mit einer Nukleinsäuresonde in Kontakt gebracht wird.
  16. Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die an ein Polypeptid nach Anspruch 8 bindet, umfassend die Schritte: a) In-Kontakt-Bringen eines Polypeptids oder einer Zelle, die ein Polypeptid nach Anspruch 8 exprimiert, mit einer Testverbindung und b) Bestimmen, ob das Polypeptid an die Testverbindung bindet.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Bindung der Testverbindung an das Polypeptid durch ein Verfahren nachgewiesen wird, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: a) Nachweis einer Bindung durch direkten Nachweis einer Bindung von Testverbindung/Polypeptid, b) Nachweis einer Bindung unter Verwendung eines Kompetitionsbindungstest, c) Nachweis einer Bindung unter Verwendung eines Tests für eine GPCRartigvermittelte Signaltransduktion.
  18. Verfahren zum Modulieren der Aktivität eines Polypeptids nach Anspruch 8, umfassend ein In-Kontakt-Bringen eines Polypeptids oder einer Zelle, die ein Polypeptid nach Anspruch 8 exprimiert, mit einer Verbindung, die an das Polypeptid bindet, wobei die Verbindung, die an das Polypeptid bindet, ein Antikörper ist, in einer ausreichenden Konzentration, um die Aktivität des Polypeptid zu modulieren.
  19. Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die die Aktivität eines Polypeptids nach Anspruch 8 moduliert, umfassend: a) In-Kontakt-Bringen eines Polypeptids nach Anspruch 8 mit einer Testverbindung und b) Bestimmen der Wirkung der Testverbindung auf die Aktivität des Polypeptids, um dadurch eine Verbindung zu identifizieren, die die Aktivität des Polypeptids moduliert.
  20. Verfahren zur Identizierung eines Mittels, das das Expressionsniveau der Nukleinsäuremoleküle nach Anspruch 1 in einer Zelle moduliert, wobei das Verfahren ein In-Kontakt-Bringen des Mittels mit der Zelle, die in der Lage ist, das Nukleinsäuremolekül zu exprimieren, so dass die Menge oder Aktiviät des Nukleinsäuremoleküls in der Zelle durch das Mittel moduliert werden kann, und ein Messen der Menge oder Aktivität des Nukleinsäuremoleküls umfasst.
  21. Verfahren zum Modulieren des Expressionsniveaus der Nukleinsäuremoleküle nach Anspruch 1, wobei das Verfahren ein In-Kontakt-Bringen des Nukleinsäuremoleküls mit einem Antisense-Nukleinsäuremolekül unter Bedingungen umfasst, die dem Antisense-Nukleinsäuremolekül erlauben, die Menge oder Aktivität des Nukleinsäuremoleküls zu modulieren.
  22. Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein jegliches der Polypeptide nach Anspruch 7 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger enthält.
  23. Verwendung eines Antikörpers, der ein Protein bindet und die Aktivität des Proteins moduliert, in einer Menge, die wirksam ist, um die Aktivität des Proteins in einem Patienten zu modulieren, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung eines Patienten, der an einer Erkrankung erkrankt ist, die mit der aberranten Aktivität oder Expression des Proteins assoziiert ist, wobei mindestens ein Symptom der Erkrankung gelindert wird, und wobei das Protein die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder eine Aminosäuresequenz aufweist, die von dem cDNA-Insert des Plasmids kodiert wird, das bei der ATCC unter der Patenthinterlegungsnummer PTA-1660 hinterlegt ist.
  24. Verwendung nach Anspruch 23, wobei ein Erkrankung Leberfibrose ist.
  25. Verwendung einer Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Protein, einer für das Protein kodierenden Nukleinsäure und einer Antisense-Nukleinsäure, die in der Lage ist, mit entweder einer mRNA, die für das Protein kodiert, oder einem Teil einer genomischen DNA, die für das Protein kodiert, zu hybridisieren, in einer Menge, die wirksam ist, um die Aktivität des Proteins in einem Patienten zu modulieren, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für eine Behandlung eines Patienten, der an einer Erkrankung erkrankt ist, die mit einer aberranten Aktivität oder Expression des Proteins assoziiert ist, wobei mindestens ein Symptom der Erkrankung gelindert wird und wobei das Protein die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder eine Aminosäuresequenz aufweist, die von dem cDNA-Insert des Plasmids kodiert wird, das bei der ATCC unter der Patenthinterlegungsnummer PTA-1660 hinterlegt ist.
  26. Verfahren zur in vitro-Diagnose einer Erkrankung, die mit einer aberranten Aktivität oder Expression eines Proteins in einem Patienten assoziiert ist, wobei das Verfahren ein Bewerten des Expressionsniveaus eines Gens, das für das Protein in dem Patienten kodiert, und einen Vergleich des Expressionsniveaus des Gens mit dem normalen Expressionniveau des Gens in einem Menschen, der nicht an der Erkrankung erkrankt ist, umfasst, wobei ein Unterschied zwischen dem Expressionsniveau des Gens in dem Patienten und dem normalen Expressionsniveau ein Anzeichen dafür ist, dass der Patient an der Erkrankung erkrankt ist, wobei das Protein die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder eine Aminosäuresequenz aufweist, die von dem cDNA-Insert des Plasmids kodiert wird, das bei der ATCC unter der Patenthinterlegungsnummer PTA-1660 hinterlegt ist.
  27. Verfahren zur in vitro-Diagnose eine Erkrankung, die mit einem Protein in einem Patienten in Beziehung steht, wobei das Verfahren ein Bewerten des Expressionsniveaus eines Gens, das für das Protein in dem Patienten kodiert, und einen Vergleich des Expressionsniveaus des Gens mit dem normalen Expressionsniveau des Gens in einem Menschen umfasst, der nicht an der Erkrankung erkrankt ist, wobei ein Unterschied zwischen dem Expressionsniveau des Gens in dem Patienten und dem normalen Expressionsniveau ein Anzeichen dafür ist, dass der Patient an der Erkrankung erkrankt ist, wobei das Protein die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder eine Aminosäuresequenz aufweist, die von dem cDNA-Insert des Plasmids kodiert wird, das bei der ATCC unter der Patenthinterlegungsnummer PTA-1660 hinterlegt ist.
DE60031418T 1999-08-03 2000-08-03 15571, ein neues gpcr-ähnliches molekül der secretin-ähnlichen familie und dessen verwendungen Expired - Lifetime DE60031418T2 (de)

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ES (1) ES2272309T3 (de)
WO (1) WO2001009328A1 (de)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2367822A (en) * 2000-06-19 2002-04-17 Smithkline Beecham Corp CD97 polypeptides
WO2002016600A2 (en) * 2000-08-25 2002-02-28 Curagen Corporation Novel proteins and nucleic acids encoding same
FR2823762A1 (fr) * 2001-04-24 2002-10-25 Servier Lab Sequence d'acides nucleiques codant un nouveau recepteur couple aux porteines g et utilisations
JP2003047472A (ja) * 2001-08-01 2003-02-18 Takeda Chem Ind Ltd 新規ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質およびそのｄｎａ
WO2003096024A1 (en) * 2002-05-08 2003-11-20 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with vasoactive intestinal peptide receptor 2 (vpac2)
WO2004000883A1 (en) * 2002-06-24 2003-12-31 Bayer Healthcare Ag Regulation of human growth hormone-releasing hormone receptor
AU2003293959A1 (en) 2002-12-20 2004-07-14 Julius-Maximilians-Uni Versitat Wurzburg Millisecond activation switch for seven-transmembrane proteins
WO2004071393A2 (en) * 2003-02-13 2004-08-26 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with glucagon-like peptide 1 receptor (glp1r)
WO2004071396A2 (en) * 2003-02-17 2004-08-26 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with parathyroid hormone receptor 2 (pthr2)
WO2004073587A2 (en) * 2003-02-19 2004-09-02 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with parathyroid hormone receptor 1 (pthr1)
WO2008147528A1 (en) * 2007-05-24 2008-12-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods of modulating angiogenesis
WO2013126590A2 (en) * 2012-02-21 2013-08-29 Baxter International Inc. Pharmaceutical composition comprising cd34+ cells
CN107362365B (zh) * 2017-08-21 2020-01-07 武汉大风生物科技有限公司 Gpr31抑制剂在制药中的应用

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5155218A (en) 1990-05-08 1992-10-13 Neurogenetic Corporation Dna encoding human 5-ht1d receptors
US5756460A (en) 1991-03-06 1998-05-26 Garvan Institute Of Medical Research Human galanin, CDNA clones encoding human galanin and a method of producing human galanin
US5576296A (en) 1991-05-15 1996-11-19 Aktiebolaget Astra Galanin antagonist
GB9214857D0 (en) 1992-07-13 1992-08-26 Medical Res Council Human nucleic acid fragments and their use
JPH11506341A (ja) 1995-06-06 1999-06-08 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ，インコーポレイテッド Ｇタンパク質レセプターｈｔｎａｄ２９
GB9614823D0 (en) 1996-07-15 1996-09-04 Pharmacia Spa Recombinant kynurenine-3-hydroxylase enzyme and process for its preparation
CA2265915C (en) 1996-09-10 2012-11-20 Theodor-Kocher Institute Cxcr3 chemokine receptor, antibodies, nucleic acids, and methods of use
US6329197B2 (en) 1996-10-09 2001-12-11 Synaptic Pharmaceutical Corporation DNA encoding galanin GALR3 receptors and uses thereof
US6403305B1 (en) 1997-02-06 2002-06-11 Cornell Research Foundation, Inc. Methods of identifying peptide agonists or negative antagonists of a G protein coupled receptor
US5948639A (en) 1997-04-10 1999-09-07 Millennium Pharmaceuticals, Inc. TGF-β pathway genes
JP2001519667A (ja) 1997-04-10 2001-10-23 ジェネティックス・インスチチュート・インコーポレーテッド 分泌発現配列タグ（ｓＥＳＴｓ）
US5912144A (en) 1997-04-24 1999-06-15 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Edg-1-receptor homolog
US6060272A (en) 1997-05-07 2000-05-09 Human Genome Sciences, Inc. Human G-protein coupled receptors
US6020158A (en) 1997-05-22 2000-02-01 Allelix Biopharmaceuticals, Inc. Isolated polynucleotide for novel G-protein coupled receptor
US6063596A (en) 1997-12-11 2000-05-16 Incyte Pharmaceuticals, Inc. G-protein coupled receptors associated with immune response
WO1999038972A2 (en) 1998-01-28 1999-08-05 Chiron Corporation Human genes and gene expression products ii
WO1999033982A2 (en) 1997-12-23 1999-07-08 Chiron Corporation Human genes and gene expression products i
ATE273390T1 (de) 1997-12-30 2004-08-15 Nps Allelix Corp Säugertier edg-7 rezeptor homologen
AU2577799A (en) 1998-02-09 1999-08-23 Human Genome Sciences, Inc. 45 human secreted proteins
WO1999042582A1 (en) 1998-02-19 1999-08-26 Smithkline Beecham Corporation Ammaid, a g protein coupled receptor
AU3276699A (en) 1998-03-12 1999-09-27 Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. Novel g protein-coupled receptor proteins
DE19817948A1 (de) 1998-04-17 1999-10-21 Metagen Gesellschaft Fuer Genomforschung Mbh Menschliche Nukleinsäuresequenzen aus Endometrium-Tumor
EP1073681A4 (de) 1998-04-24 2005-01-12 Smithkline Beecham Corp Klonierung eines neuen 7-tm-rezeptors, axor-2
WO1999057270A2 (en) 1998-05-01 1999-11-11 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human receptor molecules

Also Published As

Publication number Publication date
JP2003506042A (ja) 2003-02-18
ATE342979T1 (de) 2006-11-15
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US6733990B1 (en) 2004-05-11

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