JP2002504805A - 基底細胞癌腫瘍抑制遺伝子 - Google Patents

基底細胞癌腫瘍抑制遺伝子

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Abstract

(57)【要約】 本発明はその不活性化が母斑様基底細胞癌腫症候群又は様々な散発性基底細胞癌腫の原因となる腫瘍抑制遺伝子を提供する。このNBCCS遺伝子はショウジョウバエパッチド(ptc)遺伝子の同族体である。

Description

【発明の詳細な説明】 基底細胞癌腫瘍抑制遺伝子 発明の背景 本発明は腫瘍学の分野に属する。詳しくは、本発明は母斑様基底細胞癌腫症候 群(NBCCS)及び様々な癌、例えば基底細胞癌腫の病因に関わる腫瘍抑制遺伝子の 発見に属する。 幾多の癌は正常な細胞増殖機構の進行的な障害を招く一連の遺伝子変化に由来 するものと信じられている(Nowell（1976）Science 194:23，Foulds(1958)，J.C hronic Dis．8:2)。詳しくは、完全染色体もしくは染色体セグメント、又は遺伝 子の特定の領域のコピーの欠失又は増幅が一般的である（例えば、Smithら（199 1）Breast Cancer Res.Treat．18:Suppl．1:5-14;van de Vijer & Nusse（1991 ）Biochim.Biophys.Acta．1072:33-50，Satoら（1990）Cancer，Res．50:7184-7 189）。特に、プロト癌遺伝子及び腫瘍抑制遺伝子を含むDNA配列の増幅及び欠失 のそれぞれが腫瘍原のよくある特徴である。Dutrillauxら（1990）Cancer Genet .Cytogenet．49:203-217。 強い遺伝的基礎をもつようである一の癌関連症候群は母斑様基底細胞癌腫症候 群(NBCCS)である。Gorlin症候群及び基底細胞母斑症候群としても知られるこの 母斑様基底細胞癌腫症候群は癌及び発育不全の双方にかかり易い常染色体優性障 害である（Gorlin（1995）Dermatologic Clinics 13:113-125）。その発症率は5 6,000分の１であり、そして髄芽腫の１〜２％及び基底細胞癌腫(BCC)の0.5％が この症候群の原因となっている(Springate（1986）J.Pediatr.Surg．21:908-910 ;Evansら（1991）British J.Cancer．64:959-96 1)。基底細胞癌腫(BCC)及び髄芽腫に加えて、NBCCSの患者は卵巣線維症、髄膜症 、線維肉腫、横紋筋肉腫、心性線維症及び卵巣類皮腫の危険性も高まっている(E vansら（1991）前掲、Evansら（1993）J.Med.Genet．30:460-464;Gorlin（1995 ）前掲)。 非腫瘍的な特徴、例えば歯牙形成角化嚢胞（これは20代、30代において最もア グレッシブである）、手足の特有症候異角化性くぼみ（pittina）、並びに進行 性頭蓋内カルシウム沈着（通常は20代から現れる）が非常に一般的である。広域 な骨格欠陥(Gorlin（1995）前掲；Shanleyら（1994）Am.J.Med.Genet．50:282-2 90)、例えば肋骨、椎骨及び肩の異常、漏斗胸、不動母指及び多指趾症がある。 脳顔面頭蓋及び脳異常には口蓋裂、特徴的なしわの消失（coarse fades）、斜視 、脳梁大頭蓋症及び前頭隆起が挙げられる（Gorlin（1995）前掲）。全身過剰成 長（Baleら（1991）Am.J.Med.Genet．40:206-210)及び末端肥大の外観が一般的 であるが、成長ホルモン及びIGF1のレベルは高まらない。 冒された個体にとっての紛糾は、生涯において500回以上にも数えられうる多 産な基底細胞癌腫に主に基づき、たいへんでありうる（Shanleyら（1994）前掲 ）。この症候群の幾多の特徴の発現は多彩であり、その症度は家系内で遺伝する 傾向がある（Andersonら（1967）Am.J.Hum.Genet.，19:12-22）。家系間でのこ の違いは様々な突然変異、改変遺伝子又は環境的要因（日光に対する曝露は基底 細胞癌腫の発生時期及び頻度において一役担っているようである）の特異的な表 現型作用に反映しうる。３分の１から半分の患者が冒された親戚をもたず、従っ て新たな生殖細胞突然変異の結果と推定される（Gorlin（1995）前掲）。側方性 及び分節性NBCCSは初期胚の１個の細胞における体性突然変異を原因とする(Guti errez and Mora（1986）J.Am.Acad.Dermatol．15:1023-1029)。 NBCCS症候群は染色体9q22-31にある１又は複数の遺伝子であるとマッピングさ れている(Gailaniら（1992）Cell 69:111-117;Reisら（1992）Lancet 339:617;F arndonら（1992）Lancet 339:581-2)。更に、その領域は高いパーセンテージの 基底細胞癌腫及びこの障害に関係するその他の腫瘍において欠失していることが 示され（Gailaniら（1992）前掲）、NBCCS遺伝子が腫瘍抑制因子として機能する ことが示唆されている。NBCCS遺伝子の不活性化は、基底細胞癌腫の発達のため に、十分ではないにしても必要な現象でありうる。(Shanleyら（1995）Hum.Mol. Genet．4:129-133;Gailaniら（1996）J.Natl.Canc.Inst．88:349-354)。 1992年でのこの遺伝子のオリジナルマッピング以来、連鎖研究はNBCCS領域をD 9S180とD9S196との間の４CMインターバルにまで狭めた(Goldsteinら（1994）Am. J.Hum．Genet．54:765-773;Wickingら（1994）Genomics 22:505-511)。冒されて いない個体が関与する報告された組換は仮説的にこの遺伝子がD9S287に近いもの とした(Farndonら（1994）Genomics 23:486-489)。しかしながら、9q22領域は非 常に遺伝子に富み、そして少なくとも２つの腫瘍抑制遺伝子を含むようである。 更に、Harshmanら（1995）Hum.Mol.Genet．4:1259-1266はゲノム領域からcDNAを 同定する様々な方法を示しており、候補遺伝子の驚くべきほどに異なるアレーを もたらした。かくして、本発明がなされる前は特異的なNBCCS遺伝子は未知であ った。 発明の概要 本発明は母斑様基底細胞癌腫症候群(NBCCS)及び様々な癌、例えば様々な散発 性基底細胞癌腫(BCC)に関わる核酸配列（例えばcDNA）を提供する。ここに開示 のNBCCS遺伝子は腫瘍抑制遺伝子のよう であり、そしてショウジョウバエ（Drosophila）パッチド(ptc)遺伝子の同族体 である。従って、ヒトNBCCS遺伝子は本明細書においてヒトPATCHED（PTC）遺伝 子と呼ぶ。 NBCCS（PTC）遺伝子の不存在、部分不活性化（例えば単相不全〔haploinsuffi ciency〕又は突然変異を介する）、完全不活性化、又はその他の改変された発現 はNBCCSへのかかり易さ及び／又は基底細胞癌腫の開始の原因となる又はそれら を引き起こす。 一の好適な態様において、本発明は母斑様基底細胞癌腫症候群(NBCCS)(PTC)タ ンパク質をコードする単離ヒト核酸を提供し、ここで当該核酸はストリンジェン シー条件下で、SEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成る群から選 ばれる核酸配列より成る第二核酸配列に、ストリンジェンシー条件下のヒトゲノ ムライブラリーの存在下で特異的にハイブリダイゼーションする。この単離核酸 は長さにおいて30以上、好ましくは50以上、より好ましくは100以上、そして最 も好ましくは200以上のヌクレオチドである。 別の態様において、この単離NBCCS核酸は、30ヌクレオチド以上のウィンドー にわたり、好ましくは50ヌクレオチド以上のウィンドーにわたって、より好まし くは80ヌクレオチド以上のウィンドーにわたって、そして最も好ましくは100ヌ クレオチド、200ヌクレオチド、500ヌクレオチド以上のウィンドーにわたって、 又は全長にも及んで、SEQ ID NO:１，58又は59の核酸と、75％以上の配列同一性 、好ましくは85％以上の配列同一性、より好ましくは90％以上の配列同一性、そ して最も好ましくは95％以上の配列同一性、又は更には98％以上の配列同一性を 有する。 一の態様において、この単離ヒトNBCCS核酸を表２に供する任意のプライマー ぺアーを利用してゲノムライブラリーから増幅させる。別の態様において、NBCC S核酸は表に供する任意のプライマーペ アーを利用してゲノムライブラリーから増幅させた任意の核酸との特異的ハイブ リダイゼーションにより同定する。特に好適な態様において、この核酸はSEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成る群から選ばれる核酸である。 別の態様において、本発明は単離ヒト母斑様基底細胞癌腫症候群(NBCCS)(PTC) 核酸配列を提供し、ここで当該核酸はSEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID N O:59より成る群から選ばれる核酸配列よりコードされるポリペプチドより成る群 から選ばれる核酸配列によりコードされるポリペプチドの少なくとも10個の連続 アミノ酸残基のポリペプチドサブ配列又は当該ポリペプチドのサブ配列の保存的 置換体をコードする。この単離ヒトNBCCS核酸は好ましくは長さにおいて50以上 、より好ましくは100以上、そして最も好ましくは200，400，500又は更に800以 上の残基（アミノ酸）である。特に好適な態様において、当該核酸はSEQ ID NO: １，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成る群から選ばれる核酸によりコードさ れるポリペプチド配列をコードする。更により好ましくは、NBCCS核酸はSEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成る群から選ばれる核酸である。 更なる別の態様において、本発明はSEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID N O:59より成る群から選ばれる核酸によりコードされるポリペプチド配列に由来す る少なくとも10個の連続アミノ酸を含んで成るヒト母斑様基底細胞癌腫(NBCCS)( PTC)ポリペプチドをコードする単離核酸を提供し、ここで当該ポリペプチドは、 抗原として存在しているとき、SEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59よ り成る群から選ばれる核酸によりコードされるポリペプチド配列に特異的に結合 する抗体の生産を誘導するものであり、そして当該ポリペプチドはSEQ ID NO:１ ，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より 成る群から選ばれる核酸によりコードされるポリペプチドが完全に免疫収着した SEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成る群から選ばれる核酸によ りコードされるポリペプチドに対し生起させた抗血清には結合しない。更により 好ましくは、このNBCCS核酸はストリンジェンシー条件下でヒトゲノムライブラ リーに存在するヒトPTC遺伝子のクローンにハイブリダイズし、そして更により 好ましくはSEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成る群から選ばれ る核酸にハイブリダイズする。 本発明は更に、SEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成る群から 選ばれる核酸と比較して、１又は複数の突然変異を含む単離核酸も提供する。こ の突然変異は、例えばミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、フレームシフ ト突然変異及びスプライシング突然変異でありうる。他方、この突然変異はNBCC S遺伝子の発現に影響を及ぼす調節領域の中にあってよい。 別の態様において、本発明は任意の上記の核酸の組込まれたベクターを提供す る。このベクターは好ましくはプロモーターに（コントロール下で）作動連結し た上記の核酸を構成的又は誘導可能式に含む。このベクターは開始及び終止コド ンも含んでよい。 本発明は更に単離ヒトNBCCS（PTC）ポリペプチドを提供し、ここで当該ポリペ プチドはSEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成る群から選ばれる 核酸によりコードされる少なくとも10個の連続アミノ酸のサブ配列を含んで成る 。このNBCCSポリペプチドは好ましくは長さにおいて50以上、より好ましくは100 以上、そして最も好ましくは200，400，500又は更に800以上の残基（アミノ酸） である。このポリペプチドは表２に供する任意のプライマーペアーを利用してゲ ノムDNA又はRNAから増幅させた核酸によりコードされるポリペプチドであってよ い。特に好適な態様おいて、この NBCCSポリペプチドはSEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成る群 から選ばれる核酸によりコードされるポリペプチドである。 本発明は更に、SEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成る群から 選ばれる核酸によりコードされるポリペプチド配列に由来する少なくとも10個の 連続アミノ酸を含んで成る単離NBCCS（PTC）ポリペプチドを含み、ここで当該ポ リペプチドは、抗原として存在しているとき、SEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及び SEQ ID NO:59より成る群から選ばれる核酸によりコードされるポリペプチドに特 異的に結合する抗体の生産を誘導し、そして当該ポリペプチドはSEQ ID NO:１， SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成る群から選ばれる核酸によりコードされる ポリペプチドが完全に免疫収着したSEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO: 59より成る群から選ばれる核酸によりコードされるポリペプチドに対して生起さ せた抗血清とは結合しない。このポリペプチドは長さにおいて好ましくは50以上 、より好ましくは100以上、そして最も好ましくは200，400，500又は更に800以 上のアミノ酸残基である。特に好適な態様において、このポリペプチドはSEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成る群から選ばれる核酸によりコー ドされる。 本発明のポリペプチドは任意の上記のポリペプチドの保存的置換体を含みうる 。特に好適な態様において、上記の核酸及び／もしくはタンパク質、又はそれら のサブ配列はショウジョウバエ、マウス又はＣ．エレガンス（C．elegans）に由 来するPTC核酸又はポリペプチドではない。 別の態様において、本発明は抗NBCCS抗体を提供する。特に好適な抗体はSEQ I D NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成る群から選ばれる核酸によりコ ードされるポリペプチドの10以上、より 好ましくは20，40，50以上、そして最も好ましくは100，200，400以上、更には8 00以上の連続アミノ酸、又はその全長を含んで成るポリペプチドに特異的に結合 し、ここで当該ポリペプチドは、抗原として存在しているとき、SEQ ID NO:１， SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成る群から選ばれる核酸によりコードされる ポリペプチドに特異的に結合する抗体の生産を誘導し、そして当該ポリペプチド はSEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成る群から選ばれる核酸に よりコードされるポリペプチドが完全に免疫収着したSEQ ID NO:１，SEQ ID NO: 58及びSEQ ID NO:59より成る群から選ばれる核酸によりコードされるポリペプチ ドに対して生起させた抗血清とは結合しないものである。この抗体はポリクロー ナルでもモノクローナルでもよい。この抗体はヒト化又はヒトのものであっても よい。 本発明は更に任意の上記の抗体を発現する細胞（例えば、ハイブリドーマ又は トオーマの如き組換細胞）も提供する。 本発明は更に母斑様基底細胞癌腫症候群(NBCCS)又は基底細胞癌腫へのかかり 易さの検査方法も提供する。この方法は、ｉ）生体の生物学的サンプルを用意す る；そしてii）サンプル中のヒトNBCCS（PTC）遺伝子又は遺伝子産物を検出する ；段階を含む。生物学的サンプル及び検出方法の条件は本明細書に記載されてい る。詳しくは、その検出はNBCCS遺伝子又は任意の上記の核酸を含むそのサブ配 列の有無の検出又は定量を含む。この検出はNBCCSポリペプチド又は任意の上記 のポリペプチドを含むそのサブ配列の有無の検出又はその定量を含む。検出は正 常又は異常なNBCCS核酸又はポリペプチドの有無の検出を含みうる。例えば、NBC CS核酸における突然変異の存在を検出することによりBCC又はNBCCSへのかかり易 さを検出することができる。特に好適なアッセイには核酸についてのハイブ リダイゼーションアッセイ及び／又は配列決定、並びにNBCCSポリペプチドにつ いてのイムノアッセイが挙げられる。 別の態様において、本発明は薬理学的に許容される担体と、本明細書に記載の NBCCSポリペプチド又はそのサブ配列をコードするベクター、NBCCSポリペプチド 又はそのサブ配列、及び核NBCCS抗体より成る群から選ばれる分子とを含んで成 る薬理組成物を提供する。 本発明は更にNBCCS（PTC）遺伝子の１又は複数のエキソンの増幅のためのプラ イマーも提供する。これらのプライマーには、限定することなく、表２に供する プライマーが挙げられる。 本発明は更にNBCCS遺伝子又は遺伝子産物の検出及び／又は定量のためのキッ トも提供する。これらのキットは１又は複数の任意の上記の核酸、増幅用プライ マー、及び抗体を、本明細書に記載の通りに、ラベルされて又はされないで、遊 離で、又は固相支持体に結合されて含む容器を含みうる。これらのキットは更に 本明細書記載の任意のアッセイにおいて１又は複数のこれらの試薬を使用するた めの仕様書を含んでよい。 最後に、本発明は治療方法も提供する。これらには、哺乳動物における基底細 胞癌腫及び／又は母斑様基底細胞癌腫症候群及び／又は日光性角化症の処置方法 が挙げられる。この方法は哺乳動物を母斑様基底細胞癌腫症候群(NBCCS)ポリペ プチドを発現するベクターにより、その細胞が本明細書に記載の如き機能性NBCC Sポリペプチドを発現するようにトランスフェクションすることを含みうる。こ のトランスフェクションはin vivoでもex vivoでもよい。ex vivoトランスフェ クションには好ましくは本明細書に記載の如き生体に細胞を再注入してもどすこ とが後続する。その他の方法は哺乳動物に本明細書に記載の如きNBCCS（PTC）ポ リペプチド及び薬理学的 に許容される賦形剤を含んで成る治療的に有効な用量の組成物を投与することを 含む。これらの方法は好ましくは哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、ヒ ツジ、ヤギ、ブタ、より好ましくはヒト患者を含む霊長類で実施する。 定義 「抗体」なる語は被検物（抗原）に対して特異的に結合して認識する１もしく は複数のイムノグロブリン遺伝子により実質的にコードされるポリペプチド又は そのフラグメントを言う。認定されているイムノグロブリン遺伝子にはカッパ、 ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、エプシロン及びミュー定常領域遺伝子、並 びに無数のイムノグロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖はカッパー又は ラムダに分類される。重鎖はガンマ、ミュー、アルファー、デルタ又はエプシロ ンに分類され、これらはイムノグロブリンクラスIgG，IgM，IgA，IgD及びIgEの それぞれと定義される。 典型的なイムノグロブリン（抗体）構造単位は四量体を含んで成る。各四量体 は２組の同一のポリペプチド鎖対より成り、各対は１本の「軽」鎖（約25kD）及 び１本の「重」鎖（約50〜70kD）を有する。各鎖のＮ末端は抗原認識を主に司る 約100〜110個又はそれより多くのアミノ酸の可変領域を規定する。可変軽鎖（ＶL ）及び可変重鎖（ＶH）なる語は軽鎖及び重鎖のそれぞれを意味する。 抗体は例えばインタクトイムノグロブリン又は様々なペプチダーゼによる消化 により作られた幾多のよく特性決定されたフラグメントとして存在する。従って 、例えばペプシンはヒンジ領域におけるジスルフィド結合の下で抗体を消化して F(ab)’2、即ち、ジスルフィド結合によりＶH−ＣHに連結された軽鎖であるFab の二量体を供する。F(ab)’2は温和な条件下で還元され、ヒンジ領域にお けるジスルフィド結合が破壊されることができ、これによりF(ab)’2二量体はFa b’単量体へと変換される。Fab’単量体は本質的にヒンジ領域の一部を有するFa bである（Fundamental Immunology、第３版、W.E.Paul編、Raven Press，N.Y．1 993参照）。様々な抗体フラグメントがインタクト抗体の消化の観点において定 義されているが、当業者はかかるフラグメントが化学的に、又は組換DNA方法論 を利用することによりde novo合成できうることを理解している。即ち、本明細 書で用いる語「抗体」は、完全抗体の修飾又は組換DNA方法論を利用してde novo 合成したもの（例えば一本鎖Fv）により製造されうる抗体も含む。 「抗NBCC」抗体はNBCCS遺伝子、cDNA又はそのサブ配列によりコードされるポ リペプチドに特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントをいう。 「キメラ抗体」とは抗体分子であって、（ａ）その定常領域又はその一部が改 変、置換又は交換されて抗原結合部位（可変領域）が別の又は改変されたクラス 、エフェクター機能及び／又は種の定常領域に連結された、又はこのキメラ抗体 に新しい特性を与える全体的に異なる分子、例えば酵素、毒素、ホルモン、成長 因子、薬剤等に連結されているようになったもの、又は（ｂ）その可変領域又は その一部が改変、置換又は交換され、可変領域が異なる又は改変された抗原特異 性をもつようになったものをいう。 「イムノアッセイ」なる語は被検物に特異的に結合する抗体を利用するアッセ イを意味する。このイムノアッセイは被検物を単離する、標的とする及び／又は 定量する特定の抗体の特異的結合特性の利用を特徴とする。 「単離」、「精製」又は「生物学的に純粋」とは、ある材料が天然状態で見い 出される通常一体化した成分を実質的に又は本質的に 含まないときに使う。 「核酸」なる語は一本鎖又は二本鎖のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌク レオチドポリマーを意味し、そして何らかのことわりのない限り、天然のヌクレ オチドと同じように機能しうる天然ヌクレオチドの既知の類似体を包括する。 「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」なる語はアミノ酸残基の ポリマーを意味するよう本明細書では同義語として使用する。これらの語は１又 は複数のアミノ酸残基が対応の天然アミノ酸の人工的化学類似体であるアミノ酸 ポリマー及び天然のアミノ酸ポリマーに適用される。 「ラベル」とは、光度計、光化学、生物化学、免疫化学又は化学的手段により 検出可能な組成物である。例えば、有用なラベルには32Ｐ、蛍光色素、電子重密 （electron-dense）試薬、酵素（例えばELISAに一般に利用されるもの）、ビオ チン、ジオキシゲニン又はハプテン、及びそれに対する抗血清又はモノクローナ ル抗体が入手できるタンパク質が含まれる（例えば、SEQ ID NO:１のペプチドは 、このペプチドの中に放射線ラベルを組込むことにより検出可能にでき、そして ペプチドに特異的に反応する抗体を検出するのに利用できる）。 本明細書で利用する「核酸プローブ」とは、１又は複数のタイプの化学結合、 通常は相補性塩基対合、通常は水素結合形成を介して相補性配列の標的核酸に結 合できる核酸と定義される。本明細書で用いるプローブは天然（即ち、Ａ，Ｇ， Ｃ又はＴ）又は改変塩基（７−デアザグアノシン、イノシン等）を含みうる。更 に、プローブ中の塩基は、それがハイブリダイゼーションを妨げない限り、ホス ホジエステル結合以外の連結により結合しうる。即ち、例えばプローブはペプチ ド核酸であってその構成塩基がホスホジエステル結合 ではなくペプチド結合により連結されたものであってよい。当業者により、プロ ーブがハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存してプローブ配 列との完全相補性を欠く標的配列に結合しうることが理解されているであろう。 これらのプローブは好ましくはアイソトープ、発色団、化学発光団、色原体で直 接ラベルされているか、又はストレプトアビジン複合体が後に結合しうるビオチ ン等により間接的にラベルされていてよい。プローブの有無をアッセイすること により、選定の配列又はサブ配列の有無を検出することができうる。 「ラベル化核酸プローブ」はラベルにリンカーを介して共有結合した、又はイ オン、ファン・デル・ワールスもしくは水素結合を介して結合した核酸プローブ であり、これによりプローブの存在はプローブに結合したラベルの存在を検出す ることにより検出し得る。 「標的核酸」なる語は、それに対して核酸プローブが特異的にハイブリダイゼ ーションするようにデザインされた核酸（往々にして生物学的サンプルに由来す る）を意味する。検出すべきなのは標的核酸の有無、又は定量すべき標的核酸の 量である。標的核酸は標的に特異的な対応のプローブの核酸配列に相補性である 配列を有する。標的核酸なる語は、このプローブが特異的である大きめの核酸の 特定のサブ配列、又は発現レベルを検出するのが所望される配列全体（例えば遺 伝子又はmRNA）を意味しうる。 「サブ配列」とは核酸又はアミノ酸（例えばポリペプチド）の長めの配列の一 部を含んで成る核酸又はアミノ酸の配列のそれぞれを意味する。 細胞、核酸又はベクターに関して用いる場合の「組換」なる語は、細胞、又は 核酸又はベクターが異種核酸の導入により、又は天然核酸の改変により改質され たことを意味するか、又は細胞がそのよ うに改質された細胞に由来することを意味する。即ち、例えば、組換細胞は天然 型（非組換）の細胞内では見い出されない遺伝子を発現するか、又は天然遺伝子 を何らかの異常な状態で発現する、少なく発現する、又は全く発現しない。 ２本の核酸又はポリペプチド配列との関連での語「同一性」とは、最大の対応 性で整列させたときに同一であるその２本の配列における残基を意味する。比較 のための配列の最適な整列は例えばSmith and Waterman（1981）Adv.Appl.Math ．2:482の局所相同性アルゴリズムにより、Needleman and Wunsch（1970）J.Mol .Biol．48:443の相同性整列アルゴリズムにより、Pearson and Lipman（1988）P roc.Natl.Acad.Sci．USA 85:2444の類似の方法についての研究により、これらの アルゴリズムのコンピューター処理により（Wisconsin Genetics Software Pack age，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WIのGAP，BESTFIT ，FASTA及びTFASTA）又は目視により実施できうる。 配列類似性を決定するのに適当な更なるアルゴリズムはBLASTアルゴリズムで あり、それはAltschulら（1990）J.Mol.Biol．215:403-410に記載されている。B LAST分析を実行するためのソフトウェアはNational Center for Biotechnology Informationを介して公共的に入手できる（http://www,ncbi.nlm.nih.gov/）。 このアルゴリズムはまずデーターベース配列における長さＷのワードで整列させ たときに一定のポジティブバリュー域値スコア−Ｔに適合する又はそれを満足せ しめる問題の配列における同一の長さのショートワードを同定することにより高 スコア配列ぺアー(HSP)を同定することを包括する。Ｔは近隣のワードスコア域 値を意味する（Altschulら前掲）。このようなイニシャル近隣ワードヒットはそ れらを含む長めのHSPを探し出すイニシエイシングサーチのためのシーズとし て働く。このワードヒットは加算配列スコアが大きくなる限り各配列に沿って両 方向において広がる。各方向におけるワードヒットの延長は：加算整列スコアが 達成される最大値からＸ値降下したとき；加算スコアが、１又は複数のネガティ ブスコア残留整列の加算により０以下となったとき；又はいづれかの配列の終端 に達したとき、終了する。BLASTアルゴリズムパラメーターＷ，Ｔ及びＸは整列 の感度及びスピードを決定する。。BLASTプログラムはデフォルトとしてワード 長（Ｗ）11，50のBLOSUM62スコアマトリックス（Henikoff and Henikoff（1992 ）Proc.Natl.Acad.Sci．USA 89:10915-10919を参照）整列(alignment)(Ｂ)、10 の期待値(expectaion)(Ｅ)、Ｍ＝５，Ｎ＝４、及び両鎖の比較を利用する。 BLASTアルゴリズムは２本の配列間の類似性の統計学的分析を実行する。例え ば、Karlin and Altschul（1993）Proc.Nat'l.Acad.Sci．USA 90:5873-5787。BL ASTアルゴリズムにより供される類似性の一の尺度は最小合計確率(Ｐ(Ｎ))であ り、それは２本のヌクレオチド又はアミノ酸配列間での対合が起こりうる確率の 表示を担う。例えば、核酸は、NBCCS核酸（例えばSEQ ID NO:１，58又は59）に 対する試験核酸の比較におけるこの最小合計比率が約１未満、好ましくは約0.1 未満、より好ましくは約0.01未満、そして最も好ましくは約0.001未満であると きにNBCCS又はcDNAに類似であると考える。 ポリペプチドとの関係における「実質的同一性」又は「実質的類似性」なる語 は、ポリペプチドが約10〜20個のアミノ酸残基の比較ウィンドーにおいて対照配 列に対して70％以上、もしくは好ましくは80％以上、又は対照配列に対してより 好ましくは85％、又は最も好ましくは90％以上の配列同一性を有する配列を含ん で成ることを意味する。２本のポリペプチド配列が実質的に同一であるという表 示は、第一のペプチドが第二のペプチドに対して生起させた抗体と免疫学的に反 応性であることをいう。即ち、２本のポリペプチドが保存的置換によってのみ相 違する場合、ポリペプチドは第二のポリペプチドと実質的に同一である。 ２本の核酸配列が実質的に同一であるという表示は、第一核酸がコードするポ リペプチドが、第二核酸によりコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応 性であることをいう。 ２本の核酸配列が実質的に同一であるという別の表示は、２本の分子がストリ ンジェンシー条件下で互いにハイブリダイズし合うことを意味する。 「実質的に結合する」とは、プローブ核酸と標的核酸との相補的ハイブリダイ ゼーションを意味し、そして標的ポリヌクレオチド配列の所望の検出を達成する ためにハイブリダイゼーション媒体のストリンジェンシーを下げることにより合 わせることのできるささいなミスマッチを包含する。 「特異的にハイブリダイズする」なる表現は、配列が複雑な混合(例えば全細 胞)DNA又はRNAの中に存在している場合にストリンジェンシー条件下で特定のヌ クレオチド配列に対してのみ分子が結合、二本鎖形成又はハイブリダイズするこ とを意味する。「ストリンジェンシー条件」なる語はプローブがその標的サブ配 列に対してはハイブリダイズするが、その他の配列にはハイブリダイズしない条 件をいう。ストリンジェンシー条件は配列依存性であり、そして様々な環境にお いて相違するであろう。長めの配列は高めの温度で特異的にハイブリダイズする 。一般に、ストリンジェンシー条件は一定のイオン強度及びpHにおいて特定の配 列にとっての熱融点（Tm）より約５℃低い温度となるように選定する。Tmは標的 配列に相補性であるプローブの50％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする 温度である（一定のイオン強度、pH及び核酸濃度で）。（標的配列が概して過剰 で存在しているとき、Tmにおいて、プローブの50％が平衡において占拠されてい る）。典型的には、ストリンジェンシー条件は、pH7.0〜8.3において塩濃度が約 1.0Ｍ未満のNaイオン、典型的には約0.01〜1.0ＭのNaイオン濃度（又はその他の 塩）であり、そして温度は短いプローブ（例えば10〜50ヌクレオチド）について は約30℃以上であり、長いプローブ（例えば50ヌクレオチド以上）については約 60℃以上である。ストリンジェンシー条件はホルムアミドの如き不安定化剤の添 加によっても達成されうる。 抗体について言及する「タンパク質に対して特異的に結合する」又は「特異的 に免疫反応性である」なる表現は、タンパク質及びその他の生体物質の不均質集 団の存在下でのタンパク質の存在の決定因子である結合反応を意味する。即ち、 表示のイムノアッセイ条件下で、特定の抗体は特定のタンパク質に優先的に結合 し、そしてサンプル中に存在するその他のタンパク質に対しては有意な量では結 合しない。かかる条件下でのタンパク質に対する特異的な結合は特定のタンパク 質に対するその特異性について選定された抗体を必要とする。特定のタンパク質 に特異的に免疫反応性である抗体を選定するのに様々なイムノアッセイ方式が利 用されうる。例えば、固相ELISAイムノアッセイがタンパク質に特異的に免疫反 応性であるモノクローナル抗体を選定するのに日常的に利用されている。イムノ アッセイの方式及び特異的な免疫反応性を決定するために利用されうる条件の説 明についてはHarlow and Lane（1988）Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Publications，New Yorkを参照のこと。 タンパク質を説明しているときの「保存的置換」とは、タンパク質の活性を実 質的に改変しないタンパク質のアミノ酸組成における 変更を意味する。即ち、特定のアミノ酸配列の「保存的に改変された変異」とは タンパク質活性にとって重要でないアミノ酸のアミノ酸置換、又はアミノ酸を類 似の特性を有する別のアミノ酸で置換し（例えば、酸性、塩基性、正又は負に帯 電、極性又は非極性等）、重要なアミノ酸の置換でさえも活性を実質的に改変し ないような置換を意味する。機能的に類似のアミノ酸を供する保存的置換は当業 界において公知である。以下の６つの群はそれぞれ互いと保存的置換性であるア ミノ酸を含む。 １）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）； ２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）； ３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）； ４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）； ５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ） ；及び ６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。 Creighton（1984）Proteins，W.H.Freeman and Companyも参照のこと。更に、 コード配列において１個のアミノ酸又はごくわずかなアミノ酸を改変、追加又は 欠失させる個々の置換、欠失又は付加も「保存的に改変された変異」と呼ぶ。 ヒト「PTC」又はヒト「NBCCS遺伝子又はcDNA」は本明細書において開示するシ ョウジョウバエパッチド(ptc)遺伝子のヒト同族体を同義語で意味する。以下に 説明する通り、ヒトPTC遺伝子は母斑様癌腫細胞症候の病因に関わる腫瘍抑制遺 伝子である。 本明細書において利用する「遺伝子産物」とは、その存在、非存在、量又は核 酸配列がこの遺伝子の存在、非存在、量又は核酸組成の表示となる核酸を意味す る。かくして遺伝子産物には、限定する ことなく、mRNA転写物、mRNAを逆転写させたcDNA、このcDNAから転写させたRNA 、このcDNAから増幅させたDNA、この増幅DNAから転写させたRNA、又は任意のこ れらの核酸のサブ配列が含まれる。この遺伝子又はそのサブ配列により発現され るポリペプチドも遺伝子産物である。特定のタイプの遺伝子産物は本明細書から 明らかであろう。 「異常PTC(又はNBCCS)遺伝子又はcDNA」は非機能的なNBCCSポリペプチド又は 実質的に機能の低下したNBCCSポリペプチドをコードするNBCCS遺伝子又はcDNAを 意味する。非機能的、又は機能の低下したNBCCSポリペプチドは母斑様基底細胞 癌腫症候群へのかかり易さ（即ち、「正常」集団と比べての高まった傾向）又は その発症を特徴とする。同様に、「異常PTC(又はNBCCS)遺伝子産物」とは非機能 的もしくは機能の低下したNBCCSポリペプチドをコードする核酸又は機能の低下 したNBCCSポリペプチド自体を意味する。異常NBCCS（PTC）遺伝子又は遺伝子産 物には例えば突然変異（例えば挿入、欠失、点突然変異等）、スプライシングエ ラー、早期終止コドン、誤ったイニシエーター等により改変されたNBCCS遺伝子 又はサブ配列が含まれる。NBCCS遺伝子の異常発現には、例えば部分又は完全不 活性化、単相不全等を介するNBCCSの発現低下（「正常」健康集団と比べ）が含 まれる。 図面の簡単な説明 図１はNBCCS領域の総合フレームワークマップを示す。連鎖及び腫瘍欠失研究 はD9S196とD9S180との間にNBCCSを位置決めするが、この遺伝子がD9S287の近く 又は遠くにあるかどうかとの点で矛盾する。６つの多形態マーカーD9S197，D9S1 96-D9S280-FACC-D9S287-D9S180は遺伝子連鎖データーに由来する（Fardonら、19 94;Pericak -Vanceら、1995）。D9S196及びD9S197は有意な組換を示さない。パルスフィール ドゲル電気泳動（PFGE）及びFISHはD9S196とD9S180との間での２Mbの最小距離を 示した。YAC，BAC及びNBCCS領域におけるコスミド隣接についての重要な情報を 示す。全部で22の重複YAC及び800より多くのコスミドがこの領域から単離された 。1.2Mbより長くに及ぶBAC及びコスミド隣接をゲノムデーターベースに提示した 。 図２はPTC座のマップを示す。この遺伝子は226G7，42H11，55A16及び96F9を含 む４つの重複コスミドにある（LL09NCO1、96ウェル座標）。この遺伝子のエキソ ンコードをべた塗枠で示し、非コード（非翻訳）エキソンは白枠で示す。この遺 伝子の５’非コード領域のスプライス変異体は少なくとも２つの別々の第一エキ ソン及び可能として第三の別のエキソンを示す（実施例２参照）。 図３はNBCCS（PTC）遺伝子のプロモーター領域のマップを供する。 図４はNBCCS家系におけるPTCの早期終止突然変異の分離を示す。この一族にお いて分離したC1081T(Q21OX)突然変異はBfaＩ部位を構築している。隣接プライマ ーによるPCRは260bpの産物を供し、それは冒された家族構成員において171bp及 び90bpフラグメントへと消化された。PCR産物は冒されていない家族構成員では 未消化のままであった。 図５は散発性NBCCS患者におけるPTCのフレームシフト突然変異を示す。（図５ Ａ）冒された個体（３）の両親（１及び２）はNBCCSの表現特徴をもたなかった 。（図５Ｂ）患者はその親には存在しないエキソン12における一本鎖コンホネー ション多形態（SSCP）変異体に対してヘテロ接合であり、そしてゲノムDNAから のPCR産物の配列決定は2000個の塩基が追随するフレームの外の２本の配列を 示した。異常な型を配列決定し、そして１bpの挿入を含み、それは９個のアミノ 酸下流での早期停止をもたらした。両親からのPCR産物の配列は正常であった。 図６は散発性基底細胞癌腫におけるPTCの紫外線Ｂ誘導突然変異を示す。(図６ Ａ)NBCCS領域のアレル消失を伴う残留アレルにおけるCCからTTに至る突然変異。 このDNA改変（これは早期停止を供する）は典型的な紫外線Ｂ突然変異誘発であ る。（図６Ｂ）患者由来の構成DNAは正常な配列を有していた。 図７は散発性DCCにおけるPTC欠失を示す。(図７Ａ)NBCCS領域のアレル消失を 伴う腫瘍の残留アレルにおける14bpの欠失。この腫瘍が著しく日光にさらされる 領域である鼻から除去されたにもかかわらず、突然変異は紫外線に特異的に関連 しなかった。（図７Ｂ）構成DNAは正常な配列を有していた。 図８はヒトPTC cDNAのヌクレオチド配列（SEQ ID NO:１）を示す（Genbank Ac cession No．U43148）。PTCの配列を示し、それはオープンリーディングフレー ム並びに隣接５’及び３’配列を含む。対応のアミノ酸配列をSEQ ID NO:60に示 す。 図９は癒着性髄芽腫D322，D292及びD86から獲得したDNAにおけるヒトPTC遺伝 子における突然変異を示す。図９Ａ：ミクロサテライトD9S302は腫瘍D322におけ るヘテロ接合性の消失を示す。この腫瘍において、エキソン６の残留アレルは改 変した移動度を示した。DNA配列決定はこの腫瘍DNAにおける一塩基対欠失を示し 、それはフレームシフトをもたらし、且つPTCタンパク質のトランゲーションを もたらす。図９Ｂは染色体９ｑのアレル消失のない腫瘍D292におけるエキソン10 におけるSSCP変異を示す。改変アレルの配列決定は1393位において４つの塩基対 挿入を示した。図９Ｃは腫瘍Ｄ86におけるエキソン10の配列決定を示す。LOHを 有するこの腫瘍は1444 においても６塩基対インフレーム欠失を有する（CTGGGC）。これはトランメンブ ラン領域３における２個のアミノ酸（グリシン及びロイシンの欠失を招く。 図10は実施例５に記載の半定量RT-PCRアプローチを利用して決定するPTC mRNA ラベルを示す。10μｌにおけるRNA 250ngを40pgづつの標準RNAの存在下でPTC、 β2−ミクログロブリン及びGAPDHを内部欠失させて逆転写させた。次にcDNAをPT C及びハウスキーピング遺伝子についてのプライマーで増幅させた。この産物を 分離し、そしてABI373Aシーケンサーで定量した。３種の遺伝子の発現レベルを サンプル（右ピーク）、対、特定の標準品（左ピーク）の比として決定した。図 10Ａ：MBの古典的な変異体の２つの代表的な腫瘍におけるPTC mRNA発現；図10Ｂ ：癒着性MBsにおける発現，図10C：成人小脳における発現。 図11はPTCタンパク質の模式図であり、生殖系突然変異の位置を示している。 推定トランスメンブランドメインは「TM1」〜「TM12」で表示する。影付き枠は ２つの推定細胞外ループを示す。星印（*）はミスセンスを示す。三角形（▼） はナンセンス又はフレームシフトを示す。ダイヤ（◆）は推定スプライシング変 異体を示す。上方の白枠は対応のドメインをコードするエキソンに対応する。 詳細な説明 本発明は母斑様基底細胞癌腫症候群の病因に関わる腫瘍抑制遺伝子の発見に属 する。更に、本発明は散発性基底細胞癌腫(BCC)を含む様々な癌が同一遺伝子の 双方のコピーの体性消失により生じうるという発見に関する。 Gorlin症候群及び基底細胞神経症候群としても知られる母斑様基底細胞癌腫症 候群は癌及び発育不全の双方にかかり易い常染色体優 性障害である(Gorlin（1995）Dermatologic Clinics，13:113-125)。その発症率 は56,000分の１であり、そして髄芽腫の１〜２％及び基底細胞癌腫(BCC)の0.5％ がこの症候群の原因となっている(Springate（1986）J.Pediatr.Surg．21:908-9 10;Evansら（1991）British J.Cancer．64:959-961)。基底細胞癌腫(BCC)及び髄 芽腫に加えて、NBCCSの患者は卵巣線維症、髄膜症、線維肉腫、横紋筋肉腫、心 性線維症及び卵巣類皮腫の危険性も高まっている(Evansら（1991）前掲、Evans ら（1993）J.Med.Genet．30:460-464;Gorlin（1995）前掲）。 冒された個体にとっての紛糾は、生涯において500回以上にも数えられうる多 産な基底細胞癌腫に主に基づき、たいへんでありうる（Shanleyら（1994）前掲 ）。この症候群の幾多の特徴の発現は多彩であり、その症度は家系内で遺伝する 傾向がある（Andersonら（1967）Am.J.Hum.Genet.，19:12-22）。家系間でのこ の違いは様々な突然変異、改変遺伝子又は環境的要因（日光に対する曝露は基底 細胞癌腫の発生時期及び頻度において一役担っているようである）の特異的な表 現型作用に反映しうる。３分の１から半分の患者が冒された親戚をもたず、従っ て新たな生殖細胞突然変異の結果と推定される（Gorlin（1995）前掲）。側方性 及び分節性NBCCSは初期胚の１個の細胞における体性突然変異に寄与する(Gutier rez and Mora（1986）J.Am.Acad.Dermatol．15:1023-1029)。Ｉ．NBCCS（PTC）cDNAの利用 上述の通り、本発明のNBCCS遺伝子は腫瘍抑制遺伝子である。この遺伝子の発 現における欠陥は様々な癌、特に体細胞における散発性基底細胞癌腫の発症に関 係する。NBCCS遺伝子の発現における遺伝的欠陥はNBCCS及びそれに付随する発育 異常の原因となる重要な要因である（下記実施例２参照）。 基底細胞癌腫及びNBCCSの幾多の特徴はPTCのホモ接合不活性化に基づくものと 信じられているが、全身的な特徴、例えば過剰成長、大頭蓋症及び顔面異常形態 は単相不全又はその他の部分遺伝子不活性化のメカニズムに基づくものと信じら れている。 明らかに、欠陥NBCCS（PTC）遺伝子発現の検出は臨床的価値を有する。生物学 的サンプル中のNBCCS（PTC）遺伝子、cDNA，mRNA、タンパク質又はこの遺伝子、 cDNAもしくはタンパク質のサブ配列は例えば癌の診断（基底細胞癌腫の検査又は 確認において）、NBCCSもしくはBCCについての遺伝的なかかり易さの指標として のNBCCSもしくはBCCの予防、又はDNAフィンガープリントの如きDNA法医学分析に おいて、in vivo及び／又はin situ RNA転写及び／又は翻訳を評価するためのマ ーカーとして有用である。全長NBCCS cDNA、個々のエキソン又はそれらのサブ配 列は、生物学的サンプル中の正常又は異常(例えばトランケーション又は突然変 異した)NBCCS（PTC）DNA又はRNAの有無の検査及び／又は定量のためのプローブ （特にラベルされたとき）としても有用である。このラベル化プローブはNBCCS 遺伝子のマーカーとして蛍光カリオタイピング分析においても有用でありうる。 NBCCS cDNA又はそれらのサブ配列はヒト染色体9q22.3をマッピングするために本 明細書において示しているため、当業者は染色体９のこの領域において任意の大 きな染色体異常があるかどうかを調べるためのプローブとしてこの遺伝子、cDNA 又はサブ配列を利用できうる。これは例えば染色体異常の存在、特にNBCCS又は 基底細胞癌腫のかかり易さをモニターするよう胎児を子宮内スクリーニングする うえで有用である。 同様に、NBCCS cDNAによりコードされるタンパク質はNBCCS及び／又は基底細 胞癌腫の診断マーカーとして利用できうる。これらのタンパク質又はそのサブ配 列は抗NBCCSタンパク質抗体を生起させ るための抗原としても利用できうる。これらの抗体はNBCCSタンパク質の正常又 は異常発現の検査のためのイムノアッセイ、及びNBCCSポリペプチドの単離（ア フィニティークロマトグラフィーによる）のために有用である。 NBCCSタンパク質をコードするベクターは抗体生産のための免疫原を担うタン パク質を発現するために有用である。NBCCSタンパク質をコードするベクターはN BCCSタンパク質を発現させるようにin vitro又はin vivoで細胞を形質転換する のに有用である。異種NBCCS遺伝子を発現するよう細胞のin vivo形質転換はNBCC Sタンパク質のオフセット欠陥発現に利用できうる。 NBCCS（PTC）遺伝子を発現する細胞及び／又は組織は多種多様な観点でNBCCS ポリペプチドの発現レベルをモニターするために利用できうる。例えば、NBCCS 発現に対する薬剤の作用を決定するとき、薬剤を(NBCCSを発現するように)形質 転換された生体、組織又は細胞に投与する。発現レベル又は発現産物は下記の通 りにアッセイし、そしてその結果を、同様に処置したが、試験すべき薬剤抜きの 生体、組織又は細胞に由来する結果と比較する。II ．NBCCS（PTC）遺伝子 Ａ）ヒトPTC遺伝子 配列表ID NO:１は本発明のヒトPTC cDNAの核酸及びポリペプチド配列表の双方 を示す。示している通り、ヒトPTCの配列は3888ヌクレオチドのオープンリーデ ィングフレーム、その５’及び３’末端のそれぞれに隣接する441及び2240ヌク レオチドより成る（SEQ ID NO:１、図８）。ヒトPTC cDNAのオープンリーディン グフレームは推定1296アミノ酸のタンパク質をコードする。オープンリーディン グフレームは脊椎動物における翻訳開始共通配列に対して中程度に対合するATG コドンで始まる(PTCにおけるGAGGCTATGT（SEQ ID NO: ６）、対、GCCGCCATGG(SEQ ID NO:７)(Kozak（1991）J.Biol.Chem．266:19867-1 9870))。このコドンは、1296個のアミノ酸より成り、131×103の相対分子量（Mr ）を有するPTCタンパク質の一のヒト形態の第一アミノ酸をコードする。それは そのショウジョウバエ対応物と61％の配列同一性を示す。そのオープンリーディ ングフレームはATGコドンの更に354ヌクレオチド上流に及ぶ（図８に示す配列の 塩基対88から開始）。３’非翻訳領域は標準的なポリアデニル化シグナル(AATAA A(SEQ ID NO:８))及びmRNA不安定化モチーフ(ATTTA(SEQ ID NO:９))を含む。こ れらは終止コドンの後方1401ヌクレオチド、並びに547，743及び1515ヌクレオチ ドのそれぞれにある。第二ヒトPTCタンパク質は右方向で５’末端に至るまで連 なるオープンリーディングフレームを含み、そして上流配列により開始しうる。 Ｂ）cDNA及び／又はプローブの単離 本発明の核酸(例えばNBCCS cDNA又はサブ配列（プローブ))をin vitro法、例 えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応（LCR）、転写ベース増幅シ ステム(TAS)、自立式配列複製システム（SSR）によりクローニング又は増幅させ る。様々なクローニング及びin vitro増幅方法論が当業者に公知である。幾多の クローニング練習を介して当業者を誘導するに足りるこのような技術及び仕様の 例は、Berger and Kimmel，Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology 152 Academic Press，Inc.，San Diego，CA(Berger);Sambrookら （1989）Molecular Cloning-A Laboratory Manual(第２版)Vol．1-3，Cold Spri ng Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Press，NY，(Sambrookら);Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubelら編、Current Protocols，a j oint venture between Greene Publishing Associates，Inc． and John Wiley & Sons，Inc.，(1994 Supplement)(Ausubel);Cashionら、米国 特許5,017,478；及びCarr、ヨーロッパ特許0,246,864において見い出させる。in vitro増幅法を介して当業者を誘導するに足りる技術の例はBerger，Sambrook及 びAusubel並びにMullisら（1987）米国特許4,683,202；PCR Protocols A Guide to Methods and Applications（Innis et al．eds）Academic Press Inc．San D iego，CA(1990)(Innis)；Arnheim & Levinson（October 1，1990）C & EN36-47; The Journal Of NIH Research（1991）3:81-94;(Kwohら（1989）Proc.Natl.Acad .Sci．USA 86:1173;Guatelliら（1990）Proc.Natl.Acad.Sci．USA 87，1874;Lom ellら（1989）J.Clin.Chem.，35:1826;Landegrenら（1988）Science，241:1077- 1080;Van Brunt（1990）Biotechnology，8:291-294;Wu and Wallace，(1989)Gen e，4:560;及びBarringerら(1990)Gene,89:117において見い出せる。 一の好適な態様において、ヒトNBCCS（PTC）cDNAは日常のクローニング法によ り単離できうる。SEQ ID NO:１において示すcDNA配列はゲノムDNAサンプル中でN BCCS遺伝子に、又は全RNAサンプル中でNBCCS mRNA（例えばサザンブロット）に 特異的にハイブリダイズするプローブを供するために利用できうる。標的NBCCS 核酸が同定できたら（例えばサザンブロットで）、それは当業者周知の標準的な 方法に従って単離できうる（例えば、Sambrookら（1989）Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第２版Vols．1-3，Cold Spring Harbor Laboratory;Berger and Kimmel（1987）Methods in Enzymology，Vol．152:Guide to Molecular Cl oning Techniques，San Diego:Academic Press，Inc.;又はAusubelら（1987）Cu rrent Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley-Inters cience，New Yorkを参照のこと）。NBCCS遺伝子について のヒトcDNAライブラリーをスクリーニングする方法は実施例１に示す。 別の好適な態様において、ヒトPTC cDNAはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の如 き増幅法により単離できる。表２はcDNAの21のエキソン全ての増幅に適当なプラ イマーを供する。更に、適当なPCRプロトコールを実施例２に示す。 Ｃ）核酸プローブのラベリング NBCCS cDNA又はそのサブ配列を核酸プローブとして使用するとき、往々にして 配列を検出可能なラベルでラベリングするのが所望される。これらのラベルは当 業者に周知の数多くの手段により組込むことができうる。しかしながら、好適な 態様において、このラベルはサンプル核酸の調製における増幅工程の際に同時に 組込んでよい。即ち、例えばラベル化プライマー又はラベル化ヌクレオチドによ るポリメラーゼ連鎖反応はラベルされた増幅産物を供するであろう。別の好適な 態様において、ラベル化ヌクレオチド(例えばフルオレセインラベル化UTP及び／ 又はCTP)を利用する転写増幅はラベルを転写された核酸の中に組込む。 他方、ラベルはオリジナルの核酸サンプル（例えばmRNA、ポリAmRNA、cDNA等 ）に直接付加するか、又は増幅が完了した後に増幅産物に付加してよい。ラベル を核酸に付加する手段は当業者に周知であり、そして例えばニックトランスレー ション、又は核酸のキナーゼ処理及びサンプル核酸をラベル（例えば蛍光団）に 連結する核酸リンカーのその後の付加（ライゲーション）による末端ラベリング （例えばラベル化RNAによる）が含まれる。 本発明において利用するのに適当な検出可能なラベルには光度計、光化学的、 生化学的、免疫化学的、電子的、光学的又は化学的手段により検出可能な任意の 組成物が挙げられる。本発明において有 用なラベルには、ラベル化されたストレプトアビジンコンジュゲートで染色する ためのビオチン、磁性ビーズ(例えばDynabeads(商標))、蛍光色素（例えばフル オレセイン、テキサスレッド、ローダミン、グリーンフルオレセントタンパク質 、等）、放射性ラベル（例えば3Ｈ，125Ｉ，35Ｓ，14Ｃ又は32Ｐ）、酵素（例え ば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ及びELISAに一般的 に利用されているその他）、並びに比色ラベル、例えばコロイド金もしくは有色 ガラス又はプラスチック（例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等 ）ビーズが挙げられる。かかるラベルの利用を教示する特許には、米国特許第3, 817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；及び4,36 6,241号が含まれる。 かかるラベルを検出する手段は当業者に周知である。即ち、例えば放射性ラベ ルは写真フィルム又はシンチレーションカウンターを利用して検出し得、蛍光マ ーカーは発光を検出するホトディテクターを利用して検出し得る。酵素ラベルは 典型的には酵素に基質を供与し、そしてその基質に対する酵素の作用により生成 する反応生成物を検出することにより検出され、そして比色ラベルは有色ラベル を単に識別化することにより検出される。 III．NBCCSポリペプチドに対する抗体 抗体は、天然（全長）形態又は組換形態における個体、アレル、株又は種変異 体及びそのフラグメントを含む本発明のNBCCSポリペプチドに対して生起させる 。更に、天然形態又は非天然形態におけるこのようなポリペプチドに対して生起 させる。抗イディオタイプ抗体も構築できうる。抗体を作る数多くの方法が当業 者に周知である。以下の説明は有用な技術の一般的な概要として提供する。しか しながら、当業者は下記の方法に基づく幾多の変異法がわかること ができることを認識するであろう。 Ａ）抗体の製造 NBCCSポリペプチドに特異的に反応性である抗体を作るためにいくつかの免疫 原を使用する。SEQ ID NO:１のアミノ酸サブ配列から選定した長さにおいて10以 上のアミノ酸の組換又は合成ポリペプチドがモノクローナル又はポリクローナル 抗体の製造のための好適な免疫原（抗原）である。一のクラスの好適な態様にお いて、免疫原ペプチドコンジュゲートも免疫原に含まれる。天然のポリペプチド も純粋又は不純な状態で使用できうる。 組換ポリペプチドを真核又は原核細胞において（下記の通りに）発現させ、そ して標準の技術を利用して精製する。ポリペプチド又はその合成バージョンを抗 体を産生できる動物に注射する。モノクローナル又はポリクローナル抗体はポリ ペプチドの存在又は量を測定するためのイムノアッセイにおけるその後の利用の ために作製できうる。 ポリクローナル抗体を製造する方法は当業者に周知である。簡単には、免疫原 （抗原）、好ましくは精製ポリペプチド、適当な担体（例えばGST、キーホール −リンペット・ヘマノシアニン等）に複合させたポリペプチド、又は免疫用ベク ター、例えば組換ワクシニアウィルスの中に組込んだポリペプチド（米国特許第 4,722,848号参照）をアジュバントと混合し、そして動物をその混合物で免疫す る。この動物のこの免疫調製品に対する免疫反応を試験血液を採取し、そして注 目のポリペプチドに対するその反応性の力価を決定することによりモニターする 。免疫原に対する抗体の適度に高い力価が得られたら、血液を動物から採取し、 そして抗血清を調製する。ポリペプチドに反応性な抗体を濃厚にするための抗血 清の更なる分画を所望するなら実施する（例えば、Coligan（1991）Current Pr otocols in Immunology Wiley/Greene，NY;及びHarlow and Lane（1989）Antibo dies:A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press，NY参照）。 NBCCSポリペプチドの所定のフラグメントに対するその結合フラグメント及び 一本鎖組換バージョンを含む抗体は動物を例えば上記の担体タンパク質との当該 フラグメントのコンジュゲートにより免疫することにより生起させる。典型的に は、注目の免疫原は長さにおいて約５個以上、より典型的には10個のアミノ酸で あり、好ましくはこのフラグメントは長さにおいて15個のアミノ酸、そしてより 好ましくは長さにおいて20個以上のアミノ酸である。このペプチドは典型的には 担体タンパク質（例えば融合タンパク質）に複合させるか、又は免疫用ベクター において組換発現させる。抗体が結合するペプチド上の抗原決定基は典型的には 長さ３〜10個のアミノ酸である。 モノクローナル抗体は所望の抗体を分泌する細胞から調製する。これらの抗体 を正常もしくは改質ポリペプチドへの結合についてスクリーニングするか、又は 作動もしくは拮抗活性、例えばNBCCSタンパク質を介して媒介される活性をスク リーニングする。特異的なモノクローナル及びポリクローナル抗体は通常約0.1m M以上、より通常には約50μＭ以上、そして最も好ましくは約１μＭ以上のKpで 結合するであろう。 ある状況において、様々な哺乳動物宿主、例えばマウス、げッ歯類、霊長類、 ヒト等からモノクローナル抗体を調製するのが所望される。かかるモノクローナ ル抗体を、調製するための技術の詳細は、例えばStitesら（編）Basic and Clin ical Immunology(第４版)Lange Medical Publications，Los Altos，CA及びその 引用文献；Harlow and Lane、前掲、Goding（1986）Monoclonal Antibodies: Principlea and Practice(第２版)Academic Press，New York，NY;及びKohler a nd Milstein（1975）Nature 256:495-497において見い出せる。簡単にまとめる と、この方法は動物に免疫原を注射することにより進める。次に動物を殺し、そ して細胞を脾臓から取り出し、そしてミエローマ細胞と融合させる。その結果物 はin vitroで再生できるハイブリド細胞又は「ハイブリドーマ」である。次にハ イブリドーマの集団をスクリーニングして個々のクローンを単離し、それぞれは 免疫原に対する単一抗体種を分泌する。このようにして、得られる個々の抗体種 は免疫原物質に基づき認識される特異的な部位に応答して構築された免疫動物由 来の不死化且つクローニングされた単独Ｂ細胞の産物である。 別の不死化の方法にはアプステイン・バー・ウィルス、癌遺伝子もしくはレト ロウィルスによる形質転換、又は当業界公知のその他の方法が含まれる。単独不 死化細胞より生じたコロニーを抗原に対する所望の特異性及びアフィニティーの 抗体の生産についてスクリーニングし、そしてかかる細胞により生産されるモノ クローナル抗体の収量を脊椎動物（好ましくは哺乳動物）宿主の腹腔への注射を 含む様々な技術により高める。本発明のポリペプチド及び抗体は改質を伴って又 は伴わないで使用し、そしてヒト化マウス抗体の如きキメラ抗体が含まれる。 その他の適当な技術はファージ又は類似のベクターにおける組換抗体のライブ ラリーの選択を包括する（例えば、Huseら（1989）Science 246:1275-1281;及び Wardら（1989）Nature 341:544-546;及びVaughanら（1996）Nature Biotechnolo gy，14:309-314参照）。 しばしば、ポリペプチド及び抗体は検出シグナルを司る物質と共有又は非共有 式に連結することによりラベル化してよい。多種多様 なラベル及びコンジュゲーション技術が公知であり、そして科学及び特許文献の 双方にかなり報告されている。適当なラベルには放射性核種、酵素、基質、補酵 素、阻害剤、蛍光成分、化学発光成分、磁性粒子等が挙げられる。かかるラベル の利用の教示は米国特許3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277, 437；4,275,149；及び4,366,241に含まれている。また、組換イムノグロブリン も生産し得る。Cabilly、米国特許4,816,567；及びQueenら（1989）Proc.Nat'l Acad.Sci．USA 86:10029-10033参照。 本発明の抗体はNBCCSポリペプチドを単離するうえでのアフィニティークロマ トグラフィーのためにも利用される。カラムは例えば固相支持体、例えば粒子、 例えばアガロース、Sephadex等に連結された抗体により調製し、ここで細胞リゼ ートをこのカラムに通し、洗浄し、そして濃度を上昇させながら温和な変性剤で 処理し、これにより精製NBCCSポリペプチドを遊離させる。 これらの抗体は正常又は異常ヒトNBCCSタンパク質の如き特定の発現産物につ いて発現ライブラリーをスクリーニングするためにも利用できる。通常、かかる 手順における抗体は抗体結合による抗原の存在を検出し易くするような成分でラ ベルする。 NBCCSポリペプチドに対して生起させた抗体は抗イディオタイプ抗体を生起さ せるためにも利用できうる。これらは対応の抗原の存在に関係する様々な病理症 状を検査又は診断するために有用である。 Ｂ）ヒト又はヒト化（キメラ）抗体の製造 本発明の抗NBCCS抗体は治療目的のため（例えば、NBCCSポリペプチドの作用を ブロッキングする、又はエフェクター分子、例えばラベル、サイトトキシン、酵 素、成長因子、薬剤等に接合又は融合されているときは分子を標的分子として） 、生体（例えばヒト患者 ）に投与してもよい。生起を行った種以外の生体に投与した抗体は往々にして免 疫原となる。即ち、例えばヒトに投与したマウス抗体は往々にして複数回の投与 によりこの抗体に対する免疫学的反応を誘導する（例えば、ヒト抗マウス抗体（ HAMA）反応）。この抗体の免疫原的特性は抗体の一部又は全体を特徴的なヒト配 列へと変え、キメラ又はヒト抗体のそれぞれを作り上げることにより低下する。 ｉ）ヒト化（キメラ）抗体 ヒト化（キメラ）抗体はヒト及び非ヒト部分を含んで成るイムノグロブリン分 子である。より詳しくは、ヒト化キメラ抗体の抗原組合せ領域（又は可変領域） は非ヒト起源に由来し（例えばマウス）、そしてキメラ抗体の定常領域（これは イムノグロブリンに生物学的エフェクター機能を授ける）はヒト起源に由来する 。ヒト化キメラ抗体は非ヒト抗体分子の抗原結合（例えば抗NBCCSポリペプチド ）特異性及びヒト抗体分子により供されるエフェクター機能を有するであろう。 キメラ抗体を作製する幾多の方法が当業者に周知である（例えば米国特許5,502, 167、5,500,362、5,491,088、5,482,856、5,472,693、5,354,847、5,292,867、5 ,231,026、5,204,244、5,202,238、5,169,939、5,081,235、5,075,431、及び4,9 75,369参照）。 一般に、このようなキメラ抗体を作るのに利用される手順は下記の工程より成 る（いくつかの工程の順序は変えてよい）；（ａ）抗体分子の抗原結合領域をコ ードする正しい遺伝子セグメントを同定及びクローニングする；この遺伝子セグ メント(VDJとして知られる重鎖の可変、多彩及び連結領域、又はVJとして知られ る軽鎖の可変、連結領域(又は単にＶもしくは可変領域))はcDNA又はゲノム形態 のいづれでもよい；（ｂ）定常領域又はその所望の部分をコードする遺伝子セグ メントをクローニングする；（ｃ）この可変領域を定 常領域につなぎ、完全キメラ抗体が転写可能且つ翻訳可能な形態でコードされる ようにする；（ｄ）この構築体を選択マーカー及び遺伝子コントロール領域、例 えばプロモーター、エンハンサー及びポリ（Ａ）付加シグナルを含むベクターの 中につなぐ；（ｅ）この構築体を宿主細胞（例えば細菌）の中で増幅させる；（ ｆ）このDNAを真核細胞、往々にして哺乳動物のリンパ球の中に導入し（トラン スフェクション）；そしてこの宿主をキメラ抗体の発現に適切な条件下で培養す る。 いくつかの異なる抗原結合特異性の抗体がこれらのプロトコールによりキメラ タンパク質を作るために操作されている(例えば抗TNP;Boulianneら、（1984）Na ture 312:643;及び抗腫瘍抗原：Sahaganら（1986）J.Immunol.，137:1066)。同 様にいくつかの異なるエフェクター機能が新しい配列を抗原結合領域をコードす るものにつなげることにより達成されている。これらのいくつかには酵素(Neube rgerら（1984）Nature 312:604);他の種由来のイムノグロブリン定常領域及び他 のイムノグロブリン鎖の定常領域(Sharonら（1984）Nature 309:364;Tanら（198 5）J．Immunol．135:3565-3567)。 一の好適な態様において、組換DNAベクターを抗NBCCS抗体を産生する細胞系を トランスフェクションするのに利用する。この新規の組換DNAベクターはこの細 胞系におけるイムノグロブリン定常領域をコードする遺伝子生体又は一部を代替 する「代替遺伝子」（例えば、代替遺伝子はヒトイムノグロブリンの定常領域、 特異的なイムノグロブリンクラス、酵素、毒素、生物活性ペプチド、成長因子、 阻害剤、又は薬剤、毒素もしくはその他の分子への接合を助長するリンカーペプ チド等の全体又は一部をコードしうる）及び抗体生産細胞内でのイムノグロブリ ン配列との標的とする相同組換を可能 にする「標的配列」を含む。 別の態様において、組換DNAベクターを所望のエフェクター機能を有する抗体 を生産する細胞系をトランスフェクションするのに用い（例えばヒトイムノグロ ブリンの定常領域）、この場合、この組換ベクターの中に含まれている代替遺伝 子は抗NBCCS抗体領域全体又は一部をコードし得、そして組換ベクターの中に含 まれる標的配列は抗体生産細胞内での相同組換及び標的とする遺伝子改質を可能 にする。いづれの態様でも、可変又は定常領域の一部しか交換しないとき、得ら れるキメラ抗体は同一の抗原及び／又は未だ改変もしくは改善すべき同一のエフ ェクター機能を規定することができ、従ってキメラ抗体はより強い抗原特異性、 より強い親和結合定数、強まったエフェクター機能、又はトランスフェクション 抗体生産細胞系による高まった分泌及び生産性等を示しえる。 実施態様に関係なく、組込みDNAについての選択過程（選択マーカーを介する ）、キメラ抗体生産についてのスクリーニング及び細胞クローニングがキメラ抗 体を生産する細胞クローンを獲得するために利用できうる。 即ち、モノクローナル抗体についての改質体をコードするDNA断片はＢ細胞又 はハイブリドーマ細胞系内での発現イムノグロブリン遺伝子の部位を直接標的と することができうる。任意の特定の改質体についてのDNA構築体を任意のモノク ローナル細胞系又はハイブリドーマのタンパク質生産を改変するために利用して よい。かかる手段は有用な抗原特異性を発現する各Ｂ細胞クローン由来の重鎖及 び軽鎖可変領域遺伝子の双方をクローニングする費用及び労力を解消する。可変 領域遺伝子をクローニングする工程を解消する他に、キメラ抗体の発現レベルは この遺伝子がランダム位置ではなくその天然の染色体位置にあるとき、高まるで あろう。キメラ（ヒト化） 抗体の調製のための詳細な方法は米国特許第5,482,856号に見い出せうる。 ii ）ヒト抗体 別の態様において、本発明は完全ヒト抗NBCCS抗体を提供する。ヒト抗体は全 体的に特徴的なヒトポリペプチド配列より成る。本発明のヒト抗NBCCS抗体は様 々な方法を利用して作られうる（例えば、Larrickら、米国特許第5,001,065号参 照）。 一の好適な態様において、本発明のヒト抗NBCCS抗体は通常トリオーマ細胞に おいてまず生産される。抗体をコードする遺伝子を次にクローニングし、そして その他の細胞、特に非ヒト哺乳動物細胞において発現する。 トリオーマ技術によるヒト抗体を生産するための一般的なアプローチはOstber gら（1983）Hybridoma 2:361-367，Ostberg米国特許4,634,664及びEngelmanら米 国特許4,634,666に記載されている。この方法により得られる抗体生産細胞系は トリオーマと呼ばれ、なぜならそれらは３種の細胞、即ち、２種類のヒト及び１ 種類のマウス細胞に由来するからである。トリオーマはヒト細胞から作られた通 常のハイブリドーマよりも安定に抗体を生産することがわかっている。 トリオーマ細胞の調製はまずマウスミエローマ細胞系を非免疫化ヒト末梢Ｂリ ンパ球と融合させることを要する。この融合はヒト及びマウス染色体の双方を含 む外因性ハイブリド細胞を作り上げる（Engelman、前掲参照）。抗体を分泌能力 を失った外因性細胞を選択する。好ましくは、８−アザグアニジンに対して耐性 である外因性細胞を選別する。８−アザグアニジンに対する耐性をもつ細胞はヒ ポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（HAT）又はアザセリン−ヒポキサン チン（AH）培地上で繁殖できない。 抗体を分泌する能力は外因性細胞と、NBCCSポリペプチド又はそのエピトープ に対して免疫したＢ−リンパ球との更なる融合により供される。Ｂ−リンパ球は ヒトドナーの脾臓、血液又はリンパ節から得られる。特異的な抗原又はエピトー プに対する抗体が所望されるなら、NBCCSポリペプチドよりも抗原又はそのエピ トープを免疫原として利用する方が好ましい。他方、Ｂ−リンパ球は非免疫個体 及びNBCCSポリペプチド又はそのエピトープでin vitroで刺激した個体から入手 する。更なる変異法において、Ｂ−リンパ球を感染又は何らかの免疫した個体か ら獲得し、次いでNBCCSポリペプチドに対して約７〜14日間in vitroで曝露する ことにより過剰免疫する。 上記の手順のいづれかにより調製した免疫化Ｂ−リンパ球を周知の方法により 外因性ハイブリド細胞に融合させる。例えば、細胞をMW1000〜4000の40〜50％の ポリエチレングリコールに約37℃で約５〜10分処理する。細胞をこの融合混合物 から分離し、そして所望のハイブリドについて選択性である培地の中で繁殖させ る。外因性ハイブリド細胞が８−アザグアニジンに対して耐性であるとき、不死 化トリオーマ細胞はHAT又はAH培地で細胞の連続継代により簡単に選別できる。 むろんその他の選択手順も融合に利用する細胞の性質に依存して可能である。必 要な結合特異性を有する抗体を分泌するクローンをNBCCSポリペプチド又はその エピトープに結合する能力についてトリオーマ培養培地をアッセイすることによ り同定する。所望の特異性をもつヒト抗体を生産するトリオーマを限外希釈技術 によりサブクローニングし、そして培養培地の中でin vitro増殖させるか、又は 選定の宿主動物に注射し、そしてin vivoで増殖させる。 得られるトリオーマをNBCCSポリペプチド又はそのエピトープに結合する能力 について試験する。抗体は慣用の抗体分画手順、例え ば硫酸アンモニウム沈殿、DEAEセルロースクロマトグラフィー及びアフィニティ ークロマトグラフィーにより得られる培養培地又は体液から分離させる。 トリオーマは遺伝子的に安定ではあるが、それらは抗体を非常に高いレベルで は生産しない。発現レベルはトリオーマ由来の抗体遺伝子を１又は複数の発現ベ クターの中にクローニングし、そしてこのベクターを組換又はヒト化イムノグロ ブリンの発現のために典型的に利用する細胞系の如き細胞系の中に形質転換させ ることにより高まりうる。抗体の収量が高まるのと同様に、この戦略はイムノグ ロブリンがヒト成分を有さず、それ故ヒト細胞系に必要とされる特にめんどうな ウィルススクリーニングにかける必要のない細胞系から得られるという追加の利 点を供する。 トリオーマ細胞系により分泌されるイムノグロブリンの重鎖及び軽鎖をコード する遺伝子は当業界公知のポリメラーゼ連鎖反応等の方法に従ってクローニング される（例えばSambrookらMolecular Cloning:A Laboratory Manual，2nd ed.， Cold Spring Harbor，N.Y.，1989;Berger & Kimmel，Methods in Enzymology，V ol．152:Guide to Molecular Cloning Techniques，Academic Press，Inc.,San Diego，Calif.，1987;Coら（1992）J.Immunol.，148:1149参照）。例えば、重鎖 及び軽鎖をコードする遺伝子をトリオーマのゲノムDNA又はトリーマのRNAの逆転 写により生成したcDNAよりクローニングする。クローニングはクローニングすべ き遺伝子又は遺伝子セグメントに隣接する又はそれらと重複する配列にハイブリ ダイズするPCRプライマーの利用等の慣用の技術により達成される。 典型的には、組換構築体はトリオーマ細胞系により発現されるイムノグロブリ ンの完全ヒトイムノグロブリン重鎖及び／又は完全ヒトイムノグロブリン軽鎖を コードするDNAセグメントを含んで成る 。他方、第一抗体遺伝子の一部のみをコードするDNAセグメントを製造する。こ れは結合及び／又はエフェクター活性をもつ。その他の組換構築体は他のイムノ グロブリン遺伝子のセグメント、特に他のヒト定常領域配列（重鎖及び／又は軽 鎖）のセグメントに融合したトリオーマ細胞系イムノグロブリン遺伝子のセグメ ントを含む。ヒト定常領域配列は様々な対照起源、例えば限定することなく、Ka batら（1987）Sequences of Proteins of Immunological Interest，U.S.Depart ment of Health and Human Servicesに記載のものから選択できる。 抗NBCCSイムノグロブリン又はそのフラグメントをコードするDNAセグメントの 他に、その他の実質的に同族の改質イムノグロブリンが当業者周知の様々なDNA 技術を利用して簡単にデザインでき、そして製造できる(Gillman & Smith（1979 ）Gene，8:81-97;Robertsら（1987）Nature 328:731-734)。かかる改質セグメン トは通常抗原結合能力及び／又はエフェクター機能を保持している。更に、かか る改質セグメントは通常オリジナルのトリオーマゲノム配列とはこのような配列 に対するストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションを防ぐためにそ れほど変化していない。多くの遺伝子と同様、イムノグロブリン遺伝子は個別の 機能領域を含み、それぞれ１又は複数の独立した生物活性を有するため、これら の遺伝子は他の遺伝子に由来する機能領域に融合され、新規の特性又は新規の併 合特性を有する融合タンパク質（例えばイムノトキシン）となっていてよい。 当該組換ポリヌクレオチド構築体は典型的にはコード配列に作用可能式に連結 された発現コントロール配列、例えば天然に一体化した又は異種のプロモーター 領域を含むであろう。好ましくは、この発現コントロール配列は真核宿主細胞を 形質転換又はトランスフェ クションすることのできるベクター中の真核プロモーター系であろう。ベクター が適当な宿主に組込まれたら、この宿主は高レベルのヌクレオチド配列発現、並 びにヒト抗NBCCSイムノグロブリンの回収及び精製に適切な条件下に維持される 。 このような発現ベクターは典型的にはエピソームとして又は宿主染色体DNAの 組込み部分として宿主生体の中で複製可能である。一般に、発現ベクターは、所 望のDNA配列で形質転換された細胞の検出を可能にするよう、選択マーカー、例 えばアンピシリン耐性又はヒグロマイシン耐性マーカーを含むであろう。 一般に、ヒト抗NBCCSイムノグロブリン鎖をコードするDNA配列をクローニング するために原核細胞を利用できる。Ｅ．コリ(E．coli)が本発明のDNA配列をクロ ーニングするために極めて有用な一の原核宿主である。微生物、例えば酵母も発 現のために有用である。発現コントロール配列、複製起点、終止配列等を所望通 りに有する適当なベクターをもつサッカロマイセス(Saccharomyces)が好適な酵 母宿主である。典型的なプロモーターは３−ホスホグリセレーテキナーゼ及びそ の他の解糖系酵素を含む。誘導性酵母プロモーターには、とりわけ、アルコール デヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、並びにマルトース及びガラクトース 利用を司る酵素に由来するプロモーターが挙げられる。 哺乳動物細胞がイムノグロブリン又はそのフラグメントをコードするヌクレオ チドセグメントを発現するための極めて好適な宿主である（例えば、Winnacker ，From Genes to Clones，VCH Publishers，N.Y．1987）。インタクト異種タン パク質を分泌することのできる適当ないくつかの宿主細胞系が当業界において開 発され、そしてCHO細胞系、様々なCOS細胞系、HeLa細胞、Ｌ細胞及びミエローマ 細胞系が含まれる。好ましくは、細胞は非ヒト型とする。そのよう な細胞のための発現ベクターは発現コントロール配列、例えば複製起点、プロモ ーター、エンハンサー(Queenら（1980）Immunol.Rev.89:49)、並びに必須のプロ セシング情報部位、例えばリボソーム結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデ ニル化部位及び転写終止配列を含みうる。好適な発現コントロール配列は内因性 遺伝子、サイトメガロウィルス、SV40、アデノウィルス、ウシパピロマウィルス 等に由来する（例えば、Coら（1992）J.Immunol．148:1149参照）。 注目のDNAセグメントを含むベクターは細胞宿主のタイプに依存して周知の方 法により宿主細胞へと移入できうる。例えば、塩化カルシウムトランスフェクシ ョンが原核細胞によく利用され、一方、リン酸カルシウム処理、エレクトロポレ ーション、リポフェクション、バイオリスティクス又はウィルスベーストランス フェクションがその他の細胞宿主のために利用できうる。哺乳動物細胞を形質転 換するのに利用されるその他の方法にはポリブレン、プロトプラスト融合、リポ ソーム、エレクトロポレーション及びマイクロインジェクションの利用が挙げら れる（一般には、Sambrookら、前掲参照）。 発現されたら、本発明のヒト抗NBCCSイムノグロブリンは当業界の標準手順、 例えばHPLC精製、フラクションカラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等に従 って精製できる（一般には、Scopes，Protein Purification，Springer-Verlag ，NY，1982参照）。ヒト抗体の製造のための詳細なプロトコールは米国特許5,50 6,132に見い出せうる。 その他のアプローチはヒト血液のin vitro免疫である。このアプローチにおい ては、ヒト抗体を生産できるヒト血液リンパ球を製造する。患者からヒト末梢血 液を採取し、そして単核細胞を回収する ように処理する。次にサップレッサーＴ細胞を取り出し、そして残留細胞を抗原 及び自系血清、並びに好ましくは非特異的リンパ球アクチベーターの添加された 組織培養培地に懸濁する。次に細胞を所望の特異的な抗体が生産される時間にわ たりインキュベーションする。次にこの細胞をヒトミエローマ細胞に融合させて その細胞系を不死化させ、抗体の連続生産を可能にすることができる（米国特許 4,716,111参照）。 別のアプローチにおいて、ヒト抗NBCCSを生産するマウス−ヒトハイブリドー マを調製する（例えば、5,506,132参照）。その他のアプローチには、ヒトイム ノグロブリン遺伝子を発現するように形質転換したマウスの免疫及びファージデ ィスプレースクリーニングが挙げられる(Vaughanら、前掲)。IV ．NBCCSポリペプチドの発現 Ａ）de novo化学合成 NBCCSタンパク質又はそのサブ配列は標準の化学ペプチド合成技術を利用して 合成できうる。所望のサブ配列が比較的短い場合（例えば、特定の抗原決定基を 所望する場合）、この分子は一本の連続ポリペプチドとして合成できうる。大き めの分子が所望される場合、サブ配列を別々に合成し（１又は複数のユニットで ）、次いで一の分子のアミノ末端を他の分子のカルボキシル末端と縮合させてペ プチド結合を形成させることにより融合してよい。 配列のＣ末端アミノ酸を不溶性支持体に付加させ、次いで配列における残りの アミノ酸を連続付加させる固相合成が本発明のポリペプチドの化学合成のために 好適な方法である。固相合成のための技術はBarany and Merrifield，Solid-Pha se Peptide Synthesis;pp．3-284 in The Peptides:Analysis，Synthesis，Biol ogy．Vol．2:Special Methods in Peptide Synthesis，Part A.，Merrifield ，らJ.Am.Chem.Soc.，85:2149-2156(1963)、及びStewartらSolid Phase Peptide Synthesis、第２版Pierce Chem.Co.，Rockford，I11．（1984）に記載されてい る。 Ｂ）組換発現 好適な態様において、NBCCSタンパク質又はそのサブ配列は組換DNA方法論を利 用して合成する。一般に、これは融合タンパク質をコードするDNA配列を構築し 、このDNAを特定のプロモーターのコントロール下で発現カセットの中に入れ、 宿主においてこのタンパク質を発現させ、発現タンパク質を単離し、そして必要 ならばそのタンパク質を再生させることを含む。 本発明のNBCCSタンパク質又はそのサブ配列をコードするDNAは上述の任意の適 当な方法、例えば適当な配列のクローニング及び制限処理、又はNarangらMeth.E nzymol．68:90-99(1979)のホスホトリエステル法；BrownらMeth.Enzymol．68:10 9-151(1979)のホスホジエステル法；BeaucageらTetra.Lett.，22:1859-1862（19 81）のジエステルホスホラミジット法；及び米国特許4,458,066の固相支持体法 の如き直接化学合成等により調製し得る。 化学合成は一本鎖オリゴヌクレオチドを作り上ける。これは相補性配列とのハ イブリダイゼーションにより、又は鋳型として一本鎖を利用するDNAポリメラー ゼによる重合により二本鎖DNAへと変換することができうる。当業者はDNAの化学 合成が約100塩基の配列に制限され、長めの配列は短い配列のライゲーションに より得られることを知っているであろう。 他方、適当な制限酵素を用いてサブ配列をクローニングし、そして適当なサブ 配列を切断することができうる。これらのフラグメントを次にライゲーションし て所望のDNA配列を作ることができうる。 一の態様において、本発明のNBCCSタンパク質はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の 如きDNA増幅法を利用してクローニングすることができうる。即ち、例えは核酸 配列はサブ配列を一個の制限部位（例えばNdeI）を含むセンスプライマー及び別 の制限部位（例えばHindIII）を含むアンチセンスプライマーを用いてPCR増幅さ せる。これは所望のNBCCS配列又はサブ配列をコードし、且つ末端制限部位を有 する核酸を生み出すであろう。次にこの核酸を第二分子をコードし、且つ適切な 対応の制限部位を有する核酸を含むベクターの中に容易にライゲーションさせる ことができる。適当なPCRプライマーはSEQ ID NO:１に示す配列情報を利用して 当業者により決定できうる。適当な制限部位は部位特異的突然変異誘発によりNB CCSタンパク質又はタンパク質配列をコードする核酸に付加することもできうる 。NBCCS配列又はサブ配列を含むプラスミドを標準の方法に従って適当な制限エ ンドヌクレアーゼで切断し、次いで第二分子をコードするベクターにライゲーシ ョンする。 NBCCSタンパク質又はタンパク質サブ配列をコードする核酸配列は様々な宿主 細胞、例えばＥ．コリ、その他の細菌宿主、酵母、並びに様々な高等真核細胞、 例えばCOS，CHO及びHeLa細胞系及びミエローマ細胞系において発現されうる。NB CCSタンパク質は典型的には真核細胞において見い出されるため、真核宿主が好 ましい。組換タンパク質遺伝子は各宿主にとって適切な発現コントロール配列に 作用可能式に連結されるであろう。Ｅ．コリに関して、これにはプロモーター、 例えばＴ７，trp又はラムダプロモーター、リボソーム結合部位及び好ましくは 転写終止シグナルが含まれる。真核細胞にとっては、このコントロール配列には プロモーター、並びに好ましくはイムノグロブリン遺伝子に由来するエンハンサ ー、SV40、サイトメガロウィルス等、及びポリアデニル化配列が含まれ、そして スプライスドナー及びアクセプター配列が含まれうる。 本発明のプラスミドはＥ．コリのための塩化カルシウム形質転換及び哺乳動物 細胞のためのリン酸カルシウム処理又はエレクロポレーションの如き周知の方法 により選定の宿主に移入できうる。プラスミドにより形質転換された細胞はamp ，gpt，neo及びhyg遺伝子の如きプラスミド上に含まれる遺伝子により供与され る抗生物質に対する耐性により選定されうる。 発現されたら、組換NBCCSタンパク質は当業界の標準的な手順、例えば硫酸ア ンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気 泳動等に従って精製できる（一般的には、R.Scopes，Protein Purification，Sp ringer-Verlag，N.Y．(1982)，Deutscher，Methods in Enzymology Vol．182:Gu ide to Protein Purification，Academic Press，Inc．N.Y．(1990)参照）。約9 0〜95％の均質性の実質的に純粋な組成物が好ましく、そして98〜99％又はそれ より高い均質性が最も好ましい。所望通りにある程度又は均質に至るまで精製で きたら、このポリペプチドは使用できうる（例えば抗体製造のための免疫原とし て）。 当業者は化学合成、生物学的発現又は精製を経て、NBCCSタンパク質が構成ポ リペプチドの天然コンホメーションとは実質的に異なるコンホメーションをもち 得ることに気づくであろう。この場合、このポリペプチドを変性及び還元させ、 次いでこのポリペプチドを好適なコンホメーションへとリフォルディングさせる ことが必要でありうる。タンパク質を還元及び変性させる方法並びにリフォルデ ィングの方法は当業者に周知である（Debinskiら（1993）J.Biol.Chem.，268:14 065-14070;Kreitman and Pastan（1993）Bioconjug.Chem.，4:581-585;及びBuch nerら（1992）Anal.Biochem.，205:263-270参照）。例えばDebinskiらは、グア ニジン−DTEの中で の封入体タンパク質の変性及び還元を述べている。次にこのタンパク質を酸化グ ルタチオン及びＬ−アルギニンを含むレドックスバッファーの中でリフォルディ ングさせる。 当業者はNBCCSタンパク質の生物活性を損うことなくそれに修飾を施すことが できることを認識しているであろう。いくつかの修飾を、クローニング、発現又 は標的分子の融合タンパク質への組込みを助長するために施してよい。かかる修 飾は当業者に周知であり、そして例えば開始部位を供するためのアミノ末端への メチオニンの付加、又は好都合に位置する制限部位もしくは終止コドンもしくは 精製配列を構築するためのいづれかの末端に設ける追加のアミノ酸(例えばHis) が挙げられる。Ｖ．NBCCSの検出 上述の通り、ヒトPTC遺伝子の異常（例えば改変又は欠失）発現は基底細胞癌 腫の発達における重要な要因、並びにその改変が遺伝的な特性である場合、母斑 様基底細胞癌腫及び／又はこの症候群の様々な発育異常特徴の病因である。腫瘍 形成の発達はNBCCS遺伝子の完全な不活性化を要するものと信じられているが、 部分不活性化は単相不全又は完全不活性化へのなり易さの増大（例えば二次的な 突然変異）を介しての基底細胞癌腫及び／又はNBCCSへのかかり易さをもらたす 。 即ち、NBCCSポリペプチドをコードする核酸のNBCCSポリペプチドの発現の有無 、又は量を決定することが所望される。これは遺伝子産物；NBCCSポリペプチド 自体をアッセイすることにより、又はNBCCSポリペプチドをコードする核酸(DNA 又はmRNA)をアッセイすることにより達成されうる。特に、NBCCS発現が存在、非 存在、又は異常であるかどうかを決定することが所望される（例えば、異常遺伝 子産物のため、又はヘミ接合遺伝子の如きによる異常発現レベ ルのため）。特に、異常なNBCCS遺伝子発現についての遺伝的なかかり易さを決 定することが所望される場合、宿主のDNAを異常NBCCS遺伝子又は遺伝子転写物（ mRNA）についてアッセイすることが好ましい。 Ａ）サンプルの回収及びプロセシング NBCCS（PTC）遺伝子又は遺伝子生成物（即ち、mRNA又はポリペプチド）は好ま しくは生物学的サンプル中で検査及び／又は定量される。本明細書において利用 する生物学的サンプルとは、生物学的組織又は流体のサンプルであって、健康及 び／又は病理状態において、NBCCS（PTC）核酸又はポリペプチドを含むものであ る。かかるサンプルには、限定することなく、唾液、羊水、血液、血液細胞（例 えば白血球）、組織又は微小針生検サンプル、尿、腹水及び胸膜水、又はそれに 由来する細胞が挙げられる。生物学的サンプルには組織切片、例えば組織学的目 的のために採取した凍結切片の如きも含まれうる。サンプルは典型的にはヒト患 者から採取されるが、このアッセイは任意の哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、ヒツ ジ、ウシ及びブタ由来のサンプル中のNBCCS遺伝子又は遺伝子産物を検出するの に利用してよい。 このサンプルは適宜適当なバッファー溶液の中に希釈するか、又は所望するな ら濃縮してよい。様々なバッファー、例えばホスフェート、トリス等のいづれか を利用した生理学的pHのいくつかの標準水性バッファー溶液を利用してよい。 Ｂ）核酸アッセイ 一の態様において、本発明は基本的なNBCCS遺伝子（又はそのフラグメント） をアッセイすることにより、又はNBCCS遺伝子転写物（mRNA）をアッセイするこ とによりヒトNBCCS（PTC）発現を検査及び／又は定量する方法を提供する。この アッセイは正常な遺伝子も しくは遺伝子産物の有無のため、異常な遺伝子もしくは遺伝子産物の有無のため 、又は正常もしくは異常なNBCCS遺伝子産物の転写レベルの定量のためであって よい。 ｉ）核酸サンプル 好適な態様において、核酸アッセイは検査すべき生体から単離した核酸のサン プルで実施する。簡単な態様において、かかる核酸サンプルは生物学的サンプル から単離した全mRNAとする。核酸（例えばゲノムDNA又はmRNA）は当業者周知の 任意の幾多の方法に従ってサンプルから単離されうる。当業者はNBCCS遺伝子の コピー数の変化を検出する場合、ゲノムDNAを単離するのが好ましいことを認識 しているであろう。逆に、１又は複数の遺伝子の発現レベルを検出する場合、RN A(mRNA)を単離するのが好ましい。 全DNA又はmRNAを単離する方法は当業者に周知である。例えば、核酸の単離及 び精製方法はLaboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology 第３章：Hybridization With Nucleic Acid Probes，Part I．Theory and Nucle ic Acid Preparation，P.Tijssen，ed．Elsevier，N.Y．(1993)及びLaboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology第３章：Hybridization Wi th Nucleic Acid Probes，Part I．Theory and Nucleic Acid Preparation，P.T ijssen，ed．Elsevier，N.Y．(1993)に記載されている。 好適な態様において、全核酸を例えば酸性グアニジニウム−フェノール−クロ ロホルム抽出法を利用して所定のサンプルから単離し、そしてポリA+mRNAをオリ ゴdTカラムクロマトグラフィーもしくは(dT)n磁性ビーズを利用して単離する（ 例えばSambrookらMolecular Cloning:A Laboratory Manual(第２版)，Vols．1-3 ，Cold Spring Harbor Laboratory，(1989)又はCurrent Protocols in Mo lecular Biology，F.Ausubelら編Greene Publishing and Wiley-Interscience， New York(1987)参照）。 しばしば、ハイブリダイゼーションの前に核酸サンプルを増幅させるのが所望 される。当業者はどのような増幅法を利用しようと、定量結果を所望するなら、 増幅核酸の相対頻度を保つ又はコントロールする方法を利用する注意を払わねば ならないことを知っているであろう。 「定量」増幅は当業者に周知である。例えば、定量PCRは同じプライマーを用 いて既知量のコントロール配列を一緒に同時増幅させることを包括する。これは PCR反応を較正するのに用いる内部標準を担う。高密度アレーは増幅核酸の定量 のための内部標準に特異的なプローブを含みうる。 一の好適な内部標準は合成AW 106 cRNAである。AW 106 cRNAは当業者公知の標 準技術に従ってサンプルから単離したRNAと組合せる。次いでこのRNAを逆転写酵 素を利用して逆転写してコピーDNAを得る。このcDNA配列をラベル化プライマー を用いて（例えばPCRにより）増幅させる。この増幅産物を、典型的には電気泳 動により分離し、そして放射能値（増幅産物の量に比例する）を決定する。次に サンプル中のmRNAの量を既知のAW 106 RNA標準により供されるシグナルと比較す ることにより計算する。定量PCRのための詳細なプロトコールはPCR Protocols， A Guide to Methods and Applications，Innisら、Academic Press，Inc．N.Y. ，(1990)に供されている。 その他の適当な増幅法には、限定することなく、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)( Innisら（1990）PCR Protocols．A guide to Methods and Application．Academ ic Press，Inc．San Diego)リガーゼ連鎖反応(LCR)(Wu and Wallace（1989）Gen omics 4:560，Landegren ら（1988）Science 241:1077、及びBarringerら（1990）Gene 89:117参照）、転 写増幅（Kwohら（1989）Proc.Natl.Acad.Sci．USA 86:1173）、及び自立型配列 複製(Guatelliら（1990）Proc.Nat.Acad.Sci．USA 87:1874)が含まれる。ii ）ハイブリダイゼーションアッセイ 核酸ハイブリダイゼーション技術を利用する特異的なDNA及びRNA測定のための 様々な方法は当業者は公知である（Sambrookら前掲参照）。例えば、サンプル中 のNBCCSをコードするDNAの有無又は量を評価するための一の方法はサザントラン スファーを含む。簡単には、消化したゲノムDNAをバッファー中でアガロースス ラブゲルで泳動し、そして膜に転写させる。 ハイブリダイゼーションは標的NBCCS配列又はサブ配列に特異的な核酸プロー ブを利用して実施する。核酸プローブはNBCCSタンパク質をコードする核酸配列 に基づいてデザインする（SEQ ID NO:１参照）。これらのプローブはNBCCSタン パク質をコードする核酸配列の全長又は全長に満たなくてもよい。短めのプロー ブは特異性について実験を通して試験する。好ましくは、核酸プローブは長さに おいて20塩基以上とする。（核酸ハイブリダイゼーションにおいて利用するため の核酸プローブ配列を選定する方法についてはSambrookら参照）。ハイブリダイ ズした部分の識別はNBCCSタンパク質をコードするDNAの有無の定量決定を可能に する。 同様に、ノーザントランスファーをNBCCSタンパク質をコードするmRNAの検出 のために利用してよい。簡単には、mRNAを所定の細胞サンプルから、例えば酸性 グアニジニウム−フェノール−クロロホルム抽出法を利用して単離する。次にこ のmRNAを電気泳動にかけてmRNA種を分離し、そしてこのmRNAをゲルからニトロセ ルロース膜へと転写する。サザンブロットと同様にラベル化プローブをNBCCSタ ンパク質の有無を同定するために用いる。 様々な核酸ハイブリダイゼーション方式が当業者に公知である。例えば、一般 の方式にはサンドイッチアッセイ及び競合又は置換アッセイが含まれる。ハイブ リダイゼーション技術は一般に「Nucleic Acid Hybridization，A Practical Ap proach，」Ed.Hames，B.D．and Higgins，S.J.，IRL Press，(1985);Gall and P ardue Proc．Natl.Acad.Sci．U.S.A．63:378-383(1969);及びJohnらNature 223: 582-587(1969)に記載されている。 例えば、サンドイッチアッセイは核酸配列の検出又は単離のために商業的に有 用なハイブリダイゼーションアッセイである。かかるアッセイは固相支持体に共 有式に固定された「捕獲」核酸と溶液中のラベル化「シグナル」核酸とを利用す る。臨床サンプルは標的核酸を提供するであろう。この「捕獲」核酸及び「シグ ナル」核酸プローブは標的核酸にハイブリダイズして「サンドイッチ」ハイブリ ダイゼーション複合体を形成する。有効となるため、このシグナル核酸は捕獲核 酸にはハイブリダイズできない。 典型的には、ラベル化シグナル核酸をハイブリダイゼーションの検出のために 用いる。相補的な核酸又はシグナル核酸はハイブリダイズしたポリヌクレオチド の存在を検出するために典型的に用いられる任意のいくつかの方法によりラベル してよい。検出の最も一般的な方法は3Ｈ，125Ｉ，35Ｓ，14Ｃ又は32Ｐ−ラベル 化プローブ等によるオートラジオグラフの利用である。その他のラベルには、ラ ベル化抗体に結合するリガンド、蛍光団、化学発光因子、酵素、及びラベル化リ ガンドのための特異的結合ペアー構成員を担うことのできる抗体が挙げられる。 ハイブリダイゼーション複合体の検出は標的とプローブヌクレオチド又は核酸 の二量体に対するシグナル生成複合体を必要としうる 。典型的には、かかる結合はリガンド−接合プローブとシグナルの接合した抗リ ガンドとの間での如き、リガンドと抗リガンドとの相互作用を介して起こる。 このラベルはハイブリダイゼーション複合体の間接検出をも可能にしうる。例 えば、ラベルがハプテン又は抗原であるとき、サンプルは抗体を利用して検出で きうる。このような系において、シグナルは蛍光又は酵素分子を抗体に付加させ ることにより、又はある場合、放射性ラベルを付加させることにより生成される 。（Tijssen，P.，「Practice and Theory of Enzyme Immunoassays」Laboratory Techniques in Bio-chemistry and Molecular Biology，Burdon，R.H.，van Kni ppenberg，P.H.，Eds.，Elsevier(1985)，pp．9-20）。 ハイブリダイゼーションアッセイの感度は検出すべき標的核酸を増幅させる核 酸増幅系の利用を介して高まりうる。かかる系の例にはポリメラーゼ連鎖反応(P CR)系及びリガーゼ連鎖反応(LCR)系が挙げられる。最近当業界で発表されている その他の方法は核酸配列を基礎とする増幅（NASBA(商標)Cangene，Mississauga ，Ontario）及びＱベーターレプリカーゼ系である。 NBCCSタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを決定するためのその他の 手段はin situハイブリダイゼーションである。in situハイブリダイゼーション は周知であり、そして一般にAngererら、Methods Enzymol.，152:649-660（1987 ）に記載されている。in situハイブリダイゼーションアッセイにおいて、細胞 又は組織検体を固相支持体、典型的にはガラススライドに固定する。DNAをプロ ービングするなら、細胞を熱又はアルカリで変性させておく。次に細胞をハイブ リダイゼーション溶液に中程度の温度で接触させ、NBCCSタンパク質に特異的な ラベル化プローブのアニーリングを 起こさせる。これらのプローブは好ましくは放射性同位元素又は蛍光リポーター でラベルする。in situハイブリダイゼーションによるNBCCSの検出は実施例２に 詳細してある。 iii ）増幅を基礎とするアッセイ 別の態様において、NBCCS遺伝子又は遺伝子産物は増幅を基礎とするアッセイ を利用して検出（アッセイ）できる。増幅を基礎とするアッセイにおいては、NB CCS遺伝子又は転写物（例えばmRNA又はcDNA）の全部又は一部を増幅させ、そし て増幅産物を検出する。鋳型を担う基本的な遺伝子又は遺伝子産物がない場合、 増幅は非特異的であるか又は存在せず、従って増幅産物は全く生じない。基本的 な遺伝子又は遺伝子産物が存在している場合、標的配列はこの基本的な遺伝子又 はmRNAの有無又は量の指標となるように増幅される。 増幅を基礎とするアッセイは当業者に周知である（例えばInnis前掲参照）。N BCCS遺伝子のために供与するcDNA配列は当業者がこの遺伝子の任意の部分を増幅 するようプライマーを慣用的に選別するのに十分である。更に、表２はNBCCS（P TC）遺伝子を構成する21のエキソンそれぞれのPCR増幅のためのプライマーペア ーを示す。以降の実施例２は増幅プロトコールを示し、そしてPCRを利用するNBC CS（PTC）遺伝子の検出を示す。 増幅プライマーは下記の通り（第iv章参照）特異的な欠失、トランケーション 及び挿入を含む増幅産物を供するように選定し、これにより特異的な異常の検査 が助長されうる。 iv ）異常（例えば突然変異）の特異的な検査 異常NBCCS（PTC）遺伝子又は遺伝子産物は早期停止コドン、欠失又は挿入を特 徴とする。典型的な異常遺伝子(PTC突然変異)を表３，５，６，７及び９に示す 。早期停止コドン及び欠失は遺伝子又は遺伝子産物（mRNA転写物又はcDNA）のサ イズの減少により検出でき うる。同様に、挿入は遺伝子又は遺伝子産物のサイズの上昇により検出できうる 。他方、突然変異は標準の方法に従う遺伝子又は遺伝子産物の配列決定により決 定できる。 更に、増幅アッセイ及びハイブリダイゼーションプローブは特定の異常を特異 的に標的とするように選定できる。例えば、異常が欠失の場合、異常遺伝子にお いて欠失している核酸配列に特異的にハイブリダイズする又はそれを増幅させる 核酸プローブ又は増幅プライマーを選定してよい。プローブはハイブリダイズで きないか、又は増幅反応は欠失を有するNBCCS（PTC）核酸の異常バージョンに特 異的な増幅を与えることができないであろう。他方、プローブ又は増幅反応は欠 失全体又は欠失のいづれかの末端（欠失ジャンクション）に及ぶようにデザイン してよい。同様に、プローブ及び増幅プライマーは特異的に点突然変異又は挿入 を標的とするように選定できうる。特異的な突然変異を検出するための方法は例 えば米国特許5,512,441号に記載されている。PCRの場合、増幅プライマーはNBCC S（PTC）遺伝子の一部にハイブリダイズするようにデザインしてよいが、NBCCS （PTC）遺伝子の突然変異と野生型とを区別するためにプライマーの３’末端を 利用してよい。末端塩基が点突然変異又は野生型配列と対合するなら、ポリメラ ーゼ依存性伸長を行い、そして増幅産物を検出することができる。点突然変異又 は多形態を検出するためのこの方法はSommerら(1989)Mayo Clin.Proc．64:1361- 1372に詳細に記載されている。適切なコントロールを利用することにより、陽性 及び陰性増幅産物の双方を有するキットを開発することができる。これらの産物 は特異的なプローブを用いて、又は単にその有無を検出することにより検出でき る。PCR法の変異法は区別の点、即ち、点突然変異又は野生型塩基がLCRオリゴヌ クレオチド間に属するとき、LCRを利用する。オリゴヌクレオチドのライゲ ーションはNBCCS（PTC）遺伝子の突然変異と野生型とを区別するための手段とな る。 様々な自動化固相検査技術もNBCCS（PTC）遺伝子の突然変異の有無を検出する ために適当である。例えば、Affymetrix，Inc．Santa Clara，CAより入手できる 非常に大スケールの固定化ポリマーアレー(VLSIPS(商標))が注目の特異的な配列 を有する核酸の検出のために利用できるFodorら（1991）Science，251:767-777; Sheldonら（1993）Clinical Chemistry 39(4):718-719及びKozalら（1996）Natu re Medicine 2(7):753-759参照。例えば、全ての既知のNBCCS（PTC）突然変異に ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドはDNAチップ（かかるチップはAffymetri xより入手できる）上で合成でき、そしてサンプル由来の核酸は、任意の既知のN BCCS（PTC）突然変異の有無についてのサンプル核酸の同時分析のためにこのチ ップにハイブリダイズする。突然変異を検出するためのプロトコールは、例えば Tijssen（1993）Laboratory Techniques in biochemistry and molecular biolo gy-hybridization with nucleic acid probes parts I and II，Elsevier，New York及びChoo(ed)(1994)Methods In Molecular Biology Volume 33-In Situ Hyb ridization Protocols，Humana Press Inc.，New Jerseyに記載されている（又M ethods in Molecular Biologyシリーズのその他の書物も参照のこと）。 iv ）発現レベルの検出 サンプル中の正常又は突然変異NBCCS遺伝子の転写レベル（及びそれによる発 現）を定量することが所望される場合、核酸サンプルは、NBCCS遺伝子のmRNA転 写物の濃度又はmRNA転写物に由来する核酸の濃度がこの遺伝子の転写レベル（及 びそれ故発現レベル）に比例するものである。同様に、ハイブリダイゼーション シグナルがハ イブリダイズした核酸の量に比例するハイブリダイゼーションシグナル強度を供 することが好ましい。この比率は比較的厳密であることが好ましいが（例えば、 転写率の２倍はサンプル核酸プール中のmRNA転写物を２倍にし、且つハイブリダ イゼーションシグナルを２倍にする）、当業者はこの比率がよりゆるやかなもの 又は非直線性であってもよいことを認識するであろう。即ち、例えば、標的mRNA の濃度における５倍の違いがハイブリダイゼーション強度における３〜６倍の違 いを供するアッセイで十分である。より正確な定量が必要な場合、適当なコント ロールを流して本明細書に記載のサンプル調製品及びハイブリダイゼーションに 導入された変動を補正してよい。更に、「標準」標的mRNAの系列希釈を当業者周 知の方法に従い検量曲線を作製するために利用してよい。むろん、転写物の有無 の簡単な検査が所望されるとき、めんどうなコントロール又は較正は不要である 。 Ｃ）NBCCSポリペプチドアッセイ ヒトNBCCS（PTC）遺伝子の発現は発現NBCCSポリペプチドを検査又は定量する ことによっても検査及び／又は定量できる。NBCCSポリペプチドは当業者周知の 数多くの手段のいづれかにより検査又は定量できる。これらには分析学的生化学 法、例えば電気泳動、毛細管電気泳動、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC） 、薄層クロマトグラフィー(TLC)、高拡散クロマトグラフィー等、又は様々な免 疫学的方法、例えば流体又はゲル沈殿反応、免疫拡散（単相又は二重）、免疫電 気泳動、ラジオイムノアッセイ(RIA)、酵素連結免疫収着アッセイ(ELISA)、免疫 蛍光アッセイ、ウェスタンブロッティング等が挙げられうる。 特定の好適な態様において、NBCCSポリペプチドは電気泳動タンパク質分離、 より好ましくは二次元電気泳動で検出され、最も好ま しい態様においては、NBCCSポリペプチドはイムノアッセイを利用して検出され る。 本明細書において、イムノアッセイは被検物(NBCCSポリペプチド)に特異的に 結合する抗体を利用するアッセイである。このイムノアッセイは従って、被検物 を単離、標的及び定量するその他の物理的又は化学的性質を利用するのではなく 、抗NBCCS抗体に対するNBCCSポリペプチドの特異的な結合の検査を特徴とする。 １）電気泳動アッセイ 上述の通り、生物学的サンプル中のNBCCSポリペプチドの有無は電気泳動法を 利用して決定できうる。電気泳動技術を利用してタンパク質を検出する手段は当 業者に周知である（一般にはR.Scopes（1982）Protein Purlfication，Springer -Verlag，N.Y.;Deutscher，(1990)Methods in Enzymology Vol．182:Guide to P rotein Purification.，Academic Press，Inc.，N.Y参照）。 ２）免疫学的結合アッセイ 好適な態様において、NBCCSポリペプチドは任意の幾多のよく知られた免疫学 的結合アッセイを利用して検査及び／又は定量される（例えば、米国特許4,366, 241;4,376,110;4,517,288;及び4,837,168参照）。一般的なイムノアッセイにつ いては、Methods in Cell Biology Volume 37:Antibodies in Cell Biology，As ai編Academic Press，Inc．New York(1993);Basic and Clinical Immunology第 ７版Stltes & Terr編（1991）も参照のこと。免疫学的結合アッセイ（又はイム ノアッセイ）は典型的には被検物（この場合NBCCSポリペプチド又はサブ配列） に特異的に結合し、そして往々にして固定化する「捕獲試薬」を利用する。この 捕獲試薬は被検物に特異的に結合する成分である。好適な態様において、この捕 獲試薬はNBCCSポリペプチドに特異的に結合する抗体である。この 抗体(抗NBCCS)は第III章（Ａ）に記載した当業者周知の幾多の任意の手段により 製造できうる。 イムノアッセイは往々にして捕獲試薬と被検物とで形成される複合体に特異的 に結合してラベルするラベル用試薬を利用する。このラベル用試薬はそれ自体抗 体／被検物複合体を構成するいづれかの成分であってよい。即ち、このラベル用 試薬はラベル化NBCCSポリペプチド又はラベル化抗NBCCS抗体であってよい。他方 、このラベル用試薬は抗体／NBCCS抗体に特異的に結合する第三成分、例えば別 の抗体であってよい。 好適な態様において、このラベル用試薬はラベルを担持した第二ヒトNBCCS抗 体である。他方、この第二NBCCS抗体はラベルを欠いてよいが、第二抗体が由来 する種の抗体に特異的なラベル化第三抗体に結合していてよい。この第二抗体は 第三ラベル化分子が特異的に結合しうる検出可能な成分、例えばビオチンにより 修飾されたもの、例えば酵素ラベル化ストレプトアビジンであってよい。 イムノグロブリン定常領域に特異的に結合できるその他のタンパク質、例えば プロテインＡ又はプロテインＧもラベル試薬として利用できうる。これらのタン パク質はストレプトコッカス細菌の細胞壁の正常構成分である。それらは様々な 種に由来するイムノグロブリン定常領域と強い非免疫原的反応性を示す（一般に 、Kronvalら（1973）J.Immunol.，111:1401-1406及びAkerstromら（1985）J．Im munol.，135:2589-2542参照）。 アッセイを通じて、インキュベーション及び／又は洗浄工程が試薬をそれぞれ 組合せた後に必要とされうる。インキュベーション工程は約５秒から数時間、好 ましくは約５分〜約24時間であってよい。しかしながら、インキュベーション時 間はアッセイ方式、被検物、溶液の容量、濃度等に依存するであろう。通常、ア ッセイは周囲 温度で実施されるであろうが、それらは広い温度、例えば10℃〜40℃で実施して よい。 ａ）非競合アッセイ方式 NBCCSポリペプチドを検出するためのイムノアッセイは競合的又は非競合的で あってよい。非競合的イムノアッセイは捕獲された被検物(この場合、NBCCS)の 量を直接測定するアッセイである。一の好適な「サンドイッチ」アッセイにおい て、捕獲試薬（抗NBCCS抗体）はそれらが固定化されている固相支持体に直接結 合していてよい。これらの固定化抗体はかくして試験サンプル中に存在するNBCC Sを捕獲する。このようにして固定化したNBCCSはラベル用試薬、例えばラベルを 担持した第二ヒトNBCCS抗体に結合する。他方、第二NBCCS抗体はラベルを欠いて よく、それは第二抗体が由来する種の抗体に特異的なラベル化第三抗体に結合す る。この第二抗体は第三ラベル化分子が特異的に結合しうる検出可能な成分、例 えばビオチンにより修飾されたもの、例えば酵素ラベル化ストレプトアビジンで あってよい。 ｂ）競合アッセイ方式 競合アッセイにおいては、サンプル中に存在する被検物(NBCCS)の量はサンプ ル中に存在する被検物により捕獲試薬（抗NBCCS抗体）から追い出された添加（ 外因性）被検物(NBCCS)の量を測定することにより間接的に測定する。一の競合 アッセイにおいて、本件の場合既知量のNBCCSをサンプルに加え、そしてこのサ ンプルを捕獲試薬、本件の場合NBCCSに特異的に結合する抗体と接触させる。抗 体に結合したNBCCSの量はサンプル中に存在するNBCCSの濃度に反比例する。 特に好適な態様において、この抗体は固相支持体に固定化する。抗体に結合し たNBCCSの量はNBCCS／抗体複合体の中に存在するN BCCSの量を測定することにより、又は複合せずにいるNBCCSの量を測定すること により決定できうる。NBCCSの量はラベル化NBCCS分子を供することにより検出で きうる。 ハプテン阻害アッセイは別の好適な競合アッセイである。このアッセイにおい ては、本件の場合既知量のNBCCSを固相支持体に固定化する。既知量の抗NBCCS抗 体をサンプルに加え、次いでこのサンプルを固定化NBCCSと接触させる。本件に おいては、固定化NBCCSに結合した抗NBCCS抗体の量はサンプル中に存在するNBCC Sの量に反比例する。ここでも、固定化抗体の量は抗体の固定化画分又は溶液中 に残っている抗体画分のいづれかを検出することにより検出し得る。検出は抗体 がラベル化されているときは直接的、又は上述の如き抗体に特異的に結合するラ ベル化成分のその後の添加による間接的なものであってよい。 ｃ）その他のアッセイ方式 特に好適な態様において、ウェスタンブロット（イムノブロット）分析をサン プル中のNBCCSの存在を検出及び定量するために用いる。この技術は一般に分子 量に基づく電気泳動によるサンプルタンパク質の分離、適当な固相支持体への分 離タンパク質の転写（例えばニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター 、又は誘導化ナイロンフィルター）、及びサンプルのNBCCSに特異的に結合する 抗体とのインキュベーションを含んで成る。抗NBCCS抗体は固相支持体上のNBCCS に特異的に結合する。これらの抗体は直接的にラベル化するか、又は抗NBCCSに 特異的に結合するラベル化抗体（例えばラベル化ヒツジ抗マウス抗体）を用いて その後検出することができうる。 その他のアッセイ方式にはリポソームイムノアッセイ(LIA)があり、これは特 異的な分子（例えば抗体）に結合し、且つ封入試薬又 はマーカーを放出するようにデザインされたリポソームを利用する。放出される 化学物質を標準の技術に従って検出する（Monroeら（1986）Amer.Clin.Prod.Rev ．5:34-41参照）。 ｄ）アッセイの評価 本発明のアッセイは当業者周知の標準方法に従って評価する(NBCCSポリペプチ ドについて陽性又は陰性として)。評価の特定の方法はアッセイ方式及びラベル の選択に依存するであろう。例えば、ウェスタンブロットアッセイは酵素ラベル により生成される有色産物を識別化させることにより評価できうる。正しい分子 量にある明確に識別可能な有色バンド又はスポットは陽性結果として評価され、 一方明確に識別可能なスポット又はバンドの欠如は陰性と評価される。好適な態 様において、陽性検査はバックグランド及び／又はコントロールのそれより２倍 以上、そしてより好ましくはバックグランド及び／又は陰性コントロールのそれ より３倍以上もしくは５倍以上のシグナル強度（例えばNBCCSポリペプチド量） を示すであろう。 ｅ）非特異的結合の抑制 当業者はイムノアッセイにおいて非特異的結合を抑制することが往々にして所 望されることを知っているであろう。詳しくは、このアッセイが固相支持体に固 定化された抗原又は抗体を包括するとき、基質に非特異的結合の量を最小限にす ることが所望される。かかる非特異的結合を抑制する手段は当業者に周知である 。典型的には、これは支持体をタンパク質性組成物でコーティングすることを包 括する。詳しくは、タンパク質組成物、例えば牛血清アルブミン(BSA)、脱脂粉 乳及びゼラチンが幅広く利用され、粉乳が最も好ましい。 ｆ）ラベル 本アッセイにおいて利用する特定のラベル又は検出可能基は、それが本アッセ イにおいて利用する抗体の特異的な結合を有意に妨害しない限り本発明の重要な 観点ではない。この検出可能基は検出可能な物理的又は化学的特性を有する任意 の物質であってよい。かかる検出可能ラベルはイムノアッセイの分野においてよ く開発されており、そして一般にかかる方法において有用なほぼ全てのラベルが 本発明に適用されうる。即ち、ラベルは光度計、光化学、生物化学、免疫化学、 電子、光学又は化学的手段により検出可能な任意の組成物である。本発明におい て有用なラベルには磁性ビーズ(例えばDynabeads(商標))、蛍光色素（例えばフ ルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミン等）、放射性ラ ベル（例えば3Ｈ，125Ｉ，35Ｓ，14Ｃ又は32Ｐ）、酵素（例えば西洋ワサビペル オキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ及びELISAにおいて一般的に利用され ているその他）、及び比色ラベル、例えばコロイド状金又は有色ガラスもしくは プラスチック（例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等）ビーズが 挙げられる。 ラベルは当業者周知の方法に従って所望のアッセイ成分に直接又は間接的にカ ップリングさせてよい。上述の如き、多種多様なラベルを使用してよく、ラベル の選定は必要とされる感度、化合物との接合のし易さ、安定性の要件、有用な設 備及び廃棄条件に依存する。 非放射性ラベルは往々にして間接的手段により付加される。一般に、リガンド 分子（例えばビオチン）を分子に共有結合させる。次いでこのリガンドを、もと から検出可能であるか又はシグナル系、例えば検出可能な酵素、蛍光化合物もし くは化学発光化合物に共有結合した抗リガンド（例えばストレプトアビジン）分 子に結合させる。いくつかのリガンド及び抗リガンドが使用できる。リガンドが 天然抗リガンド、例えばビオチン、チロキシン及びコルチゾールをもっていると き、それはラベル化された天然抗リガンドと一緒に利用されうる。他方、任意の ハプテン系又は抗原性化合物を抗体と組合せて使用してよい。 これらの分子は例えば酵素又は蛍光団との接合によりシグナル発生化合物に直 接接合させてもよい。ラベルとして注目されている酵素は主にヒドロラーゼ、特 にホスファターゼ、エステラーゼ及びグリコシダーゼ、又はオキシドリダクター ゼ、特にペルオキシダーゼである。蛍光化合物にはフルオレセイン及びその誘導 体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン等が挙げられる。 化学発光化合物にはルシフェリン及び２，３−ジヒドロフタルアジンジオン、例 えばルミノールが挙げられる。使用できうる様々なラベル用又はシグナル生成系 については例えば米国特許4,391,904を参照のこと。 ラベルを検出する手段は当業者に周知である。即ち、例えば、ラベルが放射性 ラベルの場合、検出のための手段にはシンチレーションカウンター又はオートラ ジオグラフにおける写真フィルムが含まれる。ラベルが蛍光ラベルの場合、それ は適当な光波長によりフルオロクロームを励起させ、そして得られる蛍光を検出 することによって検出されうる。蛍光は写真フィルムの利用により、電子検出器 、例えばチャージ・カップル・デバイス（CCDs）又はホトマルチプライマー等の 利用により目視検出できうる。同様に、酵素ラベルは酵素に適切な基質を供与し 、そして得られる反応生成物を検出することにより検出し得る。最後に、簡単な 比色ラベルはラベルに一体化した色を観察することにより簡単に検出し得る。即 ち、様々なディップスティックアッセイにおいて、接合した金は往々にしてピン ク色であり、一方様々な接合ビーズはビーズの色のままである。 いくつかのアッセイ方式はラベル化成分の利用を要しない。例えば、凝集アッ セイは標的抗体の存在を検出するために利用できうる。この場合、抗原コート化 粒子は標的抗体を含んで成るサンプルにより凝集する。この方式において、どの 成分もラベルされる必要がなく、そして標的抗体の存在は簡単な目視により検出 される。 ｇ）支持体 上述の如き、アッセイに依存して、抗原、標的抗体又は抗ヒト抗体等の様々な 成分は固相表面に結合していてよい。生物分子を様々な固相表面に結合させる幾 多の方法が当業界において公知である。例えば、固相表面は膜（例えばニトロセ ルロース）、マイクロタイターディッシュ（例えば、PVC、ポリプロピレン、又 はポリスチレン）、試験管（ガラス又はプラスチック）、ディップスティック（ 例えばガラス、PVC、ポリプロピレン、ラテックス等）、マイクロ遠沈管又はガ ラスもしくはプラスチックビーズであってよい。所望の成分は共有結合又は非特 異的な結合を介して非共有結合してよい。 天然及び合成の双方の多種多様な有機及び無機ポリマーが固相表面のための材 料として採用できうる。具体的なポリマーにはポリエチレン、ポリプロピレン、 ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ（エチレ ンテレフタレート）、レーヨン、ナイロン、ポリ（ビニルブチレート）、ポリビ ニリデンジフルオリド（PVDF）、シリコーン、ポリホルムアルデヒド、セルロー ス、セルロースアセテート、ニトロセルロース等が挙げられる。採用できうるそ の他の材料には、紙、ガラス、セラミック、金属、メタロイド、半導体材料、セ メント等が挙げられうる。更に、ゲルを形成する物質、例えばタンパク質（例え ばゼラチン）、リポ多糖、シリケート、アガロース及びポリアクリルアミドを使 用してよい。 いくつかの水性相を形成するポリマー、例えばデキストラン、ポリアルキレング リコール又は界面活性剤、例えばリン脂質、長鎖（12〜24個の炭素数）アルキル アンモニウム塩等も適当である。固相表面が多孔質の場合、様々な孔径が系の種 類に依存して採用されうる。 表面を調製するうえで、様々な特性を得るために多種多様な材料、特にラミネ ートを利用することができうる。例えば、タンパク質コーティング、例えばゼラ チンを非特異的結合を回避する、共有接合を簡単にする、シグナル検出を向上さ せる等のために利用できうる。 化合物と表面との共有結合が所望されるなら、この表面は通常多価であるか、 又は多価化されることができるものであろう。表面上に存在しており、且つ連結 のために利用できうる官能基にはカルボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基 、エチレン系基、ヒドロキシル基、メルカプト基等が挙げられうる。多種多様な 化合物を様々な表面に連結する手段は周知であり、そして論文に例示されている 。例えばImmobilized Enzymes，Ichiro Chibata，Halsted Press，New York，19 78及びCuatrecasas（1970）J.Biol.Chem．245 3059参照）。 共有結合に加えて、アッセイ成分を非共有結合させるための様々な方法が利用 できうる。非共有結合は典型的には表面に対する化合物の非特異的収着である。 典型的には、この表面を第二化合物でブロッキングし、ラベル化アッセイ成分の 非特異的結合を防ぐ。他方、この表面はそれが一の成分と非特異的に結合するが 、他の成分とは有意に結合しないようにデザインする。例えば、レクチン、例え ばコンカナバリンＡを担持する表面は炭水化物含有化合物には結合するが、グリ コシル化を欠くラベル化タンパク質には結合しないで あろう。 アッセイ成分の非共有付加において利用するための様々な固相表面については 米国特許4,447,576及び4,254,082参照のこと。 Ｃ）NBCCSの発現レベル及び／又は異常発現の評価 当業者は異常発現レベル又は異常発現産物（例えば突然変異転写物、トランケ ーション化又はナンセンスポリペプチド）が正常な発現レベル及び正常な発現産 物との比較により同定されることを知るであろう。正常な発現レベル又は正常な 発現産物は当業者周知の標準方法に従って任意の特定集団、サブ集団又は生体群 について決定できうる。典型的には、これは健康な生体の同定（即ち、NBCCS又 は基底細胞癌腫のない生体）及びNBCCS（PTC）遺伝子（本明細書に記載）の発現 レベルを測定する又は当該遺伝子、mRNA又は逆転写cDNAを配列決定して典型的な （正常な）配列変異を得ることを包括する。分子遺伝学において利用されている 標準の統計学的方法の適用は発現の基底レベルの決定、並びに正常遺伝子産物及 びかかる基底レベルからの有意な偏差の決定を可能にする。 Ｄ）検査キット 本発明は母斑様基底細胞癌腫又は散発性基底細胞癌腫へのかかり易さ（危険性 ）をもつ生体（例えば患者）の診断のためのキットも提供する。このキットは好 ましくはNBCCS遺伝子の有無を決定する、NBCCS遺伝子の発現を定量する、又は異 常NBCCS遺伝子もしくは異常NBCCS遺伝子の発現産物を検出するための１又は複数 の試薬を含む。好適な試薬は正常NBCCS遺伝子、cDNA又はそのサブ配列に特異的 に結合する核酸プローブ、異常NBCCS遺伝子(例えば早期トランケーション、挿入 又は欠失を含むNBCCS)に特異的に結合するプローブ、正常NBCCSポリペプチド又 はそのサブ配列に特異的に結合する抗体、又は異常NBCCSポリペプチド又はその サブ配列に結合する 抗体を含む。この抗体又はハイブリダイゼーションプローブは遊離であるか、又 は固相支持体、例えば試験管、マイクロタイタープレート、ディップスティック 等に固定されていてよい。このキットは更にNBCCSへのかかり易さの検査のため のアッセイにおけるこの抗体又はハイブリダイゼーションプローブの利用を教示 する仕様書も含みうる。 これらのキットは別に、又は組合せにおいて本明細書に記載の任意のその他の 成分、抗NBCCS抗体を含みうる。この抗体はモノクローナル又はポリクローナル であってよい。この抗体はラベルの如きその他の成分に接合されているか、及び ／又は固相支持体に固定化されていてよい。 これらのキットは更にNBCCSポリペプチド／抗体複合体の検出又はハイブリダ イズした核酸プローブの検出のための第二抗体も含みうる。このキットはラベル の検出のための適当な試薬、陽性及び陰性コントロール、洗浄溶液、希釈バッフ ァー等を含みうる。VI ．内因性NBCCS遺伝子の発現の調節 更なる別の態様において、本発明は内因性NBCCS遺伝子の発現を調節する方法 を提供する。NBCCS遺伝子産物の発現は細胞の腫瘍原性能力を軽減又は消失させ る方法により高まりうる。逆に、NBCCS遺伝子の上昇調節は腫瘍形成形質転換を 誘導し、そして基底細胞癌腫の研究のための簡便且つコントロール可能なモデル 系を供する。 内因性遺伝子の発現を改変する方法は当業者に周知である。典型的には、かか る方法は調節すべき特定の遺伝子の発現をコントロールする調節配列全体又は一 部を改変又は置換することを包括する。好適な態様において、NBCCS遺伝子の上 流にあるこの調節配列（例えば天然プロモーター）を改変させる。 これは典型的には天然調節配列に異種核酸を導入する相同組換の 利用により達成される。NBCCS遺伝子産物の発現を下降調節するため、リーディ ングフレームを改変する又はプロモーターを破綻させる簡単な突然変異が適当で ある。NBCCS遺伝子産物の発現を上昇調節させるには、天然プロモーターを正常 な転写レベルよりも高く誘導する異種プロモーターで置換してよい。 特に好適な態様において、注目の構造遺伝子又は上流配列を含んで成る核酸を 異種組換構築体を標的とするために利用する。上流及び下流配列は本明細書にお いて提供する情報を利用して容易に決定できうる。かかる配列は例えば５’−又 は３’−RACEを利用して伸長でき、そして相同組換構築体は単に日常的な実験に より作り上げられる。 内因性遺伝子の発現を改変する相同組換の利用は米国特許5,272,071、WO 91／ 09955，WO 93／09222，WO 96／29411，WO 95／31560及びWO 91／12650に詳細し てある。VII ．NBCCS（PTC）療法 Ａ）薬理組成物 本発明のNBCCSポリペプチド、NBCCSポリペプチドサブ配列、抗NBCCS抗体及び 抗NBCCS抗体−エフェクター（例えば酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬剤等 ）コンジュゲート又は融合タンパク質は予防及び／又は治療処置のための非経腸 、局所、経口又は局部投与のため、例えばエアロゾール又は経皮を介する投与の ために有用である。この薬理組成物は投与の方法に依存して様々な単位投与形態 で投与されうる。例えば、経口投与のために適切な単位投与形態には粉末、錠剤 、ピル、カプセル及びロゼンジーが挙げられる。NBCCSポリペプチド及び上記の 関連化合物は経口投与する場合、消化から守られていなければならない。これは 典型的にはタンパク質を組成物と組合せ、それを酸性又は酵素加水分解に対して 耐性にする ことにより、又はタンパク質をリポソームの如き適当な耐性担体の中に封じ込め ることにより達成される。タンパク質を消化から守る手段は当業界において周知 である。 本発明の薬理組成物は基底細胞癌腫、又はその前駆体、日光性角化症を処置す るための局所投与のために極めて有用である。別の態様において、この組成物は 非経腸投与、例えば静脈内投与又は体腔もしくは器官の腔への投与にとって有用 である。投与のための当該組成物は一般に薬理学的に許容される担体、好ましく は水性担体内に溶解されたNBCCSポリペプチド、抗体又は抗体キメラ／融合体の 溶液を含んで成る。様々な水性担体、例えば緩衝食塩水等を使用できる。これら の溶液は無菌であり、そして一般に所望されない物質を含まない。これらの組成 物は慣用の周知の滅菌技術により無菌にすることができうる。これらの組成物は 生理学的条件に近づけるのに必要な薬理学的に許容される補助物質、例えばpH調 節及び緩衝剤、毒性調節剤等、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カ リウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等を含みうる。これらの製剤における キメラ分子の濃度は幅広く変えることができ、そして主に流体容量、粘度、体重 等に基づき、選定の投与の特定の態様及び患者のニーズに従って選定されるであ ろう。 即ち、静脈内投与のために典型的な薬理組成物は患者につき１日当り約0.1〜1 0mgであろう。患者につき１日当り0.1〜約100mgの用量を、特に薬剤を血流では なく隔離部位、例えば体腔又は器官の腔の中に投与するときに利用されうる。か なり多めの用量が局所投与において可能である。非経腸投与用組成物の実際の方 法は当業者に周知又は自明であり、そしてRemington's Pharmaceutical Science 第15版Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania（1980）に詳しく記載 されている。 当該NBCCSポリペプチド、抗体又は抗体キメラ／融合体を含む組成物又はその カクテル（即ち、その他のタンパク質を有する）は治療的処置のために投与でき うる。治療的用途において、組成物は病気（例えばNBCCS又は基底細胞癌腫）に 苦しむ患者にこの病気及びその合併症を治癒又は少なくとも緩和するのに十分な 量で投与する。これを成し遂げるのに適切な量を「治療的に有効な量」と定義す る。この用途のために有効な量は病気の症度及び患者の一般健康状態に依存する であろう。 当該組成物の一回又は複数回の投与を患者に必要且つ寛容される用量及び頻度 に依存して施してよい。いづれにせよ、この組成物は患者を効果的に処置するの に十分な量の本発明のタンパク質を供与すべきである。 本発明のNBCCSポリペプチド、ポリペプチドサブ配列、抗−NBCCS抗体及び抗NB CCS−エフェクターキメラ／融合体の様々な用途にはとりわけ母斑様基底細胞癌 腫症候群及び／又は基底細胞癌腫により引き起こされる様々な病気の病状が含ま れる。好適な用途には、NBCCSの処置、特にNBCCSの発育異常特性の処置及び癌、 特に基底細胞癌腫の処置が含まれる。 Ｂ）細胞形質転換及び遺伝子治療 本発明はin vitro及びin vivoでの細胞の形質転換のためのパッケージ可能ヒ トNBCCS（PTC）核酸（cDNA）を提供する。これらのパッケージ可能な核酸は下記 の標的細胞及び生体のトランスフェクション及び形質転換のための任意の幾多の 周知のベクターへと挿入することができる。これらの核酸はex vivo又はin vivo で、ベクターと標的細胞との相互作用を介して細胞の中にトランスフェクション する。プロモーターのコントロール下にあるNBCCS cDNAはNBCCSタンパク質を発 現し、これによりNBCCS遺伝子のない作用又はNBC CS遺伝子の部分的不活性化又はNBCCS遺伝子の異常発現の作用が軽減される。 かかる遺伝子治療手順は数多くの関連の後天的又は生まれつきの遺伝子欠陥、 癌及びウィルス感染症を治療するのに利用される。ヒトにおいて人工遺伝子を発 現させる能力は多くの重要なヒトの病気、例えばその他の治療による処置では治 せない多くの病気の予防及び／又は治癒を促進させる。例えば、ヒト患者におけ るコレステロール調節遺伝子、HIVの複製を選択的にブロッキングする遺伝子及 び腫瘍抑制遺伝子は心臓病、AIDS及び癌それぞれの処置を劇的に改善する。遺伝 子治療については、Anderson，Science（1992）256:808-813;Nabel and Felgner （1993）TIBTECH 11:211-217;Mitani and Caskey（1993）TIBTECH 11:162-166;M ulligan（1993）Science 926-932;Dillon（1993）TIBTECH 11:167-175:Miller（ 1992）Nature 357:455-460;Van Brunt（1988）Biotechnology 6(10):1149-1154; Vigne（1995）Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36;Kremer and P erricaudet（1995）British Medical Bulletin 51(1)31-44;Haddadaら（1995）C urrent Topics in -Verlag，Heidelberg Germany;及びYuらGene Therapy（1994）113-26を参照のこ と。 細胞への遺伝子又は遺伝子材料の導入が病気の遺伝子療法処置における最初の 重要な段階である。数多くの導入法が当業界周知である。かかる方法には、例え ばリポソームを基礎とする遺伝子導入6(7):682-691;Rose米国特許5,279,833;Bri gham（1991）WO 91/06309;及びFelgnerら（1987）Proc.Natl.Acad.Sci．USA 84: 7413-7414)及びレトロウィルスゲノムの一部として治療用ポリヌクレオチド配列 をもつ複製欠陥レトロウィルスベクターが挙けられる（ 例えばMillerら（1990）Mol.Cell.Biol．10:4239(1990);Kolberg（1992）J.NIH Res．4:43、及びCornettaらHum.Gene Ther．2:215(1991)参照）。幅広く利用さ れているレトロウィルスベクターには、マウス白血病ウィルス（MuLV）、ギボン ザル白血病ウィルス（GaLV）、サル免疫不全ウィルス(SIV)、ヒト免疫不全ウィ ルス(HIV)、及びそれらの組合せが含まれる。例えばBuchscherら(1992)J.Virol ．66（5）2731-2739;Johannら(1992)J.Virol．66(5):1635-1640(1992);Sommerfe ltら(1990)Virol．176:58-59;Wilsonら（1989）J.Virol．63:2374-2378;Miller らJ.Virol．65:2220-2224(1991);Wong-StaalらPCT/US94/05700、及びRosenburg and Fauci（1993）Fundamental Immunology、第３版Paul(編)Raven Press，Ltd. ，New York及びその中の引用文献及びYuらGene Therapy（1994）前掲を参照のこ と。 AAVを基礎とするベクターも細胞に標的核酸を導入するため、例えば核酸及び ペプチドのin vitro生産並びにin vivo及びex vivo遺伝子治療において利用され る。 AAVベクターについては、Westら(1987)Virology 160:38-47;Carterら（1989） 米国特許4,797,368;CarterらWO 93/24641(1993);Kotin（1994）Human Gene Ther apy 5:793-801;Muzyczka（1994）J.Clin.Invest．94:1351及びSamulski（前掲） を参照のこと。組換AAVベクターの構築は下記を含む多くの公開物に記載されて いるLebkowski、米国特許5,173,414;Tratschinら(1985)Mol.Cell.Biol．5(11):3 251-3260;Tratschin、ら(1984)Mol.Cell.Biol．4:2072-2081;Hermonat and Muzy czka（1984）Proc.Natl.Acad.Sci．USA 81:6466-6470:McLaughlinら（1988）及 びSamulskiら(1989)J.Virol．63:03822-3828。rAAVにより形質転換される細胞は Lebkowskiら（1988）Mol.Cell.Biol．8:3988-3996に記載のもの である。 Ａ）細胞のex vivo形質転換 診断、研究又は遺伝子治療（例えば宿主生体への形質転換細胞の再注入を介す る）のためのex vivo細胞形質転換は当業者に周知である。好適な態様において 、細胞を被検生体から単離し、本発明のNBCCS遺伝子又はcDNAでトランスフェク ションし、そしてその被検生体（例えば患者）に再注入する。ex vivo形質転換 のために適当な様々な細胞タイプが当業者に周知である。特に好適な細胞は創始 又は幹細胞である（例えば、FreshneyらCulture of Animal Cells，a Manual of Basic Technique第３版Wiley-Liss，New York(1994)及び患者から細胞をどのよ うにして単離して培養するかを論じるその引用文献を参照のこと。 上述の如き、好適な態様において、このパッケージ可能な核酸は活性化又は構 成プロモーターのコントロール下でNBCCSポリペプチドをコードする。形質転換 細胞は機能的なNBCCSポリペプチドを発現し、それは欠陥又は異常NBCCS遺伝子発 現の作用を抑える。 一の極めて好適な態様において、幹細胞を細胞形質転換及び遺伝子治療のため のex-vivo手順において利用する。幹細胞を利用する利点はそれらがin vitroで 別のタイプの細胞へと分化しうること、又は哺乳動物に導入し（例えば細胞のド ナー）、そこでそれらが骨髄に融合しうる点にある。in vitroでCD34+を臨床学 的に重要な免疫細胞タイプへとGM-CSF，IFN-γ及びTNF-αの如きサイトカインを 用いて分化させる方法は公知である(Inabaら(1992)J.Exp.Med．176:1693-1702及 びSzabolesら（1995）154:5851-5861参照のこと)。 幹細胞は公知の方法を利用して形質導入及び分化のために単離される。例えば マウスにおいて、骨髄細胞はマウスを殺し、そして一 対のハサミでその足骨を切断することにより単離する。幹細胞は骨髄細胞をCD４+ 及びCD８+（Ｔ細胞）、CD45+（panB細胞）、GR-1（顆粒球）及びIad（分化型抗 原提示細胞）の如き不要な細胞に結合する抗体で洗うことにより単離する。この プロトコールの例については、Inabaら（1992）J.Exp.Med．176:1693-1702参照 。 ヒトでは、腸骨稜からの骨髄吸引は、例えば手術室で一般的な麻酔下で実施す る。骨髄吸引は約1000mlの量とし、そして前腸骨及び腸骨稜から集める。集めた 細胞の総数が約２×108／kgに満たないなら、前稜に加えて胸骨及び後腸骨稜を 利用して第二吸引を行う。手術中、２単位の照射パック赤血球を投与して吸引に より採取した骨髄の量を代替する。ヒト造血創始及び幹細胞はCD34表層膜抗原の 存在を特徴とする。この抗原は例えばCD34を結合せしめるアフィニティーカラム での精製のために利用する。骨髄を回収した後、単核細胞をフィコル勾配遠心分 離によりその他の成分から分離する。これは細胞セパレーター（例えばBaxter F enwal CS3000＋又はTerumo装置）を利用して半自動式方法により実施する。ほぼ 単核細胞より成る光学的に密な細胞を集め、そしてその細胞をプラスチックの中 で37℃で1.5時間インキュベーションする。付着細胞（単球、マクロファージ及 びＢ細胞）は捨てる。非付着細胞を集め、そしてモノクローナルCD34抗体(例え ばマウス抗体9C5)と４℃で30分、静かに回転させながらインキュベーションする 。抗CD34抗体の最終濃度は10μｇ／mlとする。２回の洗浄後、ヒツジ抗マウスIg G(Fc)抗体でコーティングした強磁性マイクロスフィア(Dyna Beads;Baxter Immu notherapy Group，Santa Ana，California)をこの細胞懸濁物に２の細胞／ビー ズの比で添加する。４℃で30分の更なるインキュベーション時間を経て、磁性ビ ーズによりロゼット型となった細胞をマグネットで集める。200Ｕ／mlの最終濃 度のキモパパイン(Baxte r Immunotherapy Group，Santa Ana，California)を加え、CD34+細胞からビーズ を遊離させる。他方、且つ好ましくは、CD34を結合せしめる、又はCD34に結合し た抗体を結合せしめるアフィニティーカラム単離手順を利用してよい（以降の実 施例３参照）。Hoら（1995）Stem Cells 13(付録13):100-105を参照のこと。ま た、Brenner（1993）Journal of Hematotherapy 2:7-17も参照のこと。 別の態様において、造血幹細胞を胎児臍帯血から単離する。Yuら（1995）Proc .Natl.Acad.Sci．USA 92:699-703にはレトロウィルスベクターを用いてヒト胎児 臍帯血由来のCD34+細胞の形質導入の好適な方法が記載されている。 Ｂ）in vivo形質転換 治療用核酸を含むベクター（例えばレトロウィルス、アデノウィルス、リポソ ーム等）はin vivoでの細胞の形質導入のために生体に直接投与することができ る。投与は分子を血液又は組織細胞に究極的に接触させるように導入するために 通常利用される任意のルートを介する。パッケージした核酸を任意の適当な手段 で、好ましくは薬理学的に許容される担体と一緒に投与する。かかるパッケージ した核酸を投与するのに適当な方法は当業者に周知であり、特定の組成物を投与 するのに複数のルートが利用できるが、特定のルートは往々にして別のルートよ りも即効性且つ有効な反応を供しうる。 薬理学的に許容される担体は投与すべき特定の組成物によりある程度、及び組 成物を投与するのに利用する特定の方法により決定される。従って、本発明の薬 理組成物の多種多様な処方がある。 経口投与用の製剤は（ａ）液体溶液、例えば水、食塩水又はPEG400の如き希釈 剤に懸濁された有効量のパッケージされた核酸；（ｂ）液体、固体、顆粒又はゼ ラチンとして所定量の活性成分をそれぞれ含むカプセル、サッシュ又は錠剤；（ ｃ）適当な液体中の懸濁物 ；及び（ｄ）適当なエマルションより成る。錠剤形態は１又は複数のラクトース 、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、コーンスター チ、ポテトスターチ、トラガカンス、微結晶セルロース、アカシア、ゼラチン、 コロイド状二酸化珪素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸 マグネシウム、ステアリン酸、及びその他の賦形剤、着色剤、充填剤、結合剤、 希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、風味剤、染料、崩壊剤、及び薬理学的に適合 性の担体を含みうる。ロゼンジー形態は風味料、通常はスクロース及びアカシア 又はトラガカンス中の活性成分を含んで成り、パスチルは不活性ベース、例えば ゼラチン及びグリセリン又はスクロース及びアカシアエマルション、ゲル等の活 性成分以外の当業界周知の担体中の活性成分を含んで成る。 パッケージされた核酸は、単独で、又はその他の適当な成分と組合さって、吸 入を介して服用するエアロゾール製剤にすることができる（即ち、それらは「噴 霧化されうる」）。エアロゾール製剤は加圧可能な噴射剤、例えばジクロロジフ ルオロメタン、プロパン、窒素等の中に入れてよい。 直腸投与のために適当な製剤には例えば座薬が含まれ、それはパッケージされ た核酸と座薬ベースとより成る。適当な座薬ベースには天然又は合成トリグリセ リド又はパラフィン炭化水素が含まれる。更に、ゼラチン直腸カプセルを使用す ることも可能であり、それはパッケージされた核酸と、ベース、例えば液体トリ グリセリド、ポリエチレングリコール及びパラフィン炭化水素との組合せより成 る。 非経腸投与、例えば関節内、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内及び皮下ルートに よる投与に適切な製剤には水性及び非水性、等張性無菌注射溶剤（それは酸化防 止剤、緩衝剤、静菌剤、及び意図する受 容者の血液と等張な製剤にする溶質を含む）、並びに懸濁剤、溶解剤、増粘剤、 安定化剤及び保存剤を含みうる水性及び非水性無菌懸濁物が挙げられる。本発明 の実施において、組成物は静脈内点滴、経口、局所、腹腔内、膀胱内又は鞘内に より投与できうる。非経腸投与及び静脈内投与が好適な投与方法である。パッケ ージした核酸の製剤は単位投与又はマルチ投与シール化容器、例えばアンプル及 びバイアルにおいて提供できる。 注射溶液及び懸濁物は上述の種類の無菌粉末、顆粒及び錠剤から調製できる。 ex vivo治療との関係で上記したパッケージされた核酸により形質導入された細 胞も上述の如き静脈内又は非経腸投与してよい。 本発明との関連での患者に投与すべき用量は経時的に患者において有利な治療 応答を及ぼすのに十分なものとすべきである。この用量は採用した特定のベクタ ーの効能及び患者の症状、並びに処置すべき患者の体重又は表面積により決定さ れるであろう。用量のサイズはまた特定のベクターの投与に付随する任意の副作 用の存在、性質及び程度、又は特定の患者における形質導入細胞タイプにより決 定されるであろう。 NBCCSのかかり易さもしくは発症、又は基底細胞癌腫のかかり易さもしくは発 症を処置又は予防するうえで投与すべきベクターの有効量の決定において、医師 はベクターの循環血漿レベル、ベクターの毒性、病気の進行及び抗ベクター抗体 の産生を評価する。一般に、ベクター由来の正味の核酸の用量等価は典型的な70 kgの患者当り約１μｇ〜100μｇであり、そしてレトロウィルス粒子を含むベク ターの用量は当量の治療的核酸を供するように計算する。 投与のため、本発明のインヒビター及び形質導入細胞は患者の総合的な健康に 応じインヒビター、ベクター又は形質導入細胞タイプ のLD-50、インヒビター、ベクター又は細胞タイプの様々な濃度での副作用によ り決定される割合で投与されうる。投与は一回又は分割投与を介して成し遂げら れうる。 好適な態様において、注入の前に、血液サンプルを得、そして分析用に保存す る。１×108〜１×1012個の形質導入細胞を60〜200分かけて静脈内点滴する。パ ルスオキシメトリーによる生命サイン及び酸素飽和をモニターする。血液サンプ ルを点滴の５分及び１時間後に採取し、そしてその後の分析のために保存する。 白血球搬出、形質導入及び再注入を２〜３ケ月毎に繰り返す。１回目の処置の後 、点滴は医師の判断において外来ベースで実施してよい。再注入を外来患者とし て与えるなら、参加者は治療後少なくとも４時間、好ましくは８時間モニターす る。 形質導入された細胞は、確立された方法に従って再注入のために調製される。 Abrahamsenら(1991)(J.Clin.Apheresis，6:48-53);Carterら(1988)(J.Clin.Aphe resis，4:113-117);Aebersoldら(1988)(J．Immunol.Meth.，112:1-7);Muulら(19 87)(J.Immunol.Methods 101:171-181)及びCarterら(1987)(Transfusion 27:362- 365)を参照のこと。約２〜４週間の培養の後、その細胞は１×108〜１×1012の 数になるはずである。これに関して、細胞の増殖の特徴は患者間で及び細胞型間 で種々である。形質導入された細胞の再注入の前約72時間に、表現型、及び治療 剤を発現する細胞の割合（％）の分析のためにアリコートをとる。 実施例 以下の例は詳述のために供され、本発明を限定するためではない。実施例１ ヒトPatched相同体のクローニング この例は、1172アミノ酸と予想されるタンパク質をコードし、ドロソフィラ（ Drosophila）パッチト（PATCHED）タンパク質と61％の配列同一性を示す完全な ヒトパッチトcDNAの単離を記載する。ドロソフィラ・パッチト(Drosophila patc hed )(ptc)は、ハエの発達の間の幼生の体節及び成中盤の正確なパターン形成の ために必要とされる体節極性遺伝子である（Nakanoら（1989）Nature 341:508-1 3;Hooperら（1989）Cell 59:751-765）。遺伝子研究によると、パッチト（patch ed）はホルホゲン・ヘッジホッグ（hedgehog）のシグナル経路の構成物である(B aslerら（1994）Nature 368:208-214;Capdevilaら（1994）EMBOJ．13:71-82;Ing ham（1991）Nature 353:184-187)。パッチトは膜貫通タンパク質であると予想さ れ、ヘッジホッグ応答細胞において発現されるので、それはヘッジホッグレセプ ターであると提唱されている（Ingham（1991）前掲）。 脊椎動物において、いくつかのヘッジホッグ（hedgehog）相同体が同定されて いる。それらの中で最もキャラクタライズされているソニック・ヘッジホッグ（Sonic hedgehog ）は、神経管の背側−腹側のパターン形成(Roelinkら（1994）Ce ll 76:761-775:Roelink(1995)Cell 81:445〜455)、体節の分化(Johnsonら（1994 ）Cell，79:1165-1173)及び肢芽の前−後軸の確立(Riddleら（1993）Cell，75:1 401-1416)に関連する。脊椎動物におけるいくつかのヘッジホッグシグナル形成 の生化学的基盤はほとんど理解されておらず、その分子について明らかにされた レセプターの欠損によりかなり妨げられている。 実験手順 コスミド単離 本研究に用いたコスミドは、YACクローンICI-2ef8(UK Human Ge nome Mapping Project Resource Centre)でスクリーニングすることによりヒト 第９染色体特異的ゲノムコスミドライブラリー(LLO9NCOI“P”，Biomedical Sci ences Division，Lawrence Livermore National Laboratory，Livermore，CA 94 550)から単離した。このクローンは、染色体9q22.3に局在化しているマイクロサ テライトマーカーD9S287を含む(Poveyら（1994）Ann.Hum.Genet.，58;177-250) 。YAC DNAの単離及びハイブリダイゼーションを、Vorechovskyら(1994)(Genomic s，21:517-24)により記載されるように行った。コスミドの局在化を、パルスフ ィールドゲル電気泳動により展開したYAC ICI-2ef8へのハイブリダイゼーション により確認した。PTCを含むコスミドクローンの96ウエルプレート形態は、42H11 ，96F9，218A8，226G7である。 ライブラリースクリーニング ヒトcDNAクローンを、標準的な手順を用いて、ラムダZAPIIファージベクター( Stratagene，La Jolla，California，USA)内の胎児脳cDNAライブラリーから単離 した。そのプローブを、ランダムプライミング（Redisrime，Amersharm）により 〔32P〕dCTPで標識した。陽性クローンを704ヘルパーファージ／pBluescript切 り出しシステム（Rapid Excision Kit，Stratagene）を用いて救援して配列決定 した。マウスゲルクローンを129SVラムダFixIIライブラリー（Stratagene）から 単離した。ファージDNAをEcoR Ｉで切断し、PTC特異的プローブとハイブリダイズ させた。マウスcDNAクローンを、ラムダgt10内で作製された11.5dpcマウス胚（S wiss male）から単離した。ハイブリダイゼーションを55℃で行った。陽性クロ ーンを、Not Ｉで消化したpBluescript II SK（Stratagene）にサブクローニグし た。 配列決定 配列決定のためのテンプレートを、プラスミド精製キット（Qiagen）を用いて 、救援したcDNAクローン及び／又はpBluescript KS(+)内にサブクローニングし たEcoR Ｉコスミドフラグメントの一晩の培養物から調製した。製造元の説明に従 って、Taq Dyedeoxy Terminator Cycle配列決定キット（Applied Biosystems） で配列決定を行った。配列決定反応を、ABI 373A自動シーケンサーで展開した。 GCGソフトウェアーを用いて配列決定分析を行った。NCBIネットワークサービス でBLASTサーチを行った。PTC配列を受託番号#U43148でGENBANKに寄託した。 ノーザンハイブリダイゼーション ヒトPTC mRNAの発現を、〔32P〕dCTPで標識したcDNAプローブを用いてヒト組 織ブロット（Clontech）のノーザンハイブリダイゼーションにより検査した。ハ イブリダイゼーション溶液は５×SSPE，10×Denhardt's溶液、100mg／ml変性せ ん断にしん精子DNA、50％ホルムアミド及び２％ SDSを含んでいた。２×SSC及び 0.1％ SDSで60℃で洗浄を行った。 染色体局在化 ヒトPTCの染色体局在化を、ヒト−ハムスターハイブリッド細胞から得たDNAパ ネルのPCR分析により同定した。そのパネルは、完全な染色体９ハイブリッド及 び9q22.3の欠失ハイブリッドの両方からなっていた。用いたプライマーは、PTC1 (5’-TTGCATAACCAGCGAGTCT-3’(配列番号：２))及びPTC2(5’-CAAATGTACGAGCACT TCAAGG-3’(配列番号：３))であった。ネズミPtcを、インタースペシフィックバ ッククロスマッピングによりマッピングした。そのパネルはJackson Laboratory （Bar Harbor，ME）により供され、クロス(C57BL／6J×M.speretus)×C57BL／6J からのBSBパネル及び相互バッククロス(C57BL／6JEi×SPRET／Ei)×SPRET／Eiか らのDNAで作 られた類似するBSSパネルである。プライマーW18F3(5’-CTGTCAAGGTGAATGGAC-3 ’（配列番号：４）及びW18R3(5’-GGGGTTATTCTGTAAAAGG-3’(配列番号：５))で のSSCP（一本鎖コンホメーション多形性）分析によりマッピングを行った。PCR 反応は〔32P〕dCTPの存在下で行った。それらサンプルを、1.5時間以内に、70ワ ットで４℃での６％アクリルアミドゲル(2.6％架橋)上で展開した。遺伝子の連 結は、分離分析により行った。 イン−シトウハイブリダイゼーション マウス胚に完全にマウントしたイン−シトウハイブリダイゼーション及び後の セクショニングを、Christiansenら(1995)(Mech.Dev．51:341-50)により記載さ れるように行った。マウスPtcプローブは、pBluescript II SK内にサブクローン 化した遺伝子の５’末端からの706bp Not Ｉ／Pst Ｉ cDNAフラグメントであった 。そのプローブをSacIIで直鎖状にし、15分、22℃での５Ｕ／mgのKlenowとのイ ンキュベーションによりオーバーハング平滑化し、そしてT7RNAポリメラーゼで 転写することによりアンチセンスRNAを合成した。 結果及び議論 ヒトPTC相同体のクローニング 本研究で用いたコスミドは、ヒト第９染色体特異的ゲノムコスミドライブラリ ーから、YACクローンICI-2ef8を用いて単離した。このクローンは、染色体9q22. 3に局在化しているマイクロサテライトマーカーD9S287を含む。コスミド42H11１ の1.8kb EcoR Ｉフラグメントの配列決定により、ショウジョウバエptcタンパク 質の３つの逐次的ストレッチと大きな相同性を有するオープン読み枠を作り出し た。プローブとして1.8kb EcoR Ｉフラグメントを用いて、完全なヒト及び部分的 なマウスPTC cDNA配列を単離した。 ヒトPTC cDNAの配列は、3888ヌクレオチドのオープン読み枠からなり、このヌ クレオチドを各々５’端及び３’端上の441及び2240ヌクレオチドについて配列 決定した（配列番号：１；図８）。ヒトPTC cDNAのオープンリーディングフレー ム1290アミノ酸と予想されるタンパク質をコードする。このオープンリーディン グフレームは、脊椎動物における翻訳開始共通配列に中程度に適合しているATG コドンにより開始される(PTCでGAGGCTAUGT(配列番号：６）対GCCGCCAUGG(配列番 号：７)(Kozak(1991)J.Biol.Chem ．266:19867-19870))。このコドンがタンパク 質の最初のアミノ酸をコードすると仮定すると、ヒトptcは相対分子量(Mr)131× 103の1296アミノ酸からなる。それは、そのショウジョウバエ対照的物と61％の 配列同一性を示す。ATGの上流では、そのオープンリーディングフレームは更に3 54ヌクレオチド伸長する（図８に示す配列の塩基対88で開始する）。３’非翻訳 領域は、標準的なポリアデニル化シグナル(AATAAA(配列番号：８))及びmRNA不安 定化ATTTA(配列番号：９)モチーフを含む。これらは各々、終止コドンの後1401 ヌクレオチド並びに547，743、及び1515ヌクレオチドに局在化する。 エキソン３からエキソン２ａにかけてスプライシングする他の転写物が観察さ れる。オープンリーディングフレームはエキソン２ａで終る（配列番号：59を参 照のこと）が、AUGは含まない。エキソン２は３つの異なる最初のエキソンのう ちの１つにスプライシングすることができる。エキソン１ｂ（配列番号：58を参 照のこと）は、マウスmRNAの開示される最初のエキソンと相同性があり、ORFの 前にATGを有する。エキソン１ａはその全体の長さを通してのORF及び潜在的なス プライスアクセプター部位を有する（例えば、配列番号：58を参照のこと）。エ キソン３は、エキソン１ｂ内で開始する１つのものを除いて、全ての転写物のた めの最初の枠内ATGを含 む。NBCCS（PCT）のプロモーター領域のマップを図31に示す。 ヒトPTCの全体のオープン読み枠のハイドロパシー分析（Kyteら（1982）J.Mol .Biol.，157:105-32）は、８つの主な疎水性ストレッチの存在を予測する。その 疎水性ブロックの分布は種の間で著しく十分に保存されており、このことはヒトPTC は、そのショウジョウバエ対照物と同様に、一体化した膜タンパク質である ことを示す。 PTC の染色体局在化 9q22.3上のヒトPTCの染色体局在化を、第９染色体ハイブリッド、及び9q22.3 の欠失ハイブリッド、ヒト−ハムスターハイブリッドDNAパネルのPCR分析により 確認した。用いたプライマー（PTC1，PTC2）はコスミド42H11の1.8kb EcoR Ｉフ ラグメントの配列から得た。プライマーPTC1はエキソン配列及びイントロン配列 からのPTC2から得られる。全てのDNAハイブリダイゼーション及びcDNA配列決定 データは、ヒトPTCが単一コピー遺伝子であることを示唆する。ネズミPtcは、ネ ズミFacc座に近い第13染色体の短い領域にマッピングされる(188の減少分裂以外 の組換えなし)。この領域は、マウス変異flexed tail（ｆ）及びプルキニエ細胞 退化（pcd）を含み、そしてそれはヒト9q22-q31とシンテニックである。ｆ及びp cd の両方は骨又は脳の細胞の異常な発達に関連し、そしてPtcに対して対立性で あり得る。 PTC の発現 ノーザンプロット分析は、検査した全てのヒト組織において５つの明白なPTC 転写物を示した。これらの転写物の発現は、異なって制御されるようである。マ ウス胚形成の間、Ptcの発現は、中線に沿って２つの分離したドメイン内の腹側 の神経上皮細胞内のE8.0dpc内で最初に検出される。発現は、9.5dpcを通して腹 側の神経細胞 内で持続し、そして転写物は神経管の周りの側部の間葉においても検出される。Ptc 転写は、体節の出現の直後にその中で検出され、発現の吻−尾勾配に従う。 体節発現は、各々の体節の中心側内の上皮細胞に制限される。Ptcの発現も、10. 0dpcから12.5dpcの各々の肢芽の背部外胚葉内で検出される。この領域はZPAを覆 う表面外胚葉に対応する。この期間のPtc発現の他の部位には、口咽領域に隣接 する鰓弓の内部表面、震毛のプラコードの周りの細胞及び生殖隆起の周りの細胞 を含む。 Ptcの発現パターンは、Ptcとモルホゲンのヘッジホッグファミリーとの間の密 接な関係を指摘する。この関係は、もとは、ショウジョウバエにおいて確立され た（Inghamら（1991）Nature，353:184-187）。脊椎動物において、最もキャラ クタライズされたhedgehog相同体であるソニック・ヘッジホッグ（sonic hedgeh og ）は、腹部の神経管円の底板及び運動ニューロンの誘導に(Jessellら（1990）Harrey Lece .，86:87-128;Yanadaら(1993)，73:673-686)並びに体節内の硬節に( Pourqurquieら（1993）Proc.Natl.Acad.Sci．USA，90:5242-5246)関連する。肢 芽内で、間葉の‘分極活性のゾーン’内のソニック・ヘッジホッグ発現は肢の前 −後パターン形成を誘発する(Riddleら（1993）Cell，75:1401-1410)。我々のデ ータは、脊椎動物PTCが、ソニック・ヘッジホッグの全ての主要な標的組織、例 えば腹側の神経管、肢芽の分極化活性のゾーンの周囲の体節及び組織内で発現さ れる。ソニック・ヘッジホッグ及びPtc発現パターンの著しい空間的相補性及び 経時的出来事は、両方の遺伝子が共通のシグナル伝達経路のメンバーであり得る ことを示唆する。 母斑様基底細胞癌腫症候群(NBCCS)遺伝子を含む領域内のPTCの局在化は興味を そそる。NBCCSは、影響を受けた個体を、皮膚の基 底細胞癌、髄芽腫及び種々の他の腫瘍にかかりやすくする常染色体性優性遺伝病 である(Gorlin（1987）Medicine（Baltimore）66:98-113)。現在の遺伝子研究は 、母斑様基底細胞癌腫症候群のための遺伝子を、染色体9q22.3のマーカーファン コーニ貧血相補性群Ａ(Farndonら（1994）Genomics，23:486-489)とD9S287（Per icak-Vance（1995）Ann.Hum.Genet.，59:347-365）との間に認めている。いくつ かの系続の証拠は、PTCが母斑様基底細胞癌腫症候群についての遺伝子の候補で あることを示唆する。Ptc発現は、NBCCS患者に一般に見い出される先天性欠損と 適合する。新生児及び幼児における頻繁な症候群は、脊椎及び肋骨の発達の異常 である（Gorlin（1987、前掲）。これらの奇形は、その発現が神経管及び体節の 発達と空間的及び時間的に同時におこるPTC欠損のためであり得る。更に、ZPA周 囲の表面外胚葉内のPtc発現は、NBCCSの患者においてしばしば観察される肢異常 と一致する（Gorlin（1987、前掲）。全ての成人の組織内でのPTC発現は、成人 のシグナル伝達経路におけるPTCの多面発現性の役割を指摘する。これらのシグ ナル伝達経路における欠損は、生後に発達する症状を説明することができよう。 実施例２ 母斑様基底細胞癌腫症候群におけるショウジョウバエ・パッチドのヒト相同体 の変異 母斑様基底細胞癌腫症候群(NBCCS)は、多発性基底細胞癌（BCCs）、手のひら 及び足裏のピット、あごの角化嚢胞、並びに種々の他の腫瘍及び発達異常を特徴 とする常染色体性優性遺伝子病である。NBCCSは、染色体9q22.3にマッピングさ れ、そして家族性及び散発性BCCは、この領域内のマーカーについてのヘテロ接 合性の損失を示し、その遺伝子が腫瘍サプレッサーであることで一致している。 実施例１は、ショウジョウバエ体節極性遺伝子に極めて相同性の高 いヒト配列（PTC）の単離を記載する。この例は、ヒトPTCがNBCCS患者において 影響を受けた多くの組織内で発現される。一本鎖コンホメーション多形性分析及 び配列決定は、その症候群の患者及び関連する腫瘍においてPTCの変異を示した 。そのデータは、ヒトPTCがNBCCS遺伝子でもあること、この遺伝子の発現の減少 がその症候群で観察される発達異常を導くこと、及びパッチト機能の完全な喪失 が特定の細胞型の形質転換の一因となることを示す。 実験手順 患者及びサンプル DNAサンプルを128のNBCCS血縁族における363の個体から収集した。患者を臨床 遺伝学者により検査し、そしてゴーリン症候群の診断を、その症候群の少くとも ２つの主要な特徴：例えばあごのシスト、手のひらのピット、多発性基底細胞癌 、及び典型的なゴーリン症候群の家族的病歴に基づいて行った。リンパ芽球系を 、82の血縁族の少くとも１の影響を受けたメンバーから作った。252の基底細胞 癌を、新鮮な又はパラフィンに浸した試料として収集した。 短い縦列重複多形性 連結分析及び腫瘍欠失研究において、Promega緩衝液(10mM Tris HCl，pH9，50 mM KCl，0.1％ Triton X-100)中に、100ngのテンプレートDNA、200ＭのdNTPs、1 .5mMのMgCl2、0.25mMスペルミジン、10pMの各々のプライマー、１Ciの32P dCTP （Amersham，Arlington Heights，Illinois，USA）、及び1.25ユニットのTaqポ リメラーゼ（Promega，Madison，Wisconsin，USA）を含む50μｌ容量内でPCR反 応を行った。Ericomp Dual Blockサーモサイクラーを25サイクルで次のパラメー タ：94℃で１分、55℃で30秒、72℃で２分にセットした。PCR産物を５％ポリア クリルアミドゲルで分析した。Kodak XARフィルムで−70℃でオートラジオグラ フィーを行った。 分類したNBCCS領域内の座を図１に示す。プライマー配列はGenome Data Base(ht tp://gdbwww.gdb.org)から利用できる。 パルスフィールド電気泳動（PFGE） 培養したリンパ芽球細胞を、約２×106／220-1ブロックの濃度でLMPアガロー ス(Bio Rad，Hercules California，USA)に埋め、そしてDNAを標準的方法に従っ て抽出した（Sambrookら、前掲）。４分の１のブロックを製造元（New England Biolabs，Beverly，Massachusetts，USA）により推奨される条件下でSacII，Mlu Ｉ，NotＩ，BssHＩ，NruＩ、及びSfiＩで消化した。75秒のパルス時間で200ボル トで20時間、１％アガロースゲルを用いてBioRad CHEF DR11で電気泳動を行った 。500kb下でのフラグメントのより高い分解能のため、25秒のパルス時間を用い た。 そのゲルを２分間、UV(６〜７mW／cm2)に露出した後、製造元の説明に従って ナイロン膜（Du Pont Gene Screen Plus，Du Pont，Co.，Boston，Massachusett s，USA）に移した。プローブを、ランダムプライム合成法（Boehringer Mannhei m Kit，Boehringer Manuheim Corp.，Indianapolis，Indiana，USA）により、dC T32P（Amersham）で約109DPM／ｇの比活性に標識した。0.5Ｍリン酸ナトリウム （pH7.2）７％SDS、１％ BSA、１mM EDTA及び200μｇ／mlニシン精子中で65℃で 18時間、ハイブリダイゼーションを行った。反復配列を含むプローブのために、 せん断し、音波処理したヒト胎盤DNA(Sigma Chemical Co.，St．Louis，Missour i，USA)をハイブリダイゼーション溶液(500μｇ／ml)に加え、フィルターへのハ イブリダイゼーションの前に45分間、65℃でプローブと予備会合させた。フィル ターを65℃で１％ SDSを含む0.1×SSCで洗い、12時間〜３日間、−70℃で増感紙 を伴うオートラジオグラフィーフィルムに露出した。異なるブロット上で同じよ うな大きさのフラグメントが検 出されたプローブを、同じブロットへのハイブリダイゼーションにより同時移動 するフラグメントについて直接比較した。使用と使用との間、室温で30分、0.4 ＮのNAOH内でブロットをはぎとった。 インシトウハイブリダイゼーションにおける蛍光 コスミドクローンを、ビオチン−11−dUTP、ジオキシゲニン−11−dUTP、又は それら両方でのニックトランスレーションにより標識し、抑圧条件下で中期及び 間期染色体にハイブリダイズさせた。ビオチニル化プローブを、５μｇ／mlのフ ルオレセインイソチオシアネート（FITC）接合アジジンDCSで検出した。ジオキ シゲニン標識プローブをロダミンにコンジュゲートした２μｇ／mlの抗ジオキシ ゲニルFabで検出した。その染色体を200mg／mlの４，６−ジアミジノ−２−フェ ニルインドール−ジヒドロクロライド（DAPI）で対比染色した。冷却CCDカメラ につなげた顕微鏡を用いて像を得た。デジタル化した像を処理し、仮着色し、マ ージして、シグナル間の距離を測定した。 コスミド及びBACスクリーニング グリッド化した染色体９コスミドライブラリー（LLO9NCO1）をナイロンフイル ター（Gene Screen Dupont Plus，Du Pont Co.）上に移し、Human Genome Cente r，Lawrence Livermore National Laboratoryの推奨に従ってスクリーニングし た。陽性の座標物を単一コロニーにストリーキングしてとり、PCR又はハイブリ ダイゼーションにより適切なマーカーを含むことを確認した。グリッド化したBA Cフィルターを、製造元の推奨(Research Genetics，Huntsville，Alabama，USA) に従って、ハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。コスミド及びBA CSにおけるキメラ現象の少い機会のため、コンティグ（contig）の末端からのフ ラグメントをヒト−ハムスター体細胞ハイブリッドのパネルでマッピングして染 色体9q22上 のそれらの局在化を確認した。 cDNA の単離 ４つの方法を用いて候補cDNAを単離した。直接的cDNA選択(Parlmooら（1991） Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，88:9623-9627)をコスミド及びBACのプールに適用し た。２回の選択の後、そのPCR産物をサイズ分画し、PCRII（Invitrogen，Leek N V，Netherlands)にクローン化した。形質転換体を96ウエルプレートにグリット 化し、レプリカフィルターを、ゲノムテンプレートDNAでプロービングして、正 確なゲル領域ハイブリダイズするcDNAを同定した。 Bucklerら(1991)(Proc.Natl.Acad.Sci．USA，88:4005-4009)により開発され、 後にChurchら(1994)(Nature Genetics，6:98)により改良された方法を用いてエ キソントラッピングを行った。５又は６のコスミドのプールのBamHＩ／GbIII消 化物をスプライシングベクターpSPL3b（Burnら（1995）Gene，161:183-187）のB amHＩ部位にクローン化した。トラップされたDNAを配列決定し、それらが得られ たコスミドとのハイブリダイゼーションによりNBCCS候補領域にマッピングした 。 HTF島クローニングのため、YACをパルスフィールドゲル電気泳動によりサイズ 分画し、そのゲルから切り出し、そしてBssHIIで消化した。次にベクターのリン カーを加え、ベクターのプライマー及び５’Aluプライマー（Valdesら（1994）P roc.Natl.Acad.Sci.，91:5377-5381）を用いてPCR増幅を行った。100℃で５分の 最初の変性の後、98℃で１分の変異、60℃で１分のアニーリング、及び72℃で３ 分の伸長で30の増幅サイクルを行った。10ユニットのTaqポリメラーゼを、50mM のKCl、10mMのTris pH9、２mMのMgCl2、0.1％のTriton及び200μＭのdNTPからな る全量100μｌ中に用いた。そのPCR産物を、それらの大きさを決定するために、 １％アガロー スゲル上で電気泳動し、次にショットガン法によりPGEMTベクター（Promega）に クローン化した。 配列サンプリングのため、染色体９特異的コスミド又はコスミドサブクローン の末端を直接配列決定した(Smithら（1994）Nature Genepics．7:40-47)。配列 決定はABI373DNAシーケンサーで行った。生じた端の配列を手動で切断し、単純 な配列反復について検査し、そしてDNA配列データベースを調査するのに用いた 。ヌクレオチド及びアミノ酸サーチの両方を行った。更に、配列を、GRAIL（Ube rbacher and Mural（1991）Proc.Natl.Acad.Sci．USA 88:11261-11265）により 潜在的なコード化領域について検査した。 上述の方法により得られた短いcDNAフラグメントを、脳及び表皮のcDNAライブ ラリーをスクリーニングすることにより、並びにcDNA端の迅速な増幅により伸長 させた（Marathon kit，Clontech，Palo Alto，California，USA）。 ヒトパッチド遺伝子のイントロン／エキソン構造 ヒトパッチド遺伝子のcDNAを貫通する約150bpの間隔でオリゴヌクレオチドを 選択した。コスミド226G7，42H11，55A16、又は96F9からPCR産物を作り出した。 25pmolの種々のオリゴヌクレオチドの組合せ、200μmolのdNTP、1.5mM，1.85mM 又は2.2mMのMgCl2、５ＵのTaqポリメラーゼを含む50μｌ容量内で反応を行い、9 4℃で30秒、55℃で30秒、及び72℃で2.5分の35サイクルで増幅した。いくつかの サンプルを、製造元の説明に従って、Expand Long Template PCRシステム(Boehr inger Mannheim)を用いてロングレンジPCRにより増幅した。PCR産物を１％アガ ロースゲル上に展開し、DNA精製キット(Jctsorh，Genomed，Bad Oeynhausen，Ge rmany)により単離した。PCRフラグメントの配列決定を、Taq Dyedeoxy Terminat or Cycle Sequencingキット（Applied Biosystems，Foster City， California，USA）で行った。配列決定反応をABI373A自動シーケンサーで解析し た。イントロンの位置を、予想されるスプライスドナー又はスプライスアクセプ ター部位により決定した。 変異検出 SSCP(Oritaら（1989）Ann.Hum.Genet．59:347-365)及びヘテロデュプレックス 分析(Whiteら（1992）Genomics，12:301-306)アプローチの組合せを、最適化条 件（Glavac及びDean（1993）Hum.Mutation，2:404-414）を用いて行った。DNAサ ンプル(100ng)を、1.5mM MgCl及び32P-dCTPを含むPCR緩衝液中で、94℃で30秒、 55℃で30秒、72℃で30秒の35サイクルで増幅した。産物を停止溶液中で１：３に 希釈し、95℃で２分、変性し、そして３μｌをゲル上に直接充填した。用いたゲ ル製剤は、１）６％アクリルアミド：Bis（2.6％架橋）、10％グリセロール、室 温、45Ｗ；２）６％アクリルアミド：Bis（2.6％架橋）、460Ｗ；３）10％アク リルアミド：Bis（1.3％架橋）、10％グリセロール 4.60Ｗ；４）0.5×MDE(ATG C Corp，Malvern，PA)、10％グリセロール 4.50Ｗであった。ゲルを３〜16時間 展開し(3600Vh／100bp)、乾燥させて２〜24時間、Ｘ線に露出した。ゲルの底で 二本鎖DNAからヘテロ二本鎖を同定し、一本鎖領域からSSCPを同定した。 サンプルが示すバリエーションを、対立遺伝子の分離を評価するために他のフ ァミリーメンバーと、又は腫瘍の場合、同じ患者からの正常なDNAと比較した。S SCP又はヘテロ二本鎖変異体を伴うPCR産物をシュニンプアルカリホスファターゼ 及びエキソヌクレアーゼＩ(United States Biochemical)で処理し、AmplitaqFST M (Perkin Elmer，Norwalk，Connecticut，USA)でサイクル配列決定した。その産 物をApplied Biosystemsモデル373DNAシーケンサーで分析した。結果及び議論 連結及び腫瘍欠失研究により詳細なマッピング 1992年の遺伝子のもとの研究から、連結研究はNBCCS領域をD9S180とD9S196と の間の４cMインターバルにせばめた(Goldsteinら（1994）前掲；Wickingら（199 4）Genomics，22:505-511)。Farndonら(1994)(前掲)は、D9S287の近くに試験的 においた影響を受けていない個体に関する組換えを報告した。 本実験は、３世代家族におけるD9S287とFACCとの間に１つの組換えを同定した 。組換え個体化、大頭症、斜視、及び前頭突起形成に基づいて影響を受けている と予想される1.5歳の女性であった。基底細胞癌腫、あごのシスト、及び手のひ らのピットのような症候群の主な特徴のいくつかは欠如しており；しかしこれら の特徴は年齢依存性の発現を有し、幼い間のそれらの存在は子供には予想されな いであろう。彼女が前記遺伝子を有すると仮定して、この家族における組換えはD9S287 の近くにNBCCSをおいた。 BCC内の対立遺伝子喪失は、D9S196とD9S180との間に遺伝子をおく連結マッピ ングと一致した。対立遺伝子喪失を伴う最も遺伝的な腫瘍は隣接するマーカー間 の全領域を欠失した。しかしながら、１つの遺伝性の心臓繊維腫はD9S287の喪失 を示したが、病気でない対立遺伝子上のD9S280はそうではなかった。このことは 、その遺伝子がD9S280に対して遠位に位置することを示す。散発性BCCにおいて は、D9S287を保持し、そしてより遠位のマーカーを喪失する４つの腫瘍が見い出 されたが、近位のマーカーD9S280を喪失するがD9S287はそうでない２つの腫瘍も 見い出された。 腫瘍欠失マッピングにおける、並びに腫瘍欠失及び連結研究の間の矛盾を説明 するためにいくつかの仮説を立てることができる。NBCCS以外の遺伝子はいくつ かの散発性腫瘍における対立遺伝子喪失 の原因であり得よう。NBCCSはほとんど確実に、遺伝子腫瘍の対立遺伝子喪失の 標的である。なぜなら、これらの腫瘍は、影響を受けていない親からのNBCCS遺 伝子の複製を常に喪失し、遺伝された変異を保持するからである(Bonitasら（19 94）Hum.Mol.Genet.，3:447-448)。第２の座が対立遺伝子喪失を導くなら、次に 影響を与けている親及び影響を受けていない親からの対立遺伝子が等しい頻度で 喪失されるであろう。しかしながら、基底細胞癌腫において両方とも重要である 染色体９ｑ上に２つの異なる腫瘍サプレッサーが存在し得る。APC遺伝子及びMCC 遺伝子は、例えば、両方とも、結腸癌内で変異され、染色体５ｑ上で互いに１Mb 以内にある(Hamptonら（1992）Proc.Natl.Acad.Sci．USA 89:8249-8253)。皮膚 の扁平上皮癌における、D9S180に関連するがD9S287には関連しない対立遺伝子喪 失の明白なパターンの観察結果は、9q22.3領域内の１超の腫瘍サプレッサーの存 在を支持する。更に、予想される腫瘍サプレッサーは、膀胱癌において9p21-31 にマッピングされており、そしてそれは、NBCCS遺伝子から区別することができ る(Knowlesら（1995）Br.J.Urol．75:57-66)。 第２の可能性は、D9S287の両側の領域がいくつかの腫瘍において欠失されてい るが、より近位の欠失は利用できるマーカーにより必ずしも検出されないことで ある。実際、２つの腫瘍はD9S127に対して近位及び遠位側の両方でマーカーを欠 失していることが観察されており、これはおそらく、腫瘍細胞における遺伝子不 安定性を反映する。最後に、NBCCSは、D9S287座の両側において伸長する大きな 遺伝子であり得よう。本明細書に供されるデータと組み合わせると、NBCCS遺伝 子が最もありそうな位置は、マーカーD9S280とD9S287との間であった。しかしな がら、腫瘍欠失における矛盾のため、D9S196とD9S180との間の全領域からの物理 的マッピング及びcDNA単離 は行わなかった。 物理的マッピング この領域からのマーカーを含む29のYACを、CEPH mega YACライブラリーから得 た。その18は、少くとも２倍過剰にD9S196とD9S180との間に、重複するcontigを 形成した。このcontigによると、隣接するマーカー間の最少の距離は1.5Mbであ ったが、実質的には全ての大きなYACがSTS定数で判断して内部の欠失を有した。 見掛け上欠失する傾向にある領域内を過剰にするためにICIライブラリーから更 なるYACを得た。コスミド及びBAC contigを周知のSTS及び遺伝子の周囲に作製し 、そしてその領域からの更なるコスミドを、YACをLawrence Livermoreグリッド 化コスミドライブラリーにハイブリダイズすることにより単離した。全部で800 を超えるこの領域に特有のコスミドを96ウエルグリッドプレートにグリッド化し 、BACSのcontig、PIs及び1.5Mbにわたるコスミドを作製した（図１）。YAC内の 欠失並びにコスミド及びBAC contigにおけるいくつかのギャップのため、クロー ン化領域を一体化するのにパルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）を用いた。こ の領域における制限フラグメントの大きさ及びFISH評価に基づいてD9S180からD9 S196 への物理的距離を、２Mb以上であると評価した。 cDNA の単離 Harshmanら(1995)(前掲)は、ゲノム領域からcDNAを同定する異なる方法は、候 補遺伝子の驚くほど異なるアレイを生ずることを示した。染色体9q22に位置づけ る遺伝子を見い出すために、コスミドのサンプル配列決定、エキソントラッピン グ、HTF島クローニング、及びBAC及びコスミドからのcDNAの直接的選択を含むい くつかの方法を用いた。更に、この概略的な領域にあることが知られている遺伝 子を認識できる9q22欠損(NIGMS庫に与えられたもの)、YAC co ntig、及びFISHを有する２人のNBCCS患者から作った体細胞ハイブリッドの使用 によりより細かくマッピングした。GENBANKにおける配列の10の遺伝子、10のEST 、及び31の未知の選択されたcDNAフラグメント、HTF島クローン、及び未知の相 同性を有するトラップされたエキソンを同定した（表１）。 ジャームライン欠損又は再配列についての患者のスクリーニング 染色体9q22は極めて遺伝子が豊富であるように見えたので、患者の超微視的再 配列について調査することにより、より正確にNBCCS遺伝子を突きとめる試みを 行った。D9S196とD9S180との間の領域を約100〜200kb間隔で貫く15のコスミドと 82の無関係のNBCCS患者のPFGEブロットにハイブリダイズした。更に、その間隔 にマッピングされることが知られている遺伝子からのプローブ及び本研究の過程 で同定されたものをこの分析に含めた。３人の患者においてファンコニ貧血相補 群Ｃ（FACC）遺伝子内からのゲノムプローブでPFGE変異体を同定した。３つ全て が正常より約30kb短いSacIIバンドについてヘテロ接合であった(310対280kb)。P FGEの分解能は約10kbであったので、見掛け上同一な変異SacIIバンドが正確に同 じ大きさであるか否かを決定することはできなかった。NotＩ，BssHII，MluＩ， SfiＩ、及びNruＩを含む他の制限酵素は変異バンドを示さなかった。それら変異 体はこれらの患者のジャームライン欠損と一致しなかったが、新しい制限部位を 作り出す点変異又は他の小さな変換、例えば多くの血友病患者のF8C遺伝子内に 見られる再発性の逆位により引きおこされると考えられよう（Lakichら（1993）Nat ．Gene tics，5:236-241）。 PFGE上にこれらの変化を引きおこすDNA変換の性質はまだ解明されていないが 、それらを病気に関連づけるデータは人を動かさずにはおかない。変異を有する 患者のうち２人の家族は研究のために利 用できなかった。しかしながら、第３の患者はNBCCSの散発性の場合であり、い ずれの親もSacII変換を有していなかった。患者において変異が発見されたが彼 女の両親からは発見されなかったことは、FACC近くのいくつかのCGの豊富な領域 の過剰な変異性の結果であると考えることができるが、100を超える正常な染色 体のPFGEブロットにおいてこの領域内に変異は同定されなかった。 表１．染色体9q22.3上のNBCCSからのcDNAクローン サンプル配列決定、エキソントラッピング、HTF島クローニング又はcDNA選択 により同定した、新規クローン又は染色体９ｑに先にマッピングされていないク ローン。 ＋31の無名の選択されたcDNAフラグメント、HTF島クローン、並びにYAC及びコ スミドプールからのトラップされたエキソンc aGenome DataBase(http://gdbwww.dgw.org/gdb)に寄託した周知の遺伝子及び 無名のcDNAについて、標準的な座の命名法を用いる。GDB番号のないESTについて 、WIはWhitehead Instituteクローン（http.//www.genome.wi.mit.edu）を示す 。 b利用できるNCHR受託番号は無名のESTについて括弧で示す。更なる情報は、ht tp://www.negr.org/gsdbで得ることができる。 c無名のcDNAのいくつかが同じ遺伝子の異なる部分を示すか否かを決定するた めには更なる配列データが必要とされるであろう。 候補の遺伝子としてのPTCの評価 変異PFGEバンドがFACC領域及び１つの組換え体内で同定され、腫瘍欠失研究は 、このマーカー近くの可能性のある位置を示唆したので、この領域にマッピング された候補cDNAを検査した。FACC自体は候補として考慮しなかった。なぜならこ の遺伝子内のヘテロ接合変異はNBCCSを引きおこさないからである(Strathdeeら （1992）Nature，356:763-767)。FACC及びPTC(ドロソフィラ・パッチトと高い相 同性を有する新規ヒト遺伝子)は、同じ650kb NotＩフラグメント並びに675kb及 び1000kb(部分的)MluＩフラグメントはハイブリ ダイズした。マウス種間戻し交雑分析は、190の減数分裂以外でPTC及びFACC遺伝 子の間での組換え体は存在しないことを決定した。PTC及びD9S287は、両方とも 、350kbの大きさを有するICI YAC 2EF8上に存在し、このことはPTCがD9S287とFA CC との間にあることを示唆する。 PTC遺伝子内の変異についてスクリーニングするために、その遺伝子のイント ロン／エキソン境界を、遺伝子クローン及びロングレンジPCR産物から決定した 。PTCは21のエキソンからなり、その遺伝子は約34kbにわたる（図２）。無血縁N BCCS患者及びBCCのパネルを、一本鎖コンホメーション多形性（SSCP）分析によ りスクリーニングした（PTCエキソンの増幅のために用いたプライマーを表２に 示す）。変異を示す患者を、同じ種の影響を受けていない個体と比較し、そして 影響を受けた個体においてのみ見い出される変異体を、DNA配列決定により更に キャラクタライズした。非血縁患者において同定された変異のうち、４つはフレ ームシフトを生じる欠失及び挿入であり、２つは時期尚早の停止を導く点変異で あった（表３、図４及び５）。PTCの変異と病気との間の関係を確認する更なる 発見は、彼女の影響を受けていない両親のいずれにも存在しない散発性NBCCS患 者におけるフレームシフト変異の同定であった。 新生物中のPTCの役割を分析するために、その症候群に関連する腫瘍と変異に ついてスクリーニングした。NBCCS領域の対立遺伝子喪失を伴う２つの散発性基 底細胞癌は、残っている対立遺伝子の変異を不活性化していた（図６及び７）。 ほおから除去した腫瘍は、UVB変異誘発に典型的なCCからTTへの変換を有してい た。鼻からの２番目の腫瘍は、いずれの特定の環境にも関係し得ない変異である 14bpの欠失を有していた。染色体9q22の対立遺伝子喪失を示さないいずれの散発 性BCCにおいても変異はまだ同定されておらず、他の 態様の病因がこれらの新生物において作用し得る。 表２．PTCエキソンを増幅するためのプライマー aエキソンの位置をヒトcDNA配列(GENBANK #U43148)のナンバリングに従ってbp で示す。５’端がまだ定義されないエキソン１ａを除いて全ての場合においてエ キソンの大きさは周知である。 bプライマーの配列は５’−３’である。エキソン18及び19の間には45bpのイ ントロンがあり、それら両方のエキソンはプライマーF11及び21Rで増幅される。 アップデートされたプライマー配列及びPCR条件は無名のFTPにより利用できる（ contact dean @fcrfv2.ncifcrf.gov）。 c最後のコロンの最後のbpの位置 表３． PTC遺伝子における変異 aNBCCS、症候群の患者のジャームライン変異； BCC、基底細胞癌における体 細胞変異。 bＦ，家族性；Ｓ，散発性 議論 これらの例は、ショウジョウバエ・パッチドのヒト相同体であるNBCCS遺伝子 （PTC）の変異が母斑様基底細胞癌腫症候群を引きおこす強力な証拠を供する。P TC 遺伝子産物を不活性化すると予想される変換を、６の非血縁NBCCS患者におい て見い出した。フレームシフト変異は２人の散発性患者において見い出されたが 、それらの親においては見出されず、そしてその症候群において見られる型の２ つの散発性の腫瘍において体細胞変異を同定した。PTCと類似した配列を有する 周知のヒト腫瘍サプレッサーはなく、機能的には、PTCは新規の型の新生物関連 遺伝子を示し得る。 分化及び発達におけるドロソフィラ・パッチト遺伝子 パッチド遺伝子はハエから哺乳動物まで保存されているシグナル伝達経路の一 部である。ショウジョウバエ遺伝子（ptc）は、セグ メント極性において重要な役割を果たす膜貫通糖タンパク質をコードする(Hoope r及びScott(1989)Cell 59:751-765;Nakanoら（1989）Nature 341:508-513)。ptc の多くの対立遺伝子は体節境界の鏡像重複及び体節の残りの喪失を伴う胚の致死 的表現型を作り出すが(Nusslein-Volhardら（1980）Nature 287:795-801)、ハイ ポモルフ対立遺伝子は翼（翅）前方部分の過剰な成長、肋骨構造の喪失、及び翼 の静脈の欠失を伴う生存能のある成熟体を作り出す（Phillipsら（1990）Develo pment 110:105-114）。遺伝子及び機能的研究は、ptcの野生型機能の１つがWht 及びTGF-b遺伝子ファミリーのメンバーの転写抑制であることを示している(Ingh amら(1991)Curr．Opinion Genet．Develop．5:492-498;Capdevilaら（1994）EMB O J．13:71-82)。この抑制のメカニズムは未知であり、ptc活性の多くの他の下 流的な標的が存在し得る。 ptcの機能は、ヘッジホッグ遺伝子ファミリーのメンバーの機能により妨害さ れる。ショウジョウバエでの研究は、ヘッジホッグ（hh）が、ptc抑制性遺伝子 とptc自体との両方を転写的に活性化するよう機能する分泌される糖タンパク質 であることを証明している（Tabata及びKornbernic（1994）Cell，76:89-102;Ba sler及びStruhl（1994）Nature，368:208-214）。これにより、所定の細胞型に おいて標的遺伝子の活性は隣接する細胞とptc活性化とからのヘッジホッグシグ ナル伝達間のバランスから生ずる。 パッチドの哺乳動物相同体 本発明のショウジョウバエ・ptcのヒト相同体（PTC）は、ショウジョウバエ遺 伝子に対してヌクレオチドレベルにおいて67％以下の同一性を、及びアミノ酸レ ベルにおいて61％以下の同一性を示す。ハイブリダイゼーションを用いても、ハ エタンパク質に対する抗体で発現ライブラリーをスクリーニングすることによっ てもヒト相 同体の同定は困難であった。今日、パッチトは哺乳動物において単一コピーであ ることを提案する。 胎児脳cDNAクローンの分析、及び表皮のRNAでのRAした実験は、ヒトPTC遺伝子 についての２つの異なる５’端の存在を示した（図３）。２つのヒト配列は同じ 位置においてマウスPTC cDNA(８dpc胚RNAからのもの)から分かれ、そしてマウス Ｎ末端は、ドロソフィラ及びＣ．エレガンス（C ．elegans）タンパク質により密 接に適合する。Ｃ．エレガンスの上流ゲノム配列の分析は、２つのかわりのヒト 末端とどれだけの相同性を示すかに失敗した。これらのデータは、哺乳動物細胞 において少くとも３つの異なる形態のPTCタンパク質：ネズミ配列により示され る先祖的形態及び２つのヒト形態が存在することを示唆する。ヒト形態の１つに ついての最初の枠内メチオニンコドンは３番目のエキソン内にあり、このことは 、mRNAのこの形態がＮ末端がトランケートされたタンパク質をコードするか、又 はかわりの開始コドンを用いることを示唆する。第２のヒト形態は、５’末端に 伸びるオープン読み枠を含み、そしてまだ単離されていない上流配列により開始 され得る。PTCタンパク質のいくつかの可能性ある形態の同定は、単一PTC遺伝子 は異なる経路において適切に役割を果たし得るメカニズムを供する。Ptc mRNAの 異なるスプライス形態の制御を決定することが重要であろう。なぜならそれらは 胚の発達と成熟細胞の成長制御との両方においての遺伝子の見掛けの役割を解明 し得るからである。 成人のヒトのPTCは広範囲で発現される。腎臓、肝臓、肺、脳、心臓、骨格筋 、膵臓、及び皮膚において多くの転写物が見い出される。ネズミの発達の間、Pt c は中線に沿った２つの別個のドメインにおける腹側の神経上皮組織内で8.0dpc において最初に発現される。更に9.5日目までに、神経管周囲の間葉において転 写物が検出さ れる。吻−尾勾配において発達中の体細胞内で発現が見られる。10.0日目から12 .5日目には、各々の肢芽の後方の外胚葉において転写物が存在する。この期間に 発現する他の部位は、咽頭弓の内部表面、震毛のプラコードの周囲の細胞、及び 生殖丘を含む。 ショウジョウバエ・ヘッジホッグ（hh）のいくつかの相同体が脊椎動物におい て同定されており、ショウジョウバエ遺伝子のように、発達の間のパターン形成 に関連しているようである。これらの最も進んだ研究はソニック・ヘッジホッグ （Shh）においてである。マウスにおいて、Shhの発現は通常、脊索及び神経管の 重なった底板領域において検出される（Echelardら（1993）Cell 75:1417-30） 。脊椎動物における中線シグナル伝達とは別に、Shhはいくつかの他の組織、例 えば発達中の肢においても発現され、そこではShhは通常、分極活性のゾーン(ZP A)の活性を媒介するようである。 ネズミPtcの発現はShhシグナルに応答することが知られている種々の組織内で 見い出される。詳細な発現分析は、発現のパターンがShh発現の変化に密接に従 うことにより隣接する非重複組織において転写物が最も見つけられることを示し た。PtcはShhシグナル伝達のために必要とされ得、そしてhh ／ptc相互作用は進 化の間、保存されているようである。ハエにおいてと同様に、マウス内のPtc転 写に隣接hhシグナルの指標であるようである。従って、Ptc発現の周知の部位とN BCCS表現型との間の関係を解釈する時、ヘッジホッグ遺伝子ファミリーメンバー の発現パターンを考えることが価値あるものであり得る。なぜならそれらは、特 に成熟体組織において、ptcより脊椎動物においてかなりより詳細にキャラクタ ライズされているからである。 遺伝的に及び機能的にPtcがhhシグナルに応答することは明らかであるが、そ の構造はそれが明らかなhhレセプターであることを示 さない。むしろ、Ptcは、運送体であり得、そしてその基質は標的遺伝子の転写 を制御する分子である。 新生物におけるPTCの役割 本研究に供されるデータは、NBCCS遺伝子が腫瘍サプレッサーとして機能する ことを強く示唆する。これらの例は、NBCCS表現型の基礎をなすジャームライン 変異が不活性化を行い、それゆえ遺伝性腫瘍はその遺伝子の機能的複製を有さな いことを示す。更に、これらの例は、散発性細胞癌(DCC)がその遺伝子の両方の 複製の体細胞の喪失と共に生じ得るという第１の直接的証拠を供する。症候群に 関する他の腫瘍におけるPTCの役割は研究され続けている。 ショウジョウバエにおけるptc抑制の２つの周知の標的は、細胞間コミュニケ ーションに関連する遺伝子ファミリーを示し、そして細胞シグナル伝達は、ptc が腫瘍サプレッサーとして機能し得る可能性あるメカニズムを供する。ptc経路 は現在、ドロソフィラ・mad(dppに対する母)に似た配列を示す膵臓腫瘍サプレッ サー遺伝子DPC4(Hahnら（1996）Science 271:350-353)のクローニングにより腫 瘍形成に関与していると考えられている。mad遺伝子は、ptcにより特異的に抑制 されるショウジョウバエTGF-b相同体であるdppと相互作用する。 BCCの源の細胞は、かなり争いがあり、現在の理論は、周期を示すが大きな増 殖能力は示さない始原“幹細胞”を仮定する(Miller（1991）J.Am.Acad.Dermato l．24:161-175)。時折の細胞分割を通して、最終的な分化に移る前に更に増殖す る“一時的に増幅する細胞”が形成される。皮膚におけるパッチト及びヘッジホ ッグファミリーメンバーの発現は知られていない。ドロソフィラにおいて、ptc は、細胞接着点に似た膜領域において見い出され、それはPS２インテグリンと同 時局在化する。このことは、ヒト相同体は、通常、 細胞／細胞相互作用に基づく上皮の分化において役割を果たし得ることを示唆す る。ドロソフィラptcタンパク質のこれらの領域への正確な局在化は、分極した 上皮シート内の細胞の相互作用にもより、観察結果も細胞接着製造におけるptc についての役割を支持する（Capdevilaら（1994）Development 120:987-998）。 現在の発見は、BCCが、ヘッジホッグシグナル伝達に関連する増殖性及び細胞／ 細胞コミュニケーション遺伝子の過剰発現を導く細胞内PTCシグナル伝達を欠如 することを示唆する。あるいは、PTCが細胞／細胞相互作用において直接的役割 を有するなら増殖はこのレベルでの破壊からおこり得る。 発達異常におけるPTCの役割 マウスにおけるPtcの胚の発現への類似性により、NBCCSの特徴の多くは、発達 中のヒト胚におけるPTCの発現の予想される部位と相関し得る（表４）。例えば 、肋骨、椎骨及び肩に関する骨の異常は、体節内でのPCT発現の破壊によること が最もらしい。マウス胚において、Ptc発現は後に硬節を形成する領域である体 節の腹側−中央細胞において検出される（Hahnら（1996）前掲；Goodrichら（19 96）Gene Dev．10:301-12）。更に、Shhは脊索からの長期シグナル伝達による硬 節の誘導に関連している(Fanら（1995）Cell 81:457-465)。 表４．マウスPtc発現及びヒトNBCCS表現型 NBCCS患者のサブセットにおいて観察される多指症は、発達中のネズミの肢の 発現と相関するようである（Hahnら（1996）前掲；Goodrichら（1996）前掲）。 実際のメカニズムは未知のままであるが、肢の前後パターン形成がZPAからのShh シグナル伝達により制御されることは明らかなようである。早期のマウスの肢芽 において、Ptc発現はShhと相関するが、より遅い段階においては、インディアン ・ヘッジホッグ(Indian hedgehog)(Ihh)を発現する細胞の近くの細胞における指 の圧縮体の近くで発現が検出される（Goodrichら（1996）前掲）。それゆえ、NB CCSにおいて存在する多指症は、PTCの調節による肢パターン形成の乱れから生じ 得る。同様に、少い割合のNBCCS患者における固定された親指の発生は、野生型P TC 機能への改変と一致する。 頭蓋顔面異常形態は咽頭弓及び導かれる構造におけるPTCの発現と相関する。N BCCSの共通の特徴であるあごの角化症及び歯の異常形成は、歯の芽状突起及びエ ナメル節におけるPtcの観察された発現によりもっともらしく説明される（Vaaht okariら（1996）MOD，5 4:39-43;Goodrichら（1996）前掲）。あごのシストの病因はほぼ確実に、発生学 的な歯の前駆体に関係する。角化症の上皮のライニングは歯の芽状突起の前駆体 である歯層の異常型誘導体から生ずると思われる。始原細胞は、その層の発達の 間、異常な様式で移動し、又は発達の適切な段階で退縮しないことであり得る。 NBCCSの神経学的構成物、例えば脳梁、網膜欠損、及びおそらく斜視及び大脳 症は発達中の脳及び神経系におけるPtcの発現と一致する。症候群において時折 見られる精神遅滞は、隣接遺伝子欠損により引きおこされ得る。 腫瘍サプレッサーの作用についての伝統的な２−ヒットモデル(Knudson（1971 ）Proc.Natl.Acad.Sci．USA，68:820-823)下において、この型の遺伝子のヘミ（ 半）接合不活性化により引きおこされる症候群における発達欠損の発見はパラド ックスを構成する。なぜなら、ただ１つのコピーの喪失は細胞の機能にほとんど 又は全く影響を与えないと考えられるからである。NBCCSにおける別個の欠損の いくつか（例えば潜在性脊椎披裂、二裂の肢、及びあごのシスト）は、２−ヒッ トメカニズムにより説明することができる。癌素因的症候群における新生物と同 様に、これらの欠損の多くは増殖し、ランダムなパターンで現れるが、同じ型の 単離された欠損は、一般的な集団において時折見られる。これらの異常は、異常 なマイグレーション又は分化を導き、又はおそらくプログラムされた細胞死を行 わない関連組織の早期始原細胞におけるPTCのホモ接合的不活性化から生じるの かもしれない。対立遺伝子喪失の研究は、実際、あごの角化症は、NBCCS遺伝子 のホモ接合的不活性化と共に生ずるクローン異常であることを示している(Levan atら（1996）Nat.Genetics 12:85-87)。しかしながら、一般化された、又は相称 的な特徴、例えば過剰成長、大脳症、及び顔の異常形態はほとんど確実に、 ２−ヒットパラダイムを許容せず、おそらく不十分な半数分裂のためである。NB CCS患者に見られる発達上の欠損の多くは胚の発達の間の量にセンシティブな経 路の乱れから生ずるようである。これらの観察結果に基づくと、１つの予想は、 ヘテロ接合Ptc“ノックアウト”マウスは比較的弱度の発達異常を示すであろう こと、及び皮膚へのUV照射は多発性基底細胞癌を引きおこすであろうことである 。 NBCCS における表現型バリエーション NBCCSはほぼ100％の浸透度の疾患であるが、その特徴の多くは種々の発現を示 す。ショウジョウバエにおける興味ある相関関係は、非致死性の対立遺伝子につ いてホモ接合のハエは、表現型の特徴の発現において著しく多様性を示すことで ある。これらのハエは同遺伝子型であるので、その表現型の差は、異なる基礎を おく変異又は改変性遺伝子により説明することができない（Phillipsら（1990） 前掲）。おそらくその多様性は確率的な効果である。 ファミリー間よりファミリー内でヒトNBCCS表現型のより大きな類似性がある こと（Andersonら（1967）前掲）は、ある程度の遺伝子型／表現型相関が存在し 得ることを示唆する。現在、NBCCSにおける変異分布の明らかに規定されたパタ ーンはなく、これまで見い出された全ての変異はPTCタンパク質のトランケーシ ョンを引きおこすと予想される。BRCA1末端変異を有するファミリーにおいて、 卵巣癌は５’変異の患者においてより共通する。それはおそらく、変異ペプチド は、特定の細胞型において特定の野生型機能を保持し得るが、他の細胞型ではそ うでないからである(Gaytherら（1995）Nature Genetics 11:428-433)。 実施例３ NBCCS におけるPtcジャームライン変異のキャラクタリゼーショ ン 材料及び方法 DNA抽出 歯原性角化症組織を、0.5％ｗ／ｖ SDS、１μｇ／μｌプロティナーゼＫを含 む200μｌのSTE緩衝液(50mM NaCl；10mM Tris-HCl，pH8.0；１mM EDTA)内に入れ 、37℃で24時間、インキュベートした。95℃で15分のプロティナーゼＫの不活性 化の後、PCRのために１〜５μｌ（約25ng DNA）のサンプルを用いた。構成的DNA を、標準的なDNA抽出手順を用いて末梢血液リンパ球又はほおの上皮細胞から得 た。PCRのために約25ngのDNAを直接用いた。 Genbank 受託番号 PTCH遺伝子についてのDNA配列データは、受託番号U43148及びU59464で利用で きる。この例に用いたヌクレオチドのナンバリングは配列U43148に相当し、アミ ノ酸残基のナンバリングはU59464に相当する。 PTCH遺伝子のPCR-SSCP分析 パッチト遺伝子を含む23のエキソンの各々を、Hahnら(1996)(前掲)に記載され るアニーリング条件を用いて別個に増幅した。要約すると、約25ngの標的DNAを 、50mM KCl；10mM Tris-HCl（pH9.0）；1.5mM MgCl2；0.1％ ｖ／ｖ Triton X-1 00；200mMの各々のdATP，dGTP，dTTP、20μＭのdCTP；10ピコモルの各々のプラ イマー；10μCiの〔α32P-dCTP〕及び1.0unitのTaq、DNAポリメラーゼ(Promega ，UK)を含む30μｌの１×PCR反応緩衝液中で増幅した。35サイクルの増幅の後、 ５μｌのPCR産物を35μｌの10mM EDTA、0.1％ｗ／ｖ SDSに加えた。この２μｌ を、95％ｖ／ｖ脱イオンホルムアミド／20mM EDTA／0.05％ｗ／ｖブロモフェノ ールブルー／0.05％ｗ／ｖキシレンシアノールを含む２μｌのローディング緩衝 液 に加え、５分間、100℃に加熱して、氷上で反応を止め、５％ｖ／ｖグリセロー ルを含む１×TBE／６％ｗ／ｖ非変性ポリアクリルアミドゲル（５％ ｃ）に充填 した。350Ｖで18時間、電気泳動を行った。ゲルを真空で乾燥させて、増感スク リーンで室温で16時間、オートラジオグラフィーを行った。 制限SSCP エキソン14及び17の増幅により得たPCR産物を、SSCP分析の前に、各々Alu Ｉ及 びHinf Ｉで制限酵素消化した。10μｌ PCR産物のアリコートを、製造元の説明に 従って全量20μｌの１×反応緩衝液中で消化した。制限酵素で消化したPCR産物 ２μｌを２μｌのローディング緩衝液と混合し、上述のようにSSCP分析にかけた 。 PTCH エキソンのDNA配列決定 SSCP分析により移動度が変化したエキソンのPCR産物を、市販のカラム(Wizard PCRカラム、Promega)を用いて精製した。PCR産物を20μｌのTEに溶出し、２μ ｌを、製造元の説明に従って、DNA Thermosequenase(Amersham International p lc)サイクル配列決定のために用いた。配列決定プライマーを、Ｔ４ポリヌクレ オチドキナーゼを用いて、γ32P-ATP(3000Ci／mmol)で末端標識した。DNA配列決 定反応物を、2000Ｖで２時間、６％ｗ／ｖポリアクリルアミド／８Ｍ尿素／１× TBEゲルで分画した。ゲルを真空下で乾燥させて、増感スクリーンで室温で８時 間、オートラジオグラフィーを行った。 結果 全部で16のNBCCS患者からの角化症DNAを、SSCP-PCRによりスクリーニングした 。電気泳動での移動度が変化した10の単一エキソンPCR産物を検出し、DNA配列決 定分析により更に分析した。更に、多重サンプル（即ち共通の多形性を示すもの ）における可変性のバ ンドも、４つのエキソンを含むPCR産物の中で見られた。 SSCP可変性バンドを示すPCR増幅したエキソンの直接的なDNA配列決定の後に、 ４つの変異を同定した。残りの６つの可変性PCR産物においては変異は検出でき なかった。それゆえ、変異が最初に同定されなかったサンプルからの全部で23の エキソンを増幅し、それらの全体を配列決定した。しかしながら、この方法によ り１つだけの異なる変異が観察されただけであった。 エキソン５ 693insC 42歳の男性NBCCS患者において位置693における１つのシトシン残基の挿入が検 出された。これは、アミノ酸残基252における時期尚早の終止コドンの形成によ りフレームシフト変異を導入する。この変異は、BstN Ｉ制限酵素部位も作り出す 。その患者及び４の影響を受けていないファミリーメンバーからのDNAを増幅し 、BstN Ｉで制限酵素消化した。予想通り、NBCCS患者からの産物のみがその制限 酵素により切断された。 エキソン17 2988del8bp エキソン17 PCR産物のHinf Ｉ制限酵素消化及びSSCP分析の後に、２つの可変性 バンドが見られた。これらの増幅物の直接のDNAサイクル配列決定は２つの変異 を示した。12歳の男性NBCCS患者からのDNAにおいて８bpの欠失が検出された。こ のフレームシフト変異は、アミノ酸残基1141に終止コドンを導入する。この患者 は、マクロエファリー(macroephaly)、ハイパーテロリズム(hypertelorism)、眉 弓、上顎前出症、手のひらにはないが足底のピッティング及び副乳頭を有する。 更に、10歳の時、その患者は３つの上あご及び下あごの歯原性角化嚢胞の外科的 除去を行っていた。エキソン17 3014insA 18歳の女性のNBCCS患者において塩基3014におけるアデノシン挿 入が検出された。これは、アミノ酸残基1009においてフレームシフト変異（チロ シンから停止）コドンを生ずる。この患者は、前頭突起形成、ハイパーテロリズ ム、大脳石灰化像、二叉の第３、第４、第５及び第６肋骨であり、５つの上あご 及び下あごの歯原性角化嚢胞の摘出を行っていた。 エキソン21 3538deIG 38歳の女性のNBCCS患者において残基3538におけるグアノシン塩基欠失が検出 された。このフレームシフト変異は、アミノ酸残基1190において停止コドンを導 入する。その変異の原因となる性質を、その疾患を彼女が受け継いだその人の父 からのDNAの分析により確認した。その父からのエキソン21の直接的DNA配列決定 は、残基3538におけるグアノシン塩基欠失を示した。 エキソン22 G4302T 30歳の女性のNBCCS患者からの234のエキソンの直接的DNA配列決定は、ヌクレ オチド4302におけるＧ−Ｔ置換を示した。これはアミノ酸残基1438におけるグル タミン酸からアスパラギン酸（Ｅ−Ｄ）置換にあたる。その患者はNBCCSの場合 と確認されており、11の基底細胞癌腫の除去を行っていた。 PTCH 遺伝子多形性 上述のSSCP条件を用いて、本発明者らは、エキソン６，11，14及び15から増幅 されたPCR産物において多形性を観察した。エキソンの配列の分析後に、DNA配列 変換は検出されなかった。それゆえ、これらはイントロンのDNA配列多形性を示 すようである。また、エキンソンのDNA配列多形性(C306T)はエキソン２において 開示された。この塩基置換は、“原因となる”3538delG変異が既に同定されてい る患者LDI-1及び他の血縁のないNBCCS患者からのDNA中に観察された。 この例において、本発明者らは、ヒト腫瘍サプレッサー遺伝子としてのパッチ トの役割と一致するNBCC細胞を有する患者から５つの新しいジャームライン変異 を同定した。４つの変異はフレームシフト又はノン−センス変異を引きおこし、 トランケートされたPTCHタンパク質を生じ；５番目の変異はPTCHタンパク質の３ ’−カルボキシ末端近くでのグルタミン酸からアスパラギン酸への置換である。 これは、患者＃５からの全部で23のPTCHエキソンの直接的DNA配列決定後に検出 された唯一の塩基変換であった。これは保存性アミノ酸置換を示し、それゆえ多 形性のためであり変異ではあり得ないが、このグルタミン酸残基はヒト、マウス 及びニワトリPTCHタンパク質間で保存されており、機能的に重要であるようであ る。 実施例４ NBCCS におけるPtc遺伝子の変異が臨床表現型を規定する 実施例３は、NBCC症候群の個体における変異を規定した。本実施例においては 更なる変異を規定する。 材料及び方法 患者を、Shanleyら（1994）の臨床基準に従って診断した。70のNBCCS患者を、 エキソン１ｂ（他方の第１のエキソン）を除いて全てのコーディングエキソンの ためのプライマーで、上述(Itahnら、前掲)のように一本鎖コンホメーション多 形性（SSCP）及びヘテロデュプレックス分析により十分に分析した。プライマー は、エキソン12，12ｂ及び20を除いて上述及びHahnら（1996）に記載される通り であった。エキソン12ｂは、エキソン12（Hahnら、1996）が２つの別個のエキソ ンからなることの発見に基づく付加的なエキソンである。それゆえ、PTC遺伝子 は、23のコーディングエキソンからなる。可能なら、その変異が散発性であるか 家族性であるかを分子レベルで決定するために、PTC変異が見い出された場合の 両親からの DNAも分析した。SSCP変異を示すいずれのサンプルも上述のように分析した(Wick ingら（1997）Am.J.Hum.Genet．60:21-26)。 蛍光プライマー及びGenescanを用いて、８の散発性の場合の親においてマイク ロサテライトマーカーを用いて親子確認テストを行った。 結果 全部で32のNBCCSのケースにおいてPTCH変異が同定された。これらのうち28は 実施例３に記載される。この実施例は、４つの新鮮な変異を示す（表５）。これ らのうち３つはフレームシフト変異であり、そして１つはスプライス変異と予想 される。それゆえ、本発明者らは、エキソン１ｂを除く全てのエキソンの分析に より32／70（46％）のNBCCSのケースにおいてPTCH変異を検出した。これらの大 部分（27／32；84％）はタンパク質ターミネートの変異である。更に、８の散発 性のケースを、両親における関連する病気関連の変異の欠如により同定した（表 ６）。親子確認テストを、４つのマイクロサテライトマーカーを用いてこれらの ８つのケースにおいて行ったが、いずれの一致性も同定されなかった。 この実施例は、本発明者らがPTCH遺伝子に変異を有することを示したNBCCSの ８の個体を示す。全てのケースにおいて、その親は病気関連の変異を有さず、高 度に有益なマイクロサテライトマーカーの分析により非親性はありそうもないこ とを示した。更に、本発明者らは、ジャームラインPTCH変異の４のNBCCS個体を 報告する。これら４つのうち３つは時期尚早のタンパク質トランケーションを生 じるであろう。 DNA分析によりNBCCSの関係する診断状態を確認する能力により、NBCCSを診断 するのに用いる臨床的及び放射線学的基準を更に規定することができる。この研 究においてPTCH遺伝子内に新しい変異 を有することが示された８人のNBCCS個体のうち、２人のみ（JRN250，DD25）が 、両親の臨床的及び放射線学的検査に基づき明らかに散発性のケースであること を示した。１つのケース（JKK551）においては両親とも検査しなかった。全ての 他のケースにおいて、一方の親は、多発性BCCS、極めて湾曲した口蓋又はマクロ エファリー(macroephaly)のようなNBCCSに関連する少くとも１つの特徴を示した 。 表 ５ NBCCS個体におけるPTCH変異 表 ６ NBCCS患者におけるPTCHの変異 実施例５ 繊維形成性変異の髄芽腫はヒトPtc遺伝子の変異を有する 本実施例において、本発明者らは、繊維形成性髄芽腫(Mbs)の11の散発性のケ ースのうち３つにおいて見られるが、古典的（非繊維形成性の）組織構造の57の 腫瘍においては見られない非保存性のPTC変異を検出した。変異のある腫瘍のう ちの２つ及び２つの更なる繊維形成性のケースにおいて、9q22においてLOHが見 い出された。これらの発見は、PTCがMBの繊維形成性変異の発達に関連する腫瘍 サプレッサーを表現することを示唆する。 材料及び方法 患者及び腫瘍、細胞系 全部で68の髄芽腫サンプルを分析した。64のサンプルをMB腫瘍から得て、４つ を上述の髄芽腫細胞系D283Med，D341Med，Daoy、及びMHH-MED-1から得た(Pietsh ら（1994）Cancer Res．54:3278-3287)。２人の患者において本発明者らは一次 性及び再発性の腫瘍の両方を研究することができた。末梢血液からの構成的DNA を40の患者 において利用できた。健康な白色人種の有志者からの末梢血液からのDNAサンプ ルを対照として用いた。正常の小脳のサンプルを分析した。このバイオプシー試 料は小脳血管異常形成からのものであり、組織学的検査に基づき正常であること が見い出された。それら患者の年齢は１ケ月〜59歳の範囲であり、46の男性及び 20の女性がいた。NBCCSの臨床的症状を有する患者もNBCCSの一親等の親族のある 患者もいなかった。全ての腫瘍を、HE及びレチキュリン染色並びに免疫組織化学 的反応を含む標準的な組織学的方法を用いて脳腫瘍の改訂WHO分類に従って診断 した(Kleihnesら（1993）Histological typing of tumours of the central ner vous system，Springer Verlag，New York)。未発達の神経細胞接着分子（NCAM ）、ニューロン特異的エノラーゼ、シナプトフィズム及び神経膠酸性原繊維タン パク質について免疫染色することにより分化を評価した。凍結した腫瘍サンプル を、外科的切除の時に得て、液体窒素内で急速に凍結して−80℃で保存した。 DNA 抽出、LOH分析 汚染している壊死のデブリス又は正常な小脳組織を排除するため及び腫瘍の組 織学的特徴を決定するために、対応する凍結したセクションの注意深い検査の後 、DNAの抽出のために腫瘍フラグメントを選択した。標準的なプロティナーゼＫ 消化及びフェノール／クロロホルム抽出によりDNAを抽出した（Albrechtら、199 4）。ヘテロ接合性の喪失を、本質的に上述のように、PTC遺伝子にタイトに結合 させたマーカーD9S287及びD9S197で、並びに９ｑ上の２つの更なるマーカー（D9 S302，D9S303）でのマイクロサテライト分析により決定した（Albrechtら（1994 ）Neuropathol.Appl.Neurobiol．20:74−81;Krausら（1996）Int．J.Cancer 67: 71-15)。 SSCP 分析及びDNA配列決定 エキソン２−22のSSCP分析を、22のプライマー対（先の実施例及びHakinら、1 996）を用いて行った。50mMのKCl、1.0〜2.5mMのMgCl2、10mMのTris-HCl（pH8.5 ）、0.01％ｗ／ｖのゼラチン及び200mMの各々のdNTP、２μＭのプライマー並び に0.25unitのTaqポリメラーゼ(Gibco-BRL)を含むPCRをUno Thermoblockサイクラ ー（Biometra）で行った。その産物を、異なるアクリルアミド濃度及びアクリル アミド／ビスアクリルアミド比のポリアクリルアミドゲルで分析した。ゲル組成 及び電気泳動条件は、各々の個々のプライマー対について最適化した。一本鎖及 び二本鎖を上述の通り銀染色により視覚化した（Albrechtら、1994）。ゲル移動 度のシフトを示したPCR産物をその湿ったゲルから切り出し、溶出して（Kochら 、1996）、そして同じプライマーでのPCRにより再び増幅した。生じたサンプル をスピンカラム(Qiagen quick spin)を用いて精製し、20ngを蛍光ジデオキシタ ーミネーターキット(ABI)でサイクル配列決定するのに用いた。その産物をAppli ed Biosystems model 373A DNAシーケンサーで分析した。 RNA の単離、PTCH mRNAについての定量的RT-PCR 全ての細胞のRNAを、グアニジウムイソチオシアネート中での溶解及びセシウ ムクロライドクッションを通しての超遠心により（Kochら、1996）、又はTrizolTM 試薬(Gibco-BRL)での抽出により、製造元の説明に従って抽出した。また、そ の試料の組織学的外観を示すために、凍結セクション組織学により個々のサンプ ルを予め検査した。汚染している残留ゲノムDNAを、RNAseのないDNAse(Boehring er)での消化により除去した。ヒトPTC及びハウスキーピング遺伝子β2−ミクロ グロブリン及びGAPDHについて内部欠失を有するRNA鎖を、試験管内変異誘発及び 試験管内転写により作った（Horton及びPease(1991)，Direct Mutagenesis-A Pr actical Approach， McPerson，ed.，pp．217-247（IRL Press，Oxford）。半定量的評価を行うため に、対応するmRNA転写物の等モル量をカバーする特定鎖RNAの予め評価した量をM BサンプルRNAに加え、次にそれを、10μｌの最終容量でプライマーとしてのラン ダムヘキサマーと共にSuper ScriptTM Preamplification System(Gibco-BRL)を 用いて逆転写した。PTCH及びハウスキーピング遺伝子の増幅のため、RT-PCR反応 におけるテンブレートとして0.5μｌのcDNAを用いた。用いたプライマーは、PTC H 5’ACATGTACAACAGGCAGTGG-3〔配列番号：61〕及び5’-GCAAGGAGGTTTACCTAGG-3 ’〔配列番号：62〕、産物の大きさ、野生型192bp、標準182bp；GAPDH、5’-TGC CAAGGCTGTGGGCAAGG-3’〔配列番号：63〕及び5’-GCTTCACCACCTTCTTGATG-3’〔 配列番号：64〕、産物の大きさ、野生型152bp、標準142bp；β2-microglobulin 、5’-GCTGTGACAAAGTCACATGG-3'〔配列番号：65〕及び5’-GATGCTGCTTACATGTCTC G-3’〔配列番号：66〕、産物の大きさ、野生型148bp、標準130bpであった。各 々の遺伝子についてのプライマーのうち１つを蛍光染料で標識した。全てのプラ イマーを、残存ゲノムDNAにより引きおこされるcDNA産物の大きさのシグナルを 避けるためにイントロンの配列にまたがる隣接するエキソンから選択した。それ らPCR産物を分離し、Genescanソフトウェアー（ABI）を用いてApplied Biosyste msモデル373A DNAで分析した。個々の遺伝子の発現レベルを、標準に対するサン プルのシグナル比から計算した。ハウスキーピング遺伝子に対するPTCH mRNAの 相対的発現を、各々の発現レベルの比として規定した（図10）。 ヒトPTCH遺伝子は34kBにまたがり、少くとも23のエキソンを有する。68の散発 性MBからのDNAサンプルのSSCPスクリーニングは、６のサンプルにおいてバンド のシフトを示した（表７）。これらのうち３つは不活動多形性として同定された 。３つの他の腫瘍において は、対応するジャームラインDNA中にも正常な対照DNAサンプル中にも変異は見い 出されなかった。、各々エキソン６及び10の２つの変異は、タンパク質の時期尚 早のトランケーションを伴うフレームシフトを生じた（表７及び図９）。第３の 変異（Ｄ86）は、エキソン10における６塩基対枠内欠失であり、それは膜貫通領 域３内の２つのアミノ酸の欠失を導く。この欠失は、PTCHタンパク質の大きさ構 造的変化を引きおこし、機能を喪失させ得る。これは、LOH及び変異したPTC対立 遺伝子を示す腫瘍Ｄ86及びD322のケースであった。９ｑにおいて検出可能なLOH がないD292の場合、一つのSSCPバンドシフトのみが見い出された（エキソン10内 ）。他の対立遺伝子の変異が存在し得るが、SSCPの限られた感度のためSSCPスク リーニングにより検出することができなかった。他の領域、例えば調節ドメイン 内の変異はこのアプローチで同定されないであろうので、コーディングエキソン のみをスクリーニングした。系統的な配列決定分析は、Mbs内の更なるPTCH変異 をカバーできない。 この実施例において、別個の組織学的変異体又は髄芽腫（MB）、いわゆる標準 の又は“繊維形成性”MBにおいて変異が検出された。WHO分類によると、この変 異体は、密集した細胞内レチキュリン(reticulin)ファイバーネットワークを作 り出す濃密に充填され高い増殖性の細胞に囲われたより低い細胞性の島を特徴と する。より頻繁な“伝統的な”MBはこの小節状の外観及びレチキュリンパターン を欠如する。 表 ７ 髄芽腫におけるPTCH遺伝子の変異分析 表 ８ 髄芽腫におけるPTCH遺伝子の発現 *未分析；**（半定量的RT-PCRにより分析した）相対的発現の平均及び範囲； ***D365、細胞系Daoy 実施例６ NBCCS 遺伝子内のほとんどのジャームライン変異はPATCHEDタンパク質の時期尚 早のターミネーションを導く この実施例において、本発明者らは、一本鎖コンホメーション多形性（SSCP） 分析を用いて、PTCHエキソン内の変異について71の血縁でないNBCCS個体からのD NAサンプルをスクリーニングした。全部で28の変異を同定し、PCR産物の直接的 配列決定によりキャラクタライズした。これらの変異の大部分（86％）はPTCHタ ンパク質の時期尚早のトランケーションを導く。トランケーティング変異の個体 の表現型の分析は、遺伝子型とNBCCSの表現型との間に統計的に有意な相関を示 さなかった。 材料及び方法 患者及びサンプル そのほとんどがオーストラリア及びニュージーランドの人である患者を、Shan leyら(1994)(前掲)の臨床基準に従って診断した。分析した71のNBCCS患者のうち 25が明らかな家族性であり、46は見掛け上散発性である。SSCP 分析 SSCPとヘテロデュプレックス分析の組合せを上述の通り行った（Hahnら（1996 ）、前掲）。71の血縁のないNBCCS個体からのDNAを、ヒトPTCH遺伝子のエキソン １ｂ（ネズミエキソン）と相同な他方の第１のエキソン）、12及び20（これらの ために評価されるプライマーはまだ利用できない）を除く全てへのプライマーで 増幅した。プライマー配列及び条件は先及びHahnら(1996)(前掲)に記載される通 りであった。 配列決定 SSCP変異を示すサンプルからのDNAを、PCR Spinclean Columns（Progen Indus tries）を用いて自動的に配列決定するために再度増幅し、精製した。DNA濃度を アガロースゲル電気泳動により確認し、産物25〜35ngを各々の配列決定のために 用いた。Amplitaq FSポリメラーゼ及び染料標識化ターミネーター化学（Perkin Elmer Cetus）を用いてサイクル配列決定を行い、サンプルをPEC 373A電気泳動 装置で分析した。変異を手動の配列決定で確認する場合、その精製された産物を GEM-Tベクター(Promega)に連結し、そして生じたクローンをT7Sequencing Kit(P harmacia)で配列決定した。 サザン分析 EcoR Ｉ及びHindIII制限酵素を用いて、サザンブロットを先に記載される通り 行い(Chenevix-Trenchら、1992)、PTCH cDNAプローブ13Ｂ及び16Ｃとハイブリダ イズさせた。 統計分析 遺伝子型−表現型関係を検査するために一次退縮分析を用いた。結果 PTCH 変異の同定 NBCCSの71の個体からのDNAを、SSCP／ヘテロデュプレックス分 析の組合せによりPTC遺伝子における変異についてスクリーニングした。SSCP変 異を示すサンプルの配列決定に基づいて、28の推定される病気関連の変異が十分 にキャラクタライズされた（表９）。ヌクレオチド位置244におけるCT欠失の１ つの変異が３つの明らかに血縁のない個体において見い出されたが、全ての他の 変異は１つのNBCCSファミリーにおいて検出されただけであった。ほとんどのエ キソン内で及びPTCタンパク質の主要ドメイン型の全てに相当する位置において 同定された変異で、変異のクラスター化は観察されなかった（図11）。 検出された変異の大部分（24／28；86％）は、終止コドンの導入又は挿入もし くは欠失によるフレームシフトのいずれかにより、PTCHタンパク質のトランケー ションを引きおこすと予想される（表９）。それらの変異のうちの２つは、共通 する３’スプライス部位を変化させるという事実に基づいてスプライス変異であ ると予想されるが、他のものはエキソン11の開始部位の８bp上流のイントロン10 内の21bpの挿入に関連する。この２番目の変異は、それが枝分れ部位を位置27か ら３’スプライス部位の48bp上流に動かすという事実に基づいて異常なスプライ シングを引きおこすと予想された。この７bp共通配列は、一般に、スプライス部 位の約18〜37bp上流に位置し、その位置はスプライシング反応において重要であ ると考えられる。残りの２つの変異は、両方とも、PTCHタンパク質の膜貫通ドメ イン内の残基を変化させるミスセンス変異である。１つ（PP）は、４番目の膜貫 通ドメイン内でチロシンをアスパラギン酸に置換するヌクレオチド1525における GATのTATへの変換であり；他方（RS）は、PTCHタンパク質の９番目の膜貫通ドメ イン内でアルギニンをグリシンに置換するヌクレオチド3193におけるGGCのCGCへ の変換である。 病気に関連する変異に加えて、影響を受けていない個体におけるそれらの存在 、又は基礎をなす配列変化がコードされるアミノ酸を変えなかったという発見に 基づいて、いくつかの変異体を多形性であるとデザインした。SSCP変異が見い出 されなかったサンプルについて、PTC遺伝子の各々のエキソンの配列は現在決定 しているところである。SSCPにより変異が見い出されなかった38の患者からのDN Aも、その遺伝子にまたがるプローブを用いてサザン分析により検査した。２人 の患者において変異を検出した。各々の場合において、HindIIIブロット上に一 つの更なるバンド（各々３及び3.75kb）が見つけられた。EcoR Ｉ，BamH Ｉ及びPs t Ｉ 消化物ではこれらの個体中に変異は存在せず、それゆえHindIIIブロットで見 られたものは著しい再配列を示すようである。これらの変異体の少くとも１つが 病気に関連する点変異であるという可能性は、その家族内での病気との隔絶性に より増加される。第２の変異体の場合に研究のために利用できる家族のメンバー はなかった。これらの個体において基礎をなす変異はまだ決定されていない。 遺伝子型−表現型関係の分析 今日までに見い出された変異のほとんどはタンパク質をトランケートすると予 想されるが、全てがその機能を除去するか否かを決定する必要がある。このこと に注目して、この複合症候群における遺伝子型−表現型関係の予備的分析を、タ ンパク質トランケーティング変異を有する24の家族に基づいて行った。いくつか の態様のNBCCS表現型を、病気の激しさの適当なパラメータとして用いた。本発 明者らは、診断の時点で個体に見い出される主な特徴(BCC、あごのシスト、ピッ ティング及び鎌の石灰化)の数、個体がBCCを示した年齢及びあごのシストが検出 された年齢を検査した。20歳未満の個体は、これらの特徴の年齢依存性発現のた め、この分析に含めなか った。同様に、BCC兆候の年齢の分析を、BCCの発達を促進する紫外線露出の影響 を制限するためホストララシアの患者に制限した。家族内のいく人かの個体に変 異が存在することが知られていた場合、表現型のデータは、全ての血縁のある家 族のメンバー内で平均化した。BCCの兆候の年齢(Ｒ2＝0.001)、あごのシスト(Ｒ2 ＝0.023)、又は主要な特徴の数(Ｒ2＝0.015)と、変異のヌクレオチド位置との 間に見い出された相関はなかった。このことは、これらの特徴については、少く とも、表現型とトランケーティング変異の位置との間に明らかな相関はないこと を示唆する。トランケーティング変異をミスセンス及びスプライス変異体と比較 するために統計的分析を用いることは後者の型の変異の数が少いため適切ではな かったが、本発明者らがミスセンス及びスプライス変異で分析した個体は伝統的 なNBCCS表現型であり、軽度に影響を受けたものとして分類されないであろう。 共通の変異（244delCT）を分けあう３つの家族における個体の表現型と評価し 、かなり変化があることが示された。ファミリーCBの全部で５人の影響を受けて いるメンバーは、裂けた又は極めて湾曲した口蓋を有するが、これは、両方とも 典型的な範囲のNBCCS特徴を示すHC又はBKファミリーにおいては観察されなかっ た。このことは、全体的に、PTC変異の分子の性質がNBCCSの表現型の原因ではな いことを示唆する。興味あることに、BKはPTCの新しい変異を有するので、この 変異は少くとも２回、発生しているにちがいない。 本発明者らは、NBCCSの28の血縁のない個体においてPTC遺伝子内の変異を同定 し、遺伝子型と表現型との間にいずれの関連の証拠もないことを見い出した。タ ンパク質トランケーティング変異を有する24の家族において、表現型とトランケ ーティング変異の位置との間に大きな相関は見い出されなかった。これは、おそ らく３’変 異から生ずるタンパク質の残存活性のため、BRCA1遺伝子内の３’変異が５’変 異よりも卵巣癌の素因をつくる可能性が少い乳癌及び卵巣癌とは異なる。 表 ９ NBCCS個体におけるPTC遺伝子内のジャームライン変異 a Ｓ＝散発性変異；Ｆ＝家族性変異。b Genbank登録番号U43148による。c Genbank登録番号U59464による。d 以前に報告されたb.Hahnら（1996）による。e 患者を分析して変異が見い出されなかった散発性のケース。f 挿入及び欠失を含む複合メカニズム。g エキソン３，４、及び７における多形性はまれである。 本明細書に記載される実施例及び実施形態は、詳述する目的のみのためのもの であり、その範囲内での種々の改良又は変換が当業者に示唆されるであろうが、 それらは本願の精神及び範囲並びに添付の請求の範囲の範囲内に含まれるはずで ある。本明細書に示される全ての出版物、特許、及び特許出願は、全ての目的の ために引用により本明細書に組み込まれる。
【手続補正書】 【提出日】平成１１年１０月２９日（１９９９．１０．２９） 【補正内容】 請求の範囲 １．母斑様基底細胞癌腫症候群(NBCCS)(PTC)タンパク質をコードする単離ヒト 核酸であって、ヒトゲノムライブラリーの存在下で、SEQ ID NO:１，SEQ ID NO: 58及びSEQ ID NO:59より成る群から選ばれる核酸配列より成る第二核酸配列にス トリンジェント条件下で特異的にハイブリダイゼーションする、核酸。 ２．前記単離核酸が長さにおいて40ヌクレオチド以上である、請求項１記載の 単離ヒト核酸。 ３．前記単離核酸が以下に示す任意のプライマーペアーを利用してゲノムライ ブラリーから増幅させたものである、請求項１記載の核酸： ４．前記単離核酸がストリンジェント条件下での請求項３記載の核酸との特異 的ハイブリダイゼーションにより同定されたものである、請求項１記載の核酸。 ５．前記核酸がSEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成る群から 選ばれた核酸である、請求項１記載の核酸。 ６．前記核酸がSEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成る群から 選ばれた核酸と比較して１又は複数の突然変異を含むものである、請求項１記載 の核酸。 ７．前記突然変異がエキソン５ 693insC、エキソン17 2988del8bp、エキソ ン17 3014insA、エキソン21 3538delG、エキソン22 G4302T、エキソン12 17 11insC、エキソン12 1639insA、エキソン16 2707delC、及びイントロン17 31 57-2A→Gより成る群から選ばれたものである、請求項６記載の核酸。 ８．前記突然変異がナンセンス突然変異である、請求項６記載の核酸。 ９．前記突然変異がフレームシフト突然変異である、請求項６記載の核酸。 10．前記突然変異が244delCT，271insA，464insAC，693insC，804del37，877d elG，929delC，1370del76，1393insTGCC，1444del6，1497dup8，1639insA，1711 insC，2183delTC，2320insA，2392delA，2574delA，2583delC，2596complex，27 07delC，2748insC，2749dup7，2988del8bp，3014insA，3352delAT及び3538delG より成る群から選ばれたものである、請求項９記載の核酸。 11．前記突然変異がミスセンス突然変異である、請求項６記載の核酸。 12．前記突然変異がC391T，G1148A，G1368A，G1525T，C2050T，C2050T，C2068 T，C3015A，G3193C及びG4302Tより成る群から選ばれたものである、請求項11記 載の核酸。 13．前記突然変異がmRNAスプライシングを改変するものである、請求項６記載 の核酸。 14．前記突然変異がA1055-2C，3157-2A→G及び1493-8ins21より成る群から選 ばれたものである、請求項13記載の核酸。 15．前記核酸が組換ベクターを更に含んで成る、請求項１記載の核酸。 16．単離ヒト母斑様基底細胞癌腫症候群(NBCCS)(PTC)核酸であって、SEQ ID N O:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成る群から選ばれる核酸配列によりコ ードされるポリペプチドの少なくとも10個の連続アミノ酸残基のポリペプチドサ ブ配列又は当該ポリペプチドサブ配列の保存的置換体をコードする、核酸。 17．前記ポリペプチドサブ配列が長さにおいて50個以上のアミノ酸残基である 、請求項16記載の核酸。 18．前記ポリペプチドがSEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成 る群から選ばれる核酸によりコードされるポリペプチド配列である、請求項17記 載の核酸。 19．前記核酸が組換ベクターを更に含んで成る、請求項16記載の核酸。 20．SEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成る群から選ばれる核 酸によりコードされるポリペプチド配列に由来する少なくとも10個の連続アミノ 酸を含んで成るヒト母斑様基底細胞癌腫(NBCCS)(PTC)ポリペプチドをコードする 単離核酸であって、 ここで当該ポリペプチドは、抗原として供与されたとき、SEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成る群から選ばれる核酸によりコードされるポリ ペプチド配列に特異的に結合する抗体の産生を誘導するものであり；そして 当該ポリペプチドはSEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成る群 から選ばれる核酸配列によりコードされるポリペプチドが完全に免疫収着したSE Q ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成る群から選ばれる核酸配列に よりコードされるポリペプチドに対して生起させた抗血清には結合しないもので ある； 核酸。 21．前記核酸がストリンジェント条件下でヒトゲノムライブラリーにおいて存 在するヒトPTC遺伝子のクローンにハイブリダイゼーションする、請求項20記載 の核酸。 22．前記核酸が組換ベクターを更に含んで成る、請求項21記載の核酸。 23．単離NBCCS（PTC）ポリペプチドであって、SEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及 びSEQ ID NO:59より成る群から選ばれる核酸によりコードされるポリペプチドの 少なくとも10個の連続アミノ酸のサブ配列又は当該ポリペプチドのサブ配列の保 存的置換体を含んで成る、ポリペプチド。 24．前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より 成る群から選ばれる核酸によりコードされる少なくとも50個の連続アミノ酸のサ ブ配列又は当該ポリペプチドのサブ配列の保存的置換体を含んで成る、請求項23 記載のポリペプチド。 25．前記ポリペプチドがSEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成 る群から選ばれる核酸によりコードされるポリペプチドである、請求項23記載の ポリペプチド。 26．SEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成る群から選ばれる核 酸によりコードされるポリペプチド配列に由来する少なくとも10個の連続アミノ 酸を含んで成る単離NBCCS（PTC）ポリペプチドであって、 ここで当該ポリペプチドは、抗原として供与されたとき、SEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成る群から選ばれる核酸によりコードされるポリ ペプチド配列に特異的に結合する抗体の産生を誘導するものであり；そして 当該ポリペプチドはSEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成る群 から選ばれる核酸配列によりコードされるポリペプチドが完全に免疫収着したSE Q ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成る群から選ばれる核酸配列に よりコードされるポリペプチドに対して生起させた抗血清には結合しないもので ある； ポリペプチド。 27．前記ポリペプチドがSEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成 る群から選ばれる核酸によりコードされるものである、請求項26記載の単離ポリ ペプチド。 28．SEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成る群から選ばれる核 酸によりコードされるポリペプチド配列に由来する少なくとも10個の連続アミノ 酸を含んで成るポリペプチドに特異的に結合する抗体であって、 ここで当該ポリペプチドは、抗原として供与されたとき、SEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成る群から選ばれる核酸によりコードされるポリ ペプチド配列に特異的に結合する抗体の産生を誘導するものであり；そして 当該ポリペプチドはSEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成る群 から選ばれる核酸配列によりコードされるポリペプチドが完全に免疫収着したSE Q ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成る群から選ばれる核酸配列に よりコードされるポリペプチドに対して生起させた抗血清には結合しないもので ある； 抗体。 29．前記抗体がモノクローナルである、請求項28記載の抗体。 30．請求項28記載の抗体を発現する組換細胞。 31．母斑様基底細胞癌腫症候群(NBCCS)又は基底細胞癌腫へのかかり易さを検 査する方法であって、下記の工程： i）生体の生物学的サンプルを用意する；そして ii）前記サンプル中のヒトNBCCS（PTC）遺伝子又は遺伝子産物を検出する； を含んで成る方法。 32．前記検出が、NBCCS核酸の有無の検出を含んで成る、請求項31記載の方法 。 33．前記検出がハイブリダイゼーションアッセイを含んで成る、請求項32記載 の方法。 34．前記検出が異常NBCCS核酸の検出を含んで成る、請求項32記載の方法。 35．前記異常NBCCS核酸がSEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より 成る群から選ばれる核酸と比べて１又は複数の突然変異を含む、請求項34記載の 方法。 36．前記突然変異がミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、フレームシフ ト突然変異及びスプライス部位突然変異より成る群から選ばれる、請求項35記載 の方法。 37．前記検出が前記ヒトNBCCS遺伝子又は遺伝子産物の配列決定を含んで成る 、請求項31記載の方法。 38．前記検出がNBCCSポリペプチドの検出を含んで成る、請求項31記載の方法 。 39．前記検出がイムノアッセイを含んで成る、請求項36記載の方法。 40．哺乳動物における母斑様基底細胞癌腫症候群(NBCCS)を処置する方法であ って、前記哺乳動物の細胞を母斑様基底細胞癌腫症候群(NBCCS)ポリペプチドを 発現するベクターでトランスフェクションすることを含んで成る方法。 41．生体における母斑様基底細胞癌腫症候群又は基底細胞癌腫の症状を緩和す る方法であって、前記生体は治療的に有効な量のNBCCS（PTC）ポリペプチド及び 薬理学的賦形剤を含んで成る組成物を投与することを含んで成る方法。 42．薬理組成物であって、薬理学的に許容される担体と、NBCCSポリペプチド 又はそのサブ配列をコードするベクター、NBCCSポリペプチド又はそのサブ配列 、及び抗NBCCS抗体より成る群から選ばれる分子とを含んで成る組成物。 43．NBCCS（PTC）遺伝子又はポリペプチドの検査のためのキットであって、NB CCSポリペプチド又はそのサブ配列、及び抗NBCCS抗体より成る群から選ばれる分 子を含む容器を含んで成るキット。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｐ Ｃ１２Ｐ 21/08 33/574 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/50 5/00 Ｂ 33/574 Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号 ＰＯ ０３６３ (32)優先日 平成８年６月７日(1996．6．7) (33)優先権主張国 オーストラリア（ＡＵ） (31)優先権主張番号 ６０／０１９，７６５ (32)優先日 平成８年６月14日(1996．6．14) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／８５７，６３６ (32)優先日 平成９年５月16日(1997．5．16) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ， ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，Ｎ Ｚ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 クリスチャンセン，ジェフリー オーストラリア国，ブリスベーン (72)発明者 ザフィロポーラス，ペーター ジー. スウェーデン国，ハディーン (72)発明者 ガイラーニ，マエ アール. アメリカ合衆国，コネチカット 06520, ニュー ヘブン (72)発明者 シャンリー，スーザン オーストラリア国，ブリスベーン (72)発明者 シダンバラン，アビラミ アメリカ合衆国，メリーランド 21702― 1201，フレデリック (72)発明者 ボレコフスキー，イゴール スウェーデン国，ハディーン (72)発明者 ホルンベルグ，エリカ スウェーデン国，ハディーン (72)発明者 アンデン，アン ブリジット スウェーデン国，ハディーン (72)発明者 ジリーズ，スーザン オーストラリア国，セント ルチア (72)発明者 ネグス，カイリー オーストラリア国，セント ルチア (72)発明者 スミス，イアン オーストラリア国，セント ルチア (72)発明者 プレスマン，キャロル アメリカ合衆国，コネチカット 06520, ニュー ヘブン (72)発明者 レフェル，デビッド ジェイ. アメリカ合衆国，コネチカット 06520, ニュー ヘブン (72)発明者 ジェラルド，バーナード アメリカ合衆国，メリーランド 21702― 1201，フレデリック (72)発明者 ゴールドステイン，アリサ アメリカ合衆国，メリーランド 20852, ベテスダ (72)発明者 ウェインライト，ブランドン オーストラリア国，セント ルチア (72)発明者 トフトガード，ルーン スウェーデン国，ハディーン (72)発明者 シェヌーブ―トレンチ，ジョージア オーストラリア国，ブリスベーン (72)発明者 ベール，アレン イー. アメリカ合衆国，コネチカット 06520, ニュー ヘブン

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．母斑様基底細胞癌腫症候群(NBCCS)(PTC)タンパク質をコードする単離ヒト 核酸であって、ストリンジェンシー条件下でのヒトゲノムライブラリーの存在下 で、SEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成る群から選ばれる核酸 配列より成る第二核酸配列にストリンジェンシー条件下で特異的にハイブリダイ ゼーションする、核酸。 ２．前記単離核酸が長さにおいて40ヌクレオチド以上である、請求項１記載の 単離ヒト核酸。 ３．前記単離核酸が表２に示す任意のプライマーペアーを利用してゲノムライ ブラリーから増幅させたものである、請求項１記載の核酸。 ４．前記単離核酸がストリンジェンシー条件下での請求項３記載の核酸との特 異的ハイブリダイゼーションにより同定されたものである、請求項１記載の核酸 。 ５．前記核酸がSEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成る群から 選ばれた核酸である、請求項１記載の核酸。 ６．前記核酸がSEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成る群から 選ばれた核酸と比較して１又は複数の突然変異を含むものである、請求項１記載 の核酸。 ７．前記突然変異がエキソン５ 693insC、エキソン17 2988del8bp、エキソ ン17 3014insA、エキソン21 3538delG、エキソン22 G4302T、エキソン12 17 11insC、エキソン12 1639insA、エキソン16 2707delC、及びイントロン17 31 57-2A→Gより成る群から選ばれたものである、請求項６記載の核酸。 ８．前記突然変異がナンセンス突然変異である、請求項６記載の 核酸。 ９．前記突然変異がフレームシフト突然変異である、請求項６記載の核酸。 10．前記突然変異が244delCT，271insA，464insAC，693insC，804del37，877d elG，929delC，1370del76，1393insTGCC，1444del6,1497dup8，1639insA，1711i nsC，2183delTC，2320insA，2392delA，2574delA，2583delC，2596complex，270 7delC，2748insC，2749dup7，2988del8bp，3014insA，3352delAT及び3538delGよ り成る群から選ばれたものである、請求項９記載の核酸。 11．前記突然変異がミスセンス突然変異である、請求項６記載の核酸。 12．前記突然変異がC391T，G1148A，G1368A，G1525T，C2050T,C2050T，C2068T ，C3015A，G3193C及びG4302Tより成る群から選ばれたものである、請求項11記載 の核酸。 13．前記突然変異がmRNAスプライシングを改変するものである、請求項６記載 の核酸。 14．前記突然変異がA1055-2C，3157-2A→G及び1493-8ins21より成る群から選 ばれたものである、請求項13記載の核酸。 15．前記核酸が組換ベクターを更に含んで成る、請求項１記載の核酸。 16．単離ヒト母斑様基底細胞癌腫症候群(NBCCS)(PTC)核酸であって、SEQ ID N O:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成る群から選ばれる核酸配列によりコ ードされるポリペプチドの少なくとも10個の連続アミノ酸残基のポリペプチドサ ブ配列又は当該ポリペプチドサブ配列の保存的置換体をコードする、核酸。 17．前記ポリペプチドサブ配列が長さにおいて50個以上のアミノ酸残基である 、請求項16記載の核酸。 18．前記ポリペプチドがSEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成 る群から選ばれる核酸によりコードされるポリペプチド配列である、請求項17記 載の核酸。 19．前記核酸が組換ベクターを更に含んで成る、請求項16記載の核酸。 20．SEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成る群から選ばれる核 酸によりコードされるポリペプチド配列に由来する少なくとも10個の連続アミノ 酸を含んで成るヒト母斑様基底細胞癌腫(NBCCS)(PTC)ポリペプチドをコードする 単離核酸であって、 ここで当該ポリペプチドは、抗原として供与されたとき、SEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成る群から選ばれる核酸によりコードされるポリ ペプチド配列に特異的に結合する抗体の産生を誘導するものであり；そして 当該ポリペプチドはSEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成る群 から選ばれる核酸配列によりコードされるポリペプチドが完全に免疫収着したSE Q ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成る群から選ばれる核酸配列に よりコードされるポリペプチドに対して生起させた抗血清には結合しないもので ある； 核酸。 21．前記核酸がストリンジェンシー条件下でヒトゲノムライブラリーにおいて 存在するヒトPTC遺伝子のクローンにハイブリダイゼーションする、請求項20記 載の核酸。 22．前記核酸が組換ベクターを更に含んで成る、請求項23記載の核酸。 24．単離NBCCS（PTC）ポリペプチドであって、SEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及 びSEQ ID NO:59より成る群から選ばれる核酸によりコードされるポリペプチドの 少なくとも10個の連続アミノ酸のサブ配 列又は当該ポリペプチドのサブ配列の保存的置換体を含んで成る、ポリペプチド 。 25．前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より 成る群から選ばれる核酸によりコードされる少なくとも50個の連続アミノ酸のサ ブ配列又は当該ポリペプチドのサブ配列の保存的置換体を含んで成る、請求項24 記載のポリペプチド。 26．前記ポリペプチドがSEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成 る群から選ばれる核酸によりコードされるポリペプチドである、請求項24記載の ポリペプチド。 27．SEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成る群から選ばれる核 酸によりコードされるポリペプチド配列に由来する少なくとも10個の連続アミノ 酸を含んで成る単離NBCCS（PTC）ポリペプチドであって、 ここで当該ポリペプチドは、抗原として供与されたとき、SEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成る群から選ばれる核酸によりコードされるポリ ペプチド配列に特異的に結合する抗体の産生を誘導するものであり；そして 当該ポリペプチドはSEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成る群 から選ばれる核酸配列によりコードされるポリペプチドが完全に免疫収着したSE Q ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成る群から選ばれる核酸配列に よりコードされるポリペプチドに対して生起させた抗血清には結合しないもので ある； ポリペプチド。 28．前記ポリペプチドがSEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成 る群から選ばれる核酸によりコードされるものである、請求項27記載の単離ポリ ペプチド。 29．SEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成る群か ら選ばれる核酸によりコードされるポリペプチド配列に由来する少なくとも10個 の連続アミノ酸を含んで成るポリペプチドに特異的に結合する抗体であって、 ここで当該ポリペプチドは、抗原として供与されたとき、SEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成る群から選ばれる核酸によりコードされるポリ ペプチド配列に特異的に結合する抗体の産生を誘導するものであり；そして 当該ポリペプチドはSEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成る群 から選ばれる核酸配列によりコードされるポリペプチドが完全に免疫収着したSE Q ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より成る群から選ばれる核酸配列に よりコードされるポリペプチドに対して生起させた抗血清には結合しないもので ある； 抗体。 30．前記抗体がモノクローナルである、請求項29記載の抗体。 31．請求項29記載の抗体を発現する組換細胞。 32．母斑様基底細胞癌腫症候群(NBCCS)又は基底細胞癌腫へのかかり易さを検 査する方法であって、下記の工程： ｉ）生体の生物学的サンプルを用意する；そして ii）前記サンプル中のヒトNBCCS（PTC）遺伝子又は遺伝子産物を検出する； を含んで成る方法。 33．前記検出が、NBCCS核酸の有無の検出を含んで成る、請求項32記載の方法 。 34．前記検出がハイブリダイゼーションアッセイを含んで成る、請求項33記載 の方法。 35．前記検出が異常NBCCS核酸の検出を含んで成る、請求項33記載の方法。 36．前記異常NBCCS核酸がSEQ ID NO:１，SEQ ID NO:58及びSEQ ID NO:59より 成る群から選ばれる核酸と比べて１又は複数の突然変異を含む、請求項35記載の 方法。 37．前記突然変異がミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、フレームシフ ト突然変異及びスプライス部位突然変異より成る群から選ばれる、請求項36記載 の方法。 38．前記検出が前記ヒトNBCCS遺伝子又は遺伝子産物の配列決定を含んで成る 、請求項32記載の方法。 39．前記検出がNBCCSポリペプチドの検出を含んで成る、請求項32記載の方法 。 40．前記検出がイムノアッセイを含んで成る、請求項37記載の方法。 41．哺乳動物における母斑様基底細胞癌腫症候群(NBCCS)を処置する方法であ って、前記哺乳動物の細胞を母斑様基底細胞癌腫症候群(NBCCS)ポリペプチドを 発現するベクターでトランスフェクションすることを含んで成る方法。 42．生体における母斑様基底細胞癌腫症候群又は基底細胞癌腫の症状を緩和す る方法であって、前記生体は治療的に有効な量のNBCCS（PTC）ポリペプチド及び 薬理学的賦形剤を含んで成る組成物を投与することを含んで成る方法。 43．薬理組成物であって、薬理学的に許容される担体と、NBCCSポリペプチド 又はそのサブ配列をコードするベクター、NBCCSポリペプチド又はそのサブ配列 、及び抗NBCCS抗体より成る群から選ばれる分子とを含んで成る組成物。 44．NBCCS（PTC）遺伝子又はポリペプチドの検査のためのキットであって、NB CCSポリペプチド又はそのサブ配列、及び抗NBCCS抗体より成る群から選ばれる分 子を含む容器を含んで成るキット。
JP54116497A 1996-05-17 1997-05-16 基底細胞癌腫瘍抑制遺伝子 Pending JP2002504805A (ja)

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