EA003675B1 - Белки, связывающие интерлейкин-18, их получение и применение - Google Patents

Abstract

Обеспечены интерлейкин-18-связывающие белки, которые связывают IL-18, и/или модулируют, и/или блокируют активность IL-18. Обеспечены способы их выделения и рекомбинантной продукции, ДНК, кодирующие их, ДНК-векторы, экспрессирующие их, векторы, применимые для их экспрессии у людей и других млекопитающих, антитела к ним.

Description

Данное изобретение относится к интерлейкин-18-связывающему белку (ΙΌ-18), в дальнейшем 1Б-18ВР, который способен связывать 1Б-18. В частности, это изобретение относится к растворимому 1Б-18ВР. получаемому из биологических жидкостей, к растворимым 1Б-ВР, получаемым в результате экспрессии соответствующих ДНК-векторов в клетках-хозяевах, к кодируемым вирусом гомологам 1Б-18ВР, получаемым посредством экспрессии соответствующих ДНК-векторов в клетках-хозяевах, к векторам, экспрессирующим различные 1Б-ВР, к векторам, применимым для экспрессии 1Б-18ВР у людей и других млекопитающих, к антителам против 1Б-18ВР, к терапевтическому применению указанных 1Б-18ВР посредством модулирования и/или блокирования активности 1Ь-18, к терапевтическому применению указанных экспрессирующих векторов для модулирования и/или блокирования активности 1Ь-18 и к применению антител.

Предпосылки изобретения

В 1989 году было описано индуцируемое эндотоксином сывороточное активное вещество, стимулирующее выработку интерферона-гамма (ΙΡΝ-γ), выделенное из клеток селезенки мыши (27). Данное сывороточное активное вещество действует не как непосредственный индуктор ΙΡΝ-γ, а скорее как костимулятор вместе с 1Ь-2 или митогенами. Попытка выделить активное вещество из сыворотки мышей, предварительно обработанных эндотоксином, позволила выявить, по-видимому, гомогенный белок массой 50-55 кДа (26). Так как другие цитокины способны действовать как костимуляторы продукции ΙΡΝ-γ, невозможность нейтрализации сывороточного активного вещества нейтрализующими антителами против 1Ь-1, Ш-4, 1Ь-5, 1Ь-6 или ΤΝΡ позволяет предположить, что оно является отличным фактором. В 1995 г. те же исследователи показали, что индуцируемый эндотоксином костимулятор продукции ΙΡΝ-γ присутствует в экстрактах печени мышей, предварительно обработанных Р.аспек (31). В этой модели, популяция макрофагов печени (клетки Купфера) увеличивается, и для этих мышей становится летальной низкая доза бактериального липополисахарида (БР8), которая не является летальной для необработанных мышей. Фактор, названный ΙΡΝ-γ - индуцирующим фактором (ΙΟΙΡ), позднее обозначенный как интерлейкин18 (ΙΠ-18), выделили в гомогенном состоянии из 1200 г печени мышей, обработанных Р.аспек. Вырожденные олигонуклеотиды, полученные из аминокислотных последовательностей очищенного ΙΠ-18, применяли для клонирования кДНК ΙΠ-18 мыши (31). ΙΠ-18 представляет собой белок массой 18-19 кДа из 157 аминокислот, который не имеет никакой явной гомологии с какимлибо пептидом из баз данных. Мессенджерные

РНК ΙΠ-18 и интерлейкина-12 (Ш-12) легко обнаружить в клетках Купфера и активированных макрофагах. Рекомбинантный Ш-18 стимулирует выработку ΙΡΝ-γ более мощно, чем Ш-12, повидимому, посредством отдельного механизма (31). Подобно индуцированному эндотоксином сывороточному активному веществу сыворотки, ΙΠ-18 сам по себе не индуцирует ΙΡΝ-γ, а действует, главным образом, как костимулятор с митогенами или Ш-2. ΙΠ-18 усиливает пролиферацию Т-клеток, по-видимому, посредством Ш-2зависимого механизма, и увеличивает ίη νίίτο продукцию цитокинов -Τ11-1 и в случае сочетанного действия с Ш-12 проявляет синергизм, увеличивая продукцию ΙΡΝ-γ (24).

Было показано, что нейтрализующие антитела против ΙΠ-18 мыши предотвращают летальное действие низких доз БР8 на мышей, предварительно обработанных Р.аспек. Другие исследователи сообщали о значении ΙΡΝ-γ как медиатора летального действия БР8 у предварительно обработанных мышей. Например, нейтрализующие анти-ΙΡΝ-γ - антитела предупреждали развитие у мышей генерализованной реакции Шварцмана (16), а обработанные галактозамином мыши с дефицитом ΙΡΝ-γ-рецептора, оказываются резистентными к гибели, вызванной БР8 (7). Следовательно, не является неожиданным, что нейтрализующие антитела против ΙΠ-18 мыши защищают мышей, предварительно обработанных Р.аспек, от летального действия БР8 (31). К тому же обработка антитела против мышиного ΙΠ-18 предотвращает тяжелую печеночную цитотоксичность у выживших мышей.

После того как клонировали мышиную форму, в 1996 г. описали последовательность кДНК ΙΠ-18 человека (38). Рекомбинантный Ш18 человека проявляет активность нативного Ш18 (38). Рекомбинантный ΙΠ-18 человека не проявляет непосредственной индуцирующий ΙΡΝ-γ активности в Т-клетках человека, а действует как костимулятор продукции ΙΡΝ-γ и других цитокинов Т-хелперов-1 (Тй-1) (38). В настоящее время, ΙΠ-18 рассматривают главным образом как костимулятор продукции цитокинов Τ111 (ΙΡΝ-γ, Ш-2 и колониестимулирующего фактора гранулоцитов-макрофагов) (20), а также как костимулятор для ΡΆδ-лиганд-опосредованной цитотоксичности клонов натуральныхкиллеров мыши (37).

В результате клонирования ΙΠ-18 из поврежденных тканей и изучения экспрессии гена ΙΠ-18, выявлена тесная связь этого цитокина с аутоиммунным заболеванием. У нетучных диабетических (ΝΘΌ) мышей спонтанно развивается аутоиммунный инсулит и сахарный диабет, которые усиливают и синхронизируют однократной инъекцией циклофосфамида. С помощью полимеразной цепной реакции (РСК.) с обратной транскриптазой выявляют мРНК ΙΠ-18 в поджелудочной железе мышей-ΝΘΌ на ранних стадиях инсулита. После обработки циклофосфамидом быстро увеличивается содержание мРНК ГБ-18 и это предшествует возрастанию мРНК ΙΡΝ-γ и далее развитию сахарного диабета. Интересно, что эти кинетические параметры подобны кинетике мРНК 1Б-12-р40, что приводит в результате к тесной корреляции с содержанием отдельных мРНК. Клонирование кДНК ГБ-18 из РНК поджелудочной железы с последующим секвенированием позволило выявить идентичность с последовательностью ГБ-18, клонированной из купферовых клеток и ίη νίνο из предварительно активированных макрофагов. Макрофаги мышей-ΝΘΌ отвечают на циклофосфамид экспрессией гена ГБ-18, тогда как макрофаги параллельно обработанных мышей Ва1Ь/с не реагируют. Поэтому, экспрессия ГБ-18 регулируется аномально у аутоиммунных мышей-ΝΘΌ и тесно ассоциирована с развитием сахарного диабета (32).

ГБ-18 играет существенную роль в иммунорегуляции или воспалении посредством увеличения функциональной активности Раклиганда на Т11-1 клетках (10). ГБ-18 также экспрессируется в коре надпочечника и поэтому является секретируемым нейроиммуномодулятором, играющим важную роль в настройке иммунной системы после воздействия стресса (9).

Гп νίνο, ГБ-18 образуется в результате расщепления рго-ГБ-18 и, как оказалось, его эндогенная активность объясняет продукцию ΦΝ-γ в случаях летальности, опосредованной Р.аспек и БР8. Вследствие его активности, блокирование биологической активности ГБ-18 при заболевании человека является терапевтической стратегией при многочисленных болезнях. Этого достигают использованием растворимых рецепторов или блокирующих антител к связанному с клеткой рецептору ГБ-18.

Белки, связывающие цитокины, (растворимые рецепторы цитокинов) соответствуют внеклеточным лигандсвязывающим доменам соответствующих им рецепторов клеточной поверхности цитокинов. Их получают или посредством альтернативного сплайсинга пре-мРНК, свойственной рецептору клеточной поверхности, или посредством протеолитического расщепления рецептора клеточной поверхности. Такие растворимые рецепторы были описаны ранее, включая в частности растворимые рецепторы ГБ-6 и ΦΝ-γ (30), ΤΝΡ (11, 12), ГБ-1 и ГБ-4 (21), ΦΝ-α/β (28, 29) и другие. Один цитокинсвязывающнй белок, названный остеопротегерин (ОРО, также известный как фактор, ингибирующий остеокласты - ОСГР), член ΤΝΡΚ,/Рак семейства, является первым примером растворимого рецептора, который существует только как секретируемая белок (1, 34, 39).

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к ГБ-18связывающим белкам, (ГБ-18ВР) и кодируемым вирусами гомологам ГБ-18ВР (в дальнейшем, вирусные ГБ-18ВР), и рекомбинантным белкам, мутеинам, функциональным производным, активным фрагментам и их преобразованные через циклизование производные, способные связывать ГБ-18.

Изобретение также относится к способу выделения ГБ-18ВР из жидкостей организма человека, и способу получения их с помощью рекомбинантных методик. Изобретение также относится к векторам, экспрессирующим ГБ18ВР, подходящим для экспрессии ГБ-18ВР у людей и других млекопитающих. Отдельные ГБ18ВР, кодируемые вирусами гомологи ГБ-18ВР, гибридные белки, мутеины, функциональные производные, активные фрагменты и их преобразованные через циклизование производные по настоящему изобретению применимы для модулирования и/или блокирования активности ГБ18.

Также обеспечены реплицируемые экспрессирующие векторы, содержащие последовательности ДНК, подходящие для экспрессии различных ГБ-18ВР в клетках-хозяевах, трансформированных ими, и белки и полипептиды, продуцируемые посредством экспрессии такими хозяевами.

Кроме того, изобретение относится к фармацевтическим композициям, состоящим из приемлемых носителей и ГБ-18ВР, или вирусных ГБ-18ВР или векторов, экспрессирующих их у людей и других млекопитающих, для лечения заболеваний или состояний, при которых необходимо модулирование или блокирование активности ГБ-18.

Далее изобретение относится к антителам против ГБ-18ВР и вирусных ГБ-18ВР, подходящим для их аффинной очистки и иммуноанализа.

Описание чертежей

Фиг. 1 представляет 8Э8-РАОЕ (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) ГБ-18-связывающего белка, очищенного по афинной методике. Неочищенные белки мочи (500 л мочи здоровых людей, сконцентрированной ультрафильтрацией) наносят на колонку с ГБ-18-агарозой. Колонку промывали, а связанные белки элюировали при рН 2,2. Элюированные фракции нейтрализовывали и аликвоты анализировали с помощью 8Э8-РАОЕ (10% акриламид) в невосстанавливающих условиях и при окрашивании серебром. Дорожки представляют собой 1: неочищенные белки мочи (1,5 мкг наносят на гель); 2-9: элюаты 1-8 соответственно с колонки с ГБ-18агарозой; 10: маркеры молекулярных масс в кДа, указанные справа. Стрелка указывает зону, соответствующую ГБ-18ВР.

Фиг. 2 изображает авторадиограмму ЗЭЗРЛСЕ (7,5 % акриламид) комплексов, состоящих из ¹²⁵1-1Ь-18 (кажущаяся молекулярная масса 19 кДа), поперечно-связанного со следующими препаратами растворимого 1Ь-18-связывающего белка; дорожка 1: промывка с 1Ь-18-аффинной колонки; дорожка 2: элюция 2 с 1Ь-18-аффинной колонки; дорожка 3: элюция 3 с 1Ь-18-аффинной колонки. Справа указаны маркеры молекулярных масс (в кДа). Стрелка указывает поперечносшитый продукт (58 кДа).

Фиг. 3 изображает ингибирование индуцированной 1Ь-18 продукции ΙΕΝ-γ посредством ВЬ-18ВР (A) Спленоциты мыши стимулируют (24 ч, 37°С) указанными сочетаниями ЕР8 (1 мкг/мл) и 1Ь-18 человека (5 нг/мл), добавленными или непосредственно, или после предварительного смешивания (1 ч, 37°С) с 1Ь-18ВР мочи. Уровень тиIΡN-γ (мыши) в культуре определяют через 24 ч.

(B) Спленоциты мыши инкубируют (24 ч) с ЬР8 (1 мкг/мл) вместе с 1Ь-18 мыши (10 нг/мл), предварительно смешанный (1 ч, 37°С) с возрастающими концентрациями 1Ь-18ВР человека.

(C) Спленоциты мыши инкубируют (24 ч) с ЬР8 (10 мкг/мл) вместе с возрастающими концентрациями 1Ь-18ВР человека.

(Ό) Спленоциты мыши инкубируют (24 ч) с Соп А (конканавалином А) (мкг/мл) вместе с возрастающими концентрациями 1Ь-18ВР человека.

(Е) КС-1 клетки человека стимулируют ΤΝΕ-α (20 нг/мл) и НиЮ-18 (человека) (25 нг/мл), добавленных или одних, или после предварительного смешивания (1 ч, 37°С) с 1Ь18ВР мочи.

На фиг. 4 представлена последовательность кДНК 1Ь-18ВРа человека и белка. Сигнальный пептид подчеркнут.

На фиг. 5 представлена последовательность кДНК 1Ь-18ВРЬ человека и белка. Сигнальный пептид подчеркнут.

На фиг. 6 представлена последовательность кДНК 1Ь-18ВРе человека и белка. Сигнальный пептид подчеркнут.

На фиг. 7 представлена последовательность кДНК 1Ь-18ВРй человека и белка. Сигнальный пептид подчеркнут.

На фиг. 8 изображена последовательность гена 1Ь-18ВР человека. Определяют последовательность геномного клона (7,1 т.п.н.) человека и сравнивают с последовательностями различных клонов кДНК, выделенных из 3 кДНК библиотек. Общий стартовый кодон трансляции представляет собой нуклеотиды 683-685. ΝιιМА1 ген локализуется на негативной цепи от нуклеотида 3578 до конца.

Фиг. 9 показывает влияние рекомбинантного 1Ь-18ВР на активность 1Ь-18 человека и мыши.

Н18₆-меченый 1Ь-18ВРа кратковременно экспрессируют в клетках СО87 и очищают.

(A) 1Ь-18 человека (5 нг/мл) предварительно смешивают или с Н18₆-меченым-1Ь-18ВРа, или с КРМ1 и добавляют к клеткам селезенки мыши вместе с ЬР8 (1 мкг/мл). Продукцию ΙΕΝγ измеряют через 24 ч.

(B) 1Ь-18 мыши (10 нг/мл) предварительно смешивают или с Н18₆-меченым-1Ь-18ВРа, или с КРМ1 и добавляют к клеткам селезенки мыши вместе с ЬР8 (1 мкг/мл). Продукцию ΙΕΝ-γ измеряют через 24 ч.

(C) 1Ь-18 человека (25 нг/мл) предварительно смешивают или с СО87-1Ь-18ВРа, или с КРМ1 и добавляют к РВМС (монокуклеарные клетки периферической крови) человека в присутствии 1Ь-12 (10 нг/мл).

(Ό) 1Ь-18 человека (25 нг/мл) предварительно смешивают или с СО87-1Ь-18ВРа, или с КРМ1 и добавляют к КС-1 клеткам человека в присутствии ΤΝΕ-α (20 нг/мл).

Подробное описание изобретения

Данное изобретение относится к различным 1Ь-18ВР и вирусным 1Ь-18ВР5, которые связывают 1Ь-18. Такие 1Ь-18ВР модулируют и/или блокируют биологические активности 1Ь18. Термин «1Ь-18ВР и вирусные 1Ь-18В» включает в себя зрелый белок (без сигнальной последовательности), белок, содержащий сигнальную последовательность, мутеины 1Ь-18ВР и вирусных 1Ь-18ВР, производные 1Ь-18ВР и вирусных 1Ь-18ВР и усеченные формы 1Ь-18ВР и вирусных 1Ь-18ВР и их соли.

Далее изобретение относится к ДНК, кодирующим различные 1Ь-18ВР, вирусные 1Ь18ВР, мутеины, рекомбинантные белки, функциональные производные, активные фракции и их смеси. Указанная ДНК представляет собой геномную ДНК, кДНК, синтетическую ДНК, продукт РСК. или их сочетания. Эти ДНК вставляют в реплицируемые носители экспрессии для экспрессии различных 1Ь-18ВР и вирусных 1Ь18ВР в клетках-хозяине согласно данному изобретению. ДНК способны гибридизоваться с указанными ДНК при жестких условиях, а кодирование белков или полипептидов, которые связывают ТЛ-18, также включают в данное изобретение.

Одна такая ДНК кодирует 1Ь-18ВР, включающий в себя аминокислотную последовательность 8ЕО Ш ΝΟ: 10, и содержит терминирующий кодон на ее 3'-конце.

Экспрессирующие векторы, подходящие для экспрессии различных 1Ь-18ВР или вирусных 1Ь-18ВР у людей или других млекопитающих, т.е. для генной терапии, представляют собой вирусные векторы или другие типы векторов, в которые включают ген 1Ь-18ВР или кДНК

П.-18ВР или ДНК, кодирующую 1Ь-18ВР по способу, который позволяет осуществить эффективную экспрессию 1Ь-18ВР или вирусного 1Ь-18ВР у людей и других млекопитающих. Данное изобретение также включает молекулы ДНК, гибридизующиеся с указанными ДНК при жестких условиях и кодирующие белки и полипептиды, которые связывают ΣΠ-18.

Выделение 1Ь-18ВР проводят в соответствии с данным изобретением, например, посредством пропускания жидкостей организма человека, таких как моча или сыворотка, через хроматографическую колонку, к которой присоединен ΣΠ-18, и последующей элюции 1Ь-18ВР.

Различные П.-18ВР и вирусные 1Ь-18ВР получают с помощью рекомбинантных методик, т.е. посредством экспрессирования 1Ь-18ВР в соответствующем хозяине, вслед за оперативным присоединением промоторов, энхансеров экспрессии, регуляторных последовательностей и так далее, приемлемых для данного используемого хозяина, что, например, предусматривает экспрессию в правильной ориентации.

Различные 1Ь-18ВР и вирусные П.-18ВР и векторы для экспрессирования ЕЬ-18ВР у людей и других млекопитающих применяют для лечения и облегчения состояний, в которые вовлечен ΣΠ-18 или которые вызваны избытком экзогенно введенного или эндогенно образованного ΣΠ-18. Такими состояниями являются, например, аутоиммунные заболевания, сахарный диабет Σ типа, ревматоидный артрит, отторжение трансплантата, воспалительное заболевание кишечника, сепсис, рассеянный склероз, ишемическая болезнь сердца (включая сердечный приступ), ишемическое поражение мозга, хронический гепатит, псориаз, хронический панкреатит, острый панкреатит и тому подобное.

Согласно данному изобретению 1Ь-18ВР выделяют из мочи здорового человека с помощью одной хроматографической стадии. Препарат неочищенной мочи человека, сконцентрированной из 500 л мочи здоровых людей, наносят на колонку, содержащей ΣΠ-18 человека, связанный с агарозой. Колонку промывают, а связанный белок элюируют при низком значении рН. Элюированные фракции нейтрализуют, а аликвоты анализируют с помощью 8О8-РАОЕ (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) (10% акриламида) при невосстанавливающих условиях и окрашивании серебром. В частности, в элюированных фракциях выявлена белковая зона 40 кДа (фиг. 1).

Белок ~40 кДа, полученный на первой стадии, идентифицируют как ΣΓ-18-связывающий белок по его способности, в частности, поперечно связывать ¹²⁵Σ-ΣΠ-18 (фиг. 2). К тому же, белок ~40 кДа характеризуют, анализируя Νконцевую последовательность белка. Аликвоты из элюированного белка подвергают 8Ό8РАОЕ, электроблоттингу на РУОР-мембране и проводят анализ первичной структуры короткого фрагмента последовательности белка. Аналогично, аликвоты элюированного белка подвергают прямому анализу первичной структуры короткого фрагмента последовательности белка. В обоих случаях получены две полипептидные последовательности. Главная последовательность и минорная последовательность, последняя соответствующая фрагменту дефенсина человека (номер доступа р11398), начиная с аминокислоты 65. Вычитание известной последовательности дефенсина дает следующую последовательность:

Τ-Ρ-ν-5-Ο-Ω-χ-χ-χ-Α-Α-Α

1.... 5 .... 10 где х представляет собой еще неопределенные аминокислоты. Чтобы получить более длинную и более точную последовательность и чтобы идентифицировать возможные остатки цистеина, аликвоты элюированной фракции восстанавливают ДТТ (дитиотрейтолом) при денатурирующих условиях, проводят реакцию с 4винилпиридинон, обессоливают с помощью микроультрафильтрационного устройства (ϋί1га£гее, си1о££ 10000Г£, МгШроге) и проводят анализ первичной структуры короткого фрагмента последовательности белка. После цикла № 1 секвенирования, проводят реакцию остаточного белка с о-фталевым альдегидом, чтобы блокировать все Ν-концевые полипептиды помимо Рго, а затем продолжают секвенирование. По этому способу получена следующая одноцепочечная белковая последовательность:

ТРУЗОХХХАА ХАЗУКЗТКИР СРБОРРУЕРА АКОСРАЬЕУТ

10 20 30 40 (Т ТЬг; Р=Рго; У=Уа1; 8=8ег, р=О1п; Хнеизвестна; А=А1а; К=Агд; К 1,уз; О=Азр; ССуз; Г=РНе; Г=Геи; Е=О1и)

Полученная последовательность значительно отличается от последовательности любого другого известного белка, что установлено исследованием баз данных по структуре белка. Однако исследование базы данных ТНе Тпз111и1е о£ Оепот1с КезеагсН (ТООК) (НТТР псЬ£п1т.шйдоу) с помощью 1Ыаз1п программы исследования предоставило файл кДНК, обозначенный ТНС12801, открытая рамка считывания (128 кодонов) которой, когда транслируется, содержит последовательность высоко гомологичную Ν-концевой последовательности ΣΓ18ВР. Таким образом представляют гомологию:

.......ТРУЗОХХХААХАВУКЗТКОРСРЗОРРУЕ’РМКССРАЬЕУТ. . . 40

I I I I I I ! I I I I I I I ί I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I νΤΙΕνΕίΑΤΧνΧζ2ΤΤΤΑΑΤΑ5νΚ£ΤΚΟΡεΡ3ζ2ΡΡνΕΡΑΑΚ(2ΟΡΑΣΕνΤΗΡΕ 100 (Верхняя последовательность (1-40) является последовательностью Σ^-18ВР, выделенной согласно изобретению; нижняя последовательность (51-100) получена трансляцией кДНК файла ТНС123801 ТЮК).

Последовательность кДНК, идентифицированная как ТНС 12801, является, однако, только Е8Т (экспрессированная 1ад последова тельность), т.е. случайно выбранным клоном кДНК. Никогда не исследовали, содержит ли Е8Т открытую рамку считывания, или экспрессируется ли белок с гена, соответствующего Е8Т, или с самого Е8Т, не идентифицировали ли когда-либо любую функцию белка, кодируемого ТНС12801. Вообще нет информации, что ТНС123801 содержит открытую рамку считывания, кодирующую 1Ь-18ВР.

Аффинно-очищенный 1Ь-18ВР мочи сохраняет способность связывать его меченый лиганд (¹²⁵1-1Ь-18), и после ковалентного поперечного связывания образует комплекс с молекулярной массой 58 кДа. Молекулярная масса комплекса соответствует соотношению 1:1 1Ь18ВР ~40 кДа и 1Б-18 19 кДа (фиг. 2).

Аффинно-очищенный 1Б-18ВР блокирует биологическую активность 1Б-18 человека, равно как и мыши. Таким образом, когда 1Б-18ВР добавляют к 1Б-18 или человека, или мыши, он блокирует способность 1Б-18 вызывать продукцию интерферона-гамма, если добавляют вместе с липополисахаридом (БР8) к культурам клеток селезенки мыши (фиг. 3).

В целях данного описания выражение «биологическая активность 1Б-18» относится, по крайней мере, к одному из следующих биологических свойств:

(ί) индукция ΙΕΝ-γ, главным образом, в качестве костимулятора с митогенами, !Б-1, 1Б-12, ΤΝΡ-α. ЬР8 в различных типах клеток, таких как мононуклеарные клетки периферической крови человека, линия КС-1 клеток человека и Т-клетки, (ίί) увеличение пролиферации Т-клеток, (ΐϊϊ) увеличение образования цитокина ТН-1 ίη νίΐτο, главным образом в качестве костимулятора, (ίν) синергизм с 1Б-12 в отношении увеличения продукции ΙΕΝ-γ, действие костимулятора в отношении продукции ΙΕΝ-γ и других цитокинов Т-хелперов-1, (ν) костимулирующее действие в отношении ЕА8-лиганд-опосредованной цитотоксичности клонов натуральных киллеров мыши, (νί) индукция активации ΝΕ-кВ в КС-1 клетках человека, вероятно посредством индуцирования образования гомодимера 50 ΝΕ-кВ и гетеродимера р65/р50 ΝΕ-кВ, (νίί) индукция 1Ь-8.

Используемое в описании выражение «связывание с ΙΠ-18» подразумевает способность 1Ь18ВР связывать ΙΠ-18, что доказывают, например, посредством связывания ГЕ-18ВР с меченым К-18 при аффинной очистке, как описывают в примере 2 описания.

Используемое в описании выражение «модулирование активности ГБ-18» подразумевает способность !Б-18ВР изменять любую активность ΙΠ-18, а не блокирование, например час тичное ингибирование, усиление и тому подобное.

Используемое в описании выражение «блокирование активности ΙΠ-18» относится к активности Ю-^ВР, которая блокирует, по крайней мере, одну из вышеприведенных биологических активностей ΙΠ-18. Активность Ш18ВР, блокирующая ΙΠ-18, является примером способности Ю-18ВР блокировать ассоциированную с ΙΠ-18 экспрессию ΙΕΝ-γ в спленоцитах мыши. Как будет показано более подробно ниже, модулирование или блокирование активности [Б-18ВР отчасти обусловлено тем, что Ш18ВР ингибирует вызванную ΙΠ-18 активацию ΝΕ-кВ. К тому же, Ю-18ВР блокирует, по крайней мере, одну из следующих активностей ΙΕ18, а именно индукцию ΙΕΝ-γ в клетках человека и мыши, индукцию ΙΕ-8 и активацию ΝΕ-кВ.

ДНК-зонд для скрининга кДНК библиотек получают посредством РСК с обратной транскриптазой со специфическими смысловым и антисмысловым праймерами и РНК из Т-клеток человека 1игка1 с праймерами из ТЮК последовательности. Полученный продукт РСК подтверждают анализом последовательности ДНК. Продукт РСК метят ³²[Р] и используют в качестве зонда для скрининга четырех кДНК библиотек человека, полученных из моноцитов периферической крови, из линии Т-клеток 1игка1, из РВМС (мононуклеарных клеток, периферической крови) и из селезенки человека. Различные независимые клоны кДНК соответствуют четырем вариантам сплайсинга Ю-18ВР (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1, 3, 5 и 7). Все варианты сплайсинга кодируют предполагаемые растворимые секретируемые белки. Наиболее изобилующий вариант ДБ18ВРа) имеет открытую рамку считывания из 192 кодонов, кодирующую сигнальный пептид, прежде упоминаемый как «лидер-последовательность» из 28 аминокислотных остатков, за которым следует зрелый предполагаемый Λ18ВРа, первые 40 остатков которого идеально соответствуют Ν-концевой белковой последовательности Ю^ВР мочи (8ЕС ΙΌ ΝΟ: 2). Положение остатков цистеина позволяет предположить, что этот полипептид принадлежит к суперсемейству иммуноглобулинов (Ι§). Интересно, что каждый из четырех остатков С1п в зрелом !Б-18ВРа является участком возможного Νгликозилирования. Три других варианта Λ18ВР имеются в меньшем количестве, чем Λ18ВРа. Они включают в себя более короткую 1 т.п.н. кДНК ЕБЧЗВРЬ, кодирующую сигнальный пептид из 28 аминокислотных остатков с последующим зрелым белком из 85 аминокислотных остатков (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 4). Третий вариант, ГО-^ВРс, представляет собой кДНК 2,3 т. п. н., кодирующую сигнальный пептид из 28 аминокислотных остатков с последующим зрелым ΙΠ-18ВР из 169 аминокислотных остатков (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 6). Четвертый вариант, ΙΠ-18ВРП, кодирует сигнальный пептид из 28 аминокислотных остатков с последующим зрелым 1Ь18ВР из 161 аминокислотных остатков (8ЕО ΙΌ N0:8).

Для дальнейшего исследования возможного существования дополнительных вариантов сплайсинга 1Б-18ВР, проводят скрининг геномной библиотеки человека зондом, соответствующим полной длине кДНК 1Б-18ВР. Пять геномных клонов, отличающихся по длине, идентифицированы в этой библиотеке. Проводят анализ последовательности ДНК этих клонов с использованием внешнего и внутреннего праймеров. Всего из этих клонов собрана последовательность 7,8 т.п.н. (8Е0 ΙΌ N0:9). Не идентифицируют никакого экзона, кодирующего трансмембранный (ТМ) рецептор с последовательностью 7,8 т.п.н. Все варианты, распределенные в обычном инициирующем сайте трансляции, кодируют тот же сигнальный пептид из 28 аминокислотных остатков и растворимые зрелые белки, отличающиеся по величине и Сконцевым последовательностям. 1Ь-18ВР-локус содержит дополнительный ген, кодирующий белок 1 ядерного митотического аппарата (ΝυΜΑ1), находящегося на минус цепи. Эти данные локализуют ген 1Б-18ВР в хромосоме 11ς 13 (36).

Исследование гомологии проводят на полной белковой последовательности 1Ь-18ВРа и СепРер! базе данных (НТТР://\\л\лу.псЬгп1т. шй.доу), используя 8тйй ^а!егтапп-алгоритм. Обнаружено, что гомологи 1Б-18ВР экспрессируются в некоторых покс-вирусах в виде секретируемых белков с ранее неизвестной функцией. Ранее сообщали, что вирусы кодируют различные рецепторы цитокинов и что такие кодируемые вирусами молекулы служат в качестве ловушек-рецепторов, что ингибирует иммунные ответы посредством нейтрализации их соответствующего цитокина (рассматривают 8рг1ддь. МК, 1994, Ст1, Орт. 1ттипо1., 6, 526-529). Поэтому изобретение далее относится к кодируемым вирусами гомологам 1Б-18ВР. которые также являются блокаторами или модуляторами биологической активности ΙΠ-18. Примеры кодируемых вирусами гомологов 1Б-18ВР представляют в табл. 1.

Согласно данному изобретению кодируемый вирусом гомолог экспрессируют в прокариотическом или эукариотическом хозяине. Используемое в описании выражение «кодируемый вирусом гомолог 1Б-18ВР» подразумевает сходство, по крайней мере, 50% в последовательности из, по крайней мере, 70 аминокислотных остатков. Более предпочтительно сходство составляет, по крайней мере, 50%, по крайней мере, 60%, по крайней мере, 70%, по крайней мере, 80% или более предпочтительно, по крайней мере, 90% сходства в последовательности из 100 аминокислотных остатков.

Таблица 1

Кодируемые вирусами белки, проявляющие высокую гомологию с 1Б-18ВР человека

Последовательность Сеп Рер1	Тип вируса
МСи60315_54	υ60315 Вирус Мо11изсит соп- 1ащо8ит
МСи60315_53	υ60315 Вирус Мойизсит соп- 1адю8ит
8№РНЬ8В 12	Б22013 Вирус оспы свиньи
СУ41КВРЬ 14	Вирус (оспо)вакцины
УУССАА 5	Вирус натуральной оспы
υ01161_3 174	Вирус эктомелии (вирус оспы мышей)
ννυ18340 6	Вирус натуральной оспы
ννυ18338 7	Вирус натуральной оспы
ννυ18337 7	Вирус натуральной оспы
ν.\ιια,7 173	Основной вирус натуральной оспы
МСВ60315 51	Вирус Мо11и8сит сопШркынт
ΗΝΑβν.1	Новый вирус, ассоциированный с гепатитом не-А, не-В

1Ь-18ВРа экспрессируют в клетки СО87 обезьяны. С этой целью кДНК 1Ь-18ВРа включают в экспрессирующий вектор рЕР-В08 млекопитающих. Кассету, кодирующую (Н18)₆последовательность, присоединяют к 3'-концу ОВР 1Б-18ВР в рамке, чтобы облегчить очистку рекомбинантного белка. Клетки СО87 кратковременно трансфицируют экспрессирующим вектором, а бессывороточную среду этих клеток (150 мл) концентрируют и очищают посредством металлхелатирующей хроматографии. 1Ь18ВРа движется в виде одной полосы при 8Ό8РАСЕ с окрашиванием серебром при восстанавливающих и невосстанавливающих условиях и имеет такую же кажущуюся молекулярную массу, как масса 1Б-18ВР мочи. Анализ белковой последовательности этого препарата выявляет такую же Ν-концевую последовательность как последовательность 1Б-18ВР мочи. Анализ 1Ь18ВРа с помощью иммуноблоттинга с антителами, полученными против 1Б-18ВР мочи, выявляет зону с такой же молекулярной массой как масса белка мочи. Кроме того, используя иммунопреципитацию с последующими 8Ό8РАСЕ и авторадиографией, устанавливают, что 1Ь-18ВРа вытесняет ¹²⁵1-1Ь-18ВР мочи из соединения с антителом. Поэтому 1Ь-18ВРа структурно соответствует 1Б-18ВР, выделенному из мочи.

Были проведены исследования способности сырого и очищенного 1Ь-18ВРа ингибировать биологическую активность ΙΠ-18. 1Ь-18ВРа ингибирует активность 1Б-18 человека и мыши в спленоцитах мыши, РВМС и линии КС-1 клеток человека (фиг. 9). Эти результаты подтверждают подлинность кДНК 1Ь-18ВРа, как кДНК, кодирующей биологически активный 1Б-18ВР.

Далее данное изобретение относится к мутеинам и фрагментам 1Б-18ВР и вирусных 1Ь18ВР, и к рекомбинантным белкам, состоящим из 1Б-18ВР дикого типа и вирусных 1Б-18ВР или их мутеинов или фрагментов, слитых с другим полипептидом или белком и характеризующихся способностью связывать 1Б-18 или его гомологи.

Используемый в описании термин «мутеины» относится к аналогам 1Б-18ВР или аналогам вирусного 1Ь-18ВР, в которых один или более аминокислотных остатков нативного 1Ь-18ВР или вирусного 1Ь-18ВР замещают различными аминокислотными остатками или удаляют, или один или более аминокислотных остатков присоединяют к последовательности нативного 1Ь18ВР или вирусного 1Ь-18ВР без значительного изменения способности полученных продуктов связывать 1Ь-18 по сравнению с 1Ь-18ВР дикого типа или вирусным 1Ь-18ВР. Эти мутеины получают посредством известного синтеза и/или методами сайт-направленного мутагенеза, или любого другого известного метода, приемлемого для этого.

Предпочтительно любой такой мутеин имеет последовательность аминокислот существенно повторяющую последовательность 1Ь18ВР, существенно повторяющую последовательность вирусного 1Ь-18ВР, такую, чтобы иметь, по существу, одинаковую активность с 1Ь-18ВР. Одной активностью является его способность связывать 1Ь-18. Поскольку мутеин характеризуется значительной 1Ь-18-связывающей активностью, его используют для очистки 1Ь-18, как, например, посредством аффинной хроматографии, и таким образом полагают, что он имеет активность, подобную активности 1Ь18ВР. Так, имеет ли любой данный мутеин, по существу, такую же активность как 1Ь-18ВР можно определить с помощью рутинных экспериментов, в которых такой мутеин подвергают, например простому конкурентному сэндвичанализу, чтобы установить связывает ли он или нет соответственно меченный 1Ь-18, и таким как радиоиммуноанализ и ЕИ8А (твердофазный иммуноферментный анализ).

В предпочтительном осуществлении любой такой мутеин имеет, по крайней мере, 40% идентичности или гомологии с последовательностью или 1Ь-18ВР, или кодируемого вирусом гомолога 1Ь-18ВР. Более предпочтительно он имеет, по крайней мере, 50%, по крайней мере, 60%, по крайней мере, 70%, по крайней мере, 80% или наиболее предпочтительно, по крайней мере, 90% идентичности или гомологии с ней.

Мутеины полипептидов 1Е-18ВР или мутеины вирусных 1Б-18ВР. применимые в соответствии с данным изобретением, или нуклеиновая кислота, кодирующая их, включают в себя определенный набор существенно соответствующих последовательностей, как пептиды замещения или полинуклеотиды, которые рутинно получают посредством одного из обычных способов на данном уровне техники без излишних экспериментов на основании инструкций и руководства, представленных в описании. Под робное описание химии и структуры белка см. 8е1ш1х О.Е. е! а1., Ргшс1р1ез о£ Рго!еш 8(гис!иге, 8ргшд-Уег1ад, №\ν Уогк, 1978; и Сге1дЬ!оп, Т.Е., Рго1еш8: 8!гис!иге апй Мо1еси1аг Ргорейзез, ν.Η. Егеешап & Со., 8ап Егапс1зсо, 1983, которые цитируют в описании. Для ознакомления с заменами в нуклеотидной последовательности, например, такими как кодонные предпочтения, см. АизиЬе1 е! а1., зирга, а! А, 1.1-А.1.24, и 8атЬгоок е! а1., зирга, в приложениях С и Ό.

Предпочтительными заменами в отношении мутеинов согласно данному изобретению являются замены, известные как консервативные. Консервативные замены полипептидов или белков 1Б-18ВР или вирусных 1Б-18ВР включают в себя синонимические аминокислоты, группы которых характеризуются достаточно похожими физико-химическими свойствами, что при замещениях между членами группы сохраняется биологическая функция молекулы, Огаи!йаш, 8с1епсе, Уо1. 185, рр. 862-864 (1974). Ясно, что вставки и делеции аминокислот в указанных последовательностях можно производить без изменения их функции, особенно если вставки и делеции вовлекают только несколько аминокислот, например меньше тридцати, и предпочтительно меньше десяти, и не удаляют или замещают аминокислоты, которые являются существенными для функциональной конформации, например остатки цистеина, Апйпзеп, Ргтщр1ез ТЬа! Ооуегп ТЬе Ео1йшд о£ Рго!ет СЬатз, 8с1епсе, Уо1. 181, рр. 22-20 (1973). Белки и мутеины, образованные с помощью таких делеции и/или вставок, входят в компетенцию данного изобретения.

Однако остатки цистеина, которые не являются существенными для биологической функции, замещают на другие остатки, например, чтобы избежать образования нежелательных внутримолекулярных и межмолекулярных дисульфидных мостиков, которые вызывают снижение активности 1Б-18ВР.

Предпочтительные синонимические аминокислотные группы представлены в табл. 2. Более предпочтительно синонимические аминокислотные группы представляют собой группы, перечисленные в табл. 3, и наиболее предпочтительно синонимические аминокислотные группы представляют собой группы, перечисленные в табл. 4.

Таблица 2 Предпочтительные группы синонимических аминокислот

Аминокислота	Синонимическая группа
8ег	8ег, ТЬг, О1у, Азп
Агд	Агд, О1п, Ьуз, О1и, Н1з
Ьеи	11е, РЬе, Туг, Ме!, Уа1, Ьеи
Рго	О1у, А1а, ТЬг, Рго
ТЬг	Рго, 8ег, А1а, О1у, Н1з, О1п, ТЬг
А1а	О1у, ТЬг, Рго, А1а
Уа1	Ме!, Туг, РЬе, 11е, Ьеи, Уа1
О1у	А1а, ТЬг, Рго, 8ег, О1у

11е	Ме!, Туг, РЬе, Уа1, Ьеи, 11е
РЬе	Тгр, Ме!, Туг, 11е, Уа1, Ьеи, РЬе
Туг	Тгр, Ме!, РЬе, 11е, Уа1, Ьеи, Туг
Сук	8ег, ТЬг, Суз
Н18	О1и, Ьуз, О1п, ТЬг, Агд, Н1з
О1п	О1и, Ьуз, Азп, Н1з, ТЬг, Агд, О1п
Азп	О1п, Азр, 8ег, Азп
Ьуз	О1и, От, Н1з, Агд, Ьуз
Азр	О1и, Азп, Азр
О1и	Азр, Ьуз, Азп, О1п, Н1з, Агд, О1и
Ме!	РЬе, 11е, Уа1, Ьеи, Ме!
Тгр	Тгр

Таблица 3

Более предпочтительные группы синонимических аминокислот

Аминокислота	Синонимическая группа
8ег	8ег
Агд	Н1з, Ьуз, Агд
Ьеи	Ьеи, 11е, РЬе, Ме!
Рго	А1а, Рго
ТЬг	ТЬг
А1а	Рго, А1а
Уа1	Уа1, Ме!, 11е
О1у	О1у
11е	11е, Ме!, РЬе, Уа1, Ьеи
РЬе	Ме!, Туг, 11е, Ьеи, РЬе
Туг	РЬе, Туг
Суз	Суз, 8ег
Н1з	Н1з, О1п, Агд
О1п	О1и, О1п, Н1з
Азп	Азр, Азп
Ьуз	Ьуз, Агд
Азр	Азр, Азп
О1и	О1и, О1п
Ме!	Ме!, РЬе, 11е, Уа1, Ьеи
Тгр	Тгр

Таблица 4

Наиболее предпочтительные группы синонимических аминокислот

Аминокислота	Синонимическая группа
8ег	8ег
Агд	Агд
Ьеи	Ьеи, 11е, Ме!
Рго	Рго
ТЬг	ТЬг
А1а	А1а
Уа1	Уа1
О1у	О1у
11е	11е, Ме!, Ьеи
РЬе	РЬе
Туг	Туг
Суз	Суз, 8ег
Н1з	Н1з
О1п	О1п
Азп	Азп
Ьуз	Ьуз
Азр	Азр
О1и	О1и
Ме!	Ме!, 11е, Ьеи
Тгр	Ме!

Примеры производства аминокислотных замен в белках, которые используют для полу чения мутеинов полипептидов или белков 1Ь18ВР, или мутеинов вирусных 1Ь-18ВР, для применения в данном изобретении, включают любые известные стадии способов, таких как представленные в патентах США ВЕ 33653, 4959314, 4588585 и 4737462 Магк е! а1.; 5116943 Ко!Ьз е! а1., 4965195 Nатеη е! а1.; 4879111 СЬопд е! а1.; и 5017691 Бее е! а1; и белки с замещенным лизином представляют в патентах США № 4904584 (81ι;ι\\ е! а1.).

В другом предпочтительном направлении данного изобретения мутеин Ш-18ВР или вирусного Ш-18ВР имеет аминокислотную последовательность, по существу, соответствующую последовательности 1Б-18ВР или вирусного Ш18ВР. Термин «по существу соответствующая» предназначают для рассматриваемых белков с минорными изменениями в последовательности природного белка, которые не затрагивают основные характеристики природных белков, в особенности, что касается их способности связывать Ш-18. Полагают, что тип изменений, которые обычно относят к «по существу соответствующие», являются такими изменениями, которые происходят в результате общепринятых методов мутагенеза ДНК, кодирующих эти белки, приводящие в результате к немногим минорным модификациям, и скринингу требуемой активности по вышеописанному способу. Кроме связывания Ш-18 мутеины также модулируют и/или блокируют активность Ш-18.

Согласно данному изобретению мутеины включают в себя белки, кодируемые нуклеиновой кислотой, такой как ДНК или РНК, которые гибридизуются с ДНК или РНК, которые кодируют 1Б-18ВР или кодируют вирусный Ш-18ВР согласно данному изобретению при жестких условиях. Изобретение также включает в себя такую нуклеиновую кислоту, которая также применима в качестве зонда при идентификации и очистке требуемой нуклеиновой кислоты. Кроме того, такая нуклеиновая кислота является основным кандидатом для определения кодирует ли она полипептид, который сохраняет функциональную активность Ш-18ВР данного изобретения. Термин «жесткие условия» относится к гибридизации и условиям последующего промывания, которые обычны на данном уровне техники и общепринято упоминаются как «жесткие». См. АизиЬе1 е! а1., Сиггеп! Рго!осо1з ίη Мо1еси1аг Вю1оду, зирга, 1п1сгзс1спсс, Ν.Υ., 6.3 и

6.4 (1987, 1992), и 8агоЬгоок е! а1., зирга. Без ограничения примеры жестких условий включают в себя условия промывания 12-20° ниже рассчитанной температуры гибрида при исследовании в, например, 2 х 88С и 0,5% додецилсульфате натрия в течение 5 мин, 2 х 88С и 0,1% 8Ό8 в течение 15 мин; 0,1 х 88С 0,5% 8Ό8 при 37°С в течение 30-60 мин, а затем 0,1 х 88С и 0,5% 8Ό8 при 68°С в течение 30-60 мин. Специалисты в данной области понимают, что жесткие условия также зависят от длины последо вательности ДНК, олигонуклеотидных зондов (как, например, 10-40 оснований) или смешанных олигонуклеотидных зондов. Если применяют смешанные зонды, предпочтительно используют хлорид тетраметиламмония (ТМАС) вместо 88С. См. Аи8иЬе1, выше.

Далее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, которые кодируют 1Б-18ВР согласно данному изобретению, но которые отличаются по последовательности кодона вследствие вырожденности генетического кода. Изобретение также относится к таким ДНК, которые, возможно, не гибридизуются при жестких условиях с последовательностями ДНК, представленными на фиг. с 4 до 7, но тем не менее кодируют 1Б-18ВР по настоящему изобретению.

Термин «гибридный белок» относится к полипептиду, содержащему 1Ь-18ВР или вирусный 1Ь-18ВР, или их мутеины, слитые с другим белком, который, например, имеет продолжительное время циркуляции в жидкостях организма. Таким образом, 1Ь-18ВР или вирусный 1Б-18ВР могут быть слиты с другим белком или полипептидом и тому подобным, например иммуноглобулином или его фрагментом. Он также может быть слит с полиэтиленгликолем (РЕО) для пролонгирования времени циркуляции.

Термин «соли», используемый в описании, относится как к солям карбоксильных групп, так и к солям присоединения кислот аминогрупп 1Ь18ВР, вирусного 1Ь-18ВР, мутеинов или их рекомбинантных белков. Соли карбоксильной группы, образованные посредством способов, известных в данной области, включают неорганические соли, например соли натрия, кальция, аммония, железа или цинка и подобные, и соли, образованные с органическим основаниями, например аминами, такими как триэтиламин, аргинин или лизин, пиперидин, новокаин и подобные. Соли присоединения кислот включают, например, соли минеральных кислот, такие как, например, хлористо-водородная кислота или фосфорная кислота, и соли органических кислот такие как, например, уксусная кислота или щавелевая кислота. Конечно, любые такие соли должны иметь активность, подобную 1Б-18ВР.

Термин «функциональные производные», используемый в описании, подразумевает производные 1Ь-18ВР или вирусного 1Ь-18ВР и их мутеинов и рекомбинантных белков, которые получают, например, из функциональных групп, существующих в виде боковых цепей на остатках или Ν- или С-концевых группах, в соответствии с методиками, известными в данной области, и их включают в изобретение, поскольку они остаются фармацевтически приемлемыми, т.е. они не разрушают активность белка, которая, по существу, подобна активности 1Ь-18ВР или вирусного 1Ь-18ВР, и не придают токсические свойства композициям, содержащим их. Эти производные включают в себя, например, боковые цепи полиэтиленгликоля, которые мас кируют антигенные участки и продлевают пребывание 1Ь-18ВР или вирусного 1Ь-18ВР в биологических жидкостях. Другие производные включают алифатические эфиры карбоксильных групп, амиды карбоксильных групп посредством реакции с аммиаком или с первичными или вторичными аминами, Ν-ацильные производные свободных аминогрупп остатков аминокислот, образованных с ацильными компонентами (например, алканоильными или карбоциклическими ароильными группами), или Оацильные производные свободных гидроксильных групп (например, групп остатков серина и треонина), сформированных с ацильными компонентами.

В качестве «активных фракций» 1Ь-18ВР или вирусного 1Ь-18ВР, мутеинов или рекомбинантных белков в данном изобретении рассматривают любой фрагмент или предшественники полипептидной цепи белковой молекулы одних или вместе с ассоциированными молекулами или связанными с ними остатками, например остатками сахара или фосфата, или агрегатами белковой молекулы, или одними остатками сахара при условии, что названная фракция, по существу, сохраняет способность связывать 1Ь18.

Термин «преобразованные через циклизование производные», используемый в описании, относится к линейной молекуле, концы которой соединяют вместе или непосредственно, или через линкер, чтобы образовать кольцевую молекулу, а затем кольцевую молекулу раскрывают в другом участке, чтобы образовать новую линейную молекулу с концами, отличающимися от концов исходной молекулы. Преобразование через циклизование включает те молекулы, структура которых эквивалентна молекуле, которую циклизуют, а затем открывают. Так, преобразованная циклизованием молекула синтезируется йе ηονο как линейная молекула и никогда не проходит через стадию образования кольца и стадию раскрытия. Получение преобразованных через циклизование производных описывают в международной заявке АО 95/27732.

Различные рекомбинантные клетки, такие как прокариотические клетки, например Е.еоН, или эукариотические клетки, такие как дрожжи или клетки насекомых, продуцируют 1Ь-18ВР или вирусные 1Ь-18ВР, способы конструирования подходящих векторов, несущих ДНК, которые кодируют 1Ь-18ВР, и приемлемы для трансформирования (например, Е.еоН, клетки млекопитающих и клетки дрожжей) или инфицирования клеток насекомых для того, чтобы продуцировать рекомбинантные 1Ь-18ВР или вирусный 1Ь-18ВР, хорошо известны в данной области. См. например, Аи8иЬе1 е! а1., ейх Сиггеп! РгоЮеоЕ ίη Мо1еси1аг Вю1оду Сиггеп! Рго1осо18, 1993; и 8атЬгоок е! а1., ей§. Мо1еси1аг С1оп1пд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, 2^пй ей., Со1й 8рппд НагЬог Рге§8, 1989.

Для экспрессии 1Й-18ВР белков или вирусных 1Й-18ВР, ДНК, кодирующие 1Й-18ВР или вирусный 1Я-18ВР, их фрагменты, мутеины или рекомбинантные белки, и оперативно присоединенные регуляторные факторы транскрипции и трансляции, включают в векторы, которые способны интегрировать требуемые генные последовательности в хромосомы клеткихозяина. Чтобы выбрать клетки, которые стабильно интегрируют введенную в их хромосомы ДНК, используют один или более маркеров, предусматривающие отбор клеток-хозяев, которые содержат экспрессирующий вектор. Маркер обеспечивает прототрофию ауксотрофному хозяину, биоцидную резистентность, например к антибиотикам, или резистентность к тяжелым металлам, таким как медь и подобные. Селектируемый ген-маркер или непосредственно связывают с ДНК последовательности гена, чтобы экспрессировать, или вводят в ту же клетку посредством котрансфекции. Дополнительные элементы также необходимы для оптимального синтеза мРНК одноцепочечного связывающего белка.

Эти элементы включают факторы сплайсинга, а также промоторы транскрипции, энхансеры и сигналы терминации.

Названную молекулу ДНК, чтобы ввести в клетки выбора, предпочтительно включают в плазмидный или вирусный вектор, способный к автономной репликации в реципиенте-хозяине. Предпочтительные прокариотические плазмиды являются производными рВК.322. Предпочтительные эукариотические векторы включают в себя ВРУ (вирус папилломы крупного рогатого скота). Вирус осповакцины, 8У40, 2-микронный кольцевой вирус и т.д. и их производные. Такие плазмиды и векторы хорошо известны в данной области (2-5, 22). Если вектор или последовательность ДНК, содержащую конструкцию, получают для экспрессии, экспрессирующий вектор вводят в соответствующую клетку-хозяина с помощью любого из множества приемлемых способов, таких как трансформация, трансфекция, липофекция, коньюгирование, протопластное слияние, электропорация, осаждение фосфатом кальция, прямая микроинъекция и т.д.

Используемые в этом изобретении клеткихозяева являются или прокариотическими, или эукариотическими. Предпочтительные прокариотические хозяева включают в себя бактерии, такие как Е.сой, ВасШик, 81гер1отусе5, Ркеийоиотак, 8а1шоие11а, 8еггайа и т.д. Наиболее предпочтительные прокариотические хозяева представляют собой Е.со1г Особенно интересные бактериальные хозяева включают штамм 294 Е.сой К12 (АТСС 31446), Е.сой Х1776 (АТСС 3157), Е.сой ^3110 Е^-, λ^-, фототрофные (АТСС 27325). При таких условиях белок не гликозилируется. Прокариотический хозяин должен быть совместимым с репликоном и кон трольными последовательностями в экспрессирующей плазмиде.

Однако поскольку природные 1Ь-18ВР являются гликозилированными белками, эукариотические хозяева являются предпочтительными по сравнению с прокариотическими. Предпочтительные эукариотические хозяева представляют собой клетки млекопитающих, например человека, обезьяны, мыши, и клетки яичников китайского хомяка (СНО), так как они обеспечивают пост-трансляционные модификации белковым молекулам, включающие правильную укладку, правильное образование дисульфидных связей, а также гликозилирование в правильных сайтах. Клетки дрожжей и клетки насекомых также выполняют посттрансляционные модификации пептидов, включая высокоманнозное гликозилирование.

Существует ряд технологий рекомбинантных ДНК, которые утилизируют последовательности сильных промоторов и высокое число копий плазмид, которые используют для продукции требуемых белков в клетках дрожжей и клетках насекомых. Клетки дрожжей и насекомых распознают лидерные последовательности на клонированных генных продуктах млекопитающих и выбирают зрелый 1Й-18ВР. После введения вектора, клетки-хозяева выращивают на селективной среде, которую выбирают для выращивания содержащих вектор клеток. Экспрессия клонированной генной последовательности(ей) приводит к продукции 1Й-18ВР, вирусного 1Й-18ВР, рекомбинантных белков или их мутеинов или фрагментов. Указанные способы клонирования, выделения клона, идентификации, характеристики и секвенирования описывают более подробно в дальнейшем в примерах.

Экспрессированные белки затем выделяют и очищают с помощью любых общепринятых методик, включая экстракцию, осаждение, хроматографию, электрофорез или подобное, или с помощью аффинной хроматографии, используя, например анти-1Ь-18ВР моноклональные антитела, иммобилизованные на гелевом матриксе, помещенном в колонку. Неочищенные препараты, содержащие названный рекомбинантный 1Ь18ВР, пропускают через колонку, где 1Й-18ВР связывается на колонке специфическими антителами, тогда как примеси проходят. После промывания, белок элюируют с геля при условиях, обычно применяемых для этих целей, т.е. при высоком или низком рН, например рН 11 или рН 2.

Кроме того, изобретение относится к векторам, которые полезны для экспрессии 1Й-18ВР или вирусного 1Й-18ВР, или их производных у млекопитающих, а точнее у людей. Векторы для кратковременной и долговременной экспрессии генов у млекопитающих хорошо известны по литературе. Исследования показывают, что доставка гена, например, к скелетной мышце, глад кой мышце сосудов и печени приводит в результате к системным уровням терапевтических белков. Скелетная мышца является удобной мишенью из-за ее большой массы, кровоснабжения и доступности. Однако успешно используют и другие мишени и, в частности, костномозговые предшественники иммунных клеток. В настоящее время доступные векторы для экспрессии белков, например в мышце, включают плазмидную ДНК, липосомы, коньюгаты белокДНК и векторы, на основе аденовируса, аденоассоциированного вируса и вируса герпеса. Из них векторы на основе аденоассоциированного вируса (ААУ) оказываются наиболее эффективными в отношении продолжительности и уровней экспрессии гена и в отношении безопасности (Ке§8е1, Ρ.Ό. 1996, Ргос. Иа11. Асай. 8ск И8А 93, 14082-14087).

Способы конструирования вектора на основе АЛУ подробно описывают (8пуйег е1 а1., 1996, Сиггеп! РгоФсок ίη Нитап Сепейск, Скар1егз 12.1.1-12.1.17, 1о1т \УПеу & 8опк) и цитируют в этом патенте. Кратко, плазмиду ркиЬ201, содержащую геном ААУ дикого типа разрезают ферментом рестрикции ХЬа I и сшивают с конструкцией, состоящей из эффективного эукариотического промотора, например цитомегаловирусного промотора, Кохак согласованной последовательности, последовательности ДНК, кодирующей 1Ь-18ВР или вирусный 1Ь-18ВР, или их мутеины, или рекомбинантные белки, или их фрагменты, соответствующей 3' не транслируемой области и сигнала полиаденилирования, например сигнала полиаденилирования вируса обезьяны 40. Полученную рекомбинантную плазмиду котрансфицируют с хелпер ААУплазмидой, например рААУ/Ай, в клетки млекопитающих, например Т293 клетки. Затем культуры инфицируют аденовирусом в качестве хелпер-вируса, а культуральные супернатанты собирают через 48-60 ч. Супер-натанты фракционируют осаждением сульфатом аммония, очищают в градиенте плотности СЮ. диализуют, а затем нагревают при 56°С, чтобы уничтожить любой аденовирус, в то время как полученный рекомбинантный ААУ, способный экспрессировать 1Ь-18ВР или вирусный 1Ь-18ВР, или их мутеины, или рекомбинантные белки, остается стабильным на этой стадии.

До сих пор не установлена физиологическая роль растворимых рецепторов цитокинов. Растворимые рецепторы связывают свои специфические лиганда и в большинстве случаев ингибируют их биологическую активность, как показано на системе ΤΝΡ (фактор некроза опухоли) (11, 12). В очень немногих случаях, например 1Ь-6, растворимый рецептор увеличивает биологическую активность. Показано, что рекомбинантный растворимый рецептор ΤΝΡ, также известный как ТВР (ΤΝΡ связывающий белок) предотвращает септический шок на моделях животных, тогда как обнаружено, что рас творимые формы рецептора 1Ь-1 оказывают полное ингибирование развития ίη νί\Ό аллогенной реактивности у мышей-реципиентов аллотрансплантата.

Аналогично обнаружено, что 1Ь-18ВР и вирусный 1Ь-18ВР данного изобретения используют в качестве модуляторов активности 1Ь-18, например, при диабете типа I, сепсисе, аутоиммунных заболеваниях, при отторжении трансплантата, ревматоидном артрите, воспалительном заболевании кишечника, сепсисе, хроническом гепатите, псориазе, хроническом гепатите и остром гепатите. Таким образом, их можно применять, например, при любом заболевании, при котором эндогенная продукция или экзогенное введение 1Ь-18 вызывают заболевание или ухудшение состояния пациента.

Кроме того, данное изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим фармакологически приемлемый носитель и 1Ь18ВР или вирусный 1Ь-18ВР изобретения, или их активные мутеины, рекомбинантные белки и их соли, функциональные производные или их активные фракции.

Далее данное изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим фармацевтически приемлемый носитель и, например, вирусный вектор, такой как любой один из названных вирусных векторов на основе ААУ, или другой вектор, экспрессирующие 1Ь18ВР или вирусный 1Ь-18ВР, или их мутеины, фрагменты или их рекомбинантые белки и приемлемые для введения людям и другим млекопитающим с целью достижения экспрессии ίη у|уо 1Ь-18ВР или вирусного 1Ь-18ВР, или их мутеинов, или фрагментов, или рекомбинантных белков изобретения, т.е. для применения в генной терапии.

Фармацевтические композиции изобретения готовят для введения смешиванием 1Ь-18ВР или вирусного 1Ь-18ВР, или их производных, или векторов, экспрессирующих их, с физиологически приемлемыми носителями и/или стабилизаторами, и/или наполнителями, и готовят в дозированной форме, например, лиофилизацией в дозированных ампулах. Способ введения представляет собой любой из принятых способов введения для подобных агентов и зависит от состояния, которое лечат, например, внутривенно, внутримышечно, подкожно, посредством локальной инъекции или местной аппликации, или непрерывно посредством вливаний и т.д. Количество активного соединения, которое вводят, зависит от способа введения, заболевания, которое лечат, и состояния пациента. Для локальной инъекции, например, требуется более низкое количество белка на вес тела, чем при внутривенном вливании.

Соответственно, 1Ь-18ВР или вирусные 1Ь18ВР, или векторы, экспрессирующие их ίη νίνΌ, показаны для лечения аутоиммунных заболеваний, диабета I типа, ревматоидного арт рита, отторжения трансплантата, воспалительного заболевания кишечника, сепсиса, рассеянного склероза, ишемической болезни сердца, включая острый сердечный приступ, ишемического поражения мозга, хронического гепатита, псориаза, хронического и острого панкреатита и подобных заболеваний, при которых имеется аберрантная экспрессия 1Ь-18, ведущая к избытку ГС-18, или в случаях осложнений, обусловленных экзогенно введенным ГС-18.

Изобретение также включает антитела против ΙΓ-18ΒΡ или вирусного ΙΓ-18ΒΡ, а также против их мутеинов, рекомбинантных белков, солей, функциональных производных и активных фракций.

Термин «антитело» означает поликлональное антитело, моноклональное антитело (МАТ), химерных антител, антиидиотипическое (антиГб) антитело к антителам, которые метят в растворимой или связанной форме, и гуманизированные антитела, а также их фрагменты, обеспеченные с помощью любых известных методов, таких как, но не ограниченных ими, ферментативное расщепление, пептидный синтез или рекомбинантные технологии.

Поликлональные антитела представляют собой гетерогенные популяции молекул антител, полученных из сыворотки животных, иммунизированных антигеном. Моноклональные антитела содержат, по существу, гомогенную популяцию антител, специфических к антигенам, к которым популяция содержит в основном одинаковые эпитопсвязывающие участки. МАТ получают по способам, известным специалистам в данной области. См., например, КоЫет апб М11з!еш, №а!иге 256:495-497 (1975); Патент США № 4376110; АизиЬе1 е! а1., ебз., зирга, Наг1оте апб Гапе, АпбЬоб1ез: А ГаЬота!оту Мапиа1, Со1б 8ртшд НагЬог ГаЬота!оту (1988); и Со1Идап е! а1., ебз., Сиггеп! Рго!осо1з ш 1ттипо1оду, Сгеепе РиЬйзЫпд Аззос. апб \УПеу 1п!егзс1епсе, Ν.Υ., (1992, 1993), содержание которых приводят в полном объеме посредством цитирования. Такие антитела могут принадлежать к любому классу иммуноглобулинов, включая 1дС, 1дМ, 1дЕ, 1дА, С1СЭ и любым их подклассам. Гибридому, продуцирующую МАТ данного изобретения, культивируют ш У11го. ш зйи или ш у1уо. Продукция высоких титров МАТ ш У1Уо или ш зШ1 делает это сейчас предпочтительным способом получения.

Химерные антитела представляют собой молекулы, различные части которых получают от различных видов животных, такие как молекулы, имеющие вариабельную область, полученную от МАТ мыши, и констатную область иммуноглобулина человека. Химерные антитела используют главным образом для восстановления иммуногенности при применении и для увеличения выхода при продукции, например, когда МАТ мыши имеют более высокий выход из гибридом, но более высокая иммуногенность у людей, так что применяют химерные МАТ человек-мышь. Химерные антитела и способы их получения известны в данной области. (СаЬШу е! а1., Ргос. №а!1. Асаб. δα. И8А 81: 32733277 (1984); Мотзоп е! а1., Ргос. №а!1. Асаб. 8ск И8А 81: 6851-6855 (1984); Воийаппе е! а1., №а!иге 312:643-646 (1984); СаЬ111у е! а1., заявка на европейский патент 125023 (опубликована 14 ноября, 1984); №еиЬегдег е! а1., №а!иге 314: 268270 (1985); ТашдисЫ е! а1., заявка на европейский патент 171496 (опубликована 19 февраля, 1985); Мотзоп е! а1., заявка на европейский патент 173494 (опубликована 5 марта, 1986); №еиЬегдег е! а1., РСТ международная заявка \УО 8601533, (опубликована 13 марта, 1986); Кибо е! а1., заявка на европейский патент 184187 (опубликована 11 июня, 1986); Мотзоп е! а1., заявка на европейский патент 173494 (опубликована 5 марта, 1986); 8айадап е! а1., 1. 1ттиш1. 137:10661074 (1986); ВоЬшзоп е! а1., международная заявка νθ 9702671 (опубликована 7 мая 1987); Ые е! а1., Ргос. №а!1. Асаб. 8ск И8А 84:3439-3443 (1987); 8ип е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8ск И8А 84: 214-218 (1987); Ве!!ег е! а1., 8с1епсе 240: 10411043 (1988); и Наг1оте & Гапе, Ап!1Ьоб1ез: А ГаЬота!огу Мапиа1, зирга. Эти ссылки вводят в описание в полном объеме посредством цитирования.

Антиидиотипическое (анти-1б) антитело является антителом, которое распознает уникальные детерминанты, обычно ассоциированные с ангигенсвязывающим сайтом антитела. 1бантитело получают иммунизацией животного того же вида и генетического типа (например, линия мышей) в качестве источника МАТ с МАТ, к которому анти-1б получен. Иммунизированное животное распознает и отвечает на идиотипические детерминанты иммунизирующего антитела посредством продуцирования антител к этим идиотипическим детерминантам (анти-1б-антитело). См., например, патент США № 4699880, который приводят в описании посредством цитирования.

Анти-1б-антитело также используют в качестве «иммуногена», чтобы вызвать иммунный ответ у еще другого животного, продуцирующего так называемое анти-анти-1б-антитело. Антианти-1б является идентичным по эпитопу исходному МАТ, которое индуцирует анти-1б. Таким образом, посредством использования антител к идиотипическим дереминантам МАТ возможно идентифицировать другие клоны, экспрессирующие антитела идентичной специфичности.

Соответственно, МАТ, полученные против 1Г-18ВР и родственных белков данного изобретения, используют, чтобы индуцировать антиМ-антитела у соответствующих животных, таких как ВАГВ/с мыши. Клетки селезенки от таких иммунизированных мышей применяют для получения анти-1б гибридом, секретирующих анти-Гб МАТ. К тому же, анти-Гб МАТ свя зывают с носителем таким гемоцианин лимфы улитки (КЬН) и применяют для иммунизации дополнительных ВАЬВ/с мышей. Сыворотка от этих мышей содержит анти-анти-1й антитела, которые имеют связывающие свойства исходного МАТ специфического относительно эпитопа 1Ь-18ВР или эпитопов вирусного 1Ь-18ВР.

Анти-1й МАТ, таким образом, имеют собственные идиотипические эпитопы или «идиотопы», структурно подобные оцениваемому эпитопу, такому как 1Ь-18ВР или вирусный 1Ь18ВР.

Термин «гуманизированное антитело» означает включение, например антител, которые получают манипулированием с антителами мыши с помощью способов генетической инженерии с тем, чтобы они оказались более совместимыми с организмом человека. Такие гуманизированные антитела характеризуются сниженной иммуногенностыо и улучшенной фармакокинетикой у людей. Их получают с помощью технологий, известных в данной области, таких как описывают, например для гуманизированных анти-ΤΝΕ антител в Мо1еси1аг 1ттипо1о§у, 30, N 16,1443-1453,1993.

Термин «антитело» также подразумевает включение обеих интактных молекул, а также их фрагментов, таких как, например, РаЬ и Р(аЬ')2, которые связывают антиген. Фрагменты РаЬ и Р(аЬ')2, без фрагмента Рс интактного антитела, более быстро удаляются из циркуляции и характеризуются меньшим неспецифическим тканевым связыванием, чем интактное антитело (4аЫ е1 а1., I №с1. Мей. 24:316-325 (1983)). Следует оценить, что РаЬ и Р(аЬ')2 и другие фрагменты антител, полезные в данном изобретении, используют для определения и количественной оценки 1Ь-18ВР или вирусного 1Ь-18ВР, согласно способам, представленным в описании для интактных молекул антител. Такие фрагменты обычно получают посредством протеолитического расщепления, используя ферменты, такие как папаин (для получения фрагментов РаЬ) или пепсин (для получения фрагментов Р(аЬ')2).

Как отмечено, антитело является «способным связывать» молекулу, если оно способно специфически взаимодействовать с молекулой, чтобы вследствие этого связать молекулу с антителом. Термин «эпитоп» означает, что часть любой молекулы способна быть связанной антителом, которая также распознается таким антителом.

Эпитопы или «антигенные детерминанты» обычно состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи сахаров, и имеют особые характеристики трехмерной структуры, а также определенные характеристики заряда.

«Антиген» представляет собой молекулу или часть молекулы, способную быть связанной антителом, которое дополнительно индуцирует животное к продукции антитела, способного связывать эпитоп такого антигена. Антиген может иметь один или больше эпитопов. Указанная специфическая реакция предназначается, чтобы указать, что антиген взаимодействует высоко избирательным способом с ему соответствующим антителом и не взаимодействует с множеством других антител, которые вызываются другими антигенами.

Антитела, включая фрагменты антител, полезные в данном изобретении, используют для количественного и качественного определения 1Ь-18ВР или вирусного 1Ь-18ВР или родственных белков в образце или для определения присутствия в клетках, которые экспрессируют такие белки данного изобретения. Это осуществляют иммунофлуоресцентными методами, применяющими флуоресцентно меченные антитела (см. ниже), в сочетании с световой микроскопией, проточной цитометрией и флуориметрическим определением.

Антитела (или их фрагменты), полезные в данном изобретении, применяют гистологически для иммунофлуоресцентной и иммуноэлектронной микроскопии, для определения ίη кйи 1Ь-18ВР или вирусного 1Ь-18ВР или родственных белков данного изобретения. Определение ίη κίΐιι включает взятие гистологического образца у пациента и обеспечение такого образца меченым антителом данного изобретения. Предпочтительно антителом обеспечивают нанесением или присоединением меченого антитела (или фрагмента) к биологическому образцу. Применение такого способа сделало возможным определение не только присутствия 1Ь18ВР или вирусного 1Ь-18ВР, или родственных белков, но также определение его распределения в исследуемой ткани. Применяя способ данного изобретения, каждый из специалистов в данной области быстро заметит, что любой из большого разнообразия гистологических методов (таких как процедуры окрашивания) можно модифицировать для проведения подобного определения ίη κίΐιι.

Такой анализ для 1Ь-18ВР или вирусного 1Ь-18ВР, или родственных белков данного изобретения обычно включает в себя инкубацию биологического образца, такого как биологическая жидкость, экстракт ткани, свежеполученные клетки, такие как лимфоциты или лейкоциты, или клетки, которые инкубируют в культуре ткани, в присутствии эффективно меченного антитела, способного идентифицировать 1Ь18ВР или родственные белки, и определение антитела посредством любой из ряда технологий, хорошо известных в данной области.

Биологический образец обрабатывают твердофазной подложкой или носителем, таким как нитроцеллюлоза, или твердой подложкой, или носителем, которые иммобилизуют клетки, клеточные частицы или растворимые белки. Подложку или носитель затем промывают соот ветствующим буфером с последующей обработкой эффективно меченым антителом согласно данному изобретению. Твердофазную подложку или носитель затем промывают буфером второй раз, чтобы удалить несвязанные антитела. Количество связанной метки на твердой подложке или носителе определяют общепринятыми методами.

Термины «твердофазная подложка», «твердофазный носитель», «твердая подложка», «твердый носитель», «подложка» или «носитель» подразумевают любую подложку или носитель, способные связывать антиген или антитела. Хорошо известные подложки или носители включают стекло, полистирол, полипропилен, полиэтилен, декстран, найлон амилазы, природные и модифицированные целлюлозы, полиакриламиды, габро и магнетид. Для целей данного изобретения носитель может быть растворимым до некоторой степени или нерастворимым. Материал подложки имеет любую возможную структурную конфигурацию такой длины, что сопряженная молекула способна связывать антиген или антитело. Так, конфигурация подложки или носителя является сферической как шарик или цилиндрической как внутренняя поверхность опытной пробирки, или как внешняя поверхность стержня. Альтернативно, поверхность плоская, как лист, тестполоска и т.д. Предпочтительные подложки и носители включают гранулы полистирола. Специалистам в данной области известны многие другие носители для связывания антитела или антигена, или они смогут установить то же самое посредством обычного экспериментирования.

Связывающую активность данной партии антител согласно данному изобретению определяют в соответствии с хорошо известными способами. Специалисты в данной области устанавливают эффективные и оптимальные условия исследования для каждого определения посредством обычного экспериментирования.

Другие стадии, такие как промывание, перемешивание, встряхивание, фильтрование и подобное, добавляют в исследование, когда необходимо в определенной ситуации.

Одним из способов, по которому согласно данному изобретению антитело эффективно метят, является связывание антитела с ферментом и применение в иммуноферментном анализе (ΕΙΑ). Этот фермент, в свою очередь, при экспозиции с соответствующим субстратом, взаимодействует с субстратом с образованием химического компонента, который определяют, например, с помощью спектрофотометрического, флуориметрического или визуального способов. Ферменты, которые используют для эффективного мечения антител, включают, но не ограничиваются, малатдегидрогеназу, стафилококковую нуклеазу, дельта-5-стероидизомеразу, алкогольдегидрогеназу, альфа глицерофосфатдегидрогеназу, триозофосфатизомеразу, пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, аспарагиназу, пиранозооксидазу, бетагалактозидазу, рибонуклеазу, уреазу, каталазу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, глюкоамилазу и ацетилхолинэестеразу. Определение осуществляют колориметрическими методами, в которых употребляют хромогенный субстрат для фермента. Определение также проводят посредством визуального сравнения степени энзиматической реакции субстрата по сравнению с аналогично приготовленными стандартами.

Определение выполняют, используя любой из целого ряда других иммунологических анализов. Например, радиоактивным мечением антител или фрагментов антител, определяют 1Ь18ВР или вирусный 1Б-18ВР посредством применения радиоиммунного анализа (ША). Хорошее описание Κ1Α имеется в ЬаЬотакоту ТесЬпк|ис5 апб Вюсйешйкту ίη Мо1еси1аг Вю1оду, ву Аогк. Т.8. е1 а1., №г111 Но11апб РиЫйЫпд Сотрапу, ΝΥ (1978) с особой ссылкой на главу, озаглавленную Ап йШобисОоп 1о К.абю1ттипо Л55ау апб Ве1а1еб ТесЬшдиек Ьу СЬатб, Т., введенную в описание цитированием. Радиоактивный изотоп определяют с помощью таких средств, как применение гамма-счетчика или сцинтилляционного счетчика, или посредством авторадиографии.

Согласно данному изобретению антитело метят флуоресцентным соединением. Когда флуоресцентно меченное антитело подвергают действию света, надлежащей длины волны, его присутствие определяют по флуоресценции. Обычно наиболее используемыми соединениями для флуоресцентного мечения являются флуоресцеин изотиоцианат, родамин, фикоэритрин, фикоцианин, аллофикоцианин, о-фталевый альдегид и флуорескамин.

Антитела также эффективно метят, используя металлы, испускающие флуоресценцию, такие как ¹⁵²Еи или другие из серии лантанидов. Эти металлы присоединяют к антителу, используя такие металл-хелатирующие группы как диэтилентриаминпентауксусная кислота (ЕТРА).

Антитело эффективно метят связыванием его с биотином. Биотинилированное антитело затем определяют с помощью авидина или стрептавидина, присоединенных к флуоресцентному соединению или ферменту, такому как пероксидаза, или к радиоактивному изотопу и подобным.

Также антитело эффективно метят, присоединяя его к хемилюминисцентному соединению. Присутствие хемилюминисцентно-меченного антитела затем определяют, детектируя люминисценцию, которая возникает в ходе химической реакции. Примерами особенно полезных люминисцентно-меченных соединений являются луминол, изолуминол, тероматический эфир акридина, имидазол, соль акридина и эфир щавелевой кислоты.

Подобным образом биолюминисцентное соединение используют для мечения антитела данного изобретения. Биолюминисценция представляет собой вид хемилюминисценции, обнаруженной в биологических системах, в которых каталитический белок увеличивает эффективность хемилюминисцентной реакции. Присутствие биолюминисцентного белка определяют по наличию люминисценции. Для мечения важными биолюминисцентными соединениями являются люциферин, люцифераза и экворин.

Молекулу антитела данного изобретения адаптируют для применения в количественном иммуноанализе, также известном как «двасайта» или «сэндвич-анализ». В типичном количественном иммуноанализе большое количество немеченных антител (или фрагмента антитела) связывают с твердой подложкой или носителем и добавляют эффективно меченные растворимые антитела, чтобы сделать возможным выявление и/или количественный анализ тройного комплекса, образованного между твердофазным антителом, антигеном и меченым антителом.

Типичный и предпочтительный количественный иммуноанализ включает «прямой» анализ, в котором антитело, связанное с твердой фазой, сначала контактирует с тестируемым образцом, чтобы извлечь антиген из образца посредством образования двойного комплекса твердофазное антитело-антиген. После соответствующего периода инкубации твердую подложку или носитель промывают для удаления остатков жидкого образца, включая непрореагировавший антиген, если это вообще требуется, а затем осуществляют контакт с раствором, содержащим неизвестное количество меченых антител, которое функционирует как комплекс твердофазное антитело-антиген. После соответствующего периода инкубации твердую подложку или носитель промывают для удаления остатков жидкого образца, включая непрореагировавший антиген, если это вообще требуется, а затем осуществляют контакт с раствором, содержащим неизвестное количество меченых антител (которое функционирует как «репортерная группа»). После второго периода инкубации, в течение которого меченое антитело образует комплекс с антигеном, связанным с твердой подложкой или носителем посредством немеченого антитела, твердую подложку или носитель промывают второй раз для удаления непрореагировавших меченых антител.

В другом типе иммуноанализа - «сэндвичанализе», который успешно проводят с антигеном данного изобретения, используют так называемые «одновременный» и «обратный» анализ. «Одновременный» анализ включает в себя одну стадию инкубации, когда антитело, связанное с твердой подложкой или носителем, и меченое антитело - оба добавляют к тестируемому об разцу одновременно. После завершения инкубации, твердую подложку и носитель промывают для удаления остатка жидкого образца и меченого антитела, не включенного в комплекс. Присутствие меченого антитела, ассоциированного с твердой подложкой или носителем, определяют с помощью общепринятого «прямого» сэндвич-анализа.

В «обратном» анализе используют ступенчатое добавление сначала раствора меченого антитела к жидкому образцу, за которым следует добавление немеченого антитела, связанного с твердой подложкой или носителем, после соответствующего периода инкубации. После второй инкубации твердую фазу промывают общепринятым способом для удаления остатка исследуемого образца раствора непрореагировавшего меченого антитела. Определение меченого антитела, связанного с твердой подложкой или носителем, осуществляют как в случае «одновременного» и «прямого» анализов.

Данное изобретение также предусматривает молекулы ДНК, кодирующие любые из белков данного изобретения, которые описаны выше, реплицируемые носители экспрессии, содержащие любые такие молекулы ДНК, клеткихозяева, трансформированные любым таким экспрессирующим носителем, включая прокариотические и эукариотические клетки-хозяева, предпочтительно клетки СНО. Изобретение также включает в себя способ для продукции экспрессирующих векторов, кодирующих любой из белков данного изобретения, с целью их экспрессии у людей и других млекопитающих.

В изобретение также включают способ получения любого из белков данного изобретения посредством культивирования трансформированной клетки, согласно данному изобретению, и возвращение белка, кодируемого молекулой ДНК, и экспрессирующего носителя в такую трансформированную клетку-хозяина.

Кроме использования 1Б-18ВР или вирусного 1Б-18ВР для модулирования активности 1Ь18, их также применяют для очистки самого 1Ь18. С этой целью 1Б-18ВР или вирусный 1Ь18ВР связывают с аффинной колонкой и пропускают неочищенный 1Б-18. Затем 1Б-18 извлекают с колонки посредством, например элюции при низком рН.

Далее изобретение иллюстрируют следующими неограничивающими примерами.

Пример 1. Выделение белка, связывающего Ш-18.

1Б-18 Е.соБ (2,5 мг, Рсрго1сс11. N1) присоединяют к АЙ1де1-10 (0,5 мл, В1оКаб), в соответствии с инструкциями производителя, и упаковывают в колонку. Неочищенный белок мочи (сконцентрированной в 1000 раз, 500 мл) наносят на колонку при низкой скорости 0,25 мл/мин. Колонку промывают 250 мл 0,5 М №1С1 в фосфатном буферном растворе (РВ8). Связанные белки затем элюируют 25 мМ лимонной кислоты рН 2,2 и бензамидином (1 мМ), немедленно нейтрализуют 1 М №₂СО₃. Собирают фракции по 1 мл. Фракции анализируют с помощью δΌδ-РАОЕ и окрашивания серебром. Белок, связывающий ГЬ-18, элюируется во фракциях 2-8 в виде белка 40000 Да (фиг. 1). В зоне 40 кДа, соответствующей ГЬ-18ВР, при окрашивании серебром проявляется отчетливый желтый цвет. Анализируют различные фракции посредством поперечного связывания с ¹²⁵Г-ГЬ18, δΌδ-РАОЕ и авторадиографии как описывают в примере 2. Белок, связывающий ГЬ-18, обнаруживают во фракциях 2-8, элюированных с колонки с ГЬ-18-агарозой (фиг. 2).

Пример 2. Поперечное связывание аффинно-очищенного ГЬ-18ВР с меченым ГЬ-18.

Образцы (40 мкл) ГЬ-18ВР после первой стадии очистки инкубируют (70 мин при 4°С) с ¹²⁵Г-ГЬ-18 (5000000 срт - число импульсов в минуту). Дисукцинимидил суберат (Ό88), растворенный в диметилсульфоксиде (Ме₂8О, 20 мМ), добавляют до конечной концентрации 2 мМ и смесь оставляют в течение 20 мин при 4°С. Реакцию останавливают добавлением 1 М трисНС1, рН 7,5 и 1 М №С1 до конечной концентрации 100 мМ. Добавляют образец буфера, содержащего дитиотрейтол (ΌΤΤ, 25 мМ конечная) и смеси анализируют в δΌδ-РАОЕ (7,5% акриламид) с последующей авторадиографией (фиг. 2).

Особую зону с молекулярной массой 58 кДа, вероятно содержащую белок ~40 кДа поперечно-связанный с ¹²⁵Г-ГЬ-18 ~20 кДа, обнаруживают во фракциях, элюированных с ГЬ-18аффинной колонки (дорожки 2 и 3), но не в промывной жидкости с колонки (дорожка 1), содержащей все другие неочищенные белки мочи.

Пример 3. Анализ последовательности белка.

Элюированные фракции с аффинной колонки примера 1 разделяют с помощью 8Ό8РАОЕ (10% акриламид) при невосстанавливающих условиях, электроблоттинга на РУЭР мембране (Рго-В1о1, Аррйе^ Вю8у81ет8, ϋδΑ). Мембрану окрашивают кумасси голубым, вырезают зону ~40 кДа и проводят анализ белковой последовательности с помощью микросеквенатора Ргес18е (Аррйе^ Вюзу81ет8, ϋδΑ). Получена следующая основная последовательность:

Τ-Ρ-ν-3-Ώ-Ο-χ-χ-χ-Α-Α-Α

1.......5 10 где х представляет собой еще не установленные аминокислоты. Кроме того, получена минорная последовательность

Α-χ-Υ-χ-Η-I-Р-А-х-А-I-А

10

Из-за этой двойной последовательности невозможно получить данные относительно более длинной последовательности. Минорную последовательность идентифицируют как фрагмент дефенсина человека (№ доступа р11398), начиная с 65 аминокислоты дефенсина. Основную последовательность не связывают ни с одним известным белком, основываясь на исследованиях всех доступных баз данных в NСВГ и ТГОК с помощью Ь1ак1р и 1Ыа81п программ исследования.

Для того чтобы получить более длинную и более точную последовательность и для того чтобы идентифицировать предполагаемые остатки цистеина, другую аликвоту фракции, элюированной с колонки ГЬ-18-агарозы, восстанавливают ΌΤΤ в 6 М гуанидине НС1, проводят реакцию с 4-винилпиридином, обессоливают с помощью микроультрафильтрационного устройства (и11га£гее, си1о££ 10 000 Эа11оп8, М1Шроге) и проводят определение первичной структуры короткого фрагмента молекулы белка. После цикла № 1 секвенирования, фильтер взаимодействует с о-фталевым альдегидом, чтобы блокировать все Ν-концевые полипептиды другие, чем Рго. По этому способу получают только основную последовательность, как следующая: ТРУЗОХХХАА ХАЗУКЗТКИР СРЗОРРУЕРА АКССОАЬЕУТ

10 20 30 40 (Τ ΤΙτγ; Р=Рго; У=Уа1; δ=δе^; р=О1п; Х=неустанов.; А=А1а; К=Аг§; К=Ьу8; Ό=Α8ρ; С=Су8; Р=РНе; 1.1.еи; Е=О1и)

В циклах 6, 7, 8 и 11 получают низкий уровень сигнала ΤΗγ. Из-за этого низкого уровня его рассматривают более осторожно, чтобы не обозначить данный аминокислотный остаток в названных циклах.

Полученная последовательность значительно отличается от последовательности любого другого известного белка, что установлено исследованием баз данных по структуре белка. Однако исследование база данных ΤΚ'ΐΙν с помощью 1Ыа81п программы исследования обеспечило файл кДНК, обозначенный ТНС12801, открытая рамка считывания (218 кодон) которого, когда транслируется, содержит последовательность высоко гомологичную Ν-концевой последовательности ГЬ-18ВР. Настоящим представлена гомология

.......ΤΡνΒΟΧΧΧΑΆΧΑΒνΚδΤΚΟΡΟΡδΟΡΡνΓΡΑΑΚΚΡΑΙΧνΤ. . . 40

I I I II I I I I I I 11 I I I I I I I I I I I I I I I ! I I I I Г νΤΣΤνΚΑΤΧνΧΏΤΤΤΑΑΤΑ3νΗ5ΤΚΟΡΟΡ3ΰΡΡνΡ₽ΑΑΚ20ΡΑΣΕνΤΗΡΕ 100 (Верхняя последовательность (1-40) представляет собой последовательность ГЬ-18ВР, выделенного согласно изобретению; нижняя последовательность (51-100) получена трансляцией кДНК из файла ТНС123801 ΤΙ0Ή).

Предполагаемая белковая последовательность, полученная транслированием файла ТНС12801, вызывает сомнения в отношении остатков 2 и 4 ГЬ-18ВР. Она подтверждает идентичность аминокислотных остатков 6, 7 и 8 ГЬ18ВР как ΤΗγ и, по-видимому, подходит также для остатка 11.

Пример 4. ГЬ-18ВР является гликопротеином.

Аликвоту (0,3 мл) элюированных фракций примера 1 очищают далее гель-хроматографией на колонке 8ирего§е 12 (1 х 30 см, Рйатташа, 8\\'ебеп). Колонку предварительно уравновешивают и элюируют фосфатным буферным раствором и азидом натрия (0,02%) при скорости течения 0,5 мл/мин и собирают фракции по 1 мл. Белок, связывающий ΙΠ-18, элюируется во фракциях 20-25 как белок ~40000 Да, что устанавливают методом 8Э8-РАОЕ и окрашиванием серебром. Образец, содержащий белок ~40000 Да (фракция 23, 50 мкл, 50 нг белка) взаимодействует с Ν-гликозидазой Ρ (РХО-ахе Ρ, ВюКаб) согласно инструкции. Кратко, аликвоту денатурируют кипячением в присутствии 5% 8Ό8 в течение 10 мин, 10 х 07 буфера (2,5 мкл), 10% №-40 (2,5 мкл) и РХОахе Ρ (1 мкл), 1 ч при 37°С. Образец анализируют методом 8Э8-РАОЕ (10% акриламид) при невосстанавливающих условиях и сравнивают с негидролизованным Ш-18ВР из такой же фракции с 8ирего§е 12. Показано, что зона 40 кДа Ш-18ВР исчезает из фракции, обработанной РХОахе. Выявляют новые зоны, соответствующие 30 кДа (даже выше зоны РХСахе) и 20 кДа. Исчезновение зоны 40 кДа указывает, что эта зона является Νгликозилированным белком.

Пример 5. Блокирование биологической активности ΙΠ-18 с помощью [Ш-18ВР.

Способность ЕЕ-18ВР, выделенного из мочи, блокировать активность ΙΒ-18 определяют посредством измерения индуцированной ΙΒ-18 продукции ΙΡΝ-γ в мононуклеарных клетках. Ш18 индуцирует ΙΡΝ-γ, если добавляют вместе или с низкими концентрациями ЕР8, ΙΕ-12, ΙΕ-2, или с другими стимуляторами. Активность Ш18 тестируют в спленоцитах мыши, в мононуклеарных клетках периферической крови (РВМС) человека и в линии КО-1 клеток человека. Клетки селезенки получают от здоровых мышей, промывают, суспендируют в среде ΚΓΜΙ 1640, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой при 5х10⁶ клеток/мл, 1,0 мл культуры стимулируют ЕР8 (или 0,5 или 1 мкг/мл) вместе с рекомбинантным ΙΒ-18 человека или мыши (или 0,5 или 5 нг/мл). ΙΕ-18-связывающий белок человека (0,5 или 50 нг/мл) добавляют к рекомбинантному ΙΒ-18 перед добавлением к клеткам селезенки. После культивирования в течение 24 ч, клетки селезенки подвергают трем циклам замораживания (-70°С) и оттаивания (комнатная температура), клеточный дебрис удаляют центрифугированием, а супернатант анализируют в отношении ΙΡΝ-γ, используя ЕЫ8А-наборы для ΙΡΝ-γ мыши (Епйодеп). Как показывают на фиг. 3А, Ш-18ВР блокирует активность НиЮ-18 (человека) в слленоцитах мыши дозазависимым способом. В отличие от этого используемый в качестве контроля растворимый рецептор интерферона-α/β не оказывает никакого действия. Аналогично, Ю- 18ВР человека ингибирует активность рекомбинантного ΙΒ-18 мыши, позволяя предположить, что Ю-18ВР человека распо знает ΙΒ-18 мыши (фиг. 3В). В спленоцитах мыши высокие концентрации ЬР8 индуцируют эндогенный ΙΒ-18, приводя к продукции ΙΡΝ-γ. Действительно, индукция ΙΝΡ-γ посредством ЬР8 также ингибируется ЕБ-18ВР мочи (фиг. 3С). Конканавалин А (Соп А) активирует Тклетки, чтобы продуцировать ΙΡΝ-γ в отсутствие ΙΒ-18 (13). Действительно, индукция ΙΡΝ-γ конканавалином Ф не ингибируется посредством Ю-18ВР даже при высоких концентрациях (фиг. 3Д). Эти данные демонстрируют, что Ш18ВР является специфически ингибитором биоактивности ΙΒ-18 скорее, чем неспецифическим ингибитором продукции ΙΡΝ-γ. Ш-^ВР также ингибирует активность ΙΒ-18 человека в КО-1 клетках человека, индуцированную сочетанием Ш-18 и ΤΝΡ-α (фиг. 3Е).

Вышепредставленные данные демонстрируют, что ЕЕ-18ВР мочи ингибирует активность ΙΒ-18 человека, а также мыши, что оценивают посредством коиндукции ΙΡΝ-γ в мононуклеарных клетках человека и мыши. Концентрация ЕЕ-18ВР, которая снижает активность ΙΒ-18 на >90%, сравнима с концентрацией самого ΙΒ-18, позволяя предположить высокое сродство взаимодействия между этими двумя белками.

Пример 6. Выделение клонов кДНК, кодирующих Ш-18ВР.

Тотальная РНК из юркатных Т-клеток (СКБ 8163, Атепсап Τуре СнИиге Со11ес11оп) обратно-транскрибирована с 8ирег8спр1 Кпаке Н обратной транскриптазой (О1Ьсо-ВКЕ) и произвольными праймерами (Рго те да, Майкоп XVΙ). Затем полученные фрагменты кДНК амплифицируют посредством РСК, используя ΤадДНК полимеразу (81дта) и праймеры, соответствующие нуклеотидам 24-44 (смысловой) и 500-481 (обратный) клона ТНС12801 ΤΙΟΚ. Амплификацию проводят в 30 циклах отжига (55°С, 2 мин) и элонгации (70°С, 1 мин). Полученные продукты РСК разделяют методом электрофореза в агарозном геле (1%), элюируют и клонируют с рОЕМ^еаку ТА вектором клонирования (Рготеда). ДНК из индивидуальных клонов секвенируют с Т7 и 8Р6 праймерами.

Полученный фрагмент 477 пар оснований метят ³²Р посредством рендом-праймирования. Этот зонд используют для скрининга различных кДНК человека и геномных библиотек. Двойные нитроцеллюлозные фильтры подвергают гибридизации с зондом при 60°С в буфере, содержащем 6 х 88С, 10х раствор Денхардта, 0,1% 8Ό8 и 100 мкг/мл ДНК спермы лосося. Фильтры промывают и выдерживают в течение ночи при -80°С на пленке Койак ХАК. Двойные позитивные клоны очищают из колоний. Плазмиды вырезаются из Х-рСЕУ9 клонов и плазмиды самолигируются. кДНК из других библиотек выделяют согласно инструкциям авторов. Автоматизированный анализ последовательности ДНК из выделенных клонов проводят на секвенаторах моделей 373А и 377 (ЛррИеб Вюзу^ешз), используя смысловой и антисмысловой праймеры. Используют стандартные протоколы для этих процедур копирования (33).

Проведен скрининг следующих библиотек: библиотека кДНК моноцитов человека, сконструированная в λ-рСЕУ9 векторе клонирования (15), любезно предоставленная Т. М1к1 библиотека кДНК юркатных лейкозных Т-клеток человека, библиотека кДНК лейкоцитов периферической крови человека, все от С1оп1есЕ (Ра1о А11о<СА). Геномная библиотека плаценты человека в лямбда- Е1Х II векторе получена от 81га1а§епе (Ьа 1о11а, СА).

Получены и охарактеризованы все клоны кДНК, соответствующие четырем различным вариантам сплайсинга 1Б-18ВР. Все варианты сплайсинга кодируют предполагаемые растворимые секретируемые белки. Наиболее преобладающий вариант (1Ь-18ВРа) имеет открытую рамку считывания из 192 кодонов, кодирующую сигнальный пептид из 28 аминокислотных остатков с последующим зрелым предполагаемым 1Ь-18ВРа, первые 40 остатков которого (8Е9 ΙΏ ΝΟ: 10) полностью совместимы с Ν-концевой белковой последовательностью 1Б-18ВР мочи (8Е9 ΙΌ ΝΟ: 2). Положение остатков цистеина позволяет предположить, что этот полипептид принадлежит к супер-семейству иммуноглобулинов (1д). Каждый их четырех остатков О1п в зрелом 1Ь-18ВРа является возможным участком Ν-гликозилирования. Другие три варианта сплайсинга 1Б-18ВР имеются в значительно меньшем количестве.

Другая кДНК 1Ь-18ВРЬ 1 т.п.н. кодирует зрелый белок из 85 аминокислотных остатков (8Е9 ΙΌ ΝΟ: 4). Третий вариант, 1Ь-18ВРс, представляется 2,3 т.п.н. кДНК, кодирующей зрелый 1Б-18ВР из 169 аминокислотных остатков (8Е9 ΙΌ ΝΟ: 6). Четвертый вариант, ВЬ18ВР6, кодирует зрелый 1Б-18ВР из 133 аминокислотных остатков (δЕ^ ΙΙ) ΝΟ: 8). Внутриэкзонный сплайсинг происходит в двух сайтах вдоль про-мРНК. Эти явления и дополнительный 5' экзон в Ш-18ВРа приводят к 3 различным 5' ИТКз в разных клонах кДНК. Поэтому вполне возможно, что различные варианты Ш-18ВР образуются в ответ на определенные сигналы регуляции транскрипции.

До сих пор не обнаружено ни одной кДНК, кодирующей рецептор с трансмембранным доменом.

Пример 7. Конструкция экспрессирующего вектора млекопитающих, продукция рекомбинантного Ш-18ВР и оценка биологических активностей рекомбинантного Ш-18ВР.

Кодирующую область кДНК Ш-^ВРа амплифицируют посредством РСК со смысловым праймером ’ ТАТАТСТАСАСССАССАТСАСАСАСААСТССАСАССА и обратным праймером:

5¹АТАТСТАСАТТААТСАТ6АТЕАТЕАТСАТСАСССТССТ0СТСТССАСТСС

Продукты РСК вырезают посредством ХЬа 1 и клонируют в сайте ХЬа Ι рЕЕ-ВΟ8 экспрессирующего вектора (25), чтобы получить рЕЕВΟδ-I^-18ВРа. Конструкции подтверждают секвенированием ДНК.

Серии 6х10⁷ СΟ87 клеток в 1,4 мл ТЭбуфера, содержащего плазмидную ДНК рЕЕВΟδ-I^-18ВРа (10 мкг) и ДЕАЕ-декстран (120 мкг), инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре, как описывают (35). Клетки затем промывают ДМЕМ-10% фетальная бычья сыворотка, культивируют в течение 4 ч в ДМЕМ-10, промывают и инкубируют в течение 3-5 дней в бессывороточной среде ДМЕМ. Культуральную среду собирают, концентрируют в 6 раз ультрафильтрацией (10 кЭ си1о1Т) и выделяют Ш-^ВР-Нт^ на колонке Та1оп (С1оп1есЕ) с имидазолом в качестве элюента согласно инструкции авторов.

Иммунологическую перекрестную реактивность мочевого и СΟ87-экспрессированного П.-18ВР оценивают следующим образом: Ш18ВР мочи (5 мкг) метят ¹²⁵Ι по способу с хлорамином Т. Супер-натанты СС)87 клеток (250 мкл) смешивают (1 ч, комнатная температура) с антителами к Ш-^ВР мочи, разбавляют 1:1000 в забуференном фосфатом растворе (РВ8), 0,05% твине 20 и 0,5% бычьем сывороточном альбумине (АакК ВиКег). Затем добавляют ΙΕ18ВР мочи (10⁶ импульсов в минуту) и через 1 ч добавляют белок-О-зерйагозе (20 мкл). Смесь суспендируют (1,5 ч, 4°С), затем гранулы изолируют и промывают 3х АакК ВиКег и раз в РВ8. Гранулы элюируют буфером для образца, разделяют методом 8П8-РАОЕ (10% акриламид) при восстанавливающих условиях с последующей авторадиографией.

Ш-18ВРа движется в виде одной зоны на δΠδ-РАОЕ с окрашиванием серебром при восстанавливающих и невосстанавливающих условиях и имеет такую же кажущуюся молекулярную массу, как масса Ш-18ВР мочи (данные не представлены). При анализе последовательности белка этого препарата выявляют такую же Ν-концевую последовательность как последовательность Ш-^ВР мочи, указывая, что последний не деградируется на Ν-конце.

Иммуноблотинговый анализ Ш-18ВР с антителами, полученными против Ш-18ВР мочи, выявляет зону с такой же молекулярной массой как масса белка мочи. Кроме того, используя иммунопреципитацию с последующими δϋδРАОЕ и авторадиографией, показывают, что ΙΕ19ВРа способен вытеснять ¹²⁵ЫЕ-18ВР мочи из комплекса с антителами. Поэтому, Ш-^ВРа структурно соответствует Ш-^ВР мочи.

Исследуют способность неочищенного и очищенного Ш-18ВРа ингибировать биологическую активность К-18. Ш-^ВРа ингибирует дозазависимым способом индуцирующую ΙΕΝ-γ активность ΙΕ-18 человека и мыши в спленоци37 тах мыши, РВМС и в линии КС-1 клеток человека (фиг. 9).

Результаты различных биоисследований, а также анализ изменения подвижности (пример 8) показывают, что ингибирование активности ГЬ-18 является свойством присущим клонированному 1Ь-18ВР, а не свойством сопутствующих примесей в 1Ь-18ВР мочи, таких как коэлюирующийся фрагмент дефенсина.

Пример 8. Анализ изменения электрофоретической подвижности.

Изучают влияние мочевого и рекомбинантного 1Ь-18ВР на индуцированную ΙΌ-18 активацию ΝΕ-кВ в КС-1 клетках человека. КС1 клетки человека (4х10⁶ в 1 мл КМР1) стимулируют или йи1Ь-18 (человека) (10 нг/мл), или йи1Ь-18, предварительно смешанным с 1Ь-18ВР (20 мин, комнатная температура). После 20 мин при 37°С, клетки три раза промывают охлажденным льдом РВ8 и немедленно замораживают в жидком азоте. Клеточные осадки повторно суспендируют в трехкратном упаковочном колоночном объеме буфера А (20 мМ трис рН 7,6, 0,4 М №С1, 0,2 мМ ΕΌΤΑ, глицерин (20% по объему), 1,5 мМ МдС1₂, 2 мМ дититрейтол (ΌΌΤ), 0,4 мМ РМ8Е, 1 мМ №₃УО₄ 2 мкг/мл каждого из лейпептина, пепстагина и апротинина). Клеточный дебрис удаляют центрифугированием (15000 х д, 15 мин), аликвоты супернатанта замораживают в жидком азоте и хранят при -80°С. Концентрацию белка определяют по методу Бредфорда (Вю-Кай), используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта. Двухцепочечный олигонуклеотид, соответствующий элементу, связывающему ΝΕ-кВ (10 пмол, Рготеда), метят [³²Р]йСТР (300 Ки/ммол) и Т4 полинуклеотидкиназой (Νονν Епд1апй Вю1аЬ§). Свободные нуклеотиды удаляют центрифугированием с нанесением препарата на спинколонку. Экстракты (10 мкг белка) клеток, обработанные ΙΌ-18 или 1Ь-18+1Ь-18ВР, инкубируют (15 мин, комнатная температура) с меченым зондом (3 х 10⁴ импульсов в минуту) вместе с поли Й1.ЙС (500 нг, РНаппааа) и денатурированной ДНК спермы лосося (100 нг, 81дта) в 20 мкл буфера, содержащего НЕРЕ8 (рН 7,5, 10 мМ), 60 мМ КС1, 1 мМ МдС1, 2 мМ ΕΌΤΑ, 1 мМ ОТТ и глицерин (5% по объему). Затем смеси наносят на 5% неденатурирующие полиакриламидные гели. Электрофорез проводят при 185 Вт в 0,5 х ТВЕ (40 мМ трис НС1, 45 мМ борной кислоты и 2,5 мМ ΕΟΤΑ). Гели высушивают под вакуумом и проводят авторадиографию всю ночь при -80°С. Обнаружено, что ΙΌ-18 индуцирует образование гомодимера р50 ΝΕ-кВ и гетеродимера р65/р50 ΝΕ-кВ. Мочевой, а также рекомбинантный [Б-18ВР ингибирует активацию ΝΕ-кВ, вызванную ГС-18, что устанавливают по анализу изменения электрофоретической подвижности с экстрактами КС-1 клеток, связывающими радиоактивный олигонуклеотид, со ответствующий согласованной последовательности ΝΕ-кВ.

Пример 9. Экспрессия Ш-ЩВР в Е.со11, клетках дрожжей и насекомых.

^-^ВР также продуцируется другими рекомбинантными клетками, такими как прокариотические клетки, например Е. со11, или другими эукариотическими клетками такими как клетки дрожжей и насекомых. Имеются хорошо известные способы для конструирования соответствующих векторов, несущих ДНК, которые кодируют любой ^-^ΡΕ, и пригодны для трансформирования Е.сой и клеток дрожжей, или инфицирования клеток насекомых для того, чтобы продукцировать рекомбинантный ΙΌ18ВР. Для экспрессии в клетках дрожжей, ДНК, кодирующую ^-1860 (пример 6) вырезают и вставляют в экспрессирующие векторы, подходящие для трансфекции клеток дрожжей. Для экспрессии в клетках насекомых, ДНК, кодирующую ЕЕ-18ВР, вставляют в бакуловирус, а клетки насекомых инфицируют вышеназванным рекомбинантным бакуловирусом. Для экспрессии в Е.со11, ДНК, кодирующую Ю-18ВР, подвергают сайтнаправленному мутагенезу с соответствующими олигонуклеотидами с тем, чтобы ΑΤС кодон инициации вставить именно до первого кодона зрелого ЕЕ-18ВР. Альтернативно, такую ДНК получают посредством РСК с соответствующими смысловым и антисмысловым праймерами. Полученные ДНК-конструкции затем вводят в прокариотические экспрессирующие векторы, соответственно сконструированные посредством технологий, хорошо известных на данном уровне техники (23).

Пример 10. Конструкция экспрессирующего вектора, ассоциированного с аденовирусом, для экспрессии Ш-ЩВРа ίη νί\Ό.

Функциональный ген, кодирующий ΙΌ18ВРа, конструируют на основе плазмидной рсОНА3 (Iην^ί^одеη, 8ап О1едо СА). кДНК ΙΌ18ВР с Кохак-согласованной последовательностью на 5' конце сшивают в сайте ХЬа рсОНА3 по способу, который разрушает сайт рестрикции. Новые ХЬа 1 сайты вставляют посредством сайтнаправленного мутагенеза до неомициновой кассеты (основание 2151 исходной последовательности рсОНА3) и после сигнала поаденилирования 8У40 (основание 3372 исходной последовательности рсОНА3). Эту конструкцию вырезают посредством ХЬа1 и полученный 4,7 т.п.н. миниген вставляют в ХЬа1-сайт плазмидной р§цЬ201 как описывают (8пуйег е! а1., 1996, СиггеШ РгоЮсоЕ ш Нитап Сепейск, СйарЫь

12.1.1-12.1.17, Йо1т ^11еу & 8оп§). Полученную рекомбинантную плазмиду котрансфицируют с хелпер ААУ плазмидой рААУ/Ай в Т293 клетки человека. Культуры затем инфицируют аденовирусом в качестве хелпер-вируса и клетки собирают после 48-60 ч инкубации. Клетки подвергают 3 циклам замораживания-оттаивания, клеточный дебрис удаляют центрифугировани ем, а супернатант насыщают сульфатом аммония 33% насыщения. Затем смесь центрифугируют, а ΓΑΑν осаждают из супернатанта сульфатом аммония при 50% насыщения. Далее вирус очищают посредством СкС1, диализуют и, наконец, нагревают в течение 15 мин при 56°С, чтобы уничтожить любой вирус.

Пример 11. Конструкция рекомбинатных белков слияния1Ь-18ВР.

Получение белков, содержащих 1Ь-18ВР, слитых с константной областью тяжелой цепи 1дС2, проводят следующим образом: ДНК 1Ь18ВР подвергают сайтнаправленному мутагенезу с соответствующими олигонуклеотидами с тем, чтобы ввести уникальный сайт рестрикции непосредственно перед и после кодирующих последовательностей. Плазмиду, несущую константную область тяжелой цепи 1дС2, например рККСО42Рс1 (6), подвергают подобному сайтнаправленному мутагенезу, чтобы ввести тот же уникальный сайт рестрикции так близко, как возможно к Акр 216 тяжелой цепи 1дС1 по способу, который допускает трансляцию в фазе слитого белка. Фрагмент άκΌΝΑ, состоящий из 5' нетранслированных последовательностей и кодирующий 1Ь-18ВР, получают посредством расщепления в уникальных сайтах рестрикции или, альтернативно, посредством РСК с соответственно сконструированными праймерами. Аналогично расщепляют мутантный рККСО42Рс1, чтобы образовать большой фрагмент, содержащий плазмиду и последовательности 1дС1. Затем два фрагмента лигируют с образованием новой плазмиды, кодирующей полипептидный предшественник, состоящий из 1Ь-18ВР и приблизительно 227 С-концевых аминокислот 1дС1 (область петли и СН2 и СН3 домены). ДНК, кодирующую рекомбинантные белки, выделяют из плазмиды посредством рестрикции соответствующими ферментами рестрикции, а затем вводят в эффективные прокариотические и эукариотические экспрессирующие векторы.

Пример 12. Получение химически модифицированных 1Ь-18ВР.

Для увеличения периода полу-жизни 1Ь18ВР в плазме, получают 1Ь-18ВР, которые химически модифицируют полиэтиленгликолем (РЕС). Модификацию осуществляют поперечным сшиванием РЕС с остатком цистеина молекулы 1Е-18ВР. Конструируют мутантные 1Ь18ВР, которые содержат дополнительный остаток цистеина на аминоконцах, в участках гликозилирования и на карбоксильных концах каждого 1Е-18ВР. Мутагенез осуществляют методом РСК, используя олигонуклеотиды, содержащие требуемую мутацию. Эти мутантные белки экспрессируют обычным способом, хорошо известным в данной области. Проводят ре§у1айоп этих белков и определяют активность.

Пример 13. Получение поликлональных антител к 1Ь-18ВР.

Кроликам первоначально вводят подкожно 5 мкг чистого препарата 1Е-18ВР мочи, эмульгированного в полный адьювант Фрейнда. Через три недели им снова вводят подкожно 5 мкг препарата 1Е-18ВР в неполном адьюванте Фрейнда. Две дополнительные инъекции 1Ь18ВР, растворенного в РВ8, проводят с 10дневными интервалами. У кроликов забирают кровь через 10 дней после последней иммунизации. Рост уровня антител определяют с помощью радиоиммуноанализа. ¹²⁵1-меченый 1Ь18ВР (166000 импульсов в минуту) смешивают с различными разведениями (1:50, 1:500, 1:5000 и 1:50000) сыворотки кролика. Суспензию гранул белок-С-агарозы (2С мкл, Рйагташа) добавляют в общем объеме 200 мкл. Смесь оставляют в течение 1 ч при комнатной температуре, затем гранулы промывают 3 раза и считают связанную радиоактивность. Антисыворотку кролика к лептину человека используют в качестве негативного контроля. Титр 1Е-18ВР- антисыворотки оказывается между 1:500 и 1:5000, в то время как отрицательный контроль меньше чем 1:50.

Пример 14. Получение моноклональных антител к 1Ь-18ВР.

Самкам Ва1Ь/С мышей (в возрасте 3 месяцев) вводят сначала 2 мкг очищенного 1Е-18ВР в эмульсии полного адьюванта Фрейнда, а через три недели подкожно в неполном адьюванте Фрейнда. Три дополнительные инъекции делают с 10-дневными интервалами подкожно в РВ8. Конечные бустер-инъекции производят внутрибрюшинно за 4 и 3 дня до слияния мышам, показывающим наивысший тирт связывания, что определяют посредством ΙΚΙΑ (см. ниже). Слияние проводят, используя N80/1 линию клеток меланомы и лимфоциты, полученные как из селезенки, так и из лимфатических узлов животных, в качестве сливающихся клеток. Слитые клетки распределяют в многолуночные планшеты для микрокультуры и гибридомы селектируют в ДМЕМ, дополненной НАТ и 15% сыворткой лошади. Гибридомы, которые, как обнаружено, продуцируют антитела к 1Ь-18ВР, субклонируют по методу лимитирующих разведении и вводят Ва1Ь/С мышам, которым введен пристан для образования асцита. Изотипы антител определяют, используя коммерчески доступный ЕИ8А-набор (Атегкйат, ИК).

Скрининг гибридом, продуцирующих анти-1Ь-18ВР моноклональные антитела, проводят следующим образом. Гибридомные супернатанты тестируют относительно присутствия анти1Ь-18ВР антител с помощью инвертного твердофазного радиоиммуноанализа (1К1А). ЕЬ18Апланшеты (Оупа1ес11 ЬаЬогаЮпек, А1ехапййа, VΑ) покрывают Та1оп-очищенным 1Ь-18ВРаΗίκ₆ (10 мкг/мл, 100 мкл/лунку). После инкубации в течение ночи при 4°С, планшеты промывают дважды РВ8, содержащим В8А (бычий сывороточный альбумин) (0,5%) и твин-20 (0,05%) и блокируют промывающим раствором в течение, по крайней мере, 2 ч при 37°С. Добавляют гибридомные культуральные супернатанты (100 мкл/лунку) н планшеты инкубируют в течение 4 ч при 37°С. Планшеты промывают 3 раза и добавляют конъюгат пероксидазы хрена с антителами козы к антителам мыши (НКР, 1асккоп ЬаЬк, 1:10000, 100 мкл/лунку) в течение 2 ч при комнатной температуре. Планшеты промывают 4 раза, а окраску проявляют посредством АВТ8 2,2-азино-бис(3 -этилбензтиазолин-6сульфокислота, 81дта) с Н₂О₂ в качестве субстрата. Планшеты считывают с помощью автоматического ЕЫ8А-планшет-ридера. Образцы, дающие ΟΌ, которое, по крайней мере, в 5 раз выше, чем величина негативного контроля, считают позитивными.

Пример 15. Аффинная хроматография 1Ь18ВР с моноклональными антителами.

Антитела против 1Ь-18ВР используют для очистки 1Ь-18ВР с помощью аффинной хроматографии. Секретируемую гибридомой асцитную жидкость, содержащую моноклональные антитела, очищают осаждением суфатом аммония при 50% насыщения с последующим экстенсивным диализом против РВ8. Приблизительно 10 мг иммуноглобулинов связывают с 1 мл Ай1де1 10 (Вю Кай И8А), как рекомендует производитель.

250 мл белков мочи человека (эквивалентных 250 л неочищенной мочи) наносят на 0,5 мл колонку с анти-1Ь-18ВР-антителами при 4°С при скорости течения 0,25 мл/мин. Колонку промывают РВ8 до тех пор, пока не перестанет определяться белок в промывной жидкости. 1Ь18ВР элюируют 25 мМ буфером лимонной кислоты, рН 2,2, (8х1 колонка, объем фракций) и немедленно нейтрализуют 1 М №₂ΟΌ₃₁. Дальнейшую очистку этого препарата осуществляют с помощью гель-фильтрации.

Пример 16. ЕЫ8А-тест (метод твердофазного иммуноферментного анализа).

Титрационные микропланшеты (Эупа1:есй ог Мах1когЬ, Ьу Νιιικ) покрывают анти-1Ь-18ВР моноклональными антителами (бессывороточный гибридомный супернатант или иммуноглобулины асцитной жидкости) в течение ночи при 4°С. Планшеты промывают РВ8, содержащим В8А (0,5%) и твин 20 (0,05%) и блокируют тем же раствором в течение, по крайней мере, 2 ч при 37°С. Тестируемые образцы разбавляют блокирующим раствором и добавляют в лунки (100 мкл/лунку) в течение 4 ч при 37°С. Затем планшеты 3 раза промывают РВ8, содержащим твин 20 (0,05%) с последующим добавлением анти-1Ь-18ВР сыворотки кролика (1:1000, 100 мкл/лунку) для дальнейшей инкубации в течение ночи при 4°С. Планшеты промывают 3 раза и добавляют конъюгат пероксидазы хрена с антителами козы к антителам кролика (НКР, 1асккоп ЬаЬк, 1:10000, 100 мкл/лунку) в течение 2 ч при комнатной температуре. Планшеты промывают 4 раза, а окраску проявляют посредством

АВТ8 2,2'-азино-бис(3-этилбензтиазолин-6сульфокислоты, 81дта) с Н₂О₂ в качестве субстрата. Планшеты считывают с помощью автоматического аппарата для прочтения планшетов.

Пример 17. Негликозилированный 1Ь-18ВР человека биологически активен.

Исследуют способность очищенного рекомбинантного 1Ь-18ВРа ингибировать биологическую активность 1Ь-18. 1Ь-18ВРа ингибирует дозазависимым способом индуцирующую ΙΡΝ-γ активность 1Ь-18 человека и мыши в спленоцитах мыши, РВМС и линии КС-1 клеток человека (фиг. 9).

Очищенный 1Ь-18ВРа, имеющий Н1к₆ 1ад на С-конце (1,5 мкг, 50 мкл) приводят к рН 7,5 и смешивают с Ν-гликозидазой Р (3 мкл, 500000 и/мл ΡNСаке Р, Νο\ν Епд1апй Вю1аЬк). Смесь инкубируют в течение 24 ч при 37°С при невосстанавливающих условиях. Аликвоты из образца и из негидролизованного 1Е-18ВР-Н1к₆ анализируют посредством 8Ό 8-РАСЕ при невосстанавливающих условиях с последующим иммуноблотингом с антителами к 1Ь-18ВР. Обнаруживают, что зона 40 кДа 1Е-18ВР-Н1к₆ исчезает в ΡNСаке-обработанной фракции, и выявляют новую зону 20 кДа. Молекулярная масса продукта и специфичность ΡNСаке Р указывают, что 1Е-18ВР-Н1к₆ является полностью дегликозилированным.

ΡNСаке-обработанные фракции, негидролизованный 1Е-18ВР-Н1к₆ и контрольный образец, содержащий ΡNСаке в буфере, раздельно адсорбируют на Та1оп-гранулах, промывают фосфатным буфером и элюируют имидазолом (100 мМ). Элюированные фракции подвергают биоанализу, используя ΙΠ-18 человека (20 нг/мл), ЬР8 (2 мкг/мл) и спеноциты мыши. Результаты представляют в следующей таблице

Образец	ΙΡΝ-γ, нг/мл
Контроль	7,5
Негидролизованный 1Ь-18ВР-Н186	0
Обработанный ΡNСа8е 1Ь-18ВР-Н186	0

Сделан вывод, что дегликозилированный 1Ь-18ВР биологически активен как модулятор активности 1Ь-18.

Предшествующее описание отдельных направлений выявляет основную сущность изобретения так, что другие, применяя современные знания, легко модифицируют и/или приспособят для различных применений такие конкретные направления без отступления от основных представлений и поэтому такие приспособления и модификации должны быть и предназначаются для включения в значение и область эквивалентов описанных направлений. Понятно, что фразеология и терминология служат для описания, а не ограничения.

Примеры

Часть 1. Примеры 18-25, относящиеся к использованию ингибиторов ΙΕ-18 при поражении печени.

Пример 18. Продуцирование ^-^ВР-Шк1ад.

Очищенный рекомбинантный ЕБ-18ВР человека, содержащий Ык-метку (г-ЫЬ-18ВР-Н1к1ад), продуцировали в клетках СНО. Продуцирование рекомбинантных белков в эукариотических клетках известно специалистам. Существуют хорошо известные методы, которые используются для конструирования соответствующих векторов, несущих ЕЕ-18ВРкодирующую ДНК, и которые являются подходящими для трансфекции эукариотических клеток, осуществляемой в целях продуцирования рекомбинантного ЕБ-18ВР. Для экспрессии в клетках, ДНК, кодирующую Ш-18ВР (см., например, ΝονχΕ с1 а1., 1999), вырезали и встраивали в экспрессирующие векторы, подходящие для трансфекции клеток. Альтернативно, такая ДНК может быть получена посредством ПЦР с использованием подходящих смысловых и антисмысловых праймеров. Затем полученные кДНК-конструкции встраивали в соответствующим образом сконструированные эукариотические экспрессирующие векторы методами, хорошо известными специалистам (Машайк, 1982). Рекомбинантный белок очищали до чистоты выше 95%, и было обнаружено, что он является биологически активным ίη νίΐτο и ίη νίνο и имеет высокую аффинность по отношению к своему лиганду.

Пример 19. Протективное действие ΙΕ18ВР против индуцированной эндотоксином гибели клеток в мышиной модели.

Для того чтобы определить, обладает ли ЕЕ-18ВР, ингибитор ΙΒ-18, протективным действием против высокой дозы липополисахаридов (ЛПС) у мышей, использовали мышиную модель. ЛПС вызывает острое поражение печени у мышей с последующей быстрой их гибелью.

мг/кг рекомбинантного человеческого ΙΒ-18ВР (гЫЬ-18ВРЙ18), содержащего Ык-метку (полученную путем рекомбинантного продуцирования белка), внутрибрюшинно инъецировали (Ер.) мышам С57ВБ/6. Через 1 ч инъецировали 60 мг/кг ЛПС (летальные дозы). Выживаемость этих мышей сравнивали с выживаемостью группы животных, которые получали только ЛПС (без Ш-18ВР).

Пять из 7 мышей, которым инъецировали гЫЬ-18ВР-Ык, выживали после инъекции ЛПС, в отличие от контрольных мышей, которые все погибали в пределах 3 дней.

Пробы крови брали через 5 ч после инъекции ЛПС в отсутствии или в присутствии возрастающих доз гЫЬ-18ВР-Ык и анализировали с помощью ЕЫ8А на содержание ΙΕΝγ в кровотоке (фиг. 1). 0,4 и 4 мг/кг тЫЬ-18ВР индуцировали 2-кратное снижение ΙΕΝγ в сыворотке. Такое ингибирование не происходило при более низких дозах тЫЬ-18ВР (0,004 и 0,4 мг/кг).

Пример 20. ГО-^ВР обладает протективным действием против поражения печени в мышиной модели заболевания.

Для оценки эффекта ГО-^ВР использовали мышиную модель фульминативного гепатита. После последовательного введения РгорюшЬасГеиит аспек (Р.аспек) и липополисахарида (ЛПС), у мышей развивалось острое поражение печени.

Мышам инъецировали возрастающие дозы гЫЬ-18ВР-Ык (4; 0,4; 0,04; 0 мг/кг) через различные промежутки времени (1 ч, 20 мин, одновременно), а затем мышам С57ВБ/6, сенсибилизированным Р.аспек, инъецировали ЛПС. При введении, Ер., гЫЬ-18ВР-Ык одновременно с ЛПС, ни одна из мышей не выживала, а уровни ΙΕΝ-γ и ΈΝΕ-α в кровотоке оставались неизмененными. Неожиданно было обнаружено, что гЫЬ-18ВР (4 и 0,4 мг/кг) индуцировал 70% снижение аланинаминотрансферазы в кровотоке (показатель поражения печени) как показано на фиг. 2.

Помимо этого проводили мониторинг выживания мышей (фиг. 3): при введении Ер. гЫЬ18ВР-Ык за 20 мин перед введением ЛПС, гибель мышей, которым вводили две самые высокие дозы ΙΒ-18ВР (4 и 0,4 мг/кг), происходила на 10 ч позже по сравнению с контрольными мышами, которые получали №101 вместо ΙΕ18ВР.

Результаты измерения уровней ΙΕΝ-γ в сыворотке представлены на фиг. 4. гЫЬ-18ВР (4 мг/кг) на 90% ингибировал уровни ΙΕΝ-γ в кровотоке и на 80% ингибировал уровни аланинаминотрансферазы в кровотоке (данные не приводятся).

При введении гЫЕ-18ВР-Ык за 1 ч до ЛПС, кривые выживаемости и уровни ΙΕΝ-γ в кровотоке были аналогичны тем, которые наблюдались при введении гЫЬ-18ВР-Ык за 20 мин до введения ЛПС, но уровни аланинаминотрансферазы в кровотоке оставались неизменными (данные не приводятся).

Помимо этого, ткань мышиной печени была проанализирована путем окрашивания гематоксилином-эозином, а также с помощью туннельной микроскопии. В печени мышей, у которых предварительно был индуцирован тяжелый гепатит, обнаруживался обширный некроз по сравнению с печенью нормальных мышей. В противоположность этому, ткань мышиной печени, обработанная ГО-^ВР, обнаруживала значительно меньшие очаги некроза, чем у необработанных мышей.

Пример 21. Антитела против ΙΒ-18 защищают от летального эндотоксикоза.

Для того чтобы определить, защищает ли блокирование ΙΒ-18 анти-ЕЕ-18 антителами от воздействия летальных доз бактериальных липополисахаридов, мышам С57ВЬ/61 сначала инъецировали нейтрализующее кроличье антитело против мышиного ΣΠ-18 (поликлональное) или нормальную кроличью сыворотку (НКС) в качестве контроля. Через 30 мин после обработки антителом мышам инъецировали летальные дозы ЛПС, происходящих либо от Е.сой (фиг. 5А), либо от §.1урЫтигшт (фиг. 5В). Эксперименты осуществляли с использованием 10-12 мышей на группу, и проводили два раза при двух различных условиях.

Как показано на фиг. 5А, обработка мышей антисывороткой против 1Б-18 способствовала предупреждению гибели мышей, индуцированной введением 40 мг/кг ЛПС Е.соН. После обработки анти-1Ь-18 антителом выживало 100% мышей, в отличие от мышей, обработанных нормальной кроличьей сывороткой, из которых выживало лишь 10% (р<0,005).

На фиг. 5В показано, что мыши, обработанные этим антителом, также были защищены от летального действия §.1урЫтигшт (50% выживание в отличие от 0% выживания; р<0,05).

Пример 22. Блокирование 1Б-18 и ΤΝΕ-α защищает мышей от СопА- и РЕА-индуцированной гепатотоксичности.

Для оценки роли 1Б-18 и ΤΝΕ-α в поражении печени использовали две экспериментальные модели гепатотоксичности. Введение конканавалина А (СопА) и Ркеийотопак аегцдтока (РЕА) мышам приводит к индуцированию поражения печени, и такие мыши являются моделями Т-клеточно-опосредованного гепатита.

Мышей С57ВБ/61 предварительно обрабатывали антисывороткой против 1Б-18 или растворимым рецептором ΤΝΕ-α, ΤΝΕκΚρ55. Уровни аланинаминотрансферазы в сыворотке (АЬТ) измеряли как показатель поражения печени (фиг. 6).

Как показано на фиг. 6А, антисыворотка против 1Б-18 и растворимые ΤΝΕ-рецепторы значительно снижали СопА-индуцированные уровни ΑΕΤ в сыворотке по сравнению с контрольной инъекцией только одного носителя (апирогенный физиологический раствор). Совместное введение растворимого ΤΝΕрецептора и антисыворотки против 1Б-18 приводило к полному ингибированию СопАиндуцированного поражения печени.

Как показано на фиг. 6В, у РЕАинъецированных мышей, нейтрализация ингибиторов ΤΝΕ-α или антител против 1Б-18 приводила к 93%-му и 83%-му ингибированию уровней ΑΕΤ в сыворотке соответственно. Комбинированное блокирование 1Б-18 и ΤΝΕ-α приводило к 99%-й защите.

Пример 23. Уровни 1Ь-18-связывающего белка в плазме увеличены у пациентов с хроническим заболеванием печени.

Уровни 1Б-18ВР в плазме измеряли у 133 пациентов с хроническим заболеванием печени (ХЗП) различной этиологии и у 31 здоровых контрольных индивидуумов посредством специфического ЕБ18А с использованием моноклонального антитела против 1Б-18ВР.

Уровни 1Б-18ВР в плазме были значительно выше у пациентов с ХЗП (12,91 ± 0,89 нг/мл; среднее ± ср.кв.ош.), чем у здоровых индивидуумов (4,96 ± 0,43 нг/мл, р<0,001). Пациенты с циррозом печени имели значительно большие уровни, чем пациенты с нециррозным ХЗП (19,23 ± 1,28 нг/мл, п=67, ср. 6,49 ± 0,51 нг/мл, п=66, р<0,001). Пациенты с заболеванием на стадии В по классификации Чайльда-Пьюга имели более высокие уровни 1Б-18ВР, чем пациенты с заболеванием на стадии А (22,48 ±

2,44 нг/мл, ср. 9,57 ± 1,25 нг/мл, р<0,001). Однако какого-либо значимого отличия между этими уровнями на стадиях заболевания В и С по классификации Чайльда (22,48 ± 2,44 нг/мл, ср. 20,62 ± 4,75 нг/мл, р=0,7) не наблюдалось. Уровни 1Б-18ВР в плазме положительно коррелировали со скоростью осаждения ΟΟΤ, биллирубина и эритроцитов. Была обнаружена отрицательная корреляция с протромбиновым временем.

В итоге, результаты показали, что уровни 1Б-18ВР в плазме были увеличены при ХЗП и коррелировали с тяжестью заболевания независимо от его этиологии. Хотя очевидно, что эндогенный антагонист провоспаления, вызываемого 1Б-18, увеличивает уровни 1Б-18ВР, однако, это повышение не является достаточным для противодействия подавлению медиаторов провоспаления у пациентов с ХЗП.

Пример 24. Ингибирование алкогольного гепатита под действием 1Б-18ВР.

Четырем группам крыс (5 крыс на группу) вводили этанол и корм, содержащий кукурузное масло, путем внутрижелудочного вливания в течение 4 недель. У контрольных крыс, этанол заменяли декстрозой такой же калорийности. Крысам ежедневно инъецировали мышиный 1Ь18ВР (1 мг/кг) или физиологический раствор. На срезах печени проводили паталогоанатомический анализ и измеряли уровни в сыворотке печеночных ферментов, ΤΝΕ-α, Рак-лигандов и ΙΕΝ-γ. У крыс, которым вводили этанол и физиологический раствор, наблюдалось некровоспалительное поражение и экспрессия печеночных ферментов, ΤΝΕ-α, Рак-лигандов и ΙΕΝ-γ.

Инъекция крысам мышиного 1Б-18ВР защищала этих крыс от некровоспалительного поражения и значительно снижала уровни печеночных ферментов, ΤΝΕ-α, Рак-лигандов и ΙΕΝγ (>90%).

Пример 25. Ингибирование индуцированного конканавалином А гепатита под действием 1Б-18ВР.

Мышам Ва1Ь/с инъецировали 12 мг/кг конканавалина А (СопА) без инъекции мышиного [Б-18ВР или с инъекцией (1 мг/кг), которую вводили за 2 ч до введения СопА, а затем ежедневно. Поражение печени оценивали путем определения сывороточных уровней печеночных ферментов, ΈΝΡ-α. Раз-лиганда и ΣΡΝ-γ. Результаты гистопаталогии печени сравнивали с результатами, полученными для мышей, обработанных только конканавалином А.

Предварительная обработка Σ^-18ВР приводила к значительному снижению уровней печеночных ферментов и ΙΝΡ-α в сыворотке, причем гистопатологическая оценка не выявила какого-либо воспаления у этих мышей по сравнению с контрольными мышами, обработанными СопА.

Часть ΣΣ. Примеры 26 и 27, относящиеся к использованию ингибиторов ΣΠ-18 при артритах.

Пример 26. Продуцирование метки ΣΕ18ВР-Ыз.

Для проведения эксперимента, подробно описанного ниже в примере 27, рекомбинантный человеческий Σ^-18ВР, содержащий метку 1нз из 6 остатков (метка гЫЬ-18ВР-Ыз), продуцировали в клетках СНО и очищали как описано К1т е! а1., 2000. Рекомбинантный белок очищали до чистоты выше 95%, и было установлено, что он является биологически активным ш νίΙΐΌ и т угуо и имеет высокую аффинность к его лиганду.

Продуцирование рекомбинантных белков в других эукариотических системах с меткой или без меток, облегчающих очистку рекомбинантных белков, известно специалистам. Существуют хорошо известные методы, которые используются для конструирования соответствующих векторов, несущих ДНК, кодирующую Σ^-18ВР, и которые являются подходящими для трансфекции эукариотических клеток, осуществляемой в целях продуцирования рекомбинантного ^-186?. Для экспрессии в клетках ДНК, кодирующую ^-186? (см., например, №уюк е! а1., 1999), вырезали из клонирующего вектора и встраивали в экспрессирующие векторы, подходящие для трансфекции клеток. Альтернативно, такая ДНК может быть получена посредством ПЦР с использованием подходящих смысловых и антисмысловых праймеров. Затем полученные кДНК-конструкции встраивали в соответствующим образом сконструированные эукариотические экспрессирующие векторы методами, хорошо известными специалистам (Машайз, 1982).

Пример 27. Блокирование эндогенного ГЬ18 в мышиной модели артрита.

Методы

Индуцирование коллаген-индуцированного артрита (КИА).

КИА индуцировали у самцов мышей ЭВА/1 (8-12 недельных) путем иммунизации нативным бычьим коллагеном типа ΣΣ (СП), как было описано ранее (Р1а!ег-2уЬегк е! а1., 1995). Через 25 дней после СП-иммунизации, мышей ежедневно оценивали на развитие заболевания.

Обработка гЫЬ-18ВР-6Ыз.

Обработку С11-иммунизированных мышей ЭВА/1 начинали после появления первых клинических признаков заболевания. Для нейтрализации эндогенного ΣΕ18 у обработанных коллагеном мышей использовали рекомбинантный человеческий Σ^-18ВР, содержащий метку из 6 гистидинов (гЫЕ-18ВРа-6Ыз). Мышам ежедневно в течение 7 дней внутрибрюшинно (ί.ρ.) инъецировали гЫЕ-18ВР-6Ыз при 5 различных концентрациях, 10, 3, 1, 0,5, 0,25 мг/кг/инъекцию. Контрольным мышам давали только носитель, т.е. плацебо, (0,9% №С1).

Оценка развития заболевания

Клиническая оценка (клинические балльные показатели).

После первого появления клинических симптомов оценка мышей проводилась каждый день исследователем, которому был неизвестен протокол обработки. Каждую конечность оценивали на тяжесть поражения (оценки 0-3,5, максимальная оценка 14/мышь). Прогрессирование отека (воспаления) измеряли на лапах, которые обнаруживали первые признаки заболевания, с использованием точного штангенциркуля (Ргос!ез! 2Т, Кгоерйп Еапдептезз!есйшк).

Прогрессирование заболевания оценивали ежедневно в течение 8 дней от начала эксперимента, а затем всех мышей умерщвляли и проводили гистопатологический анализ лап.

Гистологическая оценка эрозии хряща и микроскопическая оценка воспаления.

После завершения экспериментов, т.е. на 8-й день их начала, мышей умерщвляли, и лапы, на которых обнаруживались первые признаки заболевания, иссекали. Суставы фиксировали, декальцинировали и заливали в парафин. Делали стандартные срезы (5-7 мкм) суставов и окрашивали гематоксилином/эозином/сафранином О. Каждый сустав оценивался 2 исследователями, которым был неизвестен протокол обработки (отсутствие деструкции хряща или кости = 0; локализованная эрозия хряща = 1-2; более обширные эрозии = 3; общая деструкция хряща и наличие эрозии костей = 4). Конечные оценки каждой мыши представляли собой среднее значение из результатов всех оцененных суставов. Микроскопическую оценку воспаления или синовита выражали в баллах от 0 до 4 следующим образом: отсутствие воспаления = 0; небольшое утолщение выстилающего слоя и/или некоторая инфильтрация клеток в субвыстилающем слое = 1-2; утолщение выстилающего слоя и/или более выраженный приток клеток субвыстилающего слоя = 3; присутствие клеток в синовиальном пространстве и высокая степень инфильтрации синовия множеством воспалительных клеток =

4.

Определение антител против коллагена.

Антитела против бычьего коллагена типа II оценивали с использованием твердофазного иммуферментного анализа (ЕЫ8А). Измеряли титры 1дС1 и 1дС2а. Вкратце, планшеты сенсибилизировали 10 мкг бычьего коллагена, а затем сайты неспецифического связывания блокировали 0,1 М этаноламином (81дта). Затем добавляли серийные разведения 1:2 сыворотки, после чего инкубировали с козьим антимышиным антителом конкретного изотипа, конъюгированным с пероксидазой (8ои1йегп Вю1ес11по1оду А88ос1а1е8, Витатдйат, АЬ, И8А) и с субстратом (5-аминосалициловая кислота, 8щта).

Планшеты считывали при 492 нм. Титры выражали как среднее ± ср.кв.ош. разведение, которое давало полумаксимальную величину.

Анализ на 1Ь-6.

Уровни 1Ь-6 определяли с помощью ЕЫ8А (Κ&Ό 8у81ет8, М1ппеаро118, ΜΝ, И8А). Биологическую активность 1Ь-6 определяли с помощью анализа на пролиферацию с использованием клеток В9. Вкратце, 5 х 10³ клеток В 9 в 200 мкл среды ВРМ1 1640 с 5% ЕС8 на лунку высевали в круглодонный микротитрационный планшет и инкубировали в течение 3 дней с использованием человеческого рекомбинантного 1Ь-6 (Κ&Ό 8у81ет8 М1ппеаро118, ΜΝ, И8А) в качестве стандарта. После завершения инкубирования добавляли 0,5 мкКи ³[Н]тимидина (ΝΕΝЭироп!, ВоЧоп, МА, И8А) на лунку. Через 3 ч клетки собирали и определяли включение тимидина. Предел детекции для биоанализа 1Ь-6 составлял 1 пг/мл.

Статистический анализ.

Значимые различия оценивали в соответствии с критерием Манна-Уитни с использованием программы для статистического анализа 8фта81а1 и программы СгарйРаб РгЕт.

Результаты

Мышиную экспериментальную модель КИА (коллаген-индуцированного артрита) использовали для оценки эффективности 1Ь-18ВР в качестве агента для лечения артрита. Введение коллагена и неполного адъюванта Фрейнда мышам ЭВАЛ индуцировало развитие эрозивного воспалительного артрита и было использовано как идеальная возможность для исследования терапевтического потенциала 1Ь-18ВР. Для достижения этой цели эндогенный 1Ь-18 нейтрализовали с использованием 1Ь-18ВР и оценивали влияние на различные патогенные параметры.

Были проведены исследования зависимости от дозы. Три группы мышей ОВА/Ι с коллаген-индуцированным артритом терапевтически обрабатывали (т.е. после начала заболевания) 5 дозами 1Ь-18ВР, 1.р. (внутрибрюшинно). На первой клинической стадии заболевания вводили 1Ь-18ВР при концентрациях 10, 3, 1, 0,5 или

0,25 мг/кг. Контрольным мышам инъецировали физиологический раствор (хлорид натрия, №1С1). Помимо этого вводили, гр., 10000 МЕ интерферона β (ΙΕΝ-β) для оценки эффекта ΙΕΝ у этих экспериментальных животных с моделью заболевания артритом. Проводили мониторинг его влияния на тяжесть заболевания путем ежедневной визуальной оценки каждой отдельной лапы как описано выше. Мышей умерщвляли на 8-й день после начала эксперимента.

Были измерены следующие величины:

- визуальные клинические оценки (0-3,5 на лапу) (фиг. 7А и В),

- опухание/отек сустава (в мм, измерено с помощью штангенциркуля) в лапе с первым признаком поражения, при условии, что она была задней лапой (фиг. 8),

- число лап, пораженных заболеванием (фиг. 9),

- оценка эрозии лапы с первым признаком поражения (деструкция хряща 0-4),

- гистопатологический анализ лапы с первым признаком развивающегося артрита,

- уровни антител против коллагена типа II,

- уровни ГЬ-6.

Клиническая оценка тяжести заболевания.

Как показано на фиг. 7А и В, клиническая тяжесть заболевания значительно снижалась у групп мышей, обработанных 1 мг/мл (Р<0,01) и 0,5 мг/мл (0,01<Р<0,05) гЫЬ-18ВР. Мыши, которые получали низкую дозу гЫЬ-18ВР (0,25 мг/кг) или высокую дозу гЫЬ-18ВР (10 мг/кг), имели клиническую оценку, аналогичную оценке, полученной для группы плацебо. Доза в 1 мг/кг ГВ-18ВР была почти такой же эффективной, как и интерферон β (обозначенный на фиг. 7А).

Воспаление суставов и опухание лапы (отек).

Макроскопическое воспаление (опухание) исследовали путем измерения отека лапы, начиная с дня 1 после развития заболевания и до дня 8, т.е. окончания эксперимента. Результаты представлены на фиг. 8А и В. Эффективные дозы ГЬ-18ВР составляли 1, 3 и 10 мг/кг. Введение более низких доз не оказывало благоприятного воздействия на опухание лап. Как показано на фиг. 8А и 8В, благоприятное воздействие на опухание лапы оказывал интерферон-β (ИРМ) при концентрации 10000 МЕ.

Микроскопическую оценку синовита проводили по окончании эксперимента на гистопатологических срезах и выражали в баллах (балльные показатели синовита). Результаты оценок воспаления (опухания) и синовита систематизированы в табл. 5. гЫЬ-18ВР-обработка при дозах 1 и 3 мг/кг приводила к снижению опухлости, однако, обработка любыми дозами ГЬ-18ВР оказывала лишь ограниченное воздействие на воспалительный синовит (табл. 5).

Таблица 5

Воздействие 1Ь-18ВР-обработки на воспаление суставов

Обработка	Опухание (ППК, среднее ± ср.от.)	Балльный показатель синовита (среднее ± ср.от.)
КЫЬ-18ВР-6Ы8 3 мг/кг	1,55±0,64	2,17±0,5
1 мг/кг	1,53±0,60	1,98±0,4
0,5 мг/кг	3,38±0,70	1,92±0,5
0,25 мг/кг	3,06±0,90	2,08±0,5
Плацебо	3,11±0,77	2,23±0,3

На фиг. 9 показано, что число лап, пораженных заболеванием, снижалось после введения 1Ь-18ВР. В частности, терапевтические инъекции 1Ь-18ВР при дозах 1 и 0,5 мг/кг снижали число лап, пораженных заболеванием, что указывало на то, что блокирование 1Ь-18 ш у1уо приводит к прекращению распространения артрита на другие суставы. Обработка 1 и 0,5 мг/кг 1Ь-18ВР очевидно может даже приводить к восстановлению некоторых пораженных артритом суставов до их нормального состояния.

Защита сустава от разрушения.

Обработка мышей тЫЬ-18ВР обеспечивала защиту суставов от деструкции. Полуколичественная система оценки продемонстрировала, что эрозия костей поддается дозо-зависимому протективному воздействию, которое дает значимые результаты при дозах 10 и 3 мг/кг (р<0,05). У мышей, получавших 1 мг/кг тЫЬ18ВР, наблюдалась меньшая эрозия, чем у мышей, получавших только носитель. Какого-либо защитного эффекта при дозах 0,5 и 0,25 мг/кг не наблюдалось. Интересно отметить, что защитное действие на суставы при дозах 3 и 10 мг/кг 1Ь-18ВР было сравнимым или даже более выраженным, чем защитное действие 10000 МЕ интерферона β (ΙΕΝ-β).

Показана гистология здорового (А) и пораженного (В) сустава по сравнению с суставом животного, обработанного 1Ь-18ВР (С). Срезы брали в конце эксперимента от тех лап, на которых были обнаружены первые признаки развития артрита.

Сустав, взятый от мышей с артритом, обнаруживал тяжелые деструктивные артритные поражения с уменьшением хрящевой массы, а также с эрозиями и многочисленными клетками воспалительного инфильтрата в пораженном синовиальном слое. В суставе мышей, обработанных тЫЬ-18ВР, наблюдался почти нормальный хрящ, несмотря на присутствие воспалительных клеток в синовиальном пространстве. При этом наблюдаемый хрящ имел не только большую массу, но был также более гладким на вид.

Обработка антителами против 1Ь-18 модулирует уровни антител против коллагена типа ΙΙ.

Мыши с КИА имели более высокие уровни антител 1дС1 и 1дС2а против коллагена типа II в кровотоке. Антитела изотипа 1дС1 ассоциированы с ТН2-опосредованными заболеваниями, а антитела изотипа 1д62а и !дС2Ь ассоциированы с ТН1-опосредованными заболеваниями. Артрит обычно классифицируется как ТН1опосредованное заболевание.

Антитела изотипов 1дС-1 и 1дС2а против коллагена типа II (СП) определяли в сыворотке животных, обработанных ГО-18ВР (фиг. 12). Уровни анти-СП антител изотипов ^0-1 и [дС2а не были значительно модифицированы обработкой Ш-18ВР на 4-й или 8-й дни (Ό4, Ό8) клинического заболевания. Однако через 8 дней после тЫЬ-18ВР-обработки наблюдалось 2,6- и 3,4-кратное снижение отношения коллагенспецифических антител ЫдСЗа при дозах 1 и 3 мг/кг соответственно. На фиг. 12 проиллюстрирован эксперимент, в котором использовалась доза 3 мг/кг. В основном, те же самые результаты были получены с использованием количества 1 мг/кг ГВ-18ВР. Снижение отношения анти-СП антител [дС1/[дС2а указывало на снижение концентрации антител изотипа против коллагена типа II и на повышение концентрации антител изотипа против коллагена типа II, что дало основание предположить о тенденции сдвига в сторону ТН2-опосредованного заболевания в данной модели артрита.

Снижение уровней ГЬ-6 после нейтрализации ГЬ-18.

Для понимания сущности эффектов блокирования ГЬ-18 измеряли уровни ГЬ-6 в сыворотке животных, обработанных ГВ-18ВР. Показано, что уровни биологически активного ГЬ-6 значительно снижались у животных, подвергаемых ГО-^ВР-обработке при всех тестируемых дозах, т. е. при 1, 3 и 10 мг/кг, а также обработке интерфероном β (ШЫЬ). Иммуноактивные уровни ^-6, измеренные в сыворотке животных, обработанных 3 мг/кг тЫЬ-18ВР, были значительно снижены (Р<0,0023) по сравнению с уровнями животных, обработанных физиологическим раствором. Уровни ГЬ-6 в сыворотке пораженных животных, обработанных 1, 3 или 10 мг ГВ-18ВР или 10000 МЕ ΓΝΕβ, были аналогичны уровням в сыворотке нормальных мышей (ΝΜ8), взятой у здоровых животных, т.е. у животных, не имеющих воспалительного заболевания.

Полученные данные продемонстрировали, что ГЬ-18 регулирует уровни ГЬ-6 в начале развития заболевания. Поскольку ГЬ-6 является маркером воспаления, эти данные показали, что ГЬ-^ВР-обработка пораженных мышей приводила к ослаблению воспаления у этих животных.

На основании проведенных выше экспериментов могут быть сделаны следующие выводы:

- введение Ш-^ВР снижает клиническую тяжесть артрита;

- Ш-^ВР ингибирует последующее прогрессирование или распространение данного заболевания;

- введение Ш-^ВР снижает отеки;

- введение ГБ-18ВР снижает деструкцию хряща;

- уровни ГБ-6 в сыворотке снижаются, а отношения анти-С11 антител 1дС1/1дС2а снижаются после ГБ-18ВР-терапии.

Данные, приведенные выше, указывают на то, что нейтрализация биоактивности ГБ-18 после начала заболевания является антиревматической терапией, ослабляющей заболевание. Полученные результаты ясно продемонстрировали, что блокирование ГБ-18 приводит к снижению клинического прогрессирования артрита и, что более важно, к прекращению прогрессирования деструкции хряща и костей. Поэтому блокирование ГБ-18 белком ГБ-18ВР, антителом против ГБ-18 или любым другим ГБ-18блокирующим агентом может рассматриваться как новая антиревматическая терапия, ослабляющая заболевание.

Вышеприведенное описание конкретных вариантов осуществления изобретения иллюстрирует общую концепцию настоящего изобретения так, чтобы любые специалисты, опираясь на современные знания, могли легко модифицировать и/или адаптировать различные применения этих конкретных вариантов изобретения, не выходя за рамки основной концепции, а поэтому, такие адаптации и модификации должны входить в объем и серию эквивалентов, описанных вариантов осуществления изобретения. Очевидно, что используемая здесь фразеология или терминология применяется лишь для описания изобретения, а не для его ограничения.

Часть ГГГ. Примеры 28 и 29, относящиеся к воспалительному заболеванию кишечника.

Пример 28. Экспрессия ГБ-18ВР эндотелиальными клетками и макрофагами в процессе активной болезни Крона.

Сбор образцов.

Биопсию слизистой кишечника брали из образцов, полученных в результате хирургической операции пациентов с болезнью Крона (БК) или язвенным колитом (ЯК). В эксперименте участвовали четырнадцать пациентов с БК (трое мужчин и одиннадцать женщин), при этом, средний возраст пациентов составлял 37,8 лет (от 20 до 78 лет), а средняя продолжительность болезни составляла 8,3 года (от 1 до 21 года). У восьми пациентов поражения локализовались в подвздошной кишке, а у шести пациентов - в толстой кишке. Двенадцать пациентов принимали иммунодепрессанты. Диагноз активной БК делали на основе гистопатологического анализа и в соответствии со следующими критериями: наличие изъязвлений, повышенное число воспалительных клеток и трансмуральное воспаление. Было идентифицировано семь пациентов с активной БК и семь пациентов, имеющих неактивное заболевание. Каких-либо отличий, зависящих от возраста, локализации заболевания, пола, лекарственной терапии и продолжительности заболевания, между паци ентами с активной БК и пациентами с неактивной БК не наблюдалось. Средний возраст 5 пациентов с ЯК (трое мужчин и две женщины) составлял 37,6 лет (от 30 до 44 лет). У всех пациентов заболевание было локализовано в толстой кишке, и все они проходили терапию иммунодепрессантами. Средняя продолжительность заболевания составляла 4 года (от 1 до 9 лет). Контрольные образцы получали от 5 пациентов, подвергшихся хирургической операции по поводу расстройств, не связанных с ВЗК (воспалительным заболеванием кишечника) (трое мужчин и две женщины). Средний возраст этой группы составлял 55,2 года (от 24 до 76 лет). У всех пациентов заболевание локализовалось в толстой кишке.

Полуколичественный ОТ-ПЦР-анализ на человеческие ГБ-18 и ГБ-18ВР.

Полноразмерную РНК экстрагировали из замороженного биоптата кишечника пациентов с БК, ЯК или контрольных пациентов. Экстракцию РНК осуществляли с использованием тризола (О1Ьсо) в соответствии с инструкциями производителей. Полученные образцы количественно оценивали путем измерения оптической плотности при 260 нМ. Целостность РНК оценивали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. кДНК синтезировали из 1 мкг полноразмерной РНК с использованием системы обратной транскрипции Рготеда в соответствии с инструкцией производителей. ПЦР-реакции осуществляли в общем объеме 50 мкл в присутствии 1 ед. ДНК-полимеразы АтрЬТац (Регкт Е1тег, ВосЬе, И8А), 2,5 мМ άΝΈΓ (АтегзЬат, И8А) и 50 пмоль прямого и обратного ПЦРпраймеров. Реакционные смеси инкубировали в термоячейке РТС-200 РеШег ЕГГес! ТЬегта1 Сус1ег (М1 ВезеагсЬ, И8А) при следующих условиях: денатурация - 1 мин при 94°С, отжиг - 1 мин при 55°С и удлинение - 1 мин при 72°С. Было определено оптимальное число циклов для ГБ18ВР, ГБ-18 и β-актина перед насыщением полос (31, 28 и 25 соответственно). На основе опубликованных последовательностей (АБ110799, Ό49950, Х00351) были сконструированы следующие ПЦР-праймеры: ГБ-18, обратный: 5'-6С6ТСАСТАСАСТСА6СТАА-3'; прямой: 5'-6ССТА6А66ТАТ66СТ6ТАА-3'; ГБ-18ВР, прямой: 5'-АССТ6ТСТАССТ66А6Т ОАА-3'; обратный: 5'-6САС6АА6АТА66А АОТСТО-3'; β-актин, обратный: 5'66А66А6СААТ6АТСТТ6АТСТТС-3'; прямой: 5'-(СТСАССАТ((АТ(АТ(АТАТС(С-3'. Для исключения амплификации примесной геномной ДНК, содержащейся в этих образцах, осуществляли ПЦР-реакции в отсутствии кДНК-матрицы. ПЦР-продукты (10 мкл) анализировали с помощью электрофореза на 1%-м агарозном геле в 1 х ТАЕ-буфере. Размер ПЦРпродуктов подтверждали путем сравнения с 1 т.п.н.-лэддером (О1Ьсо) после окрашивания геля.

Относительную количественную оценку полос, окрашенных этидийбромидом, осуществляли при УФ-излучении с использованием аналитической программы Койак О1дИа1 8с1епсез, и эту оценку выражали как отношение гена-мишени (ЬГЬ-18ВР, ЬГЬ-18) к гену домашнего хозяйства (Ηβ-актин).

Генерирование моноклональных антител против Ь1Ь-18ВР.

Мышам ВЛЬВ/с подкожно инъецировали в четыре конечности, а также внутризатылочно, 50 мкг изоформы гЬГЬ-18ВР-6Ыз (выделенной и очищенной из клеток яичника китайского хомячка) (Гп!егрЬагт ЬаЬога!опез, №з 2юпа, 1згае1) в РВ8 с адъювантом (эмульсия МРЬ + ТОМ, ВГВГ 1ттипосЬет ВезеагсЬ, 1пс.) на дни 0, 7 и 28. Через четыре дня после 3-й иммунизации выделяли лимфоузлы и гидролизовали 2,4 мкг/мл коллагеназы (коллагеназа ГУ, ’№ойЬ1пд!оп ВюсЬет1са1 Согр.) и 0,1% ДНКазой (81дта). Затем выделенные клетки подвергали слиянию с клетками миеломы 8р2/0 с использованием ПЭГ 1000 (ЕЬиКА). Эти клетки ресуспендировали в ПМЕМ-Е12, 10% ЕС8 (61Ьсо) в присутствии НАТ (гипоксантин, аминоптерин, тимидин) и распределяли по 96-луночным планшетам при концентрации 5 х 10^-4 клеток/мл. Образцы супернатанта от гибридомных культур скринировали на присутствие реактивных антител с помощью прямого скринирующего анализа. Для этого, ЕЬГ8А-планшеты сенсибилизировали козьими антимышиными антителами Е(аЬ')₂ (Заскзоп Гттипо ВезеагсЬ, Мйап апа1у!1са, 8\\йхейапй), затем добавляли супернатанты от гибридомных культур с последующим добавлением биотинилированного гЬГЬ-18ВР-6Ыз (выделенного и очищенного из клеток СО8 как описано Ыоу1ск е! а1., 1999) вместе с или без гЫЬ-18ВР (выделенного и очищенного из рекомбинантных Е.сой, 8егопо РЬагтасеийса1 ВезеагсЬ Гпзй!и!е, Сенега), и наконец конъюгат стрептавидинпероксидаза хрена (ПХ)(1аскзоп Гттипо ВезеагсЬ, Мйап апа1уйса, 8\\йхег1апй) визуализировали с использованием о-фенилендиамина (ОРЭ) (81дта). Ненейтрализующие антитела отбирали и субклонировали. В этом исследовании было использовано мышиное моноклональное антитело ГдС1, 95-Н20.

Иммуногистохимические исследования на локализацию ГЬ-18ВР-положительных клеток.

Образцы тканей быстро замораживали и хранили при -80°С. Получали серийные криосрезы (10 мкм), наносили их на покрытые полиЬ-лизином предметные стекла 8ирегГгоз1/Р1из (Ро1у1аЬо, Р1ап-1ез-Оиа!ез, 8^^!ζе^1аий) и фиксировали в охлажденном льдом ацетоне. Локализацию человеческого белка ГЬ-18ВР определяли иммуногистохимическим методом с использованием моноклонального антитела (тАЬ) 95Н20. После кратковременной регидратации в РВ8, срезы предварительно инкубировали в течение 30 мин в РВ8, содержащем 2% фетальную телячью сыворотку (ЕС8) (Сапзега, Оп!апо, Сапайа), 1% человеческую сыворотку (АВ⁺сыворотку, ТгапзГизюп Сеп!ег, Аппетаззе, Егапсе) и 0,5% альбумин бычьей сыворотки (В8А) (81дта, 8!. Ьошз, МО, И8А). Эндогенную пероксидазную активность блокировали путем погружения предметных стекол в раствор РВ8, 2% ЕС8, 1% человеческой сыворотки, 0,5% В8А и 1% перекись водорода (Н₂О₂) (Е1ика, 8\\П/ег1апй) на 1 ч. После промывки в РВ8, срезы инкубировали в течение ночи с супернатантом неразведенной культуры тАЬ 95-Н20. После второй промывки в РВ8, срезы инкубировали с биотинилированным козьим антимышиным антителом (Заскзоп Гттипо ВезеагсЬ, Мйап апа1уйса, 8\\П/ег1апй) (5 мкг/мл) в РВ8, содержащем 0,5% В8А, в течение 1 ч. Чувствительность окрашивания возрастала при инкубировании в течение 30 мин с комплексом авидин/биотинилированная ПХ (Уес!аз1аш Ей!е АВС Кй, Уес!ог ЬаЬога!опез, СА, И8А). Затем предметные стекла промывали РВ8 и проявляли с использованием раствора 30% Н₂О₂, 3,3амино-9-этилкарбазола (АЕС) (81дта), Ν,Νдиметилформамида (Мегск) в ацетатном буфере, рН 5. После контрастного окрашивания гематоксилином (81дта), срезы покрывали глицерином и покровными стеклами. В качестве контрольного изотипа использовали мышиное антитело ГдС1 (В и Ό-система).

Для идентификации клеточной локализации человеческого ГЬ-18ВР осуществляли двухцветный иммуногистохимический анализ на срезах слизистой кишечника. После 10минутной регидратации в РВ8, срезы предварительно инкубировали в течение 30 мин в РВ8, содержащем 2% ЕС8, 1% человеческую сыворотку и 0,5% В8А. Для определения совместной локализации в эндотелиальных клетках, срезы инкубировали в течение ночи с биотинилированным тАЬ 95-Н20 (20 мкг/мл), смешанным с ФИТЦ-конъюгированным мышиным антителом против человеческого СП31 (1:50) (РЬагтшдеп, СА, И8А) в РВ 8/0,5% В 8А. Для определения совместной локализации в макрофагах, срезы инкубировали в течение ночи с биотинилированным тАЬ 95-Н20 (20 мкг/мл), смешанным с ФИТЦ-конъюгированным антителом против человеческого СП68 (1:25) (Пако, Оептагк). После промывки в РВ8 на 1 ч добавляли стрептавидин-техасский красный (8ои1йет Вю!есЬпо1оду Аззос1а!ез, АЬ, И8А). Предметные стекла снова промывали и срезы покрывали мовиолом и покровными стеклами. В качестве контрольного изотипа использовали биотинилированное мышиное антитело ГдС1 (РЬагтшдеп), а затем стрептавидин-техасский красный.

Клеточная культура.

Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (НИУЕС) (С1опейсз Согр., 8ап П1едо, СА) культивировали с использованием среды для роста эндотелиальных клеток (ЕСМ), в ко торую были добавлены рекомбинантный человеческий эпидермальный фактор роста (бЕСР) (10 нг/мл), гидрокортизон (1 мкг/мл), гентамицин и амфотерицин В (50 мкг/мл), бычий мозговой экстракт (ВВЕ) (3 мг/мл) и 2% фетальной бычьей сыворотки (РС8) (С1опебс8 Согр., 8ап Р1едо, СА) в соответствии с инструкциями производителей. Чашки с тканевыми культурами предварительно покрывали человеческим фибронектином (10 мкг/см²) (Воебппдег, Маппбебп). Клетки инкубировали в 5% СО₂инкубаторе с повышенной влажностью и проводили эксперименты с использованием ΗυνΕί.' при пассаже 3. НυVЕС обрабатывали человеческим 1Ε-1β (10 нг/мл), ΤΝΡ-α (10 нг/мл) и ΙΡΝγ (20 нг/мл) (В апй Ό 8у81ет, Сегтапу) в течение 24 ч. По окончании периода культивирования, клетки собирали, РНК выделяли и подвергали ОТ-ПЦР для анализа мРНК-транскриптов Ш18ВР и ΙΚ-18. Супернатанты собирали и анализировали на экспрессию белков Ш-18ВР и ΙΚ-18 с помощью ЕЫЗА.

Человеческую моноцитарную клеточную линию ТНР-1 поддерживали в суспензионной культуре в среде ВРМ!, в которую были добавлены 10% термоинактивированная РС8, Ьглутамин (2 мМ), пенициллин-стрептомицин (10 ед./мл) (С1Ьсо ВВЬ, БГГе Тесбпо1од1е8) и βмеркаптоэтанол (50 мкМ) (Р1ика). Эту культуру инкубировали в 5% СО₂-инкубаторе с повышенной влажностью и пассировали каждые 5 дней при 1:10. За три дня перед проведением экспериментов человеческие моноциты дифференцировали при плотности 0,4 х 10⁵ клеток/мл с использованием витамина Ό3 (80 нМ) (В1ото1 Ве8еагсб БаЬогаГопе8, Б8А) и оставляли для адгезии. После дифференциации к клеточным культурам добавляли ЛПС (100 нг/мл) (Са1Ь1осбет), человеческий Ι6-1β (10 нг/мл), Т№-а (10 нг/мл) и ^Νγ (20 нг/мл). Через 48 ч, супернатанты собирали и анализировали на экспрессию белков Ш-18ВР и Ι6-18 с помощью ЕБГ8А.

Измерения уровней продуцирования Ι618ВР и Ш-18.

Присутствие ГЕ-18ВР оценивали с помощью анализа ЕБГ8А в бесклеточных супернатантах от клеток НυVЕС, нестимулированных или стимулированных в течение 24 ч смесью цитокинов (Ι6-1β, Т№а, ^Νγ), а также от клеточной линии ТНР-1, нестимулированной или стимулированной в течение 48 ч (ЛПС, Ι6-1 β, Τ№-α, ^Νγ). Для этого планшеты сенсибилизировали в течение ночи иммобилизованным моноклональным антителом (тАЬ) (клон 657.27 при 0,5 мкг/100 мкл/лунку, ШГегрбагт БаЬогаГопе8, №8 2юпа, кгае^, направленным против гЫЬ-18ВР (изоформа а). Затем растворимый ЫБ-18ВР детектировали с использованием кроличьего поликлонального антитела (разведенного 1/10000), вырабатываемого против гЫЬ18ВР-6618 (выделенного и очищенного из клеток яичника китайского хомячка, ШГегрбагт БаЬогаЮпе8, №8 2юпа, Етае^, а затем инкубировали с аффинноочищенным козьим антикроличьим антителом ЦС, конъюгированным с пероксидазой хрена (разведенным в отношении 1/20000) (1аск8оп Iттипо Ве8еагсб, М11ап апа1убса, 8\νίΐхег1апй). Это иммобилизующее тАЬ, а также кроличье поликлональное антитело тестировали с помощью Вестерн-блот-анализа для подтверждения специфичности к ГЕ-18ВР. В качестве стандарта использовали рекомбинантный бШ18ВР-6618. Чувствительность ЕЫ8А составляла 100 пг/мл. Параллельно оценивали уровни ББ-18 с использованием набора для ЕБКА-анализа человеческого Ι6-18 (МВБ, Iттиηоΐесб). Чувствительность ЕБГ8А составляла 12,5 пг/мл.

Экспрессия б!Б-18ВРа-Ы86 в клетках СНО.

Рекомбинантный человеческий ГБ-18ВР (бББ-18ВРа-Ы86-метка) выделяли из клеток яичника китайского хомячка ШИегрбагт БаЬога1опе8, №8 2юпа, йгаеО.

Результаты

Экспрессия мРНК-транскриптов Ш-18ВР в кишечных биоптатах.

Анализ экспрессии мРНК ΙΌ-18ВР осуществляли с помощью ОТ-ПЦР на тканевых гомогенатах, полученных из хирургических образцов толстой кишки от пациентов с активным БК, неактивным БК или ЯК и от невоспалительной ткани кишечника. Транскрипты ГБ-18ВР и актина детектировали во всех тестируемых кишечных гомогенатах. Аналогичным образом транскрипты для ГБ-18 были обнаружены во всех тканевых гомогенатах, т. е. от пациентов с БК, ЯК или не-ВЗК-контролей. Отношение уровней мРНК для ЕБ-18ВР или для ЕБ-18 к уровням мРНК контрольного актина продемонстрировали статистически значимое увеличение (как описано ниже) количества транскриптов для обоих ЕБ-18ВР и ЕБ-18 в биоптатах, полученных от пациентов с активным БК, по сравнению с биоптатами, полученными от пациентов с неактивным БК, с ЯК и от контрольных пациентов с отсутствием ВЗК. Эти данные показали, что ΙΕ18ВР подвержен позитивной регуляции в ткани слизистой в процессе активной БК, и это является главным свидетельством того, что уровень экспрессии ΙΒ-18ВР позволяет четко дифференцировать активную БК от неактивной БК, ЯК и не-ВЗК-контроля.

Статистический анализ экспрессии мРНКтранскриптов Ш-ШЕР в кишечных биоптатах.

После сбора всех имеющихся данных осуществляли дисперсионный анализ. Результат анализа явно выявил резко отклоняющиеся значения, относящиеся к результатам, полученным для одного из пациентов из группы с активной БК (очень высокое ОР-отношение для ΙΒ-18, а именно 16252, и очень низкое ОР-отношение для ^-^ВР, а именно 1058). Это единственная и очень нетипичная пара значений не позволяет подтвердить правильность ΑNОVΑ-модели (р величина критерия Шапиро-Уилкса для нормальности остаточных дисперсий <0,0001), а поэтому было принято решение игнорировать эту пару измерений в статистическом анализе.

Используемая А№ОУА-модель учитывала фактор-группу (контроль, активная БК, неактивная БК и ЯК), белок (ГЬ-18 или ГЬ-18ВР) и число пациентов (23 пациента). Имеется значимое различие внутри группы (р-величина <0,0001). Также интересно отметить, что различие в ΟΌ-отношениях между ГЬ-18 и ГБ-18ВР является незначимым (р-величина = 0,369). Кроме того, была также проведена корреляция между уровнями экспрессии ГЬ-18 и ГЬ-18ВР. Коэффициент корреляции между ГЬ-18 и ГЬ18ВР был равен 0,67, что позволяет предположить тесную взаимосвязь между ΟΌотношениями, измеренными для ГЬ-18 и ГЬ18ВР. После оценки результатов, касающихся группового эффекта, был использован метод Шеффе для сравнения различных групп. Может быть сделан вывод, что ΟΌ-отношение для активного БК значительно выше, чем для контроля (+3280), ЯК (+2590), а особенно для неактивного БК (+4580), как в случае экспрессии ГЬ18ВР, так и в случае экспрессии ГЬ-18.

Иммуногистохимическая локализация ГЬ18ВР в кишечной ткани.

Для оценки клеточной экспрессии ГЬ-18ВР ш зйи осуществляли иммуногистохимический анализ на криосрезах, полученных из кишечных тканей от пациентов с активным БК и от неВЗК-контролей, с использованием моноклональных антител против ЫЬ-18ВР. ГЬ-18ВРположительные клетки детектировали в собственной пластинке слизистой (1ат1па ргорпа), в подслизистом слое и в мышечном слое (данные не приводятся). Позитивно окрашенные мононуклеарные клетки, присутствующие в собственной пластинке слизистой и в подслизистом слое, имели избыточную цитоплазму, везикулярное сетеобразное ядро и морфологически соответствовали тканевым макрофагам. В мышечном слое позитивно окрашенные клетки имели избыточную цитоплазму с несколькими открытыми просветами в середине, что позволяет предположить о позитивном окрашивании микрососудов, и эти клетки морфологически соответствовали эндотелиальным клеткам. Крупные сосуды также специфически окрашивались моноклональными антителами против ЫЬ-18ВР. Значительное увеличение положительно окрашенных клеток, наблюдаемое в образцах, полученных от пациентов с активным БК, по сравнению с образцами, полученными от контрольных пациентов с отсутствием ВЗК, коррелировало с повышенным уровнем экспрессии ГЬ-18ВР, наблюдаемым в ОТ-ПЦРанализе. Смежные срезы инкубировали с соответствующим мышиным контрольным изотипом.

Идентификация продуцирования ГЬ-18ВР клетками, присутствующими в биоптатах слизистой.

ГЬ-18ВР-позитивные клетки, присутствующие в воспалительных тканях кишечника, были идентифицированы с использованием специфических маркеров макрофагов (антиΓ.Ό68 антитела) и эндотелиальных клеток (антиΓ.Ό31 антитела) (данные не приводятся). СЭ68положительные клетки (зеленая окраска) и ГЬ18ВР-положительные клетки (красная окраска) были обнаружены в собственной пластинке слизистой и в подслизистом слое кишечных тканей от пациентов с активной БК (данные не приводятся). СО31-положительные клетки (зеленая окраска) и ГЬ-18ВР-положительные клетки (красная окраска) были обнаружены в подслизистом слое. Для подтверждения того факта, что макрофаги и эндотелиальные клетки были также ГЬ-18ВР-положительными, клетки обоих цветов, зеленого от анти-СО68 антитела или анти-СЬ31 антитела и красного от анти-ГЬ-18ВР антитела анализировали вместе, в результате чего было продемонстрировано, что все клетки, которые связываются с антителами против ГЬ18ВР, были либо СО68-положительными, либо СО31-положительными (оранжево-желтая окраска). Двойное иммуномечение продемонстрировало, что эти макрофаги и эндотелиальные клетки являются главным источником окрашивания ГЬ-18ВР в воспалительных тканях, полученных от пациентов с БК.

Экспрессия мРНК и белка ГЬ-18ВР эндотелиальными клетками.

Для исследования способности человеческих эндотелиальных клеток продуцировать ГЬ18ВР, а также для подтверждения результата, полученного посредством иммуноокрашивания и реакции ОТ-ПЦР на всех биоптатах, осуществляли дополнительные эксперименты с помощью реакции ОТ-ПЦР на эндотелиальных клетках пупочной вены человека (НИУЕС). Эндотелиальные клетки обрабатывали смесью цитокинов (ЫЬ-1р, ΕΓΝΕ-α, ΜΕΝγ) и через 24 ч собирали для экстракции РНК и ПЦР-анализа. Отношение уровней мРНК для ГЬ-18ВР к уровням мРНК для контрольного актина продемонстрировало увеличение количества транскриптов ГЬ18ВР в обработанных клетках по сравнению с нестимулированными клетками, через 24 ч. Кроме того, очевидно, что мРНК ГЬ-18ВР конститутивно экспрессируется в эндотелиальных клетках. Был также проанализирован уровень мРНК ГЬ-18 и было продемонстрировано его небольшое увеличение в обработанных клетках. Однако мРНК ГЬ-18 не экспрессировался в нестимулированных эндотелиальных клетках.

ЕЬГ8А-анализ супернатантов культуры нестимулированных клеток (среда) и клеток НИУЕС, обработанных в течение 24 ч, выявил, что белок ГЬ-18ВР присутствовал как в клетках, обработанных средой, так и в стимулированных клетках, где после 24-часовой стимуляции его уровень увеличивался в 30 раз.

Экспрессия белка 1Ь-18ВР моноцитарной клеточной линией (ТНР-1).

Экспрессию 1Ь-18 и 1Ь-18ВР анализировали в супернатантах культуры нестимулированных и стимулированных дифференцированных клеток ТНР-1 с помощью ЕЬ18А. Этот эксперимент выявил увеличение экспрессии 1Ь-18ВР после 48-часовой стимуляции липосахаридами (ЛПС), ЫЬ-1р, ЬТ№-а, ΙιΙΕΝγ. Аналогичным образом секреция 1Ь-18 повышалась после стимулирования.

Выводы

В настоящем исследовании проводили характеризацию экспрессии 1Ь-18ВР и определяли локализацию 1Ь-18ВР в ткани слизистой, полученной от пациентов с болезнью Крона (БК) и язвенным колитом (ЯК). В соответствии с протоколом полуколичественного ОТ-ПЦР-анализа, было обнаружено увеличение уровней мРНКтранскриптов 1Ь-18ВР в биоптатах слизистой у пациентов с активной болезнью Крона по сравнению с пациентами с язвенным колитом и с пациентами невоспалительного контроля. Иммуногистохимические анализы биоптата слизистой выявили присутствие белка 1Ь-18ВР в эндотелиальных клетках и в макрофагах, инфильтрирующих слизистую при болезни Крона. Экспрессия 1Ь-18ВР эндотелиальными клетками и активированными макрофагами была подтверждена в первичных эндотелиальных клетках пупочной вены человека (НИУЕС) и в моноцитарной клеточной линии ТНР1, стимулированной 1п νίΙΐΌ. После стимуляции эти клетки секретировали биоактивный 1Ь-18ВР.

Пример 29. Обработка ингибиторами 1Ь-18 приводила к уменьшению интенсивности симптомов экспериментального колита.

Материалы и методы

Мыши и индуцирование колита.

Все эксперименты проводились с разрешения Комиссии по этике исследований, проводимых на животных, при Амстердамском университете, Нидерланды. Мышей ВАЬВ/с получали из Наг1ап 8рга§ие-Оа^1еу, 1пс. (Ногк1, ТНе №1йег1апйк). Мыши содержались в стандартных условиях и получали питьевую воду и корм (АМII, 10 мм, Норе Рагтк, 4оегйеп, ТНе №1йег1апйк).

Эксперименты проводили на 8- и 10недельных самках мышей ВАЬВ/с. Колит индуцировали путем ректального введения двух доз (отдельно, через интервал в 7 дней) 2 мг 2,4,6тринитробензолсульфоновой кислоты ^N88) (81дта СНет1са1 Со., 81. Ьошк, МО, И8А) в 40% этанола (Мегск, Оагтк1ай1, Сегтапу) с использованием винилового катетера, который был помещен на расстоянии 3 см от ануса (10 мышей на группу). Во время установления катетера мышей анестезировали изофлураном (1-хлор2,2,2-трифторэтилизофлурандифторметиловый эфир, АЬЬо11 ЬаЬогаЮпек Ый., ОиеепЬогоидН, Кеп1, ЦК) и после установления катетера мышей держали вертикально в течение 60 с. Контрольных мышей подвергали идентичным процедурам, но при этом вводили физиологический раствор. Через 9 дней после первого введения ΤNВ8 (т.е. через 48 ч после второго введения ΤNВ8) всех мышей умерщвляли.

Мышей внутрибрюшинно обрабатывали человеческим 1Ь-18ВР в 500 мкл 0,9%-го физиологического раствора.

Н1Ь-18ВР представляет собой человеческий рекомбинантный белок, содержащий метку из 6 гистидинов, в экспрессионной системе СНО. ЫЬ-18ВР являлся биологически активным, поскольку он ингибировал продуцирование ΙΕΝγ в клеточной линии КС-1 и снижал продуцирование ΙΕΝ-γ клетками мышиной селезенки (К1т е1 а1., 2000).

Оценка воспаления.

Массу тела регистрировали ежедневно. После умерщвления мышей вырезали селезенку, каудальные лимфотические узлы и толстую кишку. Толстую кишку удаляли посредством срединного разреза и продольного иссечения. После удаления фекальных масс, регистрировали сырую массу дистального 6 см-отдела и использовали как показатель ассоциированного с заболеванием утолщения стенки кишечника. Затем толстую кишку разделяли на две части путем продольного рассечения, и одну часть использовали для гистологического анализа.

Гистологический анализ.

Продольно разрезанную толстую кишку скатывали, фиксировали 4% формалином и заливали в парафин для рутинного гистологического анализа. Два исследователя, работавшие вслепую, т.е. не знавшие о распределении мышей по группам обработки, оценивали мышей по следующим параметрам: 1) процент пораженной площади, 2) гиперплазия фолликулярных агрегатов, 3) отеки, 4) эрозия/изъязвление, 5) отсутствие крипты и 6) инфильтрация моноили полиморфонуклеарных клеток. Процент пораженной площади и отсутствие крипты оценивали по шкале от 0 до 4 баллов следующим образом: 0 = нормальный, 1 = менеечем 10%, 2 = 10%, 3 = 10-50%, 4 = более чем 50%. Эрозию определяли как 0, если эпителий был неповрежденным, оценка 1 означала поражение собственной пластинки слизистой, оценка 2 означала изъязвление подслизистого слоя, а оценка 3 означала изъязвление в трансмуральном слое. Другие параметры оценивались по шкале 0-3 балла следующим образом: 0 - поражение отсутствует, 1 - слабое поражение, 2 - среднее поражение; 3 - сильное поражение. Эта шкала оценок имеет диапазон от 0 до максимум 26 баллов.

Гомогенаты толстой кишки.

Толстую кишку выделяли и получали гомогенаты с помощью тканевого гомогенизатора в 9 объемах буфера для лизиса СгеепЬигдег (300 мМ №С1, 15 мМ Триса, 2 мМ МдС1₂, 2 мМ Тритона (Х-100), пепстатин А, лейпептин, апротинин (все по 20 нг/мл), рН 7,4). Ткань подвергали лизису в течение 30 мин на льду, с последующим двухкратным центрифугированием (10 мин, 14000 х д). Гомогенаты хранили при -20°С вплоть до использования.

Клеточные культуры и анализ ЕЫ8А на цитокины.

Для получения суспензии клеток селезенки и каудальных лимфатических узлов использовали клеточные фильтры (ВесФп/Оюктзоп ЬаЬтеаге, №\ν 1егзеу, И8А). Клетки суспендировали в среде ΚΓΜΣ 1640 (Вю^Ыйакег-ВоеЫппдег, Уегу1егз, Ве1дшт), содержащей 10% РС8 и ципроксин (10 мкг/мг) (81дта СЫет1са1 Со., 8!. Ьошз, МО, И8А). Клетки селезенки центрифугировали со стерильным фиколлом (Рйагташа, Иррза1а, 8\уе6еп), мононуклеарные клетки переносили в среду ΚΓΜΣ и подсчитывали число клеток в суспензии. Полное число 1 х 10⁵ клеток/мышь инкубировали в 200 мкл ΚΓΜΣ (ВюХУШакег Еигоре, А СатЬгех Сотрапу, УегУ1егз, Ве1дшт), содержащей антибиотики и 10% фетальную телячью сыворотку в лунках с тремя повторностями. Клетки стимулировали путем предварительной сенсибилизации антителом против 0Ό3 (концентрация 1:30; клон 145.2С11) и растворимым антителом против ΟΌ28 (концентрация 1:1000; РЫагттдеп). Супернатанты удаляли через 48 ч и измеряли концентрации ΣΡΝγ (Рйагтщдеп) и ΨΝΡ-α (Κ&Ό зуз!етз, АЬшдбоп, Ипйеб Кшдбот) с помощью анализа ЕЫ8А.

Проточная цитометрия.

Выделенные клетки селезенки промывали буфером РАС8 (РВ8, содержащий 0,5% В8А, 0,3 ммоль/л ЕЭТА и 0,01% азида натрия) и выдерживали на льду для проведения дальнейшей процедуры. 2 х 10⁵ клеток на лунку (96луночного У-образного микропланшета, Сгетег

В.У. 1аЬог !ес1пек, А1рНеп аап бе К^п, ТЫе №111ег1ап6з) инкубировали со следующими антителами (тАЬ): крысиным антителом против мышиного 0Ό4, конъюгированным с цитохромом, (клон КМ4-5), ФИТЦ-конъюгированным крысиным антителом против мышиного 0Ό69 и ФИТЦ-конъюгированным крысиным антителом против мышиного ΟΌ25 (Рйагттдеп, 8ап О1едо, СА). Лимфоциты, отобранные на сортере путем прямого и бокового рассеяния с использованием проточного цитометра РА8Ссап в комбинации с программным обеспечением Расзсап (Вес!оп Оюкшзоп, Моип1аш У1ете, И8А) и отсчитывали 5000 клеток. Результаты выражали как процент отобранных клеток, которые были положительными по отношению к используемым тАЬ.

Статистический анализ.

Величины были представлены как среднее значение ± ср.кв.ош. на группу обработки. Различия между группами были проанализированы с использованием непараметрического Икритерия Манна-Уитни. Изменение массы в зависимости от времени анализировали с использованием одностороннего дисперсионного анализа. Р<0,05 рассматривался как уровень значимости. Для всех анализов использовали статистическое программное обеспечение 8Р88 (8Р88 Ичс. СЫсадо, И8А).

Результаты

Σ^-18ВР защищает от потери массы у мышей с моделью колита.

Для исследования роли ΣΕ-18 в экспериментальном колите, а в частности, протективного эффекта ΣΕ-18-связывающего белка (ΣΕ18ВР), у мышей ВАЬВ/с индуцировали 1КВ8колит. Эта модель предусматривает местную обработку тринитробензолсульфоновой кислотой (ТМВ8) в 40% этаноле. Это вызывает реакцию гиперчувствительности замедленного типа в ответ на аутоантиген, модифицированный гаптеном (тринитрофенилом), и этот ответ представляет собой реакцию Т1 1-типа с усиленным продуцированием провоспалительных цитокинов.

Мышей каждый день обрабатывали внутрибрюшинно (ΐ.ρ.) человеческим Σ^-18ВР или контролем.

Суточные внутрибрюшинные дозы, составляющие от 12,5 до 50 мкг ЫБ-18ВР, не влияли на тяжесть заболевания (данные не приводятся). Однако использование ежедневной внутрибрюшинной дозы 200 мкг ЫЕ-18ВР было эффективным для снижения потери массы в связи с индуцированием заболевания.

Как и ожидалось, ректальное введение ТЫВ8 приводило к диарее и к истощению. Животные в обеих группах обработки теряли 15% от своей исходной массы на 3-й день. Однако по сравнению с контрольными мышами, начиная с 4-го дня после введения ТНВ8, ЫБ-18ВРобработанные животные быстро восстанавливали свою первоначальную массу и на 8-й день имели исходную массу. У контрольных мышей, второе введение Т^ТЫВ8 на 8-й день снова приводило к значительной потере массы, которая, в основном, предотвращалась введением ЫЕ18ВР. Введение ЫБ-18ВР обработанным физиологическим раствором мышам не давало никакого эффекта (данные не приводятся). Поэтому введение ЫЕ-18ВР приводило к значительному уменьшению потери массы, ассоциированной с Т^тЫВ8-индуцированным колитом (р<0,05).

Влияние на параметры воспаления.

На 10-й день мышей умерщвляли и определяли массу последних 6 см толстой кишки. При ТИВ 8-колите, масса толстой кишки увеличивалась по сравнению с массой толстой кишки мышей, обработанных физиологическим раствором. Это увеличение массы было значитель но меньшим у ЫЬ-18ВР-обработанных мышей (181,6 мг ± 11,4, а у мышей, обработанных физиологическим раствором - 268 мг ± 27,3 (р<0,05)). Ранее сообщалось, что таВ8-колит ассоциирован с увеличением миграции клеток в каудальные лимфоузлы (Сатодйо еί а1., 2000). Ш-^ВР-обработка приводила к снижению числа клеток, поражающих каудальный лимфоузел, по сравнению с числом клеток в каудальном лимфоузле у ΤΝΉ 8-мышей, обработанных физиологическим раствором.

Изменение экспрессии СР69, которое является показателем ранней активации Тлимфоцитов, определяли с помощью анализа Еас^сап. Процент СЭ4'-клеток селезенки, экспрессирующих СР69, составлял 11,4% у ΤΝΕ8обработанных мышей, а у ΤΝΉ 8-мышей, обработанных ЫБ-18ВР, процент СЭ4'/СЭ69'клеток составлял 7,3% (Р<0,05).

Продуцирование цитокинов в клетках селезенки, в клетках каудального лимфоузла и в гомогенатах толстой кишки.

Для исследования влияния ЫБ-18ВР на способность Т-лимфоцитов стимулировать синтез провоспалительных цитокинов после активации Т-клеточного рецептора, клетки выделяли из каудального лимфоузла и селезенки и стимулировали в течение 48 ч антителами против ί.Ό3/ί.Ό28. В супернатантах измеряли уровень продуцирования ΙΡΝ-γ и ΤΝΡ-α. Каких-либо значимых отличий между продуцированием цитокинов у ЫБ-18ВР-обработанных мышей и у контрольных мышей не наблюдалось. Следовательно, нейтрализация ΙΒ-18 путем ЫБ-18ВРобработки не приводила к гене-рализованному снижению способности Т-лимфоцитов реагировать на активацию Т-клеточного рецептора.

Гомогенаты толстой кишки анализировали на уровни цитокинов, что позволяло, тем самым, определить местное продуцирование цитокинов. Никакого отличия в уровнях ΙΡΝ-γ в гомогенатах толстой кишки у ΤΝΕ 8-мышей и у ΤNВ8-мышей, обработанных ЫБ-18ВР, не наблюдалось (134 пг/мл ± 7,8 и 139 пг/мл ± 23 соответственно). Однако уровни ΤΝΡ-α в гомогенатах толстой кишки у ЫЬ-18ВР-обработанных мышей значительно снижались от 110 пг/мл ± 3 у ΤNВ8-мышей и до 59 пг/мл ± 2,7 у ΤΝΉ8мышей, обработанных ЫБ-18ВР.

Данные гистологического анализа.

Для того чтобы определить, влияет ли ЫЬ18ВР-опосредованное снижение параметров воспаления также на гистологическую оценку, проводили гистопатологический анализ на парафиновых срезах. Общая оценка воспаления, полученная при гистологическом анализе, была значительно ниже у ЫЬ-18ВР-обработанных мышей по сравнению с контрольными мышами (15,9±1,1 - у необработанных мышей и 9,8±1,3 у ЫЬ-18ВР-обработанных мышей) (данные не приводятся), что, в основном, обусловлено сни жением числа лейкоцитов, инфильтрирующих слизистую (р<0,05). Интересно отметить, что у Ш-^ВР-обработанных мышей наблюдалось полное отсутствие изъязвлений слизистой (р<0,05). Полученные результаты систематизированы в табл. 6, приведенной ниже. Особенно примечательно, что у Ш-^ВР-обработанных мышей полностью предупреждалось изъязвление слизистой.

Таблица 6 Различные параметры зоны колита у ’ГЫВ8-мышей, обработанных физиологическим раствором или гЫЬ18ВРа

	Контрольные !^В8-мыши	ЫБ-18ВРобработанные !^В8мыши
% Площади поражения	3,4 ± 0,4	3,2 ±0,5
Фолликулярные агрегаты	2,0 ± 0,4	1,5 ± 0,4
Отек	2,1 ± 0,3	1,3 ± 0,3
Фиброз	0,85 ± 0,26	0,50 ± 0,2
Изязвления	2,0 ± 0,3	0,0 ± 0,0*
Отсутствие крипты	1,7 ± 0,3	1,0 ± 0,3*
Полиморфные ядерные клетки	2,6 ± 0,2	1,3 ± 0,2*
Мононуклеарные клетки	1,1 ± 0,1	0,33 ± 0,21*

Данные представлены как среднее значение ± ср.кв.ош. по шкале оценок 0-4, * означает значимое отличие.

Поликлональные антитела против тП-ИЗ защищают от заболевания у мышей с моделью колита, индуцированного натрийсодержащим сульфатом декстрана.

В этой модели натрийсодержащий сульфат декстрана (Ό88), ίά, давали мышам вместе с питьевой водой, начиная со дня 0 и вплоть до момента умерщвления животных. Поликлональные антитела против ΙΒ-18ВР вводили 1.р. на дни 0, 4 и 8. Дозы кроличьей сыворотки составляли 200 и 400 мкл. Наиболее высокая доза (400 мкл) давала значительное снижение потери массы, клинической оценки, кровотечения из прямой кишки и укорачивания толстой кишки (данные не приводятся). Обработка кроличьим антителом против тП-18 приводила к замедлению начала заболевания и к предотвращению прогрессирования заболевания (данные не приводятся).

Выводы

В вышеописанном примере 29 продемонстрировано, что нейтрализация ΙΒ-18 путем введения либо ЫБ-18ВР, либо поликлональной антисыворотки против ΙΒ-18 приводит к эффективному снижению тяжести экспериментально индуцированного колита у мышей.

У мышей, которым ежедневно внутрибрюшинно вводили ЫБ-18ВР, по сравнению с контрольными мышами быстро восстанавливалась их первоначальная масса. Оценки других параметров воспаления толстой кишки, таких как масса толстой кишки и приток клеток в каудальные лимфоузлы, снижались у ЫБ-18ВРобработаннных мышей. Гистопатология обработанных мышей указывала на снижение тяжести деструкции тканей (изъязвлений) и на значи тельное снижение количества инфильтрирующих клеток. Эффект ЫЬ-18ВР был системным, на что указывала пониженная экспрессия 0Ό69 клетками селезенки.

Локальное продуцирование ΤΝΡα, измеренное в гомогенатах толстой кишки, было значительно снижено у ΤNБ8-мышей, обработанных ЫЬ-18ВР. Это свидетельствует о том, что ΤΝΡα играет важную роль в прогрессировании заболевания. Уровни ΙΡΝγ у ЙКВ 8-мышей и у ΤNБ8-мышей, обработанных ЫЬ-18ВР, были сравнимыми, что может быть объяснено избыточностью ΙΡΝγ-индуцирующих стимуляторов.

В заключение можно сделать вывод, что представленные выше данные демонстрируют благоприятный эффект ингибиторов ГБ-18 при лечении воспалительных заболеваний кишечника.

Литература

1. Апйегкоп, Ό.Μ. , ей а1., А кото1одие ой йке ΤΝΡ гесерЮг апй ййк Идапй епкапсе Τ-сеИ дгоМк апй йепйпкс-се11 йипсйоп. МИше, 1997. 390(6656): р. 175-179.

2. Во11оп, Ό. Р., ей а1. (1980) й. С1т. Нета!о1. Опсо1. 10:39-48.

3. Войкйет, Ό., ей а1. (1982) М1ат1 ХУкЛ. 8утр. 19:265-274.

4. Вгоаск, й. К., ίη 'Тке Мо1еси1аг Вк1оду ой йке Уеак1 8асскаготусек: Ыйе Сус1е апй [пкег11апсе, Со1й 8рппд НагЬог ЬаЬогайогу, Со1й 8рппд НагЬог, ΝΥ, рр. 445-470 (1981).

5. Вгоаск, й. К., (1982) Се11 28:203-204.

6. Вугп К. А. ей а1., 1990, №Лиге (Ьопйоп) 344:667-670.

7. Саг, В. Ό., У. М. Епд, В. 8скпуйег, Ь. Охтеп, 8. Ниапд, Р. Са11ау, Ό. Неитапп, М. Адией, апй В. Куййе1. 1994. кЛексгоп γ гесерйог йейккпй лисе аге гек1к1ап1 йо епйоЮ.хю ккоск. й. Ехр. Мей. 179:1437-44 1ккп: 0022-1007.

8. Скайег, К. Р. ей а1., ίη 81хйк клегпакопа1 8утрокшт оп Асй1потусейа1ек Вт1оду, Акайе1ша1 Ка1йо, Вийарекй, Нипдагу (1986), рр. 45-54.

9. Сопй1, В., й. У. йакпд, С. Τίηίί, й. Н. 8оп, апй Τ. Н. йок. 1997. к1йископ ой тйегйегоп^ ίηйисшд йасйог ίη йке айгепа1 согйех. й. Вк1. Скет. 272:2035-2037.

10. Эао, Τ., К. ОкакЫ, Τ. Кауапо, М. Киптойо, апй Н. Окатига. 1996. Iпйе^Ге^оп-γ-^пйис^пд йасйог, а поуе1 суйокйпе, епкапсек Рак кдапйтеФайей сугойохкку ой типпе Τ ке1рег 1 се11к. Се114ттипо1. 173:230-5 йккп: 0008-8749.

11. Епде1тапп, Н., Ό. Айегка, М. КлЬшкйеш, Ό. Койтап, апй Ό. ХУа1ккск. 1989. А йитог песгок1к йасйог-Ьтйшд ргойет рипйкй йо котодепеку йгот китап иппе ргойесйк се11к йгот йитог песгок1к йасйог йохкку. й. Вю1. Скет. 264:1197411980.

12. Епде1тапп, Н., Ό. №у1ск, апй Ό. ХУа11аск. 1990. Τ\\ό йитог песгок1к йасйог-Ьтйшд ргойетк рипйкй йгот китап иппе. Еуййепсе йог 1ттипо1од1са1 сгокк-геаскуку νίΐΗ се11 клгйасе йитог песгок1к йасйог гесерйогк. й. Вт1. Скет. 265: 1531-1536.

13. РапШххг С., ей а1., ΙΠ-18 геди1айоп ой Ш№д ргойисйоп апй се11 ргокйегакоп ак геуеа1ей ίη тйег1еикт-1Ь сопуегйпд епхутейеПаегИ тке. В1оой, 1998. 91: р. 2118-2125.

14. Сгусхап, Τ., 'Тке Мо1еси1аг Вк1оду ой йке Васкк, Асайетк Ргекк, ΝΥ (1982), рр. 307329.

15. Сийктй, Й.8. ей а1., А поуе1 с-йдг ехоп лккхей ίη Еркйет-Вап уйгик-зийесйей В 1утрксуйек Ьий пой ίη тогта1 топосуйек. Мо1ес. Се11. В1о1., 1991. 11: р. 1500-1507.

16. Негетапк, Н., й. Уап Оатте, С. ЭШеп, К. Оуктапк, апй А. Вйкаи. 1990. Iпйе^Ге^оп γ, а теФайог ой 1ейка1 кроро1укасскапйе-тйисей 8к\гаг1хтап-кке ккоск геасйкпк ίη тке. й. Ехр. Мей. 171:1853-69 йккп: 0022-1007.

17. Ьакр К. (1978) йрп. й. Васйепак 33:729742.

18. йокп, й. Р., ей а1. (1986) Кеу. Ыесй. Эк. 8:693-704.

19. Кепйа11, К.Й. ей а1. (1987) й: Васйепак 169:4177-4183.

20. Кокпо, К., й. Кайаока, Τ. Окйкикй , Υ. 8иетойо, Ι. Окатойо, М. Икш, М. Кейа, апй М. Киптойо. 1997. ^Ν-γ -тйистд йасйог (ЮТР) 1к а сокйти1айогу йасйог оп йке аскуакоп ой ΤΗ1 Ьий пой ΤΗ2 се11к апй ехегйк ййк еййесй тйерепйепку ой К-12. й. Ιι^™! 158:1541-1550.

21. Маккхеууккй, С. К., Τ. А. 8айо, Τ. Уапйеп Вок, 8. ХУаидк, 8. К. Оо\\'ег, й. 81аск, М. Р. Весктапп, апй К. Н. СгаЬкйет. 1990. Суйокте гесерйогк апй В се11 йипсйкпк. Ι. КесотЬтапй ко1иЬ1е гесерйогк кресклсаку шкйЬк ΙΠ-1- апй Ш4-йпйисей В се11 асййуккк ίη уййго. й. Iттиπо1. 144:3028-3033.

22. Машакк, Τ., ίη Се11 Вк1оду: А Сотргекепкгуе ЖеаНке, Уо1. 3: Сепе Ехргекктп, Асайетк Ргекк, ΝΥ, рр. 563-608 (1980).

23. Матакк ей. а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬогайогу Мапиа1, Со1й 8рппд НагЬог ЬаЬогайогу, №\ν Уогк, 1982.

24. Мка11ей, М. й., Τ. Окйкик1, К. Кокпо, Р. ΤаηаЬе, 8. ИкШо, М. Мипка, Τ. Τаπ^тойо, К. Шпдое, М. РиЩ, М. Кейа, 8. Рикийа, апй М. Киптойо. 1996. Iпйе^Ге^оп-γ-^пйис^пд йасйог епкапсек Τ ке1рег 1 суйокте ргойископ Ьу ккти1айей китап Τ се11к: купегдкт νίίΐι тйег1еикт-12 йог ίηйегйегоп-γ ргойископ. Еи^-^-Iттипо1 26:1647-51 1ккп: 0014-2980.

25. М1хикЫта, 8. апй №да1а, 8. (1990) рЕРВО8, а ро\уегк11 таттакап ехргекккп уесйог. №.1с1ею Ас1й Кек. 18:5322-5328.

26. Шкапина, К., Н. Окатига, К. №1да1а, Τ. Котайки, апй Τ. Τати^а. 1993. Рипксакоп ой а йасйог \г1кск ргоу1йек а сокк-ти1айогу к1дпа1 йог γ тйегйегоп ргойископ. IηГесй-Iттип 61:64-70 1ккп: 0019-9567.

27. Шкатига, К., Н. Окатига, М. ХУайа, К. №1да1а, апй Τ. Τати^а. 1989. Епйойохт-тйисей

8егит Гас(ог 1На( 8бти1а1е8 γ тЬегГегоп ргобисбоп. ГпГесЬ-Гттип 57:5 90-5 188п: 0019-9567.

28. №\тск. Ό., В. СоНеп, апб М. КиЬш8!ет. 1994. Ню Нитап Гп1егГегоп α/β КесерЬог - СНагас(епх;Шоп апб Мо1еси1аг С1ошпд. Се11 77:391400.

29. Копск, Ό., В. СоЬеп, апб М. КиЬш8!ет. 1992. 8о1иЬ1е Гп1егГегоп-а Бесер(ог Мо1еси1е8 Аге Рге8еп1 ш Вобу Р1шб8. РЕВ8 Ьеб 314:445-448.

30. Копск, Ό., Н. Епде1тапп, Ό. ^а11асб, апб М. КиЪшзГеш. 1989. 8о1иЬ1е суЬокте гесер(ог8 аге рге8еп1 ш погта1 Нитап иппе. 1. Ехр. Меб. 170:1409-1414.

31. Окатига, Н., Н. Τ8ΐι(8ΐιί, Τ. Котаки, М. Уикибо, А. Накига, Τ. Τаη^тο!ο, К. ^бдое, Τ. Окига, Υ. Nикаба, К. Набоб, К. Акба, М. №1тЬа, Р. ΤаηаЬе, К. Кош8Ь1, δ. Рикиба, апб М. Кипто(о. 1995. С1ошпд оГ а пе\г суЬокте (На( тбисе8 ΦΝ-γ ргобисбоп Ьу Τ се118. №(иге 378:8 8-91.

32. Ко!бе, Н., Ν. А. 1епкт§, Ν. О. Соре1апб, апб Н. Ко1Ь. 1997. Αсбνе 8(аде оГ аи!о1ттипе б1аЬе!е8 18 а88оаа(еб \νί(1ι (Не ехрге88юп оГ а ηονе1 суЬокте, ГОГР, ^ЫсЬ 18 1оса(еб пеаг Гбб2. 1-СбпГ№е8б 99:469-74 188п: 0021-9738.

33. ЗатЬгоок, 1., Е.Р. РпксН, апб М. Τ., Мо1еси1аг С1ошпд: А 1аЬога!огу тапиа1. 2пб еб. еб. 1989, Со1б 8рппд Наг-Ьог, №\ν Уогк: Со1б 8ргтд НагЬог ЬаЬогаБогу.

34. 81топе!, XV.δ., е( а1., О8(еорго(едегт: а ηονе1 8есге(еб ргоЬет туоКеб ш (Не геди1абоп оГ Ьопе бепзйу. Се11, 1997. 89(2): р. 309-319.

35. δοтрау^ас, Ь.Н. апб К.Ь. Паппа, ЕГГ1аеп( 1п1есбоп оГ топкеу се118 \νί(1ι ОКА оГ 81т1ап νϊηΐ8 40. Ргос. №1'1. Асаб. δ^_. ^А, 1981. 78: р. 7575-7578.

36. δра^к8, С.А., е( а1., А881дптеп1 оГ Фе пис1еаг тбобс аррагакк рго1ет NиМΑ депе (о Ьитап сбгото8оте 11μ13. Оепот1с8, 1993.17: р. 222-224.

37. Τ8ΐι(8ΐιϊ, Н., К. №1каш81и, К. Макт, К. Н1да8бто, Н. Окатига, Υ. М1уаха\уа, апб К. Капеба. 1996. ΦΝ-γ-тбистд Гас(ог ир-геди1а!е8 Ра8 бдапб-теб1а!еб суФЬохк ас(пйу о! типпе па(ига1 кШег се11 с1опе8. 1. Гттипо1. 157:3967-73 188п: 0022-1767.

38. И8Ыо, δ., М. №1тЬа, Τ. Окига, К. На((огг Υ. Nикаба, К. Акба, Р. ΤаηаЬе, К. Кош8Ь1, М. М1са11еГ, М. РиЩ, К. Юпдое, Τ. Τаη^тο(ο, δ. Рикиба, М. Гкеба, Н. Окатига, апб М. Кипто(о. 1996. С1ошпд оГ Фе сЭНА Гог Ьитап ΦΝ-γтбистд Гас(ог, ехрге88юп ш Е8сНепс1иа соб, апб 8(иб1е8 оп (Не Ью1од1с ас(па6е8 оГ Фе рго(ет. 1. Гттипо1. 156:4274-4279.34. Окауата, Н. апб Вегд, Р. (1983) А сЭУА с1ошпд гес(ог Фа! регηιί(8 ехрге881оп оГсОУА Ш8еб8 ш таттаНап се118. Мо1. Се11. Вю1. 3:280-289.

39. Υа8иба, Н., е( а1. Гбеп(11у оГ ο8!еοс1а8!οдепе818 шЫЬЬогу Гас(ог (ОСГР) апб о8(еорго(едепп (ОРО): а тесЬап18т Ьу \\'1исН ОРО/ОСГР 1пН1Ь1(8 о8(еос1а8(одепе818 ш νί(ΐΌ. Епбосппо1оду, 1998. 139: р. 1329-1337.

Список последовательностей <110> ΝονίοΙί, ОапхеЬа

01паге11о, СЬагХез

КиЫпзсехп, МепасЬет

К1т, Зоо Нуип

Уеба КезеагсЬ апб ОеуеЬортепс Со. БЕб.

дддаасдЕдд дадсасаддс асдсадсЕдЕ дсааддссЕЕ ддЕдсЕддад садсЕдассс 480 сЕдсссЕдса садсассаас ЕЕСЕссЕдЕд ЕдсЕсдЕдда сссЕдаасад дЕЕдЕссадс 540 дЕсасдЕсдЕ ссЕддсссад СЕсЕдддсЕд ддсЕдадддс аассЕЕдссс сссасссаад 600 аадссссдсс СЕСсадссас адсадсссас адсадсаддд ЕсаадасЕса дсасадддсс 660 адсадсадса саассЕСдас сададсЕЕдд дЕсс^ассЕд ЕСЕассЕдда дЕдаасадЕс 720 ссЕдасЕдсс ЕдЕаддссдс дсддасдсдс аасасасссс сессессесс дсЕЕЕдддЕс 780 ссЕесесесэ ссаааЕЕсаа асЕссаЕЕсс сассЕассЕа дааааЕсаса дссЕссЕЕаЕ 840 ааЕдсссссс сссссЕдсса еесесссесс ассЕасссае ЕадссЕЕссЕ аасдЕссЕас 900

Ессссасасс дсисЕасЕдс Есадааасоа ссаадасЕдЕ ЕдаЕдсссЕа дссЕЕдсасС 960 ссадддсссЕ ассЕдсаЕЕс сссасасдас ЕЕЕсЕддаад ссЕсссаасЕ ЕЕсссадаса дсЕсссасСс ссаЕдЕСЕсЕ дсЕсаЕЕЕад ЕсссдЕсЕЕс садсадддда асдсЕсаадс сЕддЕЕдааа ЕдсЕдссЕсЕ ЕсадЕдаадЕ садсггсддс сдсаЕЕСЕде адассессЕа ЕсЕЕсдЕдсЕ дЕахдЕЕЕЕЕ Е£сасЕс-аа ЕддасЕдЕЕс садддааддд асдддддсас садсЕдсЕЕс сдЕаЕСЕдгд ссаЕссссас аЕдддссссс аЕаааддаСЕ асЕсааЕдда аааааааааа аааааааааа аааааааа аЕссЕЕдсЕЕ 1020 СЕсассдссс 1080 СаЕССЕСЕЕЕ 1140 ЕЕЕЕЕССССС 1200 ддаЕссасас 1260 аааааааааа 1320 1348 <210> 2 <211> 192 <212> ?ат белок <213> человек <220>

<22ΐ> δΣΟΝΑΕ сигнальный пептид <222> (1] . . (23) <400> 2

МеЕ Агд ΗΪ5 Азп Тгр ТЬг Рго Азр Ьеи Зег Рго Беи Тгр Уа1 Беи Беи

1

5

10

15

Беи

Суз

А1а

Н15

Уа1

Уа1

ТЬг

Беи

Беи

Уа1

Агд

А1а

ТЬ.с

Рго

Уа1

Зег

20

25

30

01п

ТЬг

ТЫ

ТЬг

А1а

А1а

ТЬг

А1а

Зег

Уа1

Агд

Зег

ТЬг

Ьуз

Рго

35

40

45

Суз

Рго

Зег

<31п

Рго

Рго

ν«1

РЬе

Рго

А1а

А1а

Ьуз

С1п

Суз

Рго

А1а

50

55

60

Беи

С1и

Уа1

ТЬг

Тгр

Рго

(31и

Уа!

й!и

Уа1

Рго

Беи

Азп

С1у

ТЬг

Беи

65

70

?5

80

Зег

Ееи

Зег

Суз

Уа1

А1а

Суз

Зег

Агд

РЬе

Рго

Азп

РЬе

Зег

11е

Ьеи

85

90

95

Туг

Тгр

Беи

С1у

Азп

С1у

Зег

РЬе

Не

С1и

Н13

Беи

Рго

С1у

Агд

Ьеи

100

105

110

Тхр

С1и

С1у

5ег

ТЬх

2ег

Ахд

С1и

Агд

С1у

Зег

ТЬг

О1у

ТЬг

ОХп

Ьеи

115

120

125

Суз

Ьуз

А1а

Ьеи

νβΐ

Ьеи

С1и

СЬп

Ьеи

ТЬг

Рхо

А1а

Ьеи

Ηί3

Зег

ТЬг

130

135

140

Азп

РЬе

5ег

Суз

Уа1

Ьеи

Уа1

Азр

Рго

С1и

С1п

Уа1

УаХ

СХп

Агд’

ΗΪ3

145

150

155

160

νβΐ

Уа1

Ьеи

А1а

С1п

Ьеи

Тгр

АХа

С1у

Ьеи

Ахд

АХа

ТЬх

Ьеи

Рго

Рго

165

170

175

ТЬг

С1п

С1и

А1а

Ьеи

Рго

Зег

Зех

Н13

Зег

Зег

Рго

СХп

С1п

С1п

С1у

180

185

190

<210> 3 <2ΐι> юза <212> ОМА ДНК <2ΐ3> человек <400> 3 дадаададда сдЕЕдхсаса дахааададс саддсхсасс адсхссхдас дсахдсахса60 хдасса-дад асасаасхдд асассадасс ЕсадссеЕХХ дсдддхссхд ссссХдЕдХд120 сссасдхсдх сасЕсхссхд дхсададсса сасссдссхс дсадассасс асадсхдсса180 схдссхсадх хадаадсаса ааддассссс дссссхссса дсссссадхд ххсссадсад240 схаадсадсд хссадсаххд даадхдассс ддссададдс ддаадхдсса схдадсхддд300 схаадддсаа ссххдссссс сасссаадаа дссссдсссЕ ссадссасад садхссасад360 садсадсд-с аадасхсадс асаддсссад садсадсаса ассЕхдасса дадсЕЕдддх420 ссхаесхдхс Еассхддадх даасадсссс ЕдасхдссЕд Еаддсхдсдх ддасдсдсаа480 сасасссссЕ ссЕЕсхсЕдс ЕЕЕдддхссс ЕЕсЕсЕсасс аааххсааас ЕссаЕЕссса540 ссхассхада ааахсасадс сХссЕЕаЕаа хдсссссхсс хссхдссахх схсссхссас600 ссахссасха дссххссхаа сдхссхасхс сссасасЕдс Есхассдсхс адааассасс660 аадасЕдххд аЕдссхЕадс схЕдсасхсс адддсссЕас сЕдсаЕЕЕсе сасахдасхх720 ссЕддаадсс хсссаасЕах ссЕхдсЕхсЕ сссадасадс ссссзсессс ахдссхсхдс790 гсаЕХхадхс ссдхссЕссЕ сассдсссса дсаддддаас дсЕсаадссЕ ддЕЕдаааХд840 сгдссЕСЕЕс адЕдаадЕса сссЕСЕЕЕса дсЕсхддссд сахссхдсад асЕЕссЕахс900 ххсдЕдсЕдх аЕдЕСЕЕЕЕЕ ссесссссЕе сасЕсЕаахд дасхдххсса дддаадддас960 дддддсасса дсЕдсЕЕсдд агссасасЕд саЕссдЕдЕс асссссасас дддЕссЕсаЕ 1020 аааддаЕЕас ЕсааЕдда1038

113 ?=? белок человек сигнальный пептид

11)..(28)

МеЕ Агд Ηίβ Азп Тхр ТЬг Рго Азр Ьеи Зег Рго Ьеи Тгр Уа1 Ьеи Ьеи 15 1015

Ьеи Суз А1а НХз Уа1 УаХ ТЬх Ьеи Ьеи УаХ Агд А1а ТЬх Рго УаХ 5ег

2530

СХп Тех ТЬх ТЬх АХа АХа ТЬг АХа Зег УаХ Агд Зег ТЬг Ьуз Азр Рхо

4045

Суз Рхо Зех С1п Рго Рго Уа1 РЬе Рго А1а А1а Ьуз СХп Су5 Рго АХа

5560

Ьеи СХи УаХ ТЬх Тхр Рхо С1и Уа1 С1и Уа1 Рго Ьеи Зех Тхр АХа С1и

70 7590

О1у Азг. Ьеи А1а Рхо Н13 Рхо Ахд Зег Рхо А1а Ьеи <31п Рхо С1п О1п

9095

Зех ТЬх АХа А1а С1у Ьеи Агд Ьеи Зег ТЬх С1у Рхо А1а А1а АХа С1п

100 105 НО

Рго <210>

<211>

<212>

<213>

<220>

<221>

<222>

<400>

ссхаахдаад	дддхаадахх	ддасхаддха
дсхддддсдд	ддааддаЕХд	хсасххдасс
дсхссаддсс	ахдсхасддд	аддадаадсс
ааадсдддад	хддЕЕЕасса	ЕхсхссЕссс
асасаеааад	адссаддсхс	ассадсхссс
сддасассад	ассссадссс	Еххдхдддсс
схддХсадад	ссасассхдЕ	схсдсадасс
асаааддасс	ссХдссссхс	ссадссссса
ххддаадхда	ссхддссада	ддхдсаадсд
дхддссхдса	дссдсХХссс	саасхссадс
аххдадсасс	Есссаддссд	асЕдгддсад
ддХасдсадс	ХдХдсааддс	сЕСддхдсхд
аасхссхссх	дхдхдсхсдх	ддасссЕдаа
садсхсхддд	хдаддадссс	ааддададдс
аСдХддсдад	дааадддЕдд	дсссЕдссад
хсааддхсад	ссадасаааа	аддаассхад
ааадхдахда	даЕдХсссХс	ссЕЕссЕЕдд
дссдддсхда	дддсаасссх	дссссссасс
ссасадсадс	адддххаада	сЕсадсасад
Ххдддхссха	ссхдхсхасс	хддадхдаас
дсдсаасаса	сссссхссхх	схсхдсхссд
СЕсссассХа	ссхадаааах	сасадссхсс
схссассхах	ссасхадссх	-ссЕаасдхс
ассассаада	схдххдасдс	сЕЕадссхсд
Едасхххсхд	даадсссссс	аасхаххсЕЕ
схсхдсссах	хсадЕсссдх	сЕЕссхсасс
дааахдсХас	схсххсадхд	аадгсахссЕ
ссхахсххсд	хдсхдхахдх	ееееееееес
адддахдддд	дсадсадсХд	сххсддассс
ссхсасааад	даххасЕсаа	Еддасдсахс
асхсссадда	асхххдсссд	ссссасдадд
адсхдаадас	аасассхдсх	хсаддддаас
дсссахаахд	ссссссддда	дсададдсса
хдхддссхса	ддааааддда	хдададааад
ддхаддсххс	ааададссха	СаСЕСсХСЕЕ
хсасдддада	ааааЕадасЕ	ЕЕахссасаа
дсссхсзааа	ассЕссссах	саохссазах
ддхдхсадсх	дсХдсЕдаад	дсхдхссссс
дхссхдддаа	ададсасссЕ	схддсаддхд
ссаададхда	дддссссхдс	Еддасссадс
схсххаЕддс	сссххсхада	сссададдсх
адссассааа	ассадссхса	ааХсЕддЕЕд
ааддадзсаа	ддЕадддада	дсдсссасас
ссдадааддс	дссадХдаад	дассадддас
хсхаддддхх	хддсхасхдх	Еддссхддда
дсддаддасс	адахдасддс	адса-.сдддд
ссЕЕхадхдс	схсдсссдаа	ададасасад
адссхдсасс	сассддсхдд	даадахсхсЕ

адсаЕСЕЕас аассаЕЕЕдЕ ддЕсаедада 720 сссссадсЕс ЕдСЕСсЕаад Едсхдааада 780 адсЕасЕдад даааадссад сЕасЕдадаа 840 ссасс£ЕЕса ссададаада ддасдЕЕдЕс 900 дасдсахдса ссахдассаЕ' дадасасаас 960 ОЕдсЕсссдЕ дЕдсссасдЕ сдссасссхс 1020 ассасадсЕд ссасЕдссЕс адЕЕадаадс 1080 дХдХХсссад садсЕаадса дХдХссадса 1140 ссасЕдааСд даасдсЕдад сххахссхдг 1200 аЕссЕсЕасЕ ддсЕдддсаа ЕддЕЕссссс 1260 дддадсасса дссдддаасд Едддадсаса 1320 дадсадсЕда ссссЕдсссс дсасадсасс 1380 саддЕЕдЕсс адсдСсасдс сдЕссхддсс 1440 сЕссаддаас аддаддадсЕ схдсххссах 1500 адсадссЕдх даасЕаахдс ссадсаЕЕсс 1560 дЕсЕЕдддса даддаддхдс адссЕадддс 1620 ссЕдаЕесЕЕ дЕсЕдссЕЕс асЕЕсссЕад 1680 саадаадссс ЕдсссЕссад ссасадсадх 1740 ддссадсадс адсасаассс Едассададс 1800 адхсссЕдас ХдссЕдЕадд схдсдХддах 1860 ддссесЕЕсЕ сссассааах ссааасхсса 1920 ЕЕаЕааЕдсс Ессессессс дссаххсхсх 1980 сЕассссЕса сасхдсссха сЕдсЕсадаа 2040 сасСссаддд сссЕасссдс ахххсссаса 2100 дсЕЕЕЕссса дасадсЕссс асхсссахдх 2160 дссссадсад дддаасдсЕс аадссЕддЕЕ 2220 сЕЕЕсадсЕс сддссдсахс сЕдсадасЕЕ 2280 ссссеесзсе сЕаахддасс дххссаддда 2340 асасЕдхахе Едсдхсахсс ссасахдддЕ 2400 сЕдасассхд гхсахсгадд сСЕсадххсс 2460 дадхахддда дадахддасс дссасасада 2520 асаддсдсЕЕ дааааадааа адададааса 2580 схаахддада дсдддаадад сссддааада 2640 даддхддЕас ддаадассса дсаддаасаа 2700 ххЕсссасас сдаЕсаадхс аасЕсадЕас 2760 дСааСаасаЕ ЕЕадаааада хссахссссд 2820 сссассссад Едсаадхсхд дддааддсад 2В80 аассссасхс сЕдадасаса дддсссахсс 2940 сЕсссассад дссадассса дЕссхддасс 3000 сассаддаса дсаддаасса дддссхасхс 3060 аададдаада сЕдсссаддс ссааддасес 3120 Едахддадаа дСдасЕССдс сссаадаааа 3180 ЕдЕссаЕдсЕ ссаддссссс гдддссадсЕ 3240 саддссаддд Едсдддсадд сагсасхдхс 3300 дсЕдададаа ддсассдада дддасадЕад 3360 асасаддхдд ддссасссас Еддхасхддс 3420 Есасахддсс адасдадаас ХЕдсдасасЕ 3480 ЕссхдсЕссс асдссссхдх ссддахсссс 3540 <210> 5 <21Х> 7063 <212> 3ΝΑ ДНК <213> человек ¹³ <400> 5 дааЕссдсдд ссдсдЕсдас дссададддд сЕаддахдад адасададдд ЕдЕдаСддЕд 60 ддсдссддда ааЕдЕасссд ассЕхддддс ЕддЕддсСдд дддадЕдддх адссЕдддаа 120 адассаддаЕ дЕддасддас хддхасддса ЕСдадссСда адхддхссаа сЕЕддддЕЕс 180 сссадхдссх аддааадЕЕд ЕссссЕЕдаа сдхсадЕдхд ааддЕдаадд аддаадсада 240

ЕдссЕдЕЕса хагддаааса аадассхддс сдсдаададд ддаддсддас ассааадЕсс 300 хдасасххдд дсдддасада аХЕдаЕсЕдЕ дададассса ЕсхадххсаЕ асссЕаддЕд 360 асссЕддддд ЕддсаЕдддд дсадаССада даЕсссадЕс ЕддЕахссхс ЕддададЕад 420 дадЕсссадд адсЕдааддЕ ЕСсЕддссас ЕдаасСЕСдд сЕааадсада ддхдхсасад 480 ссдсссаада ЕЕссссддЕС ааааадсдаа адсдаааЕад адддЕсдддд садсдсЕЕЕс 540 ссадааддах сдсссддсах ссхдсссссс ссадаадсад схсЕддхдсс даадададса 600

СЕдссЕссог дсдсдасхдд дхдадсссах зсесесесее сдддхсхсаа ЕЕссдссЕСс 660

ЕсссЕЕдхда ссахдадааЕ сЕсЕЕасссс дсддхссддд Еассххдссс ддхддхддса садддссххс даддахдсЕд ддадасссаа сдссадддсд дсхдсхсхсЕ дЕсахддддс дсадасадха ЕддассЕЕдЕ схЕсссааса Едадддаадд адхдсхддад дддсЕсЕадд СЕддаЕхддс аЕсахсЕдЕд дассагадсЕ сдасасЕЕаЕ ЕдЕЕСхдсЕЕ ЕссЕСЕсгда дЕЕссассхд дсссхадсдс ссЕдсасадх ддддсасасх аддсЕсассс дддаасааас хдсхдссасс ЕдсаддадЕа ддададддса сЕЕддсддсс схддхдссса сссахсассд дддааЕСсед ддсаддсаад ааддаддсса ЕЕссадЕсха сЕддасассс аадсЕдадеа даддаддЕдд дадххддсдс адгдЕасадЪ сасддсасаЕ дааасдддсс сасдсахЕхс дссссадддЕ ддддссаЕсЕ асасссЕсса дддхдсссаЕ СЕддсЕсдад аЕдсдсддад ЕЕЕдаадсЕс ааддссаЕсд ЕдсЕдссЕЕс ЕсдсЕЕсаЕс ЕсЕдддссЕс дЕдддаааса дсаададдад аадЕсаасдЕ дЕЕсссахсс адададаадд саасасссад дадасссдЕЕ ЕдсаЕдссдд асддхдссса дхаЕддадаЕ ддхсдддасс ЕсЕассЕаад дсхссЕдссх даасаЕдада ЕсаддсЕада дассссаддс сдаЕЕдсдсЕ хддсаадхдс дадссЕддад сассссаЕаа сддсасасад даададдЕса аасасссада ааддасаада ссхдадаадд ддссссЕаас дааддсссхд дссЕЕддахх аЕЕЕсддддЕ сддсссддда дддсЕдадЕЕ сссдсаддсЕ ЕдЕСЕддсЕс сссхддсасС ссасдЕаЕЕс ЕЕдЕсдаеад ЕЕссаЕддад

ЕаЕсадххдс дЕсЕЕсЕсЕс дсадссЕддс дсЕсЕсаЕсд дддЕддсасс аасддсдддс сссдссдсад асЕддсдссд ссаддссадс ссссЕЕсадс адЕадЕдсЕс дсЕддЕддсс ЕсасаСсЕда дсаассхдсс асдддгсадд сЕсссЕЕЕад дадссассдс ЕдсдсЕдсЕд сЕсддсдсад ддсЕсаддда ддаддаддас сЕЕссЕдссЕ сссЕдддсаа асссссаддд аддЕсасссс ЕсадсаддЕд сссасссЕдд дсЕдсадсЕс 'ссаЕдсадаа ссддсаддЕс асЕЕдаадсс асЕаЕЕЕсха сасдсадада ддаасааахх дсЕЕСсаада дсахддадда Ессддссаад аддсЕдсадд ххсааааадс аЕадхаадхс асдасдадса дссаЕааЕсд адссЕдддаа ЕЕссасаЕсс дЕасадаадс ссаасЕдсЕЕ аадсссхсас ЕсхаЕЕсаЕа

ЕддсЕдЕдсс сЕЕддададд дЕддссссаЕ· ддЕЕйсссЕс ааеддЕгддса ЕссасЕдсда ааддсЕдЕЕс дЕсадссЕдс дЕдсЕдЕдсс сссадссгса ЕдЕЕЕдсдсс ЕЕсЕЕадасЕ адссаддЕдс ссссЕЕссса сссЕЕддада ЕссЕСддхда дсссассЕса ссдддЕддЕд ддГсЕсЕЕдд аддсЕдсасд сЕддддссдЕ асдаддсада асддсасаад асхЕсасссс ЕЕССССЕСЕЕ ддаЕЕссаад асЕссаддда ЕдсааЕдсдд дсхдхЕсссс ассЕссхддс сддсасасса ЕссЕаддддс ссдсЕассас ааддассддд ададЕседдс СЕСсссаеад адЕдссссса ааддаддддс ЕССссЕсхЕЕ ссЕдСадЕсс даасЕдсдад ддадаассса дсаддадсад адсссссдда ЕЕсссаЕссс сдсаааддхс ааддЕддЕдс асдсхсхдад

ЕдадсадсЕС адсЕассадд сЕЕддаЕдсЕ ссссаЕсссд дсадЕддсдд дсдхгддддд ссЕадсЕЕсЕ ааддаадддс асдсЕдхасс ссЕдЕЕЕадЕ сЕЕсаЕдЕсд асддадаада сЕЕдсссссС асЕсхдддсс дадддааада дсЕдддссЕд ддадЕЕссад аЕдссадЕдс дддЕсЕссад ддЕддаадад сссадаасхс аадасасаад садЕдсадЕс ЕдадЕдсссх сддссадхса даадддсадд ЕадсаддЕсх ЕхссадЕсах ссхдЕддаад ссхддсахсс дЕсхдасЕса ЕЕдсЕсасса ассхгассса аагЕааЕЕсс садсссддсс схаадхдсса асасадссад аддЕддадсс ЕСССЕдхдсс ссхсассЕдд Еддсддддсд ддсдадсЕад ассдсдЕдсЕ адасададЕд сЕЕссдаадс сЕЕааадЕдс сдаЕдгхдхс дЕадддааЕд

ЕдддЕдсЕсЕ 3600 асадддасас 3660 асЕЕддхддд 3720 ссадЕдссЕс 3780 сдсЕддсЕдС 3840 аадссЕЕдда 3900 ЕдддЕдЕдЕС 3960 Едхсадассд 4020 адсааддхсс 4080 адаадсЕдда 4140 дЕсЕсдддда 4200 ддасадЕЕад 4260 сададсхдад 4320 адаЕссХЕсс 4380 дадддддаад 4440 ассЕдадсас 4500 ддсссСддЕд 4560 ссЕсддсЕах 4620 ЕЕЕЕсаЕсЕС 4680 дсддЕсадсд 4740 хасасхсдсс 4800 ССЕСССЕЕСС 4860 сЕдассадаЕ 4920 ссадсЕдхсЕ 4380 дЕдаЕссадд 5040 даЕдддаддс 5100 ссадахдхдд 5160 ссадсЕдсЕС 5220 дсадддаадЕ 5280 хдссадсссЕ 5340 дхдссдсадд 5400 ССЕЕСЕСССЕ 5460 сссдссаадд 5520 саддддсЕсс 5580 сссссадсад 5640 саасхдхдсЕ 5700 ссссхадаЕд 5760 ддаЕддЕадс 5820 асдаЕссасс 5880 аддддсссса 5940 дхадссаддс 6000 адасхдадха 6060 дХадаасдаХ 6120 аахссдхсдс 6180 ссхсадаХсс 6240 дсдхсХдсаа 6300 аадасхсххс 6360 сададхдхсх 6420 аЕсддсссаЕ ссаддаадса садссЕсЕдс ссаассссЕС

СССССЕСЕСС

ЕЕЕддадасд ЕсададсЕдд ЕдссссЕсад ддсадсаддд ссессесссэ ддсадЕссас дасдддсЕдс сддададаас Есадаадедс асасддасЕд ССдададдаа аадсдсааад ддсЕаддссс сссааасссс ддСаСССЕаа аасссссссс

Едддсадсаа адссссдсса дссадссЕЕа ссЕсаассаа дсЕдсссасс дсдддаассд ааасааадсд саСдЕссссЕ садддсссСЕ асасэсаддЕ ссаадасдсд сааЕдссЕсс сдСЕсЕсЕсс дссаддаддс дссассдссс ссСсссСдсС сСдассЕдСс асСадсссса дассадссад ассасдсссс сссссссдсс дааасааадд садссдсасд сЕЕсасссСд адддаЕсЕаа сЕСЕСаадас ссЕдассдад дас ааСсасассд дсссасссса адаасССссс дсассадддд ааадддсссд дддсасдсЕд сасаддсЕса Ссссадсссс сссссадсЕЕ Едсссадсдс

80 6540 6600 6660 6720 6780 6840 6900 6960 7020 7063 <210> <211> <212> <213>

197 _рят белок.

человек <220>

<221>

<222>

сигнальный пептид (1)·-(28) <400> 6

МеЕ Агд

Нхз Азп

Тгр ТЫ Рго Азр Ьеи Зег Рго Ьеи Тгр Уа1

10

Ьеи Суз

А1а Нхз

Уа1 Уа1 ТЬг

Зег

ТЬг

Рго

Су:

Рго <220>

<221> сигнальный пептид <222> (1) .. (28) <400> 8

Мес Агд Нхз Азп Тгр ТЬг ?го Азр Ьеи Зег Рго Ьеи Тгр Уа1 Ьеи Ьеи 15 1015

Ьеи Суз А1а Нхз Уа1 Уа1 ТЬг Ьеи Ьеи Уа1 Агд А1а ТЬг Рго Уа1 Зег 20 2530

С1п ТЬг ТЬг ТЬг АХа АХа ТЫ А1а Зег Уа1 Агд Зег ТЬг Ьуз Азр Рго 35 4045

Суз Рго Зег С1п Рго Рго V»! РЬе Рго АХа АХа Ьуз С1п Суз Рго А1а 50 5560

Ьеи СХи 7а1 ТЬг Тгр Рго <31и УаХ СХи νβΐ Рго Ьеи Азп С1у ТЬгЬеи

70 7580

Зег Ьеи Зег Суз Уа1 А1а Суэ Зег Агд РЬе Рго Азп РЬе Зег 11еЬеи

9095

Туг Тгр Ьеи С1у Азп С1у Зег РЬе 11е С1и Нхз Ьеи Рго С1у Агд Ьеи 100 105но

Тгр С1и С1у Зег ТЬг Зег Агд С1и Агд С1у Зег ТЬг СХу Тгр А1а СХи 115 · 120125

С1у Азл Ьеи АХа Рго Нхз Рго Агд Зег Рго А1а Ьеи СХп Рго С1п С1П 130 135140

Зег ТЬг А1а А1а С1у Ьеи Агд Ьеи Зег ТЬг С1у Рго А1а А1а А1а С1п

145 150 155160

Ьеи

УаХ Рго Ье:

Аз1

С1у ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег Суз νβΐ АХа Суз Зег Агд РЬ.е

90

Рго Аз1

РЬе Зег Не

Ьеи

Туг

Тгр

Ьеи С1у Азп СХу Зе:

100

Ьеи

СХи

Агд СХу 5е;

Ьеи <21С> 9 <211> 7912 <^212> ДНК <213> человек <400> 9 .

дссдасддса сссссдддаа адасссаага идасхсасса садддсддда садаассдас 60 ссдсдадада гссасссадс сиагасссса ддхдассссд ддддсддса' дддддсадас 120

Суз

АХа

ТЬг Рго

ТЬг

Азп

145

РЬе

Зег

Суз

УаХ

Ьеи

150

Уа1

Азр

Рго

С1и

СХп Уа1

155

УаХ

С1п

Агд

ΗΪ5

160

УаХ

Уа1

Ьеи

А1а

С1п

165

Ье:

Тгр

Агд

Зег

170

Рго Агд

Агд

СХу

Ьеи

175

С1п

СХи

СХп

СХи

С1и

180

Ьеи

Суз

РЬе

ΗΪ3

Мес

195

Тгр

С1у СХу

Ьуз

СХу

190

С1у

Ьеи

Суз

С11

Зег

195

Зе:

Ьеи <210>

<211>

<212>

<213>

1360

ДНК человек <400:

дсддссдсдС аадсЕЕСЕдд асадасааад сддасассад ассЕсадссс СЕЕдСдддгс сЕдсЕ< ссасассЕдЕ сссдсадасс ассасадссд ссассдссс.

сдассасдса дссааасаса дсЕаасЕСда дссссддадс аааддааддс ссЕЕсаддас сгсСЕаддад ссааадаада адссаддссс ассадссссс дасдсасдса ЕсаЕдассас ;ссЕдг дЕдсссасдС

ЕссСаааддд ддасдссдсс дадасасаас сдЕсассссс ссддссадад ссасассЕдЕ сссдсадасс ассасадссд ссассдсссс адссадаадс асаааддасс ссЕдсссссс ссадссссса дсдсгсссад садссаадса дсдЕссадса

ЕЕддаадсда сссддссада ддСддаадСд ссасЕдааСд даасдссдад сссаЕсссдс дЕддссСдса дссдсССссс саасЕЕсадс аЕссЕсСасС ддсСдддсаа ЕддЕСссЕСс ассдадсасс Ссссаддссд ассдсдддад дддадсасса дссдддаасд Едддадсаса ддсЕдддссд адддсаассс Едссссссас ссаадаадсс сЕдсссссса дссасадсад

Ессасадсад садддгсаад асгсадсаса дддссадсад садсасаасс ЕЕдассадад ссЕдддсссЕ ассЕдгсЕас ссддадЕдаа садгсссЕда сЕдсссдсад дсЕдсдЕдда

Сдсдсаасас асссссЕссЕ ЕсЕсЕдсЕЕЕ дддЕсссЕЕс Есссассааа сссааасгсс аЕЕсесассЕ ассЕадаааа ссасадссгс сЕсаГаасдс ссссЕссЕсс ЕдссаЕЕсЕс ссЕссассЕа ЕссаЕЕадсс ЕЕссЕаасдЕ ссЕасЕссгс асасЕдсгсс асЕдсЕсада аассассаад асгдседаЕд ссЕЕадссЕЕ дсасгссадд дсссЕассЕд саЕЕЕсссас аЕдасссЕсс ддаадссссс саасЕасСсЕ сдсссЕйссс адасадсЕсс сасссссасд ссссЕдсйса ЕЕЕадссссд ссЕсссЕсас сдссссадса ддддаасдсс саадсссддс сдааасдссд ссЕссссадг даадссассс ЕсгсссадсС ссддссдсах ЕсСдсадасЕ ссссассЕЕс дгдсЕдгаЕд ееесееееес сссссЕСсас сссаасддас СдЕЕссаддд аадпдаСддд ддсадсадсЕ дсЕЕсддаЕс сасасСдЕаС сЕдсдгсаЕс сссасаСддд ссЕсаЕааа ддаЕСаЕЕса асддаддсаЕ сссдасассЕ дЕссаЕЕЕад дсгЕсадссс сасЕсссадд аасЕЕЕдссс дссссасдад ддадЕасддд

120

1Θ0

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1360 <210> Θ <211> 161 <212> белок <213> человек

ЕададаЕссс	адЕседдЕаЕ	ссссЕддада
ссасЕдаасЕ	СЕддсЕааад	сададдЕдЕс
Едааадсдаа	аЕададддЕс	ддддсадЕдс
сЕЕсссадаа	дсадсссЕдд	Сдссдаадад
ссаЕасссЕс	ссЕЕЕдддсс	ЕсааЕЕЕсдс
ддЕаадсасс	ЕЕасаассаЕ	ЕЕдЕддЕсас
дасссссеса	дсЕсЕдЕЕЕс	ЕаадСдсЕда
адссадссас	Едаддаааад	ссадссассд
Есссссассс	ЕЕсассадад	аададдасдЕ
ЕссЕдасдса	ЕдсаЕсаЕда	ссасдадаса
сдсаЕдддса	ддсддддЕад	ддЕдаддссЕ
дадсссссас	Ессааддсаа	ассасссадс
дсадасасЕд	садсЕсЕддс	сссадЕсЕаа
Еааддсдсдд	дЕдсЕдаддд	дссссЕсссс
асссссдддс	ЕддадЕсаса	ссссСасссд
ссгдсаасЕд	ЕССЕЕЕСССС	адассСсадс
дЕсдЕсассс	ЕсссддЕсад	адссасассс
ЕсадССадаа	дсасааадда	сссссдсссс
садсдсссад	саЕЕддаадЕ	дасссддсса
адсддсддад	ддЕдддсСаС	дддсасадад
садсссссЕс	сЕдсссаЕдС	ассассадсс
сссЕссссаа	сссадЕдсса	ЕдддЕдсадд
ааасаддаса	дадаасЕсаа	дасагаадЕа
дсадЕддасс	ссааддссад	ссссЕссасс
ддадсадсад	ссагссадса	ссдссЕсЕдС
сасСадаааа	ддссаЕссЕд	аддадасадд
дассагсссс	сасасЕсссс	дсдЕЕЕаддд
дсаасддасд	сссссассса	ддсддсдЕдс
ддассддддд	дадсЕддсад	ададддсаса
ЕсСдаададс	ЕаасЕдссдс	ссдЕдЕсссг
ссдсадссдс	ЕЕссссаасЕ	ссадсасссс
дсасссссса	ддссдассдЕ	дддаддддад
дсдддаадда	адсссссЕдс	ддссЕЕссса
даасдсддда	дсасаддсас	дсадссдЕдс
дсссСдсаса	дсассаасЕЕ	сссссдсдЕд
сасдссдссс	Еддсссадсс	сЕдддгдадд
дадссссдсс	ЕссаЕасдЕд	дддаддааад
аасдсссадс	аЕЕссЕсаад	дЕсадссада
ддсдсадссс	ддддсааадЕ	дасдадаЕдС
ссЕЕсасссс	ссЕаддсЕдд	дссдадддса
сссадссаса	дсадЕссаса	дсадсадддс
аассссдасс	ададссЕддд	ЕссЕассЕдС
дсаддсгдсд	ЕддаЕдсдса	асасассссс
саааЕССааа	ссссаЕЕссс	ассЕассСад
сЕссЕдссас	ЕсЕсссссса	ссЕаСссаЕЕ
сЕсЕассдсс	садааассас	саада:ЕдЕс
сссдсасгсс	ссасасдасЕ	сссгддаадс
сссссасссс	сасдсссссд	сссассЕадс

дЕаддадСсс саддадсЕда аддЕЕЕсСдд 180 асадсСдсСс аадаЕЕсссЕ ддссааааад 240 ССЕсссадаа ддаЕСдсЕсд дсаЕссЕдсс 300 адсассдссЕ ссссдЕдпда сЕдддсдадЕ 360 сЕЕсссСааС дааддддсаа даЕЕддасЕа 420 дададсЕддд дсддддаадд аЕЕдЕсасЕЕ 480 аададсЕсса ддсЕЭЕдсса сдддаддада 540 адааааадсд ддадсддЕСС ассаЕЕсСсс 600 ЕдСсасасаЕ ааададссад дсЕсассапг. 660 саасСддаса ссаддЕаддс сЕСддддсЕа 720 аЕдаасадаа ЕддадсааЕд ддсЕаасссд 780 дсасссддсд сЕдЕЕдсссс аадаассЕдд 840 адссссЕсЕд ЕасЕссдссс аагааадддс 900 ссдсссЕдаЕ Ессссддсса даасссадас 960 ддсадсссас ЕсЕдссссса дадссдсЕда 1020 ссЕСЕдгддд ЕссЕдссесЕ дсдгдсссас 1080 дЕсссдсада ссассасадс гдссасСдсс 1140 Есссадсссс садЕдЕЕсес адсадсЕаад 1200 даддЕддаад Едссассдад Еаадаадсас 1260 дЕСсссаддд ЕсдддЕсдас ЕесЕдадсдс 1320 дадссадсЕд ддсЕдадсас дсассасЕсЕ 1380 сссддсдсад сЕсссаадас дсЕссссасс 1440 аЕддссасад дассЕсссад адссссддсг 1500 сададссЕдс сддсссссдд ссассссада 1560 сассЕдддсЕ сссаадЕсас сдаддсЕддд 1620 Ессадаадад даЕЕсаЕсас дЕдаассаад 1680 сЕадддсссс ссддадасаа ссдсассЕсс 1740 ададсадЕЕс сссаддсссс адасдсасдд 1800 дсададсадд дгаддддаад ддссгдсссс 1860 адасддаасд сЕдадссЕас ссгдсдсддс 1920 сЕасЕддсЕд ддсааЕддсс ссЕЕсассда 1930 сассаддсда дддссдсадс адссаддсдд 2040 сдассЕЕЕсс сссссссссд ссссадссдд 2100 ааддсссЕдд ЕдсЕддадса дссдассссЕ 2160 сссдгддасс ссдаасаддс сдСссадсде 2220 адсссаадда даддссссса ддаасаддад 2280 ддЕдддсЕсЕ дссададсад ссЕдЕдаасс 2340 саааааддаа сЕСаддЕссЕ дддсададда 2400 сссессееес сЕЕддсссда ЕссссдЕсЕд 2460 ассгЕдсссс ссасссаада адссссдссс 2520 саадаессад сасадддсса дсадсадсас 2580 ссассСддад Едаасадссс сЕдасЕдссЕ 2640 ЕссЕЕСЕссд сЕЕЕдддгсс сЕЕсссссас 2700 аааассасад ссСссгЕаса аЕдсссссЕс 2760 адссЕЕссЕа асдЕсссасЕ ссСсасасСд 2820 дасдссссад ссЕсдсассс садддсссса 2830 сссссаасса ЕСс=сдс=:г ссссадасад 2940 сссдссЕЕсе ссассдсссс адеаддддаа 3000 сдсЕсаадсс дсаЕкскдса ддасЕдЕксс саЕссссаса ССаддсССса ддасЕдссас адаааадада аададсседд асссадсадд аадЕсаасЕс ааадаЕСсаЕ дсссддддаа асасадддсс асссадкссЕ аассадддсс саддсссаад ЕЕкдсЕккаа ссссскдддс дсаддсасса сдададддас сЕсассддка адаасЕкдсд ссЕдЕскдда адсксЕдддс ссаддасадд аЕдскасЕЕд ЕссЕдссадс ддсддсдскд дддддаадсс скксккдддк адддскдсса дсассадсаа ссадсадаад сдссддессс даададдаса ссксксадад дддссадакс ааадададдд дсссдасссд кссадддссс адсдсссссд Ессадсессс аададдкддЕ ааскОЕасас асаадссЕсс садЕссЕдас дссскссадс адксадсдас

ЕддкЕдааак дасЕЕссЕаЕ адддааддда ЕдддкссЕса дСЕссасксс асадаадссд даасадссса ааадаЕдЕдд аасааддЕад адЕасЕсасд ссссддсссг ддсадддЕдк саЕссдЕссЕ ддасЕссаад ЕаскссЕсЕЕ дасссадсса даааааадда садесссдад скдксссЕад адсаддсдда сЕддсссЕЕЕ асассадссЕ ЕССССЕСССЕ дсЕсЕссаЕд дасасскскк дсддддсддЕ дссссЕасс* дскдсддкдд Есддасаддд дтздЕЕдадда дассдддада ддЕсссдсса скддадссдс ддддадксак дЕЕаддеада сЕдадсддас ССкСССЕЕСС ддаадЕдадд адсасадкде сддЕддддсс дсЕаЕсЕдда ассЕссЕсаЕ садСддасса Есусссдаса ЕЕЕсСкдЕЕС садаЕЕссЕс сдссЕдЕСсс ссадддсссс дсЕдссЕсЕЕ ссссдедссд кдддддсадс ЕаааддаЕка саддаасссс аадасаасас кааЕдскссс ссксаддааа дсЕЕсааада ддадааааас ЕааааасссЕ дадсгдсЕдс дддааададс адкдадддсс аЕддЕсссЕЕ Есаааассад ддсааддсад ааддсдссад дддЕЕСддск ддассаддЕд адсдсссЕдс дсасссасЕд Едсдадсссс адаакддддс ассссасасс скддддддкд ЕдсссЕЕддс сддсаакдсд СскксЕЕкда сдсЕдааддс сссаакдскд дддсдксдсЕ ксксккссдд ддддсдкддд садкадсаад сккдкаадкс саасадЕЕсе дааддадада Еддадгеаса скадддадас ЕЕддсгдсаЕ скдкдасддк Еадскдкакд сксаЕддссд кдскккскас ЕссдадсЕсс асссддааса адкдсссадд садкдаадкс сакдкСЕЕЕк адсЕдскксд ЕЕсаакддад дсссдЕссса скдсЕксадд сдддадсада адддаЕдада дсскакаккс адасккЕакк сссаксаскс кдааддскдк аксскскддс сскдскдддс сЕадакссад ссЕсаааЕСЕ ддададсдсс Едааддасса ассдЕЕддсс асддсадсак скдааадада дскдддаада адддккакса саЕсЕдЕсЕЕ скссадсадс сссакдскск Есдаддддкд сддадаасдд ддсЕссссдс саЕсдассдд сскксссадд ксакссссск дссксадкад ааасадссдд аддадссаса аасдкдсаас сасссакддд дааддсЕссс сссаддадсс ссдкЕкдсдс дскддсксдд дсссаддскс дадасддадд ддассскксс скаадсссЕд Едсскасссс сдадааддЕс сЕадаЕсадс акссксЕЕкс ЕЕЕЕСССССС даЕссасасЕ дсаксскдас сдадддадка ддаасасадд ддссасЕаак даааддаддЕ СЕСЕЕЕЕЕСС ЕасаадЕаас сааассссас сссссаассс аддСдсЕссс ссадссасса аддсЕаадад ддЕкдкдаЕд сасасЕдссс дддассаддс ЕдддадсЕда сддддасаса сасадксаса ЕСЕСЕГ.ССЕд дСкдсЕддсЕ скскссксдд ссддсдЕддс саксдддсЕЕ дсассаакдд сдддккссас сдсадааддс сдссддксад ссадсдЕдс^ ксадссссад ЕдсЕссдссс ЕддсссссЕЕ ЕсЕдаадсса сЕдсЕссссЕ ЕсаддсссЕЕ ЕЕЕадкССЕЕ ассдсдсо^а сдскдссддд сдсадддссЕ адддааддсс аддассЕддд ЕдссЕасдад ддсаааЕддс садддасгЕс ассссЕсссс аддЕдддапЕ адскскддсс ксаскскаак дкакскдкдк акскдкксак сдддададас сдсЕЕдаааа ддададкддд ддкакддаад сасассдакс аасакЕкада сссадкдсаа сасксскдад ассаддксад ддасадсадд даадаскддс дадаадкдас агдссссадд садддкдсдд дадааддсас ддкддддсса сддссадакд сЕсссасдсс дгдссЕдадс ададдадска сссаксккдд ссскссссса сддсадсадЕ кдсдадкдкк кдккссскад сскдсаадда дьдссасдсЕ. ссссассЕдЕ дсдсссккса адаскасдда ддкдксккдк ксссааскск ддадададдд ддсдадседд ссксаддадк сддкдакдсс сЕЕдддддкс дсаедддедд дскдккссад дСадааадас асаадсадкд ассссЕдадк сЕсЕЕсддсс ссааддаадд

3060 3120 3180 324 0 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3840 3900 3960 4020 4080 4140 4200 4260 4320 4380 4 440 4500 4560 4620 4680 4740 4800 4860 4920 4980 5040 5100 5160 5220 5280 5340 5400 5460 5520 5580 5640 5700 5760 5820 5380 дсадддаЕдд даддссседс асадСдассс саддссЕсас ссЕддасЕсс адддаЕадса 5940 ддЕскксада Едкддддддс асасЕсдаск дсдсЕдскдс адскскдсаа Едсддкксса €000 дЕсаЕссадс ЕдсЕсаддсЕ саЕсскддса адкдсссаЕд ЕадаадсЕдЕ ЕссЕЕссЕдк 6060 ддааддсадд даадкдддаа сааакдадес ЕддадЕсддс аддЕсассЕс сЕддсссЕдд 6120 саЕсЕЕдсса дссЕЕЕдсЕд ссассЕассс саЕааасЕЕд аадсссддсё сассадксЕд 61Θ0 аЕЕсадкдсс дсаддЕдсад дадкасддса сасадассас ЕЕОЕаЕсска ддддсккдск 6240 сассассЕЕс ЕсссЕддада дддсадаада ддЕсасасдс ададассдсЕ аскасаЕсЕЕ 6300 аЕксасскдс сааддсЕкдд гддссаасас ссададдаас аааЕЕаадда ссдддаакка 6360 акЕсссаддд дсЕсссЕддЕ дсссааадда саададсЕЕс саадаададЕ сЕддссадсс 6420 Сддссккссс адсадсссаЕ сассдссСда даадддсаЕд даддаскссс сасадсЕаад 646и сдЕсасааЕЕ дкдскдддаа Есссдддссс Екаассскдд сЕаададсдс сессаасаса 6540 дссадссссЕ. адасдддсад дкааддаадд ссскдаддсС дсаддаадда ддддсаддкд 6600 дадседдаЕд дсадсаадда ддссадсскС ддакССЕЕаа ааадсЕССсс ЕсЕЕЕЕсссЕ 6660 дсдссасдас ссасскЕсса дкскааССЕС ддддкакадЕ аадЕссскдЕ адЕссссЕса 6720 сскддадддд ссссаседда сассссддсс кдддаасдас дадсадаасЕ дсдадЕддкд 6780 дддсддсадс саддсаадсЕ дадсадддсс дадСЕдссаЕ аассдддада асссаддсда 6840 дскадааасЕ дадсададда ддпддсЕсдс аддскадссЕ дддаадсадд адсадассдс 6900 дЕдскдЕада асдакдадкк ддсдскдксс ддсксЕЕсса сакскадсЕк скддаадаеа 6960 дадкдаакск дкЕдсадкдк асадкссссд дсаскдкаса даадсккссс аккссскксс 7020 даадссскса даксссасдд сасакссакд ЕакЕсссаас кдскккдсаа аддкссккаа 7080 адкдкдкдкс кдсаадааак дддссккдгс дасадаадсс сксасааддг ддкдскдакд 7140 ккдпсаадас ксккскасдс асскЕЕЕЕса ЕддадкСкаЕ ЕсаЕаакдсЕ ЕЕдаддЕадд 7200 даакдсадад ЕдЕЕЕаЕсдд сссакЕЕЕдд адакдаадЕд сааасаааЕа аадЕдаскад 7260 ссссааакса сасЕдспадд аадкаксада дсЕддддсЕа ддссссакдЕ сЕсскдаска 7320 дксаддскса Есссасадсс кскдссдссс сксадкссаа асскссаддд сссккассак 7380 дккссадаас ЕЕсссссаас кксккддкад садддддсас сскааасаса саддкссссс 7440 скдскдсасс аддддссссс кскссссксс ксссааассЕ сссссксаад акдкддааас 7500 аааддсаадд дсскдсадес Едксаддсад Ессаскдддс адсаасаакд сскексадск 7560 дсасддддса сдссдддадд сасаддакдд дскдсадскк сдссасдккс ксссссккса 7620 ссскдсасад дсЕсадЕдск асдсакддад адаакдскад ссккадксад даддсаддда 7680 ксЕаакссса дссскдсскк СЕкскксада адсдссскка ассаадссас ЕдсссЕкккЕ 7740 аадасссскс адсккЕссса сгдкаасакд даскддскдс Есаксссксс скдсксскда 7800 скдадкдссс ад 7Θ12 <210> 10 <211> 40 <212> белок <213> человек

<400> 10
ТЬг 1	Рго Уа1	2ег С1п ТЬг ТЬг ТЬг А1а А1а ТЫ А1а 5ег Уа1 Агд 5ег
5	10	15
ТЬг	Ьуз Азр	Рго Суз	Рго	Зег	31п	Рго	Рго Уа1	РЬе	Рю А1а А1а Ьуз
		20				25			30
С1п	Суз Рго	А1а Ьеи	С1и	Уа1	ТЫ
	35				40

(a) аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из АА1АА192 8ЕР ΙΌ ЫО: 2, АА29-АА192 8Ер ГО ЫО: 2, АА1-АА197 8Ер ГО \О: 6 и АА29-АА197 8ЕР ГО NΟ: 6, (b) мутеина любой последовательности, указанной в подпункте (а), где аминокислотная последовательность указанного мутеина обладает, по крайней мере, 70%-й идентичностью, по крайней мере, с одной последовательностью, указанной в подпункте (а);

где полипептид, охарактеризованный в подпункте (а) или (Ь), связывается с ТС-18.

2. Полипептид по п.1, где любые изменения аминокислотной последовательности мутеина, охарактеризованного в подпункте (Ь) п.1, представляют собой аминокислотные замены в аминокислотных последовательностях, охарактеризованных в подпункте (а) п.1.

3. Полипептид по п.1, где аминокислотная последовательность содержит АА1-АА192 8ЕЦ ГО NΟ: 2 или АА29-АА192 8Ер ГО ЫО: 2.

4. Полипептид по п.1, где полипептид гликозилирован в одном или нескольких положениях.

5. Полипептид по п.1, где полипептид негликозилирован.

6. Полипептид по п.1, где полипептид дополнительно содержит, по крайней мере, один радикал, присоединенный к одной или нескольким функциональным группам, которые являются одной или несколькими боковыми цепями аминокислотных остатков Ν- или С-концевых групп.

7. Полипептид по п.1, где полипептид претерпел циклическую перестановку.

8. Полипептид по п.1, где полипептид представляет собой невирусный белок.

9. Полипептид по п.1, где полипептид представляет собой человеческий белок.

10. Полипептид по п.1, где полипептид представляет собой слитый белок.

11. Полипептид по п.10, где полипептид содержит Ц.

12. Полипептид по п.1 или 10, где полипептид является растворимым.

13. Полипептид по п.1, где полипептид модифицирован ПЭГ.

14. Полипептид по п.6, где указанный, по крайней мере, один радикал представляет собой полиэтиленгликолевый радикал.

15. Выделенный полипептид, включающий аминокислотную последовательность АА1-192 8ЕО ΙΌ NΟ: 2 или АА29-АА192 8ЕО ΙΌ ЫО: 2 или их варианты, содержащие консервативные аминокислотные замены.

16. Выделенный полипептид, включающий аминокислотную последовательность АА1-112 8ЕО ΙΌ NΟ: 4 или АА29-АА112 8ЕЕ) ΙΌ ЫО: 4 или их варианты, содержащие консервативные аминокислотные замены.

Claims (1)

1. Выделенный полипептид, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из

17. Выделенный полипептид, включающий аминокислотную последовательность АА1-197 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 6 или АА29-АА197 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 6 или их варианты, содержащие консервативные аминокислотные замены.

18. Выделенный полипептид, включающий аминокислотную последовательность АА1-161 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 8 или АА29-АА161 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 8 или их варианты, содержащие консервативные аминокислотные замены.

19. Выделенный полипептид, который включает аминокислотную последовательность АА29-40 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 10 или АА1-АА40 81Τ) ΙΌ ΝΟ: 10, где полипептид связывается с ΙΌ-18 и модулирует или блокирует биологическую активность ΙΌ-18.

20. Полипептид по п.19, где полипептид содержит Ι^-домен.

21. Очищенный ΙΌ-18-связывающий белок (Ш-18ВР), где белок характеризуется следующим:

(a) белок обладает молекулярной массой приблизительно 40 кДа по данным ДСН-ЭПАГ в исходной гликозилированной форме;

(b) белок связывается с ΙΌ-18 и модулирует или блокирует активность ΙΌ-18 и (c) белок обладает Ν-концевой последовательностью, которая включает аминокислотную последовательность АА29-40 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 10 или АА1-АА40 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 10 или их варианты, содержащие консервативные аминокислотные замены.

22. Активный фрагмент белка Ш-18ВР по п.1 или 21, где активный фрагмент связывается с ΙΌ-18 и модулирует или блокирует активность ΙΌ-18.

23. Выделенный полипептид Ш-18ВР, обладающий Ν-концевой последовательностью, которая включает аминокислотную последовательность АА29-40 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 10 или АА1АА40 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 10 или их варианты, содержащие консервативные аминокислотные замены, и Ι^-домен, где полипептид связывается с ΙΌ-18 и модулирует или блокирует активность ΙΌ-18.

24. Смесь любых полипептидов, охарактеризованных в пп.1, 15-19, 21 и 22.

25. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (a) аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из АА1АА192 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 2, АА29-АА192 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 2, АА1-АА112 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 4, АА29-АА112 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 4, АА1-АА197 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 6, АА29АА197 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 6, АА1-АА161 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 8 и АА29-АА161 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 8, (b) мутеина любой последовательности, указанной в подпункте (а), где аминокислотная последовательность указанного мутеина обла дает, по крайней мере, 70% идентичностью, по крайней мере, с одной последовательностью, указанной в подпункте (а).

26. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (a) нуклеотидной последовательности 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 1, кодирующей АА1-АА192 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 2 или АА29-АА192 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 2;

(b) нуклеотидной последовательности 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 3, кодирующей АА1-АА112 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 4 или АА29-АА112 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 4;

(c) нуклеотидной последовательности 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 5, кодирующей АА1-АА197 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 6 или АА29-АА197 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 6;

(б) нуклеотидной последовательности 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 7, кодирующей АА1-АА161 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 8 или АА29-АА161 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 8;

(е) нуклеотидной последовательности, комплемент которой связывается в условиях высокой жесткости с любой из нуклеотидных последовательностей, охарактеризованных в подпунктах (а)-(б), и которая кодирует аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из АА1-АА192 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 2, АА29-АА192 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 2, АА1-АА112 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 4, АА29-АА112 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 4, АА1АА197 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 6, АА29-АА197 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 6, АА1-АА161 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 8 и АА29-АА161 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 8.

27. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 9 или нуклеотидную последовательность, комплемент которой связывается с ней в условиях высокой жесткости.

28. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: Ι, 3, 5 и 7, или область 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 1, 3, 5 и 7, кодирующую зрелый белок.

29. Способ определения, выделения или амплификации нуклеотидной последовательности, кодирующей Ш-18ВР, предусматривающий применение нуклеиновых кислот, охарактеризованных в любом из пп.25-28, в качестве праймера или зонда.

30. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, охарактеризованную в любом из пп.25-28.

31. Вектор по п.30, дополнительно содержащий промотор, оперативно связанный с указанной молекулой нуклеиновой кислоты.

32. Штамм эукариотических клеток, генетически модифицированных для продуцирования полипептида, охарактеризованного в любом из пп.1-23.

33. Штамм прокариотических клеток, генетически модифицированных для продуцирования полипептида, охарактеризованного в любом из пп.1-23.

34. Штамм по п.32 или 33, где клетки генетически модифицированы вектором по п.30.

35. Штамм по п.32, где клетки представляют собой клетки млекопитающего.

36. Способ получения полипептида, охарастеризованного в любом из пп.1-23, предусматривающий культивирование штамма клеток, охарактеризованного в любом из пп.32-35, в условиях, обеспечивающих экспрессию указанного полипептида.

37. Моноклональное антитело, иммуноспецифично связывающееся с полипептидом, охарактеризованным в любом из пп.1-23.

38. Антитело по п.37, где антитело представляет собой гуманизированное антитело.

39. Способ определения ГЬ-18ВР в образце, предусматривающий взаимодействие указанного образца с антителом, охарактеризованным в п.37, и дальнейшее определение наличия связанного антитела.

40. Способ очистки полипептида ГЬ-18ВР, предусматривающий взаимодействие образца ГЬ-18ВР с антителом против ГЬ-18ВР, охарактеризованным в п.37, удаление несвязавшегося белка из образца с последующей элюцией связавшегося ГЬ-18ВР.

41. Способ выделения или очистки ГЬ18ВР, охарактеризованного в любом из пп.1-23, предусматривающий (a) пропускание образца через хроматографическую колонку, с которой связывается ГЬ-18;

(b) промывание колонки для удаления несвязавшегося белка из образца и (c) элюцию связавшегося ГЬ-18ВР.

42. Способ выделения или очистки ГЬ18ВР, охарактеризованного в любом из пп.1-23, предусматривающий взаимодействие образца с субстратом, с которым связан ГЬ-18, удаление несвязавшегося белка из образца с последующей элюцией связавшегося ГЬ-18ВР.

43. Способ получения производного ГЬ18ВР, предусматривающий получение ДНКконструкта, который кодирует полипептид, охарактеризованный в любом из пп.1, 15-19 и 2123, лигированный с нуклеиновой кислотой, кодирующей второй полипептид, где при экспрессии указанный ДНК-конструкт кодирует слитый белок, содержащий полипептид, охарактеризованный в любом из пп.1, 15-19 и 21-23, слитый со вторым полипептидом.

44. Способ по п.43, где указанным вторым полипептидом является Гд.

45. Способ получения производного ГЬ18ВР, предусматривающий химическую модификацию полипептида, охарактеризованного в любом из пп.1 и 15-19, с включением, по крайней мере, одного модифицирующего радикала.

46. Способ по п.45, где модифицирующий радикал представляет собой полиэтиленгликолевый радикал.

47. Композиция, содержащая полипептиды, охарактеризованные в любом из пп.1-24, и фармацевтически приемлемый носитель.

48. Композиция, содержащая нуклеиновую кислоту, охарактеризованную в любом из пп.2528, и фармацевтически приемлемый носитель.

49. Композиция, содержащая антитело, охарактеризованное в п.37 или 38, и фармацевтически приемлемый носитель.

50. Набор, содержащий в одном или нескольких сосудах фармацевтическую композицию, охарактеризованную в п.47.

51. Набор, содержащий в одном или нескольких сосудах фармацевтическую композицию, охарактеризованную в п.48.

52. Набор, содержащий в одном или нескольких сосудах фармацевтическую композицию, охарактеризованную в п.49.

53. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, включающая нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (a) аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из АА1АА192 8ЕО ГО ΝΟ: 2, АА29-АА192 8ЕО ГО ΝΟ: 2, АА1-АА197 δ ЕС) ГО ΝΟ: 6 и АА29-АА197 δΗ() ГО ΝΟ: 6;

(b) мутеина любой последовательности, указанной в подпункте (а), где аминокислотная последовательность указанного мутеина обладает, по крайней мере, 70% идентичностью, по крайней мере, с одной последовательностью, указанной в подпункте (а);

где указанная молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, который связывается с ГЬ-18.

54. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, включающая нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (a) нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО ΝΟ: 1, кодирующей АА1-АА192 8ЕО ГО ΝΟ: 2 или АА29-АА192 δΗ(') ГО ΝΟ: 2;

(b) нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО ΝΟ: 5, кодирующей АА1-АА197 8ЕО ГО ΝΟ: 6 или АА29-АА197 δΗ(') ГО ΝΟ: 6;

(c) нуклеотидной последовательности, комплемент которой связывается в условиях высокой жесткости с любой из нуклеотидных последовательностей, охарактеризованных в подпунктах (а)-(Ь);

где указанная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, который связывается с ГЬ-18.

55. Рекомбинантная молекула ДНК, включающая молекулу нуклеиновой кислоты, охарастеризованную в п.53 или 54, лигированную со второй нуклеиновой кислотой, кодирующей второй полипептид, где при экспрессии указанная рекомбинантная молекула ДНК кодирует слитый белок, содержащий полипептид, охарактеризованный в любом из пп.1, 15-19 и 21-23, слитый со вторым полипептидом.

56. Применение ГЬ-18ВР по любому из пп.1-24 для производства лекарственного сред81 ства для лечения и/или предупреждения поражения печени.

57. Применение по п.56, где поражение печени является острым.

58. Применение по п.56, где поражение печени является хроническим.

59. Применение по любому из пп.56-58, где поражение печени представляет собой алкогольный гепатит, вирусный гепатит, иммунный гепатит, фульминативный гепатит, цирроз печени и первичный билиарный цирроз печени.

60. Применение по п.59, где поражение печени представляет собой фульминативный гепатит.

61. Применение 1Ь-18ВР по любому из пп.1-24 для производства лекарственного средства для лечения и/или предупреждения артрита.

62. Применение по п.61, где артрит представляет собой воспалительный артрит.

63. Применение по п.62, где воспалительный артрит представляет собой ревматоидный артрит.

64. Применение 1Ь-18ВР по любому из пп.1-24 для производства лекарственного средства для лечения и/или предупреждения деструкции хряща.

65. Применение 1Ь-18ВР по любому из пп.1-24 для производства лекарственного средства для лечения и/или предупреждения воспалительного заболевания кишечника.

66. Применение по п.65, где воспалительное заболевание кишечника представляет собой болезнь Крона.

67. Применение по п.65, где воспалительное заболевание кишечника представляет собой неспецифический язвенный колит.

68. Применение по любому из пп.56-67, где указанное лекарственное средство предназначено для подкожного введения.

69. Применение по любому из пп.56-67, где указанное лекарственное средство предназначено для внутримышечного введения.

70. Применение по любому из пп.56-69, где указанное лекарственное средство назначается ежедневно.

71. Применение по любому из пп.56-69, где указанное лекарственное средство назначается через день.

72. Применение вектора по п.30 или 31 для производства лекарственного средства для лечения и/или предупреждения поражения печени.

73. Применение вектора по п.30 или 31 для производства лекарственного средства для лечения и/или предупреждения артрита.

74. Применение вектора по п.30 или 31 для производства лекарственного средства для лечения и/или предупреждения воспалительного заболевания кишечника.

75. Применение по любому из пп.72-74 для генной терапии.

76. Применение вектора по п.30 или 31 для индукции и/или увеличения эндогенной продукции 1Ь-18ВР в клетке для производства лекарственного средства для лечения и/или предупреждения поражения печени.

77. Применение вектора по п.30 или 31 для индукции и/или увеличения эндогенной продукции 1Ь-18ВР в клетке для производства лекарственного средства для лечения и/или предупреждения артита.

78. Применение вектора по п.30 или 31 для индукции и/или увеличения эндогенной продукции 1Ь-18ВР в клетке для производства лекарственного средства для лечения и/или предупреждения воспалительного заболевания кишечника.

79. Использование штамма клеток по любому из пп.32-35 для производства лекарственного средства для лечения и/или предупреждения поражения печени.

80. Использование штамма клеток по любому из пп.32-35 для производства лекарственного средства для лечения и/или предупреждения артрита.

81. Использование штамма клеток по любому из пп.32-35 для производства лекарственного средства для лечения и/или предупреждения воспалительного заболевания кишечника.