JP2001514876A - インターロイキン−18結合タンパク質、それらの調製および用途 - Google Patents
インターロイキン−18結合タンパク質、それらの調製および用途Info
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Abstract
Description
−18BPという、IL−18に結合できるタンパク質に関する。さらに詳細に
は、本発明は、体液から得られる可溶性IL−18BP、宿主細胞における適し
たDNAベクターの発現により得られる可溶性IL−18BP、宿主細胞におけ
る適したDNAベクターの発現により得られるIL−18BPのウイルスがコー
ドするホモログ、多様なIL−18BPを発現するベクター、ヒトおよび他の哺
乳類におけるIL−18BPの発現に有用なベクター、IL−18BPに対する
抗体、IL−18活性を調節および/または遮断することによる該IL−18B
Pの治療用途、IL−18活性の調節および/または遮断における該発現ベクタ
ーの治療用途ならびに該抗体の用途に関する。
−γ)を誘導した内毒素誘導性血清活性が記述された(27)。この血清活性は、
IFN−γの直接的な誘導物質としてではなく、IL−2または分裂促進因子と
ともに共刺激物質として機能した。内毒素後(post-endotoxin)のマウス血清か
ら該活性を精製する試みにより、見かけ上均質な50〜55kDaのタンパク質
が明らかになった(26)。他のサイトカインはIFN−γ産生のための共刺激物
質として作用し得るので、該血清活性を中和するためのIL−1、IL−4、I
L−5、IL−6またはTNFに対する抗体を中和できないことから、それが異
なる因子であることが示唆された。1995年に、同一の科学者により、IFN
−γ産生のための内毒素誘導性共刺激物質が挫瘡プロピオンバクテリウム(P. a
cnes)で前調整したマウスからの肝臓抽出物に存在することが立証された(31)
。このモデルでは、肝臓マクロファージ集団(クッパー細胞)が増大し、前調整
されていないマウスにとっては死に到ることのない低用量の細菌リポ多糖(LP
S)がこれら前調整したマウスにとっては致死的になる。その因子は、IFN−
γ誘導因子(IGIF)と名づけられ、後にインターロイキン−18(IL−1
8)と称されるが、1200グラムの挫瘡プロピオンバクテリウムで処理したマ
ウスの肝臓から均質に精製された。精製されたIL−18のアミノ酸配列に由来
する縮重オリゴヌクレオチドはマウスIL−18 cDNAをクローニングする ために用いられた(31)。IL−18は157アミノ酸からなる18〜19kD
aのタンパク質であり、データベースによればいかなるペプチドに対しても明ら
かな類似性を有していない。IL−18およびインターロイキン−12(IL−
12)のメッセンジャーRNAは、クッパー細胞で容易に検出され、マクロファ
ージを活性化した。組換え体IL−18は、IL−12よりも強力に、明らかに
異なる経路を介してIFN−γを誘導する(31)。内毒素で誘導された血清活性
と類似して、IL−18はそれ自体でIFN−γを誘導しないが、主として分裂
促進因子またはIL−2との共刺激物質として機能する。IL−18は明らかに
IL−2依存性経路を介してT細胞の増殖を強化し、インビトロでTh1サイト
カイン産生を強化し、ならびにIL−12と組み合わせた際に強化されたIFN
−γの産生に関して相乗作用を示す(24)。
前調整されたマウスにおける低用量LPSの致死を防げることが示された。他に
も、前調整されたマウスにおけるLPS致死の媒介物質としてのIFN−γの重
要性を報告した。たとえば、抗−IFN−γ抗体の中和はシュワルツマン様のシ
ョックからマウスを防御し(16)、IFN−γ受容体が欠損したガラクトサミン
処理のマウスはLPS誘導死に耐性であった(7)。したがって、マウスIL− 18抗体の中和は、挫瘡プロピオンバクテリウムで前調整したマウスを致死性L
PSから防御したことは予期できないものではなかった(31)。抗マウスIL−
18処理はまた、生存マウスを重篤な肝性細胞障害から防御した。
A配列が報告された(38)。組換えヒトIL−18は天然のIL−18活性を示
す(38)。ヒト組換えIL−18は、ヒトT細胞において直接的なIFN−γ誘
導活性はないが、IFN−γおよび他のTヘルパー細胞−1(Th1)サイトカ
インの産生のための共刺激物質として作用する(38)。これまでに、IL−18
は、主としてTh1サイトカイン産生(IFN−γ、IL−2および顆粒球マク
ロファージコロニー刺激因子)(20)のための共刺激物質として、またマウスの
ナチュラルキラー細胞クローンのFASリガンド媒介性細胞障害のための共刺激
物質としてみなされる(37)。
究することにより、このサイトカインと自己免疫病との密接な関連性が見出され
た。非肥満性糖尿病(NOD)マウスは、自己免疫インスリン炎および糖尿病が
自然に進行し、シクロフォスファミドの単一注射によって促進し、同時進行しう
る。IL−18 mRNAは、インスリン炎の初期段階のNODマウスの膵臓に おける逆転写酵素PCRによって証明された。IL−18のレベルは、シクロフ
ォスファミド処理後に急速に増加し、IFN−γmRNAの増加より前に起き、
その後糖尿病になった。興味深いことに、これらの動態はIL−12−p40 mRNAのそれと似ており、各mRNAレベルの密接な関係に帰結する。膵臓R
NAからIL−18 cDNAをクローニングし、続いて塩基配列を決定するこ とにより、クッパー細胞およびインビボで前活性化されたマクロファージからク
ローニングされたIL−18配列との同一性を明らかにした。また、NODマウ
スマクロファージは、IL−18遺伝子発現によりシクロフォスファミドに応答
し、一方、平行して処置されたBalb/cマウスのマクロファージは応答しな
かった。したがって、IL−18発現は、自己免疫NODマウスにおいて異常に
調節され、糖尿病の進行と密接に関連している(32)。
より、免疫調節または炎症における潜在的役割を果たしている(10)。IL‐1
8はまた、腎皮質で発現し、したがって分泌された神経−免疫調節物質であり、
ストレスの多い実験後に免疫系を統制する重要な役割を果たしている可能性があ
る(9)。
活性が挫瘡プロピオンバクテリウムにおけるIFN−γ産生およびLPS−媒介
性致死の原因となるらしい。その活性のため、ヒトの疾病におけるIL−18の
生物学的活性を遮断することが、多くの疾病における治療上の戦略である。これ
は、可溶性受容体を用いることで、または細胞に結合したIL−18受容体に対
する抗体を遮断することで成し遂げられ得る。
面サイトカイン受容体の細胞外リガンド結合ドメインに相当する。それらは、細
胞表面受容体に共通なプレmRNAの選択的スプライシングにより、または細胞
表面受容体のタンパク質分解性切断により誘導される。とりわけ、IL−6およ
びIFN−γ(30)、TNF(11、12)、IL−1およびIL−4(21)、IF
N−α/β(28、29)などを含む可溶性受容体が過去に記載されてきた。オステ
オプロテゲリン(OPG、破骨細胞阻害因子としても知られる−OCIF)と呼
ばれ、TNFR/Fasファミリーのメンバーである1つのサイトカイン結合タ
ンパク質は、分泌タンパク質としてのみ存在する可溶性受容体の最初の例である
らしい(1、34、39)。
ードされたIL−18BPのホモログ(以下、ウイルスIL−18BPという)
、ならびにIL−18に結合可能なその融合タンパク質、突然変異タンパク質、
機能的誘導体、活性断片、および環状変更された誘導体を提供する。本発明はま
た、ヒトの体液からIL−18BPを単離する方法、および組換え手段によって
それらを得るための方法を提供する。本発明はまた、ヒトおよび他の哺乳類にお
けるIL−18BPの発現に適したIL−18BPの発現ベクターも提供する。
本発明の特異的IL−18BP、そのウイルスにコードされたIL−18BPの
ホモログ、融合タンパク質、機能的誘導体、活性断片および環状変更された誘導
体は、IL−18の生物学的活性を調節および/または遮断するために有用であ
る。
な発現ビヒクル、それで形質転換された宿主細胞、ならびにそのような宿主の発
現によって産生されるタンパク質およびポリペプチドもまた提供される。
の調節または遮断を要する疾病または症状の治療のため、適切なビヒクルおよび
IL−18BP、またはウイルスIL−18BP、またはベクターからなる医薬
組成物を提供する。
およびウイルスIL−18BPに対する抗体を提供する。
18BPに関する。そのようなIL−18BPは、IL−18の生物学的活性を
調節および/または遮断しうる。「IL−18BPおよびウイルスIL−18B
P」という用語には、(シグナル配列なしの)成熟タンパク質、シグナル配列、
IL−18BPおよびウイルスIL−18BPの突然変異タンパク質、IL−1
8BPおよびウイルスIL−18BPの誘導体ならびにIL−18BPおよびウ
イルスIL−18BPの短縮形態ならびにそれらの塩からなるタンパク質が含ま
れる。
はウイルスIL−18BPの発現に適した複製可能な発現ビヒクルに関する。本
発明はさらに、ヒトおよび他の哺乳類における多様なIL−18BPまたはウイ
ルスIL−18BPの発現に適した発現ベクターに関する。
変異タンパク質、融合タンパク質、機能的誘導体、活性画分および混合物をコー
ドするDNAに関する。該DNAは、ゲノムDNA、cDNA、合成DNA、P
CR産物またはその組合せでありうる。本発明にしたがって、宿主細胞における
多様なIL−18BPおよびウイルスIL−18BPの発現のために、これらの
DNAは複製可能な発現ビヒクルに挿入されうる。ストリンジェントな条件下で
上記のDNAにハイブリダイズでき、ならびにIL−18に結合もできるタンパ
ク質またはポリペプチドをコードするDNAもまた本発明に含まれる。
終止コドンをもつIL−18BPをコードする。
8BPの発現用、すなわち遺伝子治療用に適した発現ベクターは、ウイルスベク
ターまたは他のタイプのベクターであり得、ヒトおよび他の哺乳類におけるIL
−18BPまたはウイルスIL−18BPの効率的な発現を可能にする方法で該
ベクターにIL−18BP遺伝子またはIL−18BP cDNAまたはウイル スIL−18BPをコードするDNAが挿入された。ストリンジェントな条件下
で上記のDNAにハイブリダイズし、IL−18に結合できるタンパク質または
ポリペプチドをコードするDNAもまた本発明に含まれる。
が結合するクロマトグラフィーカラムに通し、その後、結合したIL−18BP
を溶出するなどにより、本発明にしたがって実施されうる。
なわち、たとえば正しい方向で発現させる特定の宿主に適したプロモーター、発
現エンハンサー、調節配列などを機能的に連結した後、適切な宿主でIL−18
BPを発現することにより調製されうる。
乳類におけるIL−18BPを発現するためのベクターが、治療、およびIL−
18が関与する、または外因的に投与されたもしくは内因的に産生された過剰の
IL−18によって生じる症状の緩和に使用され得る。そのような症状には、た
とえば自己免疫疾患、I型糖尿病、慢性関節リウマチ、移植拒絶、炎症性腸疾患
、敗血症、多発性硬化症、虚血性心臓病(心臓発作を含む)、虚血性脳障害、慢
性肝炎、乾癬、慢性膵炎、急性膵炎などがある。
常なヒトの尿から単離された。500Lの正常なヒトの尿から濃縮された未精製
のヒト尿タンパク質の調製物をアガロースに結合させたヒトIL−18からなる
カラムにかけた。カラムを洗浄し、結合タンパク質を低pHで溶出した。溶出画
分を中和し、アリコートを非還元条件下におけるSDS−PAGE(10%アク
リルアミド)および銀染色によって分析した。約40kDのタンパク質バンドが
溶出画分から特異的に得られた(図1)。
のタンパク質はさらにN末端タンパク質配列分析によって特徴決定された。溶出
されたタンパク質からのアリコートをSDS−PAGEにかけ、PVDF膜にエ
レクトロブロッティングされ、タンパク質マイクロ配列分析にかけた。同様に、
溶出タンパク質からのアリコートを直接タンパク質マイクロ配列分析にかけた。
両方の場合で、2つのポリペプチド配列が得られた。主要配列と少数配列であり
、後者はアミノ酸65で始まるヒトのデフェンシン(登録番号p11398)断
片に相当する。既知のデフェンシン配列を消去により、下記の配列が与えられた
:
定するために、変性条件下で溶出画分のアリコートをDTTで還元し、4−ビニ
ルピリジンと反応させ、マイクロ限外ろ過装置(ウルトラフリー(Ultrafree) 、カットオフ10,000Da、ミリポア(Millipore)社)によって脱塩し、 タンパク質マイクロ配列分析にかけた。配列決定サイクル1番を行った後、プロ
リン以外の全てのN末端ポリペプチドを遮断するために残りのタンパク質をo−
フタルアルデヒドと反応させた後、配列決定を再開した。この方法で、以下のた
だ1つのタンパク質配列が得られた:
; C=Cys; F=Phe; L=Leu; E=Glu) 得られた配列は、タンパク質データベースを調査することによって決定された
他の既知タンパク質の配列とは有意に異なっている。しかし、cDNAファイル
を備えたtblastn研究プログラムによるゲノム研究機関(The Institute
of Genomic Research(TIGR)、HTTP://www.ncbi.nlm.nih.gov)のデータベース
を調査することにより、THC123801であることが示され、翻訳されるそ
の読みとり枠(218コドン)は、IL−18BPのN末端配列に高い相同性を
示す配列を含む。ここに相同性が示される:
であり、下段配列(51〜100)はTIGRファイルTHC123801のc
DNAの翻訳によって推定される)。
(発現された配列タグ(expressed sequence tag))のみであり、すなわち任意
に選択されたcDNAクローンである。このESTが読み取り枠を含むか否か、
タンパク質がESTに相当する遺伝子またはEST自身から発現されるか否か、
同定されているTHC123801によってコードされるタンパク質のいかなる
も有さないのかは分析されていない。THC123801がIL−18BPをコ
ードする読み取り枠を含むという情報は全く入手されなかった。
Dの複合体が形成された。この複合体の分子量は、1:1割合の約40kDのI
L−18BPおよび19kDのIL−18に相当する(図2)。
の生物学的活性を遮断した。したがって、IL−18BPをヒトまたはマウスI
L−18のいずれかに添加した時、IL−18がマウスの脾臓細胞の培養にリポ
多糖(LPS)とともに添加するとインターフェロン‐γの産生を誘導する能力
を遮断した(図3)。
け下記の生物学的性質の少なくとも1つを指す: (i)単核細胞、マウス脾細胞、ヒト末梢血単核細胞、ヒトKG−1細胞系統お
よびT細胞などの多様な細胞型において分裂促進因子、IL−1、IL−1
2、TNF−α、LPSとともに主として共刺激物質としてIFN−γの誘
導、 (ii)T細胞増殖の増強、 (iii)主として共刺激物質としてインビトロでのTh−1サイトカイン産生の 増強、 (iv)増強されたIFN−γ産生に関するIL−12との相乗作用、IFN−γ
および他のTヘルパー細胞−1サイトカインの産生ための共刺激作用、 (v)マウスナチュラルキラー細胞クローンのFASリガンド媒介性細胞障害の
ための共刺激作用、 (vi)おそらく50NF−κBホモダイマーおよびp65/p60 NF−κB ヘテロダイマーの形成を誘導することにより、ヒトKG−1細胞におけるN
F−κBの活性の誘導、 (vii)IL−8の誘導。
ば本明細書の実施例2のようにアフィニティー精製時に標識IL−18への結合
によって証明されるようなIL−18BPのIL−18への結合能を意味する。
、遮断以外のたとえば部分的阻害、増強などのIL−18BPのIL−18活性
の調節能を意味する。
、IL−18の上記に例示した生物学的活性の少なくとも1つを遮断するための
IL−18BPの活性を指す。IL−18BPのIL−18遮断活性は、マウス
の脾細胞におけるIL−18関連IFN−γ発現を遮断するためのIL−18B
Pの能力によって例示される。より詳細に以下に示されるように、IL−18B
Pの調節または遮断能力は、ある程度IL−18BPがIL−18によるNF−
κBの活性を阻害するという事実による。さらに、IL−18BPはIL−18
の下記の活性、すなわちヒトおよびマウスの細胞におけるIFN−γの誘導、I
L−8の誘導およびNF−κBの活性の少なくとも1つを遮断する。
なセンスおよびアンチセンスプライマーならびにTIGR配列からのプライマー
とヒトのジャルカット(Jurkat)T細胞からのRNAを用いて逆転写PCRによ
り調製した。得られるPCR産物はDNA配列分析によって確認された。このP
CR産物は32[P]で標識され、末梢血単核細胞、ジャルカットT細胞系統、P
BMCおよびヒトの脾臓に由来する4つのヒトcDNAライブラリーのスクリー
ニング用のプローブとして用いられた。多様な独立のcDNAクローンは4つの
IL−18BPスプライス変異体に相当した(配列番号1、配列番号3、配列番
号5および配列番号7)。全てのスプライス変異体は、想定される可溶性の分泌
タンパク質をコードした。最も多量のもの(IL−18BPa)は192コドン
の読み取り枠を有し、本明細書でしばしば28アミノ酸残基の「リーダー配列」
として引用されるシグナルペプチド、続いて最初の40残基が完全に尿IL−1
8BP(配列番号2)のN末端タンパク質配列と一致する推定の成熟IL−18
Bpaがコードされる。システイン残基の位置から、このポリペプチドが免疫グ
ロブリン(Ig)スーパーファミリーに属することが示唆された。興味深いこと
に、成熟IL−18BPa内の4つのGln残基のそれぞれが潜在的なN−グリ
コシル化部位であった。残り3つのIL−18BPの変異体はIL−18BPa
ほど多量にはなかった。それらには、28アミノ酸残基のシグナルペプチドとそ
れに続く85アミノ酸残基の成熟タンパク質をコードする、より短い1 kbの
IL−18BPb cDNAが含まれた(配列番号4)。3番目の変異体である IL−18BPcは2.3kb cDNAに相当し、28アミノ酸残基のシグナ ルペプチドとそれに続く169アミノ酸残基の成熟IL−18BPをコードした
(配列番号6)。4番目の変異体であるIL−18BPdは、28アミノ酸残基
のシグナルペプチドとそれに続く133アミノ酸残基の成熟IL−18BPをコ
ードした(配列番号8)。
めに、IL−18Bp cDNAの全長に相当するプローブを用いてヒトゲノム ライブラリーをスクリーニングした。長さの異なる5つのゲノムクローンがこの
ライブラリーで同定された。これらのクローンは外性および内性プライマーを用
いてDNA配列分析にかけた。概して、7.8kbの配列がこれらのクローンか
ら組み立てられた(配列番号9)。7.8kbの配列内で、膜貫通(TM)受容
体をコードするエキソンは同定されなかった。全ての変異体は共通の翻訳開始部
位を共有し、28アミノ酸残基の同一のシグナルペプチドおよびサイズとC末端
配列の異なる可溶性の成熟タンパク質をコードした。IL−18BPの遺伝子座
は、さらなる遺伝子を含み、マイナス鎖に位置する核有糸分裂装置タンパク質1
(NUMA1)をコードする。この発見により、IL−18BP遺伝子はヒト染
色体11q13に配置される(36)。
L−18BPaのタンパク質配列とGenPeptデータベース(HTTP://www.ncbi.nlm
.nih.gov)とで実施された。IL−18BPのホモログは、いくつかのポックス
ウイルスにおいてあらかじめ未知の機能をもつ分泌タンパク質として発現するこ
とが見出された。ウイルスは多様なサイトカイン受容体をコードすること、なら
びにウイルスにコードされるそのような分子は対応するサイトカインを中和する
ことにより免疫応答を阻害するおとり(decoy)受容体として有用であることが 以前に報告された(スプリッグ エムケー(Spriggs, MK)、1994年、Curr.
Opin. Immunol.、6巻、526〜529頁)。したがって、本発明はさらに、 IL−18の生物学的活性の遮断物質または調節物質としても有用なIL−18
BPのウイルスにコードされるホモログに関する。ウイルスにコードされるIL
−18BPのホモログの例を表1で提供する。
核性または真核性宿主で発現されうる。本明細書で用いられるように、「ウイル
スにコードされるIL−18BPのホモログ」という表現は、少なくとも70ア
ミノ酸残基の配列において少なくとも50%の同一性を指す。より好ましくは、
100アミノ酸残基の配列において、それに対して少なくとも50%、少なくと
も60%、少なくとも70%、少なくとも80%または最も好ましくは少なくと
も90%の類似性を有する。
PaのcDNAを哺乳類発現ベクターpEF−BOSに挿入した。組換えタンパ
ク質の精製を促進するために、枠内のIL−18BP ORFの3'末端に(Hi
s)6配列をコードするカセットをつけ加えた。COS7細胞を発現ベクターで 一過的にトランスフェクションし、これらの細胞の無血清培地(150ml)を
濃縮し、金属キレートクロマトグラフィーによって精製した。IL−18BPa
は、還元および非還元条件下において銀染色したSDS−PAGE上で単一のバ
ンドとして移動し、尿IL−18BPと同じ見かけ分子量を有した。この調製物
のタンパク質配列分析により、尿IL−18BPと同じN末端配列であることが
示された。尿IL−18BPに対して生じた抗体を用いたIL−18BPaのイ
ムノブロット分析により、尿タンパク質と同じ分子量バンドが示された。さらに
、免疫沈降に続くSDS−PAGEおよびオートラジオグラフィーを用いて、I
L−18BPaは抗体への結合を尿125I−IL−18BPと置き換わることが できた。したがって、IL−18BPaは尿から単離されたIL−18BPと構
造的に一致する。
力について試験した。IL−18BPaは、マウス脾細胞、PBMCおよびヒト
KG−1細胞系統においてヒトおよびマウスIL−18の活性を阻害した(図9
)。これらの結果により、生物学的に活性なIL−18BPをコードするものと
IL−18BPa cDNAとの同一性が確認される。
ンパク質および断片、ならびに他のポリペプチドまたはタンパク質を融合させた
、野生型IL−18BPおよびウイルスIL−18BPまたはその突然変異タン
パク質またはそれらの断片からなり、IL−18またはそのホモログに結合でき
る融合タンパク質に関する。
18BPの類似体またはウイルスIL−18BPの類似体を指し、野生型IL−
18BPまたはウイルスIL−18BPのIL−18への結合と比較して得られ
る産物の能力が相当に変化することなく、天然のIL−18BPまたはウイルス
IL−18BPの1つ以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基によって置換さ
れ、または欠失し、または1つ以上のアミノ酸残基が天然のIL−18BPの配
列またはウイルスIL−18BPに付加する。これらの突然変異タンパク質は、
既知の合成および/または部位標的突然変異誘発技術、またはそのための適切な
他の既知技術によって調製される。
をもつように、好ましくは、IL−18BPと充分に重複的な、またはウイルス
IL−18BPと充分に重複的なアミノ酸配列を有する。IL−18BPの活性
の1つはIL−18結合能である。突然変異タンパク質がIL−18への実質的
な結合活性を有する限り、アフィニティークロマトグラフィーによるなどのIL
−18の精製に使用され得、したがってIL−18BPと実質的に同じ活性を有
すると考えられ得る。したがって、たとえばラジオイムノ検定またはエリザ(E
LISA)検定といった、適切に標識されたIL−18に結合するか否かを測定
するための簡単なサンドイッチ競合検定にそのような突然変異タンパク質をかけ
ることからなる常套実験により、所与の突然変異タンパク質はIL−18BPと
実質的に同じ活性を有するか否かが決定され得る。
18BPまたはウイルスにコードされたIL−18BPホモログのいずれかの配
列と少なくとも40%の同一性または相同性を有する。より好ましくは、それら
に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも
80%、または最も好ましくは少なくとも90%の同一性または相同性を有する
。
パク質またはウイルスIL−18BPの突然変異タンパク質、またはそれをコー
ドする核酸は、本明細書で与えられる教示および指導に基づいて、過度の実験を
行なうことなく、当業者によって常套的に得ることのできる置換ペプチドまたは
ポリヌクレオチドと実質的に相応する有限集合の配列を含む。タンパク質化学と
構造の詳細な説明として、本明細書に参照文献として組み込まれる、シュルツ
ジーイー(Schulz, G.E.)ら、タンパク質構造の原理(Principles of Protein
Structure)、スプリンガー−ベルラグ(Springer-Verlag)社、ニューヨーク、
1978年;クレイトン ティーイー(Creighton, T.E.)、タンパク質:構造 と分子学的性質(Proteins:Structure and Molecular Properties)、ダブリュ
エイチ フリーマン(W.H. Freeman)社、サンフランシスコ、1983年を参照
。コドンの優先性などのヌクレオチド配列置換の説明に関しては、前出のオース
ベル(Ausubel)ら、A.1.1〜A.1.24および前出のサムブロック(Sam
brook)ら、付録CおよびDを参照。
して知られているものである。IL−18BPポリペプチドまたはタンパク質ま
たはウイルスIL−18BPの保存的アミノ酸置換は、充分に類似の物理化学的
性質を有するグループ内の同義アミノ酸を含み、該グループのメンバー間での置
換は、グランサム(Grantham)、サイエンス、185巻、862〜864頁(1
974年)の分子の生物学的機能を保存し得る。アミノ酸の挿入および欠失は、
機能を変化させることなく、上記に定義された配列においてもなされ得り、詳細
には該挿入または欠失がたとえば30以下、好ましくは10以下の数アミノ酸の
みを伴うなら、アンフィンセン(Anfinsen)、「タンパク質鎖の折りたたみを支
配する原理(Principles That Govern The Folding of Protein Chains)」、サ
イエンス、181巻、223〜230頁(1973年)のシステイン残基などの
機能的構造に重要なアミノ酸を除去または置換することはない。このような欠失
および/または挿入によって産出されるタンパク質および突然変異タンパク質は
本発明の範囲内にある。
BPの活性低下をもたらし得る望ましくない分子内または分子間ジスルフィド架
橋の形成を避けるために他の残基と置換されてもよい。
しくは、同義アミノ酸グループは表IIで定義されるものであり、最も好ましくは
、同義アミノ酸グループは表IIIで定義されるものである。
突然変異タンパク質、またはウイルスIL−18BPの突然変異タンパク質を得
るために用いられ得るタンパク質におけるアミノ酸置換の産生の例として、マー
ク(Mark)らの米国特許再発行第33,653号、第4,959,314号、第
4,588,585号および第4,737,462号;コス(Koths)らの第5 ,116,943号;ナーメン(Namen)らの第4,965,195号;チョン グ(Chong)らの第4,879,111号;およびリー(Lee)らの第5,017
,691号などで提示されるような既知の方法段階および米国特許第4,904
,584号(シャウ(Shaw)ら)で提示されるリシン置換タンパク質が含まれる
。
−18BPの任意の突然変異タンパク質は、IL−18BPまたはウイルスIL
−18BPのアミノ酸配列に本質的に相当する配列を有する。「本質的に相当す
る」という用語は、とくにIL−18への結合能力の範囲では天然タンパク質の
基本的特性に作用せず、力の天然タンパク質の配列に対して微小な変化をもつタ
ンパク質を包含することが意図される。「本質的に相当する」という言葉に収ま
ると一般的に考えられる変化のタイプは、これらのタンパク質をコードするDN
Aの簡便な突然変異誘発技術に起因するものであり、少数の微小変化をもたらし
、上記の方法で所望の活性をスクリーニングする。IL−18への結合に加えて
、該突然変異タンパク質はまたIL−18活性を調節および/または遮断し得る
。
件下でIL−18BPをコードするまたはウイルスIL−18BPをコードする
DNAまたはRNAにハイブリダイズするDNAまたはRNAなどの核酸によっ
てコードされるタンパク質が含まれる。本発明はまた、所望の核酸の同定および
精製におけるプローブとしても有用な核酸も含む。さらに、そのような核酸は、
本発明のIL−18BPの機能的活性を保持するポリペプチドをコードするかど
うかを決定するための主要な候補でありうる。「ストリンジェントな条件」とい
う用語は、当業者が常習的に「ストリンジェント」と呼ぶハイブリダイゼーショ
ンおよびそれに続く洗浄条件を指す。アウスベル(Ausubel)ら、「分子生物学 の最新プロトコル」、前出、インターサイエンス(Interscience)社、ニューヨ
ーク、6.3および6.4(1987年、1992年)、および前出のサムブロ
ックらを参照。制約がないならば、ストリンジェントな条件の例には、研究中の
ハイブリッドの算出Tmから12〜20℃低く、たとえば2xSSCおよび0.
5%SDS中で5分間、2xSSCおよび0.1%SDS中で15分間;37℃
で0.1xSSCおよび0.5%SDS中で30〜60分間、次いで68℃で0
.1xSSCおよび0.5%SDS中で30〜60分間の洗浄条件が含まれる。
当業者は、ストリンジェントな条件がまた、DNA配列、(10〜40塩基など
の)オリゴヌクレオチドプローブまたは混合オリゴヌクレオチドプローブの長さ
にも依存することを理解している。混合プローブが用いられる場合、SSCのか
わりに塩化テトラメチルアンモニウム(TMAC)を使用するのが好ましい。前
出のアウスベルを参照。
によるコドンの配列において異なる核酸を含む。おそらくストリンジェントな条
件下において図4から7で示されるDNA配列にハイブリダイズしないが、それ
にもかかわらず本発明のIL−18BPをコードできるようなDNAも本発明に
含まれる。
有する他のタンパク質と融合されたIL−18BP、またはウイルスIL−18
BP、またはそれらの突然変異タンパク質からなるポリペプチドを指す。したが
って、IL−18BPまたはウイルスIL−18BPは、たとえば免疫グロブリ
ンまたはその断片などの他のタンパク質、ポリペプチドなどに融合されてもよい
。滞留時間を延ばすためにポリエチレングリコール(PEG)と融合されてもよ
い。
それらの突然変異タンパク質、または融合タンパク質のカルボキシル基の塩およ
びアミノ基の酸付加塩の両方を指す。カルボキシル基の塩は、当分野で知られる
方法によって形成され得、たとえばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄
、亜鉛の塩などの無機塩、たとえばトリエタノールアミン、アルギニン、リシン
、ピペリジン、プロカインなどのアミンで形成される有機塩基との塩が含まれる
。たとえば酸付加塩には、たとえば塩酸、硫酸などの鉱酸との塩、および、たと
えば酢酸または蓚酸などの有機酸との塩が含まれる。もちろん、このようないず
れの塩も、IL−18BPに対して実質的に同様の活性を有さなければならない
。
L−18BP、およびそれらの突然変異タンパク質および融合タンパク質の誘導
体を包括し、それらは当分野で知られる方法によって、たとえば残基上の側鎖と
して存在する官能基またはN−もしくはC−末端基から調製され得、薬学的に許
容されうる限り、すなわちIL−18BPまたはウイルスIL−18BPの活性
と実質的に同様のタンパク質の活性を破壊せず、それを含む組成物に対して毒性
を与えない限り本発明に含まれる。これらの誘導体には、たとえばポリエチレン
グリコール側鎖が含まれ、それは抗原性部位を遮蔽し、体液におけるIL−18
BPまたはウイルスIL−18BPの滞留を延長しうる。他の誘導体には、カル
ボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアと第1または第2アミンとの反応によ
るカルボキシル基のアミド、アシル部(たとえばアルカノイルまたは炭素環状ア
ロイル基)で形成されたアミノ酸残基の遊離アミノ基のN−アシル誘導体または
アシル部で形成された(たとえばセリルまたはスレオニル残基の)遊離ヒドロキ
シル基のO−アシル誘導体が含まれる。
融合タンパク質の「活性断片」として、本発明は、画分が実質的にIL−18を
結合する能力を保持しているならば、単独のまたはたとえば糖またはリン酸残基
などのタンパク質分子に結合する関連分子もしくは残基ととものタンパク質分子
のポリペプチド鎖の任意の断片もしくは前駆体、それら自身によるタンパク質分
子または糖残基の凝集体を包括する。
生するために末端が直接的にまたはリンカーを介してともに連結し、続いて本来
の分子での末端と異なる末端を有する新しい直線分子を産生するために環状分子
が他の位置で開環する直線分子を指す。環状変更には、環状化され、次いで開環
する分子と等価な構造の分子が含まれる。したがって、環状変更された分子は直
線分子としてデノボ合成されてもよく、環状化および開環段階を経ない。環状変
更された誘導体の調製は、国際公開第WO95/27732号公報に記載されて
いる。
細胞などの多様な組換え細胞は、IL−18BPまたはウイルスIL−18BP
を産生できる。組換え体IL−18BPまたはウイルスIL−18BPを産生す
るために、IL−18BPをコードし、かつ形質転換(たとえば大腸菌、哺乳類
細胞および酵母細胞)または昆虫細胞を感染するのに適したDNAを担う適切な
ベクターを構築するための方法は当分野でよく知られている。たとえば、アウス
ベル(Ausubel)ら編、「分子生物学の最新プロトコル(Current Protocols In
Molecular Biology)の最新プロトコル、1993年;およびサムブロック(Sam
brook)ら編、「分子クローニング:実験手引き(Molecular Cloning:A Labora
tory Manual)」、第2版、コールドスプリングハーバー出版(Cold Spring Har
bor Press)、1989年を参照。
IL−18BPまたはウイルスIL−18BP、それらの断片、突然変異タンパ
ク質または融合タンパク質、および機能的に連結された転写および翻訳調節シグ
ナルをコードするDNAが、宿主細胞の染色体に所望の遺伝子配列を組み込むこ
とのできるベクターに挿入される。安定して導入DNAを染色体に組み込んだ細
胞を選択できるためには、発現ベクターを含む宿主細胞の選択用に1つ以上のマ
ーカーが使用される。該マーカーは、栄養要求性宿主に対するプロトトロフィー
、たとえば抗生物質などの生物致死剤耐性、銅などの重金属に対する耐性を与え
うる。選択可能なマーカー遺伝子は、発現されるDNA遺伝子配列に直接的に連
結されるか、またはコトランスフェクションによって同じ細胞に導入されうる。
さらなる要素もまた、単鎖結合タンパク質mRNAの最適合成に必要とされうる
。これらの要素には、転写プロモータ、エンハンサー、および終止シグナルと同
様にスプライスシグナルが含まれ得る。
可能なプラスミドまたはウイルスベクターに組み込まれる。好ましい原核性プラ
スミドはpBr322の誘導体である。好ましい真核性ベクターには、BPV、
ワクシニア、SV40、2−マイクロンサイクルなど、またはそれらの誘導体が
含まれる。そのようなプラスミドおよびベクターは当分野で周知である(2〜5、
22)。一度、該ベクターまたは該構築物を含むDNA配列を発現用に調製すると
、発現ベクターは、形質転換、トランスフェクション、リポフェクション、接合
、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降、直接
マイクロインジェクションなどの多様な適した方法のいずれかによって適切な宿
主細胞に導入され得る。
原核性宿主には、大腸菌、バチルス、ストレプトマイセス、シュードモナス、サ
ルモネラ、セラッティアなどの細菌が含まれる。最も好ましい原核性宿主は大腸
菌である。特に重要な細菌宿主には、大腸菌K12株294(ATCC3144
6)、大腸菌X1776(ATCC31537)、大腸菌W3110(F-、ラ ムダ-、光栄養性(ATCC27325)が含まれる。このような条件下におい て、該タンパク質はグリコシル化されない。原核性宿主は、発現プラスミドにお
いてレプリコンおよび制御配列と和合性がなければならない。
より真核性宿主が好ましい。好ましい真核性宿主は、たとえばヒト、サル、マウ
ス、およびチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞などの哺乳類細胞であり
、なぜならば、それらは正しい部位でのグリコシル化と同様に正しい折りたたみ
、正しいジスルフィド結合形成を含むタンパク質分子の翻訳後修飾を提供するた
めである。酵母細胞および昆虫細胞もまた、高マンノースグリコシル化を含む翻
訳後ペプチド修飾を実施しうる。
虫細胞における所望のタンパク質の産生に利用され得る多数の組換えDNA戦略
が存在する。酵母および昆虫細胞は、クローニングされた哺乳類遺伝子産物にお
いてリーダー配列を認識し、成熟得IL−18BPを分泌する。ベクターの導入
後、宿主細胞は、ベクターを含む細胞の増殖を選別する選択培地で増殖する。ク
ローン化された遺伝子配列の発現により、IL−18BP、ウイルスIL−18
BP、それらの融合タンパク質、または突然変異タンパク質または断片が産生さ
れる。上述されたクローニング、クローンの単離、同定、特性決定および配列決
定手順は、以降の実施例においてより詳細に記載される。
を含む任意の常套手法によって、またはたとえばカラム内に含まれるゲルマトリ
ックス上に固定化された抗−IL−18BPモノクローナル抗体を用いるアフィ
ニティークロマトグラフィーによって単離および精製される。該組換えIL−1
8BPを含む粗調製物をカラムに通し、それによりIL−18BPを特異的抗体
によってカラムに結合させ、一方で不純物を流す。洗浄後、本目的のため通常使
用される条件下、すなわちたとえばpH11またはpH2などの高いまたは低い
pHで該タンパク質をゲルから溶出させる。
たはウイルスIL−18BPまたはそれらの誘導体の発現に有用なベクターに関
する。哺乳類における遺伝子の短および長期の発現用ベクターは、文献で周知で
ある。たとえば骨格筋、血管平滑筋および肝臓への遺伝子送達により全身レベル
の治療タンパク質をもたらすことが、研究によって示されてきた。骨格筋は、そ
の多量性、血管分布、およびアクセス性のため、有用な標的である。しかしなが
ら、他の標的および特異的には免疫細胞の骨髄前駆体もうまく用いられてきた。
たとえば筋などにおけるタンパク質発現のための最近入手可能なベクターには、
プラスミドDNA、リポソーム、タンパク質−DNA共役物ならびにアデノウイ
ルス、アデノ随伴ウイルスおよびヘルペスウイルスに基づくベクターが含まれる
。これらのうち、アデノ随伴ウイルス(AAV)に基づくベクターが、遺伝子発
現の持続期間およびレベルの点で、ならびに安全性考慮の点で最もうまくいって
いる(ケスラー ピーディー(Kessler, P.D.)、1996年、Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 93巻、14082〜14087頁)。
1996年、ヒト遺伝学における最新プロトコル(Current Protocols In Human
Genetics)、12.1.1〜12.1.17章、ジョン ウィレイ&ソンズ(J
ohn Wiley & Sons)社)、本発明に組み込まれる。簡潔には、野生型AAVゲ ノムを含むプラスミドpsub201は、制限酵素XbaIで切断され、たとえ
ばサイトメガロウイルスプロモータ、コザック共通配列などの効率的な真核プロ
モータ、IL−18BPまたはウイルスIL−18BP、またはそれらの突然変
異タンパク質または融合タンパク質またはそれらの断片、適切な3'非翻訳領域 およびたとえばシミアンウイルス40のポリアデニル化シグナルなどのポリアデ
ニル化シグナルをコードするDNA配列からなる構築物と連結する。得られる組
換えプラスミドは、たとえばヒトT293細胞などの哺乳類細胞へ、たとえばp
AAV/AdなどのヘルパーAAVプラスミドでコトランスフェクションする。
次いで、該培養物をヘルパーウイルスとしてのアデノウイルスで感染し、48〜
60時間後に培養上清を回収する。該上清を硫酸アンモニウム沈降により分画し
、CsCl密度勾配で精製し、透析した後、アデノウイルスを破壊するために5
6℃で過熱し、他方で、IL−18BPまたはウイルスIL−18BP、または
それらの突然変異タンパク質または融合タンパク質を発現できる、得られる組換
えAAVはこの段階で安定である。
。たとえばTNF系で示されたように(11、12)、可溶性受容体は特異的なリガ
ンドに結合し、ほとんどの場合それらの生物学的活性を阻害する。たとえばIL
−6などのごく少数の場合、可溶性受容体が生物学的活性を増強する。TBP(
TNF結合タンパク質)としても知られる組換え可溶性TNF受容体は、動物モ
デルにおいて敗血症ショックを妨げることが見出され、一方、IL−1受容体の
可溶形態は、マウスの同種移植レシピエントにおけるインビボでのアロ反応性の
進行において強い阻害作用を有することが見出された。
I型糖尿病において、敗血症において、自己免疫疾患において、移植拒絶、慢性
関節リウマチ、炎症性腸疾患、敗血症、多発性硬化症、急性心臓発作を含む虚血
性心臓病、虚血性脳障害、慢性肝炎、乾癬、慢性肝炎、および急性肝炎において
、IL−18活性の調節物質としての用途が見出され得る。したがって、たとえ
ばIL−18の内因的産生または外因的投与が疾患を誘起するまたは患者の症状
を悪化させる任意の疾患において使用され得る。
くはウイルスIL−18BPまたはそれらの活性な突然変異タンパク質、融合タ
ンパク質およびそれらの塩、それらの機能的誘導体または活性断片からなる医薬
組成物に関する。
たはウイルスIL−18BPまたはそれらの突然変異タンパク質または断片また
は融合タンパク質のインビボでの発現を達成するために、すなわち遺伝子治療で
の用途のために、IL−18BPまたはウイルスIL−18BPまたはそれらの
突然変異タンパク質、それらの断片または融合タンパク質を発現し、かつヒトお
よび他の哺乳類への投与に適したAAV系のウイルスベクターまたは他のベクタ
ーの任意の1つのたとえばウイルスベクターからなる医薬組成物に関する。
はそれらの誘導体、または発現用ベクターを生理学的に許容しうる担体、および
/または安定剤および/または賦形剤と混合することにより、投与用に調製され
、たとえば投薬用バイアルでの凍結乾燥による投薬形態で調製される。投薬方法
は、同様な薬剤の許容される任意の投与様式を介しうるものであり、たとえば静
脈内に、筋内に、皮下的に、局所注射または局部塗布により、または継続注入な
どにより治療されうる症状に依存する。投与されうる活性化合物の量は、投与経
路、治療される疾患および患者の症状に依存する。たとえば局所注射は、静注よ
りも体重あたり低量のタンパク質を要する。
因的に投与されたIL−18による合併症の場合の自己免疫疾患、I型糖尿病、
慢性関節リウマチ、移植拒絶、炎症性腸疾患、敗血症、多発性硬化症、急性心臓
発作を含む虚血性心臓病、虚血性脳障害、慢性肝炎、乾癬、慢性膵炎および急性
膵炎および同様な疾患の治療のために、IL−18BP、またはウイルスIL−
18BP、またはインビボで前記を発現するベクターが必要とされる。
びにそれらの突然変異タンパク質、融合タンパク質、塩、機能的誘導体および活
性画分に対する抗体を含む。「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノ
クローナル抗体(MAb)、キメラ抗体、可溶性または結合形態で標識され得る
抗体に対する抗−イディオタイプ(抗−Id)抗体、およびヒト化抗体ならびに
酵素切断、ペプチド合成または組換え技術などの、しかしこれらに限らない任意
の既知技術により提供されるそれらの断片を含むことを意味する。
な集団である。モノクローナル抗体は、実質的に抗原に特異的な抗体の均一な集
団を含み、その集団は実質的に同様なエピト−プ結合部位を含む。MAbは当業
者に周知の方法により得られ得る。たとえば、コーラー(Kohler)およびミルス
タイン(Milstein)、ネイチャー256巻、495〜497頁(1975年);
米国特許第4,376,110号;アウスベルら編、前出、ハロー(Harlow)お
よびレーン(Lane)、抗体:実験手引き(ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL) 、コールドスプリングハーバーラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory )(1988年);およびコリーガン(Colligan)ら編、免疫学の最新プロトコ
ル、グリーネ出版協会およびヴィレイ インターサイエンス(Greene Publishin
g Assoc. and Wiley Interscience)、ニューヨーク、(1992年、1993 年)を参照。これらの文献の内容は参照文献として本明細書に完全に組み込まれ
る。このような抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、GILDを含む任意
の免疫グロブリンクラスおよびその任意のサブクラスのものであり得る。本発明
のMAbを産生するハイブリドーマは、インビトロ、インサイチュ、またはイン
ビボで培養され得る。インビボまたはインサイチュでの高力価なMAbの産生に
より、これが現在好ましい産生方法である。
スMAb由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する。キメラ抗
体は、適用における免疫原性を減少させるため、および産生の収率を増加させる
ために主として用いられ、たとえばマウスMAbはハイブリドーマからより高い
収率をあげるがヒトにおいてより高い免疫原性を有し、ヒト/マウスキメラMA
bが用いられる。キメラ抗体およびその産生方法は、当分野で周知である(キャ
ビリー(Cabilly)ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81巻:3273〜327
7(1984年);モリソン(Morrison)ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 1巻:6851〜6855(1984年);ボウリアネ(Boulianne)ら、ネイ チャー312巻:643〜646頁(1984年);キャビリー(Cabilly)ら 、欧州特許出願125023(1984年11月14日発行);ノイベルガー(
Neuberger)ら、ネイチャー314巻:268〜270頁(1985年);タニ グチ(Taniguchi)ら、欧州特許出願171496(1985年2月19日発行 );モリソン(Morrison)ら、欧州特許出願173494(1986年5月5日
発行);ノイベルガーら、PCT出願、国際公開第WO86/01533号公報
(1986年3月13日発行);クドウ(Kudo)ら、欧州特許出願184187
(1986年6月11日発行);モリソンら、欧州特許出願173494(19
86年5月5日発行);サハガン(Sahagan)ら、J.Immunol. 137巻:106
6〜1074頁(1986年);ロビンソン(Robinson)ら、国際特許出願、国
際公開第WO97/02671号公報(1987年5月7日発行);リウ(Liu )ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84巻:3439〜3443頁(1987 年);サン(Sun)ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84巻:214〜218頁
(1987年);ベター(Better)ら、サイエンス240巻:1041〜104
3頁(1988年);およびハロー(Harlow)およびレーン(Lane)、抗体:実
験手引き、前出。これらの文献は、参照文献として本明細書に完全に組み込まれ
る。
的に独自の決定基を認識する抗体である。Id抗体は、MAbの起源として同じ
種および遺伝型の動物(たとえばマウス系統)に抗−Idが調製されるMAbを
免疫することにより調製され得る。免疫化された動物は、免疫抗体のイディオタ
イプ決定基を認識し、これらのイディオタイプ決定基(抗−Id抗体)に対する
抗体を産生することにより応答する。たとえば、本明細書に参照文献として完全
に組み込まれる米国特許第4,699,880号を参照。
d抗体を産生するための「免疫原」としても用いられる。抗−抗−Idは、抗−
Idを誘発した源のMAbにエピトープが同一であり得る。したがって、MAb
のイディオタイプ決定基に対する抗体を用いることによって、同一な特異性をも
つ抗体を発現する他のクローンを同定できる。
Abは、BALB/cマウスなどの適切な動物において抗−Id抗体を誘発する
ために用いられ得る。このような免疫化されたマウス由来の脾臓細胞は、抗−I
d Mabを分泌する抗−Idハイブリドーマを産生するために使用される。さ らに、抗−Id Mabは、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)など の担体に結合し、さらなるBALB/cマウスを免疫するために用いられ得る。
これらのマウス由来の血清は、IL−18BPエピトープまたはウイルスIL−
18BPのエピトープに対して特異的な始原MAbの結合性質を有する抗−抗−
Id抗体を含む。
エピトープ、すなわち「イディオトープ」を有する。
手法でマウス抗体を操作することによって得られる抗体を含むことを意味する。
そのようなヒト化抗体は、低減した免疫原性を有し、ヒトの薬物動態を改善した
。これらは、たとえばMolecular Immundogy、30巻、16号、1443〜14 53頁、1993年におけるヒト化抗−TNF抗体で記載されるような当分野で
周知の技術によって調製され得る。
びF(ab′)2などのそれらの断片の両方を含むことを意味する。Fabおよ
びF(ab′)2断片は完全な抗体のFc断片を欠き、血液循環をより速く通過
し、完全な抗体より少ない非特異的な組織結合を有し得る(ウォール(Wahl)ら
、J. Nucl. Med. 24巻:316〜325(1983年))。FabおよびF(
ab')2および本発明に有用な抗体の他の断片が、完全な抗体分子用に本明細 書で開示された方法にしたがって、IL−18BPまたはウイルスIL−18B
Pの検出および定量化に用いられ得ることが理解されよう。そのような断片は、
典型的には(Fab断片を産生するために)パパインまたは(F(ab′)2断
片を産生するために)ペプシンなどの酵素を用いるタンパク質分解切断によって
産生される。
抗体は分子を「結合できる」といわれる。「エピトープ」という用語は、抗体に
よって結合され得、抗体によって認識もされ得る任意の分子の部分を指すことを
意味する。エピトープすなわち「抗原決定基」は、通常アミノ酸または糖側鎖な
どの分子の化学的に活性な表面基からなり、特異的な三次元構造特性および特異
的な電荷特性を有する。
きる抗体を産生することを誘発できる分子または分子の1部分である。抗原は、
1つ以上のエピトープを有し得る。上記で言及された特異的反応は、きわめて選
択的な様式で抗原が相応する抗体と反応し、他の抗原によって誘起されうる多数
の他の抗体とは反応しない。
−18BP、または試料中の関連タンパク質を定量的にまたは定性的に検出する
ために、または本発明のこのようなタンパク質を発現する細胞の存在を検出する
ために使用されうる。これは、光学顕微鏡、フローサイトメトリー、または蛍光
定量検出と共益した蛍光標識抗体(以下参照)を用いる免疫蛍光技術によって達
成され得る。
スIL−18BP、および本発明の関連タンパク質のインサイチュ検出のために
免疫蛍光または免疫電子顕微鏡などのように組織学的に使用され得る。インサイ
チュ検出は、患者から組織学的試料を取り、そのような試料に本発明の標識抗体
をあてがうことによって達成され得る。抗体(または断片)は、好ましくは生物
学的試料に該標識抗体(または断片)をかけるまたはかぶせることによって提供
される。このような手法の使用により、IL−18BPまたはウイルスIL−1
8BP、または関連タンパク質のみだけでなく、試料組織上の分布も決定できる
。本発明を用いて、当業者は、このようなインサイチュ検出を達成するために(
染色手法などの)様々な任意の組織学的方法が改変され得ることを容易に理解さ
れよう。
質のための検定は、生物学的流体、組織抽出物、リンパ球または白血球、または
組織培養でインキュベーションされた細胞などの新鮮に採取された細胞などの生
物学的試料をIL−18BPまたは関連タンパク質を同定できる検出可能に標識
された抗体の存在下でインキュベーションし、当分野で周知の多数の任意の技術
によって抗体を検出することからなる。
、細胞粒子または可溶性タンパク質を固定化できる他の支持体または担体で処理
され得る。次いで、支持体または担体は適切な緩衝液で洗浄され、続いて本発明
にしたがって検出可能に標識された抗体で処理され得る。次いで、固相支持体ま
たは担体は、非結合の抗体を除去するために緩衝液で2回洗浄され得る。その後
。固体の支持体または担体上に結合した標識の量は、常套手段によって検出され
得る。
固相担体」、「固体の支持体」、「固体の担体」、「支持体」または「担体」に
よって意図される。周知の支持体または担体には、ガラス、ポリスチレン、ポリ
プロプレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロンアミラーゼ、天然および修
飾セルロース、ポリアクリルアミド、ガブロス(gabbros)、およびマグネタイ トが含まれる。該担体の性質は、本発明の目的のためにはある程度可溶性である
か、不溶性であるかのいずれかであり得る。支持体材料は、結合分子が抗原また
は抗体に結合できる限り、事実上任意の可能な構造配置を有し得る。したがって
、支持体または担体の構造は、ビーズ、または円筒形のような、試験チューブの
内表面、または棹の外表面のような球形であり得る。または、該表面は、シート
、試験片などの平坦であり得る。好ましい支持体または担体にはポリスチレンビ
ーズが含まれる。当業者は、抗体または抗原を結合するための他の多くの適切な
担体を知っていよう、または常套実験の使用によって上記を確かめることができ
よう。
測定され得る。当業者は、常套実験を行なうことにより各測定用の有効なおよび
最適な検定条件を決定できよう。
要なように、該検定に付け加えられてもよい。
させ酵素免疫検定(EIA)で使用する。その結果、この酵素は、後に適切な基
質に曝されると、検出される化学的部分を産生するような方法で、たとえば分光
光度、蛍光光度または視覚的手段により、基質と反応する。検出可能に抗体を標
識するのに使用され得る酵素には、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッ
カルヌクレアーゼ、デルタ−5−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒ
ドロゲナーゼ、アルファ−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸
イソメラーゼ、ホースラディッシュペルオキシターゼ、アルカリフォスファター
ゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシターゼ、ベータ−ガラクトシターゼ、
リボヌクレア−ゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−6‐リン酸デヒドロ
ゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが含まれるが、
これらに限らない。該検出は、酵素に対して色素原基質を用いる比色法により達
成され得る。検出はまた、同様に調整された標準と比較して基質の酵素反応の程
度の視覚的比較によっても達成され得る。
たは抗体断片を放射標識することにより、放射免疫検定(RIA)の使用でIL
−18BPまたはウイルスIL−18BPを検出できる。RIAの良い説明は、
本明細書に参照文献として組み込まれ、チャード ティー(Chard T.)による「
放射免疫検定および関連技術への序論(An Introduction to Radioimmuno Assay
and Related Techniques)」とタイトルされた章に詳しい文献のあるワーク ティーエス(Work, T.S.)らによる分子生物学の実験技術および生物化学(Labo
ratory Techniques and Biochemistry In Molecular Biology)、北オランダ出 版会社(North Holland Publishing Company)、ニューヨーク(1978年)に
見出される。放射活性アイソトープは、ガンマカウンターまたはシンチレーショ
ンカウンターの使用などの方法によりまたはオートラジオグラフィーにより検出
され得る。
は適切な波長の光に曝すと、その存在が蛍光により検出され得る。最も広く使用
される蛍光標識化合物には、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、
フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o−フタルアルデヒ
ドおよびフルオレアミンがある。
)などの金属キレート基を用いて抗体に付着され得る。
でビオチン化抗体は、蛍光化合物またはペルオキシダーゼなどの酵素または放射
活性アイソトープなどに結合したアビジンまたはストレプトアビジンによって検
出され得る。
。次いで、化学発光タグ化された抗体の存在により、化学反応の過程で生じる化
学発光の存在を検出することにより測定される。特に有用な化学発光標識化合物
の例として、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウムエステル、イミダゾ
ール、アクリジニウム塩および蓚酸エステルがある。
物発光は、酵素タンパク質が化学発光反応の効率を増加させる生物学的システム
に見出される化学発光の1タイプである。生物発光タンパク質の存在は、ルミネ
センスの存在を検出することにより測定される。標識の目的に重要な生物発光化
合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。
検定としても知られるイムノメトリック検定での利用に適用され得る。典型的な
イムノメトリック検定において、一定量の非標識抗体(または抗体の断片)が固
体の支持体または担体に結合し、検出可能に標識された一定量の可溶性抗体は、
固相抗体、抗原、および標識抗体間で形成された3重複合体の検出および/また
は定量ができるよう添加される。
まず試験試料に接触させ、二元固相抗体−抗原複合体の形成によって試料から抗
原を抽出する「おもて」検定が含まれる。適切なインキュベーション期間後、固
体の支持体または担体を洗浄し、もしあるならば未反応の抗原を含む液体試料の
残基を除去し、続いて,未知量の(「レポーター分子」として機能する)標識抗
体を含む溶液と接触させる。非標識抗体を介して固体の支持体または担体と結合
させた抗原と標識抗体とを複合化させるための第2インキュベーション期間後、
固体の支持体または担体を2回洗浄し、未反応の標識抗体を除去する。
いわゆる「同時」および「逆」検定も用いられる。「同時」検定は、固体の支持
体または担体に結合させた抗体および標識抗体の両方が同時に試験試料に添加さ
れるようにただ1回のインキュベーション段階が含まれる。インキュベーション
が完了した後、固体の支持体または担体を洗浄し、液体試料の残基および非複合
化標識抗体を除去する。続いて、支持体または担体とともに標識抗体の存在は、
慣習的な「おもて」サンドウィッチ検定におけるように測定される。
ベーション期間後、固体の支持体または担体に結合させた非標識抗体を添加する
段階的な添加が利用される。第2のインキュベーション後に、固相を常套な様式
で洗浄し、試験試料の残基および未反応の標識抗体溶液を除去する。次いで、固
体の支持体または担体とともに標識抗体の測定は、「同時」および「おもて」検
定におけるように測定される。
A分子、任意の該DNA分子からなる複製可能な発現ビヒクル、発現ビヒクルで
形質転換された原核性および真核性の宿主細胞好ましくはCHO細胞を含む宿主
細胞を提供する。本発明はまた、ヒトおよび他の哺乳類における発現の目的のた
めに本発明の任意のタンパク質をコードする発現ベクターの産生方法を含む。
主細胞内で該DNA分子および発現ビヒクルによってコードされるタンパク質を
回収することにより本発明の任意のタンパク質の産生方法を含む。
の使用に加えて、それらはもちろんIL−18自身の精製用にも使用され得る。
この目的のために、IL−18BPまたはウイルスIL−18BPをアフィニテ
ィーカラムに結合させ、粗IL−18を通す。次いで、IL−18がたとえば低
pHにおける溶出などにより、カラムから回収され得る。
(1000倍濃縮、500ml)を0.25ml/分の流速でカラムにかけた。
カラムをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で250mlの0.5M NaCl で洗浄した。続いて、結合タンパク質をpH2.2の25mMクエン酸およびベ
ンズアミジン(1mM)で溶出し、直に1M Na2CO3で中和した。1mlの 画分を採取した。該画分をSDS−PAGEおよび銀染色によって分析した。I
L−18結合タンパク質を約40,000ダルトンのタンパク質として画分2〜
8で溶出した(図1)。IL−18BPに相当する約40kDのバンドは、銀染
色において明瞭な黄色を呈した。様々な画分を実施例2で記載するように125I −IL−18との架橋、SDS−PAGEおよびオートラジオグラフィーによっ
て分析した。IL−18結合タンパク質は画分2〜8で見出され、IL−18ア
ガロースゲルカラムから溶出された(図2)。
加し、混合物を4℃で20分間おいた。PH7.5の1MのTris−HClお
よび最終濃度100mMの1M NaClを添加することにより、反応を停止し た。ジチオスレイトール(DTT、最終25mM)を含む試料緩衝液を添加し、
混合物をSDS−PAGE(7.5%アクリルアミド)、続いてオートラジオグ
ラフィーによって分析した(図2)。
ーン2および3)から溶出された画分で観察されたが、他の全ての粗尿タンパク
質を含むカラム洗浄(レーン1)では観察されなかった。
るSDS−PAGE(10%アクリルアミド)によって分離し、PVDF膜にエ
レクトロブロッティングした(プロ−ブロット(Pro-Blot)、アプライドバイオ
システムズ社(Applied Biosystems)、アメリカ合衆国)。膜をクマシーブルー
で染色し、約40kDのバンドを切除し、プロサイスマイクロシークエンサー(
Procise microsequencer)(アプライドバイオシステム社、アメリカ合衆国)に
よるタンパク質配列分析にかけた。つぎの主要配列が得られた:
配列は、デフェンシンのアミノ酸65で始まるヒトのデフェンシン断片(登録番
号p11398)として同定された。主要配列は、blastpおよびtbla
stn研究プログラムによるNCBIおよびTIGRにおける入手可能な全ての
データベースを調査することにより決定した際に、他の任意の既知タンパク質と
結びつかなかった。
定するために、IL−18−アガロースカラムから溶出された画分の他のアリコ
ートを6MグアニジンHCl中DTTで還元させ、4−ビニルピリジンと反応さ
せ、マイクロ限外ろ過装置(ウルトラフリー(Ultrafree)、カットオフ10, 000ダルトン、ミリポア社(Millipore))によって脱塩し、タンパク質微小 配列分析にかけた。サイクル番号1の配列決定後、フィルターをo−フタルアル
デヒドと反応させ、Pro以外のN−末端ポリペプチドを遮断した。この方法で
、主要配列のみが下記のように得られた:
=Cys; F=Phe; L=Leu; E=Glu) サイクル6、7、8および11において、低レベルのThrシグナルが得られ
た。この低いレベルのため、本発明者らは該サイクルで特異的なアミノ酸残基を
特定しないようより慎重に考慮した。
うに他の任意の既知タンパク質の配列と有意に異なる。しかし、tblastn
研究プログラムによるTIGRデータベースの調査により、cDNAファイルが
与えられ、翻訳されるとオープンリーディングフレーム(218コドン)がIL
−18BPのN−末端配列ときわめて相同な配列を含むTHC123801であ
ることが示された。本明細書によって相同性が示され:
であり;下段の配列(51〜100)はTIGRファイルTHC123801のcD NAの翻訳によって推定される)。
列は、IL−18BPの残基2および4が不明瞭であった。IL−18BPのア
ミノ酸残基6、7および8がThrとして同定されることを確認し、残基11に
関してもそのようである。
2カラム(1×30cm、ファルマシア社(Pharmacia)、スウェーデン)でサ イズ排除クロマトグラフィーによりさらに精製した。カラムをあらかじめ平衡化
し、0.5ml/分の流速でリン酸緩衝生理食塩水およびアジ化ナトリウム(0
.02%)で溶出し、1分の画分を採取した。IL−18結合タンパク質は、S
DS−PAGEおよび銀染色によって測定されるように約40,000ダルトン
のタンパク質として画分20〜25で溶出した。約40,000ダルトンのタン
パク質(画分23、50μl、約50mgのタンパク質)を含む試料は、製造業
者の説明書にしたがってN−グリコシダーゼF(PNGアーゼF、バイオラブ(
Biolab))と反応させた。つまり、5%SDSの存在下で10分間煮沸、10x
G7緩衝液(2.5μl)、10%NP−40(2.5μl)およびPNGアー
ゼF(1μl)で37℃1時間によってアリコートを変性した。試料は非還元条
件下でSDS−PAGE(10%アクリルアミド)によって分析し、同じスペロ
ース12画分から得られる非消化IL−18BPと比較した。IL−18BPの
約40kDのバンドがPNGアーゼで処理した画分で消失することが見出された
。30kD(PNGアーゼバンドのすぐ上)および20kDに相当する新しいバ
ンドが得られた。約40kDのバンドがないことから、このバンドがN−グリコ
シル化タンパク質であることが示唆される。
単核細胞においてIL−18に誘導されるIFN−γの産生を測定することによ
り決定された。IL−18は、低濃度のLPS、IL−12、IL−2または他
の刺激物質のいずれかとともに添加されるとIFN−γを誘導する。IL−18
の活性をマウス脾細胞、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)およびヒトKG−1細
胞系統で試験した。脾臓細胞は、健康なマウスから調製され、洗浄し、ならびに
5×106細胞/mlの10%胎児ウシ血清補足RPMI 1640培地に懸濁し
た。組換えヒトまたはマウスIL−18(0.5または5ng/ml)とともに
LPS(0.5または1μg/ml)で1.0mlの培地を刺激した。ヒトIL
−18結合タンパク質(0、5または50ng/ml)は、脾臓細胞に添加する
前に組換えIL−18に添加した。24時間の培養後、脾臓細胞を3回の凍結(
−70℃)および解凍サイクル(室温)にかけ、細胞デブリスを遠心により除去
し、マウスIFN−γ(エンドゲン社(Endogen))用のELISAキットを用 いて上清をIFN−γ検定した。図3Aに示されるように、IL−18BPは用
量依存性様式でマウスの脾細胞におけるhuIL−18の活性を遮断した。対照
的に、対照としての可溶性インターフェロン−α/β受容体は作用を有さなかっ
た。組換えマウスIL−18の活性は、同様にヒトIL−18BPにより阻害さ
れ、ヒトIL−18BPがマウスIL−18を認識することを示唆する(図3B
)。内因性IL−18は、マウス脾細胞において高濃度のLPSにより誘導され
、IFN−γが産生される。実際に、LPS(10μg/ml)によるIFN−
γ誘導はまた、尿IL−18BPによっても阻害された(図3C)。コンカナバ
リンA(conA)はT細胞を活性化し、IL−18不在下においてIFN−γ
を産生する(13)。実際に、ConAによるIFN−γの誘導は高濃度のIL−
18BPでさえ阻害されなかった(図3D)。IL−18BPは、IFN−γ産
生の非特異的阻害剤というよりIL−18の生物活性の特異的阻害剤であった。
IL−18BPはまた、IL−18およびTNF−αの組合せによって誘導され
るヒトのKG−1細胞においてヒトIL−18の活性を阻害した。
うに、上記のデータにより、尿IL−18BPがヒトだけでなくマウスIL−1
8活性を阻害することが立証される。>90%までIL−18活性を低減したI
L−18BPの濃度は、IL−18自身の濃度と同程度であり、これら2つのタ
ンパク質間の高親和的相互作用が示唆される。
アールエル社(Gibco-BRL))およびランダムプライマー(プロメガ社(Promega
)、ウィンスコンシン州マディソン)で逆転写した。続いて、タック(Taq)
DNAポリメラーゼ(シグマ(Sigma)社)およびTIGRクローンTHC12 3801のヌクレオチド24〜44(センス)および500〜481(逆)に相
当するプライマーを用いて、得られるcDNA断片をPCRにより増幅した。増
幅は、アニーリング(55℃、2分)および伸張(70℃、1分)の30サイク
ルで実施した。得られるPCR産物は、アガロース(1%)ゲル電気泳動により
分離し、溶出し、pGEM−Tイージー(easy)TAクローニングベクターにク
ローニングした(プロメガ社)。個々のクローンから得られるDNAをT7およ
びSP6プライマーで配列決定した。
々なヒトcDNAおよびゲノムライブラリーをスクリーニングするために、この
プローブを用いた。対のニトロセルロース膜を取り、6xSSC、10xデンハ
ルト溶液、0.1% SDSおよび100μg/mlのサケ精子DNAからなる 緩衝液中で60℃でプローブとハイブリダイゼーションした。膜を洗浄し、−8
0℃で一晩コダック(Kodak)XAR膜に感光させた。対のポジティブクロ
ーンをプラーク精製した。プラスミドをλpCEV9クローンから切除し、自己
連結した。製造業者の説明書にしたがって、他のライブラリーから得られるcD
NAクローンを単離した。モデル373Aおよび377シークエンサー(アプラ
イドバイオシステム社)を用いて、単離クローンの自動DNA配列分析を実施し
た。標準プロトコルにはこれらのクローニング手法が用いられた(33)。
ター(15)で構築され、ティー ミキ(T. Miki)の厚意により提供されたヒ ト単球cDNAライブラリー;クローンテック社(Clontech)(カリフォルニア
州パロアルト(Palo Alto))からの、ヒトJurkat白血性T細胞cDNAライブ ラリー、ヒト末梢血白血球cDNAライブラリーおよびヒト脾臓cDNAライブ
ラリー。ラムダFIX IIベクターのヒト胎盤ゲノムライブラリーはストラタ ジーン社(Stratagene)(カリフォルニア州、ラジョラ(La Jolla))から入手
した。
ーンを得、特徴決定された。全てのスプライス変異体は、推定可溶性分泌タンパ
ク質をコードした。最も多量のもの(IL−18BPa)は、28アミノ酸残基
のシグナルペプチド、続いて最初の40残基(配列番号10)が尿IL−18B
P(配列番号2)のN−末端タンパク質配列と完全に一致する推定成熟IL−1
8BPaをコードする192コドンのオープンリーディングフレームを有した。
システイン残基の位置から、このポリペプチドが免疫グロブリン(Ig)スーパ
ーファミリーに属することを示唆された。成熟IL−18BPa内の4つの各G
ln残基は潜在的なN−グリコシル化部位であった。IL−18BPの他の3つ
のスプライス変異体は有意に豊富ではなかった。
をコードした(配列番号4)。第3の変異体であるIL−18BPcは、169
アミノ酸残基の成熟IL−18BPをコードする2.3kbのcDNAによって
示される(配列番号6)。第4の変異体であるIL−18BPdは133アミノ
酸残基の成熟IL−18BPをコードした(配列番号8)。エキソン内で、プロ
mRNAに沿ってスプライシングが2つの部位に生じた。IL−18BPdにお
けるこれらの事象とさらなる5'エキソンにより、多様なcDNAクローンで3 つの異なる5′UTRを生じた。したがって、異なるIL−18BP変異体が明
瞭な転写調節シグナルに応答して生じる可能性があり得る。
た。
逆プライマー:5′ATATCTAGATTAATGATGATGATGATG
ATGACCCTGCTGCTGTGGACTGCを用いてPCRにより増幅し
た。PCR産物をXbaIで切断し、pEF−BOS発現ベクター(25)のX
baI部位にクローニングし、pEF−BOS−IL−18BPaを得た。該構
築物をDNA配列決定により確認した。
ドDNA(10μg)およびDEAEデキストラン(120μg)を含む1.4
mlのTD緩衝液での6×107COS細胞のバッチを室温で30分間インキュ ベーションした。次いで、細胞をDMEM−10%FBSで洗浄し、DMEM−
10で4時間平板培養し、洗浄し、無血清DMEMで3〜5日間インキュベーシ
ョンした。培地を回収し、限外ろ過(10kDカットオフ)により6倍に濃縮し
、製造業者の説明書にしたがってIL−18BP−His6をイミダゾールを用 いてタロン(Talon)カラム(クローンテック社(Clontech))上で溶出物とし て分離した。
ように評価した:尿IL−18BP(5μg)をクロラミンT法により125Iで 標識した。COS7細胞の上清(250μl)を尿IL−18BPに対する抗体
と混合し(1時間、室温、最終容量500μl)、リン酸緩衝生理食塩水(PB
S)、0.05%ツイーン(Tween)20および0.5%ウシ血清アルブミン( ウォッシュ緩衝液(Wash Buffer))で1:1000に希釈した。次いで、125I
標識された尿IL−18BP(106cpm)を添加し、1時間後にタンパク質 G−セファロース(20μl)を添加した。混合物を懸濁し(1.5時間、4℃
)、続いてビーズを単離し、3xウォッシュ緩衝液およびPBSで一回洗浄した
。次にビーズを試料緩衝液で溶出し、非還元条件下でSDS−PAGE(10%
アクリルアミド)で分離し、オートラジオグラフィーを行なった。
PAGEで単一のバンドとして移動し、尿IL−18BPと同様な見かけ分子量
を有した(データは示さず)。この調製物のタンパク質配列分析により、尿IL
−18BPと同様なN−末端配列が明らかにされ、後者はN−末端で分解されな
かったことを示唆している。
ット分析により、尿タンパク質と同様な分子量バンドが示された。さらに、免疫
沈降、続いてSDS−PAGEおよびオートラジオグラフィーを用いて、IL−
18BPaが尿125I−IL−18BPの抗体への結合と取って代わることがで きた。したがって、IL−18BPaは尿IL−18BPに構造的に一致する。
力について試験した。IL−18BPaは、用量に依存的な様式でマウス脾細胞
、PBMCおよびヒトKG−1細胞系統においてヒトおよびマウスIL−18の
活性を誘導するIFN−γを阻害した(図9)。
8活性の阻害がクローンIL−18BPの固有性質であり、尿IL−18BPに
おけるデフェンシンの共溶出断片などの任意の付随不純物の性質ではないことが
証明された。
えIL−18BPの作用も研究された。ヒトのKG−1細胞(1mlのRMPI
中4×106個)をhuIL−18(10ng/ml)またはIL−18BP( 20分、室温)とあらかじめ混合したhuIL−18のどちらかで刺激した。3
7℃で20分後に細胞を氷冷のPBSで3回洗浄し、直ちに液体窒素で凍結した
。充填した該細胞容積の3倍の緩衝液A(10mM トリスpH7.6、0.4
NaCl、0.2mM EDTA、グリセロール(20%容量)、1.5mM M
gCl2、2mMジチオスレイトール(DDT)、0.4mM PMSF、1mM
Na3VO4、ロイペプチン、ペプスタチンおよびアプロチニン各2μg/ml )に細胞ペレットを再懸濁した。細胞デブリスを遠心(15,000xg、15
分)により除去し、上清のアリコートを液体窒素で凍結し、−80℃で保存した
。標準としてウシ血清アルブミンを用いてブラドフォード検定(バイオ−ラッド
(Bio-Rad))によりタンパク質濃度を測定した。NF−κB結合要素(10p mol、プロメガ社(Promega))に相応する2本鎖オリゴヌクレオチドを[3 2P]dCTP(300Ci/mmol)およびT4ポリヌクレオチドキナーゼ
(ニューイングランドバイオラブ社(New England Biolabs))で標識した。遊 離ヌクレオチドをスピンカラムによって除去した。IL−18でまたはIL−1
8およびIL−18BPで処理された細胞の抽出物(10μgタンパク質)をH
EPES(pH7.5、10mM)、60mM KCl、1mM MgCl2、2 mM EDTA、1mM DTTおよびグリセロール(5%容量)からなる20μ
lの緩衝液中でポリdI.dC(500ng、ファルマシア社(Pharmacia)) および変性サケ精子DNA(100ng、シグマ社)とともに標識プローブ(3
×104cpm)とインキュベーション(15分、室温)した。続いて、混合物 を5%未変性ポリアクリルアミドゲルにかけた。0.5xTBE(40mM ト リスHCl、45mMホウ酸および2.5mM EDTA)中185Vで電気泳 動を行なった。ゲルを真空乾燥し、−80℃で一晩オートラジオグラフィーを行
なった。IL−18は、p50NF−κBホモダイマーおよびp65/p50 NF−κBヘテロダイマーの形成を誘導することが見出された。NF−κB共通
配列に相当する放射標識オリゴヌクレオチドと結合したKG1細胞の抽出物を用
いた電気泳動移動度変位検定による測定時に、尿および組換えIL−18BPは
IL−18によるNF−κBの活性化を阻害した。
細胞などの他の真核細胞などの他の組換え細胞によって産生され得る。任意のI
L−18BPをコードするDNAを担い、組換えIL−18BPを産生するため
に大腸菌および酵母細胞の形質転換または昆虫細胞の感染に適する、ふさわしい
ベクターを構築するため、周知の方法が利用される。酵母細胞での発現のため、
IL−18BPをコードするDNA(実施例6)を切断し、酵母細胞のトランス
フェクションに適した発現ベクターに挿入される。昆虫細胞での発現のため、I
L−18BPをコードするDNAをバキュロウイルスに挿入し、該昆虫細胞を該
組換えバキュロウイルスで感染させる。大腸菌での発現のため、IL−18BP
をコードするDNAを適切なオリゴヌクレオチドを用いて部位標的突然変異誘発
法にかけ、その結果、開始ATGコドンが成熟IL−18BPの第1コドンの直
前に挿入される。または、このようなDNAを適切なセンスおよびアンチセンス
プライマーを用いてPCRにより調製され得る。続いて、得られるcDNA構築
物を当分野で周知の技術により適切に構築された原核発現ベクターに挿入される
(23)。
ンビトロゲン社(Invitrogen)、カリフォルニア州サンディエゴ)に基づいて構
築される。5'端にコザック(Kozak)共通配列をもつIL−18BP cDNA を制限部位を破壊する方法でpcDNA3のXbaI部位に連結する。部位標的
突然変異誘発法により、新しいXbaI部位がネオマイシンカセットの前(本来
のpcDNA3配列の塩基2151)かつSV40ポリアデニル化シグナルの後
(本来のpcDNA3配列の塩基3372)に挿入される。次いで、この構築物
をXbaIで切断し、得られる4.7kbのミニ遺伝子が記載(シニダー(Snyd
er)ら、1996年、ヒト遺伝学の最新プロトコル(Current Protocols In Hum
an Genetics)、12.1.1〜12.1.17章、ジョンウィリー&ソンズ(J
ohn Wiley & Sons))のプラスミドpsub201のXbaI部位に挿入され る。ヘルパーAAVプラスミドpAAV/Adを用いて、得られる組換えプラス
ミドをヒトT293細胞にコトランスフェクションする。次に、培養物をヘルパ
ーウイルスとしてのアデノウイルスに感染させ、48〜60時間のインキュベー
ション後に細胞を採取する。細胞を3回の凍結−融解サイクルにかけ、細胞デブ
リスを遠心により除去し、上清を硫酸アンモニウムで33%飽和させる。続いて
、混合物を遠心し、該硫酸アンモニウムを50%飽和させることにより、上清か
らrAAVを沈降させる。ウイルスをさらにCsClにより精製し、透析し、い
かなるアデノウイルスも破壊するために56℃で15分最終加熱する。
生は次のように実施されうる:適切なオリゴヌクレオチドを用いて、IL−18
BPのDNAを部位標的突然変異にかけ、コード配列の直前および直後に単一の
制限部位を導入する。IgG2重鎖の定常領域をもつプラスミド、たとえばpR
KCO42Fc1(6)を部位標的突然変異誘発法にかけ、融合タンパク質の相
で翻訳されるようにIgG1重鎖のAsp216にできるだけ近くに同じ単一の
制限部位を導入する。5'非翻訳配列からなり、IL−18BPをコードするd sDNA断片が、単一の制限部位での消化により、または適切に設計されたプラ
イマーを用いたPCRにより調製される。変異したpRKCD42Fc1は、該
プラスミドおよびIgG1配列を含む大断片を生じるように同様に設計される。
続いて、2つの断片を連結し、IL−18BPおよびIgG1重鎖の約227個
のC−末端アミノ酸(ヒンジ領域ならびにCH2およびCH3ドメイン)からな
るポリペプチド前駆体をコードする新しいプラスミドを生じる。融合タンパク質
をコードするDNAが適切な制限酵素を用いた消化により該プラスミドから単離
され、続いて効率的な原核または真核発現ベクターに挿入される。
ール(PEG)で化学的に改変されたIL−18BPsが作製されうる。IL−
18BP郡市のシステイン残基にPEGを架橋させることにより、改変がなされ
得る。アミノ末端に余分のシステイン残基、グリコシル化部位、および各IL−
18BPのカルボキシル末端を含む変異体IL−18BPsが構築され得る。所
望の変異を含むオリゴヌクレオチドを用いたPCRにより、突然変異誘発が実施
され得る。これらの変異タンパク質は当分野で周知の通常の様式で発現される。
これらのタンパク質のペギレーション(Pegylation)が実施され、活性が評価さ
れる。
物5μgをウサギに皮下注射した。3週間後、不完全フロイントアジュバンドの
IL−18BP調製物5μgを再び皮下注射した。PBS溶液としてのIL−1
8BPをさらに2回10日おきに注射した。最終免疫の10日後にウサギから採
血した。抗体レベルの進行は放射免疫検定によって追跡された。125I−標識I L−18BP(166,000cpm)をウサギ血清の様々な希釈物(1:50
、1:500、1:5,000、1:50,000)と混合した。タンパク質−
Gアガロースビーズ(20μl、ファルマシア社(Pharmacia))の懸濁物を全 容積が200μlになるよう添加した。混合物を1時間室温におき、続いてビー
ズを3回洗浄し、結合放射活性が測定された。ヒトレプチンに対するウサギ抗血
清がネガティブコントロールとして用いられた。IL−18R抗血清の力価は1
:500および1:5000の間であり、ネガティブコントロールの力価は1:
50より低かった。
ュバンドで皮下注射した。PBSでIL−18BPをさらに3回10日おきに皮
下注射した。最終免疫の10日後にウサギから採血した。融合の4および3日前
に、最終ブースト(boosts)がIRIAによる測定時に最も高い結合力価を示す
マウスの腹腔内に施される(下記参照)。融合は、NSO/1ミエローマ細胞系
統および融合パートナーとしての動物の脾臓およびリンパ節からの両方から調製
されるリンパ球を用いて融合が実施される。融合細胞は、ミクロ培養プレートに
播種し、HATおよび15%馬血清を補足したDMEMでハイブリドーマを選別
する。IL−18BPに対する抗体を産生することが見出されるハイブリドーマ
を限界希釈法でサブクローニングし、腹水産生のためプリスタン(pristane)で
初回免疫されたBalb/Cマウスに注射した。抗体のアイソタイプは市販のエ
リザキット(アマーシャム社(Amersham)、英国)を用いて定義される。
ングが次のように実施される:逆固相放射免疫検定(IRIA)により、ハイブ
リドーマの上清を抗−IL−18BP抗体の存在下で試験する。エリザプレート
(ダイナテックラボラトリー社(Dynatech Laboratories)、バージニア州アレ キサンドリア)をタロンで精製したIL−18BPa−His6(10μg/m l、100μl/穴)でコーティングする。4℃で一晩インキュベーション後、
プレートをBSA(0.5%)およびツィーン20(0.05%)を含むPBS
で2回洗浄し、37℃で少なくとも2時間洗浄溶液中で遮断する。プレートを3
回洗浄し、室温で2時間、ヤギ−抗−マウスホースラディッシュペルオキシター
ゼ(HRP、ジャックソンラブズ(Jackson Labs)、1:10,000、100
μl/穴)の複合物を添加する。プレートを4回洗浄し、基質としてH2O2を用
いるABTS(2,2′−アジノ−ビス(3−エチルベンズチアゾリン−6‐ス
ルホン酸、シグマ社)により発色させる。プレートを自動エリザ読み取り機で読
み取る。ネガティブコントロール値より少なくとも5倍高いODを与える試料が
ポジティブと考えられる。
IL−18BPの精製に利用される。ハイブリドーマにより分泌されるモノクロ
ーナル抗体を含む腹水液を50%飽和の硫酸アンモニウム沈降により精製され、
続いてPBSで長い透析を行なった。製造業者によって指定されるように、約1
0mgの免疫グロブリンを1mlのアフィゲル(バイオラッドUSA社(BioRad
USA))に結合させる。
洗浄でタンパク質が検出されなくなるまでカラムをPBSで洗浄する。PH2.
2の25mMクエン酸緩衝液(8x1カラム容量画分)でIL−18BPを溶出
し、直ちに1M Na2CO3で中和する。この調製物のさらなる精製物は、サイ ズ排除クロマトグラフィーにより得られる。
またはマキシソーブ(Maxisorb)、ヌンク社(Nunc)製)を4℃で一晩抗‐IL
−18BPモノクローナル抗体(無血清ハイブリドーマ上清または腹水液の免疫
グロブリン)でコーティングする。プレートをBSA(0.5%)およびツィー
ン20(0.05%)を含むPBSで洗浄し、37度で少なくとも2時間同じ溶
液で遮断する。試験試料は、遮断溶液で希釈し、37℃で4時間ウェルに添加す
る(100μl/穴)。続いて、プレートをツィーン20(0.05%)を含む
PBSで3回洗浄し、4℃で一晩のさらなるインキュベーションのためウサギ抗
‐IL−18BP血清を添加する。プレートを3回洗浄し、室温で2時間、ヤギ
‐抗−ウサギホースラディッシュペルオキシターゼ(HRP、ジャックソンラブ
ズ(Jackson Labs)、1:10,000、100μl/穴)の複合物を添加する
。プレートを4回洗浄し、基質としてH2O2を用いるABTS(2,2′−アジ
ノ−ビス(3‐エチルベンズチアゾリン‐6‐スルホン酸、シグマ社)により発
色させる。プレートを自動エリザ読み取り機で読み取る。
いて試験した。IL−18BPaは、用量に依存的な様式でマウスの脾細胞、P
BMCおよびヒトKG−1細胞系統におけるヒトおよびマウスIL−18の活性
を誘導するIFN−γを阻害した(図9)。
ml、PNGアーゼF、ニューイングランバイオラブ社(New England Biolabs ))と混合した。混合物を非還元条件下で37℃で24時間インキュベーション
した。非還元ン条件下において試料由来および非消化IL−18BP−His6 由来のアリコートをSDS−PAGEによって分析し、続いてIL−18PBに
対する抗体でイムノブロティングした。IL−18BP−His6の約40kD のバンドがPNGアーゼ処理画分で消失することが見出され、新規な約20kD
のバンドが得られた。該産物の分子量およびPNGアーゼFの特異性から、IL
−18BP−His6充分グリコシル化されたことが示された。
浄し、イミダゾール(100mM)で溶出した。ヒトIL−18(20ng/m
l)、LPS(2μg/ml)およびマウスの脾細胞を用いて、溶出画分を生物
検定にかけた。結果を以下の表に示す:
て生物学的に活性であると結論づけられる。
の知識を応用することにより、そのような具体的実施態様を一般的概念から逸脱
することなく容易に改変および/または様々な適用に適応させることが可能であ
り、したがってそのような適応および改変は開示された実施態様に等価な意味お
よび範囲内で理解されることが意図されるべきであり、意図されているものであ
る。本明細書で用いられる表現または専門用語は説明の目的のためのものであり
、限定のためのものではないことが理解されよう。
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GE(ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動)を示す。(5
00Lの正常なヒトの尿の限外ろ過により濃縮された)粗尿タンパク質をIL−
18アガロースカラムにかけた。このカラムを洗浄し、結合タンパク質をpH2
.2で溶出した。溶出画分を中和し、アリコートを非還元条件および銀染色の下
でSDS−PAGE(10%アクリルアミド)によって分析した。レーンは、1
:粗尿タンパク質(1.5μg、ゲル上にのせた);2〜9:それぞれIL−1
8アガロースカラムからの溶出1〜8;10:右側に示すようにkDの分子量マ
ーカー。矢印はIL−18BPに相当するバンドを示す。
リルアミド)のオートラジオグラムを示す。レーン1:IL−18アフィニティ
ーカラムの洗浄。レーン2:IL‐18アフィニティーカラムの溶出2。レーン
3:IL−18アフィニティーカラムの溶出3。分子量マーカーは(kDで)右
側に示す。矢印は架橋した産物を示す(58kD)。
(1h、37℃)というLPS(1μg/ml)およびヒトIL−18(5ng
/ml)の示される組合せでマウスの脾細胞を刺激した(24hr、37℃)。
培養におけるmuIFN−γのレベルは24時間後に測定された。 (B)増加濃度のヒトIL−18BPとあらかじめ混合した(1h、37℃)マ
ウスIL−18(10ng/ml)とともにLPS(1μg/ml)とマウスの
脾細胞をインキュベーションした(24h)。 (C)増加濃度のヒトIL−18BPとともにLPS(10μg/ml)とマウ
スの脾細胞をインキュベーションした(24h)。 (D)増加濃度のヒトIL−18BPとともにConA(1μg/ml)とマウ
スの脾細胞をインキュベーションした(24h)。 (E)TNF−α(20ng/ml)およびhuIL−18(25ng/ml)
のいずれか単独を添加し、または尿IL−18BPとあらかじめ混合し(1h、
37℃)、ヒトKG−1細胞を刺激した。
kb)を決定し、3つのcDNAライブラリーから単離された多様なcDNAク
ローンの配列と比較した。共通の翻訳開始コドンはヌクレオチド683〜685
である。NuMA1遺伝子は、ヌクレオチド3578から末端までのマイナス鎖
上に位置する。
示す。 His6でタグをつけたIL−18BPaは、COS7細胞で一過的に発現し 精製された。 (A)ヒトIL−18(5ng/ml)を、His6でタグをつけたIL−18 BPaまたはRPMIのどちらかとあらかじめ混合し、LPS(1μg/ml)
とともにマウスの脾細胞に添加した。IFN−γ産生を24時間後に測定した。 (B)マウスIL−18(10ng/ml)を、His6でタグをつけたIL− 18BPaまたはRPMIのどちらかとあらかじめ混合し、LPS(1μg/m
l)とともにマウスの脾細胞に添加した。IFN−γ産生を24時間後に測定し
た。 (C)ヒトIL−18(25ng/ml)を、COS7−IL−18BPaまた
はRPMIのどちらかとあらかじめ混合し、IL−12(10ng/ml)の存
在下でヒトPBMCに添加した。 (D)ヒトIL−18(25ng/ml)を、COS7−IL−18BPaまた
はRPMIのどちらかとあらかじめ混合し、TNF−α(20ng/ml)の存
在下でヒトKG−1細胞に添加した。
Claims (41)
- 【請求項1】 配列番号10のアミノ酸配列を含むIL−18結合タンパク
質(IL−18BP)、その突然変異タンパク質、融合タンパク質、機能的誘導
体、活性画分、環状変更された誘導体および混合物。 - 【請求項2】 (i)IL−18に結合すること、 (ii)IL−18の活性を調節すること、 (iii)IL−18の活性を遮断すること の少なくとも1つが可能な請求項1記載のIL−18BP。
- 【請求項3】 (a)配列番号2、配列番号4、配列番号6または配列番号
8のアミノ酸配列のいずれか1つからなるポリペプチド; (b)リーダー配列なしの(a)で定義されるポリペプチド; (c)(a)または(b)で定義されるポリペプチドの突然変異タンパク質、融
合タンパク質、機能的誘導体、活性画分、環状変更された誘導体およびそれらの
混合物;ならびに (d)(a)または(b)で定義されるポリペプチドのウイルスのホモログ からなる群より選択されるIL−18BP。 - 【請求項4】 つぎの生物学的性質: (i)IL−18に結合すること、 (ii)IL−18の活性を調節すること、 (iii)IL−18の活性を遮断すること の少なくとも1つを有する請求項3記載のIL−18BP。
- 【請求項5】 非ウイルスタンパク質である請求項1、2、3または4記載
のIL−18BP。 - 【請求項6】 ヒトのタンパク質である請求項5記載のIL−18BP。
- 【請求項7】 約40kDの分子量を有する請求項1、2、3、4、5また
は6記載のIL−18BP。 - 【請求項8】 融合タンパク質である請求項1、2、3、4、5、6または
7記載のIL−18BP。 - 【請求項9】 請求項1、2、3、4、5、6、7または8記載のIL−1
8BPからなるタンパク質。 - 【請求項10】 可溶性形態における請求項1、2、3、4、5、6、7、
8または9記載のIL−18BP。 - 【請求項11】 非グリコシル化IL−18BPである請求項1、2、3、
4、5、6、7、8、9または10記載のIL−18BP。 - 【請求項12】 ストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるDNA
またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるが配列番号1、配列番
号3、配列番号5または配列番号7で示される少なくとも1つのDNA配列に遺
伝コードが縮重するDNAであって、請求項1、2、3、4、5、6、7、8、
9、10または11記載のIL−18BPをコードできるDNA。 - 【請求項13】 配列番号10のアミノ酸配列を含む請求項1、2、3、4
、5、6、7、8、9、10または11記載のIL−18BPをコードするDN
A。 - 【請求項14】 3′末端に終止コドンをもつ配列番号10のアミノ酸配列
を含む請求項1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または11記載のIL
−18BPをコードするDNA。 - 【請求項15】 ストリンジェントな条件下で請求項13記載のDNAとハ
イブリダイズするDNAまたはストリンジェントな条件下でハイブリダイズでき
るが遺伝コードが縮重するDNAであって、請求項1、2、3、4、5、6、7
、8、9、10または11記載のIL−18BPをコードできるDNA。 - 【請求項16】 プロモーターおよびエンハンサーなどの発現を促進する他
のDNA配列に機能的に連結させた請求項12、13、14または15記載のD
NA。 - 【請求項17】 ゲノムDNAである請求項12、13、14、15または
16記載のDNA。 - 【請求項18】 cDNAである請求項12、13、14、15、16また
は17記載のDNA。 - 【請求項19】 配列番号1、配列番号3、配列番号5および配列番号7の
DNA配列の群より選択されるcDNA配列からなる請求項18記載のcDNA
。 - 【請求項20】 細菌宿主における発現用に適合されている請求項18また
は19記載のcDNA。 - 【請求項21】 請求項12、13、14、15、16、17、18、19
または20記載のDNAからなる複製可能な発現ビヒクル。 - 【請求項22】 請求項21記載の発現ビヒクルからなる形質転換された宿
主細胞。 - 【請求項23】 真核細胞である請求項22記載の形質転換された宿主細胞
。 - 【請求項24】 原核細胞である請求項22記載の形質転換された宿主細胞
。 - 【請求項25】 請求項1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または
11記載のIL−18BPの産生方法であって、該IL−18BPの発現に適す
る条件下で請求項21、22または23記載の宿主細胞を培養すること、および
該IL−18BPを単離することからなる方法。 - 【請求項26】 請求項1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または
11記載のIL−18BPに対する抗体。 - 【請求項27】 ポリクローナル抗体である請求項26記載の抗体。
- 【請求項28】 モノクローナル抗体である請求項26記載の抗体。
- 【請求項29】 抗イディオタイプ抗体である請求項26記載の抗体。
- 【請求項30】 キメラ抗体である請求項26記載の抗体。
- 【請求項31】 ヒト化抗体である請求項26記載の抗体。
- 【請求項32】 請求項3記載のIL−18BPの単離方法であって、 (a)ヒトの体液をIL−18が結合するクロマトグラフのカラムに通すこと、
(b)IL−18に結合できるタンパク質を溶出すること、および (c)該タンパク質を精製すること からなる方法。 - 【請求項33】 請求項1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または
11記載のIL−18BPからなる医薬組成物。 - 【請求項34】 請求項1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または
11記載のIL−18BPのウイルスにコードされたホモログからなる医薬組成
物。 - 【請求項35】 請求項1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または
11記載のIL−18BPをコードするDNAからなる医薬組成物。 - 【請求項36】 IL−18BPの投与を要する症状の治療用医薬組成物の
調製における請求項1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または11記載
のIL−18BPの用途。 - 【請求項37】 IL−18BPの投与を要する症状の治療用医薬組成物の
調製における請求項1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または11記載
のIL−18BPのウイルスにコードされたホモログの用途。 - 【請求項38】 IL−18の精製用の請求項1、2、3、4、5、6、7
、8、9、10または11記載のIL−18BPの用途。 - 【請求項39】 IL−18BPの検出検定における請求項26、27、2
8、29、30または31記載の抗体の用途。 - 【請求項40】 請求項1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または
11記載のIL−18BPをコードするDNAまたは遺伝子治療のためのIL−
18BPのウイルスにコードされたホモログをコードするDNAの用途。 - 【請求項41】 請求項1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または
11記載のIL−18BPを作製するための請求項12、13、14、15、1
6、17、18、19または20記載のDNAの用途。
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