PT1689777E - Processo para a purificação da proteína de ligação a il-18 - Google Patents
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Description
1
DESCRIÇÃO "PROCESSO PARA A PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA DE LIGAÇÃO À IL- 18"
ÁREA DA INVENÇÃO A presente invenção situa-se na área da purificação de proteínas. Mais especificamente, ela relaciona-se com a purificação da proteína de ligação à IL-18 (IL-18BP) via cromatografia hidrófoba de indução de carga.
Preferencialmente, a invenção compreende ainda passos de purificação seleccionados de cromatografia de afinidade com ião metálico imobilizado, cromatografia de troca iónica, cromatografia de interacção hidrófoba e cromatografia de fase inversa.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
As proteínas tornaram-se comercialmente importantes como fármacos os quais também são geralmente chamados "produtos biológicos". Um dos maiores desafios é o desenvolvimento de processos eficientes e de baixo custo para a purificação de proteínas à escala comercial. Embora existam presentemente muitos métodos para a preparação de proteínas em grande escala, os produtos em bruto, tais como os fluidos do organismo, contêm não só o produto desejado mas também impurezas que são difíceis de separar do produto desejado. Além do mais, as fontes biológicas de proteínas contêm habitualmente misturas complexas de materiais.
As fontes biológicas como os sobrenadantes de culturas celulares de células que expressam um produto proteico de um modo recombinante podem conter menos impurezas, em particular se as células forem multiplicadas em meio sem 2 soro. No entanto, as autoridades sanitárias requerem padrões elevados de pureza para proteínas que se destinam a administração humana. Além disso, muitos métodos de purificação podem conter passos que requerem a aplicação de pH baixo ou alto, concentrações elevadas de sal ou outras condições extremas que podem deteriorar a actividade biológica de uma dada proteína. Deste modo, a definição de um processo de purificação que permita uma pureza suficiente e ao mesmo tempo conserve a actividade biológica da proteína constitui um desafio para qualquer proteína.
Os sistemas cromatográficos de troca iónica têm sido muito utilizados para a separação de proteínas principalmente com base na diferença de carga. Na cromatografia de troca iónica, grupos carregados na superfície do soluto são atraídos por cargas opostas ligadas a uma matriz de cromatografia, desde que a força iónica do tampão do meio seja baixo. A eluição é geralmente conseguida aumentando a força iónica (i.e. condutividade) do tampão para competir com o soluto para os sítios carregados da matriz de troca iónica. A alteração do pH e, desse modo, da carga do soluto é uma outra via para conseguir a eluição do soluto. A alteração na condutividade ou pH pode ser gradual (eluição gradiente) ou em degrau (eluição em degrau).
Os permutadores aniónicos podem ser classificados como fracos ou fortes. 0 grupo com carga num permutador aniónico fraco é uma base fraca, a qual fica desprotonada e, consequentemente, perde a sua carga a pH elevado. 0 DEAE-celulose é um exemplo de um permutador aniónico fraco, em que o grupo amino pode estar carregado positivamente a pH 3 inferior a 9 e perde gradualmente a carga a valores de pH mais elevados. Por exemplo o dietilaminoetilo (DEAE) ou dietil-(2-hidroxi-propil)aminoetilo (QAE) tem cloreto como contra-ião.
Um permutador aniónico forte, por outro lado, contém uma base forte, a qual permanece carregada positivamente ao longo da gama de pH normalmente utilizada na cromatografia de troca iónica (pH 1-14). A Q-sepharose (Q representa amónio quaternário) é um exemplo de um permutador aniónico forte.
Os permutadores catiónicos também podem ser classificados como fracos ou fortes. Um permutador catiónico forte contém um ácido forte (tal como um grupo sulfopropilo) que permanece carregado de pH 1-14; enquanto um permutador catiónico fraco contém um ácido fraco (tal como um grupo carboximetilo), o qual perde gradualmente a sua carga à medida que o pH diminui abaixo de 4 ou 5. Por exemplo, o carboximetilo (CM) e o sulfopropilo (SP) têm sódio como contra-ião.
Os sistemas cromatográficos com uma fase estacionária hidrófoba também têm sido muito utilizados na purificação de proteínas. Estão incluídas nesta categoria a cromatografia de interacção hidrófoba (HIC) e a cromatografia líquida de fase inversa (RPLC). A base físico-química para a separação por HIC e RPLC é o efeito hidrófobo; as proteínas são separadas numa fase estacionária hidrófoba com base em diferenças na hidrofobicidade. 4
Duma maneira geral, na HIC as moléculas da amostra num tampão com elevado teor de sal são introduzidas na coluna de HIC. 0 sal no tampão interage com as moléculas de água para reduzir a solvatação das moléculas em solução expondo, deste modo, as regiões hidrófobas das moléculas da amostra as guais são conseguentemente adsorvidas pela coluna de HIC. Quanto mais hidrófoba for a molécula, menor é o teor de sal necessário para promover a ligação. Duma maneira geral, utiliza-se um gradiente decrescente de sal para eluir as amostras da coluna. À medida gue a força iónica diminui, aumenta a exposição das regiões hidrófilas das moléculas e estas eluem da coluna por ordem crescente de hidrofobicidade. A eluição da amostra também pode ser conseguida pela adição de modificadores ou detergentes orgânicos ao tampão de eluição. A HIC é revista, por exemplo, em Protein Purification, 2a Ed., Springer-Verlag, New York, páginas 176-179 (1988).
Na HIC estão disponíveis vários suportes cromatográficos diferentes portadores de vários ligandos. Os ligandos diferem no que se refere à sua hidrofobicidade. Os ligandos hidrófobos geralmente utilizados são resíduos de fenilo, butilo ou octilo. A cromatografia hidrófoba de indução de carga é um subgrupo da HIC que utiliza resinas portadoras de ligandos tais como derivados de 4-mercaptoetilpiridina. Um exemplo de uma resina de cromatografia hidrófoba de indução de carga é o MEP-HyperCel® (Boschetti et al., Genetic Engineering Vol. 20, N° 13, Julho, 2000, Boschetti e Jungbauer, 2000) . 5 A cromatografia de fase inversa é um método de purificação de proteínas muito semelhante à HIC, uma vez que ambos se baseiam em interacções entre grupos não polares acessíveis ao solvente na superfície de biomoléculas e ligandos hidrófobos da matriz. No entanto, os ligandos utilizados na cromatografia de fase inversa estão mais substituídos com ligandos hidrófobos do que os ligandos HIC. Apesar do grau de substituição dos adsorventes de HIC poderem estar na gama de 10-50 μπιοΙβε/Γηΐ, de matriz de ligandos arilo C2-C8, na cromatografia de fase inversa são geralmente utilizados adsorventes com várias centenas de μΐΏοΙθε/πΛ de matriz de ligandos alquilo C4-C8. A cromatografia de interacção hidrófoba e a cromatografia de fase inversa também diferem pela cromatografia de interacção hidrófoba ser realizada em condições de solvente aquoso e serem utilizadas alterações da força iónica para eluir a coluna. A proteína liga-se tipicamente no estado original através dos grupos hidrófobos localizados na superfície da proteína e o estado original é mantido durante as condições de eluição. Em contrapartida, a cromatografia de fase inversa utiliza um solvente hidrófobo (tipicamente acetonitrilo) e a ligação a um ligando é função da partição de fase entre a natureza hidrófoba do solvente e do grupo funcional da coluna. As proteínas estão tipicamente desnaturadas em certa extensão em tais solventes e ligam-se devido à natureza hidrófoba da sequência completa do polipéptido. Uma vez que a maior parte dos grupos hidrófobos estão localizados no núcleo de proteínas globulares, a ligação depende do grau de desnaturação da proteína e da acessibilidade destes grupos aos grupos funcionais da coluna. 6 A coluna Source 30RPC é uma matriz polimérica de fase inversa. Baseia-se em esferas rígidas de poliestireno/divinilbenzeno com 30 mícrones de diâmetro. As suas características podem ser resumidas como se segue: gama de pH excepcionalmente lata (1-12), elevada selectividade, elevada resistência química, elevada capacidade e elevada resolução a caudais altos.
Outro tipo de cromatografia muito utilizado para a purificação de proteínas é a chamada cromatografia de afinidade com ião metálico imobilizado (IMAC). Em 1975, Porath introduziu a cromatografia de afinidade com ião metálico imobilizado (IMAC) para fraccionar proteínas [J. Porath, J. Carlsson, I. Olsson, e G. Belfrage, Nature (London) 258, 598-599 (1975)]. No trabalho de Porath, a IMAC consiste em derivatizar uma resina com ácido iminodiacético (IDA) e quelar iões metálicos à resina derivatiza com ida. As proteínas são separadas com base na sua afinidade para os iões de metal, os quais foram imobilizados por quelação. As proteínas ligam-se aos iões de metal através de sítios de coordenação não ocupados e ficam imobilizadas na coluna. Desde então têm sido utilizados outros ligandos que não o IDA para quelar iões metálicos às resinas. Estudos com proteínas séricas mostraram que a IMAC é uma técnica de separação extremamente específica e selectiva [J. Porath e B. Olin, Biochemistry 22, 1621-1630 (1983)]. O adsorvente é preparado acoplando um ligando formador de quelatos metálicos, tal como, ácido iminodiacético, a Sepharose ou superose e tratando-o com uma solução de um ou mais iões metálicos divalentes tais como Zn2+, Cu2+, Cd2+, Hg2+, Co2+, 7
Ni2+ ou Fe2+. A reacção de ligação é dependente do pH e a eluição é realizada reduzindo o pH e aumentando a força iónica do tampão ou incluindo EDTA no tampão.
Os mecanismos efectivos que originam a ligação das proteínas aos iões de metal livre não estão bem compreendidos e dependem de um número de factores, dos quais a conformação da proteína particular não é o menos relevante. No entanto, quando os iões metálicos estão imobilizados entram em jogo pelo menos três factores restritivos, nomeadamente menor número de sítios de coordenação disponíveis no metal, acessibilidade limitada do metal preso aos sítios de ligação na proteína e, dependendo das características da resina, acesso limitado da proteína ao ião metálico imobilizado. Deste modo é extremamente difícil prever à priori quais as proteínas que apresentarão e quais as que não apresentarão afinidade para os iões metálicos imobilizados. A proteína de ligação à interleucina-18 (IL-18BP) é uma proteína solúvel natural que foi inicialmente purificada por afinidade, numa coluna IL-18, a partir de urina (Novick et al. 1999). A IL-18BP anula a indução da iFN-γ pela IL-18 e a activação de NF-kb pela IL-18 in vitro. Além disso, a IL-18BP inibe a indução de IFN-γ em ratinhos injectados com LPS.
0 gene da IL-18BP está localizado no cromossoma 11 humano e não foi encontrado nenhum exão que codifique um domínio transmembranar na sequência genómica de 8,3 kb compreendendo o gene da IL-18BP. Até à data foram identificadas em seres humanos quatro isoformas de IL-18BP 8 geradas por excisão-união alternativa do ARNm. Elas foram designadas por IL-18BP a, b, c e d, partilhando todas elas da mesma extremidade N e diferindo na extremidade C (Novick et ai 1999). Estas isoformas diferem na sua capacidade para se ligar à IL-18 (Kim et ai. 2000). Das quatro isoformas humanas de IL-18BP (hIL-18BP), sabe-se que as isoformas a e c têm uma capacidade neutralizadora da IL-18. A isoforma de IL-18BP mais abundante, isoforma a, apresenta uma afinidade elevada para a IL-18 com um início rápido e uma perda lenta, e uma constante de dissociação (Kd) de aproximadamente 0,4 nM (Kim et ai. 2000). A IL-18BP é expressada de modo constitutivo no baço, e pertence à superfamília de imunoglobulinas. Os resíduos envolvidos na interacção da IL-18 com a IL-18BP foram descritos através da utilização de modulação computacional (Kim et ai. 2000) e com base na interacção entre a proteína semelhante IL-Ιβ com o IL-1R de tipo I (Vigers et ai. 1997). A IL-18BP está presente constitutivamente em muitas células (Puren et al. 1999) e circula em seres humanos saudáveis (Urushihara et al. 2000), representando um fenómeno único na biologia de citocinas. Devido à afinidade elevada da IL-18BP para a IL-18 (Kd =0,4 nM) e à concentração elevada da IL-18BP presente na circulação (excesso molar de 20 vezes em relação à IL-18) tem-se especulado que a maior parte, se não todas, as moléculas de IL-18 na circulação estão ligadas à IL-18BP. Assim, a IL-18BP em circulação que compete com os receptores da superfície celular para a IL-18 pode actuar como um anti-inflamatório natural e uma molécula imunossupressora. 9 A IL-18BP tem sido sugerida como uma proteína terapêutica num número de doenças e distúrbios, tais como psoríase, doença de Crohn, artrite reumatóide, artrite psoriática, lesão hepática, sepsia, aterosclerose, doenças cardíacas isquémicas, alergias, etc., ver, por exemplo W09909063, W00107480, WO0162285, W00185201, W002060479, WO02096456, W003080104, WO02092008, W002101049, WO03013577. Uma vez que a IL-18BP é sugerida como uma proteína terapêutica para administração, por exemplo a seres humanos, existe uma necessidade de quantidades adequadas de IL-18BP numa pureza suficientemente elevada.
No entanto, até à data, não está disponível qualquer processo de purificação que proporcione IL-18BP purificada.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção baseia-se no desenvolvimento de um processo de purificação para a proteína de ligação à IL-18 (IL-18BP) .
Por conseguinte, num primeiro aspecto, a invenção relaciona-se com a utilização de cromatografia hidrófoba de indução de carga para purificação de IL-18BP.
Num segundo aspecto, a invenção relaciona-se com um processo para a purificação da proteína de ligação à IL-18 (IL-18BP) a partir de um fluido, compreendendo um passo de cromatografia hidrófoba de indução de carga.
Mais especificamente, o processo de purificação da invenção compreende ainda um passo seleccionado de 10 cromatografia de afinidade com ião metálico imobilizado, cromatografia de troca iónica, cromatografia de interacção hidrófoba e cromatografia de fase inversa.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Fig. 1 mostra um plano esquemático de um processo de purificação preferido da invenção, que origina IL-18BP purificada ("IL-18BP EM LOTE").
Fig.2 mostra as curvas dose-resposta do material de referência IL-18BP no bioensaio Kg-1 in vitro em 10 experiências independentes.
DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO A presente invenção baseia-se no desenvolvimento de um processo de purificação para a IL-18BP que origina IL-18BP purificada.
Num primeiro aspecto a invenção relaciona-se com a utilização de cromatografia hidrófoba de indução de carga para purificação de IL-18BP. Numa forma de realização preferida, este passo de cromatografia hidrófoba de indução de carga é realizado associado a um ou mais passos seleccionados de cromatografia de afinidade com ião metálico imobilizado, cromatografia de troca iónica, cromatografia de interacção hidrófoba e cromatografia de fase inversa. 11
Preferencialmente, o passo hidrófobo de indução de carga é realizado numa resina de 4-mercapto-etil-piridina (MEP) .
Noutra forma de realização preferida, o passo hidrófobo de indução de carga é realizado associado a um ou mais passos seleccionados de cromatografia de afinidade com ião metálico imobilizado, cromatografia de troca iónica, cromatografia de interacção hidrófoba e cromatografia de fase inversa. Os passos individuais de cromatografia podem ser realizados por qualquer ordem adequada.
Num segundo aspecto, a invenção relaciona-se com um processo para a purificação da proteína de ligação à IL-18 (IL-18BP) a partir de um fluido compreendendo um passo de cromatografia hidrófoba de indução de carga. 0 termo "resina", como aqui utilizado, relaciona-se com qualquer material matriz ou portador utilizado na coluna cromatográfica, tal como, por exemplo agarose, sepharose, superose, dextrano, sephadex, polipropileno ou semelhantes, que pode ser derivatizado com ligandos, ou grupos funcionais, tais como DEAE, CM, MEP, fenilo, por exemplo, como explicado em pormenor nos "Antecedentes da Invenção". Os materiais de matriz podem surgir em formas reticuladas diferentes, dependendo da utilização específica. 0 volume da resina, assim como o comprimento e diâmetro da coluna a serem utilizados depende de vários parâmetros tais como o volume de fluido a ser tratado, a concentração de proteína no fluido a ser submetido ao processo da invenção, etc., e a sua determinação está dentro da perícia do especialista na técnica. 12 A cromatografia hidrófoba de indução de carga é preferencialmente realizada numa resina com 4-mercaptoetil-piridina (MEP) como ligando imobilizado. A MEP-Hypercel® é uma resina que é particularmente adequada no quadro da presente invenção.
Preferencialmente, o processo contém ainda pelo menos um passo seleccionado de cromatografia de afinidade com ião metálico imobilizado, cromatografia de troca iónica, cromatografia de interacção hidrófoba e cromatografia de fase inversa. Os passos individuais de cromatografia podem ser realizados por qualquer ordem. Cada passo individual também pode ser realizado mais do que uma vez, se necessário. A cromatografia de afinidade com ião metálico imobilizado é preferencialmente realizada numa resina quelante, tal como sepharose quelante. 0 passo de cromatografia de troca iónica pode conter um permutador aniónico ou um permutador catiónico. Prefere-se utilizar um material de cromatografia de troca catiónica, em particular um material de permuta catiónica fraco, e é extremamente preferida a utilização de uma resina de carboximetilo (CM), tal como CM sepharose FF, para realizar este passo do processo de purificação. 0 passo de cromatografia de interacção hidrófoba (HIC) passo pode ser realizado em qualquer resina HIC conhecida, tal como uma resina possuindo resíduos alquilo ou arilo como ligandos imobilizados. A butil-, octil- ou fenil- 13 sepharose (agarose) são outros exemplos de tais resinas HIC. Prefere-se utilizar uma resina de fenilo, tal como fenil-sepharose FF, para este passo do processo de purificação. 0 processo de purificação pode compreender ainda um passo de cromatografia de fase inversa. Um material preferido para este passo é Source 30 RPC® de fase inversa.
Numa forma de realização extremamente preferida, o processo para purificação da IL-18BP a partir de um fluido compreende os passos de: (a) Submeter o fluido a cromatografia de afinidade com ião metálico imobilizado; (b) Submeter o eluato da cromatografia de afinidade com ião metálico a cromatografia hidrófoba de interacção de carga; (c) Submeter o eluato da cromatografia hidrófoba de interacção de carga a cromatografia de troca catiónica; (d) Submeter o eluato da cromatografia de troca catiónica a cromatografia de interacção hidrófoba; (e) Submeter o eluato da cromatografia de interacção hidrófoba a cromatografia de fase inversa.
Embora seja preferida a ordem dos passos (a) a (e) acima, os passos do processo da invenção podem ser realizados por qualquer ordem que origine um produto 14 proteico purificado. Qualquer passo de purificação da invenção também pode ser realizado sozinho (isolado) para se conseguir algum grau de pureza ou para eliminar impurezas provenientes da célula hospedeira ou do meio. Assinale-se que neste processo de purificação preferido, a IL-18BP não se liga à resina de permuta catiónica e, deste modo, o eluato desta coluna é utilizado para processamento adicional. As outras resinas utilizadas no quadro do processo de purificação da invenção ligam a IL-18BP, ao passo que as impurezas não se ligam. Após os passos de ligação e lavagem, a IL-18BP é eluída em determinadas condições. Nestes passos, o eluato é novamente utilizado, respectivamente. 0 passo (a) é preferencialmente realizado numa coluna de sepharose quelante, tal como uma coluna de Sepharose Fast Flow quelante, com iões Zn2+ quelados. Preferencialmente, a ligação da IL-18BP é realizada a pH 8,5+0,1, preferencialmente em fosfato de sódio 50 mM e NaCl 0,5 M com este pH. Pode efectuar-se um passo de lavagem com cloreto de amónio 15 mM em tampão de equilíbrio. A eluição é preferencialmente realizada a pH 9,0+0,5, por exemplo a pH 8,7 ou a pH 9, por exemplo em acetato de amónio 0,075 M ou em acetato de amónio 0,06 M com este pH. O passo (b) é preferencialmente realizado numa coluna ΜΞΡ (derivado de 4-mercaptoetilpiridina), tal como MEP HyperCel® (LifeSciences). A ligação da IL-18BP é realizada preferencialmente a pH 6,1+0,1, por exemplo em PBS IX + 1 NaCl com este pH. A eluição é realizada preferencialmente a 15 ρΗ 8,4±0,1, por exemplo em tampão de fosfato 20 mM com propileno glicol a 35%, possuindo a mistura um pH 8,4±0,1. O passo (c) é preferencialmente realizado numa coluna carboximetil-sepharose (CM) . Este é um passo no qual o eluato é recolhido para purificação adicional. Este passo baseia-se no facto de em circunstâncias especificas relacionadas, por exemplo com as condições salinas e pH, a IL-18BP não se ligar à resina, enquanto as impurezas (por exemplo, proteínas de células hospedeiras, proteínas provenientes do soro) se ligam àquela. Preferencialmente, o passo (c) é realizado a pH 6,0+0,2, por exemplo na presença de MES 1 mM (ácido N-morfolinoetanossulfónico). O passo (d) é preferencialmente realizado numa coluna de fenil-sepharose, tal como uma coluna de Fenil-Sepharose Fast Flow. Preferencialmente, a ligação da IL-18BP é realizada a cerca de pH 9,1+0,2, por exemplo em borato de sódio 50 mM e sulfato de amónio 0,9 M ou sulfato de amónio 0,10 M com este pH. A eluição a partir da coluna de fenil-sepharose é preferencialmente realizada a pH 9,1±0,2 na presença de uma concentração elevada de sal, tal como em borato de sódio 50 mM 9,1±0,2, sulfato de amónio 0,15 M com este pH. O passo (e) é preferencialmente realizado numa coluna Source 30 RPC. A ligação da IL-18BP ao material da coluna é preferencialmente realizada a pH 9,1±0,2, por exemplo em tampão de borato de sódio 50 mM. A eluição é preferencialmente realizada utilizando um gradiente, 16 eluindo a IL-18BP em torno de 28-32% de 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA) em acetonitrilo.
Entender-se-á que as condições descritas acima em relação aos passos (a) até (e) da purificação também podem ser aplicadas quando se realiza apenas passos isolados da invenção ou (sub-)combinações de passos.
Noutra forma de realização preferida do presente processo de purificação são realizados um ou mais passos de ultrafiltração. A ultrafiltração é útil para eliminar componentes de baixo peso molecular nos eluatos resultantes de processos cromatográficos anteriores. Esta ultrafiltração permite eliminar solvente orgânico, TFA e sais do passo precedente, equilibrara a IL-18BP no tampão e concentrar a molécula até à concentração desejada. Esta ultraf iltração pode ser, por exemplo realizada em meio de ultrafiltração excluindo componentes com pesos moleculares inferiores a 5 kDa.
Preferencialmente, a ultrafiltração é realizada entre os passos (b) e (c), e/ou após o passo (e) . Mais preferencialmente são realizados dois passos de ultraf iltração, um entre os passos (b) e (c) e um após o passo (e).
Se a proteina purificada de acordo com o processo da invenção se destinar a administração em seres humanos é vantajoso incluir ainda no processo um ou mais passos de eliminação de vírus. Preferencialmente é realizado um passo de filtração para eliminação de vírus entre os passos (d) e (e) . É ainda mais preferido que o passo de filtração para 17 eliminação de vírus seja realizado após o passo (e) . Mais preferencialmente, o processo compreende pelo menos dois passos de eliminação de vírus um dos quais é realizado entre os passos (d) e (e), e o outro dos quais é realizado após o passo (e).
Se o volume inicial de fluido a partir do qual é purificada a IL-18BP for grande, pode ser vantajoso reduzir o volume de material capturando a proteína e ressuspendendo-a num volume mais pequeno de tampão antes de se iniciar o processo de purificação.
Consequentemente, o processo da invenção compreende ainda preferencialmente um passo inicial de captura, isto é um passo que é realizado antes de qualquer um dos passos de purificação supramencionados e preferencialmente antes do passo (a) do processo acima.
Numa forma de realização preferida, o passo de captura é realizado por cromatografia de troca iónica. Preferencialmente, a resina de troca iónica utilizada no passo de captura é uma matriz de permutador aniónico forte, tal como, por exemplo Q Sepharose Fast Flow. É extremamente preferido utilizar uma resina derivatizada com trimetilaminoetilo, tal como TMAE Fractogel® (ou TMAE HiCap®) como um material de permuta iónica. Vantajosamente, o passo de captura pode eliminar >60% dos contaminantes totais presentes no material em bruto.
Para facilitar a armazenagem ou transporte, por exemplo, o material pode ser congelado e descongelado antes e/ou após qualquer passo de purificação da invenção. 18
De acordo com a presente invenção, a IL-18BP a ser purificada pode ser nativa, isto é IL-18BP natural. Deste modo, ela pode ser purificada de qualquer fonte ou material natural, tal como, por exemplo de fluidos orgânicos tais como urina. A IL-18BP também pode ser proveniente de qualquer fonte animal ou humana. Preferencialmente, a IL-18BP a ser purificada é humana, e mais preferencialmente ela é IL-18BP recombinante. A IL-18BP recombinante pode ser produzida em sistemas de expressão procariotas, tais como em sistemas bacterianos como Escherichia coli. Ela também pode ser produzida em sistemas de expressão eucariotas, tais como células de levedura, insecto ou mamíferos. De acordo com a presente invenção, prefere-se expressar a IL-18BP em células de mamíferos tais como em linhas de células animais ou em linhas de células humanas. As células do ovário de hamster chinês (CHO) são um exemplo de uma linha de células que é particularmente adequada para a expressão de IL-18BP.
Se a IL-18BP a ser purificada é expressada por células de mamíferos que a segregam, o material de partida do processo de purificação da invenção é o sobrenadantes da cultura de células, também chamado colheita ou IL-18BP em bruto. Se as células forem cultivadas num meio contendo soro animal, o sobrenadante da cultura de células também contém proteínas séricas como impurezas.
Preferencialmente, as células que expressam a IL-18BP são cultivadas em condições sem soro. Neste caso, o material de partida do processo de purificação da invenção 19 é o sobrenadante da cultura de células sem soro que contém principalmente proteínas da célula hospedeira como impurezas. Se forem adicionados factores de crescimento ao meio de cultura de células, tal como, por exemplo insulina, estas proteínas também serão preferencialmente eliminadas durante o processo de purificação.
Uma vez que a IL- -18BP é uma proteína excretada, solúvel, ela é libertada para o sobrenadante da cultura de células, quer por meio do seu péptido de sinalização natural, quer por meio de um péptido de sinalização heterólogo, isto é um péptido de sinalização proveniente de outra proteína excretada a qual pode ser mais eficiente no sistema de expressão particular utilizado. 0 fluido a partir do qual é purificada a IL-18BP é, deste modo, preferencialmente um sobrenadante de cultura de células, tal como, por exemplo o sobrenadante de células CHO. 0 sobrenadante da cultura de células pode compreender soro proveniente de animal, se as células forem cultivadas em meio contendo soro. É preferido purificar a proteína a partir do sobrenadante de células que foram multiplicadas em meio sem soro, isto é em meio de cultura sem soro proveniente de feto de vitelo ou outras fontes animais. 0 termo "proteína de ligação à IL-18" é aqui utilizado analogamente a "IL-18BP". Este termo relaciona-se com proteínas de ligação à IL-18 tais como as definidas na wo 99/09063 ou em Novick et al., 1999. O termo IL-18BP inclui variantes de excisão-união e/ou isoformas das proteínas de ligação à IL-18, como as definidas em Kim et al., 2000, em particular as isoformas humanas a e c da IL-18BP. O termo "IL-18PB", como aqui utilizado, inclui ainda proteínas 20 mutantes, derivados funcionais, fracções activas, proteínas de fusão, proteínas circularmente permutadas e fragmentos da IL-18BP como definida na WO 99/09063. A IL-18BP objecto do processo de purificação de acordo com a presente invenção pode estar glicosilada ou não glicosilada, ela pode ser derivada de fontes naturais, tais como urina, ou ela pode ser preferencialmente produzida de modo recombinante. A expressão recombinante pode ser realizada em sistemas de expressão procariotas como E. coli ou em sistemas de expressão eucariotas e, preferencialmente, em mamíferos.
Como aqui utilizado o termo "proteínas mutantes" refere-se a análogos de uma IL-18BP, ou análogos de uma IL-18BP virai, nos quais um ou mais dos resíduos de aminoácidos de uma IL-18BP natural ou IL-18BP virai estão substituídos por resíduos de aminoácidos diferentes, ou foram eliminados ou adicionados um ou mais resíduos de aminoácidos à sequência natural de uma IL-18BP, ou uma IL-18BP virai, sem alterar consideravelmente a actividade dos produtos resultantes em relação à IL-18BP ou IL-18BP virai de tipo selvagem. Estas proteínas mutantes são preparadas por técnicas de síntese ou de mutagénese dirigida conhecidas, ou por qualquer outra técnica conhecida adequada para esse fim.
As proteínas mutantes de acordo com o que foi dito atrás incluem proteínas codificadas por um ácido nucleico, tal como ADN ou ARN, o qual hibridiza com ADN ou ARN, que codifica uma IL-18BP ou codifica uma IL-18BP virai (ambas descritas em W099/09063) em condições estringentes. O termo 21 "condições estringentes" refere-se às condições de hibridização e lavagem subsequente, as quais os técnicos médios na matéria referem convencionalmente como "estringentes". Ver Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., §§6.3 e 6.4 (1987, 1992). Sem restrições, os exemplos de condições estringentes incluem condições de lavagem 12-20 °C abaixo do Tm calculado para o hibrido em estudo, por exemplo, em 2 x SSC e 0,5% de SDS durante 5 minutos, 2 x SSC e 0,1% de SDS durante 15 minutos; 0,1 x SSC e 0,5% de SDS a 37 °C durante 30-60 minutos e depois 0,1 x SSC e 0,5% de SDS a 68 °C durante 30-60 minutos. Os técnicos médios nesta matéria compreendem que as condições de estringência também dependem do comprimento das sequências de ADN, sondas de oligonucleótidos (tal como 10-40 bases) ou sondas mistas de oligonucleótidos. Se forem utilizadas sondas mistas é preferível utilizar cloreto de tetrametilamónio (TMAC) em vez de SSC. Ver Ausubel, supra. A identidade reflecte uma relação entre duas ou mais sequências de polipéptidos ou duas ou mais sequências de polinucleótidos determinada comparando as sequências. Em geral, identidade refere-se a uma correspondência exacta nucleótido a nucleótido ou aminoácido a aminoácido nas duas sequências de polinucleótidos ou polipéptidos, respectivamente, ao longo do comprimento das sequências a serem comparadas.
Para sequências onde não existe uma correspondência exacta pode determinar-se uma "% de identidade". Duma maneira geral, as duas sequências a serem comparadas são alinhadas para dar uma correlação máxima entre as 22 sequências. Isto pode incluir a inserção de "lacunas" em qualquer uma ou ambas as sequências, para aumentar o grau de alinhamento. A % de identidade pode ser determinada ao longo de todo o comprimento de cada uma das sequências a serem comparadas (o chamado alinhamento global), que é particularmente adequado para sequências do mesmo comprimento ou com comprimentos muito semelhantes, ou ao longo de comprimentos definidos mais curtos (o chamado alinhamento local) que é mais adequado para sequências de comprimento diferente.
Os métodos para comparar a identidade e homologia de duas ou mais sequências são bem conhecidas na técnica. Deste modo pode utilizar-se, por exemplo, os programas disponíveis no Pacote de Análise de Sequências Wisconsin, versão 9.1 (Devereux J et al., 1984), por exemplo os programas BESTFIT e GAP, para determinar a % de identidade entre dois polinucleótidos e a % de identidade e a % de homologia entre duas sequências de polipéptidos. BESTFIT utiliza o algoritmo de "homologia local" de Smith e Waterman (1981) e determina a região com melhor similaridade entre as duas sequências. Também são conhecidos na técnica outros programas para determinar a identidade e/ou similaridade entre sequências, por exemplo a família BLAST de programas (Altschul S F et al, 1990, Altschul S F et al, 1997, acessível através da página de entrada da NCBI em www.ncbi.nim.nih.gov) e FASTA (Pearson W R, 1990) .
Qualquer uma das proteínas mutantes tem preferencialmente uma sequência de aminoácidos suficientemente duplicativa da de uma IL-18BP, ou 23 suficientemente duplicativa de uma IL-18BP virai, para ter uma actividade consideravelmente semelhante à IL-18BP. Uma actividade da IL-18BP é a sua capacidade de ligação à IL-18. Desde que a proteina mutante possua uma actividade substancial de ligação à IL-18, ela pode ser utilizada na purificação de IL-18, tal como por meio de cromatografia de afinidade e pode, deste modo, ser considerada como tendo uma actividade consideravelmente semelhante à IL-18BP. Assim, pode determinar-se se uma dada proteina mutante tem consideravelmente a mesma actividade da IL-18BP por meio de experiências de rotina compreendendo submeter um tal proteina mutante, por exemplo, a um ensaio de competição em sanduíche simples para determinar se ela se liga ou não a uma IL-18 apropriadamente marcada, tal como um radioimunoensaio ou ensaio ELISA.
Numa forma de realização preferida, qualquer proteína mutante a ser purificada tem pelo menos 40% de identidade ou homologia com a sequência de uma IL-18BP ou de um homólogo da IL-18BP codificado viralmente, como definido na WO 99/09063. Mais preferencialmente, ela tem pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou, muito preferencialmente, pelo menos 90% de identidade ou homologia com aquela.
As proteínas mutantes de polipéptidos de IL-18BP ou as proteínas mutantes de IL-18BP virais, que podem ser purificadas de acordo com a presente invenção, ou o ácido nucleico que as codificam, incluem um conjunto finito de sequências essencialmente correspondentes como péptidos ou polinucleótidos de substituição as quais podem ser obtidas rotineiramente por um técnico médio na matéria, sem 24 experimentação desnecessária, com base nos ensinamentos e directrizes aqui apresentados.
As alterações preferidas para as proteínas mutantes de acordo com a presente invenção são aquelas que são conhecidas como substituições "conservadoras". As substituições conservadoras de aminoácidos de polipéptidos ou proteínas da IL-18BP ou das IL-18BP virais, podem incluir aminoácidos sinónimos dentro de um grupo os quais têm propriedades físico-químicas suficientemente semelhantes para que a substituição entre membros do grupo conserve a função biológica da molécula (Grantham, 1974) . É evidente que também podem ser efectuadas inserções ou delecções de aminoácidos nas sequências definidas acima sem que se altere a sua função, em particular se as inserções ou delecções envolverem apenas alguns aminoácidos, por exemplo, menos de trinta, e preferencialmente menos de dez, e não eliminarem ou deslocarem aminoácidos que sejam críticos para uma conformação funcional, por exemplo, resíduos de cisteína. As proteínas e proteínas mutantes produzidas por tais delecções e/ou inserções caem dentro do âmbito da presente invenção.
Preferencialmente, os grupos de aminoácidos sinónimos são aqueles definidos no Quadro 1. Mais preferencialmente, os grupos de aminoácidos sinónimos são aqueles definidos no Quadro 2; e muito preferencialmente os grupos de aminoácidos sinónimos são aqueles definidos no Quadro 3. 25
QUADRO I
Grupos Preferidos de Aminoácidos Sinónimos
Aminoácido Grupo Sinónimo
Ser Ser, Thr, Gly, Asn Arg Arg, Gin, Lys, Glu, His Leu Ile, Phe, Tyr, Met, Vai, Leu Pro Gly, Ala, Thr, Pro Thr Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gin, Thr Ala Gly, Thr, Pro, Ala Vai Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Vai Gly Ala, Thr, Pro, Ser, Gly lie Met, Tyr, Phe, Vai, Leu, Ile Phe Trp, Met, Tyr, Ile, Vai, Leu, Phe Tyr Trp, Met, Phe, Ile, Vai, Leu, Tyr Cys Ser, Thr, Cys His Glu, Lys, Gin, Thr, Arg, His Gin Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gin Asn Gin, Asp, Ser, Asn Lys Glu, Gin, His, Arg, Lys Asp Glu, Asn, Asp Glu Asp, Lys, Asn, Gin, His, Arg, Glu Met Phe, Ile, Vai, Leu, Met Trp Trp 26
QUADRO II
Grupos Mais Preferidos de Aminoácidos Sinónimos
Aminoácido Grupo Sinónimo
Ser Ser Arg His, Lys, Arg Leu Leu, Ile, Phe, Met Pro Ala, Pro Thr Thr Ala Pro, Ala Vai Vai, Met, Ile Gly Gly lie lie, Met, Phe, Vai, Leu Phe Met, Tyr, Ile, Leu, Phe Tyr Phe, Tyr Cys Cys, Ser His His, Gin, Arg Gin Glu, Gin, His Asn Asp, Asn Lys Lys, Arg Asp Asp, Asn Glu Glu, Gin Met Met, Phe, Ile, Vai, Leu Trp Trp 27
QUADRO III
Grupos Muito Preferidos de Aminoácidos Sinónimos Aminoácido Grupo Sinónimo
Ser Ser Arg Arg Leu Leu, Ile, Pro Pro Thr Thr Ala Ala Vai Vai Gly Gly Ile Ile, Met, Phe Phe Tyr Tyr Cys Cys, Ser His His Gin Gin Asn Asn Lys Lys Asp Asp Glu Glu Met Met, Ile, Trp Met
Exemplos de produção de substituições de aminoácidos em proteínas que podem ser utilizados para obter proteínas mutantes de polipéptidos ou proteinas da IL-18BP, ou proteínas mutantes de IL-18BP virais, para serem utilizadas na presente invenção incluem quaisquer passos metodológicos conhecidos, como apresentados nas patente US 4 959 314, 4 588 585 e 4 737 462, de Mark et al; 5 116 943 de Koths et al., 4 965 195 de Namen et al; 4 879 111 de Chong et al; e 28 5 017 691 de Lee et al; e proteínas substituídas com lisina apresentadas na patente US n° 4 904 584 (Shaw et al). O termo "proteína de fusão" refere-se a um polipéptido compreendendo uma IL-18BP, ou uma IL-18BP virai, ou uma proteína mutante ou fragmento desta, fundido com outra proteína, a qual, por exemplo, tem um tempo de residência prolongado nos fluidos orgânicos. Uma IL-18BP ou uma IL-18BP virai pode, deste modo, ser fundida com outra proteína, polipéptido ou semelhante, por exemplo, uma imunoglobulina ou um fragmento desta. "Derivados funcionais" como aqui utilizado cobre derivados de IL-18BP ou de um IL-18BP virai, e as suas proteínas mutantes e proteínas de fusão, as quais podem ser preparadas a partir de grupos funcionais que ocorrem como cadeias laterais nos resíduos ou dos grupos N- ou C-terminais, por meios conhecidos na técnica, e estão incluídos na invenção desde que eles permaneçam farmaceuticamente aceitáveis, isto é não destruam a actividade da proteína a qual é essencialmente semelhante à actividade da IL-18BP, ou IL-18BP virais, e não confiram propriedades tóxicas às composições que os contenham.
Estes derivados podem, for exemplo, incluir cadeias laterais de polietileno glicol, as quais podem mascarar sítios antigénicos e prolongar a residência de uma IL-18BP ou uma IL-18BP virai nos fluidos orgânicos. Outros derivados incluem ésteres alifáticos dos grupos carboxilo, amidas dos grupos carboxilo por reacção com amoníaco ou com aminas primárias ou secundárias, derivados de N-acilo de grupos amino livres de resíduos de aminoácidos preparados 29 com unidades acilo (por exemplo grupos alcanoilo ou aroilo carbocíclicos) ou derivados O-acilo de grupos hidroxilo livres (por exemplo o de resíduos serilo ou treonilo) preparados com unidades acilo.
Como "fracções activas" de uma IL-18BP, ou uma IL-18BP virai, de proteínas mutantes e proteínas de fusão, a presente invenção cobre qualquer fragmento ou precursores da cadeia de polipéptido da molécula de proteína sozinha ou em conjunto com moléculas ou resíduos associados ligados naqueles, por exemplo, resíduos de açúcar ou fosfato, ou agregados da molécula de proteína ou os resíduos de açúcar por si só, desde que a referida fracção possua uma actividade essencialmente semelhante à IL-18BP. 0 termo "sais" aqui refere-se tanto aos sais de grupos carboxilo como aos sais de adição de ácido de grupos amino da molécula inibidora da IL-18, ou seus análogos. Os sais de um grupo carboxilo podem ser preparados por meios conhecidos na técnica e incluem sais inorgânicos, por exemplo, sais de sódio, cálcio, amónio, férrico ou zinco, e semelhantes, e sais com bases orgânicas como as preparadas, por exemplo, com aminas, tais como trietanolamina, arginina ou lisina, piperidina, procaína e semelhantes. Os sais de adição de ácido incluem, por exemplo, sais com ácidos minerais, tais como, por exemplo, ácido clorídrico ou ácido sulfúrico, e sais com ácidos orgânicos, tais como, por exemplo, ácido acético ou ácido oxálico. Evidentemente, qualquer um desses sais tem de reter a actividade biológica do inibidor da IL-18, tal como a indução de iFN-gama em células sanguíneas. 30
As sequências de IL-18BP e das suas variantes de excisão-união/isoformas podem ser retiradas de W099/09063 ou de Novick et al., 1999, bem como de Kim et al., 2000.
Os derivados funcionais da IL-18BP podem ser conjugados com polímeros para melhorar as propriedades da proteína, tais como a estabilidade, semivida, biodisponibilidade, tolerância pelo organismo humano ou imunogenicidade. Para atingir este objectivo, a IL18-BP pode ser ligada, por exemplo a Polietilenoglicol (PEG). A PEGilação pode ser realizada, por exemplo, por métodos conhecidos descritos na WO 92/13095. Consequentemente, numa forma de realização preferida, o derivado funcional compreende pelo menos uma unidade ligada a um ou mais grupos funcionais, os quais ocorrem como uma ou mais cadeias laterais nos resíduos de aminoácidos. Uma forma de realização na qual a unidade é uma unidade polietileno glicol (PEG) é extremamente preferida.
Noutra forma de realização preferida da invenção, a IL-18BP compreende uma imunoglobulina de fusão, isto é o inibidor da IL-18 é uma proteína de fusão compreendendo a totalidade ou parte de uma proteína de ligação à IL-18, a qual está fundida com a totalidade ou uma fracção de uma imunoglobulina. Os métodos para preparar proteínas de fusão de imunoglobulina são bem conhecidos na técnica, tais como, por exemplo, os descritos na WO 01/03737. O especialista na técnica compreenderá que a proteína de fusão da invenção resultante retém a actividade biológica da IL-18BP, em particular a ligação à IL-18. A fusão pode ser directa, ou via um péptido de ligação curto, o qual pode ser tão pequeno quanto 1 até 3 resíduos de aminoácidos de 31 comprimento ou mais comprido, por exemplo, 13 residuos de aminoácidos de comprimento. 0 referido grupo de ligação pode ser, por exemplo, um tripéptido da sequência E-F-M (Glu-Phe-Met) ou uma sequência de ligação com 13 aminoácidos compreendendo Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met introduzida entre a sequência de IL-18BP e a sequência de imunoglobulina. A proteina de fusão resultante tem melhores propriedades, tais como um tempo de residência prolongado nos fluidos orgânicos (semivida), maior actividade especifica, maior nivel de expressão ou a purificação da proteina de fusão está facilitada.
Numa forma de realização preferida, a IL-18BP está fundida com a região constante de uma molécula de Ig. Preferencialmente, ela está fundida com regiões de cadeia pesada como, por exemplo, os domínios CH2 e CH3 da IgGl humana. A preparação de proteínas de fusão específicas compreendendo IL-18BP e uma fracção de uma imunoglobulina é descrita, por exemplo, no exemplo 11 da wo 99/09063. Outras isoformas de moléculas de Ig também são adequadas para a preparação de proteínas de fusão de acordo com a presente invenção, tais como as isoformas IgG2 ou IgG4, ou outras classes de Ig como, por exemplo, a IgM ou IgA. As proteínas de fusão podem ser monoméricas ou multiméricas, hetero- ou homomultiméricas.
Num terceiro aspecto, a invenção relaciona-se com uma proteína purificada pelo processo de purificação de acordo com a invenção. No que se segue, esta proteína é também chamada "IL-18BP purificada". De um modo preferido, esta IL-18BP purificada é uma IL-18BP extremamente purificada. A IL-18BP extremamente purificada é determinada, por exemplo, 32 pela presença de uma única banda num gel PAGE revelado com prata depois de aplicar a proteína numa quantidade de 2 mcg por ponto. A IL-18BP purificada também pode ser definida como se movendo como um único pico em HPLC. A preparação de IL-18BP obtida do processo de purificação da invenção pode conter menos do que 20% de impurezas, preferencialmente menos do que 10%, 5%, 3%, 2% ou 1% de impurezas, ou ela pode ser purificada até à homogeneidade, isto livre de qualquer contaminante proteináceo.
Tendo-se agora descrito totalmente esta invenção, os especialistas na técnica compreenderão que a mesma pode ser realizada dentro de uma gama lata de parâmetros, concentrações e condições equivalentes sem que se saia do espírito e âmbito da invenção e sem experimentação excessiva.
Embora esta invenção tenha sido descrita em relação a formas de realização específicas da mesma, entender-se-á que ela pode ser sujeita a outras modificações. Este pedido cobre quaisquer variações, utilizações ou adaptações da invenção que sigam, duma maneira geral, os princípios da invenção e inclui desvios à actual descrição resultantes da prática conhecida ou corrente da técnica à qual pertence a invenção e como pode ser aplicada às características essenciais como descritas nas reivindicações apensas. A referência a passos de métodos conhecidos, passos de métodos convencionais, métodos conhecidos ou métodos convencionais não constitui qualquer reconhecimento de que 33 qualquer aspecto, descrição ou forma de realização da presente invenção esteja descrito, ou seja ensinado ou sugerido na técnica relevante. A descrição precedente das formas de realização especificas revelarão de forma tão completa a natureza geral da invenção que outros podem, aplicando o conhecimento na perícia da técnica (incluindo os conteúdos das referências aqui citadas), modificar e/ou adaptar facilmente estas formas de realização a outras aplicações, sem experimentação excessiva, sem que se saia do conceito geral da presente invenção. Consequentemente, estas adaptações e modificações estão dentro do significado e gama de equivalentes das formas de realização descritas, com base nos ensinamentos e orientações aqui apresentados. Entenda-se que a fraseologia ou terminologia aqui utilizada é para efeitos de descrição e não de restrição, pelo que a terminologia ou fraseologia da presente especificação é para ser interpretada pelo especialista à luz dos ensinamentos e orientações aqui apresentados, associados ao conhecimento de um técnico médio na matéria.
EXEMPLO 1: PURIFICAÇÃO DE IL-18BP HUMANA, RECOMBINANTE A PARTIR DO SOBRENADANTE DE CÉLULAS CHO SEM SORO 1. Passo de captura A IL-18BP presente em 300 1 de sobrenadante de cultura de células sem soro de células CHO que expressam a IL-18BP foi retira numa resina de Q Sepharose FF. O material retido foi ajustado até pH 8,5+0,1 e condutividade de 50+5 mS/cm adicionando algumas gotas de ácido orto-fosfórico a 35% 34 (Η3ΡΟ4) e NaCl sólido numa quantidade correspondente a cerca de 0,35M. 2. Processo de purificação 0 processo de purificação, começando a partir do material retido de acordo com (1) acima, é descrito em pormenor abaixo. Na Fig. 1 é apresentado um diagrama de fluxos do processo de purificação.
Duma maneira geral, os valores de pH e condutividade referem-se a valores a uma temperatura de +25 °C.
As colunas foram continuamente monitorizadas com monitores de UV, medindo a absorvância a 280 nm. 2.1. Passo a: IMAC em Sepharose Fast Flow quelante
Equipamento • Coluna cromatográfica: XK 1,6 x 20 cm (Amersham Biosciences); • Monitor de UV (comprimento do percurso óptico 2,5 mm) equipado com um registador de dois canais (Amersham Biosciences ou equivalente); • Bomba peristáltica (Minipuls Gilson ou equivalente); • Espectrofotómetro de UV (Shimadzu ou equivalente); • Medidor de pH (Metrohm ou equivalente); • Condutivimetro (Metrohm ou equivalente); • Balança (Mettler Toledo ou equivalente). 35
Materiais • Resina Sepharose Fast Flow quelante (Amersham Biosciences); • Hidróxido de Sódio em pastilhas - (Merck); • Sulfato de Cobre (Merck); • Ácido Acético Glacial (Merck); • Ácido Etilenodiaminotetracético - EDTA - (Fluka); • Cloreto de sódio - NaCl - Merck; • Água purificada (Modulab ou equivalente); • Hidrogenofosfato dissódico di-hidratado - Merck; • Acetato de Amónio - Merck; • Solução de Amoníaco a 25% - Merck; • Ácido orto-fosfórico a 85% - Merck; • Solução de Hidróxido de Sódio a 50% - Baker.
Tampões e Soluções
• Solução de carga de metal: Sulfato de Cobre 0,2 M • Água acidificada • Tampão de equilíbrio: Fosfato de sódio 50 mM pH 8,5+0,1, NaCl 0,5 M. • Tampão de eluição: Acetato de Amónio 0,075 M pH 9,0+0,1
• Solução de regeneração: Fosfato de sódio 20 mM pH 5,8+0,3, NaCl 0,5 M, EDTA 50 mM
• Solução de sanitização: NaOH 0,5 M
Empacotou-se a coluna com resina Sepharose Fast Flow quelante seguindo as instruções do fabricante. Para sanitização, lavou-se a coluna com pelo menos 3 BV de NaOH 36 0,5 M, incubou-se durante 1 hora à temperatura ambiente e lavou-se em seguida a coluna com 3 BV de água purificada.
Descongelou-se 220-300 mg de r-hlL-18BP concentrada obtida a partir do passo de captura descrito acima em (1) e ajustou-se o pH até 8,5±0,1, condutividade 50±5 mS/cm adicionando algumas gotas de ácido orto-fosfórico a 35% (H3PO4) e NaCl sólido na quantidade correspondente a cerca de 0,35M.
Eluiu-se em primeiro lugar a coluna cromatográfica com 5-4 BV (volumes do leito) de água acidificada até o pH ser <4,5. Em seguida, lavou-se a coluna com 3 BV de sulfato de cobre 0,2 Me 4 BV de água acidificada até a absorvância atingir a linha de base.
Em seguida, equilibrou-se a coluna passando 6 ou mais BV de tampão de equilíbrio, fosfato de sódio 50 mM pH 8,5+0,1, NaCl 0,5 M, condutividade 50+5 mS/cm através da coluna. Verificou-se o pH e a condutividade e prosseguiu-se a lavagem se os parâmetros do efluente da coluna estivessem fora dos valores alvo, isto é pH 8,5+0,1, condutividade 50+5 mS/cm. O material de partida, isto é r-hIL-18BP pós-captura preparado como acima, foi depois introduzido na coluna. Uma vez concluída a transferência da amostra, lavou-se a coluna com 5-10 BV de tampão de equilíbrio. Rejeitou-se estas fracções, uma vez que elas continham apenas impurezas da cultura de células. 37
Iniciou-se a eluição com acetato de amónio 0,075 M pH 9,0±0,1, condutividade 7,6±0,5 mS/cm. A r-hIL-18BP começou a eluir como um pico principal após cerca de 0,5 BV do inicio.
Recolheu-se 3-5 BV do pico principal, começando o pico principal quando a DO em linha aumentou a pique. Esta fracção continha r-hlL-18BP semipurifiçada.
Uma vez concluída a eluição, lavou-se a coluna com 3-5 BV de tampão de regeneração contendo edta. As fracções amostradas continham cobre retirado da resina, bem como impurezas da cultura de células.
Para sanitização, lavou-se a coluna com pelo menos 3 BV de NaOH 0,5 M, incubou-se durante 1 hora e lavou-se em seguida a coluna com 3 BV de água purificada. Lavou-se então a coluna com pelo menos 3 BV de solução de armazenagem, NaOH 10 mM e guarda-se à temperatura ambiente até ao ciclo seguinte.
2.2. Passo (b): HIC/IEC em Hypercel MEP
Este passo é realizado em resina de MEP, uma resina de cromatografia hidrófoba de indução de carga, a qual é uma mistura entre a cromatografia de interacção hidrófoba (HIC) e a cromatografia de troca iónica (IEC).
Equipamento • Coluna cromatográf ica: XK 1,6 x 20 cm (Amersham Biosciences); 38 • UV monitor (comprimento do percurso óptico 2,5 mm) equipado com um registador de dois canais (Amersham Biosciences ou equivalente); • Bomba peristáltica (Minipuls Gilson ou equivalente); • Espectrofotómetro de UV (Shimadzu ou equivalente); • Medidor de pH (Metrohm ou equivalente); • Condutivimetro (Metrohm ou equivalente); • Balança (Mettler Toledo ou equivalente).
Materiais • r-hIL-18BP pós-IMAC; • Resina de MEP HyperCel® (BioSepra-Cypergen
Biosystems); • Hidróxido de Sódio em pastilhas - (Merck); • Cloreto de Potássio - (Merck); • Ácido Etilenodiaminotetracético - EDTA - (Fluka); • Cloreto de sódio - NaCl - Merck; • Água purificada (Modulab ou equivalente); • Hidrogenofosfato dissódico hepta-hidratado Merck; • Hidrogenofosfato dissódico monobásico di-hidratado - Merck; • Fosfato de Potássio - Merck; • 1,2-Propanodiol (Propileno glicol) - Merck; • Ácido orto-fosfórico a 85% - Merck; • Solução de hidróxido de sódio a 50% - Baker. 39
Tampões e Soluções • Tampão de equilíbrio: Soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) IX pH 6,1+0,1, 1 NaCl, condutividade 95+5 mS/cm • Tampão de lavagem: PBS IX pH 6,1+0,1, condutividade 16+2 mS/cm
• Tampão de eluição: tampão de fosfato 20 mM pH 8,4+0,1, 35% de propileno glicol, condutividade 1,1+0,3 mS/cm • Solução de regeneração 1: Água purificada
• Solução de regeneração 2: EDTA 100 mM
• Solução de sanitização: NaOH 1 M
Empacotou-se a coluna com resina de MEP HyperCel® seguindo as instruções do fabricante. A IL-18BP pós-lMAC, resultante do passo (a), foi reforçada com NaCl 1M sob agitação até uma condutividade é 95+5 mS/cm.
Para sanitização da coluna, lavou-se a coluna com pelo menos 1 BV de NaOH 0,5 M, depois lavou-se com 3-5 BV de água purificada.
Para equilibrar a coluna, lavou-se a coluna com 6 ou mais BV de tampão de equilíbrio, PBS IX pH 6,1+0,1, 1 NaCl, condutividade 95+5 mS/cm. Verificou-se o pH e a condutividade, e prosseguiu-se a lavagem se os parâmetros do efluente da coluna estivessem fora dos valores alvo, isto é pH 6,1+0,1, 1 NaCl, condutividade 95+5 mS/cm. 40
Em seguida, carregou-se o material com o material resultante do passo (a).
Após a carga, lavou-se a coluna com 6 BV de tampão de equilíbrio PBS IX pH 6,1±0,1, 1 NaCl, condutividade 95±5 mS/cm. Rejeitou-se esta fracção, uma vez que ela continha apenas impurezas da cultura de células. Em caso de sobrecarga da coluna, esta fracção pode conter alguma r-hIL-18BP.
Em seguida, lavou-se a coluna com 10 BV de tampão de lavagem PBS IX pH 6,1+0,1, condutividade 16+2 mS/cm. Rejeitou-se também esta fracção, contendo apenas impurezas da cultura de células. A fracção pode conter alguma r-hiL-18BP no caso de sobrecarga da coluna.
Em seguida, iniciou-se a eluição com tampão de eluição tampão de fosfato 20 mM pH 8,4+0,1, 35% de propileno glicol condutividade 0,8+0,1 mS/cm. A r-hIL-18BP começou a eluir como um pico principal após cerca 0,5 BV do início. Recolheu-se 8-10 BV do pico principal, começando a partir do aumento a pique na absorvância, aproximadamente após os primeiros 0,5 BV (rejeitados), de acordo com o perfil cromatográfico. Este eluato continha r-hIL-18BP semipurifiçada.
Para regeneração, lavou-se a coluna com pelo menos 6 BV de solução de regeneração 1, seguida de 10 BV de solução de regeneração 2. Deixou-se a coluna em solução de regeneração dum dia para o outro para melhorar mais o efeito de regeneração. Lavou-se então a coluna com pelo 41 menos 6 BV de água purificada. Estas fracçoes contendo impurezas da cultura de células foram rejeitadas.
Para sanitização, lavou-se a coluna com pelo menos 6 BV de NaOH 1M, parou-se o caudal durante 1 hora e lavou-se então a coluna com pelo menos 6 BV de água purificada.
Para armazenagem, lavou-se a coluna com pelo menos 3 BV de solução de armazenagem, NaOH 0,1 M e armazenou-se à temperatura ambiente até ao ciclo seguinte.
2.3. Passo intermediário: ULTRAFILTRAÇÃO
Equipamento • Equipamento de ultrafiltração Vivaflow 200, limite de 5000D (RC, PES ou HydroSart) Sartorius ou equivalente; • Bomba peristáltica tipo Masterflex ou equivalente; • Espectrofotómetro de UV (Shimadzu ou equivalente); • Medidor de pH (Metrohm ou equivalente); • Condutivimetro (Metrohm ou equivalente); • Balança (Mettler Toledo ou equivalente).
Materiais • r-hIL-18BP pós-MEP intermediária; • Hidróxido de Sódio em pastilhas - Merck; • Água purificada (Modulab ou equivalente).
Soluções para Diafiltração 42 • Água purificada pelos sistemas Modulab ou Milli Q.
• Solução de sanitização: NaOH 0,5 M
Procedimento O passo de ultrafiltração foi realizado à temperatura ambiente (+20±5 °C).
Para sanitização do ultrafiltro, filtrou-se cerca de 500 mL de NaOH 0,5 M durante pelo menos 30 minutos e lavou-se então o ultrafiltro com água purificada até o pH do permeato ser inferior a 7,5.
Diluiu-se a fracção pós-MEP a 1:2 com água purificada, e filtrou-se no ultrafiltro. Concentrou-se a solução até cerca de 1-2/10 do volume de partida e submeteu-se a fracção de retentato a diálise contra água purificada até a condutividade do retentato ser <100 με/αη. Ajustou-se a condutividade do retentato após diluição com água até um volume de cerca de 150-200 mL.
Recolheu-se a fracção de retentato e lavou-se o ultrafiltro com água purificada. Recolheu-se as fracções de lavagem e juntou-se com a fracção de retentato (volume final de 200-250 mL). O ultrafiltro foi sanitizado filtrando 500 mL de NaOH 0,5 M, durante não menos do que 30 minutos e seguida de lavagem do ultrafiltro com água purificada até o pH do permeato ser inferior a 7,5. 43 0 ultrafiltro foi conservado em NaOH 0,05M a +4 °C±3 °C até ao ciclo seguinte. 2.4. passo (c): IEC em CM-Sepharose Fast Flow
Equipamento • Coluna cromatográfica: AC10/20 cm (Amersham Biosciences) ; • Monitor de UV (comprimento do percurso óptico 2,5 mm) equipado com um registador de dois canais (Amersham Biosciences ou equivalente); • Bomba peristáltica (Minipulse Gilson ou equivalente); • Espectrofotómetro de UV (Shimadzu ou equivalente); • Medidor de pH (Metrohm ou equivalente); • Condutivimetro (Metrohm ou equivalente); • Balança (Mettler Toledo ou equivalente).
Materiais • r-hIL-18BP intermediária, ultrafiltrada, pós-MEP; • Resina de CM-Sepharose FF (Amersham Biosciences); • Hidróxido de Sódio em pastilhas - Merck; • MES (ácido 2-N-[Morfolino]etanossulfónico) (Sigma ou equivalente); • Água purificada (Modulab ou equivalente); • Cloreto de sódio - Merck.
Tampões e Soluções 44 • Tampão de pré-equilíbrio: MES 20 mM pH 5,0+0,5 condutividade 150±50 μsi/cm • Equilíbrio: MES 1 mM, pH 6,0+0,2 condutividade 45±15μ3ί/cm
• Solução de regeneração: NaCl 1,5M
• Solução de sanitização: NaOH 0,5 M
• Solução de armazenagem: NaOH 0,01 M
Empacotou-se a coluna com resina CM-Sepharose Fast Flow seguindo as instruções do fabricante.
Ajustou-se a r-hIL-18BP ultrafiltrada, pós-MEP (ver passo (b)) até pH 6,0+0,2 com algumas gotas de MES 20 mM pH 5+0,5 e condutividade 100+15 με/cm imediatamente antes de se transferir para a coluna.
Para sanitização da coluna, lavou-se a coluna com 1 BV de NaOH 0,5 M e lavou-se com 15-20 BV de água purificada.
Em seguida, pré-equilibrou-se a coluna passando através da coluna 15-20 BV de MES 20 mM pH 5+0,5, condutividade 150+50 με/αη. Verificou-se o pH e a condutividade, e prosseguiu-se a lavagem se os parâmetros do efluente da coluna estivessem fora dos valores alvo, isto é pH 5,0+0,5, condutividade 150+50 με/απ.
Em seguida, equilibrou-se a coluna passando através da coluna 5 ou mais BV de tampão de equilíbrio, MES 1 mM pH 6,0+0,2, condutividade 45+15 μΞ/αη. Verificou-se o pH e a condutividade, e prosseguiu-se a lavagem se os parâmetros 45 do efluente da coluna estivessem fora dos valores alvo, pH 6,0±0,2, condutividade 45±15 με/οη.
Após equilíbrio transferiu-se a r-hIL-18BP, preparada como acima. Recolheu-se o eluato assim que a absorvância começou a subir, uma vez que esta fracção contém a r-hlL-18BP semipurifiçada.
Uma vez concluída a carga da amostra, lavou-se a coluna com 3-4 BV de tampão de equilíbrio, MES 1 mM pH 6+0,2, condutividade 45+15 pS/cm e recolheu-se continuamente o eluato até a absorvância atingir a linha de base.
Após a recolha, ajustou-se imediatamente a solução até pH 9,1+0,1 adicionando tetraborato de sódio 50 mM. As fracções recolhidas continham r-hIL-18BP semipurifiçada.
Para regeneração da coluna, lavou-se a coluna com pelo menos 4 BV de tampão de regeneração NaCl 1,5 M. Recolheu-se amostras e rejeitou-se a fracção. Esta fracção contém impurezas da cultura de células e isoformas mais básicas da r-hIL-18BP.
Para sanitização, lavou-se a coluna com pelo menos 3 BV de NaOH 0,5 M, parou-se o caudal durante 1 hora e lavou-se em seguida a coluna com 3 BV de água purificada.
Para armazenagem, lavou-se a coluna com pelo menos 3 BV de solução de armazenagem e armazenou-se em seguida até ao ciclo seguinte. 46
2.5. Passo (d): Interacgão hidrófoba em Fenil-Sepharose FF HS
Equipamento • Coluna cromatográfica: XK16/20 (Amersham
Biosciences); • Monitor de UV (comprimento do percurso óptico 2,5 mm) equipado com registador de dois canais (Amersham Biosciences ou equivalente), • Bomba peristáltica (Minipulse 2 Gillson ou equivalente); • Espectrofotómetro de UV (Shimadzu ou equivalente); • Medidor de pH (Metrohm ou equivalente); • Condutivimetro (Metrohm ou equivalente); • Balança (Mettler Toledo ou equivalente).
Materiais • r-hlL-18BP intermediária pós-CM; • Resina Fenil-Sepharose FF HS (Amersham Biosciences); • Tetraborato dissódico deca-hidratado-Merck; • Sulfato de Amónio (Merck); • Água purificada por Modulab ou equivalente; • Hidróxido de Sódio em pastilhas - Merck; • Solução de NaOH a 50% - J.T. Baker. 47
Tampões e Soluções
• Tampão de equilíbrio: borato de sódio 50 mM 9,1+0,2, sulfato de amónio 0,9M, condutividade 122+6 mS • Tampão de eluição: borato de sódio 50 mM 9,1+0,2, sulfato de amónio 0,15 M, condutividade 30+2 mS/cm • Tampão de regeneração: Água purificada
• Solução de sanitização: NaOH 0,5 M • Empacotou-se a coluna com resina Fenil-Sepharose FF HS seguindo as instruções do fabricante.
Para preparação do material de partida, à IL-18BP pós-CM (resultado do passo (c)) adicionou-se sulfato de amónio sólido até uma concentração de 0,9M. Uma vez concluída a dissolução do sal, ajustou-se o material até pH 9,1+0,2 adicionando NaOH a 50% em solução.
Para sanitização da coluna, lavou-se a coluna com pelo menos 1 BV de NaOH 0,5 M e lavou-se a coluna com 6 BV de água purificada.
Equilibrou-se a coluna passando através da coluna 5-7 ou mais BV de tampão de equilíbrio: borato de sódio 50 mM pH 9,1+0,2, sulfato de amónio 0,9 M, condutividade 122+6 mS. Verificou-se o pH e a condutividade, e prosseguiu-se a lavagem se os parâmetros do efluente da coluna estivessem fora dos valores alvo, isto é pH 9,1+0,2, condutividade 122+6 mS. 48 0 material de partida, isto é a r-hIL-18BP pós-CM, foi depois introduzida na coluna. Uma vez concluída a carga da amostra, lavou-se a coluna com 7-9 BV de tampão de equilíbrio. Esta fracção contém impurezas residuais da cultura de células.
Iniciou-se a eluição com tampão de eluição borato de sódio 50 mM pH 9,1+0,2, sulfato de amónio 0,15 M, condutividade 30+2 mS/cm. A r-hIL-18BP começou a eluir como um pico principal após cerca de 0,5-0,8 BV do inicio. Recolheu-se 6-8 BV do pico principal, começando a partir do aumento na absorvância. Esta fracção de eluição continha r-hIL-18BP semipurifiçada.
Uma vez concluída a eluição, regenerou-se a coluna lavando-a com pelo menos 3 BV de água purificada. Rejeitou-se esta fracção, uma vez que ela contém impurezas da cultura de células e formas agregadas de IL-18BP.
Para sanitização, lavou-se a coluna com pelo menos 3 BV de NaOH 0,5 M, parou-se o caudal durante 1 hora e lavou-se em seguida a coluna com 6 BV de água purificada.
Para armazenagem, lavou-se a coluna com pelo menos 3 BV de solução de armazenagem, NaOH 10 mM e armazenou-se a coluna à temperatura ambiente até ao ciclo seguinte.
2.6. passo 5(e): Fase Inversa em Source 30 RPC
Equipamento • Coluna cromatográfica: AC10//20 (Amersham
Biosciences); 49 • Monitor de UV (comprimento do percurso óptico 2,5 mm) equipado com registador de dois canais (Amersham Biosciences ou equivalente); • Bomba peristáltica (Minipulse 2 Gilson ou equivalente); • Espectrofotómetro de UV (Shimadzu ou equivalente); • Sistema FPLC ou equivalente para efectuar gradiente linear (Amersham Biosciences); • Medidor de pH (Metrohm ou equivalente); • Condutivimetro (Metrohm ou equivalente).
Materiais
• IL-18BP pós-HIC • Resina Source 30 RPC (Amersham Biosciences); • Cloreto de sódio - Merck; • Tetraborato dissódico deca-hidratado - Merck; • Solução de NaOH a 50% - Baker; • Água purificada (Modulab ou equivalente); • Acetonitrilo - Merck; • Ácido Trifluoroacético - J.T.Baker; • Indicador Universal pH 0-14 - Merck.
Tampões e Soluções: • Solução A: 0,1% de TFA em água • Solução B: 0,1% de tfa em acn • Tampão de equilíbrio: borato de sódio 50 mM pH 9,1±0,2, condutividade 5±2 mS/cm
• Solução de sanitização: NaOH 0,5 M 50
Empacotou-se a coluna com resina Source 30 RPC seguindo as instruções do fabricante.
Para sanitização da coluna, lavou-se a coluna em fluxo inverso com pelo menos 3 BV de NaOH 0,5 M e depois lavou-se com 4-5 BV de água purificada.
Em seguida, equilibrou-se a coluna passando através da coluna (fluxo directo) 5-6 ou mais BV de tampão de equilíbrio borato de sódio 50 mM pH 9,1±0,2, condutividade 5+2 mS/cm. Verificou-se o pH e a condutividade, e prosseguiu-se a lavagem se os parâmetros do efluente da coluna estivessem fora dos valores alvo, isto é pH 9,1+0,2 e condutividade 5+2 mS/cm. A r-hIL-18BP pós-HIC (resultado do passo (d)) a pH 9,1+0,2 condutividade 30+2 mS/cm foi o material de partida deste passo. Transferiu-se para a coluna e uma vez concluída a carga da amostra, lavou-se a coluna com 2-3 BV de tampão de equilíbrio. Rejeitou-se esta fracção.
Em seguida lavou-se a coluna com solução A até o pH do efluente da coluna ser inferior a 4. Juntou-se esta fracção com a primeira parte do gradiente de eluição (antes de 28% de ACN). Esta fracção contém alguns resíduos de impurezas da cultura de células e é assim rejeitada. A eluição foi realizada no modo de gradiente utilizando a combinação da solução de eluição A e solução de eluição B como se pormenoriza a seguir: 51
Quadro IV:
Tempo (minutos) %A %B BV Caudal (mL/min) 0 100 0 0 5 50 65 35 22 5 60 65 35 26,5 5 65 20 80 29,0 5 75 20 80 33, 0 5 A r-hIL-18BP começou a eluir a cerca de 28-32% da solução B (ver acima a negrito) e estava completamente eluída em 60 minutos (35% de B). Ajustou-se imediatamente o eluato até pH 8,0±0,5 por diluição 1:2 com borato de sódio 50 M pH 9,1±0,2 e condutividade 5±2 mS/cm.
Esta fracção contém r-hlL-18BP purificada. A regeneração da coluna foi realizada no final do gradiente de eluição. A fracção de regeneração foi recolhida de acordo com o perfil de absorvância. Esta fracção contém resíduos de impurezas da cultura de células e formas agregadas de IL-18BP.
Para sanitização, lavou-se a coluna com 2-3 BV de água, lavou-se com pelo menos 3-4 BV de NaOH e parou-se então o caudal durante 1 hora. Após isso, lavou-se a coluna com 3-4 BV de água purificada.
Lavou-se a coluna com pelo menos 3 BV de solução de armazenagem, e armazenou-se até ao ciclo seguinte. 52
3. Resumo da eliminação de proteínas de células hospedeiras da preparação de IL-18BP A quantidade de proteínas das células hospedeiras foi medida por ELISA utilizando um anti-soro policlonal que foi gerado em coelhos contra contaminantes provenientes de células CHO presentes no meio de cultura de células sem soro. A quantidade de proteínas das células hospedeiras é exprimida em ppm (partes por milhão) de proteínas contaminantes em relação à IL-18BP purificada. A quantidade de IL-18BP foi medida por determinação da densidade óptica (DO) a 280 nm (coeficiente de extinção molar ε= 1,26) na preparação purificada de IL-18BP, isto é após o passo de purificação final por cromatografia de Fase Inversa.
Esta análise foi realizada no quadro de três experiências independentes.
Quadro V: Eliminação de proteínas das células hospedeiras
Ensaio Início IMAC PÓS-IMAC PÓS-MEP PÓS-CM 1 528966 ppm 470600 ppm 68400 ppm >4000 ppm 2 475322 ppm 366800 ppm 49800 ppm 558 ppm 3 230400 ppm 236200 ppm 89100 ppm 641 ppm
EXEMPLO 2: PROTOCOLO MODIFICADO PARA PURIFICAÇÃO DE IL-18BP HUMANA, RECOMBINANTE A PARTIR DO SOBRENADANTE DE CÉLULAS CHO SEM SORO
Realizou-se o Exemplo 1 como indicado acima com as modificações seguintes: 53 0 passo de captura foi realizado em Fractogel® TMAE HiCap®, adquirida de Merck.
No passo (a), o passo de purificação em IMAC numa coluna de Sepharose Fast Flow quelante, adicionou-se um passo de lavagem adicional utilizando cloreto de amónio 15 mM em tampão de equilíbrio.
Além disso, no passo (a) a eluição foi realizada utilizando acetato de amónio 0,06 M a pH 8,7.
No passo (d), iniciou-se a eluição com tampão de eluição borato de sódio 50 mM pH 9,1±0,2, Sulfato de Amónio 0,10 M. Método: Determinação da actividade específica da IL-
18BP
Determinação da potência biológica pelo bioensaio in vitro com células KG-1 A caracterização biológica de um Material de Referência de r-hIL-18BP baseou-se na avaliação da sua aptidão para se ligar especificamente à r-hIL-18, neutralizando a sua actividade biológica na linha de células de leucemia mielóide aguda humana KG-1. Esta linha de células é capaz de produzir IFN-γ em resposta à IL-18 humana e TNF-α humano duma maneira dependente da dose, suprimindo a r-hIL-18BP deste modo a produção de IFN-γ. 54
Abreviadamente, adicionou-se células KG-1 a lxlO5 células/poço a uma placa de 96 poços que já continham concentrações diferentes de r-hlL-18BP na presença de uma concentração fixa de r-hlLl8 (40 ng/ml no poço) e de uma concentração fixa de r-hTNF-a (10 ng/ml no poço). A concentração de cada uma destas duas substâncias combinadas em conjunto foi capaz de originar a indução sub-máxima de produção de iFN-γ em células KG-1. Após 24 h a 37 °C, 5% C02, colocou-se a placa a -20 °C para submeter as células tratadas a um ciclo de congelação/descongelação antes de se realizar o imunoensaio para determinar a quantidade de ifn-γ presente no sobrenadante celular. Recolheu-se os sobrenadantes celulares e mediu-se o IFN-γ humano por meio de um imunoensaio especifico (ELISA h-IFN-γ, estojo Duo Set R&D Systems). A quantidade de IFN-γ produzida pelas células tratadas foi calculada por interpolação dos valores de y (D.O.) na Curva Padrão de IFN-γ, fornecida com o estojo, aos quais foi adaptada uma transformada Log/log dose-resposta (4PL) sigmóide, obtendo-se deste modo os valores de x (concentrações de IFN-γ) (GraphPad Prism). A diluição da solução do Material de Referência de r-hiL-18BP (STlP01/r-hIL-18 BP) capaz de inibir em 50% (EC5o) a quantidade de produção de IFN-γ induzida por uma concentração fixa de r-hlL-18 + uma concentração fixa de r-hTNF-α foi definida como 1 Unidade (U).
Efectuou-se dez ensaios independentes e representou-se cada uma das 10 curvas dose-resposta colocando no eixo dos y a % de produção de IFN-γ e no eixo dos x as diluições de STlP01/r-hIL-18BP. A curva dose de r-hIL-18BP-resposta produzida em cada experiência foi inicialmente normalizada 55 assumindo como 0% e 100% os valores menor e maior de lNF-γ, respectivamente. O valor mais elevado de lFN-γ foi dado pelas concentrações combinadas de r-hlL-18 e r-hTNF-α na ausência de r-hIL-18BP, enquanto o mais baixo foi dado pela concentração mais elevada de r-hiL-18BP testada. Aplicou-se em seguida uma sigmóide dose-resposta com um algoritmo de declive variável (4PL) para interpolar os valores normalizados e determinou-se as EC50 para cada experiência. O titulo do Material de Referência foi calculado em cada ensaio como se segue: Título (U/ml)=Recíproco da diluição a 50% da resposta x pré-diluição O titulo final da STlP01/r-hIL-18BP foi calculado fazendo a média dos 10 titulos individuais obtidos em cada experiência. A Fig. 2 mostra as curvas dose-resposta de STlPOl/r-hIL-18BP pelo bioensaio in vitro com KG-1 obtidas em 10 experiências independentes.
As curvas foram normalizadas assumindo o valor mais baixo de INF-γ como sendo igual a 0% e o valor mais alto de INF-γ como sendo igual a 100%, respectivamente. O valor mais elevado de IFN-γ foi dado pelas concentrações combinadas de r-lL-18 e r-hTNF-α na ausência de r-hlL-18BP, enquanto o mais baixo foi dado pela concentração mais 56 elevada de r-hIL-18BP testada. Aplicou-se então uma dose-resposta sigmóide com um algoritmo de declive variável (4PL) para interpolar os valores normalizados e a EC50 foi determinada para cada experiência por meio de GraphPad Prism.
Os títulos individuais para a STlP01/r-hlL-18BP obtidos em cada experiência independente conjuntamente com o desvio padrão, o Coeficiente de Variação (%) e os Limites de Confiança a 95% são dados abaixo.
Quadro VI: Estimativa da potência da STlP01/r-hIL-18BP obtida em dez experiências independentes # Ensaio STlP=l/r-hIL-18BP (U/ml) 1 794808 2 884412 3 1008216 4 987696 5 1021212 6 980856 7 1117314 8 861156 9 660402 10 642618 Média 895869 Desvio padrão 157817 CV% 17,6 LC 95% LSC 1008760 LIC 782973 57 A potência média estimada do Material de Referência STlP01/r-hIL-18BP é de 895869 U/ml com um CV % de 17,6.
Bioensaio in vitro com células KG-1 0 ensaio é realizado em placas de 96 poços.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A c.c. C.C. C.C. C.C. C.C. C.C. C.C. C.C. C.C. C.C. C.C. C.C. B 300 200 133 88, 8 59, 2 39,5 26,3 17, 5 11,7 0 IL-18 TNF C 300 200 133 88, 8 59, 2 39,5 26,3 17, 5 11,7 0 IL-18 TNF D Sl1 Sl1 S21 S21 S31 S31 E Sl2 Sl2 S22 S22 S32 S32 F G H CC = Células de controlo (adicionado apenas meio de cultura) TNF = r-hTNF-α a 10 ng/ml no poço IL-18 = r-hIL-18 a 40 ng/ml no poço 0 = r-hIL-18 + r-hTNF-α a 40 + 10 ng/ml no poço, respectivamente Linhas B e C - diluição 1:1,5 da curva dose de r-hIL-18BP-resposta Sl, S2 e S3 = Amostras a 2 concentrações diferentes dentro da parte linear da curva dose-resposta (2 replicados/amostra) , por exemplo Sl1 = amostra 1 à concentração 1; Sl2 = amostra 1 à concentração 2).
As posições de amostra indicadas na placa são ilustrativas. • Adicionar 50 μΐ de meio de cultura (500 ml de IMDM reforçado com 20% de FBS inactivado termicamente 30 min a 56°, 5 ml de 2-mercaptoetanol 3 mM, 5ml de 1-glutamina 2mM e 5 ml Penicilina/Estreptomicina; 10.000 U/ml /10.000 μρ/ηιΐ) aos poços 2 até 12 das linhas B-C. • Adicionar 150 μΐ de Material de Referência de r-hlL-18BP a 1500 ng/ml (300 ng/ml no poço) ao primeiro poço das linhas B-C. 58 • Utilizando uma pipeta multicanal realizar diluições em série 1:1,5 transferindo 100 μΐ do poço na coluna 1 para o poço da coluna 9 (linhas B-C), rejeitando os 100 μΐ em excesso do poço na coluna 9. • Adicionar 50 μΐ de amostra de r-hlL-18BP preparada a uma das 2 concentrações dentro da parte linear da curva dose-resposta (por exemplo Sl1 a 600 ng/ml correspondente a 120 ng/ml no poço) aos poços nas colunas 1-2 da linha D (2 replicados). N.B. as posições da amostra indicadas na placa são proporcionadas como um exemplo. • Repetir o ponto 4 para a segunda concentração (Sl2) da amostra. • Adicionar 50 μΐ de r-hlL-18 a 200 ng/ml (40 ng/ml no poço) a todos os poços das linhas B-C excepto aos na coluna 12 e aos poços contendo a amostra (por exemplo colunas 1-2 linhas D-E). • Adicionar 50 μΐ de r-r-hTNF-α a 50 ng/ml (10 ng/ml no poço) a todos os poços das linhas B-C excepto aos na coluna 11 e aos poços contendo a amostra (por exemplo colunas 1-2 linhas D-E) • Adicionar 50 μΐ de meio de cultura aos poços nas colunas
11 e 12 das linhas B-C • Adicionar 150 μΐ de meio de cultura a todos os poços da linha A (poços de Células de Controlo). • Adicionar 100 μΐ de uma suspensão de células KG-1 a lxlO6 células/ml a todos os poços da placa de 96 poços. 59 NB: 0 volume final no poço é de 250 μΐ; a diluição final da r-hIL-18BP é 1:5. A suspensão de células é preparada a partir de um balão T75 contendo não menos do que 20-24xl06 células (15 ml de meio de cultura). • Incubar a placa durante 24 h a 37 °C, 5% de C02 • Retirar a placa da incubadora e colocar a -20 °C até ser realizado o imunoensaio para determinar a quantidade de lFN-γ presente no sobrenadante celular. • Recolher o sobrenadante celular e medir o IFN-γ humano por meio de um imunoensaio especifico (ELISA h-IFN-γ, estojo Duo Set R&D Systems). NB: De acordo com a concentração de r-hIL-18BP adicionada, realizar, se necessário, mais do que 1 diluição da amostra de sobrenadante celular para garantir que os valores de D.O. medidos são quantificáveis na curva padrão de IFN-γ. A ELISA foi realizada de acordo com o protocolo geral fornecido com o estojo com modificações menores: • O número de passos de lavagem foi aumentado: de 3 para 4 e de 4 para 5 para o último. • O tampão de bloqueio foi preparado adicionando 1% de BSA em PBS (sem adicionar sacarose nem NaN3) . • O diluente reagente foi preparado adicionando BSA a 0,1% e Tween-20 a 0,05% em PBS em vez de soro fisiológico tamponado com Tris. A quantidade de IFN-γ produzido pelas células tratadas foi calculada na Curva Padrão de IFN-γ (fornecida com o 60 estojo) transformada em Log/Log e interpolada por meio de uma dose-resposta sigmóide com algoritmo de declive variável (suporte lógico Graph Pad) .
Cálculo da actividade especifica da IL-18BP A actividade especifica da IL-18BP é calculada de acordo coma fórmula seguinte: _\J_ mg U_ mL mL mg
Resultados:
Os quadros seguintes indicam os resultados obtidos para vários parâmetros ao longo do processo de purificação como descrito neste exemplo.
Quadro VII: Eliminação de proteínas das células hospedeiras
Material de partida 291042 238636 336538 288739 (pós-captura) Pós-IMAC 96923 162619 148061 135867 Pós-MEP 41563 43781 46708 44017 Pós-CM 2138 2689 2550 2459 Pós-HIC 372 1543 640 852 Pós-RPC 83 111 121 105
Quadro VIII: Rendimento e nível de HCP: Média de 3 lotes Rendimento (%) HCP (ppm) Material de partida pós-captura NA 288739 Pós-IMAC 91 135867 Pós-MEP 98 44017 Pós-CM 83 2459 Pós-HIC 76 852 Pós-RPC 70 105 61
Quadro IX: Atributos principais do lote de IL-18BP purificada (média de 3 lotes)
Análise de r-hIL-18BP purificada Unidade nível Actividade específica U/mg 18287 HCP ppm 165 62
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Lisboa
Claims (21)
1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de cromatografia hidrófoba de indução de carga para a produção de proteína de ligação à IL-18 (IL-18BP) purificada.
2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a cromatografia hidrófoba de indução de carga é realizado numa resina de 4-mercapto-etil-piridina (MEP).
3. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a cromatografia hidrófoba de indução de carga é utilizada associada a um passo seleccionado de cromatografia de afinidade com ião metálico imobilizado, cromatografia de troca iónica, cromatografia de interacção hidrófoba e cromatografia de fase inversa.
4. Processo para a produção de IL-18BP purificada compreendendo submeter um fluido a um passo de cromatografia hidrófoba de indução de carga.
5. Processo de acordo com a reivindicação 4, em que a cromatografia hidrófoba de indução de carga é realizado numa resina de 4-mercapto-etil-piridina (MEP).
6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 ou 5, compreendendo ainda um passo seleccionado de cromatografia de afinidade com ião metálico imobilizado, cromatografia de troca iónica, 2 cromatografia de interacção hidrófoba e cromatografia de fase inversa.
7. Processo de acordo com a reivindicação 6, em que a cromatografia de afinidade com ião metálico é realizada numa resina quelante.
8. Processo de acordo com a reivindicação 6, em que a cromatografia de troca iónica é a cromatografia de troca catiónica.
9. Processo de acordo com a reivindicação 8, em que a cromatografia de troca catiónica é realizada numa resina de carboximetilo (CM).
10. Processo de acordo com a reivindicação 6, em que a cromatografia de interacção hidrófoba é realizada numa resina de fenilo.
11. Processo de acordo com a reivindicação 6, em que o passo de cromatografia de fase inversa é realizado numa matriz polimérica de fase inversa.
12. Processo de acordo com a reivindicação 11, em que a matriz polimérica de fase inversa é a fase inversa Source 30 RPC.
13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 12, compreendendo os passos de: (a) Submeter o fluido a cromatografia de afinidade com ião metálico; 3 (b) Submeter o eluato da cromatografia de afinidade com ião metálico a cromatografia hidrófoba de indução de carga; (c) Submeter o eluato da cromatografia hidrófoba de indução de carga a cromatografia de troca catiónica; (d) Submeter o eluato da cromatografia de troca catiónica a cromatografia de interacção hidrófoba; (e) Submeter o eluato da cromatografia de interacção hidrófoba a cromatografia de fase inversa.
14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, compreendendo ainda um ou mais passos de ultrafiltração.
15. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, compreendendo ainda um ou mais passos de filtração de eliminação de virus.
16. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, compreendendo um passo inicial de captura. Processo da reivindicação 16, em que o passo de captura é realizado por cromatografia de troca aniónica forte.
Processo da reivindicação 17, em que o passo de captura é realizado numa resina de amónio quaternário (Q) .
18. 4
19. Processo da reivindicação 17, em que o passo de captura é realizado numa resina de TMAE.
20. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 19, em que a IL- 18BP é a IL-18BP humana, recombinante.
21. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 até 19 , em que o fluido é o sobrenadante de culturas de células sem soro. Lisboa, 8 de Maio de 2007.
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