ES2309508T3 - Vectores de expresion que comprenden el promotor de mcmv-ie2. - Google Patents
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Abstract
Un vector de expresión que comprende un promotor mCMV-IE2 constituido por un fragmento funcional promotor de la expresión de SEQ ID NO:1, en donde: (i) el vector de expresión no contiene ningún gen completo del mCMV; y (ii) dicho promotor de mCMV-IE2 está enlazado operativamente a una secuencia de DNA que codifica un polipéptido.
Description
Vectores de expresión que comprenden el promotor
de mCMV-IE2.
La invención se refiere a vectores de expresión
que comprenden el promotor del gen de mCMV-IE2, o un
fragmento funcional promotor de la expresión del mismo, en donde el
vector de expresión no contiene ningún gen completo del mCMV, a
células hospedadoras que contienen tales vectores, a métodos de
producción de polipéptidos deseados por utilización de estos
vectores de expresión, y a usos de dichos vectores de expresión.
Vectores de expresión que comprenden el promotor
de mCMV IE2 y el promotor de mCMV IE1, opcionalmente junto con el
nuevo intensificador de mCMV IE2, se prefieren de acuerdo con la
invención, particularmente si ambos promotores están dispuestos en
una arquitectura bidireccional.
Desde hace décadas, se han utilizado vectores de
expresión como vehículos para la expresión de genes o cDNAs que
codifican polipéptidos o proteínas de interés en células
hospedadoras. Los promotores fuertes virales o celulares están
siendo utilizados para expresar el gen de interés a niveles altos
por utilización de transfección transitoria o estable de DNA
recombinante en las células hospedadoras. Se ha demostrado que la
región inmediata temprana (IE) del citomegalovirus humano (hCMV) es
particularmente adecuada a este respecto, y se conocen vectores de
expresión que comprenden elementos génicos derivados de esta región,
v.g. por el documento EP0323997B1.
Hasta hoy, las secuencias reguladoras génicas
del citomegalovirus murino (mCMV) han sido utilizadas rara vez,
aunque elementos reguladores derivados de mCMV se identificaron como
muy potentes e incluso más fuertes que la contrapartida humana (Kim
et al. 2002).
El documento US 4.963.481 (de Villiers) describe
vectores de expresión que tienen un DNA que codifica una proteína
heteróloga bajo el control transcripcional de fragmentos de DNA
derivados de la región del gen IE de mCMV que incluye un fragmento
de la endonucleasa de restricción PstI de aproximadamente 2270 pares
de bases (pb) aislado del genoma viral. Una versión truncada de
1387 pb de este fragmento dio como resultado una mejora
significativa en la eficacia del fragmento de DNA como promotor para
la expresión de la proteína heteróloga.
El documento US 4.968.615 (Kozinowski) describe
moléculas de DNA recombinante que contienen intensificadores de la
transcripción del citomegalovirus murino (mCMV) que pueden
utilizarse para mejorar la transcripción de genes estructurales en
células eucariotas. Se decía que el intensificador de mCMV está
localizado dentro del fragmento PstI de 2,27 kb identificado por de
Villers (documento US 4.963.481).
Manning y Mocarski (1988) analizaron la
importancia funcional de la región IE2 de mCMV para la replicación
del citomegalovirus murino. A este fin, se construyó un virus
recombinante que tenía el gen informador lacZ bajo el control
transcripcional del intensificador/promotor IE de mCMV, rompiendo
así el gen IE2. De hecho, no pudo observarse expresión alguna del
gen IE2, y el virus se replicaba normalmente. Los autores dedujeron
por ello que el gen IE2, que no está conservado entre los
citomegalovirus tales como el mCMV y el hCMV, no era esencial para
replicación del virus. No fue descrita ni sugerida indicación de
utilidad particular alguna de la región intensificadora/promotora de
IE2 por Manning y Mocarski.
Bibliografía más reciente indica una diferencia
adicional entre la región IE de CMV de ratón y humano. El locus de
ratón expresa un segundo mRNA mayor en la dirección opuesta del
primer gen IE. Este segundo gen inmediato precoz se designó IE2, y
se hace referencia a su secuencia promotora como el promotor IE2
(Masserie et al., 1991).
La región IE2 del mCMV no ha sido utilizada en
vectores para expresión de proteínas heterólogas hasta ahora.
La presente invención está basada en el
descubrimiento de que un vector que tiene un elemento de DNA que
comprende la región promotora IE2 del mCMV puede conducir
eficientemente la expresión de un gen de interés en células
hospedadoras transfectadas.
La invención describe adicionalmente la
identificación de un nuevo intensificador en la región IE2 del mCMV,
que se designa en esta memoria como el intensificador IE2 de mCMV.
Este intensificador cumple los criterios aplicados comúnmente para
definición de intensificadores, es decir la intensificación de la
expresión independientemente de (1) la localización, (2) la
orientación, y (3) la intensificación de la expresión de un promotor
heterólogo.
Por esta razón, un primer aspecto de la
invención se refiere a un vector de expresión que comprende un
promotor de mCMV-IE2 constituido por un fragmento
funcional promotor de la expresión SEQ ID NO: 1, en donde el vector
de expresión no contiene ningún gen completo del mCMV y en donde
dicho promotor IE2 de mCMV está enlazado operativamente a una
secuencia de DNA que codifica un polipéptido.
En un segundo aspecto, la invención se refiere a
una célula hospedadora que comprende un vector de acuerdo con la
invención.
Un tercer aspecto de la invención se refiere a
un proceso para la producción de un polipéptido de interés que
comprende el paso de transfectar una célula hospedadora con un
vector de acuerdo con la invención.
En un cuarto aspecto, la invención se refiere a
un proceso para la producción de un polipéptido de interés que
comprende el paso de cultivar la célula hospedadora de la
invención.
Un quinto aspecto de la invención se refiere al
uso de un vector de acuerdo con la invención para la expresión de
uno o más genes o cDNAs de interés.
En un sexto aspecto, la invención se refiere al
uso de un vector de la invención para selección de clones que
expresan cantidades elevadas de un gen de interés.
Un séptimo aspecto se refiere al uso de un
vector de acuerdo con la presente invención en terapia basada en
DNA.
Un octavo aspecto se refiere a un vector de
expresión que comprende un promotor IE2 de mCMV constituido por un
fragmento funcional promotor de la expresión en donde dicho promotor
está constituido por una secuencia seleccionada del grupo
constituido por (i) el promotor IE2 de núcleo; (ii) el promotor IE2
de núcleo y una secuencia de 100 a 200 nucleótidos aguas arriba de
dicho promotor de núcleo; y (iii) la secuencia de SEQ ID NO: 1.
Fig. 1 muestra la secuencia de un elemento
bidireccional de DNA derivado de la región IE de mCMV para uso en
construcciones de expresión. Se indican respectivamente los sitios
+1 y las secuencias TATA de los promotores IE2 e IE1. Los
promotores de núcleo para ambos genes se muestran en un recuadro.
Los sitios de restricción por HpaI y XhoI se muestran en negrita.
Se indica la posición -682 con respecto a +1 de IE1.
Fig. 2 muestra las construcciones informadoras A
a G. El gen informador de luciferasa se muestra como una línea
negrita y los promotores se indican como flechas huecas.
- A:
- el control negativo sin promotor (pGL3 Basic).
- B:
- un vector informador de luciferasa conducido por el promotor/intensificador de SV40 (pGL3 Control).
- C:
- el promotor conducido IE1 de expresión de luciferasa (pmCMV Luciferasa, IE1 conducido).
- D:
- el promotor conducido IE2 de expresión de luciferasa (prevmCMV Luciferasa, IE2 conducido).
- E:
- el promotor IE2 de expresión de luciferasa conducido, promotor IE1 delecionado (prevmCMV Luciferasa, \DeltaXhoI), IE2 conducido, IE1 menos).
- F:
- el promotor IE1 de expresión de luciferasa conducido, y el promotor IE2 delecionado (pBS.mCMV3 Luciferasa, IE1 conducido (1,4 kb), IE2 menos).
- G:
- una versión corta del promotor IE1 que conduce la expresión de luciferasa (p-680 Luciferasa, IE1 conducido (versión corta, 0,68 kb)).
Fig. 3 muestra una construcción bidireccional
similar a la construcción C de Fig. 2 (construcción
C-2) con la secuencia codificante para
IL-18bp (línea en negrilla) enlazada al promotor
IE2. Así, en esta construcción, el promotor IE1 de mCMV conduce la
expresión de luciferasa, y simultáneamente el promotor IE2 de mCMV
conduce la expresión de IL-18BP. Triángulo: intrón.
Óvalos cerrados: poliA.
Fig. 4 muestra la expresión del gen informador
de luciferasa desde las construcciones de los diferentes
informadores que se representan en Fig. 2, construcciones A a G.
Las células CHO-S que crecían en un medio exento de
suero (SFM) se transfectaron transitoriamente con las
construcciones A a G, o se transfectaron falsamente. La actividad de
luciferasa se expresa como RLU = unidades relativas de luz.
Fig. 5 muestra la expresión de luciferasa medida
como RLU en agrupaciones estables de células CHO-S
transfectadas. Las células se dejaron crecer en SFM después de
transfección con las construcciones D, C, F y E, como se representa
en Fig. 2. La expresión de luciferasa se evaluó después de 21 días
de selección.
Fig. 6 muestra la expresión de luciferasa medida
como RLU después de transfección transitoria con 900, 500, 300 y
100 ng de la construcción bidireccional C-2 que se
muestra en Fig. 3.
\newpage
Fig. 7 muestra la cantidad de
IL-18BP en ng/l en los sobrenadantes del cultivo de
células del experimento de transfección transitoria de acuerdo con
Fig. 6 (construcción C-2).
Fig. 8 muestra la relación de las cantidades de
IL-18BP frente a luciferasa medidas en el
experimento de acuerdo con Figs. 6 y 7.
Fig. 9 muestra las cantidades de luciferasa en
RLU (eje Y izquierdo) e IL-18BP en ng/ml (eje Y
derecho) expresadas por 48 clones individuales que se seleccionaron
8 días después de la transfección con la construcción bidireccional
C-2 (como se muestra en Fig. 3). El límite de
detección para luciferasa era aproximadamente 500 RLU, y 2,5 ng/ml
para IL-18BP. Cada incremento en el eje X representa
un solo clon.
Fig. 10(a) muestra las construcciones
informadoras H a N. El gen informador de luciferasa (Luc) se
representa como una línea en negrilla y los promotores IE1 e IE2
respectivos se indican como flechas huecas. Los intensificadores se
representan como óvalos grises: gris claro para el intensificador
conocido IE1, y gris oscuro para el nuevo intensificador IE2.
- H:
- construcción bidireccional con la expresión de luciferasa conducida el promotor IE2;
- I:
- la expresión de luciferasa estaba conducida por el promotor IE2, y el promotor IE1 se delecionó;
J, K, L, M, N: las construcciones
contenían promotores mCMV acortados, correspondiendo las posiciones
al número de pares de bases de mCMVp, con relación al +1 de IE2 como
referencia;
- J:
- desde -1076
- K:
- desde -783
- L:
- desde -587
- M:
- desde -387
- N:
- desde -189
Fig. 10(b) muestra la expresión de
luciferasa en RLU a partir de las construcciones informadoras H a N
de acuerdo con Fig. 10 (a), después de transfección transitoria de
células CHO-S que se dejaron crecer en un medio
exento de suero.
Fig. 11(a) muestra construcciones
informadoras adicionales O a Y que combinaban el nuevo
intensificador IE2 (óvalo gris) con el promotor SV40. El óvalo gris
representa el intensificador IE2 desde -587 a -189, el óvalo gris
medio representa el intensificador IE2 desde -387 a -189. La flecha
sobre el intensificador IE2 indica la dirección de la secuencia
intensificadora. El gen informador de luciferasa se muestra como una
línea en negrilla, y el promotor SV40 se indica como una flecha
hueca. Ovalo negro: poliA.
- O:
- secuencia intensificadora IE2 larga (-587/-189) clonada en 5' del promotor SV40;
- P:
- secuencia intensificadora IE2 corta (-387/-189) clonada en 5' del promotor SV40;
- Q:
- secuencia intensificadora IE2 larga (-587/-189) clonada en 5' del promotor SV40 en la orientación inversa;
- R:
- secuencia intensificadora IE2 corta (-387/-189) clonada en 5' del promotor SV40 en la orientación inversa;
- S:
- secuencia intensificadora IE2 larga (-587/-189) clonada en 3' del gen de luciferasa;
- T:
- secuencia intensificadora IE2 corta (-387/-189) clonada en 3' del gen de luciferasa;
- U:
- secuencia intensificadora IE2 larga (-587/-189) clonada en 3' del gen de luciferasa en la orientación inversa;
- V:
- secuencia intensificadora IE2 corta (-387/-189) clonada en 3' del gen de luciferasa en orientación inversa;
- W:
- control, promotor SV40 e intensificador SV40 en 3' de la secuencia codificante de luciferasa;
- X:
- control, expresión de luciferasa conducida por el promotor SV40 sin intensificador alguno;
- Y:
- control negativo, sin promotor alguno.
Fig. 11(b) muestra la expresión de
luciferasa a partir de las construcciones informadoras O a Y como se
muestra en Fig. 11(a). Células CHO-S que
crecían en un medio exento de suero (SFM) se transfectaron
transitoriamente con las construcciones O a Y. La actividad de
luciferasa se expresa como número de veces de inducción en
comparación con el control X (valor 1), es decir la expresión
conducida por el promotor SV40 sin intensificador alguno. Barras
huecas: intensificador IE2 largo (-587 a -189), barras sombreadas:
intensificador IE2 corto (-387 a -189). El eje X es una escala
logarítmica.
Fig. 12 muestra un experimento que compara el
nuevo intensificador IE2 con el intensificador hCMV conocido. Las
células se transfectaron con la construcción de control A (pGL3
básica, véase Fig. 2, sin promotor), la construcción de control B
(pGL3 ctrl, véase Fig. 2, el promotor SV40 con la secuencia
intensificadora de SV40 en 3' de la región codificante de
luciferasa), la construcción de control X (SV-Luc+,
véase Fig. 11.a, promotor de SV40 sin intensificador), así como las
construcciones O y Q (véase Fig. 11a) o las construcciones
O-2 y Q-2, en las cuales la
secuencia intensificadora de IE2 (versión larga, -587 a -189) estaba
reemplazada por la secuencia intensificadora de hCMV conocida (SEQ
ID NO: 2). La luciferasa se midió en RLU (eje x). Barras
sombreadas: con el intensificador hCMV conocido. Barras grises: con
el nuevo intensificador IE2.
Fig. 13 muestra el vector bidireccional
utilizado para expresión simultánea de IL-18BP y
luciferasa. Los promotores IE1 e IE2 se indican como flechas
huecas. El triángulo representa el intrón A de la región IE de hCMV,
y el óvalo gris la señal de poliadenilación. El cuadrado compacto
representa el péptido de señal.
- Construcción #26:
- luciferasa expresada a partir del promotor IE1 e IL-18BP por el promotor IE2. La secuencia entre ambos promotores es como en la construcción H de Fig. 10.a.
- Construcción #140:
- luciferasa expresada a partir del promotor IE2 e IL-18BP por el promotor IE1. El intensificador IE2 (-587 a -189) está localizado entre los dos promotores.
Fig. 14 muestra las cantidades de luciferasa
expresada (RLU, eje Y izquierdo) e IL-18 BP (ng/ml,
eje Y derecho) después de transfección transitoria de células CHO
que crecían en medio exento de suero con cualquiera de las
construcciones #26 o #140 de acuerdo con Fig. 13. Barras: expresión
de luciferasa, rombos compactos: expresión de
IL-18BP.
Fig. 15 muestra la expresión de luciferasa (RLU,
eje Y izquierdo) e IL-18BP (ng/ml, eje Y derecho) en
agrupaciones estables transfectadas con cualquiera de las
construcciones #26 o #140 de acuerdo con Fig. 13. La expresión se
midió 7 semanas después de la transfección. Las células se
mantuvieron bajo selección de puromicina (+puro), o durante 3
semanas sin selección de puromicina (-puro). Barras: expresión de
luciferasa, rombos compactos: expresión de
IL-18BP.
Fig. 16 muestra la evolución temporal de la
expresión de luciferasa como en el experimento de Fig. 15. El eje x
representa el tiempo en semanas. Los datos que se muestran en Fig.
15 corresponden a la fecha de tres semanas en Fig. 16. Rombo
compacto: #26 + puro, cuadrado pequeño: #140 + puro, triángulo
compacto: #26 - puro, cuadrado grande: #140 - puro.
Fig. 17: muestra la evolución temporal de la
expresión de IL-18BP en el experimento de acuerdo
con Fig. 16, leyenda como en Fig. 16.
Fig. 18 se analizaron protoclones individuales
respecto a expresión de luciferasa (cuadrados) en RLU (eje Y
izquierdo) y la expresión de IL-18BP (rombos) en
ng/ml (eje Y derecho). Cada incremento en el eje x representa un
proto-clon individual. Los protoclones se
establecieron a partir de células CHO transfectadas establemente
con la construcción #26 y se mantuvieron bajo selección de
puromicina.
Fig. 19: como Fig. 18, pero los protoclones se
establecieron a partir de células transfectadas con la construcción
#140.
Fig. 20: los protoclones transfectados con
cualquiera de las construcciones #26 o #140 se analizaron respecto
a expresión de luciferasa en un formato de 96 pocillos, vista
ChemiDoc invertida.
De acuerdo con la presente invención, se ha
encontrado sorprendentemente que el promotor del gen dos inmediato
precoz (IE2) del citomegalovirus murino (mCMV) es eficiente en la
promoción de la expresión de un polipéptido de interés que no es la
proteína IE2 de mCMV propiamente dicha, es decir, de un polipéptido
o proteína heterólogo. Este vector de expresión no se supone que
sea el citomegalovirus murino propiamente dicho, o que contenga
cualesquiera genes virales mCMV completos, sino que es un vector
ideado para expresión recombinante de proteínas.
Por tanto, la invención se refiere a un vector
de expresión que comprende un promotor del gen de
mCMV-IE2 constituido por un fragmento funcional
promotor de la expresión de SEQ ID NO: 1 en donde el vector de
expresión no contiene ningún gen completo del mCMV, y en donde
dicho promotor de mCMV IE2 está enlazado operativamente a una
secuencia de DNA que codifica un polipéptido. La invención se
refiere adicionalmente a un vector de expresión que comprende un
promotor IE2 de mCMV constituido por un fragmento funcional promotor
de la expresión en donde dicho promotor está constituido por una
secuencia seleccionada del grupo constituido por (i) el promotor
IE2 de núcleo; (ii) el promotor IE2 de núcleo y una secuencia de 100
a 200 nucleótidos aguas arriba de dicho promotor de núcleo; y (iii)
la secuencia de SEQ ID NO: 1.
Además de esto, ha sido identificado un nuevo
intensificador en la región IE2 de mCMV, que se designa en esta
memoria como el intensificador IE2 de mCMV, o el intensificador IE2.
Este intensificador intensifica la expresión con indiferencia de su
localización u orientación frente al gen, e intensifica la expresión
de promotores heterólogos, cumpliendo así los criterios generales
de un intensificador.
Se describe también en esta memoria un vector de
expresión que comprende el intensificador del gen IE2 de mCMV, o un
fragmento funcional intensificador de la expresión del mismo, en
donde el vector de expresión no contiene ningún gen completo del
mCMV.
Las personas expertas en la técnica apreciarán
que el vector de la invención puede comprender el promotor IE2 de
mCMV solo, o en combinación con cualquier intensificador conocido
apropiado. Adicionalmente, el vector de la invención puede
comprender el promotor IE2 de mCMV en combinación con el
intensificador IE2 de mCMV.
El gen IE2 de mCMV propiamente dicho es
conocido, v.g. por Messerie et al., 1991.
El término "promotor" tal como se utiliza
en esta memoria, se refiere a una región de DNA que funciona para
controlar la transcripción de una o más secuencias de DNA, y que se
identifica estructuralmente por la presencia de un sitio de
fijación para RNA-polimerasa dependiente de DNA y de
otras secuencias de DNA, que interaccionan para regular la función
del promotor. Un fragmento funcional promotor de la expresión de un
promotor es una secuencia promotora acortada o truncada que retiene
la actividad como promotor. La actividad como promotor puede
medirse en cualquiera de los ensayos conocidos en la técnica, v.g.
en un ensayo con informador que utiliza luciferasa como gen
informador (Word, 1991; Seliger y McElroy, 1960; de Wet et
al. (1985), o disponible comercialmente de
Promega®).
Promega®).
De acuerdo con la presente invención, el
promotor IE2 puede comprender p.ej. una secuencia que abarca desde
la posición +1 a la secuencia TATA como se indica en Fig. 1. El
promotor IE2 puede comprender también una secuencia denominada en
esta memoria "promotor de núcleo" que abarca desde el
nucleótido 1 al 39 de la secuencia representada en Fig. 1
(recuadro). Las personas expertas en la técnica apreciarán que la
secuencia del promotor IE2 de mCMV puede ser más larga o más corta
que el promotor de núcleo, con tal que la misma conduzca la
transcripción de una secuencia de DNA enlazada operativamente a
ella. Por ejemplo, el promotor IE2 puede comprender también
100-200 pares de bases aguas arriba del promotor de
núcleo. Dicha región promotora se denomina también como el
"promotor proximal". Las personas expertas en la técnica
apreciarán adicionalmente que los términos "promotor" e
"intensificador" (véase más adelante) no están definidos
exactamente y por tanto el promotor puede comprender regiones
intensificadoras, o las regiones intensificadoras pueden comprender
regiones promotoras, dependiendo de la nomenclatura y el
contexto.
El vector de la invención comprende
preferiblemente un fragmento que comprende el promotor IE2 de
núcleo. Más preferiblemente, el vector de la invención comprende
adicionalmente una secuencia de 100 a 200 nucleótidos aguas arriba
de dicho promotor de núcleo.
El término "vector" hace referencia a
cualquier portador de DNA o RNA exógeno que es útil para transferir
DNA exógeno a una célula hospedadora para replicación y/o expresión
apropiada del DNA exógeno por la célula hospedadora.
El término "enlazado operativamente", como
se utiliza en esta memoria, significa la fusión funcional de un
promotor con un gen estructural o cDNA o cualquier otra secuencia de
DNA a transcribir en el marco apropiado para expresar el gen, cDNA
u otro DNA bajo control del promotor. El término enlazado
operativamente, como se utiliza en esta memoria, no se limita por
tanto a una fusión directa de secuencias de DNA.
El término "gen completo del mCMV" se
refiere a un gen viral del citomegalovirus murino que tiene sus
propios elementos de regulación (endógeno, viral) 5' y 3'.
Una "región intensificadora" hace
referencia a una región de DNA que funciona para aumentar la
transcripción de uno o más genes. Más específicamente, el término
"intensificador", como se utiliza en esta memoria, es un
elemento regulador de DNA que intensifica, incrementa, aumenta, o
mejora la expresión de un gen con indiferencia de su localización y
orientación frente al gen a expresar, y puede ser intensificador,
incrementador, aumentador, o mejorador de la expresión de más de un
promotor. Preferiblemente, el intensificador aumenta la expresión
de más de un promotor simultáneamente. Un fragmento funcional que
intensifica la expresión de un intensificador es una secuencia
intensificadora acortada o truncada que retiene la actividad de
intensificación.
El vector de la invención comprende
preferiblemente un fragmento que incluye los nucleótidos -387 a -189
de la región aguas arriba IE2 de mCMV, numerándose los nucleótidos
con relación a +1 del gen IE2. Este fragmento tiene función
intensificadora, y se denomina también en esta memoria versión corta
del intensificador IE2.
\newpage
En una realización preferida adicional, el
vector comprende un fragmento que incluye los nucleótidos -587 a
-189 de la región aguas arriba IE2 de mCMV, numerándose los
nucleótidos con relación a +1 del gen IE2. Este fragmento tiene
función intensificadora, y se designa también en esta memoria como
versión larga del intensificador IE2.
El vector de la invención puede comprender
también un intensificador adicional IE de mCMV, o un fragmento
funcional intensificador de la expresión del mismo, denominado en
esta memoria el "intensificador IE1 de CMV".
Un intensificador IE1 de mCMV de este tipo se
conoce en la técnica, v.g. por el documento US 4.968.615. El mismo
puede abarcar v.g. desde la posición -587 a -147, o desde la
posición -682 a -147 de la secuencia representada de Fig. 1,
efectuándose la numeración con relación a la posición +1 del gen
IE1. El intensificador IE1 de mCMV que puede utilizarse de acuerdo
con la presente invención puede comprender además una secuencia que
abarca desde el par de bases -1330 a -488, con relación a la
posición +1 del IE1 en Fig. 1. La región intensificadora puede
comprender asimismo la totalidad o parte de un promotor.
Por la utilización de un intensificador de mCMV
además del promotor IE2, puede incrementarse adicionalmente la
expresión del polipéptido de interés.
De acuerdo con la presente invención, el vector
comprende además un promotor que es diferente del promotor IE2 de
mCMV, o un fragmento funcional promotor de la expresión del
mismo.
En una realización preferida, el vector de la
invención comprende un primer y un segundo promotor de origen
viral, celular o artificial, o un fragmento funcional promotor de la
expresión del mismo.
De acuerdo con la presente invención, se ha
demostrado que la presencia de un segundo promotor conduce a la
expresión eficiente de un polipéptido de interés por el promotor IE2
de mCMV. Por tanto, en una realización preferida, el vector
comprende el promotor IE2 de mCMV en combinación con un segundo
promotor, o un fragmento funcional promotor de la expresión del
mismo. Ejemplos de promotores adecuados adicionales incluyen el
promotor hCMV, el promotor de metalotioneína (MT), el promotor
SV40, o un promotor artificial. Preferiblemente, el segundo
promotor es una copia adicional del promotor IE2 de mCMV. Tales
promotores adicionales pueden promover expresión constitutiva o
regulada. La expresión regulada puede ser expresión inducible o
reprimible, o ambas cosas a la vez.
Preferiblemente, un segundo promotor de este
tipo es el promotor del gen IE1 de mCMV, o un fragmento funcional
promotor de la expresión del mismo. Por tanto, se prefiere
particularmente que el primer promotor sea el promotor IE2 de mCMV,
o un fragmento funcional promotor de la expresión del mismo, y que
el segundo promotor sea el promotor IE1 de mCMV, o un fragmento
funcional promotor de la expresión del mismo.
El promotor IE1 de mCMV es conocido v.g. por el
documento WO 87/03905. El mismo puede comprender el promotor de
núcleo que contiene los últimos 47 pb de la secuencia de Fig. 1
(recuadro), o secuencias adicionales 100 a 200 pb aguas arriba (es
decir, el promotor proximal), o puede comprender la región
intergénica entera hasta la posición -1330 (con relación a la
posición +1 del IE1, véase Fig. 1).
En una realización preferida, el vector
comprende una secuencia de DNA de SEQ ID NO: 1, con inclusión de
ambos promotores IE1 e IE2 así como el intensificador IE1 y el
nuevo intensificador IE2, o cualquier fragmento funcional promotor
de la expresión de los mismos.
En una realización muy preferida, en el vector
de acuerdo con la invención, el promotor, o un fragmento funcional
promotor de la expresión del mismo, está enlazado operativamente a
una secuencia de DNA que codifica al menos un polipéptido. En una
realización adicional de la invención, el intensificador de la
invención está presente en el vector de expresión junto con una
secuencia de DNA que codifica al menos un polipéptido.
Preferiblemente, la secuencia de DNA codifica
una proteína de interés.
Adicionalmente, se prefiere que la secuencia de
DNA codifique una proteína marcadora, o sea un gen amplificable.
Se prefiere también que la secuencia de DNA
codifique una proteína informadora.
En caso de que el vector de la invención
contenga más de un promotor, puede expresarse a partir del mismo
plásmido cualquier combinación o sub-combinación de
proteína de interés, marcador, informador, gen amplificable,
etc.
De acuerdo con la presente invención, el
polipéptido de interés puede ser cualquier polipéptido que, a
diferencia del polipéptido IE2 propiamente dicho, sea una proteína
extracelular tal como hormonas peptídicas, citoquinas o factores de
crecimiento, o una proteína transmembranal tal como receptores de
factores de crecimiento o receptores de hormonas, o proteínas
intracelulares tales como quinasas, fosfatasas, o proteínas de
fijación de DNA, dependiendo del uso propuesto del polipéptido de
interés o la célula hospedadora en la que se exprese el mismo.
Proteínas marcadoras adecuadas de acuerdo con la
presente invención son p.ej. marcadores de selección negativos o
positivos, o genes amplificables. Ejemplos incluyen proteínas
seleccionadas de adenosina-desaminasa (ADA),
aminoglicosido-fosfotransferasa (NEO),
dihidrofolato-reductasa (DHFR),
higromicina-B-fosfotransferasa
(HPH), timidina-quinasa (tk),
xantina-guanina-fosforribosiltransferasa
(gpt), gen de resistencia a fármacos múltiples (MDR),
ornitina-descarboxilasa (ODC) y resistencia a
N-(fosfonacetil)-L-aspartato (CAD),
o puromicin-acetiltransferasa (TAC). Ejemplos
adicionales incluyen genes utilizados para selección por el uso de
caminos metabólicos particulares tales como galactoquinasa
(Schumperli et al., 1982), el receptor de folato (Zhu et
al., 2001), o el vehículo de folato reducido (Assaraf et
al., 1992).
En otra realización preferida adicional, el
polipéptido de interés es un gen informador.
El término "gen informador" o "proteína
informadora", como se utiliza en esta memoria, tiene por objeto
significar un gen que codifica un producto génico que puede
identificarse utilizando métodos o reactivos simples y económicos,
y que puede estar enlazado operativamente a una región promotora de
la invención o un fragmento activo de la misma. Los genes
informadores pueden utilizarse para determinar la actividad de
transcripción ensayos de cribado (véase, por ejemplo, Goeddel
(compilador), Methods Enzymol., vol. 185, San Diego, Academic Press,
Inc., (1990)), v.g. utilizando luciferasa como gen informador
(Wood, 1991; Seliger y McElroy, 1960; de Wet, et al., (1985),
o disponible comercialmente de Promega®).
Ejemplos se seleccionan de luciferasa, proteína
fluorescente verde, fosfatos alcalinos,
O-galactosidasa, o peroxidasa de rábano picante o
combinaciones intramoleculares con otras proteínas, tales como p.ej.
la Proteína Fluorescente Verde (GFP), o GFP mejorada (EGFP) con el
gen de puromicina-acetiltransferasa (Abbate et
al., 2001) o combinaciones de los mismos.
Los datos experimentales en que se basa la
presente invención han demostrado que la expresión simultánea y
eficiente de polipéptidos de interés puede conseguirse con el
promotor IE2 y el promotor IE1, presentes ambos en el mismo
plásmido. Por esta razón, en una realización preferida adicional,
tanto el promotor IE2 de mCMV, como el promotor IE1 de mCMV, o el o
los fragmentos funcionales promotores de la expresión de los mismos,
están enlazados operativamente a un polipéptido,
respectivamente.
Pueden alcanzarse niveles elevados de expresión
si ambos promotores están presentes en una arquitectura
bidireccional. Por esta razón, el promotor IE2 de mCMV, o fragmento
funcional de promoción de la expresión del mismo, y un promotor, en
particular el promotor IE1 de mCMV, o un fragmento funcional
promotor de la expresión del mismo, están dispuestos
bidireccionalmente.
La expresión "dispuesto
bidireccionalmente", como se utiliza en esta memoria, tiene por
objeto significar que los promotores conducen la transcripción en
direcciones opuestas. A esta configuración del DNA plasmídico se
hace referencia también como una "arquitectura bidireccional"
del vector.
Los promotores del gen IE1 de mCMV o IE2 de
mCMV, o los fragmentos funcionales promotores de la expresión de
los mismos, o cualquier promotor adicional que pueda utilizarse en
combinación con el promotor IE2 de MCVM, o en combinación con el
intensificador de IE2, pueden incluir adicionalmente una señal de
iniciación de la traducción.
En una realización preferida adicional, el
promotor del gen IE2 de mCMV, o un fragmento funcional promotor de
la expresión del mismo, está enlazado a otros elementos que regulan
o influyen en la transcripción. Tales elementos pueden afectar al
procesamiento, la estabilidad o la eficiencia de traducción del RNA.
Ejemplos de elementos adecuados se seleccionan del grupo
constituido por 5'UTRs, intrones, 3'UTRs (véase v.g. Mazumder et
al., 2003), secuencias de procesamiento del extremo 3' de mRNA
(v.g. sitios de poliadenilación), y secuencias IRES para expresión
policistrónica (véase v.g. Mountford y Smith, 1995).
Se prefiere utilizar un elemento IRES para
expresión de mRNAs policistrónicos, en los cuales las secuencias
codificantes están separadas por el IRES. La ventaja es que pueden
expresarse varios polipéptidos de interés a partir del mismo mRNA y
por tanto del mismo promotor.
En otra realización preferida adicional, el
promotor del gen IE2 de mCMV solo, o en combinación con el promotor
del gen IE1 de mCMV, o cualquier otro promotor natural o artificial,
puede estar enlazado a secuencias adicionales promotoras de la
expresión tales como aisladores, elementos DE límite, LCRs (v.g.
descritos por Blackwood y Kadonga (1998)) o regiones de fijación
matriz/entramado (v.g. descritas por Lee et al., 1999).
Las personas expertas en la técnica pueden
apreciar que el vector de la presente invención puede contener
también otros intensificadores, tales como v.g. el intensificador
bien conocido SV40 o el intensificador de hCMV.
De acuerdo con la presente invención, el
polipéptido enlazado operativamente a un primer promotor,
preferiblemente el promotor IE2 de mCMV, y el polipéptido enlazado
operativamente a un segundo promotor, preferiblemente el promotor
IE1 de mCMV, puede ser el mismo. En este caso, están presentes dos
copias del mismo gen en el mismo vector, pero bajo el control de
dos promotores diferentes. Por tanto, puede ser posible alcanzar una
tasa de expresión superior a la expresión de una sola copia de un
gen que codifica un polipéptido de interés.
En una realización alternativa, el polipéptido
enlazado operativamente a un primer promotor, preferiblemente el
promotor IE2 de mCMV, y el polipéptido enlazado operativamente a un
segundo promotor, preferiblemente el promotor IE1 de mCMV, son
diferentes. La invención proporciona por tanto un vector eficiente
para coexpresión de dos polipéptidos diferentes, tales como
marcadores de selección y proteínas de interés, coexpresión de dos
o más subunidades de la misma proteína, o incluso de dominios
diferentes de la misma proteína, en caso de que sea deseable
expresar los mismos por separado uno de otro, pero en la misma
célula hospedadora.
Las personas expertas en la técnica apreciarán
que varios vectores de expresión de acuerdo con la presente
invención pueden co-transfectarse en la misma célula
y servir para la expresión de proteínas y/o subunidades múltiples
de proteínas multímeras muy complejas.
Se prefiere que el polipéptido enlazado
operativamente a un primer promotor, v.g. el promotor IE2 de mCMV,
sea una primera subunidad de una proteína dímera o multímera y el
polipéptido enlazado operativamente a un segundo promotor,
preferiblemente el promotor IE1 de mCMV, sea una segunda subunidad
en una proteína dímera o multímera. La coexpresión de las dos
subunidades de una proteína dímera se prefiere de acuerdo con la
presente invención. La coexpresión de dos subunidades de la misma
proteína es particularmente ventajosa dado que la expresión de
ambos promotores puede dar como resultado la producción de
cantidades similares de subunidades, o de relaciones
predeterminadas de ambos polipéptidos, dependiendo de la fuerza de
los promotores utilizados. Las subunidades pueden ensamblarse luego
en la misma célula para formar una proteína madura.
Ejemplos preferidos de proteínas dímeras
adecuadas para ser expresadas utilizando un vector de la invención
son la cadena alfa y la cadena beta de una hormona peptídica tal
como FSH humana, LH humana, TSH humana y CG humana. Cualquiera de
las dos subunidades puede estar enlazada a un promotor de acuerdo
con la invención, preferiblemente el promotor IL2 de mCMV. Las
personas expertas en la técnica apreciarán que pueden utilizarse
igualmente hormonas de otras especies de acuerdo con la presente
invención, tales como hormonas de equino, porcino y bovino, por
ejemplo, dependiendo del uso pretendido del polipéptido
recombinante.
En otra realización de la invención, la primera
subunidad es la cadena pesada, y la segunda subunidad es la cadena
ligera de una inmunoglobulina, o viceversa. Un ejemplo preferido de
una inmunoglobulina adecuada es una IgG. Tales inmunoglobulinas
pueden, v.g., ser anticuerpos humanizados o humanos para uso
terapéutico. Un ejemplo muy preferido de un anticuerpo humanizado
de este tipo es un anticuerpo humanizado anti-CD11
que tiene el nombre comercial Raptiva®.
Muchos polipéptidos de interés pueden expresarse
utilizando un vector de la invención. En realizaciones preferidas,
el polipéptido se selecciona del grupo constituido por gonadotropina
coriónica, hormona estimuladora de los folículos, hormona
lutropin-coriogonadotrópica, hormona estimuladora
del tiroides, hormona de crecimiento humano, interferones (v.g.,
interferón beta-1a, interferón
beta-1b), receptores de interferón (v.g., receptor
de interferón gamma), receptores p55 y p65 de TNF, interleuquinas
(v.g., interleuquina-2,
interleuquina-11), proteínas de fijación de
interleuquina (v.g., la proteína de fijación de
interleuquina-18), anticuerpos
anti-CD11a, y muteínas, fragmentos, formas
solubles, derivados funcionales, y proteínas de fusión de los
mismos.
Otros polipéptidos preferidos de interés
incluyen, v.g., eritropoyetina, factor estimulador de colonias de
granulocitos, factor estimulador de colonias
granulocitos-macrófagos, hormonas peptídicas de la
hipófisis, gonadotropina menopáusica, factores de crecimiento
semejantes a la insulina, (v.g., somatomedina-C),
factor de crecimiento de los queratinocitos, factor neurotrófico
derivado de líneas de células gliales, trombomodulina, factor de
crecimiento básico de los fibroblastos, insulina, factor VIII,
somatropina, proteína-2 morfogenética de los
huesos, factor de crecimiento derivado de las plaquetas, hirudina,
epoyetina, proteína de fusión recombinante
LFA-3/IgG1, glucocerebrosidasa, y muteínas,
fragmentos, formas solubles, derivados funcionales, y proteínas de
fusión de los mismos.
El segundo aspecto de la invención se refiere a
una célula hospedadora transfectada con al menos un vector arriba
descrito. Las personas expertas apreciarán que la célula hospedadora
puede cotransfectarse igualmente con dos o más vectores de acuerdo
con la presente invención.
Muchas células hospedadoras son adecuadas de
acuerdo con la presente invención, tales como líneas de células
primarias o establecidas a partir de una gran diversidad de
eucariotas con inclusión de células de plantas y animales, células
de mamífero o células humanas. Por ejemplo, células hospedadoras
adecuadas incluyen células CHO, células COS, células CV1, células L
de ratón, células HT1080, células BHK-21, células
HEK293, células NIH-3T3, células LM, células YI,
células NS0 y células de hibridoma de ratón SP2/0 y análogas,
células Namalwa, células RPMI-8226, células Vero,
células WI-38, células MRC-5 u otras
células inmortalizadas y/o transformadas.
Preferiblemente, la célula hospedadora es una
célula CHO, y más preferiblemente una célula CHO-S,
descrita v.g. por Shotwell et al. (1982), J. Biol. Chem.
257: 2974-2980). Las células CHO fueron cultivadas
por primera vez por Puck (J. Exp. Med. 108, 945, 1958) a partir de
una biopsia de un ovario de un hámster chino hembra. A partir de
estas células originales se prepararon varias
sub-líneas con diversas características. Una de
estas líneas de células CHO, CHO-K1, requiere
prolina y es diploide para el gen de la
dihidrofolato-reductasa (DHFR). Otra línea derivada
de esta línea de células es una línea de células CHO deficiente en
DHFR (DHO DUK B11) (PNAS77, 1980, 4216-4220), que
se caracteriza por la pérdida de la función DHFR como consecuencia
de una mutación en un gen DHFR y la pérdida subsiguiente del otro
gen.
\newpage
Todas estas células pueden transfectarse con los
vectores de la presente invención, sea transitoriamente o de manera
semi-estable (v.g., si el vector es episómico), o
estable (v.g. integrado en el genoma). Se prefiere la transfección
estable a fin de establecer clones que expresen continuamente el
polipéptido de interés.
El promotor IE2 de la presente invención puede
utilizarse como elementos reguladores en el marco de una tecnología
denominada "Activación Endógena de Genes". El vector de la
invención puede comprender estar introducido en el locus del genoma
que se supone es activado por recombinación homóloga, enlazando así
operativamente la secuencia reguladora (promotor IE2) con el gen de
interés, cuya expresión se requiere introducir. La tecnología se
describe v.g. en el documento WO 91/09955.
En un tercer aspecto, la invención se refiere a
un proceso para la producción de un polipéptido de interés que
comprende el paso de transfectar una célula hospedadora con un
vector de acuerdo con la invención.
Dependiendo de la naturaleza del polipéptido de
interés, el proceso de acuerdo con la invención conduce a una
proteína o polipéptido secretado que puede cosecharse a partir del
sobrenadante del cultivo de células, o a una proteína de la
membrana celular o proteína intracelular que puede aislarse de las
células por métodos conocidos. El polipéptido producido de acuerdo
con la presente invención puede servir para cualquier finalidad, y
preferiblemente es una proteína terapéutica destinada a
administración a humanos o animales.
Dependiendo del uso propuesto, la célula
propiamente dicha que tiene el polipéptido integrado puede ser el
producto del proceso de acuerdo con la invención. Una célula de este
tipo puede utilizarse v.g. para terapia basada en células.
En un cuarto aspecto, la invención se refiere un
proceso para la producción de un polipéptido de interés que
comprende el paso de cultivar una célula hospedadora de acuerdo con
la invención.
En una realización preferida, el proceso
comprende adicionalmente el paso de aislar el polipéptido de interés
a partir de las células hospedadoras o de un sobrenadante de
cultivo de células. Este paso es particularmente ventajoso y fácil
de llevar a cabo para proteínas secretadas que pueden aislarse
simplemente del sobrenadante del cultivo de células. Sin embargo,
este paso es igualmente aplicable al aislamiento de polipéptidos a
partir de membranas celulares, o compartimientos intracelulares,
que pueden ser aislados de las células hospedadoras.
El proceso puede utilizarse en sistemas de
expresión transitorios, estables, episómicos o virales. Como se
muestra más adelante en los ejemplos, el vector de la invención daba
como resultado una expresión particularmente fuerte de la proteína
deseada si se utilizaba en un sistema de expresión estable. Por
consiguiente, en una realización preferida la transfección es
transfección estable.
En un quinto aspecto, el vector de acuerdo con
la invención se utiliza para expresión de un gen de interés. Genes
de interés pueden ser v.g. los genes que codifican cualquiera de los
polipéptidos de interés arriba mencionados. El vector de la
invención puede utilizarse también para expresión de genes
marcadores, genes informadores, genes amplificables, o
análogos.
Preferiblemente, el vector se utiliza para
expresión simultánea de dos o más genes o cDNAs de interés. El
mismo puede utilizarse también para expresión simultánea de un gen
de interés y un gen marcador o gen informador o gen amplificable, o
análogos.
Dentro del marco de la presente invención se ha
demostrado, sorprendentemente, que un vector de la invención, en
particular un vector que comprende el promotor IE2, el
intensificador IE2, y el promotor IE1, daba como resultado la
identificación de clones que expresaban fuertemente un gen
informador y un gen de interés. Por esta razón, en un sexto
aspecto, la invención se refiere al uso de un vector de acuerdo con
la invención para selección de clones que expresan cantidades
elevadas de un gen de interés.
En un séptimo aspecto, la invención se refiere
al uso de un vector de la invención para la fabricación de un
medicamento para uso en terapia basada en plásmidos o DNA o terapia
génica.
En un octavo aspecto, la célula hospedadora de
la invención se utiliza para la fabricación de un medicamento para
terapia basada en células. En caso de que la terapia basada en
células tenga por objeto tratamiento de humanos, se prefiere que la
célula hospedadora sea una célula o línea de células humana, más
preferiblemente una célula o línea de células derivada del paciente
que debe someterse a tratamiento.
Si bien esta invención se ha descrito en
conexión con realizaciones específicas de la misma, se entenderá
que la misma es susceptible de modificaciones adicionales.
La referencia a pasos de métodos conocidos,
pasos de métodos convencionales, métodos conocidos o métodos
convencionales, no es en absoluto reconocimiento de que ningún
aspecto, descripción o realización de la presente invención se
describa, se proponga o se sugiera en la técnica pertinente.
\newpage
La descripción que antecede de las realizaciones
específicas revelará tan detalladamente la naturaleza general de la
invención que otras personas pueden, aplicando su conocimiento
dentro de la experiencia de la técnica (con inclusión de los
contenidos de las referencias citadas en esta memoria), modificar
y/o adaptar fácilmente para diversas aplicaciones tales
realizaciones específicas sin experimentación excesiva, sin
desviarse del concepto general de la presente invención. Por
consiguiente, se entenderá que dichas adaptaciones y modificaciones
están comprendidas dentro del significado y campo de equivalencia de
las realizaciones descritas, basándose en la doctrina y las
orientaciones presentadas en esta memoria. Debe entenderse que la
fraseología o terminología de esta memoria tiene por objeto servir
de descripción y no de limitación, de tal modo que la terminología
o fraseología de la presente memoria descriptiva debe ser
interpretada por el técnico experto a la vista de la doctrina y
orientaciones presentadas en esta memoria, en combinación con el
conocimiento de una persona con experiencia ordinaria en la
técnica.
Células: CHO-S, origen
Gibco/Invitrogen (Cat. No. 11619).
DNAs plasmídicos construidos como se representa
en Figs. 2 y 3 se aislaron de cultivos estándar de crecimiento
nocturno con el kit Nucleobond PC 500
(Macherey-Nagel Cat. No. 740 574) de acuerdo con el
protocolo del fabricante.
Lipofectamina (Invitrogen, Cat. No.
18324-012)
Formato: placas de 24 pocillos
Células: células CHO-S
Formato: placas de 24 pocillos.
Células: células CHO-S en fase
de crecimiento exponencial se sometieron a pasos 24 h antes de la
transfección. Para evitar una fase estacionaria a baja densidad de
células, las células se diluyeron a 0,75 x 10^{6} células/ml. La
cantidad total de células a transfectar era 1,5 x 10^{5},
resuspendidas en 100 \mul de medio SFM II exento de suero
(Invitrogen, Cat No 12052-114) por pocillo, en
placas de 24 pocillos.
Las mezclas de transfección eran como sigue:
- A)
- lipofectamina: 2 \mul
- Medio SFM II: 48 \mul
- Volumen total 50 \mul
- B)
- DNAs: 1 \mug (50 ng vector de expresión + 950 ng plásmido vehículo, pBluescript II KS (+), Stratagene, Cat 212205-1
- Medio SFM II: complemento hasta 50 \mul.
\vskip1.000000\baselineskip
Se mezclaron las soluciones A y B, y se
incubaron durante 30 min a la temperatura ambiente.
Se añadió esta mezcla a los 100 \mul de medio
SFM II que contenían 1,5 x 10^{5} células. Las células se
pusieron de nuevo en la incubadora y se incubaron a 37ºC, 5%
CO_{2} durante 3 horas.
A continuación, se añadieron 400 \mul de medio
SFM II a fin de diluir la lipofectamina. Seguidamente, se incubaron
las células durante 48 horas más antes de la toma de muestras para
el análisis. Todas las transfecciones se realizaron por
triplicado.
Se utilizó el sistema de ensayo de luciferasa
Bright-Glo de Promega, Cat No E2610 se utilizó para
la medida de luciferasa de acuerdo con las directrices del
fabricante.
Resumidamente, la suspensión de células se
homogeneizó por pipeteado hacia arriba y hacia abajo varias veces,
y se tomó una parte alícuota de 50 \mul, que se puso en una placa
blanca de 96 pocillos (Nunc, Cat No 236108). A continuación, se
añadieron 50 \mul de reactivo Bright-Glo
reconstituido y se incubó durante 5 minutos a la temperatura
ambiente. Se midió la emisión de luz en un luminómetro Centro LB 960
(Berthold Technologies) durante 5 segundos de tiempo de
adquisición.
Las construcciones de vector de expresión que se
utilizaron en un sistema de expresión transitorio basado en células
CHO-S se representan en Fig. 2. En esta serie de
experimentos, se utilizó luciferasa como gen informador para
evaluación de la expresión génica. Se utilizaron como controles
vectores que no tenían promotor alguno (construcción A) o el
promotor/intensificador SV40 (construcción B), que no es muy activo
en células CHO-S.
Los resultados de los experimentos de
transfección transitoria con los vectores A a G se muestran en Fig.
4. En las construcciones C y F, la expresión de luciferasa está
conducida por el promotor IE1. Ambas construcciones dieron como
resultado expresión de luciferasa. La construcción C contenía además
el promotor IE2 dispuesto bidireccionalmente con relación al
promotor IE1. Esta disposición bidireccional reducía la eficiencia
de la expresión del promotor IE1, construcción C, en comparación
con el uso del promotor IE1 solo, construcción F. Una versión corta
de 0,68 kb del promotor IE1 (construcción G) era menos eficiente que
la versión más larga (construcción F).
Con indiferencia de la presencia o ausencia de
un segundo promotor en la misma construcción, el promotor IE2
conducía eficientemente la expresión de luciferasa (construcciones D
y E) y puede utilizarse por tanto como elemento promotor en
vectores de expresión para la expresión de polipéptidos de
interés.
En contraste con el promotor IE1, el promotor
IE2 era menos eficiente si se utilizaba solo (construcción E) que
si se utilizaba en una arquitectura bidireccional (construcción D).
Por consiguiente, el mismo es particularmente adecuado para uso en
vectores de expresión bidireccionales.
Células: CHO-S, de
Gibco/Invitrogen (Cat No 11619).
Se aislaron DNAs plasmídicos (de acuerdo con
Fig. 2) a partir de cultivos estándar de crecimiento nocturno con
el kit Nucleobond PC 500 (Macherey-Nagel Cat. No 740
574) de acuerdo con el protocolo proporcionado por el
fabricante.
Lipofectamina (Invitrogen, Cat. No
18324-012)
Para transfecciones estables, se utilizaron
matraces T75. Se sometieron a pasos las células
CHO-S en fase de crecimiento exponencial 24 h antes
de la transfección. Para evitar una fase estacionaria con densidad
de células baja, se diluyeron las mismas a 0,75 x 10^{6}
células/ml. La cantidad total de células a transfectar era 5 x
10^{6}, resuspendidas en 7 ml de medio SFM II (Invitrogen Cat No
12052-114) en un matraz T75.
Las mezclas de transfección eran como sigue:
- A)
- Lipofectamina: 52,1 \mul
- Medio SFM II: 517,9 \mul
- El volumen total es 570 \mul.
- B)
- DNAs: 10 \mug de DNA plasmídico linealizado (9 \mug vector de expresión Luc + 1 \mug plásmido para selección: SV40 promotor de dirección del gen de resistencia a la puromicina. Todos los plásmidos se linealizaron con PvuI)
- El medio SFM II se complementó hasta 570 \mul.
\vskip1.000000\baselineskip
Se mezclaron A y B, y se incubaron durante 30
min a la temperatura ambiente. Se añadieron 7 ml que contenían 5 x
10^{6} células y las células se pusieron de nuevo en una
incubadora a 37ºC y 5% de CO_{2} durante 3 horas. A continuación
se centrifugó el cultivo a 800 g durante 3 minutos, y el sedimento
de células se resuspendió en 5 ml de EX-CELL 325
(JRH, Cat No 14335-1000M), suplementado con 1X HT y
L-glutamina 4,5 mM (100X HT, Invitrogen, Cat No
11067-030, L-glutamina 200 mM, Sigma
G-7513). Se añadieron 5 ml de
EX-CELL 325 directamente al matraz T75 a fin de
resuspender las células adherentes, y se añadieron la suspensión. En
total, se encontraban 5 x 10^{6} células en 10 ml de medio
EX-CELL 325.
Se aplicó selección 48 horas después de la
transfección por cambio del medio y dilución hasta 1 x 10^{6}
células/ml en EX-CELL 325 que contenía 10 \mug/ml
de puromicina (Sigma, P 8833). Cada dos días, se contaron las
células, se centrifugaron, y se resuspendieron en medio selectivo
reciente a 1 x 10^{6} células vivas/ml. La viabilidad se comprobó
en dichos momentos. Después de 21 a 35 días se completó la
selección, y la viabilidad de las células era mayor que 80%.
Dos horas antes de la toma de muestras del
cultivo, se contaron las células y se diluyó el cultivo a 0,2 x
10^{6} células vivas/ml.
El sistema de ensayo de luciferasa
Bright-Glo de Promega, Cat No E2610 se realizó de
acuerdo con las directrices del fabricante.
Resumidamente, se resuspendieron las células por
pipeteado hacia arriba y hacia abajo varias veces, y se tomó una
parte alícuota de 50 \mul que se puso en una placa blanca de 96
pocillos (Nunc, Cat No 236108). Se añadieron directamente 50 \mul
de Reactivo Bright-Glo reconstituido, y se incubó
durante 5 min a la temperatura ambiente. La emisión de luz se midió
en un luminómetro.
Centro LB 960 (Berthold Technologies) durante 5
segundos de tiempo de adquisición.
La actividad de luciferasa se normalizó luego
por el número de células vivas en la muestra testada, es decir
típicamente 1 x 10^{4}_{ }células.
Las construcciones C, D, E y F (véase Fig. 2) se
sometieron a test en un sistema de expresión estable. Los
resultados se representan en Fig. 5. La construcción E, que
comprendía el promotor IE2 solo, dio como resultado la expresión
más fuerte de luciferasa en este sistema. Si estaba presente con el
promotor IE1 en disposición bidireccional (construcción D), el
promotor IE2 daba todavía como resultado una expresión de luciferasa
que era superior a la expresión conducida por el promotor IE1, sea
solo (construcción F) o en disposición bidireccional con el promotor
IE2 (construcción C).
\vskip1.000000\baselineskip
Las transfecciones se llevaron a cabo como se
describe en los Ejemplos 1 y 2. Resumidamente, células
CHO-S (en suspensión, Gibco SFM II) se
transfectaron transitoriamente con 900, 500, 300 y 100 ng de DNA
vector (construcción C-2, véase Fig. 3) en placas
de 24 pocillos (triplicados para cada condición). Dos días después
de la transfección, se realizaron ensayos de luciferasa con
extractos celulares a partir de los triplicados como se expresaba
por RLU (unidades relativas de luz). Los sobrenadantes de los mismos
pocillos se tomaron antes de la lisis celular, se agruparon y se
ensayaron respecto a IL 18BP por ELISA (véase más adelante).
La cantidad de IL-18BP
recombinante humana (rhIL-18BP) en el sobrenadante
se midió por ELISA estándar utilizando un anticuerpo monoclonal
anti-rh-IL-18BP
purificado de proteína G que estaba acoplado a biotina. Se utilizó
extravidina-HRP (Sigma) como reactivo de
detección.
Fig. 9 muestra las cantidades de
IL-18BP en ng/ml y la luciferasa en RLU expresadas
por 48 clones el día 90 después de transfección estable con una
construcción de promotor mCMV bidireccional (véase Fig. 3). El
límite de detección para luciferasa era aproximadamente 500 RLU, y
2,5 ng/ml para IL-18BP.
En esta serie de experimentos, se ensayó la
expresión concomitante de dos genes de la construcción
C-2, representada en Fig. 3. El gen marcador
(luciferasa) era expresado por el promotor IE1, y el gen de interés,
el gen IL-18BP era expresado por el promotor IE2.
IL-18BP es una proteína secretada. Los promotores se
dispusieron en arquitectura bidireccional, es decir ambos
promotores conducían simultáneamente la expresión en direcciones
opuestas.
Los resultados de este estudio se representan en
Figs. 6 a 9. Fig. 6 muestra la extensión de la expresión de
luciferasa tal como era expresada por RLU medidas en un sistema de
expresión transitoria. En el mismo sistema de expresión
transitoria, IL-18B se midió por ELISA en los
sobrenadantes de cultivo de células. Fig. 7 muestra los resultados
en ng/ml de IL-18B secretada. Fig. 8 muestra las
relaciones de IL-18B a luciferasa en cada
experimento de expresión transitoria.
Como se muestra en Figs. 6 a 8, se utilizaron
cantidades diferentes de DNA plasmídico para la transfección. Todas
las cantidades de DNA utilizadas daban como resultado la expresión
tanto de luciferasa como de IL-18BP.
Sorprendentemente, los mejores resultados se obtuvieron con la
cantidad mínima de DNA transfectada, 100 ng de DNA vector,
consistentemente para IL-18BP y luciferasa.
Adicionalmente, el cociente estable (Fig. 8)
indica una relación constante entre el potencial de expresión de
ambos promotores.
En conclusión, estos datos demuestran que ambos
genes son expresados simultáneamente por las dos unidades
promotoras, demostrando además que ambas unidades de expresión son
plenamente funcionales en la arquitectura bidireccional de los
promotores.
A continuación, se transfectó la construcción
C-2 de manera estable, y se ensayó la expresión de
luciferasa e IL-18BP en 48 clones
independientes.
Se realizaron transfecciones estables de acuerdo
con el protocolo descrito en el Ejemplo 2, con la excepción de que
el medio utilizado después de la transfección era ProCho5 (Cambrex,
Cat. 12766Q).
Para clonación de células simples, la agrupación
se dispuso en placas de 384 pocillos (Nunc, Cat. 164688) a una
densidad de 0,5 células por pocillo (70 \mul/pocillo) utilizando
un dispensador Multidrop (ThermoLabSystems, Cat. 5840150). Ocho
días más tarde, se seleccionaron aleatoriamente 192 clones y se
analizaron para expresión de luciferasa. Se eligieron 48 clones con
la expresión máxima de Luc y se ensayaron de nuevo para la expresión
tanto de luciferasa (luminometría) como de IL-18BP
(por ELISA manual, véase anteriormente).
Fig. 9 muestra los resultados de este
experimento. La totalidad de los 48 clones expresaban luciferasa e
IL-18BP, aunque en cantidades variables.
\vskip1.000000\baselineskip
Se construyeron una serie de vectores que
contenían los promotores mCMV acortados utilizando PCR (Reacción en
Cadena de Polimerasa) e iniciadores específicos que coincidían a lo
largo del mCMVp (Tabla 1).
\vskip1.000000\baselineskip
Las condiciones de la PCR eran como
sigue:
10 ng de plásmido de DNA
(prevmCMV-luciferasa (\DeltaXhoI), construcción E
de Fig. 2)
50 pmol de iniciadores de sentido y antisentido
(véase Tabla 1 más adelante, antisentido común para todos)
200 \muM de cada uno de los dNTPs (dATP, dTTP,
dGTP, dCTP)
1X tampón Dynazyme, que contenía MgCl_{2} 1,5
mM)
4 unidades de DNA-polimerasa
Dynazyme II (Finnzymes, Cat. F-501S)
\newpage
Parámetros de las fases cíclicas:
- 95ºC, 5'
\vskip1.000000\baselineskip
- 2 ciclos:
- 95ºC, 30''
- 52ºC, 30''
- 72ºC, 1'30
\vskip1.000000\baselineskip
- 2 ciclos:
- 95ºC, 30''
- 54ºC, 30''
- 72ºC, 1'30
\vskip1.000000\baselineskip
- 10 ciclos:
- 95ºC, 30''
- 58ºC, 30''
- 72ºC, 1'30
\vskip1.000000\baselineskip
- 15 ciclos:
- 95ºC, 30''
- 60ºC, 30''
- 72ºC, 1'30
\vskip1.000000\baselineskip
Se cargaron 5 \mul de cada reacción PCR en un
gel de agarosa al 1%. Las bandas que tenían la longitud correcta se
cortaron y se purificaron utilizando el kit Qiagen Minilute Gel,
Cat. 28606, antes de la clonación.
\vskip1.000000\baselineskip
Las posiciones correspondientes al número de
pares de bases mantenidos de mCMVp, considerando la posición +1 de
IE2 como referencia, son: -1076, -783, -587, -387 y -189.
La estrategia de clonación para cualquiera de
los fragmentos promotores era la misma, y las PCRs se llevaron a
cabo sobre mCMVp de longitud total
(prevmCMV-Luciferasa (\DeltaXhoI), es decir la
construcción E de Fig. 2). Los fragmentos se digirieron luego por
XhoI/EcoRI, con dos sitios de restricción añadidos en la extremidad
de la secuencia iniciadora específica. La secuencia iniciadora se
retiró luego de la construcción E por digestión de la misma con
XhoI/EcoRI, y se insertaron versiones más cortas exactamente en el
mismo locus.
La evaluación de las construcciones se realizó
por transfección transitoria con lipofectamina seguida por medida
de luciferasa. Los materiales y métodos ulteriores fueron como se
describe en el Ejemplo 1. El medio SFM utilizado en este ejemplo
era ProCho5, Cambrex, B-12766Q.
Se construyeron los vectores H a N (Fig. 10.a)
que comprendían el promotor mCMV IE2 que conducía el gen de
luciferasa con objeto de definir las secuencias mínimas requeridas
para niveles de expresión altos del promotor IE2.
Las siete construcciones de los vectores de
expresión H a N se utilizaron en un sistema de expresión transitoria
basado en células CHO-S. Los resultados se
representan en la Figura 10.b). La construcción L es la construcción
más corta que retiene expresión fuerte de luciferasa en este
sistema. La construcción M daba todavía como resultado expresión de
luciferasa, cuyo nivel era aproximadamente 30% del nivel de
expresión alcanzado con las construcciones H a L. La expresión de
luciferasa obtenida con la construcción N era muy baja pero todavía
significativa, indicativa de actividad basal del promotor como era
de esperar para un sitio productivo de inicio de la transcripción
que contenía una secuencia TATA e iniciador.
En conclusión, estos experimentos definen un
nuevo intensificador en la región aguas arriba de mCMV IE2,
denominado en esta memoria intensificador mCMV IE2. En los
experimentos anteriores, el intensificador IE2 aumenta la
transcripción del promotor IE2 mínimo retenido en la construcción N.
la secuencia mínima requerida para expresión alta del gen
informador está dentro del fragmento de pares de bases -587 a -189
(construcción L), y una construcción que comprendía el fragmento de
pares de bases de -387 a -189 mejoraba todavía la expresión de
luciferasa (construcción M).
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevaron a cabo experimentos adicionales a
fin de evaluar si el nuevo intensificador IE2 satisface de hecho
todos los criterios requeridos para actividad intensificadora, es
decir mejora de la expresión independientemente de (1)
localización, (2) orientación, y (3) identidad promotora. Para hacer
esto, se realizaron las construcciones O a V con objeto de
comprobar que el nuevo intensificador IE2 podría mejorar la
expresión de un promotor heterólogo, el promotor SV40, con
independencia de la orientación, distancia y posición (5' o 3'),
relativas al promotor SV40. Las construcciones W, X e Y eran los
controles, conteniendo W el intensificador SV40, en tanto que X no
contenía intensificador alguno, excepto el promotor SV40, e Y no
contenía intensificador ni promotor.
Se construyó Un vector denominado
pSV-Luc (construcción X de la Figura 11(a))
que contiene únicamente el promotor SV40 a partir de
pGL3-Ctrl (Promega, E 1741), que contenía el
promotor SV40 que conduce el gen de luciferasa, y el intensificador
SV40 localizado en 3' del gen (construcción W), y
pGL3-Basic (Promega, E 1751), que carecía tanto de
promotor como de intensificador (construcción Y).
Resumidamente, se cortó
pGL3-ctrl con NotI/XbaI para aislar un fragmento que
contenía el promotor SV40, seguido por el gen de luciferasa. De
manera similar, se cortó pGL3-Basic con NotI/XbaI y
se aisló la cadena principal del vector que contenía la región
poli-A, sin el intensificador 3'. Por combinación de
los dos fragmentos, se obtuvo pSV-Luc (construcción
X).
La región 5' del promotor SV40 de este vector se
modificó por ingeniería genética por clonación de la secuencia
intensificadora IE2 (-587 a -189) en ambas orientaciones,
denominadas p5'enh-SV-Luc
(construcción O), y p5' reverse enh-SV.Luc
(construcción Q). Adicionalmente, la secuencia intensificadora IE2
(-587 a -189) se clonó también en la región 3' del gen de
luciferasa, en ambas orientaciones. Los vectores resultantes se
designaron p3'enh-SV-Luc+
(Construcción S), y p3' reverseanh-SV.Luc.
(construcción U).
Se realizó el mismo procedimiento con la versión
corta del intensificador IE2, es decir que tenía -387 a -189 en
lugar de -587 a -189, y las construcciones se denominaron P, R, T y
V, véase Fig. 11.a.
Construcción O, P: El vector receptor era
pSV-Luc^{+} (construcción X de Fig. 11a) abierto
por digestión con NheI/SmaI. El intensificador de longitud total se
aisló por digestión con NdeI, seguida por reacción de formación de
extremos romos utilizando polimerasa Klenow, purificación y
digestión con NheI. Se aplicó la misma estrategia para la
elaboración de la construcción intensificadora corta.
Construcción Q, R: El vector receptor era
pSV-Luc^{+} (construcción X de Fig. 11a) abierto
por digestión con XhoI/SmaI. El intensificador de longitud total se
aisló por digestión con NdeI, seguida por reacción de formación de
extremos romos utilizando polimerasa Klenow, purificación y
digestión con XhoI. Se aplicó la misma estrategia para la
elaboración de la construcción intensificadora corta.
Construcción S, T, U y V: El vector receptor es
pSV-Luc^{+} (construcción X de Fig. 11a) abierto
por digestión con BamHI, seguida por formación de extremos romos
polimerasa Klenow. El intensificador de longitud total se aisló por
digestión con NdeI/NheI, seguida por reacción de formación de
extremos romos utilizando polimerasa Klenow. La clonación permitía
ambas orientaciones, lo que se identificó por análisis de
restricción. Se mantuvieron ambas orientaciones para el análisis.
Se aplicó la misma estrategia para la elaboración de la construcción
intensificadora corta.
La construcción pGL3-Basic
(construcción Y) sirvió como control de expresión nula.
pGL3-ctrl (construcción W) sirvió como vector
promotor/intensificador de SV40. pSV-Luc era el
control que tenía el promotor SV40 solo (construcción X).
Las transfecciones y las medidas de luciferasa
se llevaron a cabo como en los ejemplos anteriores.
Los resultados obtenidos con las construcciones
O a Y de Fig. 11a se representan en Fig. 11b. La construcción del
promotor SV40 sin intensificador se tomó como línea base para la
actividad de intensificador añadida, y la actividad medida con la
construcción X se estableció como 1. Todas las construcciones que
tenían el intensificador IE2 largo o el corto daban como resultado
la expresión del gen informador. La versión larga daba
consistentemente como resultado una expresión alta del gen
informador por el promotor SV40, que era mucho mayor que el nivel
de expresión obtenido con la combinación del promotor SV40 y el
intensificador SV40 (construcción O). Por tanto, este experimento
define claramente la secuencia -587 a -189 y la secuencia -387 a
-189 como intensificadores auténticos, que activan un promotor
heterólogo de manera independiente de la posición y orientación.
Los protocolos experimentales para transfección
con lipofectamina, seguida por medida de luciferasa, se describen en
el Ejemplo 1.
En este experimento, las construcciones O y Q,
que tenían la versión larga del nuevo intensificador IE2 en ambas
orientaciones en 5' del promotor SV40, se utilizaron para
comparación con un intensificador fuerte conocido, el
intensificador hCMV (citomegalovirus humano). A este fin, la
secuencia mCMV IE2 se reemplazó por la secuencia intensificadora
hCMV (SEQ ID NO: 2) en la construcción O, dando como resultado la
construcción O-2. Se hizo esto mismo en la
construcción Q, dando como resultado la construcción
Q-2.
La secuencia intensificadora hCMV que tenía
sitios MluI (MluI = acgcgt) que la flanqueaban, que se utilizaron
para la clonación, era como sigue:
- Se digirió SV-Luc^{+} con MluI, y se trató con fosfatasa alcalina de intestino de ternero a fin de prevenir la autoligación. La secuencia promotora hCMV se clonó en el sitio MluI. Los clones de ambas orientaciones se mantuvieron para comparación con construcciones IE2 equivalentes.
Los resultados de expresión de luciferasa se
muestran en Fig. 12. Los niveles de expresión de luciferasa
obtenidos con el nuevo intensificador IE2 (versión larga) eran al
menos dos veces mayores que los niveles de expresión de luciferasa
obtenidos con el intensificador clásico hCMV.
Se diseñaron dos construcciones adicionales para
testar el nuevo intensificador en una arquitectura bidireccional,
denominados construcciones #26 y #140 como se representa en Fig.
13.
#26: La base de este vector era
mCMV-Luc^{+} (construcción C, Fig. 3). Se digirió
con SacII/EcoRI. La casete IL-18BP se tomó de
phCMV-IL18BP2. Por corte de este vector con
SacII/EcoRI, se aisló un fragmento que contenía el intrón A seguido
por el marco de lectura abierto de IL-18BP y la
región SV40poliA.
#140. La base de este vector era la construcción
L de Fig.10.a. Se digirió con XhoI/NheI, abriendo el vector 5' del
intensificador IE2. Se utilizó como donante de inserción un vector
que expresaba IL-18BP a partir del promotor IE1,
denominado pBS.I IL-18BP(IE1).1. Por
digestión de este vector con XhoI/SpeI, se aisló un fragmento que
contenía el promotor IE1 de XhoI (véase Fig. 1) seguido por la
casete IntrónA-IL18BP-SV40poliA. La
construcción resultante carecía de la secuencia entre -589 a XhoI
de la secuencia promotora mCMV original.
Se llevaron a cabo transfecciones estables y
medida de luciferasa como se describe en el Ejemplo 2, y el ELISA
de IL18BP como se describe en el Ejemplo 3.
Sin embargo, la construcción #140 no refleja
exactamente la construcción #126 en el sentido de que los promotores
IE1 e IE2 están en orientación inversa. Así, la expresión de
luciferasa estaba conducida por el promotor IE1 en la construcción
#26, y en cambio por el promotor IE2 en la construcción #140, y la
expresión de IL-18BP estaba conducida por el
promotor IE2 en la construcción #26 y por el promotor IE1 en la
construcción #q40.
Los resultados obtenidos con ambas
construcciones se muestran a continuación, dado que son
significativos para el efecto simultáneo del nuevo intensificador
IE2 sobre dos promotores diferentes en un vector de expresión
bidireccional (construcción #140).
Fig. 14 representa los resultados de
agrupaciones transfectadas de manera estable con la construcción #26
y #140 en términos de la expresión de luciferasa e
IL-18BP. La construcción #140 daba como resultado
una expresión más alta tanto del gen marcador (luciferasa) como del
gen de interés (IL-18BP).
Con objeto de evaluar la estabilidad de
expresión de luciferasa e IL-18BP, las agrupaciones
se mantuvieron o bien en condiciones selectivas, es decir bajo
tratamiento con puromicina, o se mantuvieron sin presión selectiva
(sin puromicina) durante 3 semanas. Los resultados se muestran en
Figs. 15 a 17. Los niveles de expresión del gen informador de
luciferasa y el IL-18BP no cambiaban
significativamente a lo largo del tiempo, véase Fig. 16 y 17.
Así pues, se demostró que ambas construcciones
#26 y #140 exhibían niveles de expresión similares a lo largo del
tiempo, en presencia o ausencia de presión de selección. Por tanto,
las construcciones que tienen el nuevo intensificador IE2 son
adecuadas para expresión estable y simultánea de dos genes.
Dado que los resultados anteriores se obtuvieron
en agrupaciones, se derivaron clones por dilución limitante a 0,5
células/pocillo a partir de ambas agrupaciones.
Los clones se cultivaron bajo selección con
puromicina, a fin de evaluar los niveles de expresión clonales. A
continuación, los clones aislados se dividieron en presencia y
ausencia de puromicina para monitorizar eventualmente su
estabilidad. Los resultados presentados en Figs. 18 y 19 se tomaron
antes de dividir los clones en condiciones +/- de puromicina. Los
resultados de dos semanas después de la eliminación de la puromicina
no exhibían diferencia significativa alguna para ambas
construcciones, lo que sugería su estabilidad. Este estudio se
continuará a lo largo de otras 10-12 semanas.
Con objeto de evaluar la expresión de ambos
genes se utilizó un formato de alta capacidad, a saber en placas de
96 pocillos:
Día 1: dilución ½ de las células, 100
\mul de medio de cultivo ProCho5 (exento de suero) + 100 \mul de
ProCho5 nuevo que contenía 5% de suero bovino fetal. Con 2,5% de
concentración final de FBS, las células eran capaces de fijarse. El
sometimiento a pasos semanalmente de la placa de mantenimiento se
realizó en un factor de dilución 1/20, en todos los casos en medio
ProCho5.
Día 2: Se desechó el medio, se lavó una
sola vez con 200 \mul de 1x PBS (Invitrogen,
10010-015), y 75 \mul de ProCho5 nuevo que
contenía 5% de FBS añadido, y se incubó durante un pulso de
expresión de 24 h.
Día 3: Se recuperaron 50 \mul de los
sobrenadantes, y se añadieron 200 \mul de tampón Elisa (1 x PBS,
0,1% p/v BSA, 0,2% v/v Tween 20). Se analizaron 100 \mul por ELISA
para IL-18BP.
Los pocillos se lavaron con 200 \mul de 1 x
PBS (que se desechó) y se añadieron 100 \mul de tampón
Glo-Lysis (Promega, E266a). Los pocillos se
incubaron durante 30 min a la temperatura ambiente para asegurar la
lisis celular. La medida de luciferasa se realizó utilizando 30
\mul de células lisadas transferidas en una placa blanca de 96
pocillos + 30 \mul de reactivo Bright-Glo
reconstituido. La emisión de luz se midió en un luminómetro Centro
LB960 durante 5 segundos de tiempo de adquisición.
Los análisis de los clones obtenidos a partir de
transfecciones estables con la construcción #26 se representan en
Fig. 18, y los resultantes de la transfección estable con la
construcción #140 en Fig. 19.
Los clones representados en Figs. 18 y 19 se
clasificaron por su valor de luciferasa en orden descendente. La
expresión de IL18BP se indicó como valor DO. (Dado que el ELISA se
llevó a cabo en formato de alta capacidad, no pudo obtenerse la
cuantificación real de los niveles de IL-18BP. Sin
embargo, se incluyeron controles a 2500 ng/ml y 250 ng/ml y una
prueba en blanco para monitorizar la variación de placa a placa.
Fig. 20 muestra la expresión de luciferasa en
las placas en vista ChemiDoc invertida. Esta lista utiliza una
cámara CCD (Biorad), que permite adquirir señales procedentes de
quimioluminiscencia (como en Fig. 20). Un software denominado
Quantity One 4.2.3 permite el tratamiento de las imágenes, como
inversión de las señales, lo que se empleó en este caso.
Como resulta evidente por los resultados que se
muestran en Figs. 18 a 20, la construcción #140 daba como resultado
una gran cantidad de clones no expresantes. Sin embargo,
sorprendentemente, los pocos clones positivos expresaban ambos
genes muy intensamente.
Por consiguiente, la construcción #140 permite
el cribado para expresadores muy fuertes en fases de clonación muy
tempranas, omitiendo así la necesidad de someter a test y el
seguimiento de números elevados de clones a fin de identificar los
pocos clones que expresan intensamente ambos genes de interés.
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\vskip1.000000\baselineskip
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<150> EP03100617.4
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
11-03-2003
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<160> 2
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<170> PatentIn version 3.1
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<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1394
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cytomegalovirus murino
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1394)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cytomegalovirus murino
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
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<211> 644
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (40)
1. Un vector de expresión que comprende un
promotor mCMV-IE2 constituido por un fragmento
funcional promotor de la expresión de SEQ ID NO:1, en donde:
- (i)
- el vector de expresión no contiene ningún gen completo del mCMV; y
- (ii)
- dicho promotor de mCMV-IE2 está enlazado operativamente a una secuencia de DNA que codifica un polipéptido.
2. El vector de la reivindicación 1, en donde
dicho promotor mCMV-IE2 comprende el promotor de
núcleo IE2 que abarca desde el nucleótido 1 al 39 de SEQ ID NO:
1.
3. El vector de la reivindicación 2, en donde
dicho promotor mCMV-IE2 comprende adicionalmente una
secuencia de 100 a 200 nucleótidos aguas arriba de dicho promotor
de núcleo IE2.
4. El vector de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente un
intensificador mCMV-IE2 constituido por un fragmento
funcional intensificador de la expresión de SEQ ID NO: 1.
5. El vector de la reivindicación 4, en donde
dicho intensificador de mCMV-IE2 comprende los
nucleótidos -387 a -189 de la región aguas arriba de
mCMV-IE2, numerándose los nucleótidos con relación a
+1 del gen IE2.
6. El vector de acuerdo con la reivindicación 5,
en donde dicho intensificador mCMV-IE2 comprende los
nucleótidos -587 a -189 de la región aguas arriba de
mCMV-IE2, numerándose los nucleótidos con relación a
+1 del gen IE2.
7. El vector de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente un
promotor diferente de dicho promotor mCMV-IE2.
8. El vector de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende un primer y un segundo
promotor de origen viral, celular o artificial.
9. El vector de la reivindicación 8, en donde el
primer promotor es el promotor mCMV-IE2, y el
segundo promotor es el promotor mCMV-IE1.
10. El vector de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende la secuencia de DNA de
SEQ ID NO: 1.
11. El vector de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 10, en donde los promotores primero y segundo
están enlazados operativamente a secuencias de DNA que codifican al
menos un polipéptido.
12. El vector de la reivindicación 11, en donde
las secuencias de DNA codifican al menos una proteína de
interés.
13. El vector de acuerdo con la reivindicación
11, en donde las secuencias de DNA codifican al menos una proteína
marcadora.
14. El vector de acuerdo con la reivindicación
11, en donde las secuencias de DNA codifican al menos una proteína
informadora.
15. El vector de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 14, en donde el primer promotor y el segundo
promotor están dispuestos bidireccionalmente.
16. El vector de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente uno o más
elementos reguladores seleccionados de 5' UTRs, intrones, 3' UTRs,
secuencias de procesamiento del extremo 3' de mRNA, sitios de
poliadenilación, y secuencias internas de entrada de ribosoma
(IRES).
17. El vector de acuerdo con la reivindicación
16, en donde el elemento regulador es una IRES, que comprende
adicionalmente una secuencia de DNA codifica al menos un mRNA
policistrónico.
18. El vector de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente uno o más
elementos de DNA seleccionados de aisladores, elementos límite,
regiones de locus de control (LCRs), regiones de fijación de matriz
(MARs), y elementos para recombinación e intercambio de casetes.
19. El vector de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 18, en donde la secuencia de DNA que codifica
el polipéptido enlazado operativamente al primer promotor y la
secuencia de DNA que codifica el polipéptido enlazado
operativamente al segundo promotor codifican el mismo
polipéptido.
20. El vector de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 18, en donde la secuencia de DNA que codifica
el polipéptido enlazado operativamente al primer promotor y la
secuencia de DNA que codifica el polipéptido enlazado
operativamente al segundo promotor codifican polipéptidos
diferentes.
21. El vector de acuerdo con la reivindicación
20, en donde la secuencia de DNA que codifica el polipéptido
enlazado operativamente al primer promotor codifica una primera
subunidad de una proteína dímera o multímera y la secuencia de DNA
que codifica el polipéptido enlazado operativamente al segundo
promotor codifica una segunda subunidad de una proteína dímera o
multímera.
22. El vector de acuerdo con la reivindicación
21, en donde una subunidad es la cadena alfa y la otra subunidad es
la cadena beta de una hormona seleccionada de FSH humana, LH humana,
TSH humana y CG humana.
23. El vector de acuerdo con la reivindicación
20, en donde una subunidad es la cadena pesada y la otra subunidad
es la cadena ligera de una inmunoglobulina.
24. El vector de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 23, en donde la proteína de interés se
selecciona de FSH, LH, CG, TSH, hormona del crecimiento, interferón,
proteína I de fijación de TNF, proteína II de fijación de TNF,
Raptiva®, IL-18BP, o muteínas, fragmentos, derivados
funcionales, y proteínas de fusión de las mismas.
25. El vector de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 24, en donde la proteína marcadora se
selecciona de adenosina-desaminasa (ADA),
aminoglicosido-fosfotransferasa (neo),
dihidrofolato-reductasa (DHFR),
higromicina-B-fosfotransferasa
(HPH), timidina-quinasa (tk),
xantina-guanina-fosforribosiltransferasa
(gpt), gen de multirresistencia a los fármacos (MDR),
ornitina-descarboxilasa (ODC) y resistencia a
L-(fosfonacetil)-L-aspartato (CAD),
puromicin-acetiltransferasa (PAC), galactoquinasa,
receptor de humano folato, o vehículos de folato reducidos.
26. El vector de acuerdo con las
reivindicaciones 14 a 25, en donde la proteína informadora se
selecciona de luciferasa, proteína fluorescente verde, fosfatos
alcalinos, y peroxidasa de rábano picante o combinaciones de los
mismos.
27. Un vector de expresión que comprende un
promotor mCMV-IE2 constituido por un fragmento
funcional promotor de la expresión de SEQ ID NO: 1, en donde dicho
promotor está constituido por una secuencia seleccionada del grupo
constituido por:
- (i)
- el promotor IE2 de núcleo que abarca desde el nucleótido 1 al 39 de SEQ ID NO: 1;
- (ii)
- una secuencia que comprende el promotor IE2 de núcleo que abarca desde el nucleótido 1 al 39 de SEQ ID NO: 1 y una secuencia de 100 a 200 nucleótidos aguas arriba de dicho promotor IE2 de núcleo; y
- (iii)
- la secuencia de SEQ ID NO: 1.
28. El vector de acuerdo con la reivindicación
27, en donde dicho promotor del gen de mCMV-IE2 o
dicho fragmento funcional promotor de la expresión del mismo está
enlazado operativamente a una secuencia de DNA que codifica un
polipéptido.
29. El vector de acuerdo con la reivindicación
28, en donde dicho polipéptido se selecciona de FSH, LH, CG, TSH,
hormona del crecimiento, interferón, proteína I de fijación de TNF,
proteína II de fijación de TNF, Raptiva®, IL-18BP,
o muteínas, fragmentos, derivados funcionales, y proteínas de fusión
de los mismos.
30. Una célula hospedadora transfectada con un
vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
anteriores.
31. La célula hospedadora de acuerdo con la
reivindicación 30, en donde la célula hospedadora es una célula
CHO.
32. Un proceso para la producción de un
polipéptido que comprende el paso de transfectar una célula
hospedadora con al menos un vector de acuerdo con un cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 29.
33. El proceso de acuerdo con la reivindicación
32, en donde la transfección es transfección estable.
34. Un proceso para la producción de un
polipéptido que comprende el paso de cultivar una célula hospedadora
de acuerdo con la reivindicación 30 ó 31 en condiciones que
permitan la expresión del polipéptido.
35. El proceso de acuerdo con la reivindicación
32, 33 ó 34, que comprende adicionalmente el paso de aislar el
polipéptido de la célula hospedadora o del sobrenadante del cultivo
celular.
36. Uso de un vector de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 29 para expresión de un gen de
interés.
37. Uso de un vector de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 29 para selección de clones que
expresan cantidades elevadas de un gen de interés.
38. Uso de un vector de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 8 a 26 para expresión simultánea de dos o
más genes o DNAs de interés.
39. Uso de un vector de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 29 para la fabricación de un medicamento
para terapia basada en DNA.
40. Uso de una célula hospedadora de acuerdo con
la reivindicación 30 ó 31 para la fabricación de un medicamento para
terapia basada en células.
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2015
- 2015-05-20 US US14/716,937 patent/US20150252383A1/en not_active Abandoned
- 2015-06-10 JP JP2015117538A patent/JP2015180222A/ja active Pending
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