MXPA05009608A

MXPA05009608A - Vectores de expresion que comprenden el promotor mcmv ie2.

Info

Publication number: MXPA05009608A
Application number: MXPA05009608A
Authority: MX
Inventors: Markus Imhof
Original assignee: Applied Research Systems
Priority date: 2003-03-11
Filing date: 2004-03-10
Publication date: 2006-03-21
Also published as: WO2004081167A2; HRP20050705B1; CN100429315C; RS20050687A; SI1601776T1; EA200501444A1; AU2004219917B2; CA2516157C; PL1601776T3; US20110008839A1; ZA200506400B; JP5848202B2; EP1601776B1; KR20050113193A; CY1108344T1; JP2006520589A; DE602004014738D1; CA2516157A1; RS50488B; PT1601776E

Abstract

La presente invencion se refiere a un vector de expresion que comprende el promotor del gen del mCMV-IE2, o un fragmento del mismo que promueve la expresion funcional, y/o un mejorador del gen del mCMV-IE2, o un fragmento del mismo que mejora la expresion funcional, en donde el vector de expresion no contiene algun gen completo del mCMV.

Description

VECTORES DE EXPRESION QUE COMPRENDEN EL PROMOTOR MCMV IE2 CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a vectores de expresión que comprenden el promotor del gen mCMV-IE2, o un fragmento del mismo que promueve la expresión funcional, y/o un me orador del gen mCMV-IE2, o un fragmento del mismo que mejora la expresión funcional, en donde el vector de expresión no contiene algún gen completo del mCMV, a células hospederas que contienen tales vectores, a métodos para producir polipéptidos deseados usando estos vectores de expresión, y a usos de dichos vectores de expresión. Los vectores de expresión que comprenden el promotor mCMV IE2 y el promotor mCMV IE1, opcionalmente junto con el nuevo mejorador mCMV IE2, son preferidos de conformidad con la invención, particularmente si ambos promotores están acomodados en una arquitectura bi-direccional . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Desde décadas, los vectores de expresión han sido usados como vehículos para la expresión de genes o ADNc que codifican polipéptidos o proteínas de interés en las células hospederas. Los promotores y mejoradores celulares o virales fuertes, están siendo usados para expresar el gen de interés a niveles altos usando transfeccion temporal o estable de ADN REF. : 166141 recombinante en las células hospederas . La región temprana inmediata (TI) del citomegalovirus humano (hCMV) ha sido mostrada por ser particularmente estable en este sentido, y vectores de expresión que comprenden elementos del gen derivados de esta región se conocen, por ejemplo, del documento EP0323997B1. Hasta hoy, las secuencias reguladoras del gen a partir de citomegalovirus murino (mCMV) , han sido usadas raramente, aunque elementos regulatorios derivados del mCMV fueron identificados por ser poderosos y aún más fuertes que la contraparte humana ( im et al. 2002) . El documento US 4,963,481 (de Villiers) , describe vectores de expresión que tienen un ADN que codifica una proteína heteróloga bajo el control transcripcional de fragmentos de ADN derivados de la región del gen mCMV IE2 que incluye un fragmento Pstl de endonucleasa de restricción de aproximadamente 2270 pares base (pb) , aislado del genoma viral. Una versión truncada de 1387 pb de este fragmento, resulta en mejoramiento significante en la eficacia del fragmento de ADN como un promotor de la expresión de la proteina heteróloga. El documento US 4,968,615 (Kozinowski) , describe moléculas de ADN recombinante que contienen mejoradores de la transcripción a partir del citomegalovirus murino (MCMV) , el cual puede ser usado para mejorar la transcripción de genes estructurales en células eucarióticas . El mej orador mCMV se dice , está localizado dentro del fragmento Pstl de 2 . 27 kb identificado por de Villiers (documento US 4963 , 481) . Manning y Mocarski (1988) analizaron la importancia funcional de la región mCMV IE2 para la replicación del citomegalovirus murino. Con este fin, un virus reccmbinante se construye, teniendo el gen reportero lacZ bajo el control transcripcional del mej orado /promotor mCMV IE, de este modo, interrumpiendo el gen IE2. De hecho, no se podría observar la expresión del gen IE2, y el virus replicado normalmente. Los autores de este modo, concluyen que el gen IE2, que no está conservado entre los citomegalovirus tales como el mCMV y el hC V, no fue esencial para la replicación del virus . No se describió o sugirió indicación de alguna utilidad particular de la región mej oradora/promotora IE2 por Manning y Mocarski . Literatura más reciente mostró una diferencia adicional entre la región CMV IE de ratón y humana . El locus de ratón expresa un segundo AR m principal en la dirección opuesta del primer gen IE . Este segundo gen temprano inmediato se llamó IE2 , y su secuencia promotora referida como el promotor IE2 (Messerle et al . 1991) . La región IE2 del mCMV no ha sido usada en vectores para la expresión de las proteínas heterólogas , hasta ahora . SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa en el hallazgo de que un vector que tiene un elemento de ADN que comprende la región promotora IE2 del mCMV, puede accionar eficientemente la expresión de un gen de interés en células hospederas transfectadas . La invención, además, se basa en la identificación de un nuevo mejorador en la región del mCMV IE2, la cual es aquí llamada mejorador mCMV IE2. Este mejorador cumple completamente el criterio comúnmente aplicado para la definición de mejorador, es decir, mejora la expresión independientemente de (1) ubicación, (2) orientación y (3) mejoramiento de la expresión a partir de un promotor heterólogo . Por lo tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a un vector de expresión que comprende el promotor del gen mCMV IE2, o un fragmento del mismo que promueve la expresión funcional, y/o un mejorador del gen mCMV IE2, o un fragmento del mismo que mejora la expresión funcional, en donde el vector de expresión no contiene algún gen completo del mCMV. En un segundo aspecto, la invención se refiere a una célula hospedera que comprende un vector de conformidad con la invención. Un tercer aspecto de la invención se refiere a un proceso para la producción de un polipéptido de interés que comprende la etapa de transfectar una célula hospedera con un vector de conformidad con la invención.

En un cuarto aspecto, la invención se refiere a un proceso para la producción de un polipéptido de interés que comprende la etapa de cultivar la célula hospedera de la invención. Un quinto aspecto de la invención se refiere al uso de un vector de conformidad con la invención para la expresión de uno o más genes o ADNc de interés . En un sexto aspecto, la invención se refiere al uso de un vector de la invención para la selección de clones que expresan altas cantidades de un gen de interés . Un séptimo aspecto se refiere al uso de un vector de conformidad con la presente invención en terapia a base de ADN. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra la secuencia de un elemento de ADN bi- direccional derivado de la región mCMV IE2 para uso en constructos de expresión. Los sitios +1 y los cuadros TATA de los promotores IE2 e 1E1 están indicados, respectivamente. Los promotores nucleares para ambos genes se muestran en un cuadro. Se muestran en negritas los sitios de restricción Hpal y Xhol . La posición -682 está indicada con respecto a +1 de IE1. La Figura 2 muestra el constructo reportero A hasta G. El gen reportero de luciferasa se muestra como una linea en negritas y los promotores están indicados como flechas abiertas . A: Control menos promotor negativo (Básico pGL3) . B: Un vector reportero de luciferasa acciona el promoto /mejorador SV40 (control pGL3) . C: Acciona el promotor IE1 de la expresión de luciferasa (acciona IE1, Luciferasa pmCMV) . D: Acciona el promotor IE2 de la expresión de luciferasa (acciona IE2, luciferasa prevmCMV) . E: Acciona el promotor IE2 de la expresión de luciferasa, promotor IE1 suprimido (Luciferasa prevmCMV (sol) , acciona IE2, menos IE1) . F: Acciona el promotor IE1 de la expresión de luciferasa, y promotor IE2 suprimido (Luciferasa pBS.MCMV3, acciona IE1 (1.4 kb) , menor IE2) . G: Una versión corta del promotor IE1 acciona la expresión de Luciferasa (Luciferasa p-680, acciona IE1 (versión corta, 0.68 kb) ) . La Figura 3 muestra un constructo bi-direccional similar al constructo C de la Figura 2 (constructo C-2) con la secuencia codificante para IL-18BP (línea negrita) ligada al promotor IE2. De este modo, en este constructo, el promotor mCMV IE1 acciona la expresión de luciferasa, y simultáneamente, el promotor mCMV IE2 acciona la expresión IL-18BP. Triángulo: intrón: Óvalos cerrados: poliA.

La Figura 4 muestra la expresión del gen reportero de Luciferasa a partir de diferentes constructos reporteros que se representan en la Figura 2, constructos A hasta G. Las células CHO-S que crecen en un medio libre de suero (MLS) fueron temporalmente transíectados con los constructos A hasta G, o transíectadas falsamente. La actividad de luciferasa se expresa como ULR = Unidades ligeras relativas . La Figura 5 muestra la expresión de Luciferasa medida como ULR en combinaciones estables de células CHO-S transíectadas . Las células se hicieron crecer en MLS después de la transfeccion con constructos D, C, F y E, como se representa en la Figura 2. La expresión de luciferasa se valoró después de 21 días de selección.

La Figura 6 muestra la expresión de Luciferasa medida como ULR después de la transfeccion temporal con 900, 500, 300 y 100 ng del constructo bi-direccional C-2 mostrado en la Figura 3. La Figura 7 muestra la cantidad de IL-18BP en ng/1 en los sobrenadantes de cultivo celular a partir del experimento de transfeccion temporal de conformidad con la Figura 6 (constructo C-2) . La Figura 8 muestra la relación de las cantidad es de IL-18BP contra la Luciferasa medida en el experimento de conformidad con las Figuras 6 y 7.

La Figura 9 muestra las cantidades de Luciferasa en ULR (eje y izquierdo) y IL-18BP en ng/ml (eje y derecho) expresadas por 48 clones individuales que fueron escogidos 8 días después de la transfección con el constructo bi-direccional C-2 (como se muestra en la Figura 3) . El límite de detección para Luciferasa fue aproximadamente 500 ULR, y 2.5 ng/ml para IL-18BP. Cada incremento en el eje X representa un único clon. La Figura 10 (a) muestra los constructos reporteros H hasta N. El gen reportero de luciferasa (Luc) se muestra como una línea negrita y los promotores IE1 e IE2 respectivos, están indicados como flechas abiertas. Los mejoradores se muestran como óvalos grises: Gris ligero para el mejorador IE1 conocido, y el gris oscuro para el nuevo mejorador IE2. H: Constructo bidireccional con la expresión de luciferasa accionada por el promotor IE2. I: La expresión de luciferasa fue accionada por el promotor IE2, y el promotor IE1 se suprimió; J, K, L, M, E: promotores mCMV acortados contenidos en los constructos, las posiciones que corresponden al número de pares base de mCMVp, con relación al +1 de IE2 como referencia: J: desde -1076 K: desde -783 L: desde -587 M: desde -387 N: desde -189 La Figura 10 (b) muestra la expresión de lucíferasa en ULR de los constructos reporteros H hasta N de conformidad con la Figura 10 (a) , después de la transfección temporal de células CHO-S que se hicieron crecer en un medio libre de suero. La Figura 11(a) muestra constructos reporteros adicionales O hasta Y que combinan el nuevo mejorador IE2 (óvalo gris) con el promotor SV40. El óvalo gris representa el mejorador IE2 desde -587 hasta -189, la mitad del óvalo gris representa el mejorador IE2 desde -387 hasta -189. La flecha arriba del mejorador IE2 indica la dirección de la secuencia mejoradora. El gen reportero de luciferasa se muestra como una linea negrita, el promotor SV40 está indicado como una flecha abierta. Óvalo negro: poliA. 0: secuencia mejoradora IE2 larga (-587/-189) clonada 5' del promotor SV40; P: secuencia mejoradora IE2 corta (-387/-189) clonada 5' del promotor SV40; Q: secuencia mejoradora IE2 larga (-587/-189) clonada 5' del promotor SV40 en la orientación inversa; R: secuencia mejoradora IE2 corta (-387/-189) clonada 5' del promotor SV40 en la orientación inversa; S: secuencia mejoradora IE2 larga (-587/-189) clonada 3' del gen Luciferasa; T: secuencia mejoradora IE2 corta (-387/-189) clonada 3' del gen Luciferasa; U: secuencia mejoradora IE2 larga (-587/-189) clonada 3' del gen Luciferasa en la orientación inversa; V: secuencia mejoradora IE2 corta (-387/-189) clonada 3' del gen Luciferasa en la orientación inversa; W: promotor SV40 de control y me orador SV40 en 3' de la secuencia que codifica Luciferasa. X: Expresión de Luciferasa de control, accionada por el promotor SV40 sin algún mejorador Y: control, negativo, sin promotor en todos. gura 11 (b) muestra la expresión de Luciferasa a partir de constructos reporteros O hasta Y como se muestra en la Figura 11 (a) . Las células CHO-S que crecen en un medio libre de suero (MLS) fueron temporalmente transíectadas con constructos 0 hasta Y. La actividad de luciferasa se expresó como veces de inducción comparada con el control X (valor 1) , es decir, la expresión accionada por el promotor SV40 sin algún mejorador. Barras abiertas: mejorador IE largo (-587 hasta -189), barras delgadas: mejorador IE2 cortas (-387 hasta -189). Eje X es una escala logarítmica.

La Figura 12 muestra un experimento que compara el nuevo mejorador IE2 con el mejorador hCMV conocido. Las células fueron transíectadas con el constructo de control A (pGL3 básico, véase Figura 2, menor promotores) , constructo de control B (pGL3 control, véase Fig. 2, promotor SV40 con la secuencia mejoradora SV40 en 3 ' de la región que codifica a luciferasa) , constructo de control X (SV-Luc+, véase Figura lia, promotor SV40 sin mejorador) , así como también constructos O y Q (véase Figura lia) o constructos 0-2 y Q-2, en el cual, la secuencia mejoradora IE2 (versión larga, -587 hasta -189) fue reemplazada por la secuencia mejoradora hCMV conocida (SEC ID NO: 2) . La luciferasa se midió en ÜLR (eje x) . Barras delgadas: con mej orador hCMV conocido. Barras grises: con el nuevo me orador IE2. La Figura 13 muestra el vector bi-direccional usado para la expresión simultánea de IL-18BP y Luciferasa. Los promotores IE1 e IE2 están indicados como flechas abiertas. El triángulo representa el intrón A desde la región hCMV IE, y el óvalo gris la señal de poliadenilación. Los cuadrados cerrados representan el péptido señal. Constructo #25: Luciferasa expresada del promotor IE1 e IL-18PB a partir del promotor IE2. La secuencia muestra ambos promotores como en el constructo H de la figura 10a. Constructo #140: Luciferasa expresada por el promotor IE2 e IL-18BP a partir del promotor IE1- El mejorador IE2 (-587 hasta -189) está localizado entre los dos promotores . Figura 14 muestra las cantidades de Luciferasa expresada (ULR, eje y izquierdo) e IL-18BP (ng/ml, eje Y derecho) después de la transfección temporal de las células CHO que crecen en medio libre de suero con ya sea el constructo #26 ó #140 de conformidad con la Figura 13. Barras: expresión de luciferasa, rombos cerrados: expresión IL-18BP. Figura 15 muestra la expresión de luciferasa (ULR, eje y izquierdo) e IL-18PB (ng/ml, eje y derecho) en combinaciones estables transíectadas con ya sea el constructo #26 ó #140 de conformidad con la Figura 13. La expresión se midió 7 semanas posteriores a la transfección. Las células se mantuvieron bajo selección con puromicina (+puro) , o por 3 semanas sin selección de puromicina (-puro). Barras: expresión de Luciferasa, rombos cerrados: expresión IL-18BP. Figura 16 muestra el curso de tiempo de la expresión de luciferasa como en el experimento' de la Figura 15. El eje x representa tiempo en semanas. Los datos mostrados en la Figura 15 corresponden a los datos de 3 semanas en la Figura 16. Rombos cerrados: #26 + puro, cuadrados pequeños: #140 + puro, triángulos cerrados: #26 - puro, cuadrados grandes: #140 - puro. La Figura 17 muestra el curso de tiempo de expresión IL-18BP en el experimento de conformidad con la Figura 16. las leyendas como en la Figura 16. La Figura 18 se analizaron proto-clones individuales para la expresión de luciferasa (cuadrados) en ULR (eje y izquierdo) y expresión IL-18BP (rombos) en ng/ml (eje y derecho) . Cada incremento en el eje x represetan proto- clon individual . Los protoclones fueron establecidos a partir de células CHO establemente transfectadas con el constructo #26 y se mantuvieron bajo selección de puromici a . La Figura 19 Como en la Figura 18, ambos protoclones fueron establecidos de células transfectadas con el constructo #140. La Figura 20 Los protoclones transfectados ya sea con el constructo #26 o #140 fueron analizados para determinar la expresión de Luciferasa en un formato de 96 cavidades, visión ChemiDoc invertida. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN De conformidad con la presente invención, se ha encontrado sorprendentemente, que el promotor del gen dos inmediatamente temprano (IE2) del citomegalovirus murino (mCMV) es eficiente en promover la expresión de un polipéptido de interés que no es la proteína misma mCMV IE2, es decir, de un polipéptido o proteína de interés. Este vector de expresión no está supuesto por ser el citomegalovirus murino mismo, o contiene algunos genes virales mCMV completos, pero es un vector concebido para la expresión de proteína recombinante . Por lo tanto, la invención se refiere a un vector de expresión que comprende el promotor del gen mCMV-IE2, o un fragmento promotor de expresión funcional del mismo, en donde el vector de expresión no contiene algún gen completo del mCMV. Además de esto, se ha identificado un nuevo mej orador en la región mCMV IE2, el cual es llamado aquí el mej orador mCMV IE2 , o el mej orador IE2. Este mej orador incrementa la expresión irrespectivo de su ubicación y orientación vis-a-vis el gen, y mejora la expresión a partir de promotores heterólogos, de este modo, cumpliendo completamente con el criterio general de un mej orador. La invención por lo tanto, también se refiere a un vector de expresión que comprende el mejorador del gen mCMV-lE2, o un fragmento del mismo que mejora la expresión funcional, en donde el vector de expresión no contiene algún gen completo del mCMV.

Las personas expertas en la técnica apreciarán que el vector de la invención puede comprender el promotor mCMV IE2 solo, o en combinación con algún mej orador apropiado conocido. La persona experta en la técnica también apreciará que el vector de la invención puede comprender el mej orador mCMV IE2 solo, o en combinación con algún promotor adecuado. Además, el vector de la invención puede comprender el promotor mCMV IE2 en combinación con el mej orador mCMV IE2. El gen mCMV IE2 mismo es conocido por ejemplo de Messerle, et al., 1991. El término "promotor" como se usa aquí, se refiere a una región de ADN que funciona para controlar la transc ipción de una o más secuencias de ADN, y que está es truc turalmente identificado por la presencia de un sitio de enlace para la polimerasa de ARN dependiente del ADN y de otras secuencias de AD , las cuales interactúan para regular la función promotora. Un fragmento que promueve la expresión funcional de un promotor es una secuencia promotora acortada o truncada que retiene la actividad como un promotor. La actividad del promotor puede ser medida en cualquiera de los ensayos conocidos en la técnica, por ejemplo, en un ensayo reportero usando Luciferasa como gen reportero (Wood, 1391; Seliger and McElroy, 1960; de Wet et al. (1985), o comercialmente disponible de Promega®) .

De conformidad con la presente invención, el promotor IE2 puede, por ejemplo, comprender una secuencia de empalme de la posición +1 al cuadro TATA como se indica en la Figura 1. El promotor IE2 puede también comprender una secuencia aquí llamada "promotor nuclear" de empalme que parte del nucleótido 1 hasta 39 de la secuencia demostrada en la Figura 1. (cuadro). La persona experta en la técnica apreciará que la secuencia del promotor mCMV IE2 puede ser más larga o más corta que el promotor nuclear, tan pronto como accione la transcripción de una secuencia de ADN operablemente ligada a este. Por ejemplo, el promotor IE2 puede también comprender 100-200 pares de bases corriente arriba del promotor nuclear. Tal región promotora es también llamada el "promotor próximo" . la persona experta en la técnica además apreciará que los términos "promotor" y "mejorador" (véase abajo) , no son exactamente definidos y que de este modo, el promotor puede comprender regiones mej oradoras, o las regiones mejoradoras pueden comprender regiones promotoras, dependiendo de la nomenclatura y contexto. El término "vector" se refiere a cualquier portador del ADN o ARN exógeno que es útil para transferir el ADN exógeno a una célula hospedera para replicación y/o expresión apropiada del ADN exógeno por la célula hospedera. El término "operablemente ligado" como se usa aquí, significa funcionabilidad fusionando un promotor con un gen estructural o ADNc o cualquier otra secuencia de ADN a ser transcrita en la estructura apropiada para expresar el gen, el ADNc u otro ADN bajo control del promotor. El término operablemente ligado, como se usa aquí, no está así limitado a un fusión directa de las secuencias de ADN. El término "gen completo del mCMV" se refiere a un gen viral del citomegalovirus murino que tiene sus propios elementos de regulación 5' y 3' (endógeno, viral) . Una "región mejoradora" se refiere a una región de ADN que funciona para incrementar la transcripción de uno o más genes. Más específicamente, el término "mejorador" como se usa aquí, es un elemento regulatorxo de ADN que refuerza, aumenta, mejora o alivia la expresión de un gen irrespectivo de su ubicación y orientación vis-á-vis al gen a ser expresado, y puede ser reforzando, aumentando, mejorando o aliviando la expresión de más de un promotor. Preferiblemente, el mejorador mejora la expresión de más de un promotor simultáneamente. Un fragmento mejorador de la expresión funcional de un mejorador es una secuencia mejoradora acortada o truncada que retiene la actividad mejoradora . El vector de la invención preferiblemente comprende un fragmento que incluye nucleótidos -387 hasta -189 de la región 3' de mCMV IE2, la numeración de nucleótido es relativa a +1 del gen IE2. Este es el fragmento que tiene la función mejoradora, y es aquí llamado versión corta del mejorador IE2. En una modalidad preferida adicional, el vector comprende un fragmento que incluye los nucleotidos -587 hasta -189 de la región 3' de mCMV IE2, la numeración de nucleótido es relativa a +1 del gen IE2. Este fragmento tiene la función mejoradora, y es aquí también llamado la versión larga del mejorador IE2. El vector de la invención puede también comprender aún un mejorador mCMV IE2 adicional, o un fragmento mejorador de la expresión funcional del mismo, aquí llamado el "mej orador mCMV IE1" . Tal mejorador mCMV IE1 es conocido en la técnica, por ejemplo, del documento US 4,968,615. Puede por ejemplo, empalmarse de la posición -587 a la -147, o de la posición -682 a -147 de la secuencia mostrada en la Figura 1, la numeración es relativa a la posición +1 del gen IE1. El mej orador mCMV IE1 que puede ser usado de conformidad con la presente invención, puede además comprender una secuencia de empalme a partir del par de base -1330 hasta -488, con relación a la posición +1 del IE1 en la Figura 1. La región mej oradora puede comprender toda o parte de un promotor también. Usando un me orador mCMV además del promotor IE2 , la expresión del polipéptido de interés puede además ser incrementad . De conformidad con la presente invención, el vector además comprende un promotor que es diferente del promotor mC V IE2, o un fragmento del mismo que promueve la expresión funcional. En una modalidad preferida, el vector de la invención comprende un primero y un segundo promotor de origen viral, celular o artificial, o un fragmento del mismo que promueve la expresión funcional . De conformidad con la presente invención, se ha mostrado que la presencia de un segundo promotor conduce a la expresión eficiente de un polipéptido de interés a partir del promotor mCMV IE2. Por lo tanto, en una modalidad preferida, el vector comprende el promotor mCMV IE2 en combinación con un segundo promotor, o un fragmento del mismo que promueve la expresión funcional. Ejemplos para promotores adecuados adicionales incluyen el promotor hCMV, el promotor de metalotoineina ( T) , el promotor SV40, o promotor artificial. Preferiblemente, el segundo promotor es una copia adicional del promotor mCMV IE2. Tales promotores adicionales pueden promover la expresión constitutiva o regulada. La expresión regulada puede ser inducible o represible, o ambas. Preferiblemente, tal segundo promotor es el promotor del gen mCMV IEl, o un fragmento del mismo que promueve la expresión funcional. Es de este modo particularmente preferido, que el primer promotor sea el promotor mCMV IE2, o un fragmento del mismo que promueve la expresión funcional, y el segundo promotor sea el promotor mCMV IE1, o un fragmento del mismo que promueve la expresión funcional . El promotor mCMV IE1 es conocido por ejemplo, del documento O 87/03905. Puede comprender el promotor nuclear que contiene los últimos 47 pb de la secuencia de la Figura 1 (cuadro) , o 100 hasta 200 pb de secuencias corriente arriba adicionales (es decir, el promotor próximo) , o puede comprender la región intergénica completa hasta la posición -1330 (con relación a la posición +1 del IE1, véase Figura 1) · En una modalidad preferida, el vector que comprende una secuencia de ADN de la SEC ID NO.l, que incluye tanto el promotor IE1 como el IE2, así como también el me orador IE1 y el nuevo mejorador IE2 , o cualquier fragmento del mismo que promueve la expresión funcional . En una modalidad altamente preferida, en el vector de conformidad con la invención, el promotor o un fragmento del mismo que promueve la expresión funcional, está operablemente ligado a una secuencia de ADN que codifica por al menos, un polipéptido. En una modalidad adicional de la invención, el mejorador de la invención está presente en el vector de expresión, junto con una secuencia de ADN que codifica por al menos, un polipéptido. Preferiblemente, la secuencia de ADN codifica para una proteína de interés . Se prefiere además, que la secuencia de ADN codifique a una proteína marcadora, o sea un gen amplificable . También se prefiere que la secuencia de ADN codifique para una proteína reportera. El vector de la invención debe contener más de un promotor, cualquier combinación o subcombinación de proteína, marcador, reportero, gen amplificable, etc., de interés, puede ser expresado a partir del mismo plásmido. De conformidad con la presente invención, el polipéptido de interés puede ser cualquier polipéptido el cual es diferente del polipéptido IE2 mismo, es una proteína extracelular tal como hormonas peptídicas, citocinas o factores de crecimiento, o una proteína de la transmembrana tal como los receptores del factor de crecimiento o receptores de hormonas, o proteínas intracelulares tales como cinasas, fosfatasas o proteínas de enlace al ADN, dependiendo del uso propuesto del polipéptido de interés o la célula hospedera en la cual está expresado. Las proteínas marcadoras adecuadas de conformidad con la presente invención son por ejemplo, marcadores de selección negativos o positivos o genes amplificables .

Ejemplos incluyen proteínas seleccionadas de adenosina desaminasa (ADA) , fosfotransferasa de aminoglicósido (neo) , reductasa dihidrofolato (DHFR) , higromícin-B-fosfotransferasa (HPH) , cinasa timidina (tk) , fosforibosiltransferasa de xantina-guanina (gpt) , gen de resistencia múltiple al fármaco (MDR) , descarboxilasa ornitina (ODC) y resistencia a N-(fosfonacetil) -L-aspartato (CAD) , o actiltransferasa de puromicina (PAC) . Ejemplos adicionales incluyen genes usados por selección por uso de trayectorias metabólicas particulares tales como galactocinasa (Schumperli et al., 1982), el receptor folato (Zhu et al., 2001) o portador de folato reducido (Assaraf et al., 1992). En aún una modalidad preferida adicional, el polipéptido de interés es un gen reportero. El término "gen reportero" o "proteína reportera" como se usa aquí, está propuesto por significar un gen que codifica un producto de gen que puede ser identificado usando métodos o reactivos simples, baratos, y que pueden estar operablemente ligados a una región promotora de la invención o un fragmento activo del mismo. Los genes reporteros pueden ser usados para determinar la actividad transcripcional en ensayos de selección (véase por ejemplo, Goeddel (ed.), Methods Enzymol . , Vol . 185, San Diego. Academic Press, Inc. (1990)), por ejemplo, usando Luciferasa como gen reportero ( ood, 1991? Seliger and McElroy, 1960; de Wet et al. (1985), o disponible comercialmente de Promega®) . Se seleccionan ejemplos a partir de la proteína fluorescente verde, luciferasa, fosfatasas alcalinas, 0-galactosidasa o peroxidasa de rábano picante o combinaciones intramoleculares con otras proteínas, tales como por ejemplo, la Proteína Fluorescente Verde (GFP) o GFP mejorada (EGFP) con el gen de acetiltransferasa de puromicina (Abbate et al., 2001), o combinaciones de las mismas. Datos experimentales de la presente invención se basan en mostrar que la expresión simultánea eficiente de polipéptidos de interés se puede lograr a partir del promotor IE2 e IEl, ambos presentes en el mismo plásmido. Por lo tanto, en una modalidad preferida adicional, tanto el promotor mCMV IE2 como el promotor mCMV IEl, o los fragmentos de los mismos que promueven la expresión funcional, están operablemente ligados a un polipéptido, respectivamente. Se pueden lograr niveles de expresión si ambos promotores están presentes en una arquitectura bi-direccional. Por lo tanto, el promotor mCMV IE2, o un fragmento del mismo que promueve la expresión funcional, y un promotor, en particular el promotor mCMV IEl, o un fragmento del mismo que promueve la expresión funcional, están acomodados bi-direccionalmente . El término "acomodado bi-direccionalmente" como se usa aquí, está propuesto por significar que los promotores accionan la transcripción en direcciones opuestas. Este acomodo del ADN plásmido es también referido como una "arquitectura bi-direccional" del vector. Los promotores del gen del mCMV IE1 o mCMV IE2, o los fragmentos del mismo que promueven la expresión funcional, o cualquier promotor adicional que puede ser usado en combinación con el promotor del mCMV IE2, o en combinación con el mejorador IE2, pueden además, incluir una señal de iniciación de traducción. En una modalidad preferida adicional, el promotor del gen del mCMV IE2 , o un fragmento del mismo que promueve la expresión funcional, o el mejorador mCMV IE2, está ligado a otros elementos que regulan o influencian la transcripción. Tales elementos pueden afectar el procesamiento, estabilidad o eficiencia de traducción del AR . Ejemplos de elementos adecuados se seleccionan del grupo que consiste de 5'UTR, intrones, 3'UTRs (véase por ejemplo, Mazumder et al, 2003), secuencias de procesamiento de extremo ARNm 3' (por ejemplo, sitios de poliadenilación) , y secuencias IRES para expresión policistrónica (véase por ejemplo, Mountford and Smith, 1995) . Se prefiere usar un elemento IRES para la expresión de AR ms policistrónico, en el cual, las secuencias codificantes están separadas por el IRES. La ventaja de que varios polipéptidos de interés pueden ser expresados a partir del mismo AR m y de este modo, del mismo promotor. En aún una modalidad adicional, el promotor del gen mCMV IE2 solo, o en combinación con el promotor del gen mCMV IEl, o cualquier otro promotor natural o artificial, o el mejorador IE2, puede estar ligado a secuencias que promueven la expresión adicional tales como aisladores, elementos límite, LCR (por ejemplo, descritos por Blackwood and Kadonga (1998)) o regiones de unión matriz/escalonada (por ejemplo, como se describe por Li et al., 1999) . Las personas expertas en la técnica pueden apreciar que el vector de la presente invención puede también contener mejoradores adicionales, tales como por ejemplo, el mej orador SV40 bien conocido o el mejorador hCMV. De conformidad con la presente invención, el polipéptido operablemente ligado ,a un primer promotor, preferiblemente el promotor mCMV IE2, y el polipéptido operablemente ligado a un segundo promotor, preferiblemente el promotor mCMV IEl, pueden ser el mismo. En este caso, dos copias del mismo gen están presentes en el mismo vector, pero bajo el control de dos diferentes promotores. De este modo, puede ser posible lograr una velocidad de expresión superior a la expresión a partir de una copia única de un gen que codifica un polipéptido de interés. En una modalidad alternativa, el polipéptido operablemente ligado a un primer promotor, preferiblemente el promotor mCMV IE2, y el polipéptido operablemente ligado a un segundo promotor, preferiblemente el promotor mCMV IE1, son diferentes. La invención así se proporciona para un vector eficiente para la co-expresión de dos diferentes polipéptidos, tal como los marcadores de selección y proteínas de interés, co-expresión de dos o más subunidades de la misma proteína, o aún de dominios diferentes de la misma proteína, debe ser deseable expresarlos separadamente entre sí, pero en la misma célula hospedera. Las personas expertas en la técnica apreciarán que varios vectores de expresión de conformidad con la presente invención, pueden ser co-transfectados en la misma célula y servir para la expresión de proteínas múltiples y/o subunidades de proteínas absolutamente multiméricas complejas. Se prefiere que el polipéptido operablemente ligado a un primer promotor, por ejemplo, el promotor mCMV IE2, sea una primera subunidad de una proteína dimérica o multimérica y el polipéptido operablemente ligado a un segundo promotor, preferiblemente el promotor mCMV IE1, en una segunda subunidad de una proteína dimérica o multimérica. La coexpresión de las dos sub-unidades de una proteína dimérica es preferida de conformidad con la presente invención. La coexpresión de dos sub-unidades de la misma proteína es particularmente ventajosa, puesto que la expresión en ambos promotores puede resultar en la producción de cantidades similares de subunidades, o de velocidades predeterminadas de ambos polipéptidos , dependiendo de la resistencia de los promotores usados . Las subunidades pueden entonces ensamblarse en la misma célula para formar una proteína madura . Ejemplos preferidos para proteínas diméricas adecuadas para ser expresadas usando un vector de la invención son la cadena alfa y cadena beta de una hormona peptídica, tal como la FSH humana, LH humana, TSH humana y CG humana. Cualquiera de las dos subunidades puede estar ligada a un promotor de conformidad con la invención, preferiblemente el promotor mCMV IE2. Las personas expertas en la técnica apreciarán que las hormonas de otras especies pueden ser igualmente usadas de conformidad con la presente invención, tal como hormonas equinas, porcinas, bovinas, por ejemplo, dependiendo el uso propuesto del polipéptido recombinante . En otra modalidad de la invención, la primera subunidad es la cadena pesada, y la segunda subunidad es la cadena ligera de una inmunoglobulina o viceversa. Un ejemplo preferido de una inmunoglobulina adecuada es un IgG. Tales inmunoglobulinas pueden por ejemplo, ser humanizadas o anticuerpos humanos para uso terapéutico. Un ejemplo altamente preferido para tal anticuerpo humanizado es un anticuerpo anti-CDll humanizado que tiene la marca comercial apt va®. Muchos polipéptidos de interés pueden ser expresados usando un vector de la invención. En modalidades preferidas, el polipéptido se selecciona del grupo que consiste de gonadotropina coriónica, hormona estimulante del folículo, hormona lutropina-coriogonadotrópica, hormona estimulante de la tiroides, hormona de crecimiento humano, interferonas (por ejemplo, beta-la interferona, beta-Ib interferona) , receptores de interferona (por ejemplo, receptor gama interferona), receptores de TNF p55 y p65, interleucinas (por ejemplo, interleucina-2 , interleucina-11) , proteínas de enlace a interleucina (por ejemplo, proteína de enlace a interleucina-18) , anticuerpos anti-CDlla, y muteínas, fragmentos, formas solubles, derivados funcionales, proteínas de fusión de las mismas . Otros polipéptidos preferidos de interés incluyen, por ejemplo, eritropoyetina, factor de estimulación de la colonia del granulocito, factor de estimulación de la colonia del macrófago del granulocito, hormonas peptídicas de la pituitaria, gonadotropina menopáusica, factores de crecimiento similares a la insulina (por ejemplo, somatomedina-C) , factor de crecimiento del queratinocito, factor neurotrófico derivado de la línea de células gliales, trombomodulina, factor de crecimiento del fibroblasto básico, insulina, Factor VIII, somatropina, proteína-2 morfogenética ósea, factor de crecimiento derivado de plaquetas, huridina, epoyetina, proteína de fusión recombinante LFA-3/lgGl, glucocerebrosidasa y muteínas, fragmentos, formas solubles, derivados funcionales, proteínas de fusión de los mismos. El segundo aspecto de la invención se refiere a una célula hospedera transfectada con al menos, un vector descrito anteriormente. Las personas expertas apreciarán que la célula hospedera puede igualmente ser co-transfectada con dos o más vectores de conformidad con la presente invención. Muchas células hospederas son adecuadas de conformidad con la presente invención, tales como líneas de células primarias o establecidas a partir de una amplia variedad de eucariótas que incluyen células de plantas y animales, células mamífero o humanas. Por ejemplo, células hospederas adecuadas incluyen células CHO, células COS, células CV1, células L de ratón, células HT1080, células BHK-21, células HEK293, células NIH-3T3, células LM, células YI, células de hibridoma de ratón NSO y SP/20 y similares, células Namalwa, células RPMI-8226, células Vero, células I-38, células MRC-5 u otras células inmortalizadas y/o transformadas . Preferiblemente, la célula hospedera es una célula CHO, y más preferiblemente una célula CHO-S, descrita por ejemplo, por Shotwell et al. (1982, J Biol . Chem. 257:2974-2980) . Las células CHO fueron cultivadas primero por Puck (J. Exp. Med. 108, 945, 1958), de una biopsia de un ovario de un hámster Chino hembra. De estas células originales, se prepararon un número de sub-líneas con varias características. Una de estas líneas de células CHO, CHO-K1, es la que requiere prolina y es diploide para el gen de reductasa dihidrofolato (DHFR) . Otra línea derivada de esta línea de células es una línea de células CHO deficientes en DHFR (CHO DUK Bll) (PNAS 77, 1980, 4216-4220), la cual está caracterizada por la pérdida de la función DHFR como una consecuencia de una mutación en un gen DHFR y la subsecuente pérdida del otro gen. Todas estas células pueden ser transíectadas con los vectores de la presente invención, ya sea temporalmente, o en una manera semi-estable (por ejemplo, si el vector es episonal) o estable (por ejemplo, integrado en el genoma) . La transfección adecuada es preferida para establecer clones que continuamente expresan el polipéptido de interés . El promotor IE2 de la presente invención, o el mej orador IE2, pueden ser usados como elementos regulatorios en la estructura de una tecnología llamada "Activación de Gen Endógeno" . El vector de la invención puede comprender ser introducido en el sitio del genoma el cual es supuesto por ser activado por la recombinación homologa, de este modo, operablemente enlazando la secuencia regulatoria (promotor y/o mejorador IE2) con el gen de interés, la expresión del cual se requiere ser inducida o mejorada. La tecnología se describe por ejemplo, en el documento WO 91/09955. En un tercer aspecto, la invención se refiere a un proceso para la producción de un polipéptido de interés que comprende la etapa de transfectar una célula hospedera con un vector de conformidad con la invención. Dependiendo de la naturaleza del polipéptido de interés, el proceso de conformidad con la invención conduce a una proteína o polipéptido secretado que puede ser cosechado del sobrenadante de cultivo celular, o a una proteína de membrana celular o proteína intracelular que puede ser aislada de las células por métodos conocidos . El polipéptido producido de conformidad con la presente invención puede servir a cualquier propósito, y preferiblemente es una proteína terapéutica propuesta para administración a humanos o animales . Dependiendo del uso propuesto, la célula misma que tiene el polipéptido integrado puede ser el producto del proceso de conformidad con la invención. Tal célula puede por ejemplo, ser usada para la terapia a base de células. En un cuarto aspecto, la invención se refiere a un proceso para la producción de un polipéptido de interés que comprende la etapa de cultivar una célula hospedera de conformidad con la invención.

En una modalidad preferida, el proceso además comprende la etapa de aislar el polipéptido de interés a partir de las células hospederas o sobrenadante de cultivo celular. Esta etapa es particularmente ventajosa y fácil de llevar a cabo para proteínas secretadas que pueden ser aisladas simplemente del sobrenadante de cultivo celular. Sin embargo, esta etapa aplica igualmente a los polipéptidos aislantes de membranas celulares o compartimientos celulares, que pueden ser aislados de células hospederas. El proceso puede ser usado en sistemas de expresión temporal, estable, episomal o viral. Como se muestra en los ejemplos abajo, el vector de la invención resulta en una expresión particularmente fuerte de la proteína deseada si se usa en un sistema estable de expresión. Por lo tanto, en una modalidad preferida, la transfección es transfección estable. En un quinto aspecto, el vector de conformidad con la invención es usado para la expresión de un gen de interés . Los genes de interés pueden ser por ejemplo, los genes que codifican para cualquiera de los polipéptidos de interés mencionados anteriormente. El vector de la invención puede también ser usado para la expresión de genes marcadores, genes reporteros, genes amplificables o similares. Preferiblemente, el vector es usado para la expresión simultánea de dos o más genes o ADNc de interés. Puede también ser usado para la expresión simultánea de un gen de interés y un gen marcador o gen reportero, o gen amplificable, o similares. En la estructura de la presente invención, se ha mostrado sorprendentemente, que un vector de la invención, en particular un vector que comprende el promotor IE2, el mejorador IE2, y el promotor IE1, resultan en la identificación de clones que altamente expresan un gen reportero y un gen de interés. Por lo tanto, en un sexto aspecto, la invención se refiere al uso de un vector de conformidad con la invención para la selección de clones que expresan cantidades altas de un gen de interés . En un séptimo aspecto, la invención se refiere al uso de un vector de la invención para la manufactura de un medicamento para uso en un plásmido o ADN basado en terapia o terapia del gen. En un octavo aspecto, la célula hospedera de la invención es usada para la manufactura de un medicamento para la terapia a base de células . Debe ser propuesta la terapia a base de células, para tratamiento humano, se prefiere que la célula hospedera sea una célula humana o una línea celular, más preferiblemente, una célula o línea celular derivada del paciente que está siendo tratado. Habiendo ahora descrito completamente esta invención, se apreciará por aquellos expertos en la técnica, que la misma puede ser realizada dentro de un amplio intervalo de parámetros equivalentes, concentraciones y condiciones sin apartarse del espíritu y ámbito de la invención y sin la experimentación indebida. Mientras esta invención ha sido descrita en conjunto con las modalidades específicas de la misma, se entenderá que es capaz de modificaciones adicionales . Esta solicitud está propuesta para cubrir algunas variaciones, usos o adaptaciones de la invención siguiendo, en general, los principios de la invención e incluir tales apartados de la presente descripción como entran dentro de la práctica conocida y habitual dentro de la técnica a la cual pertenece la invención y como puede ser aplicada a las características esenciales anteriormente expuestas como sigue en el ámbito de las reivindicaciones adjuntas. Todas las referencias citadas en este documento, artículos de periódico o resúmenes, solicitudes de patente Estadounidenses o extranjeras, publicadas o no publicadas, patentes Estadounidenses o extranjeras publicadas o cualquiera de otras referencias, están completamente incorporadas por referencia en este documento, incluyendo todos los datos, tablas, figuras y texto presentado en las referencias citadas. Adicionalmente , los contenidos completos de las referencias citadas dentro de las referencias mencionadas en este documento, también están completamente incorporados por referencia.

La referencia a etapas de métodos conocidos, etapas de métodos convencionales, métodos conocidos o métodos convencionales, no está ausente de admisión de cualquier aspecto, descripción o modalidad de la presente invención siendo descrita, pensada o sugerida en la técnica relevante. La descripción mencionada anteriormente de las modalidades específicas, completamente revelará la naturaleza general de la invención que otros pueden, aplicando el conocimiento dentro de la habilidad de la técnica (incluyendo los contenidos de las referencias citadas en este documento) , fácilmente modificar y/o adaptar para varias aplicaciones de tales modalidades específicas, sin experimentación indebida, sin apartarse del concepto general de la presente invención. Por lo tanto, tales adaptaciones y modificaciones están propuestas por estar dentro del significado e intervalo de equivalentes de las modalidades descritas, basados en las enseñanzas y guías presentadas en este documento. Se entiende que la fraseología o terminología de este documento, es para propósitos de descripción y no de limitación, de manera tal que la terminología o fraseología de la presente especificación es para ser interpretada por la persona experta en vista de las enseñanzas y guías presentadas en este documento, en combinación con el conocimiento de uno de habilidades ordinarias en la técnica.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 ; Evaluación de los vectores de expresión en transfecciones temporales Materiales Células: de origen CHO-S, Gibco/Invitrogen (Cat. No 11619) . Plásmidos de ADN construidos como se representa en las Figuras 2 y 3 fueron aislados a partir de cultivos estándares que crecen durante la noche con el kit Nucleobond PC 500 (Macherey-Nagel Cat. No 740 574), de conformidad con el protocolo del fabricante.

Transfeccion: Lipofectamina (Invitrogen, Cat No 18324-012) Formato: placas de 24 cavidades Células: Células CHO-S en fase de crecimiento exponencial fueron pasadas 24 horas antes de la transfeccion. Para evitar una fase estacionaria en baja densidad celular, las células fueron diluidas a 0.75 x 106 células/ml. La cantidad total de células a ser transfectadas fue de 1.5 x 105, resuspendidas en 100 µ? en un medio libre de suero MLS II (Invitrogen, Cat No 12052-114) por cavidad, en placas de 24 cavidades.

Las mezclas de transfecciones fueron como sigue: A) Lipofectamina: 2 µ? Medio MLS II: 48 µ? Volumen total es 50 µ? . B) ADN: 1 µg (50 ng de vector de expresión + 950 ng de plásmido portador, pBluescript II KS(+), Stratagene, cat. 212205-01. Medio MLS II: complemento a 50 µ?. Se mezclaron las soluciones A y B, e incubaron por 30 minutos a temperatura ambiente. Esta mezcla se agregó a 100 µ? de medio MLS II que contiene células 1.5 x 105. Las células fueron colocadas nuevamente en el incubador e incubadas por 37°C, 5% de C02 por 3 horas. Después, se agregaron 400 µ? de medio MLS II para diluir la Lipofectamina. Después, las células fueron incubadas por otras 48 horas antes de ser muestreadas para análisis . Todas las transfecciones se llevaron a cabo por triplicado .

Medición de Luciferasa: El sistema de ensayo de Luciferasa Bright-Glo de Promega, Cat No E2610, se usó para la medición de Luciferasa, de conformidad con las guias del fabricante . Brevemente, la suspensión celular se homogenizó pipeteando ascendentemente y descendentemente varias veces, y se tomó una alícuota de 50 µ? y se colocó en una placa blanca de 96 cavidades (Nunc, Cat no 236108) . Después, 50 µ? de Reactivo Bright-Glo reconstituido se agregó e incubó por 5 minutos a temperatura ambiente. Se midió la emisión de luz en un luminómetro Centro LB 960 (Berthold Technologies) durante 5 segundos del tiempo de adquisición.

Resultados Los constructos del vector de expresión que se usaron en el sistema de expresión temporal basado en las células CHO-S, se representan en la Figura 2. En esta serie de experimentos, la Luciferasa se usó como un gen reportero para la evaluación de la expresión del gen. Vectores que no tienen ya sea promotor en todos (constructo A) o el promotor/mejorador SV40 (constructo B) , el cual no es altamente activo en células CHO-S, fueron usados como controles . Los resultados de los experimentos de transfección temporal con vectores A hasta G se muestran en la Figura 4. En los constructos C y F, la expresión de Luciferasa se acciona por el promotor IE1. Ambos constructos resultaron en la expresión de Luciferasa. El constructo C además contiene el promotor IE2 acomodado bi-direccionalmente con respecto al promotor IE1. Este acomodo bi-direccional reduce la eficiencia de expresión del promotor IE1, Constructo C, comparado con el uso del promotor IE1 solo, constructo F. Una versión corta de 0.68 kb del promotor IE1 (constructo G) , fue menos eficiente que la versión larga (constructo F) . Irrespectivo de la presencia o ausencia de un segundo promotor en el mismo constructo, el promotor IE2 acciona eficientemente la expresión de Luciferasa (constructos D y E) y puede de este modo, ser usado como un elemento promotor en los vectores de expresión para la expresión de polipéptidos de interés. Contrario con el promotor IE1, el promotor IE2 fue menos eficiente si se usó solo (constructo E) , que si se usó en una arquitectura bi-direccional (constructo D) . Es por lo tanto particularmente adecuado para uso en vectores de expresión bi-direccionales .

EJEMPLO 2 : Evaluación de los vectores de expresión en transfecciones estables Materiales y Métodos Métodos Células: CHO-S, Gibco/Invitrogen (Cat. No 11619) . Plásmidos de ADN (de conformidad con la Figura 2) , fueron aislados a partir de cultivos estándares que crecen durante la noche con el kit Nucleobond PC 500 (Macherey-Nagel Cat. No 740 574), de conformidad con el protocolo del fabricante.

Transíección: Lipofectamina {Invitrogen, Cat No 18324-012) Para transfecciones estables, se usaron matraces T75, células CHO-S en fase de crecimiento exponencial fueron pasadas 24 horas antes de la transfección. Para evitar una fase estacionaria en baja densidad celular, las células fueron diluidas a 0.75 x 10e células/ml. La cantidad total de células a ser transfectadas fue de 1.5 x 105, resuspendidas en medio libre de suero MLS II (Invitrogen, Cat No 12052-114) en un matraz T75. Las mezclas de transfección fueron como sigue: A) Lipofectamina: 52.1 µ? Medio MLS II: 517.9 µ? Volumen total es 570 µ? . B) ADN: 10 µg de ADN de plásmido linealizado (9 µg de vector de expresión Luc + 1 µg de plásmido para selección: promotor SV40 que acciona el gen de resistencia a Puromicina. Todos los plásmidos se linealizaron con Pvul) . El Medio MLS II se complementó a 570 µ?. Se mezclaron las soluciones A y B, e incubaron por 30 minutos a temperatura ambiente. Se agregaron 7 mi que contiene células 5 x 106 y las células se colocaron nuevamente en un incubador a 37°C y 5% de C02 por 3 horas. Después, el cultivo se centrifugó a 800 g por 3 minutos, y la pelotilla celular se resuspendió en 5 mi de EX-CELL 325 (JRH, Cat no 14335-1000M) , suplementado con IX HT y 4.5 mM de L-Glutamina (100X HT, Invitrogen, Cat. No 11057-030, L-glutamina 200 mM, Sigma, G-7513). Se agregaron 5 mi de EX-CELL 325 directamente al matraz T75 para resuspender las células adherentes y se agregaron a la suspensión. En total, las células 5 X 10s fueron en 10 mi de medio EX-CELL 325.

Procedimiento de Selección: Se aplicó selección 48 horas posteriores a la transfección intercambiando el medio y diluyendo a 1 x 106 células/ml en EX-CELL 325 que contiene 10 µg/ml de puromicina (Sigma, P-8833) . Cada dos días, las células se contaron, centrifugaron y resuspendieron en medio selectivo fresco a 1 x 106 células vivientes/ml . La viabilidad se verificó en estos puntos. Después de 21 a 35 días, se completó la selección y la viabilidad celular fue superior del 80%.

Medición de Luciferasa : Dos horas antes de muestrear el cultivo, las células fueron contadas y el cultivo se diluyó a 0.2 x 106 células vivientes/ml.

El sistema de ensayo de Luciferasa Bright-Glo de Promega, Cat No E2610, se usó para la medición de Luciferasa, de conformidad con las guías del fabricante. Brevemente, la suspensión celular se homogenizó pipeteando ascendentemente y descendentemente varias veces, y se tomó una alícuota de 50 µ? y se colocó en una placa blanca de 96 cavidades (Nunc, Cat no 236108) . 50 µ? de Reactivo Bright-Glo reconstituido se agregó directamente e incubó por 5 minutos a temperatura ambiente. Se midió la emisión de luz en un luminómetro Centro LB 960 (Berthold Technologies) durante 5 segundos del tiempo de adquisición. La actividad de luciferasa fue entonces normalizada por el número de células vivientes en la muestra probada, es decir, típicamente células 1 x 104.

Resultados Los constructos C, D, E y F (véase Figura 2) , fueron probados en un sistema de expresión estable. Los resultados se representan en la Figura 5. El constructo E que comprende el promotor IE2 solo, resultó en la expresión más fuerte de luciferasa en este sistema. Si se presenta junto con el promotor IE1 en acomodo bi-direccional (constructo D) , el promotor IE2 todavía resulta en la expresión de luciferasa que fue superior a la expresión accionada por el promotor IE1, ya sea solo (constructo F) o en acomodo bi-direccional con el promotor IE2 (constructo C) .

EJEMPLO 3 : Co-expresi5n de dos polipéptidos de interés a partir de vectores de expresión bi-direccional Materiales y Métodos Las transfecciones se llevaron a cabo como se describe en los Ejemplos 1 y 2. Brevemente, las células CHO-S (en suspensión, Gibco MLSII) fueron temporalmente transfectadas con 900, 500, 300 y 100 ng del ADN de vector (constructo C-2, véase Figura 3) en placas de 24 cavidades (triplicados para cada condición) . Dos días posteriores a la transfección, se llevaron a cabo ensayos en luciferasa con extractos celulares a partir de triplicados como se expresa por ULR (unidades ligeras relativas) . Los sobrenadantes de las mismas cavidades fueron tomados antes de la lisis celular, combinados y ensayados para IL18BP por Elisa (véase abajo) .

ELISA IL-18BP La cantidad de IL-18BP humano recombinante (rhlL-18BP) en el sobrenadante, se midió por ELISA estándar usando anticuerpo anti-rh-IL-18BP monoclonal purificado con proteína G, que se acopló a la biotina. Se usó extravidina-HRP (Sigma) como el reactivo de detección.

La Figura 9 muestra las cantidades de IL-18 BP en ng/ml y luciferasa en ULR expresadas por 48 clones al día 90 después de la transfeccion estable con un constructo promotor mCMV bi-direccional (véase Figura 3) . El límite de detección para luciferasa fue aproximadamente 500 ULR, y 2.5 ng/ml para IL-18BP.

Resultados En esta serie de experimentos, la expresión concomitante de dos genes a partir del constructo C-2, representada en la Figura 3 , se ensayó . El gen marcador (Luciferasa) , se expresó del promotor IE1, y el gen de interés, el gen IL-18BP se expresó del promotor IE2. El IL-18BP es una proteína secretada. Los promotores fueron acomodados en arquitectura bi-direccional, es decir, ambos promotores simultáneamente accionaron la expresión en direcciones opuestas. Los resultados de este estudio se representan en las Figuras 6 a 9. La Figura 9 muestra la extensión de la expresión de luciferasa como se expresa por URL medidas en un sistema de expresión temporal. En el mismo sistema de expresión temporal, el XL-18BP fue medido por ELISA en los sobrenadantes de cultivos celulares. La Figura 7 muestra los resultados en ng/ml de IL-18BP secretado. La Figura 8 muestra las relaciones de IL-18BP a Luciferasa en cada experimento de expresión temporal . Como se muestra en las Figuras 6 a 8, cantidades diferentes de ADN plásmido fueron usadas para transíección. Todas las cantidades de ADN usadas resultaron en la expresión de tanto Luciferasa como IL-18BP. Sorprendentemente, los mejores resultados se obtuvieron con la cantidad más baja de ADN transíectado, 100 ng de ADN vector, consistentemente para IL-18BP y luciferasa. Además, el cociente estable (figura 8) , indica una relación constante entre la expresión potencial de ambos promotores . En conclusión, estos datos demuestran que ambos genes son simultáneamente expresados a partir de las dos unidades promotoras, mostrando además que ambas unidades de expresión son completamente funcionales en la arquitectura del promotor bi-direccional . Después, el constructo C-2, fue establemente transfectado, y la expresión de Luciferasa e IL18BP ensayada en 48 clones independientes. Se llevaron a cabo transfecciones estables de conformidad con el protocolo descrito en el ejemplo 2, con la excepción de que el medio usado después de la transfección fue PrCho5 (Cambrex, cat . 12766Q) . Para clonación de células únicas, las combinaciones se acomodaron en placas de 384 cavidades (Nun. Cat 1S4688) , a una densidad de 0.5 célula por cavidad (70 µ/cavidad) usando un despachador Multidrop (ThermoLa systems, cat. 5840150) . 8 días después, 192 clones fueron aleatoriamente elegidos y analizados para determinar la expresión de Luciferasa. 48 clones con la expresión L c más alta se eligieron y reensayaron para tanto la expresión de Luciferasa (luminometría) e IL18BP (por ELISA manual, véase anteriormente) . La Figura 9 muestra los resultados de este experimento. Todos los 48 clones expresaron Luciferasa e IL-18BP, no obstante en cantidades variantes.

EJEMPLO 4 ; Definición de secuencia mejoradora mínima Materiales y métodos ??? plásmido Se construyó una serie de vectores que contienen promotores mCMV acortados usando RCP (Reacción en Cadena de la Polimerasa) y cebadores específicos igualados a lo largo de mCMVp (Tabla 1) .

Condiciones RCP como sigue: Mezcla: 10 ng del plásmido de ADN (prevmCMV-Luciferasa (?????) , Constructo E de Fig. 2) 50 pmol de cebador tanto sentido como antisentido (véase tabla 1 abajo, antisentido común para todos) 20D µ cada uno dNTPs (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) IX amortiguador Dinazima, que contiene 1.5 mM de MgCl2) 4 unidades de polimerasa de ADN de Dinazima II (Finnzimas, cat. F-501S) Parámetros cíclicos 95°C, 5' 2 ciclos: 95°C, 30' ' 52°C, 30'' 72°C,1' 30 2 ciclos; 95°C, 30'' 54°C, 30'' 72°C,1' 30 10 ciclos: 95°C, 30'' 58°C, 30'' 72°C, 1'30 15 ciclos: 95°C, 30'' 60°C, 30'' 72°C,1'30 5 µ? de cada reacción de RCP se cargaron en un gel de agarosa al 1%. Fueron cortadas y purificadas bandas que tienen la longitud correcta usando el kit de Extracción en Gel inilute Qiagen, cat. 28606, antes de la clonación.

Tabla 1 Las posiciones que corresponden al número de pares de bases mantenidas de mCMVp, considerando el +1 de IE2 como referencia, son: -1076, -783, -587, -387 y -189. La estrategia de clonación de cualquiera de los fragmentos del promotor son las mismos, las RCP se llevan a cabo en mCMVp de longitud completa (premC V-Luciferasa (?????) , es decir, constructo E de la Fig. 2) . Los fragmentos después se digirieron por Xhol/EcoRI, se agregaron dos sitios de restricción en la extremidad de la secuencia del cebador especifico. La secuencia del promotor después se removió del constructo E por digestión por Xhol/EcoRI, y versiones cortas se insertaron en el mismo sitio. La evaluación de los constructos se hizo por transfección de Lipofectamina temporal seguido por medición de Luciferasa. Los materiales adicionales y métodos son como se describen en el Ejemplo 1. El medio MLS usado en este ejemplo fue ProC oS, Cambrex, B-12766Q.

Resultados Los vectores H a N (Fig. 10.a) que comprenden el promotor mCMV IE2 accionan el gen de Luciferasa se construyó para definir las secuencias mínimas requeridas para altos niveles de expresión del promotor IE2. Los siete constructos H a N del vector de expresión se usaron en un sistema de expresión temporal basado en las células CHO-S. Los resultados se describieron en la Figura 10. ) . El constructo L es el constructo más corto que retiene expresión fuerte de Luciferasa en este sistema. El constructo M todavía resulta en el nivel de expresión de Luciferasa el cual es aproximadamente 30% del nivel de expresión alcanzado con los constructos H a L. La expresión de Luciferasa obtenida con el constructo N es muy baja pero todavía significante, indicativa de la actividad del promotor basal como se espera para un sitio de partida de transcripción productiva que contiene un cuadro e iniciador TATA. En conclusión, estos experimentos definen un nuevo me orador en la región 3 ' de mCMV IE2 ( en este documento llamado mejorador mCMV IE2. En los anteriores experimentos, el mejorador IE2 incrementa la transcripción del promotor IE2 mínimo retenido en el constructo N. La secuencia mínima requerida para la alta expresión del gen reportero está dentro de los fragmentos -587 a -189 pb (constructo L) , y un constructo que comprende el fragmento -387 a -189 pb todavía mejora la expresión de Luciferasa (constructo M) .

EJEMPLO 5 ; El nuevo mejorador IE2 activa un promotor mínimo SV40 Se llevaron a cabo experimentos adicionales para valorar si el mejorador IE2 nuevo de hecho cumple todos los criterios requeridos para mejora la actividad, es decir, mejorar la expresión independientemente de (1) localización, (2) orientación, y (3) identidad del promotor. Para esto, se construyeron los constructos O a V para valorar que el nuevo mejorador IE2 podría mejorar la expresión de un promotor heterólogo, el promotor SV40, independientemente de la orientación, distancia y posición (5' ó 3'), relativo al promotor SV40. Los constructos W, X y Y fueron los controles, W contiene el mejorador SV40, X no contiene algún mejorador, pero el promotor SV40, y Y no contiene ni un mejorador ni un promotor . Construcción del Vector Un vector llamado pSV-Luc (constructo X de la Figura 11(a)) el cual contiene únicamente el promotor SV40 se construyó del pGL3-Ctrl (Promega, E 1741) , que contiene el promotor SV40 que acciona el gen de Luciferasa, y el mejorador SV40 localizado en 3' del gen (constructo W) , y pGL3-Básico (Promega, E1751) , ambos carecen del promotor y mejorador (constructo Y) . Brevemente, el pGL3-Ctrl se cortó con Notl/Xbal para aislar un fragmento que contiene el promotor SV40, seguido por el gen de Luciferasa. En una forma similar, el pGL3 -básico se cortó con Notl/Xbal y la estructura del vector que contiene la región poli A, se aisló, sin el mejorador 3' . Combinando los dos fragmentos, se obtuvo pSV-Luc (constructo X) . La región 5' del promotor SV40 de este vector se diseño por ingeniería clonando la secuencia del mejorado IE2 (-587 a -189) en ambas orientaciones, llamadas p5 ' enh-SV-Luc (constructo O), y p5' enh-SV.Luc inverso (constructo Q) . Además, la secuencia del mejorador IE2 (-587 a -189) también se clonó en la región 3' del gen de Luciferasa, en ambas orientaciones. Los vectores resultantes se llamaron p3'enh-SV-Luc+ (constructo S) , p3' enh-SV.Luc inverso (constructo U) . El mismo procedimiento se llevó a cabo con la versión corta del mejorador IE2, es decir, que tiene -387 a -189 en lugar de -587 a -189, y se llamaron constructos P, R, T y V, véase la Fig. 11. a.

Constructo O, P: Se abrió el vector recipiente pSV-Luc+ (constructo X de la Fig. 11.a) por digestión con Nhel/Smal. El mejorador de longitud completa se aisló por una digestión con Ndel, seguido por reacción blunt.de término usando polimerasa lenow, purificación y digestión por Nhel . La misma estrategia se aplicó para construcción del constructo mejorador corto. Constructo Q, R: Se abrió el vector de recipiente pSV-Luc+ (constructo X de la Fig. 11. a) por digestión con Xhol/Smal. El mejorador de longitud completa se aisló por una digestión con Ndel, seguido por reacción blunt.de término usando polimerasa Klenow, purificación y digestión por Xhol . La misma estrategia se aplicó para construcción del constructo mejorador corto. Constructo S, T, U y V: Se abrió el vector del recipiente pSV-Luc+ (constructo X de la Fig. 11.a) por digestión con BamHI, seguido por blunt de término usando la polimerasa Klenow. Se aisló el mejorador de longitud completa por una digestión con Ndel/Nhel, seguido por reacción blunt.de término usando la polimerasa Klenow. La clonación permitió ambas orientaciones las cuales se identificaron por análisis de restricción. Ambas orientaciones se mantuvieron por análisis . La misma estrategia de aplicó por construcción del constructo mejorador corto. Los constructos pGL3-Básico (constructo Y) sirvieron como control sin expresión. El pGL3-ctrl (constructo W) sirvió como el promotor SV40/vector mejorador.

El pSV-Luc fue el control que tiene solo el promotor SV40 (constructo X) . Las mediciones de transfecciones y Luciferasa se llevaron a cabo en los ejemplos previos.

Resultados Los resultados obtenidos con constructos O a Y de la Fig. 11. a se describen en la Fig. 11. b. El constructo del promotor SV40 menos mejorador se tomó como una línea base para la actividad mejoradora agregada, y la actividad medida con el constructo X se fijó como 1. Todos los constructos que tienen ya sea el mejorador IE2 largo o corto, resultaron en la expresión del gen reportero. La versión larga consistentemente resultó en alta expresión del gen reportero a partir del promotor SV40, el cual fue mucho más alto que el nivel de expresión obtenido con la combinación del promotor SV40 y mejorador SV40 (constructo 0) . Por lo- tanto, este experimento define claramente la secuencia -587 a -189 y la secuencia -387 a -189 como mejoradores auténticos, activando un promotor heterólogo en una manera independiente de la posición y orientación.

EJEMPLO 6 : comparación entre la versión larga del mejorador IE2 (-537 a -189) y el mejorador hCMV Se describen protocolos experimentales para transfección con Lipofectamina, seguidos por mediciones de Luciferasa, en el Ejemplo 1.

Resultados En este experimento, los constructos 0 y Q, que tienen la versión larga del nuevo me orador IE2 en ambas orientaciones en 5' del promotor SV40, se usaron por comparación a un mejorador fuerte conocido, el mejorador hCMV (citomegalovirus humano) . En este extremo, se reemplazó la secuencia mC V IE2 por la- secuencia del mejorador hCMV (SEC ID NO: 2) en el constructo 0, que resulta en el constructo 0-2. Lo mismo se hizo en el constructo Q, resultando en el constructo Q-2. La secuencia del mejorador hCMV que tiene los sitios Mlul (Mlul=acgcgt ) que lo flanquean, los cuales se usan por clonación, son como siguen: aCGCGTTGACArTGATTATTGACTAGTTATrAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTC ATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGAC CGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAA 3?AGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTA-?TTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAG rACATCAAGTGrATCArATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGG3?AAATGGC CCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCT ACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTG GATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTT TGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCACGCG TGCTAGCCCGGGCTCGAGATCTGCGATCTGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCG CCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCcacgcgt El SV-Luc+ se digirió con Mlul, y se trató por Fosfatasa Alcalina de Intestino de ternero para prevenir la misma ligación. La secuencia del promotor hCMV se clonó en el sitio Mlul. Ambos clones de orientación se mantuvieron por comparación con constructos IE2 equivalentes . Los resultados de la expresión de Luciferasa se muestran en la Fig. 12. El nivel de expresión de Luciferasa obtenido con el nuevo mej orador IE2 (versión larga) fue al menos, dos veces tan alto como los niveles de expresión de Luciferasa obtenidos con el mej orador hCMV clásico.

EJEMPLO 7 ; Desempeño del mejorador IE2 realizado en un constructo bi-direccional Se diseñaron dos constructos adicionales para probar el nuevo mejorador en una arquitectura bi-direccional, llamado constructos #26 y #140 como se describe en la Fig. 13. #26: La base de este vector es mCMV-Luc+ (constructo C, Fig. 3) . Se digirió con SacIl/EcoRI. El cásete IL-18BP se recuperó de phCMV-IL18BP2. Cortando este vector con SacII/EcoRI, se aisló un fragmento que contiene el Intrón A seguido por la estructura lectora abierta IL-18BP y la región SV40poliA. #140. La base de este vector es el constructo L de la Fig. 10.a. Se digirió con Xhol/Nhel, abriendo el vector 5' del mejorador IE2. Un vector que expresa IL18BP del promotor IE1, llamado pBS . I IL18BP (IE1) . I , se usó como donador inerte. Digiriendo este vector con Xhol/Spel, se aisló un fragmento que contiene el promotor IE1 de Xhol (véase la Fig 1) seguido por el cásete intronA-IL18BP-SV40poliA. El constructo resultante carece de la secuencia entre -589 a Xhol de la secuencia del promotor mCMV original. Las transíecciones estables y la medición de Luciferasa se llevan a cabo como se describe en el ejemplo 2, y el ELISA IL18BP como se describe en el ejemplo 3. Sin embargo, el constructo #140 no es exactamente el reflejo del constructo #26, en que los promotores IE1 y IE2 están en orientación inversa. Así, la expresión de Luciferasa se acciona por el promotor IE1 en el constructo #26, pero por el promotor IE2 en el constructo #140, y la expresión IL18BP se acciona por el promotor IE2 en el constructo #26 y por el promotor IE1 en el constructo #140. Los resultados obtenidos con ambos constructos se muestran abajo, puesto que son significantes por el efecto simultáneo del nuevo mejorador IE2 en dos diferentes promotores en un vector de expresión bi-direccional (constructo #140) . La Fig. 14 representa los resultados de grupos transfectados con el constructo #26 y #140 en términos de expresión de Luciferasa y IL-18BP. El constructo #140 resultó en expresión superior de ambos genes marcadores (Luciferasa) y gen de interés (IL-18BP) . Para valorar la estabilidad de expresión de Luciferasa y IL-18BP, las combinaciones son ya sea tomadas bajo condiciones selectivas, es decir, bajo tratamiento de puromicina, o son tomadas sin presión selectiva (sin puromicina) por tres semanas. Los resultados se muestran en las Figuras 15 a 17. Los niveles de expresión de la Luciferasa del gen reportado y el IL-18BP significantemente no cambian con el tiempo, véase las Figuras 16 y 17. Así, se demostró que ambos constructos #26 y #140 mostraron similares niveles de expresión sobre el tiempo, en presencia o ausencia de presión de selección. Por lo tanto, los constructos que tienen el nuevo mej orador IE2 son adecuados para expresiones estables y simultáneas de dos genes . Como los anteriores resultados se obtienen en grupos, se derivaron clones por dilución limitante a 0.5 células por cavidad de ambos grupos . Los clones se cultivaron bajo selección de puromicina, para evaluar niveles de expresión clonal. Después, los clones aislados se dividieron en presencia y ausencia de puromicina para eventualmente monitorear su estabilidad. Los resultados presentados en las Figuras 18 y 19 se tomaron antes que los clones se dividieran en +/-condiciones de puromicina. Los resultados de 2 semanas después de remover la puromicina no muestran diferencias significantes para ambos constructos, asi, sugieren la estabilidad. Este estudio continuará por otras 10-12 semanas. Para evaluar la expresión de ambos genes, se usó un formato, es decir, en placas de 96 cavidades: Día 1: ½ dilución de las células, 100 µ? de medio de cultivo ProCho5 (libre de suero) + 100 µ? de ProCho5 fresco que contiene Suero de Bovino Fetal al 5%. Con FBS al 2.5% de concentración final, las células son capaces de unirse. El paso semanal de la placa de mantenimiento se hizo en un factor de dilución 1/20, todos en el medio ProCho5. Día 2: El medio se desechó, se lavó una vez con 200 µ? lx PBS (Invitrogen, 10010-015), y 75 µ? de ProCho5 fresco que contiene FBS al 5% agregado, y se incubaron por unas 24 horas de expresión de pulso. Día 3: 50 µ? de lo sobrenadante se recuperaron, y 200 µ? del amortiguador Elisa se agregó (lx PBS, 0.1% p/v de BSA, 0.2% de v/v de Tween 20). Se analizaron 100 µ? por ELISA por IL-18BP. Las cavidades se lavaron con 200 µ? lx PBS (desechadas) y se agregó 100 µ? de amortiguador Lisis Glo (Pro ega, E266a) . Las cavidades se incubaron por 30 minutos a temperatura ambiente para asegurar la lisis celular. La medición de Luciferasa se hizo usando 30 µ? de células transfectadas lisadas en una placa de 96 cavidades blanca + 30 µ? del reactivo Bright-Glo reconstituido. La emisión de luz se midió en un luminómetro ' LB960 Central durante 5 segundos de tiempo de adquisición. El análisis de los clones obtenidos de las transíecciones estables con el constructo #26 se describe en la Fig. 18, y los que resultan de transfecciones estables con constructos #140 en la Fig. 19. Los clones descritos en las Figuras 18 y 19 se clasificaron por su valor de Luciferasa en una manera descendente. La expresión IL18BP se indicó como el valor OD. Puesto que el Elisa se llevó a cabo en un formato de alto rendimiento, la cuantificación real de los niveles IL-18BP no podrá obtenerse. Sin embargo, los controles a 2500 ng/ml y 250 ng/ml así como los blancos, se incluyeron para monitorear la placa para la variación de la placa. La figura 20 muestra la expresión de luciferasa en las 'placas en visión ChemiDoc invertida. Esta vista usa una cámara CCD (Biorad) , que permite adquirir señales próximas a la quimioluminiscencia (como en la Fig. 20) . Un software llamado Quantity One 4.2.3 permite el manejo de la fotografía como invirtiendo las señales, las cuales se emplean aquí. Como es evidente de las resultados que muestran en las Figuras 18 a 20, el constructo #140 resultó en una porción de clones no expres dos. Sin embargo, sorprendentemente, los clones poco positivos expresan ambos genes extremadamente f ertes . Por lo tanto, el constructo #140 permite seleccionar expresores muy altos en fases de clonación muy tempranas, asi omitiendo la necesidad de probar y continuar en números altos de clones para identificar los pocos clones que expresan altamente ambos genes de interés .

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Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Vector de expresión, caracterizado porque comprende el promotor del gen mCMV-IE2, o un fragmento del mismo que promueve la expresión funcional, y/o un mej orador del gen mCMV-IE2, o un fragmento del mismo que mejora la expresión funcional, en donde el vector de expresión no contienen algún gen completo del mCMV.

2. Vector de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende un promotor diferente del promotor mCMV-IE2, o un fragmento del mismo que promueve la expresión funcional.

3. Vector de conformidad con la reivindicación 1 ó 2 , caracterizado porque comprende un primero y un segundo promotor de origen viral, celular o artificial, o fragmentos del mismo que promueven la expresión funcional.

4. Vector de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el primer promotor es el promotor mCMV-IE2 , o un fragmento del mismo que promueve la expresión funcional, y el segundo promotor es el promotor mCMV-IEl, o un fragmento del mismo que promueve la expresión funcional.

5. Vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque comprende la secuencia de ADN de la SEC ID NO: 1.

6. Vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque comprende un fragmento que incluye nucleótidos -387 a -189 de la región 3' de de mCMV IE2, la numeración del nucleótido es relativa a +1 del gen IE2.

7. Vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque comprende un fragmento que incluye nucleótidos -587 a -189 de la región 3' de de mCMV IE2, la numeración del nucleótido es relativa a +1 del gen IE2.

8. Vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el promotor, o el fragmento del miso que promueve la expresión funcional, está operablemente ligado a una secuencia de ADN codificada por al menos un polipéptido.

9. Vector de conformidad con la reivindicación 8 , caracterizado porque la secuencia de ADN codifica para una proteína de interés .

10. Vector de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la secuencia de ADN codifica para una proteína marcadora.

11. Vector de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la secuencia de ADN codifica para una proteína reportera.

12. Vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 11, caracterizado porque el primer promotor, o fragmento del mismo que promueve la expresión funcional, y el segundo promotor, o fragmento del mismo que promueve la . expresión funcional, están acomodados bi-direccionalmente .

13. Vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque además comprende uno o más elementos regulatorios seleccionados de 5'UT , intrones, 3'UTR, secuencias de procesamiento de extremos 3' de ARNm, sitios de poliadenilación, y secuencias de entrada al ribosoma interno (IRES) .

14. Vector de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el elemento regulatorio es un IRES, que comprende además una secuencia de ADN que codifica por al menos, un ARNm policistrónico .

15. Vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque además comprende uno o más elementos de ADN seleccionados de aisladores, elementos limite, regiones de control de locus (RCL) , regiones de unión a la matriz (RUM) , y elementos para la recombinación e intercambio de casetes .

16. Vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15 , caracterizado porque la secuencia de ADN que codifica para el polipéptido operablemente ligado al primer promotor y la secuencia de ADN que codifica para el polipéptido operablemente ligado al segundo promotor, codifican para el mismo polipéptido.

17. Vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15, caracterizado porque la secuencia de ADN que codifica para el polipéptido operablemente ligado al primer promotor y la secuencia de ADN que codifica para el polipéptido operablemente ligado al segundo promotor, codifican para polipéptidos diferentes .

18. Vector de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la secuencia de ADN que codifica para el polipéptido operablemente ligado al primer promotor, codifica para una primera subunidad de una proteina dimérica o multimérica y la secuencia de ADN que codifica para el polipéptido operablemente ligado al segundo promotor, codifican para una segunda subunidad de una proteína dimérica o multimérica.

19. Vector de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque una subunidad es la cadena alfa y la otra subunidad es la cadena beta de una hormona seleccionada de la FSH humana, LH humana, TSH humana y CG humana.

20. Vector de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque una subunidad es la cadena pesada y la otra subunidad es la cadena ligera de una inmunoglobulina.

21. Vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 20, caracterizado porgue una proteína de interés se selecciona de la FSH, LH, CG, THS, hormona de crecimiento, interferona, proteína I de enlace a TNF, proteína II de enlace a TNF, Raptiva®, IL-18BP, o muteínas, fragmentos, derivados funcionales, proteínas de fusión de los mismos .

22. Vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 21, caracterizado porque la proteína marcadora se selecciona de adenosina desaminasa (ADA) , fosfotransferasa de aminoglicósido (neo) , reductasa dihidrofolato (DHFR) , higromicin-B-fosfotransferasa (HPH) , cinasa timidina (tk) , fosforibosiltransferasa de xantina-guanina ¦ (gpt) , gen de resistencia múltiple al fármaco (MDR) , descarboxilasa ornitina (ODC) y resistencia a N- (fosfonacetil) -L-aspartato (CAD) , actiltransferasa de puromicina (PAC) , galactocinasa, receptor de folato humano o portadores reducidos de folato.

23. Vector de conformidad con las reivindicaciones 11 a 22, caracterizado porque la proteína reportera se selecciona de luciferasa, proteína fluorescente verde, fosfatasa alcalina y peroxidasa de rábano picante o combinaciones de los mismos .

24. Célula hospedera caracterizada porque se transfecta con un vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

25. Célula hospedera de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque la célula hospedera es una célula CHO.

26. Proceso para la producción de un polipéptido, caracterizado porque comprende la etapa de transíectar una célula hospedera con al menos un vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23.

27. Proceso de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la transfección es transfección estable .

28. Proceso para la producción de un polipéptido, caracterizado porque comprende la etapa de cultivar una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 24 ó 25 vaho condiciones que permiten la expresión del polipéptido.

29. Proceso de conformidad con la reivindicación 26 o 27, caracterizado porque además comprende la etapa de aislar el polipéptido a partir de la célula hospedera o el sobrenadante de cultivo celular.

30. Uso de un vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23 para expresión de un gen de interés .

31. Uso de un vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23 para selección de clones que expresan altas cantidades de un gen de interés .

32. Uso de un vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 23 para la expresión simultánea de dos o más genes o ADN de interés .

33. Uso de un vector de conformidad con cualquiera de los párrafos precedentes para la manufactura de un medicamento para terapia a base de ADN.

34. Uso de una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 24 ó 25 para la manufactura de un medicamento para terapia a base de célula.