NO333818B1 - Ekspresjonsvektorer omfattende mCMV IE2 promoter, vertcelle inneholdende nevnte vektorer, anvendelses av vektorene samt fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid - Google Patents

Abstract

Det beskrives en ekspresjonsvektor omfattende promoteren av mCMV-IE2 genet, eller et funksjonelt, ekspresjonsfremmende fragment derav, og/eller en enhancer av mCMV-IE2 genet, eller funksjonelt, ekspresjonsfremmende fragment derav, der ekspresjonsvektoren ikke inneholder noe komplett gen av mCMV.

Description

OPPFINNELSENS OMRÅDE

Foreliggende oppfinnelse angår ekspresjonsvektorer omfattende promoteren av mCMV-IE2 genet, eller et funksjonelt, ekspresjonsfremmende fragment derav og/eller en enhancer for mCMV-IE2 genet, eller et funksjonelt, ekspresjonsforsterkende fragment derav, der ekspresjonsvektoren ikke inneholder noe fullstendig gen av mCMV, den angår vertsceller inneholdende slike vektorer, fremgangsmåte for fremstilling av det ønskede polypeptidet ved bruk av disse ekspresjonsvektorer og anvendelsen av ekspresjonsvektorene.

Ekspresjonsvektorer omfattende mCMV IE2 promoteren og mCMV IE1 promoteren, eventuelt sammen med den nye mCMV IE2 enhanceren, er foretrukket ifølge oppfinnelsen, særlig hvis begge promotere er anordnet i en bidireksjonell arkitektur.

OPPFINNELSENS BAKGRUNN

I tiår har ekspresjonsvektorer vært benyttet som bærer ("vehicles") for ekspresjon av gener eller cDNA'er som koder polypeptider eller proteiner av interesse i vertsceller. Sterke virale eller cellulære promotere og enhancere benyttes for å uttrykke genet av interesse i høye nivåer ved å benytte transient eller stabil transfeksjon av rekombinant DNA inn i vertscellene. Det umiddelbare tidlige (IE) området av humant cytomegalovirus (hCMV) har vært påvist å være spesielt egnet i denne forbindelse og ekspresjonsvektorer omfattende genelementer avledet fra dette området er kjent for eksempel fra EP0323997B1.

Inntil i dag har genregulatoriske sekvenser fra den murine cytomegalovirus (mCMV) sjelden vært benyttet selv om mCMV-avledede, regulatoriske elementer, ble identifisert til å være meget kraftige og sågar sterkere enn den humane motpart (Kim et al. 2002).

US 4.963.481 (de Villiers) beskriver ekspresjonsvektorer med et DNA som koder et heterologt protein under transkripsjonen kontroll av DNA-fragmenter avledet fra mCMV IE genområdet inkludert et rundt 2270 basepar (bp) restriksjonsendonuklease Pstl fragment isolert fra det virale genom. En 1387 bp trunkert versjon av dette fragment resulterte i signifikant forbedring av effektiviteten av DNA fragmentet som promoter for ekspresjonen av det heterologe protein.

US 4.968.615 (Kozinowski) beskriver rekombinant DNA molekyler inneholdende transkripsjonsenhancere fra murin cytomegalovirus (MCMV) som kan benyttes for å forsterke transkripsjonen av strukturelle gener i eukaryotiske celler. mCMV enhanceren ble sagt å være lokalisert i 2,27 kb Pstl fragmentet som var identifisert av de Villiers (US 4.963.481).

Manning og Mocarski (1988) analyserte den funksjonelle viktighet av mCMV IE2 området for replikering av den murine cytomegalovirus. For dette formål ble en rekombinant virus konstruert med lacZ reseptorgenet under transkripsjonen kontroll av mCMV IE enhancer/promoteren for derved å disruptere i IE2 genet. Det kunne ikke observeres noen IE2 genekspresjon og virusene replikerte normalt. Forfatterne konkluderte derved med at IE2-genet, som ikke er bevart blant cytomegaloviruset som mCMV og hCMV, ikke var essensiell for virusreplikasjonen. Ingen indikasjon på noen spesiell nytte for IE2 enhancer/promoterområdet ble diskutert eller antydet av Manning og Mocarski.

Senere litteratur viser en ytterligere forskjell mellom muse- og human CMV IE området. Muselocusen uttrykker en andre hoved mRNA i den motsatte retning enn det første IE-gen. Dette andre, umiddelbart tidlige gen ble kalt IE2 og dens promotersekvens er angitt som IE2 promoteren (Messerle et al. 1991).

US 4963481 A beskriver en ekspresjonsvektor som omfatter både IE1 og IE2 eller bare IE1 promotersekvenser, det fremgår også at El er en sterk promoter.

Baron U. et al, Co regulation of two gene activities by tetracycline via a bidirectional promoter, Nuclear acids research. 1995, Vol. 23, No. 17, side 3605-3606 angir en vektor omfattende en bidireksjonell promoter bestående av to tetracyclin responderende elementer flankert av to IE1 mCMV promoter sekvenser.

Manning WC, et al., Insertional mutagenesis of the murine cytomegalovirus genome one prominent alpha gene IE2 dispensable for growth. Virology, 1988, Vol. 167, No.2, side 477-484 gjør kjent insersjon mutagenese for å studere IE2 mCMV promoterens rolle i CMV genregulering og funksjon.

IE2 området fra mCMV har ikke vært benyttet i vektorer for ekspresjon av heterologe proteiner til i dag.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse er basert på det funn at en vektor med et DNA-element omfattende IE2 promoterområdet av mCMV effektivt kan drive ekspresjonen av et gen av interesse i transfekterte vertsceller.

Oppfinnelsen er videre basert på identifisering av en ny enhancer i mCMV IE2 området, her kalt mCMV IE2 enhanceren. Denne enhancer oppfyller de kriterier man vanligvis legger på definisjonen av enhancer, dvs. å forsterke ekspresjonen uavhengig av (1) lokasjon, (2) orientering og (3) å forsterke ekspresjonen fra en heterolog promoter.

Foreliggende oppfinnelse omfatter ekspresjonsvektor, kjennetegnet ved at den omfatter en mCMV-IE2 promoter som består av et funksjonelt ekspresjonsfremmende fragment av SEQIDNO: 1, hvori:

i. ekspresjonsvektoren ikke inneholder noe fullstendig gen av mCMV; og

ii. nevnte mCMV-IE2 promoter er operativt forbundet til en DNA-sekvens som koder for et polypeptid.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse ekspresjonsvektor, kjennetegnet ved at den omfatter en mCMV-IE2 promoter som består av et funksjonelt ekspresjonsfremmende fragment av SEQ ID NO: 1, hvori nevnte promoter består av en sekvens valgt fira gruppen som består av: i. kjerne IE2 promoter som strekker seg fra nukleotid 1 til 39 av SEQ ID NO: 1; ii. en sekvens som omfatter kjerne IE2 promoter som strekker seg fra nukleotid 1 til 39 av SEQ ID NO: 1 og en sekvens på 100 til 200 nukleotider oppstrøms for nevnte kjerne IE2 promoter; og

iii. sekvensen ifølge SEQ ID NO: 1.

Omfattet av oppfinnelsen er også vertscelle, kjennetegnet ved at den er transfektert med en vektor ifølge et hvilket som helst av de foregående krav.

Foreliggende oppfinnelse omfatter fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid, kjennetegnet ved at den omfatter trinnet med å transfektere en vertscelle med minst en vektor ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 29.

Omfattet av foreliggende oppfinnelse er også anvendelse av en vektor ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 29 for ekspresjon av et gen av interesse.

Det er også mulig å skaffe tilveie en ekspresjonsvektor som omfatter promoteren til mCMV-IE2 genet, eller et funksjonelt ekspresjonsfremmende fragment derav, og/eller en enhancer for mCMV-IE2 genet, eller et funksjonelt ekspresjonsforsterkende fragment derav, der ekspresjonsvektoren ikke inneholder noe fullstendig gen av mCMV.

I et aspekt angår oppfinnelsen en vertscelle omfattende en vektor i henhold til oppfinnelsen.

Et aspekt ved oppfinnelsen angår en fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid av interesse omfattende transfektering av en vertscelle med en vektor i henhold til oppfinnelsen.

I et aspekt angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid av interesse omfattende dyrking av vertscellen ifølge oppfinnelsen.

Et aspekt ved oppfinnelsen angår bruken av en vektor ifølge oppfinnelsen for ekspresjon av ett eller flere gener eller cDNA'er av interesse.

I et aspekt angår oppfinnelsen bruken av en vektor ifølge oppfinnelsen for seleksjon av kloner som uttrykker høye mengder av et gen av interesse.

Et aspekt angår anvendelsen av en vektor ifølge oppfinnelsen i DNA-basert terapi.

Kort beskrivelse av figurene.

Figur 1 viser en sekvens av et bidireksjonelt DNA-element avledet fra mCMV IE området for bruk i ekspresjonskonstrukter. +1 setene og TATA boksene av IE2- og IE1 promoterne er indikert. Kjernepromoterne for begge gener er vist i en boks. Hpal- og Xhol restriksjonssetene er vist fremhevet. -682 posisjonen er antydet i forhold til +1 av IE1. Figur 2 viser rapportørkonstruktene A til G. Luciferaserapportørgenet er vist som en fremhevet linje og promoteren er indikert som åpne piler.

A: Den negative promoter - kontroll (pGL3 Basic)

B: En SV40 promoter/enhancerdrevet Luciferaserapportørvektor (pGL3 kontroll). C: Luciferaseekspresjon IE1 promoterdrevet (pmCMV Luciferase, IE1 drevet).

D: Luciferaseekspresjon IE2 promoterdrevet (prevmCMV Luciferase, IE2 drevet) E: Luciferaseekspresjon IE2 promoterdrevet, IE1 promoter deletert (prevmCMV

Luciferase (AXhol), IE2 drevet, IE1 minus).

F: Luciferaseekspresjon IE1 promoterdrevet, og IE2 promoterdeletert

(pBS.MCMV3 Luciferase, IE1 drevet (1,4 kb), IE2 minus).

G: En kortversjon av IE1 promoteren driver Luciferaseekspresjon (p-680

Luciferase, IE1 drevet (kortversjon, 0,68 kb)).

Figur 3 viser et bidireksjonelt konstrukt tilsvarende konstruktet C i figur 2 (konstrukt C-2) med den kodende sekvens for IL-18BP (fremhevet linje) forbundet til IE2 promoteren. I dette konstrukt driver således mCMV IE1 promoteren luciveraseekspresjon og samtidig driver mCMV IE2 promoteren IL-18BP ekspresjon. Triangehintron. Lukkede ovaler: polyA. Figur 4 viser Luciferase reseptorgenekspresjonen fra de forskjellige rapportørkonstruktene som er vist i figur 2, konstruktene A til G. CHO-S celler dyrket i et serumfritt medium (SFM) ble transient transfektert med konstruktene A til G, eller narretransfektert. Luciferaseaktiviteten er uttrykt som RLU = relativ lysenheter. Figur 5 viser Luciferaseekspresjonen målt som RLU i stabile sammenslåinger av transfekterte CHO-S celler. Cellene ble dyrket i SFM etter transfeksjon med konstruktene D, C, F og E, som vist i figur 2. Luciferaseekspresjonen ble bedømt etter 21 dagers seleksjon. Figur 6 viser Luciferaseekspresjonen målt som RLU etter transgen transfeksjon med 900, 500, 300 og 100 ng av det bidireksjonelle konstruktet C-2 som vist i figur 3. Figur 7 viser mengden IL-18BP i ng/1 i cellekultursupernatanter fra det transiente transfeksjonsforsøk ifølge figur 6 (konstrukt C-2). Figur 8 viser forholdet for mengdene av IL-18BP versus Luciferase, målt i forsøket ifølge figurene 6 og 7. Figur 9 viser mengdene Luciferase i RLU (venstre y akse) og IL-18BP i ng/ml (høyre y akse), uttrykt ved 48 individuelle kloner som ble plukket 8 dager etter transfeksjon med det bidireksjonelle konstruktet C-2 (som vist i figur 3). Detekteringsgrensen for Luciferase var rundt 500 RLU og 2,5 ng/ml for IL-18BP. Hvert inkrement på x-aksen representerer en enkelt klon. Figur 10(a) viser rapportørkonstruktene H til N. Luciferase rapportørgen (Lue) er vist som en fremhevet linje og de respektive IE1- og IE2 promotere er antydet som åpne piler. Enhancere er vist som grå ovaler: Lysegrått for den kjente IE1 enhanceren og mørkegrått for den nye IE2 enhancer.

H: Bidireksjonell konstrukt med IE2 promoterdrevet Luciferaseekspresjon;

I: Luciferaseekspresjonen var IE2 promoterdrevet og IE1 promoteren var deletert; J, K, L, M, N: konstrukter inneholdt forkortede mCMV promotere, posisjonene tilsvarer

antallet basepar fra mCMVp relativt +1 for IE2 som referanse:

J: fra-1076

K: fra -783

L: fra -587

M: fra -387

N: fra-189

Figur 10(b) viser Luciferaseekspresjonen i RLU fra rapportørkonstrukter H til N i henhold til figur 10(a) etter transient transfeksjon av CHO-S celler som var dyrket i et serumfritt medium. Figur 1 l(a) viser ytterligere rapportørkonstrukter O til Y som kombinerte den nye IE2 enhancer (grå oval) med SV40 promoteren. Den grå ovale representerer IE2 enhanceren fra -587 til -189, den halvgrå ovale representerer IE2 enhanceren fra -387 til -189. Pilen over IE2 enhanceren indikerer retningen av enhancersekvensen. Luciferase rapportørgenet er vist som en fremhevet linje, SV40 promoteren er indikert som en åpen pil. Sort oval: polyA.

O: lang IE2 enhancersekvens (-587/-189) klonet 5' av SV40 promoter;

P: kort IE2 enhancersekvens (-387/-189) klonet 5' av SV40 promoter;

Q: lang IE2 enhancersekvens (-587/-189) klonet 5' av SV40 promoteren i revers

orientering;

R: kort IE2 enhancersekvens (-387/-189) klonet 5' av SV40 promoteren i revers orientering;

S: lang IE2 enhancersekvens (-587/-189) klonet 3' av Luciferasegenet;

T: kort IE2 enhancersekvens (-387/-189) klonet 3' av Luciferasegenet;

U: lang IE2 enhancersekvens (-587/-189) klonet 3' av Luciferasegenet i

reversorientering;

V: kort IE2 enhancersekvens (-387/-189) klonet 3' av Luciferasegenet i

reversorientering;

W: Kontroll, SV40 promoter og SV40 enhancer 3' av den Luciferasekodende

sekvens;

X: Kontroll, Luciferaseekspresjon drevet av SV40 promoteren uten noen enhancer; Y: negativ kontroll, ingen promoter i det hele tatt. Figur 1 l(b) viser Luciferaseekspresjonen fra rapportørkonstruktet O til Y som vist figur 1 l(a). CHO-S celler dyrket i serumfritt medium (SFM) ble transient transfektert med konstrukter O til Y. Luciferaseaktiviteten uttrykkes som ganger induksjon sammenlignet med kontroll X (verdi 1), dvs. ekspresjon drevet av SV40 promoteren uten noen enhancer. Åpne søyler: lang IE2 enhancer (-587 til -189), skraverte søyler: korte IE2 enhancer (-387 til -189). X aksen er en logaritmisk skala. Figur 12 viser et forsøk som sammenligner den nye IE2 enhancer med den kjente hCMV enhancer. Celler ble transfektert med kontrollkonstrukt A (pGL3 basic, se figur 2, promoterfri), kontrollkonstrukt B (pGL3 ctrl, se figur 2, SV40 promoter med SV40 enhancersekvens i 3' av det Luciferasekodende området), kontrollkonstrukt X (SV-Luc<+>, se figur lia, SV40 promoter uten enhancer), så vel som konstruktene O og Q (se Fig. Ila) eller konstrukter 0-2 og Q-2 der IE2 enhancersekvensen (lang versjon, -587 til -189) var erstattet med den kjente hCMV enhancersekvens (SEQ ID NO: 2). Luciferase ble målt i RLU (x-aksen). Skraverte søyler: med kjent hCMV enhancer. Grå søyler: med ny IE2 enhancer.

Figur 13 viser den bidreksjonelle vektor som ble benyttet for samtidig ekspresjon av IL-18BP og Luciferase. IE1- og IE2 promoterne er indikert som åpne piler. Trianglet representerer intron A fra hCMV IE området og den grå ovale representerer polyadenyleringssignalet. Det lukkede kvadrat representerer signalpeptidet.

Konstrukt #26: Luciferase uttrykt fra IE1 promoteren og IL-18BP fra IE2 promoteren.

Sekvensen mellom de to promoterne er som i konstrukt H i figur 10a. Konstrukt #140: Luciferase uttrykt av IE2 promoter og IL-18BP fra IE1 promoteren.

IE2-enhanceren (-587 til -189) er lokalisert mellom de to promoterne.

Figur 14 viser mengdene av uttrykt Luciferase (RLU, venstre y akse) og IL-18BP (ng/ml, høyre y-akse) etter transient transfeksjon av CHO-celler dyrket i serumfritt medium med enten konstrukt #26 eller #140 i henhold til figur 13. Stolpene:Luciferaseekspresjon, lukkede rutere:IL-18BP ekspresjon. Figur 15 viser ekspresjonen av Luciferase (RLU, venstre y akse) og IL-18BP (ng/ml, høyre y akse) i stabile pooler transfektert med enten konstrukt #26 eller #140 i henhold til figur 13. Ekspresjonen ble målt 7 uker etter transfeksjon. Cellene ble holdt under seleksjon med puromycin (+ puro) eller i 3 uker uten puromycinseleksjon (-puro). Stolpene: Luciferaseekspresjon, lukkede rutere: IL-18BP ekspresjon. Figur 16 viser tidsforløpet for Luciferaseekspresjon som i figur 15. X-aksen representerer tiden i uker. Data vist i figur 15 tilsvarer 3 ukers data i figur 16. Lukkede ruter: #26 + puro, små kvadrater: #140 + puro, lukkede triangler: #26 - puro, store kvadrater: #140 - puro. Figur 17 viser tidsforløpet for IL-18BP ekspresjonen i forsøket ifølge figur 16, tegnforklaring som i figur 16. Figur 18: individuelle protokloner ble analysert for Luciferaseekspresjon kvadrater i RLU (venstre y-akse) og IL-18BP ekspresjonen (ruter) i ng/ml (høyre y-akse). Hvert inkrement på x-aksen representerer en individuell protoklon. Protokloner ble etablert fra CHO-celler som stabilt var transfektert med konstrukt #26 og ble holdt under puromycinseleksjon. Figur 19: som i figur 18, men protoklonene ble etablert fra celler transfektert med konstrukt #140. Figur 20: protoklonene transfektert med enten konstrukt #26 eller #140 ble analysert for Luciferaseekspresjon i et 96-brønners format, invertert ChemiDoc bilde.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Ifølge oppfinnelsen er det overraskende funnet at promoteren av det umiddelbart tidlige to (IE2) gen av den murine cytomegalovirus (mCMV) er effektiv ved å fremme ekspresjonen av et polypeptid av interesse som ikke er mCMV IE2 proteinet per se, dvs. av et heterologt polypeptid eller protein. Denne ekspresjonsvektor er ikke antatt å være den murine cytomegalovirus per se eller inneholde noen fullstendig mCMV virale gener, men er en vektor som er konsipiert for rekombinant proteinekspresjon.

Derfor angår foreliggende oppfinnelse en ekspresjonsvektor omfattende promoteren til mCMV-IE2 genet bestående av et funksjonelt ekspresjonsfremmende fragment av SEQ ID NO:l, der ekspresjonsvektoren ikke inneholder noe fullstendig gen av mCMV.

I tillegg til dette er en ny enhancer identifisert i mCMV IE2 området og som her angis som mCMV IE2 enhanceren eller IE2 enhanceren. Denne enhancer forsterker ekspresjonen uansett dets lokasjon eller orientering vis-å-vis genet, og forsterker ekspresjonen fra heterologe promotere og fullfører derved generelle kriterier for en enhancer.

Det er også beskrevet en ekspresjonsvektor omfattende enhanceren av mCMV i IE2 genet, eller et funksjonelt ekspresjonsforsterkende fragment derav, der ekspresjonsvektoren ikke inneholder noe fullstendig gen av mCMV.

Fagmannen på området vil erkjenne at vektoren ifølge oppfinnelsen kan omfatte mCMV IE2 promoteren alene eller i kombinasjon med en hvilken som helst egnet, kjent enhancer. Vektoren kan også omfatte mCMV IE2 enhanceren alene eller i kombinasjon med en hvilken som helst egnet promoter. I tillegg kan vektoren ifølge oppfinnelsen omfatte mCMV IE2 promoteren i kombinasjon med mCMV IE2 enhanceren.

mCMV IE2 genet per se er kjent for eksempel fra Messerle et al., 1991.

Uttrykket "promoter" slik det benyttes her, henviser til et område av DNA som virker for kontroll av transkripsjonen av en eller flere DNA-sekvenser, og som strukturelt identifiseres ved nærvær av et bindingssete for DNA-avhengig RNA-polymerase og av andre DNA-sekvenser, som interagerer for å regulere promoterfunksjonen. Et funksjonelt, ekspresjonsfremmende fragment av en promoter er en forkortet eller trunkert promotersekvens som bibeholder aktiviteten som en promoter. Promoteraktivitet kan måles i en hvilken som helst av de i teknikken kjente analyser, for eksempel en rapportøranalyse ved bruk av Luciferse som rapportørgen (Wood, 1991; Seliger og McElroy, 1960; de Wet et al. (1985) eller kommersielt tilgjengelig fra Promega ®).

I henhold til foreliggende oppfinnelse kan IE2 promoteren for eksempel omfatte en sekvens som spenner fra posisjon +1 til TATA-boksen som angitt i Figur 1. IE2 promoteren kan også omfatte en sekvens her angitt som "kjernepromoter" som spenner fra nukleotid 1 til 39 av sekvensen som er angitt i figur 1 (boks). Fagmannen på området vil erkjenne at sekvensen for mCMV IE2 promoteren kan være lenger eller kortere enn kjernepromoteren så lenge den driver transkripsjonen av en DNA-sekvens som operativt er forbundet dertil. For eksempel kan IE2 promoteren også omfatte 100 - 200 basepar oppstrøms kjernepromoteren. Et slikt promoterområde kalles også den "proksimale promoter". Fagmannen på området vil videre erkjenne at uttrykkene "promoter" og "enhancer" (se nedenfor) ikke er nøyaktig definert og at promoteren således kan omfatte enhancerområdet eller enhancerområdene kan omfatte promoterområdet, avhengig av nomenklatur og kontekst.

Uttrykket "vektor" henviser til en hvilken som helst bærer av eksogen DNA eller RNA som er brukbar for overføring av eksogent DNA til en vertscelle for replikasjon og/eller riktig ekspresjon av den eksogene DNA fra vertscellen.

Uttrykket "operativt forbundet" som benyttes her, betyr funksjonell fusering av en promoter med et strukturelt gen eller cDNA eller en hvilken som helst annen DNA-sekvens som skal transkriberes i den riktige ramme for å uttrykke genet, cDNA eller annen DNA under kontroll av promoteren. Uttrykket operativt forbundet, slik det her benyttes, er således ikke begrenset til en direkte fusjon av DNA-sekvenser.

Uttrykket "fullstendig gen av mCMV" henviser til et viralt gen av den murine cytomegalovirus som har sine egne (endogene, virale) 5'- og 3' reguleringselementer.

Et "enhancerområde" henviser til et område av DNA som bevirker økning i transkripsjonen av ett eller flere gener. Mer spesielt er uttrykket "enhancer" som benyttet her, et DNA regulatorisk element som forsterker, øker, forbedrer eller på annen måte gjør ekspresjonen av et gen bedre, uansett dets lokasjon og orientering vis-å-vis genet som skal uttrykkes, og kan være enhver forsterkning, økning, forbedring eller tilsvarende av ekspresjonen av mer enn en promoter. Fortrinnsvis forsterker enhanceren ekspresjonen fra mer enn en promoter samtidig. Et funksjonelt, ekspresjonsforsterkende fragment av en enhancer er en forkortet eller trunkert enhancersekvens som bibeholder den forsterkende aktivitet.

Vektoren ifølge oppfinnelsen omfatter fortrinnsvis et fragment som inkluderer nukleotider -387 til -189 av mCMV IE2 oppstrømsområde der nukleotidnummereringen er i forhold til +1 av IE2 genet. Dette fragment har enhancerfunksjon og det angis her som IE2 enhancer-kortversjonen.

I en ytterligere, foretrukket utførelsesform omfatter vektoren et fragment som inkluderer nukleotidene -587 til -189 av mCMV IE2 oppstrømsområdet der nukleotidnummereringen er i forhold til +1 av IE2 genet. Dette fragmentet har enhancerfunksjon og angis her også som IE2 enhancer-langversjonen.

Vektoren ifølge oppfinnelsen kan også omfatte en ytterligere mCMV IE1 enhancer eller et funksjonelt ekspresjonsforsterkende fragment derav, heretter kalt "CMV IE1 enhancer".

En slik mCMV IE1 enhancer er kjent i teknikken, for eksempel fra US 4.968.615. Den kan for eksempel spenne fra posisjon -587 TIL -147 eller fra posisjon -682 til -147 av sekvensen som vist i figur 1 der nummereringen er i forhold til +1 posisjonen av IE1 genet. mCMV IE1 enhanceren som kan benyttes ifølge oppfinnelsen kan videre omfatte en sekvens som spenner fra basepar -1330 til -488 i forhold til posisjon +1 av IE1 i figur 1. Enhancerområdet kan omfatte hele eller en del av promoteren også.

Ved å benytte en mCMV enhancer i tillegg til IE2 promoteren, kan ekspresjonen av polypeptidet av interesse økes ytterligere.

Ifølge oppfinnelsen omfatter vektoren videre en promoter som er forskjellig fra mCMV IE2 promoteren, eller et funksjonelt, ekspresjonsfremmende fragment derav.

I en foretrukket utførelsesform omfatter vektoren ifølge oppfinnelsen en første og en andre promoter av viral, cellulær eller kunstig opprinnelse, eller et funksjonelt, ekspresjonsfremmende fragment derav.

Ifølge oppfinnelsen er det vist et nærvær av en andre promoter fører til effektiv ekspresjon av et polypeptid av interesse fra mCMV IE2 promoteren. I en foretrukket utførelsesform omfatter vektoren derfor mCMV IE2 promoteren i kombinasjon med en andre promoter, eller et funksjonelt, ekspresjonsfremmende fragment derav. Eksempler på ytterligere, egnede promotere er hCMV promoteren, metallotoineinpromoteren (MT), SV40 promoteren eller en kunstig promoter. Fortrinnsvis er den andre promoter en ytterligere kopi av mCMV IE2 promoteren. Slike ytterligere promotere kan fremme konstitutiv eller regulert ekspresjon. Regulert ekspresjon kan være induserbar eller represserbar ekspresjon, eller begge deler.

Fortrinnsvis er en slik andre promoter promoteren av mCMV-IEl genet, eller et funksjonelt, ekspresjonsfremmende fragment derav. Det er således spesielt foretrukket at den første promoter er mCMV-IE2 promoter, eller et funksjonelt, ekspresjonsfremmende fragment derav, og den andre promoter er mCMV-IEl promoteren, eller et funksjonelt, ekspresjonsfremmende fragment derav.

mCMV-IEl promoteren er kjent for eksempel fra WO 87/03905. Den kan omfatte kjernepromoteren inneholdende de siste 47 bp av sekvensen i figur 1 (boks) eller ytterligere 100 til 200 bp oppstrømssekvenser (dvs. den proksimale promoter), eller den kan omfatte hele det intergeniske området opp til posisjon -1330 (i forhold til posisjon +1 av IE1, se figur 1).

I en foretrukket utførelsesform omfatter vektoren en DNA sekvens i henhold til SEQ ID NO: 1, inkludert både IE1- og IE2 promoteren så vel som IE1 enhanceren og den nye IE2 enhanceren, eller et hvilket som helst funksjonelt, ekspresjonsfremmende fragment derav.

I en meget foretrukket utførelsesform er, i vektoren ifølge oppfinnelsen, promoteren eller et funksjonelt, ekspresjonsfremmende fragment derav, operativt forbundet til en DNA sekvens som koder for minst ett polypeptid. I en ytterligere utførelsesform av oppfinnelsen er enhanceren ifølge oppfinnelsen tilstede på ekspresjonsvektoren sammen med en DNA sekvens som koder for minst ett polypeptid.

Fortrinnsvis koder DNA sekvensen for et protein av interesse.

Det er videre foretrukket at DNA sekvensen koder for et markørprotein, eller et forsterkbart gen.

Det er også foretrukket at DNA sekvensen koder for et rapportørprotein.

Skulle vektoren ifølge oppfinnelsen inneholde mer enn en promoter, kan en hvilken som helst kombinasjon eller subkombinasjon av proteinet av interesse, markør, rapportør, forsterkbart gen, osv., uttrykkes fra det samme plasmid.

Ifølge oppfinnelsen kan polypeptidet av interesse være et hvilket som helst polypeptid som er forskjellig fra IE2 polypeptidet per se, det være seg et ekstracellulært protein som peptidhormon, cytokin eller vekstfaktor eller et transmembranprotein som vekstfaktor-reseptorer eller hormonreseptorer, eller intracellulære proteiner som kinaser, fosfataser eller DNA-bindingsproteiner, avhengig av den tilsiktede bruk av polypeptidet av interesse eller vertscellen i hvilken det uttrykkes.

Markørproteinet som er egnet ifølge oppfinnelsen, er for eksempel negative eller positive seleksjonsmarkører, eller forsterkbare gener. Eksempler inkluderer proteiner valgt blant adenosin deaminase (ADA), aminoglykosid fosfotransferase (neo), dihydrofolat reduktase (DHFR), hygromycin-B-fosfotransferase (HPH), tymidin kinase (tk), xantin-guanin fosforibosyltransferase (gpt), multippel medikamentresistensgen (MDR), ornitin dekarboksylase (ODC) og N-(fosfonacetyl)-L-aspartatresistens (CAD) eller puromycin actyltransferase (PAC). Ytterligere eksempler inkluderer gener som benyttes for seleksjon ved bruk i spesielle metabolske veier som galaktokinase (Schumperli et al., 1982), folatreseptoren (Zhu et al., 2001) eller redusert folatbærer (Assarafetal, 1992).

I nok en foretrukket utførelsesform er polypeptidet av interesse et rapportørgen.

Uttrykket "rapportørgen" eller "rapportørprotein" som benyttet her, er ment å bety et gen som koder et genprodukt som kan identifiseres ved bruk av enkle, rimelige metoder eller reagenser og som operativt kan være forbundet med et promoterområde ifølge oppfinnelsen eller et aktivt fragment derav. Rapportørgener kan benyttes for å bestemme transkripsjonen aktivitet ved screeninganalyser (se for eksempel Goeddel (ed.) Methods Enzymol., Vol. 185, San Diego. Academic Press, Inc. (1990)), f.eks. ved å bruke Luciferase som rapportørgen (Wood, 1991; Seliger and McElroy, 1960; de Wet et al. (1985), eller kommersielt tilgjengelig fra Promega ®).

Eksempler er valgt blant Luciferase, grønt fluorescent protein, alkalisk fosfataser, O-galaktosidase eller pepperrotperoksydase eller intramolekylære kombinasjoner med andre proteiner som f.eks. det grønne fluorescente protein (GFP) eller forsterket GFP (EGFP) med puromycin acetyltransferasegenet (Abbate et al., 2001) eller kombinasjoner derav.

Eksperimentelle data som foreliggende oppfinnelse er basert på, har vist at effektiv, samtidig ekspresjon av polypeptider av interesse kan oppnås fra IE2- og IE1 promoteren, begge tilstede i det samme plasmid. Derfor er, i en ytterligere foretrukket utførelsesform, både mCMV IE2 promoteren og mCMV-IEl promoteren, eller de funksjonelle ekspresjonsfremmende fragmenter derav, operativt forbundet til et polypeptid.

Høye ekspresjonsnivåer kan oppnås hvis begge promotere er tilstede i en bidireksjonell arkitektur. Derfor er mCMV-IE2 promoteren, eller et funksjonelt ekspresjonsfremmende fragment derav, og en promoter, særlig mCMV-IEl promoteren, eller et funksjonelt, ekspresjonsfremmende fragment derav, arrangert bidireksjonelt.

Uttrykket "bidireksjonelt arrangert", som benyttet her, er ment å bety at promoterne driver transkripsjonen i motsatte retninger. Dette arrangement for plasmid-DNA kan gis også som en "bidireksjonell arkitektur" for vektoren.

Promoterne for mCMV-IEl- eller mCMV-IE2 genet, eller de funksjonelle, ekspresjonsfremmende fragmenter derav, eller en hvilken som helst ytterligere promoter som kan benyttes i kombinasjon med mCMV-IE2 promoteren, eller i kombinasjon med IE2 enhanceren, kan videre inkludere et translasjons initierings signal.

I en ytterligere, foretrukket utførelsesform er promoteren av mCMV-IE2 genet, eller et funksjonelt, ekspresjonsfremmende fragment derav forbundet med andre elementer som regulerer eller påvirker transkripsjonen. Slike elementer kan påvirke prosessering, stabilitet eller translasjonseffektivitet for RNA. Eksempler på egnede elementer er valgt fra gruppen bestående av 5'UTR'er, introner, 3'UTR'er (se for eksempel Mazumder et al, 2003), mRNA 3'-ende prosesseringssekvenser (for eksempel polyadenyleringsseter) og IRES-sekvenser for polycistronisk ekspresjon (se for eksempel Mountford og Smith, 1995).

Det er foretrukket å benytte et IRES-element for ekspresjon av polycistroniske mRNA, hvori de kodende sekvenser er adskilt av denne IRES. Fordelene er at flere polypeptider av interesse kan uttrykkes fra den samme RNA og således fra den samme promoter.

I nok en foretrukket utførelsesform kan promoteren av mCMV-IE2 genet alene, eller i kombinasjon med promoteren av mCMV IE1 genet eller en hvilken som helst annen nøytral eller kunstig promoter, være forbundet til ytterligere ekspresjonsfremmende sekvenser som isolatorer, grenseelementer, LCR'er (for eksempel beskrevet av Blackwood og Kadonga (1998)) eller matriks/stillasfesteområder (for eksempel beskrevet av Li et al, 1999).

Fagmannen på området vil erkjenne at vektoren ifølge oppfinnelsen også kan inneholde ytterligere enhancer som for eksempel den velkjente SV40 enhanceren eller hCMV enhanceren.

I henhold til foreliggende oppfinnelse kan polypeptidet som operativt er forbundet til den første promoter, fortrinnsvis mCMV IE 2 promoteren, og polypeptidet som operativt er forbundet til en andre promoter, fortrinnsvis mCMV IE1 promoteren, være de samme. I dette tilfellet er to kopier av det samme gen tilstede på samme vektor, men under kontroll av to forskjellige promotere. Det kan således være mulig å oppnå en ekspresjonshastighet som er større enn ekspresjonen fra en enkelt kopi av et gen som koder polypeptidet av interesse.

I en alternativ utførelsesform er polypeptidet som operativt er forbundet med en første promoter, fortrinnsvis mCMV IE2 promoteren, og polypeptidet som operativt er forbundet til en andre promoter, fortrinnsvis mCMV 1E1 promoteren, forskjellige. Oppfinnelsen tilveiebringer således en effektiv vektor for ko-ekspresjon av to forskjellige polypeptider som seleksjonsmarkører og proteiner av interesse, ko-ekspresjon av to eller flere subenheter med det samme protein, eller også forskjellige domener av det samme protein hvis det skulle være ønskelig å uttrykke disse separat fra hverandre, men i samme vertscelle.

Fagmannen på området vil erkjenne at flere ekspresjonsvektorer ifølge oppfinnelsen kan ko-transfekteres inn i den samme celle og tjene til ekspresjon av flere proteiner og/eller subenheter av heller komplekse, multimere proteiner.

Det er foretrukket at polypeptidet som operativt er forbundet til en første promoter, for eksempel mCMV IE2 promoteren, er en første subenhet av et dimert eller multimert protein og at polypeptidet som operativt er forbundet til en andre promoter, fortrinnsvis mCMV IE1 promoteren, er en andre subenhet av et dimert eller multimert protein. Ko-ekspresjon av de to subenheter av et dimert protein er foretrukket ifølge oppfinnelsen. Ko-ekspresjon av to subenheter av det samme protein er spesielt fordelaktig fordi ekspresjon fra begge promotere kan resultere i produksjon av like mengder av subenheter eller av på forhånd bestemte forhold mellom polypeptidene, avhengig av styren av de benyttede promotere. Subenhetene kan så settes sammen i den samme celle for å gi et modent protein.

Foretrukne eksempler på dimere proteiner som er egnet for ekspresjon ved bruk av en vektor ifølge oppfinnelsen, er alfakjeden og betakjeden av et peptidhormon som human FSH, human LH, human TSH og human CG. En av de to subenheter kan være forbundet til en promoter ifølge oppfinnelsen, fortrinnsvis mCMV IE2 promoteren. Fagmannen på området vil erkjenne at hormoner fra andre specier likeledes kan benyttes ifølge oppfinnelsen, for eksempel hest eller hestelignende, svin eller svinefamilien eller bovine hormoner, for eksempel avhengig av den tilsiktede bruk av det rekombinante polypeptid.

Den første subenheten kan være en tung kjede, og den andre subenhet er den lette kjede av et immunoglobulin, eller vice versa. Et eksempel på et egnet immunoglobulin er IgG. Slike immunoglobuliner kan for eksempel være humanisert eller humane antistoffer for terapeutisk bruk. Et meget foretrukket eksempel for et slikt humanisert antistoff er et humanisert anti-CDl 1 antistoff med handelsnavnet Raptiva ®.

Mange polypeptider av interesse kan uttrykkes ved bruk av en vektor ifølge oppfinnelsen. Polypeptidet kan være valgt fra gruppen bestående av chorionisk gonadotropin, follikel-stimulerende hormon, lutropin-choriogonadotropisk hormon, thyroidstimulerende hormon, humant veksthormon, interferoner (for eksempel interferon beta-la, interferon beta-lb), interferon reseptorer (for eksempel interferon gammareseptor), TNF reseptorer p55 og p65, interleukiner (for eksempel interleukin-2, interleukin-11), interleukin bindingsproteiner (for eksempel interleukin-18 bindingsprotein), anti-CDl la antistoffer, og muteiner, fragmenter, oppløselige former, funksjonelle derivater eller fusjonsproteiner derav.

Andre foretrukne polypeptider av interesse kan for eksempel inkludere erytropoietin, granulocyttkoloni-stimulerende faktor, granulocytt-makrofag kolonistimulerende faktor, pituitær peptidhormoner, menopausal gonadotropin, insulinlignende vekstfaktorer (for eksempel somatomedin-C), keratinocytt-vekstfaktor, glial cellelinje-avledet neurotrofisk faktor, trombomodulin, basisk fibroblast vekstfaktor, insulin, Faktor VIII, somatropin, benmorfogenisk protein-2, plateavledet vekstfaktor, hirudin, epoietin, rekombinant LFA-3/IgGl fusjonsprotein, gluccocerebrosidase og muteiner, fragmenter, oppløselige former, funksjonelle derivater, fusjonsproteiner derav.

Oppfinnelsen angår en vertscelle som kan være transfektert med minst en vektor som beskrevet ovenfor. Fagmannen vil erkjenne at vertscellen likeledes kan ko-transfekteres med to eller flere vektorer.

Mange vertsceller er egnet som primære eller etablerte cellelinjer fra et vidt spektrum av eukaryoter inkludert plante- og animalceller, pattedyr- eller humanceller. For eksempel kan egnede celler inkludere CHO-, COS-, CV1-, muse L-, HT1080-, BHK-21-, HEK293-, NIH-3T3-, LM-, Yl-, NSO- og SP2/0 muse hybridomceller og lignende, Namalwa celler, RPMI-8226 celler, Vero celler, WI-38 celler, MRC-5celler eller andre immortaliserte og/eller transformerte celler.

Fortrinnsvis er vertscellen i følge oppfinnelsen en CHO celle som kan være en CHO-S celle, som beskrevet av Shotwell et al. (1982, J Biol. Chem. 257:2974-2980). CHO celler ble først dyrket av Puck (J. Exp. Med. 108, 945, 1958) fra en biopsi fra et ovarie fra en kinesisk hunnhamster. Fra disse opprinnelige celler ble det fremstilt et antall underlinjer med forskjellig karakteristika. En av disse CHO cellelinjer, CHO-K1, er prolinkrevende og er diploid for dihydrofolatreduktase (DHFR) genet. En annen linje avledet fra denne cellelinje er en DHFR effektiv CHO cellellinje (CHO DUK Bil)

(PNAS 77,1980, 4216-4220) som karakteriseres ved tap av DHFR-funksjonen som en konsekvens av en mutasjon i et DHFR gen og det etterfølgende tap av det andre genet.

Alle disse cellelinjer kan transfekteres med vektorene ifølge oppfinnelsen, enten transient, eller i en halvstabil (for eksempel hvis vektoren er episomal) eller stabil (for eksempel integrert i genomet) modus. Stabil transfeksjon er foretrukket for å etablere kloner som kontinuerlig uttrykker polypeptidet av interesse.

IE2 promoteren eller IE2 enhanceren, kan benyttes som regulatoriske elementer innen rammen av en teknologi kalt "endogen genaktivering". Vektoren ifølge oppfinnelsen kan innføres i lokus av genomet som antas å være aktivert ved homolog rekombinering og således operativt forbinde den regulatoriske sekvens (IE2 promoter og/eller - enhancer) med genet av interesse, hvis ekspresjon man ønsker å indusere eller forsterke. Teknologien beskrevet for eksempel W091/09955.

I et tredje aspekt angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid av interesse omfattende det trinn med transfektering av en vertscelle med en vektor ifølge oppfinnelsen.

Avhengig av arten av polypeptidet av interesse fører fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen til et utskilt protein eller polypeptid som kan høstes fra cellekultursupernatanten, eller til et cellemembranprotein eller et intracellulært protein som kan isoleres fra cellene ved kjente metoder. Polypeptid som fremstilles ifølge oppfinnelsen kan tjene et hvilket som helst formål og er fortrinnsvis et terapeutisk protein ment for administrering til dyr eller mennesker.

Avhengig av den tilsiktede bruk kan cellen per se med polypeptidet integrert, være produktet av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. En slik celle kan for eksempel benyttes for cellebasert terapi.

I et fjerde aspekt angår foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid av interesse omfattende trinnet dyrking av en vertscelle ifølge oppfinnelsen.

I en foretrukket utførelsesform omfatter fremgangsmåten videre isolering av polypeptidet av interesse fra vertscellene eller cellekultursupernatanten. Dette trinn er spesielt fordelaktig og lett og gjennomføre for utskilte proteiner som kan isoleres enkelt fra cellekultursupernatanten. Imidlertid kan dette trinnet likeledes gjelde isolering av polypeptidet fra cellemembraner eller intracellulære rom, som kan isoleres fra vertscellene.

Fremgangsmåten kan benyttes i transiente, stabile, episomale eller virale ekspresjonssystemer. Som vist i eksemplene nedenfor, resulterte vektoren ifølge oppfinnelsen i spesielt sterk ekspresjon av det ønskede protein hvis benyttet i et stabilt ekspresjonssystem. I en foretrukket utførelsesform er transfeksjonen derfor en stabil transfeksjon.

I et femte aspekt benyttes vektoren ifølge oppfinnelsen for ekspresjon av et gen av interesse. Gener av interesse kan for eksempel være gener som koder for et hvilket som helst av de ovenfor nevnte polypeptider av interesse. Vektoren ifølge oppfinnelsen kan også benyttes for ekspresjon av markørgener, rapportørgener, forsterkbare gener eller lignende.

Fortrinnsvis benyttes vektoren for samtidig ekspresjon av to eller flere gener eller cDNA'er av interesse. Den kan også benyttes for samtidig ekspresjon av ett gen av interesse og et markørgen eller rapportørgen eller et forsterkbart gen, eller lignende. Innenfor rammen av oppfinnelsen er det overraskende vist at en vektor ifølge oppfinnelsen, særlig en vektor omfattende IE2 promoteren og IE1 promoteren, resulterer i identifisering av kloner som sterkt uttrykte et rapportørgen og et gen av interesse.

I et sjette aspekt angår oppfinnelsen derfor bruken av en vektor ifølge oppfinnelsen for seleksjon av kloner som uttrykker høye mengder av et gen av interesse.

I et syvende aspekt angår oppfinnelsen anvendelsen av en vektor ifølge oppfinnelsen for fremstilling av et medikament for bruk i plasmid- eller DNA basert terapi eller genterapi.

I et åttende aspekt blir vertscellen ifølge oppfinnelsen benyttet for fremstilling av et medikament for cellebasert terapi. Skulle den cellebaserte terapi være ment for human behandling, er det foretrukket et vertscellen er en human celle eller human cellelinje, mer spesielt en celle eller cellelinje avledet fra pasienten som skal behandles.

Mens oppfinnelsen er beskrevet i forbindelse med spesifikke utførelsesformer skal det være klart at det er mulig med ytterligere modifikasjoner.

Referanser til kjente metodetrinn, konvensjonelle metodetrinn, kjente metoder eller konvensjonelle metoder skal ikke på noen måte anses som en innrømmelse dit hen at foreliggende oppfinnelse skal være foregrepet av noen kjent teknikk.

Beskrivelsen skal anses å omfatte alt som ligger innenfor rammen av de vedlagte krav.

EKSEMPLER

EKSEMPEL 1: Evaluering av ekspresjonsvektorer ved transiente

tr ansfeks joner.

Materialer og metoder:

Materialer

Celler: CHO-S, opprinnelse Gibco/Invitrogen (Cat no. 11619).

Plasmid DNA'er som er konstruert som angitt i figurene 2 og 3 blir isolert fra overnatt-voksende standardkulturer med Nucleobond PC 500 kit (Macherey-Nagel Cat. No. 740574) i henhold til produsentens protokoll.

Transfeksjon:

Lipofectamine (Invitrogen, Cat. No. 18324-012)

Format: 24 brønners plate.

Celler: CHO-S celler i eksponensielle vekstfaser ble ført 24 timer før transfeksjon. For å unngå en stasjonær fase ved lav celledensitet, ble cellene fortynnet til 0,75 x IO6 celler/ml. Den totale mengde av celler for transfeksjon var 1,5 x 10<5>, resuspendert i 100 (il serumfritt medium SFM II (Invitrogen, Cat. No. 12052-114) pr. brønn, i 24 brønners plater.

Transfeksjonsblandingen var som følger:

A) Lipofectamine: 2 ul

SFM II Medium: 48 ul

Totalvolum er 50 ul.

B) DNA'er: 1 ug (50 ng ekspresjonsvektor + 950 ng bæreplasmid, pBluescript II KS(+), Stratagene, cat. 212205-01

SFM II Medium: komplement til 50 (il.

Oppløsningene A og B ble blandet og inkubert i 30 minutter ved romtemperatur. Denne blanding ble satt til 100 ul SFM II Medium inneholdende 1,5 x IO<5>celler. Cellene ble plassert tilbake til inkubatoren og inkubert ved 37°C, 5% CO2, i 3 timer.

Deretter ble 400 ul SFM II Medium satt til for å fortynne Lipofectamine. Deretter ble cellene inkubert i ytterligere 48 timer før prøvetaking for analyse. Alle transfeksjoner ble gjennomført i triplikat.

Luciferasemåling:

Bright-Glo Luciferase-analysesystemet fra Promega, Cat No E2610 ble benyttet for Luciferasemåling ifølge produsentens retningslinjer.

Kort sagt ble cellesuspensjonen homogenisert ved pipettering opp og ned flere ganger og en alikvot på 50 ul ble hentet ut og brakt i en hvit 96 brønners plate (Nunc, Cat no 236108). Deretter ble 50 ul rekonstituert Bright-Glo reagens tilsatt og det hele inkubert i 5 minutter ved romtemperatur. Lysemisjonen ble målt på en Centro LB 960 luminometer (Berthold Technologies) 5 sekunder etter akviseringstiden.

Resultater

Ekspresjonsvektorkonstruktene som ble benyttet i et CHO-S cellebasert transient ekspresjonssystem er vist i Figur 2. I denne serie forsøk ble Luciferase benyttet som et rapportørgen for evaluering av genekspresjon. Vektorer med enten ingen promoter i det hele tatt (konstrukt A) eller SV40 promoteren/enhanceren (konstrukt B), som ikke er meget aktiv i CHO-S celler, ble benyttet som kontroller.

Resultatene fra transient transfeksjonsforsøk med vektorene A til G er vist i figur 4. I konstruktene C og F drives Luciferaseekspresjonen av IE1 promoteren. Begge konstrukter resulterte i Luciferaseekspresjon. Konstrukt C inneholdt videre IE2 promoteren anordnet bidireksjonelt i forhold til IE1 promoteren. Dette bidireksjonelle arrangement reduserte ekspresjonseffektiviteten fra IE1 promoteren, konstruktet C, sammenlignet med bruken av IE1 promoteren alene, konstrukt A. En kortversjon på 0,68 kb av IE1 promoteren (konstrukt G) var mindre effektivt enn den lengre versjon (konstrukt F).

Uansett nærvær eller fravær av en andre promoter i det samme konstrukt, drev IE2 promoteren effektivt Luciferaseekspresjon (konstruktene D og E) og kan således benyttes som et promoterelement i ekspresjonsvektorer for ekspresjon av polypeptider av interesse.

I motsetning til IE1 promoteren var IE2 promoteren mindre effektiv hvis benyttet alene (konstrukt E) enn hvis den ble benyttet i en bidireksjonell arkitektur (konstrukt D). Den er derfor spesielt egnet for bruk i bidireksjonelle ekspresjonsvektorer.

EKSEMPEL 2: Evaluering av ekspresjonsvektorer ved stabil transfeksjon Materialer og metoder

Metoder:

Celler: CHO-S, fra Gibco/Invitrogen (Cat no. 11619).

Plasmid DNA'er i henhold til figur 2 ble isolert fra overnatt-voksende standardkulturer med Nucleobond PC 500 kit (Macherey-Nagel Cat. No. 740574) i henhold til instruksjoner gitt av produsenten.

Transfeksjon:

Lipofectamine (Invitrogen, Cat. No. 18324-012)

For stabile transfeksjoner ble det benyttet T75 kolber. CHO-S i eksponensielle vekstfaser ble ført 24 timer før transfeksjon. For å unngå en stasjonær fase ved lav celledensitet, ble cellene fortynnet til 0,75 x IO6 celler/ml. Den totale mengde av celler for transfeksjon var 5 x IO6 celler, resuspendert i 7 (il SFM II medium (Invitrogen, Cat. No. 12052-114) i en T75 kolbe.

Transfeksjonsblandingenr var som følger:

A) Lipofectamine: 52,1 (il

SFM II Medium: 517,9 (il

Totalvolum er 570 (il.

B) DNA'er: 10 ug linearisert plasmid DNA (9 ug Lue ekspresjonsvektor + 1 ug plasmid for seleksjon: SV40 promoterdriver Puromycine resistensgenet. Alle plasmider ble linearisert med Pvul)

SFM II Medium: komplement til 570 (il.

A og B ble blandet og inkubert i 30 minutter ved romtemperatur. 7 ml inneholdende 5 x IO<6>celler ble satt til og cellene brakt tilbake til inkubatoren ved 37°C, 5% CO2, i 3 timer. Cellekulturen ble så sentrifugert ved 800 g i 3 minutter og cellepelleten resuspendert i 5 ml EX-CELL 325 (JRH, Cat no 14335-1000M), supplert med IX HT og 4,5 mM L-glutamin (100X HT, Invitrogen, Cat no 11067-030, L-Glutamine 200 mM, Sigma, G-7513). 5 ml EX-CELL 325 ble tilsatt direkte til T75 kolben for å resuspendere adherende celler og satt til suspensjonen. Til sammen var det 5 x IO<6>celler i 10 ml EX-CELL 325 medium.

Seleksjonsprosedyre:

Seleksjon ble gjennomført 48 timer etter transfeksjon ved å skifte medium og fortynning til 1 x IO6 celler/ml i EX-CELL 325 inneholdende 10 ug/ml puromycine (Sigma, P-8833). Hver annen dag ble cellene telt, sentrifugert og resuspendert i friskt, selektivt medium ved 1 x IO<6>levende celler/ml. Levedyktigheten ble undersøkt ved disse punkter. Etter 21 til 35 dager var seleksjonen ferdig og cellelevedyktigheten av over 80%.

Luciferasemåling:

2 timer før prøvetaking fra kulturen ble cellene talt og kulturen fortynnet til 0,2 x IO6 levende celler/ml.

Bright-Glo Luciferase-analysesystemet fra Promega, Cat No E2610 ble benyttet i henhold til produsentens retningslinjer.

Kort sagt ble cellene suspendert ved pipettering opp og ned flere ganger og en alikvot på 50 (il ble hentet ut og brakt i en hvit 96 brønners plate (Nunc, Cat no 236108). 50 (il rekonstituert Bright-Glo reagens ble tilsatt direkte og inkubert i 5 minutter ved romtemperatur. Lysemisjonen ble målt på et Centro LB 960 luminometer (Berthold Technologies) innen 5 sekunder etter akkvisisjonstiden.

Luciferaseaktiviteten ble så normalisert ved antall levende celler i den testede prøve, dvs. typisk 1 x IO4 celler.

Resultater

Konstruktene C, D, E og F (se figur 2) ble testet i et stabilt ekspresjonssystem. Resultatene er vist i figur 5. Konstrukt E omfattende IE2 promoteren alene, resulterte i den sterkeste ekspresjon av Luciferase i dette system. Tilstede sammen med IE1 promoteren i bidireksjonelt arrangement (konstrukt D) resulterte i IE2 promoteren fremdeles i Luciferaseekspresjon som var overlegen ekspresjonen drevet av IE1 promoteren, enten alene (konstrukt F) eller i bidireksjonelt arrangement med IE2 promoteren (konstrukt C).

EKSEMPEL 3: Ko-ekspresjon av to polypeptider av interesse fra

bidireksjonelle ekspresj onsvektorer

Materialer og metoder

Transfeksjonene ble gjennomført som beskrevet i Eksemplene 1 og 2. Kort sagt ble CHO-S celler (i suspensjon, Gibco, SFMII) transfektert transient med 900, 500, 300 eller 100 ng vektor DNA (konstrukt C-2, se figur 3) i 24 brønners plater (triplikat for hver betingelse). To dager etter transfeksjon ble Luciferaseanalyse gjennomført med celleekstrakter fra triplikatene, uttrykt ved RLU (relative lysenheter). Supernatanter fra de samme brønner ble tatt før cellelysering, slått sammen og analysert på IL18BP ved Elisa (se nedenfor).

IL- 18BP ELISA

Mengden av rekombinant human IL-18BP (rhIL-18BP) i supernatanten ble målt ved standard ELISA ved bruk av proteinG-renset, monoklonalt anti-rh-IL-18BP antistoff som var koblet til biotin. Extravidine-HRP (Sigma) ble benyttet som detekteringsreagens.

Figur 9 viser mengdene av IL-18 BP i ng/ml og Luciferase i RLU uttrykt ved 48 kloner på dag 90 etter stabil transfeksjon med et bidireksjonelt mCMV promoterkonstrukt (se figur 3). Detekteringsgrensen for Luciferase var rundt 500 RLU og 2,5 ng/ml for IL-18BP.

Resultater:

I denne serie av forsøk analyserte man samtidig ekspresjon av to gener fra konstrukt C-2, angitt i figur 3. Markørgenet (Luciferase) ble uttrykt fra IE1 promoteren og genet av interesse, IL-18BP-genet, ble uttrykt fra IE2 promoteren. IL-18BP er et utskilt protein. Promoterne ble anordnet i bidireksjonell arkitektur, dvs. at begge promotere samtidig

drev ekspresjonen i motsatte retninger.

Resultatene av denne studie er vist i figurene 6 til 9. Figur 6 viser graden av Luciferaseekspresjon, uttrykt ved RLU målt i et transient ekspresjonssystem. I det samme, transiente ekspresjonssystem ble IL-18BP målt ved ELISA i cellekultursupernatanter. Figur 7 viser resultater i ng/ml utskilt IL-18BP. Figur 8 viser forholdet IL-18BP:Luciferase i hvert transient ekspresjonsforsøk.

Som vist i figurene 6 til 8, ble forskjellige mengder av plasmid DNA benyttet for transfeksjon. Alle mengder av DNA som ble benyttet resulterte i ekspresjon av både Luciferase og IL-18BP. Overraskende ble de beste resultater oppnådd ved den laveste mengde transfektert DNA, 100 ng vektor DNA, konsistent for IL-18BP og Luciferase.

Videre indikerer den stabile kvotient (figur 8) en konstant sammenheng mellom ekspresjonspotensialet for de to promotere.

Som konklusjon viser disse data at begge gener samtidig er uttrykt fra de to promoterenheter, noe som videre viser at begge ekspresjonsenheter fullt ut funksjonerer i den bidireksjonelle promoterarkitektur.

Deretter ble konstruktet C-2 transfektert stabil og ekspresjonen av Luciferase og IL-18BP ble analysert i 48 uavhengige kloner.

Stabile transfeksjoner ble gjennomført i henhold til protokollen som beskrevet i Eksempel 2, bortsett fra at det medium som ble benyttet etter transfeksjonen, var ProCho5 (Cambrex, cat 12766Q).

For enkeltcellekloning ble poolen brakt opp i en 384 brønners plate (Nunc, cat. 164688) ved en densitet på 0,5 celler pr. brønn (70 ul/brønn) ved bruk av en Multidrop dispenser (ThermoLabsystems, cat. 5840150). 8 dager senere ble 192 kloner plukket vilkårlig og analysert på Luciferaseekspresjon. 48 kloner med høyest Lue ekspresjon ble valgt og analysert igjen både på Luciferase (luminometri) og IL 18 BP ekspresjon (ved manuell ELISA, se ovenfor).

Figur 9 viser resultatene av dette forsøk. Alle 48 kloner uttrykte Luciferase og IL-18BP, om enn i forskjellige mengder.

EKSEMPEL 4: Minimal enhancersekvensdefinisjon

Materialer og metoder

Plasmid DNA' er

Et sett av vektorer bestående av forkortede mCMV promotere ble bygget ved bruk av PCR (Polymerase Chain Reaction) og spesifikke primere som matchet langs mCMVp (Tabell 1).

PCR betingelser var som følger:

Blanding:

10 ng DNA plasmid (prevmCMV-Luciferase (AXhoI), konstrukt E i figur 2)

50 pmol av både sens- og antisens primer (se tabell 1 nedenfor, felles antisens for alle) 200 uM hver av dNTPs (dATP, dTTP, dGTP, dCTP)

IX Dynazyme buffer inneholdende 1,5 mM MgCy

4 enheter Dynazyme II DNA polymerase (Finnzymes, cal. F-501S)

Sykliseringsparametere:

95°C,5'

2 sykler:

95°C, 30"

52°C, 30"

72°C,1'30

2 sykler:

95°C, 30"

54°C, 30"

72°C,1'30

10 sykler:

95°C, 30"

58°C, 30"

72°C,1'30

15 sykler:

95°C, 30" 60°C, 30" 72°C,1'30 5 ul av hver PCR reaksjon ble satt på en 1% agarosegel. Bånd med korrekt lengde ble skåret ut og renset ved bruk av Qiagen Minilute Gel Ekstraheringskit, cat. 28606, før kloning.

Posisjonene tilsvarende antallet basepar som var beholdt fra mCMVp med +1 fra IE2 som referanse er -1076, -783, -587, -387 og -189.

Kloningsstrategien for hvert av promoterfragmentene var den samme. PCR ble gjennomført på fullengde mCMVp (prevmCMV-Luciferase (AXhoI), dvs. konstrukt E i figur 2). Fragmentene ble så kuttet med XhoI/EcoRI, to restriksjonsseter som var addert ved ekstremiteten av den spesifikke primersekvens. Promotersekvensene ble så fjernet fra konstrukt E ved kutting med XhoI/EcoRI og kortere versjoner ble innskutt ved den samme locus.

Evalueringen av konstruktene skjedde ved transient Lipofectamin transfeksjon fulgt av Luciferasemåling. Ytterligere materialer og metoder var som beskrevet i Eksempel 1. SFM-mediet som ble benyttet i dette eksempel var ProCho5, Cambrex, B-12766Q.

Resultater

Vektorene H til N (Figur lO.a) omfattende mCMV IE2 promoteren som driver Lusiferacegenet ble konstruert for å definere minimale sekvenser som er nødvendige for høye ekspresjonsnivåer fra IE2 promoteren.

De syv ekspresjonsvektorkonstrukter H til N ble benyttet i CHO-S cellebasert transient ekspresjonssystem. Resultatene er vist i figur lO.b). Konstrukt L er det korteste konstrukt som bibeholder sterk ekspresjon av Luciferase i dette system. Konstrukt M resulterte fremdeles i Luciferaseekspresjon hvis nivå var ca. 30% av ekspresjonsnivåene som ble nådd med konstruktene H til L. Luciferaseekspresjonen som ble oppnådd i konstrukt N ved meget lav, men fremdeles signifikant, noe som antyder en basal promoteraktivitet som forventet for et produktivt transkripsjonsstartsete inneholdende en TATA boks og initiator.

Som en konklusjon, definerer disse forsøk en ny enhancer i mCMV IE2 oppstrøms området, her kalt mCMV IE2 enhanceren. I forsøkene ovenfor øker IE2 enhanceren transkripsjonen fra den minimale IE2 promoter som ble beholdt i konstrukt N. Den minimale sekvens som var nødvendig for høye rapportørgenekspresjoner ligger innen -587 til -189 bp fragmentet (konstrukt L), og et konstrukt omfattende -387 til -189 bp fragment forsterket fremdeles Luciferaseekspresjonen (konstrukt M).

EKSEMPEL 5: Den nye IE2 enhancer aktiverer en SV40 minimal promoter

Ytterligere forsøk ble gjennomført for å bedømme hvorvidt den nye IE2 enhancer virkelig oppfyller alle kriterier som kreves for enhanceraktivitet, dvs. forsterkning av ekspresjonen uavhengig av (1) lokasjon, (2) orientering og (3) promoteridentitet. For å gjøre dette ble konstruktene O til V konstruert for å bedømme om den nye IE2 enhanceren kunne forsterke ekspresjonen av en heterolog promoter, SV40 promoteren, uavhengig av orientering, avstand og posisjon (5' eller 3'), relativt SV40 promoteren. Konstrukter W, X og Y var kontrollene, W inneholdende SV40 enhanceren, X ikke inneholdende noen enhancer, men SV40 promoter og Y inneholdende verken enhancer eller promoter.

Vektorkonstruksjon

En vektor kalt pSV-Luc (konstrukt X i figur 1 l(a)) som inneholder kun SV40 promoteren ble konstruert frapGL3-CtrI (Promega, E 1741), inneholdende SV40 promoter som driver Luciferasegenet og SV40 enhancer lokalisert i 3' av genet (konstrukt W) og pGL3-Basic (Promega, E1751) som mangler både promoter og enhancer (konstrukt Y).

Kort sagt ble pGL3-ctrI kuttet med Notl/Xbal for å isolere et fragment inneholdende SV40 promoteren, fulgt av Luciferasegenet. På en tilsvarende måte ble pGL3-basic kuttet med Notl/Xbal og vektorskjelettet inneholdende poly A området ble isolert, uten 3' enhanceren. Ved å kombinere de to fragmenter oppnådde man pSV-Luc (konstrukt

X).

5'-området av SV40 promoteren av denne vektoren ble konstruert ved kloning av IE2 enhancersekvensen (-587 til -189) i begge orienteringer, kalt p5'enh-SV-Luc (konstrukt O) og p5' revers enh-SV.Luc (konstrukt Q). Videre ble IE2 enhancersekvensen (-587 til -189) også klonet inn i 3' området av Luciferasegenet, i begge retninger. Resulterende vektorer ble kalt p3'enh-SV-Luc+ (konstrukt S) og p3' reverseenh-SV.Luc (konstrukt U).

Den samme prosedyre ble gjennomført med de korte versjoner av IE2 enhanceren, dvs. med -387 til -189 i stedet for -587 til -189, og ble kalt konstruktene P, R, T og V, se figur 11 .a.

Konstrukt O, P: Resipientvektor var pSV-Luc+ (konstrukt X i Fig. 11 .a) åpnet ved kutting med Nhel/Smal. Fullengde enhanceren ble isolert ved en kutting med Ndel, fulgt av en stumpendingsreaksjon ved bruk av klenow polymerase, rensing og kutting med Nhel. Den samme strategi ble benyttet for konstruksjon av det korte enhancerkonstrukt.

Konstrukt Q, R: Resipientvektor var pSV-Luc+ (konstrukt X i Fig. 11 .a) åpnet ved kutting med Xhol/Smal. Fullengde enhanceren ble isolert ved en kutting med Ndel, fulgt av en stumpendingsreaksjon ved bruk av klenow polymerase, rensing og kutting med Xhol. Den samme strategi ble benyttet for konstruksjon av det korte enhancerkonstrukt

Konstrukt S,T, U og V: Resipientvektor var pSV-Luc+ (konstrukt X i Fig. 1 l.a) åpnet ved kutting med BamHI fulgt av stumpending ved bruk av klenow polymerase. Fullengde enhanceren ble isolert ved kutting med Ndel/Nhel, fulgt av stumpendingsreaksjon ved bruk av klenow polymerase. Kloning tillot begge orienteringer som ble identifisert ved restriksjonsanalyse. Begge orienteringer ble beholdt for analyse. Den samme strategi ble benyttet for konstruksjon av det korte enhancerkonstrukt

Konstruktene pGL3-Basic (konstrukt Y) tjente som kontroll uten ekspresjon. pGL3-ctrI (konstrukt W) tjente som SV40 promoter/enhancervektor. PSV-Luc var kontrollen som hadde SV40 promoteren alene (konstrukt X).

Transfeksjoner og Luciferasemålinger ble gjennomført som i de foregående eksempler.

Resultater

Resultatene som ble oppnådd med konstruktene O til Y i figur 1 La er angitt i figur 1 l.b. Det enhancerfrie SV40 promoterkonstrukt ble tatt som en bunnlinje for tilføyet enhanceraktivitet og aktivitetsmåling med konstrukt X ble satt som 1. Alle konstrukter med enten den lange eller den korte IE2 enhancer resulterte i ekspresjon av reseptorgenet. Den lange versjonen resulterte konsistent i høy ekspresjon av rapportørgenet fra SV40 promoteren som var meget høyere enn ekspresjonsnivåene som ble oppnådd ved kombinasjonen av SV40 promoter og SV40 enhancer (konstrukt O). Derfor definerer dette forsøket klart -587 til -189 sekvensen og -387 til -189 sekvensen som bona fide enhancer som aktiverer en heterolog promoter på en posisjons- og orienteringsuavhengig måte.

EKSEMPEL 6: Sammenligning mellom den lange IE2 enhancerversjon (-587

til -189) og hCMV enhanceren

Forsøksprotokoller for transformering med Lipofektamin etterfulgt av Luciferasemåling, er beskrevet i Eksempel 1.

Resultater

I dette forsøk ble konstrukter O og Q med den lange versjon av den nye IE2 enhancer i begge orienteringer 5' av SV40 promoteren, benyttet for sammenligning med en kjent, sterk enhancer, hCMV (human cytomegalovirus) enhanceren. For dette formål ble mCMV IE2 sekvensen erstattet med hCMV enhancersekvensen (SEQ ID NO: 2) i konstrukt O, noe som resulterte i konstrukt 0-2. Det samme skjedde i konstrukt Q og man fikk konstrukt Q-2.

hCMV enhancersekvensen med Mlul setene (Mlul=acgcgt) som flankerte den og som ble benyttet for kloning, var som følger:

SV-Luc+ ble kuttet ved Mlul og behandlet med kalvetarm alkalisk fosfatase for å forhindre autoligering. hCMV promotersekvensen ble klonet i Mlul setet. Begge orienteringskloner ble beholdt for sammenligning med ekvivalente IE2 konstrukter.

Resultater av Luciferaseekspresjonen er vist i figur 12. Luciferaseekspresjonsnivået som ble oppnådd med den nye IE2 enhancer (lang versjon) var minst to ganger så høy som Luciferaseekspresjonsnivåene som ble oppnådd med den klassiske hCMV enhancer.

EKSEMPEL 7: IE2 enhancer\ teiser i et bidireksjonelt konstrukt

To ytterligere konstrukter ble designet for å teste den nye enhancer i en bidireksjonell arkitektur, kalt konstruktene #26 og #140 som vist i figur 13.

#26: Basis for denne vektor var mCMV-Luc+ (konstrukt C, figur 3). Den ble kuttet med SacI/EcoRI. IL-18BP kassetten ble tatt fra phCMV-IL18BP2. Ved å kutte denne vektor med SacI/EcoRI, et fragment inneholdende Intron A fulgt av IL-18BP åpen leseramme og SV40polyA området, ble isolert.

#140: Basis for denne vektor var konstruktet L i figur lO.a. Den ble kuttet med Xhol/Nhel, noe som åpnet vektoren 5' av IE2 enhanceren. En vektor som uttrykker IL18BP fra IE1 promoteren, kalt pBS.I IL18BP(IE1), ble benyttet som innskuddsdonor. Ved kutting av denne vektor med Xhol/Spel, ble det isolert et fragment inneholdende IE1 promoteren fra Xhol (se figur 1) fulgt av Intron A-IL18BP-SV40polyA kassetten. Det resulterende konstrukt manglet sekvensen mellom -589 til Xhol av den opprinnelige mCMV promotersekvensen.

Stabile transfeksjoner og Luciferasemålinger ble gjennomført som beskrevet i Eksempel 2 og IL18BP ELISA ble gjennomført som beskrevet i Eksempel 3.

Imidlertid gjenspeiler konstrukt #140 ikke nøyaktig konstrukt #26 dithen at IE1- og IE2 promoteren er i revers orientering. Således ble Luciferaseekspresjonen drevet av IE1 promoteren i konstrukt #26, men av IE2 promoteren i konstrukt #140, og IL18BP ekspresjonen ble drevet av IE2 promoteren i konstrukt #26 og av IE1 promoteren i konstrukt #140.

Resultatene som ble oppnådd med begge konstrukter er vist nedenfor fordi de er signifikante for den samtidige effekt av den nye IE2 enhanceren i to forskjellige promotere i en bidireksjonal ekspresjonsvektor (konstrukt #140).

Figur 14 viser resultatene fra pooler stabilt transfektert med konstrukt #26 og #140 uttrykt ved Luciferase- og IL-18BP ekspresjon. Konstrukt #140 resulterte i høyere ekspresjoner av både markørgen (Luciferase) og gen av interesse (IL-18BP).

For å bedømme stabiliteten ved ekspresjonen av Luciferase og IL-18BP ble poolene enten holdt under selektive betingelser, dvs. puromycinbehandling eller ble holdt uten selektivt trykk (uten puromycin) i tre uker. Resultatene er vist i figur 15 til 17. Ekspresjonsnivåene for reseptorgen Luciferase og IL-18BP forandret seg ikke signifikant med tiden, se figurene 16 og 17.

Således ble det påvist at begge konstrukter #26 og #140 viste tilsvarende ekspresjonsnivåer med tiden, i nærvær eller fravær av seleksjonstrykk. Derfor er konstrukter med den nye IE2 enhancer egnet for stabil og samtidig ekspresjon av to gener.

Da resultatene ovenfor ble oppnådd i pooler, ble kloner avledet ved begrenset fortynning ved 0,5 celler pr. brønn fra begge pooler.

Kloner ble dyrket under puromycinseleksjon for å evaluere de klonale ekspresjonsnivåer. Således ble de isolerte kloner splittet i nærvær og fravær av puromycin for til slutt å overvåke deres stabilitet. Resultatene er vist i figurene 18 og 19 og ble tatt før klonene ble delt i +/- puromycinbetingelser. Resultater fra to uker etter fjerning av puromycin viste ingen signifikant forskjell for noen av konstruktene og antyder derfor stabilitet. Denne studien vil fortsette i ytterligere 10-12 uker.

For å evaluere ekspresjonen av begge gener ble det benyttet et høygjennomløpsformat, nemlig i 96 brønn plater: Dag 1: Fortynning Vi av cellene, 100 (il ProCho5 kulturmedium (serumfritt) + 100 (il friskt ProCho5 inneholdende 5% føtalt bovint serum. Med 2,5% FBS sluttkonsentrasjon var cellene i stand til å feste seg. Ukentlig passasje av vedlikeholdsplaten ble foretatt i en 1/20 fortynningsfaktor, alt i ProCho5 medium. Dag 2: Medium ble kassert, vasket en gang med 200 ul lx PBS (Invitrogen, 10010-015) og 75 ul friskt ProCho5 inneholdende 5% tilsatt FBS og inkubert i en 24 timers ekspresjonspuls.

Dag 3: 50 ul av supernatantene ble gjenvunnet og 200 ul Elisa buffer tilsatt (lx PBS, 0,1% vekt/volum BSA, 0,2% volum/volum Tween 20). 100 (il ble analysert ved ELISA forIL-18BP.

Brønnene ble vasket med 200 (il lx PBS (kasseres) og 100 (il Glo Lysis buffer (Promega, E266a) ble tilsatt. Brønnene ble inkubert i 30 minutter ved romtemperatur for å sikre cellelysering. Luciferasemålingen ble foretatt ved bruk av 30 (il lyserte celler overført til en hvit 96 brønners plate + 30 (il rekonstituert Bright-Glo reagens. Lysemisjonen ble målt på et Centro LB960 luminometer under 5 sekunders akvisisjonstid.

Analysene av klonene oppnådd fra stabil transfeksjon med konstrukt #26 er angitt i

Figur 18 og de som resulterte fra stabil transfeksjon med konstrukt #140 i figur 19.

Klonene som vist i figur 18 og 19 ble rangert ved deres Luciferaseverdi i en fallende modus. IL18BP ekspresjonen ble indikert som OD verdi. Fordi Elisa ble gjennomført i høygjennomløpsformat, kunne man ikke oppnå noen reell kvantitering av IL-18BP nivåene. Imidlertid ble kontroller ved 2500 ng/ml og 250 ng/ml så vel som blanke, benyttet for å overvåke variasjonen av plate til plate.

Figur 20 viser luciferaseekspresjonen på platene i invertert ChemiDoc betraktning. Disse bilder benytter et CCD kamera (Biorad), noe som tillater å oppnå signaler som kommer fra kjemiluminescens (se i figur 20). Et program kalt Quantity One 4.2.3 tillater billedhåndtering lik invertering av signalene, hvilket ble benyttet her.

Slik det er klart fra resultatene som er vist i figurene 18 til 20, resulterte konstrukt #140

i en mengde ikke-uttrykkende kloner. Overraskende var imidlertid de få positive kloner som uttrykte begge gener ekstremt sterkt.

Derfor viser konstrukt #140 screening for meget høye ekspresjoner i meget tidlige kloningsfaser og unngår derved nødvendigheten av å teste og følge opp det høye antall kloner for å identifisere de få kloner som i høy grad uttrykker begge gener av interesse.

REFERANSER:

1. Abbate et al, Biotechniques 2001 Aug; 31 (2):336-40

2. Assaraf et al, J Biol Chem 1992 Mar 25; 267(9): 5776-84

3. Blackwood EM, Kadonaga JT. Science 1998 Jul 3; 281(5373): 61-3

4. De Wet et al. (1985) Proe. Nati. Acad. Sei USA 82, 7870

5. Dorsch-Haesler, K. et al. (1985). Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82: 8325-8329

6. Goeddel Methods Enzymol, Vol. 185, San Diego

7. Li Q, Harju S. Peterson KR. Trends Genet 1999 Oet; 15(10): 403-8

8. Manning WC and Mocarski, ES, Virology 167, 477-484 (1988).

9. Mazumder B, Seshadri V, Fox PL. Trends Biochem Sei 2003 Feb;28(2):91-8

10. Messerle, M. Et al. (1991). J. Virol. 65: 1638-1643

11. Kim, S-Y. et al. (2002), J. Biotech. 93:183-187

12. Mountford PS, Smith AG. Trends genet 1995 May: 11(5): 179-84

13. Sandford and Burns, Virology 222, 310-317(1996)

14. Schumperli et al, Proe Nati Acad Sei U S A 1982 Jan; 79(2): 257-61

15. Seliger and McElroy (1960) Arch. Biochem. Biophys. 88, 136

16. Shotwell et al, 1982, J.B.C. 257(6), 2974-80

17. Wood et al., (1991) Biochem. Biophys. Res. Comm. 124, 592

18. US patent 4.963.481. 19. US patent 4.968.615

20. Zhu et al, J Cell Biochem 2001 Mar 26; 81(2): 205-19

Claims (40)

1. Ekspresjonsvektor,karakterisert vedat den omfatter en mCMV-IE2 promoter som består av et funksjonelt ekspresjonsfremmende fragment av SEQ ID NO: 1, hvori: iii. ekspresjonsvektoren ikke inneholder noe fullstendig gen av mCMV; og iv. nevnte mCMV-IE2 promoter er operativt forbundet til en DNA-sekvens som koder for et polypeptid.

2. Vektor ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte mCMV-IE2 promoter omfatter kjerne IE2 promoter som strekker seg fra nukleotid 1 til 39 av SEQ ID NO: 1.

3. Vektor ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte mCMV-IE2 promoter ytterligere omfatter en sekvens på 100 til 200 nukleotider oppstrøms for nevnte kjerne IE2 promoter.

4. Vektor ifølge hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat den ytterligere omfatter en mCMV-IE2 forsterker ("enhancer") som består av et funksjonelt ekspresjonsforsterkende fragment av SEQ ID NO: 1.

5. Vektor ifølge krav 4,karakterisert vedat nevnte mCMV-IE2 forsterker omfatter nukleotidene -387 til -189 av mCMV IE2 oppstrømsområdet der nukleotidnummereringen er relativt +1 av IE2 genet.

6. Vektor ifølge krav 5,karakterisert vedat nevnte mCMV-IE2 forsterker omfatter nukleotidene -587 til -189 av mCMV IE2 oppstrømsområdet der nukleotidnummereringen er relativt +1 av IE2 genet.

7. Vektor ifølge hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat den ytterligere omfatter en promoter forskjellig fra nevnte mCMV-IE2 promoter.

8. Vektor ifølge hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat den omfatter en første og andre promoter av viral, cellulær eller kunstig opprinnelse.

9. Vektor ifølge krav 8,karakterisert vedat den første promoter er mCMV-IE2 promoteren og den andre promoter er mCMV-IEl promoter.

10. Vektor ifølge hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat den omfatter DNA sekvensen ifølge SEQ ID NO: 1.

11. Vektor ifølge hvilket som helst av kravene 7-10,karakterisert vedat den første og andre promoter er operativt forbundet til en DNA-sekvens som koder for minst ett polypeptid.

12. Vektor ifølge krav 11,karakterisert vedat DNA-sekvensen koder for minst ett protein av interesse.

13. Vektor ifølge krav 11,karakterisert vedat DNA-sekvensen koder for minst ett markørprotein.

14. Vektor ifølge krav 11,karakterisert vedat DNA-sekvensen koder for minst ett reporterprotein.

15. Vektor ifølge et hvilket som helst av kravene 8 til 14,karakterisert vedat den første promoter og den andre promoter er arrangert bidireksjonelt.

16. Vektor ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat den ytterligere omfatter en eller flere regulatoriske elementer valgt blant 5'UTR'er, introner, 3'UTR'er, mRNA 3' endeprosesseringssekvenser, polyadenylerringsseter og interne ribosominngangssekvenser (IRES).

17. Vektor ifølge krav 16,karakterisert vedat det regulatoriske element er en IRES, videre omfattende en DNA-sekvens som koder for minst ett polycistronisk mRNA.

18. Vektor ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat den videre omfatter ett eller flere DNA-elementer valgt insulatorer, grenseelementer, locuskontrollområder (LCR'er), matriksfesteområder (MAR'er) og elementer for rekombinasjon og kassettskifte.

19. Vektor ifølge et hvilket som helst av kravene 11 til 18,karakterisert vedat DNA-sekvensen som koder for polypeptidet operativt forbundet med den første promoter og DNA-sekvensen som koder for polypeptidet operativt forbundet med den andre promoter koder for det samme polypeptid.

20. Vektor ifølge et hvilket som helst av kravene 11 til 18,karakterisert vedat DNA-sekvensen som koder for polypeptidet operativt forbundet med den første promoter og DNA-sekvensen som koder for polypeptidet operativt forbundet med den andre promoter koder for forskjellige polypeptider.

21. Vektor ifølge krav 20,karakterisert vedat DNA-sekvensen som koder for polypeptidet operativt forbundet med den første promoter koder for en første subenhet av et dimerisk eller multimerisk protein og DNA-sekvensen som koder for polypeptidet operativt forbundet med den andre promoter koder for en andre subenhet av et dimerisk eller multimerisk protein.

22. Vektor ifølge krav 21,karakterisert vedaten subenhet er alfakjeden og den andre subenhet betakjeden av et hormon valgt fra human FSH, human LH, human TSH og human CG.

23. Vektor ifølge krav 20,karakterisert vedat en subenhet er den tunge kjede og den andre kjede er den lette kjede av et immunoglobulin.

24. Vektor ifølge et hvilket som helst av kravene 12 til 23,karakterisert vedat proteinet av interesse er valgt blant FSH, LH, CG, TSH, veksthormon, interferon, TNF bindingsprotein I, TNF bindingsprotein II, Raptiva ®, IL-18BP eller muteiner, fragmenter, funksjonelle derivater eller fusjonsproteiner derav.

25. Vektor ifølge et hvilket som helst av kravene 13 til 24,karakterisert vedat markørproteinet er valgt blant adenosindeaminase (ADA), aminoglykosidfosfotransferase (neo), dihydrofolatreduktase (DHFR), hygromycin-B-fosfotransferase (HPH), tymidinkinase (tk), xanthin-guanin fosforibosyltransferase (gpt), multiple medikamentresistente gener (MDR), ornitin dekarboksylase (ODC) og N-(fosfonoacetyl)-L-aspartat resistens (CAD), puromycin actyltransferase (PAC), glaktokinase, human folatreseptor eller redusert folatbærer.

26. Vektor ifølge kravene 14 til 25,karakterisert vedat reporterproteinet er valgt blant Luciferase, grønn fluoreserende protein, alkalifosfater og pepperrot peroksidase eller kombinasjoner derav.

27. Ekspresjonsvektor,karakterisert vedat den omfatter en mCMV-IE2 promoter som består av et funksjonelt ekspresjonsfremmende fragment av SEQ ID NO: 1, hvori nevnte promoter består av en sekvens valgt fra gruppen som består av: iv. kjerne IE2 promoter som strekker seg fra nukleotid 1 til 39 av SEQ ID NO: 1; v. en sekvens som omfatter kjerne IE2 promoter som strekker seg fra nukleotid 1 til 39 av SEQ ID NO: 1 og en sekvens på 100 til 200 nukleotider oppstrøms for nevnte kjerne IE2 promoter; og vi. sekvensen ifølge SEQ ID NO: 1.

28. Vektor ifølge krav 27,karakterisert vedat nevnte promoter for mCMV-IE2 genet eller nevnte ekspresjonsfremmende fragment derav er operativt forbundet til en DNA-sekvens som koder for et polypeptid.

29. Vektor ifølge krav 28,karakterisert vedat nevnte polypeptid er valgt fra FSH, LH, CG, TSH, veksthormon, interferon, TNF bindingsprotein I, TNF bindingsprotein II, Raptiva ®, IL-18BP eller muteiner, fragmenter, funksjonelle derivater eller fusjonsproteiner derav.

30. Vertscelle,karakterisert vedat den er transfektert med en vektor ifølge et hvilket som helst av de foregående krav.

31. Vertscelle ifølge krav 30,karakterisert vedat vertscellen er en CHO-celle.

32. Fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid,karakterisert vedat den omfatter trinnet med å transfektere en vertscelle med minst en vektor ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 29.

33. Fremgangsmåte ifølge krav 32,karakterisert vedat transfeksjonen er en stabil transfeksjon.

34. Fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid,karakterisert vedat den omfatter trinnet med å dyrke en vertscelle ifølge krav 30 eller 31 under betingelser som tillater ekspresjon av polypeptidet.

35. Fremgangsmåte ifølge krav 32, 33 eller 34,karakterisertv e d at den videre omfatter trinnet med isolering av polypeptidet fra vertscellen eller cellekultursupernatanten.

36. Anvendelse av en vektor ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 29 for ekspresjon av et gen av interesse.

37. Anvendelse av en vektor ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 29 for seleksjon av kloner som uttrykker høye mengder av et gen av interesse.

38. Anvendelse av en vektor ifølge et hvilket som helst av kravene 8 til 26 for simultan ekspresjon av to eller flere gener eller DNA'er av interesse.

39. Anvendelse av en vektor ifølge et hvilket som helst av krav 1-29 for fremstilling av et medikament for DNA-basert terapi.

40. Anvendelse av en vertscelle ifølge krav 30 eller 31 for fremstilling av et medikament for cellebasert terapi.