EA010096B1 - Экспрессирующие векторы, содержащие ie2-промотор mcmv - Google Patents
Экспрессирующие векторы, содержащие ie2-промотор mcmv Download PDFInfo
- Publication number
- EA010096B1 EA010096B1 EA200501444A EA200501444A EA010096B1 EA 010096 B1 EA010096 B1 EA 010096B1 EA 200501444 A EA200501444 A EA 200501444A EA 200501444 A EA200501444 A EA 200501444A EA 010096 B1 EA010096 B1 EA 010096B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- promoter
- expression
- gene
- vector
- vector according
- Prior art date
Links
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims abstract description 34
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 140
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 134
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims abstract description 113
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 48
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 96
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 claims description 94
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 claims description 87
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 59
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 59
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 59
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 41
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 28
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 claims description 28
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 27
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 26
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 20
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 20
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 claims description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 9
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 9
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 8
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 8
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 7
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 7
- -1 binding ΤΝΕ Proteins 0.000 claims description 5
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 claims description 5
- 102000052812 Ornithine decarboxylases Human genes 0.000 claims description 4
- 108700005126 Ornithine decarboxylases Proteins 0.000 claims description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 4
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 claims description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 4
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 4
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 claims description 3
- 102000055025 Adenosine deaminases Human genes 0.000 claims description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims description 3
- 101001091269 Escherichia coli Hygromycin-B 4-O-kinase Proteins 0.000 claims description 3
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 3
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims description 3
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims description 3
- 101001091268 Streptomyces hygroscopicus Hygromycin-B 7''-O-kinase Proteins 0.000 claims description 3
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 claims description 3
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 claims description 3
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 claims description 3
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 3
- 102000048120 Galactokinases Human genes 0.000 claims description 2
- 108700023157 Galactokinases Proteins 0.000 claims description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims description 2
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 claims description 2
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 claims description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 claims description 2
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 claims description 2
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 claims description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 claims description 2
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 claims description 2
- 102000006646 aminoglycoside phosphotransferase Human genes 0.000 claims description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 2
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 claims description 2
- 229940014144 folate Drugs 0.000 claims description 2
- 102000006815 folate receptor Human genes 0.000 claims description 2
- 108020005243 folate receptor Proteins 0.000 claims description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 claims description 2
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 claims description 2
- 239000012212 insulator Substances 0.000 claims description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 claims description 2
- 108090000668 Annexin A2 Proteins 0.000 claims 2
- 102100034613 Annexin A2 Human genes 0.000 claims 2
- 108090000669 Annexin A4 Proteins 0.000 claims 2
- 102100034612 Annexin A4 Human genes 0.000 claims 2
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 claims 2
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 claims 2
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 claims 2
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 claims 2
- 108700041567 MDR Genes Proteins 0.000 claims 1
- 101150056744 SH2 gene Proteins 0.000 claims 1
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 claims 1
- UNQNIRQQBJCMQR-UHFFFAOYSA-N phosphorine Chemical compound C1=CC=PC=C1 UNQNIRQQBJCMQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 abstract description 17
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 100
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 25
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 18
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 16
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 13
- 230000002457 bidirectional effect Effects 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 9
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 8
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000013461 design Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 6
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 5
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 5
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 2
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 2
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 2
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 2
- 108010005714 Interferon beta-1b Proteins 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000701029 Murid betaherpesvirus 1 Species 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 229940015047 chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003161 interferon beta-1b Drugs 0.000 description 2
- 229940065638 intron a Drugs 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- 102000007350 Bone Morphogenetic Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010007726 Bone Morphogenetic Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 1
- 102000004547 Glucosylceramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010017544 Glucosylceramidase Proteins 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000152447 Hades Species 0.000 description 1
- 102100030826 Hemoglobin subunit epsilon Human genes 0.000 description 1
- 102100024025 Heparanase Human genes 0.000 description 1
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 description 1
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 description 1
- 102100039121 Histone-lysine N-methyltransferase MECOM Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001047819 Homo sapiens Heparanase Proteins 0.000 description 1
- 101001033728 Homo sapiens Histone-lysine N-methyltransferase MECOM Proteins 0.000 description 1
- 101000664737 Homo sapiens Somatotropin Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 1
- 108010005716 Interferon beta-1a Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 102000003815 Interleukin-11 Human genes 0.000 description 1
- 108090000177 Interleukin-11 Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010057021 Menotropins Proteins 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 1
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 1
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 1
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 102000012607 Thrombomodulin Human genes 0.000 description 1
- 108010079274 Thrombomodulin Proteins 0.000 description 1
- 108010061174 Thyrotropin Proteins 0.000 description 1
- 102000011923 Thyrotropin Human genes 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010027570 Xanthine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 229940112869 bone morphogenetic protein Drugs 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 description 1
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 229960004461 interferon beta-1a Drugs 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 102000002467 interleukin receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010093036 interleukin receptors Proteins 0.000 description 1
- 229940074383 interleukin-11 Drugs 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000036457 multidrug resistance Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 229960000874 thyrotropin Drugs 0.000 description 1
- 230000001748 thyrotropin Effects 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/01—DNA viruses
- C07K14/03—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus
- C07K14/04—Varicella-zoster virus
- C07K14/045—Cytomegalovirus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
- C12N2710/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
- C12N2710/16141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/16143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/20—Vector systems having a special element relevant for transcription transcription of more than one cistron
- C12N2830/205—Vector systems having a special element relevant for transcription transcription of more than one cistron bidirectional
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/60—Vector systems having a special element relevant for transcription from viruses
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к экспрессирующему вектору, содержащему IE2-промотор mCMV-гена либо его фрагмент, стимулирующий функциональную экспрессию, и/или IE2-энхансер mCMV-гена либо его фрагмент, усиливающий функциональную экспрессию, где указанный экспрессирующий вектор не содержит целого mCMV-гена.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к экспрессирующим векторам, содержащим 1Е2-промотор тСМУ-гена либо его фрагмент, стимулирующий функциональную экспрессию, а также и/или 1Е2-энхансер гена тСМУ либо его фрагмент, усиливающий функциональную экспрессию, где указанный экспрессирующий вектор не содержит какого-либо целого гена тСМУ, к хозяйским клеткам, содержащим такие векторы, к способам получения требуемых полипептидов с использованием данных экспрессирующих векторов, а также к использованию указанных экспрессирующих векторов.
В соответствии с настоящим изобретением экспрессирующие векторы, содержащие промотор тСМУ 1Е2 и промотор тСМУ 1Е1, необязательно вместе с новым энхансером тСМУ 1Е2, являются предпочтительными, особенно если оба промотора составляют элементы одной структуры и являются разнонаправленными.
Сущность изобретения
В последние десятилетия экспрессирующие векторы используют в качестве носителей для экспрессии генов или кДНК, кодирующих полипептиды или белки в интересующих хозяйских клетках. Сильные вирусные или клеточные промоторы и энхансеры используют для высокоуровневой экспрессии представляющего интерес гена с помощью временной или постоянной (устойчивой) трансфекции рекомбинантной ДНК в соответствующие хозяйские клетки. Показано, что в этом отношении особенно пригодна предранняя (1Е) область цитомегаловируса человека (ЙСМУ), а экспрессирующие векторы, содержащие генные элементы, полученные из данной области, известны, например, из ЕР0323997В1.
До последнего времени генные регуляторные последовательности из мышиного цитомегаловируса (тСМУ) используют редко, несмотря на то, что, как было показано, полученные из тСМУ регуляторные элементы являются очень мощными, даже сильнее аналогичных копий вируса человека (К1т с1 а1., 2002).
В патенте США № 4963481 (бе У1Шегк) описаны экспрессирующие векторы, содержащие ДНК, которая кодирует гетерологичный белок под транскрипционным контролем ДНК-фрагментов, полученных из ΙΒ-генной области тСМУ, содержащей фрагмент размером около 2270 пар оснований (п.н.), выделенный рестрикционной эндонуклеазой Ркб из данного вирусного генома. Неполный вариант данного фрагмента из 1387 п.н. существенно улучшает эффективность указанного ДНК-фрагмента в качестве промотора для экспрессии вышеупомянутого гетерологичного белка.
В патенте США № 4968615 (Κοζίπο\ν81<ί) описаны молекулы рекомбинантной ДНК, содержащей транскрипционные энхансеры из мышиного цитомегаловируса (МСМУ), которые можно использовать для усиления транскрипции структурных генов эукариотических клеток. Показано, что данный тСМУэнхансер расположен в рамках 2,27 т.п.н. Ркб-фрагмента, идентифицированного бе УШегк (патент США № 4963481).
Мапшпд апб Моеагкк! (1988) проанализировали функциональную значимость 1Е2-области тСМУ для репликации мышиного цитомегаловируса. С этой целью сконструировали рекомбинантный вирус, который содержал репортерный ген 1ηοΖ под транскрипционным контролем Ш-энхансера/промотора тСМУ, разрывающего, тем самым, этот 1Е2-ген. Действительно, экспрессия 1Е2-гена не наблюдалась, а вирус реплицировался нормально. Поэтому эти авторы сделали вывод, что данный 1Е2-ген, который не сохраняется у таких цитомегаловирусов, как тСМУ и 11СМУ. не являлся существенным для репликации вируса. Мапшпд апб Моеагкк1 не смогли определить или подтвердить особую пользу в наличии энхансер/промоторной 1Е2-области.
В последних публикациях показано дополнительное отличие между 1Е-областью СМУ мыши и человека. Мышиный локус экспрессирует вторую основную мРНК в противоположном направлении от мРНК первого 1Е2-гена. Этот второй предранний ген назвали 1Е2, а его промоторную последовательность обозначили как 1Е2-промотор (Меккебе е1 а1., 1991).
Указанная 1Е2-область из тСМУ до сих пор не использовалась в векторах для экспрессии гетерологичных белков.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение основано на данных, в соответствии с которыми вектор, обладающий ДНКэлементом, содержащим 1Е2-промоторную область из тСМУ, может эффективно запускать экспрессию представляющего интерес гена в трансфицированных хозяйских клетках.
Кроме того, настоящее изобретение основано на данных по идентификации нового энхансера в 1Е2области тСМУ, который в настоящем описании называют 1Е2-энхансер тСМУ. Данный энхансер удовлетворяет критерию, предъявляемому к определению энхансера, то есть усиливает экспрессию, независимо от (1) размещения (2) ориентации и от (3) усиления экспрессии с гетерологичного промотора.
Поэтому первый аспект настоящего изобретения относится к экспрессирующему вектору, содержащему 1Е2-промотор тСМУ-гена, либо к его фрагменту, усиливающему функциональную экспрессию, а также/или к 1Е2-энхансеру тСМУ-гена либо к его фрагменту, усиливающему функциональную экспрессию, где указанный экспрессирующий вектор не содержит никакого целого гена тСМУ.
Второй аспект настоящего изобретения относится к хозяйской клетке, содержащей вектор в соответствии с настоящим изобретением.
Третий аспект настоящего изобретения относится к способу получения представляющего интерес
- 1 010096 полипептида, включающему в себя стадию трансфекции хозяйской клетки вектором в соответствии с настоящим изобретением.
Четвертый аспект настоящего изобретения относится к способу получения представляющего интерес полипептида, включающему в себя стадию культивирования хозяйской клетки согласно изобретению.
Пятый аспект настоящего изобретения относится к использованию вектора в соответствии с настоящим изобретением для экспрессии представляющих интерес одного или нескольких генов либо кДНК.
Шестой аспект настоящего изобретения относится к использованию вектора согласно изобретению для селекции клонов, которые экспрессируют большие количества представляющего интерес гена.
Седьмой аспект относится к использованию вектора в соответствии с настоящим изобретением для ДНК-терапии.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлена последовательность двунаправленного ДНК-элемента, полученного из ΙΕобласти тСМУ, для использования в экспрессирующих конструкциях. Указаны, соответственно, +1сайты и ТАТА-боксы промоторов ΙΕ2 и ΙΕ1. Коровые промоторы обоих генов выделены в четырехугольнике. Сайты рестрикции Нра1 и ΧΙιοΙ выделены жирным шрифтом. Положение -682 указано относительно +1 ΙΕ1.
На фиг. 2 представлены репортерные конструкции А-С. Люциферазный репортерный ген представлен в виде жирной линии, а промоторы указаны в виде светлых стрелок.
А: негативный беспромоторный контроль (рСЬ3 Основной).
В: 8У40-промотор/энхансерный запуск люциферазного репортерного вектора (рСЬ3 Контроль).
С: экспрессия люциферазы, управляемая Ш1-промотором (ртСМУ-люцифераза, управляемая ΙΕ1).
Ό: экспрессия люциферазы, управляемая Ш2-промотором (ргеутСМУ-люцифераза, управляемая ΙΕ2).
Е: экспрессия люциферазы, управляемая промотором ΙΕ2, Ш1-промотор удален (ргеутСМУ-люцифераза (ΔΧΙιοΙ). управляемая ΙΕ2, ΙΕ1 отсутствует).
Е: экспрессия люциферазы, управляемая ΙΕ1-промотором, при том, что ΙΕ2-промотор удален (рВ8.МСМУ3-люцифераза, управляемая ΙΕ1 (1.4 т.п.н.), ΙΕ2 отсутствует).
С: сокращенный вариант запуска экспрессии люциферазы под Ш1-промотором (р-680-люцифераза, управляемая ΙΕ1 (сокращенный вариант, 0,68 т.п.н.)).
На фиг. 3 представлена двунаправленная конструкция, подобная конструкции С на фиг. 2 (конструкция С-2), с последовательностью, кодирующей Ш-18ВР (жирная линия), присоединенной к ΙΕ2-промотору. Таким образом, в данной конструкции Ш1-промотор запускает экспрессию тСМУ-люциферазы и одновременно Ш2-промотор тСМУ запускает экспрессию Ш-18ВР. Треугольник: интрон. Зачерненные овалы: ро1уА.
На фиг. 4 показана экспрессия люциферазного репортерного гена в разных репортерных конструкциях, которые изображены на фиг. 2, конструкции А-С. Клетки СНО-8, выращенные на бессывороточной среде (8ЕМ), были случайным образом трансфицированы конструкциями А-С или ложнотрансфицированы. Активность люциферазы выражена в относительных световых единицах (КБИ).
На фиг. 5 представлена экспрессия люциферазы, измеренная в КЕЛ в стабильных группах СНО-8клеток. Данные клетки выращивают в 8ЕМ после трансфекции конструкциями Ό, С, Е и Ε, как изображено на фиг. 2. Экспрессию люциферазы определяют после 21 дня селекции.
На фиг. 6 показаны результаты измерения в КБИ после временной трансфекции с помощью 900, 500, 300 и 100 нг двунаправленной конструкции С-2, представленной на фиг. 3.
На фиг. 7 показаны количества Ш-18ВР в нг/л в супернатантах культуры клеток, полученные в эксперименте с временной трансфекцией, в соответствии с фиг. 6 (конструкция С-2).
На фиг. 8 представлено соотношение количества Ш-18ВР и люциферазы, измеренной в соответствии с экспериментами на фиг. 6 и 7.
На фиг. 9 представлены количества люциферазы в РВИ (на левой у-оси) и Ι4-18 ВР в нг/мл (на правой у-оси), экспрессируемые в 48 индивидуальных клонах, которые были отобраны через 8 дней после трансфекции двунаправленной конструкцией С-2 (как показано на фиг. 3). Предел для обнаружения люциферазы составил около 500 КВИ, и 2,5 нг/мл - для Ш-18ВР. Каждый шаг на оси X соответствует одному единичному клону.
На фиг. 10а показаны репортерные конструкции Н-Ν. Люциферазный репортерный ген (Бис) выделен жирной линией, а соответствующие промоторы ΙΕ1 и ΙΕ2 указаны светлыми стрелками. Энхансеры представлены в виде серых овалов: светло-серый овал использован для известного Ш1-энхансера, а темно-серый овал использован для нового Ш2-энхансера.
Н: двунаправленная конструкция с Ш2-промотором управляет экспрессией люциферазы;
Ι: экспрессией люциферазы управляет Ш2-промотор, а Ш1-промотор удален;
1, К, Б, М, Ν: конструкции, содержащие укороченные тСМУ-промоторы, цифрами даны положения, соответствующие числу пар оснований для тСМУр относительно +1 ΙΕ2:
1: начиная от - 1076,
К: начиная от - 783,
Б: начиная от - 587,
- 2 010096
М: начиная от - 387,
Ν: начиная от - 189.
На фиг. 10Ь показана экспрессия в КЬи для репортерных конструкций Н-Ν в соответствии с фиг. 10а после временной трансфекции клеток СНО-8, которые выращивают в бессывороточной среде.
На фиг. 11а представлены дополнительные конструкции О-Υ, в которых объединены новый 1Е2энхансер (серый овал) с 8V40-промотором. Указанный серый овал соответствует ГЕ2-энхансеру от -587 до -189, половина серого овала соответствует 1Е2-энхансеру от -387 до -189. Стрелки выше данного ΙΕ2энхансера указывают направление энхансерной последовательности. Люциферазный репортерный ген представлен в виде жирной линии, 8V40-промотор указан светлой стрелкой. Черный овал: ро1уА.
О: длинную 1Е2-энхансерную последовательность (-587/-189) клонируют по 5'-концу 8V40-промотора.
Р: короткую 1Е2-энхансерную последовательность (-387/-189) клонируют по 5'-концу 8У-промотора.
О: длинную 1Е2-энхансерную последовательность (-587/-189) клонируют по 5'-концу 8V40-промотора в обратной ориентации.
К: короткую 1Е2-энхансерную последовательность (-387/-189) клонируют по 5'-концу 8V40-промотора в обратной ориентации.
8: длинную 1Е2-энхансерную последовательность (-587/189) клонирует по 3'-концу люциферазного гена.
Т: короткую 1Е2-энхансерную последовательность (-387/-189) клонируют по 3'-концу люциферазного гена.
И: длинную 1Е2-энхансерную последовательность (-587/-189) клонируют по 3'-концу люциферазного гена в обратной ориентации.
V: короткую 1Е2-энхансерную последовательность (-387/-189), клонируют по 3'-концу люциферазного гена в обратной ориентации.
контроль, 8V40-промотор и 8V40-энхансер в 3'-конце кодирующей последовательности люциферазы.
X: контроль, экспрессия люциферазы, управляемая 8V-промотором без какого-либо энхансера.
Υ: негативный контроль, везде без промотора.
На фиг. 11Ь представлена экспрессия люциферазы с репортерными конструкциями О-Υ, как показано на фиг. 11а. Клетки СНО-8, выращенные в бессывороточной среде (8ЕМ), трансфицируют случайным образом с помощью конструкций О-Υ. Люциферазную активность изображают в виде сложенной ленты, длина которой определена по отношению к контролю X (значение 1), т.е. по отношению к экспрессии, управляемой 8V40-промотором без какого-либо энхансера. Светлые четырехугольники: длинный 1Е2-энхансер (-587/-189), заштрихованные прямоугольники: короткий 1Е2-энхансер (-387/-189). Хось представляет собой логарифмическую шкалу.
На фиг. 12 представлен эксперимент по сравнению нового 1Е2-энхансера с известным ЬСМУ-энхансером. Клетки трансфицируют с помощью контрольной конструкции А (рСЬ3 основная, см. фиг. 2, с отсутствием промотора), контрольной конструкции В (рСЬ3 контрольная, см. фиг. 2, 8V40-промотор с 8V40-энхансерной последовательностью в 3'-кодирующей области люциферазы), контрольной конструкции X (8У-Рис'. см. фиг. 11а, 8V40-промотор без энхансера), а также с помощью конструкций О-Ц (см. фиг. 11а) или с помощью конструкций О-2 и Ц-2, в которых 1Е2-энхансерную последовательность (длинный вариант, от -587 до -189) замещают известной 11СМУ-энхансерной последовательностью (8ЕЦ ΙΌ Νο: 2). Люциферазу измеряют в ΡΕϋ (х-ось). Заштрихованные прямоугольники: с известным 11СМУэнхансером. Прямоугольники серого цвета: с новым 1Е2-энхансером.
На фиг. 13 показан двунаправленный вектор, используемый для одновременной экспрессии 1Ь18ВР и люциферазы. Промоторы 1Е1 и 1Е2 указаны светлыми стрелками. Треугольник представляет собой интрон А из 1Е-области НСМУ, а овал серого цвета - сигнал полиаденилирования. Зачерненный квадрат соответствует сигнальному пептиду.
Конструкция #26: люцифераза экспрессируется под 1Е1-промотором, а 1Ь-18ВР экспрессируется под 1Е2-промотором. Последовательность между обоими промоторами как в конструкции Н на фиг. 10а.
Конструкция #140: люцифераза экспрессируется под 1Е2-промотором, а 1Ь-18ВР экспрессируется с 1Е1-промотора. Между этими двумя промоторами располагается 1Е2-энхансер (от -587 до -189).
На фиг. 14 представлены данные о количествах экспрессируемой люциферазы (ΡΕϋ, левая у-ось) и 1Ь-18ВР (нг/мл, правая Υ-ось) после временной трансфекции СНО-клеток, выращиваемых в бессывороточной среде, с помощью любой конструкции, #26 или #140, в соответствии с фиг. 13. Прямоугольники: экспрессия люциферазы; зачерненные ромбы: экспрессия 1Ь-18ВР.
На фиг. 15 представлены данные по экспрессии люциферазы (ΡΕϋ, левая у-ось) и 1Ь-18ВР (нг/мл, правая у-ось) в устойчивых группах, трансфицированных с помощью любой конструкции, #26 или #140, в соответствии с фиг. 13. Экспрессию измеряют через 7 дней после трансфекции. Клетки отбирают в присутствии пуромицина (+риго) или же отбирают в течение 3 недель без пуромицина (-риго). Прямоугольники: экспрессия люциферазы, зачерненные ромбы: экспрессия 1Ь-18ВР.
На фиг. 16 показана продолжительность экспрессии люциферазы, как в эксперименте на фиг. 15. На оси х отложено время в неделях. Данные, представленные на фиг. 15, соответствуют 3-недельным данным на фиг. 16. Зачерненный ромб: #26 + риго, маленький квадрат: #140 + риго, зачерненный треуголь
- 3 010096 ник: #26 - риго, большой квадрат: #140 - риго.
На фиг. 17 показана продолжительность экспрессии 1Ь-18ВР в соответствии с экспериментами фиг. 16. Обозначения - как на фиг. 16.
На фиг. 18 представлены результаты анализа протоклонов в отношении экспрессии люциферазы (квадраты) в КЬИ (левая у-ось) и экспрессии 1Ь-18ВР (ромбы) в нг/мл (правая у-ось). Каждый шаг на оси х соответствует индивидуальному протоклону. Протоклоны создаются СНО-клетками, устойчиво трансфицированными конструкцией #26, и отбираются в присутствии пуромицина.
На фиг. 19: то же, что и на фиг. 18, но протоклоны создаются клетками, трансфицированными конструкцией #140.
Фиг. 20: протоклоны, трансфицированные любой конструкцией, #26 или #140, анализируют на предмет экспрессии люциферазы в 96-луночном планшете, инвертированном с помощью устройства Сйеш1Оос.
Подробное описание изобретения
В соответствии с настоящим изобретением неожиданно обнаружилось, что промотор предраннего второго (ΙΕ2) гена мышиного цитомегаловируса (тСМУ) оказался эффективен для стимуляции экспрессии полипептида, представляющего интерес, который, собственно, не является 1Е2-белком тСМУ, т.е. гетерологичным полипептидом или белком. Данный экспрессирующий вектор предположительно не является собственно мышиным цитомегаловирусом или же содержащим какие-либо полные гены вируса шСМУ, но представляет собой вектор для экспрессии рекомбинантного белка.
Вследствие этого настоящее изобретение относится к экспрессирующему вектору, содержащему 1Е2-промотор шСМУ-гена, или к его фрагменту, стимулирующему функциональную экспрессию, где данный экспрессирующий вектор не содержит какого-либо полного гена шСМУ.
Кроме этого, в 1Е2-области тСМУ был идентифицирован новый энхансер, который именуется здесь 1Е2-энхансер тСМУ, или 1Е2-энхансер. Данный энхансер усиливает экспрессию независимо от его локализации или ориентации по отношению к данному гену, а также усиливает экспрессию с гетерологичных промоторов, соответствуя, таким образом, основному критерию энхансера.
В этой связи настоящее изобретение относится также к экспрессирующему вектору, содержащему указанный 1Е2-энхансер тСМУ-гена, или к его фрагменту, усиливающему функциональную экспрессию, где экспрессирующий вектор не содержит какого-либо полного гена тСМУ.
Специалистам в данной области техники очевидно, что вектор согласно изобретению может содержать лишь один только 1Е2-промотор тСМУ либо 1Е2-промотор в сочетании с любым подходящим известным энхансером. Специалистам в данной области также очевидно, что вектор согласно изобретению может содержать лишь один только 1Е2-энхансер тСМУ либо 1Е2-энхансер в сочетании с любым подходящим промотором. Кроме того, вектор согласно изобретению может содержать 1Е2-промотор тСМУ в сочетании с 1Е2-энхансером тСМУ.
Сам 1Е2-ген тСМУ известен, например, из публикации Ме^епе е! а1., 1991г.
Используемый здесь термин промотор относится к участку ДНК, функции которого заключаются в контроле транскрипции одной или нескольких ДНК-последовательностей и который структурно идентифицируется по наличию сайта связывания ДНК-зависимой РНК-полимеразы и по наличию других ДНК-последовательностей, влияющих на регуляцию промоторной функции. Функционально экспрессирующий усиливающий фрагмент промотора представляет неполную или усеченную промоторную последовательность, сохраняющую активность в качестве промотора. Промоторную активность можно измерить любым методом, известным в данной области, например репортерным методом с использованием люциферазы в качестве репортерного гена (\Уооб. 1991; §ейдег апб МсЕ1гоу, 1960; бе \¥е1 е! а1., 1985 или коммерчески пригодной люциферазы от Рготеда®).
В соответствии с настоящим изобретением 1Е2-промотор может, к примеру, включать в себя последовательность от положения +1 до ТАТА-бокса, как указано на фиг. 1. 1Е2-промотор может также включать в себя последовательность, именуемую здесь коровый промотор, простирающуюся от нуклеотида 1 до нуклеотида 39 в последовательности, изображенной на фиг. 1 (четырехугольник). Специалистам в данной области известно, что последовательность 1Е2-промотора тСМУ может быть длиннее или короче данного корового промотора до тех пор, пока он запускает транскрипцию ДНК-последовательности, оперативно с ним связанной. Например, 1Е2-промотор может также включать в себя 100-200 пар оснований слева от данного корового промотора. Такая промоторная область именуется также проксимальным промотором. Специалистам в данной области должно быть также очевидно, что термины промотор и энхансер (см. ниже) точно не определяются и что поэтому данный промотор может включать в себя энхансерные области либо энхансерные области могут включать в себя промоторные области, в зависимости от терминологии и контекста.
Термин вектор относится к любому носителю экзогенной ДНК или РНК, который пригоден для перемещения экзогенной ДНК в хозяйскую клетку для репликации и/или для соответствующей экспрессии экзогенной ДНК с помощью данной хозяйской клетки.
Используемый здесь термин оперативно связанный подразумевает функциональное слияние промотора со структурным геном, или кДНК, или с другой последовательностью ДНК, которая находится
- 4 010096 под контролем данного промотора. Поэтому используемый здесь термин оперативно связанный не ограничивается прямым слиянием ДНК-последовательностей.
Термин полный ген тСМУ относится к вирусному гену мышиного цитомегаловируса, который обладает своими собственными (эндогенными, вирусными) 5'- и З'-регуляторными элементами.
Энхансерная область относится к участку ДНК, функция которого заключается в повышении уровня транскрипции одного или нескольких генов. В частности, используемый здесь термин энхансер подразумевает регуляторный ДНК-элемент, который усиливает, увеличивает, улучшает или повышает качество экспрессии гена вне зависимости от его местоположения и ориентации по отношению к экспрессирующему гену и который может быть усиливающим, увеличивающим, улучшающим, повышающим качество или превышающим экспрессию более чем одного промотора.
Предпочтительно, если данный энхансер усиливает экспрессию одновременно более чем с одного промотора. Фрагмент энхансера, усиливающий функциональную экспрессию, представляет собой неполную или усеченную энхансерную последовательность, сохраняющую данную усиливающую способность.
Вектор согласно изобретению предпочтительно состоит из фрагмента, включающего в себя нуклеотиды от -387 до -189 из левой 1Е2-области тСМУ, и нумерация нуклеотидов осуществляется относительно положения +1 1Е2-гена. Данный фрагмент обладает энхансерной функцией и именуется здесь коротким вариантом энхансера 1Е2.
Еще в одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данный вектор состоит из фрагмента, содержащего нуклеотиды от -587 до -189 левой 1Е2-области тСМУ, и нумерация нуклеотидов осуществляется относительно +1 1Е2-гена. Данный фрагмент обладает энхансерной функцией и именуется здесь длинным вариантом 1Е2-энхансера.
Вектор согласно изобретению может также включать в себя еще и дополнительный 1Е-энхансер тСМУ либо его фрагмент, усиливающий функциональную экспрессию, именуемый здесь 1Е1-энхансер тСМУ.
Такой 1Е1-энхансер тСМУ известен в данной области, например, из патента США № 4968615. Он, к примеру, может простираться в последовательности, представленной на фиг. 1, от положения -587 до -147 или от положения -682 до -147, нумерация которых осуществляется относительно положения +1 1Е1-гена. 1Е1-энхансер тСМУ, который может быть использован в соответствии с настоящим изобретением, может дополнительно включать в себя последовательность, простирающуюся от пары оснований -1330 до -488 относительно положения +1 в 1Е1 на фиг. 1. Данная энхансерная область может также включать в себя весь промотор или его часть.
Благодаря использованию тСМУ-энхансера в дополнение к 1Е2-промотору можно еще больше повысить экспрессию представляющего интерес полипептида.
В соответствии с настоящим изобретением указанный вектор дополнительно содержит промотор, который отличается от 1Е2-промотора тСМУ, или его фрагмент, усиливающий функциональную экспрессию.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения вектор согласно изобретению включает в себя первый и второй промотор вирусного, клеточного или искусственного происхождения или его фрагмент, усиливающий функциональную экспрессию.
Поэтому в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данный вектор включает в себя 1Е2-промотор тСМУ в сочетании со вторым промотором или его фрагментом, усиливающим функциональную экспрессию. Примеры дополнительных подходящих промоторов включают в себя йСМУ-промотор, металлотионеиновый промотор (МТ), 8У40-промотор либо искусственный промотор. Предпочтительно второй промотор представляет собой дополнительную копию 1Е2-промотора тСМУ. Такие дополнительные промоторы могут усилить конститутивную или регуляторную экспрессию. Регулируемая экспрессия может быть индуцируемой, или репрессируемой, либо и той, и другой.
Предпочтительно, когда такой второй промотор представляет собой промотор 1Е1-гена тСМУ или его фрагмент, усиливающий функциональную экспрессию. Поэтому особенно предпочтительно, чтобы первый промотор представлял собой 1Е2-промотор тСМУ или его фрагмент, усиливающий функциональную экспрессию, а второй промотор представлял собой 1Е1-промотор тСМУ или его фрагмент, усиливающий функциональную экспрессию.
1Е1-промотор тСМУ известен, к примеру, из XVО 87/03905. Он может включать в себя коровый промотор, содержащий последние 47 п.н. из последовательности на фиг. 1 (в рамке) или дополнительные 100-200 п.н. слева от последовательности (т.е. проксимальный промотор), либо он может включать в себя целую межгенную область вплоть до положения -1330 (относительно положения +1 в 1Е1, см. фиг. 1).
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения вектор состоит из ДНК-последовательности 8ЕО Ш Νο: 1, включающей в себя и 1Е1-, и 1Е2-промотор, а также 1Е1-энхансер и новый 1Е2-энхансер или любой его фрагмент, усиливающий функциональную экспрессию.
В наиболее предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения в используемом векторе в соответствии с настоящим изобретением промотор или его фрагмент, усиливающий функциональную экспрессию, оперативно связан с ДНК-последовательностью, кодирующей по меньшей мере один полипептид. В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения энхансер соглас
- 5 010096 но изобретению присутствует в экспрессирующем векторе вместе с ДНК-последовательностью, кодирующей по меньшей мере один полипептид.
Предпочтительно, чтобы указанная ДНК-последовательность кодировала представляющий интерес белок.
Весьма предпочтительно, если ДНК-последовательность кодирует маркерный белок или она представляет собой амплифицируемый ген.
Предпочтительно также, если указанная ДНК-последовательность кодирует репортерный белок.
Если вектор согласно изобретению содержит более одного промотора, то любое сочетание или часть сочетания представляющего интерес белка, маркера, репортера, амлифицируемого гена и пр. может экспрессироваться с одной и той же плазмиды.
В соответствии с настоящим изобретением представляющий интерес полипептид может представлять собой любой полипептид, который отличается от собственно 1Е2-полипептида, может быть внеклеточным белком, таким как пептидные гормоны, или трансмембранным белком, таким как рецепторы фактора роста или гормональные рецепторы, либо внутриклеточным белком, таким как киназы, фосфатазы или ДНК-связывающие белки, в зависимости от предполагаемого использования интересующего полипептида или от хозяйской клетки, в которой он экспрессируется.
В соответствии с настоящим изобретением подходящие маркерные белки представляют собой, например, негативные или позитивные селективные маркеры либо амплифицируемые гены. Примеры включают в себя белки, выбранные из аденозиндезаминазы (ΆΌΆ), аминогликозидфосфотрансферазы (пео), дигидрофолатредуктазы (ЭНЕК), гигромицин-В-фосфотрансферазы (НРН), тимидинкиназы (1к). ксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (др!), фактора множественной лекарственной устойчивости (МЭК), орнитиндекарбоксилазы (ОЭС) и фактора Ы-(фосфоноацетил)-Е-аспартатрезистентности (САЭ) или пуромицинацетилтрансферазы (РАС). Дополнительные примеры включают в себя гены, используемые для селекции при использовании отдельных метаболических путей, такие как галактокиназа (8сйитрег11 е! а1., 1982), рецептор фолиевой кислоты (ΖΙπ.ι е! а1., 2001) или носитель восстановленного фолата (АззагаЕ е! а1., 1992).
Еще в одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения представляющий интерес полипептид представляет собой продукт репортерного гена.
Используемый здесь термин репортерный ген или репортерный белок подразумевает ген, кодирующий генный продукт, который можно идентифицировать с использованием простых, недорогостоящих способов или реактивов и который можно оперативно связать с областью промотора согласно изобретению или к его активному фрагменту. Репортерный ген можно использовать для определения транскрипционной активности в скринирующих анализах (см., например, Соеббе1 (ред.) Ме!йобз ЕпхутоЕ Уо1. 185, 8ап Э1едо. Асабетю Ргезз, 1пс. (1990)), например, с использованием люциферазы в качестве репортерного гена (^ооб, 1991; 8ейдег апб МсЕг1оу, 1960; бе \Уе( е! а1., 1985 или коммерчески доступного от Рготеда®).
Примеры выбраны из люциферазы, зеленого флуоресцирующего белка, щелочных фосфатаз, О-галактозидазы, или пероксидазы хрена, или из внутримолекулярных сочетаний с другими белками, такими, например, как зеленый флуоресцирующий белок (СЕР) или улучшенный СЕР (ЕСЕР) с пуромициновым ацетилтрансферазным геном (АЬЬа!е е! а1., 2001), или из их сочетаний.
Экспериментальные данные согласно изобретению основаны на том, что эффективную одновременную экспрессию интересующих полипептидов можно осуществить с 1Е2- и 1Е1-промотора, оба из которых представлены в одной и той же плазмиде. В этой связи в дополнительном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения оба промотора, 1Е2-промотор тСМУ и 1Е1-промотор тСМУ, или их фрагменты, усиливающие функциональную экспрессию, соответственно, оперативно связывают с полипептидом.
Высокие уровни экспрессии могут быть осуществлены, если оба промотора представлены в двунаправленной структуре. Поэтому 1Е2-промотор тСМУ или его фрагмент, усиливающий функциональную экспрессию, и промотор, в частности 1Е1-промотор тСМУ, или его фрагмент, усиливающий функциональную экспрессию, располагают в двух направлениях.
Используемый здесь термин расположенный в двух направлениях подразумевает, что данные промоторы запускают транскрипцию в противоположных направлениях. Данная схема расположения плазмидной ДНК называется также двунаправленной структурой данного вектора.
Промоторы 1Е1 или 1Е2 тСМУ-гена, или их фрагменты, усиливающие функциональную экспрессию, или любой новый промотор, который можно использовать в сочетании с 1Е2-промотором тСМУ либо в сочетании с 1Е2-энхансером, может также включать в себя сигнал инициации трансляции.
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения 1Е2-промотор тСМУ-гена, или его фрагмент, усиливающий функциональную экспрессию, либо 1Е2-энхансер тСМУ соединяются с другими элементами, регулирующими или влияющими на транскрипцию. Такие элементы могут влиять на процессинг, стабильность или трансляционную эффективность РНК. Примеры подходящих элементов выбраны из группы, состоящей из 5'-иТК, интронов, З'-ИТК (см., например, Магитбег е! а1., 2003), З'-концевых процессирующих последовательностей мРНК (например, сайты полиаденили
- 6 010096 рования) и ГВЕЗ-последовательностей для экспрессии полицистронной мРНК (см., например, МоииДогб аиб 8тйД, 1995).
Предпочтительно использовать ГВЕ8-элемент для экспрессии полицистронных мРНК, в которых кодирующие последовательности отделены с помощью ГВЕ8. В этом случае преимуществом является то, что некоторые представляющие интерес полипептиды могут экспрессироваться с одной и той же мРНК и, следовательно, с одного и того же промотора.
Еще в одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения лишь один ΙΕ2промотор тСМУ-гена или в сочетании с ΙΕ1-промотором тСМУ-гена или любой другой естественный или искусственный промотор или ГЕ2-энхансер могут быть присоединены к дополнительным последовательностям, усиливающим экспрессию, таким как инсуляторы, пограничные элементы, ЬСВ (описанные, например, у В1асктеооб апб Кабопда (1998)) или области, связанные с матриксом/клеточным каркасом (описанные, к примеру, у Ь1 с1 а1., 1999).
Специалисты в данной области примут во внимание и то, что вектор согласно изобретению может также содержать дополнительные энхансеры, такие, например, как хорошо известный 8У40-энхансер или ДСМУ-энхансер.
В соответствии с настоящим изобретением полипептид, оперативно связанный с первым промотором, предпочтительно с ГЕ2-промотором тСМУ, и полипептид, оперативно связанный со вторым промотором, предпочтительно с ГЕ1-промотором тСМУ-, может быть одним и тем же. В этом случае две копии одного и того же гена представлены в одном и том же векторе, но под контролем двух разных промоторов. Именно поэтому представляется возможным достичь скорости экспрессии, которая превосходит экспрессию единственной копии гена, кодирующего представляющий интерес полипептид.
В альтернативном варианте осуществления настоящего изобретения полипептид, оперативно связанный с первым промотором, предпочтительно ГЕ2-промотором тСМУ, и полипептид, оперативно связанный со вторым промотором, предпочтительно ГЕ1-промотором тСМУ, отличаются. Поэтому настоящее изобретение содержит эффективный вектор для коэкспрессии двух разных полипептидов, таких как селективные маркеры или представляющие интерес белки, коэкспрессии двух или более субъединиц одного и того же белка или даже разных доменов одного и того же белка, необходимых для их раздельной экспрессии, но при этом в одной и той же хозяйской клетке.
Специалистам в данной области техники следует иметь в виду, что в соответствии с настоящим изобретением одну и ту же клетку можно одновременно трансфицировать несколькими экспрессирующими векторами, которые служат для экспрессии множества белков и/или субъединиц всего комплекса мультимерных белков.
Предпочтительно, чтобы указанный полипептид, оперативно связанный с первым промотором, например с ГЕ2-промотором тСМУ, представлял собой первую субъединицу димерного или мультимерного белка, а полипептид, оперативно связанный со вторым промотором, предпочтительно с ГЕ1-промотором тСМУ, представлял собой вторую субъединицу димерного или мультимерного белка. В соответствии с настоящим изобретением коэкспрессия двух субъединиц димерного белка является предпочтительной. Коэкспрессия двух субъединиц одного и того же белка является особенно предпочтительной, так как экспрессия с обоих промоторов может привести к образованию сходных количеств субъединиц или заданных соотношений обоих полипептидов, в зависимости от силы используемых промоторов. Затем эти субъединицы можно собрать в одной и той же клетке для создания зрелого белка.
Предпочтительные примеры димерных белков, подходящих для экспрессии с использованием вектора согласно изобретению, представляют собой альфа-цепь и бета-цепь пептидного гормона, такого как Р8Н человека, ЬН человека, Т8Н человека и СО человека. В соответствии с настоящим изобретением любую из двух субъединиц можно присоединить к промотору, предпочтительно к ГЕ2-промотору тСМУ. Специалистам в данной области следует иметь в виду, что в соответствии с настоящим изобретением в равной степени можно использовать гормоны других видов животных, таких как лошадь или свинья, а также бычьи гормоны, в зависимости от цели использования данного рекомбинантного полипептида.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения первая субъединица представляет собой тяжелую цепь, а вторая субъединица представляет собой легкую цепь иммуноглобулина, или наоборот. Предпочтительным примером подходящего иммуноглобулина является ЦС. Для терапевтического использования такие иммуноглобулины могут, например, представлять собой гуманизированные антитела или человеческие антитела. Наиболее предпочтительным примером такого гуманизированного антитела является гуманизированное анти-СВ 11-антитело с торговым названием ВарДуа®.
Многие представляющие интерес полипептиды могут экспрессироваться с использованием вектора согласно изобретению. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения полипептид выбирают из группы, состоящей из хорионического гонадотропина, фолликулостимулирующего гормона, лютеинизирующего хорионического гонадотропного гормона, тиреотропина, человеческого соматотропина, интерферона (например, интерферона бета-1а, интерферона бета-1Ь), рецепторов интерферона (например, рецептора гамма-интерферона), ΤΝΡ-рецепторов р55 и р65, интерлейкинов (например, интерлейкина-2, интерлейкина-11), белков, связывающих интерлейкин (например, белка, связы
- 7 010096 вающего интерлейкин-18), анти-СЭИа-антител, а также мутеинов, фрагментов, растворимых форм, функциональных производных, их слитых белков.
Другие представляющие интерес предпочтительные полипептиды включают в себя, например, эритропоэтин, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, гипофизарные пептидные гормоны, менопаузный гонадотропин, инсулиноподобные ростовые факторы (например, соматомедин-С), фактор роста кератиноцитов, выделенный из глиальных клеток нейротропный фактор, тромбомодулин, основной фактор роста фибробластов, инсулин, фактор VIII, соматотропин, морфогенетический белок кости типа 2, тромбоцитарный фактор роста, гирудин, эритропоэтин, рекомбинантный слитый белок ЬЕА-3/1дС1, глюкоцереброзидазу, а также мутеины, фрагменты, растворимые формы, функциональные производные, их слитые белки.
Второй аспект настоящего изобретения относится к хозяйской клетке, трансфицированной по меньшей мере одним вектором, описанным выше. Специалистам в данной области следует иметь в виду, что в соответствии с настоящим изобретением хозяйскую клетку можно в равной степени одновременно трансфицировать двумя или несколькими векторами.
Подходящими клетками в соответствии с настоящим изобретением являются многие хозяйские клетки, такие как первичные или устойчивые клеточные линии от самых разнообразных эукариот, включая растительные и животные клетки, а также клетки млекопитающих или человека. Например, подходящие хозяйские клетки включают в себя СНО-клетки, СО8-клетки, СV1-клетки, мышиные Ь-клетки, НТ1080-клетки, ВНК-21-клетки, НЕК293-клетки, ΝΙΗ-ЗТЗ-клетки, ЕМ-клетки, ΥΙ-клетки, мышиные N80 и 8Р2/0 гибридомные клетки и им подобные, №ипа1\\'а-клетки. ΚΡΜΙ-8226-клетки, Vе^ο-клетки, XVI38-клетки, МВС-5-клетки или иные иммортализованные и/или трансформированные клетки.
Предпочтительно, если хозяйские клетки представляют собой СНО-клетки, и более предпочтительно, если они представляют собой СНО-8-клетки, описанные, например, 8йо1\\'е11 е! а1. (1982, I. ΒίοΙ. Сйет. 257: 2974-2980). СНО-клетки впервые были получены Риск (I. Ехр. Мей. 108, 945, 1958) из биоптата яичника самки китайского хомячка. Из данных исходных клеток был получен ряд сублиний с различными характеристиками. Одна из этих СНО-клеточных линий, СНО-К1, является пролинзависимой и диплоидной по гену дигидрофолатредуктазы (ΌΗΕΒ). Другая линия, полученная из данной клеточной линии, представляет собой дефицитную по ΌΗΕΒ СНО-клеточную линию (СНО ЭИК В11) (ΡΝΑ8 77, 1980, 4216-4220), которая характеризуется утратой ΌΗΕΒ-функции в результате мутации одного из ΌΕΚΗ-генов и последующей утратой другого гена.
Все эти клетки можно трансфицировать с помощью векторов согласно изобретению либо временно, либо частично устойчиво (например, если вектор является эписомным), либо устойчивым (например, интегрированным в данный геном) способом. Устойчивая трансфекция является предпочтительной для определения клонов, которые непрерывно экспрессируют представляющий интерес полипептид.
1Е2-промотор согласно изобретению или 1Е2-энхансер можно использовать в качестве регуляторных элементов в рамках способа, называемого эндогенная активация гена. Вектор согласно изобретению может содержать введенный геномный локус, который, как считают, активируется в результате гомологической рекомбинации, оперативно связывая, таким образом, данную регуляторную последовательность (1Е2-промотор и/или энхансер) с интересующим геном, экспрессия которого нуждается в индукции или в усилении. Данный способ описан, например, в νθ 91/09955.
Третий аспект настоящего изобретения относится к способу получения интересующего полипептида, включающему в себя стадию трансфекции хозяйской клетки с помощью вектора согласно изобретению.
В зависимости от природы интересующего полипептида, использование способа в соответствии с настоящим изобретением приводит к секретированию белка или полипептида, который можно собрать из супернатанта данной клеточной культуры, либо к получению белка клеточной мембраны или внутриклеточного белка, который можно выделить из имеющихся клеток с помощью известных способов. Соответствующий полипептид, производимый в соответствии с настоящим изобретением, может служить любой цели, но предпочтительно он представляет собой терапевтический белок, предполагаемый для введения человеку или животным.
В зависимости от предполагаемого использования, сама клетка, обладающая интегрированным полипептидом, может быть продуктом предлагаемого способа. Такая клетка может, например, использоваться в клеточной терапии.
Четвертый аспект настоящего изобретение относится к способу получения интересующего полипептида, включающему в себя стадию культивирования хозяйских клеток в соответствии с настоящим изобретением.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данный способ дополнительно включает в себя стадию выделения интересующего полипептида из хозяйских клеток или культурального супернатанта. Данная стадия дает особое преимущество и облегчает осуществление секреции белков, которые можно просто выделить из клеточного супернатанта. Вместе с тем, данная стадия также применима для выделения полипептидов из клеточных мембран или из внутриклеточных структур, которые можно выделить из хозяйских клеток.
Данный способ можно использовать во временной, устойчивой, эписомной или в вирусной экс
- 8 010096 дрессирующей системах. Как показано ниже в примерах, вектор согласно изобретению, полученный в устойчивой экспрессирующей системе, дает в результате особенно сильную экспрессию требуемого белка. Поэтому в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения используемая трансфекция представляет собой устойчивую трансфекцию.
В пятом аспекте настоящего изобретения вектор в соответствии с настоящим изобретением используют для экспрессии представляющего интерес гена. Такими генами могут быть, например, гены, кодирующие любой из вышеуказанных полипептидов. Вектор согласно изобретению можно также использовать для экспрессии маркерных генов, репортерных генов, амплифицируемых генов и пр.
Предпочтительно данный вектор используют для одновременной экспрессии представляющих интерес двух или более генов либо кДНК. Его можно также использовать для совместной экспрессии одного представляющего интерес гена и одного маркерного гена или репортерного гена, или амплифицируемого гена, или других подобных генов.
В рамках настоящего изобретения неожиданно было показано, что вектор согласно изобретению, в частности вектор, содержащий 1Е2-промотор, 1Е2-энхансер и 1Е1-промотор, получен при идентификации клонов, которые весьма эффективно экспрессируют репортерный ген и ген, представляющий интерес. В этой связи, шестой аспект настоящего изобретения относится к использованию вектора в соответствии с настоящим изобретением для селекции клонов, которые экспрессируют большие количества представляющего интерес гена.
В седьмом аспекте настоящее изобретение относится к использованию вектора согласно изобретению в производстве лекарственного средства, используемого для плазмидной или ДНК-терапии, или генотерапии.
В восьмом аспекте хозяйскую клетку согласно изобретению используют для производства лекарственного средства для клеточной терапии. Если данная клеточная терапия предполагается для лечения человека, предпочтительно, чтобы хозяйская клетка представляла собой клетку человека или клеточную линию, более предпочтительно, чтобы клетка или клеточная линия была получена от пациента, которого лечат.
Теперь, располагая полным описанием настоящего изобретения, специалистам в данной области следует иметь в виду, что это же можно осуществить в широких пределах эквивалентных параметров, концентраций и условий, не выходящих за рамки существа и содержания настоящего изобретения и без излишнего экспериментирования.
Хотя данное изобретение описано в связи с конкретными вариантами его осуществления, очевидно, что оно поддается дополнительным модификациям. Настоящая заявка подразумевает внесение любых изменений, назначений или переделок настоящего изобретения, которые в общем плане следуют принципам настоящего изобретения, и в том числе таких отклонений от существа настоящего изобретения, которые находятся в рамках известной или обычной практики в пределах области, к которой относится настоящее изобретение, и которые могут быть применены к сформулированным выше существенным признакам, так же, как и в рамках нижеследующей формулы изобретения.
Все цитируемые здесь ссылки, в том числе журнальные статьи и рефераты, опубликованные или неопубликованные патентные заявки США или иностранные, изданные патенты США или иностранные патенты, или любые иные ссылки полностью включены здесь путем ссылки, включая все данные, таблицы, рисунки и текст, представленные в цитируемых ссылках. Кроме того, полное содержание цитируемых ссылок, в рамках цитируемых здесь ссылок, также полностью включено путем ссылки.
Ссылка на известные стадии способа, традиционные стадии способа, известные способы или традиционные способы никоим образом не должна расцениваться таким образом, что какой бы то ни было аспект, описание или вариант осуществления настоящего изобретения уже раскрыт, известен или предложен в данной области.
Предшествующее описание конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения должно столь полно выявлять основную природу настоящего изобретения, что другие, применяя знания в рамках данной области (в том числе содержимое цитируемых здесь ссылок), легко смогут модифицировать и/или адаптировать для различных применений такие конкретные варианты осуществления настоящего изобретения без излишнего экспериментирования, не выходя за рамки общего замысла настоящего изобретения. Поэтому такие переделки и модификации подразумеваются в рамках смысла и диапазона равноценных раскрываемых вариантов осуществления настоящего изобретения, базирующихся на указаниях и следующих указаниям, представленным здесь. Очевидно, следует иметь в виду, что фразеология или терминология данного документа предназначены для описания, но не ограничиваются им, так что терминология или фразеология описания настоящего изобретения предназначаются для интерпретации специалистами в данной области в свете изложенных здесь указаний, наряду с общими сведениями специалистов в данной области.
Примеры
Пример 1. Оценка пригодности экспрессирующих векторов для временной трансфекции.
Материалы и методы
Материалы.
Клетки: СНО-8, источник О1Ьсо/1пуйгодеи (Са!. Νο 11619).
Плазмидные ДНК, сконструированные, как указано на фиг. 2 и 3, выделяют из стандартно выращива
- 9 010096 емых ночных культур с помощью набора №.1с1еоЬопй РС 500 в соответствии с протоколом производителя. Трансфекция.
Липофектамин (1пу11тодеп, Са!. Νο 18324-012).
Посуда: 24-луночные планшеты.
Клетки: СНО-δ клетки в экспоненциальной фазе роста пассируют 24 ч перед трансфекцией. Чтобы исключить стационарную фазу при низкой плотности клеток, клетки разбавляют до концентрации 0,75х106 клеток/мл. Суммарное количество для трансфекции составило 1,5х105 клеток, ресуспендированных в 100 мкл бессывороточной среды 8РМ II Дпуйгодеп, Са!. Νο 12052-114) на лунку, для 24-луночного планшета.
Трансфекционные смеси были следующими.
A) Липофектамин: 2 мкл.
8РМ 11-среда: 48 мкл.
Общий объем равен 50 мкл.
B) Аликвоты ДНК: 1 мкг (50 нг экспрессирующего вектора + 950 нг плазмиды-носителя, рВ1ие§сйр! II К8(+), 8!га!адепе, са!. 212205-01.
8РМ П-среда: дополнять до 50 мкл.
Растворы А и В смешивают и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Данную смесь приливают к 100 мкл 8РМ П-среды, содержащей 1,5х105 клеток. Данные клетки вновь ставят в инкубатор и инкубируют при 37°С 5% СО2 в течение 3 ч. Затем добавляют 400 мкл 8РМ П-среды для разбавления липофектамина. В течение последующих 48 ч клетки повторно инкубируют перед отбором проб для анализа. Каждую трансфекцию осуществляют трижды.
Измерение люциферазы.
Аналитическую систему Впд111-О1о Ьисйегаке от Рготеда, Са!. Νο Е2610, используют для измерения люциферазы в соответствии с указаниями производителя.
Вкратце, суспензию клеток гомогенизируют, пипетируя несколько раз, отбирают аликвоту в 50 мкл и вносят ее в белый 96-луночный планшет (Νιιικ, Са!. № 236108). Затем добавляют перерастворенный Впд111-С1о-реагент и инкубируют в течение 5 мин при комнатной температуре. Световое излучение измеряют с помощью люминометра Сеп!го ЬВ 960 (ВеййоИ Тес11по1още5) в течение 5 с.
Результаты
Конструкции экспрессирующих векторов, используемые во временной экспрессирующей системе на основе СНО-8-клеток, изображены на фиг. 2. В данной серии экспериментов люциферазу используют в качестве репортерного гена для оценки генной экспрессии. Векторы, не обладающие каким-либо промотором вообще (конструкция А) или 8У40-промотор/энхансер (конструкция В), которая не является очень активной в СНО-8-клетках, используют в качестве контроля.
Результаты экспериментов по временной трансфекции с векторами А-0 представлены на фиг. 4. В конструкциях С и Р экспрессия люциферазы управляется промотором ГЕ1. Обе конструкции обеспечивают экспрессию люциферазы. Конструкция С, дополнительно содержащая Ш2-промотор, располагается в двух противоположных направлениях по отношению к Ш1-промотору. Данное двунаправленное расположение уменьшает эффективность экспрессии с Ш1-промотора (конструкция С) по сравнению с использованием одного лишь Ш1-промотора (конструкция Р). Короткий вариант в 0,68 п.н. Ш1-промотора (конструкция О) был менее эффективным, чем его длинный вариант (конструкция Р).
Независимо от присутствия или отсутствия второго промотора в одной и той же конструкции, Ш2промотор эффективно запускает экспрессию люциферазы (конструкции И и Е) и поэтому может использоваться в качестве промоторного элемента в экспрессирующих векторах для экспрессии интересующего полипептида.
В противоположность !Е1-промотору, Ш2-промотор, взятый отдельно (конструкция Е), менее эффективен, чем при его использовании в двунаправленной структуре (конструкция И). Поэтому он особенно подходит для использования в двунаправленных экспрессирующих векторах.
Пример 2. Оценка пригодности экспрессирующих векторов в устойчивой трансфекции.
Материалы и методы
Методы.
Клетки: СНО-8, от ОФсоДпуйтодеп (Са!. № 11619).
Плазмидные ДНК (в соответствии с фиг. 2) выделяют из стандартно выращиваемых ночных культур с помощью набора М.1с1еоЬопй РС 500 (Масйетеу-№де1 Са!. № 740574) в соответствии с протоколом производителя.
Трансфекция.
Липофектамин Дпуйтодеп, Са!. № 18324-012).
Для осуществления устойчивой трансфекции используют колбы Т75. Клетки СНО-8, находящиеся в экспоненциальной фазе роста, пассируют за 24 ч до трансфекции. Чтобы исключить стационарную фазу при низкой плотности клеток, последние разбавляют до концентрации 0,75х106 клеток/мл. Суммарное количество трансфицируемых клеток, равное 5х106, ресуспендируют в 7 мл среды 8РМ II Дпуйгодеп Са!.
- 10 010096
Νο 12052-114) в колбе Т75.
Использовали следующие смеси для трансфекции.
A) Липофектамин: 52,1 мкл.
Среда 8ЕМ II: 517,9 мкл.
Общий объем составляет 570 мкл.
B) Аликвоты ДНК: 10 мг линеаризованной плазмидной ДНК (9 мкг Ьис-экспрессирующего вектора + 1 мкг плазмиды для селекции: 8У40-промотор, управляющий геном устойчивости к пуромицину. Все плазмиды линеаризуют с помощью Руи1).
Объем доводят до 570 мкл средой 8РМ II.
Растворы А и В смешивают и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Приливают 7 мл, содержащих 5х106 клеток, и затем вновь помещают в инкубатор при 37°С и 5% СО2 на 3 ч. Затем инкубированную культуру центрифугируют при 800 д в течение 3 мин и клеточный осадок ресуспендируют в 5 мл ЕХ-СЕЬЬ 325 (1КН, Са1. Νο 14335-1000М) с добавлением 1Х НТ и 4,5 мМ Ь-глутамина (100Х НТ, Шуйгодеи, Са1. Νο 11067-030, 200 мМ Ь-глутамина, 81дта, С-7513). 5 мл ЕХ-СЕЬЬ 325 добавляют непосредственно в колбу Т75 для того, чтобы ресуспендировать прилипшие клетки, которые добавляются к имеющейся суспензии. В итоге, в 10 мл среды ЕХ-СЕЬЬ 325 находится 5х 106 клеток.
Методика отбора.
Через 48 ч после трансфекции осуществляют селекцию, меняя среду и разбавляя клетки до концентрации 1x10 клеток/мл в среде ЕХ-СЕЬЬ 325, содержащей 10 мкг/мл пуромицина (81дша, Р-8833). Каждые 2 дня клетки подсчитывают, центрифугируют и ресуспендируют в свежей селективной среде до концентрации 1х108 живых клеток/мл. В эти же дни осуществляют контроль жизнеспособности. После 21-35 дней селекцию завершают, и жизнеспособность клеток превышает 80%.
Измерение люциферазы.
За 2 ч до отбора культуральных проб клетки подсчитывают и данную культуру разбавляют до концентрации 0,2х 108 живых клеток/мл.
Измерение люциферазы осуществляют с помощью аналитической системы Впд111-С1о Ьисйегаке от Рготеда, Са1. Νο Е2610 в соответствии с указаниями производителя.
Вкратце, клетки суспендируют путем неоднократного их пипетирования, после чего берут аликвоту в 50 мкл и помещают ее в белый 96-луночный планшет (Νιιικ. Са1. Νο 236108). Приливают 50 мкл перерастворенного ВпдЫ-Ск-реагента и инкубируют в течение 5 мин при комнатной температуре. Люминометром СегИго ЬВ 960 (Вег11ю1<! Τесйηο1οд^е5) в течение 5 с в опыте измеряют световое излучение.
Затем активность люциферазы стандартизуют путем подсчета живых клеток в испытываемом образце, т.е., как правило, 1 х 104 клеток.
Результаты
Конструкции С, Ό, Е и Е (см. фиг. 2) тестируют в устойчивой экспрессирующей системе. Полученные результаты изображены на фиг. 5. Конструкция Е, содержащая только Ш2-промотор, приводит к сильнейшей экспрессии люциферазы в данной системе. При совместном присутствии ЬЕ1 -промотора и Ш2-промотора, размещенных в двух противоположных направлениях (конструкция Ό), Ш2-промотор все еще обеспечивает экспрессию люциферазы, превышающую экспрессию под промотором ГЕ1, либо при отдельном его присутствии (конструкция Е), или в двунаправленном положении с Ш2-промотором (конструкция С).
Пример 3. Коэкспрессия двух полипептидов, представляющих интерес, в двунаправленных экспрессирующих векторах.
Материалы и методы
Трансфекцию осуществляют так, как описано в примерах 1 и 2. Вкратце, СНО-8-клетки (в суспензии, Скот 8ЕМП) были временно трансфицированы с помощью 900, 500, 300 и 100 нг векторной ДНК (конструкция С-2, см. фиг. 3) в 24-луночных планшетах (трижды для каждой обработки). Через 2 дня после трансфекции осуществляют анализ люциферазы с клеточными экстрактами в трех повторах, который выражают с помощью КЬИ (относительные единицы света). Перед лизисом клеток были взяты супернатанты из одних и тех же лунок, объединены и проанализированы на !Ь18ВР с помощью ИФА (см. ниже).
ИФА Ш-18ВР.
Количество рекомбинантного человеческого Ш-18ВР (гЫЬ-18ВР) в супернатанте измеряют с помощью стандартного ИФА с использованием выделенных очисткой белком С моноклопальных анти-гй!Ь-18ВР-антител, конъюгированных с биотином.
Экстравидин-НКР (81дта) используют в качестве детектирующего реагента.
На фиг. 9 показаны количества (И-18ВР в нг/мл и люциферазы в КЬИ, экспрессируемые в 48 клонах на 90-й день после устойчивой трансфекции с помощью двунаправленной тСМУ-промоторной конструкции (см. фиг. 3). Предел обнаружения для люциферазы составляет около 500 КЬИ и 2,5 нг/мл - для Ш-18ВР.
Результаты
В данной серии экспериментов проанализирована экспрессия двух генов, находящихся в конструк
- 11 010096 ции С-2, изображенной на фиг. 3. Маркерный ген (люцифераза) экспрессируется с ΙΕ2-промотора, а представляющий интерес ген, ген 1Б-18ВР, экспрессируется с промотора ΙΕ2. 1Б-18ВР представляет собой секретируемый белок. Промоторы выстроены в двунаправленную структуру, т.е. оба промотора одновременно запускают экспрессию в противоположных направлениях.
Результаты данного исследования изображены на фиг. 6-9. На фиг. 6 показана величина люциферазной экспрессии, которая измерена в ЯЬи во временной экспрессирующей системе. В той же временной экспрессирующей системе с помощью ИФА измеряют 1Б-18ВР в супернатантах клеточных культур. На фиг. 7 показаны результаты секреции белка 1Б-18ВР в нг/мл. На фиг. 8 показано соотношение 1Ь18ВР и люциферазы в каждом эксперименте.
Как показано на фиг. 6-8, для трансфекции используют разные количества плазмидной ДНК. Все использованные количества ДНК приводят к экспрессии как люциферазы, так и 1Б-18ВР. Поразительно, но самые лучшие результаты получены при трансфекции наименьшим количеством ДНК, а именно 100 нг векторной ДНК, и этот результат одинаков и для 1Б-18ВР, и для люциферазы.
Более того, этот стабильный показатель (фиг. 8) свидетельствует о константном соотношении потенциальной экспрессии обоих промоторов.
Наконец, эти данные демонстрируют, что оба гена экспрессируются одновременно с двух промоторных единиц, показывая также, что обе экспрессирующие единицы полностью функциональны в двунаправленной промоторной структуре.
Далее, устойчиво трансфицируют конструкцию С-2, а экспрессию люциферазы и 1Б-18ВР анализируют в 48 независимых клонах.
Устойчивую трансфекцию осуществляют в соответствии с протоколом, описанным в примере 2, за тем исключением, что используемая после трансфекции среда представляет собой РгоС1о5 (СатЬгех, саР 12766Р).
Что касается клонирования одиночной клетки, данный пул упорядочивают в 384-луночной планшете (Пипс, саР 164688) с плотностью 0,5 клеток на лунку (70 мкл/лунку) с использованием диспенсера МиШбгор (ТйегтоЬаЬкуйегпк, саР 5840150). Спустя 8 дней случайным образом отбирают 192 клона и анализируют люциферазную экспрессию. Отбирают 48 клонов с наивысшей Ьис-экспрессией, которые перепроверяют на экспрессию люциферазы (люминометром) и на 1Б-18ВР (неавтоматизированный ИФА, см. выше).
На фиг. 9 представлены результаты данного эксперимента.
Все 48 клонов экспрессируют люциферазу и 1Б-18ВР, хотя и в разном количестве.
Пример 4. Определение минимальной энхансерной последовательности.
Материалы и методы
Плазмидные ДНК.
Набор векторов, содержащих укороченные тСМУ-промоторы, создан с использованием ПЦР (полимеразная цепная реакция) и специфичных для тСМУр праймеров (таблица ниже).
Условия ПЦР были следующими.
Смесь.
нг плазмидной ДНК (ргеутСМУ-Ьисйегаке (АХНоЦ конструкция Е на фиг. 2).
пкмоль смыслового и антисмыслового праймера (см. ниже таблицу, обычный антисмысловой праймер для всех).
200 мкМ каждого 6ЫТР (6АТР, 6ТТР, 6ОТР, 6СТР).
1х Оупахуте-буфер, содержащий 1,5 мМ МдС12.
единицы ДНК-полимеразы Эупахуте II (Иппхутек, саР. Р-5018).
Характеристика циклов:
95°С, 5' цикла:
95°С, 30
52°С, 30
72°С, 1'30 цикла:
95°С, 30
54°С, 30
72°С, 1'30 циклов:
95°С, 30
58°С, 30
72°С, 1'30 циклов:
95°С, 30
60°С, 30
72°С, 1'30
- 12 010096 мкл амплификата из каждой ПЦР-реакции помещают в 1%-ный агарозный гель. Перед клонированием вырезают полосы, обладающие нужной длиной, и подвергают выделению очисткой с использованием набора О1адеп М1ш1и!е Се1 Ех!гас!юп, са!. 28606.
| Положение | Праймер |
| -1076 | ССССТССАеАССТТАТСТАССТСССА |
| -783 | ССССТССАССТССААТССААСТТТССТС |
| -587 | ССССТССАСАСТТТССТСТТСАТТСАСС |
| -387 | ССССТССАССААААСССАбТСОАААСТС |
| -189 | ССССТССАСДТСССАТАТСАСТСТАТ ТАС |
| 1Е1-1Е2аа | СССААТТССАТАТССССССТСТС |
Положения, корреспондирующие с числом пар оснований, взятых из тСМУр, рассматривая +1 из 1Е2 в качестве начала отсчета, представляют собой -1076, -783, -587, -387 и -189.
Метод клонирования для любого промоторного фрагмента был одним и тем же, ПЦР выполняют в полную длину тСМУр (ртеутСМУ-Ьисйегаке (ДХйо1), т.е. конструкция Е на фиг. 2). Затем данные фрагменты обрабатывают с помощью Хйо1/ЕхоШ, добавляют два сайта рестрикции по краям специфической праймерной последовательности. Затем из конструкции Е удаляют промоторную последовательность путем обработки ее с помощью Хйо1/ЕсоК1 и укороченные варианты встраивают в тот же локус.
Оценку конструкций осуществляют с помощью временной трансфекции липофектамином с последующим измерением люциферазы. Дополнительные материалы и методы описаны в примере 1. 8ЕМсреда, используемая в данном примере, представляет собой РгоСйо5, СатЬгех, В-127660.
Результаты
Векторы Н-Ν (фиг. 10а), содержащие 1Е2-промотор тСМУ, приводящие в действие люциферазный ген, были сконструированы для того, чтобы определить минимальные последовательности, необходимые для высокого экспрессирующего уровня с 1Е2-промотора.
Семь конструкций Н-Ν экспрессирующих векторов используют для временной экспрессирующей системы, основанной на СНО-8-клетках. Полученные результаты изображены на фиг. 10Ь. Конструкция Ь представляет собой самую короткую конструкцию, сохраняющую сильную экспрессию люциферазы в данной системе. Конструкция М все еще приводит к экспрессии люциферазы на уровне, соответствующем 30% уровня экспрессии, достигаемого с помощью конструкций Н-Ь. Экспрессия люциферазы, получаемая с помощью конструкции Ν, оказывается очень низкой, но все же существенной, свидетельствуя о базальной промсторной активности, что и следовало ожидать для продуктивного сайта инициации транскрипции, содержащего ТАТА-бокс и инициатор.
Наконец, данные эксперименты определяют новый энхансер, расположенный слева от 1Е2 тСМУ, именуемый здесь 1Е2-энхансер тСМУ. В вышеуказанных экспериментах 1Е2-энхансер увеличивает транскрипцию с минимального 1Е2-промотора, сохраняемого в конструкции Ν. Минимальная последовательность, необходимая для высокой экспрессии репортерного гена, находится в пределах фрагмента от -587 до -189 п.н. (конструкция Ь) и в пределах конструкции, содержащей фрагмент от -387 до -189, все еще усиливающей экспрессию люциферазы (конструкция М).
Пример 5. Новый 1Е2-энхансер активирует минимальный 8У40-промотор.
Дополнительные эксперименты осуществляют для того, чтобы выяснить, действительно ли новый 1Е2-энхансер в самом деле удовлетворяет всем критериям, необходимым для энхансерной активности, т.е. усиливает экспрессию, независимо от (1) местоположения, (2) ориентации и (3) промоторной идентичности. Для этого были сконструированы конструкции О-У с целью выяснить, может ли новый 1Е2-энхансер усиливать экспрессию гетерологичного промотора, 8У40-промотора, независимо от ориентации, расстояния и положения (5' или 3') относительно 8У40-промотора. Конструкции ^, X и Υ служат контролем, содержит 8У40-энхансер, X содержит 8У40-промотор и не содержит какого-либо энхансера, а Υ не содержит ни энхансера, ни промотора.
Конструкция вектора
Вектор, именуемый р8У-Ьис (конструкция X на фиг. 11а), который содержит лишь 8У40-промотор, был сконструирован из рОЬ3-С!г1 (Рготеда, Е 1741), содержащего 8У40-промотор, приводящий в действие люциферазный ген, а также 8У40-энхансер, локализованный на 3'-конце данного гена (конструкция ^), и рОЕ3-Ва81с (Рготеда, Е1751), не содержащего ни промотора, ни энхансера (конструкция Υ).
Вкратце, рОЬ3-с!г1 разрезают с помощью №П/ХЬак чтобы выделить фрагмент, содержащий 8У40промотор с последующим люциферазным геном. Аналогичным способом разрезают рОЕ3-Ьа8Ю с помощью №П/ХЬа1 и выделяют векторный остов без энхансера, но содержащий ро1у А-область. В результате объединения двух фрагментов получают р8У-Ьис (конструкция X).
5'-Область 8У40-промотора данного вектора создана путем клонирования 1Е2-энхансерной после
- 13 010096 довательности (от -587 до -189) в обеих ориентациях, названной р5'епй-8У-Ьис (конструкция О), и р5'обратноориентироваиной последовательности епй-8У-Ьис (конструкция О). Кроме того, данную 1Е2-энхансерную последовательность (от -587 до -189) также клонируют в обеих ориентациях в 3'-область люциферазного гена. Полученные векторы были названы р3'епй-8У-Ьис+ (конструкция 8) и р3'-обратноориентированный епй-8У.Ьис. (конструкция и).
Такую же процедуру осуществляют с коротким вариантом ГЕЗ-энхансера, а именно занимающего позицию от -387 до -189, вместо положения от -587 до -189, и получают конструкции Р, В, Т и У, см. фиг. 11а.
Конструирование О, Р.
Реципиентный вектор представляет собой р8У-Ьис+ (конструкция X из фиг. 11а), линеаризованный с помощью обработки Ыйе1/8та1. Полноразмерный энхансер выделяют путем обработки Ыбе1 и последующей реакцией затупления по концам с использованием полимеразы Кленова с последующей очисткой и обработкой Ыйе1. Такой же подход применяют для создания короткой энхансерной конструкции.
Конструирование О, В.
Реципиентный вектор представляет собой р8У-Ьис+ (конструкция X из фиг. 11а), линеаризованный обработкой с помощью Хйо1/8та1. Полноразмерный энхансер выделяют путем обработки с помощью Ыбе1 и последующей реакцией затупления концов с использованием полимеразы Кленова, очисткой и обработкой с помощью ΧΙιοΙ. Такой же подход применяют для создания короткой энхансерной конструкции.
Конструирование 8, Т, и и У.
Реципиентный вектор представляет собой р8У-Ьис+ (конструкция X из фиг. 11а), раскрываемый обработкой с помощью ВатН1 и последующим туплением концов с использованием полимеразы Кленова. Полноразмерный энхансер выделяют обработкой с помощью ЫбеГ/МйеГ и последующей реакцией затупления концов с использованием полимеразы Кленова. Клонирование осуществляют в обеих ориентациях, которые идентифицируют с помощью рестрикционного анализа. Обе конструкции с разными ориентациями оставляют для анализа. Такой же подход применяют для создания короткой энхансерной конструкции.
Конструирование рСЬ3-Вак1с (конструкция Υ) служит в качестве контроля отсутствия экспрессии. рСЬ3с1г1 (конструкция XV) служит в качестве 8У40-промотор/энхаисерного вектора. Р8У-Ьис является контролем, обладающим только 8У40-промотором (конструкция X).
Измерения трансфекции и люциферазы осуществляют в качестве предварительных примеров.
Результаты
Результаты, полученные для конструкций О-Υ из фиг. 11а, изображены на фиг. 11Ь. Конструкция, содержащая 8У40-промотора с отсутствием энхансерной активности, взята в качестве исходного уровня добавляемой энхансерной активности, а активность, измеряемая с помощью конструкции X, задается в виде 1. Все конструкции, обладающие либо длинным, либо коротким 1Е2-энхансером, обеспечивают экспрессию репортерного гена. Длинный вариант конструкции устойчиво обеспечивает высокую экспрессию репортерного гена с 8У40-промотора, которая оказывается гораздо выше той, которую получают при объединении 8У40-промотора и 8У40-энхансера (конструкция О). Вследствие этого данный эксперимент четко определяет последовательность от -587 до -189 и последовательность от -387 до 189 в качестве настоящих энхансеров, активирующих гетерологичный промотор в независимости от положения и ориентации.
Пример 6. Сравнение длинного IЕ2-энхаисерного варианта (от -587 до -189) и йСМУ-энхансера.
Протоколы экспериментов по трансфекции липофектамином с последующим измерением люциферазы, описаны в примере 1.
Результаты
В данном эксперименте конструкции О и р, обладающие длинным вариантом нового 1Е2-энхансера в обоих направлениях в 5'8У40-промоторе, используют для сравнения с известным сильным энхансером, ЙСМУ (человеческий цитомегаловиру^-энхансером. На этом конце 1Е2-последовательность тСМУ замещают йСМУ-энхансерной последовательностью (8ЕР ΙΌ Νο: 2) в конструкции О, получая таким образом конструкцию О-2. То же самое проделали с конструкцией р, превращая ее в конструкцию Р-2.
Использованная для клонирования последовательность йСМУ-энхансера, обладающая фланкирующими М1и1-сайтами (М1и1=асдсд1), имеет следующий вид:
свсотт<%смтск.питисшп*пшаА0хмтс1матасбв8(зтсяхтасттс
ТЛССОЛСТТТССЛ1ГТаЬОС1СЛА1ХЮ<ЗТСЗаЬСТЛТГ1ЛСввТААЛСТвССа^^ тматсмвк®мсаиаяюс«стыхссссстжтт^^ «таоосеттталсгаьсгаэатттсаиштстсслсотсаттаго ТОТТТТООСЛССААААТСЛАСОбвАСТТПХМААТОТССТЛАСАЛСГС^ тостя£СССооос9сояаАясяасштстсеистсмятшзтсдосздосдхя0Тсса(; сссстстссасэдтчхясссстздяссоссс^
- 14 010096
8У-Ьис+ расщепляют с помощью М1и1 и обрабатывают щелочной фосфатазой из кишечника теленка для предотвращения самолигирования. Последовательность ЬСМУ-промотора клонируют в М1и1-сайт. Оба разноориентированных клона сохраняют для сравнения с эквивалентными 1Е2-конструкциями.
Результаты по экспрессии люциферазы представлены на фиг. 12. Уровень экспрессии люциферазы, полученный с новым 1Е2-энхансером (длинный вариант), оказывается по меньшей мере в 2 раза выше уровня экспрессии люциферазы, полученного с помощью классического йСМУ-энхансера.
Пример 7. Характеристика 1Е2-энхансера в двунаправленной конструкции.
Созданы две дополнительные конструкции для тестирования нового энхансера в двунаправленной структуре, названные конструкциями #26 и #140, которые изображены на фиг. 13.
#26: основу данного вектора составляет последовательность тСМУ-Ьис+ (конструкция С, фиг. 3). Она была создана с помощью 8ас11/ЕсоШ. 1Ь-18ВР-кассета взята из рйСМУ-1Ь18ВР2. Путем разрезания данного вектора с помощью 8ас11/ЕсоК1 выделяют фрагмент, содержащий интрон А, за которым следуют открытая рамка считывания 1Ь-18ВР и 8У40ро1уЛ-область.
#140: основу данного вектора составляет конструкция Ь из фиг. 10а. Он создан с помощью ΧΜ/ΝΜ, открывающих данный вектор 5' 1Е2-энхансером. Вектор, экспрессирующий 1Ь-18ВР с 1Е1промотора, названный рВ8.1 1Ь18ВР(1Е1).1, используют для встраивания в качестве донорного. Обрабатывая данный вектор с помощью Х1ю1/8рс1. выделяют ΧΙιοΙ-фрагмент. содержащий 1Е1-промотор (см. фиг. 1), за которыми следует кассета интрон А-1Ь18ВР-8У40ро1уЛ. В полученной конструкции недостает последовательности между -589 и Х1о1-сайтом исходной тСМУ-промоторной последовательности.
Устойчивую трансфекцию и измерение люциферазы осуществляют, как описано в примере 2, а ИФА 1Ь18ВР осуществляют, как описано в примере 3.
Однако конструкция #140 не является точным отображением конструкции #26 в отношении того, что промоторы 1Е1 и 1Е2 находятся в противоположной ориентации. Так, экспрессия люциферазы запускается в конструкции #26 под промотором 1Е1, а в конструкции #140 под промотором 1Е2, экспрессия 1Ь18ВР запускается под промотором 1Е2 в конструкции #26 и под промотором 1Е1 в конструкции #140.
Результаты, полученные с обеими конструкциями, представлены ниже, так как они существенны для одновременного действия нового 1Е2-энхансера двух разных промоторов в двунаправленном экспрессирующем векторе (конструкция #140).
На фиг. 14 изображены объединенные результаты по устойчивой трансфекции клеток с помощью конструкции #26 и #140 на примере экспрессии люциферазы и 1Ь-18ВР. Конструкция #140 обеспечивает более высокую экспрессию и маркерного гена (люцифераза) и представляющего интерес гена (1Ь-18ВР).
Для того, чтобы определить стабильность экспрессии люциферазы и 1Ь-18ВР, совокупности клеток выдерживают в селективных условиях, а именно либо обрабатывают пуромицином, либо выдерживают в течение 3 недель без селективного давления (без пуромицина). Полученные результаты представлены на фиг. 15-17. Уровни экспрессии репортерного гена люциферазы и 1Ь-18ВР существенно не изменяются во времени, см. фиг. 16 и 17.
Таким образом, было продемонстрировано, что обе конструкции, #26 и #140, показывают аналогичные уровни экспрессии во времени, в присутствии или в отсутствие селективного давления. Поэтому конструкции, обладающие новым 1Е2-энхансером, пригодны для устойчивой и одновременной экспрессии двух генов.
Поскольку вышеприведенные результаты были получены для совокупностей, клоны были получены путем лимитирующего разведения в концентрации 0,5 клеток на лунку из обеих совокупностей.
Чтобы оценить уровни клональной экспрессии, клоны культивируют при пуромициновом отборе. Затем выделенные клоны разделяют в присутствии и в отсутствие пуромицина, чтобы со временем контролировать их устойчивость. Результаты, представленные на фиг. 18 и 19, взяты до разделения клонов на среде с отсутствием/присутствием пуромицина. Результаты, полученные через 2 недели после удаления пуромицина, свидетельствуют о незначительной разнице между обеими конструкциями, подтверждая тем самым их устойчивость. Данное исследование было продолжено в течение последующих 10-12 недель.
Чтобы оценить экспрессию обоих генов, используют посуду с высокой пропускной способностью, а именно 96-луночные планшеты.
День 1.
Разведение 1/2 анализируемых клеток, 100 мкл культуральной среды (бессывороточной) РгоС1о5 + 100 мкл свежей РгоС1о5, содержащей 5% околоплодной сыворотки теленка. В конечной концентрации 2,5% РВ8 клетки были способны прикрепляться. Был сделан еженедельный пассаж поддерживающего планшета для фактора разведения 1/20, каждый в РгоС1о5-среде.
День 2.
Удаляют среду, однократно промывают 200 мкл 1х РВ8 (1пуйтодеп, 10010-015), после чего добавляют 75 мкл свежей РгоС1о5, содержащей 5% РВ8, и инкубируют в течение 24 ч.
День 3.
Из каждого супернатанта отбирают 50 мкл и приливают 200 мкл ИФА-буфера (1х РВ8, 0,1% мас./об. В8Л, 0,2% Твина 20). Аликвоту в 100 мкл анализируют с помощью ИФА на 1Ь-18ВР.
Лунки промывают 200 мкл 1х РВ8 (отбросить) и приливают 100 мкл С1о-лизирующего буфера
- 15 010096 (Рготеда, Е266а). Данные лунки инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре, чтобы обеспечить лизис клеток. Измерение люциферазы осуществляют с использованием 30 мкл лизированных клеток, перенесенных в белый 96-луночный планшет + 30 мкл перерастворенного Впдй!-С1о-реагента. Световое излучение замеряют люминометром Сеп!го БВ960 в течение 5 с экспонирования.
Анализ клонов, полученный при устойчивой трансфекции с помощью конструкции #26, изображен на фиг. 18, а анализ клонов при устойчивой трансфекции с помощью конструкции #140 изображен на фиг. 19.
Клоны, представленные на фиг. 18 и 19, оценивают по их люциферазному показателю нисходящим способом. Экспрессию ГЕ18ВР выражают ОП-величиной. Так как ИФА осуществляют в посуде с высокой пропускной способностью, получение реальной количественной оценки уровней ГЕ-18ВР невозможно. Однако контроли с 2500 и 250 нг/мл, а также холостой контроль включены в данную планшету для контроля изменчивости.
На фиг. 20 показана экспрессия люциферазы, полученная с помощью устройства СйетГОос. Данное изображение дает ССИ-камера (Вюгаб), позволяющая получать сигналы хемилюминисцентного происхождения (как на фиг. 20). Программное обеспечение под названием ОнапШу Опе 4.2.3 позволяет управлять изображением инвертирования сигналов, которые были использованы здесь.
Как следует из результатов, представленных на фиг. 18-20, конструкция #140 дает группу неэкспрессируемых клонов. Однако удивительно, что небольшая часть позитивных клонов экспрессируется обоими генами чрезвычайно сильно.
Поэтому конструкция #140 дает возможность осуществлять скрининг при очень высокой экспрессии на очень ранних стадиях клонирования и тем самым исключает необходимость тестирования и доведения до конца большого числа клонов, обычно используемых для идентификации небольшого числа клонов с высокой экспрессией двух интересующих генов.
Список литературы
1. АЬЬа!е е! а1., Вю1ес11пк|иек 2001 Аид.; 31 (2): 336-40.
2. АккагаТ е! а1., 1. Вю1. Сйет. 1992, Маг. 25; 267 (9): 5776-84.
3. В1аскмюоб, Б.М., Кабопада, БТ. 8с1епсе 1998, 1и1. 3; 281 (5373): 61-3.
4. Эе \Уе1 е! а1. (1985) Ргос. Νι!1. Асаб. 8а. И8А 82, 7870.
5. Погксй-Наек1ег, К. е! а1. (1985). Ргос. №!1. Асаб. 8а. И8А 82: 8325-8329.
6. Соеббе1 Мебюбк Εηζуто1., Уо1. 185, 8ап И1едо.
7. Ь1, р., Нади, 8., Ре!егкоп, К.К. Тгепбк Сепе!. 1999 Ос!.; 15 (10): 403-8.
8. Маптпд, \У.С. апб Мосагккц Ε.8., У1го1оду 167, 477-484 (1988).
9. Махитбег, В., 8екйабп, У., Рох, Р.Ь. Тгепбк Вюсйет. 8а. 2003 ЕеЬ.; 28 (2): 91-8.
10. Меккег1е, М. е! а1. (1991). 1. Уио1. 65: 1638-1643.
11. К1т, 8.-Υ. е! а1. (2002). 1. Вю!есй. 93: 183-187.
12. МоипЛогб, Р.8., 8111611, А.С. Тгепбк Сепе!. 1995 Мау; 11 (5): 179-84.
13. 8апб£огб апб Витк, У1го1оду 222, 310-317 (1996).
14. 8сйитрег11 е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8а. И8А, 1982 1ап.; 79 (2): 257-61.
15. 8е11дег апб МсВ1гоу (1960) Агс11. Вюсйет. Вюрйук. 88, 136.
16. 81ю1\\е11 е! а1., 1982, 1. В. С. 257 (6), 2974-80.
17. \Уооб е! а1., (1991) Вюсйет. Вюрйук. Кек. Сотт. 124, 592.
18. Патент США № 4963481.
19. Патент США № 4968615.
20. /би е! а1., 1. Се11 Вюсйет. 2001, Маг. 26; 81 (2): 205-19.
Claims (38)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Экспрессирующий вектор, содержащий коровый промотор тСМУ-Ш2-гена, простирающийся от нуклеотида 1 до нуклеотида 39 в последовательности 8ΕΟ ΙΌ №: 1, где:(ί) экспрессирующий вектор не содержит никакого полного гена тСМУ и (ίί) указанный промотор тСМУ-Ш2-гена оперативно связан с ДНК-последовательностью, кодирующей полипептид.
- 2. Вектор по п.1, дополнительно содержащий промотор, отличающийся от указанного тСМУ-Ш2промотора.
- 3. Вектор по п.1 или 2, включающий в себя первый и второй промоторы вирусного, клеточного или искусственного происхождения.
- 4. Вектор по п.3, в котором первый промотор представляет собой тСМУ-Ш2-промотор, а второй промотор представляет собой тСМУ-Ш1-промотор.
- 5. Вектор по любому из предшествующих пунктов, содержащий ДНК-последовательность 8ΕΟ ΙΌ №: 1.
- 6. Вектор по любому из предшествующих пунктов, содержащий фрагмент, содержащий нуклеотиды от -587 до -189 слева от области тСМУ-Ш2, где нумерация нуклеотидов осуществляется относительно +1 Ш2-гена.- 16 010096
- 7. Вектор по любому из предшествующих пунктов, включающий в себя фрагмент, содержащий нуклеотиды от -587 до -189 слева от области тСМУ-1Е2, где нумерация нуклеотидов осуществляется относительно +1 1Е2-гена.
- 8. Вектор по любому из пп.3-7, где первый и второй промоторы оперативно связаны с ДНК-последовательностями, кодирующими по меньшей мере один полипептид.
- 9. Экспрессирующий вектор, содержащий энхансер тСМУ-1Е2-гена, простирающийся от нуклеотида -387 до нуклеотида -189 выше области тСМУ-1Е2, где нумерация нуклеотидов осуществляется относительно +1 1Е2-гена, где указанный экспрессирующий вектор:(ί) не содержит никакого полного гена тСМУ и (ίί) содержит первый и второй промоторы вирусной, клеточной или искусственной природы, где указанные первый и второй промоторы оперативно связаны с ДНК-последовательностями, кодирующими по меньшей мере один полипептид.
- 10. Вектор по п.8 или 9, где ДНК-последовательности кодируют по меньшей мере один представляющий интерес белок.
- 11. Вектор по п.10, где ДНК-последовательности кодируют по меньшей мере один маркерный белок.
- 12. Вектор по п.10, где ДНК-последовательности кодируют по меньшей мере один репортерный белок.
- 13. Вектор по любому из пп.3-11, где первый промотор, а также второй промотор располагают таким образом, чтобы они были двунаправленными.
- 14. Вектор по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающий в себя один или более регуляторных элементов, выбранных из 5'иТК, интронов, 3'ИТК, 3'-концевых процессирующих мРНК-последовательностей, сайтов полиаденилирования и последовательностей внутреннего связывания рибосом (1КЕ8).
- 15. Вектор по п.14, где регуляторный элемент представляет собой 1КЕ8, дополнительно содержащий ДНК-последовательность, кодирующую по меньшей мере одну полицистронную мРНК.
- 16. Вектор по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающий в себя один или более ДНК-элементов, выбранных из инсуляторов, пограничных элементов, районов контроля локуса (ЪСК), областей прикрепления к матриксу (МАК) и элементов для рекомбинации и кассетного обмена.
- 17. Вектор по любому из пп.8-16, где ДНК-последовательность, кодирующая полипептид, оперативно связанная с первым промотором, и ДНК-последовательность, кодирующая полипептид, оперативно связанная со вторым промотором, кодирует тот же самый полипептид.
- 18. Вектор по любому из пп.8-16, где ДНК-последовательность, кодирующая полипептид, оперативно связанная с первым промотором, и ДНК-последовательность, кодирующая полипептид, оперативно связанная со вторым промотором, кодирует разные полипептиды.
- 19. Вектор по п.18, где ДНК-последовательность, кодирующая полипептид, оперативно связанная с первым промотором, кодирует первую субъединицу димерного или мультимерного белка, и ДНК-последовательность, кодирующая полипептид, оперативно связанная со вторым промотором, кодирует вторую субъединицу димерного или мультимерного белка.
- 20. Вектор по п.19, где одна субъединица представляет собой альфа-цепь, а другая субъединица представляет собой бета-цепь гормона, выбранного из Е8Н человека, ЬН человека, Т8Н человека и СО человека.
- 21. Вектор по п.19, где одна субъединица представляет собой тяжелую цепь, а другая субъединица представляет собой легкую цепь иммуноглобулина.
- 22. Вектор по любому из пп.10-21, где представляющий интерес белок выбран из Е8Н, ЬН, СО, Т8Н, гормона роста, интерферона, белка I, связывающего ΤΝΕ, белка II, связывающего ΤΝΕ, Кар!гуа®, 1Ь-18ВР или их мутеинов, фрагментов, функциональных производных и слитых белков.
- 23. Вектор по любому из пп.11-22, где маркерный белок выбран из аденозиндезаминазы (АЭА), аминогликозидфосфотрансферазы (иео), дигидрофолатредуктазы (ЭНРК), гигромицин-В-фосфотрансферазы (НРН), тимидинкиназы (!к), ксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы (др!), гена множественной лекарственной устойчивости (МОК), орнитиндекарбоксилазы (ОЭС) и устойчивости к №(фосфоноацетил)-Ь-аспартату (САП), пуромицинацетилтрансферазы (РАС), галактокиназы, человеческих рецепторов фолата или восстановленных носителей фолата.
- 24. Вектор по пп.12-23, где репортерный белок выбран из люциферазы, зеленого флуоресцирующего белка, щелочных фосфатаз и пероксидазы хрена или их сочетаний.
- 25. Экспрессирующий вектор, содержащий промотор тСМУ-1Е2-гена, где указанный промотор состоит из последовательности, выбранной из группы, состоящей из:(ί) корового 1Е2-промотора, простирающегося от нуклеотида 1 до нуклеотида 39 в последовательности 8ЕО ΙΌ Νο: 1;(ίί) последовательности, содержащей коровый 1Е2-промотор, простирающийся от нуклеотида 1 до нуклеотида 39 в последовательности 8ЕО ΙΌ Νο: 1, и последовательности от 100 до 200 нуклеотидов слева от указанного корового промотора и (ΐϊϊ) последовательности 8ЕО ΙΌ Νο: 1.
- 26. Вектор по п.25, где указанный промотор оперативно связан с ДНК-последовательностью, кодирующей полипептид.- 17 010096
- 27. Вектор по п.26, где указанный полипептид выбран из Е8Н, ЬН, СО, Т8Н, гормона роста, интерферона, белка I, связывающего ΤΝΕ, белка II, связывающего ΤΝΕ, Карйуа®, Ш-18ВР или их мутеинов, фрагментов, функциональных производных и слитых белков.
- 28. Хозяйская клетка, трансфицированная вектором по любому из предшествующих пунктов.
- 29. Хозяйская клетка по п.28, являющаяся клеткой СНО.
- 30. Способ получения полипептида, включающий в себя стадию трансфекции хозяйской клетки по меньшей мере одним вектором по любому из пп.1-27.
- 31. Способ по п.30, где трансфекция представляет собой устойчивую трансфекцию.
- 32. Способ получения полипептида, включающий в себя стадию культивирования хозяйской клетки по п.28 или 29 в условиях, обеспечивающих возможность экспрессии полипептида.
- 33. Способ по п.30 или 31, дополнительно включающий в себя стадию выделения полипептида из хозяйской клетки или из супернатанта клеточной культуры.
- 34. Применение вектора по любому из пп.1-27 для экспрессии представляющего интерес гена.
- 35. Применение вектора по любому из пп.1-27 для селекции клонов, которые экспрессируют высокие количества представляющего интерес гена.
- 36. Применение вектора по любому из пп.4-24 для одновременной экспрессии представляющих интерес двух и более генов или ДНК.
- 37. Применение вектора по любому из предшествующих пунктов для производства лекарственного средства, предназначенного для ДНК-терапии.
- 38. Применение хозяйской клетки по п.28 или 29 для производства лекарственного средства для клеточной терапии.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP03100617 | 2003-03-11 | ||
| PCT/EP2004/050280 WO2004081167A2 (en) | 2003-03-11 | 2004-03-10 | Expression vectors comprising the mcmv ie2 promoter |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200501444A1 EA200501444A1 (ru) | 2006-02-24 |
| EA010096B1 true EA010096B1 (ru) | 2008-06-30 |
Family
ID=32981915
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200501444A EA010096B1 (ru) | 2003-03-11 | 2004-03-10 | Экспрессирующие векторы, содержащие ie2-промотор mcmv |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US7824907B2 (ru) |
| EP (1) | EP1601776B1 (ru) |
| JP (3) | JP5171033B2 (ru) |
| KR (1) | KR101180139B1 (ru) |
| CN (1) | CN100429315C (ru) |
| AT (1) | ATE399872T1 (ru) |
| AU (1) | AU2004219917B2 (ru) |
| BR (1) | BRPI0408246A (ru) |
| CA (1) | CA2516157C (ru) |
| CY (1) | CY1108344T1 (ru) |
| DE (1) | DE602004014738D1 (ru) |
| DK (1) | DK1601776T3 (ru) |
| EA (1) | EA010096B1 (ru) |
| ES (1) | ES2309508T3 (ru) |
| HK (1) | HK1085766A1 (ru) |
| HR (1) | HRP20050705B1 (ru) |
| IL (1) | IL170754A (ru) |
| MX (1) | MXPA05009608A (ru) |
| NO (1) | NO333818B1 (ru) |
| PL (1) | PL1601776T4 (ru) |
| PT (1) | PT1601776E (ru) |
| RS (1) | RS50488B (ru) |
| SI (1) | SI1601776T1 (ru) |
| UA (1) | UA88138C2 (ru) |
| WO (1) | WO2004081167A2 (ru) |
| ZA (1) | ZA200506400B (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2699715C2 (ru) * | 2014-05-19 | 2019-09-09 | Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг | Способ получения полипептидов |
Families Citing this family (40)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB0216648D0 (en) | 2002-07-18 | 2002-08-28 | Lonza Biologics Plc | Method of expressing recombinant protein in CHO cells |
| SI1601776T1 (sl) * | 2003-03-11 | 2008-10-31 | Serono Lab | Ekspresijski vektorji, ki vsebujejo mcmv ie2 promotor |
| CA2524403C (en) * | 2003-05-13 | 2013-07-09 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Active variants of the il-18 binding protein and medical uses thereof |
| ES2354160T3 (es) * | 2003-10-21 | 2011-03-10 | Merck Serono Sa | Secuencia de adn mínima que actúa como un aislante de cromatina, y su uso en la expresión de proteínas. |
| ATE360647T1 (de) * | 2003-11-05 | 2007-05-15 | Ares Trading Sa | Verfahren zur aufreinigung von il-18-bindendem protein |
| ME01218B (me) * | 2004-03-01 | 2013-06-20 | Ares Trading Sa | Upotreba podloge za ćelijsku strukturu bez sadrzaja seruma za produkciju il-18bp u ćelijama sisara |
| ATE408616T1 (de) * | 2004-06-29 | 2008-10-15 | Ares Trading Sa | Verfahren zur aufreinigung von il-18-bindendem protein |
| EP1819812B1 (en) * | 2004-12-02 | 2012-05-30 | Merck Serono SA | The lupac bifunctional marker and its use in protein production |
| AU2006237193B2 (en) | 2005-04-22 | 2012-02-02 | Lonza Biologics Plc. | Mammalian expression vector comprising the mCMV promoter and first intron of hCMV major immediate early gene |
| WO2006124784A2 (en) * | 2005-05-16 | 2006-11-23 | Morphotek, Inc. | Regulated vectors for selection of cells exhibiting desired phenotypes |
| US7691611B2 (en) * | 2005-06-03 | 2010-04-06 | Ares Trading S.A. | Production of recombinant IL-18 binding protein |
| JP5091127B2 (ja) * | 2005-06-10 | 2012-12-05 | アレス トレーディング ソシエテ アノニム | Ｉｌ−１８結合タンパク質の精製のための方法 |
| EP1760092A1 (en) | 2005-08-26 | 2007-03-07 | Applied Research Systems ARS Holding N.V. | System for screening cells for high expression of a protein of interest |
| WO2009080759A1 (en) * | 2007-12-21 | 2009-07-02 | Novartis Ag | Organic compounds |
| JP2009276724A (ja) * | 2008-05-19 | 2009-11-26 | Nitto Denko Corp | 光導波路装置の製造方法 |
| DK2401377T3 (en) * | 2009-02-27 | 2016-08-29 | Novartis Ag | Expression vector system comprising two selection markers |
| JP5502406B2 (ja) * | 2009-09-14 | 2014-05-28 | ロンザ・バイオロジクス・ピーエルシー | Ｃｈｏ細胞において組換えタンパク質を発現する方法 |
| KR101038126B1 (ko) * | 2010-11-30 | 2011-05-31 | 주식회사 엘지생명과학 | 새로운 융합 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 벡터 |
| US9249785B2 (en) * | 2012-01-31 | 2016-02-02 | Brightsource Industries (Isreal) Ltd. | Method and system for operating a solar steam system during reduced-insolation events |
| PL2711426T3 (pl) * | 2012-09-24 | 2015-09-30 | Lonza Biologics Plc | Wektory ekspresyjne zawierające chimeryczne sekwencje promotora i wzmacniacza wirusa cytomegalii |
| ITFI20120221A1 (it) * | 2012-10-22 | 2014-04-23 | Nuovo Pignone Srl | "exhaust gas collector and gas turbine" |
| WO2014133468A1 (en) * | 2013-02-28 | 2014-09-04 | Agency For Science, Technology And Research | Chimeric promoters for high gene expression level and stability in mammalian cells |
| CN103173481A (zh) * | 2013-03-01 | 2013-06-26 | 上海中医药大学附属普陀医院 | 一种含有abcb1基因3′utr序列和报告基因的质粒载体及其构建方法和用途 |
| CN103173480B (zh) * | 2013-03-01 | 2015-06-24 | 上海中医药大学附属曙光医院 | 一种利用双荧光素酶报告基因筛选多药耐药相关microRNA的方法 |
| US20160017319A1 (en) | 2013-03-11 | 2016-01-21 | Audrey Nommay | Method of screening cell clones |
| DK3027646T3 (en) | 2013-07-31 | 2018-09-24 | Novartis Ag | New selection vectors and methods for selecting eukaryotic host cells |
| DK3083677T3 (da) | 2013-12-20 | 2019-11-25 | Novartis Ag | Hidtil ukendte eukaryote celler og fremgangsmåder til rekombinant ekspression af et produkt af interesse |
| KR102288857B1 (ko) | 2013-12-20 | 2021-08-11 | 노파르티스 아게 | 신규한 진핵 세포 및 관심 생성물의 재조합 발현 방법 |
| JP6265020B2 (ja) * | 2014-04-16 | 2018-01-24 | Jnc株式会社 | エビルシフェラーゼの触媒蛋白質の変異遺伝子とその使用法 |
| DK3137595T3 (da) | 2014-04-29 | 2019-06-17 | Novartis Ag | Hidtil ukendte vertebratceller og fremgangsmåder til rekombinant ekspression af et polypeptid af interesse |
| KR20160068558A (ko) | 2014-12-05 | 2016-06-15 | 삼성바이오에피스 주식회사 | 마우스 cmv 프로모터를 포함하는 융합 폴리뉴클레오타이드 및 이를 이용한 목적 폴리펩타이드의 생산 방법 |
| US10882905B2 (en) | 2015-03-05 | 2021-01-05 | Ab2 Bio Sa | IL-18 binding protein (IL-18BP) and antibodies in inflammatory diseases |
| CN107466324B (zh) * | 2015-04-14 | 2022-01-14 | 扬森疫苗与预防公司 | 具有双向启动子的表达两种转基因的重组腺病毒 |
| EP3408397B1 (en) | 2016-01-27 | 2020-07-15 | Just-Evotec Biologics, Inc. | Hybrid promoter and uses thereof |
| US11473105B2 (en) | 2016-05-12 | 2022-10-18 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Potent and balanced bidirectional promoter |
| CN109312362B (zh) | 2016-06-20 | 2022-06-28 | 扬森疫苗与预防公司 | 有效和平衡的双向启动子 |
| KR101864581B1 (ko) * | 2016-11-04 | 2018-07-13 | 국립암센터 | 양방향 프로모터를 포함하는 렌티바이러스 발현 벡터 및 이의 용도 |
| US11034978B2 (en) | 2017-02-09 | 2021-06-15 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Potent and short promoter for expression of heterologous genes |
| US20200370056A1 (en) | 2017-10-02 | 2020-11-26 | Astrazeneca Ab | Cell lines and methods for increased protein production |
| EP3891278A4 (en) * | 2018-12-04 | 2022-08-31 | Catalent Pharma Solutions, LLC | PROTEIN MANUFACTURE VECTORS |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4963481A (en) * | 1985-12-18 | 1990-10-16 | Genetics Institute Inc | Promoter system |
Family Cites Families (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2007A (en) * | 1841-03-16 | Improvement in the mode of harvesting grain | ||
| JPS63502719A (ja) * | 1985-12-18 | 1988-10-13 | ジェネティックス・インスチチュ−ト・インコ−ポレ−テッド | プロモ−タ−系 |
| US4968615A (en) * | 1985-12-18 | 1990-11-06 | Ciba-Geigy Corporation | Deoxyribonucleic acid segment from a virus |
| US20020065213A1 (en) * | 1998-01-16 | 2002-05-30 | Robert J. Debs | Methods and compositions for nonviral gene delivery |
| JP4987205B2 (ja) * | 2000-03-03 | 2012-07-25 | ジェネトロニクス， インコーポレイテッド | 遺伝子送達用核酸製剤および使用方法 |
| CN1250286C (zh) * | 2000-05-05 | 2006-04-12 | 应用研究系统Ars股份公司 | Il－18抑制剂在治疗和/或预防动脉粥样硬化中的应用 |
| US7812148B2 (en) * | 2001-04-05 | 2010-10-12 | Millipore Corporation | Vectors comprising CpG islands without position effect varigation and having increased expression |
| WO2002099089A1 (en) * | 2001-06-04 | 2002-12-12 | Corixa Corporation | Compositions and methods for high-level, large-scale production of recombinant proteins |
| SI1601776T1 (sl) * | 2003-03-11 | 2008-10-31 | Serono Lab | Ekspresijski vektorji, ki vsebujejo mcmv ie2 promotor |
| CA2524403C (en) | 2003-05-13 | 2013-07-09 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Active variants of the il-18 binding protein and medical uses thereof |
| ES2354160T3 (es) * | 2003-10-21 | 2011-03-10 | Merck Serono Sa | Secuencia de adn mínima que actúa como un aislante de cromatina, y su uso en la expresión de proteínas. |
| ATE360647T1 (de) | 2003-11-05 | 2007-05-15 | Ares Trading Sa | Verfahren zur aufreinigung von il-18-bindendem protein |
| ME01218B (me) * | 2004-03-01 | 2013-06-20 | Ares Trading Sa | Upotreba podloge za ćelijsku strukturu bez sadrzaja seruma za produkciju il-18bp u ćelijama sisara |
| ATE408616T1 (de) * | 2004-06-29 | 2008-10-15 | Ares Trading Sa | Verfahren zur aufreinigung von il-18-bindendem protein |
| EP1819812B1 (en) * | 2004-12-02 | 2012-05-30 | Merck Serono SA | The lupac bifunctional marker and its use in protein production |
| US7691611B2 (en) | 2005-06-03 | 2010-04-06 | Ares Trading S.A. | Production of recombinant IL-18 binding protein |
| JP5091127B2 (ja) | 2005-06-10 | 2012-12-05 | アレス トレーディング ソシエテ アノニム | Ｉｌ−１８結合タンパク質の精製のための方法 |
| DK2695947T3 (en) * | 2011-04-01 | 2017-05-08 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Process for Preparation of Recombinant Polypeptides |
-
2004
- 2004-03-10 SI SI200430835T patent/SI1601776T1/sl unknown
- 2004-03-10 PL PL04718972T patent/PL1601776T4/pl unknown
- 2004-03-10 PT PT04718972T patent/PT1601776E/pt unknown
- 2004-03-10 JP JP2006505456A patent/JP5171033B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2004-03-10 US US10/548,364 patent/US7824907B2/en active Active
- 2004-03-10 KR KR1020057015746A patent/KR101180139B1/ko active IP Right Grant
- 2004-03-10 AU AU2004219917A patent/AU2004219917B2/en not_active Expired
- 2004-03-10 MX MXPA05009608A patent/MXPA05009608A/es active IP Right Grant
- 2004-03-10 BR BRPI0408246-0A patent/BRPI0408246A/pt not_active Application Discontinuation
- 2004-03-10 EA EA200501444A patent/EA010096B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2004-03-10 DE DE602004014738T patent/DE602004014738D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2004-03-10 WO PCT/EP2004/050280 patent/WO2004081167A2/en active IP Right Grant
- 2004-03-10 RS YUP-2005/0687A patent/RS50488B/sr unknown
- 2004-03-10 CA CA2516157A patent/CA2516157C/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-03-10 DK DK04718972T patent/DK1601776T3/da active
- 2004-03-10 EP EP04718972A patent/EP1601776B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-03-10 AT AT04718972T patent/ATE399872T1/de active
- 2004-03-10 CN CNB2004800067294A patent/CN100429315C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2004-03-10 ES ES04718972T patent/ES2309508T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-10-03 UA UAA200509529A patent/UA88138C2/ru unknown
-
2005
- 2005-08-09 HR HRP20050705AA patent/HRP20050705B1/hr not_active IP Right Cessation
- 2005-08-11 ZA ZA200506400A patent/ZA200506400B/en unknown
- 2005-09-08 IL IL170754A patent/IL170754A/en unknown
- 2005-10-10 NO NO20054642A patent/NO333818B1/no unknown
-
2006
- 2006-07-14 HK HK06107903A patent/HK1085766A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2008
- 2008-09-16 CY CY20081100997T patent/CY1108344T1/el unknown
-
2010
- 2010-08-31 US US12/872,151 patent/US9051582B2/en active Active
-
2012
- 2012-07-13 JP JP2012157563A patent/JP5848202B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2015
- 2015-05-20 US US14/716,937 patent/US20150252383A1/en not_active Abandoned
- 2015-06-10 JP JP2015117538A patent/JP2015180222A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4963481A (en) * | 1985-12-18 | 1990-10-16 | Genetics Institute Inc | Promoter system |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| BARON U. ET AL.: "CO-REGULATION OF TWO GENE ACTIVITIES BY TETRACYCLINE VIA A BIDIRECTIONAL PROMOTER", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, OXFORD UNIVERSITY PRESS, SURREY, GB, vol. 23, no. 17, 11 September 1995 (1995-09-11), pages 3605-3606, XP000775822, ISSN: 0305-1048, page 3605, left-hand column, paragraph 2; figure 1 * |
| MANNING W.C. ET AL.: "INSERTIONAL MUTAGENESIS OF THE MURINE CYTOMEGALOVIRUS GENOME ONE PROMINENT ALPHA GENE IE2 IS DISPENSABLE FOR GROWTH", VIROLOGY, vol. 167, no. 2, 1988, pages 477-484, XP008020484, ISSN: 0042-6822, page 481, right-hand column, paragraph 2 - page 480, right-hand column, paragraph 2 - page 481, left-hand column, paragraph 1; figure 6 * |
| URABE M. ET AL.: "A novel dicistronic AAV vector using a short IRES segment derived from hepatitis C virus genome", GENE: AN INTERNATIONAL JOURNAL ON GENES AND GENOMES, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS, BARKING, GB, vol. 200, no. 1-2, 24 October 1997 (1997-10-24), pages 157-162, XP004126490, ISSN: 0378-1119, figure 1 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2699715C2 (ru) * | 2014-05-19 | 2019-09-09 | Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг | Способ получения полипептидов |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA010096B1 (ru) | Экспрессирующие векторы, содержащие ie2-промотор mcmv | |
| EP1105507B1 (en) | Overexpression of desired proteins in eukaryotic cells mediated by cyclin d1 overexpression | |
| US20170183649A1 (en) | Method for identifying a subpopulation of mammalian cells with distinctive ribosome translation profiles | |
| EP1819812B1 (en) | The lupac bifunctional marker and its use in protein production | |
| CN105255895A (zh) | 用于真核细胞系的提高蛋白表达水平的mar转录调控元件及其表达系统 | |
| CN107164527A (zh) | 一种筛选参与多能干细胞体外定向分化调节因子的方法 | |
| CN115176016B (zh) | 增强的表达系统及其使用方法 | |
| CN110938656B (zh) | 重组表达大熊猫促卵泡生成素的载体、表达系统及制备方法 | |
| JP6384685B2 (ja) | 組換えタンパク質の発現増進のための遺伝子断片を含むベクター及びその用途 | |
| CN109790539A (zh) | Hspa5基因的启动子 | |
| RU2502798C2 (ru) | КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ huFSHIK, СЕКРЕТИРУЮЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ ФСГ | |
| CN111718929B (zh) | 利用环形rna进行蛋白翻译及其应用 | |
| KR101971614B1 (ko) | 목적 단백질의 생산이 증가된 세포주 및 이를 이용한 목적 단백질 생산 방법 | |
| US8367404B2 (en) | Chimeral internal ribosomal entry site sequence and uses thereof | |
| Zucchetti | Transposon based technology in DHFR knockout CHO cell line improves generation of AMH high producing clones for industrial applications | |
| Zhang et al. | Developmental stage-related expression and identification of murine erythroid differentiation-denucleation factor (MEDDF) | |
| Class et al. | Patent application title: Expression System With Sar Element From IFNalpha2 Inventors: Yves Durocher (Montreal, CA) Assignees: NATIONAL RESEARCH COUNCIL OF CANADA | |
| US20020123092A1 (en) | Regulatory elements from RP1 gene and uses thereof | |
| CN105400812A (zh) | 一种猪流行腹泻蛋白重组质粒及其制备方法与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC1A | Registration of transfer to a eurasian application by force of assignment | ||
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM |
|
| PD4A | Registration of transfer of a eurasian patent in accordance with the succession in title |