KR101864581B1 - 양방향 프로모터를 포함하는 렌티바이러스 발현 벡터 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 양방향 프로모터를 포함하는 렌티바이러스 발현 벡터 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로는 양방향 프로머터와 두 종류의 리포터를 포함하는 렌티 바이러스 발현 벡터 및 이를 이용한 표적 RNA 검출 및 소분자 저해제 스크리닝 용도에 관한 것이다.

Description

양방향 프로모터를 포함하는 렌티바이러스 발현 벡터 및 이의 용도{LENTIVIRAL EXPRESSION VECTOR CONTAINING BIDIRECTIONAL PROMOTERS AND USES THEREOF}

본 발명은 양방향 프로모터를 포함하는 렌티바이러스 발현 벡터 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로는 양방향 프로머터와 두 종류의 리포터를 포함하는 렌티 바이러스 발현 벡터 및 이를 이용한 표적 RNA 검출 및 소분자 저해제 스크리닝 용도에 관한 것이다.

마이크로RNA, long non-coding RNA, 바이러스 RNA 등과 같은 질환 RNA는 종양의 발생과 악성화, 정신병, 심장질환, 당뇨병등과 같은 다양한 인간의 질병과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있으나 유전체의 결손, 돌연변이 및 전사조절과 달리 전사후 조절 (post-transcriptional regulation)에 발생하여, 많은 부분이 미지의 영역이고 관련연구가 미흡한 실정이다.

질환 RNA의 발현수준에 따라 질환이 발생하거나 악성되는 것에 관련한 많은 연구 결과들이 있으며 질환 RNA를 조절하는 RNA결합-수식단백질의 중요성도 대두되고 있다. 따라서 고전적이고 통상적인 기존 분석방법을 떠나 질환 RNA의 발현-조절과정을 효율적이고 민감하게 계측하고 질환 RNA의 조절자들의 역할 용이하게 분석 해줄 수 있는 차세대 sensing 시스템이 현재 매우 절실하다.

기존 플라스미드, 레트로바이러스 기반 sensing 시스템은 많은 실험적 한계, 예를 들어, 리포터 전달이 어려운 세포, 분화종료로 더 이상 분열하지 않는 세포(신경세포), 특정 프로모터의 발현이 저해되는 줄기세포, 동물 또는 인체유래 생체조직 등으로 인해 개발에 어려움을 겪고 있다.

미국공개특허 제2015-0159171호

본 발명은 상기 기재한 기존 시스템들의 한계를 극복하기 위한 것으로, 도출 결과의 용이한 정량화를 위해 양방향 프로모터를 채용하고, 다양한 질환 RNA 표적 element들을 삽입할 수 있도록 카세트화한 고감도-고효율 질환 RNA 표적 렌티바이러스 센서를 개발하고, 질환RNA 질병의 소분자 저해제 스크리닝을 대규모-조직적으로 수행하여 아직까지 의생명과학의 미지의 영역으로 남아있는 RNA 의존적 질환의 궁극적 이해와 해결책을 마련하고자 한다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 CMV 게놈의 제1 프로모터 및 PGK 게놈의 제2 프로모터를 포함하며, 제1 프로모터 및 제2 프로모터에 각각 작동가능하게 연결된 제1 리포터 및 제2 리포터를 포함하는, 렌티바이러스 유래 발현 벡터를 제공한다. 구체적으로, 상기 리포터는 제1 리포터로서 제1 프로모터에 작동가능하게 연결된 반딧불이 루시페라아제(firefly luciferase) 및 제2 리포터로서 제2 프로모터에 작동가능하게 연결된 레닐라 루시페라아제(Renilla luciferase)일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 벡터는 상기 제1 리포터와 작동가능하게 연결된 표적 RNA가 부착할 수 있는 타겟 사이트를 포함하며, 표적 RNA는 질환의 RNA일 수 있다. 상기 표적 RNA는 암, 암 전이, 심장마비, 알츠하이머병, 류마티스 관절염, 정신분열증, 자폐증, O형 간염 바이러스 유래 간암, 구제역, 신경질환유도 수족구, SMA(근육위축증), 정신지체, 샤르코마리투드병(Charcot-Marie-Tooth disease), 선천성 이상각화증(Dyskeratosis congenita) 등의 질병에서 검출될 수 있는 RNA일 수 있고, 구체적으로는 miR-21일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 벡터는 서열번호 6의 서열을 가질 수 있으며, 도 1에 개시된 개열 지도에 도시된 바와 같을 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 렌티바이러스 유래 발현 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다. 상기 형질전환된 세포는 본 분야에서 사용되는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있으며, 예를 들어 293FT 세포일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 렌티바이러스 유래 발현 벡터를 이용하여 검체에서 표적 RNA를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 검체는 질병을 진단하고자 하는 개체로부터 수득될 수 있는 체액, 타액, 혈액, 소변, 세포 등일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 표적 RNA는 질병 RNA일 수 있으며, 예를 들어 miR-21일 수 있다. 상기 질병은 암, 암 전이, 심장마비, 알츠하이머병, 류마티스 관절염, 정신분열증, 자폐증, O형 간염 바이러스 유래 간암, 구제역, 신경질환유도 수족구, SMA(근육위축증), 정신지체, 샤르코마리투드병(Charcot-Marie-Tooth disease), 선천성 이상각화증(Dyskeratosis congenita) 등일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 표적 RNA의 발현이 낮을 경우 형광이 발현되고, 상기 표적 RNA의 발현이 높을 경우, 즉 상기 표적 RNA가 존재할 경우 형광이 ?칭되어, 표적 RNA를 검출할 수 있다.

나아가, 본 발명은 상기 렌티바이러스 유래 발현 벡터를 이용하여 소분자 저해제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 소분자 저해제는 질환 RNA의 소분자 저해제로서, 후보 물질이 표적 질환 RNA를 저해할 경우 상기 표적 RNA의 발현이 낮아져 형광이 발현되는 것을 확인하여, 소분자 저해제를 스크리닝할 수 있다.

본 발명의 벡터는 양방향 프로모터를 도입하여 단독적인 유전자 전달방식에 비해 두 종류의 원하는 transgene을 동시 다발적으로, 간섭을 최소화하면서 발현시킬 수 있으며, 또한 두 종류의 유전자를 양방향, 한 유닛에서 발현시키므로 리포터 활성에 대한 표준화가 매우 용이한 장점이 있다.

본 발명의 양방향 프로모터인 CMV, hPGK 프로모터의 경우 배아줄기 및 배아유래암세포에서 전사억제 현상이 낮은 것으로 알려져 있으며 리포터(센서)의 높은 발현을 보장할 수 있다.

또한, 세포기반의 질환 RNA sensing assay를 수행하는 경우 분비 luciferase 형태로 sensing 리포터를 교체하여 세포를 희생하지 않고 세포배양배지에 배출된 luciferase 활성을 용이하게 검출할 수 있다.

도 1의 본 발명의 일 구현예에 따른 렌티바이러스 발현 벡터의 개열 지도 및 이의 작용 및 적용 예를 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 렌티바이러스 발현 벡터의 뇌종양 줄기세포 적용 구성을 도시한 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 gel extraction의 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 pLJ-Duo의 Infusion 및 transformation 조건을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 pLJ-Duo의 Colony PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 pLJ-Duo의 효소 컷팅 조건을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 miR21 표적서열의 어닐링 조건을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 miR21 표적서열의 pLJ-Duo 삽입 조건을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 pLJ-Duo의 Colony PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 렌티바이러스 발현 벡터의 dual luciferase assay 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 렌티바이러스 발현 벡터의 small RNA northern blot 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 렌티바이러스 발현 벡터의 dual luciferase assay 결과를 나타낸 것이다.

본 발명의 렌티바이러스 유래 발현 벡터는 두 종류의 리포터 (1차 센서, 반딧불이 luciferase; 2차 센서, Renilla luciferase)를 cytomegalovirus (CMV) 및 인간 phosphoglycerate kinase (hPGK) 프로모터의 양방향 프로모터의 영향 하에 반대방향으로 배열하여 각 리포터 전사체가 생체 내에서 전사간섭 없이 발현할 수 있도록 디자인되었다.

상기 양방향 프로모터는 단독적인 유전자 전달방식에 비해 두 종류의 원하는transgene을 동시다발적으로, 간섭을 최소화하면서 발현시킬 수 있으며, 또한 두 종류의 유전자를 양방향, 한 유닛에서 발현시키므로 리포터 활성에 대한 표준화가 매우 용이하다. CMV 및 hPGK 프로모터의 경우 배아줄기 및 배아유래암세포에서 전사억제 현상이 낮은 것으로 알려져 있으며 리포터(센서)의 높은 발현을 보장한다.

본 발명에 따른 렌티바이러스 발현 벡터는 도 1에 도시된 바와 같이 제조될 수 있으며, RNA의 발현이 낮을 경우 형광이 발현되고, 상기 표적 RNA의 발현이 높을 경우, 즉 상기 표적 RNA가 존재할 경우 형광이 ?칭된다.

본 발명의 양방향 프로모터 렌티바이러스 발현 벡터는 질환 RNA 센서로서 사용될 수 있다.

우선, 본 발명의 양방향 프로모터 렌티바이러스 기반 센서에 대한 바이러스 입자를 제작하고 이를 목적으로 하는 세포주나 조직에 감염을 유도한다. 필요에 따라 puromycin 또는 blasticidin S 처리를 통해 센서를 효율적으로 발현하는 세포주를 확립할 수도 있다. Dual luciferase assay kit을 이용하여 렌티바이러스 센서가 감염된 세포주에 대해서 각각의 luciferase 수치를 정량적으로 계측하여 정확한 작동유무나 센서의 발현 정도를 모니터링할 수 있다.

또한, 본 발명의 양방향 프로모터 렌티바이러스 발현 벡터에 다양한 질병 RNA 표적서열을 삽입함으로써 질환 RNA 센서 카세트를 구성할 수 있다.

질환 마이크로RNA의 경우 반딧불이 luciferase 3'UTR 영역에 반복되는 마이크로RNA 표적서열의 완벽 상보적 결합형태[(표적서열-간극)n]로 반복 삽입한다. 일반적으로 표적서열은 n=2 이상이면 센서의 번역을 완벽히 저해하는 것으로 알려져 있다. 따라서 n=2, 3, 4, 5, 6, 7, 8등에 대해 sensing 효율을 검증하고 최적서열을 확정할 수 있다 (예: 종양마이크로RNA-21, n=5).

생체 내에서 일반적으로 마이크로RNA는 완벽 상보적 결합에 의한 것이 아닌 불완전 상보결합에 의해 작동하므로 특정유전자의 마이크로 RNA의 표적서열 부위를 센서의 3'UTR 영역에 삽입하여 세포 내에서 센서의 작용 여부를 조사할 수 있다.

또한 질환 RNA를 조절하는 질환 RNA 결합-수식단백질에 대한 인식-표적서열을 삽입하여 센서의 민감도를 계측할 수 있다[예: AU-rich element; AUUUA 반복서열, cytoplasmic poly-adenylation element (CPE); UUUUUA1-2U 등].

구체적으로, 반딧불이 luciferase 5' 끝의 제한효소 자리(BamHI)를 이용하여 질환 RNA의 전구체 서열(예: 종양마이크로RNA-21의 전구체 서열), 특정 바이러스의 5' controlling element (예: hepatitis C virus internal ribosomal entry site) 등을 삽입하여 질환 RNA를 조절하는 질환 RNA결합-수식단백질에 대한 반응을 매우 민감하게 조사할 수 있다. 예를 들어, 도 2에 도시된 바와 같이, 종양 마이크로RNA-21(miR-21) 검출을 위해 pLJ-Duo 시스템으로 형성된 본 발명의 렌티바이러스 발현 벡터를 이용하여 환자유래 뇌종양줄기세포에 적용함으로써 효과적으로 뇌종양 관련 RNA를 검출할 수 있다.

다양한 질병 RNA 표적 서열이 삽입된 렌티바이러스 발현 벡터 센서는, 예를 들어, 마이크로RNA의 반복 표적서열을 반딧불이 luciferase 3'UTR에 삽입한 센서를 고안한 경우 마이크로RNA의 발현에 따라 luciferase의 번역과정이 전사후 수준에서 조절되며, 마이크로RNA의 낮을 경우 센서가 켜지고 높을 경우 센서가 꺼지는 원리에 의해 작동한다.

많은 종류의 cytokine이나 원암유전자(proto-oncogene)의 경우 3'UTR 영역에 다수의AU-rich element가 관찰되며 여기에 다양한 종류의 RNA결합단백질이 결합하여 mRNA의 안정성을 조절한다. 따라서3'UTR 카세트에 다양한 신호전달과정에 반응하는 주요 cytokine과 원암유전자의 AU-rich element를 삽입하여 mRNA의 안정성 조절 여부를 매우 민감하게 조사할 수 있다.

Cytoplasmic polyadenylation 현상은 핵 mRNA polyadenylation과 별개로 신경세포, 초기발생, 암화과정에서 매우 중요하다. 특정 유전자의 CPE 서열을 반딧불이 luciferase 의 3'UTR 영역에 삽입하여 polyadenylation이 증대되면 luciferase의 활성이 증대되고, polyadenylation이 감소하면 활성이 감소되는지 여부를 매우 민감하게 조사할 수 있다.

본 발명의 렌티바이러스 발현 벡터 센서는 리포터 유닛 변경을 통해 sensing의 기능을 확장할 수 있다.

예를 들어, 생체발광(bioluminescence)기반의 sensing 리포터가 아닌 enhanced green florescence단백질로 리포터를 변경하여, 질환환경에 따른 질환 RNA 또는 질환 RNA의 조절자들의 생체 내 기능을 가시화하고 실시간으로 sensing 여부를 민감하게 조사할 수 있다.

또한, 세포기반의 질환 RNA sensing assay를 수행하는 경우 secreted luciferase 형태로 sensing 리포터를 교체하여 세포를 희생하지 않고 세포배양배지에 배출된 luciferase 활성을 용이하게 검출할 수 있다.

본 발명의 렌티바이러스 발현 벡터는 동물 질환모델에서 분자영상 기법을 통한 질환의 RNA sensing의 용도로서 확장될 수 있다.

구체적으로, 분자영상기법을 이용 생쥐와 같은 소동물의 렌티바이러스 센서가 감염된 암세포주의 xenograft와 생체발광을 통해 암의 증식, 전이 등의 연구에 있어 높은 민감도와 활성으로 분석을 실시할 수 있다.

또한, 본 발명의 렌티바이러스 발현 벡터는 임상 기검증 소분자 저해제 라이브러리 (LOPAC®1280, SCREEN-WELL® FDA approved drug library 등) 스크리닝을 통한 RNA 질병증 적용 및 신규 발굴 약물의 repositioning의 용도로서 사용될 수 있으며, 소분자 저해제 라이브러리 대단위 분석을 통한 신규 RNA 질병증 적용가능 선도물질 발굴에도 적용될 수 있다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예들은 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

제조예 1

pLJ-Duo는 일련의 단계에 의해 구성하였다. 우선, pLenti6/V5-DEST(Life Technologies)의 유도체로서, 게이트웨이 엔트리(gateway entry) 영역을 제거하여 pLJ를 제작하기 위해 EcoRI-XhoI로 절제했다. 상보적인 올리고머의 쌍(서열번호 1 및 2)을 annealing시키고 EcoRI-XhoI 절제된 pLenti6/V5-DEST 내로 삽입시켰다. pGL3-con(Promega)을 갖는 반딧불이 루시페라아제를 pfu-x를 사용하여 PCR 증폭하여 반딧불이 루시페라아제 사이토메갈로바이러스 프로모터(firefly luciferase cytomegalovirus promoter)-의존 방식으로 발현하는 pLJ-Fluc를 구성하였다. 완성된 pLJ-Fluc를 KflI과 ClaI을 차례로 반응시키고 (도 3 ①), pLKO.1puro에서 hPGK 영역을 그리고 pRL-TK(Promega)에서 레닐라 루시페라아제(Renilla luciferase)부분을 pfu-x를 사용하여 PCR 증폭하고 연결하여 제작된 ~1.4kb PCR 산물hPGK-Rluc을 DpnI으로 반응시키고 겔 정제하였다(도 3의 ②). 정제된 pLJ-Fluc (KflI과 ClaI이 처리됨)와 hPGK-Rluc PCR 단편을 도 4에 도시된 바와 같이 제조된 InFusion 반응을 진행하여 pLJ-Duo를 구성하였다. Colony PCR 결과는 도 5에 도시된 바와 같다.

pLJ-Duo-5xmiR-21 표적의 구성을 위해 도 6에 기재된 조건에 따라 제한효소 처리를 하고, 상보적 올리고머의 쌍(서열번호 3 및 4)을 도 7에 기재된 조건에 따라 어닐링한 후 EcoRI-XhoI 절제된 pLJ-Duo 내로 삽입시켰다.(도 8 및 9) EcoRI-XhoI 절제된 pLJ-Duo은 도 6에 도시된 조건에 따라 제조하였다.

실시예 1

종양 마이크로RNA-21의 5개의 반복되는 표적서열(GAATTC TGTCAACATCAGTCTGATAAGCTATGTCAACATCAGTCTGATAAGCTATGTCAACATCAGTCTGATAAGCTATGTCAACATCAGTCTGATAAGCTATGTCAACATCAGTCTGATAAGCTA CTCGAG: 서열번호 5)이 없는 렌티바이러스 발현 벡터(pLJ-Duo)와 이를 보유하고 있는 construct의 렌티바이러스(pLJ-Duo-5xmiR-21)를 제조예 1에서와 같이 제작하였다. 그런 다음 악성뇌종양 세포주인 U87MG와 췌장암세포주인 Panc-1에 감염시킨 뒤 dual luciferase assay를 수행하여 상대적인 활성을 비교하고, 그 결과를 도 10에 나타냈다. 도 10에서 볼 수 있는 바와 같이, 표적서열을 갖는 렌티바이러스 발현 벡터가 악성뇌종양 세포 및 줴장암 세포의 존재시 루시페라아제 형광이 낮은 반면, 표적서열이 없는 렌티바이러스 발현 벡터는 높은 루시페라아제 형광 활성을 나타내는 것으로, 이로부터 본 발명에 따른 표적서열을 갖는 렌티바이러스 발현 벡터가 효과적으로 암세포의 존재를 감지하는 센서로서 작용할 수 있음을 확인할 수 있었다.

그런 다음, 췌장암 세포주들 및 IMM(불멸화된 pancreatic cell line)에서 종양 마이크로RNA-21의 발현수준을 small RNA northern blot을 통해 확인하고 그 결과를 도 11에 나타냈다. 도 11에서 볼 수 있는 바와 같이, 췌장암 세포주들에서 종양 마이크로RNA-21이 다량 발현함을 확인할 수 있었으며, 본 발명의 렌티바이러스 발현 벡터의 표적 서열이 이러한 다량 발현된 종양 마이크로RNA-21에 결합함으로써 암을 효과적으로 진단할 수 있음을 예상할 수 있다.

실시예 2

pLJDuo-5xmiR-21 센서를 포함하고 있는 construct의 렌티바이러스를 제조예1에서와 같이 제작한 뒤 췌장암세포주인 Panc-1에 감염시키고 여기에 기존 보고 [Brain. 2015 Sep;138(Pt 9):2553-70.]에서 종양마이크로 RNA-21 생합성을 저해하는 것으로 알려진 ivermectin을 처리하고 dual luciferase assay를 수행하여 상대적인 활성을 비교하였다(도 12 참조). 도 12에서 볼 수 있는 바와 같이, 저해하는 것으로 알려진 ivermectin의 처리시 종양마이크로 RNA-21 생합성이 저해되어 본 발명의 렌티바이러스 발현 벡터 센서의 루시페라아제 형광이 발광되는 것을 확인할 수 있다. 이러한 결과로부터, 종양마이크로 RNA-21을 저해함으로써 항암 효과를 나타낼 수 있는 항암제의 스크리닝에 본 발명의 렌티바이러스 발현 벡터를 사용할 수 있음을 확인할 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> NATIONAL CANCER CENTER <120> LENTIVIRAL EXPRESSION VECTOR CONTAINING BIDIRECTIONAL PROMOTERS AND USES THEREOF <130> PN1610-379 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pLenti6-MCS-F <400> 1 aattcgctag ctgcagtcga ctgtacac 28 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pLenti6-MCS-R <400> 2 tcgagtgtac agtcgactgc agctagcg 28 <210> 3 <211> 126 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5x_miR-21_target-F <400> 3 aattctgtca acatcagtct gataagctat gtcaacatca gtctgataag ctatgtcaac 60 atcagtctga taagctatgt caacatcagt ctgataagct atgtcaacat cagtctgata 120 agctac 126 <210> 4 <211> 126 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5x_miR-21_target-R <400> 4 tcgagtagct tatcagactg atgttgacat agcttatcag actgatgttg acatagctta 60 tcagactgat gttgacatag cttatcagac tgatgttgac atagcttatc agactgatgt 120 tgacag 126 <210> 5 <211> 132 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-21_target <400> 5 gaattctgtc aacatcagtc 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caaacaagca ccccaatcat ggccgacaaa aatgatcttc 2400 tttggtaaat taagaagttc aaaccatgca gtaagatatt tgtaatgatc aagtaaccta 2460 taagaaccat taccagattt gcctgatttg cccataccaa taaggtctgg tataatacac 2520 cgcgctactg gctcaatatg tggcacaaca tgtcgccata aataagaaga ggccgcgtta 2580 ccatgtaaaa aaataacagc attttctgca tgtttttctg aatcataata attaataaat 2640 gaatcaagaa cattcatttg tttacatctg gcccaccact gcggaccagt tatcatccgt 2700 ttcctttgtt ctggatcata aactttcgaa gtcatggtgg ctagcctata gtgagtcgta 2760 ttagatcccc ctggggagag aggtcggtga ttcggtcaac gagggagccg actgccgacg 2820 tgcgctccgg aggcttgcag aatgcggaac accgcgcggg caggaacagg gcccacacta 2880 ccgccccaca ccccgcctcc cgcaccgccc cttcccggcc gctgctctcg gcgcgccctg 2940 ctgagcagcc gctattggcc acagcccatc gcggtcggcg cgctgccatt gctccctggc 3000 gctgtccgtc tgcgagggta ctagtgagac gtgcggcttc cgtttgtcac gtccggcacg 3060 ccgcgaaccg caaggaacct tcccgactta ggggcggagc aggaagcgtc gccggggggc 3120 ccacaagggt agcggcgaag atccgggtga cgctgcgaac ggacgtgaag aatgtgcgag 3180 acccagggtc ggcgccgctg cgtttcccgg aaccacgccc agagcagccg cgtccctgcg 3240 caaacccagg gctgccttgg aaaaggcgca accccaaccc cctcgaatcg ataagcttgg 3300 gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc 3360 cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat 3420 tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat 3480 catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat 3540 gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc 3600 gctattacca tggtgatgcg gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac 3660 tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa 3720 aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca aatgggcggt 3780 aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc agagctcgtt tagtgaaccg tcagatcgcc 3840 tggagacgcc atccacgctg ttttgacctc catagaagac accgactcta gaggatccgc 3900 caccatggaa gacgccaaaa acataaagaa aggcccggcg ccattctatc cgctggaaga 3960 tggaaccgct ggagagcaac tgcataaggc tatgaagaga tacgccctgg ttcctggaac 4020 aattgctttt acagatgcac atatcgaggt ggacatcact tacgctgagt acttcgaaat 4080 gtccgttcgg ttggcagaag ctatgaaacg atatgggctg aatacaaatc acagaatcgt 4140 cgtatgcagt gaaaactctc ttcaattctt tatgccggtg ttgggcgcgt tatttatcgg 4200 agttgcagtt gcgcccgcga acgacattta taatgaacgt gaattgctca acagtatggg 4260 catttcgcag cctaccgtgg tgttcgtttc caaaaagggg ttgcaaaaaa ttttgaacgt 4320 gcaaaaaaag ctcccaatca tccaaaaaat tattatcatg gattctaaaa cggattacca 4380 gggatttcag tcgatgtaca cgttcgtcac atctcatcta cctcccggtt ttaatgaata 4440 cgattttgtg ccagagtcct tcgataggga caagacaatt gcactgatca tgaactcctc 4500 tggatctact ggtctgccta aaggtgtcgc tctgcctcat agaactgcct gcgtgagatt 4560 ctcgcatgcc agagatccta tttttggcaa tcaaatcatt ccggatactg cgattttaag 4620 tgttgttcca ttccatcacg gttttggaat gtttactaca ctcggatatt tgatatgtgg 4680 atttcgagtc gtcttaatgt atagatttga agaagagctg tttctgagga gccttcagga 4740 ttacaagatt caaagtgcgc tgctggtgcc aaccctattc tccttcttcg ccaaaagcac 4800 tctgattgac aaatacgatt tatctaattt acacgaaatt gcttctggtg gcgctcccct 4860 ctctaaggaa gtcggggaag cggttgccaa gaggttccat ctgccaggta tcaggcaagg 4920 atatgggctc actgagacta catcagctat tctgattaca cccgaggggg atgataaacc 4980 gggcgcggtc ggtaaagttg ttccattttt tgaagcgaag gttgtggatc tggataccgg 5040 gaaaacgctg ggcgttaatc aaagaggcga actgtgtgtg agaggtccta tgattatgtc 5100 cggttatgta aacaatccgg aagcgaccaa cgccttgatt gacaaggatg gatggctaca 5160 ttctggagac atagcttact gggacgaaga cgaacacttc ttcatcgttg accgcctgaa 5220 gtctctgatt aagtacaaag gctatcaggt ggctcccgct gaattggaat ccatcttgct 5280 ccaacacccc aacatcttcg acgcaggtgt cgcaggtctt cccgacgatg acgccggtga 5340 acttcccgcc gccgttgttg ttttggagca cggaaagacg atgacggaaa aagagatcgt 5400 ggattacgtc gccagtcaag taacaaccgc gaaaaagttg cgcggaggag ttgtgtttgt 5460 ggacgaagta ccgaaaggtc ttaccggaaa actcgacgca agaaaaatca gagagatcct 5520 cataaaggcc aagaagggcg gaaagatcgc cgtgtaaact agtccagtgt ggtggaattc 5580 gctagctgca gtcgactgta cactcgagtc tagagggccc gcggttcgaa ggtaagccta 5640 tccctaaccc tctcctcggt ctcgattcta cgcgtaccgg ttagtaatga gtttggaatt 5700 aattctgtgg aatgtgtgtc agttagggtg tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag 5760 aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccagg tgtggaaagt ccccaggctc 5820 cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca tagtcccgcc 5880 cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc cgccccatgg 5940 ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc tctgcctctg agctattcca 6000 gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct aggcttttgc aaaaagctcc cgggagcttg 6060 tatatccatt ttcggatctg atcagcacgt gttgacaatt aatcatcggc atagtatatc 6120 ggcatagtat aatacgacaa ggtgaggaac taaaccatgg ccaagccttt gtctcaagaa 6180 gaatccaccc tcattgaaag agcaacggct acaatcaaca gcatccccat ctctgaagac 6240 tacagcgtcg ccagcgcagc tctctctagc gacggccgca tcttcactgg tgtcaatgta 6300 tatcatttta ctgggggacc ttgtgcagaa ctcgtggtgc tgggcactgc tgctgctgcg 6360 gcagctggca acctgacttg tatcgtcgcg atcggaaatg agaacagggg catcttgagc 6420 ccctgcggac ggtgccgaca ggtgcttctc gatctgcatc ctgggatcaa agccatagtg 6480 aaggacagtg atggacagcc gacggcagtt gggattcgtg aattgctgcc ctctggttat 6540 gtgtgggagg gctaagcaca attcgagctc ggtaccttta agaccaatga cttacaaggc 6600 agctgtagat cttagccact ttttaaaaga aaagggggga ctggaagggc taattcactc 6660 ccaacgaaga caagatctgc tttttgcttg tactgggtct ctctggttag accagatctg 6720 agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt aagcctcaat aaagcttgcc 6780 ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac tctggtaact agagatccct 6840 cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtagt agttcatgtc atcttattat 6900 tcagtattta taacttgcaa agaaatgaat atcagagagt gagaggaact tgtttattgc 6960 agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt 7020 ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctggct 7080 ctagctatcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat 7140 tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag aggccgaggc cgcctcggcc 7200 tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag gcctagggac gtacccaatt 7260 cgccctatag tgagtcgtat tacgcgcgct cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact 7320 gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc acatccccct ttcgccagct 7380 ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg 7440 gcgaatggga cgcgccctgt agcggcgcat taagcgcggc gggtgtggtg gttacgcgca 7500 gcgtgaccgc tacacttgcc agcgccctag cgcccgctcc tttcgctttc ttcccttcct 7560 ttctcgccac gttcgccggc tttccccgtc aagctctaaa tcgggggctc cctttagggt 7620 tccgatttag tgctttacgg cacctcgacc ccaaaaaact tgattagggt gatggttcac 7680 gtagtgggcc atcgccctga tagacggttt ttcgcccttt gacgttggag tccacgttct 7740 ttaatagtgg actcttgttc caaactggaa caacactcaa ccctatctcg gtctattctt 7800 ttgatttata agggattttg ccgatttcgg cctattggtt aaaaaatgag ctgatttaac 7860 aaaaatttaa cgcgaatttt aacaaaatat taacgcttac aatttaggtg gcacttttcg 7920 gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc 7980 gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag 8040 tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt 8100 tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt 8160 gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga 8220 acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat 8280 tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga 8340 gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag 8400 tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg 8460 accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg 8520 ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt 8580 agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg 8640 gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc 8700 ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg 8760 tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac 8820 ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact 8880 gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga ttgatttaaa 8940 acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa 9000 aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg 9060 atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc 9120 gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac 9180 tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca 9240 ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt 9300 ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc 9360 ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg 9420 aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc 9480 cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac 9540 gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct 9600 ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc 9660 cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt 9720 tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac 9780 cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg 9840 cccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca gctggcacga 9900 caggtttccc gactggaaag cgggcagtga gcgcaacgca attaatgtga gttagctcac 9960 tcattaggca ccccaggctt tacactttat gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt 10020 gagcggataa caatttcaca caggaaacag ctatgaccat gattacgcca agcgcgcaat 10080 taaccctcac taaagggaac aaaagctgga gctgcaagct t 10121

Claims (9)

1. CMV 게놈의 제1 프로모터 및 PGK 게놈의 제2 프로모터를 포함하며, 제1 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1 리포터 및 제2 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2 리포터를 포함하는, 서열번호 6의 서열을 갖는 렌티바이러스 유래 발현 벡터.
2. 제1항에 있어서,
   상기 제1 리포터는 상기 제1 프로모터에 작동가능하게 연결된 반딧불이 루시페라아제(firefly luciferase)이고, 상기 제2 리포터는 제2 프로모터에 작동가능하게 연결된 레닐라 루시페라아제(Renilla luciferase)인 것인 렌티바이러스 유래 발현 벡터.
3. 제1항에 있어서,
   상기 벡터는 상기 제1 리포터와 작동가능하게 연결된 표적 RNA가 부착할 수 있는 타겟 사이트를 포함하는 것인 렌티바이러스 유래 발현 벡터.
4. 삭제
5. 제1항에 있어서,
   도 1에 개시된 개열 지도를 갖는 렌티바이러스 유래 발현 벡터.
6. 제1항 내지 제3항, 제5항 중 어느 한 항의 렌티바이러스 유래 발현 벡터로 형질전환된 세포.
7. 제1항 내지 제3항, 제5항 중 어느 한 항의 렌티바이러스 유래 발현 벡터를 이용하여 검체에서 표적 RNA를 검출하는 방법.
8. 제7항에 있어서,
   표적 RNA의 존재시 형광이 ?칭되는 것인 방법.
9. 제1항 내지 제3항, 제5항 중 어느 한 항의 렌티바이러스 유래 발현 벡터를 이용하여 소분자 저해제를 스크리닝하는 방법.

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