CN107746857B - 一种抑制基因表达的rna干扰方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种抑制基因表达的RNA干扰方法，将目的基因的siRNA和含shRNA的质粒同时显微注射入目的基因所在的宿主细胞中。本发明进一步提供一种改良的抑制绵羊早期孤雌胚胎NLRP7基因表达的RNA干扰方法，是将NLRP7基因siRNA干扰片段和shRNA干扰质粒混合注射入成熟卵母细胞中，所述siRNA如SEQ ID NO.6‑7、8‑9和/或10‑11所示，所述shRNA如SEQ ID NO.14、16和/或18所示；孤雌激活后发现NLRP7基因敲降后的胚胎出现了发育异常，说明NLRP7是绵羊早期孤雌胚胎正常发育所需的关键基因。本发明方法为研究基因的功能提供了新的方法。

Description

一种抑制基因表达的RNA干扰方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及一种抑制基因表达的RNA干扰方法，具体地涉及一种特异性抑制NLRP7基因表达的RNA干扰方法。

背景技术

NLRs(Nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat containing)即NOD样受体家族，是生物体众多复杂的免疫识别系统之一，根据其结构域的不同又划分为好多亚家族，其中，将含有pyrin结构域的亚家族称为NLRP亚家族。NLRP基因家族首先在人身上被发现，共有十四个成员，分别命名为NLRP1-NLRP14。在灵长类动物上也有十四个成员，跟人的命名一样。相比与人的NLRP基因家族，小鼠的NLRP基因家族中没有NLRP7、NLRP8、NLRP11和NLRP13，但是NLRP1、NLRP4和NLRP9在进化的过程中发生了变化，又分别命名为NLRP1a、NLRP1b、NLRP1c、NLRP4a、NLRP4b、 NLRP4c、NLRP4d、NLRP4e、NLRP4f、NLRP4g、NLRP9a、NLRP9b、NLRP9c，总共有二十个成员。在大鼠中也没有7、8、11、13，但只有NLRP4和NLRP9发生了变化，和小鼠不同的是，大鼠没有NLRP4g和NLRP9c。研究表明，NLRP基因在哺乳动物进化之前存在并发生复制，有一部分基因比较保守，如NLRP3(人和小鼠的同源性为80％以上)，然而，还有许多基因进化迅速导致动物谱系间序列的差异，如NLRP5(人和小鼠同源性为50％左右)和NLRP14(人和小鼠同源性为60％左右)。此外，除了部分成员发生复制外，还有许多成员消失了，例如，NLRP8和NLRP13似乎在小鼠的进化过程中退化了。在大动物上，该基因家族的研究并不是很多，许多物种的基因序列在NCBI 上都是预测的，尽管并不是在所有的物种中都有NLRP家族成员，但NLRP的同源基因在生物的进化中是高度保守的。近年来，好多研究表明NLRP家族成员不止在免疫系统中发挥重要作用，还在哺乳动物生殖系统中发挥作用。巧合的是，NLRP基因家族的进化过程中，主要基因的复制和消失都与生殖相关，比如NLRP4(复制)、NLRP7(缺失)、 NLRP8(缺失)、NLRP9(复制)、NLRP11(缺失)、NLRP13(缺失)和NLRP14等，这说明与生殖相关的基因在不同物种的系统发生过程中发生了快速的趋异进化。近年来的研究显示，对于人类和猴子等灵长类动物来说，许多NLRP基因在其配子和早期胚胎中表达，这表明NLRP基因在胚胎附植前的发育过程中起着某种作用(McDanielP等， 2009)。繁殖相关的NLRP基因聚集在人19号染色体上，而对小鼠来说，则是聚集到7 号染色体上。

NLRP7(NACHT，Leucine-rich repeat and PYD containing 7)是NLRP蛋白家族中的一员。NLRP7拥有NLRP蛋白家族通常的结构域，比如亮氨酸重复域、NACHT结构域和Pyrin结构域，其位于人类19号染色体q13.42位置，小鼠身上没有该基因。对于 NLRP7的研究主要集中在人和猕猴等灵长类动物身上，大动物上很少有报道，因此，我们选择绵羊为实验对象来研究NLRP7的功能。

RNA干扰(RNA interference)技术是近年来常用的一种抑制靶基因表达的方法，采用19-23个碱基或发卡状不同长度的双链RNA可使不同类型细胞的靶基因表达明显降低。RNA干扰技术可以作为基因下调的一项有效技术手段来弥补敲除技术的不足，从而鉴定未知功能的基因转录本。在发育生物学领域，哺乳动物由卵母细胞到受精卵再到后代个体的整个发育过程具有极大的复杂性。因此，将RNA干扰技术应用于胚胎发育领域的研究将有助于深入地揭示调节胚胎发育过程中关键分子生物学的发生机理。在哺乳动物卵母细胞及胚胎中RNA干扰已经得到了广泛应用(Stein P等，2003；Cabot R.A 等，2003)。RNA干扰技术可以将目的基因特异、高效地下调，这一过程可以通过小干扰RNA(siRNA)以及短发夹RNA(shRNA)这两种类型小分子得以实现，siRNA是体外化学合成的双链小干扰RNA，shRNA是基于质粒的短发夹RNA。在胞内滞留时间方面，转染后48小时内，仅有部分siRNA滞留于胞内，大部分则被降解，而shRNA 则可以被宿主细胞持续的合成，所以其作用更为持久，但siRNA发挥作用的速度则相对较快，因为shRNA需要一定的时间来进行转录。

小鼠的体外受精卵发育到囊胚通常需要四天左右，对于小鼠早期胚胎中基因的敲降，人们往往选择siRNA，但对于大动物的早期胚胎来说，其在体外培养的时间则相对较长(七八天左右)，而普通的siRNA往往不能持续高效的降解靶基因，shRNA虽然作用持久但需要一定的时间转录，启动速度慢。因此，需要提供一种改良的RNA干扰方法快速、持续地将大动物早期胚胎中目的基因敲降以研究其功能。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性抑制绵羊NLRP7基因表达的RNA干扰方法。

实现上述目的的技术方案如下：从屠宰场采集绵羊的各个组织，将NCBI数据库中不同物种的预测序列及存在序列比对后找出保守区，设计引物，首先通过普通PCR鉴定NLRP7基因在绵羊身上是否存在，然后通过荧光定量PCR检测其不同组织中的相对表达量。结果发现NLRP7基因在绵羊身上存在，且仅在卵巢组织中高表达，但其在卵巢组织的哪些细胞中表达并不清楚，又通过将绵羊卵巢组织切片，进行免疫组化染色，确定了 NLRP7在绵羊卵巢组织中的定位情况，结果发现NLRP7仅存在于卵巢上的卵泡内，又以绵羊卵丘卵母细胞复合体为材料进行RT-PCR克隆出该基因的部分CDS区，分析发现其在不同物种间具有较高同源性。

本发明的影响动物早期胚胎发育的NLRP7基因，其具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列或与该核苷酸序列具有80％以上同源性的核苷酸序列。所述动物为偶蹄类动物，优选绵羊、山羊、牛。本发明提供了NLRP7基因在调节动物早期胚胎发育中的应用，所述 NLRP7基因具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列或与该核苷酸序列具有80％以上同源性的核苷酸序列。上述的应用，所述的动物为绵羊、山羊、牛。

本发明提供一种抑制基因表达的RNA干扰方法，将目的基因的siRNA和含shRNA 的质粒同时显微注射入目的基因所在的宿主细胞中。

进一步地，本发明提供的一种抑制NLRP7基因表达的RNA干扰方法，是将NLRP7 基因的siRNA和含shRNA的质粒同时显微注射入成熟卵母细胞。

所述NLRP7基因的siRNA包括以下3组siRNA中的一组或多组，3组siRNA核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6-7、8-9、10-11所示；

所述shRNA包括以下3组shRNA中的一组或多组，3组shRNA核苷酸序列分别如SEQID NO.14、16、18所示。

本发明提供一种抑制NLRP7基因表达的siRNA，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6-7、8-9和/或10-11所示。

本发明提供一种抑制NLRP7基因表达的shRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16和/或SEQ ID NO.18所示。

本发明提供的上述RNA干扰方法中，所述含shRNA的质粒的序列如SEQ ID NO15、17、19所示。

上述方法中，NLRP7基因的siRNA注射浓度为20μM，含shRNA的质粒浓度为1 μg/μl，注射剂量为10pL,siRNA和shRNA体积各为5pl。在进行显微注射时，为了减少对卵母细胞的机械和氧化损伤，在操作液中添加了10^-9mol/L的抗氧化剂Melatonin。

进而，本发明提供一种抑制NLRP7基因表达的siRNA，其核苷酸序列如SEQ IDNO.6-7、8-9和/或10-11所示。

本发明提供了上述siRNA在干扰NLRP7基因表达中的应用。

本发明提供一种抑制NLRP7基因表达的shRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16和/或SEQ ID NO.18所示。

本发明提供了上述shRNA在干扰NLRP7基因表达中的应用。

本发明通过一种改良的RNA干扰方法研究了在体外早期胚胎中将靶基因NLRP7敲降进而研究NLRP7基因在孤雌胚胎发育中的功能。本发明的实施例中，对绵羊成熟的卵母细胞进行显微注射NLRP7-siRNA和NLRP7-shRNA质粒，孤雌激活后进行体外培养，结果发现敲降NLRP7基因后的大部分胚胎出现了发育阻滞现象，而对照组则发育正常，这表明NLRP7基因对于绵羊早期孤雌胚胎发育十分关键。

本发明相对于现有技术具有如下优点及效果：(1)本发明最先在除灵长类以外的大动物身上系统研究了NLRP7基因，国内外文献未见相关报道。(2)根据大动物体外胚胎的发育特点，本发明最先将siRNA联合shRNA质粒进行显微注射敲降靶基因，既发挥了siRNA作用迅速的优点又发挥了shRNA作用持久的优点，国内外文献也未见相关报道。 (3)本发明提供的方法并不仅仅局限于NLRP7基因，还适用于其他基因的抑制表达；本发明的研究对象实例为小尾寒羊，但本发明并不仅仅适用于绵羊，还适用于其他大动物。本发明对于大动物早期胚胎发育的研究具有重要科学意义，可为人类葡萄胎疾病的研究提供新的参考。

附图说明

图1为绵羊不同组织中NLRP7基因PCR产物电泳结果。第1泳道至第14泳道分别为心脏、肝脏、脾、肾脏、胃、子宫、输卵管、睾丸、卵巢、胎盘、下丘脑、垂体、松果体、黄体。结果显示仅第九泳道跑出单一且明亮的条带。

图2为绵羊NLRP7和β-actin基因的扩增动力学曲线图。

图3为绵羊NLRP7和β-actin基因的熔解曲线图。图A、B为目的基因NLRP7的熔解曲线，图C、D为内参基因β-actin的熔解曲线。

图4为NLRP7mRNA在绵羊各组织中的表达情况。He心；Li肝脏；Sp脾；Ki肾脏；St胃；Ut子宫；Ovi输卵管；Te睾丸；Ov卵巢；Pla胎盘；Hyp下丘脑；Pin垂体；Pi松果体；CL黄体。

图5为NLRP7蛋白在绵羊卵巢各级卵泡中的表达定位情况。

图6为NLRP7基因克隆片段PCR产物凝胶电泳图。自左向右第1和4泳道为2000bpMarker，2、3泳道分别为COCs和无模板阴性对照组。

图7为NLRP7 shRNA干扰载体图谱，图7A-图7D分别是NLRP7-shRNA干扰载体 pHS-ASR-LJ031、pHS-ASR-LJ032、pHS-ASR-LJ033和阴性对照载体pHS-ASR-LJ006。

图8为半定量NLRP7基因敲降效率验证图。1-6泳道分别为：2细胞期Non-injected组、 2细胞期Nc-siRNA+shRNA组、2细胞期NLRP7-siRNA+shRNA组；8细胞期Non-injected组；8细胞期Nc-siRNA+shRNA组；8细胞期NLRP7-siRNA+shRNA组。

图9为定量NLRP7基因敲降效率验证图。

图10为体式显微镜下观察体外培养第七天各组胚胎发育情况。A为Non-injected组； B为Nc-shRNA+siRNA组；C为NLRP7-shRNA+siRNA组。

图11为体外培养第7天各组胚胎发育情况统计。

具体实施方式

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。本研究所用的实验材料取自河北省廊坊市大厂回族自治县屠宰场。采集3只成年小尾寒羊的心脏、肝脏、脾、肾脏、胃(瘤胃)、子宫、输卵管、睾丸(附睾头)、卵巢、胎盘(3月龄左右)、下丘脑、垂体、松果体、黄体等14种组织。

实施例1 NLRP7基因在绵羊各组织中的表达差异

1、不同组织中总RNA的提取

2、RNA的反转录RNA去除基因组，试剂盒PrimeScript^TMRT reagent Kit with gDNAEraser(Perfect Real Time)购自Takara公司。

3、引物的设计与合成本发明通过NCBI将已公布或预测的人、山羊、牛等动物NLRP7基因编码区序列与绵羊NLRP7的预测序列一起经DNAMAN软件比对后，找出其共有的保守部位，而后依据绵羊NLRP7预测序列的共有区域利用Primer Premier 5.0软件设计引物。引物由北京生工生物有限公司合成，引物序列如下:

正义链：5'-TGCTTACCGGGACTTCTGTC-3'(序列表中SEQ ID No：1)；

反义链：5'-CCACTGCCAAGTGGTGTCA-3'(序列表中SEQ ID No：2)；

β-actin：(登录号为NM_001009784.1)

正义链：5'-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT-3'

反义链：5'-GGGCAGTGATCTCTTTCTGC-3'

4、RT-PCR和实时荧光定量PCR

反应程序为：94℃，5min，1个循环；94℃，15s，58-60℃，15s，72℃，20s，40 个循环；72℃，5min，1个循环；4℃保存；使用2.0％琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测。Premix TaqVersion 2.0plus dye购自Takara公司。荧光定量PCR反应体系为：10μL

480SYBR Green I Master、1μL Primer-F、1μL Primer-R、2μL模板、6μL ddH2O；反应程序为：①预孵：95℃，10min,1个循环；②扩增：95℃，10s,60℃，10s,72℃， 10s,72℃，3min，45个循环；③绘制溶解曲线：95℃，5s,65℃，1min,97℃，40个循环；④冷却：40℃，10s，1个循环。PCR反应结束后检测观察曲线，是否呈单峰状，最后根据NLRP7和内参基因(β-ctin)的Ct值计算出目的基因的相对表达量。试剂盒

480SYBR Green I Master购自Roche公司。采用spass 21.0统计软件分别对实验数据进行单因素方差分析(ANOVA)，P<0.05认为数据是有显着性差异的，P<0.01认为数据差异极显着。均值的多重比较采用Duncan氏进行，结果用Means±SEM表示。

以反转录出的绵羊各组织cDNA为模板进行NLRP7基因和β-actin基因的PCR反应，凝胶电泳检测PCR产物并使用凝胶成像仪拍照，半定量结果如图1所示，扩增得到的目的片段大小为181bp，与设计所需片段大小一致。本实施例中绵羊NLRP7和β-actin基因 PCR产物的扩增动力学曲线如图2所示，从曲线上可以看出大部分样品基线平齐无上扬，拐点明显清晰，说明本实验具有较小系统误差，实验数据可信度及准确度较高。目的基因NLRP7与内参基因β-actin的熔解曲线如图3所示，曲线峰均显示为单一且唯一，表明 PCR不存在非特异性条带和引物二聚体，产物单一，引物特异性较好，试验数据定量准确，数据可用。

荧光定量PCR检测结果如图4所示，NLRP7mRNA在绵羊各个组织中的相对表达量分别为：心脏(1.32±1.12)、肝脏(0.59±0.30)、脾(0.28±0.21)、肾脏(0.28±0.17)、胃(1.96±1.96)、子宫(0.61±0.49)、输卵管(2.17±1.78)、睾丸(1.86±1.50)、胎盘(0.25±0.15)、下丘脑(0.61±0.35)、垂体(0.87±0.54)、松果体(0.39±0.17)、黄体(0.45±0.44)，而卵巢(7.75±3.73)表达量极显著高于其他组织(P＜0.01)。这说明只有卵巢组织特异性高表达NLRP7基因，其他组织表达十分微弱。

实施例2 NLRP7基因在绵羊卵巢内的表达定位与克隆

本实施例旨在通过免疫组织化学探明NLRP7蛋白在绵羊卵巢组织中的表达定位情况，同时，以绵羊卵丘卵母细胞体为材料，通过RT-PCR方法对绵羊NLRP7进行克隆。 1、石蜡切片的制备

2、免疫组织化学染色组化试剂盒购自中山金桥公司，货号PV-9001。免疫组化结果如图5所示，图中显示了位于卵巢皮质中的原始卵泡(A图)、初级卵泡(B图)、次级卵泡(C、D图)、三级卵泡(E、F图)、成熟卵泡(G图)，阴性对照(H图)，的染色情况，可见其中的各级卵母细胞的胞质深染棕黄色颗粒，围绕在卵母细胞周围的卵泡细胞也有阳性着色，基质细胞没有明显着色，阴性对照则无阳性染色，次级卵泡阳性着色较深，推测其在卵泡的成腔阶段表达量增多；结果表明，NLRP7蛋白主要定位于绵羊卵泡内并且在卵泡发育的各个阶段持续表达。

3、绵羊卵丘卵母细胞的获取绵羊卵巢来自河北省廊坊市大厂回族自治县屠宰场。常规方法获取绵羊卵丘卵母细胞。

4、克隆引物的设计与合成

正义链：5'-GCGATTGGGGTCTTGTTCTG-3'(序列表中SEQ ID No：3)；

反义链：5'-AGGATCTGGTTGTTCTGGCA-3'(序列表中SEQ ID No：4)；

5、RT-PCR PCR反应体系：25μL PrimeSTAR GXL DNA Polymerase、10μL 5×PrimeSTAR GXL Buffer、4μL dNTP Mixture(2.5mM each)、2μL Primer-F、2μL Primer-R、2μL模板、5μL ddH2O；PCR反应程序如下：98℃，5min，1个循环；98℃，15s，60℃， 15s，68℃，20s，35个循环；68℃，5min，1个循环；4℃保存。使用1.0％琼脂糖凝胶对 PCR产物进行电泳检测。采用的长链高保真酶

GXL DNA Polymerase购自 Takara公司，货号R050A。

6、常规方法进行PCR产物纯化、连接与转化。

以绵羊GV期卵丘卵母细胞复合体cDNA为模板进行RT-PCR扩增反应，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，并在凝胶成像仪下观测和拍照。结果显示：如图6所示，在800bp 左右条带处有单一清晰的亮带与预测产物大小结果一致。测序成功后，使用DNAMAN 软件比对所测绵羊NLRP7序列与NCBI上已公布(含预测序列)马、山羊、猕猴、人、牛和猪等多种动物的NLRP7序列，并进行同源性分析。结果显示，测序所得部分基因序列同山羊、牛、人、猕猴、猪、马的mRNA预测序列的相似性分别达到99％、96％、75％、 74％、87％和83％。由此可得，NLRP7基因在不同物种间具有较高的同源性。所得序列长度为763bp，结果如SEQ ID NO.5所示。

实施例3 NLRP7基因的敲降对绵羊早期胚胎发育的影响

RNA干扰通常采用siRNA，因其可短时间内快速发挥作用而被广泛应用，但由于siRNA容易降解，持续发挥作用的时间并不长，而绵羊早期胚胎发育通常要持续一周左右，普通的siRNA很难一直靶向降解mRNA，到了胚胎发育靠后阶段其效力大大降低，往往达不到持续敲降目的基因的效果，shRNA则可以被宿主细胞持续的合成而剪接为 siRNA，所以其具有持续时间长的特点，不足的是，shRNA干扰质粒进入宿主细胞后并不会立马发挥作用，而是需要一定的时间转录翻译，利用内源性的Dicer酶产生siRNA而后靶向降解目的基因mRNA。鉴于shRNA和siRNA各有优劣，因此，选择联合使用shRNA 和siRNA，既利用siRNA的快速发挥作用的优势，又利用shRNA持续作用时间长的优势，以确保其能够有效的降解目的基因mRNA从而达到基因敲降的目的。本发明利用改良的 RNA干扰技术结合显微注射将NLRP7基因敲降来研究其在胚胎发育中的功能。

下述实施例中siRNA由上海吉玛生物有限公司合成,shRNA载体及序列由北京合生基因公司合成。

1、抑制NLRP7基因表达的siRNA和shRNA的设计合成

根据绵羊NLRP7基因序列(SEQ ID NO.5)，借助Ambion公司在网上提供的siRNA 工具软件(https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/rnai.html)，参照siRNA设计原理，选择3个siRNA序列作为靶位点分别设计了3条合理的siRNA序列、一条阴性对照序列，分别命名为LOC101102259-Ovis-1464、LOC101102259-Ovis-2614、LOC101102259-Ovis-3602、Negative control。NLRP7的shRNA则根据Invitrogen在线网站(BLOCK-iT^TM RNAi Designer)进行设计，将得到的序列放进BLAST工具中进行严格的序列同源性比对，确保设计的干扰序列在绵羊基因组中靶标序列的唯一性。将设计出来的3条NLRP7 shRNA干扰序列分别连接到表达载体 pZDonor_Seq1-U6-hEF1a-EGFP-2A-Puro-Seq2上，并且用一个无意义的shRNA序列作为阴性对照，分别命名为pHS-ASR-LJ031、pHS-ASR-LJ032、pHS-ASR-LJ033、 pHS-ASR-LJ006。NLRP7 siRNA和shRNA序列如下：

LOC101102259-Ovis-1464：

正义链：5'-GGAAGUUUACUGAAGAGAATT-3'(序列表中SEQ ID No：6)

反义链：5'-UUCUCUUCAGUAAACUUCCTT-3'(序列表中SEQ ID No：7)

LOC101102259-Ovis-2614：

正义链：5'-GCUCUGUGCUCAGUUCAAATT-3'(序列表中SEQ ID No：8)

反义链：5'-UUUGAACUGAGCACAGAGCTT-3'(序列表中SEQ ID No：9)

LOC101102259-Ovis-3602：

正义链：5'-GGACAAAUCUACCGUGGAATT-3'(序列表中SEQ ID No：10)

反义链：5′-UUCCACGGUAGAUUUGUCCTT-3'(序列表中SEQ ID No：11)

Negative control：

正义链：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'(序列表中SEQ ID No：12)

反义链：5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'(序列表中SEQ ID No：13)

干扰载体名称：pHS-ASR-LJ031,

shRNA：5'-ACCGCAGGTAGGAAAGAAGATATTCGAAAATATCTTCTTTCCTAC-3' (SEQ ID No：14)；载体骨架为pZDonor_Seq1-U6-NLRP-7 shRNA001(NLRP-7Ovis aries 2504)-hEF1a-EGFP-2A-Puro-Seq2，载体序列为序列表中SEQ ID No：15。

干扰载体名称：pHS-ASR-LJ032，

shRNA：5'-ACCGCTGTCTTCTGCTTTGATTGTCGAAACAATCAAAGCAGAAG-3'(SEQ ID No：16)；载体骨架：pZDonor_Seq1-U6-NLRP-7 shRNA002(NLRP-7Ovis aries 3122)-hEF1a-EGFP-2A-Puro-Seq2，载体序列为序列表中SEQ ID No：17。

干扰载体名称：pHS-ASR-LJ033，

shRNA：5'-ACCGCACTGAGATATTTCTCTTACCGAAGTAAGAGAAATATCTCA-3'(序列表中SEQID No：18)；载体骨架：pZDonor_Seq1-U6-NLRP-7 shRNA003(NLRP-7Ovis aries 3728)-hEF1a-EGFP-2A-Puro-Seq2，载体序列为序列表中SEQ ID No：19。

阴性对照载体名称：pHS-ASR-LJ006，

shRNA：5'-ACCGTAATTGTCAAATCAGAGTGCTTCAAGAGAAAGCACTCTGAT-3'(序列表中SEQID No：20)；载体骨架：pZDonor_Seq1-U6-shRNA(FF5)-hEF1a-EGFP-2A-P uro-Seq2，载体序列为序列表中SEQ ID No：21。shRNA干扰载体图谱分别见图7A-图7D。 2、常规方法采集绵羊卵巢卵母细胞并体外培养卵母细胞成熟。

3、成熟卵母细胞的显微注射

实验分为三组，Non-injected(非注射组)、Nc-shRNA+siRNA(阴性对照注射组)、NLRP7-shRNA+siRNA(混合注射组)，每组50枚卵，实验重复四次。卵母细胞成熟后用1％透明质酸酶(Sigma)脱掉卵丘，在60mm的培养皿上，用移液器将含有7.5μg/mL 细胞松弛素B的体外操作液制成体积为10μL的显微注射滴，并将带有NLRP7 siRNA混合shRNA干扰载体及阴性对照制成体积为2μL的小滴，置于显微注射滴的右侧，覆盖石蜡油后放在38.5℃热台上预热，将MII期卵母细胞放入显微操作滴中；先将显微操作仪(Olympus IX-71,奥林巴斯，日本)的视野转到干扰滴中，使右侧注射针吸如；再将视野转回显微操作滴中，用左侧持卵针固定卵母细胞，注射针于3点钟方向刺入卵胞质中，匀速注入其中，待透明带明显胀大后撤出注射针，平均每个卵母细胞的注射时间为30 sec，siRNA注射浓度为20μM，干扰质粒注射浓度为1μg/μl，注射剂量约为10pL。注射后的MII期卵母细胞用操作液清洗三遍，放入成熟液中恢复30分钟，然后进行孤雌激活。 4、绵羊卵母细胞的孤雌激活及胚胎培养

对各组成熟卵母细胞用Ionomycin(离子霉素，Sigma)和6-DMAP(6-二甲基氨基嘌呤,Sigma)和Cycloheximide(放线菌酮,Sigma)联合进行化学孤雌激活。其具体方法为，将成熟的卵母细胞用0.2％透明质酸酶脱去卵丘细胞，再用发育液洗3次后置于含5 μmol/L离子霉素的发育液中处理5min；用发育液洗3次后，再将其置于含有2mmol/L 6-DMAP和10μg/mL CHX的发育中培养4h，激活后的胚胎用发育液洗3次后置于预先平衡好的发育液滴中，于38.5℃、5％CO₂、饱和湿度条件下进行培养。体外培养7天后统计各组胚胎发育情况。胚胎发育液(10ml)配方为公知技术。

卵母细胞及胚胎RNA的提取及反转录采用Invitrogen公司的微量试剂盒Cell tocDNA^TM II kit(AM1722)按照说明书进行。将卵母细胞经过显微注射的时间定为第0天，合子培养24小时后定为发育的第一天，七天后观察并统计各组胚胎所处发育阶段。如图 10和图11所示，Non-injected(非注射组)和Nc-shRNA+siRNA(阴性对照注射组)都有囊胚形成，囊胚率为10.06±3.57％vs.9.59±3.58％，差异不显著(P>0.05)，而NLRP7- shRNA+siRNA(混合注射组)大都阻滞在8到16细胞阶段，说明NLRP7基因表达量的下降导致了绵羊早期胚胎发育异常。为了验证设计合成的干扰片段和干扰质粒的干扰效率，在绵羊MII期卵母细胞注射干扰片和干扰质粒段的混合物后进行孤雌激活，而后进行胚胎培养，收集2细胞期和8细胞期的早期胚胎，进行半定量PCR和实时荧光定量PCR 检测，RT-PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳后，结果如图8所示，第1、4泳道非注射组和第 2、5泳道阴性对照注射组的电泳条带明显比第3、6泳道干扰注射组条带亮，说明敲降组 NLRP7的表达量明显下降；通过实时荧光定量PCR检测NLRP7基因的表达量，结果如图 9所示，注射干扰片段和质粒的混合物能够将NLRP7基因的表达量降低至原水平的48.4％ (2细胞)、31.9％(8细胞)，P<0.01，能够高效降解NLRP7基因mRNA，与半定量结果相符，结果表明，本发明提供的siRNA和shRNA干扰质粒混合注射后能够显著抑制绵羊早期孤雌胚胎中NLRP7基因的表达，NLRP7基因表达量的降低会导致早期孤雌胚胎发育异常。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业大学

<120> 一种抑制基因表达的RNA干扰方法

<130> KHP171114825.0

<160> 21

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列的描述：绵羊NLRP7基因PCR的正义链引物

<400> 1

tgcttaccgg gacttctgtc 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列的描述：绵羊NLRP7基因PCR的反义链引物

<400> 2

ccactgccaa gtggtgtca 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列的描述：克隆绵羊NLRP7基因正义链引物

<400> 3

gcgattgggg tcttgttctg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列的描述：克隆绵羊NLRP7基因反义链引物

<400> 4

aggatctggt tgttctggca 20

<210> 5

<211> 763

<212> DNA

<213> 绵羊

<400> 5

atagtgcgat tggggtcttg ttctgacacc acttggcagt gggctgactt ctcctcagca 60

ctcaaagtca accagtccct gaaatgcctg gatctcacgg ccagtgagtt cctggatgcg 120

ggtgtcaaat tgctgtgttt gactctgaga cacccgaagt gcgtcctgca gaaattgtcg 180

ttggagaact gtcagcttac agaagcctgt tgtaaggagc tgtcttctgc tttgattgtc 240

aaccagaggt tgacccacct gtgcttggcc aagaacgacc ttggggatgg cggggtgaag 300

actctgtgtg agggcttgag ttaccccgaa tgtcagctac agaccttggt gctgagtcat 360

tgcaacataa acagacatgg ctgcaagtac atctcaaagc ttctccaagg agactcgagc 420

ctcaccagcc tggacctggg tttcaacccc atagccaccg gactgtgttt tctctatgaa 480

gctttgaaga aaccaaattg taacctgaaa tgtctagggc tctggggctg ccccatcacc 540

ccgttcagtt gccagcatct cgcctccgct ctagtcagca gccggagcct ggaaacactg 600

gacttgggcc aggacgcctg gggacagagt ggcatcgtgg tgctccttaa ggctttaaaa 660

cagaaccacg gctccttaaa gatgctcagg ttgaagatgg acaaatctac cgtggaaatc 720

cagaggctgt tgaaggatgg aaggagaaca atcccagata gcg 763

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213>人工序列的描述：人工合成的小双链RNA正义链

<400> 6

ggaaguuuac ugaagagaat t 21

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213>人工序列的描述：人工合成的小双链RNA反义链

<400> 7

uucucuucag uaaacuucct t 21

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213>人工序列的描述：人工合成的小双链RNA正义链

<400> 8

gcucugugcu caguucaaat t 21

<210> 9

<211> 21

<212> RNA

<213>人工序列的描述：人工合成的小双链RNA反义链

<400> 9

uuugaacuga gcacagagct t 21

<210> 10

<211> 21

<212> RNA

<213>人工序列的描述：人工合成的小双链RNA正义链

<400> 10

ggacaaaucu accguggaat t 21

<210> 11

<211> 21

<212> RNA

<213>人工序列的描述：人工合成的小双链RNA反义链

<400> 11

uuccacggua gauuugucct t 21

<210> 12

<211> 21

<212> RNA

<213>人工序列的描述：人工合成的小双链RNA正义链

<400> 12

uucuccgaac gugucacgut t 21

<210> 13

<211> 21

<212> RNA

<213>人工序列的描述：人工合成的小双链RNA反义链

<400> 13

acgugacacg uucggagaat t 21

<210> 14

<211> 45

<212> DNA

<213>人工序列的描述：人工合成的shRNA的DNA序列

<400> 14

accgcaggta ggaaagaaga tattcgaaaa tatcttcttt cctac 45

<210> 15

<211> 6637

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cagggtaatt cggtcaagcc ttgccttgtt gtagcttaaa ttttgctcgc gcactactca 60

gcgacctcca acacacaagc agggagcaga tactggctta actatgcggc atcagagcag 120

attgtactga gagtgcacca taggggatcg ggagatctcc cgatccgtcg acgtcaggtg 180

gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa 240

atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga 300

agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc 360

ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg 420

gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc 480

gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat 540

tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg 600

acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag 660

aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa 720

cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc 780

gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca 840

cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc 900

tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc 960

tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg 1020

ggtcacgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta 1080

tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag 1140

gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga 1200

ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc 1260

tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa 1320

agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa 1380

aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc 1440

cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt 1500

agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc 1560

tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac 1620

gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca 1680

gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg 1740

ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag 1800

gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 1860

ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat 1920

ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc 1980

acatgttctt tattaccctg ttatccctaa ccggtttacc gagctcttat tggttttcaa 2040

acttcattga ctgtgccaag cttctgacct cttctcttcc tcccacaggg cctcgagaca 2100

attgcatcga tggtaccagt gaaagtctgc aatgaattcg agttggcgcg cctgtcattc 2160

taaatctctc tttcagccta aagctttttc cccgtatccc cccaggtgtc tgcaggctca 2220

aagagcagcg agaagcgttc agaggaaagc gatcccgtgc caccttcccc gtgcccgggc 2280

tgtccccgca cgctgccggc tcggggatgc ggggggagcg ccggaccgga gcggagcccc 2340

gggcggctcg ctgctgcccc ctagcggggg agggacgtaa ttacatccct gggggctttg 2400

ggagggggct gtccccgtga gctcccaggc gcgcctgtca ttctaaatct ctctttcagc 2460

ctaaagcttt ttccccgtat ccccccaggt gtctgcaggc tcaaagagca gcgagaagcg 2520

ttcagaggaa agcgatcccg tgccaccttc cccgtgcccg ggctgtcccc gcacgctgcc 2580

ggctcgggga tgcgggggga gcgccggacc ggagcggagc cccgggcggc tcgctgctgc 2640

cccctagcgg gggagggacg taattacatc cctgggggct ttgggggggg gctgtccccg 2700

tgagctccca ggcgcgccaa ctcggtaccg tatcgatgtc gacgttaacg ctagtgatat 2760

caactttgta tagaaaagtt ggctccgaat ttctcgagga attcggcagg aagagggcct 2820

atttcccatg attccttcat atttgcatat acgatacaag gctgttagag agataattag 2880

aattaatttg actgtaaaca caaagatatt agtacaaaat acgtgacgta gaaagtaata 2940

atttcttggg tagtttgcag ttttaaaatt atgttttaaa atggactatc atatgcttac 3000

cgtaacttga aagtatttcg atttcttggc tttatatatc ttgtggaaag gacgaaacac 3060

cgcaggtagg aaagaagata ttcgaaaata tcttctttcc tacctgcttt ttttaagctt 3120

ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgtgg 3180

ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt 3240

gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca 3300

gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca ggtaagtgcc 3360

gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt gccttgaatt 3420

acttccacct ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc ttcgggttgg aagtgggtgg 3480

gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt tgaggcctgg 3540

cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg tctcgctgct 3600

ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct ttttttctgg 3660

caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg gtatttcggt ttttggggcc 3720

gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg gggcctgcga 3780

gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc tctggtgcct 3840

ggcctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg gtcggcacca 3900

gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctg cagggagctc aaaatggagg 3960

acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaaaag ggcctttccg 4020

tcctcagccg tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg cgccgtccag gcacctcgat 4080

tagttctcga gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg gggaggggtt ttatgcgatg 4140

gagtttcccc acactgagtg ggtggagact gaagttaggc cagcttggca cttgatgtaa 4200

ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt tcattctcaa gcctcagaca 4260

gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtcccgggta actgatcata attcgaccca 4320

agtttgtaca aaaaagcagg ctgattaccg gagaattttc catggtgagc aagggcgagg 4380

agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca 4440

agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg accctgaagt 4500

tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accctgacct 4560

acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt 4620

ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact 4680

acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga 4740

agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca 4800

acagccacaa cgtctatatc atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca 4860

agatccgcca caacatcgag gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca 4920

cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg 4980

ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg 5040

ccgccgggat cactctcggc atggacgagc tgtacaagga gggccgcggc agcctgctga 5100

cctgcggcga cgtggaggaa aaccccggcc ccatgaccga gtacaagccc acggtgcgcc 5160

tcgccacccg cgacgacgtc ccccgggccg tacgcaccct cgccgccgcg ttcgccgact 5220

accccgccac gcgccacacc gtcgacccgg accgccacat cgagcgggtc accgagctgc 5280

aagaactctt cctcacgcgc gtcgggctcg acatcggcaa ggtgtgggtc gcggacgacg 5340

gcgccgcggt ggcggtctgg accacgccgg agagcgtcga agcgggggcg gtgttcgccg 5400

agatcggccc gcgcatggcc gagttgagcg gttcccggct ggccgcgcag caacagatgg 5460

aaggcctcct ggcgccgcac cggcccaagg agcccgcgtg gttcctggcc accgtcggcg 5520

tgtcgcccga ccaccagggc aagggtctgg gcagcgccgt cgtgctcccc ggagtggagg 5580

cggccgagcg cgccggggtg cccgccttcc tggaaacctc cgcgccccgc aacctcccct 5640

tctacgagcg gctcggcttc accgtcaccg ccgacgtcga ggtgcccgaa ggaccgcgca 5700

cctggtgcat gacccgcaag cccggtgcct gatgcagcgg ccgctacgga tccccgggta 5760

actgaaaatc caccggatct agataactga tctacccagc tttcttgtac aaagtggtac 5820

gcgtgaattc actcctcagg tgcaggctgc ctatcagaag gtggtggctg gtgtggccaa 5880

tgccctggct cacaaatacc actgagatct ttttccctct gccaaaaatt atggggacat 5940

catgaagccc cttgagcatc tgacttctgg ctaataaagg aaatttattt tcattgcaat 6000

agtgtgttgg aattttttgt gtctctcact cggaaggaca tatgggaggg caaatcattt 6060

aaaacatcag aatgagtatt tggtttagag tttggcaaca tatgcccata tgctggctgc 6120

catgaacaaa ggttggctat aaagaggtca tcagtatatg aaacagcccc ctgctgtcca 6180

ttccttattc catagaaaag ccttgacttg aggttagatt ttttttatat tttgttttgt 6240

gttatttttt tctttaacat ccctaaaatt ttccttacat gttttactag ccagattttt 6300

cctcctctcc tgactactcc cagtcatagc tgtccctctt ctcttatgga gatccctcga 6360

cctgcagccc aagcttggcg taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc 6420

cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct 6480

aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa 6540

acctgtcgtg ccagcggatc gacagtacta agcttggtgc gtttttatgc ttgtagtatt 6600

gtataatgtt tttaagatcc ttaattaata gggataa 6637

<210> 16

<211> 44

<212> DNA

<213>人工序列的描述：人工合成的shRNA的DNA序列

<400> 16

accgctgtct tctgctttga ttgtcgaaac aatcaaagca gaag 44

<210> 17

<211> 6637

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cagggtaatt cggtcaagcc ttgccttgtt gtagcttaaa ttttgctcgc gcactactca 60

gcgacctcca acacacaagc agggagcaga tactggctta actatgcggc atcagagcag 120

attgtactga gagtgcacca taggggatcg ggagatctcc cgatccgtcg acgtcaggtg 180

gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa 240

atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga 300

agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc 360

ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg 420

gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc 480

gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat 540

tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg 600

acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag 660

aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa 720

cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc 780

gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca 840

cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc 900

tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc 960

tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg 1020

ggtcacgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta 1080

tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag 1140

gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga 1200

ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc 1260

tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa 1320

agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa 1380

aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc 1440

cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt 1500

agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc 1560

tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac 1620

gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca 1680

gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg 1740

ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag 1800

gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 1860

ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat 1920

ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc 1980

acatgttctt tattaccctg ttatccctaa ccggtttacc gagctcttat tggttttcaa 2040

acttcattga ctgtgccaag cttctgacct cttctcttcc tcccacaggg cctcgagaca 2100

attgcatcga tggtaccagt gaaagtctgc aatgaattcg agttggcgcg cctgtcattc 2160

taaatctctc tttcagccta aagctttttc cccgtatccc cccaggtgtc tgcaggctca 2220

aagagcagcg agaagcgttc agaggaaagc gatcccgtgc caccttcccc gtgcccgggc 2280

tgtccccgca cgctgccggc tcggggatgc ggggggagcg ccggaccgga gcggagcccc 2340

gggcggctcg ctgctgcccc ctagcggggg agggacgtaa ttacatccct gggggctttg 2400

ggagggggct gtccccgtga gctcccaggc gcgcctgtca ttctaaatct ctctttcagc 2460

ctaaagcttt ttccccgtat ccccccaggt gtctgcaggc tcaaagagca gcgagaagcg 2520

ttcagaggaa agcgatcccg tgccaccttc cccgtgcccg ggctgtcccc gcacgctgcc 2580

ggctcgggga tgcgggggga gcgccggacc ggagcggagc cccgggcggc tcgctgctgc 2640

cccctagcgg gggagggacg taattacatc cctgggggct ttgggggggg gctgtccccg 2700

tgagctccca ggcgcgccaa ctcggtaccg tatcgatgtc gacgttaacg ctagtgatat 2760

caactttgta tagaaaagtt ggctccgaat ttctcgagga attcggcagg aagagggcct 2820

atttcccatg attccttcat atttgcatat acgatacaag gctgttagag agataattag 2880

aattaatttg actgtaaaca caaagatatt agtacaaaat acgtgacgta gaaagtaata 2940

atttcttggg tagtttgcag ttttaaaatt atgttttaaa atggactatc atatgcttac 3000

cgtaacttga aagtatttcg atttcttggc tttatatatc ttgtggaaag gacgaaacac 3060

cgctgtcttc tgctttgatt gtcgaaacaa tcaaagcaga agacagcttt ttttaagctt 3120

ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgtgg 3180

ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt 3240

gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca 3300

gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca ggtaagtgcc 3360

gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt gccttgaatt 3420

acttccacct ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc ttcgggttgg aagtgggtgg 3480

gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt tgaggcctgg 3540

cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg tctcgctgct 3600

ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct ttttttctgg 3660

caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg gtatttcggt ttttggggcc 3720

gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg gggcctgcga 3780

gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc tctggtgcct 3840

ggcctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg gtcggcacca 3900

gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctg cagggagctc aaaatggagg 3960

acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaaaag ggcctttccg 4020

tcctcagccg tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg cgccgtccag gcacctcgat 4080

tagttctcga gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg gggaggggtt ttatgcgatg 4140

gagtttcccc acactgagtg ggtggagact gaagttaggc cagcttggca cttgatgtaa 4200

ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt tcattctcaa gcctcagaca 4260

gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtcccgggta actgatcata attcgaccca 4320

agtttgtaca aaaaagcagg ctgattaccg gagaattttc catggtgagc aagggcgagg 4380

agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca 4440

agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg accctgaagt 4500

tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accctgacct 4560

acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt 4620

ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact 4680

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<211> 45

<212> DNA

<213>人工序列的描述：人工合成的shRNA的DNA序列

<400> 18

accgcactga gatatttctc ttaccgaagt aagagaaata tctca 45

<210> 19

<211> 6637

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

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acagccacaa cgtctatatc atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca 4860

agatccgcca caacatcgag gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca 4920

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ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg 5040

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<212> DNA

<213>人工序列的描述：人工合成的shRNA的DNA序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc 4980

agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg 5040

tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caaggagggc cgcggcagcc 5100

tgctgacctg cggcgacgtg gaggaaaacc ccggccccat gaccgagtac aagcccacgg 5160

tgcgcctcgc cacccgcgac gacgtccccc gggccgtacg caccctcgcc gccgcgttcg 5220

ccgactaccc cgccacgcgc cacaccgtcg acccggaccg ccacatcgag cgggtcaccg 5280

agctgcaaga actcttcctc acgcgcgtcg ggctcgacat cggcaaggtg tgggtcgcgg 5340

acgacggcgc cgcggtggcg gtctggacca cgccggagag cgtcgaagcg ggggcggtgt 5400

tcgccgagat cggcccgcgc atggccgagt tgagcggttc ccggctggcc gcgcagcaac 5460

agatggaagg cctcctggcg ccgcaccggc ccaaggagcc cgcgtggttc ctggccaccg 5520

tcggcgtgtc gcccgaccac cagggcaagg gtctgggcag cgccgtcgtg ctccccggag 5580

tggaggcggc cgagcgcgcc ggggtgcccg ccttcctgga aacctccgcg ccccgcaacc 5640

tccccttcta cgagcggctc ggcttcaccg tcaccgccga cgtcgaggtg cccgaaggac 5700

cgcgcacctg gtgcatgacc cgcaagcccg gtgcctgatg cagcggccgc tacggatccc 5760

cgggtaactg aaaatccacc ggatctagat aactgatcta cccagctttc ttgtacaaag 5820

tggtacgcgt gaattcactc ctcaggtgca ggctgcctat cagaaggtgg tggctggtgt 5880

ggccaatgcc ctggctcaca aataccactg agatcttttt ccctctgcca aaaattatgg 5940

ggacatcatg aagccccttg agcatctgac ttctggctaa taaaggaaat ttattttcat 6000

tgcaatagtg tgttggaatt ttttgtgtct ctcactcgga aggacatatg ggagggcaaa 6060

tcatttaaaa catcagaatg agtatttggt ttagagtttg gcaacatatg cccatatgct 6120

ggctgccatg aacaaaggtt ggctataaag aggtcatcag tatatgaaac agccccctgc 6180

tgtccattcc ttattccata gaaaagcctt gacttgaggt tagatttttt ttatattttg 6240

ttttgtgtta tttttttctt taacatccct aaaattttcc ttacatgttt tactagccag 6300

atttttcctc ctctcctgac tactcccagt catagctgtc cctcttctct tatggagatc 6360

cctcgacctg cagcccaagc ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt 6420

gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg 6480

gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt 6540

cgggaaacct gtcgtgccag cggatcgaca gtactaagct tggtgcgttt ttatgcttgt 6600

agtattgtat aatgttttta agatccttaa ttaataggga taa 6643

Claims (3)

1.一种抑制NLRP7基因表达的siRNA和shRNA组合，其特征在于，所述siRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.6-7、8-9和10-11所示；所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.14、SEQ IDNO.16和SEQ ID NO.18所示。

2.权利要求1所述的siRNA和shRNA组合在制备干扰NLRP7基因表达试剂盒中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂盒含有3种质粒，所述3种质粒的序列分别如SEQ ID NO. 15、17、19所示。

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