CN108251434A - 一种拟南芥蓝光受体cry2介导的蓝光诱导细胞凋亡的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用拟南芥蓝光受体CRY2介导的蓝光诱导细胞凋亡的系统。将CRY2的N端结构域PHR和凋亡相关蛋白caspase8融合，以及将CRY2蓝光特异性互作转录因子CIB1的N端结构域CIBN和caspase8融合，然后分别转入HEK293T细胞，照射蓝光，由于PHR能够发生蓝光特异性聚集，所以导致融合的caspase8也发生蓝光诱导性聚集，同时PHR和CIBN能够发生蓝光特异性互作，所以也使得caspase8发生蓝光诱导性聚集，聚集的caspase8能够发生自剪切，产生活性体p18，激活caspase3，进而导致细胞凋亡。

Description

一种拟南芥蓝光受体CRY2介导的蓝光诱导细胞凋亡的方法

技术领域

本发明涉及生物方法发明领域，具体的说，是一种拟南芥蓝光受体CRY2介导的蓝光诱导细胞凋亡的的方法。

背景技术

光是植物生长发育的必要条件之一，影响植物的形态建成。植物有两类光感受器，一类是光合色素，负责进行光合作用获取光能；另一类是光受体，介导非光和作用的光反应。人们对植物光受体功能的探索主要来自对模式植物拟南芥的研究，目前已知拟南芥至少有12个光受体：（1）七个蓝光/紫外光受体，两个隐花色素(CRY1与CRY2)和两个向光素（phot1与 phot2）及三个LOV结构域的F-box家族蛋白ZTL/FKF/LKP2；（2）五个红光/远红光受体（PHYs）。植物通过这些光受体来调控自身的生长发育。

隐花色素CRY首先在拟南芥中被发现，目前已证实广泛分布于各种生物中，从细菌乃至人体。拟南芥中有2个隐花色素基因CRY1与CRY2，功能分别是蓝光下抑制下胚轴的伸长和介导光周期控制开花等。目前已知隐花色素CRY通过蛋白互作调控下游基因来控制植物光形态建成，已报道有多个信号蛋白与CRY互作，如COP1，SPA1及CIB1等，为蓝光信号传导机制的研究提供重要线索。

2016年林辰涛等科学家世界上首次解析了植物蓝光受体原初光反应的分子机制，在光受体蛋白及植物信号传导研究中具有重大意义，为未来提高农林作物光合作用效率，精准调控农林作物花期等农业生产关键技术的开发利用提供了必要的理论基础。此外，与此同时，该研究成果将为光控遗传学（Optogenetics）这一新兴研究领域提供新一代分子工具，该领域科学家利用光对各类功能蛋白进行快速精准调控，有望以此在神经科学以及疾病治疗研究上获得突破。

光是影响地球上所有生命体系的重要环境因子。动植物均通过光受体蛋白感受感知光信号，其中隐花色素（Cryptochrome）是一类在生命进化过程中极为保守的蓝光受体蛋白。隐花色素控制植物的光合作用与生长发育、昆虫鸟类的磁场感应、以及人类的生物钟与昼夜节律。植物隐花色素蛋白（CRY) 通过其称之为黄素（Flavin）的吸光基团吸收光子以激发原初光反应，激发态隐花色素蛋白通过与其信号蛋白 (CIB1、SPA1、COP1等)的相互作用而调控下游功能基因表达。隐花色素自1993年在植物上首先发现以来其原初光反应的分子机制众说纷纭，不甚了然。科学家的研究证明了植物隐花色素的光诱导蛋白质二聚化反应为其原初光反应的关键步骤，同时发现了隐花色素的二聚化反应受到两个隐花色素抑制因子(BIC)的调控以决定植物光受体的活性与信号強弱，进而调控光合作用、光形态建成以及开花时间等植物生长发育进程。该研究同时发现人类隐花色素也具有二聚化反应。

既然拟南芥蓝光受体CRY2可以在植物体内受光诱导形成多聚体，那么在动物细胞里面是不是会产生同样的现象，如果可以产生同样的现象，若果在CRY2后面融合表达相关信号蛋白，这样就可以通过蓝光特异性调控CRY2的多聚化来调控融合蛋白的多聚化，进而调控其融合蛋白介导的信号转导。于是我们开始设计这样一个实验，从文献中寻找一个单体状态中没有活性或者活性较弱，但是多聚体状态下活性增强的信号蛋白。

在细胞凋亡途径中有这样一个蛋白，caspase8，caspase8在受到外界凋亡信号的诱导后，会发生聚集，聚集的caspase8发生自剪切，产生活性体p18，活性体p18又可以激活下游caspase3，caspase3蛋白也会发生剪切产生活性体，进而使得细胞凋亡。

发明内容

本发明的目的在于提供一种拟南芥蓝光受体CRY2介导的蓝光诱导细胞凋亡的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种拟南芥蓝光受体CRY2介导的蓝光诱导细胞凋亡的方法，包括如下：

（1）载体设计以及构建为：设计引物

PHR-F：5’-3’ gcgtggtacctctagaatgaagatggacaaaaagac，

PHR-R：5’-3’ TGAAGTCCATCCCGGGTGCTGCTCCGATCATGATC，

caspase8-F：5’-3’ cccgggatggacttcagcagaaa，

caspase8-R：5’-3’GAAGCGGCCGCCCGGGATCAGAAGGGAAGACAAGT，

CIBN-F：5’-3’ gcgtggtacctctagaatgaatggagctataggagg，

CIBN-R：TGAAGTCCATCCCGGGATGAATATAATCCGTTTTCT，

首先利用以上引物，分别以拟南芥cDNA和HEK293T细胞cDNA为模板，利用pcr技术将PHR、CIBN和caspase8扩增出来，然后利用引物PHR-F和caspase8-R以及CIBN-F和caspase8-R，体系中加入PHR、caspase8以及CIBN caspase8模板，进行重叠 PCR，此时将PHR caspase8以及CIBN caspase8融合到一起，回收后的PHR caspase8 和CIBN caspase8产物和限制性内切酶XbaI XmaI双酶切线性化的pci 4xmyc、pci 6xflag、以及pci mcherry载体连接，转化DH5a，菌落pcr验证大小正确的克隆送测序，测序正确的单菌落提取质粒并保菌。此时，构建好pci 4xmyc PHR caspase8、pci mcherry PHR caspase8、pci 6xflag CIBN caspase8动物表达载体。

（2）动物细胞的培养以及转染：37℃水浴迅速复苏冻存的细胞，然后将细胞冻存液800g离心5min，弃掉上清液，加入1ml DMEM细胞培养液重悬起来，加入到含有12ml DMEM培养基的75cm²的细胞培养瓶中，24h后换新鲜的DMEM培养基，待细胞铺板率到90%，继代，铺板，铺板24h后，进行细胞转染，利用lipo3000进行细胞转染，分别在六孔板中转染1微克pci4xmyc PHR caspase8质粒，1微克pci 4xmyc PHR caspase8＋1微克pci 6xflag CIBNcaspase8质粒，以及1微克pci mcherry PHR caspase8质粒，转染36h后进行蓝光处理，随后western鉴定或者激光共聚焦显微镜观测。

caspase8序列如SEQ ID NO.13所示，CIBN caspase8序列如SEQ ID NO.14所示，PHR序列如SEQ ID NO.15所示。

所述的pci 4xmyc、pci 6xflag、以及pci mcherry载体构建方法为：分别设计PCR引物如下：

Myc F :ctagcctcgagaattcatggggttaattaacggtg；

Myc R: TACCACGCGTGAATTCGCTACCGTTCAAGTCTTCC；

Flag F：ctagcctcgagaattcatgactgattacaa；

Flag R：TACCACGCGTGAATTCACCTCCACCACCTCCTCCCT；

mcherry F： ctagcctcgagaattcatggtgagcaagggcgagg；

mcherry R： TACCACGCGTGAATTCCTACTTGTACAGCTCGTCCA；

以4xmyc（SEQ ID NO.16）、6xflag（SEQ ID NO.17）、mcherry（SEQ ID NO.18）为模板，扩增出来myc，flag，mcherry片段，然后利用EcoRI酶单酶切pci neo载体，将其分别和线性化载体连接，构建成pci 4xmyc、pci 6xflag、以及pci mcherry。

本发明的优点在于：

本发明属于一种蓝光诱导的光遗传学系统，能够高效地诱导蛋白的多聚化，而且是一种可逆的反应，属于可调控系统，届时有可能代替现在的放疗化疗方法来治疗癌症，我们可以在癌症肿瘤组织引入此系统，然后用蓝光二极管来照射，来杀死癌细胞。

附图说明

图1 pci 4xmyc PHR caspase8载体设计图。

图2 pci mcherry PHR caspase8载体设计图。

图3 pci 6xflag CIBN caspase8载体设计图。

图4 为PHR caspase8经蓝光照射后的结果图，其中 PHR caspase8转染细胞后照射蓝光，分别照射0、3、6、9h后wenstern检测蛋白，发现PHR caspase8会发生前体剪切，产生活性体p18，但是对照组nanoluc caspaspe8不会发生这种变化。

图5 为PHR caspase8经IP试验后的结果图；其中pci 4xmyc PHR caspase8转染293T细胞后，蓝光处理后进行IP试验，发现蓝光照射后PHR caspase8确实能够形成聚集。

图6 为激光共聚焦显微镜观测结果图，其中mcherry PHR caspase8转染293T细胞后，利用激光共聚焦显微镜观测，发现照射蓝光后PHR caspase8确实能够发生多聚现象，蓝光撤掉后多聚体又会逐渐消失。

图7为流式细胞仪检测结果图；其中PHR,PHR caspase8，以及caspase8转染细胞后，进行蓝光处理，然后流式细胞仪检测凋亡细胞数目，能够看出来PHR caspase8在蓝光下能明显导致细胞凋亡，AB分别为PHR dark，PHR blue，CD分别为PHR caspase8 dark，PHRcaspase8 blue，EF分别为caspase8 dark，caspase8 blue。

图8 为蓝光处理后显微镜检测结果图；其中PHR caspase8转染293T细胞后，蓝光处理后利用显微镜检测caspase8活性体，可以看出活性体在蓝光照射后明显要比黑暗状态多。

图9 为经过共转和蓝光照射后的电泳图，其中PHR caspase8以及PHR caspase8和CIBN caspase8共转后，照射蓝光后都能发生前体剪切现象，但是单独的CIBN caspase8不能发生前体剪切现象，这说明PHR能够导致caspase8发生蓝光特异性聚集，PHR和CIBN互作也能够导致caspase8发生蓝光特异性聚集。

具体实施方式

实施例1

一种拟南芥蓝光受体CRY2介导的蓝光诱导细胞凋亡的方法，包括如下：

（1）载体设计以及构建为：设计引物PHR-F：5’-3’gcgtggtacctctagaatgaagatggacaaaaagac，

PHR-R：5’-3’ TGAAGTCCATCCCGGGTGCTGCTCCGATCATGATC，

caspase8-F：5’-3’ cccgggatggacttcagcagaaa，

caspase8-R：5’-3’GAAGCGGCCGCCCGGGATCAGAAGGGAAGACAAGT，

CIBN-F：5’-3’ gcgtggtacctctagaatgaatggagctataggagg，

CIBN-R：TGAAGTCCATCCCGGGATGAATATAATCCGTTTTCT，

首先利用以上引物，分别以拟南芥cDNA和HEK293T细胞cDNA为模板，利用pcr技术将PHR、CIBN和caspase8扩增出来，然后利用引物PHR-F和caspase8-R以及CIBN-F和caspase8-R，体系中加入PHR、caspase8以及CIBN caspase8模板，进行重叠 PCR，此时将PHR caspase8以及CIBN caspase8融合到一起，回收后的PHR caspase8 和CIBN caspase8产物和限制性内切酶XbaI XmaI双酶切线性化的pci 4xmyc、pci 6xflag、以及pci mcherry载体连接，转化DH5a，菌落pcr验证大小正确的克隆送测序，测序正确的单菌落提取质粒并保菌。此时，构建好pci 4xmyc PHR caspase8、pci mcherry PHR caspase8、pci 6xflag CIBN caspase8动物表达载体。

所述的pci 4xmyc、pci 6xflag、以及pci mcherry载体构建方法为：分别设计PCR引物如下：

Myc F :ctagcctcgagaattcatggggttaattaacggtg；

Myc R: TACCACGCGTGAATTCGCTACCGTTCAAGTCTTCC；

Flag F：ctagcctcgagaattcatgactgattacaa；

Flag R：TACCACGCGTGAATTCACCTCCACCACCTCCTCCCT；

mcherry F： ctagcctcgagaattcatggtgagcaagggcgagg；

mcherry R： TACCACGCGTGAATTCCTACTTGTACAGCTCGTCCA；

扩增出来myc，flag，mcherry片段，然后利用EcoRI酶单酶切pci neo载体，将其分别和线性化载体连接，构建成pci 4xmyc、pci 6xflag、以及pci mcherry。

（2）动物细胞的培养以及转染：37℃水浴迅速复苏冻存的细胞，然后将细胞冻存液800g离心5min，弃掉上清液，加入1ml DMEM细胞培养液重悬起来，加入到含有12ml DMEM培养基的75cm²的细胞培养瓶中，24h后换新鲜的DMEM培养基，待细胞铺板率到90%，继代，铺板，铺板24h后，进行细胞转染，利用lipo3000进行细胞转染，分别在六孔板中转染1微克pci4xmyc PHR caspase8质粒，1微克pci 4xmyc PHR caspase8＋1微克pci 6xflag CIBNcaspase8质粒，以及1微克pci mcherry PHR caspase8质粒，转染36h后进行蓝光处理，随后western鉴定或者激光共聚焦显微镜观测。

具体结果见附图。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 吉林大学

<120> 一种拟南芥蓝光受体CRY2介导的蓝光诱导细胞凋亡的方法

<130> 18

<160> 18

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcgtggtacc tctagaatga agatggacaa aaagac 36

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgaagtccat cccgggtgct gctccgatca tgatc 35

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cccgggatgg acttcagcag aaa 23

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gaagcggccg cccgggatca gaagggaaga caagt 35

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcgtggtacc tctagaatga atggagctat aggagg 36

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgaagtccat cccgggatga atataatccg ttttct 36

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ctagcctcga gaattcatgg ggttaattaa cggtg 35

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

taccacgcgt gaattcgcta ccgttcaagt cttcc 35

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ctagcctcga gaattcatga ctgattacaa 30

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

taccacgcgt gaattcacct ccaccacctc ctccct 36

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ctagcctcga gaattcatgg tgagcaaggg cgagg 35

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

taccacgcgt gaattcctac ttgtacagct cgtcca 36

<210> 13

<211> 1437

<212> DNA

<213> Caspase8

<400> 13

atggacttca gcagaaatct ttatgatatt ggggaacaac tggacagtga agatctggcc 60

tccctcaagt tcctgagcct ggactacatt ccgcaaagga agcaagaacc catcaaggat 120

gccttgatgt tattccagag actccaggaa aagagaatgt tggaggaaag caatctgtcc 180

ttcctgaagg agctgctctt ccgaattaat agactggatt tgctgattac ctacctaaac 240

actagaaagg aggagatgga aagggaactt cagacaccag gcagggctca aatttctgcc 300

tacagggtca tgctctatca gatttcagaa gaagtgagca gatcagaatt gaggtctttt 360

aagtttcttt tgcaagagga aatctccaaa tgcaaactgg atgatgacat gaacctgctg 420

gatattttca tagagatgga gaagagggtc atcctgggag aaggaaagtt ggacatcctg 480

aaaagagtct gtgcccaaat caacaagagc ctgctgaaga taatcaacga ctatgaagaa 540

ttcagcaaag agagaagcag cagccttgaa ggaagtcctg atgaattttc aaatggggag 600

gagttgtgtg gggtaatgac aatctcggac tctccaagag aacaggatag tgaatcacag 660

actttggaca aagtttacca aatgaaaagc aaacctcggg gatactgtct gatcatcaac 720

aatcacaatt ttgcaaaagc acgggagaaa gtgcccaaac ttcacagcat tagggacagg 780

aatggaacac acttggatgc aggggctttg accacgacct ttgaagagct tcattttgag 840

atcaagcccc acgatgactg cacagtagag caaatctatg agattttgaa aatctaccaa 900

ctcatggacc acagtaacat ggactgcttc atctgctgta tcctctccca tggagacaag 960

ggcatcatct atggcactga tggacaggag gcccccatct atgagctgac atctcagttc 1020

actggtttga agtgcccttc ccttgctgga aaacccaaag tgttttttat tcaggcttgt 1080

cagggggata actaccagaa aggtatacct gttgagactg attcagagga gcaaccctat 1140

ttagaaatgg atttatcatc acctcaaacg agatatatcc cggatgaggc tgactttctg 1200

ctggggatgg ccactgtgaa taactgtgtt tcctaccgaa accctgcaga gggaacctgg 1260

tacatccagt cactttgcca gagcctgaga gagcgatgtc ctcgaggcga tgatattctc 1320

accatcctga ctgaagtgaa ctatgaagta agcaacaagg atgacaagaa aaacatgggg 1380

aaacagatgc ctcagcctac tttcacacta agaaaaaaac ttgtcttccc ttctgat 1437

<210> 14

<211> 510

<212> DNA

<213> CIBN

<400> 14

atgaatggag ctataggagg tgaccttttg ctcaattttc ctgacatgtc ggtcctagag 60

cgccaaaggg ctcacctcaa gtacctcaat cccacctttg attctcctct cgccggcttc 120

tttgccgatt cttcaatgat taccggcggc gagatggaca gctatctttc gactgccggt 180

ttgaatcttc cgatgatgta cggtgagacg acggtggaag gtgattcaag actctcaatt 240

tcgccggaaa cgacgcttgg gactggaaat ttcaagaaac ggaagtttga tacagagact 300

aaggattgta atgagaagaa gaagaagatg acgatgaaca gagatgacct agtagaagaa 360

ggagaagaag agaagtcgaa aataacagag caaaacaatg ggagcacaaa aagcatcaag 420

aagatgaaac acaaagccaa gaaagaagag aacaatttct ctaatgattc atctaaagtg 480

acgaaggaat tggagaaaac ggattatatt 510

<210> 15

<211> 7141

<212> DNA

<213> PHR

<400> 15

cccgggcggc cgcttccctt tagtgagggt taatgcttcg agcagacatg ataagataca 60

ttgatgagtt tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgcttt atttgtgaaa 120

tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca ttataagctg caataaacaa gttaacaaca 180

acaattgcat tcattttatg tttcaggttc agggggagat gtgggaggtt ttttaaagca 240

agtaaaacct ctacaaatgt ggtaaaatcc gataaggatc gatccgggct ggcgtaatag 300

cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatggac 360

gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct 420

acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg 480

ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt 540

gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg tagtgggcca 600

tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt taatagtgga 660

ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt tgatttataa 720

gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac 780

gcgaatttta acaaaatatt aacgcttaca atttcctgat gcggtatttt ctccttacgc 840

atctgtgcgg tatttcacac cgcatacgcg gatctgcgca gcaccatggc ctgaaataac 900

ctctgaaaga ggaacttggt taggtacctt ctgaggcgga aagaaccagc tgtggaatgt 960

gtgtcagtta gggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat 1020

gcatctcaat tagtcagcaa ccaggtgtgg aaagtcccca ggctccccag caggcagaag 1080

tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa ctccgcccat 1140

cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc catggctgac taattttttt 1200

tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg 1260

cttttttgga ggcctaggct tttgcaaaaa gcttgattct tctgacacaa cagtctcgaa 1320

cttaaggcta gagccaccat gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc tccggccgct 1380

tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc 1440

gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac cgacctgtcc 1500

ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca gcgcggctat cgtggctggc cacgacgggc 1560

gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg gctgctattg 1620

ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc 1680

atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg cccattcgac 1740

caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg tcttgtcgat 1800

caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt cgccaggctc 1860

aaggcgcgca tgcccgacgg cgaggatctc gtcgtgaccc atggcgatgc ctgcttgccg 1920

aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg gctgggtgtg 1980

gcggaccgct atcaggacat agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga gcttggcggc 2040

gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc gcagcgcatc 2100

gccttctatc gccttcttga cgagttcttc tgagcgggac tctggggttc gaaatgaccg 2160

accaagcgac gcccaacctg ccatcacgat ggccgcaata aaatatcttt attttcatta 2220

catctgtgtg ttggtttttt gtgtgaatcg atagcgataa ggatccgcgt atggtgcact 2280

ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc gccaacaccc 2340

gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc 2400

gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg cgcgagacga 2460

aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat ggtttcttag 2520

acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa 2580

atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat 2640

tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg 2700

gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa 2760

gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt 2820

gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt 2880

ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat 2940

tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg 3000

acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta 3060

cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat 3120

catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag 3180

cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa 3240

ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca 3300

ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc 3360

ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt 3420

atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc 3480

gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat 3540

atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt 3600

tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac 3660

cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc 3720

ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca 3780

actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta 3840

gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct 3900

ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg 3960

gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc 4020

acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta 4080

tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg 4140

gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt 4200

cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg 4260

cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg 4320

ccttttgctc acatggctcg acagatcttc aatattggcc attagccata ttattcattg 4380

gttatatagc ataaatcaat attggctatt ggccattgca tacgttgtat ctatatcata 4440

atatgtacat ttatattggc tcatgtccaa tatgaccgcc atgttggcat tgattattga 4500

ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc 4560

gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat 4620

tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 4680

aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 4740

caagtccgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt 4800

acatgacctt acgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 4860

ccatggtgat gcggttttgg cagtacacca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg 4920

gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac 4980

gggactttcc aaaatgtcgt aacaactgcg atcgcccgcc ccgttgacgc aaatgggcgg 5040

taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcac 5100

tagaagcttt attgcggtag tttatcacag ttaaattgct aacgcagtca gtgcttctga 5160

cacaacagtc tcgaacttaa gctgcagtga ctctcttaag gtagccttgc agaagttggt 5220

cgtgaggcac tgggcaggta agtatcaagg ttacaagaca ggtttaagga gaccaataga 5280

aactgggctt gtcgagacag agaagactct tgcgtttctg ataggcacct attggtctta 5340

ctgacatcca ctttgccttt ctctccacag gtgtccactc ccagttcaat tacagctctt 5400

aaggctagag tacttaatac gactcactat aggctagcct cgagaattca tggggttaat 5460

taacggtgaa caaaagctaa tctccgagga agacttgaac ggtgaacaaa aattaatctc 5520

agaagaagac ttgaacggac tcgacggtga acaaaagttg atttctgaag aagatttgaa 5580

cggtgaacaa aagctaatct ccgaggaaga cttgaacggt agcgaattca cgcgtggtac 5640

ctctagaatg aagatggaca aaaagactat agtttggttt agaagagacc taaggattga 5700

ggataatcct gcattagcag cagctgctca cgaaggatct gtttttcctg tcttcatttg 5760

gtgtcctgaa gaagaaggac agttttatcc tggaagagct tcaagatggt ggatgaaaca 5820

atcacttgct cacttatctc aatccttgaa ggctcttgga tctgacctca ctttaatcaa 5880

aacccacaac acgatttcag cgatcttgga ttgtatccgc gttaccggtg ctacaaaagt 5940

cgtctttaac cacctctatg atcctgtttc gttagttcgg gaccataccg taaaggagaa 6000

gctggtggaa cgtgggatct ctgtgcaaag ctacaatgga gatctattgt atgaaccgtg 6060

ggagatatac tgcgaaaagg gcaaaccttt tacgagtttc aattcttact ggaagaaatg 6120

cttagatatg tcgattgaat ccgttatgct tcctcctcct tggcggttga tgccaataac 6180

tgcagcggct gaagcgattt gggcgtgttc gattgaagaa ctagggctgg agaatgaggc 6240

cgagaaaccg agcaatgcgt tgttaactag agcttggtct ccaggatgga gcaatgctga 6300

taagttacta aatgagttca tcgagaagca gttgatagat tatgcaaaga acagcaagaa 6360

agttgttggg aattctactt cactactttc tccgtatctc catttcgggg aaataagcgt 6420

cagacacgtt ttccagtgtg cccggatgaa acaaattata tgggcaagag ataagaacag 6480

tgaaggagaa gaaagtgcag atctttttct taggggaatc ggtttaagag agtattctcg 6540

gtatatatgt ttcaacttcc cgtttactca cgagcaatcg ttgttgagtc atcttcggtt 6600

tttcccttgg gatgctgatg ttgataagtt caaggcctgg agacaaggca ggaccggtta 6660

tccgttggtg gatgccggaa tgagagagct ttgggctacc ggatggatgc ataacagaat 6720

aagagtgatt gtttcaagct ttgctgtgaa gtttcttctc cttccatgga aatggggaat 6780

gaagtatttc tgggatacac ttttggatgc tgatttggaa tgtgacatcc ttggctggca 6840

gtatatctct gggagtatcc ccgatggcca cgagcttgat cgcttggaca atcccgcgtt 6900

acaaggcgcc aaatatgacc cagaaggtga gtacataagg caatggcttc ccgagcttgc 6960

gagattgcca actgaatgga tccatcatcc atgggacgct cctttaaccg tactcaaagc 7020

ttctggtgtg gaactcggaa caaactatgc gaaacccatt gtagacatcg acacagctcg 7080

tgagctacta gctaaagcta tttcaagaac ccgtgaagca cagatcatga tcggagcagc 7140

a 7141

<210> 16

<211> 174

<212> DNA

<213> 4xmyc

<400> 16

atggggttaa ttaacggtga acaaaagcta atctccgagg aagacttgaa cggtgaacaa 60

aaattaatct cagaagaaga cttgaacgga ctcgacggtg aacaaaagtt gatttctgaa 120

gaagatttga acggtgaaca aaagctaatc tccgaggaag acttgaacgg tagc 174

<210> 17

<211> 168

<212> DNA

<213> 6xflag

<400> 17

atgactgatt acaaggatga tgatgataag gactacaagg atgacgatga caaggattat 60

aaggatgacg acgataagga ctacaaggat gacgatgaca aggattataa ggacgatgac 120

gataaagact acaaggatga cgatgacaag ggaggaggtg gtggaggt 168

<210> 18

<211> 708

<212> DNA

<213> mcherry

<400> 18

atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60

gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120

cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180

ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240

cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300

gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360

ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420

atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480

gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540

gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600

aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660

cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaag 708

Claims (3)

1.一种拟南芥蓝光受体CRY2介导的蓝光诱导细胞凋亡的方法，其特征在于：所述方法包括载体设计以及构建、动物细胞的培养以及转染。

2.根据权利要求1所述的一种拟南芥蓝光受体CRY2介导的蓝光诱导细胞凋亡的方法，其特征在于：所述载体设计以及构建为：设计引物

PHR-F：5’-3’ gcgtggtacctctagaatgaagatggacaaaaagac，

PHR-R：5’-3’ TGAAGTCCATCCCGGGTGCTGCTCCGATCATGATC，

caspase8-F：5’-3’ cccgggatggacttcagcagaaa，

caspase8-R：5’-3’GAAGCGGCCGCCCGGGATCAGAAGGGAAGACAAGT，

CIBN-F：5’-3’ gcgtggtacctctagaatgaatggagctataggagg，

CIBN-R：TGAAGTCCATCCCGGGATGAATATAATCCGTTTTCT，

首先利用以上引物，分别以拟南芥cDNA和HEK293T细胞cDNA为模板，利用pcr技术将PHR、CIBN和caspase8扩增出来，然后利用引物PHR-F和caspase8-R以及CIBN-F和caspase8-R，体系中加入PHR、caspase8以及CIBN caspase8模板，进行重叠 PCR，此时将PHR caspase8以及CIBN caspase8融合到一起，回收后的PHR caspase8 和CIBN caspase8产物和限制性内切酶XbaI XmaI双酶切线性化的pci 4xmyc、pci 6xflag、以及pci mcherry载体连接，转化DH5a，菌落pcr验证大小正确的克隆送测序，测序正确的单菌落提取质粒并保菌；此时，构建好pci 4xmyc PHR caspase8、pci mcherry PHR caspase8、pci 6xflag CIBN caspase8动物表达载体。

3.根据权利要求1所述的一种拟南芥蓝光受体CRY2介导的蓝光诱导细胞凋亡的方法，其特征在于：所述的动物细胞的培养以及转染：37℃水浴迅速复苏冻存的细胞，然后将细胞冻存液800g离心5min，弃掉上清液，加入1ml DMEM细胞培养液重悬起来，加入到含有12mlDMEM培养基的75cm²的细胞培养瓶中，24h后换新鲜的DMEM培养基，待细胞铺板率到90%，继代，铺板，铺板24h后，进行细胞转染，利用lipo3000进行细胞转染，分别在六孔板中转染1微克pci 4xmyc PHR caspase8质粒，1微克pci 4xmyc PHR caspase8＋1微克pci 6xflagCIBN caspase8质粒，以及1微克pci mcherry PHR caspase8质粒，转染36h后进行蓝光处理，随后western鉴定或者激光共聚焦显微镜观测。