CN107778364B - 一种影响羊早期胚胎发育的nlrp7基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种影响羊早期胚胎发育的NLRP7基因及应用，NLRP7基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。该基因在雌性绵羊的卵巢组织中高表达，仅定位于卵泡内；本发明将NLRP7基因siRNA干扰片段和shRNA干扰质粒混合注射入成熟卵母细胞中，孤雌激活后发现NLRP7基因敲降后的胚胎出现了发育异常，这说明NLRP7是绵羊早期孤雌胚胎正常发育所需的关键基因，应用前景广阔。

Description

一种影响羊早期胚胎发育的NLRP7基因及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及一种影响羊早期胚胎发育的NLRP7基因及其应用，还涉及一种特异性抑制NLRP7基因表达的RNA干扰方法。

背景技术

NLRs(Nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat containing)即NOD样受体 家族，是生物体众多复杂的免疫识别系统之一，根据其结构域的不同又划分为好多亚家 族，其中，将含有pyrin结构域的亚家族称为NLRP亚家族。NLRP基因家族首先在人身上被发现，共有十四个成员，分别命名为NLRP1-NLRP14。在灵长类动物上也有十 四个成员，跟人的命名一样。相比与人的NLRP基因家族，小鼠的NLRP基因家族中没 有NLRP7、NLRP8、NLRP11和NLRP13，但是NLRP1、NLRP4和NLRP9在进化的过 程中发生了变化，又分别命名为NLRP1a、NLRP1b、NLRP1c、NLRP4a、NLRP4b、 NLRP4c、NLRP4d、NLRP4e、NLRP4f、NLRP4g、NLRP9a、NLRP9b、NLRP9c，总共 有二十个成员。在大鼠中也没有7、8、11、13，但只有NLRP4和NLRP9发生了变化， 和小鼠不同的是，大鼠没有NLRP4g和NLRP9c。研究表明，NLRP基因在哺乳动物进 化之前存在并发生复制，有一部分基因比较保守，如NLRP3(人和小鼠的同源性为80％ 以上)，然而，还有许多基因进化迅速导致动物谱系间序列的差异，如NLRP5(人和小鼠同源性为50％左右)和NLRP14(人和小鼠同源性为60％左右)。此外，除了部分成员 发生复制外，还有许多成员消失了，例如，NLRP8和NLRP13似乎在小鼠的进化过程 中退化了。在大动物上，该基因家族的研究并不是很多，许多物种的基因序列在NCBI 上都是预测的，尽管并不是在所有的物种中都有NLRP家族成员，但NLRP的同源基因 在生物的进化中是高度保守的。近年来，好多研究表明NLRP家族成员不止在免疫系统 中发挥重要作用，还在哺乳动物生殖系统中发挥作用。巧合的是，NLRP基因家族的进 化过程中，主要基因的复制和消失都与生殖相关，比如NLRP4(复制)、NLRP7(缺失)、 NLRP8(缺失)、NLRP9(复制)、NLRP11(缺失)、NLRP13(缺失)和NLRP14等， 这说明与生殖相关的基因在不同物种的系统发生过程中发生了快速的趋异进化。近年来 的研究显示，对于人类和猴子等灵长类动物来说，许多NLRP基因在其配子和早期胚胎 中表达，这表明NLRP基因在胚胎附植前的发育过程中起着某种作用(McDaniel P等， 2009)。繁殖相关的NLRP基因聚集在人19号染色体上，而对小鼠来说，则是聚集到7 号染色体上。

NLRP7(NACHT，Leucine-rich repeat and PYD containing 7)是NLRP蛋白家族中的一员。NLRP7拥有NLRP蛋白家族通常的结构域，比如亮氨酸重复域、NACHT结构 域和Pyrin结构域，其位于人类19号染色体q13.42位置，小鼠身上没有该基因。对于 NLRP7的研究主要集中在人和猕猴等灵长类动物身上，大动物上很少有报道，因此， 选择绵羊为实验对象来研究NLRP7的功能。

发明内容

本发明的目的是提供一种影响羊早期胚胎发育的NLRP7基因及其应用。

实现上述目的的技术方案如下：将NCBI数据库中不同物种的预测序列及存在序列比对后找出保守区，设计引物，首先通过普通PCR鉴定NLRP7基因在绵羊身上是否存在， 然后通过荧光定量PCR检测其不同组织中的相对表达量。结果发现NLRP7基因在绵羊身 上存在，且仅在卵巢组织中高表达，通过将绵羊卵巢组织切片进行免疫组化染色，确定 了NLRP7在绵羊卵巢组织中的定位，发现NLRP7仅存在于卵巢上的卵泡内，又以绵羊卵 丘卵母细胞复合体为材料进行RT-PCR克隆出该基因的部分CDS区，分析发现其在不同 物种间具有较高同源性。

本发明提供的影响动物早期胚胎发育的NLRP7基因，其具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列或与该核苷酸序列具有80％以上同源性且编码相同功能蛋白的核苷酸序列。所述动物为偶蹄类动物，优选绵羊，山羊，牛。

本发明提供了上述NLRP7基因或与该核苷酸序列具有80％以上同源性的核苷酸序列在调节动物早期胚胎发育中的应用。

本发明提供了上述NLRP7基因或与该核苷酸序列具有80％以上同源性的核苷酸序列在动物繁殖育种中的应用。

本发明提供了上述NLRP7基因的表达促进剂在促进动物早期胚胎正常发育中的应用。本发明提供了NLRP7基因的表达抑制剂在使动物早期胚胎发育异常中的应用。

本发明提供了上述NLRP7基因的siRNA在使动物早期胚胎发育异常中的应用，所述NLRP7基因的siRNA核苷酸序列如SEQ ID NO.6-7、SEQ ID NO.8-9和/或SEQ ID NO.10-11所示。

本发明提供了上述NLRP7基因的shRNA在使动物早期胚胎发育异常中的应用，所述NLRP7基因的shRNA核苷酸序列如SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16和/或SEQ ID NO.18所示。

上述的应用，所述的动物为绵羊、山羊、牛。

本发明提供一种抑制NLRP7基因表达的siRNA，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6-7、8-9和/或10-11所示

本发明提供一种抑制NLRP7基因表达的shRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16和/或SEQ ID NO.18所示。

本发明通过一种改良的RNA干扰方法研究了在体外早期胚胎中将靶基因NLRP7敲降进而研究NLRP7基因在孤雌胚胎发育中的功能。本发明的实施例中，对绵羊成熟的卵 母细胞进行显微注射NLRP7-siRNA和NLRP7-shRNA质粒，孤雌激活后进行体外培养， 结果发现敲降NLRP7基因后的大部分胚胎出现了发育阻滞现象，而对照组则发育正常， 这表明NLRP7基因对于绵羊早期孤雌胚胎发育十分关键。

本发明相对于现有技术具有如下优点及效果：(1)本发明最先在除灵长类以外的大动物身上系统研究了NLRP7基因，国内外文献未见相关报道。(2)根据大动物体外胚 胎的发育特点，本发明最先将siRNA联合shRNA质粒进行显微注射敲降靶基因，既发挥 了siRNA作用迅速的优点又发挥了shRNA作用持久的优点，国内外文献也未见相关报道。 (3)本发明提供的方法并不仅仅局限于NLRP7基因，还适用于其他基因的抑制表达； 本发明的研究对象实例为小尾寒羊，但本发明并不仅仅适用于绵羊，还适用于其他大动 物。本发明对于大动物早期胚胎发育的研究具有重要科学意义，可为人类葡萄胎疾病的 研究提供新的参考。

附图说明

图1为绵羊不同组织中NLRP7基因PCR产物电泳结果。第1泳道至第14泳道分别为心脏、肝脏、脾、肾脏、胃、子宫、输卵管、睾丸、卵巢、胎盘、下丘脑、垂体、松果体、 黄体。结果显示仅第九泳道跑出单一且明亮的条带。

图2为绵羊NLRP7和β-actin基因的扩增动力学曲线图。

图3为绵羊NLRP7和β-actin基因的熔解曲线图。图A、B为目的基因NLRP7的熔解曲线，图C、D为内参基因β-actin的熔解曲线。

图4为NLRP7mRNA在绵羊各组织中的表达情况。He心；Li肝脏；Sp脾；Ki肾 脏；St胃；Ut子宫；Ovi输卵管；Te睾丸；Ov卵巢；Pla胎盘；Hyp下丘脑；Pin垂 体；Pi松果体；CL黄体。

图5为NLRP7蛋白在绵羊卵巢各级卵泡中的表达定位情况。

图6为NLRP7基因克隆片段PCR产物凝胶电泳图。自左向右第1和4泳道为2000bpMarker，2、3泳道分别为COCs和无模板阴性对照组。

图7为NLRP7shRNA干扰载体图谱，图7A-图7D分别是NLRP7-shRNA干扰载体 pHS-ASR-LJ031、pHS-ASR-LJ032、pHS-ASR-LJ033和阴性对照载体pHS-ASR-LJ006。

图8为半定量NLRP7基因敲降效率验证图。1-6泳道分别为：2细胞期Non-injected组、 2细胞期Nc-siRNA+shRNA组、2细胞期NLRP7-siRNA+shRNA组；8细胞期Non-injected组；8细胞期Nc-siRNA+shRNA组；8细胞期NLRP7-siRNA+shRNA组。

图9为定量NLRP7基因敲降效率验证图。

图10为体式显微镜下观察体外培养第七天各组胚胎发育情况。A为Non-injected组； B为Nc-shRNA+siRNA组；C为NLRP7-shRNA+siRNA组。

图11为体外培养第7天各组胚胎发育情况统计。

具体实施方式

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若 未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。本研究所用的实验材料取自河北省廊坊市大厂回族自治县屠宰场。采集3只成年小尾寒羊的心脏、肝脏、脾、肾脏、胃(瘤胃)、子 宫、输卵管、睾丸(附睾头)、卵巢、胎盘(3月龄左右)、下丘脑、垂体、松果体、黄 体等14种组织。

实施例1 NLRP7基因在绵羊各组织中的表达差异

1、不同组织中总RNA的提取

2、RNA的反转录RNA去除基因组，试剂盒PrimeScript^TMRT reagent Kit with gDNAEraser(Perfect Real Time)购自Takara公司。

3、引物的设计与合成本发明通过NCBI将已公布或预测的人、山羊、牛等动物NLRP7基因编码区序列与绵羊NLRP7的预测序列一起经DNAMAN软件比对后，找出其共有的 保守部位，而后依据绵羊NLRP7预测序列的共有区域利用Primer Premier 5.0软件设计引 物。引物由北京生工生物有限公司合成，引物序列如下:

正义链：5'-TGCTTACCGGGACTTCTGTC-3'(序列表中SEQ ID No：1)；

反义链：5'-CCACTGCCAAGTGGTGTCA-3'(序列表中SEQ ID No：2)；

β-actin：(登录号为NM_001009784.1)

正义链：5'-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT-3'

反义链：5'-GGGCAGTGATCTCTTTCTGC-3'

4、RT-PCR和实时荧光定量PCR

反应程序为：94℃，5min，1个循环；94℃，15s，58-60℃，15s，72℃，20s，40 个循环；72℃，5min，1个循环；4℃保存；使用2.0％琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳 检测。PremixTaq Version 2.0plus dye购自Takara公司。荧光定量PCR反应体系为：10μL

480SYBR Green I Master、1μL Primer-F、1μL Primer-R、2μL模板、6μL ddH2O；反应程序为：①预孵：95℃，10min,1个循环；②扩增：95℃，10s,60℃，10s,72℃， 10s,72℃，3min，45个循环；③绘制溶解曲线：95℃，5s,65℃，1min,97℃，40个循环； ④冷却：40℃，10s，1个循环。PCR反应结束后检测观察曲线，是否呈单峰状，最后根 据NLRP7和内参基因(β-ctin)的Ct值计算出目的基因的相对表达量。试剂盒

480 SYBR Green I Master购自Roche公司。采用spass 21.0统计软件分别对实验数据进行 单因素方差分析(ANOVA)，P<0.05认为数据是有显着性差异的，P<0.01认为数据 差异极显着。均值的多重比较采用Duncan氏进行，结果用Means±SEM表示。

以反转录出的绵羊各组织cDNA为模板进行NLRP7基因和β-actin基因的PCR反应，凝胶电泳检测PCR产物并使用凝胶成像仪拍照，半定量结果如图1所示，扩增得到的目 的片段大小为181bp，与设计所需片段大小一致。本实施例中绵羊NLRP7和β-actin基因 PCR产物的扩增动力学曲线如图2所示，从曲线上可以看出大部分样品基线平齐无上扬， 拐点明显清晰，说明本实验具有较小系统误差，实验数据可信度及准确度较高。目的基 因NLRP7与内参基因β-actin的熔解曲线如图3所示，曲线峰均显示为单一且唯一，表明 PCR不存在非特异性条带和引物二聚体，产物单一，引物特异性较好，试验数据定量准 确，数据可用。

荧光定量PCR检测结果如图4所示，NLRP7mRNA在绵羊各个组织中的相对表达量 分别为：心脏(1.32±1.12)、肝脏(0.59±0.30)、脾(0.28±0.21)、肾脏(0.28±0.17)、胃(1.96±1.96)、子宫(0.61±0.49)、输卵管(2.17±1.78)、睾丸(1.86±1.50)、胎盘(0.25±0.15)、 下丘脑(0.61±0.35)、垂体(0.87±0.54)、松果体(0.39±0.17)、黄体(0.45±0.44)，而卵 巢(7.75±3.73)表达量极显著高于其他组织(P＜0.01)。这说明只有卵巢组织特异性高 表达NLRP7基因，其他组织表达十分微弱。

实施例2 NLRP7基因在绵羊卵巢内的表达定位与克隆

本实施例旨在通过免疫组织化学探明NLRP7蛋白在绵羊卵巢组织中的表达定位情况，同时，以绵羊卵丘卵母细胞体为材料，通过RT-PCR方法对绵羊NLRP7进行克隆。

1、石蜡切片的制备

2、免疫组织化学染色组化试剂盒购自中山金桥公司，货号PV-9001。免疫组化结果如图5所示，图中显示了位于卵巢皮质中的原始卵泡(A图)、初级卵泡(B图)、次级 卵泡(C、D图)、三级卵泡(E、F图)、成熟卵泡(G图)，阴性对照(H图)，的染 色情况，可见其中的各级卵母细胞的胞质深染棕黄色颗粒，围绕在卵母细胞周围的卵泡 细胞也有阳性着色，基质细胞没有明显着色，阴性对照则无阳性染色，次级卵泡阳性着 色较深，推测其在卵泡的成腔阶段表达量增多；结果表明，NLRP7蛋白主要定位于绵羊 卵泡内并且在卵泡发育的各个阶段持续表达。

3、绵羊卵丘卵母细胞的获取绵羊卵巢来自河北省廊坊市大厂回族自治县屠宰场。常 规方法获取绵羊卵丘卵母细胞。

4、克隆引物的设计与合成

正义链：5'-GCGATTGGGGTCTTGTTCTG-3'(序列表中SEQ ID No：3)；

反义链：5'-AGGATCTGGTTGTTCTGGCA-3'(序列表中SEQ ID No：4)；

5、RT-PCR PCR反应体系：25μL PrimeSTAR GXL DNAPolymerase、10μL 5×PrimeSTAR GXL Buffer、4μL dNTP Mixture(2.5mM each)、2μL Primer-F、2μL Primer-R、2μL模板、5μL ddH2O；PCR反应程序如下：98℃，5min，1个循环；98℃，15s，60℃， 15s，68℃，20s，35个循环；68℃，5min，1个循环；4℃保存。使用1.0％琼脂糖凝胶对 PCR产物进行电泳检测。采用的长链高保真酶

GXL DNA Polymerase购自 Takara公司，货号R050A。

6、常规方法进行PCR产物纯化、连接与转化

以绵羊GV期卵丘卵母细胞复合体cDNA为模板进行RT-PCR扩增反应，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，并在凝胶成像仪下观测和拍照。结果显示：如图6所示，在800bp 左右条带处有单一清晰的亮带与预测产物大小结果一致。测序成功后，使用DNAMAN 软件比对所测绵羊NLRP7序列与NCBI上已公布(含预测序列)马、山羊、猕猴、人、牛和 猪等多种动物的NLRP7序列，并进行同源性分析。结果显示，测序所得部分基因序列同 山羊、牛、人、猕猴、猪、马的mRNA预测序列的相似性分别达到99％、96％、75％、 74％、87％和83％。由此可得，NLRP7基因在不同物种间具有较高的同源性。所得序列 长度为763bp，结果如SEQ ID NO.5所示。

实施例3 NLRP7基因的敲降对绵羊早期胚胎发育的影响

RNA干扰通常采用siRNA，因其可短时间内快速发挥作用而被广泛应用，但由于siRNA容易降解，持续发挥作用的时间并不长，而绵羊早期胚胎发育通常要持续一周左 右，普通的siRNA很难一直靶向降解mRNA，到了胚胎发育靠后阶段其效力大大降低， 往往达不到持续敲降目的基因的效果，shRNA则可以被宿主细胞持续的合成而剪接为 siRNA，所以其具有持续时间长的特点，不足的是，shRNA干扰质粒进入宿主细胞后并 不会立马发挥作用，而是需要一定的时间转录翻译，利用内源性的Dicer酶产生siRNA而 后靶向降解目的基因mRNA。鉴于shRNA和siRNA各有优劣，因此，选择联合使用shRNA 和siRNA，既利用siRNA的快速发挥作用的优势，又利用shRNA持续作用时间长的优势， 以确保其能够有效的降解目的基因mRNA从而达到基因敲降的目的。本发明利用改良的 RNA干扰技术结合显微注射将NLRP7基因敲降来研究其在胚胎发育中的功能。

下述实施例中siRNA由上海吉玛生物有限公司合成,shRNA载体及序列由北京合生基因公司合成。

1、抑制NLRP7基因表达的siRNA和shRNA的设计合成

根据绵羊NLRP7基因序列(SEQ ID NO.5)，借助Ambion公司在网上提供的siRNA 工具软件(https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/rnai.html)，参照siRNA设 计原理，选择3个siRNA序列作为靶位点分别设计了3条合理的siRNA序列、一条阴性对 照序列，分别命名为LOC101102259-Ovis-1464、LOC101102259-Ovis-2614、LOC101102259-Ovis-3602、Negative control。NLRP7的shRNA则根据Invitrogen在线网 站(BLOCK-iT^TMRNAi Designer)进行设计，将得到的序列放进BLAST工具中进行严格的 序列同源性比对，确保设计的干扰序列在绵羊基因组中靶标序列的唯一性。将设计出来 的3条NLRP7shRNA干扰序列分别连接到表达载体 pZDonor_Seq1-U6-hEF1a-EGFP-2A-Puro-Seq2上，并且用一个无意义的shRNA序列作为 阴性对照，分别命名为pHS-ASR-LJ031、pHS-ASR-LJ032、pHS-ASR-LJ033、 pHS-ASR-LJ006。NLRP7siRNA和shRNA序列如下：

LOC101102259-Ovis-1464：

正义链：5'-GGAAGUUUACUGAAGAGAATT-3'(序列表中SEQ ID No：6)

反义链：5'-UUCUCUUCAGUAAACUUCCTT-3'(序列表中SEQ ID No：7)

LOC101102259-Ovis-2614：

正义链：5'-GCUCUGUGCUCAGUUCAAATT-3'(序列表中SEQ ID No：8)

反义链：5'-UUUGAACUGAGCACAGAGCTT-3'(序列表中SEQ ID No：9)

LOC101102259-Ovis-3602：

正义链：5'-GGACAAAUCUACCGUGGAATT-3'(序列表中SEQ ID No：10)

反义链：5'-UUCCACGGUAGAUUUGUCCTT-3'(序列表中SEQ ID No：11)

Negative control：

正义链：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'(序列表中SEQ ID No：12)

反义链：5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'(序列表中SEQ ID No：13)

干扰载体名称：pHS-ASR-LJ031,

shRNA：5'-ACCGCAGGTAGGAAAGAAGATATTCGAAAATATCTTCTTTCCTAC-3' (SEQ ID No：14)；载体骨架为pZDonor_Seq1-U6-NLRP-7shRNA001(NLRP-7Ovis aries 2504)-hEF1a-EGFP-2A-Puro-Seq2，载体序列为序列表中SEQ ID No：15。

干扰载体名称：pHS-ASR-LJ032，

shRNA：5'-ACCGCTGTCTTCTGCTTTGATTGTCGAAACAATCAAAGCAGAAG-3'(SEQ ID No：16)；载体骨架：pZDonor_Seq1-U6-NLRP-7shRNA002(NLRP-7Ovis aries 3122)-hEF1a-EGFP-2A-Puro-Seq2，载体序列为序列表中SEQ ID No：17。

干扰载体名称：pHS-ASR-LJ033，

shRNA：5'-ACCGCACTGAGATATTTCTCTTACCGAAGTAAGAGAAATATCTCA-3'(序 列表中SEQ ID No：18)；载体骨架：pZDonor_Seq1-U6-NLRP-7shRNA003(NLRP-7 Ovis aries3728)-hEF1a-EGFP-2A-Puro-Seq2，载体序列为序列表中SEQ ID No：19。

阴性对照载体名称：pHS-ASR-LJ006，

shRNA：5'-ACCGTAATTGTCAAATCAGAGTGCTTCAAGAGAAAGCACTCTGAT-3'(序 列表中SEQ ID No：20)；载体骨架：pZDonor_Seq1-U6-shRNA(FF5)-hEF1a-EGFP-2A-P uro-Seq2，载体序列为序列表中SEQ ID No：21。shRNA干扰载体图谱分别见图7A-图7D。

2、常规方法采集绵羊卵巢卵母细胞并体外培养卵母细胞成熟。

3、成熟卵母细胞的显微注射

实验分为三组，Non-injected(非注射组)、Nc-shRNA+siRNA(阴性对照注射组)、NLRP7-shRNA+siRNA(混合注射组)，每组50枚卵，实验重复四次。卵母细胞成熟 后用1％透明质酸酶(Sigma)脱掉卵丘，在60mm的培养皿上，用移液器将含有7.5μg/mL 细胞松弛素B的体外操作液制成体积为10μL的显微注射滴，并将带有NLRP7siRNA混 合shRNA干扰载体及阴性对照制成体积为2μL的小滴，置于显微注射滴的右侧，覆盖 石蜡油后放在38.5℃热台上预热，将MII期卵母细胞放入显微操作滴中；先将显微操作 仪(Olympus IX-71,奥林巴斯，日本)的视野转到干扰滴中，使右侧注射针吸如；再将视野 转回显微操作滴中，用左侧持卵针固定卵母细胞，注射针于3点钟方向刺入卵胞质中， 匀速注入其中，待透明带明显胀大后撤出注射针，平均每个卵母细胞的注射时间为30 sec，siRNA注射浓度为20μM，干扰质粒注射浓度为1μg/μl，注射剂量约为10pL。注射 后的MII期卵母细胞用操作液清洗三遍，放入成熟液中恢复30分钟，然后进行孤雌激活。 4、绵羊卵母细胞的孤雌激活及胚胎培养

对各组成熟卵母细胞用Ionomycin(离子霉素，Sigma)和6-DMAP(6-二甲基氨基 嘌呤,Sigma)和Cycloheximide(放线菌酮,Sigma)联合进行化学孤雌激活。其具体方法 为，将成熟的卵母细胞用0.2％透明质酸酶脱去卵丘细胞，再用发育液洗3次后置于含5 μmol/L离子霉素的发育液中处理5min；用发育液洗3次后，再将其置于含有2mmol/L 6-DMAP和10μg/mL CHX的发育中培养4h，激活后的胚胎用发育液洗3次后置于预先平 衡好的发育液滴中，于38.5℃、5％CO₂、饱和湿度条件下进行培养。体外培养7天后统 计各组胚胎发育情况。胚胎发育液(10ml)配方为公知技术；

卵母细胞及胚胎RNA的提取及反转录采用Invitrogen公司的微量试剂盒Cell tocDNA^TMII kit(AM1722)按照说明书进行。将卵母细胞经过显微注射的时间定为第0天， 合子培养24小时后定为发育的第一天，七天后观察并统计各组胚胎所处发育阶段。如图 10和图11所示，Non-injected(非注射组)和Nc-shRNA+siRNA(阴性对照注射组)都 有囊胚形成，囊胚率为10.06±3.57％vs.9.59±3.58％，差异不显著(P>0.05)，而NLRP7- shRNA+siRNA(混合注射组)大都阻滞在8到16细胞阶段，说明NLRP7基因表达量的下 降导致了绵羊早期胚胎发育异常。为了验证设计合成的干扰片段和干扰质粒的干扰效 率，在绵羊MII期卵母细胞注射干扰片和干扰质粒段的混合物后进行孤雌激活，而后进 行胚胎培养，收集2细胞期和8细胞期的早期胚胎，进行半定量PCR和实时荧光定量PCR 检测，RT-PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳后，结果如图8所示，第1、4泳道非注射组和第 2、5泳道阴性对照注射组的电泳条带明显比第3、6泳道干扰注射组条带亮，说明敲降组 NLRP7的表达量明显下降；通过实时荧光定量PCR检测NLRP7基因的表达量，结果如图 9所示，注射干扰片段和质粒的混合物能够将NLRP7基因的表达量降低至原水平的48.4％ (2细胞)、31.9％(8细胞)，P<0.01，能够高效降解NLRP7基因mRNA，与半定量结果 相符，结果表明，本发明提供的siRNA和shRNA干扰质粒混合注射后能够显著抑制绵羊 早期孤雌胚胎中NLRP7基因的表达，NLRP7基因表达量的降低会导致早期孤雌胚胎发育 异常。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业大学

<120> 一种影响羊早期胚胎发育的NLRP7基因及其应用

<130> KHP171114553.8

<160> 21

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列的描述：绵羊NLRP7基因PCR的正义链引物

<400> 1

tgcttaccgg gacttctgtc 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列的描述：绵羊NLRP7基因PCR的反义链引物

<400> 2

ccactgccaa gtggtgtca 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列的描述：克隆绵羊NLRP7基因正义链引物

<400> 3

gcgattgggg tcttgttctg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列的描述：克隆绵羊NLRP7基因反义链引物

<400> 4

aggatctggt tgttctggca 20

<210> 5

<211> 763

<212> DNA

<213> 绵羊

<400> 5

atagtgcgat tggggtcttg ttctgacacc acttggcagt gggctgactt ctcctcagca 60

ctcaaagtca accagtccct gaaatgcctg gatctcacgg ccagtgagtt cctggatgcg 120

ggtgtcaaat tgctgtgttt gactctgaga cacccgaagt gcgtcctgca gaaattgtcg 180

ttggagaact gtcagcttac agaagcctgt tgtaaggagc tgtcttctgc tttgattgtc 240

aaccagaggt tgacccacct gtgcttggcc aagaacgacc ttggggatgg cggggtgaag 300

actctgtgtg agggcttgag ttaccccgaa tgtcagctac agaccttggt gctgagtcat 360

tgcaacataa acagacatgg ctgcaagtac atctcaaagc ttctccaagg agactcgagc 420

ctcaccagcc tggacctggg tttcaacccc atagccaccg gactgtgttt tctctatgaa 480

gctttgaaga aaccaaattg taacctgaaa tgtctagggc tctggggctg ccccatcacc 540

ccgttcagtt gccagcatct cgcctccgct ctagtcagca gccggagcct ggaaacactg 600

gacttgggcc aggacgcctg gggacagagt ggcatcgtgg tgctccttaa ggctttaaaa 660

cagaaccacg gctccttaaa gatgctcagg ttgaagatgg acaaatctac cgtggaaatc 720

cagaggctgt tgaaggatgg aaggagaaca atcccagata gcg 763

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213>人工序列的描述：人工合成的小双链RNA正义链

<400> 6

ggaaguuuac ugaagagaat t 21

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213>人工序列的描述：人工合成的小双链RNA反义链

<400> 7

uucucuucag uaaacuucct t 21

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213>人工序列的描述：人工合成的小双链RNA正义链

<400> 8

gcucugugcu caguucaaat t 21

<210> 9

<211> 21

<212> RNA

<213>人工序列的描述：人工合成的小双链RNA反义链

<400> 9

uuugaacuga gcacagagct t 21

<210> 10

<211> 21

<212> RNA

<213>人工序列的描述：人工合成的小双链RNA正义链

<400> 10

ggacaaaucu accguggaat t 21

<210> 11

<211> 21

<212> RNA

<213>人工序列的描述：人工合成的小双链RNA反义链

<400> 11

uuccacggua gauuugucct t 21

<210> 12

<211> 21

<212> RNA

<213>人工序列的描述：人工合成的小双链RNA正义链

<400> 12

uucuccgaac gugucacgut t 21

<210> 13

<211> 21

<212> RNA

<213>人工序列的描述：人工合成的小双链RNA反义链

<400> 13

acgugacacg uucggagaat t 21

<210> 14

<211> 45

<212> DNA

<213>人工序列的描述：人工合成的shRNA的DNA序列

<400> 14

accgcaggta ggaaagaaga tattcgaaaa tatcttcttt cctac 45

<210> 15

<211> 6637

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cagggtaatt cggtcaagcc ttgccttgtt gtagcttaaa ttttgctcgc gcactactca 60

gcgacctcca acacacaagc agggagcaga tactggctta actatgcggc atcagagcag 120

attgtactga gagtgcacca taggggatcg ggagatctcc cgatccgtcg acgtcaggtg 180

gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa 240

atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga 300

agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc 360

ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg 420

gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc 480

gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat 540

tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg 600

acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag 660

aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa 720

cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc 780

gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca 840

cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc 900

tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc 960

tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg 1020

ggtcacgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta 1080

tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag 1140

gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga 1200

ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc 1260

tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa 1320

agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa 1380

aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc 1440

cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt 1500

agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc 1560

tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac 1620

gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca 1680

gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg 1740

ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag 1800

gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 1860

ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat 1920

ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc 1980

acatgttctt tattaccctg ttatccctaa ccggtttacc gagctcttat tggttttcaa 2040

acttcattga ctgtgccaag cttctgacct cttctcttcc tcccacaggg cctcgagaca 2100

attgcatcga tggtaccagt gaaagtctgc aatgaattcg agttggcgcg cctgtcattc 2160

taaatctctc tttcagccta aagctttttc cccgtatccc cccaggtgtc tgcaggctca 2220

aagagcagcg agaagcgttc agaggaaagc gatcccgtgc caccttcccc gtgcccgggc 2280

tgtccccgca cgctgccggc tcggggatgc ggggggagcg ccggaccgga gcggagcccc 2340

gggcggctcg ctgctgcccc ctagcggggg agggacgtaa ttacatccct gggggctttg 2400

ggagggggct gtccccgtga gctcccaggc gcgcctgtca ttctaaatct ctctttcagc 2460

ctaaagcttt ttccccgtat ccccccaggt gtctgcaggc tcaaagagca gcgagaagcg 2520

ttcagaggaa agcgatcccg tgccaccttc cccgtgcccg ggctgtcccc gcacgctgcc 2580

ggctcgggga tgcgggggga gcgccggacc ggagcggagc cccgggcggc tcgctgctgc 2640

cccctagcgg gggagggacg taattacatc cctgggggct ttgggggggg gctgtccccg 2700

tgagctccca ggcgcgccaa ctcggtaccg tatcgatgtc gacgttaacg ctagtgatat 2760

caactttgta tagaaaagtt ggctccgaat ttctcgagga attcggcagg aagagggcct 2820

atttcccatg attccttcat atttgcatat acgatacaag gctgttagag agataattag 2880

aattaatttg actgtaaaca caaagatatt agtacaaaat acgtgacgta gaaagtaata 2940

atttcttggg tagtttgcag ttttaaaatt atgttttaaa atggactatc atatgcttac 3000

cgtaacttga aagtatttcg atttcttggc tttatatatc ttgtggaaag gacgaaacac 3060

cgcaggtagg aaagaagata ttcgaaaata tcttctttcc tacctgcttt ttttaagctt 3120

ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgtgg 3180

ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt 3240

gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca 3300

gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca ggtaagtgcc 3360

gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt gccttgaatt 3420

acttccacct ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc ttcgggttgg aagtgggtgg 3480

gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt tgaggcctgg 3540

cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg tctcgctgct 3600

ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct ttttttctgg 3660

caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg gtatttcggt ttttggggcc 3720

gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg gggcctgcga 3780

gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc tctggtgcct 3840

ggcctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg gtcggcacca 3900

gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctg cagggagctc aaaatggagg 3960

acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaaaag ggcctttccg 4020

tcctcagccg tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg cgccgtccag gcacctcgat 4080

tagttctcga gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg gggaggggtt ttatgcgatg 4140

gagtttcccc acactgagtg ggtggagact gaagttaggc cagcttggca cttgatgtaa 4200

ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt tcattctcaa gcctcagaca 4260

gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtcccgggta actgatcata attcgaccca 4320

agtttgtaca aaaaagcagg ctgattaccg gagaattttc catggtgagc aagggcgagg 4380

agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca 4440

agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg accctgaagt 4500

tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accctgacct 4560

acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt 4620

ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact 4680

acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga 4740

agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca 4800

acagccacaa cgtctatatc atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca 4860

agatccgcca caacatcgag gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca 4920

cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg 4980

ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg 5040

ccgccgggat cactctcggc atggacgagc tgtacaagga gggccgcggc agcctgctga 5100

cctgcggcga cgtggaggaa aaccccggcc ccatgaccga gtacaagccc acggtgcgcc 5160

tcgccacccg cgacgacgtc ccccgggccg tacgcaccct cgccgccgcg ttcgccgact 5220

accccgccac gcgccacacc gtcgacccgg accgccacat cgagcgggtc accgagctgc 5280

aagaactctt cctcacgcgc gtcgggctcg acatcggcaa ggtgtgggtc gcggacgacg 5340

gcgccgcggt ggcggtctgg accacgccgg agagcgtcga agcgggggcg gtgttcgccg 5400

agatcggccc gcgcatggcc gagttgagcg gttcccggct ggccgcgcag caacagatgg 5460

aaggcctcct ggcgccgcac cggcccaagg agcccgcgtg gttcctggcc accgtcggcg 5520

tgtcgcccga ccaccagggc aagggtctgg gcagcgccgt cgtgctcccc ggagtggagg 5580

cggccgagcg cgccggggtg cccgccttcc tggaaacctc cgcgccccgc aacctcccct 5640

tctacgagcg gctcggcttc accgtcaccg ccgacgtcga ggtgcccgaa ggaccgcgca 5700

cctggtgcat gacccgcaag cccggtgcct gatgcagcgg ccgctacgga tccccgggta 5760

actgaaaatc caccggatct agataactga tctacccagc tttcttgtac aaagtggtac 5820

gcgtgaattc actcctcagg tgcaggctgc ctatcagaag gtggtggctg gtgtggccaa 5880

tgccctggct cacaaatacc actgagatct ttttccctct gccaaaaatt atggggacat 5940

catgaagccc cttgagcatc tgacttctgg ctaataaagg aaatttattt tcattgcaat 6000

agtgtgttgg aattttttgt gtctctcact cggaaggaca tatgggaggg caaatcattt 6060

aaaacatcag aatgagtatt tggtttagag tttggcaaca tatgcccata tgctggctgc 6120

catgaacaaa ggttggctat aaagaggtca tcagtatatg aaacagcccc ctgctgtcca 6180

ttccttattc catagaaaag ccttgacttg aggttagatt ttttttatat tttgttttgt 6240

gttatttttt tctttaacat ccctaaaatt ttccttacat gttttactag ccagattttt 6300

cctcctctcc tgactactcc cagtcatagc tgtccctctt ctcttatgga gatccctcga 6360

cctgcagccc aagcttggcg taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc 6420

cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct 6480

aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa 6540

acctgtcgtg ccagcggatc gacagtacta agcttggtgc gtttttatgc ttgtagtatt 6600

gtataatgtt tttaagatcc ttaattaata gggataa 6637

<210> 16

<211> 44

<212> DNA

<213>人工序列的描述：人工合成的shRNA的DNA序列

<400> 16

accgctgtct tctgctttga ttgtcgaaac aatcaaagca gaag 44

<210> 17

<211> 6637

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cagggtaatt cggtcaagcc ttgccttgtt gtagcttaaa ttttgctcgc gcactactca 60

gcgacctcca acacacaagc agggagcaga tactggctta actatgcggc atcagagcag 120

attgtactga gagtgcacca taggggatcg ggagatctcc cgatccgtcg acgtcaggtg 180

gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa 240

atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga 300

agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc 360

ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg 420

gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc 480

gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat 540

tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg 600

acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag 660

aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa 720

cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc 780

gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca 840

cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc 900

tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc 960

tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg 1020

ggtcacgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta 1080

tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag 1140

gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga 1200

ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc 1260

tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa 1320

agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa 1380

aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc 1440

cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt 1500

agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc 1560

tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac 1620

gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca 1680

gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg 1740

ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag 1800

gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 1860

ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat 1920

ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc 1980

acatgttctt tattaccctg ttatccctaa ccggtttacc gagctcttat tggttttcaa 2040

acttcattga ctgtgccaag cttctgacct cttctcttcc tcccacaggg cctcgagaca 2100

attgcatcga tggtaccagt gaaagtctgc aatgaattcg agttggcgcg cctgtcattc 2160

taaatctctc tttcagccta aagctttttc cccgtatccc cccaggtgtc tgcaggctca 2220

aagagcagcg agaagcgttc agaggaaagc gatcccgtgc caccttcccc gtgcccgggc 2280

tgtccccgca cgctgccggc tcggggatgc ggggggagcg ccggaccgga gcggagcccc 2340

gggcggctcg ctgctgcccc ctagcggggg agggacgtaa ttacatccct gggggctttg 2400

ggagggggct gtccccgtga gctcccaggc gcgcctgtca ttctaaatct ctctttcagc 2460

ctaaagcttt ttccccgtat ccccccaggt gtctgcaggc tcaaagagca gcgagaagcg 2520

ttcagaggaa agcgatcccg tgccaccttc cccgtgcccg ggctgtcccc gcacgctgcc 2580

ggctcgggga tgcgggggga gcgccggacc ggagcggagc cccgggcggc tcgctgctgc 2640

cccctagcgg gggagggacg taattacatc cctgggggct ttgggggggg gctgtccccg 2700

tgagctccca ggcgcgccaa ctcggtaccg tatcgatgtc gacgttaacg ctagtgatat 2760

caactttgta tagaaaagtt ggctccgaat ttctcgagga attcggcagg aagagggcct 2820

atttcccatg attccttcat atttgcatat acgatacaag gctgttagag agataattag 2880

aattaatttg actgtaaaca caaagatatt agtacaaaat acgtgacgta gaaagtaata 2940

atttcttggg tagtttgcag ttttaaaatt atgttttaaa atggactatc atatgcttac 3000

cgtaacttga aagtatttcg atttcttggc tttatatatc ttgtggaaag gacgaaacac 3060

cgctgtcttc tgctttgatt gtcgaaacaa tcaaagcaga agacagcttt ttttaagctt 3120

ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgtgg 3180

ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt 3240

gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca 3300

gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca ggtaagtgcc 3360

gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt gccttgaatt 3420

acttccacct ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc ttcgggttgg aagtgggtgg 3480

gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt tgaggcctgg 3540

cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg tctcgctgct 3600

ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct ttttttctgg 3660

caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg gtatttcggt ttttggggcc 3720

gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg gggcctgcga 3780

gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc tctggtgcct 3840

ggcctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg gtcggcacca 3900

gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctg cagggagctc aaaatggagg 3960

acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaaaag ggcctttccg 4020

tcctcagccg tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg cgccgtccag gcacctcgat 4080

tagttctcga gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg gggaggggtt ttatgcgatg 4140

gagtttcccc acactgagtg ggtggagact gaagttaggc cagcttggca cttgatgtaa 4200

ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt tcattctcaa gcctcagaca 4260

gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtcccgggta actgatcata attcgaccca 4320

agtttgtaca aaaaagcagg ctgattaccg gagaattttc catggtgagc aagggcgagg 4380

agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca 4440

agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg accctgaagt 4500

tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accctgacct 4560

acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt 4620

ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact 4680

acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga 4740

agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca 4800

acagccacaa cgtctatatc atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca 4860

agatccgcca caacatcgag gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca 4920

cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg 4980

ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg 5040

ccgccgggat cactctcggc atggacgagc tgtacaagga gggccgcggc agcctgctga 5100

cctgcggcga cgtggaggaa aaccccggcc ccatgaccga gtacaagccc acggtgcgcc 5160

tcgccacccg cgacgacgtc ccccgggccg tacgcaccct cgccgccgcg ttcgccgact 5220

accccgccac gcgccacacc gtcgacccgg accgccacat cgagcgggtc accgagctgc 5280

aagaactctt cctcacgcgc gtcgggctcg acatcggcaa ggtgtgggtc gcggacgacg 5340

gcgccgcggt ggcggtctgg accacgccgg agagcgtcga agcgggggcg gtgttcgccg 5400

agatcggccc gcgcatggcc gagttgagcg gttcccggct ggccgcgcag caacagatgg 5460

aaggcctcct ggcgccgcac cggcccaagg agcccgcgtg gttcctggcc accgtcggcg 5520

tgtcgcccga ccaccagggc aagggtctgg gcagcgccgt cgtgctcccc ggagtggagg 5580

cggccgagcg cgccggggtg cccgccttcc tggaaacctc cgcgccccgc aacctcccct 5640

tctacgagcg gctcggcttc accgtcaccg ccgacgtcga ggtgcccgaa ggaccgcgca 5700

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<212> DNA

<213>人工序列的描述：人工合成的shRNA的DNA序列

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<210> 19

<211> 6637

<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213>人工序列的描述：人工合成的shRNA的DNA序列

<400> 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

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ggacatcatg aagccccttg agcatctgac ttctggctaa taaaggaaat ttattttcat 6000

tgcaatagtg tgttggaatt ttttgtgtct ctcactcgga aggacatatg ggagggcaaa 6060

tcatttaaaa catcagaatg agtatttggt ttagagtttg gcaacatatg cccatatgct 6120

ggctgccatg aacaaaggtt ggctataaag aggtcatcag tatatgaaac agccccctgc 6180

tgtccattcc ttattccata gaaaagcctt gacttgaggt tagatttttt ttatattttg 6240

ttttgtgtta tttttttctt taacatccct aaaattttcc ttacatgttt tactagccag 6300

atttttcctc ctctcctgac tactcccagt catagctgtc cctcttctct tatggagatc 6360

cctcgacctg cagcccaagc ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt 6420

gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg 6480

gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt 6540

cgggaaacct gtcgtgccag cggatcgaca gtactaagct tggtgcgttt ttatgcttgt 6600

agtattgtat aatgttttta agatccttaa ttaataggga taa 6643

Claims (5)

1.NLRP7基因在调节绵羊早期胚胎发育中的应用，所述NLRP7基因为绵羊的NLRP7基因，具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；所述调节为通过抑制所述NLRP7基因的表达调节绵羊早期胚胎发育。

2.NLRP7基因在绵羊繁殖育种中的应用，所述NLRP7基因为绵羊的NLRP7基因，具有SEQID No.5所示的核苷酸序列；所述应用为通过抑制所述NLRP7基因的表达实现。

3.NLRP7基因的表达抑制剂在使绵羊早期胚胎发育异常中的应用，所述NLRP7基因为绵羊的NLRP7基因，具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。

4.NLRP7基因的siRNA在使绵羊早期胚胎发育异常中的应用，所述NLRP7基因为绵羊的NLRP7基因，具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；所述NLRP7基因的siRNA核苷酸序列如SEQID NO.6-7、SEQ ID NO.8-9和/或SEQ ID NO.10-11所示。

5.NLRP7基因的shRNA在使绵羊早期胚胎发育异常中的应用，所述NLRP7基因为绵羊的NLRP7基因，具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；所述NLRP7基因的shRNA核苷酸序列如SEQID NO.14、SEQ ID NO.16和/或SEQ ID NO.18所示。

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