CN105400812A - 一种猪流行腹泻蛋白重组质粒及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种猪流行性腹泻蛋白重组质粒，用于表达猪流行性腹泻病毒中S1蛋白、N蛋白和M蛋白，所述重组质粒携带有：载体质粒；和依次连接的猪流行性腹泻病毒S1蛋白编码基因、N蛋白编码基因和M蛋白编码基因。本发明还提供了上述猪流行性腹泻蛋白重组质粒的制备方法及应用。本发明提供的重组质粒在真核细胞内能够很好的表达PEDV的3个结构蛋白M、N和S1，能在哺乳动物细胞中高效表达，并且对小鼠具有较好的免疫效力；该重组质粒是采用载体质粒将S1、N、M依次连接在一起，采用IRES2代替内部启动子克服了启动子间的抑制现象，是较优的连接策略。

Description

一种猪流行腹泻蛋白重组质粒及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种猪流行腹泻蛋白重组质粒及其制备方法与应用。
背景技术
猪流行性腹泻(Porcineepidemicdiarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV)引起的病毒性高度传染性肠道疾病，以猪呕吐，严重腹泻脱水为主要临床症状特征。主要发生于7日龄内哺乳仔猪感染时发病最为多见，严重时可导致全群发病，只是哺乳仔猪严重死亡，保育猪和育肥猪增重减慢，对养猪业造成很大损失。
PEDV属于尼多病毒目冠状病毒科冠状病毒属，其基因组为不分节段的单股正链RNA,基因组全长约28033bp，编码的结构蛋白主要有纤突(spike)蛋白(即S蛋白)，囊膜(Membrane)蛋白(即M蛋白)，核衣壳(nucleocapsid)蛋白(即N蛋白)。PEDVS蛋白可以被划分为2个功能去即S1(第1-789位氨基酸和S2(第790-1383位氨基酸)，其中S1区包含了病毒主要的中和表位和受体结合域。
核酸疫苗是把外源基因克隆到真核质粒表达载体上，然后将重组的质粒DNA直接注射到动物体内，使外源基因在活体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，引发免疫反应。核酸疫苗与其他疫苗相比，具有无可比拟的优点：如生产成本低，易于构建适于大批量生产，可以根据需要随时进行更新，化学性质稳定，保存和运输方便，不存在减毒疫苗毒力回升的危险；选择抗原决定簇的自由空间比较大，可以同时构建编码不同蛋白质的重组质粒同时预防多种疾病，为制备联合疫苗方面提供了广阔空间。
核酸疫苗是在细胞水平上转移外源抗原基因，同时转移并表达多个外源基因在基因治疗领域有重要的应用价值。主要采取两种途径：一是多个携带不同基因的独立载体系统同时转染靶细胞，优点是可以自由调节各表达载体的比例，缺点是效率太低。二是在同一个载体上构建、表达多个基因。这种方式可以提高转移及表达效率，同时在使用的过程中一个质粒有多个基因，简单方便。
使用内部核糖体进入位点(InternalRibosomeEntrysite,IRES)连接多个基因是近年来多基因表达的重要方法，IRES序列来源于某些病毒和细胞的mRNA5’端的一段非翻译区。在上游启动子的控制下，该序列及与之相连的基因可同时转录，并以不依赖帽的方式启动远端mRNA的翻译，从而在同一转录本上翻译出不同的蛋白。采用IRES元件代替内部启动子克服了启动子间的抑制现象，尤其是当目的基因与其后的选择标记基因共同翻译时，是近几年来较为常用的连接方式。但IRES基因也存在上、下游基因表达不平衡的缺点。IRES2在IRES的基因上进行改良，效果更优。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种猪流行腹泻蛋白重组质粒。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种猪流行性腹泻蛋白重组质粒，用于表达猪流行性腹泻病毒中S1蛋白、N蛋白和M蛋白，所述重组质粒携带有：
载体质粒；和
依次连接的猪流行性腹泻病毒S1蛋白编码基因、N蛋白编码基因和M蛋白编码基因。
作为优选，所述S1蛋白编码基因与N蛋白编码基因通过IRES2肽连接，所述N蛋白编码基因与M蛋白编码基因通过IRES2肽连接。
作为优选，所述载体质粒为pVAX1载体质粒。
作为优选，该重组质粒为pVAX1-S1-IRES2-N-IRES2-M，其中pVAX1表示pVAX1载体质粒，S1表示S1蛋白编码基因，N表示N蛋白编码基因，M表示M蛋白编码基因，IRES2表示IRES2肽。
本发明的另一目的在于提供上述的猪流行性腹泻蛋白重组质粒的制备方法，包括以下步骤：
1)构建含有第一酶切位点-连接肽-N蛋白编码基因-连接肽-M蛋白编码基因-第二酶切位点序列的原核重组质粒；
2)构建含有第三酶切位点-S1蛋白编码基因-第一酶内切酶切位点序列的真核重组质粒，转化感受态，筛选第一阳性克隆；
3)将真核载体质粒与步骤1)构建的原核重组质粒双酶切，进行连接反应，得到含有真核载体质粒-连接肽-N蛋白编码基因-连接肽-M蛋白编码基因-第二酶切位点序列的真核重组质粒，转化感受态，筛选第二阳性克隆；
其中，所述真核载体质粒的一端含有第三酶切位点，另一端含有第二酶切位点；
4)将步骤2)第一阳性克隆和步骤3)得到的第二阳性克隆双酶切，进行连接反应，得到含有真核载体质粒-S1蛋白编码基因-连接肽-N蛋白编码基因-连接肽-M蛋白编码基因序列的重组质粒。
作为优选，所述连接肽为IRES2肽。
作为优选，所述第一酶切位点为NotI酶切位点，所述第二酶切位点为Xhol酶切位点，所述第三酶切位点为BamHI酶切位点。
作为优选，步骤2)中，构建含有第三酶切位点-S1蛋白编码基因-第一酶内切酶切位点序列的真核重组质粒的方法包括以下步骤：
1)以PEDV-S1的核酸序列为模板，以SEQIDNo.1和SEQIDNo.2为引物进行PCR扩增，得到S1基因片段：
SEQIDNo.1：CGCGGATCCATGAGGTCTTTAATTTAC；
SEQIDNo.2：ATAAGAATGCGGCCGCAATACTCATACTAAAGTT；
2)将扩增得到的S1基因片段与真核载体质粒连接，得到真核重组质粒；
所述真核载体质粒为pMD18-T。
作为优选，其制备方法包括以下步骤：
1)构建pUC57-NotI-IRES2-N-IRES2-M-Xhol原核重组质粒：
2)构建pMD18-T-S1，转化感受态，筛选第一阳性克隆；
a)以PEDV-S1的核酸序列为模板，以SEQIDNo.1和SEQIDNo.2为引物进行PCR扩增，得到S1基因片段：
SEQIDNo.1：CGCGGATCCATGAGGTCTTTAATTTAC；
SEQIDNo.2：ATAAGAATGCGGCCGCAATACTCATACTAAAGTT；
将扩增得到的S1基因片段与pMD18-T-Simple载体质粒连接，得到pMD18-T-S1质粒；
b)TA克隆
将步骤a)获得的特异性的S1片段与pMD18-Tsimple载体连接，连接产物转化DH5α，涂布于含有卡那青霉素的琼脂汤培养基上培养过夜，挑选单菌落于含有卡那青霉素的LB培养基上培养过夜，小提质粒，并进行BamHI/NotI双酶切鉴定，将pMD18-T-S1阳性克隆进行测序鉴定；
3)构建NotI-IRES2-N-IRES2-M-Xhol真核重组质粒；
将pVAX1质粒和pUC57-NotI-IRES2-N-IRES2-M-Xhol质粒，分别用NotI/Xhol双酶切，两者在T4DNA连接酶的作用下发生连接反应，连接产物转化DH5α，涂布于含有卡那青霉素抗性的琼脂糖培养基上培养过夜，小提质粒，进行PCR鉴定，得到pVAX1-NotI-IRES2-N-IRES2-M阳性克隆；
4)构建pVAX1-S1-IRES2-N-IRES2-M重组质粒；
将步骤2)得到的pMD18-T-S1阳性克隆与步骤3)得到pVAX1-NotI-IRES2-N-IRES2-M质粒阳性克隆分别用BamHI/NotI双酶切，两者在T4DNA连接酶的作用下发生连接反应，连接产物转化DH5α，涂布于含有卡那青霉素抗性的琼脂糖培养基上培养过夜，小提质粒，进行PCR鉴定和BamHI/NotI双酶切鉴定，得到阳性克隆，并送测序，证实pVAX1-S1-IRES2-N-IRES2-M质粒构建成功。
本发明的目的之三在于提供上述猪流行性腹泻蛋白重组质粒在制备猪流行性腹泻核酸疫苗中的应用。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明提供的质粒在真核细胞内能够很好的表达PEDV的3个结构蛋白M、N和S1，并且初步免疫小鼠具有较好的免疫效力；
2、本发明中，采用载体质粒将S1、N、M依次连接在一起，采用IRES2代替内部启动子克服了启动子间的抑制现象，是较优的连接策略；
3、本发明选取pVAX1作为表达载体，它能使重组蛋白在哺乳动物细胞中高效的表达。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1为猪流行腹泻蛋白重组质粒的构建示意图；
图2为pVAX1-S1-IRES2-N-IRES2-M重组质粒酶切图；
其中：
泳道M为KBladder；
泳道1为pVAX1-S1-IRES2-N-IRES2-M质粒；
泳道2为经BamHI/NotI双酶切的pVAX1-M-IRES2-N-IRES2-S1重组质粒；
图3为pVAX1-S1-IRES2-N-IRES2-M重组质粒PCR鉴定图；
其中，
泳道M为KBladder；
泳道1为pVAX1-S1-IRES2-N-IRES2-M重组质粒；
泳道2为经M引物扩增的pVAX1-S1-IRES2-N-IRES2-M重组质粒；
泳道3为经N引物扩增的pVAX1-S1-IRES2-N-IRES2-M重组质粒；
泳道4为经S1引物扩增的pVAX1-S1-IRES2-N-IRES2-M重组质粒；
图4为重组质粒转染细胞S蛋白单抗间接免疫荧光图；
图5为重组质粒转染细胞N蛋白单抗间接免疫荧光图；
图6为免疫小鼠血清抗体检测图；
图7为采用PEDV-S1为激活试剂的脾淋巴细胞增殖实验结果图；
图8为采用PEDV-M为激活试剂的脾淋巴细胞增殖实验结果图；
图9为采用PEDV-N为激活试剂的脾淋巴细胞增殖实验结果图；
图10为免疫小鼠的CD4+T淋巴细胞分析实验结果图；
图11为免疫小鼠的CD8+T淋巴细胞分析实验结果图；
图12为采用IFN-γELISA试剂盒进行细胞因子水平检测的结果图；
图13为采用小鼠IL-4ELISA试剂盒进行细胞因子水平检测的结果图。
具体实施方式
以下具体实施方式中，所采用的实验试剂、试剂盒或器材如未特殊说明，均视为市售或可通过常规试验手段获得。
本发明提供一种猪流行腹泻蛋白重组质粒，用于表达猪流行性腹泻病毒中M蛋白、N蛋白和S1蛋白，该组质粒携带有：载体质粒；和依次连接的猪流行性腹泻病毒S1蛋白编码基因、N蛋白编码基因和M蛋白编码基因。
所述S1蛋白编码基因和N蛋白编码基因通过连接肽连接，所述N蛋白编码基因和M蛋白编码基因通过连接肽连接，所述述连接肽为IRES2肽。该重组质粒为pVAX1-S1-IRES2-N-IRES2-M，其中pVAX1表示pVAX1载体质粒，S1表示S1蛋白编码基因，N表示N蛋白编码基因，M表示M蛋白编码基因，IRES2表示IRES2肽。
本发明中选取的S1、N和M蛋白编码基因均参考PEDV经典毒株CV777的序列，GeneBank所公布的编号为：AF353511,其中PEDV-S基因长4152bp，位于20638bp-24789bp，插入目的基因S1包含了病毒主要的中和表位和受体结合域，位于20638bp-23004bp位置，长2367bp；N基因全长1326bp，插入目的基因的mRNA片段序列为其全部ORF区域，位于26374bp-27699bp；M基因全长681bp，插入目的基因的mRNA片段序列为全部ORF区域，位于25682bp-26362bp。
其中试剂载体：pVAX1(2999bp)购自invitrogen,lifetechnologies，连接酶T4polymerase(Takara)、转染试剂lipofectamineLTXPLUSReagent购自invitrogen,lifetechnologies。S蛋白单克隆抗体由本实验室制作并保存，N蛋白单克隆抗体由中国农业科学院上海兽医研究所猪病课题组周艳君副研究员赠送。猪流行性腹泻病毒ELISA抗体检测试剂盒购自哈尔滨动物生物制品国家工程研究中心有限公司，FITC-conjugatedanti-CD4+antibody(Cat.NO.11-0041)、PE-conjugatedanti-CD8+antibody(Cat.NO.12-0081)购自eBioscience。小鼠IFN-γELISA试剂盒(CatNO.EM007)和小鼠IL-4ELISA试剂盒(CatNO.EM003)购自上海依科赛生物制品有限公司。
实验设备包括：PCR仪(Biorad,美国)、移液器(eppendorf,德国)、超净工作台(上海苏净安泰)、实验室冷冻冷藏冰箱(海尔)、电热恒温培养箱(上海一恒)、恒温摇床(上海一恒)、电热恒温水浴锅(上海一恒)、电泳仪(Biorad,美国)、数码凝胶成像系统(天能科学仪器)。
实施例1
一种猪流行腹泻蛋白重组质粒，用于表达猪流行性腹泻病毒中M蛋白、N蛋白和S1蛋白，该重组质粒为pVAX1-S1-IRES2-N-IRES2-M，其制备方法包括以下步骤：
1)构建NotI-IRES2-N-IRES2-M-Xhol原核重组质粒：
构建NotI-IRES2-N-IRES2-M-Xhol的序列，其序列如SEQIDNo.3所示，将其与pUC57载体质粒连接，得到pUC57-NotI-IRES2-N-IRES2-M-Xhol原核重组质粒；
2)构建pMD18-T-S1重组质粒，转化感受态，筛选阳性克隆；
a)以PEDV-S1的核酸序列为模板，以SEQIDNo.1和SEQIDNo.2为引物进行PCR扩增，得到S1基因片段：
SEQIDNo.1：CGCGGATCCATGAGGTCTTTAATTTAC；
SEQIDNo.2：ATAAGAATGCGGCCGCAATACTCATACTAAAGTT；
将扩增得到的S1基因片段与pMD18-T-Simple载体质粒连接，得到pMD18-T-S1质粒。
其中，GGATCC为BamHI酶切位点，GCGGCCGC为NotI酶切位点，选择LATaq，扩增条件为：起始变性95℃，5min,然后执行如下反应条件：95℃，1min，56.1℃，3min；72℃，1min；30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见扩增出2367bp特异性的S1片段，回收并纯化，其序列如SEQIDNo.4所示；
b)TA克隆
将步骤a)获得的特异性的S1片段与pMD18-Tsimple载体连接，连接产物转化DH5α，涂布于含有卡那青霉素的琼脂汤培养基上培养过夜，挑选单菌落于含有卡那青霉素的LB培养基上培养过夜，小提质粒，并进行BamHI/NotI双酶切鉴定，将阳性克隆pMD18-T-S1进行测序鉴定。
3)构建NotI-IRES2-N-IRES2-M-Xhol真核重组质粒；
将pVAX1质粒、pUC57-NotI-IRES2-N-IRES2-M-Xhol质粒，分别用NotI/Xhol双酶切，两者在T4DNA连接酶的作用下发生连接反应，连接产物转化DH5α，涂布于含有卡那青霉素抗性的琼脂糖培养基上培养过夜，小提质粒，进行PCR鉴定，得到阳性克隆，并送测序，证实pVAX1-NotI-IRES2-N-IRES2-M质粒构建成功；
4)构建pVAX1-S1-IRES2-N-IRES2-M重组质粒；
将步骤2)得到的pMD18-T-S1阳性克隆与步骤3)得到pVAX1-NotI-IRES2-N-IRES2-M质粒分别用BamHI/NotI双酶切，两者在T4DNA连接酶的作用下发生连接反应，连接产物转化DH5α，涂布于含有卡那青霉素抗性的琼脂糖培养基上培养过夜，小提质粒，进行PCR鉴定和BamHI/NotI双酶切鉴定，得到阳性克隆，并送测序，证实pVAX1-S1-IRES2-N-IRES2-M质粒构建成功。
pVAX1-S1-IRES2-N-IRES2-M质粒的结构示意图如图1所示。
其中，重组质粒使用BamHI/NotI双酶切鉴定，酶切图如图2所示，得到两个片段，大小分别在2500bp和6500bp左右，与理论值相符。
重组质粒使用S1、M和N上下游引物扩增鉴定，其PCR鉴定图如图3所示，经琼脂糖凝胶电泳检测，扩增到3个片段，大小分别约为681bp、1326bp和2367bp，与预期大小相符；经测序，与参考序列PEDV经典毒株CV777(AF353511)的M、N和S1基因序列相符。
检测实施例
1、免疫检测
在本检测实施例中，先将实施例1获得的pVAX1-S1-IRES2-N-IRES2-M转染293-T细胞，于24孔板中培养，得到转染复合物，37℃细胞培养箱孵育48小时后，使用4％的多聚甲醛室温下固定10min,PBS清洗后，用0.2％的TritonX-100透化固定后的细胞，2min后用PBS清洗，后使用抗PEDVN蛋白单克隆抗体和抗PEDVS蛋白单克隆抗体对转染复合物进行间接免疫荧光检测。
具体操作如下：
1)提取质粒：
使用去内毒素的试剂盒提取质粒pVAX1-S1-IRES2-N-IRES2-M，并使用紫外分光光度计测得核酸浓度。
2)转染：
培养293-T细胞，转染前一天进行细胞传代并铺24孔板(50％-80％的细胞汇集度)，每孔中含有500μL完全生长培养基，细胞培养过夜，在细胞密度达到70％-90％可进行转染。按照下表配比将LipofectamineLTXReagent与Opti-MEMReducedSerumMedium进行混合，得到混合液A：
按照下表配比将DNA,PlusTMReagent使用Opti-MEMReducedSerumMedium进行稀释，得到混合液B：
将混合液A和混合液B各取50μL轻柔混合均匀后，在常温下孵育5min，得到转染复合物。将细胞培养板中的完全培养液弃去，用PBS冲洗干净后，以逐滴加入的方式，在每孔中加入100μL转染复合物。轻柔晃动24孔板，将转染复合物和细胞培养物混合，细胞继续培养24-72h后，进行固定和检测。
3)细胞固定及检测
使用4％的多聚甲醛室温下固定10min,后用0.2％的TritonX-100透化固定后的细胞，再使用抗PEDVN蛋白单克隆抗体和抗PEDVS蛋白单克隆抗体对上述培养的转染复合物进行间接免疫荧光检测。
具体操作如下：
固定细胞培养板：用PBS洗1次，弃去PBS。加入4％的多聚甲醛，室温下静止10min。用PBS洗两次，后弃去PBS。用0.2％的TritonX-100透化固定后的细胞，2min,室温，PBS洗4次。
间接免疫荧光检测：
①每孔加入稀释好的抗PEDV单抗100μL，轻柔晃动24孔板，使单抗和细胞混合，将24孔板放入湿盒中，37℃，孵育1h；
②单抗弃去，PBS，洗涤5遍；
③加入二抗，同步骤①；
④洗涤，同步骤②；
⑤荧光显微镜下观察。
荧光检测结果如图4和5所示，在荧光显微镜的视野中，可观察到有多个荧光强度高的色斑，即为特异性的N蛋白、S蛋白与相应抗体结合后显现出的荧光，证明质粒pVAX1-S1-IRES2-N-IRES2-M可在真核质粒中成功表达S1蛋白和N蛋白。
2、小鼠免疫性试验
本检测实施例中，先对小鼠进行质粒免疫处理，再检测其抗体水平，并进行淋巴细胞增殖实验、T淋巴细胞分析、细胞因子水平检测。
1)免疫小鼠
6-8周龄清洁级健康雌性BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，共100只，每组20只，分成5组，分别进行免疫，首免后每间隔14天加强免疫一次，然后间隔14天后再加强免疫一次，一共免疫3次，试验参数具体如下表所示：
2)抗体水平检测
在首次免疫后的第7，14，21，28，35，42，56天采血，分离血清，按照猪流行性腹泻病毒ELISA试剂盒操作说明进行检测。具体操作为：所有的试剂恢复到室温，配置1×洗涤液，将阴、阳性血清对照和处理好的待检血清，加入到包被板中，100μL/孔。置37℃下作用1小时。用洗涤液洗涤，200～300μL/孔，共5次。加兔抗鼠IgG酶标抗体，100μL/孔。置37℃下作用1小时。用洗涤液洗涤，200～300μL/孔，共5次。加底物溶液，100μL/孔，在室温下(15～25℃)，显色10分钟。加终止液，50μL/孔，5分钟内用酶标仪读取其吸光值(OD450nm值)，并记录数值，绘成柱形图。同一时间点不同组的值使用SPASS软件进行显著性分析(p<0.05)，用小写英文字母标识，不同字母标识的组存在显著性差异。
实验结果如图6所示，结果表明，质粒pVAX1-S1-IRES2-N-IRES2-M组抗体水平持续上升，在首免后42天达到高峰，后持平稳。显著性分析显示：质粒pVAX1-S1-IRES2-N-IRES2-M组抗体水平在各个时间点均显著高于pVAX1质粒组和PBS对照组，与灭活疫苗组比较无显著性差异。表明pVAX1-S1-IRES2-N-IRES2-M质粒可在小鼠体内诱导相应抗体的产生。
3)淋巴细胞增殖实验
在首次免疫后的第14，28，42，56天采血，分别处死5只小鼠，取脾脏，分离脾淋巴细胞。制备细胞悬液(2×106cells/ml，RPMI1640培养基，包含10％血清)，加入到96孔细胞培养板中，50μL/孔。同时，每孔分别加入50μL，20μg/mL纯化的PEDV-S1或PEDV-M,每个蛋白重复3次。将细胞板在37℃孵育72小时后，加入10μL/孔的MTT，再放置在37℃孵育4小时。每孔加入100μL的DMSO终止实验，室温下孵育10min,用酶标仪读取其吸光值(OD490nm值)，并记录数值，绘成柱形图。同一实验组求取平均值，同一时间点不同组的值使用SPASS软件进行显著性分析(p<0.05),用小写英文字母标识，不同字母标识的组存在显著性差异。
使用S1蛋白刺激脾淋巴细胞，其结果见图7所示，OD值在首免后持续上升，28天达到高峰，显著性分析显示：质粒PVAX1-S1-IRES2-N-IRES2-M组显著高于PBS组，但显著低于灭活疫苗免疫组；
使用N蛋白刺激脾淋巴细胞，其结果见图8所示，OD值在首免后42天达到高峰，显著性分析显示：质粒PVAX1-S1-IRES2-N-IRES2-M组显著高于PBS组，同时与灭活疫苗免疫组无显著性差异；
使用M蛋白刺激脾淋巴细胞，其结果见图9所示，OD值在首免后42天达到高峰，显著性分析显示：质粒PVAX1-S1-IRES2-N-IRES2-M组显著高于PBS组，同时与灭活疫苗免疫组无显著性差异。
4)T淋巴细胞分析
T淋巴细胞分析是为了检验真核质粒免疫小鼠的CD4+/CD8+T细胞变化。
在首次免疫后的第14，28，42，56天采血，分别处死5只小鼠，取脾脏，分离脾淋巴细胞。制备细胞悬液(1×107cells/ml，RPMI1640培养基，包含10％血清)，然后将细胞与FITC-conjugatedanti-CD4+antibody/PE-conjugatedanti-CD8+antibody孵育30min,然后用PBS洗5遍，上流式细胞仪，分析CD4+/CD8+细胞所占百分比，绘制柱形图。同一时间点不同组的值使用SPASS软件进行显著性分析(p<0.05)，用小写英文字母标识，不同字母标识的组存在显著性差异。
免疫小鼠的CD4+T淋巴细胞分析实验结果图10所示，质粒PVAX1-S1-IRES2-N-IRES2-M组CD4+细胞水平在首免后42天达到最高，仅低于灭活疫苗组。显著性分析显示：在42DPI,质粒PVAX1-S1-IRES2-N-IRES2-M组显著高与其它组，与灭活疫苗组比较显著性差异。
免疫小鼠的CD8+T淋巴细胞分析实验结果图11所示，CD8+细胞水平在首免后56天达到最高，仅低于灭活疫苗组，存在显著性差异。
5)细胞因子水平检测
从免疫学角度来说，IFN-γ是细胞免疫水平的指征，而IL-4则指征体液免疫水平。在首次免疫后的第14，28，42，56天采血，分离血清，按照小鼠IFN-γELISA试剂盒(上海依科赛生物制品有限公司，CatNO.EM007)和小鼠IL-4ELISA试剂盒(上海依科赛生物制品有限公司，CatNO.EM003)的操作说明进行检测。结果判定：将每个标准品和标本的OD值应减去零孔的OD值；使用CurveExpert1.3绘制标准曲线，以标准品浓度作横坐标，OD值做纵坐标，选择Linear或Quadratic既可获得两条标准曲线。Linear为直线方程，Quadratic为二次方程。比较两条曲线的相关系数(即r值，在标准曲线的右上角)。选择r值高的标准曲线使用(保证r≥0.98)。最后通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。通过每个样品的浓度得到每组的平均值，同一时间点不同组的平均值使用SPASS软件进行显著性分析(p<0.05)，绘图时用小写英文字母标识，不同字母标识的组存在显著性差异。
采用IFN-γELISA试剂盒进行细胞因子水平检测的结果图如图12所示，采用小鼠IL-4ELISA试剂盒进行细胞因子水平检测的结果图如图13所示，各组小鼠外周血的IFN-γ水平在0DPI,14DPI均没有太大的差异，在28DPI、42DPI和56DPI,重组质粒PVAX1-S1-IRES2-N-IRES2-M组显著高于PBS组和PVAX1组；低于PEDV(灭活疫苗)组，比较后显示但并无显著性差异。细胞因子IL-4的浓度，重组质粒PVAX1-S1-IRES2-N-IRES2-M组逐步升高，56DPI达到高峰，显著性分析显示：显著高于PBS组和PVAX1组；显著低于PEDV(灭活疫苗)组。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种猪流行性腹泻蛋白重组质粒，用于表达猪流行性腹泻病毒中S1蛋白、N蛋白和M蛋白，其特征在于，所述重组质粒携带有：
载体质粒；和
依次连接的猪流行性腹泻病毒S1蛋白编码基因、N蛋白编码基因和M蛋白编码基因。
2.如权利要求1所述的猪流行性腹泻蛋白重组质粒，其特征在于，所述S1蛋白编码基因与N蛋白编码基因通过IRES2肽连接，所述N蛋白编码基因与M蛋白编码基因通过IRES2肽连接。
3.权利要求1所述的猪流行性腹泻蛋白重组质粒，其特征在于，所述载体质粒为pVAX1载体质粒。
4.如权利要求1所述的猪流行性腹泻蛋白重组质粒，其特征在于，该重组质粒为pVAX1-S1-IRES2-N-IRES2-M，其中pVAX1表示pVAX1载体质粒，S1表示S1蛋白编码基因，N表示N蛋白编码基因，M表示M蛋白编码基因，IRES2表示IRES2肽。
5.如权利要求1-4任一项所述的猪流行性腹泻蛋白重组质粒的制备方法，包括以下步骤：
1)构建含有第一酶切位点-连接肽-N蛋白编码基因-连接肽-M蛋白编码基因-第二酶切位点序列的原核重组质粒；
2)构建含有第三酶切位点-S1蛋白编码基因-第一酶内切酶切位点序列的真核重组质粒，转化感受态，筛选第一阳性克隆；
3)将真核载体质粒与步骤1)构建的原核重组质粒双酶切，进行连接反应，得到含有真核载体质粒-连接肽-N蛋白编码基因-连接肽-M蛋白编码基因-第二酶切位点序列的真核重组质粒，转化感受态，筛选第二阳性克隆；
其中，所述真核载体质粒的一端含有第三酶切位点，另一端含有第二酶切位点；
4)将步骤2)第一阳性克隆和步骤3)得到的第二阳性克隆双酶切，进行连接反应，得到含有真核载体质粒-S1蛋白编码基因-连接肽-N蛋白编码基因-连接肽-M蛋白编码基因序列的重组质粒。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述连接肽为IRES2肽。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第一酶切位点为NotI酶切位点，所述第二酶切位点为XhoI酶切位点，所述第三酶切位点为BamHI酶切位点。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)中，构建含有第三酶切位点-S1蛋白编码基因-第一酶内切酶切位点序列的真核重组质粒的方法包括以下步骤：
1)以PEDV-S1的核酸序列为模板，以SEQIDNo.1和SEQIDNo.2为引物进行PCR扩增，得到S1基因片段：
SEQIDNo.1：CGCGGATCCATGAGGTCTTTAATTTAC；
SEQIDNo.2：ATAAGAATGCGGCCGCAATACTCATACTAAAGTT；
2)将扩增得到的S1基因片段与真核载体质粒连接，得到真核重组质粒；
所述真核载体质粒为pMD18-T。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，其制备方法包括以下步骤：
1)构建pUC57-NotI-IRES2-N-IRES2-M-Xhol原核重组质粒：
2)构建pMD18-T-S1，转化感受态，筛选pMD18-T-S1阳性克隆；
a)以PEDV-S1的核酸序列为模板，以SEQIDNo.1和SEQIDNo.2为引物进行PCR扩增，得到S1基因片段；
SEQIDNo.1：CGCGGATCCATGAGGTCTTTAATTTAC；
SEQIDNo.2：ATAAGAATGCGGCCGCAATACTCATACTAAAGTT；
将扩增得到的S1基因片段与pMD18-T-Simple载体质粒连接，得到pMD18-T-S1质粒；
b)TA克隆
将步骤a)获得的特异性的S1片段与pMD18-Tsimple载体连接，连接产物转化DH5α，涂布于含有卡那青霉素的琼脂汤培养基上培养过夜，挑选单菌落于含有卡那青霉素的LB培养基上培养过夜，小提质粒，并进行BamHI/NotI双酶切鉴定，将pMD18-T-S1阳性克隆进行测序鉴定；
3)构建NotI-IRES2-N-IRES2-M-Xhol真核重组质粒；
将pVAX1质粒和pUC57-NotI-IRES2-N-IRES2-M-Xhol质粒，分别用NotI/Xhol双酶切，两者在T4DNA连接酶的作用下发生连接反应，连接产物转化DH5α，涂布于含有卡那青霉素抗性的琼脂糖培养基上培养过夜，小提质粒，进行PCR鉴定，得到pVAX1-NotI-IRES2-N-IRES2-M阳性克隆；
4)构建pVAX1-S1-IRES2-N-IRES2-M重组质粒；
将步骤2)得到的pMD18-T-S1质粒与步骤3)得到pVAX1-NotI-IRES2-N-IRES2-M质粒阳性克隆分别用BamHI/NotI双酶切，两者在T4DNA连接酶的作用下发生连接反应，连接产物转化DH5α，涂布于含有卡那青霉素抗性的琼脂糖培养基上培养过夜，小提质粒，进行PCR鉴定和BamHI/NotI双酶切鉴定，得到阳性克隆，并送测序，证实pVAX1-S1-IRES2-N-IRES2-M质粒构建成功。
10.如权利要求1-4任一项所述的猪流行性腹泻蛋白重组质粒在制备猪流行性腹泻核酸疫苗中的应用。
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