CN103301476A - 猪流行性腹泻病基因重组疫苗及其构建引物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种猪流行性腹泻病基因重组疫苗及其构建引物和方法，猪流行性腹泻病基因重组疫苗，其序列如序列表Seq No.1所示。用于构建猪流行性腹泻病基因重组疫苗的引物对，上引物P1：如序列表Seq No.2所示；下引物P2：如序列表Seq No.3所示。构建方法，包括如下步骤：根据现有质粒EasyT-S的核苷酸序列设计引物对；进行常规链式聚合酶反应扩增PEDV S基因；构建重组质粒pVAX1-PEDV S。本试验首次将PEDV S基因插入真核载体中构建质粒并将其作为预防猪流行性腹泻病的核酸疫苗。本发明具有制备简单，省时省力，成本低，稳定性好的优点。

Description

猪流行性腹泻病基因重组疫苗及其构建引物和方法

技术领域

本发明属于动物疫苗制造技术领域，具体涉及一种猪流行性腹泻病基因重组疫苗(pVAX1-PEDV S)及其构建引物和方法。

背景技术

核酸疫苗，就是把外源基因克隆到真核质粒表达载体上，然后将重组的质粒DNA直接注射到动物体内，使外源基因在活体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，引发免疫反应。

目前，国内外市场使用的仔猪冠状病毒性腹泻疫苗主要有3种：一是灭活苗，因为只能通过注射免疫，仔猪无法获得SIgA，保护效果不佳；二是弱毒苗，由于存在着成本高、易返祖、有潜在感染危险等缺陷，很难在实践中推广应用；三是强毒疫苗，主要用于妊娠母猪免疫使新生仔猪获得被动保护，但由于病毒毒力过强，有使母猪流产和散毒的危险，不能为养猪业所接受。

DNA疫苗与其他疫苗相比，具有无可比拟的优点，如生产成本较低，适于大批量生产；可根据需要随时进行更新；便于运输和保存；安全性好，不存在减毒疫苗毒力回升的危险；抗原相关表位比较稳定，因此，不会像弱毒疫苗或亚单位疫苗会丢失表位；免疫保护效果好；重组质粒DNA在宿主体内存在时间长，避免免疫逃脱现象。

发明内容

基于以上不足之处，本发明目的是提供一种全新的猪流行性腹泻病基因重组疫苗(pVAX1-PEDV S)，用于更好的保护猪群尤其是仔猪。本发明首次将PEDV S基因插入真核载体中构建质粒并将其作为预防猪流行性腹泻病的核酸疫苗，该核酸疫苗制备简单，省时省力，成本低，稳定性好。总之，该核酸疫苗有望在猪流行性腹泻病的防治中发挥重要作用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种猪流行性腹泻病基因重组疫苗(pVAX1-PEDV S)，序列如序列表Seq No.1所示。

本发明还具有如下技术特征：

1、一种用于构建猪流行性腹泻病基因重组疫苗(pVAX1-PEDV S)的引物对，上引物P1：如序列表Seq No.2所示；下引物P2：如序列表Seq No.3所示。

2、一种猪流行性腹泻病基因重组疫苗(pVAX1-PEDV S)的构建方法，包括如下步骤：

(1)根据现有质粒EasyT-S的核苷酸序列设计引物对，

P1：5’-GGGGGGATCCATGAGGTCTTTAATTTAC-3’

(下划线表示引入的酶切位点为BamH I)

P2：5’-CCCCGAATTCTCACTGCACGTGGACCTT-3’

(下划线表示引入的酶切位点为EcoR I)；

(2)进行常规链式聚合酶反应扩增PEDV S基因；

(3)构建重组质粒pVAX1-PEDV S。

3、如上所述的一种猪流行性腹泻病基因重组疫苗(pVAX1-PEDV S)的构建方法，其所述的步骤(2)采用常规链式聚合酶反应的具体步骤如下：将混合液在94℃预变性5min，然后进入下列循环：94℃、135s，57.6℃、135s，72℃、4min，共进行30个循环，最后72℃延伸10min，扩增完毕后置4℃终止反应；

所述混合液组成如下：

4、如上所述的一种猪流行性腹泻病基因重组疫苗(pVAX1-PEDV S)的构建方法，其所述的步骤(3)质粒pVAX1-PEDV S的重组构建方法具体步骤如下：用限制性内切酶BamH I和EcoR I酶切消化PCR所得PEDV S基因产物和pVAX1载体，分别获得PEDV S基因片段和线性载体pVAX1，将所得片段胶回收后进行体外连接，构建重组质粒pVAX1-PEDV S，将疑似阳性的质粒送华大基因测序，将测序鉴定为阳性的重组质粒命名为pVAX1-PEDV S。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：(1)本试验首次将PEDV S基因插入真核载体中构建质粒并将其作为预防猪流行性腹泻病的核酸疫苗。(2)该核酸疫苗制备简单，省时省力，成本低，稳定性好。(3)研究表明，核酸疫苗在疾病的防治中具有其他疫苗不可比拟的优点，因此该核酸疫苗有望在猪流行性腹泻病的防治中发挥重要作用。

附图说明

图1是PEDV S基因PCR图；

其中，M：DNA marker；1：PEDV S基因扩增结果；

图2是重组质粒pVAX1-PEDV S的构建示意图；

图3是重组质粒pVAX1-PEDV S的BamH I和EcoR I双酶切鉴定图；

其中，M：DNA marker；1：重组质粒BamH I和EcoR I双酶切鉴定；

图4是免疫小鼠外周血CD4+T细胞亚群数量变化图；

图5是免疫小鼠外周血CD8+T细胞亚群数量变化图；

图6是免疫小鼠外周血PEDV S IgG抗体含量动态变化图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述：

实施例1

PEDV S基因的PCR扩增

(1)根据质粒EasyT-S的核苷酸序列，设计引物P1和P2，

P1：5’-GGGGGGATCCATGAGGTCTTTAATTTAC-3’(下划线表示引入的酶切位点为BamH I)

P2：5’-CCCCGAATTCTCACTGCACGTGGACCTT-3’(下划线表示引入的酶切位点为EcoR I)

(2)进行常规链式聚合酶反应扩增PEDV S基因。

以质粒EasyT-S为模板，P1和P2为引物，以高保真DNA聚合酶进行PCR，反应条件为：50μL体系中含有Ex Taq0.25μL，10×Ex Taq buffer5μL，EasyT-S2.5μL，上游引物P11μL，下游引物P21μL，2.5mM dNTP4μL，ddH₂O36.25μL；；将上述混合液在94℃预变性5min，然后进入下列循环：94℃、135s，57.6℃、135s，72℃、4min，共进行30个循环，最后72℃延伸10min，扩增完毕后置4℃终止反应。PCR产物用质量分数为1％的琼脂糖凝胶电泳进行分析，在4000bp附近存在单一的目标条带，结果如图1所示，表明实验获得了与预期相符的特异DNA片段即PEDV S基因片段。

实施例2

重组质粒pVAX-S的构建及鉴定

(1)将胶纯化回收后PEDV S PCR产物进行BamH I和EcoR I双酶切，胶纯化回收后，与经同样酶切回收的pVAX1质粒体外连接，构建重组质粒pVAX-S。重组质粒构建过程如图2所示。转化大肠杆菌感受态，Kan+筛选阳性克隆子。

(2)采用碱裂解法小量制备质粒DNA，方法如下：

(a)挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2mL LB(60μg/mL Kan+)液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养过夜。

(b)取1.5mL培养物入Eppendorf离心管中，室温8000×g离心2min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。

(c)将细菌沉淀重悬于100μL预冷的Solution I中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。

(d)加200μL新鲜配制的Solution II，缓慢颠倒数次混匀，并将离心管放置于冰上2～3min，使细胞膜裂解。

(e)加入150μL预冷的SolutionIII，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，在冰上放置3～5min。

(f)12000×g，4℃离心10min。

(g)吸取上清转移到新的Eppendorf离心管中，加入450μL的苯酚/氯仿/异戊醇(1∶1∶25)，振荡混匀，12000×g，4℃离心10min。

(h)小心移出上清于一新Eppendorf离心管中，加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，-20℃放置30min，12000×g，4℃离心15min。

(i)弃掉上清，加入1mL预冷的70％乙醇洗涤沉淀1～2次(也可以放于冰内将质粒沉淀过夜)，8000×g，4℃离心10min，弃上清，将沉淀真空干燥。

(j)沉淀溶于30μL TER中(含Rnase A20μg/mL的TE)，37℃水浴30min以降解RNA，-20℃保存备用。

(3)重组质粒pVAX1-PEDV S的酶切鉴定

将-20℃保存的质粒BamH I和EcoR I双酶切，酶切反应体系共10μL。酶切产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，出现两条DNA带，位置与预测一致(如图3所示)。

酶切反应体系如下：

(4)重组质粒的测序鉴定

将疑似阳性的质粒送华大基因测序，测序鉴定为阳性。重组质粒命名为pVAX1-PEDV S。

实施例3

免疫小鼠

(1)根据《分子克隆试验指南》，用碱裂解法大量制备重组质粒，PEG-MgCl2纯化后溶于灭菌TE中，用紫外分光光度计进行质粒浓度测定，用适量灭菌的0.1MPBS将终浓度调整到1μg/μL。

(2)取18-25g，6-8周龄的昆明小鼠，随机分成5组：重组质粒pVAX1-PEDVS组、空质粒pVAX1组、TGE-PED两联疫苗(阳性对照组)组、PBS组及空白对照组(不注射任何试剂)，每组28只。腿部肌肉先注射盐酸利多卡因50μL/只，15min后分别按以上分组腿部肌肉注射重组质粒、空质粒、两联疫苗及PBS100μl/只。每间隔两周免疫1次，共免疫3次，分别于在免疫前和免疫后的7d，14d，21d，28d，35d，42d每组取3只小鼠，眼球取血制备血清检测抗体及检测T淋巴细胞亚群的数量。

实施例4T淋巴细胞亚群数量的检测

(1)外周血淋巴细胞的分离

小鼠眼球采血，一部分不加抗凝剂分离血清，另一部分加3.8％柠檬酸钠抗凝剂制备抗凝血，用PBS(pH7.4)稀释液1∶1稀释，缓慢加入装有2mL淋巴细胞分离液的试管中，此时上层为血液，下层为淋巴细胞分离液，以2000rpm水平离心20min。以2000rpm水平离心20min。收集血浆层与淋巴细胞分离液层之间的呈云雾状的淋巴细胞层，放入含不完全RPMI1640(即不含胎牛血清及双抗)培养液3ml的试管中，充分混匀后，以1500rpm离心15min。弃上清液沉淀用3ml不完全RPMI1640培养液洗涤液以1500rpm离心15min洗两次，所得沉淀即是淋巴细胞。细胞沉淀用1ml完全RPMI1640的营养液悬浮，进行活力检测与计数。

(2)外周血淋巴细胞亚群数量的检测

按(1)中制备的血液淋巴细胞悬液，并将其浓度调成1×10⁷个细胞每毫升，每份样品各取500μL，3000×g离心5min沉淀淋巴细胞。用冷PBS缓冲液(pH7.4)洗2次，每次3000×g离心5min。然后分别加入1∶1000稀释的CD4+-FITC标记、CD8+-FITC标记抗体的预冷PBS100μL进行反应，4℃孵育30min后，用冷PBS缓冲液(pH7.4)洗2次，加入500μL缓冲液重悬，流式细胞仪检测。检测结果如图4、5所示

实施例5血液中抗体的检测

(1)用PEDV200μl/孔包被ELISA酶标板中，4℃静置包被过夜；

(2)取出，甩去液体，用PBST(含0.3％Tween-20的PBS，pH7.4)洗板3次，每次5min，然后加入200μL/孔的封闭液(0.5％脱脂乳)，37℃作用2h；

(3)甩去液体、洗板3次，每次5min，加入50倍稀释的被检血清样品，100μL/孔，37℃作用1h；

(4)洗涤；加入5000倍稀释的HRP标记的山羊抗鼠IgG酶标抗体100μL，37℃作用1h，洗涤；

(5)加入新配制的显色液OPD100μL，37℃闭光作用10min，加2mol/L硫酸50μL终止反应，在酶联免疫检测仪上依次读取490nm下的OD值。根据下列公式计算出P/N值：P/N＝(待检样品OD值一空白对照OD值)/(阴性对照OD值一空白对照oD值)，结果判定，以P/N值≥2.0判为阳性，P加＜2.0时判为阴性。抗体检测结果如图6所示。

Claims (5)

1.一种猪流行性腹泻病基因重组疫苗(pVAX1-PEDV S)，其特征在于，序列如序列表Seq No.1所示。

2.一种用于构建猪流行性腹泻病基因重组疫苗(pVAX1-PEDV S)的引物对，其特征在于，上引物P1：如序列表Seq No.2所示，下引物P2：如序列表Seq No.3所示。

3.一种猪流行性腹泻病基因重组疫苗(pVAX1-PEDV S)的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)根据现有质粒EasyT-S的核苷酸序列设计引物对，上引物，序列如序列表SeqNo.2所示，下引物如序列表Seq No.3所示；

(2)进行常规链式聚合酶反应扩增PEDV S基因；

(3)构建重组质粒pVAX1-PEDV S。

4.根据权利要求3所述的一种猪流行性腹泻病基因重组疫苗(pVAX1-PEDV S)的构建方法，其特征在于：所述的步骤(2)采用常规链式聚合酶反应的具体步骤如下：将混合液在94℃预变性5min，然后进入下列循环：94℃、135s，57.6℃、135s，72℃、4min，共进行30个循环，最后72℃延伸10min，扩增完毕后置4℃终止反应；

所述混合液组成如下：

5.根据权利要求3所述的一种猪流行性腹泻病基因重组疫苗(pVAX1-PEDV S)的构建方法，其特征在于：所述的步骤(3)质粒pVAX1-PEDV S的重组构建方法具体步骤如下：用限制性内切酶BamH I和EcoR I酶切消化PCR所得PEDV S基因产物和pVAX1载体，分别获得PEDV S基因片段和线性载体pVAX1，将所得片段胶回收后进行体外连接，构建重组质粒pVAX1-PEDV S，将疑似阳性的质粒送华大基因测序，将测序鉴定为阳性的重组质粒命名为pVAX1-PEDV S。

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