CN101955950A

CN101955950A - 一种重组减蛋综合症病毒纤维蛋白抗原的制备方法

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Publication number: CN101955950A
Application number: CN2010102578272A
Authority: CN
Inventors: 李荣贵; 李莹; 孙志豪; 周立桥; 李金华
Original assignee: Qingdao University
Current assignee: Qingdao University
Priority date: 2010-08-12
Filing date: 2010-08-12
Publication date: 2011-01-26

Abstract

本发明涉及一种重组减蛋综合症病毒纤维蛋白抗原的制备方法。首先利用PCR技术从减蛋综合症病毒基因组中克隆纤维蛋白C-末端的编码基因并进行序列分析；然后将该基因克隆到表达载体pET-15b，转化大肠杆菌后构建工程菌，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导工程菌表达纤维蛋白C-末端；最后裂解工程菌细胞，离心分离其中的包含体，尿素溶解后，再用镍离子敖和树脂亲和纯化重组蛋白，稀释复性，利用Western blotting技术检测重组蛋白的免疫原性。利用该方法制备的重组蛋白与感染了减蛋综合症病毒鸡的血清有明显的免疫反应，可应用于预防家禽减蛋综合症的基因工程疫苗。

Description

一种重组减蛋综合症病毒纤维蛋白抗原的制备方法

技术领域：

本发明涉及一种重组减蛋综合症病毒纤维蛋白抗原的制备方法，制备该重组蛋白可应用于预防家禽减蛋综合症的基因工程疫苗，属于农业生物技术领域。

背景技术：

减蛋综合症(Egg Drop Syndrome，EDS)是由减蛋综合症病毒(EDSV)引起的一种以产蛋鸡产薄壳或无壳蛋，产蛋率严重下降为主要特症的传染病(殷震，1982)。1976年被Van Eck首次报道，现已成为世界范围内引起产蛋损失的主要原因之一；并于1977年根据其病毒粒子形态、化学组成、及复制特点等归为血凝性禽腺病毒。该病毒被命名为Ⅲ群禽类腺病毒，是此群中的唯一成员，并且确定了其完整的EDSV核苷酸序列(McFerran等，1997)。我国于1986年-1990年证实许多鸡场EDS-76血清阳性，1992年由李刚首次分离到病毒，之后，从发病鸡群和其他禽类中分离到多株病毒(Prya等，2001)。目前该病已经成为世界范围内引起产蛋损失的重要疾病之一，给养禽业造成了巨大的经济损失。本病可使产蛋率下降10％-30％，最高达41％，蛋的破损率达38％-41％，不同年龄的鸡均可感染，6-8月龄母鸡处于发病高峰期，既可水平传播，又可垂直传播，给养鸡业造成严重的经济损失。

目前，本病尚无有效的治疗方法，只能从加强管理、免疫、淘汰病鸡等方面进行防治。在发病时，如有必要也可给抗菌药物，以防混合感染或继发感染。预防本病的关键是注射疫苗。目前对于鸡减蛋综合症的防治措施主要是使用减蛋综合症的灭活疫苗。然而，用该病毒进行接种，作为灭活疫苗或减毒株，有很多的缺点。一方面，一些减毒活疫苗仍保留有一定的毒力，并且对于强毒株展示出的抗原覆盖效果是有区别的。另一方面，灭活疫苗灭活剂对病毒抗原有影响，而且对不同的抗原成分影响不同。

腺病毒是(adenovirus)是一种没有包膜的直径为70～90nm的颗粒，其衣壳(capsid)呈规则的20面体结构，直径约80-110nm。衣壳含有240个六联体(hexon)、12个五联体(penton)及12根纤毛(fiber)，12根纤毛以五联体蛋白为基底由衣壳表面伸出，纤毛顶端形成头节区(knob)，其中基底由纤维蛋白的N-末端组成，而头节区则由纤维蛋白的C-末端组成。纤毛的头节区可与动物细胞表面的病毒受体结合，在病毒感染细胞过程中起着非常重要的作用。因此，纤维蛋白的C-末端区域为其抗体封闭后，病毒就丧失了其感染细胞的能力。

本发明从一株减蛋综合症病毒的基因组中克隆了其纤维蛋白C-末端编码基因，并建立了获得该基因编码重组蛋白的方法，为减蛋综合症基因工程疫苗的研制提供了一种新的途径。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有灭活疫苗生产技术的缺点，旨在提供一种利用DNA重组技术制备EDSV关键抗原的方法。利用该方法可以快速、简便、制备大量重组蛋白，可应用于家禽减蛋综合症的预防。

为了实现上述发明目的，本发明的重组减蛋综合症病毒纤维蛋白抗原的制备方法为：首先利用PCR技术从EDSV基因组中克隆纤维蛋白C-末端的编码基因并进行序列分析；然后将该基因克隆到表达载体pET-15b，转化大肠杆菌(E.coliBL21(DE3))后构建工程菌，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导工程菌表达纤维蛋白C-末端；最后裂解工程菌细胞，离心分离其中的包含体，尿素溶解后，再用镍离子敖和树脂亲和纯化重组蛋白，稀释复性，利用Western blotting技术检测重组蛋白的免疫原性。

步骤一，纤维蛋白C-末端基因克隆与序列分析，按照如下步骤操作：

根据分离病毒的基因组序列设计一对引物，

引物1：5’AAACATATGTCGAGCTCGGTACCTTTGACTTTGGC 3’，

引物2：5’AAACTCGAGTTATAAGGGAATGG 3’。

采用酚抽提法从感染EDSV的鸡血细胞中提取总DNA，以该DNA为模板，按照94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸1min，共进行30循环进行PCR扩增，将PCR产物直接克隆到pMD-18T载体上，构建pMD-18T-EDS，转化大肠杆菌E.coli DH5α，提取质粒，利用双脱氧链终止法进行序列测定。从减蛋综合症病毒基因组中克隆纤维蛋白C-末端的编码基因具有序列1所示的核苷酸序列。

序列1

ATGTCGAGCT CGGTACCTTT GACTTTGGCT TATGATTCCA CGGATTTTCA GGTGACAGAA

AACGGCCTAG CCCTAAAGGT ATCTCCGACG CAGACCCCTC TCACCAGAAT AATTTCTATG

GGAAATAACT TGTTTGATTC TGGTTATGAG ATTTTTGCTT CATGTCCGCA GAACAAAGCA

GCAAAGGTTG CAGGGTATGT GTATTTAACA TCGGTTGGTG GGCTTGTACA TGGGACCATT

CAGATTAAAG CTACTGCGGG GTATTGGTTT ACGGGGGAAA ACAGCGTGCA GGAAAGTATC

AGGTTTGGAT TGGTGTTGTG TCCTTTTAGT GCTCGCGACC CCACTGCTAA CCTGTCAGGC

TGGCCAGCGC CAGTAGTGTG GAGTGGTGAT AGCAATACTC CCCTATATTT TGCGGCCAAT

GCCATTAGTT ATACCAATAA CCGTGTAAAT CATGCAGTTA CCGGTAACTT TTACAAGGAG

GAAACCGAAT TGCCGGGTTA CACTCGTCAT TCTTTCTGCC CTACCGGGAC CACCGGAATG

AATTTTACAG GGGGTAATTT GTATGTGTGT CCCTGCACTG TAAATACAGG GGCCACCACA

CTAAATGCCA TTTATATGGT GTTTGTGATT ACTCAATCAG CTTTGGGAAC TAATTTCTTT

GCTTCTAACA CCCCTCCCAA CACATTCTTT TTAACTCCCC CCATTCCCTT TACATAA

步骤二，表达载体与工程菌的构建，按照如下步骤操作：

将pMD-18T-EDS与pET-15b用Nde I/Xho I双酶切，酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，分别回收700bp目的片段和5.7kb的pET-15b，然后16℃连接过夜；将连接产物转化到E.coliDH5α感受态细胞，挑取单菌落接种到含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基，37℃振荡培养12h，提取质粒后用Nde I/Xho I双酶切进行鉴定，获得表达质粒pET-15b-EDS；将重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)，用0.5mmol/L的IPTG诱导表达，然后SDS-PAGE电泳分析。

步骤三，重组EDSV纤维蛋白C-末端的纯化，按照如下步骤操作：

挑取工程菌单菌落接种于LB液体培养基(含氨苄青霉素浓度0.1g/L)，37℃恒温振荡过夜培养；将过夜培养物按体积比为1∶20的比例倒入LB液体培养基(含氨苄青霉素浓度0.1g/L)，37℃恒温振荡培养3h。然后加入IPTG使其终浓度为5mmol/L，37℃恒温振荡培养4h。

将培养物低温冷冻离心，8000rpm，20min；弃上清，加入结合缓冲溶液100ml(20mmol/LTris.HCl，pH8.0，0.5mol/L NaCl，5mmol/L咪唑)悬浮菌体，进行超声波破碎，然后4℃，8000rpm，30min，保留沉淀(包含体)。

将包含体中加入2％(W/V)Triton X-100，用搅拌器搅拌，超声破碎，搅拌器继续搅拌，然后低温冷冻离心8000rpm，30min。再分别用2％，2.2％，2.4％，2.5％(W/V)的Triton X-100按上述方法洗涤，共洗涤4次，向最后洗涤的包含体沉淀中加入浓度为8mol/L的尿素(结合缓冲溶液配制)，用磁力搅拌器搅拌40min，冷冻离心8000rpm，30min，保留上清。

将尿素溶解包含体的上清上8mol/L尿素(结合缓冲溶液配制)平衡的Ni敖合树脂柱(2×10cm)，先用10倍柱床体积的8mol/L尿素(结合缓冲溶液配制)冲洗层析柱，再用2倍柱床体积的洗涤缓冲溶液(20mmol/L Tris.HCl，pH8.0，0.5mol/L NaCl，100mmol/L咪唑)配制的8mol/L尿素洗涤层析柱，最后用30mL洗脱缓冲溶液(20mmol/L Tris.HCl，pH8.0，0.5mol/L NaCl，300mmol/L咪唑)配制的8mol/L尿素洗脱目的蛋白，收集流出液。流出液于4℃对蒸馏水透析过夜后，冷冻干燥。

通过对重组EDSV纤维蛋白C-末端抗原性分析实验证实，利用本发明方法制备的重组蛋白与感染了减蛋综合症病毒鸡的血清具有明显的免疫反应。从减蛋综合症病毒基因组中克隆纤维蛋白C-末端的基因编码蛋白具有序列2所示的氨基酸序列。

序列2

MSSSVPLTLA YDSTDFQVTE NGLALKVSPT QTPLTRIISM GNNLFDSGYE IFASCPQNKA

AKVAGYVYLT SVGGLVHGTI QIKATAGYWF TGENSVQESI RFGLVLCPFS ARDPTANLSG

WPAPVVWSGD SNTPLYFAAN AISYTNNRVN HAVTGNFYKE ETELPGYTRH SFCPTGTTGM

NFTGGNLYVC PCTVNTGATT LNAIYMVFVI TQSALGTNFF ASNTPPNTFF LTPPIPFT

本制备方法可以快速、简便、制备大量重组蛋白，对于开发预防家禽减蛋综合症的基因工程疫苗具有极大的应用价值。

附图说明：

图1为纤维蛋白C-末端的编码基因的PCR扩增图。

图2为质粒pMD-18T-EDS的酶切鉴定图。

图3为表达质粒pET-15b-EDS的酶切鉴定图。

图4为工程菌表达纤维蛋白C-末端的SDS-PAGE分析图。

图5为重组纤维蛋白C-末端的SDS-PAGE分析图。

图6为重组纤维蛋白C-末端的Western blotting分析图。

具体实施方式：

下面通过具体实施例对本发明方法做进一步的阐述。

实施例1：

1、纤维蛋白C-末端基因克隆与序列分析：

设计合成一对引物，引物1：5’AAACATATGTCGAGCTCGGTACCTTTG ACTTTGGC3’；引物2：5’AAACTCGAGTTATGTAAAGGGAATGG 3’。

抽取感染EDSV的鸡血10ml，1000rpm离心5min，分离血细胞，用1.0mLTSE缓冲液(20mmol/LTris.Cl，pH8.0，50mmol/LNaCl，5mmol/L EDTA)悬浮血细胞，加入5μL蛋白酶K，50℃消化30min-3h；再加入330μL醋酸钾(5mol/L)溶液，混匀，10,000rpm离心10min，取上清；向上清中加入等体积的饱和酚，充分混匀；10,000rpm离心10min，取上清；向上清中加入10μL RNase，37℃，10min；加入等体积异丙醇，混匀；10,000rpm离心5min，取沉淀；沉淀用70％乙醇漂洗，室温放置30min，加入20μL蒸馏水，溶解，即得到总DNA。

以该DNA为模板，按照94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸1min，共进行30循环进行PCR扩增，如图1所示，其中1，2是PCR扩增产物，3是标准DNA；将PCR产物直接克隆到pMD-18T载体(TaKaRa公司)上，构建pMD-18T-EDS，如图2所示，其中，1是λDNA/EcoRI，HindIII，2，3是pMD-18T-EDS经Nde I和Xho I酶切图；利用双脱氧链终止法进行序列测定，结果显示，从减蛋综合症病毒基因组中克隆纤维蛋白C-末端的编码基因具有序列1所示的核苷酸序列。

序列1

ATGTCGAGCT CGGTACCTTT GACTTTGGCT TATGATTCCA CGGATTTTCA GGTGACAGAA

AACGGCCTAG CCCTAAAGGT ATCTCCGACG CAGACCCCTC TCACCAGAAT AATTTCTATG

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2、表达载体与工程菌的构建：

将pMD-18T-EDS与pET-15b用Nde I/Xho I双酶切，酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，分别回收700bp目的片段和5.7kb的pET-15b，然后16℃连接过夜；将连接产物转化到E.coliDH5α感受态细胞，挑取单菌落接种到2ml含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基，37℃振荡培养12h，提取质粒后用Nde I/Xho I双酶切进行鉴定，获得表达质粒pET-15b-EDS，如图3所示，其中，1是λDNA/EcoR I，HindIII，2，3是pET-15b-EDS/NdeI，XhoI。将重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)，挑取单菌落，接种到200mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基，37℃振荡培养12h，后转接到4L相同培养基中，37℃振荡培养3h后，加入IPTG至终浓度为0.5mM，继续培养4h，然后SDS-PAGE电泳分析，结果如图4所示，其中，1是标准蛋白，2是E.coliBL21(DE3)全蛋白，3，4是IPTG诱导工程菌全蛋白。

3、重组EDSV纤维蛋白C-末端的纯化：

挑取工程菌单菌落于200ml LB液体培养基(含氨苄青霉素浓度0.1g/L)，37℃恒温振荡过夜培养；将过夜培养物按体积比为1∶20的比例倒入总计4L的LB液体培养基(氨苄青霉素浓度0.1g/L)，37℃恒温振荡培养3h；然后加入IPTG使其终浓度为5mM，37℃恒温振荡培养4h。

将培养物用大型低温冷冻离心机离心，8000rpm，20min；弃上清，加入结合缓冲液100ml(20mmol/L Tris.HCl，pH8.0，0.5mol/L NaCl，5mmol/L咪唑)悬浮菌体，然后进行750W超声波破碎(工作时间10s，间隔时间20s，破碎120次)。然后4℃，8000rpm，30min，保留沉淀(包含体)。

将5g包含体中加入120ml的2％(W/V)Triton X-100，用搅拌器搅拌30min，超声破碎40次，搅拌器继续搅拌30min，然后低温冷冻离心8000rpm，30min。再分别用2％，2.2％，2.4％，2.5％(W/V)的Triton X-100各120ml按上述方法洗涤，共洗涤4次，向最后洗涤的包含体沉淀中加入100ml浓度为8mol/L的尿素(结合缓冲溶液配制)，用磁力搅拌器搅拌40min，冷冻离心8000rpm，30min，保留上清。

将尿素溶解包含体的上清上8mol/L尿素(结合缓冲溶液配制)平衡的Ni敖合树脂柱(2×10cm)，先用10倍柱床体积的8mol/L尿素(结合缓冲溶液配制)冲洗层析柱，再用2倍柱床体积的洗涤缓冲溶液(20mmol/L Tris.HCl，pH8.0，0.5mol/L NaCl，100mmol/L咪唑)配制的8mol/L尿素洗涤层析柱，最后用30mL洗脱缓冲溶液(20mmol/L Tris.HCl，pH8.0，0.5mol/LNaCl，300mmol/L咪唑)配制的8mol/L尿素洗脱目的蛋白，收集流出液。纯化效果如图5所示，其中1，2，3是纯化的重组EDSV纤维蛋白C-末端，4是标准蛋白。流出液于4℃对1L蒸馏水透析过夜后，冷冻干燥。

4、重组EDSV纤维蛋白C-末端抗原性分析：

将0.1μg纯化的重组的EDSV纤维蛋白C-末端经SDS-PAGE分离后，电转移至PVDF(聚偏氟乙烯)膜上，用5％的脱脂奶粉封闭2h，PBS振洗3次，分别加入一抗(鸡抗血清)1∶250作用2h，振洗3次，再加入二抗1∶1000(HRP标记的兔抗鸡IgG)作用2h，振洗后于显色液中显色(20mmol/L Tris.HCl，pH8.0，50mmol/L NaCl，0.03％NiCl₂，0.01％二氨基联苯胺，0.3％H₂O₂)。结果如图6所示，重组纤维蛋白C-末端具有良好的抗原性。从减蛋综合症病毒基因组中克隆纤维蛋白C-末端的基因编码蛋白具有序列2所示的氨基酸序列。

序列2

MSSSVPLTLA YDSTDFQVTE NGLALKVSPT QTPLTRIISM GNNLFDSGYE IFASCPQNKA

AKVAGYVYLT SVGGLVHGTI QIKATAGYWF TGENSVQESI RFGLVLCPFS ARDPTANLSG

WPAPVVWSGD SNTPLYFAAN AISYTNNRVN HAVTGNFYKE ETELPGYTRH SFCPTGTTGM

NFTGGNLYVC PCTVNTGATT LNAIYMVFVI TQSALGTNFF ASNTPPNTFF LTPPIPFT

Claims

1.一种重组减蛋综合症病毒纤维蛋白抗原的制备方法，其特征在于：首先利用PCR技术从减蛋综合症病毒基因组中克隆纤维蛋白C-末端的编码基因并进行序列分析；然后将该基因克隆到表达载体pET-15b，转化大肠杆菌后构建工程菌，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导工程菌表达纤维蛋白C-末端；最后裂解工程菌细胞，离心分离其中的包含体，尿素溶解后，再用镍离子敖和树脂亲和纯化重组蛋白，稀释复性，利用Western blotting技术检测重组蛋白的免疫原性。

2.根据权利要求1所述的一种重组减蛋综合症病毒纤维蛋白抗原的制备方法，其特征在于所述的纤维蛋白C-末端基因克隆与序列分析按照如下步骤操作：根据分离病毒的基因组序列设计一对引物：引物1：5’AAACATATGTCGAGCTCGGTACCTTTGACTTTGGC 3’，引物2：5’AAACTCGAGTTATAAGGGAATGG 3’，采用酚抽提法从感染减蛋综合症病毒的鸡血细胞中提取总DNA，以该DNA为模板，按照94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸1min，共进行30循环进行PCR扩增，将PCR产物直接克隆到pMD-18T载体上，构建pMD-18T-EDS，转化大肠杆菌E.coli DH5α，提取质粒，利用双脱氧链终止法进行序列测定。

3.根据权利要求1所述的一种重组减蛋综合症病毒纤维蛋白抗原的制备方法，其特征在于所述的表达载体与工程菌的构建按照如下步骤操作：将pMD-18T-EDS与pET-15b用NdeI/Xho I双酶切，酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，分别回收700bp目的片段和5.7kb的pET-15b，然后16℃连接过夜；将连接产物转化到E.coliDH5α感受态细胞，挑取单菌落接种到含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基，37℃振荡培养12h，提取质粒后用Nde I/Xho I双酶切进行鉴定，获得表达质粒pET-15b-EDS；将重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)，用0.5mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达，然后SDS-PAGE电泳分析。

4.根据权利要求1所述的一种重组减蛋综合症病毒纤维蛋白抗原的制备方法，其特征在于重组减蛋综合症病毒纤维蛋白C-末端的纯化按照如下步骤操作：挑取工程菌单菌落接种于LB液体培养基，37℃恒温振荡过夜培养；将过夜培养物按体积比为1∶20的比例倒入LB液体培养基，37℃恒温振荡培养3h；然后加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷使其终浓度为5mmol/L，37℃恒温振荡培养4h；将培养物低温冷冻离心，8000rpm，20min；弃上清，加入结合缓冲溶液悬浮菌体，进行超声波破碎；然后4℃，8000rpm，30min，保留沉淀即包含体；将包含体中加入W/V为2％的Triton X-100，用搅拌器搅拌，超声破碎，搅拌器继续搅拌，低温冷冻离心8000rpm，30min；再分别用W/V为2％，2.2％，2.4％，2.5％的Triton X-100按上述方法洗涤，共洗涤4次，向最后洗涤的包含体沉淀中加入结合缓冲溶液配制的浓度为8mol/L的尿素，用磁力搅拌器搅拌，冷冻离心8000rpm，30min，保留上清；将尿素溶解包含体的上清上结合缓冲溶液配制的8mol/L尿素平衡的Ni敖合树脂柱，先用10倍柱床体积的结合缓冲溶液配制的8mol/L尿素冲洗层析柱，再用2倍柱床体积的洗涤缓冲溶液配制的8mol/L尿素洗涤层析柱，最后用洗脱缓冲溶液配制的8mol/L尿素洗脱目的蛋白，收集流出液，流出液于4℃对蒸馏水透析过夜后，冷冻干燥；其中，结合缓冲溶液是20mmol/L Tris.HCl，pH8.0，0.5mol/L NaCl，5mmol/L咪唑；洗涤缓冲溶液是20mmol/L Tris.HCl，pH8.0，0.5mol/LNaCl，100mmol/L咪唑；洗脱缓冲溶液是20mmol/L Tris.HCl，pH8.0，0.5mol/L NaCl，300mmol/L咪唑；所述LB液体培养基含氨苄青霉素浓度0.1g/L。

5.根据权利要求1所述一种重组减蛋综合症病毒纤维蛋白抗原的制备方法，其特征在于从减蛋综合症病毒基因组中克隆纤维蛋白C-末端的编码基因具有序列表中序列1所示的核苷酸序列。

6.根据权利要求1所述一种重组减蛋综合症病毒纤维蛋白抗原的制备方法，其特征在于重组减蛋综合症病毒纤维蛋白抗原是纤维蛋白C-末端，具有序列表中序列2所示的氨基酸序列。

7.根据权利要求1所述一种重组减蛋综合症病毒纤维蛋白抗原的制备方法，其特征在于利用该方法制备的重组蛋白与感染了减蛋综合症病毒的鸡血清具有明显的免疫反应。