CN104356240A - 一种重组融合蛋白TAT-p53及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组融合蛋白TAT-p53及其编码基因与应用。本发明公开一种蛋白，为如下(1)或(2)所示：(1)SEQ ID No.5所示的蛋白；(2)将SEQ ID No.5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。本发明公开的重组融合蛋白可以有效抑制HBV的复制，清除感染肝脏的病毒，对于乙肝防治具有重大价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种重组融合蛋白TAT-p53及其编码基因与应用，属于生物技术领域。
背景技术
目前全世界有3.5亿人感染HBV，在中国约有9300万人慢性感染HBV，大约15-40％的感染人群可能发展为威胁生命的疾病例如肝硬化、肝功能衰竭和肝细胞癌等，慢性HBV感染严重危害人们身体健康。现有用于慢性乙肝患者的治疗方法包括α-干扰素(IFN-α)和核苷或核苷类似物(如拉咪呋啶、阿德福韦和恩替卡韦)。干扰素-α是第一个获得临床治疗乙肝病毒感染的药物，作为重要的一线药物，聚乙二醇干扰素-α单一治疗能有效治疗25-40％的慢性乙型肝炎患者，其与核苷酸类似物联合使用能产生更大的持续抗病毒疗效和使HBeAg阳性患者中病毒e抗原转阴，但干扰素-α治疗副作用明显，停药后容易反弹，部分患者对干扰素-α反应不敏感，疗效差。核苷类似物疗程长，停药后病毒易反弹，而且引起突变、增加耐药性。在中国，肝细胞癌多数由慢性乙肝感染引发，而且目前临床没有有效的药物治疗。因此，迫切需要开发新的乙肝和肝癌治疗性药物以补充或替代现有的抗病毒治疗方案。
人免疫缺陷病毒HIV-Ⅰ的转录活化因子(Trans-activating transcriptionalactivator,TAT)，是最先被发现并证实的具穿膜功能的多肽分子。而其做为穿膜肽，在体内或者离体实验中也被广泛的应用。TAT可以携带多种蛋白质，一般来讲，外源性蛋白不能进入胞浆，但是如果将TAT与其相连，可以快速有效的被细胞摄入。
p53基因是一种抑癌基因，定位于人类染色体17p13.1，编码393个氨基酸组成的53kD的核内磷酸化蛋白，被称为p53蛋白。p53基因是细胞生长周期中的负调节因子，与细胞周期的调控、DNA修复、细胞分化、细胞凋亡等重要的生物学功能有关。肝癌患者有一定比例的p53蛋白过表达，p53基因突变可能与肝癌的恶性分化程度有关。有越来越多的文献表明，p53能抑制癌细胞生长和恶性转化，调节乙型肝炎病毒的复制。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组融合蛋白TAT-p53及其编码基因与应用。
本发明提供一种蛋白，为如下(1)或(2)所示：
(1)SEQ ID No.5所示的蛋白；
(2)将SEQ ID No.5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质；
所述蛋白在N端与C端还可以带有His标签。
上述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。
上述编码基因中，所述编码基因为如下中至少一种：
1)SEQ ID No.4中自5’末端起第10位至第1224位核苷酸所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述蛋白质的DNA分子。
含有上述任一所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
一种制备上述蛋白的方法也属于本发明的保护范围，是将上述任一所述的编码基因导入原核细胞中进行表达。
上述方法中，所述编码基因是通过重组表达载体导入的，所述重组表达载体是将所述编码基因插入pET28a(+)的多克隆位点得到的，具体是将SEQ ID No.4所示的DNA分子插入pET28a(+)的BamHI和XhoI位点间得到的；
所述原核细胞为大肠杆菌，具体为大肠杆菌BL21(DE3)。
上述任一所述的方法中，所述表达之后还包括将细胞破碎、收集沉淀、将沉淀溶解取上清和/或将上清进行纯化的步骤。
上述任一所述的方法中，所述破碎为超声破碎；
所述将沉淀溶解取上清的方法为：将所述收集沉淀得到的沉淀用8M的尿素溶液溶解，得到蛋白溶液；将蛋白溶液的pH值调至9.8-10.2，离心取上清，记作上清1；将上清1的pH值调至7.6-7.8，离心取上清，即得；
所述pH值调至9.8-10.2时所用的溶液具体为NaOH的水溶液；
所述pH调至7.6-7.8时所用的溶液具体为HCl水溶液；
所述pH值调至9.8-10.2时所述pH具体为10.0；
所述pH值调至7.6-7.8时所述pH具体为7.7；
所述将上清进行纯化为镍离子亲和层析纯化，步骤如下：
a、用8M的尿素溶液预平衡镍离子柱至少3个柱体积；
b、将所述沉淀溶解取上清得到的上清加入镍离子柱；
c、用8M的尿素溶液冲洗镍离子柱至少5个柱体积，洗去杂蛋白；
d、用60mM咪唑溶液冲洗镍离子柱至少5个柱体积，洗去未结合的蛋白；
所述60mM咪唑溶液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为Na2HPO4,NaCl,尿素和咪唑，所述Na2HPO4在所述60mM咪唑溶液中的浓度为20mM、所述NaCl在所述60mM咪唑溶液中的浓度为0.5M、所述尿素在所述60mM咪唑溶液中的浓度为8M、所述咪唑在所述60mM咪唑溶液中的浓度为60mM，pH为7.7；
e、用300mM咪唑溶液洗脱目的蛋白，即得；
所述300mM咪唑溶液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为Na2HPO4,NaCl,尿素和咪唑，所述Na2HPO4在所述300mM咪唑溶液中的浓度为20mM、所述NaCl在所述300mM咪唑溶液中的浓度为0.5M、所述尿素在所述300mM咪唑溶液中的浓度为8M、所述咪唑在所述300mM咪唑溶液中的浓度为300mM，pH为7.7；
所述8M的尿素溶液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为Na2HPO4,NaCl,尿素和咪唑，所述Na2HPO4在所述8M的尿素溶液中的浓度为20mM、所述NaCl在所述8M的尿素溶液中的浓度为0.5M、所述尿素在所述8M的尿素溶液中的浓度为8M、所述咪唑在所述8M的尿素溶液中的浓度为20mM，pH为7.7。
上述任一所述的方法中，所述将上清进行纯化之后还包括将纯化后的目的蛋白透析浓缩、去除内毒素和/或除菌的步骤；
所述透析的具体条件为：在4℃条件下，用pH8.0的1M Tris-HCl缓冲液进行透析；
所述除菌具体为0.22uM滤膜除菌。
上述蛋白、上述任一所述的编码基因在制备抑制HBV蛋白的表达、HBV mRNA转录和/或HBV复制的产品中的应用也属于本发明的保护范围；
所述蛋白具体为HBV表面抗原和/或HBV e抗原；
所述mRNA具体为转录合成前基因组RNA和/或总RNA；
或，
上述蛋白、上述任一所述的编码基因在制备抑制和/或清除HBV的产品中的应用也属于本发明的保护范围；
或，
上述蛋白、上述任一所述的编码基因在制备预防和/或治疗HBV引起的疾病的产品中的应用也属于本发明的保护范围；
所述疾病具体为肝炎、肝硬化、肝功能衰竭或肝细胞癌。
本发明提供的重组融合蛋白可以有效抑制HBV的复制，清除感染肝脏的病毒，对于乙肝防治具有重大价值。
附图说明
图1为重组融合蛋白TAT-p53的电泳结果。
图2为HBV复制中间体的检测。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复，结果取平均值。
ATCC即美国模式培养物集存库(American type culture collection)的简写，网址为http://www.atcc.org/。
HBV表面抗原(HBsAg)检测试剂盒和HBV e抗原检测试剂盒均购自上海科华生物工程股份有限公司，批准文号分别为国药准字S10910113和国药准字S10910112。
乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)购自中山大学达安基因股份有限公司，产品号为Cat.#DA-B051。
全血/组织基因组提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，产品目录号为DP304。
Southern blot试剂盒购自GE，产品目录号为RPN3680，RPN3681，RPN3690，RPN3691，RPN3692。
转染试剂Lipofectamine 2000购自invitrogen，产品目录号为11668019。
人肝癌细胞HepG2.2.1.5在文献“Mary Ann Sells,Mei-Ling Chen,George Acs.Production of hepatiti s B virus particles in Hep G2 cells transfected withcloned hepatitis B virus DNA.Proc.Nati.Acad.Sci.1987；84:1005-1009.”中公开过，公众可从中国科学院微生物研究所获得。
Huh-7购自ATCC，ATCC编号为PTA-4583。
HBV DNA质粒(pHBV1.3)在文献“Hong Tang，Alan McLachlan*.Transcriptionalregulation of hepati tis B virus by nuclear hormone receptors is a criticaldeterminant of viral tropism.Proc.Nati.Acad.Sci.2001；98(4):1841-1846.”中公开过，公众可从中国科学院微生物研究所获得。
pET28a(+)购自武汉华美生物工程有限公司，产品目录号为CSB-PL200040。
大肠杆菌BL21(DE3)购自天根生化科技(北京)有限公司，产品目录号为CB105-02。
HBV转基因鼠购自中国人民解放军第四五八(458)医院。
实施例1、重组融合蛋白TAT-p53的制备
一、pET28a-TAT-p53载体的构建
1、TAT-p53引物的设计与合成
TAT-p53-up:5’-ATCGGATCCTATGCGCGTGCGGCGGCGCGTCAGGCGCGTGCGATGGAGGAGCCGCAGTCAG-3’(SEQ ID No.1)
(下划线所示序列为BamHI酶切识别位点)
TAT-p53-dn:5’-ACACTCGAGTCAGTCTGAGTCAGGCCCTTCTGTC-3’(SEQ ID No.2)
(下划线所示序列为XhoI酶切识别位点)
2、以SEQ ID No.3所示的DNA分子为模板，TAT-p53-up和TAT-p53-dn为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，如SEQ ID No.4所示。SEQ ID No.4中自5’末端起第10位至第1224位核苷酸所示的序列为TAT-p53的编码基因序列，TAT-p53蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。
3、BamHI和XhoI双酶切SEQ ID No.4所示的DNA分子，得到基因片段；BamHI和XhoI双酶切pET28a(+)，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名为pET28a-TAT-p53，将pET28a-TAT-p53送测序，结果正确。
二、原核表达TAT-p53重组融合蛋白
利用大肠杆菌表达TAT-p53重组融合蛋白，具体方法如下：
1、将重组质粒pET28a-TAT-p53转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，从平板上挑取单菌落接入含100mg/mL卡那霉素的2×YT培养基(胰蛋白胨16g，酵母提取物10g，氯化钠5g，加水定容至1000mL)活化，得活化液；取活化液接入2×YT培养基，37℃培养至OD600值为0.6-1.0，然后加入IPTG使其终浓度为1mmol/L，37℃诱导4h，收集菌体。
2、菌体用1/10培养体积的超声缓冲液(20mM Na2HPO4,0.1M NaCl,3.5M Urea,余量为水，pH7.7)重悬，冰浴条件下超声破碎(200W，破碎3s停7s，99次3个循环)，然后4℃10000转/min离心15min，去上清，收集沉淀。
3、用干净的玻璃棒轻轻刮去表层暗黄色的杂质，得到蛋白沉淀。
三、TAT-p53重组融合蛋白的纯化
1、将步骤二收集的蛋白沉淀用8M的尿素溶液溶解，得到蛋白溶液。
8M的尿素溶液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为Na2HPO4,NaCl,尿素和咪唑，所述Na2HPO4在所述8M的尿素溶液中的浓度为20mM、所述NaCl在所述8M的尿素溶液中的浓度为0.5M、所述尿素在所述8M的尿素溶液中的浓度为8M、所述咪唑在所述8M的尿素溶液中的浓度为20mM，pH7.7。
2、加入1M NaOH的水溶液将上述蛋白溶液的pH值调至10.0(10.0±0.2均可)，温度25℃(25±5℃均可)下搅拌混匀10分钟。
3、4℃12000转/min离心20min，去沉淀，取上清，记作上清1。
4、在上清1中加入体积百分含量10％的HCl水溶液将上清的pH值调回至7.7(7.7±0.1均可)。
5、4℃12000转/min离心20min，去沉淀，取上清，记作上清2。
6、利用镍离子柱亲和层析法纯化上清2，步骤如下：
a、用8M的尿素溶液至少3个柱体积(具体约3-5个柱体积)预平衡镍离子柱；
8M的尿素溶液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为Na2HPO4,NaCl,尿素和咪唑，所述Na2HPO4在所述8M的尿素溶液中的浓度为20mM、所述NaCl在所述8M的尿素溶液中的浓度为0.5M、所述尿素在所述8M的尿素溶液中的浓度为8M、所述咪唑在所述8M的尿素溶液中的浓度为20mM，pH7.7。
b、将上清2缓慢加入镍离子柱；
c、用8M的尿素溶液至少5个柱体积(约5-10个柱体积)冲洗镍离子柱，洗去杂蛋白；
d、用60mM咪唑溶液至少5个柱体积(约5-10个柱体积)冲洗镍离子柱，洗去未结合的蛋白；
60mM咪唑溶液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为Na2HPO4,NaCl,尿素和咪唑，所述Na2HPO4在所述60mM咪唑溶液中的浓度为20mM、所述NaCl在所述60mM咪唑溶液中的浓度为0.5M、所述尿素在所述60mM咪唑溶液中的浓度为8M、所述咪唑在所述60mM咪唑溶液中的浓度为60mM，pH7.7。
e、用300mM咪唑溶液(约3个柱体积)洗脱目的蛋白。
300mM咪唑溶液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为Na2HPO4,NaCl,尿素和咪唑，所述Na2HPO4在所述300mM咪唑溶液中的浓度为20mM、所述NaCl在所述300mM咪唑溶液中的浓度为0.5M、所述尿素在所述300mM咪唑溶液中的浓度为8M、所述咪唑在所述300mM咪唑溶液中的浓度为300mM，pH7.7。
7、将目的蛋白溶液置于4℃、1M Tris-HCl(pH8.0)缓冲液中透析浓缩，得到浓缩的蛋白。
8、浓缩的蛋白经过TritonX-114萃取法除内毒素，0.22uM滤膜除菌。
9、将步骤8得到的蛋白经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，只有单一的目的条带，结果如图1所示。采用BCA法测定蛋白浓度，最后将蛋白分装，贮存于-80℃。
该目的蛋白在N端与C端带有His标签，下述实施例中简称为TAT-p53重组融合蛋白。
实施例2、对照蛋白TAT-GST的合成
一、pET28a-TAT-GST载体的构建
1、TAT-GST引物的设计与合成
TAT-GST-up:
5’-ATCGGATCCTATGCGCGTGCGGCGGCGCGTCAGGCGCGTGCGATGTCCCCTATACTA-3’(SEQ IDNo.6)
(下划线所示序列为BamHI酶切识别位点)
TAT-GST-down:5’-ACACTCGAGTCAGTCACGATGCGGCCGCTCGAGT-3’(SEQ ID No.7)
(下划线所示序列为XhoI酶切识别位点)
2、以SEQ ID No.8所示的DNA分子为模板，TAT-GST-up和TAT-GST-down为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，如SEQ ID No.9所示。SEQ ID No.9中自5’末端起第10位至第777位为TAT-GST的编码基因序列，TAT-GST蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.10所示。
3、BamHI和XhoI双酶切PCR扩增产物，得到基因片段；BamHI和XhoI双酶切pET28a(+)，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名为pET28a-TAT-GST，将pET28a-TAT-GST送测序，结果正确。
二、原核表达TAT-GST重组融合蛋白
具体步骤同实施例1中步骤二，仅将pET28a-TAT-p53替换为pET28a-TAT-GST。
三、TAT-GST重组融合蛋白的纯化
具体步骤同实施例1中步骤三。
实施例3、人肝癌细胞Huh-7中TAT-p53重组融合蛋白抑制HBV能力的检测
转染前一天将同等量的Huh-7接种到6孔板用含体积百分含量10％FBS的DMEM培养基培养，细胞汇合度达到90％左右进行转染，转染前一个小时将培养基换成opti-MEM，将pHBV1.3复制性质粒采用Lipofectamine 2000转染Huh-7细胞。转染后4-6小时用PBS洗细胞三次，并换成2ml含有体积百分含量10％的FBS的DMEM培养基，同时加入终浓度为30ug/mL的重组融合蛋白TAT-p53作为实验组，或加入终浓度为30ug/mL的对照蛋白TAT-GST作为对照组，继续培养，在加入蛋白后的72h检测各组上清中的HBsAg、HBeAg，上清DNA拷贝数以及胞内pgRNA、总RNA表达水平和胞内HBV复制中间体。每个组设3个重复，实验重复2次。采用t检验计算显著性差异，P<0.05作为差异显著。
一、HBV表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)的检测
在加入蛋白后72h收集各组细胞的上清，按照HBV表面抗原(HBsAg)检测试剂盒和HBV e抗原检测试剂盒说明书检测各组上清中的HBV表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)。
结果表明，与对照蛋白TAT-GST相比，TAT-p53显著降低了细胞培养上清中HBV表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)的水平。与对照组相比，实验组的HBV表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)的水平分别下降了63％和41％(P<0.01)。
二、细胞上清DNA拷贝数检测
使用乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)进行DNA拷贝数的绝对定量，按照试剂盒说明书进行操作。
在加入蛋白后的72h后收集各组的200ul培养液，室温12000rpm，2min离心去除细胞碎片，加入10mM的MgCl2,100UI/ml的DNaseⅠ,37℃消化3小时，再加入1g/100ml的SDS，0.5mg/ml的蛋白酶K，55℃消化2个小时，再加入等体积的苯酚进行1:1抽提，乙醇沉淀过夜，高速离心，晾干，50ul H2O溶解，RT-PCR定量检测，把没有经过蛋白酶K消化的样品作为阴性对照(阴性对照是为了确定DNaseⅠ完全把外源质粒消化干净，后续所得的DNA全为细胞内的)，确定转染的质粒消化干净，不会干扰RT-PCR定量检测结果。
HBV DNA定量检测标准曲线的制作方法：将已知浓度的质粒pHBV1.3依次进行1000倍稀释，进行RT-PCR定量检测。
上述实验重复三次，结果取平均值。
RT-PCR定量检测引物如下：
forward：5’-CTCCCCGTCTGTGCCTTCTC-3’；(SEQ ID No.11)
reverse：5’-TCGGTCGTTGACATTGCTGA-3’。(SEQ ID No.12)
结果表明，与对照蛋白TAT-GST相比，TAT-p53处理的细胞上清中HBV DNA拷贝数下降了93％(P<0.01)。
三、mRNA检测
在加入蛋白后的72h，在各组中分别加入1ml的Trizol试剂，裂解5min，吸入到1.5ml的EP管中，加入200ul无RNA酶污染的氯仿，混匀15s，4℃13000rpm离心15min，吸取上清转移到一个新的1.5mlEP管中，加入500ul异丙醇室温沉淀10min，4℃13000rpm离心10min，倒掉上清，用DEPC水配制的体积百分含量为75％的乙醇水溶液洗涤沉淀一次，晾干，50ul DEPC水溶解，得到各组的mRNA，并将其反转录为cDNA。以cDNA为模板，以pgRNA forward和pgRNA reverse为引物进行RT-PCR，定量检测转录合成前基因组RNA(pregenomicRNA,pgRNA)水平，或，以total RNA forward和total RNA reverse为引物进行RT-PCR，定量检测总RNA水平，同时以GAPDH为内参基因，以GAPDH forward和GAPDH reverse为其检测引物。
pgRNA forward：5’-TCTTGCCTTACTTTTGGAAG-3’；(SEQ ID No.13)
pgRNA reverse：5’-AGTTCTTCTTCTAGGGGACC-3’；(SEQ ID No.14)
total RNA forward：5’-CTCCCCGTCTGTGCCTTCTC-3’；(SEQ ID No.15)
total RNA reverse：5’-TCGGTCGTTGACATTGCTGA-3’；(SEQ ID No.16)
GAPDH forward：5’-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3’；(SEQ ID No.17)
GAPDH reverse：5’-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3’；(SEQ ID No.18)
结果表明，与对照蛋白TAT-GST相比，TAT-p53处理的细胞中HBV pgRNA和总RNA水平分别下降了63％和59％(P<0.01)。
四、Southern blot检测胞内HBV复制中间体
在加入蛋白后的72h，将各组细胞收集到1.5ml离心管中，采用全血/组织基因组提取试剂盒提取各组细胞内的总DNA，并用紫外分光光度计OD260和OD280测定DNA浓度和纯度，1％琼脂糖凝胶电泳，采用Southern blot试剂盒检测各组的HBV复制中间体，检测方法按照试剂盒说明书。
结果如图2所示，图2中，TAT-p53代表实验组，TAT-GST代表对照组。
图2表明，与实验组相比，对照组的HBV复制中间体条带(rc-ds-ss DNA)灰度较深，HBV复制中间体浓度高。
以上结果表明，TAT-p53能显著抑制HBV蛋白的表达、mRNA转录和病毒复制。
实施例4、人肝癌细胞HepG2.2.1.5中TAT-p53重组融合蛋白抑制HBV能力的检测
按照实施例3的方法检测人肝癌细胞HepG2.2.1.5中TAT-p53重组融合蛋白抑制HBV能力，其中将人肝癌细胞Huh-7替换为人肝癌细胞HepG2.2.1.5，并且不经过pHBV1.3复制性质粒转染的步骤(因为HepG2.2.1.5内含有HBV整合基因组，所以不需要转染步骤。)
检测结果如下：与对照组相比，TAT-p53显著降低了细胞培养上清中HBV表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)的水平，与对照组相比，实验组的HBV表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)的水平分别下降了51％和31％(P<0.01)。与对照蛋白TAT-GST相比，TAT-p53处理的细胞上清中HBV DNA拷贝数下降了83％(P<0.01)。与对照蛋白TAT-GST相比，TAT-p53处理的细胞中HBV pgRNA和总RNA水平分别下降了56％和49％(P<0.01)。与实验组相比，对照组的HBV复制中间体条带灰度较深，HBV复制中间体浓度高。
以上结果表明，TAT-p53能显著抑制HBV蛋白表达、mRNA转录和病毒复制。
实施例5、重组融合蛋白TAT-p53在HBV转基因鼠中抑制HBV能力的检测
将6-8周龄的体重相近的HBV转基因鼠随机分成2组，每组5只，各组的处理方法如下：
第一组(TAT-p53组)：每只小鼠按照10ug/g小鼠体重的剂量给药TAT-p53，将蛋白溶解于0.3ml的PBS中，尾静脉注射，每隔三天注射一次，持续两周。
第二组(阴性对照TAT-GST组)：每只小鼠按照10ug/g小鼠体重的剂量给药TAT-GST，将蛋白溶解于0.3ml的PBS中，尾静脉注射，每隔三天注射一次，持续两周。
自尾静脉注射蛋白结束，每隔3天检测一次小鼠血清中HBV表面抗原(HBsAg)表达水平以及HBV DNA拷贝数。
一、小鼠血清中HBsAg的检测
小鼠血清中的HBsAg检测采用HBV表面抗原(HBsAg)检测试剂盒检测，操作步骤按照说明书进行。
结果表明，与阴性对照TAT-GST组相比，TAT-p53组的HBsAg在尾静脉注射蛋白结束第9天明显下降。在尾静脉注射蛋白结束的第15天，TAT-p53组平均HBsAg值为0.37ug/ml，阴性对照TAT-GST组为0.55ug/ml，相对于阴性对照TAT-GST组，TAT-p53组的HBsAg下降了33％(P<0.05)，在尾静脉注射蛋白结束的第15天，相对于阴性对照TAT-GST组，TAT-p53组小鼠血清中HBsAg的表达水平下降最明显。
二、小鼠血清中HBV DNA拷贝数的检测
在尾静脉注射蛋白结束的第15天，使用乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)对各组小鼠的200ul血清进行HBV DNA拷贝数的绝对定量，操作步骤按照说明书进行，各组重复三次实验，结果取平均值。
HBV DNA定量检测标准曲线的制作方法如实施例3中步骤二所示。
结果表明，在尾静脉注射蛋白结束的第15天，阴性对照TAT-GST组小鼠血清中HBV DNA拷贝数的平均值为105.4个拷贝，TAT-p53组的平均值为103.1个拷贝，与阴性对照TAT-GST组相比，TAT-p53组的HBV DNA拷贝数降低约200倍(p<0.01)。
三、小鼠肝脏中HBV DNA拷贝数的检测
采用全血/组织基因组提取试剂盒提取各组小鼠的肝脏组织中的DNA，以totalRNA forward和total RNA reverse为引物，进行RT-PCR定量检测。
结果表明，在尾静脉注射蛋白结束的第15天，阴性对照TAT-GST组小鼠肝脏中HBV DNA拷贝数平均值为106.3个拷贝，TAT-p53组的平均值为103.4个拷贝，与阴性对照TAT-GST组相比，TAT-p53组的HBV DNA拷贝数降低了794倍(p<0.01)。
以上结果表明，TAT-p53能在体内显著抑制HBV的蛋白表达和病毒复制。
Claims (10)
1.一种蛋白，为如下(1)或(2)所示：
(1)SEQ ID No.5所示的蛋白；
(2)将SEQ ID No.5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为如下中至少一种：
1)SEQ ID No.4中自5’末端起第10位至第1224位核苷酸所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.一种制备权利要求1所述蛋白的方法，是将权利要求2或3所述的编码基因导入原核细胞中进行表达。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述编码基因是通过重组表达载体导入的，所述重组表达载体是将所述编码基因插入pET28a(+)的多克隆位点得到的，具体是将SEQ ID No.4所示的DNA分子插入pET28a(+)的BamHI和XhoI位点间得到的；
所述原核细胞为大肠杆菌，具体为大肠杆菌BL21(DE3)。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述表达之后还包括将细胞破碎、收集沉淀、将沉淀溶解取上清和/或将上清进行纯化的步骤。
8.根据权利要求5-7任一所述的方法，其特征在于：所述破碎为超声破碎；
所述将沉淀溶解取上清的方法为：将所述收集沉淀得到的沉淀用8M的尿素溶液溶解，得到蛋白溶液；将蛋白溶液的pH值调至9.8-10.2，离心取上清，记作上清1；将上清1的pH值调至7.6-7.8，离心取上清，即得；
所述将上清进行纯化的方法为镍离子亲和层析纯化，步骤如下：
a、用8M的尿素溶液预平衡镍离子柱至少3个柱体积；
b、将所述沉淀溶解取上清得到的上清加入镍离子柱；
c、用8M的尿素溶液冲洗镍离子柱至少5个柱体积，洗去杂蛋白；
d、用60mM咪唑溶液冲洗镍离子柱至少5个柱体积，洗去未结合的蛋白；
所述60mM咪唑溶液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为Na2HPO4,NaCl,尿素和咪唑，所述Na2HPO4在所述60mM咪唑溶液中的浓度为20mM、所述NaCl在所述60mM咪唑溶液中的浓度为0.5M、所述尿素在所述60mM咪唑溶液中的浓度为8M、所述咪唑在所述60mM咪唑溶液中的浓度为60mM，pH为7.7；
e、用300mM咪唑溶液洗脱目的蛋白，即得；
所述300mM咪唑溶液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为Na2HPO4,NaCl,尿素和咪唑，所述Na2HPO4在所述300mM咪唑溶液中的浓度为20mM、所述NaCl在所述300mM咪唑溶液中的浓度为0.5M、所述尿素在所述300mM咪唑溶液中的浓度为8M、所述咪唑在所述300mM咪唑溶液中的浓度为300mM，pH为7.7；
所述8M的尿素溶液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为Na2HPO4,NaCl,尿素和咪唑，所述Na2HPO4在所述8M的尿素溶液中的浓度为20mM、所述NaCl在所述8M的尿素溶液中的浓度为0.5M、所述尿素在所述8M的尿素溶液中的浓度为8M、所述咪唑在所述8M的尿素溶液中的浓度为20mM，pH为7.7。
9.根据权利要求5-8任一所述的方法，其特征在于：所述将上清进行纯化之后还包括将纯化后的目的蛋白透析浓缩、去除内毒素和/或除菌的步骤。
10.权利要求1所述的蛋白，权利要求2或3所述的编码基因在制备抑制HBV蛋白的表达、HBV mRNA转录和/或HBV复制的产品中的应用；
或，
权利要求1所述的蛋白，权利要求2或3所述的编码基因在制备抑制和/或清除HBV的产品中的应用；
或，
权利要求1所述的蛋白，权利要求2或3所述的编码基因在制备预防和/或治疗HBV引起的疾病的产品中的应用。
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