CN110128521B - 用于生产重组融合蛋白的辅助蛋白、编码基因、重组融合蛋白、重组表达载体及制备方法 - Google Patents

用于生产重组融合蛋白的辅助蛋白、编码基因、重组融合蛋白、重组表达载体及制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110128521B
CN110128521B CN201910434917.5A CN201910434917A CN110128521B CN 110128521 B CN110128521 B CN 110128521B CN 201910434917 A CN201910434917 A CN 201910434917A CN 110128521 B CN110128521 B CN 110128521B
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
fusion protein
recombinant fusion
protein
val
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910434917.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110128521A (zh
Inventor
梁莉
刘懿
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chengdu Yingpuboji Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Chengdu Yingpuboji Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chengdu Yingpuboji Biotechnology Co ltd filed Critical Chengdu Yingpuboji Biotechnology Co ltd
Publication of CN110128521A publication Critical patent/CN110128521A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110128521B publication Critical patent/CN110128521B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/605—Glucagons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/14—Angiotensins: Related peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种辅助蛋白，为氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的蛋白，或为与氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白具有85％以上同源性的蛋白，还公开了包含该辅助蛋白的重组融合蛋白、重组表达载体以及该重组融合蛋白的制备方法。本发明的优点在于，该辅助蛋白可用于生产多种氨基酸个数为20‑80个和/或等电点范围为3‑9的小分子多肽；该重组融合蛋白表达于细胞内，破壁后在4℃‑100℃均可稳定存在于上清液中，具有较佳的热稳定性，可在60℃‑100℃通过热破壁法即可获得大量重组融合蛋白，简化重组融合蛋白的提取流程，降低成本，再在合适条件下通过酶切割或化学切割使辅助蛋白与目的多肽断裂，即可获得稳定而有活性的目的多肽。

Description

用于生产重组融合蛋白的辅助蛋白、编码基因、重组融合蛋 白、重组表达载体及制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于生产重组融合蛋白的辅助蛋白、编码基因、重组融合蛋白、重组表达载体及制备方法。
背景技术
对于很多种类的多肽和蛋白质，都可用包含编码所述多肽的核苷酸序列的表达载体、转化微生物或动植物宿主细胞表达。目的多肽的表达方法有多种，一种是直接将目的多肽分泌到胞外，另一种是在细胞内直接从目的多肽的天然N端开始表达，还有一种方法是在目的多肽的N端或C端加以辅助蛋白序列从而让辅助蛋白和目的多肽共同表达。
大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚、操作简单、培养周期短、异源蛋白表达量高等优点，已经在当今生物制药行业广泛使用。然而，运用如此成熟的表达系统，仍然面临一些问题。例如，大部分小分子量多肽在大肠杆菌中直接表达时，通常表达量不高。由于其分子量小，大部分小分子量多肽直接表达时缺乏稳定而可溶的状态。此外，小分子量多肽在重组表达时，易被宿主胞内或胞外的蛋白酶或肽酶所降解，导致生成不同序列的目的多肽类似物杂质。一些多肽在大肠杆菌或是其他原核生物表达系统中可成功表达和富集的情况下，通常是以不溶的包涵体形式存在。即使不形成包涵体，小分子量的线性多肽由于其构象的自由性，易受外界环境影响从而形成不可预知的结构，影响其生物活性，在应用于生物制药领域时往往无法达到预期效果。包涵体往往需要变性和复性以获得可溶且正确折叠的蛋白或多肽，而涉及包涵体纯化的过程通常较为复杂和困难，而且根据蛋白和多肽种类的不同而适应特别的条件。包涵体纯化过程有时会导致目的蛋白或多肽的生物活性降低甚至失活，而且，包涵体额外的纯化步骤会给目的产物的分离纯化带来更多难度，成本更高，不利于重组蛋白或多肽产品的大规模生产。
基于上述问题，急需开发一种能克服上述问题获得稳定且有活性的小分子量多肽的方法。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述生产的蛋白不溶于上清、利用包涵体生产成本高的问题，本发明提供了一种用于生产重组融合蛋白的辅助蛋白、编码基因、重组融合蛋白、重组表达载体以及该重组融合蛋白的制备方法。
本发明所采用的技术方案为：
本发明提供了一种用于生产重组融合蛋白的辅助蛋白，为氨基酸序列如 SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的蛋白，或为与氨基酸序列如 SEQ ID NO.1所示的蛋白具有85％以上同源性的蛋白。
优选地，该辅助蛋白为与氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白具有95％以上同源性的蛋白。
优选地，所述辅助蛋白为人工修饰或包含C29S突变的硫氧还蛋白。
本发明还提供了一种前述辅助蛋白的编码基因，为核苷酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示的基因。
本发明还提供了一种包含前述辅助蛋白的重组融合蛋白，所述重组融合蛋白包括从N端到C端依次连接的辅助蛋白—连接肽—目的多肽，所述辅助蛋白为氨基酸序列为前述辅助蛋白，所述目的多肽的等电点范围为3-9和/或氨基酸个数为20-80个，所述连接肽为蛋白酶切割位点或化学物质切割位点。
具体的，上述重组融合蛋白，所述目的多肽包括促生长激素神经肽、血管紧张素I、血管紧张素II、胰高血糖素、胰高血糖素-1类似物、胰高血糖素样肽 -2、生长激素、促胰液素以及前述物质的衍生物。
具体的，上述重组融合蛋白，所述蛋白酶包括凝血酶、烟草蚀纹病毒蛋白酶、3C蛋白酶、肠激酶、胰蛋白酶和赖氨酰肽链内切酶，所述化学物质包括溴化氰、羟胺和甲酸。
具体的，上述重组融合蛋白，所述连接肽包含六个组氨酸组成的组氨酸标签序列，所述组氨酸标签序列位于所述连接肽的氨基酸序列的N端或C端。
可选地，所述重组融合蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9 或SEQ IDNO.11所示的蛋白。
可选地，所述重组融合蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、 SEQID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24或SEQ ID NO.26所示的蛋白。
具体地，上述重组融合蛋白的编码基因为核苷酸序列如SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.10或SEQ ID NO.12所示的基因。
可选地，上述重组融合蛋白的编码基因为核苷酸序列如SEQ ID NO.17、SEQ IDNO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25或SEQ ID NO.27所示的基因。
本发明还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体由载体和前述重组融合蛋白的编码基因重组而成，所述载体包括但不限于pET系列载体。
本发明还提供了一种前述的重组融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：
(1)根据氨基酸序列合成重组融合蛋白的编码基因；
(2)将所述重组融合蛋白的编码基因插入载体，得到重组表达载体；
(3)将所述重组表达载体转化入宿主菌，得到重组工程菌；
(4)培养所述重组工程菌，加入诱导剂诱导重组融合蛋白表达，得到含有所述重组融合蛋白的菌体；
(5)将步骤(4)中含有所述重组融合蛋白的菌体与缓冲液混合，获得菌悬液；
(6)将菌悬液加热破壁，加热温度为60℃-100℃，加热完成后离心取上清，即得重组融合蛋白，所述重组融合蛋白稳定存在于上清中。
可选地，步骤(4)中所述诱导剂为IPTG诱导剂。
本发明的有益效果为：
本发明提供的辅助蛋白作为融合蛋白中的辅助蛋白，可用于生产多种氨基酸个数为20-80个和/或等电点范围为3-9的小分子多肽。通过在辅助蛋白的C 端与目的多肽的N端设计酶切割位点或化学切割位点形成重组融合蛋白，该重组融合蛋白表达于重组工程菌的细胞内，菌体细胞经过高温加热破壁，离心后所述重组融合蛋白位于上清中。所述重组融合蛋白具有较佳的热稳定性，在4℃ -100℃时均可稳定存在于液体中。故在大规模生产时通过热破壁法即可获得大量重组融合蛋白，热破壁温度范围在60℃-100℃，简化重组融合蛋白的提取流程，降低成本，获得的重组融合蛋白再在合适条件下通过酶切割或化学切割使得辅助蛋白与目的多肽断裂，即可获得稳定而有活性的目的多肽。
附图说明
图1是本发明的重组融合蛋白mTrA-7-36的表达及热稳定性实验的 SDS-PAGE图。
图2是重组融合蛋白2CV-7-36的表达及热稳定性实验的SDS-PAGE图。
图3为重组融合蛋白mTrA-9-37以及mTrA-11-37的表达及热稳定性实验的 SDS-PAGE图。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步阐释。
实施例1
本实施例的目的在于提供三种辅助蛋白(Thioredoxin)和包含该三种辅助蛋白的重组融合蛋白。
根据已经公布的硫氧还蛋白(Thioredoxin)的氨基酸序列(序列号为：KFL15614.1)，将该硫氧还蛋白的29位的半胱氨酸突变为丝氨酸并删除最后一位氨基酸，如Seq ID No.3所示；在Seq ID No.3的基础上，在其C端增加三个氨基酸(GSG)或五个氨基酸(GSGSG)，以增加重组融合蛋白的柔性，其氨基酸序列分别如Seq ID No.1和Seq ID No.2所示；再在Seq ID No.1-3的基础上，在C端依次连接肠激酶的酶切位点和胰高血糖素-1类似物7-36，其氨基酸序列分别如Seq ID No.7、Seq ID No.9和Seq ID No.11所示；在Seq IDNo.1-3的基础上，在C端依次连接肠激酶的酶切位点和胰高血糖素-1类似物Arg34(9-37)，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.20所示；在 Seq ID No.1-3的基础上，在C端依次连接肠激酶的酶切位点和胰高血糖素-1类似物Arg34(9-37)，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.26所示。根据前述氨基酸序列反推其核苷酸序列，并将反推得到的核苷酸序列送往生物公司合成，得到辅助蛋白的突变后的核苷酸序列以及包含辅助蛋白的重组融合蛋白，对所得到的辅助蛋白和重组融合蛋白的核苷酸序列进行基因测序验证确认。辅助蛋白Seq ID No.1-Seq ID No.3对应的编码基因的核苷酸序列如Seq ID No.4-6所示，包含Seq ID No.1-Seq ID No.3的重组融合蛋白的氨基酸序列分别如Seq ID No.7、Seq ID No.9、Seq ID No.11、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.26所示，重组融合蛋白Seq IDNo.7、Seq ID No.9和Seq ID No.11、SEQ ID NO.16、 SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ IDNO.22、SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.26 所对应的编码基因的核苷酸序列分别如Seq IDNo.8、Seq ID No.10和Seq ID No.12、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ IDNO.23、SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.27所示。为便于后续纯化，可在Seq ID No.7、Seq IDNo.9 和Seq ID No.11的连接肽上设计组氨酸标签，分别如Seq ID No.13、Seq ID No.14和Seq ID No.15所示。
表1
Figure RE-GDA0002125815320000061
Figure RE-GDA0002125815320000071
Figure RE-GDA0002125815320000081
Figure RE-GDA0002125815320000091
Figure RE-GDA0002125815320000101
实施例2
本实施例的目的在于构建重组表达载体。
将上述辅助蛋白的编码基因的核苷酸序列分别插入载体pET28a的NcoI (CCATGG)以及XhoI(CTCGAG)多克隆位点，得到重组表达载体，将所构建的重组表达载体测序，验证插入的基因正确，命名为pET28a-mtrA/7-36、 pET28a-mtrA1/7-36和pET28a-mtrA2/7-36；以及pET28a-mtrA/9-37、 pET28a-mtrA1/9-37和pET28a-mtrA2/9-37；pET28a-mtrA/11-37、pET28a-mtrA1/11-37和pET28a-mtrA2/11-37。除了pET28a，还可以用pET系列载体的其他载体，如pET-28b、pET-28c、pET-29a、pET-30a、pET-30b、pET-30c、 pET-33b、pET-39b、pET-40b、pET-41a、pET-41b、pET-41c，pET-42a、pET-42b、 pET-42c，pET-47b、pET-48b、pET-49b、pET-50b、pET-51或pET-52b。三种重组表达载体中插入的重组融合蛋白具体包含以下三种类型：
(1)pET28a-mtrA/7-36：该重组表达载体的重组融合蛋白的氨基酸序列如表1中SEQ ID NO.7所示，氨基酸序列1-107为SEQ ID NO.1，氨基酸序列 108-112为肠激酶的切割位点对应的氨基酸序列，氨基酸序列113-142为胰高血糖素-1类似物7-36对应的氨基酸序列，重组融合蛋白的核苷酸序列如表1中 SEQ ID NO.8所示，核苷酸序列1-321为SEQ IDNO.4，核苷酸序列322-336为肠激酶的切割位点对应的核苷酸序列，核苷酸序列337-426为胰高血糖素-1类似物7-36对应的核苷酸序列。
(2)pET28a-mtrA1/7-36：该重组表达载体的重组融合蛋白的氨基酸序列如表1中SEQ ID NO.9所示，氨基酸序列1-109为SEQ ID NO.2，氨基酸序列 110-114为肠激酶的切割位点对应的氨基酸序列，氨基酸序列115-144为胰高血糖素-1类似物7-36对应的氨基酸序列。所重组融合蛋白的核苷酸序列如表1中 SEQ ID NO.10所示，核苷酸序列1-327为SEQ IDNO.5，核苷酸序列328-342 为肠激酶的切割位点对应的核苷酸序列，核苷酸序列343-432为胰高血糖素-1 类似物7-36对应的核苷酸序列。
(3)pET28a-mtrA2/7-36：该重组表达载体的重组融合蛋白的氨基酸序列如表1中SEQ ID NO.11所示，氨基酸序列1-104为SEQ ID NO.3，氨基酸序列 105-109为肠激酶的切割位点对应的氨基酸序列，氨基酸序列110-139为胰高血糖素-1类似物7-36对应的氨基酸序列。重组融合蛋白的核苷酸序列如表1中 SEQ ID NO.12所示，核苷酸序列1-312为SEQ IDNO.6，核苷酸序列313-327 为肠激酶的切割位点对应的核苷酸序列，核苷酸序列328-417为胰高血糖素-1 类似物7-36对应的核苷酸序列。
(4)pET28a-mtrA/9-37：该重组表达载体的重组融合蛋白的氨基酸序列如表1中SEQ ID NO.16所示，氨基酸序列1-107为SEQ ID NO.1，氨基酸序列 108-112为肠激酶的切割位点对应的氨基酸序列，氨基酸序列113-141为胰高血糖素-1类似物(R34)9-37对应的氨基酸序列，重组融合蛋白的核苷酸序列如表1 中SEQ ID NO.17所示，核苷酸序列1-321为SEQ ID NO.4，核苷酸序列322-336 为肠激酶的切割位点对应的核苷酸序列，核苷酸序列337-423为胰高血糖素-1 类似物(R34)9-37对应的核苷酸序列。
(5)pET28a-mtrA1/9-37：该重组表达载体的重组融合蛋白的氨基酸序列如表1中SEQ ID NO.18所示，氨基酸序列1-109为SEQ ID NO.2，氨基酸序列 110-114为肠激酶的切割位点对应的氨基酸序列，氨基酸序列115-143为胰高血糖素-1类似物(R34)9-37对应的氨基酸序列。所重组融合蛋白的核苷酸序列如表 1中SEQ ID NO.19所示，核苷酸序列1-327为SEQ ID NO.5，核苷酸序列328-342 为肠激酶的切割位点对应的核苷酸序列，核苷酸序列343-429为胰高血糖素-1 类似物(R34)9-37对应的核苷酸序列。
(6)pET28a-mtrA2/9-37：该重组表达载体的重组融合蛋白的氨基酸序列如表1中SEQ ID NO.20所示，氨基酸序列1-104为SEQ ID NO.3，氨基酸序列 105-109为肠激酶的切割位点对应的氨基酸序列，氨基酸序列110-138为胰高血糖素-1类似物(R34)9-37对应的氨基酸序列。重组融合蛋白的核苷酸序列如表1 中SEQ ID NO.21所示，核苷酸序列1-312为SEQ ID NO.6，核苷酸序列313-327 为肠激酶的切割位点对应的核苷酸序列，核苷酸序列328-414为胰高血糖素-1 类似物(R34)9-37对应的核苷酸序列。
(7)pET28a-mtrA/11-37：该重组表达载体的重组融合蛋白的氨基酸序列如表1中SEQ ID NO.22所示，氨基酸序列1-107为SEQ ID NO.1，氨基酸序列 108-112为肠激酶的切割位点对应的氨基酸序列，氨基酸序列113-139为胰高血糖素-1类似物(R34)11-37对应的氨基酸序列，重组融合蛋白的核苷酸序列如表1 中SEQ ID NO.23所示，核苷酸序列1-321为SEQ ID NO.4，核苷酸序列322-336 为肠激酶的切割位点对应的核苷酸序列，核苷酸序列337-417为胰高血糖素-1 类似物(R34)11-37对应的核苷酸序列。
(8)pET28a-mtrA1/11-37：该重组表达载体的重组融合蛋白的氨基酸序列如表1中SEQ ID NO.24所示，氨基酸序列1-109为SEQ ID NO.2，氨基酸序列 110-114为肠激酶的切割位点对应的氨基酸序列，氨基酸序列115-141为胰高血糖素-1类似物(R34)11-37对应的氨基酸序列。所重组融合蛋白的核苷酸序列如表 1中SEQ ID NO.25所示，核苷酸序列1-327为SEQ ID NO.5，核苷酸序列328-342 为肠激酶的切割位点对应的核苷酸序列，核苷酸序列343-423为胰高血糖素-1 类似物(R34)11-37对应的核苷酸序列。
(9)pET28a-mtrA2/11-37：该重组表达载体的重组融合蛋白的氨基酸序列如表1中SEQ ID NO.26所示，氨基酸序列1-104为SEQ ID NO.3，氨基酸序列 105-109为肠激酶的切割位点对应的氨基酸序列，氨基酸序列110-136为胰高血糖素-1类似物(R34)11-37对应的氨基酸序列。重组融合蛋白的核苷酸序列如表1 中SEQ ID NO.27所示，核苷酸序列1-312为SEQ ID NO.6，核苷酸序列313-327 为肠激酶的切割位点对应的核苷酸序列，核苷酸序列328-408为胰高血糖素-1 类似物(R34)11-37对应的核苷酸序列。
实施例3
本实施例的目的在于制备重组工程菌。
将上述构建正确的表达载体pET28a-mtrA/7-36、pET28a-mtrA1/7-36和 pET28a-mtrA2/7-36、pET28a-mtrA/9-37、pET28a-mtrA1/9-37、 pET28a-mtrA2/9-37、pET28a-mtrA/11-37、pET28a-mtrA1/11-37和 pET28a-mtrA2/11-37。分别热激转化大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于含有50 μg/mL硫酸卡那霉素的LB平板培养基。大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞的制备以及热激转化的方法参见《分子克隆实验指南》。待转化子长出，筛选若干送出测序，测序正确的转化子保存备用，测序正确的转化子即为重组工程菌。
实施例4
本实施例的目的在于表达重组融合蛋白。
将上述测序正确的单个阳性转化子(含pET28a-mtrA/7-36、 pET28a-mtrA/9-37和pET28a-mtrA/11-37)即工程菌分别接种于含有硫酸卡那霉素(50μg/mL)的LB液体培养基，37℃，220rpm培养过夜。将所得培养液作为种子，1％接种量接种于新鲜的含硫酸卡那霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中，即1mL种子加入100mL新鲜培养基中，37℃培养4h，将温度调至30℃并加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)至IPTG终浓度0.4mM，继续振荡培养 20h。将所得培养液于室温4000rpm离心10min，收集菌体，多余菌体保存于 -20℃。取一定体积的菌体，向其中加入一定体积的Sample loading buffer，100℃煮沸5min制样。所得样品进行SDS-PAGE电泳。
图1为SDS-PAGE分析重组融合蛋白mTrA-7-36表达情况。泳道1中画框部分的条带即为目的蛋白mTrA-7-36的表达结果，其灰度值远远大于与其大小相当的Marker的灰度值，由此可见，利用本发明提供的辅助蛋白和本发明提供的重组融合蛋白的制备方法生产的目的蛋白mTrA-7-36的表达量较大。含pET28a-mtrA1/7-36和pET28a-mtrA2/7-36的阳性转化子按上述步骤得到的目的蛋白的蛋白条带灰度与pET28a-mtrA/7-36相当，无明显差异，结果未展示。图 3为SDS-PAGE分析重组融合蛋白mTrA-9-37以及mTrA-11-37结果。其中，泳道1-5：融合蛋白mTrA-9-37数据。具体地，泳道1：诱导的大肠杆菌菌体；泳道M：蛋白预染Marker；泳道2：菌体悬液90℃水浴30min后离心上清；泳道 3：菌体悬液90℃水浴30min后离心沉淀；泳道4：菌体悬液70℃水浴30min 后离心上清；泳道5：菌体悬液70℃水浴30min后离心沉淀。泳道1为经诱导的重组大肠杆菌菌体，在约15kD处蛋白条带灰度值远远大于其他条带，该位置与mTrA-9-37理论分子量相当，可以看出mTrA-9-37表达量较大。泳道6-10：融合蛋白mTrA-11-37数据。具体地，泳道6：诱导的大肠杆菌菌体；泳道7：菌体悬液90℃水浴30min后离心上清；泳道8：菌体悬液90℃水浴30min后离心沉淀；泳道9：菌体悬液70℃水浴30min后离心上清；泳道10：菌体悬液 70℃水浴30min后离心沉淀。泳道6为经诱导的重组大肠杆菌菌体，在约15kD 处蛋白条带灰度值远远大于其他条带，该位置与mTrA-11-37理论分子量相当，可以看出mTrA-11-37表达量较大。
实施例5
本实施例的目的在于评价重组融合蛋白mTrA-7-36的热稳定性。
将实施例4中得到的菌体重悬于1/10V的培养液体积(实施例4中培养工程菌的培养基的体积)的20mM Tris-HCl(pH 7.5)，超声法破壁提取重组融合蛋白mTrA-7-36。超声条件为：功率450W，超声2s，间隔6s，70次重复循环。将所得混悬液于4℃、12000rpm离心10min，分离上清(可溶蛋白)和沉淀一(不可溶蛋白)。所得上清经90℃水浴30min，然后4℃，12000rpm离心 10min分离上清和沉淀二。所得蛋白样品均按前述SDS-PAGE制样方法制样，经SDS-PAGE分析后结果见图1，其中，各泳道的样品如下，泳道1为未诱导的大肠杆菌菌体；泳道M为蛋白预染Marker；泳道2为经诱导的大肠杆菌菌体；泳道3为超声后的离心上清；泳道4为超声后的离心沉淀(沉淀一)；泳道5为 90℃水浴后的离心上清；泳道6为90℃水浴后的离心沉淀(沉淀二)。由泳道2 的结果(灰度)可知，诱导后的大肠杆菌菌体中存在大量的重组融合蛋白 mTrA-7-36，表明重组融合蛋白mTrA-7-36大量存在于大肠杆菌菌体内；经过超声破壁后，重组融合蛋白mTrA-7-36能稳定存在于上清液中(泳道3)，而不是超声破壁后的沉淀中(泳道4)，表明mTrA-7-36具有较佳的可溶性；然而超声破壁的上清经90℃水浴30min后，大部分重组融合蛋白mTrA-7-36仍存在于上清(泳道5)中，而不是水浴加热后的沉淀中(泳道6)，表明mTrA-7-36 具备较佳的热稳定性。由于mTrA-7-36经过破壁后能溶于上清且具有较佳的热稳定性，mTrA-7-36的大规模生产可由菌体混悬液通过热破壁法获得，避免了形成包涵体后的大量纯化费用，仅需要用蛋白酶将重组融合蛋白切开，即可获得所要生产的目的多肽胰高血糖素-1类似物7-36，便于后续目的多肽胰高血糖素-1类似物7-36的大规模且低成本生产。
将之前所构建表达的另一重组融合蛋白2CV-7-36按照相同方法进行热稳定性实验，以便与本发明所述重组融合蛋白mTrA-7-36进行对比。2CV-7-36的连接肽以及目的多肽的氨基酸序列均与mTrA-7-36相同，但其辅助蛋白2CV的氨基酸序列不同于本发明提供的SEQ ID NO.1，其辅助蛋白2CV也是一种辅助蛋白Thioredoxin。所得结果见图2，图2中各泳道的样品如下，泳道1为诱导的大肠杆菌菌体；泳道2为超声后的离心上清；泳道M为蛋白预染Marker；泳道 3为超声后的离心沉淀(沉淀一)；泳道4为90℃水浴后的离心上清；泳道5为90℃水浴后的离心沉淀(沉淀二)。从图2中可见，由泳道1～3的结果(灰度)可知，诱导后的大肠杆菌菌体中存在大量重组蛋白2CV-7-36(泳道1)，诱导后的大厂杆菌菌体经过超声破壁再离心后，重组蛋白2CV-7-36在上清中的量(泳道2)显著低于超声离心后的沉淀中的量(泳道3)，表明虽然利用辅助蛋白2CV也能生产重组融合蛋白2CV-7-36，但经超声后，大部分重组融合蛋白 2CV-7-36位于沉淀中(泳道3)，即2CV-7-36的可溶性不佳；然而上清(泳道2)经90℃水浴30min后，2CV-7-36几乎都存在于沉淀中(泳道5)，而不是水浴后的上清中(泳道4)，表明2CV-7-36的热稳定性不佳。由此可见，2CV-7-36 可溶性不佳且热稳定性不佳，无法采用热破壁的方法进行目的多肽胰高血糖素 -1类似物7-36的大规模生产，后期生产费用较大。
实施例6
本实施例的目的在于评价重组融合蛋白mTrA-9-37以及mTrA-11-37的热稳定性。
将实施例4中得到的菌体分别重悬于1/5V的培养液体积(实施例4中培养工程菌的培养基的体积)的20mM Tris-HCl(pH 7.5)，取样作为菌体总蛋白对照。将菌悬液分为两份，于90℃下水浴30min，然后4℃，12000rpm离心 10min分离上清和沉淀；于70℃下水浴30min，然后4℃，12000rpm离心10min 分离上清和沉淀。将所有样品均按前述SDS-PAGE制样方法制样，经SDS-PAGE 分析后结果见图3。
图3中，泳道1-5：融合蛋白mTrA-9-37数据。泳道1：诱导的大肠杆菌菌体；泳道M：蛋白预染Marker；泳道2：菌体悬液90℃水浴30min后离心上清；泳道3：菌体悬液90℃水浴30min后离心沉淀；泳道4：菌体悬液70℃水浴30 min后离心上清；泳道5：菌体悬液70℃水浴30min后离心沉淀。
泳道6-10：融合蛋白mTrA-11-37数据。泳道6：诱导的大肠杆菌菌体；泳道7：菌体悬液90℃水浴30min后离心上清；泳道8：菌体悬液90℃水浴30min 后离心沉淀；泳道9：菌体悬液70℃水浴30min后离心上清；泳道10：菌体悬液70℃水浴30min后离心沉淀。
图3泳道1-5可看出，重组大肠杆菌菌悬液经70℃水浴破胞30min后，重组融合蛋白mTrA-9-37稳定存在于上清中(泳道4)，而不是存在于相应沉淀中(泳道5)，说明mTrA-9-37在70℃下热稳定性好；同样的菌悬液经90℃水浴30min后，重组融合蛋白mTrA-9-37稳定存在于上清中(泳道2)，而不是存在于相应沉淀中(泳道3)，说明mTrA-9-37在90℃下热稳定性好。
图3泳道6-10可看出，重组大肠杆菌菌悬液经70℃水浴破胞30min后，重组融合蛋白mTrA-11-37稳定存在于上清中(泳道9)，而不是存在于相应沉淀中(泳道10)，说明mTrA-11-37在70℃下热稳定性好；同样的菌悬液经90℃水浴30min后，重组融合蛋白mTrA-11-37稳定存在于上清中(泳道7)，而不是存在于相应沉淀中(泳道8)，说明mTrA-11-37在90℃下热稳定性好。
由于mTrA-9-37和mTrA-11-37经过破壁后能溶于上清且具有较佳的热稳定性，mTrA-9-37和mTrA-11-37的大规模生产可由菌体混悬液通过热破壁法获得，避免了形成包涵体后的大量纯化费用，仅需要用蛋白酶将重组融合蛋白切开，即可获得所要生产的目的多肽胰高血糖素-1类似物9-37或11-37，便于后续目的多肽胰高血糖素-1类似物9-37或11-37的大规模且低成本生产。
本发明提供的辅助蛋白或重组融合蛋白，除用于生产肽胰高血糖素-1类似物7-36外，还可用于生产促生长激素神经肽、血管紧张素I、血管紧张素II、胰高血糖素、胰高血糖素样肽-2、生长激素、促胰液素以及各自的衍生物等，重组融合蛋白中的连接肽，除了上述实施例中用到的肠激酶切的割位点对应的核苷酸序列，还可使用现有技术中常用的酶切割位点或化学切割位点对应的氨基酸序列，酶切割位点包括但不限于凝血酶、烟草蚀纹病毒蛋白酶、3C蛋白酶、肠激酶、胰蛋白酶或赖氨酰肽链内切酶的切割位点对应的氨基酸序列，化学切割位点包括但不限于溴化氰、羟胺和甲酸等的切割位点对应的氨基酸序列。
本发明提供的辅助蛋白作为融合蛋白中的辅助蛋白，可用于生产多种氨基酸个数为20-80个和/或等电点范围为3-9的小分子多肽。通过在辅助蛋白的C 端与目的多肽的N端通过酶切割位点或是化学切割位点相连接形成重组融合蛋白，该重组融合蛋白存在于重组工程菌细胞内，经加热破壁后大量存在于上清中，具有较佳的热稳定性，在4℃-100℃时均可稳定存在于液体。故通过热破壁法即可获得大量重组融合蛋白，热破壁温度范围在60℃-100℃，简化重组融合蛋白的提取流程，降低成本，获得的重组融合蛋白再在合适条件下通过酶切割或化学切割使得辅助蛋白与目的多肽断裂，即可获得稳定而有活性的目的多肽。
本发明中使用到但未详细说明的步骤可参见分子克隆实验指南(第三版， J.萨姆布鲁克等，科学出版社，2002)。
本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本发明的保护范围应当以权利要求书中界定的为准，并且说明书可以用于解释权利要求书。
序列表
<110> 成都英普博集生物科技有限公司
<120> 用于生产重组融合蛋白的辅助蛋白、编码基因、重组融合蛋白、重组表达载体及制备方法
<150> 2018108585098
<151> 2018-07-31
<160> 27
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ala Ile Val Asn Ala Thr Asp Gln Thr Phe Ala Ala Glu Thr Lys
1 5 10 15
Asp Gly Leu Thr Leu Val Asp Phe Trp Ala Pro Trp Ser Gly Pro Cys
20 25 30
Arg Met Ile Ala Pro Val Leu Glu Glu Leu Asp Arg Glu Met Gly Asp
35 40 45
Lys Val Lys Ile Val Lys Val Asn Val Asp Glu Asn Gln Glu Thr Ala
50 55 60
Ser Lys Phe Gly Val Met Ser Ile Pro Thr Leu Leu Val Phe Lys Asn
65 70 75 80
Gly Glu Leu Val Asp Lys Ala Val Gly Tyr Gln Pro Lys Glu Ala Leu
85 90 95
Val Gln Leu Val Gly Lys His Val Gly Ser Gly
100 105
<210> 2
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ala Ile Val Asn Ala Thr Asp Gln Thr Phe Ala Ala Glu Thr Lys
1 5 10 15
Asp Gly Leu Thr Leu Val Asp Phe Trp Ala Pro Trp Ser Gly Pro Cys
20 25 30
Arg Met Ile Ala Pro Val Leu Glu Glu Leu Asp Arg Glu Met Gly Asp
35 40 45
Lys Val Lys Ile Val Lys Val Asn Val Asp Glu Asn Gln Glu Thr Ala
50 55 60
Ser Lys Phe Gly Val Met Ser Ile Pro Thr Leu Leu Val Phe Lys Asn
65 70 75 80
Gly Glu Leu Val Asp Lys Ala Val Gly Tyr Gln Pro Lys Glu Ala Leu
85 90 95
Val Gln Leu Val Gly Lys His Val Gly Ser Gly Ser Gly
100 105
<210> 3
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Ala Ile Val Asn Ala Thr Asp Gln Thr Phe Ala Ala Glu Thr Lys
1 5 10 15
Asp Gly Leu Thr Leu Val Asp Phe Trp Ala Pro Trp Ser Gly Pro Cys
20 25 30
Arg Met Ile Ala Pro Val Leu Glu Glu Leu Asp Arg Glu Met Gly Asp
35 40 45
Lys Val Lys Ile Val Lys Val Asn Val Asp Glu Asn Gln Glu Thr Ala
50 55 60
Ser Lys Phe Gly Val Met Ser Ile Pro Thr Leu Leu Val Phe Lys Asn
65 70 75 80
Gly Glu Leu Val Asp Lys Ala Val Gly Tyr Gln Pro Lys Glu Ala Leu
85 90 95
Val Gln Leu Val Gly Lys His Val
100
<210> 4
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggcaattg tgaatgccac cgatcagacc tttgccgcag aaaccaaaga tggcctgacc 60
ctggtggatt tttgggcccc gtggagcggt ccgtgccgca tgattgcacc ggttctggaa 120
gaactggatc gtgaaatggg cgataaagtg aaaattgtta aagtgaatgt ggacgaaaac 180
caggaaaccg ccagcaaatt tggtgtgatg agtattccga ccctgctggt ttttaaaaat 240
ggcgaactgg ttgataaagc agttggttat cagccgaaag aagcactggt tcagctggtt 300
ggtaaacatg tgggcagtgg c 321
<210> 5
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atggcaattg tgaatgccac cgatcagacc tttgccgcag aaaccaaaga tggcctgacc 60
ctggtggatt tttgggcccc gtggagcggt ccgtgccgca tgattgcacc ggttctggaa 120
gaactggatc gtgaaatggg cgataaagtg aaaattgtta aagtgaatgt ggacgaaaac 180
caggaaaccg ccagcaaatt tggtgtgatg agtattccga ccctgctggt ttttaaaaat 240
ggcgaactgg ttgataaagc agttggttat cagccgaaag aagcactggt tcagctggtt 300
ggtaaacatg tgggcagtgg cagtggc 327
<210> 6
<211> 312
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atggcaattg tgaatgccac cgatcagacc tttgccgcag aaaccaaaga tggcctgacc 60
ctggtggatt tttgggcccc gtggagcggt ccgtgccgca tgattgcacc ggttctggaa 120
gaactggatc gtgaaatggg cgataaagtg aaaattgtta aagtgaatgt ggacgaaaac 180
caggaaaccg ccagcaaatt tggtgtgatg agtattccga ccctgctggt ttttaaaaat 240
ggcgaactgg ttgataaagc agttggttat cagccgaaag aagcactggt tcagctggtt 300
ggtaaacatg tg 312
<210> 7
<211> 142
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Met Ala Ile Val Asn Ala Thr Asp Gln Thr Phe Ala Ala Glu Thr Lys
1 5 10 15
Asp Gly Leu Thr Leu Val Asp Phe Trp Ala Pro Trp Ser Gly Pro Cys
20 25 30
Arg Met Ile Ala Pro Val Leu Glu Glu Leu Asp Arg Glu Met Gly Asp
35 40 45
Lys Val Lys Ile Val Lys Val Asn Val Asp Glu Asn Gln Glu Thr Ala
50 55 60
Ser Lys Phe Gly Val Met Ser Ile Pro Thr Leu Leu Val Phe Lys Asn
65 70 75 80
Gly Glu Leu Val Asp Lys Ala Val Gly Tyr Gln Pro Lys Glu Ala Leu
85 90 95
Val Gln Leu Val Gly Lys His Val Gly Ser Gly Asp Asp Asp Asp Lys
100 105 110
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
115 120 125
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg
130 135 140
<210> 8
<211> 429
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atggcaattg tgaatgccac cgatcagacc tttgccgcag aaaccaaaga tggcctgacc 60
ctggtggatt tttgggcccc gtggagcggt ccgtgccgca tgattgcacc ggttctggaa 120
gaactggatc gtgaaatggg cgataaagtg aaaattgtta aagtgaatgt ggacgaaaac 180
caggaaaccg ccagcaaatt tggtgtgatg agtattccga ccctgctggt ttttaaaaat 240
ggcgaactgg ttgataaagc agttggttat cagccgaaag aagcactggt tcagctggtt 300
ggtaaacatg tgggcagtgg cgatgatgat gataaacatg ccgaaggtac ctttaccagc 360
gatgttagca gctatctgga aggccaggcc gccaaagaat tcattgcatg gctggtgcgt 420
ggccgctaa 429
<210> 9
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Met Ala Ile Val Asn Ala Thr Asp Gln Thr Phe Ala Ala Glu Thr Lys
1 5 10 15
Asp Gly Leu Thr Leu Val Asp Phe Trp Ala Pro Trp Ser Gly Pro Cys
20 25 30
Arg Met Ile Ala Pro Val Leu Glu Glu Leu Asp Arg Glu Met Gly Asp
35 40 45
Lys Val Lys Ile Val Lys Val Asn Val Asp Glu Asn Gln Glu Thr Ala
50 55 60
Ser Lys Phe Gly Val Met Ser Ile Pro Thr Leu Leu Val Phe Lys Asn
65 70 75 80
Gly Glu Leu Val Asp Lys Ala Val Gly Tyr Gln Pro Lys Glu Ala Leu
85 90 95
Val Gln Leu Val Gly Lys His Val Gly Ser Gly Ser Gly Asp Asp Asp
100 105 110
Asp Lys His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu
115 120 125
Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg
130 135 140
<210> 10
<211> 435
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atggcaattg tgaatgccac cgatcagacc tttgccgcag aaaccaaaga tggcctgacc 60
ctggtggatt tttgggcccc gtggagcggt ccgtgccgca tgattgcacc ggttctggaa 120
gaactggatc gtgaaatggg cgataaagtg aaaattgtta aagtgaatgt ggacgaaaac 180
caggaaaccg ccagcaaatt tggtgtgatg agtattccga ccctgctggt ttttaaaaat 240
ggcgaactgg ttgataaagc agttggttat cagccgaaag aagcactggt tcagctggtt 300
ggtaaacatg tgggcagtgg cagtggcgat gatgatgata aacatgccga aggtaccttt 360
accagcgatg ttagcagcta tctggaaggc caggccgcca aagaattcat tgcatggctg 420
gtgcgtggcc gctaa 435
<210> 11
<211> 139
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Met Ala Ile Val Asn Ala Thr Asp Gln Thr Phe Ala Ala Glu Thr Lys
1 5 10 15
Asp Gly Leu Thr Leu Val Asp Phe Trp Ala Pro Trp Ser Gly Pro Cys
20 25 30
Arg Met Ile Ala Pro Val Leu Glu Glu Leu Asp Arg Glu Met Gly Asp
35 40 45
Lys Val Lys Ile Val Lys Val Asn Val Asp Glu Asn Gln Glu Thr Ala
50 55 60
Ser Lys Phe Gly Val Met Ser Ile Pro Thr Leu Leu Val Phe Lys Asn
65 70 75 80
Gly Glu Leu Val Asp Lys Ala Val Gly Tyr Gln Pro Lys Glu Ala Leu
85 90 95
Val Gln Leu Val Gly Lys His Val Asp Asp Asp Asp Lys His Ala Glu
100 105 110
Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala
115 120 125
Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg
130 135
<210> 12
<211> 420
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atggcaattg tgaatgccac cgatcagacc tttgccgcag aaaccaaaga tggcctgacc 60
ctggtggatt tttgggcccc gtggagcggt ccgtgccgca tgattgcacc ggttctggaa 120
gaactggatc gtgaaatggg cgataaagtg aaaattgtta aagtgaatgt ggacgaaaac 180
caggaaaccg ccagcaaatt tggtgtgatg agtattccga ccctgctggt ttttaaaaat 240
ggcgaactgg ttgataaagc agttggttat cagccgaaag aagcactggt tcagctggtt 300
ggtaaacatg tggatgatga tgataaacat gccgaaggta cctttaccag cgatgttagc 360
agctatctgg aaggccaggc cgccaaagaa ttcattgcat ggctggtgcg tggccgctaa 420
<210> 13
<211> 148
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Met Ala Ile Val Asn Ala Thr Asp Gln Thr Phe Ala Ala Glu Thr Lys
1 5 10 15
Asp Gly Leu Thr Leu Val Asp Phe Trp Ala Pro Trp Ser Gly Pro Cys
20 25 30
Arg Met Ile Ala Pro Val Leu Glu Glu Leu Asp Arg Glu Met Gly Asp
35 40 45
Lys Val Lys Ile Val Lys Val Asn Val Asp Glu Asn Gln Glu Thr Ala
50 55 60
Ser Lys Phe Gly Val Met Ser Ile Pro Thr Leu Leu Val Phe Lys Asn
65 70 75 80
Gly Glu Leu Val Asp Lys Ala Val Gly Tyr Gln Pro Lys Glu Ala Leu
85 90 95
Val Gln Leu Val Gly Lys His Val Gly Ser Gly His His His His His
100 105 110
His Asp Asp Asp Asp Lys His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val
115 120 125
Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu
130 135 140
Val Arg Gly Arg
145
<210> 14
<211> 150
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Met Ala Ile Val Asn Ala Thr Asp Gln Thr Phe Ala Ala Glu Thr Lys
1 5 10 15
Asp Gly Leu Thr Leu Val Asp Phe Trp Ala Pro Trp Ser Gly Pro Cys
20 25 30
Arg Met Ile Ala Pro Val Leu Glu Glu Leu Asp Arg Glu Met Gly Asp
35 40 45
Lys Val Lys Ile Val Lys Val Asn Val Asp Glu Asn Gln Glu Thr Ala
50 55 60
Ser Lys Phe Gly Val Met Ser Ile Pro Thr Leu Leu Val Phe Lys Asn
65 70 75 80
Gly Glu Leu Val Asp Lys Ala Val Gly Tyr Gln Pro Lys Glu Ala Leu
85 90 95
Val Gln Leu Val Gly Lys His Val Gly Ser Gly Ser Gly His His His
100 105 110
His His His Asp Asp Asp Asp Lys His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser
115 120 125
Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala
130 135 140
Trp Leu Val Arg Gly Arg
145 150
<210> 15
<211> 145
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Met Ala Ile Val Asn Ala Thr Asp Gln Thr Phe Ala Ala Glu Thr Lys
1 5 10 15
Asp Gly Leu Thr Leu Val Asp Phe Trp Ala Pro Trp Ser Gly Pro Cys
20 25 30
Arg Met Ile Ala Pro Val Leu Glu Glu Leu Asp Arg Glu Met Gly Asp
35 40 45
Lys Val Lys Ile Val Lys Val Asn Val Asp Glu Asn Gln Glu Thr Ala
50 55 60
Ser Lys Phe Gly Val Met Ser Ile Pro Thr Leu Leu Val Phe Lys Asn
65 70 75 80
Gly Glu Leu Val Asp Lys Ala Val Gly Tyr Gln Pro Lys Glu Ala Leu
85 90 95
Val Gln Leu Val Gly Lys His Val His His His His His His Asp Asp
100 105 110
Asp Asp Lys His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr
115 120 125
Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly
130 135 140
Arg
145
<210> 16
<211> 141
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Met Ala Ile Val Asn Ala Thr Asp Gln Thr Phe Ala Ala Glu Thr Lys
1 5 10 15
Asp Gly Leu Thr Leu Val Asp Phe Trp Ala Pro Trp Ser Gly Pro Cys
20 25 30
Arg Met Ile Ala Pro Val Leu Glu Glu Leu Asp Arg Glu Met Gly Asp
35 40 45
Lys Val Lys Ile Val Lys Val Asn Val Asp Glu Asn Gln Glu Thr Ala
50 55 60
Ser Lys Phe Gly Val Met Ser Ile Pro Thr Leu Leu Val Phe Lys Asn
65 70 75 80
Gly Glu Leu Val Asp Lys Ala Val Gly Tyr Gln Pro Lys Glu Ala Leu
85 90 95
Val Gln Leu Val Gly Lys His Val Gly Ser Gly Asp Asp Asp Asp Lys
100 105 110
Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala
115 120 125
Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
130 135 140
<210> 17
<211> 426
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
atggcaattg tgaatgccac cgatcagacc tttgccgcag aaaccaaaga tggcctgacc 60
ctggtggatt tttgggcccc gtggagcggt ccgtgccgca tgattgcacc ggttctggaa 120
gaactggatc gtgaaatggg cgataaagtg aaaattgtta aagtgaatgt ggacgaaaac 180
caggaaaccg ccagcaaatt tggtgtgatg agtattccga ccctgctggt ttttaaaaat 240
ggcgaactgg ttgataaagc agttggttat cagccgaaag aagcactggt tcagctggtt 300
ggtaaacatg tgggcagtgg cgatgatgat gataaagaag gtacctttac cagcgatgtt 360
agcagctatc tggaaggcca ggccgccaaa gaattcattg catggctggt gcgtggccgc 420
ggttaa 426
<210> 18
<211> 143
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Met Ala Ile Val Asn Ala Thr Asp Gln Thr Phe Ala Ala Glu Thr Lys
1 5 10 15
Asp Gly Leu Thr Leu Val Asp Phe Trp Ala Pro Trp Ser Gly Pro Cys
20 25 30
Arg Met Ile Ala Pro Val Leu Glu Glu Leu Asp Arg Glu Met Gly Asp
35 40 45
Lys Val Lys Ile Val Lys Val Asn Val Asp Glu Asn Gln Glu Thr Ala
50 55 60
Ser Lys Phe Gly Val Met Ser Ile Pro Thr Leu Leu Val Phe Lys Asn
65 70 75 80
Gly Glu Leu Val Asp Lys Ala Val Gly Tyr Gln Pro Lys Glu Ala Leu
85 90 95
Val Gln Leu Val Gly Lys His Val Gly Ser Gly Ser Gly Asp Asp Asp
100 105 110
Asp Lys Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
115 120 125
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
130 135 140
<210> 19
<211> 432
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
atggcaattg tgaatgccac cgatcagacc tttgccgcag aaaccaaaga tggcctgacc 60
ctggtggatt tttgggcccc gtggagcggt ccgtgccgca tgattgcacc ggttctggaa 120
gaactggatc gtgaaatggg cgataaagtg aaaattgtta aagtgaatgt ggacgaaaac 180
caggaaaccg ccagcaaatt tggtgtgatg agtattccga ccctgctggt ttttaaaaat 240
ggcgaactgg ttgataaagc agttggttat cagccgaaag aagcactggt tcagctggtt 300
ggtaaacatg tgggcagtgg cagtggcgat gatgatgata aagaaggtac ctttaccagc 360
gatgttagca gctatctgga aggccaggcc gccaaagaat tcattgcatg gctggtgcgt 420
ggccgcggtt aa 432
<210> 20
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Met Ala Ile Val Asn Ala Thr Asp Gln Thr Phe Ala Ala Glu Thr Lys
1 5 10 15
Asp Gly Leu Thr Leu Val Asp Phe Trp Ala Pro Trp Ser Gly Pro Cys
20 25 30
Arg Met Ile Ala Pro Val Leu Glu Glu Leu Asp Arg Glu Met Gly Asp
35 40 45
Lys Val Lys Ile Val Lys Val Asn Val Asp Glu Asn Gln Glu Thr Ala
50 55 60
Ser Lys Phe Gly Val Met Ser Ile Pro Thr Leu Leu Val Phe Lys Asn
65 70 75 80
Gly Glu Leu Val Asp Lys Ala Val Gly Tyr Gln Pro Lys Glu Ala Leu
85 90 95
Val Gln Leu Val Gly Lys His Val Asp Asp Asp Asp Lys Glu Gly Thr
100 105 110
Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu
115 120 125
Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
130 135
<210> 21
<211> 417
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
atggcaattg tgaatgccac cgatcagacc tttgccgcag aaaccaaaga tggcctgacc 60
ctggtggatt tttgggcccc gtggagcggt ccgtgccgca tgattgcacc ggttctggaa 120
gaactggatc gtgaaatggg cgataaagtg aaaattgtta aagtgaatgt ggacgaaaac 180
caggaaaccg ccagcaaatt tggtgtgatg agtattccga ccctgctggt ttttaaaaat 240
ggcgaactgg ttgataaagc agttggttat cagccgaaag aagcactggt tcagctggtt 300
ggtaaacatg tggatgatga tgataaagaa ggtaccttta ccagcgatgt tagcagctat 360
ctggaaggcc aggccgccaa agaattcatt gcatggctgg tgcgtggccg cggttaa 417
<210> 22
<211> 139
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Met Ala Ile Val Asn Ala Thr Asp Gln Thr Phe Ala Ala Glu Thr Lys
1 5 10 15
Asp Gly Leu Thr Leu Val Asp Phe Trp Ala Pro Trp Ser Gly Pro Cys
20 25 30
Arg Met Ile Ala Pro Val Leu Glu Glu Leu Asp Arg Glu Met Gly Asp
35 40 45
Lys Val Lys Ile Val Lys Val Asn Val Asp Glu Asn Gln Glu Thr Ala
50 55 60
Ser Lys Phe Gly Val Met Ser Ile Pro Thr Leu Leu Val Phe Lys Asn
65 70 75 80
Gly Glu Leu Val Asp Lys Ala Val Gly Tyr Gln Pro Lys Glu Ala Leu
85 90 95
Val Gln Leu Val Gly Lys His Val Gly Ser Gly Asp Asp Asp Asp Lys
100 105 110
Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys
115 120 125
Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
130 135
<210> 23
<211> 420
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
atggcaattg tgaatgccac cgatcagacc tttgccgcag aaaccaaaga tggcctgacc 60
ctggtggatt tttgggcccc gtggagcggt ccgtgccgca tgattgcacc ggttctggaa 120
gaactggatc gtgaaatggg cgataaagtg aaaattgtta aagtgaatgt ggacgaaaac 180
caggaaaccg ccagcaaatt tggtgtgatg agtattccga ccctgctggt ttttaaaaat 240
ggcgaactgg ttgataaagc agttggttat cagccgaaag aagcactggt tcagctggtt 300
ggtaaacatg tgggcagtgg cgatgatgat gataaaacct ttaccagcga tgttagcagc 360
tatctggaag gccaggccgc caaagaattc attgcatggc tggtgcgtgg ccgcggttaa 420
<210> 24
<211> 141
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Met Ala Ile Val Asn Ala Thr Asp Gln Thr Phe Ala Ala Glu Thr Lys
1 5 10 15
Asp Gly Leu Thr Leu Val Asp Phe Trp Ala Pro Trp Ser Gly Pro Cys
20 25 30
Arg Met Ile Ala Pro Val Leu Glu Glu Leu Asp Arg Glu Met Gly Asp
35 40 45
Lys Val Lys Ile Val Lys Val Asn Val Asp Glu Asn Gln Glu Thr Ala
50 55 60
Ser Lys Phe Gly Val Met Ser Ile Pro Thr Leu Leu Val Phe Lys Asn
65 70 75 80
Gly Glu Leu Val Asp Lys Ala Val Gly Tyr Gln Pro Lys Glu Ala Leu
85 90 95
Val Gln Leu Val Gly Lys His Val Gly Ser Gly Ser Gly Asp Asp Asp
100 105 110
Asp Lys Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala
115 120 125
Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
130 135 140
<210> 25
<211> 426
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
atggcaattg tgaatgccac cgatcagacc tttgccgcag aaaccaaaga tggcctgacc 60
ctggtggatt tttgggcccc gtggagcggt ccgtgccgca tgattgcacc ggttctggaa 120
gaactggatc gtgaaatggg cgataaagtg aaaattgtta aagtgaatgt ggacgaaaac 180
caggaaaccg ccagcaaatt tggtgtgatg agtattccga ccctgctggt ttttaaaaat 240
ggcgaactgg ttgataaagc agttggttat cagccgaaag aagcactggt tcagctggtt 300
ggtaaacatg tgggcagtgg cagtggcgat gatgatgata aaacctttac cagcgatgtt 360
agcagctatc tggaaggcca ggccgccaaa gaattcattg catggctggt gcgtggccgc 420
ggttaa 426
<210> 26
<211> 136
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Met Ala Ile Val Asn Ala Thr Asp Gln Thr Phe Ala Ala Glu Thr Lys
1 5 10 15
Asp Gly Leu Thr Leu Val Asp Phe Trp Ala Pro Trp Ser Gly Pro Cys
20 25 30
Arg Met Ile Ala Pro Val Leu Glu Glu Leu Asp Arg Glu Met Gly Asp
35 40 45
Lys Val Lys Ile Val Lys Val Asn Val Asp Glu Asn Gln Glu Thr Ala
50 55 60
Ser Lys Phe Gly Val Met Ser Ile Pro Thr Leu Leu Val Phe Lys Asn
65 70 75 80
Gly Glu Leu Val Asp Lys Ala Val Gly Tyr Gln Pro Lys Glu Ala Leu
85 90 95
Val Gln Leu Val Gly Lys His Val Asp Asp Asp Asp Lys Thr Phe Thr
100 105 110
Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile
115 120 125
Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
130 135
<210> 27
<211> 411
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
atggcaattg tgaatgccac cgatcagacc tttgccgcag aaaccaaaga tggcctgacc 60
ctggtggatt tttgggcccc gtggagcggt ccgtgccgca tgattgcacc ggttctggaa 120
gaactggatc gtgaaatggg cgataaagtg aaaattgtta aagtgaatgt ggacgaaaac 180
caggaaaccg ccagcaaatt tggtgtgatg agtattccga ccctgctggt ttttaaaaat 240
ggcgaactgg ttgataaagc agttggttat cagccgaaag aagcactggt tcagctggtt 300
ggtaaacatg tggatgatga tgataaaacc tttaccagcg atgttagcag ctatctggaa 360
ggccaggccg ccaaagaatt cattgcatgg ctggtgcgtg gccgcggtta a 411

Claims (13)

1.一种用于生产重组融合蛋白的辅助蛋白，其特征在于：为氨基酸序列如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的蛋白；
所述辅助蛋白为人工修饰或包含C29S突变的硫氧还蛋白。
2.一种权利要求1所述的辅助蛋白的编码基因，其特征在于：为核苷酸序列如SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示的基因。
3.一种包含权利要求1所述的辅助蛋白的重组融合蛋白，其特征在于：所述重组融合蛋白包括从N端到C端依次连接的辅助蛋白—连接肽—目的多肽，所述辅助蛋白为权利要求1所述的辅助蛋白，所述目的多肽的等电点范围为3-9和/或氨基酸个数为20-80个，所述连接肽为蛋白酶切割位点或化学物质切割位点。
4.根据权利要求3所述的重组融合蛋白，其特征在于：所述目的多肽包括促生长激素神经肽、血管紧张素I、血管紧张素II、胰高血糖素、胰高血糖素-1类似物、胰高血糖素样肽-2、生长激素、促胰液素以及前述物质的衍生物。
5.根据权利要求4所述的重组融合蛋白，其特征在于：所述蛋白酶包括凝血酶、烟草蚀纹病毒蛋白酶、3C蛋白酶、肠激酶、胰蛋白酶和赖氨酰肽链内切酶，所述化学物质包括溴化氰、羟胺和甲酸。
6.根据权利要求3-5任意一项所述的重组融合蛋白，其特征在于：所述连接肽包含六个组氨酸组成的组氨酸标签序列，所述组氨酸标签序列位于所述连接肽的氨基酸序列的N端或C端。
7.根据权利要求3-5任意一项所述的重组融合蛋白，其特征在于：所述重组融合蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.11所示的蛋白。
8.根据权利要求3-5任意一项所述的重组融合蛋白，其特征在于：所述重组融合蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24或SEQ ID NO.26所示的蛋白。
9.一种权利要求7所述的重组融合蛋白的编码基因，其特征在于：为核苷酸序列如SEQID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12所示的基因。
10.一种权利要求8所述的重组融合蛋白的编码基因，其特征在于：为核苷酸序列如SEQID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25或SEQ ID NO.27所示的基因。
11.一种重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体由载体和权利要求9或10所述的编码基因重组而成，所述载体包括pET系列载体。
12.一种权利要求3-8任意一项所述的重组融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)根据氨基酸序列合成重组融合蛋白的编码基因；
(2)将所述重组融合蛋白的编码基因插入载体，得到重组表达载体；
(3)将所述重组表达载体转化入宿主菌，得到重组工程菌；
(4)培养所述重组工程菌，加入诱导剂诱导重组融合蛋白表达，得到含有所述重组融合蛋白的菌体；
(5)将步骤(4)中含有所述重组融合蛋白的菌体与缓冲液混合，获得菌悬液；
(6)将菌悬液加热破壁，加热温度为60℃-100℃，加热完成后离心取上清，即得重组融合蛋白，所述重组融合蛋白稳定存在于上清。
13.根据权利要求12所述的重组融合蛋白的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述诱导剂为IPTG诱导剂。
CN201910434917.5A 2018-07-31 2019-05-23 用于生产重组融合蛋白的辅助蛋白、编码基因、重组融合蛋白、重组表达载体及制备方法 Active CN110128521B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2018108585098 2018-07-31
CN201810858509.8A CN108912221A (zh) 2018-07-31 2018-07-31 用于生产重组融合蛋白的辅助蛋白、编码基因、重组融合蛋白、重组表达载体及制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110128521A CN110128521A (zh) 2019-08-16
CN110128521B true CN110128521B (zh) 2021-06-22

Family

ID=64393397

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810858509.8A Pending CN108912221A (zh) 2018-07-31 2018-07-31 用于生产重组融合蛋白的辅助蛋白、编码基因、重组融合蛋白、重组表达载体及制备方法
CN201910434917.5A Active CN110128521B (zh) 2018-07-31 2019-05-23 用于生产重组融合蛋白的辅助蛋白、编码基因、重组融合蛋白、重组表达载体及制备方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810858509.8A Pending CN108912221A (zh) 2018-07-31 2018-07-31 用于生产重组融合蛋白的辅助蛋白、编码基因、重组融合蛋白、重组表达载体及制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (2) CN108912221A (zh)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110257347B (zh) * 2019-06-25 2021-06-22 成都英普博集生物科技有限公司 硫氧还蛋白突变体、其制备方法及其在重组融合蛋白生产中的应用
CN110564797B (zh) * 2019-08-14 2022-02-18 成都英普博集生物科技有限公司 一种利用热稳定融合蛋白制备多肽的方法
CN111394323B (zh) * 2020-04-16 2021-11-23 深圳易致生物科技有限公司 一种重组RecA*蛋白及其表达方法和应用
CN114381471A (zh) * 2020-10-19 2022-04-22 丽珠集团新北江制药股份有限公司 一种辅助蛋白在重组蛋白生产中的应用及融合表达系统
CN112946041B (zh) * 2021-02-06 2022-07-22 自然资源部第一海洋研究所 一种基于融合蛋白传感器的重金属离子检测方法
CN113121705B (zh) * 2021-04-19 2023-03-24 成都英普博集生物科技有限公司 用于制备短肽混合物的融合蛋白、目的多肽、短肽混合物的制备方法及应用
CN113817709B (zh) * 2021-08-12 2023-08-04 中国科学院天津工业生物技术研究所 碳水化合物结合结构域cbm68及其应用
CN114457099B (zh) * 2021-12-18 2023-12-15 江苏阿尔法药业股份有限公司 一种索马鲁肽核心肽链的生物发酵制备方法
CN115975047B (zh) * 2022-10-24 2024-05-28 扬州奥锐特药业有限公司 一种重组融合蛋白生产多肽的方法及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5270181A (en) * 1991-02-06 1993-12-14 Genetics Institute, Inc. Peptide and protein fusions to thioredoxin and thioredoxin-like molecules
CN102348800A (zh) * 2009-01-13 2012-02-08 科英布拉农业大学 融合蛋白、其制备方法及其在重组蛋白表达系统中的应用
CN104356240A (zh) * 2014-11-03 2015-02-18 中国科学院微生物研究所 一种重组融合蛋白TAT-p53及其编码基因与应用
CN106350527A (zh) * 2016-11-03 2017-01-25 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 一种可在大肠杆菌可溶性高表达的白喉毒素突变体

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5270181A (en) * 1991-02-06 1993-12-14 Genetics Institute, Inc. Peptide and protein fusions to thioredoxin and thioredoxin-like molecules
CN102348800A (zh) * 2009-01-13 2012-02-08 科英布拉农业大学 融合蛋白、其制备方法及其在重组蛋白表达系统中的应用
CN104356240A (zh) * 2014-11-03 2015-02-18 中国科学院微生物研究所 一种重组融合蛋白TAT-p53及其编码基因与应用
CN106350527A (zh) * 2016-11-03 2017-01-25 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 一种可在大肠杆菌可溶性高表达的白喉毒素突变体

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
《PAP-a/CD81-LEL 融合蛋白表达载体的构建》;潘延凤等;《中国现代医学杂志》;20051030;第15卷(第19期);第2909-2911页 *
《嗜酸氧化亚铁硫杆菌硫氧还蛋白系统的表达纯化及定点突变》;王亿平;《中国优秀硕士学位论文全文数据库基础科学辑》;20100515;摘要以及第22页第一段 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110128521A (zh) 2019-08-16
CN108912221A (zh) 2018-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110128521B (zh) 用于生产重组融合蛋白的辅助蛋白、编码基因、重组融合蛋白、重组表达载体及制备方法
JP4680237B2 (ja) 穀類の非貯蔵タンパクを融合キャリアとして使用する胚乳におけるポリペプチド発現方法及びその使用
CN107245494A (zh) Aβ42在大肠杆菌中的高效可溶性表达及纯化方法
RU2007124369A (ru) Производство белков
CN112424366A (zh) 用于生产用于诊断非洲猪瘟的抗原的重组载体及其用途
CN112661856A (zh) 一种elp类胶原蛋白的纯化方法及应用
US20160168226A1 (en) Process for production of insulin and insulin analogues
Tong et al. Extracellular expression, purification, and characterization of a winter flounder antifreeze polypeptide from Escherichia coli
CN110835366B (zh) 促进蛋白质可溶性表达的标签多肽及其用途
CN108998458B (zh) 重组人胰岛素的制备方法
WO2020258372A1 (zh) 硫氧还蛋白突变体、其制备方法及其在重组融合蛋白生产中的应用
CN104195157A (zh) 生物活性肽在原核细胞中的高效率重组表达和纯化方法
KR20100086717A (ko) 대장균에서 외래단백질을 분비 생산하는 방법
CN112500495A (zh) 一种elp-ⅲ型胶原蛋白的纯化方法及应用
JP5865002B2 (ja) 組換えプラスミドベクターおよびそれを用いたタンパク質の製造方法
CN113801239B (zh) 多肽标签、高度可溶性的重组腈水解酶及其在医药化学品合成中的应用
CN104163865A (zh) 优化的重组人骨形态发生蛋白质-2的dna序列及其编码蛋白质
CN113025599A (zh) 一种重组溶组织梭菌i型胶原酶及其制备方法和应用
CN114292321B (zh) 可溶性表达eg95蛋白及其制备方法和应用
CN109371047A (zh) 一种利用蛋白IHF-α构建和表达耐热性抗菌肽融合蛋白的方法
CN109295041A (zh) 具有舍雷肽酶活性的多肽及其制备方法
CN111233995B (zh) 一种来自猫的新过敏原npc2
CN114807101B (zh) 包含牛肠激酶轻链蛋白的融合蛋白及其表达载体和重组工程菌
CN108949796A (zh) 一种用于合成谷胱甘肽的重组菌及谷胱甘肽的合成方法
CN114621352B (zh) 硅融合蛋白及制备和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant