CN111394323B - 一种重组RecA*蛋白及其表达方法和应用 - Google Patents

一种重组RecA*蛋白及其表达方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111394323B
CN111394323B CN202010302411.1A CN202010302411A CN111394323B CN 111394323 B CN111394323 B CN 111394323B CN 202010302411 A CN202010302411 A CN 202010302411A CN 111394323 B CN111394323 B CN 111394323B
Authority
CN
China
Prior art keywords
recombinant
protein
reca protein
reca
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010302411.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111394323A (zh
Inventor
李腾
宋又强
吴永辉
李达
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Yizhi Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Shenzhen Yizhi Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Yizhi Biotechnology Co ltd filed Critical Shenzhen Yizhi Biotechnology Co ltd
Priority to CN202010302411.1A priority Critical patent/CN111394323B/zh
Publication of CN111394323A publication Critical patent/CN111394323A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111394323B publication Critical patent/CN111394323B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种重组RecA*蛋白，其是通过对绿脓杆菌RecA氨基酸序列中的第62位、69位、73位以及85位的氨基进行修饰后获得的多肽，命名为重组RecA*蛋白，该重组RecA*蛋白的多肽具有为SEQ ID NO.1的氨基序列。本发明所述的重组RecA*蛋白相对于天然RecA蛋白，催化ATP水解效率更强，与DNA结合能力增更强，能形成更稳定的蛋白‑DNA复合物；所述的重组RecA蛋白应用于RAA扩增检测试剂盒中，能够大大提高了RAA扩增反应效率。

Description

一种重组RecA*蛋白及其表达方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种重组RecA*蛋白序列及其表达方法和应用
背景技术
体外核酸快速扩增技术是一种可使微量核酸在体外高效快速扩增的技术，自问世以来，被广泛应用于分子生物学、医学和法理鉴定等领域，并被不断改进，以使其功能和适应性更为广泛。重组酶介导扩增法是在现有体外核酸扩增原理的基础上发展起来的恒温体外快速扩增核酸技术。
重组酶核酸等温扩增法(RAA)利用重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶代替了传统PCR的热循环解链过程，实现了在37℃恒温下的核酸快速扩增，无需特殊的辅助仪器，对操作人员的要求也不高，具备简单、节能、便携、快速等特点，有望在不远的将来取代传统的热循环PCR反应.重组酶核酸等温扩增反应在现场快速检测(POCT)环景中有巨大的应用潜力。RecA重组酶是E.coli中负责同源重组交换的重要功能蛋白。RecA与DNA形成复合功能体，与dsDNA中的同源序列形成配对，然后形成D-环，打开双链结构。在聚合酶存在的情况下，可以利用重组酶该特性快速扩增反应。但是在体外环境中RecA与DNA结合能力较弱，直接限制了扩增效率。阻碍了重组核酸等温扩增技术在环境监测、食品安全以及临床诊断等领域的病原微生物现场快速检测。如何通过提高RecA重组酶与DNA结合效率是直接决定RAA扩增效率的关键因素。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种重组RecA*蛋白，通过修改绿脓杆菌RecA蛋白酶的特定氨基酸序列，使其与DNA结合能力增强并且催化水解ATP能力提高，从而大大提高了RAA扩增反应效率。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案内容具体如下：
一种重组RecA*蛋白，其是通过对绿脓杆菌RecA氨基酸序列(SEQ ID NO.2)中的第62位、69位、73位以及85位的氨基进行修饰后获得的多肽，命名为重组RecA*蛋白，该重组RecA*蛋白的多肽具有为SEQ ID NO.1的氨基序列。
作为进一步优选的方案，本发明所述的重组RecA*蛋白，其特征在于，所述重组RecA*蛋白的多肽编码核苷酸序列为SEQ ID NO.3。
本发明还提供了一种重组载体，包括原始载体和本发明所述的重组RecA*蛋白的核苷酸序列。
本发明还提供了一种的重组RecA*蛋白的表达方法，包括：
编码核苷酸序列步骤：编码重组RecA*蛋白的多肽的核苷酸序列SEQ ID NO.3；
构建重组载体的步骤：将上述核苷酸序列SEQ ID NO.3与原始载体进行重组，获得重组载体；
表达步骤：将上述重组载体转入表达系统中进行表达，筛选成功转入的菌株，经过破碎、离心、纯化处理后得到目的蛋白。
本发明还提供了一种蛋白-DNA复合物，其是由本发明所述的重重组RecA*蛋白与DNA结合后形成的大分子复合物。
本发明还提供了一种RecA*蛋白在恒定温度下特异性扩增DNA的方法，包括将重组RecA*蛋白，单链结合蛋白SSB，聚合酶Bst，DNA模版，dNTP，正向引物和反向引物在扩增反应体系中孵育，用苯酚氯仿提取反应，用乙醇沉淀。
作为进一步优选的方案，本发明所采用的扩增反应体系Tris-HCl50mM、KCl 60mM、二硫苏糖醇2mM、甜菜碱1M、海藻糖5.5％、PEG 5.5％、BSA 0.1mg/mL；所述反应酶系包含dNTPs 200μM、聚合酶Bst 50U、单链重组RecA*蛋白262ng/μl、E.coli RecA蛋白360ng/μl；上游引物和下游引物浓度均为200nM；浓度为5mM的氯化镁。
一种核酸扩增试剂盒，包括本发明所述的重组RecA*蛋白。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1.本发明所述的重组RecA*蛋白相对于RecA蛋白，催化水解DNA效率增加，与DNA结合能力增更强，能形成更稳定的蛋白-DNA复合物。
2.本发明所述的重组RecA*蛋白应用于RAA扩增检测试剂盒中，能够大大提高了RAA扩增反应效率。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举较佳实施例，并配合附图，详细说明如下。
附图说明
图1为RecA蛋白与重组RecA*蛋白进行重组等温扩增反应电泳结果对比图，其中，A：DNA marker、B：RecA进行重组等温扩增反应、C：RecA*进行重组等温扩增反应。
图2为RecA蛋白与重组RecA*蛋白分别与DNA结合后的电泳结果图，其中A：DNAmarker、B：500ng DNA、C：5ug RecA与DNA、D：5ug RecA*与DNA。
图3为RecA*与RecA水解ATP效率对比曲线图；
图4为RecA*与RecA结合DNA效率对比曲线图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明的具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如下：
一种重组RecA*蛋白，其是通过对绿脓杆菌RecA氨基酸序列(SEQ ID NO.2)中的第62位、69位、73位以及85位的氨基进行修饰后获得的多肽，命名为重组RecA*蛋白，该重组RecA*蛋白的多肽具有为SEQ ID NO.1的氨基序列。
作为进一步优选的方案，本发明所述的重组RecA*蛋白，其特征在于，所述重组RecA*蛋白的多肽编码核苷酸序列为SEQ ID NO.3。SEQ ID NO.3序列如下：
Figure BDA0002452872130000041
Figure BDA0002452872130000042
本发明还提供了一种重组载体，包括原始载体和本发明所述的重组RecA*蛋白的DNA片段，其根据氨基酸密码子对照表，DNA序列可以翻译成RecA*的序列(SEQ ID NO.1)，其中一种优选DNA序列为SEQ ID NO.3。所述原始载体可以为pET-28a载体、pBR322载体、pSC101载体中的一种，所述原始载体中可以包含一种或多种抗性基因，所述抗性基因具体可以选自但不限于抗青霉素基因、抗卡那霉素基因等。所述原始载体还可以包含一种或多种纯化标签，例如可以是6*His标签、10*His标签、GST标签等。
本发明还提供了一种的重组RecA*蛋白的表达方法，包括：
编码核苷酸序列步骤：编码重组RecA*蛋白的多肽的核苷酸序列SEQ ID NO.3；
构建重组载体的步骤：将上述核苷酸序列SEQ ID NO.3与原始载体进行重组，获得重组载体；
表达步骤：将上述重组载体转入表达系统中进行表达，筛选成功转入的菌株，经过破碎、离心、纯化处理后得到目的蛋白。
本发明所述的表达系统可以为大肠杆菌表达系统，酵母表达系统，哺乳动物表达系统或昆虫表达系统。作为一种优选，选用大肠杆菌pET表达系统，进一步作为优选大肠杆菌BL21(DE3)表达系统。将上述含有RecA*DNA序列(SEQ ID NO.5)的重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3)表达系统。利用抗性琼脂平板筛选成功转入RecA*载体的重组大肠杆菌，挑选单克隆菌株，扩大培养，离心收集培养液和大肠杆菌，破碎大肠杆菌，例如用超声方法或者酶消化方法，离心收集上清与大肠杆菌菌沉淀，纯化培养液，上清和大肠杆菌沉淀得到目的蛋白；纯化方法可以是亲和层析法，分子筛法等。
本发明还提供了一种蛋白-DNA复合物，其是由本发明所述的重组RecA*蛋白与DNA结合后形成的大分子复合物。
本发明还提供了一种RecA*蛋白在恒定温度下特异性扩增DNA的方法，包括将重组RecA*蛋白，单链结合蛋白SSB，聚合酶Bst，DNA模版，dNTP，正向引物和反向引物在扩增反应体系中孵育，用苯酚氯仿提取反应产物，用乙醇沉淀。
作为进一步优选的方案，本发明所采用的扩增反应体系Tris-HCl 50mM、KCl60mM、二硫苏糖醇2mM、甜菜碱1M、海藻糖5.5％、PEG 5.5％、BSA 0.1mg/mL；所述反应酶系包含dNTPs 200μM、聚合酶Bsu 50U、单链重组RecA*蛋白262ng/μl、E.coli RecA蛋白360ng/μl；上游引物和下游引物浓度均为200nM；浓度为5mM的氯化镁。
一种核酸扩增试剂盒，包括本发明所述的重组RecA蛋白。
实施例1
用重组RecA*蛋白进行重组反应，反应条件如下：
Tris-HCl(pH8.3)50mM、KCl 60mM、二硫苏糖醇2mM、甜菜碱1M、海藻糖5.5％、PEG5.5％、BSA 0.1mg/mL；所述反应酶系包含dNTPs 200μM、聚合酶Bsu 50U、单链RecA*蛋白262ng/μL、E.coli RecA蛋白360ng/μL；DNA底物(奇异变形杆菌)50ng，上游引物(FP)下游引物(RP)浓度均为200nM；氯化镁，浓度5mM。
上游引物(SEQ ID NO.4)：TATTCCTAAATATAGTCAAGTTTCTTGTGATGT
下游引物(SEQ ID NO.5)：ATTAAAACGAAAAATATTAAGAATATCGACCCC。
在37℃继续孵育30分钟，用苯酚氯仿提取反应，用乙醇沉淀。然后3％琼脂糖凝胶上观察扩增结果并对扩增产物进行测序。测序的产物序列为SEQ ID
Figure BDA0002452872130000061
对比实施例1
用RecA蛋白和重组RecA*蛋白分别同时进行重组反应，反应条件如下：Tris-HCl(pH8.3)50mM、KCl 60mM、二硫苏糖醇2mM、甜菜碱1M、海藻糖5.5％、PEG 5.5％、BSA 0.1mg/mL；所述反应酶系包含dNTPs 200μM、聚合酶Bsu 50U、单链结合蛋白262ng/μl、RecA蛋白/重组RecA*蛋白360ng/μl；上游引物(FP)下游引物(RP)浓度均为200nM；氯化镁，浓度5mM。反应体系50微升。在37℃孵育30分钟。取10微升反应样品，加入2ul 6x上样缓冲液(0.25％溴酚蓝，36％蔗糖和30mM EDTA)。3％琼脂糖凝胶上观察扩增结果。
上游引物(SEQ ID NO.4)：TATTCCTAAATATAGTCAAGTTTCTTGTGATGT
下游引物(SEQ ID NO.5)：ATTAAAACGAAAAATATTAAGAATAT CGACCCC。扩增结果参见图1。图1的结果表明：利用RecA重组酶与修饰后重组RecA*蛋白组酶，分别同时进行重组等温扩增，RecA*组扩增得到目的大小条带，扩增效率显著增强。
实施例2
利用重组RecA*蛋白进行重组反应，反应条件如下：Tris-HCl(pH8.3)50mM、KCl60mM、二硫苏糖醇2mM、甜菜碱1M、海藻糖5.5％、PEG 5.5％、BSA 0.1mg/mL；所述反应酶系包含dNTPs 200μM、聚合酶Bsu 50U、单链结合蛋白262ng/μl、E.coli RecA蛋白360ng/μl；上游引物(FP)下游引物(RP)浓度均为200nM；氯化镁，浓度5mM。在37℃继续孵育30分钟，用苯酚氯仿提取反应，用乙醇沉淀。4％琼脂糖凝胶上观察扩增结果。
上游引物(SEQ ID NO.6)：ATTTCATAACCCCCTGTTTATTGTGTTAATGG
下游引物(SEQ ID NO.7)：ATTTTGTTAAACTCAAACGTGATAATGAGAAT
对比例2
将纯化后的RecA蛋白按照上述实施例2的步骤进行重组扩增反应。电泳结果参见图2。
图2中A：DNA marker；B：500ng DNA；C：5ug RecA与DNA；D：5ug RecA*与DNA；由于DNA带负电，在电场的作用下做迁移运动。蛋白结合DNA后形成蛋白-DNA大分子复合物，迁移速率降低。通过DNA电泳实验，与天然的RecA蛋白相比，突变修饰后的RecA*与DNA结合能力更强，形成更稳定的蛋白-DNA复合物，迁移速率明显降低。
效果检测
1.RecA*与RecA水解ATP效率对比
检测原理：ATPase水解ATP释放ADP和游离磷酸根离子。通过反应，游离的磷酸根离子生成稳定的显色基团，在650nm测量其吸光值。
采用ATPase酶活检测试剂盒(品牌：Abcam，货号：ab234055)测量RecA与RecA*催化ATP水解效率。根据说明书要求，配置测试样本(RecA(2.5uM)，RecA*(2.5uM))，ATPase阳性对照，磷酸盐标准品(0，1，2，3，4and 5nmol/孔)加入到96微孔板中。向测试样品孔和阳性对照孔中加入反应底物(100ul)。然后所有孔，包括磷酸盐标准品，ATPase阳性对照，测试样品，添加30μL显色剂。在25℃下孵育，并在650nm下每5分钟测量一次吸光值。根据磷酸盐标准品与对应吸光值(30分钟)制作标准曲线，计算不同时间点下，RecA与RecA*产生磷酸盐的量，然后计算水解ATP的量，并绘制得到RecA*与RecA水解ATP效率曲线(参见图3)。
图3的结果表明：RecA*水解ATP效率明显高于与RecA的水解ATP效率。
2.RecA*与RecA结合DNA效率对比
用恒定量的DNA孵育浓度越来越高的RecA或RecA*，并使其通过碱处理的硝化纤维素和DEAE过滤器。与蛋白结合的DNA被拦截在膜上。未与蛋白结合的DNA流过膜。通过检测穿过膜的液体中DNA的含量，用总量减去剩余DNA的量，得到与蛋白结合DNA量。结合的百分比代表与总DNA相比与蛋白结合的DNA的量。绘制曲线图(参见图4)。
图4的结果表明RecA*与DNA的结合效率明显高于与RecA与DNA的结合效率。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
序列表
<110> 深圳易致生物科技有限公司
<120> 一种重组RecA*蛋白及其表达方法和应用
<130> 深圳易致生物科技有限公司
<141> 2020-04-09
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 186
<212> PRT
<213> artificial
<400> 1
Glu Arg Gln Phe Gly Lys Gly Ala Val Met Arg Met Gly Asp His Glu
1 5 10 15
Arg Gln Ala Ile Pro Ala Ile Ser Thr Gly Ser Leu Gly Leu Asp Ile
20 25 30
Ala Leu Gly Ile Gly Gly Leu Pro Lys Gly Arg Ile Val Glu Ile Tyr
35 40 45
Gly Pro Glu Ser Ser Gly Lys Thr Thr Leu Thr Leu Ser Leu Ile Ala
50 55 60
Glu Ala Gln Lys Gly Gly Ala Thr Gly Ala Phe Val Asp Ala Glu His
65 70 75 80
Ala Leu Asp Pro Leu Tyr Ala Gly Lys Leu Gly Val Asn Val Asp Asp
85 90 95
Leu Leu Val Ser Gln Pro Asp Thr Gly Glu Gln Ala Leu Glu Ile Thr
100 105 110
Asp Met Leu Val Arg Ser Asn Ala Val Asp Val Ile Ile Val Asp Ser
115 120 125
Val Ala Ala Leu Val Pro Lys Ala Glu Ile Glu Gly Glu Met Gly Asp
130 135 140
Ala His Val Gly Leu Gln Ala Arg Leu Met Ser Gln Ala Leu Arg Lys
145 150 155 160
Ile Thr Gly Asn Ile Lys Asn Ala Asn Cys Leu Val Ile Phe Ile Asn
165 170 175
Gln Ile Arg Met Lys Ile Gly Val Met Phe
180 185
<210> 2
<211> 186
<212> PRT
<213> artificial
<400> 2
Glu Arg Gln Phe Gly Lys Gly Ala Val Met Arg Met Gly Asp His Glu
1 5 10 15
Arg Gln Ala Ile Pro Ala Ile Ser Thr Gly Ser Leu Gly Leu Asp Ile
20 25 30
Ala Leu Gly Ile Gly Gly Leu Pro Lys Gly Arg Ile Val Glu Ile Tyr
35 40 45
Gly Pro Glu Ser Ser Gly Lys Thr Thr Leu Thr Leu Ser Val Ile Ala
50 55 60
Glu Ala Gln Lys Gln Gly Ala Thr Cys Ala Phe Val Asp Ala Glu His
65 70 75 80
Ala Leu Asp Pro Asp Tyr Ala Gly Lys Leu Gly Val Asn Val Asp Asp
85 90 95
Leu Leu Val Ser Gln Pro Asp Thr Gly Glu Gln Ala Leu Glu Ile Thr
100 105 110
Asp Met Leu Val Arg Ser Asn Ala Val Asp Val Ile Ile Val Asp Ser
115 120 125
Val Ala Ala Leu Val Pro Lys Ala Glu Ile Glu Gly Glu Met Gly Asp
130 135 140
Ala His Val Gly Leu Gln Ala Arg Leu Met Ser Gln Ala Leu Arg Lys
145 150 155 160
Ile Thr Gly Asn Ile Lys Asn Ala Asn Cys Leu Val Ile Phe Ile Asn
165 170 175
Gln Ile Arg Met Lys Ile Gly Val Met Phe
180 185
<210> 3
<211> 558
<212> DNA
<213> artificial
<400> 3
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> artificial
<400> 4
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> artificial
<400> 5
<210> 6
<211> 360
<212> DNA
<213> artificial
<400> 6
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> artificial
<400> 7
<210> 8
<211> 32
<212> DNA
<213> artificial
<400> 8

Claims (7)

1.一种重组RecA*蛋白，其特征在于，其是通过对绿脓杆菌RecA氨基酸序列中的第62位、69位、73位以及85位的氨基进行修饰后获得的多肽，命名为重组RecA*蛋白，该重组RecA*蛋白的多肽氨基序列为SEQ ID NO.1。
2.根据权利要求1所述的重组RecA*蛋白，其特征在于，所述重组RecA*蛋白的多肽编码核苷酸序列为SEQ ID NO.3。
3.一种重组载体，其特征在于，包括原始载体和权利要求1所述的重组RecA*蛋白的多肽，所述原始载体为pET-28a载体、pBR322载体、pSC101载体中的一种。
4.一种蛋白-DNA复合物，其特征在于，其是由权利要求1所述的重组RecA*蛋白与DNA结合后形成的大分子复合物。
5.一种如权利要求1所述的重组RecA*蛋白的表达方法，其特征在于，包括：
编码核苷酸序列：编码重组RecA*蛋白的多肽的核苷酸序列SEQ ID NO.3；
构建重组载体的步骤：将上述核苷酸序列SEQ ID NO.3与原始载体进行重组，获得重组载体；
表达步骤：将上述重组载体转入表达系统中进行表达，筛选成功转入的菌株，经过破碎、离心、纯化处理后得到目的蛋白。
6.一种利用RecA*蛋白在恒定温度下特异性扩增DNA的方法，其特征在于，将重组RecA*蛋白、单链结合蛋白SSB、聚合酶Bsu、DNA模版、dNTP、正向引物和反向引物在扩增反应体系中孵育，用苯酚氯仿提取反应产物，用乙醇沉；所述扩增反应体系为Tris-HCl 50mM、KCl60mM、二硫苏糖醇 2mM、甜菜碱 1M、海藻糖 5.5%、PEG 5.5%、BSA 0.1mg/mL、dNTPs 200μM、聚合酶Bsu 50U、单链结合蛋白262ng/μl、重组RecA*蛋白360ng/μl；上游引物和下游引物浓度均为200nM；浓度为5mM的氯化镁。
7.一种核酸扩增试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的重组RecA*蛋白。
CN202010302411.1A 2020-04-16 2020-04-16 一种重组RecA*蛋白及其表达方法和应用 Active CN111394323B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010302411.1A CN111394323B (zh) 2020-04-16 2020-04-16 一种重组RecA*蛋白及其表达方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010302411.1A CN111394323B (zh) 2020-04-16 2020-04-16 一种重组RecA*蛋白及其表达方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111394323A CN111394323A (zh) 2020-07-10
CN111394323B true CN111394323B (zh) 2021-11-23

Family

ID=71426497

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010302411.1A Active CN111394323B (zh) 2020-04-16 2020-04-16 一种重组RecA*蛋白及其表达方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111394323B (zh)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5051423B2 (ja) * 2006-07-26 2012-10-17 アイシン精機株式会社 改変型の耐熱性ＲｅｃＡタンパク質、及び該タンパク質を用いた核酸増幅方法
JP6387722B2 (ja) * 2014-07-24 2018-09-12 アイシン精機株式会社 改変型の耐熱性ＲｅｃＡタンパク質、該タンパク質をコードする核酸分子、該タンパク質を用いた核酸の増幅方法、及び核酸増幅用キット
CN108912221A (zh) * 2018-07-31 2018-11-30 成都英普博集生物科技有限公司 用于生产重组融合蛋白的辅助蛋白、编码基因、重组融合蛋白、重组表达载体及制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN111394323A (zh) 2020-07-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111020045B (zh) 蜡样芽孢杆菌的核酸快速恒温检测方法及应用
KR20190059966A (ko) Ｓ. 피오게네스 ｃａｓ９ 돌연변이 유전자 및 이에 의해 암호화되는 폴리펩티드
CN113583996B (zh) Bst DNA聚合酶重组突变体、其编码DNA及超快磁珠LAMP检测方法
WO2020199342A1 (zh) 常温核酸扩增反应
JP2022174242A (ja) 標的核酸の検出方法
CN112899253B (zh) 具有dna聚合酶活性的多肽、重组载体及其制备方法与应用
CN115029333B (zh) 一种核酸内切酶及其纯化方法和应用
CN111394323B (zh) 一种重组RecA*蛋白及其表达方法和应用
JP4355830B2 (ja) 新規ｄｎａ複製因子
CN113025586B (zh) 一种经改造的萤光素酶突变体蛋白、生物发光探针、探针组、制备方法和检测方法
CN114645033B (zh) 一种三磷酸核苷水解酶及其纯化方法和应用
CN116287125A (zh) 一种基于VPCR-Cas13a的CRP2C19基因多态性检测方法
CN110564744B (zh) Dna聚合酶及其制备方法、表达基因、表达载体、宿主细胞及试剂盒
CN114875002A (zh) 一种精氨酸突变的dna/rna连接酶
US8137943B2 (en) Heat-resistant DNA ligase with high reactivity
CN115044571B (zh) 极端嗜热古菌重组HhH-GPD蛋白及其制备方法和应用
CN116926170A (zh) 基于硫修饰核酸及硫修饰核酸识别蛋白的核酸检测方法
CN115011578B (zh) 一种强化型m-mlv逆转录酶突变体及其应用
CN112010948B (zh) 一种应用于对苯二酚废水低温降解的突变蛋白及构建方法
WO2022210748A1 (ja) 新規なガイドｒｎａとの複合体形成能を有するポリペプチド
Hu et al. Improvement of duplex-specific nuclease salt tolerance by fusing DNA-binding domain of DNase from an extremely halotolerant bacterium Thioalkalivibrio sp. K90mix
JP4019171B2 (ja) 誤対合修復系を利用したｄｎａの解析方法および操作方法
CN116574710A (zh) 具有链置换功能的dna聚合酶及其应用
CN117625751A (zh) 基于CRISPR/Cas12a的一体化、无PAM依赖的核酸检测方法
CN112725300A (zh) 一种DNA聚合酶γ及其编码基因、制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant