CN102348800A - 融合蛋白、其制备方法及其在重组蛋白表达系统中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及融合蛋白，其包括对应于肝片形吸虫(Fasciola hepatica)成虫排泄的-分泌的H片段或钙结合蛋白，即蛋白Fh8和Fh22的氨基酸序列，其后是对应于不相关的蛋白片段或蛋白的氨基酸序列，及其制备方法和它们在重组蛋白表达系统中的应用。
Description
【技术领域】
本发明涉及融合蛋白、其制备方法和它们在重组蛋白表达系统中的应用。
【背景技术】
富含特异性蛋白的提取物的制备容易从产生它们的生物罕有发生。由此，产生重组蛋白常是以需要的量产生及产生有必需的活性水平的那些蛋白的仅有可能的方式。
重组蛋白的表达是在研究和开发水平以及工业水平最相关和最可应用的方法之一。在良好限定的模型中使用细菌、真菌或真核细胞表达外源蛋白的可能性、构成在生物技术加工领域有巨大潜力和关联性的工具，使得产生大量目的蛋白。
大肠埃希氏菌(E.coli)已经是世界上最广泛使用的用于不要求翻译后修饰(例如糖基化)而呈现活性的蛋白的系统。由于细菌的简单、快速和成本有效生长的能力、既有的生理知识和遗传表征、以及先进的遗传工具(其中有大量种有适当的突变的质粒、融合重组偶体和株)的可利用性，在大肠埃希氏菌(E.coli)中表达重组蛋白是异源生产的最有吸引力的方法之一。基于此模型提供的优势，在大肠埃希氏菌(E.coli)中重组蛋白的表达成为最广泛使用的在实验室和工业水平产生蛋白的方法之一。
已描述并商业上使用几种表达具有为了分离和生产稳定目的添加的序列的融合蛋白的载体。最广泛报道的包括用所谓的″组氨酸-标签″生产蛋白，其特征在于添加具有多个组氨酸的序列，与谷胱甘肽S-转移酶、麦芽糖结合蛋白(MBP)、RNA结合蛋白的融合蛋白(文献US2004033564)，或与泛素的融合蛋白(文献WO9701627)的产生。
使用这些表达系统的主要困难之一是蛋白以包含体形式产生，常见的导致非常低产率的条件，和难以操作的沉淀的形成。当使用不稳定片段时，此发生尤其常见。
本发明的目标基于允许显著增加重组蛋白的产生和使得它们的分离更容易的方法的开发、基于蛋白序列或钙结合蛋白的融合。
本发明是重组抗原产生领域的现有技术系统的替代方案，描述为可在研究水平和商业应用中具有显著的影响的简单、高产率和通用的方法。
【发明概述】
本发明涉及融合蛋白，其在它们的结构中包括：(1)肝片形吸虫(Fasciola hepatica)成虫排泄的/分泌的钙结合蛋白的部分或全氨基酸序列；及目的不相关的蛋白或蛋白片段。
本发明也旨在提供制备这些融合蛋白的方法，其允许非常显著的表达增加和融合蛋白及结果添加的片段或蛋白的增溶。
将蠕虫肝片形吸虫(Fasciola hepatica)钙结合蛋白(SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4)或成虫排泄的/分泌的相同的蛋白(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3)的小片段(以下被称为H(蠕虫)片段)或优选有90～95％的同源性的类似序列添加到不相关的蛋白片段或蛋白允许这些多肽的产生水平和它们的增溶显著增加。
由此，本发明第一方面是融合蛋白，其包括具有肝片形吸虫(Fasciola hepatica)成虫排泄的-分泌的H片段或钙结合蛋白结构的氨基酸序列，其后是结构上类似于不相关的蛋白片段或蛋白的氨基酸序列。可在N或C-端位置将融合标签(H片段或钙结合蛋白)添加到不相关的蛋白。
本发明另一方面是表达载体，其特征在于包括编码所述融合蛋白的多核苷酸序列。
本发明再一方面是宿主细胞，其包括提及的表达载体。
本发明也是制备融合蛋白的方法，其特征在于，将之前提及的宿主细胞在适于所述融合蛋白表达的条件下培养，及分离所述融合蛋白。
本发明还是所述用于产生添加的蛋白或蛋白片段的融合蛋白在重组蛋白表达系统中应用。
本发明另一方面是肝片形吸虫(Fasciola hepatica)成虫排泄的-分泌的H片段或钙结合蛋白用于生产重组蛋白的用途。
这些融合蛋白的产生允许添加的片段或蛋白非常显著的表达增加和增溶，由此增强它们用于研究和开发、以及工业目的。
【附图说明】
【图1】被称为钙结合蛋白Fh8和Fh22的H片段的重组蛋白和蛋白片段的表征。A-多肽Fh8的推定的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)；称为Fh8的H片段的多肽的推定的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)；B-多肽Fh22的推定的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)；称为多肽Fh22的H片段的多肽的推定的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。
【图2】用于评估H片段或Fh8对蛋白产生的效应的亚克隆过程的示意图。
【图3】含CP12片段的构建体的产生结果。A-蛋白产生的图形化表示；B-考马斯蓝-染色的SDS-PAGE Tris-Tricine凝胶。M-预染的SDS-PAGE标准品标记物(Biorad)。(a)：F1、F2和F3-收集自Ni-NTA柱的CP12的级分1、2和3。(b)：F1、F2、F3和F4-收集自Ni-NTA柱的HCP12的级分1、2、3和4。(c)：F1、F2、F3、F4、F5、F6和F7-收集自Ni-NTA柱的Fh8CP12的级分1、2、3、4、5、6和7。箭标表示相应蛋白的条带。
【图4】含IL5片段的构建体的产生结果。A-蛋白产生的图形化表示；B-考马斯蓝-染色的SDS-PAGE Tris-Tricine凝胶。M-预染的SDS-PAGE标准品标记物(Biorad)。(a)：F1、F2和F3-收集自Ni-NTA柱的IL5的级分1、2和3。(b)：F1、F2、F3和F4-收集自Ni-NTA柱的HIL5的级分1、2、3和4。箭标表示相应蛋白的条带。
【图5】含TgOWP片段的构建体的产生结果。A-蛋白产生的图形化表示；B-考马斯蓝-染色的SDS-PAGE Tris-Tricine凝胶。M-预染的SDS-PAGE标准品标记物(Biorad)。(a)：F1、F2、F3和F4-收集自Ni-NTA柱的TgOWP的级分1、2、3和4。(b)：F1、F2、F3、F4和F5-收集自Ni-NTA柱的HTgOWP的级分1、2、3、4和5。箭标表示相应蛋白的条带。
【发明详述】
本发明涉及重组蛋白融合到肝片形吸虫(Fasciola hepatica)成虫排泄的-分泌的钙结合蛋白、即以Fh8或fasciolin表示的蛋白(Genbank数AF213970)，及通常被知为Fh22的钙结合蛋白家族之内的片段(被称为H片段(来自蠕虫的)-SEQ ID NO：2和/或SEQ IDNO：4)或全氨基酸序列，其包括EMBL号AJ003822；AJ003821描述的抗原。此策略允许增加融合到H片段或含H片段的蛋白的抗原的产生水平，而且也增加它们的增溶，由此增加既有的重组蛋白产生系统的效率。此系统允许防止包含体内的目的抗原的产生，由此使得它们容易分离。由于钙结合能力，钙结合抗原的生物化学特征允许通过碱性的层析技术(即离子交换柱)的融合蛋白的分离，由此产生倾向于作为回收融合抗原的基础的带电的元素。
提供的实施例涉及使用Fh8的H片段(SEQ ID NO：2)或蛋白Fh8(SEQ ID NO：1)的应用。实验结果显示，蛋白Fh22的H片段(SEQ ID NO：4)或蛋白Fh22(SEQ ID NO：3)具有类似作用。同样，本发明背景下开发的方法不限于实施例中显示的融合蛋白的产生，在不扭曲本发明的精神的情况下可延伸至任何多肽。
在大肠埃希氏菌(Escherichia coli)中将几种构建体亚克隆进表达载体pQE(Qiagen)、导致N-端序列表现为6组氨酸序列的重组蛋白的产生，所述产生在大肠埃希氏菌(E.coli)M15(pREP4)(Qiagen)中进行，由此允许它们通过用NiNTA琼脂糖柱(Qiagen)的亲和层析，基于生产商(Castro，2001，Silva等人，2004)提供的流程的分离。全部产生比较使用此系统进行，在以实现最有效的分离的变性条件下实现重组抗原的分离，以便比较不同构建体的产生水平。
对于产生和分离目的蛋白而言，可使用任何重组蛋白表达和分离系统。本发明涉及含H片段的构建体、或含H片段的抗原，以便使融合多肽增溶和增加它们的产生。可在其他蛋白产生系统、即真菌或真核系统中使用相同的方法。
本发明的原理之一的特征在于通过分子生物学技术将H片段尤其Fh8或Fh22的N-端片段序列(SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4)，添加到对应于待产生的多肽序列之前。此构建体可通过分子生物学技术使包含此序列来获得，即使用适当的限制酶，并在片段序列之前和之后添加那些限制性位点；或通过其他方法获得，例如将含目的序列(接头)的DNA片段添加到PCR产物；或通过其他可应用的方法获得。H片段的减少的幅度允许用于融合到目的多肽的各种策略的使用。
构建体的另一可能性是使用对应于Fh8或Fh22和待产生的多肽序列的多肽制备融合蛋白。插入Fh8或Fh22序列的过程可使用分子生物学技术实现，即使用限制酶，所述方法用于例示方法。
本发明应用于几种片段，即：
-CP12：CP12是小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)(属于顶复门(Apicomplexa)、隐孢子虫属(Cryptosporidium)的球虫原生动物)的表面蛋白。此蛋白具有104个氨基酸(GenBank N°XM_625821)、及12kDa的分子量、具有氨基-末端信号序列(aa 1-28)和跨膜区(aa 12-32)，其为表面蛋白的特征，且不含保守的或有功能的结构域(Yao等人，2006)。此工作中使用的CP12片段具有213bp的长度，且对应于无跨膜结构域的蛋白CP12的核苷酸序列。片段经PCR-扩增，并亚克隆进载体pQE(CP12)；也制备含H片段、且其后是CP12(HCP12)，及含融合到CP12序列的Fh8序列(Fh8CP12)的构建体。在变性条件下、使用NiNTA琼脂糖树脂(QIAGEN)分离的重组抗原的产生分析显示CP12和HCP12产生之间216％的增加、及CP12和Fh8CP12产生之间954％的增加。
-IL5：人白细胞介素5是造血生长因子，其具有编码134个氨基酸的816bp的核苷酸序列(GenBank N°BC069137.1)。用于评估的IL5片段对应于小部分IL5，由144bp构成，对应于编码48个氨基酸的位于IL5的5′末端的外显子。片段经PCR-扩增，并亚克隆进载体pQE(IL5)；也制备含H片段、且其后是IL5(HIL5)，及含融合到IL5序列的Fh8序列(Fh8IL5)的构建体。在变性条件下、使用NiNTA琼脂糖树脂(QIAGEN)分离的重组抗原的产生的分析、显示IL5和HIL5的产生之间610％的增加、及IL5和Fh8IL5的产生之间1600％的增加。
-TgOWP：TgOWP蛋白是鼠弓形虫(Toxoplasma gondii)卵囊壁蛋白，其具有编码499个氨基酸的长度为1846bp的核苷酸序列(GenBank N°EU851867.1)。TgOWP片段对应于包含2875和3238bp之间的第二外显子。片段经PCR-扩增，并亚克隆进载体pQE(TgOWP)；也制备含H片段、且其后是TgOWP(HTgOWP)的构建体。在变性条件下、使用NiNTA琼脂糖树脂(QIAGEN)分离的重组抗原的产生的分析显示TgOWP和HTgOWP的产生之间575％的增加。
在以上描述的3例中，产生水平从与它们在包含体中的表达一致的水平增加到对应于可溶性蛋白的产生水平，从而可说，肝片形吸虫(Fasciola hepatica)成虫排泄的/分泌的H片段或钙结合蛋白的定位允许重组蛋白产生非常显著增加，可能增加产生的抗原的溶解度。
【抗原Fh8和Fh22和它们的H片段的表征】
先分离Fh8和Fh22抗原，并由属于所列发明人的成员(Castro，2001，Silva等人，2004，Eguino等人，1999)用以下提供的抗原简述(图1)表征。
进行编码被称为Fh8或fasciolin(Genbank号AF213970)的计算的分子量是8kDa的69个氨基酸多肽的cDNA克隆(图1)的分离。
多肽的主要特征是2个推定的钙结合基序(EF-手)的存在。获得的结果(Castro、2001)显示，Fh8是存在于肝片形吸虫(F.hepatica)成虫的排泄/分泌产物(ESP)的抗原，且可呈现为聚合物形式。
为表征目的和分析Fh8活性，以及潜在诊断性目的，获得了含对应于Fh8的序列的重组抗原rFh8。
为研究目的，将对应于Fh8的片段在大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)中亚克隆进表达载体pQE(Qiagen)。在大肠埃希氏菌(E.coli)M15(pREP4)(Qiagen)中进行N-端序列表现为6个组氨酸的序列的重组蛋白rFh8的产生，并通过亲和层析用NiNTA琼脂糖柱(Qiagen)，基于生产商提供的流程(Castro，2001，Silva等人，2004)分离。
分离几种编码具有高同源性的钙结合蛋白的cDNA克隆。将这些克隆亚克隆和分析，及一些显示含对应于有22kDa的计算的分子量的191个氨基酸肽的ORF的相同的插入子(EMBL号AJ003822)，将其表示为Fh22-1。另一克隆含有具有有与之前的高同源性的蛋白的ORF的插入子，将其在下文表征，及称为Fh22-2(EMBL号AJ003821)。
Fh22是具有4个被描述为肝片形吸虫(F.hepatica)成虫的ESP的成分的EF-手结构的钙结合蛋白(Eguino等人，1999)。将这些抗原亚克隆进表达载体pQE及在表达载体pQE中产生。
Fh8和Fh22抗原的表征显示ESP中存在一组具有类似结构特征的蛋白。因此将此一组抗原表征为存在EF-手、调节其折叠的钙结合结构，可能导致大肠埃希氏菌(E.coli)中产生的天然的蛋白和重组抗原的稳定性。两种重组蛋白以高于6mg/L的培养物的水平产生，且两种蛋白显示在大肠埃希氏菌(E.coli)细胞质中以可溶性形式产生。
基于在Fh8水平定向突变获得的结果显示，大肠埃希氏菌(E.coli)中观察到的产生水平取决于那些EF-手之外的结构元件，由于在分离的EF-手(防止钙结合)突变的重组蛋白水平不显著变化。这些数据提示确保所述稳定性的其他蛋白结构的存在。Fh8的三维结构显示、除了在N-端(11aa)和C-端(6aa)的小序列之外，全部其余序列涉及由结合到EF-手的钙所致的结构或受(活性中心的形成)由结合到EF-手的钙所致的结构影响。由此，这些研究导致将Fh8的N-端序列(在下文中称之为H序列)鉴定为在Fh8的稳定性和产生中起关键作用。
对于蛋白Fh22，HLH(EF-手结构、螺旋-环-螺旋-HLH)基序的排列类似于Fh8，且如在Fh8中，除了N和C-端序列之外，其余蛋白涉及钙结合结构，或受它们影响。
在大肠埃希氏菌(Escherichia coli)中将片段和构建体亚克隆进表达载体pQE(Qiagen)。在大肠埃希氏菌(E coli)M15(pREP4)(Qiagen)中进行N-端序列表现为6个组氨酸的序列的重组蛋白rFh8的产生，及将其通过亲和层析，用NiNTA琼脂糖柱(Qiagen)，基于生产商提供的流程(Castro，2001，Silva等人，2004)分离。为产生和分离抗原，可使用任何重组蛋白表达和分离系统。
【株】
在此工作中，将大肠埃希氏菌(Esch erichia coli)XL1Blue(Stratagene)和大肠埃希氏菌(Escherichia coli)M15[pREP4](QIAGEN)株分别用于克隆pGEM-T Easy(Promega)质粒和pQE30以及pQE32(QIAGEN)质粒。
将大肠埃希氏菌(Escherichia coli)M15[pREP4]株用于蛋白表达。
将质粒DNA使用来自Promega的
Plus SV MiniprepsDNA纯化系统试剂盒，从于37℃过夜生长的细菌培养物，根据生产商提供的使用说明分离的和纯化。
【构建体】
图2提供制备用于评定重组抗原Fh8和其11个氨基酸结构元件(H片段)对增加的重组蛋白表达的效应的构建体的示意图。
图2中显示的全部构建体如下通过聚合酶链式反应(PCR)获得，并克隆进pGEM和然后克隆进pQE。
【PCR】
PCR中使用的引物描述于表1。
为了获得含BamHI和SacI限制性位点的H片段和Fh8RSac片段，将含编码Fh8多肽的基因的pQE30载体用作PCR反应的模板(Castro，2001；Silva等人，2004)。PCR反应开始于95℃、1分钟的变性步骤，其后是30个扩增循环、于94℃变性45s、于50℃退火30s和于72℃延伸45s。于72℃进行额外的延伸步骤11分钟。
获得选择以评估重组抗原(及其部分)对蛋白表达产生阳性效应的能力的片段(CP12、IL5和TgOWP)并通过PCR扩增。此PCR反应也包括将SacI和KpnI限制酶的限制性位点添加到相应片段。
表1.制备的构建体、DNA模板、使用的引物和相应PCR程序的列表
使用小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)的基因组DNA作为模板进行用于获得CP12的PCR反应，所述基因组DNA使用DNA提取试剂盒QIAamp DNA mini试剂盒(QIAGEN)，根据生产商提供的流程从此寄生虫卵囊获得。
PCR反应开始于95℃、4分钟的变性步骤，其后是30个如下构成的扩增循环：于95℃30s的变性步骤、于50℃30s的退火步骤，及于72℃1分钟的延伸步骤。最后，于72℃进行额外的延伸步骤7分钟。
使用智人(Homo sapiens)的基因组DNA作为模板进行用于获得IL5片段的PCR反应，所述基因组DNA使用DNA提取试剂盒QIAamp DNA mini试剂盒(QIAGEN)，根据生产商提供的流程从外周血获得。
PCR反应开始于95℃4分钟的变性步骤，其后是30个如下构成的扩增循环：于95℃30s的变性步骤、于50℃30s的退火步骤，及于72℃45s的延伸步骤。最后，于72℃进行额外的延伸步骤7分钟。
使用鼠弓形虫(Toxoplasma gondii)的基因组DNA作为模板进行用于获得TgOWP的PCR反应，所述基因组DNA使用DNA提取试剂盒QIAamp DNA mini试剂盒(QIAGEN)，根据生产商提供的流程从此寄生虫营养子的培养物获得。
PCR反应开始于95℃4分钟的变性步骤，其后是30个如下构成的扩增循环：于95℃30s的变性步骤、于50℃30s的退火步骤，及于72℃1分钟的延伸步骤。最后，于72℃进行额外的延伸步骤7分钟。
对于含有H片段和CP12、IL5或TgOWP片段的构建体而言，将用SacI限制酶消化的H片段与用相同的限制酶消化的靶片段的结合用作模板。
对于含有CP12和IL5片段的Fh8RSac片段的构建体而言，将用SacI限制酶消化的Fh8RSac片段与用相同的限制酶消化的靶片段的结合用作模板。
用于获得含有H片段(即HCP12、HIL5和HTgOWP)的构建体的PCR程序开始于95℃4分钟的变性步骤，其后是30个如下构成的扩增循环：于95℃30s的变性步骤、于55℃30s的退火步骤，及于72℃45s的延伸步骤。最后，于72℃进行7分钟的额外的延伸步骤。
用于获得有重组抗原Fh8RSac(即Fh8CP12和Fh8IL5)的构建体的PCR程序开始于95℃4分钟的变性步骤，其后是30个如下构成的扩增循环：于95℃30s的变性步骤、于55℃30s的退火步骤，及于72℃1分钟的延伸步骤。最后，于72℃进行7分钟的额外的延伸步骤。
全部PCR反应用热循环仪My CyclerTM热循环仪(BioRad)进行。
PCR反应混合剂组成如下：1μL的样品(DNA模板)、2μL的氯化镁、1μL的dNTP(Roche)、1μL的正向引物和1μL的反向引物、5μL的Taq聚合酶缓冲液(Thermo Scientific)、1U/μL的Taq聚合酶(Thermo Scientific)，及蒸馏水至50μL的最终体积。
【从琼脂糖凝胶的DNA提取和纯化】
在描述的过程后，使用illustraTM GFX PCR DNA&凝胶条带纯化试剂盒(GE Healthcare)在琼脂糖凝胶上分离用限制酶消化产生的PCR产物或DNA条带。
【pGEM载体结合】
使用如下组成的混合物进行与pGEM-T Easy载体的结合反应：3μL的DNA样品(PCR产物或限制酶-消化的产物)、1μL的pGEM-TEasy载体(Promega)、5μL的DNA连接酶缓冲液2×(Promega)，及1μL的DNA T4连接酶(Promega)，至10μL的最终体积。此反应于室温过夜进行或于37℃进行1小时30分钟。
【通过限制酶消化的转化体的确认】
与pGEM载体的结合反应后，将大肠埃希氏菌(E.coli)XL1 Blue用结合产物转化。然后将细胞平铺于LB/氨苄西林/X-Gal/IPTG板及于37℃温育过夜。将白色转化体转移到LB/氨苄西林的液体培养物，然后进行从大肠埃希氏菌(E.coli)的质粒DNA提取流程。
通过用EcoRI限制酶(Promega)消化(使用7μL的选择的克隆、2μL的H缓冲液10×和1μL的EcoRI，至10μL的最终体积)进行转化体的确认。反应于37℃进行2～3小时，及在合适的百分率(w/v)的琼脂糖凝胶上观察消化的结果。
【pQE载体结合】
使用由6μL的插入子、2μL的pQE载体、1μL的连接酶缓冲液10×(Promega)，及1μL的DNA T4连接酶(Promega)组成的混合物，将由本工作中进行的用限制酶消化产生的插入子插入pQE载体。此反应于室温过夜进行或于37℃进行1小时30分钟。
插入子结合到pQE载体后，将大肠埃希氏菌(E.coli)M15[pREP4]用结合产物转化。然后将细胞平铺于LB/氨苄西林/卡那霉素板，及于37℃温育过夜。将获得的转化体转移到LB/氨苄西林/卡那霉素的液体培养物，然后进行从大肠埃希氏菌(E.coli)的质粒DNA提取流程。
在蛋白表达评估的阴性对照(pQECP12、pQEIL5和pQETgOWP)的情况下，及在有Fh8重组抗原或有H片段的构建体的情况下，通过用KpnI和BamHI限制酶(Promega)消化进行转化体的确认。
用KpnI，使用如下组成的混合物进行第一消化：26μL的DNA、3μL的J缓冲液(Promega)，及1μL的KpnI(Promega)，至30μL的最终体积。在琼脂糖凝胶上分析10μL的此消化物，及使用由2μL的K缓冲液10×(Promega)和1μL的BamHI(Promega)组成的混合物，用BamHI进行得到的20μL的第二消化。在合适的百分率(w/v)的琼脂糖凝胶上观察消化的结果。
【构建体测序】
通过以Eurofins MWG Operon(德国)测序确认此工作中制备的pGEM和pQE载体中有插入子的全部构建体。
【在变性条件下有重组抗原/H片段的构建体的表达分析】
于37℃搅拌着生长过夜而制备200mL预培养物，及通过混合100ml的饱和的培养物与900ml的含100μg/mL氨苄西林、50μg/mL卡那霉素和1mM IPTG的LB培养基来诱导2l的培养物。5小时的温育后，通过以4000rpm，4℃离心20分钟来收集细胞。通过将细胞与40ml的8M脲缓冲液(pH8.0)搅拌着温育过夜来进行细胞裂解。将提取物以13000rpm、于室温离心15分钟，及收集上清。回收上清后，将其在玻璃棉柱中过滤，然后施加于用8M脲(pH8.0)预平衡的Ni-NTA柱(Amersham Biosciences)。
上清依重力流过柱，然后将柱用5CV(柱体积)的8M脲缓冲液(pH8.0)洗涤，其后是用5CV的含10％甘油的8M脲缓冲液(pH6.5)洗涤。用8M脲缓冲液(pH4.5)进行洗脱，并收集4mL级分。
将洗脱的级分如下所述通过Bradford测定来定量，并在SDS-PAGE Tris-Tricine凝胶上分析。
【蛋白定量】
通过Bradford测定，用以1∶5稀释的蛋白测定(Biorad)试剂进行蛋白定量，及读取595nm的波长处的光密度。用此试剂从595nm处的光密度读取获得指定的牛血清白蛋白(BSA)浓度的溶液的标准曲线。
【聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE Tris-Tricine】
用于分析收集的级分的Tris-Tricine凝胶基于Schagger、H.和Jagow、G.(1987)的Tris-Tricine系统，及基于Laemmli(1970)的SDS-PAGE系统。采用的系统由2种凝胶组成：15％分离胶和4％浓缩胶。分离胶含有：3.3ml的30％丙烯酰胺、2.205ml的凝胶缓冲液、705μL的甘油、367.5μL的水、150μL的10％APS4，及9μL的TEMED。浓缩胶含有：700μL的30％丙烯酰胺、1.25ml的凝胶缓冲液、3ml的水、200μL的10％APS，及5μL的TEMED。
使用的电泳系统包含2个分别有阴极缓冲液和阳极缓冲液的上(邻接凝胶)和下槽。100V电位差(dop)施加于浓缩胶，150V dop施加于分离胶。
在施加于凝胶之前，将样品(在天然或变性条件下)用样品Tris-Tricine缓冲液1×处理。将在天然条件下的样品也于100℃放置在浴中2分钟，然后于4℃放置，直到装载到凝胶。
将凝胶用考马斯蓝染色，并用脱色溶液脱色。
【实施例】
此工作中研究的重组抗原的特征在于良好的表达产率，且可通过离子交换层析容易分离。
以下提供的策略基于这些前提，并选择3个片段(IL5、CP12和TgOWP)来评估由添加H片段或含H片段的蛋白所致的表达产率的增加。
【实施例1：HCP12和HIL5构建体】
为了获得这些构建体，我们首先获得了H片段。使用引物H和Fh8Rev进行PCR(见表1)。引物H允许在Fh8的第11个氨基酸的密码子后插入SacI限制性位点。将该PCR产物分离，然后用SacI限制酶消化。然后分离SacI-消化的N-端片段(H片段)。
其次，分别使用分离的人基因组DNA(gDNA)和小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)的gDNA作为模板扩增IL5(引物IL5Sac和IL5Kpn)和CP12(引物CP12Sac和CP12Kpn)片段。PCR产物分离后，用SacI消化，并进行Sac-消化的片段的相应分离。
将Sac-消化的H片段结合于用SacI消化的IL5和CP12片段。通过PCR使用该结合物作为模板、以及引物H和引物IL5Kpn作为引物获得HIL5片段。以类似方式、使用引物H和引物CP12Kpn获得HCP12片段。将这两个片段均使用BamHI和KpnI限制酶亚克隆进pQE30载体。
【实施例2：HTgOWP构建体】
为了获得HTgOWP片段，将pQEHCP12载体用KpnI和SacI消化，由此从载体移出CP12片段，及由此获得pQE30H。
通过PCR，使用鼠弓形虫(Toxoplasma gondii)的gDNA作为模板、及引物TgOWPSac和TgOWPKpn产生TgOWP片段。
PCR反应允许将SacI和KpnI酶限制性位点添加到TgOWP的DNA模板序列。然后将此产物在琼脂糖凝胶上纯化，并结合于pGEM载体。随后，进行用KpnI和SacI限制酶的消化，其后是用SacI和KpnI消化的TgOWP片段的分离。此片段结合于用SacI和KpnI消化的pQE30H载体，由此获得构建体pQEHTgOWP。
此片段结合于用SacI和KpnI消化的pQE30H载体，由此获得构建体pQEHTgOWP。
【实施例3：pQECP12、pQEIL5和pQETgOWP构建体】
将含H片段的载体(pQEHCP12、pQEHIL5和pQEHTgOWP)用于制备相应阴性对照。如所述，将HCP12、HIL5和HTgOWP片段用作用于获得阴性对照的起始点。
由于3种载体的过程类似，以下提供制备pQECP12重组载体的实施例。将pQEHCP12载体用SacI酶消化，并随后在琼脂糖凝胶上纯化。
纯化步骤后，将pQEHCP12载体也用EcoRI限制酶消化，存在于pQE30载体序列。此消化允许移出H片段以及小部分pQE30载体。将用SacI和EcoRI限制酶消化的pQEHCP12、pQEHIL5和pQEHTgOWP载体在琼脂糖凝胶上纯化，然后接收pQE30空载体的消化片段。为了该目的，有必要用相同的限制酶(SacI和EcoRI)消化此载体。将对应于EcoRI和SacI限制性位点之间的小部分pQE30载体的获得的最低分子量条带(约70bp)在琼脂糖凝胶上纯化，并结合于含之前获得的CP12片段的pQE30，产生pQECP12载体。然后将pQECP12载体转化于大肠埃希氏菌(E.coli)M15[pREP4]。
【实施例4：pQEFh8CP12和pQEFh8IL5构建体】
【Fh8RSac片段】
通过PCR修饰Fh8模板序列和使用引物Fh8For和Fh8RSac获得Fh8RSac片段，其中在Fh8终止密码子之前添加SacI酶限制性位点。然后将PCR反应产物在琼脂糖凝胶上纯化，并结合于pGEM载体。
然后将获得的PCR产物用SacI限制酶消化，产生SacI酶-消化的Fh8RSac片段。然后将此片段使用琼脂糖凝胶纯化，及结合于用SacI酶消化的CP12和IL5片段。
【Fh8CP12和Fh8IL5片段】
如上所述，使用类似策略从添加了SacI和KpnI限制性位点的PCR反应获得CP12以及IL5片段。IL5或CP12扩增后，将这些片段用SacI限制酶消化，并结合于之前也用SacI消化的Fh8RSac片段。然后使用Fh8CP12结合物作为模板和引物Fh8For和CP12Kpn获得Fh8CP12片段。以类似方式，使用Fh8IL5结合物作为模板和引物Fh8For和IL5Kpn获得Fh8IL5片段。分离PCR片段，及首先亚克隆进pGEM载体及随后亚克隆进pQE载体。
【在变性条件下通过Ni-NTA柱的重组抗原表达分析】
在大肠埃希氏菌(E.coli)M15[pREP4]中表达IL5、HIL5、Fh8IL5、CP12、HCP12、Fh8CP12、TgOWP和HTgOWP蛋白，在含LB培养基和相应抗生素的2L培养物中评价。将IL5、CP12和TgOWP蛋白用作相应融合蛋白的蛋白表达分析的阴性对照。将全部培养物用1mM IPTG于37℃诱导5小时，制备细胞提取物，并通过Ni-NTA柱(Amersham Biosciences)在变性条件下(8M脲)分析可溶性级分。
将融合蛋白以及相应阴性对照的表达通过Bradford测定定量，并在SDS-PAGE Tris-Tricine凝胶上评价。
【蛋白表达定量】
通过Bradford测定进行蛋白表达定量，且图3、4和5显示融合蛋白、HIL5和HCP12-Fh8CP12和Fh8IL5、及相应阴性对照、IL5和CP12之间的蛋白表达水平。
HIL5表达(1.22mg/L)约6倍高于相应阴性对照，IL5(0.2mg/L)。当IL5融合到Fh8时，此增加变得甚至更显著，所述表达(3.2mg/L)约16倍高于相应阴性对照，IL5。
融合到重组抗原H片段的CP12导致蛋白表达(1.21mg/L)相比相应阴性对照，CP12(0.44mg/L)的3倍增加。对于融合到Fh8的CP12而言，此增加甚至更显著，所述表达(3.94mg/L)约9倍高于相应阴性对照，CP12。Fh8CP12融合蛋白显示蛋白表达3倍高于HCP12融合蛋白。
阴性对照蛋白、IL5和CP12是在正常条件下(未添加部分或全重组抗原)，不在大肠埃希氏菌(E.coli)中以可溶性形式产生的蛋白，可能在再折叠处理期间被导向到包含体(Proudfoot等人，1990；Yao等人，2006)。
此外，用于此工作的序列对应于小部分IL5和CP12蛋白，给再折叠期间它们的稳定增加难度。为这些蛋白获得的表达产率在溶解度限制以下(通常在0.5和1mg/L之间)，表明它们的难的可溶性表达。
H片段或全重组抗原的添加稳定IL5和CP12片段，导致它们的表达增加。相比此表达增加更显著的是在细胞水平发生的变化，导致从不溶性结构转变为可溶性的不同的结构。
HTgOWP融合蛋白(3.68mg/L)的表达约6倍高于阴性对照，TgOWP(0.64mg/L)。此蛋白的表达在溶解度阈值。但应注意的是由添加H片段所致的表达显著的增加。此片段(如IL5和CP12)将稳定蛋白，导致其可溶性产生。由于TgOWP产生，随着添加的H片段达到高表达水平，添加含重组抗原序列(Fh8)的TgOWP的需要无法满足。
也通过电泳(图3、4和5)、在变性条件(SDS-PAGE Tris-Tricine)下评价用重组抗原的蛋白表达。
【序列表】
<110>Escola Superior Agrária de Coimbra
<120>融合蛋白、其制备方法及
其在重组蛋白表达系统中的应用
<130>PAT 39544-08
<150>PT104331
<151>2009-01-13
<160>4
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>69
<212>PRT
<213>肝片形吸虫(Fasciola hepatica)
<400>1
Met Pro Ser Val Gln Glu Val Glu Lys Leu Leu His Val Leu Asp Arg
1 5 10 15
Asn Gly Asp Gly Lys Val Ser Ala Glu Glu Leu Lys Ala Phe Ala Asp
20 25 30
Asp Ser Lys Cys Pro Leu Asp Ser Asn Lys Ile Lys Ala Phe Ile Lys
35 40 45
Glu His Asp Lys Asn Lys Asp Gly Lys Leu Asp Leu Lys Glu Leu Val
50 55 60
Ser Ile Leu Ser Ser
65
<210>2
<211>11
<212>PRT
<213>肝片形吸虫(Fasciola hepatica)
<400>2
Met Pro Ser Val Gln Glu Val Glu Lys Leu Leu
1 5 10
<210>3
<211>190
<212>PRT
<213>肝片形吸虫(Fasciola hepatica)
<400>3
Met Thr Thr Ala Tyr Lys Leu His Asp Val Glu Ser Leu Ile Asp Trp
1 5 10 15
Phe Met Glu Leu Asp Lys Asn Asn Asp Glu Ala Val Asp Lys Lys Glu
20 25 30
Leu Thr Ala Tyr Tyr Lys Ser Lys Gly Val Ser Asp Ser Lys Ile Asn
35 40 45
Glu Trp Met Glu His Phe Asp Ala Asp Ser Asp Gly Lys Ile Thr Leu
50 55 60
Met Glu Phe Cys Arg Gly Leu Gly Leu Arg Ile Asp Glu Val Arg Val
65 70 75 80
Glu Gln Lys Gln Pro Pro Leu Gln Arg Ala Gly Thr Ala Pro Ala Leu
85 90 95
Gly Thr Asp Ile Glu Met Ile Ala Thr Thr Met Ser Gln Pro Arg Gln
100 105 110
Val Glu Val Thr Glu Lys Phe Lys Ser Leu Val Thr Ala His Asn Gly
115 120 125
Lys Asp Glu Glu Met Lys Asp Val Ala His Glu Leu Lys Thr Phe Leu
130 135 140
Asp Asp Thr Tyr Gly Arg Val Trp Gln Cys Val Ile Leu Thr Gly Ser
145 150 155 160
Tyr Trp Met Gln Phe Ser His Glu Pro Phe Leu Ser Ile Gln Phe Arg
165 170 175
Tyr Gly Arg Tyr Ile Cys Leu Ala Trp Arg Thr Pro Arg Gly
180 185 190
<210>4
<211>20
<212>PRT
<213>肝片形吸虫(Fasciola hepatica)
<400>4
Met Thr Thr Ala Tyr Lys Leu His Asp Val Glu Ser Leu Ile Asp Trp
1 5 10 15
Phe Met Glu Leu
20
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.融合蛋白，其特征在于，包括相同于或90～95％类似于肝片形吸虫(Fasciola hepatica)成虫排泄的-分泌的H片段或钙结合蛋白的氨基酸序列，其后是对应于无关于融合蛋白的蛋白片段或蛋白的氨基酸序列，是将融合标签添加到于N或C-端位置连接的不相关的蛋白。
2.根据权利要求1的融合蛋白，其特征在于，H片段对应于结构上类似于Fh8蛋白的N-端11个氨基酸，SEQ ID NO：2的片段。
3.根据权利要求1的融合蛋白，其特征在于，对应于钙结合蛋白的氨基酸序列结构上类似于肝片形吸虫(Fasciola hepatica)成虫排泄的-分泌的钙结合蛋白Fh8的氨基酸序列-SEQ ID NO：1。
4.根据权利要求1的融合蛋白，其特征在于，对应于不相关的蛋白片段或蛋白的氨基酸序列是CP12。
5.根据权利要求1的融合蛋白，其特征在于，对应于不相关的蛋白片段或蛋白的氨基酸序列是IL5。
6.根据权利要求1的融合蛋白，其特征在于，对应于不相关的蛋白片段或蛋白的氨基酸序列是TgOWP。
7.表达载体，其特征在于，包括编码根据权利要求1～6之任一项的融合蛋白的多核苷酸序列。
8.宿主细胞，其特征在于，包括根据权利要求7的表达载体。
9.制备根据权利要求1～6之任一项的融合蛋白的方法，其特征在于，在适于表达融合蛋白的条件下培养根据权利要求8的宿主细胞，及分离所述融合蛋白。
10.根据权利要求1～6之任一项的融合蛋白用于在重组蛋白表达系统中生产添加的蛋白或蛋白片段的用途。
11.肝片形吸虫(Fasciola hepatica)成虫排泄的-分泌的H片段或钙结合蛋白用于生产重组蛋白的用途。
Claims (14)
1.融合蛋白，其特征在于，包括相同于或90～95％结构上类似于肝片形吸虫(Fasciola hepatica)成虫排泄的-分泌的H片段或钙结合蛋白的氨基酸序列，其后是对应于非相关添加的蛋白或蛋白片段的氨基酸序列。
2.根据权利要求1的融合蛋白，其特征在于，H片段对应于结构上类似于Fh8蛋白的N-端11个氨基酸的片段，所述Fh8蛋白的N-端11个氨基酸是SEQ ID NO：2。
3.根据权利要求1的融合蛋白，其特征在于，H片段对应于结构上类似于Fh22蛋白的N-端20个氨基酸的片段，所述Fh22蛋白的N-端20个氨基酸是SEQ ID NO：4。
4.根据权利要求1的融合蛋白，其特征在于，对应于钙结合蛋白的氨基酸序列在结构上类似于肝片形吸虫(Fasciola hepatica)成虫排泄的-分泌的钙结合蛋白Fh8的氨基酸序列-SEQ ID NO：1。
5.根据权利要求1的融合蛋白，其特征在于，对应于钙结合蛋白的氨基酸序列在结构上类似于肝片形吸虫(Fasciola hepatica)成虫排泄的-分泌的钙结合蛋白Fh22的氨基酸序列-SEQ ID NO：3。
6.根据前述权利要求的融合蛋白，其特征在于，标签添加到于N或C-端位置连接的不相关的蛋白。
7.根据权利要求1的融合蛋白，其特征在于，对应于不相关的蛋白片段或蛋白的氨基酸序列是CP12。
8.根据权利要求1的融合蛋白，其特征在于，对应于不相关的蛋白片段或蛋白的氨基酸序列是IL5。
9.根据权利要求1的融合蛋白，其特征在于，对应于不相关的蛋白片段或蛋白的氨基酸序列是TgOWP。
10.表达载体，其特征在于，包括编码根据权利要求1～8之任一项的融合蛋白的多核苷酸序列。
11.宿主细胞，其特征在于，包括根据权利要求10的表达载体。
12.制备根据权利要求1～9之任一项的融合蛋白的方法，其特征在于，在适于表达融合蛋白的条件下培养根据权利要求11的宿主细胞，及分离所述融合蛋白。
13.根据权利要求1～9之任一项的融合蛋白用于在重组蛋白表达系统中生产添加的蛋白或蛋白片段的用途。
14.肝片形吸虫(Fasciola hepatica)成虫排泄的-分泌的H片段或钙结合蛋白用于生产重组蛋白的用途。
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