MX2011007492A

MX2011007492A - Proteinas de fusion, proceso de preparacion y uso de estas en sistemas de expresion de proteinas recombinantes.

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Publication number: MX2011007492A
Application number: MX2011007492A
Authority: MX
Inventors: Maria Antonia Pereira Da Conceicao; Sofia Judite Marques Da Costa; Antonio Manuel Oliveira Castro; Andre Augusto Da Silva Almeida
Original assignee: Escola Superior Agraria De Coimbra
Priority date: 2009-01-13
Filing date: 2009-12-10
Publication date: 2011-11-18
Also published as: PT104331A; CN102348800A; AU2009337517A1; CN102348800B; WO2010082097A4; WO2010082097A2; ZA201105921B; US20120165508A1; WO2010082097A3; SG174348A1; EP2388329A2; CA2749571A1; BRPI0924214A2

Abstract

La invención concierne a proteínas de fusión que comprenden una secuencia de aminoácidos que corresponde a un fragmento H o una secuencia de aminoácidos que corresponde a una proteína de enlace de calcio secretada-excretada por el gusano adulto de Fasciola hepática, es decir las proteínas Fh8 y Fh22, seguidas por una secuencia de aminoácidos correspondiente a una proteína o fragmento de proteína no relacionada, y a un proceso para la preparación de éstas y a su uso en sistemas de expresión de proteínas recombinantes.

Description

PROTEÍNAS DE FUSIÓN, PROCESO DE PREPARACIÓN Y USO DE ESTAS EN SISTEMAS DE EXPRESION DE PROTEINAS RECOMBINANTES CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a proteínas de fusión, a un proceso para la preparación de las mismas y a su uso en sistemas de expresión de proteínas recombinantes.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La preparación de extractos ricos en proteínas específicas raramente ocurre fácilmente a partir de los organismos que las producen. Por consiguiente, la producción de proteínas recombinantes frecuentemente es la única manera viable para producir las proteínas en las cantidades requeridas y con los niveles de actividad necesarios.

La expresión de proteínas recombinantes es una de las metodologías más relevantes y más aplicables, tanto a nivel de investigación como en el de desarrollo así como también a nivel industrial. La posibilidad de expresar proteínas extrañas en modelos bien definidos, usando bacterias, hongos, o células eucarióticas , constituye un instrumento de gran potencial y relevancia en el campo de los procesos de biotecnología, que facilitan la producción de altas cantidades de la proteína de interés.

E. coli ha sido el sistema usado más ampliamente a nivel mundial para proteínas que no requieren modificaciones post-traslación, como glicosilación, a fin de exhibir actividad. La expresión de proteínas recombinantes en E. coli es uno de los métodos más atractivos de producción heteróloga, debido a la simplicidad de las bacterias, la habilidad de un crecimiento rápido y efectivo-costo, los conocimientos fisiológicos y la caracterización genética existentes, y también la disponibilidad de instrumentos genéticos avanzados, entre ellos la gran variedad de plásmidos, cepas y partícipes recombinantes de fusión con las mutaciones apropiadas. Dadas las ventajas ofrecidas por este modelo, la expresión de proteínas recombinates en E. coli se ha convertido en uno de los métodos más ampliamente usados para producción de proteínas, tanto a nivel de laboratorio como a nivel industrial.

Se han descrito y han sido usados comercialmente varios vectores que expresan proteínas de fusión con secuencias añadidas para propósitos de aislamiento y estabilización de producción. El más ampliamente reportado incluye la producción de proteínas con el denominado "marcador-histidina", caracterizado por la adición de una secuencia con múltiples histidinas, la producción de proteínas de fusión con glutatión S-transferasa, con proteínas de enlace de maltosa (MBP) , con proteínas de enlace de ARN (Documento US200403356 ) , o proteínas de fusión con ubiquitina (Documento O9701627 ) .

Una de las principales dificultades cuando se usan estos sistemas de expresión es la producción de proteínas en la forma de cuerpos de inclusión, una situación común que conduce a rendimientos muy bajos y a la formación de precipitados difíciles de manejar. Esta ocurrencia es particularmente común cuando se usan fragmentos inestables.

El objeto de la presente invención se basa en el desarrollo de una metodología que permite incrementar significativamente la producción de proteínas recombinantes y hacer más fácil su aislamiento, con base en la fusión de secuencias de proteínas o de proteínas de enlace de calcio.

La presente invención es una alternativa a los sistemas del estado del arte en el contexto de la producción de antígenos recombinantes, que se describe como simple, alto rendimiento, y método general que puede tener impacto significativo tanto al nivel de investigación como para aplicaciones comerciales.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a proteínas de fusión que comprenden en su estructura: (1) parte de la secuencia de aminoácidos completa de proteínas de enlace de calcio excretadas/secretadas por el gusano adulto de Fasciola hepática ; y una proteína no relacionada o fragmento de proteína de interés.

Es también un objeto de la presente invención proporcionar un proceso para preparar estas proteínas de fusión que permita un incremento muy significativo en la expresión y solubilización de proteínas de fusión, y consecuentemente de los fragmentos o proteínas añadidos.

La adición de pequeños fragmentos de proteínas de enlace de calcio del helminto Fasciola hepática - a partir de ahora se designará fragmentos H (Helminto) - (SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 4), o las mismas proteínas excretadas/secretadas por el gusano adulto (SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 3), o secuencias similares preferiblemente con 90 a 95 % de homología, con fragmentos de proteínas no relacionadas o proteínas que permiten un incremento significativo en los niveles de producción de estos polipéptidos y su solubilización.

Por consiguiente, un primer aspecto de la presente invención se refiere a una proteína de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene la estructura del fragmento H o de las proteínas de enlace de calcio excretadas/secretadas por el gusano adulto de Fasciola hepática , seguido por una secuencia de aminoácidos estructuralmente similar a una proteina o fragmento de proteina no relacionados. La adición de la marca de fusión (fragmento H o proteina de enlace de calcio) a una proteina no relacionada puede hacerse en la posición terminal N o C.

Otro aspecto de la invención se refiere a un vector de expresión caracterizado porque comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica para dicha proteina de fusión.

Aún otro aspecto de la invención se refiere a una célula hospedadora que comprende el vector de expresión mencionado .

La presente invención también se refiere a un proceso para la preparación de proteínas de fusión, caracterizado por el hecho de que una célula hospedadora previamente mencionada es cultivada bajo condiciones apropiadas para la expresión de dicha proteína de fusión, y la proteína de fusión es aislada.

La invención aún se refiere al uso de dicha proteína de fusión para la producción de proteínas o fragmentos de proteínas añadidos, en sistemas de expresión de proteínas recombinantes .

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de un fragmento H o de proteínas de enlace de calcio excretadas-secretadas por el gusano adulto de Fasciola hepática , para la producción de proteínas recombinantes .

La producción de estas proteínas de fusión permite un incremento muy significativo en la expresión y solubilización de proteínas o fragmentos añadidos, mejorando así su uso para investigación y desarrollo así como también para propósitos industriales.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1A - Caracterización de fragmentos de proteínas y de proteínas recombinantes, referidos como fragmentos H, de proteínas de enlace de calcio Fh8. Secuencia de aminoácidos deducida para el polipéptido Fh8 (SEC ID NO: 1); secuencia de aminoácidos deducida para el polipéptido referido como fragmento H de Fh8 (SEC ID NO: 2) .

Figura IB - Caracterización de fragmentos de proteínas y de proteínas recombinantes, referidos como fragmentos H, de proteínas de enlace de calcio Fh22. Secuencia de aminoácidos deducida para el polipéptido Fh22 (SEC ID NO: 3); secuencias de aminoácidos deducidas para el polipéptido referido como fragmento H del polipéptido Fh22 (SEC ID NO: 4) .

Figura 2 - Vista esquemática de procedimientos de subclonación usados para evaluar el efecto del fragmento H o Fh8 sobre la producción de la proteína.

Figura 3A - Representación gráfica de la producción de proteínas para construcciones que contienen el fragmento CP12.

Figura 3B - Resultados de producción para construcciones que contienen el fragmento CP12; Geles de SDS-PAGE Tris-Tricina teñidos con Azul de Coomassie. Marcadores Estándares de SDS-PAGE pre-teñidos - M (BioRad) . (a) : Fx, F2, y F3 - Fracciones 1, 2 y 3 de CP12 colectadas a partir de la columna de Ni-NTA. (b) : Fx, F2, F3, y F4 - Fracciones 1, 2, 3, y 4 de HCP12 colectadas a partir de la columna de Ni-NTA. (c) : Fi, F2, F3, F4, F5, F5 y F7 - Fracciones 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7 de Fh (CP12 colectadas a partir de la columna de Ni-NTA. Las flechas indican las bandas de las proteínas respectivas.

Figura 4A - Representación gráfica de la producción de proteínas para construcciones que contienen el fragmento IL5.

Figura 4B - Resultados de producción para construcciones que contienen el fragmento IL5; Geles de SDS-PAGE Tris-Tricina teñidos con Azul de Coomassie. Marcadores Estándares de SDS-PAGE pre-teñidos - M (Biorad) . (a) : Fi, F2, y F3 - Fracciones 1, 2 y 3 de IL5 colectadas a partir de la columna de Ni-NTA. (b) : Fi, F2, F3, y F4 - Fracciones 1, 2, 3, y 4 de HIL5 colectadas a partir de la columna de Ni-NTA. Las flechas indican las bandas de las proteínas respectivas.

Figura 5A - Representación gráfica de la producción de proteínas para construcciones que contienen el fragmento TgOWP.

Figura 5B - Resultados de producción para construcciones que contienen el fragmento TgOWP; Geles de SDS-PAGE Tris-Tricina teñidos con Azul de Coomassie. Marcadores Estándares de SDS-PAGE pre-teñidos - M (Biorad) . (a) : Fi, F2, F3, y F - Fracciones 1, 2, 3, y 4 de TgOWP colectadas a partir de la columna de Ni-NTA. (b) : Fj, F2, F3, F y F5 - Fracciones 1, 2, 3, 4 y 5 de HTgOWP colectadas a partir de la columna de Ni-NTA. Las flechas indican las bandas de las proteínas respectivas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención concierne a proteínas recombinantes fusionadas a fragmentos (designados como fragmentos H (de Helminto) - SEC ID NO: 2 y SEC ID NO: 4) o secuencias de aminoácidos completas en proteínas de enlace de calcio excretadas-secretadas por el gusano adulto de Fasciola hepática, es decir la proteína denotada por Fh8 o fasciolina (Número de GenBank AF213970), y la familia de proteínas de enlace de calcio genéricamente conocida como Fh22, la cual incluye los antígenos descritos por el número de EMBL AJ003822; AJ003821. Esta estrategia permite incrementar los niveles de producción de antígenos que están fusionados a los fragmentos H o a proteínas que contienen el fragmento H, y también a su solubilización, incrementando así la eficiencia de los sistemas de producción de proteínas recombinantes existentes. Este sistema permite evitar la producción del antígeno de interés en cuerpos de inclusión, haciendo así viable su aislamiento. Las características bioquímicas de antígenos de enlace de calcio permiten el aislamiento de las proteínas de fusión por medio de técnicas cromatográficas básicas, es decir, columnas de intercambio iónico, debido a la habilidad del enlace de calcio, creando así un elemento cargado dispuesto a servir como base para recuperar el antígeno de fusión.

Los ejemplos presentados conciernen a aplicaciones que usan el fragmento H de Fh8 (SEC ID NO: 2) o la proteína Fh8 (SEC ID NO: 1) . Resultados experimentales mostraron que el fragmento H de proteínas Fh22 (SEC ID NO: 4) o las proteínas Fh22 (SEC ID NO: 3) tienen una acción similar. Igualmente, la metodología desarrollada en el contexto de la presente invención no se limita a la producción de las proteínas de fusión mostradas en los ejemplos, siendo extensiva a cualquier polipéptido sin distorsionar el espíritu de la invención.

Varias de las construcciones fueron subclonadas en el vector de expresión pQE (Qiagen) en Escherichia coli, dando como resultado la producción de proteínas recombinantes que expresan a una secuencia de 6 histidinas en su secuencia N-terminal, siendo efectuada una producción en E. coli M15 (pREP4) (Qiagen) , permitiendo así su aislamiento por cromatografía por afinidad con una columna de Ni-NTA agarosa (Qiagen) , basada en protocolos proporcionados por el fabricante {Castro, 2001, Silva y colaboradores, 2004). Todas las comparaciones de producción fueron efectuadas usando este sistema, el aislamiento del antígeno recombinantes efectuado bajo condiciones de desnaturalización para lograr el aislamiento más efectivo, a fin de comparar los niveles de producción de las diferentes construcciones.

Para la producción y aislamiento de la proteína de interés es posible usar cualquier sistema de aislamiento y expresión de proteínas recombinantes. La invención concierne a construcciones que contienen los fragmentos H, o antígenos que contienen el fragmento H, a fin de solubilizar los polipéptidos de fusión e incrementar su producción. La misma metodología puede ser usada en otros sistemas de producción de proteínas, es decir sistemas eucarióticos o de hongos.

Uno de los principios de la invención se caracteriza por la adición de fragmentos H, particularmente a la secuencia de del fragmento N-terminal de Fh8 o Fh22, SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 4, por medio de técnicas de biología molecular, antes de que sea producida la secuencia que corresponde al polipéptido.

Esta construcción puede ser obtenida por inclusión de esta secuencia por medio de técnicas de biología molecular, es decir, usando enzimas de restricción apropiadas y añadiéndolos sitios de restricción antes de y después de la secuencia del fragmento, o por medio de otros procesos, como la adición de fragmentos de ADN con la secuencia de interés (enlazadores) a un producto de PCR, u otros procedimientos apropiados. La amplitud reducida del fragmento H permite el uso de una gran variedad de estrategias para la fusión al polipéptido de interés.

Otra posibilidad para la construcción es la preparación de una proteína de fusión usando el polipéptido correspondiente a la secuencia de Fh22 o Fh8 y el polipéptido a ser producido. El proceso de inserción de la secuencia de Fh8 o Fh22 puede lograrse usando técnicas de biología molecular, es decir, usando enzimas de restricción, una metodología tal es usada en los procesos de demostración.

La invención ha sido aplicada a varios fragmentos, es decir: - CP12: CP12 es una proteína de superficie de Cryptosporidium parvum, un protozoario coccidium que pertenece al género Cryptosporidium, phylum Apico plexa . Esta proteina tiene 104 aminoácidos (No. GenBank XM_625821), y un peso molecular de 12 kDa, que posee una secuencia de señal amino-terminal (aa 1-28) y una región transmembrana (aa 12-32), la cual es una característica de las proteínas de fusión, y que no contiene dominios conservados ni funcionales (Yao y colaboradores) , 2006) . El fragmento CP12 usado en este trabajo tiene 213 pb de extensión y corresponde a la secuencia de nucleótidos de la proteína CP12 sin el dominio transmembrana de ésta. El fragmento fue amplificado por PCR y subclonado en el vector pQE (CP12); se prepararon también construcciones que contienen el fragmento H seguido por CP12 (HCP12), y qus contienen la secuencia Fh8 fusionada a la secuencia de CP12 (Fh8CP12). El análisis de la producción de antígenos recombinantes aislados bajo condiciones de desnaturalización, usando resina de Ni-NTA agarosa (Qlagen) , mostraron un incremento de 216 % entre la producción de CP12 y HCP12, y de 954 % entre la producción de CP12 y Fh8CP12.

IL5 : Interleuquina 5 humana es un factor de crecimiento hematopoyético, que tiene una secuencia de nucleótidos de 816 pb que codifica para 134 aminoácidos (GenBank No. BC069137.1). El fragmento de IL5 usado para evaluación corresponde a una pequeña parte de IL5, que consiste de 144 pb que corresponden a un exón en el extremo 5' de IL5 que codifica para 48 aminoácidos. El fragmento fue amplificado por PCR y subclonado en el vector pQE (IL5) ; se prepararon también construcciones que contienen el fragmento H seguido por IL5 (HIL5) , y que contienen la secuencia de Fh8 fusionada a la secuencia de IL5 (Fh8lL5) . El análisis de la producción de antigenos recombinantes aislados bajo condiciones de desnaturalización, usando resina de Ni-NTA agarosa (QIAGEN) , mostró un incremento de 610 % entre la producción de IL5 y HIL5, y de 1600 % entre la producción de IL5 y Fh8lL5.

- TgOWP: la proteina TgOWP es una proteina de pared de oocisto de Toxoplasma gondii con 1846 pb de extensión que codifica para 400 aminoácidos (GenBank No. EU851867.1). El fragmento de TgOWP corresponde al segundo exón, comprendido entre el pb 2875 y el 3238. El fragmento fue amplificado por PCR y subclonado en el vector pQE (TgOWP) ; se preparó también la construcción que contiene el fragmento H seguido por TgOWP (HTgOWP) . El análisis de la producción de antigenos recombinantes aislados bajo condiciones de desnaturalización, usando resina de Ni-NTA agarosa (QIAGEN) , mostró un incremento de 575 % entre la producción de TgOWP y HTgOWP.

En los tres ejemplos descritos anteriormente, los niveles de producción tienen incrementos desde niveles consistentes con su expresión en cuerpos de inclusión a niveles de producción correspondientes a proteínas solubles, y de esta manera puede establecerse que la colocación de los fragmentos H o de proteínas de enlace de calcio excretadas/secretadas por el gusano adulto de Fasciola hepática permite incrementar muy significativamente la producción de proteína recombinante, probablemente incrementando la solubilidad del antígeno producido.

Caracterización de los antigenos Fh8 y Fh22 y de sus fragmentos H : Los antígenos de Fh8 y Fh22 fueron previamente aislados y caracterizados por colegas que pertenecen a la lista de inventores (Castro, 2001, Silva y colaboradores, 2004, Equino y colaboradores, 1999), con una breve descripción de los antígenos (Figuras 1A y IB) que es presentada a continuación.

Se llevó a cabo el aislamiento de clones de cADN (Figuras 1A y IB) que codifica para un polipéptido de 69 aminoácidos con un peso molecular calculado de 8 kDa, designado por Fh8 o fasciolina (número de GenBank AF213970.

La principal característica del polipéptido es la existencia de dos motivos de enlace de calcio putativos (EF-hand) . Los resultados obtenidos (castro, 2001) han demostrado que Fh8 es un antígeno que está presente en los productos de excreción/secreción (ESP) del gusano adulto de F. hepática, y puede aparecer en la forma de polímeros.

Para propósitos de caracterización y análisis de la actividad de Fh8, así como también el interés de diagnóstico potencial, se obtuvo un antígeno recombinante, rFh8, que contiene la secuencia correspondiente a Fh8.

Para propósitos de investigación, el fragmento que corresponde a Fh8 fue subclonado en el vector de expresión pQE (Qiagen) en Escherichia coli. La producción de la proteína recombinante rFh8 que expresa a una secuencia de 6 histidinas en su secuencia N-terminal se efectuó en E. coli M15 (pREP4) (Qiagen), y fue aislado por cromatografía por afinidad con una columna de Ni-NTA agarosa (Qiagen) , con base en protocolos proporcionados por el fabricante (castro, 2001, Silva y colaboradores, 2004).

Se aislaron varios clones de cADN codificados por proteínas de enlace de calcio con alta homología. Estos clones fueron subclonados y analizados, y algunos mostraron insertos idénticos (número EMBL AJ003822) que contenían un ORF correspondiente a un péptido de 191 aminoácidos con un peso molecular calculado de 22 kDa, el cual fue denotado por Fh22-1. Otro clon contuvo un inserto con un ORF para una proteína con alta homología con el anterior, el cual será caracterizado posteriormente, y fue designado Fh22-2 (número de EMBL AJ003821) .

Fh22 es proteina de enlace de calcio con 4 estructuras en el EF-hand que han sido descritas como un componente de la ESP de gusanos adultos de F. hepática (Eguino y colaboradores, 1999) . Estos antigenos fueron subclonados y producidos en el vector de expresión pQE.

La caracterización de los antigenos de Fh8 y Fh22 mostró la existencia en ESP de un grupo de proteínas con características estructurales similares. Por consiguiente, este grupo de antígenos se caracteriza por la presencia de "EF-hands" (estructuras con dos motivos helicoidales en posición alfa perpendiculares entre sí unidos por un bucle corto de aproximadamente 12 aminoácidos) , estructuras de enlace de calcio que regulan el plegado del mismo, que causa probablemente la estabilidad tanto de la proteína nativa como de los antígenos recombinantes producidos en E. coli. Ambas proteínas recombinantes son producidas en niveles más altos que 6 mg/L de cultivo, y ambas proteínas han mostrado ser producidas en forma soluble en el citoplasma de E. coli.

Los resultados obtenidos basados en mutaciones directas al nivel de Fh8 mostraron que los niveles de producción observados en E. coli dependen de elementos estructurales diferentes de los EF-hands, ya que los niveles de proteína recombinante mutada en EF-hands aislada (que previenen el enlace de calcio) no cambian significativamente.

Estos datos sugieren la existencia de otras estructuras proteínicas que aseguran dicha estabilidad. La estructura tridimensional de Fh8 mostró que, excepto por pequeñas secuencias en los extremos N-terminal (11 aa) y C-terminal (aa 6) , toda la secuencia restante está involucrada en o es afectada por (formación de centro activo) la estructura resultante del enlace de calcio a EF-hands. Por consiguiente, estos estudios conducen a la identificación de la secuencia N-terminal de Fh8 (posteriormente sobre la denominada secuencia H) que desempeña un papel clave en la estabilidad y en la producción de Fh8.

Para la proteína Fh22, la distribución de los motivos de HLH (la estructura EF-hand, hélice-bucle-hélice -HLH) es similar a Fh8, y como en Fh8, excepto por las secuencias N y C- terminal, la proteína remanente está involucrada en las estructuras de enlace de calcio, o es afectada por ellas.

Los fragmentos y construcciones fueron subclonados en el vector de expresión pQE (Qiagen) en Escherichia coli. La producción de la proteína recombinante rFh8 que expresa a una secuencia de 6 histidinas en su secuencia N-terminal se efectuó en E. coli M15 (pREP4) (Qiagen), y fueron aislados por cromatografía por afinidad con una columna Ni-NTA agarosa (Qiagen) , con base en protocolos proporcionados por el fabricante (Castro, 2001, Silva y colaboradores, 2004). Para la producción y aislamiento del antigeno, puede usarse cualquier sistema de aislamiento y expresión de proteínas recombinantes .

Cepas En este trabajo, se usaron cepas de Escherichia coli XL1 Blue (Stratagene) y Escherichia coli M15 [pREP41] (QIAGEN) para clonar los plásmidos pGEM-T Easy (Promega) y los plásmidos pQE30 así como también pQE32 (QIAGEN) , respectivamente .

Se usó la cepa Escherichia coli MI5 [pREP4] para expresión de proteínas.

Se aisló y purificó el ADN plásmido usando el equipo para Sistemas de Purificación de ADN Wizard® Plus SV Minipreps de Promega, a partir de cultivos bacterianos desarrollados toda la noche a 37°C, siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante.

Construcciones Se proporciona en la Figura 2 una representación esquemática de las construcciones preparadas para evaluar el efecto del antígeno recombinante Fh8 y de sus 11 elementos estructurales aminoácidos (fragmento H) sobre la expresión de proteínas recombinantes.

Todas las construcciones presentadas en la Figura 2 fueron obtenidas por la Reacción en Cadena Polimerasa (PCR) y fueron clonadas en pGEM y luego en pQE, como sigue.

PCR Los cebadores usados en las PCRs se describen en la Tabla 1.

A fin de obtener el fragmento H y el fragmento Fh8RSac, que contienen los sitios de restricción BamHI y SacI, se usó el vector pQE30 que contiene el gen que codifica para el polipéptido Fh8 como patrón para la reacción de PCR (Castro, 2001; Silva y colaboradores, 2004). Se inició la PCR con una etapa de desnaturalización a 95° por 1 minuto, seguido por 30 ciclos de amplificación, con desnaturalización a 94°C por 45 segundos, fortalecimiento a 50°C por 30 segundos y extensión a 72 °C por 45 segundos. Se efectuó una etapa de extensión adicional a 72°C por 11 minutos.

Se obtuvieron y amplificaron por PCR los fragmentos (CP12, IL5, y TgOWP) seleccionados para evaluarla habilidad del antigeno recombinante (y parte de éste) para producir un efecto positivo sobre la expresión de la proteina. Esta reacción por PCR también incluyó la adición de los sitios de restricción de las enzimas de restricción SacI y Kpnl a los fragmentos respectivos.

Tabla 1. Lista de construcciones preparadas, ADN patrón, cebadores usados, y programa de P respectivo 10 15 Tabla 1. (Continuación) Objeto Muestra de ADN usada Identificación y secuencia de cebadores Programa de PCR como patrón usados Fragmento ADN genómico de CP12Fwd: 5'-C A T A C T G G T A T G A G 4 min a 95°C, seguido CP12 Cryptosporidium parvum C T C G A A G G A G T A C -3' por 30 ciclos de 5 amplificación (30 s a CP12 ev: 51 -C A T T A A A A G G T 95°C, 30 s a 50°C, y 1 A C C T T T C A T T A T C A A G- min a 72°C) . 7 min a 3 ' 72°C.

Fragmento ADN genómico humano IL5Fwd: 5 ' -T T C P G A G C C G A G C T C 4 min a 95°C, seguido IL5 A T G A G G A T G C-3' por 30 ciclos de 10 IL5Rev: 5' amplificación (30 s a -A A G A A A A T T A C G G T 95°C, 30 s a 50°C, y 45 A C C T T A C T C A T T G G C- 3' s a 72°C) . 7 min a 72°C.

Fragmento ADN genómico de TgOWP_ SacI: 5' -T G T G C C T G T 4 min a 95 °C, seguido TgOWP Toxoplasma gondii por 30 ciclos de G T G A G C T C C C T C C T G T amplificación (30 s a 15 G-3 ' 95°C, 30 s a 50°C, y 1 Tabla 1. (Continuación) Objeto Muestra de ADN usada Identificación y secuencia de cebadores Programa de PCR como patrón usados TgOWP_KpnI : 5'-T G A T G C G C min a 72°C) . 7 min a 72°C. 5 G G T A C C C T A G G G A A C G A C-3 ' Fragmento Enlace del producto de HFwd: 5 ' -G G A T C C A T G C C T A G T 4 min a 95°C, seguido G T T C A A-3 ' HCP12 PCR correspondiente al por 30 ciclos de CP12Rev: 51 -C A T T A A A A G G T A c fragmento de H digerido amplificación (30 s a con SacI al producto de C T T T C A T T A T C A A G -3 95°C, 30 S a 55°C, y 45 10 PCR correspondiente al s a 72°C) . 7 min a 72°C. fragmento de CP12 digerido con SacI Fragmento Enlace del producto de HFwd: 5'-G G A T C C A T G C C T A G T 4 min a 95°C, seguido G T T C A A-3 ' HIL5 PCR correspondiente al por 30 ciclos de fragmento de H digerido IL5Rev : 5 ' -A A G A A A A T T A amplificación (30 s a 15 C G G T A C C T T A C T C A T T con SacI al producto de G G C-3 ' 95°C, 30 S a 55°C, y 45 Tabla 1 (Continuación) Tabla 1. (Continuación) Objeto Muestra de ADN usada Identificación y secuencia de cebadores Programa de PCR como patrón usados producto de PCR min a 72°C) . 7 min a correspondiente al 72°C. 5 fragmento de CP12 digerido con SacI Fragmento Enlace del producto de HF d: 5 ' -G G A T C C A T G C C T A G T 4 min a 95°C, seguido G T T C A A- 3 ' de Fh8IL5 PCR correspondiente al por 30 ciclos de IL5Rev: 5 ' -A A G A A A A T T A C G G T fragmento de Fh8RSac amplificación (30 s a A C C T T A C T C A T T G G C-3' digerido con SacI al 95°C, 30 s a 55°C, y 1 10 producto de PCR min a 72°C) . 7 min a correspondiente al 72°C. fragmento de IL5 digerido con SacI La reacción de PCR para obtener CP12 se efectuó usando ADN genómico de Cryptosporidium parvum como patrón, obtenido de oocistos de este parásito, usando el equipo de extracción de ADN mini equipo para ADN QIAmp (QIAGEN) , siguiendo el protocolo proporcionado por el fabricante.

La reacción de PCR inició con una etapa de desnaturalización a 95°C por 4 minutos, seguida por 30 ciclos de amplificación que consistieron de una etapa de desnaturalización por 30 segundos a 95°C, una etapa de fortalecimiento por 30 segundos a 50°C, y una etapa de extensión por 1 minuto a 72°C. Finalmente, se efectuó una etapa de extensión adicional a 72°C por 7 minutos.

La reacción de PCR para obtener el fragmento IL5 se efectuó usando ADN genómico de Homo sapiens como patrón, obtenido de sangre periférica, usando el equipo de extracción de ADN mini equipo para ADN QIAmp (QIAGEN) , siguiendo el protocolo proporcionado por el fabricante.

La reacción de PCR inició con una etapa de desnaturalización a 95°C por 4 minutos, seguida por 30 ciclos de amplificación que consistieron de una etapa de desnaturalización por 30 segundos a 95°C, una etapa de fortalecimiento por 30 segundos a 50°C, y una etapa de extensión por 45 segundos a 72°C. Finalmente, se efectuó una etapa de extensión adicional a 72°C por 7 minutos.

La reacción de PCR para obtener TgOWP se efectuó usando ADN genómico de Toxoplasma gondii como patrón, obtenido de un cultivo de tropozoitos de este parásito, usando el equipo de extracción de ADN mini equipo para ADN QIAmp (QIAGEN) , siguiendo el protocolo proporcionado por el fabricante .

La reacción de PCR inició con una etapa de desnaturalización a 95°C po.r 4 minutos, seguida por 30 ciclos de amplificación, que consistieron de una etapa de desnaturalización por 30 segundos a 95°C, una etapa de fortalecimiento por 30 segundos a 50°C, y una etapa de extensión por 1 minuto a 72°C. Finalmente, se efectuó una etapa de extensión adicional a 72°C por 7 minutos.

Para las construcciones con el fragmento H y los fragmentos CP12, IL5 o TgOWP, el enlace del fragmento H digerido con la enzima de restricción SacI al fragmento objetivo digerido con la misma enzima de restricción se usó como patrón.

Para las construcciones con el fragmento Fh8RSac con los fragmentos CP12 y IL5, el enlace del fragmento Fh8RSac digerido con la enzima de restricción SacI al fragmento objetivo digerido con la misma enzima de restricción se usó como patrón.

El programa de PCR usado para obtener las construcciones con el fragmento H (es decir, HCP12, HIL5, y HTgOWP) inició con una etapa de desnaturalización a 95°C por 4 minutos, seguido por 30 ciclos de amplificación que consistieron de una etapa de desnaturalización a 95 °C por 30 segundos, una etapa de fortalecimiento a 55°C por 30 segundos, y una etapa de extensión a 72 °C por 45 segundos. Finalmente, se llevó a cabo una etapa de extensión adicional a 72°C por 7 minutos.

El programa de PCR usado para obtener las construcciones con el antigeno Fh8RSac recombinante, es decir Fh8CP12 y Fh8IL5, inició con una etapa de desnaturalización a 95°C por 4 minutos, seguida por 30 ciclos de amplificación que consistieron de una etapa de desnaturalización a 95°C por 30 segundos, una etapa de fortalecimiento a 55°C por 30 segundos, y una etapa de extensión a 72 °C por 1 minuto. Finalmente, se llevó a cabo una etapa de extensión adicional a 72°C por 7 minutos.

Todas las reacciones de PCR se efectuaron con el termociclador "My Cycler™ Thermal Cycler" (BioRad) .

La mezcla de reacción para PCR consistió de 1 i de muestra (ADN patrón) ) , 2 µ? de cloruro de magnesio, 1 L de dNTPs (Roche) , 1 de cebador en sentido directo y 1 pL de cebador antisentido, 5 µL de regulador de la enzima Taq polimerasa (Thermo Scientific) , 1 unidad/ L de la enzima Taq polimerasa (Thermo Scientific) , y agua destilada hasta un volumen final de 50 L.

Extracción y Purificación de ADN a partir de geles de agarosa Los productos de PCR o bandas de ADN que resultan de digestiones con enzimas de restricción fueron asilados en gel de agarosa usando el equipo de Purificación en Banda de Gel e Illustra™ GFX PCR ADN GE Healthcare), siguiendo el procedimiento descrito a continuación.

Enlace al vector pGEM La reacción de enlace al vector pGEM-T Easy se llevó a cabo usando una mezcla que consistió de 3 pL de la muestra de ADN (producto de PCR o producto digerido por enzima de restricción) , 1 pL del vector pGEM-T Easy (Promega), 5 pL de regulador de enzima ADN ligasa 2X (Promega), 1 µ?? de enzima ADN-T4 ligasa (Promega), hasta un volumen final de 10 pL. Esta reacción se condujo a temperatura ambiente toda la noche o a 37 °C por 1 hora y 30 minutos .

Confirmación de los transformantes por digestión con enzima de restricción Después de reacción de enlace al vector pGEM, E. coli XL1 Blue fue transformado con el producto de enlace. Las células fueron entonces plaqueadas sobre placas de LB/Ampicilina/X-Gal/IPTG y se incubaron toda la noche a 37°C. Los transformantes blancos fueron transferidos a cultivos líquidos de LB/Ampicilina, y luego se llevó a cabo el protocolo de extracción de ADN plásmido a partir de E. coli.

Se hizo la confirmación de los transformantes por digestión con la enzima de restricción EcoRI (Promega) , usando 7 pL de clones seleccionados, 2 L de regulador de H 10X y 1 µ?? de EcoRI, hasta un volumen final de 10 ~L. La reacción se condujo por 2 a 3 horas a 37 °C, y el resultado de la digestión se observó sobre un gel de agarosa con un porcentaje (peso/volumen) apropiado.

Enlace al Vector pQE Los insertos que resultaron de las digestiones, efectuadas en este trabajo, con enzimas de restricción fueron insertados en el vector pQE usando una mezcla que consistió de 6 µL de inserto, 2 \i~L de vector pQE, 1 L de regulador de ligasa 10X (Promega) , y 1 pL de enzima ADN T4 ligasa (Promega) . Esta reacción fue conducida a temperatura ambiente toda la noche o a 37 °C por 1 hora y 30 minutos.

Después de enlace del inserto al vector pQE, E. coli M15 [pREP4] se transformó con el producto de enlace. Las células fueron plaqueadas sobre placas de LB/Ampicilina/Kanamicina y fueron incubadas toda la noche a 37 °C. Los transformantes obtenidos fueron transferidos a cultivos líquidos de LB/Ampicilina/Kanamicina, y luego se llevó a cabo el protocolo de extracción del ADN plásmido a partir de E. coli.

La confirmación de los transformantes se hizo por digestión con las enzimas de restricción Kpnl y BamHI (Promega), ambas en el caso de controles negativos de la evaluación de la expresión de las proteínas, pQECP12, pQEIL5, y PQETgO P, y en el caso de las construcciones con el antígeno recombinante o con el fragmento H.

Se efectuó la primera digestión con Kpnl, usando una mezcla que consistió de 26 pL de ADN, 3 de regulador J (Promega), y 1 \i de Kpnl (Promega), a un volumen final de 30 µL. Se analizaron 10 L de esta digestión sobre gel de agarosa, y se efectuó la segunda digestión de los 20 i resultantes con BamHI, usando una mezcla que consistió de 2 pL de regulador K 10X (Promega) y 1 µ? de BamHI (Promega) . Se observó el resultado de la digestión sobre gel de agarosa con un porcentaje (peso/volumen) apropiado.

Formación de secuencias de la construcción Todas las construcciones preparadas en este trabajo, con los insertos en los vectores pGEM y pQE, fueron confirmados por formación de secuencias en Eurofins M G Operon (Alemania) .

Análisis de la expresión de las construcciones con el fragmento H/antigeno recombinante , bajo condiciones de desnaturalización Se preparó un pre-cultivo de 200 mL, se desarrolló toda la noche a 37 °C con agitación, y se indujeron 2 litros de cultivo por mezcla de 100 mL del cultivo desnaturalizado y 900 mL de medio LB que contuvo 100 g/mL de Ampicilina, 50 g/mL de Kanamicina y 1 mM de IPTG. Después de 5 horas de incubación, las células fueron colectadas por centrifugación a 4000 rpm, 4 °C por 20 minutos. Se llevó a cabo la lisis celular por incubación de las células con 40 mL de regulador de urea 8 , pH de 8.0, toda la noche con agitación. El extracto fue centrifugado a 13000 rpm, a temperatura ambiente por 15 minutos, y el sobrenadante fue colectado. Después de recuperar el sobrenadante, éste fue filtrado en una columna de lana de vidrio que es aplicada a la columna de Ni-NTA (Amersham Biosciences) , fue pre-equilibrada con urea 8 M a pH de 8.0.

El sobrenadante fluyó a través de la columna por gravedad, y la columna fue entonces lavada con 5 CV (volúmenes de columna) de regulador de urea 8 M a pH de 8.0, seguido por 5 CV de regulador de urea 8 M con glicerol al 10 %, pH de 6.5. La elución tuvo lugar con regulador de urea 8 M, pH de 4.5, y se colectaron fracciones de 4 mL .

Las fracciones eluidas fueron cuantificadas por medio del ensayo de Bradford y fueron analizadas sobre gel de SDS-PAGE Tris-Tricina, como se describe a continuación.

Cuantificación de las proteínas Se efectuó la cuantificación de las proteínas por medio del ensayo de Bradforf con el reactivo para Ensayo de Proteínas (BioRad) diluido 1:5, y se leyó la densidad óptica a una longitud de onda de 595 nm. Se obtuvo la curva de calibración a partir de las lecturas de densidad óptica, a 595 nm, de soluciones de concentraciones de albúmina de suero bovino (BSA) definidas con este reactivo.

Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS-PAGE Tris-Tricina Los geles de Tris-Tricina usados para analizar las fracciones colectadas se basaron en los sistemas Tris-tricina de Schagger, H. y Jagow, G. (1987) y en el sistema SDS-PAGE de Laemmli (1970). El sistema adoptado consistió de dos geles: un gel de resolución al 15 % y un gel de apilamiento al 4 %. El gel de resolución contuvo 3.3 mL de acrilamida al 30 %, 2.205 mL de regulador en gel, 705 µL de glicerol, 367.5 pL de agua, 150 pL de APS4 al 10 ¾ y 9 pL de TEMED. El gel de apilamiento contuvo 700 pL de acrilamida al 30 %, 1.25 mL de regulador en gel, 3 mL de agua, 200 pL de APS al 10 %, y 5 L de TEMED.

El sistema de electroforesis usado comprendió dos, superior (después de los geles) e inferior depósitos con regulador catódico y regulador anódico, respectivamente. Una diferencia de potencial de 100 Voltios (dop) se aplicó al gel de apilamiento y una dop de 150 Voltios se aplicó al gel de resolución .

Antes de aplicarlas sobre el gel, las muestras (bajo condiciones nativas y de desnaturalización) fueron tratadas con regulador Tris-tricina de muestra IX. Las muestras bajo condiciones nativas fueron también colocadas en el baño a 100°C por 2 minutos, luego de permanecer a 4°C fueron cargadas sobre el gel.

Los geles fueron teñidos con azul de Coomassie y desteñidos con una solución decolorante.

Ejemplos El antigeno recombinante estudiado en este trabajo se caracterizó por un buen rendimiento de expresión, y puede ser aislado fácilmente por cromatografía de intercambio iónico .

Las estrategias presentadas a continuación estuvieron basadas en estas premisas, y tres fragmentos (IL5, CP12, y TgO P) fueron seleccionados para evaluar el incremento en los rendimientos de expresión que resultaron de la adición del fragmento H o de la proteína que contuvo el fragmento H.

Ejemplo 1 - Construcciones HCP12 y HIL5 A fin de obtener estas construcciones se obtuvo primero el fragmento H. Se llevó a cabo una PCR usando cebadores H y Fh8Rev (ver la Tabla 1) . El cebador H permite insertar un sitio de restricción SacI después del codón del onceavo aminoácido de Fh8. Este producto de PCR fue aislado y luego digerido con la enzima de restricción SacI. Se aisló entonces el fragmento N-terminal digerido con SacI (fragmento H) .

En segundo término, los fragmentos IL5 (cebadores IL5Sac e IL5Kpn) y CP12 (cebadores CP12Sac y CP12Kpn) fueron amplificados usando ADN genómico humano aislado (gADN) y gADN de Cryptosporidium parvum, respectivamente, como patrones. Después del aislamiento de los productos de PCR, se efectuó la digestión con SacI y el asilamiento respectivo de los fragmentos digeridos con Sac.

El fragmento H digerido con Sac fue enlazado a los fragmentos IL5 y CP12 digeridos con SacI. Se obtuvo el fragmento HIL5 por PCR usando ese enlace como patrón y el cebador H y el cebador IL5Kpn como cebadores. El fragmento HCP12 fue se obtuvo de una manera similar, usando el cebador H y el cebador CP12Kpn. Ambos de estos fragmentos fueron subclonados en el vector pQE30 usando las enzimas de restricción BamHI y Kpnl.

Ejemplo 2 - Construcción de HTgOWP A fin de obtener el fragmento HTgOWP, el vector pQEHCP12 fue digerido con Kpnl y Sacl, removiendo asi el fragmento CP12 del vector, y obteniendo asi pQE30 H.

El fragmento TgOWP fue producido por PCR usando gADN de Toxoplasma gondii como patrón, y los cebadores TgOWPSac y TgOWPKpn.

La reacción de PCR permitió la adición de los sitios de enzimas de restricción Sacl y Kpnl a la secuencia de ADN patrón de TgOWP. Este producto fue entonces purificado sobre gel de agarosa y enlazado al vector pGEM. Subsecuentemente, se efectuaron las digestiones con las enzimas de restricción Kpnl y Sacl, seguidas por el aislamiento del fragmento TgOWP digerido con Sacl y Kpnl. Este fragmento fue enlazado al vector pQE30H digerido con Sacl y Kpnl, obteniendo asi la construcción pQEHTgOWP.

Ejemplo 3 - Construcciones pQECP12 , pQEIL5, y pQETgO P Se usaron los vectores que contenían el fragmento H (pQEHCP12, pQEHIL5, y pQETgOWP) para preparar los controles negativos respectivos. Como tales, los fragmentos HCP12, HIL5, y HTgOWP fueron usados como puntos de partida para obtener los controles negativos.

Ya que el procedimiento fue similar para los tres vectores, se presenta a continuación el ejemplo para preparar el vector recombinante pQECP12. El vector pQEHCP12 fue digerido con la enzima SacI y subsecuentemente fue purificado sobre gel de agarosa. Después de la etapa de purificación, el vector pQEHCP12 fue también digerido con la enzima de restricción EcoRI, presente en la secuencia del vector pQE30. Esta digestión permitió la remoción del fragmento H así como ¦ también de una pequeña parte del vector pQE30. Los vectores PQEHCP12, pQEHIL5, y pQEHTgO P, digeridos con las enzimas de restricción SacI y EcoRI, fueron purificados sobre gel de agarosa, y luego recibieron un fragmento de digestión del vector vacio pQE30. Para ese propósito fue necesario digerir este vector con las mismas enzimas de restricción, SacI y EcoRI. La banda de peso molécula mínimo obtenida, correspondiente a la pequeña parte del vector pQE30 entre los sitios de restricción EcoRI y SacI (de aproximadamente 70 pb) , fue purificada sobre gel de agarosa y enlazada a pQE30 con el fragmento CP12 obtenido previamente, dando como resultado el vector pQECP12. El vector pQECP12 fue entonces transformado en E. coli M15 [pREP4] .

Ejemplo 4 - Construcciones pQEFh8CP12 y pQEFh8lL5 : Fragmento Fh8RSac Se obtuvo el fragmento Fh8RSac por PCR modificando una secuencia patrón de Fh8 y usando los cebadores Fh8For y Fh8RSac, en donde el sitio de enzima de restricción SacI fue añadido antes del codón de detención de Fh8. El producto de la reacción de PCR fue entonces purificado sobre gel de agarosa y enlazado al vector pGEM.

El producto de PCR obtenido fue entonces digerido con la enzima de restricción SacI, dando como resultado el fragmento Fh8RSac digerido con la enzima SacI. Este fragmento fue entonces purificado usando un gel de agarosa y fue enlazado a los fragmentos CP12 e IL5, digeridos con la enzima SacI .

Fragmentos Fh8CP12 y Fh8lL5 Como se mencionó anteriormente, los fragmentos CP12 asi como también IL5 se obtuvieron usando una estrategia similar, a partir de la reacción por PCR a la cual se añadieron los sitios de restricción SacI y Kpnl . Después de la amplificación de IL5 o CP12, estos fragmentos fueron digeridos con la enzima de restricción SacI y fueron enlazados al fragmento FhSRSac, también previamente digeridos con SacI. Se obtuvo entonces el fragmento Fh8CPl2 usando el enlace de Fh8CP12 como patrón y los cebadores Fh8For y CP12Kpn. Se obtuvo el fragmento Fh8lL5 en una manera similar, usando el enlace de Fh8IL5 como patrón y los cebadores Fh8For e IL5Kpn. Los fragmentos de PCR fueron aislados, y subclonados primeramente en el vector pGEM y posteriormente en el vector pQE .

Análisis de la expresión antigénica recombinante por columna de Ni-NTA, bajo condiciones desnaturalizantes Se expresaron las proteínas IL5, HIL5, Fh8lL5, CP12, HCP12 , Fh8CP12, TgO P, y HTgO P en E. coli M15 [pREP4], siendo evaluadas en cultivos de 2 L con medio LB y los antibióticos respectivos. Se usaron las proteínas IL5, CP12 y TgOWP como controles negativos del análisis de expresión de proteínas de las proteínas de fusión respectivas. Todos los cultivos fueron inducidos con 1 mM de IPTG a 37 °C por 5 horas, se prepararon los extractos celulares y las fracciones solubles fueron analizadas bajo condiciones desnaturalizantes (urea 8 M) por columnas de Ni-NTA (Amersham Biosciences) .

Se cuantificó la expresión de las proteínas de fusión, asi como también los controles negativos respectivos por medio del ensayo de Bradford y se evaluaron sobre geles de Tris-tricina por SDS-PAGE.

Cuantificacion de la expresión proteinica Se cuantificó la expresión proteinica por medio del ensayo de Bradford, y las Figuras 3A, 3B 4A, 4B, 5A y 5B muestran los niveles de expresión de las proteínas entre las proteínas de fusión, HIL5 y HCP12 - Fh8CP12 y Fh8IL5, y controles negativos respectivos, IL5 y CP12.

La expresión de HIL5 (1.22 mg/L fue aproximadamente 6 veces más alta que el control negativo respectivo, IL5 (0.2 mg/L) . Este incremento se volvió aún más significativo cuando IL5 se fusionó a Fh8, la expresión (3.2 mg/L) siendo aproximadamente 16 veces más alta que el control negativo respectivo, IL5.

La fusión de CP12 al fragmento H del antigeno recombinante (1.21 mg/L) dio como resultado un incremento de 3 veces en la expresión proteinica cuando se comparó con el control negativo respectivo, CP12 (0.44 mg/L). Este incremento fue aún más significativo para CP12 fusionada a Fh8, siendo la expresión (3.94 mg/L) aproximadamente 9 veces más alta que la del control negativo respectivo, CP12. La proteina de fusión Fh8CP12 mostró una expresión proteinica 3 veces más alta que la proteina de fusión HCP12.

Las proteínas de los controles negativos IL5 y CP12, son proteínas que bajo condiciones normales (sin adición del antígeno recombinante parcial o total) no son producidas en forma soluble en E. coli, posiblemente se dirigen hacia cuerpos de inclusión durante el proceso de redoblamiento (Proudfoot y colaboradores, 1990; Yao y colaboradores, 2006) .

Además, las secuencias usadas en este trabajo corresponden a una pequeña parte de las proteínas IL5 y CP12, a las que se añade la dificultad de su estabilización durante el redoblamiento. Los rendimientos de expresión obtenidos para estas proteínas son inferiores al límite de solubilidad (usualmente entre 0.5 y 1 mg/L) , destacando su difícil expresión soluble.

La adición de fragmento H o del antígeno recombinante total estabiliza los fragmentos IL5 y CP12, causando un incremento en su expresión. Más impresionante que el incremento de esta expresión son los cambios que tienen lugar al nivel celular, que causan un desplazamiento desde una estructura insoluble a una soluble diferente.

La expresión de la proteína de fusión HTgOWP (3.68 mg/L) fue de aproximadamente 6 veces más alta que el control negativo, TgOWP (0.64 mg/L). La expresión de esta proteína está en el umbral de solubilidad. No obstante, deberá observarse, el incremento significativo en la expresión resulta de la adición del fragmento H. Este fragmento, como con IL5 y CP12, estabilizará a la proteína, conduciendo a su producción soluble. Puesto que la producción de TgOWP con el fragmento H añadido alcanzó altos niveles de expresión, la necesidad de añadir TgOWP con la secuencia del antígeno recombinante (Fh8) no se justificó.

La expresión de la proteína con el antígeno recombinante se evaluó también por electroforesis (Figuras 3A, 3B 4A, 4B, 5A y 5B) bajo condiciones de desnaturalización (Tris-tricina por SDS-PAGE) .

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. - Una proteina de fusión caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos idéntica o 90 a 95 % similar al fragmento H o a proteínas de enlace de calcio excretadas - secretadas por el gusano adulto de Fasciola hepática , seguida por una secuencia de aminoácidos correspondiente a una proteína o fragmento de proteína no relacionada con la proteína de fusión, la adición de marcas de fusión a la proteína no relacionada se hace en la posición o N o C- terminal.

2. - Proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el fragmento H corresponde a un fragmento similar a los 11 aminoácidos N-terminales de la proteína Fh8, SEC ID NO: 2.

3. - Proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos correspondiente a una proteína de enlace de calcio es similar a la excretada - secretada por el gusano adulto de Fasciola hepática, Fh8, SEC ID NO: 1.

4. - Proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos correspondiente a una proteína o fragmento de proteína no relacionada es CP12.

5. - Proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos correspondiente a una proteína o fragmento de proteína no relacionada es IL5.

6. - Proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos correspondiente a una proteína o fragmento de proteína no relacionada es TgOWP.

7. - Un vector de expresión caracterizado porque comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica para la proteína de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. - Una célula hospedadora caracterizada porque comprende un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 7.

9. - Un proceso para la preparación de proteínas de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque una célula hospedadora de conformidad con la reivindicación 8 es cultivada bajo condiciones apropiadas para la expresión de la proteina de fusión, y la proteína de fusión es aislada.

10. - Uso de la proteina de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la producción de proteínas o fragmentos de proteínas añadidas en sistemas de expresión de proteínas recombinantes .

11. -Uso de un fragmento H o de proteínas de enlace de calcio excretadas - secretadas por el gusano adulto de Fasciola hepática para la producción de proteínas recombinantes .