WO2010082097A2 - Proteínas de fusão, processo para a sua preparação e sua utilização em sistemas de expressão de proteínas recombinantes - Google Patents

Proteínas de fusão, processo para a sua preparação e sua utilização em sistemas de expressão de proteínas recombinantes Download PDF

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Sofia Judite Marques Da Costa
António Manuel OLIVEIRA CASTRO
André Augusto DA SILVA ALMEIDA
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    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/35—Fusion polypeptide containing a fusion for enhanced stability/folding during expression, e.g. fusions with chaperones or thioredoxin

Definitions

  • the present invention relates to fusion proteins, a process for their
  • E. coli has been the most widely used system worldwide for proteins that do not require post-translational modifications, such as glycosylation, to have activity.
  • the expression of recombinant proteins in E. coli is one of the most attractive methods of heterologous production due to the simplicity of the bacterium, the ability to grow rapidly and economically, the physiological knowledge and existing genetic characterization and also the availability of advanced genetic tools, among them. , the wide variety of plasmids, recombinant fusion partners and strains with the appropriate mutations. Given the advantages offered by this model, the expression of recombinant proteins in E. coli has become one of the most widely used protein production methods, both at laboratory and industrial level.
  • the object of the present invention is based on the development of a methodology that significantly increases the production of recombinant proteins and facilitates their isolation based on the fusion of protein-binding or calcium-protein sequences.
  • the present invention is an alternative to the systems described in the prior art in the context of recombinant antigen production and is a simple, high yield and general application method that can have significant impact both research as well as commercial applications. Description of the invention
  • the present invention relates to fusion proteins comprising in their
  • fusion proteins enabling the expression and solubilization of fusion proteins to be increased significantly and, consequently, to the added fragments or proteins.
  • Hepatic fasciola - hereinafter referred to as the H (Helminth) fragments - (SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4), or from these adult worm secreted / secreted proteins (SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3), or similar sequences of preferably with 90 to 95% homology, to protein fragments or unrelated proteins allows a significant increase in the production levels of these polypeptides and their
  • a first aspect of the present invention relates to a fusion protein comprising an amino acid sequence having the structure of the H fragment or the excreted-secreted calcium binding proteins secreted by the adult Fasciola hepatic worm, followed by an amino acid sequence structurally similar to a protein fragment or unrelated protein. Addition of the fusion tag (H fragment or calcium binding protein) to the unrelated protein may be effected at the N or C-terminal position.
  • Another aspect of the invention relates to an expression vector comprising a polynucleotide sequence encoding said fusion protein.
  • Still another aspect of the invention relates to a host cell comprising said expression vector.
  • the present invention also relates to a process for the preparation of fusion proteins wherein a host cell referred to above is cultivated under conditions appropriate to the expression of said fusion protein and the fusion protein is isolated. .
  • the invention further relates to the use of said fusion protein for the production of added protein or protein fragments in recombinant protein expression systems.
  • Another aspect of the invention relates to the use of an H fragment or excreted-secreted calcium-binding calcium proteins by the adult Fasciola hepatic worm for the production of recombinant proteins.
  • FIG. 1 Figure 1 - Characterization of recombinant proteins and protein fragments designated as H fragments of calcium binding proteins Fh8 and Fh22.
  • a - Deduced amino acid sequence for Fh8 polypeptide SEQ ID NO 1
  • Deduced amino acid sequence for the polypeptide called Fh8 fragment H SEQ ID NO 2
  • B -Deduced amino acid sequence for polypeptide Fh22 SEQ ID NO 3
  • Deduced amino acid sequences for polypeptide called fragment H of polypeptide Fh22 SEQ ID NO 4).
  • FIG. 1 Production results of constructs containing fragment CP 12.
  • FIG. 4 Production results of constructs containing the IL5 fragment.
  • FIG. 23 Figure 5- Production results of constructs containing the TgOWP fragment.
  • the present invention relates to recombinant proteins fused to
  • H (Helminta) - SEQ ID NO 2 and / or SEQ ID NO 4 fragments or all of the amino acid sequences in secreted calcium-binding proteins secreted by the adult Fasciola hepatic worm, namely the protein designated Fh8 or fasciolin (Genbank number AF213970), and the family of calcium binding proteins generically designated as Fh22 which include the antigens referenced by EMBL number AJ003822; AJ003821.
  • This strategy allows to increase the production levels of antigens that are fused to H fragments or proteins containing H fragments, and their solubilization allowing efficiency gain in existing recombinant protein production systems.
  • This system avoids the production of the antigen of interest in inclusion bodies, enabling its isolation.
  • the biochemical characteristics of calcium binding antigens allow fusion protein isolation by basic chromatography techniques, namely ion exchange columns, due to the calcium binding capacity creating a loading element that can serve as a basis for recovering the antigen from fusion proteins. Fusion.
  • any recombinant protein expression and isolation system may be used.
  • the invention relates to constructs containing H fragments or antigens containing H fragments in order to solubilize fused polypeptides and increase their production.
  • the same methodology could be used in other protein production systems, namely in fungi or eukaryotic systems.
  • H fragments specifically to the sequence of the Fh8 or Fh22 N-terminal fragment, SEQ ID NO 2 or SEQ ID NO 4, by molecular biology procedures prior to the sequence. corresponding to the polypeptide to be produced.
  • This construct can be accomplished by including this sequence by molecular biology techniques, namely by using suitable restriction enzymes and by adding before and after the fragment sequence such restriction sites or by other methods such as adding DNA fragments with the sequence of linkers to a PCR product, or other applicable strategies.
  • the small amplitude of the H fragment allows the use of a wide variety of strategies for fusion with the polypeptide of interest.
  • Another possibility for construction is the preparation of a fusion protein using the polypeptide corresponding to the sequence of Fh8 or Fh22 and the polypeptide to be produced.
  • the insertion process of the Fh8 or Fh22 sequence can be performed using molecular biology techniques, namely through the use of restriction enzymes, which is used in the demonstration processes.
  • CP12 is a surface protein of Cryptosporidium parvum
  • This 104 amino acid protein (GenBank No. XM_625821) has a molecular weight of 12 kDa having an amino terminal signal sequence (aa 1-28) and a transmembrane region (aa 12-32) which is characteristic of proteins. surface and not containing conserved or functional domains (Yao et ah, 2006).
  • the CP 12 fragment used in this work is 213 bp and corresponds to the nucleotide sequence of the CP 12 protein without its transmembrane domain.
  • the fragment was PCR amplified and subcloned into the pQE vector (CP 12), constructs containing fragment H followed by CP12 (HCP12), and containing the Fh8 sequence fused to the CP 12 sequence (Fh8CP12) were also prepared.
  • Analysis of the production of recombinant antigens isolated under denaturing conditions using NiNTA agarose resin (QIAGEN) showed a 216% increase between CP 12 and HCP12 production and 954% between CP 12 and Fh8CP12 production.
  • Human interleukin 5 is a hematopoietic growth factor
  • the IL5 fragment used for evaluation corresponds to a small part of IL5 consisting of 144 bp corresponding to a 5 'end exon of IL5 encoding 48 amino acids.
  • the fragment was PCR amplified and subcloned into the pQE vector (IL5), constructs containing fragment H followed by IL5 (HIL5), and containing the Fh8 sequence fused to the IL5 sequence (Fh8IL5) were also prepared.
  • IL5 pQE vector
  • TgOWP - TgOWP protein is an 1846 bp Toxoplasma gondii oocyst wall protein encoding 499 amino acids (GenBank No. EU851867.1).
  • the fragment was amplified by PCR and subcloned in the pQE vector (TgOWP) was also prepared construct containing the fragment H followed by TgOWP (HTgOWP).
  • QIAGEN NiNTA agarose resin
  • Fh8 and Fh22 antigens have been isolated and previously characterized by elements on the inventor list (Castro, 2001, Silva et al., 2004, Eguino et ah, 1999) followed by a brief description of the antigens ( Figure 1).
  • Fh8 is an antigen present in F. hepatic adult worm excretion / secretion (ESP) products and may appear as polymers.
  • a recombinant antigen, rFh8, containing the sequence corresponding to Fh8 was obtained.
  • the Fh8 fragment was subcloned into the Escherichia coli pQE (Qiagen) expression vector. Production of the recombinant protein rFh8 expressing in its N-terminal sequence a sequence of 6 histidines was performed on E.
  • coli M15 (pREP4) (Qiagen) and isolated by affinity chromatography with a NiNTA agarose column (Qiagen) with based on the protocols provided by the manufacturer (Castro, 2001; Silva et ah, 2004).
  • Fh22 is a 4-structure EF-hands calcium binding protein that has been
  • Escherichia coli XL1 fi / ae (Stratagene) and Escherichia coli Ml 5 [pREP4] (QlAGEN) strains were used for the cloning of plasmids pGEM-T Easy (Promega) and plasmids pQE30 and pQE32 (QIAGEN) respectively.
  • Plasmid DNA was isolated and purified by the Wizard® Plus SV Kit.
  • PCR polymerase chain
  • the pQE30 vector containing the gene encoding the Fh8 polypeptide gene was used as the PCR reaction template (Castro, 2001; Silva et ah, 2004).
  • the PCR reaction began with a 1 minute denaturation step at 95 ° C, followed by 30 cycles of amplification, 45 seconds of denaturation at 94 ° C, 30 seconds of pairing at 50 ° C and 45 seconds of polymerization at 100 ° C. 72 ° C.
  • recombinant antigen and part of it producing a positive effect on protein expression were obtained and amplified by PCR.
  • This PCR reaction also includes cut the restriction enzyme Saci and KpnI cut-off sites to the respective fragments.
  • Fh8RSac CP12Rev fragment 5 -CAT amplification (30 sec digested with Sac I and TAAAAGGTA 95 ° C, 30 sec 55 ° C and PCR product CCTTTCATT 1 min at 72 ° C) .7 corresponding to ATCAA G-3 'min . at 72 ° C CP 12 fragment
  • Fh8RSac IL5Rev fragment 5-AAG amplification (30 sec digested with Sac I and AAAATTACG 95 ° C, 30 sec 55 ° C and the PCR AC GTT AC product 1 min. at 72 ° C) .7 corresponding to TCATTGG C-3 'min at 72 ° C IL5 fragment
  • the PCR reaction began with a denaturation step for 4 minutes at 95 ° C, followed by 30 cycles of amplification with 30 seconds of denaturation at 95 ° C, 30 seconds of pairing at 50 ° C and 1 minute polymerization at 72 ° C. Finally, an additional polymerization step was performed for 7 minutes at 72 ° C.
  • Homo sapiens genomic DNA obtained from peripheral blood, using the QIAamp DNA mini kit from QIAGEN following the manufacturer's protocol.
  • the PCR reaction began with a denaturation step for 4 minutes at 95 ° C, followed by 30 cycles of amplification with 30 seconds of denaturation at 95 ° C, 30 seconds of pairing at 50 ° C and 45 ° C. polymerization seconds at 72 ° C. Per Finally, an additional polymerization step was performed for 7 minutes at 72 ° C.
  • TgOWP The PCR reaction to obtain TgOWP was performed using the Toxoplasma gondii genomic DNA, obtained from a trophozoite culture of this parasite, using the QIAamp DNA mini kit from QIAGEN following the protocol. from the manufacturer.
  • the PCR reaction began with a denaturation step for 4 minutes at 95 ° C, followed by 30 cycles of amplification with 30 seconds of denaturation at 95 ° C, 30 seconds of pairing at 50 ° C and 1 minute polymerization at 72 ° C. Finally, an additional polymerization step was performed for 7 minutes at 72 ° C.
  • HCP12 HIL5 and HTgOWP
  • a denaturation step for 4 minutes at 95 ° C, followed by 30 cycles of amplification with 30 seconds of denaturation at 95 ° C, 30 seconds of pairing at 55 ° C and 45 seconds of polymerization at 72 ° C. Finally, an additional polymerization step was performed for 7 minutes at 72 ° C.
  • the PCR program used to obtain the recombinant Fh8RSac antigen constructs began with a denaturation step for 4 minutes at 95 ° C, followed by 30 rounds of 30 second amplification. denaturation at 95 ° C, 30 seconds pairing at 55 ° C and 1 minute polymerization at 72 ° C. Finally, an additional polymerization step was performed for 7 minutes at 72 ° C.
  • the thermal cycler used for all PCR reactions was My Cycler TM Thermal Cycler (BioRad).
  • DNA template DNA template
  • 2 ⁇ L ⁇ magnesium chloride 1 ⁇ L ⁇ dNTPs (Roche)
  • 1 ⁇ L ⁇ forward and 1 reverse primer 5 ⁇ l Taq polymerase enzyme buffer (Thermo Scientific)
  • 1 unit ⁇ L of Taq polymerase enzyme Thermo Scientific
  • the binding reaction to the pGEM-T Easy vector was by mixing 3 ⁇ l of the DNA sample (PCR product or restriction enzyme digestions) with 1 ⁇ L ⁇ of the pGEM-T Easy vector. (Promega), 5 ⁇ g DNA ligase 2X buffer (Promega) and 1 ⁇ L ⁇ DNA T4 Ligase enzyme (Promega), making up a final volume of 10 ⁇ . This reaction occurred at room temperature overnight or for 1 hour and 30 minutes at 37 ° C.
  • E. coli XL1 Blue was transformed with the binding product. The cells were then spread on LB /
  • E. coli M1 [pREP4] was transformed with the ligation product.
  • the cells were then spread on LB /
  • Kpnl digestion was performed by mixing 26 ⁇ DNA, 3 ⁇ J buffer (Promega) and 1 ⁇ Kpnl (Promega), making a final volume of 30 ⁇ . 10 ⁇ L ⁇ of this digestion was analyzed on agarose gel and the second 20 ⁇ was digested with BamHI, in which 2 ⁇ L ⁇ K 10X buffer was mixed. (Promega) and 1 ⁇ ⁇ of BamHI (Promega). The result of digestion was visualized on appropriate percentage (w / v) agarose gel.
  • a 200 ml preculture was prepared and grown overnight at 37 ° C with stirring and 2 liters of culture induced by placing 100 ml saturated culture and 900 ml LB medium. containing 100 ⁇ g / ml Ampicillin, 50 ⁇ g / ml Kanamycin and 1 mM IPTG. After 5 hours incubation cells were harvested by centrifuging 20 minutes at 4000 rpm at 4 ° C. Cell lysis was performed by incubating the cells with 40 mL of 8 M urea buffer, pH 8.0, and stirring overnight. The extract was centrifuged at 13,000 rpm for 15 minutes at room temperature and the supernatant was collected. After recovery of the supernatant, it was filtered through a glass wool column and applied to the NIMTA column (Amersham Biosciences), pre-equilibrated with 8M urea, pH 8.0.
  • Tris-Tricine gels used to analyze the collected fractions were based on the Tris-Tricine systems of Schagger, H. and Jagow, G. (1987) and Laemmli's SDS-PAGE (1970). Thus, the adopted system consisted of two gels: a 15% resolvent gel and a 4% packaging gel.
  • the resolving gel contained 3.3 mL 30% acrylamide, 2.205 mL gel buffer, 705 glycerol, 367.5 ⁇ of water, 150 ⁇ of 10% PSA4 and 9 ⁇ TEMED.
  • the packaging gel contained 700 ⁇ 30% acrylamide, 1.25 mL gel buffer, 3 mL water, 200 ⁇ PS A 10% and 5% of TEMED.
  • the electrophoresis system used consisted of two reservoirs, upper (near the gels) and lower, in which cathode buffer and anode buffer were placed respectively.
  • a potential difference (ddp) of 100 V was applied to the packaging gel and a ddV of 150 V to the resolving gel.
  • the H fragment was first obtained. PCR was performed with primers H and Fh8Rev (see Table 1). Primer H allows the incorporation of a Saci digestion site after the 11 amino acid codon of Fh8. This PCR product was isolated and digested with Saci restriction enzyme. The Saci digested N-terminal fragment (fragment H) was then isolated.
  • IL5Sac and IL5Kpn primers were amplified using isolated human genomic DNA (gDNA) and Cryptosporidium parvum gDNA, respectively. After isolation of the PCR products, Saci digestion and isolation of Sac-digested fragments were performed.
  • binding between Sac-digested H fragment and Saci-digested IL5 and CP12 fragments was prepared.
  • the HIL5 fragment was then obtained by PCR using this ligation as a template and as primers: Primer H and primer IL5Kpn.
  • the HCP12 fragment was similarly obtained using H primer and CP12 Kpn primer. These fragments were subcloned into vector pQE30 using restriction enzymes BamHI and Kpnl.
  • Example 2- Obtaining the HTgOWP construct: [89] To obtain HTgOWP, the pQEHCP12 vector was digested with Kpnl and Saci, thereby removing the CP 12 fragment from the vector, leaving it with pQE30 H.
  • the TgOWP fragment was produced by PCR using the Toxoplasma gondii DNAg template and the TgOWPSac primer and the TgOWPKpn primer as a sequence.
  • KpnI to TgOWP DNA template sequence This product was then purified on agarose gel and ligated to the pGEM vector.
  • the restriction enzymes Kpn1 and Saci were then digested and the Saci and Kpn1 digested TgOWP fragment was isolated. This fragment was ligated into the Saci and KpnI digested vector pQE30H to yield the pQEHTgOWP construct.
  • the pQEHCP12 vector was also digested with the restriction enzyme EcoRI present in the sequence of the pQE30 vector. This digestion allowed the removal of fragment H and a small part of the pQE30 vector. Agarose gel was purified from pQEHCP12, pQEHIL5 and pQEHTgOWP vectors digested with restriction enzymes Saci and EcoRI to subsequently receive an empty pQE30 digestion fragment. For this, it was necessary to digest this vector with the same restriction enzymes, Saci and EcoRI.
  • the lowest molecular weight band obtained which corresponded to the small part of the pQE30 vector between the EcoRI to Saci restriction sites (about 70 bp) was purified on agarose gel and ligated to pQE30 with the previously obtained CP 12 fragment from to form the vector pQECP12.
  • the pQECP12 vector was then transformed into E. coli M1.
  • the Fh8RSac fragment was obtained by PCR alteration of an Fh8 template sequence and using the Fh8For and Fh8RSac primers, where the Saci enzyme restriction site was added prior to the Fh8 stop codon.
  • the reaction product PCR was then purified on agarose gel and ligated to the pGEM vector.
  • the PCR product obtained was then digested with the Saci restriction enzyme and a Fh8RSac fragment digested with the Saci enzyme was obtained. This fragment was further purified by an agarose gel and used to bind to the Saci enzyme digested CP12 and IL5 fragments.
  • the CP12 and IL5 fragments were obtained by a similar strategy from a PCR reaction in which the Saci and KpnI restriction sites were added. Following IL5 or CP12 amplification, these fragments were digested with the restriction enzyme Saci and ligated to the Fh8RSac fragment, also previously digested with Saci. The Fh8CP12 fragment was then obtained using the Fh8CP12 ligation as a template and the Fh8For and CP12Kpn primers. Similarly, the Fh8IL5 fragment was obtained using the Fh8IL5 ligation as a template and the Fh8For and IL5Kpn primers. PCR fragments were isolated and subcloned initially in the pGEM vector and later in the pQE vector.
  • IL5, HIL5, Fh8IL5, CP12, HCP12, Fh8CP12, TgOWP and HTgOWP proteins were expressed in E. coli M1 [pREP4] and evaluated in 2 L cultures with LB medium and respective antibiotics.
  • IL5, CP 12 and TgOWP proteins were used as a negative control for protein expression analysis of the respective fusion proteins. All cultures were induced with 1 mM IPTG for 5 hours at 37 ° C, cell extracts were prepared and soluble fractions under denaturing conditions (8 M urea) were analyzed by Ni-NTA columns (Amersham Biosciences). .
  • HIL5 (1.22 mg / L) expression was approximately 6-fold higher than that of its negative control, IL5 (0.2 mg / L). This increase became even more significant in the case of the fusion of IL5 with Fh8, where expression (3.2 mg / L) was approximately 16-fold higher than that obtained for the respective negative control, IL5.
  • Fusion of CP12 with recombinant antigen fragment H (1.21 mg / L) resulted in protein expression 3 times greater than expression obtained with its negative control, CP12 (0.44 mg / L). This increase became even more significant in the case of the fusion of CP12 with Fh8, where the expression (3.94 mg / L) was approximately 9 times higher than that obtained for the respective negative control, CP 12.
  • the Fh8CP12 fusion protein showed a protein expression 3 times higher than the HCP12 fusion protein.
  • the negative control proteins, IL5 and CP 12 are proteins that under normal conditions (without addition of part or all of the recombinant antigen) are not soluble in E. coli and can be directed to inclusion when refolding (Proudfoot et al., 1990; Yao et ah, 2006).
  • sequences used in this work correspond to a small part of the IL5 and CP 12 proteins, making their stabilization even more difficult when refolding them. Expression values obtained for these proteins are below the solubility limit (usually 0.5 to 1 mg / L), highlighting the difficult soluble expression.

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Abstract

A invenção refere-se a proteínas de fusão compreendendo uma sequência de aminoácidos correspondente a um fragmento H ou uma sequência de aminoácidos correspondente a uma proteína de ligação ao cálcio excretada-secretada pelo verme adulto de Fasciola hepatica, nomeadamente as proteínas Fh8 e Fh22, seguida de uma sequência de aminoácidos correspondente a um fragmento proteico ou proteína não relacionada e a um processo para a sua preparação e à sua utilização em sistemas de expressão de proteínas recombinantes.

Description

Description
Title of Invention: PROTEÍNAS DE FUSÃO, PROCESSO PARA A SUA PREPARAÇÃO E SUA UTILIZAÇÃO EM SISTEMAS DE
EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES
Campo da invenção
[1] A presente invenção refere-se a proteínas de fusão, a um processo para a sua
preparação e à sua utilização em sistemas de expressão de proteínas recombinantes. Antecedentes da invenção
[2] A preparação de extractos ricos numa proteína específica raramente ocorre com facilidade a partir dos organismos que as produzem. Assim, a produção de proteínas recombinantes é frequentemente a única forma viável de produzir essas proteínas em quantidades e com os níveis de actividade necessários.
[3] A expressão de proteínas recombinantes constitui uma das aplicações mais relevantes e de maior aplicabilidade, tanto a nível de investigação e desenvolvimento, como a nível industrial. A possibilidade de expressar proteínas estranhas em modelos bem definidos, usando bactérias, fungos ou eucariotas, constitui uma ferramenta de grande potencial e relevo no âmbito dos processos biotecnológicos, permitindo a produção de elevadas quantidades da proteína de interesse.
[4] A E. coli tem sido o sistema mais usado a nível mundial, para proteínas que não necessitem de modificações de pós-tradução, tais como a glicosilação, para terem actividade. A expressão de proteínas recombinantes em E. coli é um dos métodos mais atractivos de produção heterologa devido à simplicidade da bactéria, capacidade de um crescimento rápido e económico, conhecimento fisiológico e caracterização genética existente e também devido à disponibilidade de ferramentas genéticas avançadas, entre elas, a grande variedade de plasmídeos, partners recombinantes de fusão e estirpes com as mutações adequadas. Tendo em conta as vantagens oferecidas por este modelo, a expressão de proteínas recombinantes em E. coli tornou-se num dos métodos de produção proteica mais usados, quer ao nível laboratorial, quer industrial.
[5] Vários vectores expressando proteínas de fusão com sequências que são adicionadas para fins de isolamento e estabilização da produção foram descritos e usados comercialmente. Entre os mais divulgados temos a produção de proteínas com o designado 'Histidine-tag', caracterizada pela adição de uma sequência com várias histidinas, a produção de proteínas de fusão com glutationa-S-transferase, com proteínas de ligação à maltose (MBP), com proteínas de ligação a RNA (Documento US2004033564) ou com proteínas de fusão com ubiquitina (Documento WO9701627).
[6] Uma das maiores dificuldades na utilização destes sistemas de expressão reside na produção de proteínas na forma de corpos de inclusão, situação frequente que origina rendimentos muito reduzidos e a formação de precipitados difíceis de manipular. Esta ocorrência é particularmente frequente quando são usados fragmentos instáveis.
[7] O objecto da presente invenção baseia-se no desenvolvimento de uma metodologia que permite aumentar significativamente a produção de proteínas recombinantes e facilitar o seu isolamento baseado na fusão de sequências de proteínas ou proteínas de ligação ao cálcio.
[8] A presente invenção apresenta-se como uma alternativa aos sistemas descritos no estado da técnica no contexto da produção de antigénios recombinantes, assumindo-se como um método simples, com elevado rendimento e de aplicação geral que pode ter impacto significativo tanto a nível de investigação, como de aplicações comerciais. Descrição da invenção
[9] A presente invenção refere-se a proteínas de fusão que compreendem na sua
estrutura: (1) parte ou a totalidade da sequência de aminoácidos de proteínas de ligação ao cálcio excretadas/secretadas pelo verme adulto de Fasciola hepática; e uma proteína ou fragmento proteico de interesse não relacionado.
[10] É também objecto da presente invenção um processo para a preparação destas
proteínas de fusão que permita aumentar muito significativamente a expressão e a solubilização das proteínas de fusão e consequentemente dos fragmentos ou proteínas adicionados.
[11] A adição de pequenos fragmentos de proteínas de ligação ao cálcio do helminta
Fasciola hepática- doravante designados fragmentos H (de Helminta) - (SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4), ou dessas proteínas excretadas/secretadas pelo verme adulto (SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3), ou de sequências semelhantes de preferência com 90 a 95% de homologia, a fragmentos proteicos ou proteínas não relacionados permite um aumento significativo nos níveis de produção destes polipéptidos e da sua
solubilização.
[12] Assim, um primeiro aspecto da presente invenção refere-se a uma proteína de fusão que compreende uma sequência de aminoácidos com a estrutura do fragmento H ou das proteínas de ligação ao cálcio excretadas-secretadas pelo verme adulto de Fasciola hepática, seguida de uma sequência de aminoácidos estruturalmente semelhantes a um fragmento proteico ou proteína não relacionada. A adição do tag de fusão (fragmento H ou proteína de ligação ao cálcio) à proteína não relacionada pode ser efectuado na posição N ou C-terminal.
[13] Um outro aspecto da invenção refere-se a um vector de expressão caracterizado por compreender uma sequência polinucleotídica que codifica a referida proteína de fusão.
[14] Ainda outro aspecto da invenção refere-se a uma célula hospedeira que compreende o vector de expressão mencionado. [15] A presente invenção refere-se, igualmente, a um processo para a preparação de proteínas de fusão caracterizado pelo facto de se cultivar uma célula hospedeira anteriormente referida em condições apropriadas à expressão da referida proteína de fusão e se isolar a proteína de fusão.
[16] A invenção refere-se ainda à utilização da referida proteína de fusão para a produção de proteínas ou fragmentos proteicos adicionados, em sistemas de expressão de proteínas recombinantes.
[17] Outro aspecto da invenção refere-se à utilização de um fragmento H ou proteínas de ligação ao cálcio excretadas-secretadas pelo verme adulto de Fasciola hepática para a produção de proteínas recombinantes.
[18] A produção destas proteínas de fusão permite aumentar muito significativamente a expressão e solubilização dos fragmentos ou proteínas adicionadas, potenciando assim a sua utilização quer para fins de investigação e desenvolvimento, quer para fins industriais.
Breve descrição das figuras
[19] Figura 1 - Caracterização das proteínas recombinantes e dos fragmentos proteicos designados por fragmentos H das proteínas de ligação ao cálcio Fh8 e Fh22. A - Sequência de aminoácidos deduzida para o polipéptido Fh8 (SEQ ID NO 1); Sequência de aminoácidos deduzida para o polipéptido denominado por fragmento H do Fh8 (SEQ ID NO 2); B -Sequência de aminoácidos deduzida para o polipéptido Fh22 (SEQ ID NO 3); Sequências de aminoácidos deduzidas para o polipéptido denominado por fragmento H do polipéptido Fh22 (SEQ ID NO 4).
[20] Figura 2 - Esquema das subclonagens usadas para avaliar o efeito do fragmento H ou do Fh8 sobre a produção proteica.
[21] Figura 3- Resultados das produções das construções contendo o fragmento CP 12. A- Gráfico da produção proteica; B- Géis SDS-PAGE Tris-Tricina corados com
Coomassie Blue. M- Marcador Prestained SDS-PAGE Standards (BioRad). (a): F1; F2 e F3 - Fracções 1, 2 e 3 de CP 12 recolhidas da coluna de Ni-NTA. (b): F1; F2, F3 e F4 - Fracções 1, 2, 3 e 4 de HCP12 recolhidas da coluna de Ni-NTA. (c): F1; F2, F3, F4, F5, F 6 e F7 - Fracções 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7 de Fh8CP12 recolhidas da coluna de Ni-NTA. As setas indicam as bandas das respectivas proteínas.
[22] Figura 4 - Resultados das produções das construções contendo o fragmento IL5. A- Gráfico da produção proteica; B- Géis de SDS-PAGE Tris-Tricina corados com Coomassie blue. M- Marcador Prestained SDS-PAGE Standards (BioRad). (a): F1; F2 e F3 - Fracções 1, 2 e 3 de IL5 recolhidas da coluna de Ni-NTA. (b): F1; F2, F3 e F4 - Fracções 1, 2, 3 e 4 de HIL5 recolhidas da coluna de Ni-NTA. As setas indicam as bandas das respectivas proteínas.
[23] Figura 5- Resultados das produções das construções contendo o fragmento TgOWP. A- Gráfico da produção proteica; B- Géis SDS-PAGE Tris-Tricina corados com Coomassie Blue. M- Marcador Prestained SDS-PAGE Standards (BioRad). (a): Fl, F2, F3 e F4 - Fracções 1, 2, 3 e 4 de TgOWP recolhidas da coluna de Ni-NTA. (b): Fl, F2, F3, F4 e F5 - Fracções 1, 2, 3, 4 e 5 de HTgOWP recolhidas da coluna de Ni-NTA. As setas indicam as bandas das respectivas proteínas.
Descrição detalhada da invenção
[24] A presente invenção diz respeito a proteínas recombinantes fusionadas com
fragmentos (designados fragmentos H (de Helminta) - SEQ ID NO 2 e/ou SEQ ID NO 4) ou totalidade das sequências de aminoácidos existentes em proteínas de ligação ao cálcio excretadas-secretadas pelo verme adulto de Fasciola hepática, nomeadamente a proteína designada por Fh8 ou fasciolina (Genbank number AF213970), e a família de proteínas de ligação ao cálcio designadas genericamente por Fh22 que incluem os antigénios referenciados por EMBL número AJ003822; AJ003821. Esta estratégia permite aumentar os níveis de produção dos antigénios que são fusionados aos fragmentos H ou às proteínas contendo os fragmentos H, e a sua solubilização permitindo um ganho de eficiência nos sistemas de produção de proteínas recombinantes existentes. Este sistema permite evitar a produção do antigénio de interesse em corpos de inclusão viabilizando o seu isolamento. As características bioquímicas dos antigénios de ligação ao cálcio permitem o isolamento das proteínas de fusão por técnicas de cromatografia básicas, nomeadamente colunas de troca iónica, devido à capacidade de ligação ao cálcio criando um elemento de carga susceptível de servir de base para recuperar o antigénio de fusão.
[25] Os exemplos apresentados referem-se a aplicações utilizando o fragmento H do Fh8 (SEQ ID NO 2) ou a proteína Fh8 (SEQ ID NO 1). Os resultados experimentais mostraram que o fragmento H das proteínas Fh22 (SEQ ID NO 4) ou as proteínas Fh22 (SEQ ID NO 3) têm acção semelhante. Do mesmo modo a metodologia desenvolvida no âmbito da presente invenção não se restringe à produção das proteínas de fusão demonstradas nos exemplos, sendo extensíveis a qualquer polipéptido, não
desvirtuando o espírito da invenção.
[26] As várias construções foram subclonadas no vector de expressão em Escherichia coli pQE (Qiagen), do qual resulta a produção de proteínas recombinantes expressando na sua sequência N-terminal uma sequência de 6 histidinas, produção essa realizada na E. coli M15(pREP4) (Qiagen), permitindo o seu isolamento por cromatografia de afinidade com uma coluna de NiNTA agarose (Qiagen), com base nos protocolos fornecidos pelo fabricante (Castro, 2001; Silva e tal., 2004). Todas as comparações de produção efectuadas usaram este sistema, efectuando-se o isolamento do antigénio re- combinante em condições desnaturantes para permitir o isolamento mais eficaz, de forma a efectuar a comparação entre os níveis de produção das várias construções. [27] Para a produção e isolamento da proteína de interesse poderá ser usado qualquer sistema de expressão e isolamento de proteína recombinante. A invenção refere-se a construções contendo os fragmentos H ou os antigénios contendo os fragmentos H de forma a solubilizar os polipéptidos que são fusionados e aumentar a sua produção. A mesma metodologia poderá ser usada noutros sistemas de produção proteicos, nomeadamente em fungos ou sistemas eucariotas.
[28] Um dos princípios da invenção caracteriza-se pela adição dos fragmentos H, concretamente à sequência do fragmento N-terminal do Fh8 ou do Fh22, SEQ ID NO 2 ou SEQ ID NO 4, por processos de biologia molecular, antes da sequência correspondente ao polipéptido que se pretende produzir. Esta construção, pode ser realizada por inclusão desta sequência por técnicas de biologia molecular, nomeadamente usando enzimas de restrição adequadas e adicionando antes e depois da sequência do fragmento esses locais de restrição ou por outros processos como a adição de fragmentos de DNA com a sequência de interesse (linkers) a um produto de PCR, ou outras estratégias aplicáveis. A reduzida amplitude do fragmento H permite o uso de uma grande variedade de estratégias para a fusão com o polipéptido de interesse.
[29] Outra possibilidade para a construção consiste na preparação de uma proteína de fusão usando o polipéptido correspondente à sequência do Fh8 ou Fh22 e o polipéptido que se pretende produzir. O processo de inserção da sequência do Fh8 ou Fh22 pode ser realizado com recurso às técnicas de biologia molecular, nomeadamente através do uso de enzimas de restrição, metodologia essa usada nos processos de demonstração.
[30] A invenção foi aplicada a vários fragmentos, nomeadamente:
[31] - CP12: A CP12 é uma proteína de superfície do Cryptosporidium parvum,
protozoário coccídeo pertencente ao género Cryptosporidium, filo Apicomplexa. Esta proteína com 104 aminoácidos (GenBank n° XM_625821), tem um peso molecular de 12 kDa possuindo uma sequência sinal amino-terminal (aa 1-28) e uma região trans- membranar (aa 12-32), que é característica das proteínas de superfície, e não contendo domínios conservados nem funcionais (Yao et ah, 2006). O fragmento CP 12 usado neste trabalho apresenta 213 pb e corresponde à sequência nucleotídica da proteína CP 12 sem o seu domínio transmembranar. O fragmento foi amplificado por PCR e subclonado no vector pQE (CP 12), foram igualmente preparadas construções contendo o fragmento H seguido do CP12 (HCP12), e contendo a sequência do Fh8 fusionada com a sequência do CP 12 (Fh8CP12). A análise da produção dos antigénios recom- binantes isolados em condições desnaturantes usando resina de NiNTA agarose (QIAGEN) evidenciou um aumento de 216 % entre a produção de CP 12 e HCP12, e de 954 % entre a produção de CP 12 e Fh8CP12.
[32] - IL5: A interleucina 5 humana é um factor de crescimento hematopoiético,
possuindo uma sequência nucleotídica de 816 pb que codificam para 134 aminoácidos (GenBank n° BC069137.1). O fragmento IL5 usado para avaliação corresponde a uma pequena parte da IL5, constituída por 144 pb correspondendo a um exão da extremidade 5' da IL5 codificando para 48 aminoácidos. O fragmento foi amplificado por PCR e subclonado no vector pQE (IL5), foram igualmente preparadas construções contendo o fragmento H seguido do IL5 (HIL5), e contendo a sequência do Fh8 fusionada com a sequência do IL5 (Fh8IL5). A análise da produção dos antigénios re- combinantes isolados em condições desnaturantes usando resina de NiNTA agarose (QIAGEN) evidenciou um aumento de 610 % entre a produção de IL5 e HIL5, e de 1600 % entre a produção de IL5 e Fh8IL5.
[33] - TgOWP - A proteína TgOWP é uma proteína da parede do oocisto do Toxoplasma gondii com 1846 pb que codificam para 499 aminoácidos (GenBank n° EU851867.1). O fragmento TgOWP corresponde ao 2o exão, compreendido entre as pb 2875 e 3238. O fragmento foi amplificado por PCR e subclonado no vector pQE (TgOWP), foi igualmente preparada a construção contendo o fragmento H seguido do TgOWP (HTgOWP). A análise da produção dos antigénios recombinantes isolados em condições desnaturantes usando resina de NiNTA agarose (QIAGEN) evidenciou um aumento de 575 % a produção de TgOWP e HTgOWP.
[34] Nos 3 exemplos supracitados os níveis de produção passaram de níveis compatíveis com a sua expressão em corpos de inclusão para níveis de produção correspondentes a proteínas solúveis, pelo que se pode afirmar que a colocação de fragmentos H ou de proteínas de ligação ao cálcio excretadas/secretadas pelo verme adulto de Fasciola hepática permite aumentar muito significativamente a produção de proteína re- combinante, provavelmente aumentando a solubilidade do antigénio produzido.
Caracterização dos antigénios Fh8 e Fh22 e respectivos fragmentos H:
[35] Os antigénios Fh8 e Fh22 foram isolados e caracterizados previamente por elementos constando na lista de inventores (Castro, 2001, Silva et al., 2004, Eguino et ah, 1999) procedendo-se de seguida a uma descrição resumida dos antigénios (Figura 1).
[36] Foi efectuado o isolamento de clones de cDNA (Figura 1) codificando para um
polipéptido de 69 aminoácidos com uma massa molecular calculada de 8 kDa, o qual foi designado por Fh8 ou fasciolina (Genbank number AF213970).
[37] O polipéptido tem como principal característica a existência de dois potenciais
motivos de ligação ao cálcio (EF-hand). Os resultados obtidos (Castro, 2001) permitiram demonstrar que o Fh8 é um antigénio presente nos produtos de excreção/ secreção (ESP) de verme adulto de F. hepática podendo aparecer sob a forma de polímeros.
[38] Para fins de caracterização e análise da actividade da Fh8, assim como do potencial interesse diagnóstico, procedeu-se à obtenção de um antigénio recombinante, rFh8, contendo a sequência correspondente ao Fh8. [39] Para fins de investigação, o fragmento correspondente ao Fh8 foi subclonado no vector de expressão em Escherichia coli pQE (Qiagen). A produção da proteína re- combinante rFh8 expressando na sua sequência N-terminal uma sequência de 6 histidinas foi realizada na E. coli M15(pREP4) (Qiagen) e isolada por cromatografia de afinidade com uma coluna de NiNTA agarose (Qiagen), com base nos protocolos fornecidos pelo fabricante (Castro, 2001; Silva et ah, 2004).
[40] Vários clones de cDNA isolados codificavam para proteínas de ligação ao cálcio com elevada homologia. Estes clones foram subclonados e analisados verificando- se que alguns deles tinham 'inserts' idênticos (EMBL número AJ003822), contendo um ORF correspondente a um péptido de 191 aminoácidos com um peso molecular calculado de 22 kDa, que foi designada por Fh22-1. Outro clone continha um 'insert' com um ORF para uma proteína com elevada homologia com a anterior que será caracterizada posteriormente e foi designada Fh22-2 (EMBL número AJ003821).
[41] A Fh22 é uma proteína de ligação ao cálcio com 4 estruturas EF-hands que foi
descrita como sendo um componente do ESP de vermes adultos de F. hepática (Eguino et al, 1999). Estes antigénios foram subclonados e produzidos no vector de expressão pQE.
[42] A caracterização dos antigénios Fh8 e Fh22 demonstrou a existência nos ESP de um conjunto de proteínas com características estruturais semelhantes. Assim, este conjunto de antigénios é caracterizado pela presença de EF-hands, estruturas de ligação ao cálcio que condicionam toda ofolding dos mesmos, sendo provavelmente a causa da estabilidade tanto da proteína nativa como dos antigénios recombinantes produzidos em E. coli. Ambas as proteínas recombinantes são produzidas a níveis superiores a 6 mg/L de cultura e ambas as proteínas demonstraram ser produzidas de forma solúvel no citoplasma de E.coli.
[43] Os resultados obtidos com base nas mutações dirigidas efectuadas a nível do Fh8 mostram que os níveis de produção observados em E. coli estão dependentes de elementos estruturais que não as EF-hands, uma vez que os níveis de proteína re- combinante mutadas nas EF-hands (impossibilitando a ligação ao cálcio) isoladas não se alteram significativamente. Estes dados sugerem a existência de outras estruturas na proteína que garantam essa estabilidade. A estrutura tridimensional do Fh8 veio demonstrar que, com excepção de pequenas sequências nas extremidades N-terminal (11 a.a) e C-terminal (6 a.a.), toda a restante sequência está envolvida ou comprometida (formação de centro activo) pela estrutura resultante da ligação do cálcio às EF-hands. Assim estes estudos levaram à identificação da sequência N-terminal do Fh8 (posteriormente designada por sequência H) como tendo um papel essencial na estabilidade e produção do Fh8.
[44] Para a proteína Fh22, a disposição dos motivos HLH (a estrutura EF-hand, helix- loop-helix -HLH), é semelhante à do Fh8, e tal como no Fh8, com excepção das sequências N e C-terminal, a restante proteína está envolvida nas estruturas de ligação ao cálcio ou comprometidas pelas mesmas.
[45] Os fragmentos e construções foram subclonados no vector de expressão em Escherichia coli pQE (Qiagen). A produção da proteína recombinante rFh8 expressando na sua sequência N-terminal uma sequência de 6 histidinas foi realizada na E. coli M15(pREP4) (Qiagen) e isolada por cromatografia de afinidade com uma coluna de NiNTA agarose (Qiagen), com base nos protocolos fornecidos pelo fabricante (Castro, 2001; Silva et ah, 2004). Para a produção e isolamento do antigénio poderá ser usado qualquer sistema de expressão e isolamento de proteína recombinante.
Estirpes usadas
[46] Neste trabalho foram utilizadas as estirpes Escherichia coli XL1 fi/ae(Stratagene) e Escherichia coli Ml 5 [pREP4](QlAGEN) para a clonagem dos plasmídeos pGEM-T Easy (Promega) e dos plasmídeos pQE30 e pQE32 (QIAGEN), respectivamente.
[47] Para a expressão proteica utilizou-se a estirpe Escherichia coli Ml 5 [pREP4 ].
[48] O DNA plasmídico foi isolado e purificado através do kit Wizard® Plus SV
Minipreps DNA Purification System da Promega, a partir de culturas bacterianas crescidas a 37 °C, durante a noite, seguindo as instruções fornecidas pelo fabricante. Construções
[49] O esquema das construções realizadas para avaliar o antigénio recombinante Fh8 e seu elemento estrutural de 11 aminoácidos (fragmento H) no aumento da expressão de proteínas recombinantes encontra-se na Figura 2.
[50] Todas as construções apresentadas na Figura 2 foram obtidas por reacção de
polimerase em cadeia (PCR) e clonadas em pGEM e posteriormente em pQE, tal como é indicado seguidamente.
PCR
[51] Os primers usados nos PCR estão descritos na Tabela 1.
[52] Para obtenção do fragmento H e do fragmento Fh8RSac, contendo os locais de
restrição BamHI e Saci, usou-se como molde, para a reacção de PCR, o vector pQE30 contendo o gene codificando para o polipéptido Fh8 (Castro, 2001; Silva et ah, 2004). A reacção de PCR teve início com um passo de desnaturação de 1 minuto a 95 °C, seguido por 30 ciclos de amplificação, com 45 segundos de desnaturação a 94 °C, 30 segundos de emparelhamento a 50 °C e 45 segundos de polimerização a 72 °C.
Realizou-se um passo adicional de polimerização durante 11 minutos a 72 °C.
[53] Os fragmentos escolhidos (CP12, IL5 e TgOWP) para avaliar a capacidade do
antigénio recombinante (e parte deste) de produzir um efeito positivo na expressão proteica foram obtidos e amplificados por PCR. Nesta reacção de PCR também se adi- cionaram os locais de corte das enzimas de restrição Saci e Kpnl aos respectivos fragmentos.
[54] Tabela 1. Lista das construções efectuadas, moldes de DNA, primers usados e respectivo programa de PCR
[Table 1] [Table ]
Figure imgf000011_0001
Figure imgf000012_0001
o produto de PCR GGTACCCTA 45 s a 72 °C).7 min.
correspondente ao GGGAACGA a72°C
fragmento TgOWP C-3'
digerido com Sac I
Obtenção do Ligação entre o HFwd : 5-G G A T 4 min. a 95 °C, fragmento produto de PCR corCCATGCCT A seguido por 30
Fh8CP12 respondente ao G T G T T C A A-3' ciclos de
fragmento Fh8RSac CP12Rev : 5 -C A T amplificação (30 s a digerido com Sac I e TAAAAGGTA 95 °C, 30 s a 55 °C e o produto de PCR CCTTTCATT 1 min. a 72 °C).7 correspondente ao A T C A A G-3' min. a 72 °C fragmento CP 12
digerido com Sac I
Obtenção do Ligação entre o HFwd : 5 -G G A T 4 min. a 95 °C, fragmento Fh8IL5 produto de PCR corCCATGCCT A seguido por 30
respondente ao G T G T T C A A-3' ciclos de
fragmento Fh8RSac IL5Rev : 5 -A A G amplificação (30 s a digerido com Sac I e AAAATTACG 95 °C, 30 s a 55 °C e o produto de PCR GT ACCTT AC 1 min. a 72 °C).7 correspondente ao T C A T T G G C-3' min. a 72 °C fragmento IL5
digerido com Sac I
[55] A reacção de PCR para obter o CP12 foi efectuada usando como molde o DNA
genómico do Cryptosporidium parvum, obtido a partir de oocistos deste parasita, usando o kit de extracção de DNA QIAamp DNA mini kit da QIAGEN, seguindo o protocolo do fabricante.
[56] A reacção de PCR teve início com um passo de desnaturação, durante 4 minutos, a 95 °C, seguido de 30 ciclos de amplificação com 30 segundos de desnaturação a 95 °C, 30 segundos de emparelhamento a 50 °C e 1 minuto de polimerização a 72 °C. Por último, realizou-se um passo adicional de polimerização durante 7 minutos, a 72 °C.
[57] A reacção de PCR para obter o fragmento IL5 foi efectuado usando como molde o
DNA genómico do Homo sapiens, obtido a partir de sangue periférico, usando o kit de extracção de DNA QIAamp DNA mini kit da QIAGEN seguindo o protocolo do fabricante.
[58] A reacção de PCR teve início com um passo de desnaturação, durante 4 minutos, a 95 °C, seguido de 30 ciclos de amplificação com 30 segundos de desnaturação a 95 °C, 30 segundos de emparelhamento a 50 °C e 45 segundos de polimerização a 72 °C. Por último, realizou-se um passo adicional de polimerização durante 7 minutos, a 72 °C.
[59] A reacção de PCR para obter o TgOWP foi efectuado usando como molde o DNA genómico do Toxoplasma gondii, obtido a partir de uma cultura de trofozoitos deste parasita, usando o kit de extracção de DNA QIAamp DNA mini kit da QIAGEN seguindo o protocolo do fabricante.
[60] A reacção de PCR teve início com um passo de desnaturação, durante 4 minutos, a 95 °C, seguido de 30 ciclos de amplificação com 30 segundos de desnaturação a 95 °C, 30 segundos de emparelhamento a 50 °C e 1 minuto de polimerização a 72 °C. Por último, realizou-se um passo adicional de polimerização durante 7 minutos, a 72 °C.
[61] Para as construções com o fragmento H e os fragmentos CP 12, IL5 ou TgOWP
usamos como molde a ligação entre o fragmento H digerido com a enzima de restrição Saci e o fragmento alvo digerido com a mesma enzima de restrição.
[62] Para as construções com o fragmento Fh8RSac com os fragmentos CP12 e IL5
usamos como molde a ligação entre o fragmento Fh8RSac digerido com a enzima de restrição Saci e o fragmento alvo digerido com a mesma enzima de restrição.
[63] O programa de PCR usado na obtenção das construções com o fragmento H
(nomeadamente HCP12, HIL5 e HTgOWP) teve início com um passo de desnaturação, durante 4 minutos, a 95 °C, seguido de 30 ciclos de amplificação com 30 segundos de desnaturação a 95 °C, 30 segundos de emparelhamento a 55 °C e 45 segundos de polimerização a 72 °C. Por último, realizou-se um passo adicional de polimerização durante 7 minutos, a 72 °C.
[64] O programa de PCR usado na obtenção das construções com o antigénio re- combinante Fh8RSac, nomeadamente Fh8CP12 e Fh8IL5, teve início com um passo de desnaturação durante 4 minutos a 95 °C, seguido de 30 ciclos de amplificação com 30 segundos de desnaturação a 95 °C, 30 segundos de emparelhamento a 55 °C e 1 minuto de polimerização a 72 °C. Por último, realizou-se um passo adicional de polimerização durante 7 minutos, a 72 °C.
[65] O termociclador usado para todas as reacções de PCR foi o My CyclerTM Thermal Cycler (BioRad).
[66] A mistura das reacções de PCR efectuadas era constituída por 1 μL· de amostra
(molde de DNA), 2 μL· de cloreto de magnésio, 1 μL· de dNTPs (Roche), 1 μL· do primer forward e 1 do primer reverse, 5 de tampão da enzima Taq polimerase (Thermo Scientific), 1 unidade^L da enzima Taq polimerase (Thermo Scientific) e água destilada até completar um volume final de 50 \L.
Extracção e purificação de DNA a partir dos géis de agarose
[67] Para isolar em gel de agarose os produtos de PCR ou bandas de DNA resultantes de digestões com enzimas de restrição, utilizou-se o UlustraTM GFX PCR DNA & Gel Band Purification kit (GE Healthcare), pelo procedimento seguidamente descrito. Ligação ao vector pGEM
[68] A reacção de ligação ao vector pGEM-T Easy deu-se através da mistura de 3 \L da amostra de DNA (produto de PCR ou de digestões com enzimas de restrição), com 1 μL· do vector pGEM-T Easy (Promega), 5 de tampão da enzima DNA ligase 2X (Promega) e com 1 μL· de enzima DNA T4 Ligase (Promega), perfazendo um volume final de 10 μί. Esta reacção ocorreu à temperatura ambiente, durante a noite ou durante 1 hora e 30 minutos a 37 °C.
Confirmação dos transformantes por digestão com enzimas de restrição
[69] Após a reacção de ligação ao vector pGEM, transformou- se E. coli XL1 Blue com o produto da ligação. As células foram depois espalhadas em placas de LB/
Ampicilina/X-Gal IPTG e incubadas durante a noite a 37 °C. Os transformantes que apresentavam cor branca foram repicados para culturas líquidas de LB/Ampicilina e, posteriormente, fez-se a extracção do DNA plasmídico a partir de E. coli.
[70] A confirmação dos transformantes foi realizada por digestão com a enzima de
restrição EcoRI (Promega), tendo-se utilizado 7 μL· dos clones seleccionados, 2 μL· de tampão H 10X e 1 de EcoRI, perfazendo um volume final de 10 μί. A reacção ocorreu durante 2 a 3 horas, a 37 °C, tendo-se visualizado o resultado da digestão num gel de agarose com percentagem (p/v) apropriada.
Ligação ao vector pQE
[71] Os inseris resultantes das digestões com enzimas de restrição, realizadas neste
trabalho, foram inseridos no vector pQE através da mistura de 6 μί de inseri com 2 \L de vector pQE, 1 μL· de tampão ligase 10X (Promega) e 1 μί da enzima DNA T4 Ligase (Promega). Esta reacção ocorreu à temperatura ambiente, durante a noite ou durante 1 hora e 30 minutos a 37 °C.
[72] Após a ligação do inseri ao vector pQE, transformou- se E. coli Ml 5 [pREP4] com o produto da ligação. As células foram depois espalhadas em placas de LB/
Ampicilina/Kanamicina e incubadas durante a noite a 37 °C. Os transformantes obtidos foram repicados para culturas líquidas de LB/Ampicilina/Kanamicina e, posteriormente, fez-se a extracção do DNA plasmídico a partir de E. coli.
[73] A confirmação dos transformantes foi realizada por digestão com as enzimas de restrição Kpnl e BamHI (Promega), quer no caso dos controlos negativos da avaliação da expressão proteica, pQECP12, pQEIL5 e pQETgOWP, quer no caso das construções com o antigénio recombinante Fh8ou com o fragmento H.
[74] Em primeiro, realizou-se a digestão com Kpnl, misturando 26 μί de DNA, 3 μί de tampão J (Promega) e 1 μί de Kpnl (Promega), perfazendo um volume final de 30 μί. Analisou-se 10 μL· desta digestão em gel de agarose e procedeu-se à segunda digestão dos 20 μί resultantes com BamHI, na qual de misturou 2 μL· de tampão K 10X (Promega) e 1 μΐ^ de BamHI (Promega). O resultado da digestão foi visualizado em gel de agarose com percentagem (p/v) apropriada.
Sequenciação das construções realizadas
[75] Todas as construções realizadas, com as inserções nos vectores pGEM e pQE, foram confirmadas por sequenciação na Eurofins MWG Operon (Alemanha).
Análise da expressão das construções com o antigénio recombinante/ fragmento H, em condições desnaturantes
[76] Procedeu-se à preparação de uma pré-cultura de 200 ml que se colocou a crescer durante a noite a 37 °C com agitação e induziu-se 2 litros de cultura colocando 100 ml da cultura saturada e 900 ml de meio LB contendo 100 μg/ml de Ampicilina, 50 μg/ml de Kanamicina e 1 mM de IPTG. Após 5 horas de incubação procedeu-se à recolha das células centrifugando 20 minutos a 4000 rpm a 4 °C. A lise celular deu-se por incubação das células com 40 mL de tampão ureia 8 M, pH 8.0, deixando-se em agitação durante a noite. Centrifugou-se o extracto a 13000 rpm durante 15 minutos a temperatura ambiente e recolheu-se o sobrenadante. Após recuperação do so- brenadante, filtrou-se o mesmo por coluna de lã de vidro e aplicou-se na coluna de Ni- NTA (Amersham Biosciences), pré-equilibrada com ureia 8M, pH 8.0.
[77] Depois do sobrenadante ter passado na coluna pela acção da gravidade, esta foi
lavada com 5 CV (volumes da coluna) de tampão ureia 8 M, pH 8.0, seguidos de 5 CV de tampão ureia 8 M com 10% de glicerol, pH 6.5. A eluição deu-se com tampão ureia 8 M, pH 4.5, tendo-se recolhido fracções de 4 mL.
[78] As fracções eluídas foram quantificadas pelo método de Bradford e analisadas em gel de SDS-PAGE Tris-Tricina, tal como se encontra descrito seguidamente.
Quantificação proteica
[79] A quantificação proteica foi realizada pelo método de Bradford, com o reagente
Protein Assay (BioRad) diluído 1:5, tendo-se lido a densidade óptica a um comprimento de onda de 595 nm. A curva de calibração foi obtida através da leitura da densidade óptica, a 595 nm, de soluções de concentração conhecida da albumina sérica bovina (BSA) com este reagente.
Electroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE Tris-Tricina
[80] Os géis Tris-Tricina usados para analisar as fracções recolhidas basearam-se nos sistemas Tris-Tricina de Schagger, H. e Jagow, G. (1987) e SDS-PAGE de Laemmli (1970). Desta forma, o sistema adoptado era constituído por dois géis: um gel re- solvente de 15 % e um gel de empacotamento de 4 %. O gel resolvente continha 3,3 mL de acrilamida 30 %, 2,205 mL de tampão de gel, 705 de glicerol, 367,5 μί de água, 150 μί de PSA4 10 % e 9 μί de TEMED. O gel de empacotamento continha 700 μί de acrilamida 30 %, 1,25 mL de tampão de gel, 3 mL de água, 200 μί de PS A 10 % e 5 de TEMED.
[81] O sistema de electroforese usado era constituído por dois reservatórios, superior (junto dos géis) e inferior, nos quais foi colocado tampão de cátodo e tampão do ânodo, respectivamente. Aplicou-se uma diferença de potencial (ddp) de 100 V para o gel de empacotamento e uma ddp de 150 V para o gel resol vente.
[82] As amostras (em condições nativas ou desnaturantes), antes de serem aplicadas no gel, foram tratadas com tampão de amostra Tris-Tricina IX. As amostras em condições nativas foram ainda colocadas no banho a 100 °C, durante 2 minutos, ficando depois a 4 °C até serem carregadas no gel.
[83] Os géis foram corados com Coomassie Blue e descorados com uma solução de- scorante.
Exemplos
[84] O antigénio recombinante em estudo neste trabalho caracteriza- se por apresentar uma boa expressão e pode ser facilmente isolado através de cromatografia de troca iónica.
[85] As estratégias apresentadas de seguida tiveram como ponto de partida estas
premissas, escolhendo-se três fragmentos (IL5, CP12 e TgOWP) para avaliar o aumento de expressão com a adição do fragmento H ou da proteína contendo este fragmento.
Exemplo 1 - Obtenção das construções HCP12 e HIL5
[86] Para a obtenção destas construções procedeu-se numa primeira fase à obtenção do fragmento H. Procedeu-se à realização de um PCR com os primers H e Fh8Rev (ver Tabela 1). O primer H permite a incorporação de um local para digestão da Saci após o codão do 11 aminoácido do Fh8. Esse produto de PCR foi isolado e digerido com a enzima de restrição Saci. Procedeu-se então ao isolamento do fragmento N-terminal digerido com Saci (fragmento H).
[87] Numa segunda fase procedeu-se à amplificação dos fragmentos IL5 (primers IL5Sac e IL5Kpn) e CP12 (primers CP12Sac e CP12Kpn) usando como moldes, respectivamente, DNA genómico (DNAg) humano e DNAg de Cryptosporidium parvum isolados. Após isolamento dos produtos de PCR procedeu-se à digestão com Saci e respectivo isolamento dos fragmentos digeridos com Sac.
[88] Procedeu-se à preparação de ligações entre o fragmento H digerido com Sac e os fragmentos IL5 e CP12 digeridos com Saci. Procedeu-se de seguida à obtenção do fragmento HIL5 por PCR usando como molde essa ligação e como primers: Primer H e primer IL5Kpn. Para a obtenção do fragmento HCP12 procedeu-se de forma semelhante usando o primer H e o primer CP12 Kpn. Estes fragmentos foram sub- clonados no vector pQE30 usando as enzimas de restrição BamHI e Kpnl.
Exemplo 2- Obtenção da construção HTgOWP: [89] Para a obtenção de HTgOWP, digeriu-se o vector pQEHCP12 com Kpnl e Saci, removendo desta forma o fragmento CP 12 do vector, ficando com pQE30 H.
[90] O fragmento TgOWP foi produzido por PCR, usando como sequência molde DNAg de Toxoplasma gondii e os primers TgOWPSac e o primer TgOWPKpn.
[91] A reacção de PCR possibilitou a adição dos locais de restrição das enzimas Saci e
Kpnl à sequência molde de DNA de TgOWP. Este produto foi então purificado em gel de agarose e ligado ao vector pGEM. Procedeu-se então à digestão com as enzimas de restrição Kpnl e Saci e isolamento do fragmento TgOWP digerido com Saci e Kpnl. Este fragmento foi ligado ao vector pQE30H digerido com Saci e Kpnl de forma a obter-se a construção pQEHTgOWP.
[92] Este fragmento foi ligado ao vector pQE30H digerido com Saci e Kpnl de forma a obter-se a construção pQEHTgOWP.
Exemplo 3 - Obtenção das construções pQECP12, pQEIL5 e pQETgOWP:
[93] Os vectores contendo o fragmento H (pQEHCP12, pQEHIL5 e pQEHTgOWP) foram usados para a construção dos respectivos controlos negativos. Sendo assim, usou-se os fragmentos HCP12, HIL5 e HTgOWP como ponto de partida para a obtenção dos controlos negativos.
[94] Como se procedeu da mesma forma para os três vectores, apresenta-se de seguida o exemplo de obtenção do vector recombinante pQECP12.0 vector pQEHCP12 foi digerido com a enzima Saci e posteriormente purificado em gel de agarose.
[95] Depois de purificado, o vector pQEHCP12 foi também digerido com a enzima de restrição EcoRI, presente na sequência do vector pQE30. Esta digestão permitiu a remoção do fragmento H e de uma pequena parte do vector pQE30. Procedeu-se à purificação em gel de agarose dos vectores pQEHCP12, pQEHIL5 e pQEHTgOWP digeridos com as enzimas de restrição Saci e EcoRI para posteriormente receberem um fragmento da digestão do vector pQE30 vazio. Para tal, foi necessário proceder à digestão deste vector com as mesmas enzimas de restrição, Saci e EcoRI. A banda de menor peso molecular obtida, que correspondia à pequena parte do vector pQE30 entre os locais de restrição de EcoRI a Saci (cerca de 70 pb) foi purificada em gel de agarose e ligada ao pQE30 com o fragmento CP 12 obtido anteriormente, de modo a formar o vector pQECP12. O vector pQECP12 foi depois transformado em E. coli Ml 5
[pREP4].
Exemplo 4- Obtenção das construções pQEFh8CP12 e pQEFh8IL5:
Obtenção do fragmento Fh8RSac.
[96] O fragmento Fh8RSac foi obtido a partir da alteração por PCR de uma sequência molde de Fh8 e usando os primers Fh8For e Fh8RSac, onde se adicionou o local de restrição da enzima Saci antes do codão de terminação do Fh8. O produto da reacção de PCR foi depois purificado em gel de agarose e ligado ao vector pGEM.
[97] O produto de PCR obtido foi então digerido com a enzima de restrição Saci, tendo-se obtido um fragmento Fh8RSac digerido com a enzima Saci. Este fragmento foi posteriormente purificado através de um gel de agarose e utilizado para fazer a ligação aos fragmentos CP12 e IL5 digeridos com a enzima Saci.
Obtenção dos fragmentos Fh8CP12 e Fh8IL5
[98] Tal como já foi referido anteriormente, os fragmentos CP12 e IL5 foram obtidos por uma estratégia semelhante, a partir de uma reacção de PCR, na qual se adicionaram os locais de restrição de Saci e Kpnl. Após a amplificação de IL5 ou CP12, estes fragmentos foram digeridos com a enzima de restrição Saci e ligados ao fragmento Fh8RSac, também previamente digerido com Saci. Procedeu-se de seguida à obtenção do fragmento Fh8CP12 usando a ligação Fh8CP12 como molde e os primers Fh8For e CP12Kpn. De igual modo procedeu-se à obtenção do fragmento Fh8IL5 usando a ligação Fh8IL5 como molde e os primers Fh8For e IL5Kpn.Procedeu-se ao isolamento dos fragmentos de PCR e subclonagem inicialmente no vector pGEM e posteriormente no vector pQE.
Análise da expressão do antigénio recombinante através da coluna de Ni- NTA, em condições desnaturantes.
[99] As proteínas IL5, HIL5, Fh8IL5,CP12, HCP12, Fh8CP12, TgOWP e HTgOWP, foram expressas em E. coli Ml 5 [pREP4], tendo-se feita a sua avaliação em culturas de 2 L com meio LB e respectivos antibióticos. As proteínas IL5, CP 12 e TgOWP foram usadas como controlo negativo da análise da expressão proteica das respectivas proteínas de fusão. Todas as culturas foram induzidas com 1 mM de IPTG durante 5 horas, a 37 °C, tendo-se preparado os extractos celulares e analisado as fracções solúveis em condições desnaturantes (ureia 8 M) através de colunas de Ni-NTA (Amersham Biosciences).
[100] A expressão das proteínas de fusão e dos respectivos controlos negativos foi quantificada pelo método de Bradford e avaliada em géis de SDS-PAGE Tris-Tricina. Quantificação da expressão proteica.
[101] A quantificação da expressão proteica foi efectuada pelo método de Bradford, en- contrando-se apresentados nas Figuras 3,4 e 5, os níveis de expressão proteica entre as proteínas de fusão, HIL5 e HCP12 - Fh8CP12 e Fh8IL5, e respectivos negativos, IL5 e CP12.
[102] A expressão de HIL5 (1,22 mg/L) foi aproximadamente 6 vezes superior à do respectivo controlo negativo, IL5 (0,2 mg/L). Este aumento tornou-se ainda mais significativo no caso da fusão de IL5 com o Fh8, onde a expressão (3,2 mg/L) foi aproximadamente 16 vezes superior à obtida para o respectivo controlo negativo, IL5. [103] A fusão de CP12 com o fragmento H do antigénio recombinante (1,21 mg/L) resultou numa expressão proteica 3 vezes maior do que a expressão obtida com o respectivo controlo negativo, CP12 (0,44 mg/L). Este aumento tornou-se ainda mais significativo no caso da fusão de CP12 com o Fh8, onde a expressão (3,94 mg/L) foi aproximadamente 9 vezes superior à obtida para o respectivo controlo negativo, CP 12. A proteína de fusão Fh8CP12 apresentou uma expressão proteica 3 vezes maior que a proteína de fusão HCP12.
[104] As proteínas que serviram de controlo negativo, IL5 e CP 12, são proteínas que em condições normais (sem adição de parte ou totalidade do antigénio recombinante) não são produzidas de forma solúvel em E. coli, podendo ser dirigidas para corpos de inclusão aquando do seu refolding (Proudfoot et al., 1990; Yao et ah, 2006).
[105] Para além disso, as sequências usadas neste trabalho correspondem a uma pequena parte das proteínas IL5 e CP 12, tornando ainda mais difícil a sua estabilização aquando do refolding das mesmas. Os valores de expressão obtidos para estas proteínas encontram-se abaixo do limite de solubilidade (normalmente entre 0,5 a 1 mg/L), realçando a difícil expressão solúvel.
[106] A adição do fragmento H ou da totalidade do antigénio recombinante estabiliza os fragmentos de IL5 e CP12 e provoca um aumento da sua expressão. Mais impressionante que esse aumento de expressão, são as alterações que ocorrem ao nível da célula que levam à passagem de uma estrutura insolúvel para uma outra solúvel.
[107] A expressão da proteína de fusão HTgOWP (3,68 mg/L) foi aproximadamente 6 vezes superior à expressão do controlo negativo, TgOWP (0,64 mg/L). Esta proteína possui uma expressão que se situa no limite de solubilidade. No entanto, o que importa salientar é o aumento considerável da expressão introduzido pela adição do fragmento H. Este fragmento, tal como aconteceu com IL5 e CP 12, vai estabilizar a proteína, levando à sua produção solúvel. Dado que a produção de TgOWP com a adição do fragmento H atingiu níveis de expressão elevados, não se justifica a necessidade de adição de TgOWP com a sequência do antigénio recombinante (Fh8).
[108] A expressão proteica com o antigénio recombinante foi também avaliada por electroforese (Figuras 3, 4 e 5) em condições desnaturantes (SDS-PAGE Tris-Tricina). Sequence List Text
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<160> 4
<170> Patentln version 3.5
<210> 1
<211> 69
<212> PRT
<213> Fasciola hepática
<400> 1
Met Pro Ser Val Gln Glu Val Glu Lys Leu Leu His Val Leu Asp Arg 1 5 10 15
Asn Gly Asp Gly Lys Val Ser Ala Glu Glu Leu Lys Ala Phe Ala Asp 20 25 30
Asp Ser Lys Cys Pro Leu Asp Ser Asn Lys lie Lys Ala Phe lie Lys 35 40 45
Glu His Asp Lys Asn Lys Asp Gly Lys Leu Asp Leu Lys Glu Leu Val 50 55 60
Ser lie Leu Ser Ser
65
<210> 2
<2l l> 11
<212> PRT
<213> Fasciola hepática
<400> 2
Met Pro Ser Val Gln Glu Val Glu Lys Leu Leu
1 5 10
<210> 3
<2l l> 190
<212> PRT
<213> Fasciola hepática
<400> 3
Met Thr Thr Ala Tyr Lys Leu His Asp Val Glu Ser Leu lie Asp Trp 1 5 10 15
Phe Met Glu Leu Asp Lys Asn Asn Asp Glu Ala Val Asp Lys Lys Glu 20 25 30
Leu Thr Ala Tyr Tyr Lys Ser Lys Gly Val Ser Asp Ser Lys lie Asn 35 40 45
Glu Trp Met Glu His Phe Asp Ala Asp Ser Asp Gly Lys lie Thr Leu 50 55 60 [152] Met Glu Phe Cys Arg Gly Leu Gly Leu Arg lie Asp Glu Val Arg Val
[153] 65 70 75 80
[154] Glu Gln Lys Gln Pro Pro Leu Gln Arg Ala Gly Thr Ala Pro Ala Leu
[155] 85 90 95
[156] Gly Thr Asp lie Glu Met lie Ala Thr Thr Met Ser Gln Pro Arg Gln
[157] 100 105 110
[158] Val Glu Val Thr Glu Lys Phe Lys Ser Leu Val Thr Ala His Asn Gly
[159] 115 120 125
[160] Lys Asp Glu Glu Met Lys Asp Val Ala His Glu Leu Lys Thr Phe Leu
[161] 130 135 140
[ 162] Asp Asp Thr Tyr Gly Arg Val Trp Gln Cys Val lie Leu Thr Gly Ser
[163] 145 150 155 160
[ 164] Tyr Trp Met Gln Phe Ser His Glu Pro Phe Leu Ser lie Gln Phe Arg
[165] 165 170 175
[166] Tyr Gly Arg Tyr lie Cys Leu Ala Trp Arg Thr Pro Arg Gly
[167] 180 185 190
[168] <210> 4
[169] <211> 20
[170] <212> PRT
[171] <213> Fasciola hepática
[172] <400> 4
[173] Met Thr Thr Ala Tyr Lys Leu His Asp Val Glu Ser Leu lie Asp Trp
[174] 1 5 10 15
[175] Phe Met Glu Leu
[176] 20

Claims

Claims
Uma proteína de fusão caracterizada pelo facto de compreender uma sequência de aminoácidos idêntica ou 90 a 95% estruturalmente semelhante ao fragmento H ou às proteínas de ligação ao cálcio excretadas-secretadas pelo verme adulto de Fasciola hepática, seguida de uma sequência de aminoácidos correspondente a um fragmento proteico ou proteína não relacionada. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de o fragmento H corresponder a um fragmento estruturalmente semelhante ao N-terminal de 11 aminoácidos da proteína Fh8,SEQ ID NO 2.
Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de o fragmento H corresponder ao fragmento estruturalmente semelhante ao N-terminal de 20 aminoácidos da proteína Fh22, SEQ ID NO 4.
Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de a sequência de aminoácidos correspondente a uma proteína de ligação ao cálcio ser estruturalmente semelhante à excretada-secretada pelo verme adulto de Fasciola hepática ser de Fh8, SEQ ID NO 1.
Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de a sequência de aminoácidos correspondente a uma proteína de ligação ao cálcio ser estruturalmente semelhante à excretada-secretada pelo verme adulto de Fasciola hepática ser de Fh22, SEQ ID NO 3).
Proteína de fusão de acordo com as reivindicações anteriores caracterizada por a adição dos tags de fusão à proteína não relacionada ser feita na posição N ou C-terminal.
Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de a sequência de aminoácidos correspondente a um fragmento proteico ou proteína não relacionada ser de CP 12. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de a sequência de aminoácidos correspondente a um fragmento proteico ou proteína não relacionada ser de IL5.
Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de a sequência de aminoácidos correspondente a um fragmento proteico ou proteína não relacionada ser de TgOWP. Um vector de expressão caracterizado pelo facto de compreender uma sequência polinucleotídica que codifica a proteína de fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8.
Uma célula hospedeira caracterizada pelo facto de compreender o vector de expressão de acordo com a reivindicação 10.
Um processo para a preparação de proteínas de fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo facto de se cultivar uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 11 em condições apropriadas à expressão da proteína de fusão e se isolar a proteína de fusão.
Utilização da proteína de fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9 para a produção de proteínas ou fragmentos proteicos adicionados em sistemas de expressão de proteínas re- combinantes.
Utilização de um fragmento H ou proteínas de ligação ao cálcio excretadas-secretadas pelo verme adulto de Fasciola hepática para a produção de proteínas recombinantes.
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