RU2658758C1 - Рекомбинантная плазмида для экспрессии в дрожжах Pichia pastoris гена химерного белка ангиогенина человека и штамм дрожжей Pichia pastoris - продуцент рекомбинантного химерного белка ангиогенина человека - Google Patents
Рекомбинантная плазмида для экспрессии в дрожжах Pichia pastoris гена химерного белка ангиогенина человека и штамм дрожжей Pichia pastoris - продуцент рекомбинантного химерного белка ангиогенина человека Download PDFInfo
- Publication number
- RU2658758C1 RU2658758C1 RU2017134047A RU2017134047A RU2658758C1 RU 2658758 C1 RU2658758 C1 RU 2658758C1 RU 2017134047 A RU2017134047 A RU 2017134047A RU 2017134047 A RU2017134047 A RU 2017134047A RU 2658758 C1 RU2658758 C1 RU 2658758C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- ang
- protein
- human angiogenin
- angiogenin
- recombinant
- Prior art date
Links
- 101000757236 Homo sapiens Angiogenin Proteins 0.000 title claims abstract description 58
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 56
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 49
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 title claims abstract description 36
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims abstract description 27
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 10
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 10
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title abstract description 10
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title abstract description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 38
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 16
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 10
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 102100022987 Angiogenin Human genes 0.000 claims description 36
- 108010072788 angiogenin Proteins 0.000 claims description 36
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 22
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 18
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 17
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 13
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 13
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 claims description 11
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 claims description 11
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 8
- 102100036826 Aldehyde oxidase Human genes 0.000 claims description 7
- 101000928314 Homo sapiens Aldehyde oxidase Proteins 0.000 claims description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 7
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 6
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 6
- 101000582398 Staphylococcus aureus Replication initiation protein Proteins 0.000 claims description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 4
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 claims description 3
- 108010007528 Cytochromes c1 Proteins 0.000 claims description 3
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 claims description 3
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical group C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 claims description 3
- 101150038738 ble gene Proteins 0.000 claims description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 3
- 101100010928 Saccharolobus solfataricus (strain ATCC 35092 / DSM 1617 / JCM 11322 / P2) tuf gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101150001810 TEAD1 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101150074253 TEF1 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 102100029898 Transcriptional enhancer factor TEF-1 Human genes 0.000 claims description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract description 7
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 33
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 28
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 14
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 6
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 4
- 210000001643 allantois Anatomy 0.000 description 4
- 210000003711 chorioallantoic membrane Anatomy 0.000 description 4
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 4
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 4
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 3
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 3
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 2
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000007073 chemical hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 101150061183 AOX1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241001506991 Komagataella phaffii GS115 Species 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108010079246 OMPA outer membrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-M deoxycholate Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-M 0.000 description 1
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011013 endotoxin removal Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000006455 gy-medium Substances 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000011837 pasties Nutrition 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к генной инженерии и биотехнологии и может быть использовано для получения химерного белка ангиогенина человека. Предложена рекомбинантная плазмида pPICZaA:ZZ_ANG, содержащая синтетический ген химерного белка ангиогенина человека (SEQ ID NO: 1), состоящего из аминокислотной последовательности двух IgG-связывающих доменов белка A (SEQ ID NO: 2) и ангиогенина человека (SEQ ID NO: 3), соединенных между собой пептидным линкером (SEQ ID NO: 4). Плазмида имеет размер 4228 п.о. Предложен штамм дрожжей Pichia pastoris X-33/pPICZaA:ZZ-ANG, являющийся продуцентом рекомбинантного химерного белка ангиогенина человека ZZ-ANG и полученный путем трансформации дрожжей Pichia pastoris X-33 линеаризованной плазмидой pPICZaA:ZZ-ANG. Группа изобретений обеспечивает получение активного рекомбинантного химерного ангиогенина человека, секретируемого в культуральную среду с высоким выходом. 2 н.п. ф-лы, 4 ил., 5 пр.
Description
Рекомбинантная плазмида для экспрессии в дрожжах Pichia pastoris гена химерного белка ангиогенина человека и штамм дрожжей Pichia pastoris - продуцент рекомбинантного химерного белка ангиогенина человека
Изобретение относится к биотехнологии и касается штамма дрожжей Pichia pastoris - продуцента химерного белка ангиогенина человека и рекомбинантной плазмиды, которой трансформирован этот штамм. Посредством представленного изобретения может быть получен рекомбинантный химерный белок - ангиогенин человека, слитый с IgG-связывающим доменом белка А стафилококка, секретируемый в культуральную среду.
Ангиогенин, или РНКаза 5 - это растворимый секретируемый негликозилированный белок с молекулярной массой 14 кДа, состоящий из 124 аминокислотных остатков. Он играет важную роль в ангиогенезе, стимулируя эндотелиальные клетки к образованию новых сосудов. Ангиогенин вызывает большой интерес как полифункциональный терапевтический белок, в частности, его применяют для лечения ран, ожогов, а также при заболеваниях, связанных с нарушением кровообращения (1, 2).
Получение штаммов-продуцентов ангиогенина человека и его химерных форм пролонгированного действия методами генной инженерии является наиболее подходящим способом производства данного белка в промышленных масштабах.
Известен метод получения рекомбинантного ангиогенина человека путем химического гидролиза химерного рекомбинантного полипептида, состоящего из фрагмента β-галактозидазы, слитого с белком ангиогенина человека. Химерный полипептид получают в клетках Escherichia.coli. в виде телец включения. Рекомбинантный ангиогенин, полученный после химического гидролиза, ренатурируют с восстановлением вторичной и третичной структуры [ЕР 0292763, дата приоритета 19.05.1988]. Недостатком этого способа получения ангиогенина является большая трудоемкость и низкий выход целевого белка.
Известен синтетический ген белка ангиогенина человека, оптимизированный по встречаемости кодонов в клетках Е. coli. Рекомбинантный ангиогенин нарабатывается в нерастворимой форме в телах включения, активную форму ангиогенина человека получают ренатурацией с восстановлением вторичной и третичной структуры белка [FR 2610324, дата приоритета 29.01.1987]. Недостатком этого способа является малый размер получаемого рекомбинантного белка и, следовательно, короткое время полужизни при введении в организм человека.
Известны два штамма Е. coli - продуцента химерных форм рекомбинантного белка ангиогенина человека: «ангиогенин- β-галактозидаза» и «IgG связывающий домен белка А - ангиогенин». Штаммы получены путем клонирования синтетического гена ангиогенина человека в составе нескольких экспрессирующих бактериальных векторов и трансформации ими штамма Е. Coli JM103 (3). Известен штамм-продуцент Е. coli VL1222p R AngT (ВКПМ B-6895), продуцирующий свободный ангиогенин (4).
Недостатками указанных бактериальных штаммов-продуцентов является низкий выход рекомбинантного ангиогенина, который составляет 2 мг/л, что эквивалентно 0,02% суммарного клеточного белка (5).
Известна бактериальная рекомбинантная плазмида pJZZ-A, наиболее близкая заявляемой рекомбинантной плазмиде. Бактериальная рекомбинантная плазмида pJZZ-A содержит синтетический химерный ген ангиогенина человека, состоящий из 5'-концевого фрагмента, кодирующего N-концевую аминокислотную последовательность двух IgG-связывающих доменов (ZZ) белка A Staphylococcus aureus, и 3'-концевого фрагмента, кодирующего С-концевую аминокислотную последовательность ангиогенина человека [RU 2512527, дата приоритета 10.07.2012].
Бактериальный штамм-продуцент рекомбинантного химерного ангиогенина белка Escherichia coli BL21(DE3)/pJZZ-А, полученный с помощью бактериальной плазмиды pJZZ-A, обеспечивает высокий выход химерного ангиогенина человека в клетках Е. Coli - 500 мг на 5 г биомассы, или 10% от суммарного клеточного белка. Высокий выход химерного белка ангиогенина достигается благодаря использованию в указанной рекомбинантной плазмиде pJZZ-A ориджина репликации pUC, который обеспечивает увеличенное количество копий плазмиды в клетке, а также благодаря оптимизированной по встречаемости кодонов в клетках E. coli нуклеотидной последовательности синтетического гена химерного ангиогенина.
В заявляемой плазмиде pPICZαA:ZZ-ANG использован такой же состав синтетического гена ZZ_ANG, как и в прототипе pJZZ-A, однако, в отличие от бактериальной плазмиды, синтетический ген заявляемой плазмиды pPICZαA:ZZ-ANG имеет другую нуклеотидную последовательность (состав кодонов), и адаптирован для экспрессии в дрожжах Pichia pastoris.
Недостатком бактериальных продуцентов является то, что ангиогенин накапливается в клетка Е. Coli в виде тел включения. Чтобы обеспечить функциональную активность рекомбинантного ангиогенина из тел включения, требуется трудоемкая процедура ренатурации и рефолдинга белка, после которой, как правило, все равно возникают проблемы с растворимостью.
Известен способ получения растворимого рекомбинантного ангиогенина в клетках Е. Coli с использованием вектора pTED, который содержит последовательность сигнала секреции Е. Coli OmpA (б). Выход рекомбинантного ангиогенина (свободная форма) составил около 50 мг/л после 72 часов культивирования. Однако в работе не показана ангиогенная активность полученного белка, что связано, вероятно, с отсутствием правильного процессинга в клетках Е. Coli.
Кроме того, рекомбинантные белки, получаемые в клетках Е. Coli, загрязнены эндотоксинами (липополисахаридами), остаточные количества которых вызывают серьезные побочные эффекты в организме человека (7, 8), поэтому рекомбинантный ангиогенин, получаемый в Е. Coli, требует дополнительной стадии очистки.
Экспрессия чужеродных генов в метилотрофных дрожжах Pichia pastoris позволяет получать не загрязненные эндотоксинами рекомбинантные белки с более высоким выходом, чем в клетка Е. Coli. Поскольку дрожжи Pichia pastoris являются эукариотами, они производят растворимые белки, обеспечивая фолдинг и посттрансляционные модификации, необходимые для функциональной активности белка (9). Поэтому получение рекомбинантного ангиогенина человека в системе экспрессии Pichia pastoris является наиболее привлекательным методом.
Наиболее близким к заявляемому штамму-продуценту (прототипом) является штамм дрожжей Pichia pastoris - продуцент секретируемого ангиогенина человека (10). Ген ангиогенина человека (378 пар оснований) клонирован в составе плазмиды pPIC9 по сайтам EcoRI и NotI в рамке считывания с ATG кодоном альфа-сигнала секреции. Экспрессия гена ангиогенина человека в составе полученной рекомбинантной плазмиды pPIC9-Ang находится под контролем промотора гена АОХ1, обеспечивающего активацию транскрипции в присутствии метанола в культуральной среде. Компетентные клетки Pichia pastoris GS115 были трансформированы при помощи электропорации плазмидой pPIC9-Ang, линеаризованной по сайту BglII. Полученные трансформанты проверяли на наличие секреции белка ангиогенина, выращивая клоны в 5 мл среды BMGY в течение 36 часов, затем проводили индукцию, добавляя метанолом до концентрации 1% каждые 24 часа в течение 120 часов. Позитивные трансформанты обеспечивали секрецию рекомбинантного ангиогенина в культуральную среду, концентрация белка в супернатанте составляла 50 мг/л. По результатам электрофоретического анализа молекулярный вес рекомбинантного ангиогенина соответствовал ожидаемому (14,4 кДа). Были подобраны оптимальные условия получения белка в колбах на качалке: температура 29°С, скорость качания 290 об/мин, время индукции 72 часа. Содержание рекомбинантного ангиогенина в супернатанте составляло 70% от общего количества секретируемых белков. После очистки при помощи ионообменной хроматографии на SP сефарозе был получен рекомбинантный ангиогенин с выходом 30 мг на 1 л культуры.
С помощью теста на хориоаллантоисной оболочке (ХАО) куриного эмбриона было установлено, что указанный рекомбинантный ангиогенин обладает специфической ангиогенной активностью.
Недостатком указанного метода является низкий выход белка - 30 мг/л. Кроме того, для терапевтического применения малый размер рекомбинантного полипептида (126 аминокислотных остатков) будет являться недостатком из-за короткого времени полужизни белка.
Технический результат заявляемой группы изобретений заключается в увеличении выхода секретируемого химерного белка ангиогенина человека в системе экспрессии Pichia pastoris.
Технический результат достигается путем конструирования рекомбинантной плазмиды pPICZαA:ZZ-ANG, обеспечивающей биосинтез и секрецию химерного белка ангиогенина человека ZZ-ANG (SEQ ID NO: 1), состоящего из аминокислотной последовательности двух IgG-связывающих доменов белка A (SEQ ID NO: 2) и ангиогенина человека (SEQ ID NO: 3), соединенных между собой пептидным линкером (SEQ ID NO: 4), имеющая размер 4228 п.о. и состоящая из следующих элементов (Фиг. 1):
а) AOX1 promoter - 5'-концевая область промотора алкоголь оксидазы: 1-940;
б) Alpha factor signal peptide - участок, кодирующий N-концевой сигнальный пептид из Saccharomyces cerevisiae: 941-1207;
в) ZZ - 5'-концевой фрагмент синтетического гена ZZ_ANG, кодирующий аминокислотную последовательность двух IgG-связывающих доменов (ZZ) белка A Staphylococcus aureus: 1214 - 1567 п.о.;
г) Link - фрагмент, кодирующий аминокислотную последовательность линкера, связывающего последовательность IgG связывающей области ZZ белка А из Staphylococcus aureus и последовательность ангиогенина человека: 1568 - 1573 п.о.;
д) ANG - 3'-концевой фрагмент синтетического гена ZZ_ANG, кодирующий аминокислотную последовательность ангиогенина человека: 1574 - 1945 п.о.;
е) AOX1 transcription terminator - терминатор транскрипции: 1973-2317 п.о.;
ж) TEF1 promoter - эукариотический промотор: 2318-2729 п.о.;
з) ЕМ7 promoter - бактериальный промотор: 2730-2797 п.о.;
и) Zeo(R) - ген Sh ble устойчивости к селективному антибиотику зеоцину: 2798-3172 п.о.;
к) CYC1 transcription terminator - терминатор транскрипции гена цитохрома С1: 3173-3490 п.о.;
л) pUC origin - бактериальная точка начала репликации pUC: 3501 - 4174 п.о.
Технический результат также достигается получением штамма дрожжей Pichia pastoris X-33/pPICZαA:ZZ-ANG - продуцента рекомбинантного химерного белка ангиогенина человека ZZ-ANG, состоящего из аминокислотной последовательности двух IgG-связывающих доменов белка A (ZZ) и ангиогенина человека (ANG), соединенных между собой пептидным линкером, путем трансформации дрожжей Pichia pastoris Х-33 линеаризованной плазмидой pPICZαA:ZZ-ANG.
Для получения рекомбинантной плазмиды pPICZαA:ZZ-ANG сначала был спроектирован химерный синтетический ген ZZ-ANG, кодирующий химерный белок ангиогенина человека. Ген ZZ-ANG состоит из 5'-концевого фрагмента, кодирующего аминокислотную последовательность двух IgG-связывающих доменов (ZZ) белка A Staphylococcus aureus, связанного через последовательность, кодирующую пептидный линкер аспарагин/серин, с геном ангиогенина человека.
Далее проводится оптимизация нуклеотидной последовательности синтетического гена по составу кодонов, для экспрессии в дрожжах Pichia pastoris. Оптимизацию кодонового состава осуществляют с использованием компьютерной программы «Gene designer» ("DNA 2.0", США) удаляя при этом ненужные сайты рестрикции путем синонимических замен. Кроме этого, используют синонимические замены наиболее часто встречаемых пар кодонов в геноме Pichia pastoris, так как в соответствующих участках затормаживается трансляция мРНК (11).
Нуклеотидная последовательность полученного химерного гена ZZ-ANG указана в SEQ ID NO 1, его синтез осуществляют в составе плазмиды pMK-RQ:ZZ_ANG.
Рекомбинантную плазмиду pPICZαA:ZZ-ANG получают, проводя лигирование фрагмента плазмиды pPICZαA, гидролизованной рестриктазами EcoRI и Sall, и фрагмента ампликона химерного гена ZZ-ANG, полученного на матрице плазмиды pMK-RQ:ZZ_ANG, гидролизованного рестриктазами EcoRI и XhoI, при помощи ДНК-лигазы фага Т4, как в примерах 1 и 2.
Штамм дрожжей Pichia pastoris X-33/pPICZαA:ZZ-ANG - продуцент рекомбинантного химерного белка ангиогенина человека ZZ-ANG, получают путем трансформации компетентных клеток нативного штамма дрожжей Pichia pastoris Х-33 линеаризованной по сайту BstXI в области 5'-АОХ1 промотора плазмидой pPICZαA:ZZ-ANG методом электропорации, как в примере 3.
Биосинтез рекомбинантного химерного белка ангиогенина человека ZZ-ANG проводят в клетках заявляемого штамма дрожжей Pichia pastoris X-33/pPICZαA:ZZ-ANG при культивировании и последующей индукции метанолом, как в примерах 4 и 5.
Функциональную ангиогенную активность рекомбинантного химерного белка ангиогенина человека ZZ-ANG определяют с помощью теста на хориоаллантоисной мембране куриных эмбрионов, как в примере 4.
Предложенная группа технических решений позволяет значительно увеличить выход рекомбинантного ангиогенина в сравнении с прототипами и другими аналогами. При культивировании клеток рекомбинантного штамма Pichia pastoris X-33/pPICZαA:ZZ-ANG и последующей индукции метанолом в культуральную среду секретируется растворимый химерный ангиогенин человека с выходом около 200 мг на 1 л среды, при этом доля рекомбинантного ангиогенина по отношению к общему количеству секретируемых белков превышает 75%. Проверка ангиогенной активности с помощью теста на хориоаллантоисной мембране показывает, что полученный химерный ангиогенин человека обладает специфической ангиогенной активностью.
Достижение заявленного технического результата обусловлено следующим:
1. Получением рекомбинантного штамма дрожжей Pichia pastoris путем трансформации дрожжей Pichia pastoris Х-33 линеаризованной плазмидой pPICZαA:ZZ-ANG, что обеспечивает экспрессию гена химерного белка ангиогенина человека ZZ-ANG, а также секрецию и процессинг химерного белка, что позволяет получить растворимый, обладающий специфической активностью химерный ангиогенин человека.
2. Использованием в составе линеаризованной плазмиды pPICZαA:ZZ-ANG синтетического гена химерного белка ангиогенина человека, полученного с оптимизацией состава кодонов и с учетом синонимичных замен пар кодонов, наиболее часто встречаемых пар кодонов в геноме Pichia pastoris, приводящих к торможению трансляции мРНК в соответствующих участках, что в совокупности способствовало увеличению экспрессии гена химерного ангиогенина человека.
Сущность заявляемого изобретения далее поясняется на чертежах.
Фиг. 1 содержит физическую карту рекомбинантной плазмиды pPICZαA:ZZ_ANG.
АОХ1 promoter - 5'-концевая область промотора алкоголь оксидазы; Alpha factor signal peptide - участок, кодирующий N-концевой сигнальный пептид из Saccharomyces cerevisiae; ZZ - 5'-концевой фрагмент синтетического гена ZZ_ANG, кодирующий аминокислотную последовательность двух IgG-связывающих доменов (ZZ) белка A Staphylococcus aureus; Link - фрагмент, кодирующий аминокислотную последовательность пептидного линкера; ANG - 3'-концевой фрагмент синтетического гена ZZ_ANG, кодирующий аминокислотную последовательность ангиогенина человека; АОХ1 transcription terminator - терминатор транскрипции; TEFl promoter - эукариотический промотор; ЕМ7 promoter - бактериальный промотор; Zeo(R) - ген Sh ble устойчивости к зеоцину; CYC1 transcription terminator - терминатор транскрипции гена цитохрома C1; pUC origin - бактериальная точка начала репликации.
Фиг. 2. Физическая карта бактериальной плазмиды pMK-RQ:ZZ_ANG.
ZZ_ANG - синтетический ген химерного белка ангиогенина человека ZZ-ANG; Col E1 origin - точка начала репликации; Kan R - ген устойчивости к антибиотику канамицину.
Фиг. 3. Электрофореграмма белков культуральной жидкости, полученных при отборе рекомбинантных клонов штамма Pichia pastoris X-33/pPICZαA:ZZ-ANG. М - маркер молекулярных масс; 1-9 номера клонов.
Фиг. 4. Электрофореграмма очищенного препарата рекомбинантного химерного ангиогенина человека. М - маркер молекулярных масс; 1 препарат белка.
Осуществление изобретения пояснено на примерах.
Пример 1. Оптимизация нуклеотидной последовательности проектируемого синтетического гена химерного белка ангиогенина человека для его эффективной экспрессии в клетках P. pastoris. Клонирование синтетического гена апоА-I человека в составе плазмиды pMK-RQ:ZZ_ANG в клетках Е. coli. Оптимизированную нуклеотидную последовательность гена химерного белка ангиогенина человека получают путем синонимичных замен кодонов на наиболее часто встречаемые в геноме P. pastoris кодоны и удалением возникающих сайтов рестрикции при помощи программы Gene designer (DNA2.0 USA). Кроме того, производят синонимичную замену наиболее часто встречающихся пар кодонов, а именно TTCAAG/TTTAAG, AAGAAG/AAGAAA и TTTGAA/TTCGAA, при помощи собственной программы.
Также проверяют наличие в мРНК, кодируемой синтетическим геном, нежелательных участков вторичной структуры.
Синтетический ген химерного белка ангиогенина человека ZZ_ANG (SEQ ID NO 1) получают химическим синтезом, клонированным в составе бактериальной плазмиды pMK-RQ:ZZ_ANG, карта плазмиды представлена на Фиг. 2.
Пример 2. Получение рекомбинантной химерной плазмиды pPICZαA:ZZ_ANG.
Ампликона химерного гена ZZ-ANG получают методом ПЦР на матрице плазмиды pMK-RQ:ZZ_ANG с помощью высокоточной термостабильной полимеразы Phusion (Thermo scientific, USA). с прямым праймером 427 CAGAATTCGACAACAAGTTCAACAAAGAGC с достройкой 5'-концевого сайта рестрикции EcoRI и обратного праймера 428 CCGCTCGAGTCATGGTCTTCTGAAGATGGACTG с достройкой 3'-концевого сайта рестрикции XhoI. Ампликон выделяют экстракцией фенолом/хлороформом с последующим осаждением изопропанолом и гидролизуют рестриктазами EcoRI и XhoI. Полученный фрагмент очищают при помощи фенол/хлороформной экстракции и осаждают изопропанолом.
Плазмиду pPICZαA гидролизуют по сайтам рестрикции EcoRI и SalI, фрагмент плазмиды размером 3487 п.о. получают, выделяя из 0,8% агарозного гела при помощи набора Qiagen USA.
Полученные фрагменты лигируют с использованием Т4 ДНК лигазы (Сибэнзим, Россия) в амплификаторе «Терцик» в течение 12-ти часов по заданной программе при температуре, меняющейся циклически от 10°С до 30°С (12). Полученной лигазной смесью трансформировали клетки E. coli BL21 (DE3). Отбор клонов, содержащих рекомбинантную плазмиду pPICZαA:ZZ_ANG, проводили на агаризованной среде LB, содержащей 50 мкг/мл зеоцина. Наличие целевой ДНК-вставки определяли методом ПЦР колоний, с праймерами AOX1-F: GACTGGTTCCAATTGACAAGC и AOX1-R GCAAATGGCATTCTGACATCC, а также проводили рестрикционный анализ плазмид, выделенных из полученных клонов. Клон, содержащий плазмиду pPICZαA:ZZ_ANG, использовали для препаративной наработки.
Пример 3. Получение рекомбинантного штамма дрожжей Pichia pastoris X-33/pPICZαA:ZZ-ANG - продуцента рекомбинантного химерного белка ангиогенина человека.
Рекомбинантную плазмиду, полученную в примере 2, обрабатывают рестриктазой BstXI, находящейся в области АОХ1 промотора (Фиг. 1). При этом происходит встройка экспрессирующей кассеты, состоящей из гена устойчивости к зеоцину и синтетического гена химерного белка ангиогенина человека ZZ_ANG, который слит с находящимся в плазмиде pPICZαA:ZZ-ANG альфа-сигналом секреции, путем гомологичной рекомбинации. Таким образом, трансформанты, выросшие на агаризованной среде с селективным антибиотиком зеоцином, генетически стабильны как в присутствии, так и в отсутствие в среде культивирования селективного антибиотика (13).
Кроме того, отбор трансформантов на высоких концентрациях зеоцина (1000-2000 мкг/мл) позволяет отобрать клоны, в которых содержится несколько экспрессирующих кассет с геном устойчивости к зеоцину, таким образом, эти клоны должны продуцировать большее количество рекомбинантного белка (13).
Компетентные клетки Pichia pastoris Х-33 для электропорации получали по следующей методике: Выращивали 5 мл штамма Pichia pastoris Х-33 в среде YPD в 5 мл пробирке при 30°С в течение ночи; инокулировали 200 мл среды YPD в 1 литровой колбе 0,1-0,5 мл ночной культуры; выращивали в течение ночи до OD600 = 1.3-1.5; центрифугировали клетки при 1500 хд в течение 5 мин при +4°С (ЦФ) в центрифуге Beckman Allegra X-12R с ротором SX4750; промывали осадок в 200 мл ледяной (0°С) стерильной деионизованной воды; ЦФ; промывали осадок в 100 мл ледяной (0°С) стерильной деионизованной воды; ЦФ; промывали осадок в 8 мл ледяного (0°С) стерильного 1М сорбита; ЦФ; ресуспендировали осадок в 400 мкл ледяного (0°С) 1М сорбитола, получив конечный объем примерно 600 мкл. Клетки использовали в аликвотах по 4 0 мкл.
16 мкг плазмиды pPICZαA:ZZ-ANG гидролизовали 10 мкл рестриктазы BstXI в течение ночи, линеаризованную плазмиду очищали фенолом/хлороформом с последующим осаждением изопропанолом, растворяли в 10 мкл ТЕ буфера. К 4 0 мкл компетентных клеток, находящихся на льду, добавляли 10 мкл линейной плазмиды, инкубировали 2 мин при 0°С, клетки переносили в охлажденную 0,2 см кювету, прводили электропорацию при 2000 В, время импульса 5,3 мс, заливали в кювету 1 мл ледяной среды YPDS, клетки переносили в стерильный фалькон емкостью 15 мл инкубировали на качалке, 200 об/мин при 30°С в течение примерно 3-х часов. Высевали по 50, 100 и 200 мкл на чашки со средой YPD с концентрациями зеоцина 200 и 1000 мкг/мл. Чашки инкубировали при 30°С. На третьи сутки вырастали клоны, которые далее анализировали при помощи индукции синтеза рекомбинантного белка метанолом в 96-луночном глубоком планшете (объем лунок по 2 мл, квадратной формы. Axygen р - 2ml- sq- с) следующим образом: в лунки добавляли по 300 мкл среды BMGY, стерильной зубочисткой переносили часть колонии в лунки, при этом перекалывая этой же зубочисткой колонии на 2 чашки параллельно. Выращивали при 30°С на качалке, 300 об/мин в течение 60 часов, планшет при этом накрывали 2-мя слоями стерильной марли. Добавляли по 250 мкл среды ВММ2, инкубировали далее в течение 12 часов. Добавляли по 50 мкл среды ВММ10 через каждые последующие 24 часа. На третьи сутки индукции клетки осаждали центрифугированием при 3500 xg, белки из супернатантов концентрировали в 10 раз осаждением ТХУ (добавляли 1/100 объема 1,5 раствора дезоксихолата Na, инкубировали 10 мин при комнатной t, добавляли 1/10 исходного объема насыщенного раствора ТХУ, -20°С 10 мин, 16*103 об/мин 10 мин) с промывкой ацетоном. Электрофорез по Лэммли проводили в 13% полиакриламидном геле с последующим окрашиванием кумасси G250.
На Фиг. 3 представлена электофореграмма белков, секретируемых в культуральную жидкость рекомбинантными клонами Pichia pastoris X-33/pPICZαA:ZZ-ANG, которые выросли при концентрации зеоцина 1000 мкг/мл.
Полученный рекомбинантный штамм дрожжей Pichia pastoris X-33/pPICZaA:ZZ-ANG характеризуется следующими свойствами:
Морфологические и культуральные характеристики. При росте на агаризованной среде YPD колонии круглые, гладкие, блестящие, белые, диаметр колоний 1-5 мм; консистенция пастообразная. Рост в жидкой среде YPD характеризуется ровным помутнением.
Физиолого-биохимические характеристики. Клетки растут при температуре 10-30°С при рН 5,0-7,5 без признаков лизиса. В качестве источника азота используют как минеральные соли в виде смеси, так и органические соединения в виде пептона, дрожжевого экстракта, аминокислот. В качестве источника углерода используют глицерин, глюкозу, метанол.
Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к зеоцину (до 2000 мкг/мл), обусловленную внесением в геном при трансформации линеаризованной плазмидой pPICZαA:ZZ-ANG гена Sh-ble.
Продуктивность. Заявляемый штамм обеспечивает синтез рекомбинантного химерного белка ангиогенина человека ZZ-ANG в количестве 200 мг на литр культуральной среды при наработке белка, как в примере 4, по результатам электрофоретического анализа и замера концентрации белка.
Пример 4. Биосинтез и очистка рекомбинантного химерного белка ангиогенина человека ZZ-ANG из культуральной жидкости заявляемого штамма Pichia pastoris X-33/pPICZαA:ZZ-ANG.
Индивидуальную колонию клеток заявленного штамма дрожжей Pichia pastoris переносят в колбу с 25 мл среды GY (пептон 2%, дрожжевой экстракт 1%, глицерин 1%), выращивают на орбитальном шейкере при 25°С-30°С и 200-250 об/мин в течение 48 часов. После 2-х суток предварительного роста начинают индукцию метанолом, добавляя 10% метанол до конечной концентрации 0,5% через каждые 24 часа в течение 4-х суток. Клетки отделяют центрифугированием при 3500 g в течение 20 мин при +4°С, к супернатанту добавляют сульфат аммония до концентрации 40-60% от насыщения при 4°С и инкубируют при 4°С около 12 часов. Осадок белка получают центрифугированием при 4°С и 1000g в течение 30 мин. Осадок растворяют в 10 mM Na-фосфатном буфере и проводят диализ против 10 mM Na-фосфатного буфера при +4°С. Раствор белка фильтруют через 0,45 мкм фильтр и проводят хроматографическую очистку на DEAE сефарозе FF, при этом, по результатам электрофоретического анализа, наиболее чистым получается не связавшийся белок. На фиг. 4 показан полученный результат очистки рекомбинантного ангиогенина человека.
Пример 5. Проверка функциональной активности рекомбинантного химерного ангиогенина человека.
Ангиогенную активность рекомбинантного химерного ангиогенина человека проверяли на хориоаллантоисной оболочке куриных эмбрионов in ovo следующим способом (14): Оплодотворенные куриные яйца инкубировали при 37°С и влажности примерно 60%. На 4-й день эмбриональный яйца вскрывали в стерильных условиях под ламинаром, предварительно обработав 70% спиртом. Предварительно через маленькое отверстие в скорлупе со стороны острой вершины яйца шприцом отбирали по 2-3 мл альбумина, чтобы аллантоисная оболочка отделилась от скорлупы. На верхнем боку яйца при помощи минидрели и отрезного круга в скорлупе вырезали окно квадратной формы размером примерно 1,5*1,5 см и закрывали стерильной пленкой. Яйца помещали обратно в инкубатор. На 10-эмбриональный день на мембрану наносили препараты белка следующим способом: на предварительно простерилизованные стерильные бумажные фильтры диаметром ок. 1 см наносили по 10 мкл стерильного препарата белка с концентрациями 0,1 и 0,2 г/л и стерильный буфер как отрицательный контроль. В качестве положительного контроля использовали бактериальный препарат химерного ангиогенина человека. Фильтры высушивали под ламинаром и укладывали на аллантоисную мембрану, таким образом, чтобы та сторона фильтра, на которую наносили раствор белка, лежала на аллантоисной мембране. Окно закрывали стерильной пленкой и помещали яйца в инкубатор. Через 72 часа инкубации фильтры снимали с аллантоисной мембраны и оценивали результаты. В случае положительного ответа, на мембране наблюдался характерный рост капиллярной сетки в пределах круга, на котором находился препарат белка.
Четкий положительный ответ наблюдался при аппликации на мембрану 1 мкг химерного ангиогенина человека.
Источники информации
1. Комолова Г.С, Ионова И.И. Биологические функции и лечебные свойства ангиогенина // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2010. Т. 73. №3. С. 40-44.
2. Tello-Montoliu A, Patel JV, Lip GY. Angiogenin: a review of the pathophysiology and potential clinical applications // J Thromb Haemost. 2006 Sep; 4(9):1864-74.
3. Mertvetsov N.P. Chemo-enzymatic synthesis of the human angiogenin gene. Construction of bacterial strains, producers of human angiogenin. Elaboration of a technology for the purification and preparation of angiogenin // Russian Chemical Bulletin. 1996. T. 45. №12. P. 2688-2697.
4. Никонова A.A., Серегин С.В., Чикаев H.A., Мишин В.П., Бабкина И.Н., Мертвецов Н.П. Экспрессия синтетического гена ангиогенина человека в клетках Е. coli // Биоорган, химия. - 1996, т. 22. - с. 891-893.
5. Studier FW, Rosenberg АН, Dunn JJ, Dubendorff JW. Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes // Methods Enzymol. 1990; 185:60-89.
6. Yoon JM, Kim SH, Kwon OB, Han SH, Kim BK. High level expression of soluble angiogenin in Escherichia coli // Biochem Mol Biol Int. 1999 Feb; 47(2):267-73.
7. Mayer H, Rapin AM, Schmidt G, Boman HG. Immunochemical studies on lipopolysaccharides from wild-type and mutants of Escherichia coli K-12 // Eur J Biochem. 1976. 66(2). P. 357-368.
8. Petsch D., Anspach F.B. Endotoxin removal from protein solutions // J Biotechnol. 2000. 76 (2-3). P. 97-119. Review.
9. Cregg J.M. Methods in Molecular Biology: Pichia Protocols / Second Edition. Humana Press, 2007. 389. P. 1-10.
10. Xia WR, Fu WL, Cai L, Cai X, Wang YY, Zou MJ, Xu DG. Expression, purification and characterization of recombinant human angiogenin in Pichia pastoris // Biosci Biotechnol Biochem. 2012; 76(7):1384-8.
11. Hatfield G.W., Roth D.A. Optimizing scaleup yield for protein production: Computationally Optimized DNA Assembly (CODA) and Translation Engineering // Biotechnol Annu Rev. 2007. 13. P. 27-42. Review.
12. Lund A.H., Duch M., Pedersen F.S. Increased cloning efficiency by temperature-cycle ligation // Nucleic Acids Research. 1996;24(4):800-801.
13. Cregg J.M. Methods in Molecular Biology: Pichia Protocols / Second Edition. Humana Press, 2007. 389. P. 1-10.
14. Valdes TI, Kreutzer D, Moussy F. The chick chorioallantoic membrane as a novel in vivo model for the testing of biomaterials. J Biomed Mater Res. 2002 Nov; 62(2):273-82.
Claims (14)
1. Рекомбинантная плазмида pPICZaA:ZZ-ANG, обеспечивающая биосинтез и секрецию химерного белка ангиогенина человека ZZ-ANG (SEQ ID NO: 1), состоящего из аминокислотной последовательности двух IgG-связывающих доменов белка A (SEQ ID NO: 2) и ангиогенина человека (SEQ ID NO: 3), соединенных между собой пептидным линкером (SEQ ID NO: 4), имеющая размер 4228 п.о. и состоящая из следующих элементов:
а) AOX1 promoter - 5’-концевая область промотора алкоголь оксидазы: 1-940;
б) Alpha factor signal peptide – участок, кодирующий N-концевой сигнальный пептид из Saccharomyces cerevisiae: 941-1207;
в) ZZ - 5'-концевой фрагмент синтетического гена ZZ_ANG, кодирующий аминокислотную последовательность двух IgG-связывающих доменов (ZZ) белка A Staphylococcus aureus: 1214 – 1567 п.о.;
г) Link – фрагмент, кодирующий аминокислотную последовательность линкера, связывающего последовательность IgG–связывающей области ZZ белка A из Staphylococcus aureus и последовательность ангиогенина человека: 1568 – 1573 п.о.;
д) ANG - 3'-концевой фрагмент синтетического гена ZZ_ANG, кодирующий аминокислотную последовательность ангиогенина человека: 1574 – 1945 п.о.;
е) AOX1 transcription terminator - терминатор транскрипции: 1973-2317 п.о.;
ж) TEF1 promoter – эукариотический промотор: 2318-2729 п.о.;
з) EM7 promoter – бактериальный промотор: 2730-2797 п.о.;
и) Zeo(R) – ген Sh ble устойчивости к селективному антибиотику зеоцину: 2798-3172 п.о.;
к) CYC1 transcription terminator - терминатор транскрипции гена цитохрома С1: 3173-3490 п.о.;
л) pUC origin – бактериальная точка начала репликации pUC: 3501 - 4174 п.о.,
при этом указанная плазмида характеризуется физической картой, приведенной на фиг. 1.
2. Штамм дрожжей Pichia pastoris X-33/pPICZaA:ZZ-ANG – продуцент рекомбинантного химерного белка ангиогенина человека ZZ-ANG, состоящего из аминокислотной последовательности двух IgG-связывающих доменов белка A (ZZ) и ангиогенина человека (ANG), соединенных между собой пептидным линкером, полученный путем трансформации дрожжей Pichia pastoris X-33 линеаризованной плазмидой pPICZaA:ZZ-ANG по п.1.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2017134047A RU2658758C1 (ru) | 2017-10-02 | 2017-10-02 | Рекомбинантная плазмида для экспрессии в дрожжах Pichia pastoris гена химерного белка ангиогенина человека и штамм дрожжей Pichia pastoris - продуцент рекомбинантного химерного белка ангиогенина человека |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2017134047A RU2658758C1 (ru) | 2017-10-02 | 2017-10-02 | Рекомбинантная плазмида для экспрессии в дрожжах Pichia pastoris гена химерного белка ангиогенина человека и штамм дрожжей Pichia pastoris - продуцент рекомбинантного химерного белка ангиогенина человека |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2658758C1 true RU2658758C1 (ru) | 2018-06-22 |
Family
ID=62712686
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2017134047A RU2658758C1 (ru) | 2017-10-02 | 2017-10-02 | Рекомбинантная плазмида для экспрессии в дрожжах Pichia pastoris гена химерного белка ангиогенина человека и штамм дрожжей Pichia pastoris - продуцент рекомбинантного химерного белка ангиогенина человека |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2658758C1 (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US12084667B2 (en) | 2015-05-11 | 2024-09-10 | Impossible Foods Inc. | Expression constructs and methods of genetically engineering methylotrophic yeast |
US12116699B2 (en) | 2019-04-17 | 2024-10-15 | Impossible Foods Inc. | Materials and methods for protein production |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003064660A1 (fr) * | 2002-01-31 | 2003-08-07 | Yury Akhmetovich Ramazanov | Plasmide hybride pzzsa codant la synthese de la proteine chimere d'angiogenine et souche d'escherichia coli bl21 (des) pzzsa comme super-producteur de la proteine chimere angiogenique chez l'humain |
RU2512527C2 (ru) * | 2012-07-10 | 2014-04-10 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Центр Вихревых Технологий" | ИСКУССТВЕННЫЙ ГЕН, КОДИРУЮЩИЙ ХИМЕРНЫЙ БЕЛОК АНГИОГЕНИНА ЧЕЛОВЕКА, ХИМЕРНАЯ ПЛАЗМИДА pJZZ-A, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ ЭКСПРЕССИЮ ГЕНА ХИМЕРНОГО БЕЛКА АНГИОГЕНИНА ЧЕЛОВЕКА В Escherichia coli И ШТАММ Escherichia coli BL21(DE3)/pJZZ-A-ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ХИМЕРНОГО БЕЛКА АНГИОГЕНИНА ЧЕЛОВЕКА |
-
2017
- 2017-10-02 RU RU2017134047A patent/RU2658758C1/ru active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003064660A1 (fr) * | 2002-01-31 | 2003-08-07 | Yury Akhmetovich Ramazanov | Plasmide hybride pzzsa codant la synthese de la proteine chimere d'angiogenine et souche d'escherichia coli bl21 (des) pzzsa comme super-producteur de la proteine chimere angiogenique chez l'humain |
RU2512527C2 (ru) * | 2012-07-10 | 2014-04-10 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Центр Вихревых Технологий" | ИСКУССТВЕННЫЙ ГЕН, КОДИРУЮЩИЙ ХИМЕРНЫЙ БЕЛОК АНГИОГЕНИНА ЧЕЛОВЕКА, ХИМЕРНАЯ ПЛАЗМИДА pJZZ-A, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ ЭКСПРЕССИЮ ГЕНА ХИМЕРНОГО БЕЛКА АНГИОГЕНИНА ЧЕЛОВЕКА В Escherichia coli И ШТАММ Escherichia coli BL21(DE3)/pJZZ-A-ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ХИМЕРНОГО БЕЛКА АНГИОГЕНИНА ЧЕЛОВЕКА |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
XIA W.-R. ET AL. Expression, Purification and Characterization of Recombinant Human Angiogenin in Pichia pastori // Biosci. Biotechnol. Biochem., 2012, 76(7), 1384-1388. * |
СЕРЁГИН С. В. Оптимизация конструкций рекомбинантных ДНК для получения иммунобиологических препаратов. Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук. Кольцово - 2015, c. 130, 182. * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US12084667B2 (en) | 2015-05-11 | 2024-09-10 | Impossible Foods Inc. | Expression constructs and methods of genetically engineering methylotrophic yeast |
US12116699B2 (en) | 2019-04-17 | 2024-10-15 | Impossible Foods Inc. | Materials and methods for protein production |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2321948T3 (es) | Tecnica de expresion genetica. | |
ES2401856T3 (es) | Un método para producir un polipéptido biológicamente activo que tiene actividad insulinotrópica | |
BRPI0616054A2 (pt) | clivagem de precursores de insulunas por uma variante de tripsina | |
DE69005959T2 (de) | Verfahren zur Reinigung von menschlichem Serum-Albumin. | |
CN104704126B (zh) | 在酵母表达系统中利用人内质网分子伴侣蛋白天然信号序列产生天然重组的分泌的人内质网分子伴侣蛋白 | |
RU2658758C1 (ru) | Рекомбинантная плазмида для экспрессии в дрожжах Pichia pastoris гена химерного белка ангиогенина человека и штамм дрожжей Pichia pastoris - продуцент рекомбинантного химерного белка ангиогенина человека | |
KR20210032972A (ko) | 전사인자를 사용하여 단백질 발현을 증가시키는 수단 및 방법 | |
JPWO2018110471A1 (ja) | 転写調節融合ポリペプチド | |
ES2356641T3 (es) | Saccharomyces cerevisiae transformada y método para la producción en masa de la proteína lk8 utilizando la misma. | |
ES2258371B1 (es) | Levadura transformante productora de hormona paratiroidea humana y procedimiento para producir la hormona. | |
CN106282196A (zh) | 中华绒螯蟹hsp90基因克隆及其应用 | |
JPH06509229A (ja) | シクロヘキシミド耐性タンパク質及びヌクレオチド配列 | |
ES2370683T3 (es) | Procedimiento para producir alergeno de grupo i de acaro recombinante maduro. | |
Wang et al. | Production and characterization of a novel antimicrobial peptide HKABF by Pichia pastoris | |
DE69432963T2 (de) | Plasmid und damit transformierte E. Coli Stämme | |
US10316074B2 (en) | Interleukin-2 expression construct using human serium albumin | |
Tsygankov et al. | Synthesis of recombinant gamma interferons resistant to proteolysis in the yeast Pichia pastoris | |
JP2021101733A (ja) | 新規宿主細胞及びそれを用いた目的タンパク質の製造方法 | |
WO2010082097A2 (pt) | Proteínas de fusão, processo para a sua preparação e sua utilização em sistemas de expressão de proteínas recombinantes | |
AU2018210684B2 (en) | Recombinant vaccine against helminths in Pichia pastoris and methods for producing and purifying proteins for use as vaccines against helminths | |
RU2315105C1 (ru) | ШТАММ ДРОЖЖЕЙ PICHIA PASTORIS PS107(pPIC9HAbIL-2), ЯВЛЯЮЩИЙСЯ ПРОДУЦЕНТОМ ГИБРИДНОГО БЕЛКА, СОСТОЯЩЕГО ИЗ АЛЬБУМИНА ПЛАЗМЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА И ИНТЕРЛЕЙКИНА-2 ЧЕЛОВЕКА, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pPIC9HAbIL-2 И СПОСОБ ЕЕ КОНСТРУИРОВАНИЯ | |
CN105968177B (zh) | 香蕉抗菌肽MaSN2及其基因的新应用 | |
RU2766448C2 (ru) | Получение гена фосфолипазы А2 с измененным оптимумом рН путем удаления сайтов гликозилирования | |
RU2203950C1 (ru) | Штамм дрожжей pichia pastoris - продуцент лейкоцитарного интерферона-16 человека, рекомбинантная плазмидная днк phin и способ ее конструирования | |
Nikaidou et al. | Molecular cloning and nucleotide sequence of a pectin lyase gene from Pseudomonasmarginalis N6301 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20200204 Effective date: 20200204 |
|
QC41 | Official registration of the termination of the licence agreement or other agreements on the disposal of an exclusive right |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20200204 Effective date: 20210728 |
|
HE4A | Change of address of a patent owner |
Effective date: 20210812 |
|
TC4A | Change in inventorship |
Effective date: 20220112 |
|
PD4A | Correction of name of patent owner |