CN104704126B - 在酵母表达系统中利用人内质网分子伴侣蛋白天然信号序列产生天然重组的分泌的人内质网分子伴侣蛋白 - Google Patents
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Abstract
一种利用酵母作为宿主产生人ER分子伴侣蛋白的方法,该方法利用了细胞内人蛋白的内源信号肽,该内源信号肽在酵母细胞中被识别和正确加工并随后致使人蛋白分泌。所得的蛋白具有天然氨基酸序列并具有生物学活性。此外,分泌使得可以以高产量简单地一步纯化天然重组人蛋白。
Description
相关申请
本申请要求于2012年7月12日递交的共同未决美国临时申请61/670,768号的权益,特此通过引用将其整体并入本文。
背景技术
内质网(ER)分子伴侣蛋白是多功能蛋白,参与多种生物学过程如蛋白折叠和ER中的质量控制(Hebert等,1995;Zhang等,1997;Braakman&van Anken,2000;High等,2000;Bedard等,2005;Benyair等,2011;Braakman&Bulleid,2011)、解折叠蛋白反应(Spear&Ng,2001;Ma&Hendershot,2004;Malhotra&Kaufman,2007;Groenendyk等,2010;Chakrabarti等,2011),I类MHC抗原加工(Maffei等,1997;Nicchitta&Reed,2000;Zhang&Williams,2006;Wearsch&Cresswell,2009)以及这些蛋白在ER外侧行使的其他重要功能(Panayi&Corrigall,2006;Gonzalez-Gronow等2009;Gold等,2010;Ni等,2011;Peters&Raghavan,2011;Turano等,2011)。ER分子伴侣蛋白在各种人疾病中的作用可能尤为重要。表明特定ER分子伴侣蛋白参与多种病理过程的数据量日益增多。例如,ER分子伴侣蛋白GRP78/BiP可能参与癌症进展(Li&Lee,2006;Lee,2007;Luo&Lee,2012)、自身免疫炎症和组织损伤(Panayi&Corrigall,2006;Morito&Nagata,2012)和风湿性关节炎(Corrigall等,2001;Yoo等,2012)。另一ER分子伴侣蛋白钙网蛋白(calreticulin)在激活化疗和各种其他癌症治疗策略所需的抗肿瘤响应中具有重要作用(Chaput等,2007;Obeid等,2007;Wemeau等,2010)并且还与皮肤创伤的愈合过程相关(Nanney等,2008)。其他ER分子伴侣蛋白也涉及了疾病相关过程,例如,对于分子伴侣蛋白GRP58/ERp57而言是朊病毒疾病(Hetz等,2005)。这些最近的发现表明可将ER分子伴侣蛋白应用于治疗试验和新药开发。因此,可预见不久的将来对人ER分子伴侣蛋白产品会有增长的需求。
天然人ER分子伴侣蛋白可以从各种组织中纯化,例如已经从人胎盘中纯化了钙网蛋白(Houen&Koch,1994),但人组织对于大规模临床试验而言不是这些蛋白的充足来源。为有效而安全地生产这些蛋白应考虑重组蛋白表达技术。另外,理想的是这些重组蛋白对于临床试验应尽可能对应于天然类似物。
当前大多数重组人ER分子伴侣蛋白在细菌宿主大肠杆菌中产生(Rokeach等,1991;Baksh等,1992;Antoniou等,2002),并且这些产品可商购获得(Abcam产品ab78432,ab91577和ab92937,2012;StressMarq产品SPR-119B,2012;USBiological产品B1770-01,C1036-02L1和E2291-75E,2012)。然而,大肠杆菌和其它原核生物不具有ER、Golgi器和真核分泌途径的其它细胞器,因此不确定在细菌中产生的人ER蛋白是否正确折叠并具有所有与天然蛋白类似物相同的功能。酵母是产生ER分子伴侣蛋白和其它复杂的分泌人蛋白的有吸引力的宿主,因为这种单细胞真核微生物具有真核特征,包括导致正确蛋白加工和翻译后修饰的分泌途径(Mattanovich等,2012)。已经进行多种尝试来在酵母中产生重组分泌的人蛋白(Damasceno等,2012;Hou等,2012),因为这种表达系统有利于蛋白产物的纯化和下游加工,并且分泌的蛋白通常具有生物学活性。对于在酵母中产生分泌的人ER分子伴侣蛋白,可以采用数种技术。所有这些方法都包括利用与经加工的成熟人ER蛋白的序列融合的常规酵母蛋白分泌信号。以这种方式产生的蛋白产物在N末端具有数个非天然氨基酸,这一操纵对所制备蛋白的生物学活性的影响是未知的。迄今为止文献描述的酵母表达的分泌的全长重组哺乳动物ER分子伴侣蛋白的唯一已知实例是在毕赤酵母(Pichia pastoris)中产生的重组兔钙网蛋白(Andrin等,2000)。
发明内容
已知尚未尝试利用人ER分子伴侣蛋白的天然信号序列在微生物宿主中产生与人细胞中天然类似物相同的方式正确加工的最终天然重组ER分子伴侣蛋白产物。本文描述了在酿酒酵母(S.cerevisiae)和毕赤酵母(P.pastoris)表达系统中利用数种细胞内人ER分子伴侣蛋白的天然信号序列从而将正确加工的终产物分泌到培养基。令人惊讶的是,该方法能够产生大量的按照与人细胞中相同的方式加工的天然重组人分子伴侣,不同之处在于成熟的蛋白产物被分泌到酵母培养基中。本发明还显示了证实人ER分子伴侣蛋白的信号序列在酵母细胞中正确加工的实验数据,并提供了如何有效以分泌形式产生这些蛋白。
本发明提供了通过简单的下游纯化程序在酵母中产生天然重组人ER分子伴侣蛋白的方法。这些蛋白不具有任何附加的人工氨基酸序列,并且被加工成最终产物,根据其预测分子量恰好对应于类似的人蛋白。这通过整合如下所述的数种关键因素而实现,并仅适用于人内质网(ER)管腔蛋白。通过以三种人ER蛋白为例描述程序,结果显示所述方法如何进行。
本发明涵盖了产生重组蛋白的方法。这些方法包括以下步骤
(a)以核苷酸序列转化酵母细胞,所述核苷酸序列包含针对天然人ER分子伴侣蛋白信号序列和人ER分子伴侣蛋白的编码序列;
(b)在人ER重组分子伴侣蛋白以分泌的形式表达的条件下培养所述酵母细胞;和
(c)从培养基中提取所述人ER重组分子伴侣蛋白。
本发明所述方法的一个实施方式产生人ER重组分子伴侣蛋白,其中所述人ER分子伴侣蛋白是人ER管腔蛋白。该方法包括以下步骤:在以分泌形式表达人ER重组分子伴侣蛋白的条件下培养酵母细胞,所述酵母细胞已转化有核苷酸序列,所述核苷酸序列包含针对天然人ER分子伴侣蛋白信号序列和人ER分子伴侣蛋白两者的编码序列;和从培养基中提取所述人ER重组分子伴侣蛋白。
本发明所述方法的另一实施方式产生选自由BiP/GRP78、钙网蛋白和ERp57组成的组的人ER重组分子伴侣蛋白。所述方法包括以下步骤
(a)提供转化有核苷酸序列的酵母细胞,所述核苷酸序列包含针对天然人ER分子伴侣蛋白信号序列和人ER分子伴侣蛋白两者的编码序列;
(b)在人ER重组分子伴侣蛋白以分泌的形式表达的条件下培养所述酵母细胞;和
(c)从培养基中提取BiP/GRP78、钙网蛋白或ERp57中的至少一种。
本发明所述方法可产生高达约100mg/L的所需蛋白,并且通过本领域已知的常规方法优化酵母培养条件可以进一步增加产量。
本发明所述方法的另一实施方式通过以下步骤产生人ER重组分子伴侣蛋白,
(a)提供转化有核苷酸序列的酵母细胞,所述核苷酸序列包含针对天然人ER分子伴侣蛋白信号序列和人ER分子伴侣蛋白两者的编码序列;
(b)在人ER重组分子伴侣蛋白以分泌的形式表达的条件下培养所述酵母细胞;和
(c)从培养基中提取所述人ER重组分子伴侣蛋白。
附图说明
图1显示了用空质粒转化(泳道1)或产生人分子伴侣BiP、钙网蛋白和ERp57(分别为泳道2、3和4)的酿酒酵母AH22细胞的40×浓缩的培养基的SDS-PAGE(图1A)和蛋白质印迹(图1B)分析。
图2显示了从酿酒酵母纯化的分泌的重组人分子伴侣钙网蛋白(图2A)、ERp57(图2B)和GRP78/BiP(图2C)的ESI-MS。
图3显示了来自所选择的过表达了分泌的重组人BiP(图3A)、钙网蛋白(图3B)和ERp57(图3C)的毕赤酵母GS115株多拷贝转化体的未浓缩的培养基(各8μl)的SDS-PAGE。C表示对照(转化有不具有人基因的空载体pPIC3.5K并与过表达人分子伴侣的株平行培养的毕赤酵母GS115株的8μl未浓缩培养基),而M是具有条带上方所指示的已知分子量的蛋白标记物。
图4显示了从酿酒酵母培养基纯化分泌的重组人GRP78/BiP蛋白。泳道代表蛋白分子量标记物(M)、人BiP在酿酒酵母中表达后的酵母培养基(A)、微孔过滤后相同酵母生长培养基(B)、切向超离心后的相同培养基(C)和通过ATP亲和层析从相同培养基纯化的分泌的重组人BiP蛋白(D)。
图5显示了利用MALDI-TOF/TOF串联MS/MS(质谱)以及UPLC/MSE法对酿酒酵母分泌的GRP78/BiP蛋白条带的胰蛋白酶化肽质量指纹(mass fingerprinting)的定位。
图6分别显示了通过Edman降解和ESI-MS对酿酒酵母和毕赤酵母分泌的重组人GRP78/BiP的完整分子的N端测序结果。
图7显示了从酿酒酵母(图7A)和毕赤酵母(图7B)纯化的重组BiP蛋白的部分蛋白水解。
图8显示了利用细菌和酵母中表达的重组BiP蛋白进行的ATP酶活性测试。
图9显示了从酿酒酵母纯化的重组人BiP蛋白的天然PAGE。
图10显示了分别对酵母培养基以及来自毕赤酵母和酿酒酵母的纯化的重组人钙网蛋白样品的SDS-PAGE分析。
图11显示了酿酒酵母表达的蛋白的胰蛋白酶化肽质量指纹,这确认了纯化的分泌蛋白代表了具有正确加工的N端氨基酸序列的人钙网蛋白。
图12显示了从毕赤酵母和酿酒酵母纯化的分泌的重组人钙网蛋白的ESI-MS和N端Edman测序。
图13显示了对从毕赤酵母培养基纯化的重组人钙网蛋白的胰蛋白酶消化证实了酵母分泌的人蛋白的正确折叠。
图14显示了关于源自细菌和酵母的重组钙网蛋白诱导的人成纤维细胞增殖的数据。
图15显示了伤口愈合刮擦平板测试的数据。源自细菌或酵母的重组钙网蛋白诱导了人成纤维细胞迁移。
图16显示了来自酵母培养基的分泌的重组人ERp57蛋白的纯化。泳道代表蛋白分子量标记物(M)、人ERp57在酿酒酵母中表达后的粗酵母生长培养基(A)、微孔过滤后的相同酵母生长培养基(B)、切向超离心后的相同培养基(C)和利用肝素Sepharose通过一步亲和层析从相同培养基纯化的分泌的重组人ERp57蛋白(D)。
图17显示了从酿酒酵母纯化的分泌重组人ERp57的ESI-MS和N端Edman测序。
图18显示了通过胰蛋白酶化肽质量指纹对从酿酒酵母纯化的分泌的重组人分子伴侣ERp57(PDIA3)进行的蛋白N端鉴定。
图19显示了通过胰岛素沉降法测试的酵母来源的重组人ERp57蛋白的硫醇基依赖的催化活性。
图20显示了从毕赤酵母纯化的分泌的重组人ERp57的SDS-PAGE。
具体实施方式
本发明涵盖了在酵母细胞中合成天然重组分泌的人ER分子伴侣蛋白的酵母表达系统。酵母是能够对表达的多肽进行真核加工的单细胞真核微生物。由于酵母是真核生物,因此其细胞内环境更适合包括人细胞蛋白的真核蛋白的正确折叠。酵母来源的异源蛋白不含毒性污染物,是开发疫苗、诊断剂或生物医药的优异工具。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)被称为GRAS(一般认为是安全的)生物。酵母中产生的大多数天然重组人或病毒蛋白具有与来自人细胞的天然蛋白相似的性质,优于其在细菌中表达的类似物。对各种高质量重组蛋白的增长性需求需要更好和更有效的表达系统,甚至对于有充分建立的生产规程的蛋白也是如此。用于各种目的的天然人蛋白通常从各种人细胞纯化,因为重组蛋白利用各种标签从大肠杆菌中合成和纯化。本发明证明酵母是迄今用于表达和纯化天然重组人蛋白的优异宿主。
ER分子伴侣蛋白是多功能蛋白,参与多种生物学过程如蛋白折叠和ER中的质量控制、解折叠蛋白响应、I类MHC抗原加工、以及这些蛋白在ER外侧行使的其他重要功能。ER分子伴侣蛋白在各种人疾病中的作用可能尤为重要,有数据表明特定ER分子伴侣蛋白参与多种病理过程。这些最近的发现表明可将ER分子伴侣蛋白应用于治疗试验和新药开发,以及基础研究和应用研究。重组蛋白表达技术可以有效和安生地产生这些蛋白。此处提供的实例包括包括但不限于在酵母细胞中产生的GRP78/BiP、钙网蛋白和GRP58/ERp57。通过本发明方法产生的所得蛋白不具有标签。没有标签用于纯化这些重组蛋白;然而,蛋白也可以具有His标签。通过本发明方法产生的所得蛋白在酵母细胞中得到正确加工,最终蛋白产物由与人细胞中相同的氨基酸序列组成。所得的重组产物中不存在非天然修饰。所得的重组蛋白的寡聚状态对应于从人组织中分离的天然人分子伴侣蛋白的寡聚状态。本发明方法产生的所得的重组蛋白具有完全的活性并且具有稳定性。
三种人ER蛋白用作所公开程序中的实例。从商用人肝脏cDNA文库(Clonetech,USA)中克隆了编码人ER分子伴侣蛋白BiP/GRP78(SEQ ID NO:1)、钙网蛋白(SEQ ID NO:2)和ERp57(SEQ ID NO:3)的人基因HSPA5(SEQ ID NO:4)、CALR(SEQ ID NO:5)和PDIA3(SEQID NO:6)(GeneBank编号分别为AF216292、M84739和U42068)。对人基因的cDNA进行无损克隆,不改变对信号序列、ER保留信号进行编码的序列。对蛋白的功能性部分没有去除、修饰或以来自酵母或任何其他物种的基因的任何同源序列取代。核苷酸序列分析后,人基因HSPA5、CALR和PDIA3克隆到(Ciplys等,2011)所述的酵母PGK1基因启动子控制的酵母表达载体pFDC中,得到3种重组质粒pFDC-BiP、pFDC-CALR和pFDC-ERp57。携带人基因的pFDC-BiP、pFDC-CALR和pFDC-ERp57酵母表达载体用于转化酿酒酵母株AH22MATa(leu2his4)。酵母转化和后续对转化体的筛选完全按照(Ciplys等,2011)所述进行。在YEPD培养基(酵母提取1%,蛋白胨2%,右旋葡萄糖2%)中培养携带重组质粒的酵母细胞后,分析酵母细胞和生长培养基中的蛋白。令人惊讶的是,如图1所示,重组人分子伴侣不仅如此前所述(Ciplys等,2011)存在于酵母细胞的膜蛋白部分中,还以相当大量存在于培养基中,其构成培养基中所有蛋白的约50%~60%。
约1L的培养基含有40mg~50mg的分泌的人钙网蛋白和10mg~15mg的BiP/GRP78和ERp57蛋白。利用抗各人分子伴侣的特异抗体通过蛋白质印迹分析确认蛋白的身份(图1B):泳道2-抗人BiP/GRP78的兔多克隆抗体(Ab21685,Abcam,UK);泳道3-抗人钙网蛋白的小鼠单克隆抗体(Ab22683,Abcam,UK);和泳道4-抗人ERp57的小鼠单克隆抗体(Ab13506,Abcam,UK)。所观察到的这一人ER分子伴侣蛋白在酵母中利用其不具有任何改变的完整cDNA核苷酸序列的高水平分泌现象此前从未有过报道。
为进一步分析该过程,将人HSPA5、CALR和PDIA3基因克隆到与pFDC相似但在其他酵母基因ADH2、TDH2、TPI1、TEF和ENO2的不同启动子控制下的酵母表达载体中。为了表达人BiP、钙网蛋白和ERp57蛋白,使用了不同酿酒酵母株(8188c、AH-214u、AH-214uΔpep4)。利用不同启动子和株获得的结果与图1所示结果非常相似。这表明天然氨基酸序列人分子伴侣在酵母培养基中的分泌与使用特定启动子或株进行其合成无关,而是酵母细胞的以下不同性质的综合:(i)识别人蛋白的信号序列并将它们转位至ER内的能力,但(ii)不能将人分子伴侣保留在其预定的细胞区室。这些性质并未被发现和/或利用于在酵母中产生天然重组人蛋白。
应注意,人分子伴侣的内源信号肽实际上不是分泌信号氨基酸序列,这是因为它们仅用于将天然人蛋白导引至ER。当信号序列被切割时,人细胞中的分子伴侣蛋白保留在ER中。即使在一些情况下显示出天然人分子伴侣被导引至细胞表面,但它们并不会被分泌到细胞外侧。实际上,已知人ER分子伴侣蛋白是细胞内蛋白。因此,本发明人在此首次显示出了酵母将细胞内人蛋白利用其天然信号序列进行分泌的能力,以进行细胞内加工和细胞内成熟蛋白的转运。已知一些分泌的人蛋白可利用其天然分泌信号序列而在酵母细胞中分泌(Hitzeman等,1983;Barr等,1992)。该方法利用人干扰素为例在1988年获得专利权(Hitzeman和Leung,1988);该方法还在1994年使用,并获得了对人血清白蛋白利用其天然分泌信号序列在毕赤酵母中表达的专利(Prevatt和Sreekrishna,1994)。然而,在大多数情况中酿酒酵母α-MF前信号序列原被用于在其他异源蛋白在酵母中的分泌,因为天然分泌信号序列效果较差(Cereghino和Cregg,2000)。本发明人的发现不同于此前的观察,天然信号序列可驱动分泌性人蛋白在酵母中的分泌。可以预见的是,分泌性人蛋白利用相同的信号序列也可以在酵母细胞中分泌。相反,细胞内人蛋白例如ER驻留的分子伴侣蛋白的分泌对于在酵母中重组表达的类似物是不能预见的。此外,人ER分子伴侣蛋白在酵母中的分泌水平出乎预料地高,并且可有效产生正确加工的重组产物。总之,本发明人大体上提出了异源人蛋白在酵母细胞中分泌的新规程。
所有三种分泌的人分子伴侣随后进行纯化和分析。分泌的重组人分子伴侣从培养基中的纯化利用标准程序例如微孔过滤、超滤和一步层析和标准规程进行。该简单的纯化程序足以实现纯度超过90%的天然重组人分子伴侣。这种简单有效的下游纯化程序是所公开的表达系统的另一优点。进行通过Edman降解的N端测序以鉴定和表征纯化的分泌蛋白。在所有三种情况下对来自酿酒酵母的分子伴侣蛋白产物的Edman测序(利用AltaBioscience的服务进行)鉴定出5个N端氨基酸,并显示出它们对应于来自人细胞的成熟天然分子伴侣蛋白产物(见表1:对于GRP78/BiP是NH2-EEEDK;对于钙网蛋白是NH2-EPAVY和对于ERp57是NH2-SDVLE)。这些结果表明人分子伴侣蛋白的天然ER信号序列在酵母细胞中被识别和正确加工,并且这可以使重组蛋白转位到ER中,随后出乎预料地分泌到酵母细胞外。为了检查所分泌蛋白产物的可能的修饰,本发明人进行全蛋白分子的电喷雾质谱(ESI-MS)分析,以确定酵母分泌的人ER分子伴侣蛋白的确切分子量。表1和图2中给出了质谱结果;表1指出了产物的精确测定分子量和预测分子量。
表1.自酿酒酵母纯化的分泌的重组人分子伴侣的N端序列、预测分子量和测定分子量
具有所示信号肽的N末端序列1获自UniProtKB数据库,对于BiP、钙网蛋白和ERp57的经审阅著录项分别为P11021(GRP78_HUMAN)、P27797(CALR_HUMAN)和P30101(PDIA3_HUMAN)。切割的内源信号肽的序列高亮标出,而成熟蛋白序列以粗体标出。
BiP、钙网蛋白和ERp57的预测2分子量利用相同UniProtKB数据库来源的免费软件工具计算。
源自酿酒酵母的纯化的人BiP、钙网蛋白和ERp57蛋白的质谱结果分别显示70478.39、46466.09和54265.55的质量,准确对应于成熟人蛋白的理论预测质量(图2和表1)。这表明了以下两点:(i)重组分泌的人BiP、钙网蛋白和ERp57蛋白是完全与成熟人ER蛋白相同的多肽(包括在蛋白C端的预测的ER保留信号KDEL或QEDL)和(ii)它们不具有酵母来源的修饰——这对重组蛋白而言是非常重要的特点。此外,质谱分析表明蛋白具有高纯度(图2)。
分泌的重组人BiP、钙网蛋白和ERp57蛋白的质谱结果连同N端测序清楚表明所有三种人分子伴侣在酵母细胞中均得到正确加工。在真核细胞中,成熟蛋白的内源信号肽被易位子机构识别,确保蛋白正确转位到ER中。在多肽转位到ER腔中以后,内源信号肽被位于ER内侧的内源信号肽肽酶复合物切割(Zimmermann等,2011)。不存在关于人和酵母易位子机构或内源信号肽肽酶复合物之间相容性的数据。本文公开的数据显示,来自这两个物种的所述复合物的特异性通常相同,因此成熟中的人分子伴侣的信号序列在酵母细胞中被酵母蛋白正确识别,从而导致在人蛋白成功转位到ER后对内源信号肽的正确切割。该现象从未被细胞内重组人蛋白在酵母细胞中的分泌性生产所利用。如上所述,对于各酵母物种中的重组蛋白分泌,酵母分泌信号序列与靶蛋白融合,从而使得在蛋白分泌后附着有数种附加非天然氨基酸。所公开的方法不仅简化了用于在酵母细胞中表达的人基因的克隆,而且确保了重组人蛋白具有在人细胞中相同的氨基酸组成。
因此,对重组人BiP、钙网蛋白和ERp57的N端的鉴定确认了质谱结果,即,自酿酒酵母纯化的分泌的人分子伴侣具有完好的天然氨基酸序列。所有三种蛋白的ER回收序列也均完好(BiP和钙网蛋白中的KDEL氨基酸和ERp57中的QEDL)。真核细胞的回收机构识别具有回收信号的蛋白,并将它们保留在ER腔中(Capitani&Sallese,2009)。这表明尽管存在ER回收信号,但重组人分子伴侣还是从酿酒酵母中分泌出来。这对酵母细胞分泌人蛋白的原因和蛋白通常保留在ER中的原因提出了问题。此前描述了漏保留信号(leaky retentionsignal)(Andrin等,2000;Hamilton&Gerngross,2007),但从未用于产生分泌的天然重组蛋白。酿酒酵母细胞对人ER蛋白的分泌可通过酵母对用于ER驻留蛋白的有效回收的HDEL信号的偏好(相对于KDEL或QEDL信号)来解释(Dean和Pelham,1990),但这不是本情形中的原因,这是因为以HDEL序列替换KDEL或QEDL并未抑制BiP、钙网蛋白和ERp57的分泌(本发明人未公开的数据)。另外,可以排除酵母ER回收机构的超负荷作为人ER蛋白分泌的原因,这是因为利用相同pFDC载体过表达具有天然HDEL ER回收序列的酵母Kar2蛋白没有导致该蛋白的分泌(本发明人未公开的数据)。此外,利用相同pFDC载体还表达了人PDI(是人ERp57和酵母PDI蛋白的同源物并含有KDEL ER回收序列),并在该情况中没有观察到重组蛋白的分泌(本发明人未公开的数据)。这些实验表明ER管腔蛋白的保留是复杂的且机理尚不清楚,其不严格依赖于HDEL/KDEL回收机制。本发明关于酵母细胞分泌人ER分子伴侣蛋白的发现可作为研究该现象的方便模型。另一方面,该方法可用于在酵母中有效产生天然重组人ER蛋白。
总之,这些结果清楚表明,酵母细胞能够识别和正确加工人ER蛋白的信号序列、并随后将成熟产物分泌至培养基这一新发现的现象给在酵母中合成重组ER分子伴侣蛋白提供了新机会。本发明的发现使得通过简单的下游纯化程序可以合成分泌的天然重组人分子伴侣。此外,重组人蛋白通过了酵母细胞蛋白的分泌途径,这可确保其正确成熟。
本发明还涵盖了其他酵母表达系统,包括但不限于毕赤酵母。使用了编码具有用于蛋白产物分泌的天然信号序列的人分子伴侣全序列的相同cDNA构建体。显示了所有三种蛋白产物的分泌(见实施例)。GRP78/BiP和钙网蛋白的表达(实施例1和2)在毕赤酵母系统中更有效,这可用来显著提高产物产量。BiP和CRT蛋白的毕赤酵母培养基样品的SDS-PAGE图像显示出在该宿主中分泌的效率(图3A和3B)。起初,ERp57在毕赤酵母中的分泌量小于在酿酒酵母中。然而,在优化毕赤酵母培养物的培养条件后,人ERp57的分泌量超过酿酒酵母细胞(图3C)。实施例3中提供了在毕赤酵母中表达ERp57的优化规程。在分泌至培养基后,利用与在酿酒酵母中表达的情况相同的方法从毕赤酵母纯化人BiP、钙网蛋白和ERp57蛋白。纯化产物的性质与源自酿酒酵母细胞的类似蛋白相似(实验的更详细描述在实施例中给出)。因此,本发明涉及在一般酵母中产生人ER分子伴侣蛋白,而不是在一个酵母物种中表达。
最后,本发明人要求保护在酵母中产生生物活性的人ER分子伴侣蛋白。此处,本发明人显示了所有三种酵母来源的人蛋白BiP、钙网蛋白和ERp57正确折叠并具有生物活性。根据所公开发明产生的GRP78/BiP蛋白显示出产物的正确折叠和活性。酵母表达的BiP蛋白结合ATP,这保护了约60kDa的片段免于受蛋白酶K水解(图7)。此前采用相似数据表明大肠杆菌表达的类似蛋白的正确折叠。对于酵母表达的蛋白的活性,采用了GRP78/BiP的ATP酶活性测试,并且也利用了大肠杆菌表达的类似物作为平行对照。如图8所示,酵母表达的分泌的BiP分子伴侣蛋白活性比大肠杆菌产品高三倍(相同时间内相同量的蛋白水解的ATP为约6.3μM相比于约2.1μM)。ATP结合和对毕赤酵母来源的BiP的约60kDa结构域的保护与酿酒酵母相似(图7B)。还测量了毕赤酵母表达的BiP的ATP酶活性,显示出与酿酒酵母表达的类似物相似的结果(图8,毕赤酵母表达的BiP的平均值稍高于酿酒酵母类似物,但在误差范围内),与大肠杆菌表达的产物相比增加约3倍。这一巨大差异表明酵母表达的产物的优点。以胰蛋白酶对钙网蛋白的部分消化(Corbett等,2000;等,2001)表明酵母表达的hCRT的正确折叠和Ca2+结合,如在实施例2中所示。另外,细胞增殖的体外测试(Nanney等,2008;Greives等,2012)显示出酿酒酵母来源的和毕赤酵母来源的人钙网蛋白对人成纤维细胞增殖的诱导均显著高于从大肠杆菌细菌纯化的相同蛋白(表2和图14)。此外,伤口愈合刮擦平板测试表明,大肠杆菌和酵母表达的重组钙网蛋白诱导人成纤维细胞迁移的程度在误差范围内相似(表3和图15)。总之,酵母表达的人钙网蛋白数据表明重组产物具有至少与源自细菌的重组钙网蛋白相同的生物活性。应当注意的是,在这些测试中用作对照的大肠杆菌表达的相同钙网蛋白此前显示出在鼠和猪的正常以及受损的动物皮肤损伤模型中通过引起剂量依赖性的上皮迁移增加和颗粒组织形成对体内伤口愈合过程有明显效果(Gold等,2006;Greives等,2012)。因此,可以预见到酵母来源的分泌的人钙网蛋白也可成功用于体内伤口愈合。对于ERp57,数据表明ERp57分子伴侣蛋白的硫醇依赖的还原酶活性。将酿酒酵母表达的ERp57分子伴侣蛋白产物与细菌大肠杆菌表达的相同的商购重组分子伴侣蛋白比较,数据表明酵母表达的蛋白比大肠杆菌表达的相同量ERp57类似物明显更具有活性(图19)。因此,所公开的系统比大肠杆菌可产生更具活性的产物,并提供产生重组ER分子伴侣蛋白的有效平台。
将参照以下非限制性的实施例进一步评述本发明。
实施例1.在酵母中表达系统中产生天然重组人GRP78/BiP蛋白
人BiP/GRP78是在ER中起双重作用的主要内质网分子伴侣蛋白:控制蛋白折叠从而阻止聚集,和控制解折叠蛋白响应(UPR)的信号传导。其还参与多种其他重要的细胞过程,例如,钙稳态、凋亡调节和信号转导。最近,还显示该蛋白在癌细胞中有重要作用,其可能用于治疗目的。另外,越来越多的证据表明GRP78对于前脑缺血、帕金森病和视网膜变性治疗是新治疗靶标(Gorbatyuk和Gorbatyuk,2013)。在本研究中,本发明人提供证据,酿酒酵母和毕赤酵母是表达和纯化天然重组人BiP/GRP78蛋白的优异宿主。新发现的酵母细胞识别和正确加工人BiP/GRP78蛋白的天然信号序列并随后将其分泌到培养基中的能力使得可以从酿酒酵母和毕赤酵母中以简单的一步纯化出高纯度的重组BiP/GRP78蛋白,产量分别达到10mg/L和20mg/L。数据表明它是完好无缺的有活性蛋白,不带有源自酵母的修饰。酵母来源的人BiP/GRP78蛋白具有ATP酶活性,该活性超过大肠杆菌来源的重组人BiP/GRP78活性3倍。
通过PCR利用以限制性内切核酸酶(RE)XbaI消化的特异性寡核苷酸引物BiPF(gtatct aga aca atg aag ctc tcc ctg gtg g)和BiPR(cag tct aga cta caa ctc atc tttttc tgc tgt)从商用人成人肝cDNA文库(Clontech)中扩增编码全长人GRP78/BiP(基因HSPA5Acc.号AF216292)的cDNA,并克隆到分别在酿酒酵母PGK1或毕赤酵母AOX1启动子控制下的酵母表达载体pFDC(等,2011)和pPIC3.5K(Intvitrogen)的RE位点XbaI和AvrII中。通过DNA测序验证克隆的HSPA5基因序列(从起始密码子ATG开始并以终止密码子TAG结束),并将所产生的质粒pFDC-BiP和pPIC3.5K-BiP分别用于转化酿酒酵母和毕赤酵母。通过对甲醛的抗性和包藏多拷贝自发复制质粒pFDC-BiP来选择酿酒酵母转化体,而根据本领域已知的标准程序通过对G418的抗性来选择多拷贝毕赤酵母转化体,并选择最有效分泌BiP蛋白的株进行进一步实验。两种酵母均用于表达包含天然N端信号肽的全长GRP78/BiP蛋白。酿酒酵母和毕赤酵母均分泌GRP78/BiP蛋白产物到培养基中。分泌在所选择的毕赤酵母克隆中更有效。转化有质粒pFDC-BiP的酿酒酵母AH22株的40倍浓缩的培养基如图1所示(泳道2),而最有效的所选择的毕赤酵母克隆的8μL未浓缩的培养基如图3A所示(泳道rBiP;泳道C代表来自转化有不含人基因的空载体pPIC3.5K的毕赤酵母的对照培养基,而泳道M是具有所表示分子量的蛋白标记物)。
在表达重组人BiP后,通过离心从培养基中分离细胞,对酵母生长培养基进一步进行预过滤,随后通过0.2μM滤器对所分泌的蛋白进行微孔过滤。微孔过滤后,利用50kDa截留膜的盒通过切向超滤将蛋白浓缩并转移到结合缓冲液(20mM HEPES,50mM NaCl,10mMMgCl2,pH 7.5)中。蛋白进而与在相同缓冲液中达到平衡的8AH-ATP-琼脂糖(JenaBioscience)混合,并以成批形式在4℃温育2~3小时。以20个柱体积的结合缓冲液洗涤从而去除未结合的蛋白,以等柱体积的洗脱缓冲液(20mM HEPES,50mM NaCl,10mM MgCl2,5mMATP,pH 7.5)洗脱结合的蛋白。通过SDS-PAGE分析洗脱级分。三个依次的洗脱级分表明约95%纯的人GRP78/BiP蛋白。将这些级分汇集,并相对ATP酶缓冲液(50mM HEPES,50mMNaCl,2mM MgCl2,5mM ATP,pH 6.8)或BiP储存缓冲液(20mM Tris-HCl,350mM NaCl,0.5mMDTT,10%甘油,pH 8.0)进行透析。所述纯化程序足以达到约95%纯度的分泌的重组人BiP。在酿酒酵母和毕赤酵母表达系统中所获得的产量分别为约10mg/1L培养基和20mg/1L培养基。
图4显示了酿酒酵母的酵母培养基和纯化的重组人BiP样品的SDS-PAGE分析。A——酿酒酵母中人BiP表达后的酵母培养基(20×浓缩的培养基上清);B——未过滤后的酵母生长培养基;C——切向超滤后酵母生长培养基的20×浓缩的蛋白;D——通过ATP亲和层析从酿酒酵母纯化的3μg的分泌的重组人BiP蛋白。M——分子量在左侧显示的蛋白标志物。未显示从毕赤酵母纯化的人BiP的SDS-PAGE分析,但其与酿酒酵母的相似。
纯化的分泌的GRP78/BiP蛋白的条带从SDS-PAA凝胶上切下,并利用生物化学研究所(Vilnius,Lithuania)的蛋白质组学中心的服务通过胰蛋白酶消化和MALDI-TOF/TOF串联MS/MS(质谱)以及UPLC/MSE法进行鉴定。胰蛋白酶化肽质量指纹确认了纯化的分泌蛋白代表人GRP78/BiP,这通过两种方法以高水平置信度和约57%序列覆盖鉴定(图5)。图5显示了GRP78_人蛋白(UniProt KB数据库中的Acc.编号P11021)的鉴定的肽(以粗体标出)。本发明人通过该方法不能鉴定对应于人细胞的天然成熟GRP78/BiP的N端序列的N端胰蛋白酶化肽。然而,在UPLC/MSE方法中利用PLGS(ProteinLynx Global Service)搜索引擎在UniProtKB数据库中进行检索鉴定了C端人GRP78/BiP肽(Y)GSAGPPPTGEEDTAEKDEL(-),其在图5中标有下划线。这表明所分泌的人BiP蛋白具有完好的C端氨基酸序列,包括KDEL ER保留/回收信号。此外,利用Agilent Q-TOF 6520质谱仪通过电喷雾质谱(ESI-MS)测定酿酒酵母分泌的和毕赤酵母分泌的BiP蛋白的分子量。完整的酿酒酵母来源的重组GRP78/BiP蛋白分子的ESI-MS显示出约70478Da的分子量,恰好对应于成熟人GRP78/BiP(19~654aa)的理论预测质量(图6,上图)。而毕赤酵母分泌的BiP蛋白显示出相似但稍有不同的分子量70482.74Da(图6,下图),其比成熟人GRP78/BiP(70478.57Da)的预测质量仅大4Da。本发明人推测这一差异可能源自对酵母来源的人BiP进行分析的缓冲液不同。在酿酒酵母分泌的BiP蛋白的情况下,从ATP酶缓冲液(50mM HEPES,50mM NaCl,2mM MgCl2,5mM ATP,pH 6.8)中直接取样,而毕赤酵母来源的人GRP78/BiP则从含有DTT的BiP储存缓冲液(20mM Tris-HCl,350mM NaCl,0.5mM DTT,10%甘油,pH 8.0)中取样进行分析。毕赤酵母表达的BiP蛋白的增加的分子量有可能是含DTT样品中的还原型半胱氨酸所决定的。
另外,通过Edman降解的N端测序确认来自两种酵母的重组蛋白的前5个N端氨基酸均为NH2-EEEDK(图6),对应于在信号切割后的成熟人BiP蛋白的N端序列(表1)。综上,这些结果表明人BiP蛋白的天然ER信号序列在酵母细胞中得到识别和正确加工,并且可以使重组蛋白转位到ER中,然后出乎预料地分泌到酵母细胞外侧。并且,结果证明从酵母细胞纯化的分泌的人GRP78/BiP蛋白不具有任何修饰。
根据所公开发明产生的GRP78/BiP蛋白显示出产物的正确折叠和活性。利用Wei和Hendershot,1995所述的方法,通过对从酿酒酵母和毕赤酵母纯化的重组BiP蛋白的部分蛋白水解来分析评价正确折叠。结果在图7中显示,展示出来自酿酒酵母(图7A)和毕赤酵母(图7B)的BiP的部分蛋白水解:将从酵母培养基纯化的5μg人BiP蛋白加载到各泳道上:1——不具有蛋白酶;2、3和4——在存在100μM ATP(泳道3)或100μM ADP(泳道4)或不存在任何核苷酸(泳道2)的情况下以2μg的蛋白酶K处理。在ATP酶缓冲液(50mM HEPES,pH=6.8,50mM NaCl,2mM MgCl2)中以65μl体积37℃进行反应25分钟,然后通过加入10μl的1mg/mlPMSF终止反应,并冰上温育30分钟(根据Wei和Hendershot,1995)。对消化的BiP蛋白通过SDS-PAGE进一步分析。M——分子量标准(Fermentas,Lithuania,SM0671)。酿酒酵母表达的BiP蛋白结合ATP,并且这保护了约60kDa片段免受蛋白酶K水解,而ADP的结合保护了约44kDa片段(图7A)。相似的数据此前用于证明天然哺乳动物表达(Kassenbrock和Kelly,1989)和大肠杆菌表达的重组BiP蛋白(Wei和Hendershot,1995)的正确折叠。
对于酵母表达的蛋白的活性,采用了GRP78/BiP的ATP酶活性测试,还使用了大肠杆菌表达的类似物作为平行对照。结果如图8所示。大肠杆菌产生的BiP蛋白购自NordicBioSite(目录号SPR-119),而酵母表达的蛋白在本研究中纯化。在50μl体积中反应进行如下:1μg的重组BiP蛋白(或对于阴性对照为等体积的缓冲液)与20mM KCl和20μM ATP在ATP酶缓冲液(50mM HEPES,pH=6.8,50mM NaCl,2mM MgCl2)中25℃温育75分钟。利用Malachite Green Phosphate测试试剂盒(Cayman Chemical)根据制造商的建议(所进行测试的具体程序如Bernal-Bayard等,2010所述)通过分光光度计(TECAN200,波长620nm至650nm)测定从ATP上释放的磷酸盐的浓度。如图8所示,酵母表达的分泌的BiP分子伴侣蛋白活性比商购大肠杆菌产品高约3倍(在相同时间里通过相同量的蛋白水解的ATP约6.3μM相比于约2.1μM)。这一显著差异表明酵母表达的产物的优势。毕赤酵母来源的BiP的ATP结合和对约60kDa结构域的保护、以及ADP的约44kDa片段与酿酒酵母来源的BiP相似(图7B)。也测定了毕赤酵母表达的BiP的ATP酶活性,其显示出与酿酒酵母表达的类似物相似的结果(图8,毕赤酵母表达的BiP的平均值稍高于酿酒酵母类似物,但在误差范围内),比大肠杆菌表达的产物高约3倍。
为了解释酵母和细菌表达的人BiP蛋白之间活性的这种显著差异,本发明人进行了进一步实验,包括利用天然PAGE测试BiP寡聚化。根据Freiden等,1992的规程对酵母表达的BiP蛋白进行天然PAGE程序,该规程用于评价天然哺乳动物犬BiP(Freiden等,1992)和大肠杆菌表达的仓鼠BiP蛋白(Wei和Hendershot,1995)的寡聚化。酿酒酵母来源的人BiP蛋白的天然PAGE如图9所示。从酿酒酵母培养基纯化的5μg人BiP蛋白加载在凝胶泳道上,而5μg的BSA用作天然PAGE的分子量标记物。所观察到的大约分子量在图9中标示。未显示毕赤酵母来源的人BiP的天然PAGE,但其显现出非常相似的结果。该测试证明酵母来源的分泌的人BiP蛋白主要以单体形式存在。在细胞中,BiP以单体和二聚体存在(Freiden等,1992;Wei和Hendershot,1995)。相反,发现大肠杆菌表达的BiP蛋白主要以二聚体形式存在,不过也存在一些单体和更高级的寡聚体(Blond-Elguindi等,1993;Wei和Hendershot,1995)。因此,寡聚状态的这些差异可能与重组人BiP蛋白的不同酶活性有关。此外,酵母表达的重组BiP蛋白在整个酵母分泌途径过程中经历蛋白质量控制;而大肠杆菌合成的BiP则通过捕获所有表达的BiP蛋白分子来纯化,而与其折叠状态无关。
实施例2.人钙网蛋白的天然信号肽在酵母中介导正确加工的成熟重组钙网蛋白的有效分泌
越来越多的数据将钙网蛋白与ER外侧的亚细胞定位中的多种不同功能关联起来。对蛋白功能的分析需要大量正确折叠的生物活性蛋白。在本研究中,本发明人引入酿酒酵母和毕赤酵母作为优秀宿主来产生人钙网蛋白。分泌的数据证明人钙网蛋白的天然信号肽在酵母细胞中得到识别和正确加工,并引起蛋白分泌。分泌使得可以从酵母培养基中简单地一步纯化重组钙网蛋白,产量在酿酒酵母和毕赤酵母中分别超过30mg/L和100mg/L。对酵母表达的分泌的重组人钙网蛋白的分析揭示出其具有与人细胞中相同的天然氨基酸序列,并且在重组产物中不存在非天然修饰。另外,胰蛋白酶的有限蛋白水解表明酵母来源的钙网蛋白是正确折叠的Ca2+结合蛋白。最终,重组分泌的产物显得具有生物活性并在伤口愈合刮擦平板测试中诱导细胞增殖和人成纤维细胞的迁移。
通过PCR利用以限制性内切核酸酶(RE)XbaI消化的特异性寡核苷酸引物CRTF(gtatct aga aca atg ctg cta tcc gtg ccg ttg)和CRTR(cag tct aga cta cag ctc gtcctt ggc ctg)从商用人成人肝cDNA文库(Clontech)扩增编码全长人钙网蛋白(Acc.编号M84739)的cDNA,并克隆到分别在酿酒酵母PGK1或毕赤酵母AOX1启动子控制下的酵母表达载体pFDC(等,2011)和pPIC3.5K(Intvitrogen)的RE位点XbaI和AvrII中。通过DNA测序验证克隆的CRT基因序列(从起始密码子ATG开始并以终止密码子TAG结束),并将所产生的质粒pFDC-CRT和pPIC3.5K-CRT分别用于转化酿酒酵母和毕赤酵母。通过对甲醛的抗性和包藏多拷贝自发复制质粒质粒pFDC-CRT来选择酿酒酵母转化体,而根据本领域已知的标准程序通过对G418的抗性来选择多拷贝毕赤酵母转化体,并选择最有效分泌BiP蛋白的株进行进一步实验。两种酵母均用于表达包含天然N端信号肽的全长CRT蛋白。
在表达重组人钙网蛋白后,通过离心从培养基中分离细胞,对酵母生长培养基进一步进行预过滤,随后通过0.2μM滤器对所分泌的蛋白进行微孔过滤。微孔过滤后,利用100kDa截留膜的盒通过切向超滤将蛋白浓缩并转移到结合缓冲液(20mM Tris-HCl,pH8.0)中。进而通过离子交换色谱在Sepharose Q上纯化蛋白。所述纯化程序足以达到90%纯度的分泌的重组人钙网蛋白。在酿酒酵母和毕赤酵母表达系统中所获得的产量分别为约30mg/1L培养基和100mg/1L培养基。
图10显示了酵母培养基和纯化的重组人钙网蛋白样品的SDS-PAGE分析。上图在毕赤酵母(10×浓缩的培养基上清)和酿酒酵母(30×浓缩的培养基上清)中CRT表达后的酵母培养基。A——来自不具有CRT基因的对照酵母株的培养基;B——来自表达人CRT的酵母株的培养基。下图——纯化的分泌的重组人CRT蛋白(C泳道)。M——蛋白分子量标记物。
胰蛋白酶化肽质量指纹确认纯化的分泌蛋白代表人钙网蛋白(图11,鉴定的肽以粗体标出)。此外,鉴定了N端胰蛋白酶化肽(EPAVYFK)其对应于来自人细胞的天然成熟钙网蛋白的N端序列。此外。通过对酵母来源的全重组钙网蛋白的ESI-MS获得了重要结果。毕赤酵母分泌的和酿酒酵母分泌的CRT蛋白均显示出约46466Da的分子量,准确对应于成熟人CRT的理论预测质量(18aa~417aa)(图12)。另外,通过Edman降解的N端测序确认来自两种酵母的重组蛋白的前5个N端氨基酸均为NH2-EPAVY,对应于在信号切割后的成熟人CRT蛋白的N端序列(表1)。总之,这些结果表明人CRT蛋白的天然ER信号序列在酵母细胞中得到识别和正确加工,并且可以使重组蛋白转位到ER中,然后出乎预料地分泌到酵母细胞外侧。并且,结果证明从酵母细胞纯化的分泌的人钙网蛋白不具有任何修饰。
以胰蛋白酶对钙网蛋白的部分消化(根据Corbett等,2000,Eur J Biochem.268:2558-65;等,2001,J Biol Chem.275:27177-85)用于显示酵母表达的hCRT的正确折叠和Ca2+结合。hCRT在含3mM CaCl2的储存缓冲液中稀释至1mg/ml的浓度。在50μl体积中通过加入1μl的0.5mg/ml胰蛋白酶(hCRT:胰蛋白酶比例为100:1(w/w))进行消化。在对照管中,加入EDTA至5mM浓度来去除钙。还采用了不含有胰蛋白酶和EDTA的对照。在10分钟和60分钟这两个时间点后通过加入1mM PMSF终止反应。煮沸样品,加载到凝胶上并进行SDS-PAGE。结果如图13所示:从毕赤酵母培养基纯化的重组人钙网蛋白的胰蛋白酶消化。U——具有5μg hCRT的未处理的样品,在不具有钙和EDTA的情况下在37℃温育;对于其他样品,在储存缓冲液(20mM Tris-HCl,pH 7.5,100mM NaCl,3mM CaCl2)中于37℃进行反应。在对照管中,加入EDTA至5mM浓度来去除钙。M——蛋白分子量标记(“Page标尺未染色蛋白梯度物”,Fermentas,#26614)。未显示对酿酒酵母来源的CRT的分析,但获得了相同的结果。
以胰蛋白酶进行的消化揭示出对蛋白酶消化有抗性的两个CRT条带:分别约50kDa和约23kDa。此前等,2001报道了胰蛋白酶将人胎盘CRT部分消化为约50kDa片段。此外,他们报道了加入Ca2+增加了天然CRT的蛋白水解速率。本发明人也观察到该效应(图13;在胰蛋白酶消化后比较含有钙和不含有钙的hCRT样品)。然而,加入钙导致酵母表达的hCRT的约23kDa片段对胰蛋白酶消化有抗性(图13)。这符合对在毕赤酵母中表达的兔CRT的报道数据,因为在钙结合后,约27kDa相似CRT条带也抵抗蛋白酶消化(Corbett等,2000)。以胰蛋白酶进行有限蛋白水解被认为是对重组钙网蛋白质量的最佳测试,并用于分析商业CRT产品(Abcam,ab15729,见“性质”)。因此,以胰蛋白酶进行有限消化表明酵母表达的人CRT是正确折叠的Ca2+结合蛋白,并具有与天然人胎盘CRT(等,2001)和毕赤酵母表达的重组兔CRT(Corbett等,2000)相似的性质。
在证明酵母表达的hCRT的正确折叠和钙结合性质后,本发明人评价了毕赤酵母表达的和酿酒酵母表达的人重组蛋白产物的生物活性。此前显示细菌大肠杆菌表达的重组人钙网蛋白在鼠和猪动物模型中均通过多种生物学效应改善了伤口愈合(Gold等,2006;Nanney等,2008;Gold等,2010;Greives等,2012)。因此,特别重要的是在与伤口愈合效果直接相关的生物活性的平行测试中比较大肠杆菌和酵母表达的hCRT。对于细胞增殖和迁移测试,在此本发明人利用了来自细菌的相同的人CRT,其此前显示出在鼠和猪正常和皮肤损伤受损动物模型中通过引起表皮迁移和颗粒化组织形成的剂量依赖性增长而体内改善伤口愈合(Gold等,2006;Greives等,2012)。将酵母表达的hCRT蛋白与来自细菌的重组hCRT(来自M.Michalak,University of Alberta,Edmonton Alberta,加拿大)平行进行测试。根据Nanney等,2008;和Greives等,2012进行细胞增殖的体外测试。简言之,人成纤维细胞以1,000细胞/孔接种在96孔板中,并生长至50%融合。在0.5%FBS培养基中24小时饥饿后,在0.5%培养基中施加处理24小时。然后将细胞在MTS溶液中温育1小时,并测定490nm的吸收。与从细菌大肠杆菌纯化的相同蛋白相比,酿酒酵母表达的和毕赤酵母表达的人钙网蛋白均显示出对人成纤维细胞增殖的显著高的诱导(表2和图14)。这可通过以下事实来解释:酵母分泌的hCRT在整个酵母分泌途径中必须经历蛋白质量控制,这使得仅分泌正确折叠的蛋白;同时大肠杆菌合成的类似物通过捕获所有表达的hCRT分子来进行纯化而与其折叠状态无关。
另一生物hCRT活性测试是伤口愈合刮擦平板测试(Nanney等,2008;Greives等,2012)。人成纤维细胞以10,000细胞/孔接种在24孔板中,并生长至80%融合。在0.5%FBS培养基中24小时饥饿后,在孔中间以200μl移液管尖端产生刮擦。在0.5%培养基中施加处理24小时。在0小时和6小时获取图片。结果显示出大肠杆菌表达的hCRT对人成纤维细胞迁移的诱导的平均值稍高于源自酵母的类似物,但在误差范围内(表3和图15)。细菌表达的和酵母表达的hCRT均分别比阴性(0.5%FBS(胎牛血清))和阳性(10%FBS)对照显示出更多的细胞迁移。可认为酵母表达的重组hCRT具有生物学活性,并与来自细菌的hCRT类似物以相同程度诱导人成纤维细胞的迁移。
表3.分别在细菌、酿酒酵母和毕赤酵母中表达的hCRT诱导的人成纤维细胞的细胞迁移
注:结果的图示在图15中显示
综上,本发明人在此证明人钙网蛋白的天然信号在酵母细胞中被正确切割并驱动分泌。酵母分泌的人钙网蛋白的序列完全对应于来自人细胞的成熟蛋白,并且蛋白不含有酵母来源的修饰。因此,酵母细胞是产生大量正确折叠的天然重组人钙网蛋白的优异宿主。
实施例3.人ERp57二硫键异构酶的天然信号肽介导活性天然重组ERp57蛋白在酿酒酵母和毕赤酵母中的分泌
人ERp57蛋白是主要的糖蛋白特异性二硫键异构酶,其与ER凝集素分子伴侣蛋白钙网蛋白和钙连蛋白协调促进ER中糖蛋白前体的折叠。
越来越多的数据将ERp57蛋白与ER之外的其他亚细胞定位中的多种不同功能关联起来。这些功能通常未能很好得到了解,需要进一步的研究和更深入的分析。对蛋白功能的分析需要大量尽可能与其天然状态相似的生物活性蛋白。
引入酿酒酵母作为优秀宿主来产生人ERp57蛋白。本发明人发现人ERp57蛋白的内源信号肽在酵母细胞中被识别和正确加工,这随后导致ERp57蛋白的分泌。分泌的重组ERp57蛋白具有天然氨基酸序列,并具有生物学活性。此外,分泌使得可以简单地一步纯化天然重组人ERp57蛋白,产量高达10mg/L。
该实施例显示:人ERp57的天然信号肽在酿酒酵母中被正确加工,天然序列人ERp57在酿酒酵母中得到分泌,并且所分泌的天然重组人ERp57具有生物学活性。
DNA操作用的酶和试剂盒来自ThermoScientific。引物来自IDT。
对于质粒、株、培养基、酵母转化和培养,所有的DNA操作根据标准程序进行(Sambrook和Russell,2001)。在大肠杆菌DH5αF’细胞中筛选细菌重组物。酿酒酵母株AH22MATa leu2his4用于表达实验。酿酒酵母细胞的转化通过常规方法进行(Sambrook和Russell,2001)。对甲醛有抗性的转化体的选择在补充有4mM甲醛的YEPD(酵母提取1%,蛋白胨2%,右旋葡萄糖2%)琼脂上进行。酿酒酵母转化体在补充有4mM甲醛的YEPD培养基中生长。
对于蛋白表达和纯化,使携带人PDIA3基因的酵母细胞在YEPD培养基中生长36h。在2000×g离心10分钟将细胞从培养基中分离。酵母生长培养基进而通过定性滤纸(VWR,目录号516-0812)进行预过滤,随后通过1.6μM(SartoriusStedim Biotech,目录号FT-3-1101-047)、0.45μM(SartoriusStedim Biotech,目录号15406-47)和0.2μM(SartoriusStedim Biotech,目录号15407-47-MIN)过滤器进行微孔过滤。在微孔过滤后,利用具有50kDa截留膜的盒(SartoriusStedim Biotech,目录号VF20P3)通过切向超滤将来自培养基的蛋白浓缩,并转移到结合缓冲液(20mM Tris-HCl,pH 8.0)。将蛋白与肝素Sepharose(GE Healthcare,目录号17-0998-01)以批量形式温育30分钟。去除未结合的蛋白,对结合的蛋白以分步NaCl梯度(150mM-250mM-350mM)洗脱。洗脱级分通过SDS-PAGE进行分析。所有均显示出超过90%纯度的人ERp57蛋白。汇集所有级分,并对20mM Tris-HCl,pH8.0NaCl 100mM缓冲液进行透析。
根据此前所述(Hirano等,1995;Frickel等,2004),进行胰岛素浑浊度测试。测试混合物如下制备,在皿中加入50μl胰岛素(Sigma-Aldrich,目录号I2643)(1mg/ml,在100mM乙酸钾中pH 7.5,2mM EDTA)加测试蛋白和水,至终体积60μl。通过在皿中加入2μl二硫苏糖醇(10mM)而使反应开始。随后对皿进行充分混合,并放置在分光光度计(Tecan’s InfiniteM200)中。利用60s记录在650nm进行测试。对持续达到60分钟的测试不再混合。将聚集的开始限定为OD650达到0.025值的时候。将其发生时的酶浓度对聚集的开始进行作图,从而获得各氧化还原酶的还原酶活性的浓度依赖的活性曲线。大肠杆菌硫氧还蛋白购自Sigma-Aldrich(目录号T0910),大肠杆菌产生的重组人ERp57购自Nordic BioSite(目录号PAT-80438-1),用作对照。
通过Edman降解对酵母分泌的人ERp57蛋白的N端测序由AltaBioscience进行。利用Agilent Q-TOF 6520质谱仪通过电喷雾质谱测定蛋白的分子量。通过Roti-Nanoquant蛋白测试(Carl Roth Gmbh.,目录号K880)确定蛋白浓度。
由图像扫描仪III(GE Healthcare)扫描的SDS-PAGE凝胶的密度分析通过ImageQuant TL(GE Healthcare)软件利用默认设置进行。
用于SDS-PAGE分析的从酵母生长培养基沉淀蛋白根据限定的甲醇-氯仿-水混合物根据此前所述(Wessel和Flügge,1984)进行。对于构建人ERp57酵母表达载体,将ERp57编码基因(PDIA3,Acc.编号U42068)克隆在pFDC载体中的组成型酵母PGK1启动子下,产生如此前所述的pFDC-hERp57质粒(等,2011)。简言之,利用在基因两端产生XbaI限制位点并可以在pFDC载体中在酵母PGK1启动子和终止子之间XbaI位点中进行限制性克隆的引物,从人成人肝cDNA文库(Clontech)中克隆人PDIA3基因。酵母表达载体pFDC-hERp57转化到酿酒酵母株AH22中。具有人PDIA3基因的酵母细胞在YEPD培养基中生长,并如上所述将分泌的天然重组人ERp57蛋白纯化至90%纯度。纯化程序如图16所示:A——粗酵母生长培养基(20×浓缩),B——微孔过滤后的酵母生长培养基(20×浓缩),C——切向超滤后在中的结合缓冲液来自酵母生长培养基的20×浓缩蛋白;D——纯化的酵母来源的重组人ERp57蛋白(2μg),M——未染色蛋白梯度物(ThermoScientific,目录号26614)。根据对SDS–PAGE凝胶的密度分析获得的数据,分泌的人ERp57蛋白构成总的酵母分泌蛋白的约30%(图16泳道A),随后的微孔过滤将纯度提高至约50%(图16泳道B),并且一步亲和层析利用肝素Sepharose足以达到90%的纯度(图16泳道D)。从1L培养基所获得的产量为约9mg,纯化效率达到90%。总之,人ERp57在酵母生长培养基中的分泌使得可以简单和成本有效地纯化天然重组蛋白。
进行通过Edman降解进行的N端测序以鉴定和表征纯化的分泌蛋白。重组蛋白的前5个N端氨基酸是NH2-SDVLE,对应于信号切割后的成熟人ERp57蛋白的N端序列(Charnock-Jones等,1996)。这些结果表明人ERp57蛋白的天然ER信号序列在酵母细胞中得到识别和正确加工,这使得重组蛋白转位到ER中,随后出乎预料地分泌到酵母细胞外。由于天然分泌信号很少有效因而通常采用酿酒酵母α配合因子信号序列将重组蛋白在酵母中分泌(Sleep等,1990;Ferrarese等,1998;Guo和Ma,2008),不过使用天然分泌信号提供了数种优势。首先,其简化了基因的克隆,并且最重要的是如所公开的数据显示其使得可以分泌不具有任何额外氨基酸的重组蛋白。相反,在利用非天然信号序列时重组产物中通常引入一些额外的氨基酸(Andrin等,2000)。
酵母来源的纯化的人ERp57蛋白的质谱结果显示出54265.55道尔顿的质量,准确对应于成熟人ERp57(25–505aa)的理论预测质量(图17)。这表明以下两点:(a)重组人ERp57蛋白是与成熟人ERp57完全相同的多肽(包括在蛋白C端的预测的ER保留信号QEDL),和(b)其不具有酵母来源的修饰——对于重组蛋白是非常重要的特征。此外,质谱分析揭示出蛋白具有高纯度(图17)。另外,本发明人进行了酿酒酵母纯化的重组分泌的ERp57的胰蛋白酶化肽质量指纹分析,并且已经鉴定了N端肽SDVLELTDDNFESR(图18,以粗体标出),其对应于在数据库检索中作为PDIA3_Human(Acc.编号P30101)鉴定的成熟人ERp57蛋白的N末端。结合N端测序和ESI-MS数据,这又一次证明分泌的重组人ERp57蛋白产物的正确加工。
通常作为人细胞中ER保留信号的完好QEDL序列存在于重组人ERp57中,这带来了以下问题:酵母细胞分泌人蛋白的原因,和蛋白通常在ER中的保留。在一些情况下,发现ERp57在人细胞的表面上,这对于该蛋白表明数种重要功能(Turano等,2011)。酿酒酵母细胞对人ERp57蛋白的分泌可通过酵母对于ER驻留蛋白的回收对HDEL信号比对QDEL信号更偏好来解释(Dean和Pelham,1990),但这不是本情形中的原因,因为以HDEL序列替换QEDL不抑制ERp57的分泌(本发明人未公开的数据)。另外,可以排除酵母ER回收机构的超负荷是人ERp57分泌的原因,这是因为利用相同pFDC载体以天然HDEL ER回收序列进行酵母KAR2蛋白的过表达没有引起该蛋白的分泌(本发明人未公开的数据)。此外,利用相同pFDC载体还表达了与人ERp57和酵母PDI蛋白同源并且含有KDEL ER回收序列的人PDI,在该情况下没有观察到重组蛋白的分泌(本发明人未公开的数据)。这些实验表明ER管腔蛋白的保留很复杂,并且机制仍未解决,该机制并不严格依赖HDEL/KDEL回收机制。本发明人的发现(酵母细胞对人ERp57的分泌)可作为研究该现象的方便模型。
通过胰岛素浑浊度测试测定酵母来源的重组人ERp57蛋白的活性,胰岛素浑浊度测试通常用于表征蛋白二硫键异构酶(Hirano等,1995;Antoniou等,2000;Frickel等,2004;Celli和Jaiswal,2003)。重组ERp57展示出硫醇依赖的还原酶活性,通过二硫苏糖醇催化胰岛素二硫键的还原(图19)。将该蛋白的还原酶活性与大肠杆菌硫氧还蛋白和商售大肠杆菌来源的重组人ERp57进行比较。利用胰岛素沉淀法测试的酵母来源的重组人ERp57蛋白的硫醇依赖的催化活性如图19所示:测试各种浓度的大肠杆菌硫氧还蛋白(◆)、纯化的酿酒酵母分泌的人重组ERp57(■)和从大肠杆菌纯化的人重组ERp57(▲)催化以0.33mMDTT对130mM胰岛素进行还原的能力。将聚集的开始限定为650nm处的光密度达到0.025的值的时候,并对所用催化剂的浓度作图。数据是3次独立实验的平均值。误差条过小而不可视。没有测定重组大肠杆菌来源的人ERp57在高浓度的活性,因为没有大量蛋白。如图19所示,两种重组人ERp57蛋白催化胰岛素还原的速率慢于硫氧还蛋白,与此前研究的结果相符(Hirano等,1995;Frickel等,2004)。不过,酵母分泌的人ERp57的活性稍微但确凿地高于大肠杆菌来源的蛋白(注:蛋白的活性越高,则在图19图谱中Y轴上的位置越低,这是因为胰岛素沉淀的时间越短表示反应的催化越快)。这可以通过以下事实来解释:酵母分泌的人ERp57必须在整个酵母分泌途径过程中经历蛋白质量控制,这使得仅分泌正确折叠的蛋白,而大肠杆菌合成的ERp57通过捕获所有含组氨酸标签的蛋白来纯化,而无论其折叠状态如何。总之,产生天然重组人ERp57的本发明方法产生了活性蛋白,因此使其能够应用于各种研究。
通过酿酒酵母,本发明人还进行了人ERp57在毕赤酵母系统中的表达实验。与表达编码BiP和钙网蛋白的人基因的情况相似,PDIA3基因的全cDNA克隆到受AOX1启动子控制的pPIC3.5K载体中。然而,在ERp57的情况中,在制造商(Invitrogen)建议的标准条件下的表达不太成功,这是因为ERp57分泌水平大大低于该蛋白在酿酒酵母中的分泌(未显示)。本发明人随后利用优化的毕赤酵母培养条件,在20℃,培养基中含有1%YNB、2%蛋白胨、1%酵母提取物、100mM磷酸钾缓冲(pH 6.0),并分别包含用于产生酵母生物质或诱导PDIA3基因表达的1%甘油或1%甲醇。在这些优化条件下,本发明人实现了ERp57向培养基中的高水平分泌。在加载未浓缩的培养基样品后在SDS-PAGE中可见清楚的人ERp57蛋白条带(图3C泳道rERp57)。然后利用与酿酒酵母表达的ERp57完全相同的方法,将蛋白从毕赤酵母培养基中进行纯化。纯化程序从1升的毕赤酵母培养基中产生约30mg的纯化的人蛋白。对毕赤酵母来源的人ERp57蛋白的SDS-PAGE分析如图20所示。5μg的纯化蛋白加载在SDS-PAA凝胶泳道上。通过Edman降解进行的N端测序展示出与毕赤酵母表达的人ERp57相同的N端氨基酸序列NH2-SDVLE。如上所述,对于在酿酒酵母中表达的类似蛋白获得了相同结果。因此,两种酵母均正确加工和分泌了大量的天然重组人ERp57蛋白。
本实施例提供了产生天然重组人ERp57蛋白的简单方法。所示例的利用酿酒酵母和毕赤酵母细胞的系统使得可在真核内质网中产生人硫醇-二硫键氧化还原酶ERp57,在真核内质网环境中非常适合于所述蛋白的成熟。所公开的方法表明人ERp57蛋白的天然信号可以得到正确切割并驱动其分泌到酵母细胞外。分泌的天然重组人ERp57蛋白的氨基酸序列完全对应于来自人细胞的成熟蛋白,没有酵母来源的修饰。人ERp57蛋白向酵母培养基中的分泌不仅使得可以有效地简单并成本有效地一步纯化蛋白,并且还能确保其具有比大肠杆菌产生的ERp57蛋白更高的活性。酵母是产生人ERp57蛋白的优异宿主,并且还能够作为研究ER管腔蛋白在ER中保留的方便模型。
本说明书所示和所述的实施方式仅是作为本领域技术人员的本发明人的具体实施方式,不具有任何方面的限制性。因此,可以对这些实施方式进行各种改变、修改或变化,而不背离所附权利要求范围中的本发明的精神。所引用的参考文件明确地通过引用以整体并入本文。
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Claims (13)
1.一种产生人内质网重组分子伴侣蛋白的方法,所述方法包括
(a)以核苷酸序列转化酵母细胞,所述核苷酸序列包含针对含有在人内质网分子伴侣蛋白的N端的天然人内质网分子伴侣蛋白信号序列的多肽的编码序列;
(b)在人内质网重组分子伴侣蛋白以分泌的形式表达的条件下培养所述酵母细胞;和
(c)从培养基中提取所述人内质网重组分子伴侣蛋白。
2.如权利要求1所述的方法,其中,所述酵母是酿酒酵母。
3.如权利要求1所述的方法,其中,所述酵母是毕赤酵母。
4.如权利要求1、2或3所述的方法,其中,所述人内质网重组分子伴侣蛋白选自由BiP/GRP78、钙网蛋白和ERp57组成的组。
5.如权利要求4所述的方法,其中,所述人内质网重组分子伴侣蛋白是BiP/GRP78。
6.如权利要求4所述的方法,其中,所述人内质网重组分子伴侣蛋白是钙网蛋白。
7.如权利要求4所述的方法,其中,所述人内质网重组分子伴侣蛋白是ERp57。
8.如权利要求1~3中任一项所述的方法,其中,所述人内质网重组分子伴侣蛋白是人内质网管腔蛋白。
9.如权利要求1~3和5~7中任一项所述的方法,其中,所述核苷酸序列是包含天然信号序列的全长人分子伴侣cDNA的形式。
10.如权利要求1~3和5~7中任一项所述的方法,其中,所述核苷酸序列不含对标签编码的序列。
11.如权利要求1~3和5~7中任一项所述的方法,其中,所述核苷酸序列包含组氨酸标签的编码序列。
12.如权利要求1~3和5~7中任一项所述的方法,其中,通过微孔过滤、超滤或层析从所述培养基中提取所述人内质网重组分子伴侣蛋白。
13.包含针对含有在人内质网分子伴侣蛋白的N端的天然人内质网分子伴侣蛋白信号序列的多肽的编码序列的核苷酸序列的用途,其用于在酵母中产生分泌的人内质网分子伴侣蛋白。
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