CN112940955B - 一种高效合成乳铁蛋白的毕赤酵母及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高效合成乳铁蛋白的毕赤酵母及其构建方法与应用，本发明在细胞内和内质网中分别表达不同的分子伴侣，进一步优化分子伴侣之间的组合，通过发酵实验发现，不同分子伴侣之间的组合能够导致不同的蛋白分泌水平。其中当分子伴侣分别为HSP70和Sec61a时，乳铁蛋白的分泌得到明显的改善，通过western blot发现乳铁蛋白的表达量增加了约3.8倍，达到了570mg/L。本发明通过不同分子伴侣之间的组合，能够有效的提高乳铁蛋白的表达量。

Description

一种高效合成乳铁蛋白的毕赤酵母及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于代谢工程技术领域，尤其涉及一种高效合成乳铁蛋白的毕赤酵母及其构建方法与应用。

背景技术

乳铁蛋白(Lactoferrin，LF)是一种能够结合铁的糖蛋白，并且是较大的转铁蛋白家族的一部分。乳铁蛋白广泛存在于粘膜分泌物(眼泪，唾液，阴道液，尿液，鼻和支气管分泌物，胆汁，胃肠液)中，尤其在牛初乳和人初乳中含量最高，分别达到1g/L和5g/L。乳铁蛋白是一种包含大约703个氨基酸的单链蛋白，分子量约为80kDa，折叠成两个球形小叶，其二级结构主要由α-螺旋和β-折叠交替排列而成，且α-螺旋明显多于β-折叠；乳铁蛋白的高级结构是在二级结构基础上，由多肽链折叠成。

LF在体内不仅发挥转运铁离子的作用，同时还具有广泛的生物学活性，包括广谱抗菌作用、消炎、抑制肿瘤细胞生长及调节机体免疫反应等，从而具有调节细胞生长，清除有害的自由基并抑制几种有毒化合物形成的功能。因此，LF被认为是一种新型抗菌、抗癌的药物。目前，LF已被添加到许多商业产品中，包括婴儿配方粉、热疗饮料、发酵乳、化妆品和牙膏等。LF的多种促进健康的功能及其在现实生活中的广泛应用激发了越来越多的研究兴趣。

目前，获得乳铁蛋白的方式主要是从牛乳中分离提取，然而，牛乳仅含有0.03-0.49g/L乳铁蛋白。在提取的过程中不仅价格昂贵，而且人体食用异源蛋白可能会带来一定的负面影响，产生抗原反应。为了获得大量乳铁蛋白，同时避免其带来的副作用，研究者基因工程技术大量生产人LF。其中，生产乳铁蛋白的宿主细胞主要包括大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞以及植物细胞。大肠杆菌表达系统缺乏糖基化修饰机制，导致不能生产具有生物活性的乳铁蛋白。哺乳动物细胞和植物细胞虽然能够进行适当的糖基化修饰，但是由于细胞生长周期长、培养复杂，难以实现大规模生产。

在过去的十几年中，研究者以酵母细胞作为宿主进行了人LF的异源表达。酵母表达系统虽然具有生长快，操作简单的特点，还具各翻译后加工和修饰功能，但其系统固有的一些缺陷比如人源性蛋白分子、细胞因子不能在酵母中高效表达，并且蛋白产物容易形成多聚体进而导致蛋白降解。

研究者主要通过优化酵母表达系统中的关键表达元件(启动子、终止子、增强子以及沉默子)，增强外源蛋白的表达水平。但是当外源蛋白在细胞内大量积累时，对细胞分泌系统造成很大的压力，易引起细胞的崩溃，导致外源蛋白的降解，减少蛋白的产量。为了增强外源基因的表达水平，首要解决外源蛋白能够进入内质网并进行正确的折叠和修饰，从而实现外源蛋白的顺利分泌。

发明内容

为解决上述技术问题，促进乳铁蛋白在毕赤酵母中正确折叠，并能够快速的分泌到细胞外，实现增强乳铁蛋白的高效表达，本发明分别在细胞内使用启动子FLD1增加分子伴侣HSP70、Ydj1和GrpE的表达，并验证了分子伴侣不同组合对乳铁蛋白表达量的影响。进一步使用组成型启动子GAP强化内质网中分子伴侣BiP、Sec61a的表达，最后通过将不同分子伴侣进行组合优化，证明HSP70和Sec61a为最佳组合，获得一株乳铁蛋白高效合成的毕赤酵母菌株。本发明不仅实现提高乳铁蛋白表达量的目的，同时也提供了一种增加蛋白表达水平的方法。

本发明的第一个目的是提供一种高效合成乳铁蛋白的毕赤酵母，所述的毕赤酵母强化表达了宿主中的分子伴侣HSP70、Ydj1、GrpE、BiP、Sec61a中的至少一种，所述的宿主异源表达了人源乳铁蛋白。

进一步地，所述的分子伴侣HSP70的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，Ydj1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，GrpE的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，BiP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，Sec61a的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

进一步地，所述的分子伴侣HSP70、Ydj1、GrpE在细胞内表达。

进一步地，所述的分子伴侣BiP、Sec61a在内质网中表达。

进一步地，分子伴侣HSP70、Ydj1、GrpE采用启动子FLD1进行增强表达。

进一步地，分子伴侣BiP、Sec61a采用启动子GAP进行增强表达。

进一步地，所述的宿主为异源表达了人源乳铁蛋白的毕赤酵母GS115。

进一步地，所述的乳铁蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明的第二个目的是提供所述的毕赤酵母的构建方法，包括如下步骤：

S1、分别构建分子伴侣HSP70、Ydj1、GrpE、BiP、Sec61a中至少一种的启动子表达分子伴侣的表达框；

S2、将S1步骤构建的表达框转化到异源表达了人源乳铁蛋白的宿主中，筛选得到重组毕赤酵母。

本发明的第三个目的是提供所述的毕赤酵母在发酵生产乳铁蛋白中的应用。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明在细胞内和内质网中分别表达不同的分子伴侣，进一步优化分子伴侣之间的组合，通过发酵实验发现，不同分子伴侣之间的组合能够导致不同的蛋白分泌水平。其中当分子伴侣分别为HSP70和Sec61a时，乳铁蛋白的分泌得到明显的改善，通过western blot发现乳铁蛋白的表达量增加了约3.8倍，达到了570mg/L。本发明通过不同分子伴侣之间的组合，能够有效的提高乳铁蛋白的表达量。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细说明如后。

附图说明

图1为乳铁蛋白的表达量，其中，1-3：不同分子伴侣组合优化之后乳铁蛋白的产量，1：HSP70和BiP4组合，2：HSP70和Sec61a组合，3：YDJ1和Sec61a组合，4：未经分子伴侣优化的乳铁蛋白产量。

具体实施方式

涉及的检测方法：乳铁蛋白产量使用购自生工生物工程股份有限的ELISA试剂盒进行检测(货号：D711315)，检测方法按照说明书进行。乳铁蛋白基因转录水平使用SYBRGreen方法进行检测。

实施例1：分子伴侣的扩增

以酵母基因组为模板，利用表1所列的引物序列分别扩增对应的分子伴侣，并将PCR产物进行测序鉴定，核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～5所示。

表1扩增分子伴侣的引物序列

实施例2：基因组利用组成型启动子表达分子伴侣

随后通过重叠延伸PCR的方式用FLD1启动子表达HSP70、Ydj1和GrpE并与不同抗生素标签(Kan、Zeo和Bsd)进行整合，然后通过电转化的方式构建重组毕赤酵母。电转之后涂板含有响应抗生素的平板。利用同样的方式构建启动子GAP表达分子伴侣BiP、Sec61a的表达框。最后，在重组菌中对分布不同的分子伴侣进行组合，通过不同浓度抗生素的筛选获得分子伴侣不同比例的重组菌株。

实施例3：重组质粒电转化毕赤酵母

取80μL感受态细胞与10μL线性化重组质粒DNA混合均匀，并转移到-20℃条件下冰浴过的0.2cm电转化杯中，并将装有混合液的电转化杯冰浴5min。调整好电转化仪的参数，置于毕赤酵母档，电压1.5千伏，电容25微法，电阻200欧姆，时间约为5毫秒。电击后，迅速向转化杯中加入1ml冰上预冷的1M山梨醇溶液，轻轻吸打混匀，将混合液吸出转移到离心管中。30℃静置培养1-2h，3000rpm离心5min。弃800μl上清，剩余菌体吹匀，涂布于MD平板上，30℃培养箱中培养2-4天，直至长出单菌落。

实施例4：重组毕赤酵母中分子伴侣转录水平的测定

将上述获得的转化子分别首先在BMGY培养基培养16h，然后离心收集菌体，无菌水洗涤两次，最后将菌体转移到BMMY中，加入1％的甲醇进行诱导，每24h补加甲醇。随后收集菌体，液氮迅速降温冷冻，使用研钵破碎菌体，通过Trizol提取RNA，根据反转录试剂盒说明书获得cDNA，进一步通过购自Takara的荧光定量试剂盒(货号：RR420A)对不同菌体中乳铁蛋白的转录水平进行测定。其中检测分子伴侣转录水平的引物序列如表2所示。

表2分子伴侣qPCR引物序列

检测不同分子伴侣组合对乳铁蛋白产量的影响，结果如表3所示，上述分子伴侣能够在重组菌中正常表达，并且通过不同浓度抗生素筛选能够获得不同拷贝数的重组菌。以低浓度抗生素对应的转录水平记为1。

表3不同抗生素浓度对分子伴侣转录水平的影响

实施例5：重组毕赤酵母中乳铁蛋白的翻译水平的检测

将上述获得的菌株先后利用BMGY和BMMY进行发酵，并且每天添加不同体积的甲醇，保持发酵液中甲醇的终含量为1％，持续发酵5天。然后，离心收集上清液，通过离心浓缩，使用SDS-PAGE和western blot对乳铁蛋白进行定量分析。结果如图1所示，随着发酵时间的延长，乳铁蛋白的表达量逐渐增加，产量最终达到570mg/L。其他分子伴侣对乳铁蛋白产量影响如表4所示。

表4不同分子伴侣组合对乳铁蛋白产量的影响

对比例

对比例为不表达分子伴侣的重组菌株，只利用启动子Paox1表达人源乳铁蛋白基因，加入甲醇的终浓度为1％，然后每天添加甲醇，保持终浓度不变。然后，离心收集上清，浓缩之后通过SDS-PAGE检测蛋白表达量。

以上仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种高效合成乳铁蛋白的毕赤酵母及其构建方法与应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2520

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 1

cggctgagat ctttactcgt gaacgttctc gaaagctctt tgccgaccca ctcttcattc 60

atatataaac aaacacctct ctgccttctc ttcctcacac aatcataaac acaacaacac 120

tcacaaattc tcttaaagct cacagacgaa ttctttctat ttttaatctt tccggcgaac 180

aattctgatc tctaataatg gcgggtaaag gtgaaggtcc agctatcggt atcgatctcg 240

gtacaaccta ctcttgcgtc ggtgtttggc aacatgaccg cgtcgaaatc atcgccaacg 300

atcaaggcaa ccgcaccact ccttcctacg ttgctttcac tgacagcgag cgtctcatcg 360

gggatgctgc caagaatcaa gtcgccatga accctaccaa caccgtcttc gatgctaagc 420

gtctaatcgg aagaagatac agtgatccct ctgttcaagc ggataagagt cactggcctt 480

ttaaggttgt ttccggtcca ggtgagaagc ctatgattgt ggttaaccac aagggagagg 540

agaaacagtt ctctgctgag gaaatctcgt cgatggttct tattaagatg cgggagattg 600

cagaagcttt ccttggttct cctgttaaga acgctgtcgt tacagttcct gcttatttca 660

acgactctca gcgtcaagcg actaaggacg ctggagttat ctctggtctc aacgtgatgc 720

gtatcatcaa tgagccaact gctgctgcta ttgcttacgg tcttgacaag aaggcgtcga 780

gtgttggcga gaagaatgtt ttgatctttg atttgggagg tggtactttt gatgtgtctt 840

tgcttacgat tgaggaaggt atctttgaag tcaaggcaac tgctggtgac acgcatcttg 900

gtggtgagga cttcgacaac aggatggtta atcattttgt tcaggagttt aagaggaaga 960

acaagaagga tattactggg aacccgagag ctttgaggag gcttaggaca gcttgtgagc 1020

gggcgaagag aactctttct tcgactgctc agacgactat agagattgac tctctttttg 1080

agggtattga tttctacact accatcactc gtgctaggtt cgaggagctc aacatggatt 1140

tgtttaggaa gtgtatggag ccagtggaga agtgtttgag ggatgctaag atggacaaga 1200

gcagtgttca tgatgttgtt cttgttggtg gctctacaag gattcccaaa gtgcagcagc 1260

ttttgcaaga cttcttcaat gggaaagagc tctgtaaaag cattaacccg gacgaggctg 1320

ttgcttacgg agcagctgtg caagctgcaa tcttgagcgg tgaagggaat gagaaggtcc 1380

aggacttgtt acttcttgat gtcactcctc tgtccttggg tttggaaact gccggtggtg 1440

ttatgactgt tttgattccg aggaacacca caattccgac caagaaagag cagatattct 1500

ctacctattc agacaaccag cccggtgtac tgatccaggt ctacgaagga gagagggcac 1560

gaacaaagga caacaacctt ttgggaaagt tcgagctcag tggtatacca cctgctccac 1620

gaggtgtacc gcagattact gtctgtttcg acatcgacgc caatggtatc ctgaatgtgt 1680

cggctgagga caagacgact ggtcagaaga acaagatcac aatcacaaac gacaagggaa 1740

ggttatcaaa ggaagagatc gagaagatgg tacaagaggc agagaagtac aaggctgagg 1800

atgaagaaca caagaagaag gtggatgcaa agaacgctct cgagaactat gcatacaaca 1860

tgaggaacac gatcaaggac gagaagatcg catctaagct tgacgcagct gacaagaaga 1920

agattgagga tgcaatcgac caagctattg aatggttaga tgggaatcaa ctggctgagg 1980

cagatgagtt cgaggataag atgaaggagc tcgagtctct ttgcaaccct attattgcaa 2040

gaatgtacca aggagctggg cctgatatgg gtggtgcagg aggaatggat gacgacacac 2100

ctgctggtgg tagcggcggt gctggcccaa agattgaaga agttgattaa gccttttggc 2160

ttttgtttac tctgtttgct tgagattcta gttggtttct tgttcttagt tttatctttc 2220

tatgtcactc tgaaactggt gtgtgatcat tttgatgctt taagaattta gctttaccgt 2280

ttttaaaact cgctctgacc tatgaaagac gactgggcat aatactctac acgaaatata 2340

gtagacaaag tgaaagaagt taagttcatg gtttaaggaa tatgatctta gcactttgat 2400

tttataatta accatccaat atgaatccaa gatctcttgt tatacatatt aaagaaaatt 2460

ttcttcttat ttcaatatag tttatctgaa aaaccgtaca aattgtagtg ggattccata 2520

<210> 2

<211> 1230

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 2

atggttaaag aaactaagtt ttacgatatt ctaggtgttc cagtaactgc cactgatgtc 60

gaaattaaga aagcttatag aaaatgcgcc ttaaaatacc atccagataa gaatccaagt 120

gaggaagctg cagaaaagtt caaagaagct tcagcagcct atgaaatttt atcagatcct 180

gaaaagagag atatatatga ccaatttggt gaagatggtc taagtggtgc tggtggcgct 240

ggcggattcc caggtggtgg attcggtttt ggtgacgata tcttttccca attctttggt 300

gctggtggcg cacaaagacc aagaggtccc caaagaggta aagatatcaa gcatgaaatt 360

tctgcctcac ttgaagaatt atataagggt aggacagcta agttagccct taacaaacag 420

atcctatgta aagaatgtga aggtcgtggt ggtaagaaag gcgccgtcaa gaagtgtacc 480

agctgtaatg gtcaaggtat taaatttgta acaagacaaa tgggtccaat gatccaaaga 540

ttccaaacag agtgtgatgt ctgtcacggt actggtgata tcattgatcc taaggatcgt 600

tgtaaatctt gtaacggtaa gaaagttgaa aacgaaagga agatcctaga agtccatgtc 660

gaaccaggta tgaaagatgg tcaaagaatc gttttcaaag gtgaagctga ccaagcccca 720

gatgtcattc caggtgatgt tgtcttcata gtttctgaga gaccacacaa gagcttcaag 780

agagatggtg atgatttagt atatgaggct gaaattgatc tattgactgc tatcgctggt 840

ggtgaatttg cattggaaca tgtttctggt gattggttaa aggtcggtat tgttccaggt 900

gaagttattg ccccaggtat gcgtaaggtc atcgaaggta aaggtatgcc aattccaaaa 960

tacggtggct atggtaattt aatcatcaaa tttactatca agttcccaga aaaccatttc 1020

acatcagaag aaaacttgaa gaagttagaa gaaattttgc ctccaagaat tgtcccagcc 1080

attccaaaga aagctactgt ggacgaatgt gtactcgcag actttgaccc agccaaatac 1140

aacagaacac gggcctccag gggtggtgca aactatgatt ccgatgaaga agaacaaggt 1200

ggcgaaggtg ttcaatgtgc atctcaatga 1230

<210> 3

<211> 594

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 3

atgagtagta aagaacagaa aacgcctgag gggcaagccc cggaagaaat tatcatggat 60

cagcacgaag agattgaggc agttgagcca gaagcttctg ctgagcaggt ggatccgcgc 120

gatgaaaaag ttgcgaatct cgaagctcag ctggctgaag cccagacccg tgaacgtgac 180

ggcattttgc gtgtaaaagc cgaaatggaa aacctgcgtc gtcgtactga actggatatt 240

gaaaaagccc acaaattcgc gctggagaaa ttcatcaacg aattgctgcc ggtgattgat 300

agcctggatc gtgcgctgga agtggctgat aaagctaacc cggatatgtc tgcgatggtt 360

gaaggcattg agctgacgct gaagtcgatg ctggatgttg tgcgtaagtt tggcgttgaa 420

gtgatcgccg aaactaacgt cccactggac ccgaatgtgc atcaggccat cgcaatggtg 480

gaatctgatg acgttgcgcc aggtaacgta ctgggcatta tgcagaaggg ttatacgctg 540

aatggtcgta cgattcgtgc ggcgatggtt actgtagcga aagcaaaagc ttaa 594

<210> 4

<211> 2238

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 4

ggcacgagcg tagacgtgtt gagttttggg aagttgtcag cttgggacac tgccccgctt 60

ttcgccatgg cgcgcttgca ctgggctggc atttttgttt tagcgctggc ctgcgtggca 120

gtcgccaagg acgacgaaaa gaagatcgat ggtccagtga ttggaattga cttgggcaca 180

acgtactcct gtgtcggcat ctacaagaac ggaagggtgg agatcatccc caacgatcag 240

ggaaaccgaa tcacgccttc ctatgtagcc ttcactgaag atgagcgtct catcggcgag 300

gccgcgaaga accaggcgac aatcaacccc gcccagaccc tcttcgacgt gaagcgcttg 360

atcggccgac gcttcaagga ctccacagtg cagaaggaca tcaagctcct gcccttcgac 420

atcgtcgaca aaaacggcaa gcctcagatc agtgtcaagg ttaagggcga gaccaagcag 480

atggcccctg aggaggtttc ctccatggtg cttaccaaga tgaaggagac cgctgagaac 540

tacttgggca aggaagtgaa gcatgctgtc atcaccgtgc cggcctactt caacgaccag 600

cagcgacagt ccacgaagga tgccggagtc atcgctggct tgaatgtgct ccgaatcatc 660

aacgagccca ctgccgccgc catcgcctac ggcttggaca agaaggccga gaagaacatc 720

ttggtctacg acttgggagg tggcaccttc gatgtctcct tgttgaccat tgacaatggc 780

gtcttcgagg tggtcgccac caacggcgac acccacttgg gaggtgagga tttcgatcag 840

cgagtcatgc agcacttcat gaaggtcttc cagaagaagc acagcaagga catgtccaag 900

gacaagcgtg ccatccagaa gttgcgccgc gaggtcgaga aggcgaagcg agccttgagc 960

tccactcacc aggcccgctt ggagatcgag gccctcttcg acggcgtcga cttctccgag 1020

accttgactc gcgcccgatt cgaggagatc aacaacgacc tcttcaagaa caccttgggc 1080

cccgtgaagc aggtcatcga ggactctggc ttgaagaaga cccagatcga cgagatcgtc 1140

ttggtcggtg gttccacccg aatccccaag gtccagcagc ttatcaagga ctttttcaac 1200

ggcaaggagc ccaaccgagg catcaaccct gatgaggccg tcgcctacgg cgctgccgtc 1260

caggctggta tcctcagcgg cgagggtggc caggacctcc tcttgttgga tgtgacccct 1320

ttgactttgg gcatcgagac cgtcggtggt gtcatgacca agctcatcaa caggaacact 1380

gtgatcccca cgaagaagtc ccagaccttc tccacctacc aggacaacca gcctgccgtg 1440

aacatccagg tcttcgaggg cgagcgaccc atgaccaagg acaaccactt gctcggcaag 1500

ttcgagcttg gcgggatccc ccccgcccct cgaggacagc cccagattga ggtgaccttc 1560

gagatcgact ccaacggcat cttgaacgtc ggcgccgagg acaaggccac cggcaagggc 1620

gagaagatca ccatcaccaa cgacaagggc cgcttgacgg aggagcagat cgagaagatg 1680

atcaaggagg ccgagcagtt cgccgacgag gacaagaagg tgaaggagcg agtggacgcc 1740

aagaactcct tcgacggcta catccactcc atgaggtcgg ccaccgaggg ctccggcgac 1800

aacaagggcc tcagcgagaa gatggacgag gacgagaagg agaagatctt ggaggccctc 1860

aaggacgggc agtcctggtt ggactccaac ccggagggcg acgccgaaga catcaaggag 1920

aagcacaagg aggtggaggg catctgtgct ccaatcgtct ccaagtacta cggtgtgggc 1980

ggtggcggcg ccggtgctgc tgacgaggac gaagatgagg cccacgacga gctgtaaatt 2040

ttctgtgcaa aatgaccttc ctccttgacg aagtcaatac acattgttca atactcaaca 2100

cctctatagc tagctaggat ctgtacagtc tttctcacat ttccgccgag agcgggcaga 2160

gaccgattct gcatcaccaa gcccaccttt gaagccaacc gtgctcaggg tgaggttcgc 2220

cagtcatggc agcacgaa 2238

<210> 5

<211> 1428

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 5

atgggtttcc gtttcttaga tattgttaaa ccatttacct cactcgttcc agaggttggt 60

caaccagata gaaaaattcc tttccgtgaa aaggttcttt ggacagcaat ttgtttattc 120

attttcttag tttgcagtca aattccactt tatggtatta gatcaactga ttcatcagat 180

ccattttact gggctaaagt tattatggcc tcaaacagag gtactttaat ggaattaggt 240

atttcaccaa tcgttacatc aggtatggtt atgcaattat tagcaggtgc caaattaatt 300

gaaattgatc aatctgttaa agccgataga gatttattct ctgctgccca aaaattattt 360

ggtatgttaa tttgtgtagg tcaaggtgta gcttatattt ggagtggttc atatggtgat 420

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tcattattta ttgcaaccaa tatttgtgag accattgtat ggaagacatt ttcaccaact 600

acagtatccg ttggtaaagg taccgaattt gaaggtgcag tgattgcatt attccatttg 660

ttattaactc gtaacgataa ggttagagca ctcaaagaag cattctatag acaaaactta 720

ccaaacatta ccaatttatt ggctaccgtg ttaattttta tggttgtaat ttatttccaa 780

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ccaatcaagt tattctacac ttcaaatatt ccaatcattc ttcaaagtgc actcgttagc 900

aatctttatt tcatctctca attattgtat cgtcgtttcc cagataacat tttggtaaac 960

ttatttggtg cttggagaac cagtgaatat tcacaacaaa tgattccagt ctctggtctc 1020

acctattaca tcagctcccc aaataatatg agcgctgttt tggccgatcc attccatgcc 1080

ctcttttaca tcacctttat gttgacaagt tgtgctctct tctccaaagt ttggatcgaa 1140

gttagtggtt cctctgctcg tgacgttgct aagcaactca aagatcaaca aatgaccatg 1200

aaaggtcatc gtgatacctc tgtcatcaag gaactcaatc gttatattcc aaccgctgcc 1260

gcttttggtg gtctctgtat tggtgctctc actgtcgtcg ccgatttcat gggtgccatc 1320

ggttctggta ctggtatttt attagctgtc actatcatct atcaatactt tgaaaccttt 1380

gttaaagaac aacaagaact ttctggtggt attggtggtc ttttctaa 1428

<210> 6

<211> 2130

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 6

atgaaattgg tttttttggt tttgttgttt ttgggtgctt tgggtttgtg tttggctggt 60

agaaggagat ctgttcaatg gtgtgcagtt tctcaacctg aagctactaa atgttttcaa 120

tggcaaagaa atatgagaaa agttagaggt ccacctgttt cttgtattaa aagagattct 180

ccaattcaat gtattcaagc tattgctgaa aatagagctg atgctgttac attggatggt 240

ggtttcattt atgaagctgg tttggctcca tataaattga gacctgttgc tgctgaagtt 300

tatggtactg aaagacaacc aagaactcat tattatgctg tcgctgttgt taaaaaaggt 360

ggttcttttc aattgaatga attgcaaggt ttgaaatctt gccatactgg attgagaaga 420

actgctggtt ggaatgttcc aattggtact ttgagaccat ttttgaattg gactggtcca 480

cctgaaccaa ttgaagctgc tgttgctaga tttttttctg cttcttgtgt tcctggtgct 540

gataaaggtc aatttccaaa tttgtgtaga ttgtgtgctg gtactggtga aaacaagtgt 600

gcattttctt ctcaagaacc atatttttct tattctggag cttttaaatg tttgagagat 660

ggtgctggtg atgtcgcttt tattagagaa tctactgttt ttgaagattt gtctgatgaa 720

gctgaaagag atgaatatga attgttgtgt cctgataata ctagaaagcc tgttgacaaa 780

tttaaagatt gtcacttggc tagagttcca tctcatgcag ttgttgctag atctgttaat 840

ggtaaagaag atgctatttg gaatttgttg agacaagctc aagaaaaatt tggtaaagat 900

aaatctccaa aatttcaatt gtttggttct ccatctggtc aaaaagattt attatttaaa 960

gattctgcta ttggtttttc tagagttcca ccaagaattg attctggttt gtatttgggt 1020

tctggttatt ttactgctat tcaaaatttg agaaaatctg aagaggaagt tgctgctaga 1080

agagctagag ttgtttggtg tgctgttggt gaacaagaat tgagaaaatg taatcaatgg 1140

tctggtttgt ctgaaggttc tgttacttgt tcttctgctt ctactactga agattgtatt 1200

gctttggttt tgaaaggtga agctgatgct atgtctttgg atggtggtta tgtttatact 1260

gctggtaaat gtggtttggt tcctgtttta gcagaaaatt ataaatctca acaatcttct 1320

gatcctgatc caaattgtgt tgatagacct gttgaaggtt atttggctgt tgctgttgtt 1380

agaagatctg atacttcttt gacttggaat tctgttaaag gtaaaaagtc ttgtcatact 1440

gctgttgata ggactgctgg ttggaatatt ccaatgggtt tgttgtttaa tcaaactggt 1500

tcttgtaaat ttgatgaata tttttctcaa tcttgtgctc ctggttctga tccaagatct 1560

aatttgtgtg ctttgtgtat tggtgatgaa caaggtgaaa ataaatgtgt tccaaattca 1620

aacgaaagat attatggtta tactggtgct ttcagatgtt tggctgaaaa tgctggtgac 1680

gttgcttttg ttaaggatgt tactgttttg caaaatactg atggtaataa caatgaagct 1740

tgggctaaag atttgaaatt ggctgatttt gctttgttgt gtttggatgg taaaagaaaa 1800

cctgttactg aggctagatc ttgtcatttg gcaatggctc caaatcatgc tgtcgtttct 1860

agaatggata aagttgaaag attgaaacaa gttttgttgc atcaacaagc taaatttggt 1920

agaaatggat ctgattgtcc tgataaattc tgtttgttcc aatctgaaac taaaaatttg 1980

ttgtttaatg ataatactga atgtttggct agattgcatg gtaaaactac ttatgaaaaa 2040

tatttgggtc cacaatatgt tgctggtatt actaatttga aaaaatgttc tacttctcca 2100

ttgttggaag cttgtgaatt tttgagaaaa 2130

Claims (4)

1.一种高效合成乳铁蛋白的毕赤酵母，其特征在于，所述的毕赤酵母强化表达了宿主中的分子伴侣HSP70、Ydj1、GrpE中的一种和BiP、Sec61a中的一种，所述的宿主异源表达了人源乳铁蛋白；

所述的分子伴侣HSP70的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，Ydj1的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，GrpE 的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，BiP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，Sec61a的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

分子伴侣HSP70、Ydj1、GrpE采用启动子FLD1进行增强表达；

分子伴侣BiP、Sec61a采用启动子GAP进行增强表达；

所述的宿主为异源表达了人源乳铁蛋白的毕赤酵母GS115。

2.根据权利要求1所述的毕赤酵母，其特征在于，所述的乳铁蛋白的核苷酸序列如SEQID NO.6所示。

3.一种权利要求1~2任一项所述的毕赤酵母的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、分别构建分子伴侣HSP70、Ydj1、GrpE中的一种和BiP、Sec61a中的一种的启动子表达分子伴侣的表达框；

S2、将S1步骤构建的表达框转化到异源表达了人源乳铁蛋白的宿主中，筛选得到重组毕赤酵母。

4.权利要求1~2任一项所述的毕赤酵母在发酵生产乳铁蛋白中的应用。

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