CN1236011A - 一种使用分子伴侣促进蛋白质分泌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及利用分子伴侣与所需蛋白质在原核细胞特别是大肠杆菌宿主内的共表达,以促进所需蛋白质分泌表达的方法。具体地说,本发明涉及用于在原核细胞中分泌表达所需蛋白质的重组表达载体,所说的表达载体含可操作地连接编码分子伴侣的基因序列至第一启动子后的位点。编码分子伴侣基因序列下游有一个可操作地连接编码所需蛋白质基因序列到含第二个启动子的信号肽DNA序列。

Description

一种使用分子伴侣促进蛋白质分泌的方法

本发明总地涉及利用分子伴侣与所需蛋白质在原核生物体中的共表达，以生产可溶性的所需蛋白质的方法。具体地说，本发明涉及使用可在原核生物体中分泌表达所需蛋白质的新的重组表达载体，携带所说的新的重组表达载体的细菌细胞，以及利用分子伴侣与目的蛋白质的共表达，以分泌表达形式生产可溶性所需蛋白质的方法。

近年来，已对分子伴侣的作用进行了深入的研究，并已发现其参予不同种生物体的许多共有生物学功能，例如形成和维持蛋白质的高级结构、蛋白质的跨膜运送、调节细胞生长分化和生长周期以调节免疫系统的功能等(Ellis,R.J.et al,Molecular Chaperons,Annu.Rev.Biochem.,60:321-347,1991)。

生物体的大多数分泌蛋白质，包括内膜蛋白、外膜蛋白和周质空间内的蛋白质，以及分泌到细胞外环境中的蛋白质的N端和C端都有起分泌信号作用的特定结构，例如分泌蛋白质的N端都带有长度约20至30个氨基酸信号肽序列。信号肽序列的氨基端通常为带正电荷的氨基酸，参与前体分子与质膜的结合。其后为高度疏水的、有高度形成α螺旋趋势的(特别是在接近去污剂或脂质分子的条件下)非极性氨基酸。信号肽序列的这些和其他一些结构特征，不仅直接影响前体分子的跨膜分泌和其正确切割，而且可能有助于成熟蛋白质的适当构象。另一方面，成熟的蛋白质分子的结构对其后胞外分泌也有着重要影响(得永正雄，菱沼文男。蛋白质核酸酵素，1992；37(3):223)。这些蛋白质被分泌到细胞外，须借助某因子和/或酶的作用维持其特定的适于透膜分泌的构象。

近年来的研究表明，大肠杆菌中一些与菌体中蛋白质的分泌密切相关的分泌因子(Schatz,P.J.et al.,Annu.Rev.Genet.24:215-248,1990；Hajime Tokuda 1993，蛋白质核酸酵素，38:947-956)，这些分泌因子与信号肽酶及其他一些已知和未知的因子相互作用，参予细胞内蛋白质的穿膜转运和加工过程。在已确定的至少七种Sec基因中，SecB作为其家族的一个成员，在蛋白质的跨膜转运系统中发挥重要作用。

SecB是以四聚体形式存在于胞浆中，由155个氨基酸组成的蛋白质，是一种分子伴侣(Kumamoto C.A.et al.,Mol.Microbiol.,5:19-22,1991)。其可与大多数在核糖体上合成的分泌型蛋白质结合，使之维持其松散折叠的、适于跨膜转运的活性构象。当前体蛋白质在SecB帮助下被运送到内膜后，即与具有ATP酶结构特征的另一个家族成员即SecA结合，并且在SecA及其他一些相关因子的帮助下完成分子的跨膜分泌过程。

在Sec家族的成员中，SecB是存在于大肠杆菌胞浆内的唯一可溶性的，并带有许多负电荷的分泌因子(Kumamoto C.A.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:5320-5324,1989；Watanabe M.et al.,Cell,58:695-705,1989)。SecB在分泌型前体蛋白质的肽链折叠过程中通过分子骨架间的β片层结构与之相互作用(Breukink E.et al.,Eur.J.Biochem.,208:419-425,1992)。一般认为SecB分子与蛋白质前体分子的结合部位存在着一个β片层核心，两侧则是各自的α螺旋结构(Spurlino,J.C.,et al.,J.Biol.Chem.,266:5202-5219,1991)。

因为细菌细胞易于生长和操作，所以在基因工程领域中，为了以大批量和高回收率生产所需蛋白质，常常使用细菌细胞作为宿主。然而，在细菌细胞中，大多数外源蛋白质都是以不溶性的和无活性的包涵体形式表达的。另外，在使用可在细菌细胞内发挥功能的外源启动子的情况下，被表达的蛋白质一般都是不溶性和无活性形式的。因此，人们一直在试图寻找改善已合成之蛋白质跨膜转运，以可溶性形式制取所需蛋白质的途径。利用目的蛋白质与分子伴侣如SecB蛋白的共表达是实现这一目的的可能途径之一。本发明人在以前的研究工作中发现，由于受细菌细胞固有SecB蛋白的含量等因素的限制，已在核糖体上大量合成的外源蛋白质常常被积聚在细胞内，发生前体分子的无规折叠，造成分子间聚集，致使这些前体分子不能与各种相关分子伴侣特别是SecB蛋白结合，而丧失跨膜转送能力。本发明人在其长期的研究实践中发现并进一步证实SecB蛋白的结合位点与许多待分泌的前体蛋白质带净正电荷区域有较高的亲和性，因此推测有可能设计并构建包含分泌信号肽编码序列和待表达之结构基因序列的融合基因，试图通过控制所得融合基因与SecB基因的同步表达来提高外源蛋白质的分泌效率。结果令人惊奇地发现，在使用适当合成的启动子，例如大肠杆菌碱性磷酸酯酶启动子的情况下，利用本发明的共表达系统，成功地实现了高分泌效率表达所需蛋白质的目的，从而完成了本发明。

因此，本发明的一个目的是提供用于在原核细胞中表达所需蛋白质的重组表达载体，其中所说的表达载体包含可操作地连接编码分子伴侣的基因至第一启动子后的位点。

根据本发明的表达载体，其中在编码分子伴侣的DNA序列的下游有一个可操作地连接编码所需蛋白质之基因序列至含第二启动子的信号肽DNA序列。

根据本发明的表达载体，其中所说的编码分子伴侣的基因是大肠杆菌SecB基因。

根据本发明的表达载体，其中所说的第一和/或第二启动子是大肠杆菌碱性磷酸酯酶启动子，且第一和第二启动子是相同的或是不同的。

根据本发明的表达载体，其中所说的编码所需蛋白质的基因是从天然来源筛选得到的野生型基因、筛选后经过改造的突变基因或化学合成的基因。

本发明的另一个目的是提供用上述表达载体转化的用于表达所需外源蛋白质的原核细胞。

根据本发明的原核细胞，所说的原核细胞是大肠杆菌细胞。

本发明的再一个目的是提供利用原核细胞宿主以可溶性形式分泌表达所需蛋白质的方法，该方法包括：

(1)得到编码所需蛋白质的DNA序列；

(2)将步骤(1)的编码所需蛋白质的DNA序列可操作地连接

   到编码适当的伴侣分子的DNA序列上，得到用于在适当启

   动子控制下共表达所需蛋白质和分子伴侣蛋白质的重组表

   达载体；

(3)用步骤(2)的重组表达载体转化适当的细菌宿主细胞；

(4)在适于以可溶的分泌形式表达所需蛋白质的条件下培养步骤

   (3)的宿主细胞；

(5)从培养物中分离出不溶性部分并从可溶性部分中回收所需蛋

   白质。

根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的重组表达载体还包含可操作地连接编码所需蛋白质的DNA序列上的第一启动子序列和位于其下游的，可操作地连接到编码分子伴侣的DNA上的第二启动子序列。

根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的细菌宿主细胞是大肠杆菌细胞。

根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的编码分子伴侣的DNA序列是大肠杆菌SecB基因的DNA序列。

本发明的再一个目的是提供利用原核细胞以可溶形式分泌表达所需蛋白质的方法，该方法包括：

(1)得到编码所需蛋白质的DNA序列，并将其可操作地连接到

   适于在原核宿主中表达所需蛋白质的第一表达载体上；

(2)得到编码分子伴侣蛋白的DNA序列，并将其可操作地连接

   到适于在原核宿主中表达所需蛋白质的第二表达载体上；

(3)用步骤(1)和(2)的第一和第二重组表达载体共转化适

   当的原核宿主；

(4)在适于以可溶形式分泌表达所需蛋白质的条件下培养步骤

   (3)的宿主细胞；

(5)从培养物中分离出不溶性部分并从可溶性部分中回收所需蛋

   白质。

根据本发明方法的优选实施方案，其中所说的所需蛋白质选自包括人在内的所有动物、植物和微生物的蛋白质和多肽。

图1显示从大肠杆菌中克隆得到的SecB的DNA编码序列。

图2显示从人胚肺细胞中克隆得到的人粒细胞、巨噬细胞集落刺激因子的DNA编码序列。

图3显示用于克隆SecB基因的重组载体M13mp19-SecB的构建。

图4显示用于表达人粒细胞、巨噬细胞集落刺激因子的重组载体pAGMT-8的构建。

图5显示携带用于在大肠杆菌中共表达分泌信号蛋白质SecB和人粒细胞、巨噬细胞集落刺激因子的重组载体pAGMST-8的构建。

图6a～6c分别显示用质粒pAGMST-8和对照质粒pAGMT-8转化大肠杆菌宿主细胞后，不同组份的SDS-PAGE图谱。

图7显示发酵培养携带SecB基因，但该基因上游不带信号SPphoA序列的工程菌株EGMST-8和不含SecB基因的EGMT-8的溶胞产物所作Northern印迹分析。

本发明提供了适于在原核宿主中以可溶性分泌蛋白质的形式表达所需蛋白质的重组表达载体，其中所说的重组表达载体包含表达所需蛋白质的第一转录单位和表达分子伴侣蛋白质的第二转录单位，其中所说的第一转录单位和第二转录单位可以以串联方式存在于同一个重组表达载体，也可以分别存在于用于共转化同一原核宿主的两个不同重组表达载体内。

如前所述，尽管某些原核细胞，特别是大肠杆菌常常被用于以重组DNA技术表达许多具有各种各样生物学活性和生物学功能的不同的外源蛋白质，但由于这些原核生物体特别是大肠杆菌的固有功能特性所决定，大多数被表达的蛋白质均主要在细胞内形成包涵体，并以包涵体的形式存在于细胞内，从而给继后分离和纯化所需表达产物的步骤带来很大困难，难以得到高生物活性的蛋白质。本发明人在以前用重组技术分泌表达粒细胞、巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的实践中发现，在大肠杆菌宿主内高表达的GM-CSF蛋白质，约80％以上被积聚在细胞内，而存在于培养物上清中的表达产物仅10％～20％。为了解决这一问题，对改善目的蛋白质之分泌效率的可能性进行了广泛深入地研究，并构建了用于分泌表达的重组载体和相应的表达系统。结果令人惊奇地发现，利用我们构建的合成的大肠杆菌碱性磷酸酯酶启动子控制下共表达所需目的蛋白质和分子伴侣SecB蛋白的重组表达系统，在摇床培养条件下，可使所需蛋白质GM-CSF的分泌表达效率提高约5～6倍，进一步优化发酵生产条件可望进一步提高分泌表达效率。

本发明的重组表达载体包括可操作地连接到第一启动子上的编码分子伴侣的DNA序列和一个可插入第二个转录单位的插入位点。利用所说的插入位点，可很容易地在所说的重组表达载体中插入基本上由编码所需蛋白质的DNA序列和可操作地连接在其上游的第二启动子组成的第二转录单位。在第二转录单位的第二启动子与编码所需蛋白质的DNA序列之间加入一个另外的前导序列(信号肽序列)，并在所得融合基因的下游加入终止子。

作为启动子序列，可使用任何一种适于在原核生物中表达所需蛋白质和/或分子伴侣的启动子，例如可使用细菌启动子和噬菌体启动子。这些启动子例如包括但不只限于tac启动子、lac启动子、T7启动子、gal启动子和碱性磷酸酯酶(phoA)启动子，但本发明优选的是phoA启动子。

作为与编码所需蛋白质的DNA序列共表达的分子伴侣基因，本发明中优选的是具有助分泌功能的分子伴侣SecB的基因。SecB是分泌因子Sec家族中唯一的存在于胞内的可溶性蛋白。其它分泌因子SecA、SecD、SecE、SecF、SecY等都定位于膜上。SecB可与大多数蛋白质结合，使其维持特异的松散折叠的，宜于转送的空间构象。SecB将结合的蛋白质运送至膜上，与SecA结合，在其它分泌因子的相互协助下，完成蛋白质的跨膜过程。SecB的结合位点无需特异氨基酸序列，它结合于带正电的并具有β折叠构象的区域，因而能与大多数蛋白质结合。这也是我们发明中优选分子伴侣SecB作为与所需蛋白质共表达的原因。

作为用来构建本发明重组表达载体的起始载体，可使用任何一种能够在细菌细胞中稳定地保留并复制的载体。这样的起始载体包括但不只限于pTZ18R、pBR322、pKK223-3、pUC18、pUC19、pUC119等，但本专利优选的是多拷贝质粒pTZ18R。

作为宿主，可使用任何一种适于在其中以高效率分泌表达所需蛋白质和分子伴侣的细菌细胞，特别是大肠杆菌细胞。本发明优选的宿主细胞是碱性磷酸酯酶基因缺失的大肠杆菌YK537。

构建本发明的重组表达载体时，可首先按照本领域技术人员已知的方法(例如参见J.Sambrook,E.F.Fritsck&T.Manicetis,MolecularCloning,A Laboratory Mannual,Znd ed.,Cold Spring Harbour Press,NY,1989)将启动子导入起始质粒中。然后，将编码分子伴侣的DNA序列连接到第一启动子的下游。在使用大肠杆菌碱性磷酸酯酶缺陷型菌株YK537的情况下，最好使用碱性磷酸酯酶启动子(phoA)作为第一启动子。可以适当调整第一启动子序列与分子伴侣基因之间的距离，以获得最佳表达活性。可以从已知的大肠杆菌中分离并克隆已知其序列的分子伴侣序列。本发明根据SecB基因序列(465bp)，设计一对引物，应用聚合酶链反应(PCR)，从大肠杆菌YK537的染色体DNA中克隆出大肠杆菌SecB基因。

为了提高表达效率，必要时可在分子伴侣的下游加入一个终止子序列，但也可以在设计并克隆分子伴侣序列时加入适当的终止信号。可以按照已知的方法完成分子伴侣序列与终止序列间的连接。本发明中将分子伴侣基因插入在质粒例如质粒pAE-8或pAET-8(该质粒转化的菌株已于本专利申请之前按布达佩斯条约的规定保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCC NO.0287)的启动子序列和终止子序列之间，以构建含有彼此串联的启动子序列、分子伴侣基因和终止子序列的重组载体。如果如此得到的分子伴侣表达载体中具有适当的连接所需蛋白质基因的克隆位点，该载体即可作为本发明的表达载体。如果所构建的载体没有适当的克隆位点，则可适当修饰序列的末端并加入克隆位点。可使用具有不同的限制性酶切位点的多接头作为克隆位点。

可以将可操作地连接有第二启动子的编码所需蛋白质的DNA序列导入上述表达载体的克隆位点中。被导入的与编码所需蛋白质的DNA序列可操作地连接的第二启动子序列，可以是与上述第一启动子相同或不同的。本发明中第一启动子和第二启动子两者均为phoA启动子。必要时可在第一转录单位和第二转录单位之间加入一个适当长度的接头，并可适当调整接头的长度，以便更有效地表达所需的蛋白质。

应用已知方法，用表达载体转化宿主菌，例如CaCl₂处理法将表达载体转化到细菌细胞。培养并增殖细胞后，根据抗药性来选择被转化的细胞，以得到为本发明目的所需的，以高产率分泌表达所需蛋白质的重组体。在使用大肠杆菌宿主的情况下，最好利用药物抗性基因作为选择标志基因，例如可使用氨苄青霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因或四环素抗性基因。

为本发明的目的，按上述方法制备的转化体不一定包含同时携带分子伴侣基因和所需蛋白质基因的同一个质粒载体。作为一种可替代的方法，可以分别用携带第一启动子和分子伴侣基因的第一个重组载体和携带第二启动子和编码所需蛋白质之外源DNA序列的第二个重组表达载体共转化适当的细菌宿主，以得到本发明的重组体。相对地，用于共转化的两个重组载体最好分别带有其各自不同的药物抗性选择标志基因。

可按本领域已知的方法，在适当培养基中培养上述转化细胞。培养完成后，例如可通过简单的离心方法分离培养物上清，并从所得培养物上清中分离和纯化所需的蛋白质。用于纯化和回收所需蛋白质的方法包括但不只限于硫酸铵沉淀法、超滤法、离子交换层析法、疏水层析法、凝胶过滤法、亲和层析法或这些方法的组合。

可用本发明的方法以可溶形式分泌表达的蛋白质包括但不只限于微生物蛋白质、植物蛋白质或动物蛋白质，或它们的抗体或各种形式的融合蛋白质，或这些蛋白质的天然或人工变异体。

下列实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何形式限制本发明。虽然下列实施例中是以分子伴侣SecB蛋白与目的蛋白质GM-CSF的分泌型共表达作为具体实例来举例描述本发明，但本领域技术人员可以理解到，除利用分子伴侣SecB基因与GM-CSF共表达外，也可依据本发明的精神和原则，使用其他有相同或相似功能的分子伴侣，共表达与GM-CSF有相同或相似结构特征的蛋白质。因此，在不违背本发明的基本精神和原则的前提下，对本发明的任何等同替代、改动或改进都将落入本发明待批权利要求范围内。实施例1：分子伴侣SecB基因的制备

图1显示了SecB基因的核苷酸序列。为了得到用于本发明的大肠杆菌分子伴侣SecB基因，首先在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基(每升含有10g蛋白胨、5g酵母提取物和10g氯化钠)中培养大肠杆菌YK537(由日本东京大学MAKARI YAMASAKI教授提供)，并按已知方法分离染色体DNA。设计并使用DNA合成仪合成下示序列引物(1)和引物(2)：引物(1):5’-GGAATTCATGTCAGAACAAAACAACAC-3’

          EcoRⅠ引物(2):5’-AACTGCAGTTATCAGGCATCCTGATGTTC-3’

           PstⅠ

以YK537的染色体总DNA作为模板，在Taq聚合酶作用下，利用引物(1)和引物(2)，以聚合酶链反应(PCR)方法扩增得到两端分别带有EcoRⅠ和PstⅠ酶切位点的长度约480bp的DNA片段。PCR的反应条件是：94℃反应30秒，50℃反应60秒，最后在72℃下延伸60秒，共重复35次循环后，于72℃下反应约600秒以完成PCR扩增。

电泳分离(1％低融点胶)PCR反应混合物，从凝胶上切下相当于480bp的电泳条带并回收之。用SmaⅠ，牛小肠碱性磷酸酶(CIP)处理M13mp19，回收大片段后与上述480bp的片段在T4DNA连接酶作用下进行连接(见图3)，筛选到正向及反向两种连接产物。从噬菌体的培养上清中抽提单链DNA，按已知方法用通用引物测定正向和反向连接片段的核苷酸序列，证明所得产物即为编码155个氨基酸的SecB蛋白的核苷酸序列。实施例2：编码人粒细胞、巨噬细胞集落刺激因子的cDNA的制备

本实施例描述编码人粒细胞、巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)的cDNA的制备。

将人胚肺细胞HFL细胞株(购自中国科学院上海细胞生物研究所)培养在含20％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基中，待细胞生长至70％单层后，换成含TNF-α(终浓度1000U/ml)的新鲜培养基。诱导培养36小时后收获细胞，并用硫氰酸胍法(Chomczynskiet al)提取总RNA。

设计并用DNA合成仪合成下示序列的引物(3)和引物(4)：引物(3):5’-GCACCCGCCCGCTCGCCCAG-3’引物(4):5’-AAAGCTTATCACTCCTGGACTGGCTCCC-3’

         HindⅢ

取2μg经TNF-α诱导的人胚肺细胞总RNA作为模板，使用上述引物(4)作为反转录起始引物，于65℃变性处理15分钟后加入1μlSuper Script(R)反转录酶。37℃反应40分钟后，升温至95℃并保持5分钟以终止反应，然后以反转录得到的cDNA为模板，使用引物(3)和引物(4)进行PCR扩增(94℃30秒，50℃60秒，72℃60秒，重复35次循环后，于72℃反应约600秒)。

对PCR反应混合物进行电泳分离后，得到长度约390bp的扩增产物，按实施例1所述方法克隆该片段，按已知的双链测序法从序列的5’端和3’端双向测定序列。(图2)结果可见，所测得的序列与Wong等人(Science 228:310,1985)报导的hGM-CSF的cDNA序列完全一致。实施例3：重组载体pAGMT-8的构建

本实施例简要描述携带外源GM-CSF编码序列和分泌表达信号的重组表达载体的构建。

使用我们以前构建的，携带编码人表皮生长因子(hEGF)的DNA序列的重组质粒pAET-8作为本实施例的起始材料。在pAET-8中，在EGF编码区的5’上游相继连接有预先合成并组装进来的大肠杆菌碱性磷酸酯酶启动子序列(phoA)和信号肽序列(SPphoA)。因此，当在这些调控元件的下游导入目的基因并将质粒转入适当宿主后，即使在不含其他大肠杆菌分泌信号的情况下，其也可有效地分泌表达所需的蛋白质。

为了构建重组质粒pAGMT-8，首先用EcoRⅠ酶切上述质粒pAET-8，从酶切反应混合物中回收大片段后用绿豆核酸酶(MungBean Nuclease)处理以形成平头，回收大片段后再用HindⅢ将EGF基因切下，在T4DNA连接酶存在下，使之与预先用HindⅢ消化的按实施例2所述方法制备的含GM-CSF编码序列的DNA片段相连接，即得到长度约4.1Kb定名为pAGMT-8的携带GM-CSF编码序列的重组载体(图4)。该质粒(pAGMT-8)与pAET-8的不同之处只在于由GM-CSF的编码序列取代了质粒pAET-8上的编码EGF的序列。实施例4：重组载体pAGMST-8的构建

本实施例描述用于在大肠杆菌中共表达分子伴侣蛋白和人粒细胞、巨噬细胞集落刺激因子的重组载体的构建。

如前所述，尽管我们构建的pAGMT-8质粒中带有用于驱动外源基因如EGF基因表达的信号元件phoA和SPphoA，但我们将该表达系统用于表达GM-CSF时却发现发酵培养后有大量的表达产物在宿主细胞内堆积，而且GM-CSF产物堆积量似乎与分泌量成反比，因此，为解决GM-CSF的表达产物分泌问题，我们进一步在已有表达载体pAGMT-8的基础上，构建了携带可操作地连接到phoA启动子后编码大肠杆菌SecB基因的重组载体，该基因与phoA启动子一起作为独立的转录单位，其可以串联连接在编码GM-CSF的转录单位的上游或下游，或者，亦可与编码GM-CSF或其他目的蛋白质的转录单位存在于两个分立的载体中。

如图5所示使用M13mp19-SecB和pAGMT-8构建带有SecB基因的质粒pAGMST-8。

首先用EcoRⅠ和PstⅠ消化M13mp19-SecB得到含SecB基因的DNA片段，另一方面，合成具有下示序列的引物(5)和引物(6)：引物(5):5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’引物(6):5’-GGAATTCTTTATTTTCTCCATGTAC-3’

          EcoRⅠ

以pAGMT-8为模板，使用引物(5)和引物(6)进行PCR反应，所得片段用PstⅠ和EcoRⅠ双酶切后最终得到含大肠杆菌碱性磷酸酯酶启动子序列的DNA片段。用PstⅠ和牛小肠碱性磷酸酶(CIP)处理质粒pAGMT-8，回收大片段以后与上述含SecB基因的DNA片段和含大肠杆菌碱性磷酸酯酶启动子序列的DNA片段在T4DNA连接酶存在下进行连接，回收得到约4.7Kb的大片段后用KpnⅠ和EcoRⅠ酶切筛选正向连接产物，即得pAGMST-8重组质粒。该质粒具有一个串联在控制GM-CSF基因表达之phoA启动子上游的控制大肠杆菌分泌信号SecB基因表达的另一个phoA启动子。两个串联连接的转录单位的区别在于，处于上游指导SecB基因表达的转录单位中没有处于下游的指导GM-CSF基因表达的第二个转录单位中所携带的信号肽序列SPphoA。(该质粒转化的菌株已于本专利申请之前按布达佩斯条约的规定保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCC NO.0288)实施例5：重组载体pAGMST-8的转化和表达

本实施例描述用按上述方法构建的重组质粒转化大肠杆菌宿主细胞，并在该宿主中以可溶性分泌形式表达具有人GM-CSF活性的蛋白质。

将衍生于大肠杆菌K12菌株系列的，碱性磷酸酯酶缺陷型大肠杆菌菌株YK537新鲜过夜菌以1％体积转接至LB培养基中，于37℃振荡培养至OD₆₀₀为0.4左右(大约培养3小时)。10,000rpm离心1分钟收集菌体(均需无菌操作)，按每1.5ml菌液加入100μl预冷的钙溶液(50mM CaCl₂,10mM Tris·Cl pH8.0,15磅灭菌15分钟，4℃保存)轻摇悬浮菌体，冰浴10分钟，4,000rpm4℃离心10分钟，倾去上清，加等体积保存液(100mM CaCl₂,15％甘油，15磅灭菌15分钟，4℃保存)，按200μl分装，-80℃可存放半年。

1～10ng质粒pAGMST-8加入100μl感受态菌液中，混匀，冰浴30分钟，42℃热休克90秒，加5倍体积LB于37℃恢复培养1小时，之后取适当体积涂平板，于37℃倒置培养12小时。

筛选单克隆，培养并酶切鉴定最终得到相应的工程菌。

将过夜工程菌接入200ml LB培养基中(氨苄青霉素的含量为100μg/ml)，于37℃培养18小时以诱导phoA启动子驱动下的GM-CSF的DNA转录和表达。诱导后离心培养物并收集上清液。作为对照组，还用不带有SecB基因的重组质粒pAGMT-8转化大肠杆菌YK537，并按上述同样方法培养转化体细胞并分离培养物上清，然后从所得上清液中分离并纯化表达产物hGM-CSF。实施例6：对转化细胞株发酵产物的分析

本实施例描述使用大肠杆菌分子伴侣SecB与目的蛋白质GM-CSF共表达，对转化菌株发酵培养产物的各种分析结果。

分别用本发明的携带大肠杆菌分泌信号SecB基因的质粒pAGMST-8和不携带SecB基因的对照质粒pAGMT-8转化大肠杆菌YK537，分别得到GM-CSF生产菌重组体菌株EGMST-8和EGMT-8。将如此得到的各转化体菌株在低磷培养基中诱导目的基因的表达。将诱导后的菌株和上清，应用SDS裂解液，100℃,5分钟加热后，进行SDS-PAGE分析，电泳后用考马斯亮兰(Coomassie Brilliant Blue)染色。

图6a显示对这些转化体的培养物不同部分进行SDS-PAGE分析的结果。从图中可以看出，用质粒pAGMT-8转化的对照菌株EGMT-8的培养物上清中含hGM-CSF量较低(泳道3和4)，而hGM-CSF主要见于不溶部分中(泳道1、2、5、6)。泳道8为分子量标准。质粒pAGMST-8转化的EGMST-8工程菌株的发酵培养物上清液中则可见有大量成熟hGM-CSF(图6b中泳道2和3，泳道1为分子量标准)。

图6c显示EGMST-8和EGMT-8经发酵诱导至表达高峰后，离心除去上清，用SDS电泳液，100℃5分钟裂解菌体，离心后的电泳图。EGMST-8菌株以诱导表达后菌体蛋白中可见较强SecB条带，而菌内pre-GM-CSF量很少，仅可见成熟的GM-CSF条带(泳道1)；EGMT-8菌株经诱导表达后菌体蛋白中SecB条带很浅，但存在较强pre-GM-CSF和成熟的GM-CSF条带(泳道2)。泳道3为分子量标准。

上述分析结果表明，在GM-CSF与分子伴侣共表达的情况下，在宿主内表达的目的蛋白质在与之共表达的分子伴侣即跨膜分泌蛋白质的帮助下，以显著增加的量被分泌到宿主细胞外，从而大大地增加了细胞分泌表达的效率。因此，预期本发明的分泌表达系统有可能被广泛应用于许多生物学活性蛋白质的分泌表达。

另外，我们还使用酶联免疫吸附分析法(ELISA)对发酵罐培养的工程菌株EGMT-8和EGMST-8的培养物各组份中的表达产物进行了半定量分析。应用Amersham公司的ELISA Kit分析结果表明，在EGMT-8发酵培养物的溶胞产物(包括细胞周质、细胞浆和包涵体)中存在大量表达产物GM-CSF，而在发酵液上清中的GM-CSF含量只占不溶部分的1/6。相反，EGMST-8发酵液上清中的GM-CSF含量约比前者高5～6倍。

图7显示发酵培养携带SecB基因，但该基因上游不带信号SPphoA序列的工程菌株EGMST-8和不含SecB基因的EGMT-8的溶胞产物所作Northern印迹分析。结果可见，该工程菌在摇瓶培养条件下，其细胞内存在有很浓的SecB条带(图6c)，而在进一步的Northern印迹分析中，使用已知序列SecB基因作探针，预杂交后用随机引物标记，并于42℃杂交20小时，洗涤后进行放射自显影，结果可见，有较强的SecB mRNA杂交条带。相反，不携带SecB基因的EGMT-8菌株在相同发酵与检测条件下则只见有微弱的杂交条带。泳道2、4为EGMST-8；泳道1、3为EGMT-8。实施例7：工程菌株EGMST-8的放大发酵培养、产物的分离纯化和生物活性的测定

取于-70℃保存的含15％甘油的EGMST-8甘油菌20μl接种于3mlLB培养基中(氨苄青霉素含量为100μg/ml),37℃培养过夜，第二天取少许菌液作适当稀释后涂布LB平板(氨苄青霉素浓度为100μg/ml，每升LB中含15g琼脂)，在37℃恒温培养箱中倒置培养16小时后挑取单菌落于含3ml LB的试管中(氨苄青霉素浓度为100μg/ml)，放入37℃摇床培养过夜(转速200rpm)，第二天以1％比例将过夜菌接入含200ml LB培养基的1升摇瓶中(氨苄青霉素浓度100μg/ml)，在37℃,200rpm的摇床中培养10-12小时即成种子。

将200ml种子培养液加入含10升发酵培养基(每升含蛋白胨20g，酵母提取物10g，葡萄糖30g，硫酸镁1g)的发酵罐(New BrunswickScientific公司，型号：Bio Flo Ⅳ)中，于37℃通气搅拌培养约18～20小时。当培养物OD₆₀₀值约为30～36时，GM-CSF的产率达到峰值约100～120mg/L。利用相同的发酵条件发酵培养大肠杆菌工程菌株EGMT-8,GM-CSF的最高产率只有大约20mg/L。

发酵完成后，离心分离细胞沉淀物和培养液上清，按照常规方法，例如依次用截留量为10,000道尔顿的超滤膜(Millipore Co.)超滤、疏水层析、阴离子交换和凝胶过滤等方法来纯化表达产物hGM-CSF。

可按照建立的标准方法，使用TF-1细胞作为靶细胞(培养于含10％FCS的RPMI-1640培养基中)，在微量滴定板中培养并裂解细胞后测定样品的OD₅₇₀吸光率，以回归分析后计算样品的活性单位。结果证明，使用本发明的分泌表达系统生产的hGM-CSF比标准样品有较高的生物学活性。

Claims (15)

1．用于在原核细胞中分泌表达所需蛋白质的重组表达载体，其中所说的表达载体包含可操作地将编码分子伴侣基因插入到第一启动子后的位点。

2．根据权利要求1的表达载体，其中在编码分子伴侣的DNA序列的下游有一个可操作地连接编码所需蛋白质之DNA序列至含第二启动子的信号肽DNA序列。

3．根据权利要求1或2的表达载体，其中所说的编码分子伴侣的基因是大肠杆菌SecB基因。

4．根据权利要求1或2的表达载体，其中所说的第一和/或第二启动子是大肠杆菌碱性磷酸酯酶启动子，且第一和第二启动子是相同的或是不同的。

5．根据权利要求1或2的表达载体，其中所说的编码所需蛋白质的基因是从天然来源筛选得到的野生型基因、筛选后经过改造的突变基因或化学合成的基因。

6．用根据权利要求1至5中任何一项的表达载体转化的用于表达所需外源蛋白质的原核细胞。

7．根据权利要求6的原核细胞，所说的原核细胞是大肠杆菌细胞。

8．利用权利要求6的原核细胞宿主以可溶性形式分泌表达所需蛋白质的方法，该方法包括：

(1)得到编码所需蛋白质的DNA序列；

(2)将步骤(1)的编码所需蛋白质的DNA序列可操作地连接

   到含有编码适当的伴侣分子的DNA序列的质粒上，得到用

   于在适当启动子控制下共表达所需蛋白质和分子伴侣蛋白

   的重组表达载体；

(3)用步骤(2)的重组表达载体转化适当的原核宿主细胞；

(4)在适于以可溶的分泌形式表达所需蛋白质的条件下培养步

   骤(3)的宿主细胞；

(5)从培养物中分离出不溶性部分并从可溶性部分中回收所需

   蛋白质。

9． 根据权利要求8的一个优选实施方案，其中所说的重组表达载体还包含可操作地连接编码所需蛋白质的DNA序列上的第一启动子序列和位于其下游的，可操作地连接到编码分子伴侣的DNA上的第二启动子序列。

10．根据权利要求8的一个优选实施方案，其中所说的细菌宿主细胞是大肠杆菌细胞。

11．根据权利要求8的一个优选实施方案，其中所说的编码分子伴侣的DNA序列是大肠杆菌SecB基因的DNA序列。

12．利用原核细胞以可溶形式分泌表达所需蛋白质的方法，该方法包括：

(1)得到编码所需蛋白质的DNA序列，并将其可操作地连接到

   适于在原核宿主中表达所需蛋白质的第一表达载体上；

(2)得到编码分子伴侣蛋白的DNA序列，并将其可操作地连接

   到适于在原核宿主细胞中表达分子伴侣蛋白的第二表达载

   体上；

(3)用步骤(1)和(2)的第一和第二重组表达载体共转化适

   当的原核宿主细胞；

(4)在适于以可溶形式分泌表达所需蛋白质的条件下培养步骤

   (3)的宿主细胞；

(5)从培养物中分离出不溶性部分并从可溶性部分中回收所需

   蛋白质。

13．根据权利要求12的一个优选实施方案，其中所说的细菌宿主细胞是大肠杆菌细胞。

14．根据权利要求12的一个优选实施方案，其中所说的编码分子伴侣的DNA序列是大肠杆菌SecB基因的DNA序列。

15．根据权利要求8或12的方法，其中所说的所需蛋白质选自包括人在内的所有动物、植物和微生物的蛋白质和多肽。

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