CN1283702A - 通过分子伴侣的共分泌制备天然折叠的和分泌的蛋白质的方法 - Google Patents

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Abstract

一种制备含有两个或几个通过二硫键连接的半胱氨酸的天然折叠的真核多肽的方法,该方法包括:a)培养原核细胞,其中,所说的原核细胞含有一种表达载体,该载体编码所说的在N－末端含有一种原核信号序列的多肽,b)将该多肽分泌至周质中或培养基中,c)切割信号序列,并从周质或培养基中分离该多肽,其中,在所说的原核细胞中还表达一种编码一种分子伴侣的核酸,并且该分子伴侣被分泌至周质中,该方法适用于在原核细胞中高产率地重组生产。

Description

通过分子伴侣的共分泌制备天然折叠的和分泌的蛋白质的方法
本发明涉及一种在原核细胞中表达后通过分子伴侣的共分泌制备一种水溶性的，自然折叠和分泌的多肽。
原核生物中蛋白质的合成，也称作翻译，发生在细胞质的核糖体上。当重组DNA在原核宿主生物中表达时，通常需要将这一过程中得到的重组基因产物或蛋白质从细胞质中通过细菌内膜分泌至内膜和外膜之间的周质腔中。然后，分泌的蛋白质可通过例如渗透冲击从周质腔中释放进培养基中。这一方法的缺点是分泌的多肽常常不形成天然的，具有生物活性的构型(Hockney，TJBTECH 12(1994)456-463)。
最近，分子伴侣和折叠催化剂，例如肽基脯氨酸顺/反异构酶或蛋白质二硫键异构酶(Glockshuber等，EP-A 0 510 658)被用于提高天然重组蛋白质在体内折叠时的产率(Thomas等，Appl.Biochem.Biotechnol.66(1997)197-238)。在某些情况下，这可引起表达的极大的改善，例如，对核酮糖二磷酸羧化酶(RUBISCO；Goloubinoff等，Nature 337(1989)44-47)，人类胶原酶原(Lee&Olins，J.Biol.Chem.267(1992)2849-2852)或来自大鼠的神经元氧化氮合成酶(Roman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(1995)8428-8432)即属于这种情况。在这些例子中，来自大肠杆菌的GroEL/ES或者DnaK系统在胞质中被共过量表达。
当重组蛋白质被分泌至大肠杆菌的周质中时也对分子伴侣的共表达进行了检测。但是，在这种情况下，仅对分子伴侣的胞质过表达进行了评估，以使向周质中的分泌最适化(Perez-Perez等，Biochem.Biophys.Res.Commun.210(1995)524-529；Sato等，Bioehem.Biophys.Res.Commun.202(1994)258-264；Berges等，Appl.Environ.Microbiol.62(1996)55-60)。以前在大肠杆菌中的共表达的实验集中在折叠-辅助蛋白质，例如蛋白质二硫键异构酶(PDI；Glockshuber等，EP-A 0 510 658)或者肽基脯氨酸顺/反异构酶(Knappik等，Bio/Technology 11(1993)77-83；Qiu等，Appl.Environm.Microbiol.64(1998)4891-4896和Schmidt等，Prot.Engin.11(1998)601-607)或者Skp蛋白质(Hayhurst和Harris，Protein Expr.Purif.15(1999)336-343)。
本发明的目的是提供一种在原核细胞中表达后制备一种水溶性的，自然折叠的多肽的方法，这可以一种简单的方式进行，不需要费力的体外后处理，例如包含体的溶解，还原和复性。
本发明的目的通过一种制备含有两个或几个通过二硫键连接的半胱氨酸的天然折叠的真核多肽的方法，该方法包括：
a)培养原核细胞，其中，所说的原核细胞含有一种表达载体，该载体编码所说的在N-末端含有一种原核细胞信号序列的多肽，
b)将该多肽分泌至周质中或培养基中，
c)切割信号序列，并从周质或培养基中分离该多肽。
其中，在所说的原核细胞中还表达一种编码一种分子伴侣的核酸，并且该分子伴侣被分泌至周质中，其先决条件是，培养是在没有精氨酸或一种通式Ⅰ R2-CO-NRR1(Ⅰ)的化合物的存在下进行的，其中，R和R1表示氢或一种饱和的或不饱和的支链或非支链的C1-C4烷基链和R2表示氢，NHR1或一种饱和的或不饱和的支链或非支链的C1-C3烷基链。在这一方法中，优选该分子伴侣是过表达的。
在本发明的方法的一个优选实施方案中，含有SH基团的还原硫醇(thiol)试剂被额外加入在用于培养原核细胞的培养基(发酵培养基)中，这进一步提高重组产生的蛋白质的产率。优选加入0.1-15mmol/l的硫醇试剂。按照本发明，术语“硫醇试剂”或者表示具有SH基团的还原(还原的)硫醇试剂，或者表示具有SH基团的还原硫醇试剂与具有二硫键基团的氧化硫醇试剂的混合物。优选的物质为还原的谷胱甘肽(GSH)，半胱氨酸，N-乙酰半胱氨酸，半胱胺，β-巯基乙醇以及类似的化合物。这种硫醇试剂可单独使用，也可以混合物的形式使用。每分子具有单个SH基团的硫醇试剂例如谷胱甘肽(GSH)特别适用。当重组DNA在原核细胞中表达时已知诸如谷胱甘肽的硫醇试剂可改善天然折叠的蛋白质的产率(Glockshuber等，EP-A O 510 658)。
本发明中，分子伴侣是指可防止其它的非天然蛋白质在体内聚集并促进它们的天然构型的形成的蛋白质(综述：Silver和Way，Cell 74(1994)5-6和Cyr等，TIBS 19(1994)176-181)。分子伴侣在现有技术中被用于稳定蛋白质，防止它们聚集和失活(Buchner等，EP-A 0 556 726 A1)。优选使用HSP40型的ATP-依赖性分子伴侣(分子量约为40 kDa)或者小热休克蛋白质(sHSP)。DnaJ是一种40 kDa的热休克蛋白质，它存在于大肠杆菌的细胞质中并且是所谓的Hsp70分子伴侣系统的一部分(Bukau，B.&Horwich，A.，Cell 92(1998)35 1-366)。DnaK(Hsp70)和GrpE也属于这一系统。特定的蛋白通过DnaK系统在一种ATP-依赖性过程中被折叠成天然构型(Schroder等，EMBO J.12(1993)4137-4144；Langer等，Nature 356(1992)683-689)。这一系统另外还需要ATP将变性的蛋白质进行重新折叠。DnaJ也在不存在DnaK和ATP的情况下防止非天然蛋白质的聚集，并介导可折叠状态(Schroder等，EMBO J.12(1993)4137-4144)。优选含有氨基酸1-108的DnaJ的N-末端片段(下文称作J-区域)的共分泌(Kelley，TIBS23(1998)222-227)。负责与DnaK相互作用的J-区域和一种G/F-富集区域位于这一区域中(Wall等，J.Biol.Chem.270(1995)2139-2144)。已有实验显示DnaJ在胞液中的共表达可导致可溶性蛋白质的产率的提高(Yokoyama等，Microbiol.Ferment.Techno1.62(1998)1205-1210)。
Hsp25(例如来自小鼠)是一个小热休克蛋白质的代表(sHsps；Gaestel等，Eur.J.Biochem.179(1989)209-213)，它是一种遍在类型的分子伴侣。这些蛋白质的分子量在15和30kDa之间。在热休克过程中，细胞中有相当量的sHsp聚集(高达细胞总蛋白的1％-Arrigo & Landry(1994)，InMorimoto(Ed.)：The Biology of Heat Shock Proteins and MolecularChaperones，Cold Spring Harbour Press，335-373)。与DnaJ蛋白质一样，sHsp具有防止非天然蛋白质聚集并将它们保持在可折叠的状态的功能(Jakob等，J.Bio1.Chem.268(1993)1517-1520；Ehrnsperger等，FMBO J.16(1997)221-229)。所有的sHsp具有与真核细胞的眼睛玻璃体蛋白质αA和αB-晶体蛋白同源性的区域，αA和αB-晶体蛋白自身是sHsp家族的成员(Jakob和Buchner，TIBS 19(1994)205-211)。
本发明所使用的术语“过表达”是指分泌的蛋白质，例如DnaJ和Hsp25的表达与相应的原核宿主生物体中的野生型表达相比表达的提高(优选至少提高100％)。这种过表达可在例如这些基因(蛋白质的，分子伴侣的和/或信号肽的)在强的原核的，优选可诱导的，表达信号(例如lac或者T7启动子或者它们的衍生物)的控制之下得到。
包括重组DNA上的调节区域(启动子和终止子)的用于多肽(蛋白质)过表达的分泌构建体优选被整合进一种载体中，该载体还编码精氨酸-tRNAAGA/AGG，这在原核细胞中是罕见的，或者它与编码这种tRNA的载体共表达(Brinkmann等，Gene 85(1989)109-114)。这能够使各种蛋白质共过表达至细菌的周质中以及使这种罕见的tRNAArgAGA/AGG转录，这导致所需的蛋白质在细菌宿主生物中合成的提高。编码该多肽和分子伴侣的核酸可被定位在一个载体或两个不同的载体上。
本发明中的原核信号序列是指一种来源于原核细胞的核酸片段，优选来源于格兰氏阴性细菌，并保证与该信号肽结合的蛋白质可穿过细菌内膜。结果，该蛋白质位于周质中或细胞上清液中。这种信号序列通常具有18-30个氨基酸的长度，描述于，例如，Murphy&Beckwith：Export ofProteins to the Cell Envelope in Escherichia coli，以及Neidhardt等(editors)：Escherichia coli和Salmonella，Second Edition，Vol.1，ASM Press，Washington，1996，p.967-978。细菌信号序列的切除可发生在例如一个Ala-X-Ala序列之后(von Heijne等，J.Mol.Biol.184(1985)99-105)。细菌信号肽酶的结构描述于Paetzel等，Nature 396(1998)186-190。优选使用通过位于原核细胞的周质中的蛋白酶从所需的蛋白质再次切除的信号序列。或者，这种蛋白酶可被加入在细胞上清液中或者加入在分离的蛋白质中来切除信号序列。
本发明的方法可改善大量的真核蛋白质的异源性表达，例如蛋白酶，干扰素，蛋白质激素，抗体或者它们的片段。该方法特别适用于在天然状态下含有至少两个通过二硫键相连的半胱氨酸的蛋白质的异源性表达，特别是当它们不具有在N-末端融合的原核信号序列，以及在它们的原核表达过程中形成了不溶性的包含体的情况下。该方法特别适用于在天然状态下含有多于5个二硫键的蛋白质。这样一种蛋白质是例如一种重组血纤蛋白溶酶原激活物(下文称作rPA，Martin等，Cardiovasc.DrugRev.11(1993)299-311，US-Patent No.5，223，256)。rPA具有9个二硫键，这9个二硫键在大肠杆菌的还原性胞液中不会形成。
蛋白质和分子伴侣在周质中的定位是通过与可穿过细菌内膜的信号肽的“可操纵连接”保证的。
为了从大肠杆菌中分离功能形式的分泌性rPA蛋白，将来自质粒pA27fd7(Kohnert等，Protein Engineering 5(1992)93-100)的这种蛋白质的基因通过基因工程方法融合到格兰氏阴性细菌的原核信号序列上，例如融合到来自胡萝卜软腐欧文氏菌的果胶酸酶(PelB)的信号序列上。基因融合是通过克隆进载体pET20b(+)(Novagen Inc.，Madison，USA)构建的。结构，基因表达是在T7启动子的控制之下。融合蛋白质中存在的信号序列造成向周质中的分泌。信号序列在分泌的过程中或之后被位于内膜中的肽酶切割。然后分泌的蛋白质可在周质中折叠。在这一空间中的氧化条件促使二硫桥的形成(Wulfing und Pluckthun，Mol.Microbiol.12(1994)685-692)。在周质中DnaJ，J-区域或者Hsp25的同时共过表达促使功能性蛋白质的产率提高约5-10倍(表1)。
下文通过实施例，出版物，序列表和附图对本发明进行进一步的说明，权利要求限定保护范围。所描述的方法应被认为是举例性的，即使在改动之后仍描述本发明的主题。
序列表简要描述：
SEQ ID NO：1显示表达质粒pUBS520-pIN-dnaJ的部分序列，它编码由OmpA信号序列和DnaJ以及调节序列(启动子，终止子)组成的融合蛋白质，它是从pIN Ⅲ ompA3-dnaJ扩增的。
SEQ ID NO：2显示OmpA-DnaJ融合多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：3显示表达质粒pUBS520-pIN-J-区域的部分序列，它编码由OmpA信号序列和J-区域以及调节序列(启动子，终止子)组成的融合蛋白质，它是从pIN Ⅲ ompA3-dnaJ扩增的。
SEQ ID NO：4显示OmpA-J-区域融合多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：5显示表达质粒pUBS520-pIN-hsp25的部分序列，它编码由OmpA信号序列和Hsp25以及调节序列(启动子，终止子)组成的融合蛋白质，它是从pIN Ⅲ ompA3-hsp25扩增的。
SEQ ID NO：6显示OmpA-Hsp25融合多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：7显示表达质粒pUBS520-pIN-ScFvOx的部分序列，它编码由PelB信号序列和ScFvOxazolon以及调节序列(启动子，终止子)组成的融合蛋白质，它是从pHEN-ScFv或者pIN Ⅲ ompA3扩增的。
SEQ ID NO：8显示PelB-scFvoxazolon融合多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：9显示表达质粒pET20b(+)-rPA的部分序列，它编码由PelB信号序列和rPA组成的融合蛋白质。
SEQ-ID NO：10显示PelB-rPA融合多肽的氨基酸序列。
附图简要描述：
图l显示周质和胞液中表达的DnaJ用50μg/ml的胰蛋白酶进行限制水解的Western印迹，以检测该蛋白质在细胞中的定位和天然折叠。分子量标准加在左边和右边。作为对照，对纯化的DnaJ(左)进行了同样的处理，但使用6.25μg/ml胰蛋白酶。
图2显示表达质粒pUBS520-pIN-dnaJ。
图3显示表达质粒pUBS520-pIN-J-区域。
图4显示表达质粒pUBS520-pIN-hsp25。
图5显示表达质粒pUBS520-ScFvOx。
图6显示表达质粒pET20b(+)-rPA.
综述：
对于DnaJ，J-区域和Hsp25在大肠杆菌中的周质过表达，将编码这些蛋白质的DNA通过基因工程技术与大肠杆菌的外膜蛋白质A(OmpA)的信号序列融合，并将该融合体在1ac-1pp启动子的控制之下在大肠杆菌中在一个重组质粒上表达。结果，DnaJ和Hsp25的多肽链被转移至原核宿主生物体的周质中并在其中进行天然折叠。它们的定位和DNAJ的天然折叠通过使用胰蛋白酶的限制水解和通过Western印迹来显示。
实施例1：
表达质粒pIN Ⅲ omp A3-dnaJ的构建
分子遗传技术基于Ausubel等(Ed.)，J.Wiley&Sons，1997，Curr.Protocols of Molecular Biology。寡核苷酸得自以下公司：MWG Biotech，Ebersberg or GIBCO Life Sciences，Eggenstein，GER。
编码DnaJ，Gene Bank Accession No.M 12565，的基因通过限制性内切酶位点EcoRⅠ和BamHⅠ被克隆进表达质粒pIN Ⅲ ompA3(Ghayreb等，EMBO J.3(1984)2437-2442)。被克隆的PCR片段的序列通过双脱氧测序方法检测(LiCor DNA-Sequencer 4000，MWG Biotech，Fbersberg)。将得到的质粒命名为pIN Ⅲ ompA3-dnaJ。在周质中表达的DnaJ的序列不同于野生型蛋白，不同点为该多肽序列的开始为Gly-Ile-Pro而不是Met，因而具有一个2个氨基酸的N-末端延伸。因而，DnaJ是在lac-lpp启动子的控制之下，该启动子被IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导。
实施例2：
表达质粒pUBS520-pIN-dnaJ的构建
将来自质粒pIN Ⅲ ompA3-dnaJ的编码lac-lpp操纵子，信号序列，dnaJ基因和该操纵子的终止子的区段通过PCR扩增(SEQ ID NO：1)。将该PCR产物用限制性内切酶BglⅡ进行切割并克隆进用限制性内切酶BamHI线性化的载体pUBS520。将得到的质粒命名为pUBS520-pIN-dnaJ(图2)。
实施例3：
表达质粒puBS 520-pIN-J-区域
通过使用QuikChange诱变系统(Promega，Mannheim，DE)将两个终止密码子插入在质粒puBS 520-pIN-dnaJ的核苷酸324之后，从而仅使最初的108个氨基酸被表达。通过双脱氧测序(LiCor DNA-Sequencer 4000，MWG Biotech，Ebersberg)确定突变的区域的序列，并通过Western印迹和用抗-DnaJ抗体检测测定截短的蛋白质片段的表达。将形成的质粒命名为puBS 520-pIN-J-区域(图3)。
实施例4：
表达质粒pIN Ⅲ ompA3-hsp25的构建
将编码Hsp25，Gene Bank Accession No.：L 07577，的基因通过限制性酶切位点EcoRⅠ和BamHⅠ克隆进表达质粒pIN Ⅲ ompA3(Ghayreb等，EMBO J.3(1984)2437-2442)。通过双脱氧测序检测克隆的PCR片段的序列(LiCor DNA-Sequencer 4000，MWG Biotech，Fbersberg)。将得到的质粒命名为pIN Ⅲ ompA3-hsp25。在周质中表达的Hsp25的序列不同于野生型蛋白质的序列，其不同点为该多肽序列的开始为Gly-Ile-Leu而不是Met，因而在N-末端具有2个氨基酸的延伸。因而，Hsp25是在lac-lpp启动子的控制之下，该启动子被IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导。
实施例5：
表达质粒pUBS520-pIN-hsp25的构建
将来自质粒pIN Ⅲ ompA3-hsp25的编码lac-lpp操纵子，信号序列，hsp25基因和该操纵子的终止子的区段通过PCR扩增(SEQ ID NO：5)。将该PCR产物用限制性内切酶BglⅡ进行切割并克隆进用限制性内切酶BamHⅠ线性化的载体pUBS520。将得到的质粒命名为pUBS520-pIN-hsp25(图4)。
实施例6：
表达质粒pUBS520-ScFvOx的构建
对一种不具有伴侣分子性能的针对半抗原oxazolon的单链Fv片段(ScFvOxazolon；Fiedler和Conrad，Bio/Technology 13(1995)的共表达进行检测，作为负对照。
将来自质粒pHFN-ScFvOx的编码lac启动子的区域、信号序列pelB和scfvox基因通过PCR扩增。来质粒pIN Ⅲ ompA3的编码lpp终止子的区域在第二个PCR中扩增。在下一个PCR中将这两个片段融合。将以这种方式形成的PCR产物(SEQ ID NO：7)用限制性内切酶BglⅡ切割并克隆进用限制性内切酶BamHⅠ线性化的载体pUBS520中。将得到的质粒命名为pUBS520-ScFvOx(图5)。
实施例 7：
表达质粒pET20b(+)-rPA的构建
将来自质粒载体pA27fd7(Kohnert等，Protein Engineering 5(1992)93-100)的rPA的基因通过PCR扩增。将PCR产物用限制性内切酶NcoⅠ和BamHI切割并克隆进质粒载体pET20b(+)(Novagen Inc.，Madison，USA)。该质粒编码一种融合蛋白质，它是由PelB的信号序列和rPA组成的，并且rPA向周质中的分泌通过双脱氧测序进行检测(LiCor DNA-Sequencer 4000，MWG Biotech，Ebersberg，DE)。将该构建体命名为pFT20b(+)-rPA(SEQIDNO：10)(图6)。rPA在质粒中在T7启动子的控制之下进行表达，在大肠杆菌菌株BL21(DF3)中的T7-RNA-聚合酶是在lacUV5启动子的控制之下。通过加入IPTG进行诱导。在周质中表达的rPA不同于由Kohnert等描述的血纤蛋白溶酶原激活物，其不同点在于第二个氨基酸(Ser)被Ala替换。
实施例8：
rPA大肠杆菌周质中的功能性表达
将静止过夜培养的大肠杆菌BL21(DE3)细胞(Studier & Moffat，J.MoLBiol.189(1986)113-130)，它含有pET20b(+)-rPA和pUBS520-pIN-dnaJ(DnaJ的共表达)，过夜培养的大肠杆菌BL21(DE3)细胞，它含有pET20b(+)-rPA和pUBS520-pIN-J-区域(J-区域的共表达)，过夜培养的大肠杆菌BL21(DE3)细胞，它含有pET20b(+)-rPA和pUBS520-pIN-hsp25(Hsp25的共表达)，过夜培养的大肠杆菌BL21(DE3)细胞，它含有pET20b(+)-rPA和pUBS520-ScFvOx(ScFvOx的共表达)，过夜培养的大肠杆菌BL21(DE3)细胞，它含有pET20b(+)-rPA和pUBS520或者过夜培养的大肠杆菌BL21(DE3)细胞，它含有pET20b(+)和pUBS520(对照培养)，以1∶50的比率稀释在100ml LB-培养基中，该培养基中含有氨苄青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml，Fluka Chemica，Neu-Ulm，GER)，并在24℃和170rpm下振荡。在生长3小时后，将5ml的培养物等份试样加入10ml LB培养基中，该LB培养基中含有上述量的氨苄青霉素和卡那霉素和5mMGSH(Fluka，GER)并将它们用1mM IPTG(AppliChem，Darmstadt，GER)诱导。将细胞再在24℃和170rpm下振荡21小时，并在测定OD600后取出1ml样品。将这些1ml的细胞样品在2ml Eppendorf反应管中，按照Jacobi等(J.Biol.Chem.272(1997)21692-21699)的方法的改良方法进行分级。详细地说，将500μl的分级缓冲液(150mM NaCl(Roth GmbH)，50mM Tris/HCl(Roth GmbH，5mM FDTA(Biomol)和1mg/ml多粘菌素B硫酸盐(Sigma)，pH7.5)加入细胞团粒中，在10℃在一个Eppendorf热振荡器上在1400rpm振荡1小时，然后在14000rpm在一个冷却至10℃的Eppendorf微离心器上离心15分钟，形成一个含有可溶性周质蛋白质的级分(上清液)和一个残留级分(团粒)。
基本上按照Verheijen等Thromb.Haemostasis 48(1982)266-269)的方法测定rPA的活性。
将所有的在细胞抽提物中测定的rPA浓度对OD600=1的细胞悬液进行标准化，以校正在不同的缓冲液中测定时发生的误差。结果示于表1。
                        表1：
分子伴侣的共表达在大肠杆菌周质中在发酵培养基中5mM GSH的存在下对rPA形成的影响
    共表达的蛋白质     rPA(ng/ml*OD600)     刺激因子
    0.030±0.001     29
    DnaJ     0.197±0.019     29
    J区域     0.339±0.007     16
    Hsp25     0.053±0.002     27
    ScFvOxazolon(对照)     0.041±0.003     13
培养是在5mM GSH的存在下进行的。
实施例9：
通过pIN Ⅲ ompA3表达的DnaJ的周质定位的测定
制备原生质球，以改善通过pIN Ⅲ ompA3-dnaJ分泌至周质中的DnaJ的周质定位和正确折叠。该含有pIN Ⅲ ompA3-dnaJ的大肠杆菌XLI蓝色细胞是从含有100pg/ml氨苄青霉素(Sigma，Deisenhofen)的LB培养基(1LLB培养基含有l0g Bacto-tryptone(Difco Factories，Detroit，Michigan，USA)，5g酵母(Difco Factories)和5g NaCl(Roth GmbH，Karlsruhe))，在37℃和200rpm培养并在2.75小时后用1mM IPTG诱导(OD600约0.5)的静止预先培养物以1∶50的比例稀释后得到的。在诱导剂的存在下生长3小时后，通过离心收集细胞(Eppendorf微离心，5000rpm，5分钟)。将一个含有一种用于细胞内过表达DnaJ的质粒的大肠杆菌菌株作为对照进行培养，并诱导3小时。从离心后得到的细胞团粒按照下述方法制备原生质球：
将相应与QD600为1的等量的2ml细菌按照Thorstenson等，J.Bacteriol.179(1997)5333-5339的方法进行分级。将以团粒形式聚集的原生质球溶解在含有100mM NaCl的30μl 50mM Tris/HCI，pH8.0的溶液中，作为对照，将原生质球溶解在相同的缓冲液中，但加入0.1％Triton-X-100(Amresco，Solon，Ohio，USA)。对于随后的用胰蛋白酶限制水解来说，将15μl的各个原生质球制剂(含有或不含有Triton-X-100)与2μl的1mg/ml胰蛋白酶(Roche Diagnostics GmbH，GER)和23μl的含有100mM NaCl的50mM Tris/HCl，pH8.0混合，并在20℃温浴。在0，5和30分钟后，取出8μl样品，与2μl 4mg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂和3μl SDS-PAGE加样缓冲液(4％甘油(Sigma，Deisenhofen)，0.5％SDS(ICN)，2％巯基乙醇(Sigma)，0.0625M Tris/HCl，pH6.8和溴酚兰(Sigma))混合，并沸煮5分钟。在对照实验中，将2μg纯化的DnaJ(2μg／μl)与lμl 100μg/ml胰蛋白酶和含有100 mM NaCl的14μl 50mM Tris/HCl，pH8.0混合，在20℃下温浴，并在所述的时间结束水解。将水解的产物按照Lammli等，Nature227(1970)680-685)所述的SDS-PAGE进行分离。将分离的蛋白质转移至硝酸纤维素膜上(RioRad Laboratories，Munich)(Khyse-Anderson，J.Biochem.Biophys.Methods 10(1984)203-207；Towbin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79(1979)267-271)。将该膜用TBS-5％奶粉(Glucksklee，NestleFrankfurt)封闭过夜，然后用TBS 5％奶粉中的抗-DnaJ抗体反应2小时。在TBS中洗涤5分钟的三个洗涤步骤之后，将它们用TBS-5％奶粉中的额外的抗体(抗兔-IgG过氧化物酶，Amersham Life Sciences，Braunschweig)温浴1.5小时，并在用TBS缓冲液洗涤5次。使用Amersham Company的ECLWestern印迹测定试剂盒进行检测。结果如图1所示。由于在原生质球制备后分泌的分子伴侣是蛋白酶敏感性的，这表明它位于内膜的周质侧。相反，细胞内DnaJ在原生质球制备后仍为蛋白酶保护的。由Triton-X-100造成的原生质球的通透化导致细胞内DnaJ被胰蛋白酶消化。在周质中表达的DnaJ的切割类型与纯化的天然的DnaJ的相同。因而这表明周质中表达的产物在这一空间中是天然形式的。
参考文献
Arrigo & Landry(1994)In Morimoto(publ.):The Biology of HeatShock Proteins and Molecular Chaperones(热休克蛋白质和分子伴侣的生物学)，Cold Spring Harbour Press，335-373
Ausubel等(publ.)Current Protocols in Molecular Biology(当代生物学方法)，J.Wiley & Sons,1997
Berges等，Appl.Environ.Microbiol.62(1996)55-60
Brinknann等，Gene(基因)85(1989)109-114
Bukau，B.& Horwich，A.，Cell(细胞)92(1998)351-366
Cyr等，TIBS 19(1994)176-181)
Ehrnsperger等，FMBO 1.16(1997)221-229
EP-A0510658
EP-A 0 556 726
Fiedler和Conrad，Bio/Technology 13(1995)1090-1093
Gaestel等，Eur.J.Biochem.(欧洲生物化学杂志)179(1989)209-213
Ghayreb等，FMBO J.3(1984)2437-2442
Goloubinoff等，Nature(自然)337(1989)44-47
Hayhurst和Harris，Protein Expr.Purif．15(1999)336-343
Hockney，TIBTECH 12(1994)456-463
Jacobi等J.Biol.Chem.(生物化学杂志)272(1997)21692-21699
Jakob等，J.Biol．Chem.268(1993)1517-1520
Jakob和Buchner，TIBS 19(1994)205-211
Kelley，TIBS 23(1998)222-227
Khyse-Anderson，J.Biochem.Biophys.Methods 10(1984)203-207
Knappik等，Bio/Technology 11(1993)77-83
Kohnert等，Protein Engineering(蛋白质工程)5(1992)93-100
Lammli等，Nature 227(1970)680-685
Langer等，Nature 356(1992)683-689
Lee & Olins，J.Biol.Chem.267(1992)2849-2852
Martin等，Cardiovasc.Drug Rev.11(1993)299-311
Murphy & Beckwith:Export of Proteins to the Cell Envelope inEscherichia coli
Neidhardt等(publ.)：Escherichia coli和Salmonella，Second Edition，Vol.1，ASM Press，Washington，1996，5.967-978
Paetzel等，Nature 396(1998)186-190
Perez-Perez等，Biochem.Biophys.Res.Commun.(生物化学生物物理学研究通讯)210(1995)524-529
Qiu等，Appl.Fnvironm.Microbiol.64(1998)4891-4896
Roman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(1995)8428-8432
Sato等，Biochem.Biophys.Res.Commun.202(1994)258-264
Schmidt等，Prot.Engin.11(1998)601-607
Schroder等，EMBO J.12(1993)4137-4144
Silver和Way，Cell(细胞)74(1994)5-6
Studier & Moffat，J.Mol.Biol.189(19&6)113-130
Thomas等，Appl.Biochem.Biotechnol.(应用生物化学生物技术)66(1997)197-238
Thorstenson等，J.Bacteriol.(细菌学杂志)179(1997)5333-5339
Towbin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院刊)79(1979)267-271
US-Patent(美国专利)No.5，223，256
Verheijen等Thromb.Haemostasis 48(1982)266-269
Wall等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)270(1995)2139-2144
Wulflng und Pluckthun，Mol.Microbiol.(分子微生物学)12(1994)685-692
Yokoyama等，Microbiol.Ferment.Technol.(微生物发酵杂志)62(1998)1205-1210
                                  序列表<110>霍夫曼拉罗奇有限公司<120>通过分子伴侣的共分泌制备天然折叠的和分泌的蛋白质的方法<130>案号20381<140><141><150>EP99114811.5<151>1999-07-29<160>10<170>Patentln Ver.2.1<210>1<211>1881<212>DNA<213>大肠杆菌<220><221>CDS<222>(392)..(1591)<400>1taggcgtatc acgaggccct ttggataacc agaagcaata aaaaatcaaa tcggatttca 60ctatataatc tcactttatc taagatgaat ccgatggaag catcctgttt tctctcaatt 120tttttatcta aaacccagcg ttcgatgctt ctttgagcga acgatcaaaa ataagtgcct 180tcccatcaaa aaaatattct caacataaaa aactttgtgt aatacttgta acgctacatg 240gagattaact caatctagct agagaggctt tacactttat gcttccggct cgtataatgt 300gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag ctatgaccat gattacggat 360tcactggaac tctagataac gagggcaaaa a atg aaa aag aca gct atc gcg    412Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala
                                   1               5att gca gtg gca ctg gct ggt ttc gct acc gta gcg cag gcc gga att   460Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Gly Ile
       10                  15                  20cca gct aag caa gat tat tac gag att tta ggc gtt tcc aaa aca gcg   508Pro Ala Lys Gln Asp Tyr Tyr Glu Ile Leu Gly Val Ser Lys Thr Ala
   25                  30                  35gaa gag cgt gaa atc aga aag gcc tac aaa cgc ctg gcc atg aaa tac   556Glu Glu Arg Glu Ile Arg Lys Ala Tyr Lys Arg Leu Ala Met Lys Tyr40                  45                  50                  55cac ccg gac cgt aac cag ggt gac aaa gag gcc gag gcg aaa ttt aaa   604His Pro Asp Arg Asn Gln Gly Asp Lys Glu Ala Glu Ala Lys Phe Lys
             60                  65                  70gag atc aag gaa gct tat gaa gtt ctg acc gac tcg caa aaa cgt gcg   652Glu Ile Lys Glu Ala Tyr Glu Val Leu Thr Asp Ser Gln Lys Arg Ala
         75                  80                  85gca tac gat cag tat ggt cat gct gcg ttt gag caa ggt ggc atg ggc   700Ala Tyr Asp Gln Tyr Gly His Ala Ala Phe Glu Gln Gly Gly Met Gly
     90                  95                 100ggc ggc ggt ttt ggc ggc ggc gca gac ttc agc gat att ttt ggt gac   748Gly Gly Gly Phe Gly Gly Gly Ala Asp Phe Ser Asp Ile Phe Gly Asp
105                 110                 115gtt ttc ggc gat att ttt ggc ggc gga cgt ggt cgt caa cgt gcg gcg   796Val Phe Gly Asp Ile Phe Gly Gly Gly Arg Gly Arg Gln Arg Ala Ala120                 125                 130                 135cgc ggt gct gat tta cgc tat aac atg gag ctc acc ctc gaa gaa gct   844Arg Gly Ala Asp Leu Arg Tyr Asn Met Glu Leu Thr Leu Glu Glu Ala
            140                 145                 150gta cgt ggc gtg acc aaa gag atc cgc att ccg act ctg gaa gag tgt   892Val Arg Gly Val Thr Lys Glu Ile Arg Ile Pro Thr Leu Glu Glu Cys
        155                 160                 165gac gtt tgc cac ggt agc ggt gca aaa cca ggt aca cag ccg cag act   940Asp Val Cys His Gly Ser Gly Ala Lys Pro Gly Thr Gln Pro Gln Thr
    170                 175                 180tgt ccg acc tgt cat ggt tct ggt cag gtg cag atg cgc cag gga ttc   988Cys Pro Thr Cys His Gly Ser Gly Gln Val Gln Met Arg Gln Gly Phe
185                 190                 195ttc gct gta cag cag acc tgt cca cac tgt cag ggc cgc ggt acg ctg   1036Phe Ala Val Gln Gln Thr Cys Pro His Cys Gln Gly Arg Gly Thr Leu200                 205                 210                 215atc aaa gat ccg tgc aac aaa tgt cat ggt cat ggt cgt gtt gag cgc   1084Ile Lys Asp Pro Cys Asn Lys Cys His Gly His Gly Arg Val Glu Arg
            220                 225                 230agc aaa acg ctg tcc gtt aaa atc ccg gca ggg gtg gac act gga gac   1132Ser Lys Thr Leu Ser Val Lys Ile Pro Ala Gly Val Asp Thr Gly Asp
        235                 240                 245cgc atc cgt ctt gcg ggc gaa ggt gaa gcg ggc gag cat ggc gca ccg   1180Arg Ile Arg Leu Ala Gly Glu Gly Glu Ala Gly Glu His Gly Ala Pro
    250                 255                 260gca ggc gat ctg tac gtt cag gtt cag gtt aaa cag cac ccg att ttc   1228Ala Gly Asp Leu Tyr Val Gln Val Gln Val Lys Gln His Pro Ile Phe
265                 270                 275gag cgt gaa ggc aac aac ctg tat tgc gaa gtc ccg atc aac ttc gct   1276Glu Arg Glu Gly Asn Asn Leu Tyr Cys Glu Val Pro Ile Asn Phe Ala280                 285                 290                 295atg gcg gcg ctg ggt ggc gaa atc gaa gta ccg acc ctt gat ggt cgc   1324Met Ala Ala Leu Gly Gly Glu Ile Glu Val Pro Thr Leu Asp Gly Arg
            300                 305                 310gtc aaa ctg aaa gtg cct ggc gaa acc cag acc ggt aag cta ttc cgt   1372Val Lys Leu Lys Val Pro Gly Glu Thr Gln Thr Gly Lys Leu Phe Arg
        315                 320                 325atg cgc ggt aaa ggc gtc aag tct gtc cgc ggt ggc gca cag ggt gat   1420Met Arg Gly Lys Gly Val Lys Ser Val Arg Gly Gly Ala Gln Gly Asp
    330                 335                 340ttg ctg tgc cgc gtt gtc gtc gaa aca ccg gta ggc ctg aac gaa agg   1468Leu Leu Cys Arg Val Val Val Glu Thr Pro Val Gly Leu Asn Glu Arg
345                 350                 355cag aaa cag ctg ctg caa gag ctg caa gaa agc ttc ggt ggc cca acc   1516Gln Lys Gln Leu Leu Gln Glu Leu Gln Glu Ser Phe Gly Gly Pro Thr360                 365                 370                 375ggc gag cac aac agc ccg cgc tca aag agc ttc ttt gat ggt gtg aag   1564Gly Glu His Asn Ser Pro Arg Ser Lys Ser Phe Phe Asp Gly Val Lys
            380                 385                 390aag ttt ttt gac gac ctg acc cgc taa ggatccggct gagcaacgac          1611Lys Phe Phe Asp Asp Leu Thr Arg
        395                 400gtgaacgcaa tgcgttccga cgttcaggct gctaaagatg acgcagctcg tgctaaccag 1671cgtctggaca acatggctac taaataccgc aagtaatagt acctgtgaag tgaaaaatgg 1731cgcacattgt gcgacatttt ttttgtctgc cgtttaccgc tactgcgtca cgcgtaacat 1791attcccttgc tctggttcac cattctgcgc tgactctact gaaggcgcat tgctggctgc 1851gggagttgct ccactgctca ccgaaaccgg                                  1881<210>2<211>399<212>蛋白质<213>大肠杆菌<400>2Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala1               5                  10                  15Thr Val Ala Gln Ala Gly Ile Pro Ala Lys Gln Asp Tyr Tyr Glu Ile
        20                  25                  30Leu Gly Val Ser Lys Thr Ala Glu Glu Arg Glu Ile Arg Lys Ala Tyr
     35                  40                  45Lys Arg Leu Ala Met Lys Tyr His Pro Asp Arg Asn Gln Gly Asp Lys
 50                  55                  60Glu Ala Glu Ala Lys Phe Lys Glu Ile Lys Glu Ala Tyr Glu Val Leu65                  70                  75                  80Thr Asp Ser Gln Lys Arg Ala Ala Tyr Asp Gln Tyr Gly His Ala Ala
             85                  90                  95Phe Glu Gln Gly Gly Met Gly Gly Gly Gly Phe Gly Gly Gly Ala Asp
        100                 105                 110Phe Ser Asp Ile Phe Gly Asp Val Phe Gly Asp Ile Phe Gly Gly Gly
    115                 120                 125Arg Gly Arg Gln Arg Ala Ala Arg Gly Ala Asp Leu Arg Tyr Asn Met
130                 135                 140Glu Leu Thr Leu Glu Glu Ala Val Arg Gly Val Thr Lys Glu Ile Arg145                 150                 155                 160Ile Pro Thr Leu Glu Glu Cys Asp Val Cys His Gly Ser Gly Ala Lys
            165                 170                 175Pro Gly Thr Gln Pro Gln Thr Cys Pro Thr Cys His Gly Ser Gly Gln
        180                 185                 190Val Gln Met Arg Gln Gly Phe Phe Ala Val Gln Gln Thr Cys Pro His
    195                 200                 205Cys Gln Gly Arg Gly Thr Leu Ile Lys Asp Pro Cys Asn Lys Cys His
210                 215                 220Gly His Gly Arg Val Glu Arg Ser Lys Thr Leu Ser Val Lys Ile Pro225                 230                 235                 240Ala Gly Val Asp Thr Gly Asp Arg Ile Arg Leu Ala Gly Glu Gly Glu
            245                 250                 255Ala Gly Glu His Gly Ala Pro Ala Gly Asp Leu Tyr Val Gln Val Gln
        260                 265                 270Val Lys Gln His Pro Ile Phe Glu Arg Glu Gly Asn Asn Leu Tyr Cys
    275                 280                 285Glu Val Pro Ile Asn Phe Ala Met Ala Ala Leu Gly Gly Glu Ile Glu
290                 295                 300Val Pro Thr Leu Asp Gly Arg Val Lys Leu Lys Val Pro Gly Glu Thr305                 310                 315                 320Gln Thr Gly Lys Leu Phe Arg Met Arg Gly Lys Gly Val Lys Ser Val
            325                 330                 335Arg Gly Gly Ala Gln Gly Asp Leu Leu Cys Arg Val Val Val Glu Thr
        340                 345                 350Pro Val Gly Leu Asn Glu Arg Gln Lys Gln Leu Leu Gln Glu Leu Gln
    355                 360                 365Glu Ser Phe Gly Gly Pro Thr Gly Glu His Asn Ser Pro Arg Ser Lys
370                 375                 380Ser Phe Phe Asp Gly Val Lys Lys Phe Phe Asp Asp Leu Thr Arg385                 390                 395<210>3<211>1881<212>DNA<213>大肠杆菌<220><221>CDS<222>(392)..(790)<400>3taggcgtatc acgaggccct ttggataacc agaagcaata aaaaatcaaa tcggatttca 60ctatataatc tcactttatc taagatgaat ccgatggaag catcctgttt tctctcaatt 120tttttatcta aaacccagcg ttcgatgctt ctttgagcga acgatcaaaa ataagtgcct 180tcccatcaaa aaaatattct caacataaaa aactttgtgt aatacttgta acgctacatg 240gagattaact caatctagct agagaggctt tacactttat gcttccggct cgtataatgt 300gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag ctatgaccat gattacggat 360tcactggaac tctagataac gagggcaaaa a atg aaa aag aca gct atc gcg    412Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala
                                 1               5att gca gtg gca ctg gct ggt ttc gct acc gta gcg cag gcc gga att   460Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Gly Ile
     10                  15                  20cca gct aag caa gat tat tac gag att tta ggc gtt tcc aaa aca gcg   508Pro Ala Lys Gln Asp Tyr Tyr Glu Ile Leu Gly Val Ser Lys Thr Al
 25                  30                  35gaa gag cgt gaa atc aga aag gcc tac aaa cgc ctg gcc atg aaa tac    556Glu Glu Arg Glu Ile Arg Lys Ala Tyr Lys Arg Leu Ala Met Lys Tyr40                  45                  50                  55cac ccg gac cgt aac cag ggt gac aaa gag gcc gag gcg aaa ttt aaa   604His Pro Asp Arg Asn Gln G1y Asp Lys Glu Ala Glu Ala Lys Phe Lys
             60                  65                  70gag atc aag gaa gct tat gaa gtt ctg acc gac tcg caa aaa cgt gcg    652Glu Ile Lys Glu Ala Tyr Glu Val Leu Thr Asp Ser Gln Lys Arg Ala
         75                  80                  85gca tac gat cag tat ggt cat gct gcg ttt gag caa ggt ggc atg ggc    700Ala Tyr Asp Gln Tyr Gly His Ala Ala Phe Glu Gln Gly Gly Met Gly
     90                  95                 100ggc ggc ggt ttt ggc ggc ggc gca gac ttc agc gat att ttt ggt gac   748Gly Gly Gly Phe Gly Gly Gly Ala Asp Phe Ser Asp Ile Phe Gly Asp
105                 110                 115gtt ttc ggc gat att ttt ggc ggc gga cgt ggt cgt taa tag             790Val Phe Gly Asp Ile Phe Gly Gly Gly Arg Gly Arg120                 125                 130gcggcgcgcg gtgctgattt acgctataac atggagctca ccctcgaaga agctgtacgt 850ggcgtgacca aagagatccg cattccgact ctggaagagt gtgacgtttg ccacggtagc 910ggtgcaaaac caggtacaca gccgcagact tgtccgacct gtcatggttc tggtcaggtg 970cagatgcgcc agggattctt cgctgtacag cagacctgtc cacactgtca gggccgcggt 1030acgctgatca aagatccgtg caacaaatgt catggtcatg gtcgtgttga gcgcagcaaa 1090acgctgtccg ttaaaatccc ggcaggggtg gacactggag accgcatccg tcttgcgggc 1150gaaggtgaag cgggcgagca tggcgcaccg gcaggcgatc tgtacgttca ggttcaggtt 1210aaacagcacc cgattttcga gcgtgaaggc aacaacctgt attgcgaagt cccgatcaac 1270ttcgctatgg cggcgctggg tggcgaaatc gaagtaccga cccttgatgg tcgcgtcaaa 1330ctgaaagtgc ctggcgaaac ccagaccggt aagctattcc gtatgcgcgg taaaggcgtc 1390aagtctgtcc gcggtggcgc acagggtgat ttgctgtgcc gcgttgtcgt cgaaacaccg 1450gtaggcctga acgaaaggca gaaacagctg ctgcaagagc tgcaagaaag cttcggtggc 1510ccaaccggcg agcacaacag cccgcgctca aagagcttct ttgatggtgt gaagaagttt 1570tttgacgacc tgacccgcta aggatccggc tgagcaacga cgtgaacgca atgcgttccg 1630acgttcaggc tgctaaagat gacgcagctc gtgctaacca gcgtctggac aacatggcta 1690ctaaataccg caagtaatag tacctgtgaa gtgaaaaatg gcgcacattg tgcgacattt 1750tttttgtctg ccgtttaccg ctactgcgtc acgcgtaaca tattcccttg ctctggttca 1810ccattctgcg ctgactctac tgaaggcgca ttgctggctg cgggagttgc tccactgctc 1870accgaaaccg g                                                                1881<210>4<2ll>131<212>蛋白质<213>大肠杆菌<400>4Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala1               5                  10                  15Thr Val Ala Gln Ala Gly Ile Pro Ala Lys Gln Asp Tyr Tyr Glu Ile
         20                  25                  30Leu Gly Val Ser Lys Thr Ala Glu Glu Arg Glu Ile Arg Lys Ala Tyr
     35                  40                  45Lys Arg Leu Ala Met Lys Tyr His Pro Asp Arg Asn Gln Gly Asp Lys
 50                  55                   60Glu Ala Glu Ala Lys Phe Lys Glu Ile Lys Glu Ala Tyr Glu Val Leu65                  70                  75                  80Thr Asp Ser Gln Lys Arg Ala Ala Tyr Asp Gln Tyr Gly His Ala Ala
             85                  90                  95Phe Glu Gln Gly Gly Met Gly Gly Gly Gly Phe Gly Gly Gly Ala Asp
        100                 105                 110Phe Ser Asp Ile Phe Gly Asp Val Phe Gly Asp Ile Phe Gly Gly Gly
    115                 120                 125Arg Gly Arg
130<210>5<211>1379<212>DNA<213>大肠杆菌<220><221> CDS<222> (392)..(1090)<400> 5taggcgtatc acgaggccct ttggataacc agaagcaata aaaaatcaaa tcggatttca 60ctatataatc tcactttatc taagatgaat ccgatggaag catcctgttt tctctcaatt 120tttttatcta aaacccagcg ttcgatgctt ctttgagcga acgatcaaaa ataatgcct 180tcccatcaaa aaaatattct caacataaaa aactttgtgt aatacttgta acgctacatg 240gagattaact caatctagct agagaggctt tacactttat gcttccggct cgtataatgt 300gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag ctatgaccat gattacggat 360tcactggaac tctagataac gaggcaaaa a atg aaa aag aca gct atc gcg     412
                                  Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala
                                    1               5att gca gtg gca ctg gct ggt ttc gct acc gta gcg cag gcc gga att   460Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Gly Ile
     10                  15                  20ctc acc gag cgc cgc gtg ccc ttc tcg ctg ctg cgg agc ccg agc tgg   508Leu Thr Glu Arg Arg Val Pro Phe Ser Leu Leu Arg Ser Pro Ser Trp
 25                  30                  35gaa cca ttc cgg gac tgg tac cct gca cac agc cgc ctc ttc gat caa   556Glu Pro Phe Arg Asp Trp Tyr Pro Ala His Ser Arg Leu Phe Asp Gln40                  45                  50                  55gct ttc ggg gtg ccc cgg ttg ccc gat gag tgg tcg cag tgg ttc agc   604Ala Phe Gly Val Pro Arg Leu Pro Asp Glu Trp Ser Gln Trp Phe Ser
             60                  65                  70gcc gct ggg tgg ccc gga tac gtg cgc ccg ctg ccc gcc gcg acc gcc   652Ala Ala Gly Trp Pro Gly Tyr Val Arg Pro Leu Pro Ala Ala Thr Ala
         75                  80                  85gag ggc ccc gcg gcg gtg acc ctg gcc gca cca gcc ttc agc cga gcg   700Glu Gly Pro Ala Ala Val Thr Leu Ala Ala Pro Ala Phe Ser Arg Ala
     90                  95                 100ctc aac cga cag ctc agc agc ggg gtc tcg gag atc cga cag acg gct   748Leu Asn Arg Gln Leu Ser Ser Gly Val Ser Glu Ile Arg Gln Thr Ala
105                 110                 115gat cgc tgg cgc gtg tcc ctg gac gtc aac cac ttc gct ccg gag gag   796Asp Arg Trp Arg Val Ser Leu Asp Val Asn His Phe Ala Pro Glu Glu120                 125                 130                 135ctc aca gtg aag acc aag gaa ggc gtg gtg gag atc act ggc aag cac   844Leu Thr Val Lys Thr Lys Glu Gly Val Val Glu Ile Thr Gly Lys His
            140                 145                 150gaa gaa agg cag gac gaa cat ggc tac atc tct cgg tgc ttc acc cgg   892Glu Glu Arg Gln Asp Glu His Gly Tyr Ile Ser Arg Cys Phe Thr Arg
        155                 160                 165aaa tac acg ctc cct cca ggt gtg gac ccc acc cta gtg tcc tct tcc   940Lys Tyr Thr Leu Pro Pro Gly Val Asp Pro Thr Leu Val Ser Ser Ser
    170                 175                 180cta tcc cct gag ggc aca ctt acc gtg gag gct ccg ttg ccc aaa gca   988Leu Ser Pro Glu Gly Thr Leu Thr Val Glu Ala Pro Leu Pro Lys Ala
185                 190                 195gtc acg cag tca gcg gag atc acc att ccg gtt act ttc gag gcc cgc   1036Val Thr Gln Ser Ala Glu Ile Thr Ile Pro Val Thr Phe Glu Ala Arg200                 205                 210                 215gcc caa att ggg ggc cca gaa gct ggg aag tct gaa cag tct gga gcc   1084Ala Gln Ile Gly Gly Pro Glu Ala Gly Lys Ser Glu Gln Ser Gly Ala
            220                 225                 230aag tag gatccggctg agcaacgacg tgaacgcaat gcgttccgac gttcaggctg    1140Lysctaaagatga cgcagctcgt gctaaccagc gtctggacaa catggctact aaataccgca 1200agtaatagta cctgtgaagt gaaaaatggc gcacattgtg cgacattttt tttgtctgcc 1260gtttaccgct actgcgtcac gcgtaacata ttcccttgct ctggttcacc attctgcgct 1320gactctactg aaggcgcatt gctggctgcg ggagttgctc cactgctcac cgaaaccgg  1379<2l0>6<211>232<212>蛋白质<213>大肠杆菌<400> 6Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala1               5                  10                  15Thr Val Ala Gln Ala Gly Ile Leu Thr Glu Arg Arg Val Pro Phe Ser
         20                  25                  30Leu Leu Arg Ser Pro Ser Trp Glu Pro Phe Arg Asp Trp Tyr Pro Ale
     35                  40                  45His Ser Arg Leu Phe Asp Gln Ala Phe Gly Val Pro Arg Leu Pro Asp
50                   55                  60Glu Trp Ser Gln Trp Phe Ser Ala Ala Gly Trp Pro Gly Tyr Val Arg65                  70                  75                  80Pro Leu Pro Ala Ala Thr Ala Glu Gly Pro Ala Ala Val Thr Leu Ala
             85                  90                  95Ala Pro Ala Phe Ser Arg Ala Leu Asn Arg Gln Leu Ser Ser Gly Val
        100                 105                 110Ser Glu Ile Arg Gln Thr Ala Asp Arg Trp Arg Val Ser Leu Asp Val
    115                 120                 125Asn His Phe Ala Pro Glu Glu Leu Thr Val Lys Thr Lys Glu Gly Val
130                 135                 140Val Glu Ile Thr Gly Lys His Glu Glu Arg Gln Asp Glu His Gly Tyr145                 150                 155                 160Ile Ser Arg Cys Phe Thr Arg Lys Tyr Thr Leu Pro Pro Gly Val Asp
            165                 170                 175Pro Thr Leu Val Ser Ser Ser Leu Ser Pro Glu Gly Thr Leu Thr Val
        180                 185                 190Glu Ala Pro Leu Pro Lys Ala Val Thr Gln Ser Ala Glu Ile Thr Ile
    195                 200                 205Pro Val Thr Phe Glu Ala Arg Ala Gln Ile Gly Gly Pro Glu Ala Gly
210                 215                 220Lys Ser Glu Gln Ser Gly Ala Lys225                 230<2l0>7<211>1256<212>DNA<213>大肠杆菌<220><22l>CDS<222>(199)..(969)<400>7gatctggctt tacactttat gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa 60caatttcaca caggaaacag ctatgaccat gattacgcca agcttgcatg caaattctat 120ttcaaggaga cagtcataat gaaataccta ttgcctacgg cagccgctgg attgttatta 180ctcgcggccc agccggcc atg gcc gag gtc aag ctg cag gag tct ggg gga   231
                Met Ala Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly
                  1               5                  10ggc tta gtg cag cct gga ggg tcc cgg aaa ctc tcc tgt gca gcc tct   279Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser
         15                  20                      25gga ttc act ttc agt agc ttt gga atg cac tgg gtt cgt cag gct cca   327Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Mis Trp Val Arg Gln Ala Pro
    30                   35                      40gag aag ggg ctg gag tgg gtc gca tat att agt agt ggc agt agt acc   375Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr
 45                  50                      55atc tac tat gca gac aca gtg aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac   423Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp60                  65                  70                  75aat ccc aag aac acc ctg ttc ctg caa atg acc agt cta agg tct gag   471Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu
             80                  85                  90gac acg gcc atg tat tac tgc gca aga gat tac ggg gct tat tgg ggc   519Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Gly Ala Tyr Trp Gly
         95                 100                 105caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca ggt gga ggc ggt tca ggc gga   567Gln Gly Thr Thr Val Thr Va1 Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
    110                 115                 120ggt ggc tct ggc ggt ggc gga tcg gac att gag crc acc cag tct cca   615Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro
125                 130                 135gca atc atg tct gca tct cca ggg gag aag gtc acc atg acc tgc agt   663Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser140                 145                 150                 155gcc agt tca agt gta agg tac atg aac tgg ttc caa cag aag tca ggc   711Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Met Ash Trp Phe Gln Gln Lys Ser Gly
            160                 165                 170acc tcc ccc aaa aga tgg att tat gac aca tcc aaa ctg tct tct gga   759Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ser Ser Gly
        175                 180                 185gtc cct gct cgc ttc agt ggc agt ggg tct ggg acc tct tac tct ctc   807Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu
    190                 195                 200aca atc agc agc atg gag gct gaa gat gct gcc act tat tac tgc cag   855Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
205                 210                 215cag tgg agt agt aat cca ctc act ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag   903Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu220                 225                 230                 235ctg aaa cgg gcg gcc gca gaa caa aaa ctc atc tca gaa gag gat ctg   951Leu Lys Arg Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
            240                 245                 250aat ggg gcc gca tag taa ctgagcaacg acgtgaacgc aatgcgttcc            999AsN Gly Ala Ala
        255gacgttcagg ctgctaaaga tgacgcagct cgtgctaacc agcgtctgga caacatggct 1059actaaatacc gcaagtaata gtacctgtga agtgaaaaat ggcgcacatt gtgcgacatt 1119ttttttgtct gccgtttacc gctactgcgt cacgcgtaac atattccctt gctctggttc 1179accattctgc gctgactcta ctgaaggcgc attgctggct gcgggagttg ctccactgct 1239caccgaaacc ggagatc                                                1256<210>8<211>255<212>蛋白质<213>大肠杆菌<400>8Met Ala Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro1               5                  10                  15Gly Gly Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
         20                  25                  30Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu
     35                  40                  45Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp
 50                  55                  60Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr65                  70                  75                  80Leu Phe Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr
             85                  90                  95Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
        100                 105                 110Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
    115                 120                 125Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala
130                 135                 140Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val145                 150                 155                 160Arg Tyr Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg
            165                 170                 175Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ser Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe
        180                 185                 190Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met
    195                 200                 205Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn
210                 215                 220Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Ala225                 230                 235                 240Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala
            245                 250                 255<210>9<211>1137<212>DNA<213>大肠杆菌<220><221>CDS<222>(1)..(1137)<400>9atg aaa tac ctg ctg ccg acc gct gct gct ggt ctg ctg ctc ctc gct   48Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala1               5                  10                  15gcc cag ccg gcg atg gcc atg gct tac caa gga aac agt gac tgc tac   96Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Ala Tyr Gln Gly AsN Ser Asp Cys Tyr
         20                  25                  30ttt ggg aat ggg tca gcc tac cgt ggc acg cac agc ctc acc gag tcg   144Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser
     35                  40                  45ggt gcc tcc tgc ctc ccg tgg aat tcc atg atc ctg ata ggc aag gtt   192Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile Leu Ile Gly Lys Val
 50                  55                  60tac aca gca cag aac ccc agt gcc cag gca ctg ggc ctg ggc aaa cat   240Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys His65                  70                  75                  80aat tac tgc cgg aat cct gat ggg gat gcc aag ccc tgg tgc cac gtg   288Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Val
             85                  90                  95ctg acg aac cgc agg ctg acg tgg gag tac tgt gat gtg ccc tcc tgc   336Leu Thr Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys
        100                 105                 110tcc acc tgc ggc ctg aga cag tac agc cag cct cag ttt cgc atc aaa    384Ser Thr Gys Gly Leu Arg Gln Tyr Ser Gln Pro Gln Phe Arg Ile Lys
    115                 120                 125gga ggg ctc ttc gcc gac atc gcc tcc cac ccc tgg cag gct gcc atc   432Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro Trp Gln Ala Ala Ile
130                 135                 140ttt gcc aag cac agg agg tcg ccc gga gag cgg ttc ctg tgc ggg ggc   480Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly145                 150                 155                 160ata ctc atc agc tcc tgc tgg att ctc tct gcc gcc cac tgc ttc cag   528Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gln
            165                 170                 175gag agg ttt ccg ccc cac cac ctg acg gtg atc ttg ggc aga aca tac   576Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Val Ile Leu Gly Arg Thr Tyr
        180                 185                 190cgg gtg gtc cct ggc gag gag gag cag aaa ttt gaa gtc gaa aaa tac    624Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr
    195                 200                 205att gtc cat aag gaa ttc gat gat gac act tac gac aat gac att gcg   672Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asp AsN Asp Ile Ala
210                 215                 220ctg ctg cag ctg aaa tcg gat tcg tcc cgc tgt gcc cag gag agc agc   720Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys Ala Gln Glu Ser Ser225                 230                 235                 240gtg gtc cgc act gtg tgc ctt ccc ccg gcg gac ctg cag ctg ccg gac   768Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gln Leu Pro Asp
            245                 250                 255tgg acg gag tgt gag ctc tcc ggc tac ggc aag cat gag gcc ttg tct   816Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser
        260                 265                 270cct ttc tat tcg gag cgg ctg aag gag gct cat gtc aga ctg tac cca   864Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala Mis Val Arg Leu Tyr Pro
    275                 280                 285tcc agc cgc tgc aca tca caa cat tta ctt aac aga aca gtc acc gac   912Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp
290                 295                 300aac atg ctg tgt gct gga gac act cgg agc ggc ggg ccc cag gca aac   960Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn305                 310                 315                 320ttg cac gac gcc tgc cag ggc gat tcg gga ggc ccc ctg gtg tgt ctg   1008Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu
            325                 330                 335aac gat ggc cgc atg act ttg gtg ggc atc atc agc tgg ggc ctg ggc   1056Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly
        340                 345                 350tgt gga cag aag gat gtc ccg ggt gtg tac acc aag gtt acc aac tac   1104Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr
    355                 360                 365cta gac tgg att cgt gac aac atg cga ccg tga                       1137Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro
370                 375<210>10<211> 378<212>蛋白质<213>大肠杆菌<400> 10Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala1               5                  10                  15Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Ala Tyr Gln Gly Asn Ser Asp Cys Tyr
         20                  25                  30Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser
     35                  40                  45Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile Leu Ile Gly Lys Val
 50                  55                  60Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys His65                  70                  75                  80Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Val
             85                  90                  95Leu Thr Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys
        100                 105                 110Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr Ser Gln Pro Gln Phe Arg Ile Lys
    115                 120                 125Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro Trp Gln Ala Ala Ile
130                 135                 140Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly145                 150                 155                 160Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gln
            165                 170                 175Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Val Ile Leu Gly Arg Thr Tyr
        180                 185                 190Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr
    195                 200                 205Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala
210                 215                 220Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys Ala Gln Glu Ser Ser225                 230                 235                 240Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gln Leu Pro Asp
            245                 250                 255Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser
        260                 265                 270Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro
    275                 280                 285Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp
290                 295                 300Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn305                 310                 315                 320Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu
            325                 330                 335Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly
        340                 345                 350Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr
    355                 360                 365Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro
370                 375

Claims (10)

1．一种制备含有两个或几个通过二硫键连接的半胱氨酸的天然折叠的真核多肽的方法，该方法包括：
a)培养原核细胞，其中，所说的原核细胞含有一种表达载体，该载体编码所说的在N-末端含有一种原核信号序列的多肽，
b)将该多肽分泌至周质中或培养基中，
c)切割信号序列，并从周质或培养基中分离该多肽，其中，在所说的原核细胞中还表达一种编码一种分子伴侣的核酸，并且该分子伴侣被分泌至周质中，其先决条件是，培养是在没有精氨酸或一种通式Ⅰ
R2-CO-NRR1    (Ⅰ)的化合物的存在下进行的，其中，R和R1表示氢或一种饱和的或不饱和的支链或非支链的C1-C4烷基链和R2表示氢，NHR1或一种饱和的或不饱和的支链或非支链的C1-C3烷基链。
2．权利要求1的方法，其中，使用一种小热休克蛋白质(sHsp型)或者一种具有分子量约40kDa(Hsp40型)的热休克蛋白质。
3．权利要求1或2的方法，其中，一种还原硫醇试剂被加入在培养基中。
4．权利要求3的方法，其中，谷胱甘肽(GSH)被用作还原硫醇试剂。
5．权利要求1至4中任意一项所述的方法，其中，信号序列来自格兰氏阴性细菌。
6．权利要求1至5中任意一项所述的方法，其中，编码分子伴侣的核酸和编码该多肽的核酸位于两个不同的载体中。
7．权利要求1至5中任意一项所述的方法，其中编码分子伴侣的核酸位于还含有编码该多肽的核酸的表达载体上。
8．权利要求6或7的方法，其中，编码分子伴侣的重组DNA与编码用于穿过细菌内膜的信号肽的DNA片段是可操纵连接的。
9．权利要求6至8中任意一项所述的方法，其中，编码分泌的分子伴侣和/或分泌的蛋白质的DNA是在一种可诱导表达的信号的控制之下。
10．权利要求1至9中任意一项所述的方法，其中，该多肽是一种抗体，抗体片段，干扰素，蛋白质激素或蛋白酶。
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Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008138229A1 (fr) * 2007-05-15 2008-11-20 Stresspro Biomedicine Incorporation Système d'expression de protéine recombinante à rendement et immunogénicité améliorés
CN101294164B (zh) * 2007-04-23 2013-01-16 南京大学 重组人中期因子(rh-Midkine)的表达及其单克隆抗体的制备和应用
CN105296652A (zh) * 2015-11-26 2016-02-03 天津师范大学 采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp40基因表达的方法
CN105296654A (zh) * 2015-11-26 2016-02-03 天津师范大学 采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp60基因表达的方法
CN105296653A (zh) * 2015-11-26 2016-02-03 天津师范大学 采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp83基因表达的方法
CN105296651A (zh) * 2015-11-26 2016-02-03 天津师范大学 采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp90基因表达的方法
CN110734480A (zh) * 2019-11-07 2020-01-31 中国科学院遗传与发育生物学研究所 大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES在协助合成植物Rubisco中的应用
CN112239760A (zh) * 2020-09-18 2021-01-19 深圳科兴药业有限公司 高效表达重组hGH的重组工程菌及构建方法和应用
CN112940955A (zh) * 2021-04-18 2021-06-11 江南大学 一种高效合成乳铁蛋白的毕赤酵母及其构建方法与应用

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU6124201A (en) * 2000-05-03 2001-11-12 Expressive Constructs Inc A method and device for improving protein stability and solubility
US6955910B2 (en) 2000-11-14 2005-10-18 Boehringer Ingelheim International Gmbh Method for large scale production of recombinant DNA-derived TPA or K2S molecules
GB0027779D0 (en) * 2000-11-14 2000-12-27 Boehringer Ingelheim Int Methods for large scale production of recombinant dna-derived tpa or k2s molecules
US7087412B2 (en) 2000-11-14 2006-08-08 Boehringer Ingelheim International Gmbh Methods for large scale protein production in prokaryotes
US6979556B2 (en) * 2000-12-14 2005-12-27 Genentech, Inc. Separate-cistron contructs for secretion of aglycosylated antibodies from prokaryotes
US6962982B2 (en) 2001-06-22 2005-11-08 Roche Diagnostics Corporation Soluble complexes of target proteins and peptidyl prolyl isomerase chaperones and methods of making and using them
US7094757B2 (en) 2001-06-22 2006-08-22 Roche Diagnostics Corporation Complexes comprising a prion protein and a peptidyl prolyl isomerase chaperone, and method for producing and using them
US7094884B2 (en) 2001-06-22 2006-08-22 Roche Diagnostics Corporation Soluble complexes of amylod β peptide and peptidyl prolyl isomerase chaperone and methods of making and using them
US7244819B2 (en) * 2001-06-22 2007-07-17 Roche Diagnostics Operations, Inc. Fusion polypeptides, vaccines and compositions of FKBP chaperones and target polypeptides
KR100441755B1 (ko) * 2001-07-24 2004-08-02 재단법인서울대학교산학협력재단 분자 샤페론을 핵 내부로 이동시키는 방법
CA2454731C (en) * 2001-08-27 2010-11-02 Genentech, Inc. A system for antibody expression and assembly
DE10145694A1 (de) * 2001-09-17 2003-04-03 Roche Diagnostics Gmbh Verfahren zur Erhöhung der Löslichkeit, der Expressionsrate und der Aktivität von Proteinen während der rekombinanten Herstellung
WO2004042017A2 (en) 2002-10-31 2004-05-21 Genentech, Inc. Methods and compositions for increasing antibody production
CA2513113A1 (en) * 2003-01-23 2004-08-05 Genentech, Inc. Methods for producing humanized antibodies and improving yield of antibodies or antigen binding fragments in cell culture
EP1624886A2 (en) * 2003-05-12 2006-02-15 Expressive Constructs, Inc. Methods for increasing cell and tissue viability
WO2005027966A2 (en) * 2003-09-05 2005-03-31 Genentech, Inc. Antibodies with altered effector functions
GB0329681D0 (en) * 2003-12-23 2004-01-28 Delta Biotechnology Ltd Gene expression technique
WO2006028936A2 (en) * 2004-09-02 2006-03-16 Genentech, Inc. Heteromultimeric molecules
EP1831375B1 (en) * 2004-12-23 2014-07-16 Novozymes Biopharma DK A/S Gene expression technique
WO2006126750A1 (en) * 2005-05-23 2006-11-30 Korea Advanced Institute Of Science And Technology METHOD FOR PREPARING A TARGET PROTEIN USING THE sHSPs
GB0512707D0 (en) * 2005-06-22 2005-07-27 Delta Biotechnology Ltd Gene expression technique
DK2102239T3 (da) 2006-11-30 2012-05-29 Res Dev Foundation Forbedrede immunoglobulin-biblioteker
DK2155789T3 (da) * 2007-05-01 2013-10-21 Res Dev Foundation Immunoglobulin-Fc-biblioteker
EP2448972A4 (en) * 2009-06-30 2012-11-28 Res Dev Foundation IMMUNOGLOBULIN FC POLYPEPTIDES
AU2012214643B2 (en) 2011-02-07 2016-12-15 Research Development Foundation Engineered immunoglobulin Fc polypeptides
EP2905342A4 (en) * 2012-10-03 2016-03-16 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd METHOD FOR PREVENTING POLYPEPTIDE REDUCTION BY ADDITION OF AMINO ACID TO A LIQUID CULTURE MEDIUM
EP2929045B1 (en) 2012-12-05 2020-12-02 SOLA Biosciences LLC Protein expression enhancing polypeptides
JP6724023B2 (ja) 2015-02-09 2020-07-15 リサーチ ディベロップメント ファウンデーション 改善された補体活性化を示す操作された免疫グロブリンｆｃポリペプチド
US10973908B1 (en) 2020-05-14 2021-04-13 David Gordon Bermudes Expression of SARS-CoV-2 spike protein receptor binding domain in attenuated salmonella as a vaccine

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4757013A (en) * 1983-07-25 1988-07-12 The Research Foundation Of State University Of New York Cloning vehicles for polypeptide expression in microbial hosts
DE3537708A1 (de) * 1985-10-23 1987-04-23 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur aktivierung von t-pa nach expression in prokaryonten
US5453363A (en) 1985-10-23 1995-09-26 Boehringer Mannheim Gmbh Process for the activation of t-PA or Ing after genetic expression in prokaryotes
DE3611817A1 (de) 1986-04-08 1987-10-15 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur renaturierung von proteinen
ATE140731T1 (de) * 1988-01-11 1996-08-15 Xoma Corp Plasmidvektor mit pectatlyase-signalsequenz
DE3835350A1 (de) * 1988-10-17 1990-04-19 Boehringer Mannheim Gmbh Aktivierung von gentechnologisch hergestellten, in prokaryonten exprimierten antikoerpern
DE4113750A1 (de) * 1991-04-26 1992-10-29 Boehringer Mannheim Gmbh Verbesserung der renaturierung bei der sekretion von disulfidverbrueckten proteinen
US5639635A (en) * 1994-11-03 1997-06-17 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5789199A (en) * 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
JPH09173078A (ja) * 1995-09-14 1997-07-08 Tadayuki Imanaka 分子シャペロンを用いる蛋白質の製造方法
AU692728B2 (en) * 1996-03-28 1998-06-11 Mitsui Chemicals, Inc. Method for secretory production of protein
US6083715A (en) * 1997-06-09 2000-07-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing heterologous disulfide bond-containing polypeptides in bacterial cells
JP3344618B2 (ja) * 1997-06-20 2002-11-11 株式会社エイチ・エス・ピー研究所 シャペロン発現プラスミド
EP1048732A1 (de) 1999-04-26 2000-11-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Verfahren zur Herstellung von natürlich gefalteten und sekretierten Proteinen
FI109361B (fi) * 1999-05-04 2002-07-15 Korpela Timo Mikrobinen proteiinin ilmentämisjärjestelmä

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101294164B (zh) * 2007-04-23 2013-01-16 南京大学 重组人中期因子(rh-Midkine)的表达及其单克隆抗体的制备和应用
WO2008138229A1 (fr) * 2007-05-15 2008-11-20 Stresspro Biomedicine Incorporation Système d'expression de protéine recombinante à rendement et immunogénicité améliorés
CN105296654B (zh) * 2015-11-26 2018-07-06 天津师范大学 采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp60基因表达的方法
CN105296654A (zh) * 2015-11-26 2016-02-03 天津师范大学 采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp60基因表达的方法
CN105296653A (zh) * 2015-11-26 2016-02-03 天津师范大学 采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp83基因表达的方法
CN105296651A (zh) * 2015-11-26 2016-02-03 天津师范大学 采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp90基因表达的方法
CN105296652A (zh) * 2015-11-26 2016-02-03 天津师范大学 采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp40基因表达的方法
CN105296652B (zh) * 2015-11-26 2018-07-06 天津师范大学 采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp40基因表达的方法
CN105296653B (zh) * 2015-11-26 2018-07-06 天津师范大学 采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp83基因表达的方法
CN110734480A (zh) * 2019-11-07 2020-01-31 中国科学院遗传与发育生物学研究所 大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES在协助合成植物Rubisco中的应用
CN112239760A (zh) * 2020-09-18 2021-01-19 深圳科兴药业有限公司 高效表达重组hGH的重组工程菌及构建方法和应用
CN112940955A (zh) * 2021-04-18 2021-06-11 江南大学 一种高效合成乳铁蛋白的毕赤酵母及其构建方法与应用
CN112940955B (zh) * 2021-04-18 2022-10-18 江南大学 一种高效合成乳铁蛋白的毕赤酵母及其构建方法与应用

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