CN105296654B - 采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp60基因表达的方法 - Google Patents

采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp60基因表达的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种采用荧光RT‑PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp60相对表达量的方法。本发明中周氏啮小蜂Hsp60实时荧光RT‑PCR检测方法的建立，为研究周氏啮小蜂Hsp60表达调控机理及其生态防治奠定基础。研究温度的变化对于周氏啮小蜂体内Hsp60基因表达量的影响，研究结果可为科学利用天敌昆虫周氏啮小蜂提供理论基础，这对于以后在何种室外温度下放飞周氏啮小蜂防治美国白蛾具有重要意义。本发明为在mRNA水平对Hsp60基因的相对定量分析提供了技术平台。

Description

采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp60基因表达的方法
本发明得到：国家自然科学基金（31201730）；天津市高等学校科技发展计划项目（20110602）；天津师范大学博士基金（52XB1003）及天津市动植物抗性重点实验室开放基金的资助。
技术领域
本发明涉及生物技术领域，涉及用于检测周氏啮小蜂Hsp60基因表达的特异性引物，更具体的说是一种采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp60基因表达的方法。主要用于周氏啮小蜂Hsp60基因表达调控机理及其生态防治的研究，研究结果可为科学利用天敌昆虫周氏啮小蜂进行生物防治提供理论基础。
背景技术
热激蛋白 Heat shock protein (Hsp) 是一类在生物体内广泛存在的，对体内外环境变化极为敏感的高保守性蛋白质，广泛参与了各种生理代谢途径，近年来已成为生物研究领域中的一个热点。根据其分子量的大小可将其分为不同的蛋白家族，其中Hsp60与温度胁迫应激性密切相关。温度是影响生物体生存至关重要的环境因子，只有在一定的温度范围内生物体才能进行物质能量代谢以维持正常生理活动，超出温度的耐受范围都会使生物的生长发育停滞甚至死亡。一般来说生物体受到高温或低温刺激后，蛋白合成量会有显著变化，用以增强抗逆境能力。由于热激蛋白会在胁迫消除后一段时间内保持一定的含量使生物体更好生存，可以认为其存在对于生物体适应环境有着重要作用。
周氏啮小蜂Chouioiacunea Yang 是我国重要入侵物种美国白蛾Hyphantriacunea（Drury）的重要寄生性天敌，体长1.1-1.5 mm，群集内寄生于美国白蛾蛹中，是抑制美国白蛾的主要天敌因子，对控制美国白蛾的危害起到重要作用。除寄生于美国白蛾外，还可寄生于鳞翅目的枯叶蛾科、毒蛾科、舟蛾科、尺蛾科、菜蛾科和双翅目的蝇科、寄蝇科及鞘翅目的叶甲科和瓢甲科等。
通过野外释放C. cunea可以达到有效防治美国白蛾的目的。然而，在野外环境下，C. cunea的活力会受到多重因素的影响，其中，温度作为一个主要生态因素，会影响C. cunea的生命力。在合适的温度范围投放小蜂，才会起到更好的防治效果。
实时荧光PCR技术是在常规PCR技术的基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光PCR不仅实现了常规PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，实时荧光PCR技术由自动化仪器收集荧光信号，避免了肉眼判断的主观性，可进一步提高灵敏度；实时荧光PCR技术全封闭反应，无须PCR后处理，避免污染，保证了结果的可靠性和重复性。目前，已广泛应用于分子生物学和医学研究等领域。随着实时荧光PCR试剂盒的进一步开发，近年来，实时荧光PCR技术在动物生态防治中也得到了广泛的应用。
发明内容
本发明的目的是公开一种采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp60基因表达的方法。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下:
设计一种采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp60基因表达的特异性引物，其特征在于包括符合荧光PCR反应特点的特异上下游引物：Hsp60-F：5'-TGCGATGAACAACGAATA-3'; Hsp60-R：5'-CGTCAATAGTGAAGCGACT-3'；
本发明所述特异性引物快速检测周氏啮小蜂Hsp60基因表达的方法，其特征在于按如下步骤进行：
（1）使用下述引物进行该基因的检测：
符合荧光PCR反应特点的该序列特异上下游引物：
Hsp60-F：5'-TGCGATGAACAACGAATA-3'
Hsp60-R：5'-CGTCAATAGTGAAGCGACT-3'
（1）总RNA的提取：采用各种通用的RNA提取方法，从周氏啮小蜂成体中提取总RNA；
（3）cDNA 合成：以周氏啮小蜂总RNA为模板合成cDNA，反应体系为20μL ；
（4）实时荧光PCR：以上述合成的cDNA为模板，上述（1）中Hsp60-F和Hsp60-R、GADPH-F和GADPH-R为特异性引物，进行实时荧光PCR 扩增反应，每个样品设3个平行管，扩增后所得3个平行管的Ct值取平均数。
（5）周氏啮小蜂在不同温度下Hsp60基因相对表达量计算：
实时荧光PCR后，当目的基因与内参基因的扩增效率相近时，采用2－ΔΔCT法计算不同温度下Hsp60基因相对于内参GADPH基因的mＲNA相对表达量。
本发明所述的检测方法，其中每条引物分别配制成浓度为25 μmol/L 的贮存液，工作浓度为0.5 μmol/L。
本发明进一步公开了采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp60基因表达的特异性引在制备检测周氏啮小蜂适应外界环境变化方面的应用。实验结果表明：图1为不同温度下周氏啮小蜂Hsp60基因的相对表达量。从图中看出无论是高温还是低温都可以影响周氏啮小蜂体内的Hsp60的表达。在低温胁迫的情况下，随着温度的不断降低，周氏啮小蜂体内的Hsp60的相对表达量呈上升的趋势，并且在-7℃时达到最大表达量；在高温胁迫的情况下，随着温度的不断升高，周氏啮小峰体内的Hsp60的相对表达量也呈上升的趋势，但在40℃时达到最大表达量。这对于以后在何种室外温度下放飞白蛾周氏啮小蜂防治美国白蛾具有重要意义。
本发明提供的特异性引物快速检测周氏啮小蜂Hsp60基因表达的方法与现有技术相比的有益效果是：
（1）本发明采用的实时荧光RT-PCR技术与常规PCR 相比，实时荧光PCR 技术由自动化仪器收集荧光信号，避免了肉眼判断的主观性，可进一步提高灵敏度；实时荧光PCR技术全封闭反应，无须PCR后处理，避免污染，保证了结果的可靠性和重复性。实时荧光RT-PCR技术也免除了常规PCR 中的电泳、定量扫描等后续繁琐步骤，大大缩短了实验时间。
（2）在通过RT-qPCR 的方法研究不同温度下Hsp60基因表达的变化，结果显示在不同温度条件下周氏啮小蜂体内的Hsp60基因的表达水平处于一个动态过程中，高温和低温胁迫都使周氏啮小蜂体内Hsp60有一个高的表达量，在40℃和-7℃体内表达量最大。
（3）因此本发明提出研究了周氏啮小蜂适应外界环境的变化，避免受到胁迫因子对自身的伤害的保护机制，对于防治美国白蛾有重大意义，为绿色防治林业害虫提供了一个新的思路和技术。
周氏啮小蜂热激蛋白Hsp60基因，其cDNA序列和编码氨基酸的序列如表1、表2所示。
表1
表2
MFRLPTVLRSAALRQMQLQSRTYAKDVRFGAEVRALMLQGVDILADAVAVTMGPKGRNVILEQSWGSPKITKDGVTVAKGVELKDKFQNIGAKLVQDVANNTNEEAGDGTTTATVLARAIAKEGFEKISKGANPVEIRRGVMMAVDKIKEELKNLSKPVTTPEEIAQVATISANGDTAIGNLISDAMKKVGKEGVITVKDGKTLNDDLEVIEGMKFDRGYISPYFINSTKGAKVEFQDALVLFSDKKISSVQSIIPALELANSQRKPLVIVAEDIDGEALSTLVVNRLKIGLQVAAVKAPGFGDNRKATMQDMAIATGGIVFGDDANLVKIEDVQPSDLGQVGEVLITKDDTLFLKGKGKKSDIDRRAEQLRDQIQDTTSDYEKEKLQERLARLASGVAVLRIGGSSEVEVNEKKDRVNDALNATRAAVEEGIVPGGGTALLRCAPALKTLQPKNEDQKTGINIVANALRMPCLQIAQNAGVDASVVVAKVSEGKLGYDAMNNEYVDMIEKGIIDPTKVVRTALTDAAGVASLLTTAEAVVTELPKEDPPMPGGMGGMGGMGGMGGMGGMM。
附图说明
图1为周氏啮小蜂Hsp60在相同时间不同温度胁迫下表达变化。
具体实施方式
下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定；其中所用试剂均有市售。本发明中所述的提取白蛾周氏啮小蜂总RNA的提取，cDNA的合成，实时荧光定量RT-qPCR等方法都是本领域成熟的技术，试剂盒TransScript®RT、TransStart® Top Green qPCR SuperMix等都可以从生产商家购买。
实施例1：
获得白蛾周氏啮小蜂Hsp60基因序列
实验材料取自室内传代培养的白蛾周氏啮小蜂（培养条件：于人工气候箱（PQX-350H）中，温度25℃，相对湿度60%~80%，无光黑暗）。取羽化后24 h内的雌性周氏啮小蜂，于解剖镜下切取触角，立即浸于RNAlater（Ambion公司，AM7020）中；每200头雌性白蛾周氏啮小蜂的触角贮存于一个1.5 mL离心管中，共搜集8管样品，并于-20℃下低温保存，样品制备完成后送华大基因科技服务有限公司（http://www.genomics.cn/index）进行转录组测序。
应用高通量测序平台Illumina HiSeq™ 2000对周氏啮小蜂触角样本进行转录组测序，采用Trinity 软件对每个读取序列片段进行聚类后拼接成unigene，再结合生物信息学软件进行靶标序列cDNA全长的判定，进行Blast同源序列检索予以确认，得到Hsp60基因cDNA序列和编码氨基酸的序列。
实施例2：
总RNA的提取
选取30头左右白蛾周氏啮小蜂进行不同温度处理，高温处理（1h）为28℃、32℃、36℃、40℃和42℃；低温处理（1h）为11℃、6℃、1℃、-3℃、-7℃。处理后产物立即使用或保存于-20℃冷冻。
（1）取30头左右白蛾周氏啮小蜂置于1.5mL的无菌离心管内，倒入液氮并迅速用研磨棒进行充分研磨。将600μL Trizon溶液加入离心管，静置5min。
（2）将200μL氯仿加入离心管，剧烈振荡15s，静置3min。
（3）4℃下12000rpm离心15min，将上层无色水相转入新无菌离心管中，加入400μL异丙醇，-20℃下放置20min，12000rpm离心10min。
（4）小心倒掉管中液体，保留沉淀，加入600μL 75%乙醇洗涤沉淀。4℃下7500rpm离心5min，再重复一次乙醇洗涤沉淀操作。
（5）小心弃去上清液，室温干燥2min。将RNA沉淀溶于20μLRelution Buffer中，必要时可55℃-60℃水浴10min。
（6）所得沉淀即为白蛾周氏啮小峰总RNA，产物立即使用或冷冻保存于-70℃。
实施例3：
cDNA的合成
以实施例2所述白蛾周氏啮小蜂总RNA 作为模板。取一消毒的0.2mL离心管，加入以下反应体系（20μL体系)：Total RNA 5μL，or Random Primer（N9）（0.1μg/μL）1μL，2×TSReaction Mix 10μL，TransScript®RT/RI Enzyme Mix 1μL，RNase-free Water 3μL，混匀。
反应条件为25℃水浴保温10分钟，42℃水浴保温30分钟，85℃高温加热5分钟，以使离心管中存留的TransScript®RT失去活性。产物立即使用或保存于-20℃冷冻。
实施例4：
荧光定量PCR反应体系和条件
(1) 引物设计：
根据所述周氏啮小蜂Hsp60基因的全长序列，使用Primer 5 软件设计适用于实时荧光PCR 检测的特异性引物，引物序列如下：
Hsp60-F：5'-TGCGATGAACAACGAATA-3'
Hsp60-R：5'-CGTCAATAGTGAAGCGACT-3'
PCR 产物预计长度为 108 bp
同时，根据转录组数据库里提供的周氏啮小蜂GADPH基因的cds序列设计用于实时荧光PCR内对照的引物，引物序列如下：
GADPH-F：5'-GAGGTGGTAGAGCCGCTTCC-3'
GADPH-R：5'-TTTAGCTTTGATCGCGTCGT-3'
PCR 产物预计长度为154 bp
（2）实时荧光PCR：运用SYBR Green嵌合荧光法进行RT-PCR分析。使用CF96X PCR仪（Bio-Rad）进行PCR反应。以上述实施例3中合成的cDNA为模板，使用Hsp60-F和Hsp60-R、GADPH-F和GADPH-R为特异性引物，进行实时荧光PCR扩增反应，每个样品设3个平行管，扩增后所得3个平行管的Ct值（即每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的反应循环数）取平均数。
实时荧光PCR 扩增体系设置如下：
实时荧光PCR 扩增参数设置如下：
50℃ 120s ；
95℃ 120s；95℃1s ；60℃30s (40个循环)；
（3）白蛾周氏啮小蜂在不同温度下Hsp60基因相对表达量计算：
当目的基因与内参基因的扩增效率相近时，采用2－ΔΔCT法计算各个温度下Hsp60基因相对于内参基因的的mＲNA相对表达量，用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，Duncan氏新复极差法检验不同处理间差异显著性。
图1为不同温度下周氏啮小蜂Hsp60基因的相对表达量。从图中看出无论是高温还是低温都可以影响周氏啮小蜂体内的Hsp60的表达。在低温胁迫的情况下，随着温度的不断降低，周氏啮小蜂体内的Hsp60的相对表达量呈上升的趋势，并且在-7℃时达到最大表达量；在高温胁迫的情况下，随着温度的不断升高，周氏啮小峰体内的Hsp60的相对表达量也呈上升的趋势，但在40℃时达到最大表达量。这对于以后在何种室外温度下放飞白蛾周氏啮小蜂防治美国白蛾具有重要意义。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津师范大学
<120> 采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp60基因表达的方法
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgcgatgaac aacgaata 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgtcaatagt gaagcgact 19
<210> 3
<211> 1716
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgttcagac taccaactgt tcttcgctct gctgctctgc gacagatgca gttgcaatca 60
cgtacttatg ctaaagatgt tcgatttgga gcagaggtgc gggcactcat gttgcaagga 120
gttgacatct tggctgatgc tgtcgctgtc actatgggtc ccaagggacg taatgtcatt 180
ctcgaacaga gttggggtag cccaaaaatc acaaaggatg gtgtcactgt cgcaaagggt 240
gttgaattga aggacaaatt ccagaatatt ggagctaagt tagtacaaga tgttgccaac 300
aacactaatg aagaagctgg agatggaacc accacagcca cagttttggc tagggctatt 360
gccaaagaag gttttgaaaa aatcagcaaa ggagctaacc cagttgaaat caggcgtggt 420
gtaatgatgg ctgtggacaa aatcaaggag gaactcaaaa acttgagcaa accagtaaca 480
acacctgaag agattgccca agtagctacc atttctgcca atggtgatac agctattggt 540
aatcttatct ctgatgccat gaaaaaagta ggaaaagagg gtgtaatcac agtcaaggat 600
ggcaaaactc tcaatgatga tctggaagtt attgagggga tgaaatttga tcgtggatac 660
atttccccat atttcattaa ctctacaaag ggtgccaaag tggagttcca ggatgctctt 720
gtcttattca gtgacaagaa aatttcttct gtccagagca tcattccagc tttggagctt 780
gcaaactctc aacgcaaacc acttgtcatt gttgctgaag acattgatgg tgaagcactt 840
tcaactttgg ttgtcaatcg tttgaaaatc ggattgcaag ttgcagcagt taaggctcct 900
ggttttggag acaacaggaa agctactatg caagacatgg caattgccac tggaggtatc 960
gtttttggag acgacgcaaa tctagtcaag atcgaagatg ttcagccttc agacttggga 1020
caagttggcg aagtactcat cacgaaagac gacacactct ttttgaaggg aaaaggaaag 1080
aaatccgaca tcgacagaag ggccgaacaa cttagagatc aaattcagga tacaacgtct 1140
gactatgaaa aggagaaatt gcaggaacga ttggccaggc ttgcttctgg tgtagccgtt 1200
ttgagaattg gaggaagcag tgaagtcgaa gtcaacgaaa agaaagaccg tgttaacgat 1260
gctctcaatg ctactcgtgc tgctgttgaa gaaggaattg ttcctggagg tggtaccgct 1320
ctactaagat gcgcaccagc tttgaagact ttgcagccta agaacgaaga ccagaagacg 1380
ggcatcaaca ttgtggcaaa cgcactccgt atgccatgct tacagatcgc tcaaaatgct 1440
ggagttgacg caagtgtcgt cgttgccaaa gtgtccgaag gcaagcttgg ttacgatgcg 1500
atgaacaacg aatacgtcga catgatcgag aaaggcatta tcgatccaac caaggtcgta 1560
cgcactgctc ttaccgatgc cgctggagtc gcttcactat tgacgaccgc tgaggcagtg 1620
gtgaccgaat tgcctaaaga ggatccacca atgcctggtg gtatgggtgg aatgggcggt 1680
atgggtggta tgggtggtat gggcggcatg atgtaa 1716
<210> 4
<211> 571
<212> PRT
<213> 周氏啮小蜂Hsp60基因编码的氨基酸序列
<400> 4
Met Phe Arg Leu Pro Thr Val Leu Arg Ser Ala Ala Leu Arg Gln Met
1 5 10 15
Gln Leu Gln Ser Arg Thr Tyr Ala Lys Asp Val Arg Phe Gly Ala Glu
20 25 30
Val Arg Ala Leu Met Leu Gln Gly Val Asp Ile Leu Ala Asp Ala Val
35 40 45
Ala Val Thr Met Gly Pro Lys Gly Arg Asn Val Ile Leu Glu Gln Ser
50 55 60
Trp Gly Ser Pro Lys Ile Thr Lys Asp Gly Val Thr Val Ala Lys Gly
65 70 75 80
Val Glu Leu Lys Asp Lys Phe Gln Asn Ile Gly Ala Lys Leu Val Gln
85 90 95
Asp Val Ala Asn Asn Thr Asn Glu Glu Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr
100 105 110
Ala Thr Val Leu Ala Arg Ala Ile Ala Lys Glu Gly Phe Glu Lys Ile
115 120 125
Ser Lys Gly Ala Asn Pro Val Glu Ile Arg Arg Gly Val Met Met Ala
130 135 140
Val Asp Lys Ile Lys Glu Glu Leu Lys Asn Leu Ser Lys Pro Val Thr
145 150 155 160
Thr Pro Glu Glu Ile Ala Gln Val Ala Thr Ile Ser Ala Asn Gly Asp
165 170 175
Thr Ala Ile Gly Asn Leu Ile Ser Asp Ala Met Lys Lys Val Gly Lys
180 185 190
Glu Gly Val Ile Thr Val Lys Asp Gly Lys Thr Leu Asn Asp Asp Leu
195 200 205
Glu Val Ile Glu Gly Met Lys Phe Asp Arg Gly Tyr Ile Ser Pro Tyr
210 215 220
Phe Ile Asn Ser Thr Lys Gly Ala Lys Val Glu Phe Gln Asp Ala Leu
225 230 235 240
Val Leu Phe Ser Asp Lys Lys Ile Ser Ser Val Gln Ser Ile Ile Pro
245 250 255
Ala Leu Glu Leu Ala Asn Ser Gln Arg Lys Pro Leu Val Ile Val Ala
260 265 270
Glu Asp Ile Asp Gly Glu Ala Leu Ser Thr Leu Val Val Asn Arg Leu
275 280 285
Lys Ile Gly Leu Gln Val Ala Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp
290 295 300
Asn Arg Lys Ala Thr Met Gln Asp Met Ala Ile Ala Thr Gly Gly Ile
305 310 315 320
Val Phe Gly Asp Asp Ala Asn Leu Val Lys Ile Glu Asp Val Gln Pro
325 330 335
Ser Asp Leu Gly Gln Val Gly Glu Val Leu Ile Thr Lys Asp Asp Thr
340 345 350
Leu Phe Leu Lys Gly Lys Gly Lys Lys Ser Asp Ile Asp Arg Arg Ala
355 360 365
Glu Gln Leu Arg Asp Gln Ile Gln Asp Thr Thr Ser Asp Tyr Glu Lys
370 375 380
Glu Lys Leu Gln Glu Arg Leu Ala Arg Leu Ala Ser Gly Val Ala Val
385 390 395 400
Leu Arg Ile Gly Gly Ser Ser Glu Val Glu Val Asn Glu Lys Lys Asp
405 410 415
Arg Val Asn Asp Ala Leu Asn Ala Thr Arg Ala Ala Val Glu Glu Gly
420 425 430
Ile Val Pro Gly Gly Gly Thr Ala Leu Leu Arg Cys Ala Pro Ala Leu
435 440 445
Lys Thr Leu Gln Pro Lys Asn Glu Asp Gln Lys Thr Gly Ile Asn Ile
450 455 460
Val Ala Asn Ala Leu Arg Met Pro Cys Leu Gln Ile Ala Gln Asn Ala
465 470 475 480
Gly Val Asp Ala Ser Val Val Val Ala Lys Val Ser Glu Gly Lys Leu
485 490 495
Gly Tyr Asp Ala Met Asn Asn Glu Tyr Val Asp Met Ile Glu Lys Gly
500 505 510
Ile Ile Asp Pro Thr Lys Val Val Arg Thr Ala Leu Thr Asp Ala Ala
515 520 525
Gly Val Ala Ser Leu Leu Thr Thr Ala Glu Ala Val Val Thr Glu Leu
530 535 540
Pro Lys Glu Asp Pro Pro Met Pro Gly Gly Met Gly Gly Met Gly Gly
545 550 555 560
Met Gly Gly Met Gly Gly Met Gly Gly Met Met
565 570

Claims (1)

1.采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp60基因表达的特异性引物在制备检测周氏啮小蜂适应外界环境变化的 试剂盒方面的应用；所述的特异性引物它是由符合荧光RT-PCR反应特点的特异性上下游引物：
Hsp60-F：5'-TGCGATGAACAACGAATA -3'；Hsp60-R：5'-CGTCAATAGTGAAGCGACT -3'组成。
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白蛾周氏啮小蜂滞育诱导及滞育后发育;孙守慧等;《昆虫学报》;20091231;第52卷(第12期);第1310页结论与讨论部分 *
马铃薯甲虫热激蛋白基因Ld-hsp90的克隆及温度胁迫下的表达;蒋健等;《植物保护学报》;20131031;第40卷(第5期);第400-401页引言部分，材料与方法部分 *

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