CN110042107B - 红花CtACO1基因、其编码蛋白质及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体是红花CtACO1基因及其编码蛋白质在提高红花中黄酮醇类化合物含量中的应用。本发明首次提供了红花CtACO1参与红花黄酮醇类化合物生物合成途径相关基因的调控，CtACO1通过转基因的方法转入红花中，可以刺激大部分黄酮合成通道结构酶基因的表达，同时，可以提高黄酮醇类化合物的含量。

Description

红花CtACO1基因、其编码蛋白质及应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，是红花CtACO1基因、其编码蛋白质及应用。

背景技术

传统中药红花(Carthami Flos)具有活血祛瘀，通经活络的功效，其主要成分为黄酮类化合物，羟基红花黄色素A(HSYA)、Carthamin、槲皮素及其苷类、山萘酚及其苷类被认为是其发挥药理活性的主要活性成分。因此，通过红花黄酮代谢通道关键基因的调控是提高红花黄酮含量的一种有效方法。

黄酮类成分是植物重要的次生代谢产物，广泛地受到外界环境及刺激的影响。作为气态植物激素，乙烯调节植物生长，发育和应激反应的各种过程，并且作为传导外界刺激的信号分子。研究表明，乙烯及其前体ACC的外源应用可以诱导黄酮醇积累。ACO参与乙烯生物合成的最后步骤并催化ACC至乙烯，其与植物的生理和生物化学变化密切相关。但ACO对黄酮类化合物积累或黄酮类代谢途径的影响仍不清楚。

发明内容

本发明的目的在于提供红花CtACO1基因、其编码蛋白和在提高红花中重要活性成分黄酮醇类化合物含量中的应用。

中国专利文献CN106967735A公开了红花CtCHS1基因、其编码蛋白质及应用，CtCHS1位于黄酮合成通道的入口，过表达后具有提高醌式查尔酮类化合物的作用。而本发明提供的CtACO1基因位于乙烯合成途径，对黄酮合成途径处于整体调控的位置，过表达CtACO1提高了部分黄酮醇类化合物的含量。综上，CtACO1与CtCHS1基因相比，提高的黄酮成分类型不同；同时，ACO基因作为乙烯合成末端基因，明确其基因及蛋白功能，不仅有助于后续培育定向提高黄酮类成分的种质资源，同时，为外源乙烯刺激以影响红花黄酮类成分合成提供了参考及理论支持，以更便捷低成本的方式提高红花中的黄酮类成分含量。

本发明的第一方面，提供一种红花CtACO1(ACC氧化酶)基因，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。所述的CtACO1基因全长1195bp，其开放阅读框(ORF，Open Reading Frame)区包含了1098bp，编码365个氨基酸，开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的第二方面，提供一种红花CtACO1蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明的第三方面，提供一种重组表达载体、重组菌或转基因植物，所述的重组表达载体、重组菌或转基因植物含有上述红花CtACO1基因SEQ ID NO.1或其开放阅读框SEQID NO.3。

优选的，在制备所述的重组表达载体、重组菌或转基因植物时，用于扩增红花CtACO1基因开放阅读框的引物对为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5：用于扩增红花CtACO1基因的引物对分别如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示。

CtACO1F：GAGCTTTCGCGGATCCGCCACCATGGCTTCAGCCACTAAC(SEQ ID NO.4)；

CtACO1R：CATGGTGGCAAGCTTAGGGCCGGGATTCTCCTCCACGTCACCGCATGTTAGAAG(SEQ IDNO.5)；

5’-Full length of CtACO1(CGAATCTAGACCGTCAGCCATG，SEQ ID NO.10)

3’-Full length of CtACO1(GCATCCATGGTCGACTCAACGC，SEQ ID NO.11)

优选的，所述的重组表达载体为植物表达载体。更优选真核表达载体pMT39。

优选的，所述的重组菌，即宿主细胞，为大肠杆菌、农杆菌等。优选为农杆菌。更优选农杆菌GV3101。

本发明的第四方面，提供上述的红花CtACO1基因在提高红花中重要活性成分黄酮醇类化合物含量中的应用。

本发明的第五方面，提供上述的红花CtACO1蛋白在提高红花中重要活性成分黄酮醇类化合物含量中的应用。

优选的，所述的黄酮醇类化合物包括槲皮素、槲皮素3-β-D-葡萄糖苷、芦丁。

本发明的第六方面，提供一种提高红花中黄酮醇类化合物含量的转基因方法，所述的提高红花中黄酮醇类化合物含量的转基因方法是将含有上述红花CtACO1基因SEQ IDNO.1或其开放阅读框SEQ ID NO.3的重组菌采用花粉管通道法遗传转化红花。

花粉管通道法在1983年被我国学者周光宇第一次提出，目前，该技术已经被应用在黄瓜，玉米等多种转基因农作物上。这个技术解决了开花植物组织再生率低的问题，而且操作简单稳定，尤其适用于药用植物红花这一类药用部位为花器官且组织再生率低的物种(Zhou,G.Weng,J.Zeng,Y.Huang,J.Qian,S.Liu,G.Introduction of exogenous DNA intocotton embryos.Methods Enzymol.1983,(101):433-481.)。

优选的，包括以下步骤：

A、构建含有上述红花CtACO1基因或其开放阅读框的重组表达载体；

B、用步骤A构建的重组表达载体转化农杆菌，得到重组菌；

C、步骤B得到的重组菌通过花粉管通道法转化盛开期的红花柱头；

D、种子成熟后，采集并种下T0代种子，采集T1代植株花器官，筛选获得转基因阳性植株。

更优选的，包括以下步骤：

I、载体构建：设计无缝克隆引物扩增CtACO1的ORF区，扩增引物为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，构建真核表达载体pMT39，将扩增产物与载体连接后，生成含目的基因的重组载体；

II、农杆菌介导的转化，具体操作方法为：

a.在温室中培育红花植株，温度25℃，昼夜节律为16小时光照/8小时黑暗；

b.将步骤I获得的重组载体用热击法转入农杆菌GV3101中，在LB+卡那霉素+链霉素的培养基上进行筛选，PCR扩增得到阳性克隆菌液，在LB培养基大摇，至菌液浓度OD约为0.8；菌液5000prm，离心5分钟，弃去上清；

c.用5％蔗糖溶液重悬，加入0.02％的表面活性剂silwet-77重悬；

d.用微量注射器吸取含目的基因的重悬菌液转化盛开期的红花柱头，转化结束后，立即将花用牛皮纸密封，重复操作，直至花朵闭合，取下牛皮纸，让植株恢复原来的生长环境；

e.待种子成熟后，采集获得T0代种子，翻土施肥后，种下T0代种子，待T1代植株花盛开时采集花器官样品；

f.设计引物SEQ ID NO.6(GCTATCTGTCACTTCATCAAAAGG)和SEQ ID NO.7(ATCTAGCAGTCCTTTCACTCCG)进行基因组水平验证，筛选出转基因阳性植株。

本发明的第七方面，提供一种采用上述的提高红花中黄酮醇类化合物含量的转基因方法获得的红花转基因植株或种质。

本发明优点在于：

本发明首次提供了红花CtACO1参与红花黄酮生物合成途径相关基因的调控，CtACO1通过转基因的方法转入红花中，可以刺激上游大部分黄酮合成通道结构酶基因的表达，抑制下游基因的表达，同时，可以提高黄酮醇类化合物的含量。实验证明，过表达红花CtACO1可以明显提高红花黄酮醇类化合物，包括槲皮素、槲皮素3-β-D-葡萄糖苷、芦丁的含量。

附图说明

图1.CtACO1编码的氨基酸序列与红花中其他ACO基因序列的同源比对结果。

图2.CtACO1编码的氨基酸序列与其他物种中查尔酮合酶的系统进化树分析。

图3.为红花过表达CtACO1的载体图谱。

图4.过表达CtACO1对黄酮生源途径基因的影响，CK：空载处理组；OVX：过表达CtACO1组。

图5.过表达CtACO1对黄酮生源途径代谢产物的影响，CK：空载处理组；OVX：过表达CtACO1组。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。所使用的实验方法若未特殊说明，均为常规实验方法。

下述实施例中所使用的材料，试剂等。如无特殊说明，均可从商业途径得到。

红花为野生型云南巍山品种，种植于第二军医大学药学院温室。

SMART^TMRACE cDNA Amplification Kit购自Clonetech公司。

KOD-Plus-Neo购自Toyobo。

pMD-19T simple Vector购自Takara。

实施例1.红花CtACO1全长cDNA的克隆

一、设计并合成RACE引物

CtACO1-GSP1:TCAAGTGTGGTGAAGACTGGGCTG(SEQ ID NO.8)

CtACO1-GSP2:TCGGCAGATACGAGCTCCGGGAACGG(SEQ ID NO.9)

Trizol法提取RNA，利用SMARTer^TM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒进行反转录建立5’和3’文库。

以红花5’和3’RACE cDNA文库为模板，利用通用引物UPM(Universal Primer AMix)和设计的GSP引物，做PCR扩增，获得CtACO1的5’端序列和3’序列。

将CtACO1序列测序获得的5’和3’-cDNA片段序列在Vector NTI Suite9.0上进行序列拼接，获得一条cDNA全长序列。

根据这条序列的cDNA末端设计扩增全长cDNA的PCR引物5’-Full length ofCtACO1(CGAATCTAGACCGTCAGCCATG，SEQ ID NO.10)和3’-Full length of CtACO1(GCATCCATGGTCGACTCAACGC，SEQ ID NO.11)。以总RNA反转录的cDNA为模板，进行PCR扩增全长cDNA，测序。得到CtACO1基因的全长cDNA序列，总共1195bp(如SEQ ID NO.1所示)。

二、基因序列分析

CtACO1基因全长1195bp，开放阅读框(Open Reading Frame)区包含了1098bp(如SEQ ID NO.3所示)，编码365个氨基酸。多序列比对表明，其编码的氨基酸与其他植物ACO均以2-氧戊二酸结合域RxS和亚铁结合位点HxDxnH为特征，表明其在乙烯生物合成途径中的生理功能，或至少与ACO的生理功能相关(图1)。系统进化树结果显示，CtACO1氨基酸序列(如SEQ ID NO.2所示)与CtACO2基因具有较高的相似性，与CaACO4(XP_016572720)具有69％的相似性(图2)。

实施例2.CtACO1花粉管通道法转化红花植株

为了进一步分析CtACO1的功能，我们将其通过花粉管通道法转入红花中，观察过表达CtACO1之后，对黄酮代谢通道上其他基因以及黄酮代谢产物的影响。

一、载体构建

设计无缝克隆引物扩增CtACO1的ORF区，扩增引物为SEQ ID NO.4(CtACO1F：GAGCTTTCGCGGATCCGCCACCATGGCTTCAGCCACTAAC)和SEQ ID NO.5(CtACO1R：CATGGTGGCAAGCTTAGGGCCGGGATTCTCCTCCACGTCACCGCATGTTAGAAG)，构建真核表达载体pMT39，将扩增产物与载体连接后，生成含目的基因的重组载体。

二、农杆菌介导的转化

具体操作方法为：

A.在温室中培育红花植株，温度25℃，昼夜节律为16小时光照/8小时黑暗。

B.将对照质粒和重组载体用热击法转入农杆菌GV3101中，在LB+卡那霉素+链霉素的培养基上进行筛选，PCR扩增得到阳性克隆菌液，在LB培养基扩大培养，至菌液浓度OD约为0.8。菌液5000prm，离心5分钟，弃去上清。

C.用现配的5％蔗糖溶液重悬，加入0.02％的表面活性剂silwet-77重悬。

D.用微量注射器吸取含目的基因的重悬菌液转化盛开期的红花柱头，转化结束后，立即将花用牛皮纸密封，重复操作，直至花朵闭合，取下牛皮纸，让植株恢复原来的生长环境。

E.待种子成熟后，采集获得T0代种子，翻土施肥后，种下T0代种子，待T1代植株花盛开时采集花器官样品。

三、转基因验证

设计引物进行基因组水平验证，

ID-F：GCTATCTGTCACTTCATCAAAAGG(SEQ ID NO.6)；

ID-R：ATCTAGCAGTCCTTTCACTCCG(SEQ ID NO.7)；

PCR体系是：

PCR程序是94℃热启动2min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸，35个循环。琼脂糖凝胶电泳结果显示，从31株中筛选出8株转基因阳性植株。

四、过表达CtACO1对黄酮生源途径中其他基因的影响

对阳性转基因植株和对照植株的花器官提取RNA，并反转录为cDNA，将样品cDNA浓度平衡成一致浓度。设计黄酮代谢通道上基因的荧光定量引物，引物序列如下表1所示，设置qPCR程序，95℃热启动3分钟，95℃变性10分钟，58℃退火20秒，72℃延伸35秒。在ABI7500仪器上进行实验。60S作为内参，相对定量法2^-△△Ct分析转录表达情况。

表1.黄酮代谢通道基因荧光定量引物

结果显示(图4)，CtPAL1，CtCHI1，Ct4CL1和CtF3H1的表达在转基因植株中明显升高，具有共调节作用。而CtCHS1在转基因植株中表达明显下调，总共下调了约5倍。

五、过表达CtACO1对黄酮代谢产物的影响分析

Ultra-high-performance liquid chromatography coupled to electrosprayionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry(UPLCESI-QTOF-MS)系统被用来分析过表达CtACO1对黄酮生源途径中代谢产物的影响。

柚皮素，芦丁，槲皮素，山奈酚，山奈酚-3-O-芸香糖苷，山奈酚-3-O-葡萄糖苷，芹菜素，异槲皮素，木犀草素，D-苯丙氨酸购买自阿拉丁，HSYA和carthamin为本实验室自提。采用标准曲线法对样品中的化合物含量进行定量。

将红花花冠样品置于50℃烘箱中烘至恒重，磨成粉末，取约10mg，精密称定，置于1ml 70％甲醇溶液中浸泡12小时，

超声处理40分钟，13000prm离心10分钟，取上清进样。

结果显示(图5)，和空载组比较，多数黄酮类化合物均呈现不同程度的下调，而黄酮醇类化合物槲皮素，芦丁，槲皮素3-β-D-葡萄糖苷积累量表现出明显上升。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

序列表

<110> 中国人民解放军第二军医大学

<120> 红花CtACO1基因、其编码蛋白质及应用

<130> /

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1195

<212> DNA

<213> 红花(Carthami Flos)

<400> 1

cgaatctaga ccgtcagcca tggcttcagc cactaacgaa ccacacagca gctacgatcg 60

tctccaggaa gtgaagcaag tcgacgaatc gaaaatcgga gtgaaaggac tgctagattc 120

cggcctaacc accatccctc ggttcttcca ccagccgccg gagaatctcc cggggccaaa 180

acctaaaaac cggccgcgat tgacggtgcc ggtgatcgac ttatccggag agaggtcaac 240

cgtggttgaa gagatccggc gatcggcttc gacgctaggg tttttccaga tcgtgaatca 300

cagcatcccg ccgagcttaa tcgattcagc gattgatgct atgaagaagt tttttgagga 360

atcgaacgag tataagatga aattttatca cagagaggct gggaaggggg cagcttattc 420

taccaatttt gatttgtacc aatcaaaagc tgccagctgg agggactccc ttcaggttcg 480

gatggcgccc atggagccgg catgggatgc ggtgcccgag atgtgcaggg aagcgctggc 540

ggagtgggac aaggcggttg tggggttagg agaggagctt atgtcgattc tatgcgaagg 600

attgggtgtg aagagtgata agttgaagga gttgtcgtgt ttgagcgcaa gggtaagcgt 660

gtcccattac tatccccagc gcccacagcc ggatctcacg gtcgggctca ccgcccacac 720

cgaccccggg gtgctgaccg tgctcgtgca gaatgaggtc ggcgggttgt tgcaggtcaa 780

gtgtggtgaa gactgggctg atgttgaggc agttcctggt gccgttgtta tcaacattgg 840

tgatctcctt cagatgatgt ctaacgagga atataaaagc gtgatgcata gagtgctggc 900

taacccggtt gaaggtgcac gcgtgtctat cgccgtcttt ttcaatccaa gcatccgaga 960

aaacctatat ggaccgttcc cggagctcgt atctgccgaa aaaccagcag tttaccggca 1020

attcacgtat gaagaataca ttacaaggtt ttttaaaaag gaactcgatg ggaagacatt 1080

aaccaatttc tacagaatcg atgacacgaa tgcttaatgt tgtatgattc tttgtatgta 1140

caatacaacg aactgtctgt ttcatttcaa gtcgcgttga gtcgaccatg gatgc 1195

<210> 2

<211> 365

<212> PRT

<213> 红花(Carthami Flos)

<400> 2

Met Ala Ser Ala Thr Asn Glu Pro His Ser Ser Tyr Asp Arg Leu Gln

1 5 10 15

Glu Val Lys Gln Val Asp Glu Ser Lys Ile Gly Val Lys Gly Leu Leu

20 25 30

Asp Ser Gly Leu Thr Thr Ile Pro Arg Phe Phe His Gln Pro Pro Glu

35 40 45

Asn Leu Pro Gly Pro Lys Pro Lys Asn Arg Pro Arg Leu Thr Val Pro

50 55 60

Val Ile Asp Leu Ser Gly Glu Arg Ser Thr Val Val Glu Glu Ile Arg

65 70 75 80

Arg Ser Ala Ser Thr Leu Gly Phe Phe Gln Ile Val Asn His Ser Ile

85 90 95

Pro Pro Ser Leu Ile Asp Ser Ala Ile Asp Ala Met Lys Lys Phe Phe

100 105 110

Glu Glu Ser Asn Glu Tyr Lys Met Lys Phe Tyr His Arg Glu Ala Gly

115 120 125

Lys Gly Ala Ala Tyr Ser Thr Asn Phe Asp Leu Tyr Gln Ser Lys Ala

130 135 140

Ala Ser Trp Arg Asp Ser Leu Gln Val Arg Met Ala Pro Met Glu Pro

145 150 155 160

Ala Trp Asp Ala Val Pro Glu Met Cys Arg Glu Ala Leu Ala Glu Trp

165 170 175

Asp Lys Ala Val Val Gly Leu Gly Glu Glu Leu Met Ser Ile Leu Cys

180 185 190

Glu Gly Leu Gly Val Lys Ser Asp Lys Leu Lys Glu Leu Ser Cys Leu

195 200 205

Ser Ala Arg Val Ser Val Ser His Tyr Tyr Pro Gln Arg Pro Gln Pro

210 215 220

Asp Leu Thr Val Gly Leu Thr Ala His Thr Asp Pro Gly Val Leu Thr

225 230 235 240

Val Leu Val Gln Asn Glu Val Gly Gly Leu Leu Gln Val Lys Cys Gly

245 250 255

Glu Asp Trp Ala Asp Val Glu Ala Val Pro Gly Ala Val Val Ile Asn

260 265 270

Ile Gly Asp Leu Leu Gln Met Met Ser Asn Glu Glu Tyr Lys Ser Val

275 280 285

Met His Arg Val Leu Ala Asn Pro Val Glu Gly Ala Arg Val Ser Ile

290 295 300

Ala Val Phe Phe Asn Pro Ser Ile Arg Glu Asn Leu Tyr Gly Pro Phe

305 310 315 320

Pro Glu Leu Val Ser Ala Glu Lys Pro Ala Val Tyr Arg Gln Phe Thr

325 330 335

Tyr Glu Glu Tyr Ile Thr Arg Phe Phe Lys Lys Glu Leu Asp Gly Lys

340 345 350

Thr Leu Thr Asn Phe Tyr Arg Ile Asp Asp Thr Asn Ala

355 360 365

<210> 3

<211> 1098

<212> DNA

<213> 红花(Carthami Flos)

<400> 3

atggcttcag ccactaacga accacacagc agctacgatc gtctccagga agtgaagcaa 60

gtcgacgaat cgaaaatcgg agtgaaagga ctgctagatt ccggcctaac caccatccct 120

cggttcttcc accagccgcc ggagaatctc ccggggccaa aacctaaaaa ccggccgcga 180

ttgacggtgc cggtgatcga cttatccgga gagaggtcaa ccgtggttga agagatccgg 240

cgatcggctt cgacgctagg gtttttccag atcgtgaatc acagcatccc gccgagctta 300

atcgattcag cgattgatgc tatgaagaag ttttttgagg aatcgaacga gtataagatg 360

aaattttatc acagagaggc tgggaagggg gcagcttatt ctaccaattt tgatttgtac 420

caatcaaaag ctgccagctg gagggactcc cttcaggttc ggatggcgcc catggagccg 480

gcatgggatg cggtgcccga gatgtgcagg gaagcgctgg cggagtggga caaggcggtt 540

gtggggttag gagaggagct tatgtcgatt ctatgcgaag gattgggtgt gaagagtgat 600

aagttgaagg agttgtcgtg tttgagcgca agggtaagcg tgtcccatta ctatccccag 660

cgcccacagc cggatctcac ggtcgggctc accgcccaca ccgaccccgg ggtgctgacc 720

gtgctcgtgc agaatgaggt cggcgggttg ttgcaggtca agtgtggtga agactgggct 780

gatgttgagg cagttcctgg tgccgttgtt atcaacattg gtgatctcct tcagatgatg 840

tctaacgagg aatataaaag cgtgatgcat agagtgctgg ctaacccggt tgaaggtgca 900

cgcgtgtcta tcgccgtctt tttcaatcca agcatccgag aaaacctata tggaccgttc 960

ccggagctcg tatctgccga aaaaccagca gtttaccggc aattcacgta tgaagaatac 1020

attacaaggt tttttaaaaa ggaactcgat gggaagacat taaccaattt ctacagaatc 1080

gatgacacga atgcttaa 1098

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

gagctttcgc ggatccgcca ccatggcttc agccactaac 40

<210> 5

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 5

catggtggca agcttagggc cgggattctc ctccacgtca ccgcatgtta gaag 54

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 6

gctatctgtc acttcatcaa aagg 24

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 7

atctagcagt cctttcactc cg 22

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 8

tcaagtgtgg tgaagactgg gctg 24

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 9

tcggcagata cgagctccgg gaacgg 26

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 10

cgaatctaga ccgtcagcca tg 22

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 11

gcatccatgg tcgactcaac gc 22

Claims (2)

1.红花CtACO1基因在提高红花中黄酮醇类化合物含量中的应用；所述的红花CtACO1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的黄酮醇类化合物为槲皮素、芦丁或槲皮素3-β-D-葡萄糖苷。

2.红花CtACO1蛋白在提高红花中黄酮醇类化合物含量中的应用；所述的红花CtACO1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述的黄酮醇类化合物为槲皮素、芦丁或槲皮素3-β-D-葡萄糖苷。

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