CN110106197B - 一种芸薹根肿菌分泌蛋白的鉴定方法 - Google Patents

一种芸薹根肿菌分泌蛋白的鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种芸薹根肿菌分泌蛋白的鉴定方法，包括预测芸薹根肿菌分泌蛋白的信号肽序列；构建芸薹根肿菌分泌蛋白载体：提取感染根肿病的拟南芥根部RNA，反转录成cDNA，作为PCR扩增模板，利用高保真酶KOD‑FX NEO扩增预测信号肽序列；构建pSUC2‑PbCe1；酵母转化；酵母转化子的PCR验证。本发明提供的芸薹根肿菌分泌蛋白的鉴定方法，可以为芸薹根肿菌的分泌蛋白鉴定以及相关的后续研究提供强有力的技术支持。

Description

一种芸薹根肿菌分泌蛋白的鉴定方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种芸薹根肿菌分泌蛋白的鉴定方法。
背景技术
根肿病(clubroot disease)是由芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicaeWoronin)引起的世界性土传病害，该病原菌的寄主范围十分广泛，可危害甘蓝、花椰菜、大白菜、小白菜、油菜、荠菜等多种十字花科栽培和野生植物。根肿病常年危害面积约320-400万hm2，大流行年份发生与危害面积可达900万hm2，平均产量损失达20％-30％，病重田块直接产量损失达60％以上。除了直接导致作物减产外，病根中释放的休眠孢子生命力极强可在土壤中存活达20年，一旦田间受到根肿菌的污染后，田块将长期带菌不再适合栽种十字花科植物。明确芸薹根肿菌致病分子机理是有效防控该病的关键。
芸薹根肿菌为专性活体营养型生物，目前尚无法在人工合成培养基上生长，独特的生活方式在很大程度上限制了对其致病分子机理的研究；越来越多的研究表明病原物的分泌蛋白在其致病过程中起到重要作用，而芸薹根肿菌分泌蛋白的鉴定尚缺乏研究报道。
因此，提供一种芸薹根肿菌分泌蛋白的鉴定方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种芸薹根肿菌分泌蛋白的鉴定方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种芸薹根肿菌分泌蛋白的鉴定方法，具体步骤如下：
(1)预测芸薹根肿菌分泌蛋白的信号肽序列；
(2)构建芸薹根肿菌分泌蛋白载体：提取感染根肿病的拟南芥根部RNA，反转录成cDNA，作为PCR扩增模板，利用高保真酶KOD-FX NEO扩增预测信号肽序列；
(3)将扩增产物进行电泳，回收目的片段，连接pMD18-T，构建pMD18-T-PbCe1，并转化大肠杆菌DH5α，将测序正确的阳性克隆提取质粒，酶切回收；将回收片段与经同一组酶消化的pSUC2连接，构建pSUC2-PbCe1，转化大肠杆菌DH5α，将测序正确的阳性克隆提取质粒备用；
(4)酵母转化：将步骤(3)测序正确的质粒pSUC2-PbCe1转化酵母菌YTK12，采用LiAc转化法转化酵母，涂布于SD-Trp板，30℃倒置培养3-5天；
(5)酵母转化子的PCR验证：提取酵母转化子的质粒，并利用PCR验证阳性克隆；
(6)将步骤(5)所述的阳性克隆利用一缺营养液SD-Trp摇培过夜，次日离心收集菌体，并用灭菌水重悬，再次离心收集菌体，利用平板生长实验和TTC实验进行验证。
进一步，步骤(2)所述PCR反应体系如下：共20μl，其中Tris-HCl 10mM，KCl 50mM，MgCl2 1.5mM，dNTPs 0.2mM，上下游引物各0.5μM，预混抗Taq DNA聚合酶抗体的DNA聚合酶0.1U/μl。
进一步，所述上下游引物的引物序列如下：
PbCe1-Sig-F：5’-ATGAATTCATGCAGAGCTGGCTTGCGCTGT-3’；SEQ ID NO.4；
PbCe1-Sig-R：5’-ATCTCGAGGCCGGAGCACGACCATGCCAGC-3’；SEQ ID NO.5。
进一步，步骤(2)所述PCR反应条件为：98℃3min；95℃30s，54℃30s，72℃20s，30个循环；72℃延伸7min；4℃保存。
进一步，步骤(6)将步骤(5)所述的阳性克隆利用一缺营养液SD-Trp于30℃200rpm摇培过夜，次日8000rpm离心2min收集菌体，并用灭菌水重悬，再次8000rpm离心2min收集菌体。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种芸薹根肿菌分泌蛋白的鉴定方法，可以为芸薹根肿菌的分泌蛋白鉴定以及相关的后续研究提供强有力的技术支持。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明SingalP 4.1在线预测的默认参数；
图2附图为本发明用SignalP 4.1默认参数对PbCe1的信号肽进行预测；
图3附图为本发明PbCe1蛋白结构图；
其中，蓝色部分为预测信号肽的位置(1-19)；
图4附图为本发明平板生长实验结果；
其中，YTK12为不能分泌蔗糖酶的酵母菌突变体菌株；pSUC2表示向YTK12酵母菌转化pSUC2载体；PbCe1-1和PbCe1-2分别表示转化了pSUC2-PbCe1的阳性克隆；
图5附图为本发明TTC实验结果；
其中，YTK12为不能分泌蔗糖酶的酵母菌突变体菌株；pSUC2表示向YTK12酵母菌转化pSUC2载体；pSUC2-PbCe1-1和pSUC2-PbCe1-2分别表示转化了pSUC2-PbCe1的阳性克隆；其中YTK12和pSUC2作为本实验的阴性对照。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种芸薹根肿菌分泌蛋白的鉴定方法，具体步骤如下：
(1)芸薹根肿菌分泌蛋白的鉴定：将氨基酸序列(MQSWLALCTTVLLAWSCSGACNCTLDVAQVCGSDGVTYRNSCLALCSGAAVAKAGPCSCTCQPSSPSDTVCGTDGRAHKSACEAECNSVKVAYTGSCIQPCSSSDAATTSMPVCGNDGQTYPNPCEARNKGILISSQGACSGQPVKCDCPDQVAPVCASDGSTYSSSCKAKCTGVSIVHLGACTN；SEQ ID NO.1)输入框内，利用SingalP 4.1在线预测(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)信号肽(signal peptide，SP)序列(预测信号肽的氨基酸序列为MQSWLALCTTVLLAWSCSG；SEQ ID NO.2；该信号肽对应的核酸序列为ATGCAGAGCTGGCTTGCGCTGTGTACGACGGTTCTGCTGGCATGGTCGTGCTCCGGC；SEQ ID NO.3)，选择默认参数如图1所示，用SignalP 4.1默认参数对PbCe1的信号肽进行预测(图2)，从图2中可知，SignalP4.1预测到PbCe1的信号肽位于氨基端第1-19个氨基酸残基。结合PbCe1的SMART(http://smart.embl- heidelberg.de/)分析结果，绘制PbCe1蛋白结构图(图3)。
(2)芸薹根肿菌分泌蛋白载体的构建：用RNA提取试剂盒(天根)提取感染根肿病的拟南芥根部RNA，反转录成cDNA，作为PCR扩增模板，利用高保真酶KOD-FX NEO扩增预测信号肽序列，PCR反应体系(20μ1)如下：Tris-HCl 10mM，KCl 50mM，MgCl21.5mM，dNTPs 0.2mM，上下游引物各0.5μM，预混抗Taq DNA聚合酶抗体的DNA聚合酶0.1U/μl；
其中，上下游引物的引物序列如下：
PbCe1-Sig-F：5’-ATGAATTCATGCAGAGCTGGCTTGCGCTGT-3’；SEQ ID NO.4；
PbCe1-Sig-R：5’-ATCTCGAGGCCGGAGCACGACCATGCCAGC-3’；SEQ ID NO.5。
PCR反应条件为：98℃3min；95℃30s，54℃30s，72℃20s，30个循环；72℃延伸7min；4℃保存。120V跑胶15min，切胶回收，将回收的片段连接pMD18-T，构建pMD18-T-PbCe1，并转化大肠杆菌DH5α，将测序正确的阳性克隆提取质粒，用EcoR I和Xho I双酶切后跑胶回收目的条带。将回收片段与经同一组酶消化的pSUC2连接，构建pSUC2-PbCe1，转化大肠杆菌DH5α，将测序正确的阳性克隆提取质粒备用。
(3)酵母转化：将上述测序正确的质粒pSUC2-PbCe1转化酵母菌YTK12，采用LiAc转化法转化酵母：
A、取-70℃保存的酵母菌株YTK12在YPAD平扳上划线，30℃培养3天；
B、从平板上挑取生长3天、直径为2-3mm的YTK12接入30ml YPDA液体培养基中，30℃，200rpm培养过夜；
C、取1ml菌液加到2ml灭菌离心管中，室温，13200rpm离心1min，弃上清；
D、沉淀用1ml无菌ddH2O重悬，13200rpm离心1min，弃上清；
E、重复步骤D一次；
F、沉淀用1ml 0.1M LiAc重悬，30℃孵育5min，获得酵母细胞悬浮液；
G、将上述1ml酵母细胞悬浮液分装到2ml灭菌离心管中，每管500μl，室温13200rpm离心2min，弃上清；
H、依次加入：240μl PEG(50％)，36μl LiAc(1M)，50μl ssDNA(2mg/ml)，10μl质粒pSUC2-PbCe1；20μl ddH2O；
I、涡旋混匀90s，42℃温浴20min；
J、13200rpm离心2min，沉淀用200μl无菌水重悬；
K、吸取100μl重悬液涂于SD-Trp(Clontech)固体培养基上，30℃倒置培养3-5天直至菌落出现。
(4)酵母转化子的PCR验证：利用质粒提取试剂盒提取酵母转化子的质粒，并利用PCR验证阳性克隆，PCR反应体系和反应条件同步骤(2)。
(5)将上述阳性克隆利用一缺营养液(SD-Trp)于30℃200rpm摇培过夜，次日8000rpm离心2min收集菌体，并用灭菌水重悬，再次8000rpm离心2min收集菌体；
a、平板生长实验：用灭菌牙签沾取少量酵母，分别涂在CMD-W，YPRAA板上，30℃倒置培养3-5天，结果如图4所示，在CMD-W培养基上，只有转化了空载体pSUC2的YTK12(pSUC2)和转化pSUC2-PbCe1的YTK12(PbCe1-1和PbCe1-2)在CMD-W培养基上能够生长，而酵母蔗糖酶突变体YTK12不能生长；在YPRAA上，只有转化pSUC2-PbCe1的YTK12(PbCe1-1和PbCe1-2)能够生长；结果表明，只有PbCel能够正常分泌蔗糖酶利用培养基中的碳源；
b、TTC实验：向菌体中加入1ml含有25Mm蔗糖的醋酸钠溶液(pH 5.0)，置于37℃反应30min，再加入1ml含有0.1％TTC的氢氧化钠溶液(1N)，10min内观察显色反应，并拍照记录结果，结果如图5所示，酵母蔗糖酶突变体YTK12，转化空载体pSUC2的YTK12(pSUC2)不能分泌蔗糖酶，因此不能使TTC变色，转化pSUC2-PbCe1的YTK12(PbCel)能够分泌蔗糖酶使得蔗糖分解成葡萄糖和果糖，这两种单糖与TTC反应从而生成红色物质。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一种芸薹根肿菌分泌蛋白的鉴定方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 185
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Met Gln Ser Trp Leu Ala Leu Cys Thr Thr Val Leu Leu Ala Trp Ser
1 5 10 15
Cys Ser Gly Ala Cys Asn Cys Thr Leu Asp Val Ala Gln Val Cys Gly
20 25 30
Ser Asp Gly Val Thr Tyr Arg Asn Ser Cys Leu Ala Leu Cys Ser Gly
35 40 45
Ala Ala Val Ala Lys Ala Gly Pro Cys Ser Cys Thr Cys Gln Pro Ser
50 55 60
Ser Pro Ser Asp Thr Val Cys Gly Thr Asp Gly Arg Ala His Lys Ser
65 70 75 80
Ala Cys Glu Ala Glu Cys Asn Ser Val Lys Val Ala Tyr Thr Gly Ser
85 90 95
Cys Ile Gln Pro Cys Ser Ser Ser Asp Ala Ala Thr Thr Ser Met Pro
100 105 110
Val Cys Gly Asn Asp Gly Gln Thr Tyr Pro Asn Pro Cys Glu Ala Arg
115 120 125
Asn Lys Gly Ile Leu Ile Ser Ser Gln Gly Ala Cys Ser Gly Gln Pro
130 135 140
Val Lys Cys Asp Cys Pro Asp Gln Val Ala Pro Val Cys Ala Ser Asp
145 150 155 160
Gly Ser Thr Tyr Ser Ser Ser Cys Lys Ala Lys Cys Thr Gly Val Ser
165 170 175
Ile Val His Leu Gly Ala Cys Thr Asn
180 185
<210> 2
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Met Gln Ser Trp Leu Ala Leu Cys Thr Thr Val Leu Leu Ala Trp Ser
1 5 10 15
Cys Ser Gly
<210> 3
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
atgcagagct ggcttgcgct gtgtacgacg gttctgctgg catggtcgtg ctccggc 57
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
atgaattcat gcagagctgg cttgcgctgt 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
atctcgaggc cggagcacga ccatgccagc 30

Claims (1)

1.一种芸薹根肿菌分泌蛋白的鉴定方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)预测芸薹根肿菌分泌蛋白的信号肽序列；
(2)构建芸薹根肿菌分泌蛋白载体：提取感染根肿病的拟南芥根部RNA，反转录成cDNA，作为PCR扩增模板，利用高保真酶KOD-FX NEO扩增预测信号肽序列；
(3)将扩增产物进行电泳，回收目的片段，连接pMD18-T，构建pMD18-T-PbCe1，并转化大肠杆菌DH5α，将测序正确的阳性克隆提取质粒，酶切回收；将回收片段与经同一组酶消化的pSUC2连接，构建pSUC2-PbCe1，转化大肠杆菌DH5α，将测序正确的阳性克隆提取质粒备用；
(4)酵母转化：将步骤(3)测序正确的质粒pSUC2-PbCe1转化酵母菌YTK12，采用LiAc转化法转化酵母；
所述LiAc转化法具体步骤如下：
A、取-70℃保存的酵母菌株YTK12在YPAD平扳上划线，30℃培养3天；
B、从平板上挑取生长3天、直径为2-3mm的YTK12接入30ml YPDA液体培养基中，30℃，200rpm培养过夜；
C、取1ml菌液加到2ml灭菌离心管中，室温，13200rpm离心1min，弃上清；
D、沉淀用1ml无菌ddH2O重悬，13200rpm离心1min，弃上清；
E、重复步骤D一次；
F、沉淀用1ml 0.1M LiAc重悬，30℃孵育5min，获得酵母细胞悬浮液；
G、将上述1ml酵母细胞悬浮液分装到2ml灭菌离心管中，每管500μl，室温13200rpm离心2min，弃上清；
H、依次加入：240μl PEG(50％)，36μl LiAc(1M)，50μl ssDNA(2mg/ml)，10μl质粒pSUC2-PbCe1；20μl ddH2O；
I、涡旋混匀90s，42℃温浴20min；
J、13200rpm离心2min，沉淀用200μl无菌水重悬；
K、吸取100μl重悬液涂于SD-Trp固体培养基上，30℃倒置培养3-5天直至菌落出现；
(5)酵母转化子的PCR验证：提取酵母转化子的质粒，并利用PCR验证阳性克隆；
(6)将步骤(5)所述的阳性克隆利用一缺营养液SD-Trp摇培过夜，次日离心收集菌体，并用灭菌水重悬，再次离心收集菌体，利用平板生长实验和TTC实验进行验证；
步骤(2)所述PCR反应体系如下：共20μ1，其中Tris-HCl 10mM，KCl50mM，MgCl2 1.5mM，dNTPs0.2mM，上下游引物各0.5μM，预混抗Taq DNA聚合酶抗体的DNA聚合酶0.1U/μl。所述上下游引物的引物序列如下：
PbCe1-Sig-F：5’-ATGAATTCATGCAGAGCTGCCTTGCGCTGT-3’；SEQ ID NO.4；
PbCe1-Sig-R：5’-ATCTCGAGGCCGGAGCACGACCATGCCAGC-3’；SEQ ID NO.5；
步骤(2)所述PCR反应条件为：98℃3min；95℃30s，54℃30s，72℃20s，30个循环；72℃延伸7min；4℃保存；
步骤(6)将步骤(5)所述的阳性克隆利用一缺营养液SD-Trp于30℃200rpm摇培过夜，次日8000rpm离心2min收集菌体，并用灭菌水重悬，再次8000rpm离心2min收集菌体。
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CN104480138A (zh) * 2014-12-11 2015-04-01 江苏省农业科学院 一种PEG/LiAc介导的芸薹根肿菌遗传转化方法

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Non-Patent Citations (1)

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小麦病程相关蛋白１基因的亚细胞定位及信号肽鉴定;张家瑞 等;《河北农业大学学报》;20170731;第40卷(第4期);第1.2-1.8节 *

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