CN110734480A - 大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES在协助合成植物Rubisco中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES在协助合成植物Rubisco中的应用。本发明首先公开了大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES的相关生物材料在生物合成植物Rubisco中的应用；所述大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES由GroEL蛋白和GroES蛋白组成。本发明进一步公开了生物合成植物Rubisco的方法。本发明构建了以大肠杆菌分子伴侣GroES/EL与植物分子伴侣作为分子伴侣系统共同在大肠杆菌MGM100菌株中合成拟南芥Rubisco的体系，可以有效合成拟南芥Rubisco，简化了拟南芥Rubisco的合成体系，为后续改造Rubisco提供了便利。

Description

大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES在协助合成植物Rubisco中的 应用

技术领域

本发明属于生物技术领域。具体涉及大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES在协助合成植物Rubisco中的应用。

背景技术

植物的光合作用是维持生物圈稳定的重要途经，通过一系列的反应将大气中的H₂O和CO₂转化成碳水化合物，即CO₂的固定。其中关键催化反应的酶为核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(ribulose-1，5-biphosphate carboxylase/oxygenase，简称Rubisco)，但是Rubisco固定CO₂的效率非常低，提高Rubisco的羧化酶活性成为提高作物产量的靶点。因此，研究Rubisco的生物合成及调控逐渐成为研究的热点和难点，因为Rubisco的生物合成需要复杂的分子伴侣系统协助其折叠和组装。

因此，迫切需要开发一种新的、简单的分子伴侣系统替代叶绿体的分子伴侣素Cpn60在大肠杆菌中对Rubisco进行组装。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是找到一种新的分子伴侣以合成植物Rubisco。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES的相关生物材料在生物合成植物Rubisco中的应用；所述大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES由GroEL蛋白和GroES蛋白组成，所述大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES的相关生物材料为如下任一所述：

A1)所述GroEL蛋白和所述GroES蛋白；所述GroEL蛋白为序列16所示的核酸分子编码的蛋白质，所述GroES蛋白为序列17所示的核酸分子编码的蛋白质；

A2)编码A1)所述蛋白质的核酸分子；

A3)含有A2)所述核酸分子的表达盒；

A4)含有A2)所述核酸分子的重组载体，或含有A3)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A2)所述核酸分子的重组微生物，或含有A3)所述表达盒的重组微生物；含有A4)所述重组载体的重组微生物。

上述应用中，所述A2)中编码所述GroEL蛋白的核酸分子为序列16所示，编码所述GroES蛋白的核酸分子为序列17所示。

本发明中，所述序列16所示的核酸分子由1638个核苷酸序列组成，编码序列为1-1638位；所述序列17所示的核酸分子由291个核苷酸序列组成，编码序列为1-291位。

上述大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES中GroEL蛋白和GroES蛋白是作为合成植物Rubisco的伴侣蛋白。

本发明还提供了上述大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES和植物分子伴侣的相关生物材料在生物合成植物Rubisco中的应用；所述植物分子伴侣由Raf1、Raf2、RbcX2和BSD2蛋白组成，所述植物分子伴侣的相关生物材料为如下任一所述：

B1)所述Raf1蛋白、所述Raf2蛋白、所述RbcX2蛋白和所述BSD2蛋白；所述Raf1蛋白为序列11所示的核酸分子编码的蛋白质，所述Raf2蛋白为序列13所示的核酸分子编码的蛋白质，所述RbcX2蛋白为序列14所示的核酸分子编码的蛋白质，所述BSD2蛋白为序列15所示的核酸分子编码的蛋白质；

B2)编码B1)所述蛋白质的核酸分子；

B3)含有B2)所述核酸分子的表达盒；

B4)含有B2)所述核酸分子的重组载体，或含有B3)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B2)所述核酸分子的重组微生物，或含有B3)所述表达盒的重组微生物；含有A4)所述重组载体的重组微生物。

上述应用中，所述A2)中编码所述Raf1蛋白的核酸分子为序列11所示，编码所述Raf2蛋白为序列13所示，编码所述RbcX2蛋白为序列14所示，编码所述BSD2蛋白为序列15所示。

本发明中，所述序列11所示的核酸分子由1170个核苷酸序列组成，编码序列为1-1170位；所述序列13所示的核酸分子由516个核苷酸序列组成，编码序列为1-516位；所述序列14所示的核酸分子由429个核苷酸序列组成，编码序列为1-429位；所述序列15所示的核酸分子由246个核苷酸序列组成，编码序列为1-246位。

本发明含有编码上述大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES的核酸分子的大肠杆菌在生物合成植物Rubisco中的应用。

本发明还提供了含有编码上述大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES的核酸分子的大肠杆菌和和表达上述植物分子伴侣(BSD2、Raf1、Raf2和RbcX2)的载体在生物合成植物Rubisco中的应用。

上述应用中，表达植物分子伴侣(BSD2、Raf1、Raf2和RbcX2)的载体可以为一个也可以为多个。

在本发明具体的实施方式中，所述植物分子伴侣BSD2、Raf1、Raf2和RbcX2为拟南芥分子伴侣AtBSD2、AtRaf1、AtRaf2和AtRbcX2，其构建在同一个载体上，所述载体为pT7linker2-AtBSD2-AtRaf1-AtRaf2-AtRbcX2。所述pT7linker2-AtBSD2-AtRaf1-AtRaf2-AtRbcX2包含依次连接的序列12第1215-2053位所示的大肠杆菌p15A复制子、序列12第194-853位所示的氯霉素抗性基因、序列7第994-2076位所示的LacI阻遏蛋白基因、序列7第4505-4547位所示的Linker1、串联的AtBSD2基因表达盒、AtRaf1基因表达盒、AtRaf2基因表达盒和AtRbcX2基因表达盒、序列7第1-51位所示的Linker2；所述AtBSD2基因表达盒包含依次连接的序列5第1-19位所示的T7启动子、序列5第20-44位所示的Lac操纵子、AtBSD2基因和序列1第475-517位所示的T7转录终止子，所述AtRaf1基因表达盒包含依次连接的序列5第1-19位所示的T7启动子、序列5第20-44位所示的Lac操纵子、AtRaf1基因和序列1第475-517位所示的T7转录终止子，所述AtRaf2基因表达盒包含依次连接的序列5第1-19位所示的T7启动子、序列5第20-44位所示的Lac操纵子、AtRaf2基因和序列1第475-517位所示的T7转录终止子，所述AtRbcX2基因表达盒包含依次连接的序列5第1-19位所示的T7启动子、序列5第20-44位所示的Lac操纵子、AtRbcX2基因和序列1第475-517位所示的T7转录终止子。

本发明还提供了一种生物合成植物Rubisco的产品。

本发明生物合成植物Rubisco的产品为如下任一所示：

B1)上述大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES的相关生物材料；

B2)上述大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES的相关生物材料和上述植物分子伴侣的相关生物材料。

本发明还提供了一种生物合成植物Rubisco的方法。

本发明所述生物合成植物Rubisco的方法，包括如下步骤：

将编码上述植物分子伴侣的核酸分子和植物Rubisco的大亚基基因和小亚基基因导入到含有编码上述大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES的核酸分子的大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌，对重组大肠杆菌进行诱导培养，完成植物Rubisco的生物合成。

在本发明具体的实施方式中，所述植物Rubisco的大亚基基因的序列为序列4所示，所述植物Rubisco小亚基基因的序列为序列3所示，具体的，所述植物Rubisco的大亚基基因为拟南芥Rubisco的大亚基基因AtRbcL，所述植物Rubisco小亚基基因为拟南芥Rubisco小亚基基因AtRbcS，所述AtRbcS和AtRbcL构建在同一个载体上，所述载体为pTetlinker-AtRbcLS-AtRbcL，所述pTetlinker-AtRbcLS-AtRbcL包含依次连接的序列1第2574-3312位所示的大肠杆菌CDF复制子、序列1第1646-2434位所示的壮观霉素抗性基因、序列1第748-1371位所示的四环素抑制蛋白基因、序列1第265-295位所示的Linker1、串联的AtRbcS基因表达盒和AtRbcL基因表达盒、序列1第518-583位所示的Linker2；所述外源基因表达盒包含依次连接的序列1第296-386位所示的四环素诱导启动子、外源基因和序列1第475-517位所示的T7转录终止子；所述AtRbcS基因表达盒包含依次连接的序列1第296-386位所示的四环素诱导启动子、AtRbcS基因和序列1第475-517位所示的T7转录终止子，所述AtRbcL基因表达盒包含依次连接的序列1第296-386位所示的四环素诱导启动子、AtRbcL基因和序列1第475-517位所示的T7转录终止子。

本发明中，所述含有编码上述大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES的核酸分子的大肠杆菌为大肠杆菌MGM100。

本发明中，所述植物为拟南芥。

本发明构建了以大肠杆菌分子伴侣GroES/EL与植物分子伴侣作为分子伴侣系统共同在大肠杆菌MGM100菌株中合成拟南芥Rubisco的体系，通过诱导大肠杆菌MGM100基因组上的GroEL/ES可以有效合成拟南芥Rubisco，避免了拟南芥Rubisco合成对叶绿体分子伴侣素Cpn60的依赖，极大的简化了拟南芥Rubisco的体外合成体系，为后续改造Rubisco和获取高羧化酶活性的Rubisco提供了便利。

附图说明

图1为大肠杆菌菌株MGM100的受到阿拉伯糖启动子pBAD的调控表达的示意图。

图2为拟南芥Rubisco的合成；A为Western blot检测诱导后产物中的Rubisco的相对含量；左边条带为在MGM100中导入质粒1、质粒2和质粒3进行Rubisco的合成后检测Rubisco的合成量；右边为MGM1000中导入质粒1和质粒3进行Rubisco的合成后检测Rubisco的合成量；B为通过Rubisco酶活性测定检验Rubisco的相对含量；pCpn60/20为在MGM100中导入质粒1、质粒2和质粒3进行Rubisco的合成后检测活性；eGroEL/ES为MGM1000中导入质粒1和质粒3进行Rubisco的合成后检测活性。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1质粒1：pTetlinker-AtRbcS-AtRbcL的构建

一、构建pTetlinker载体

一、构建pTetlinker载体

1、用引物(pLCM1 For：cacggtcacactgcttccggta，pLCM1 Rev：gggatctcgaccgatgcccttgag)PCR扩增质粒pCDFDuet-1(购自addgene：http://www.addgene.org/)，得到扩增片段A(序列1第1499-3479位)，所述扩增片段A包含大肠杆菌CDF复制子(序列1第2574-3312位)和壮观霉素抗性基因(序列1第1646-2434位)的表达盒。

2、用引物(pJKR-Tet For：agggcatcggtcgagatccc Gagtagggaactgccaggcatcaa，pJKR-Tet Rev3：gtgcttctcgcctgaggttCCGTGTGCTTCTCGCCTGAGGTT)PCR扩增质粒pJKR-H-TetR(购自addgene：http：//www.addgene.org/)，得到扩增片段B(序列2)，所述扩增片段B包含四环素抑制蛋白基因(序列2第1404-2027位)的表达盒和GFP基因表达盒(序列2第265-2128位)，所述GFP基因表达盒包含四环素诱导启动子(序列2第265-355位)、GFP基因和T7转录终止子(序列2第2086-2128位)。

3、将上述得到的扩增片段A和扩增片段B无缝克隆连接，得中间载体pLCM1-Tet-GFP。用100ng/L四环素诱导pLCM1-Tet-GFP表达，检测GFP可以正常被诱导表达。

4、人工合成序列1第250-596所示的TetRlink元件，其中，该TetRlink元件包含linker1(序列1第265-295位)、四环素诱导启动子(序列1第296-386位)、T7转录终止子(序列1第475-517位)和Linker2(序列1第518-583位)；用引物(pTetR sy For：GCAAGTAAGGCCGACGAGCTTAA，pTetR sy Rev：GGTGTTAGCTGTGTCTCGCCAAGCTA)PCR扩增人工合成TetRlink元件，得到扩增片段C(序列1第250-596位)。

5、用引物(pTet inter For：cgagacacagctaacaccacgtcgtccctat，pTet interRev：gctcgtcggccttacttgctagcagagttt)PCR扩增中间载体pLCM1-Tet-GFP，得到扩增片段D(序列1第1-268和第579-2479位)，所述扩增片段D包含大肠杆菌CDF复制子((序列1第2574-3312位)和壮观霉素抗性基因(序列1第1646-2434位)的表达盒、四环素抑制蛋白基因(序列1第748-1371位，与序列2第1404-2027位序列相同)的表达盒。

6、将扩增片段C和扩增片段D无缝克隆连接，得到将中间载体pLCM1-Tet-GFP中GFP基因表达盒替换为TetRlink元件的质粒，命名为pTetlinker(具体序列如序列1所示)，包含大肠杆菌CDF复制子((序列1第2574-3312位)、壮观霉素抗性基因(序列1第1646-2434位)、四环素抑制蛋白基因(序列1第748-1371位)、link1(序列1第265-295位)、四环素诱导启动子(序列1第296-386位)、T7转录终止子(序列1第475-517位)和Linker2(序列1第518-583位)

二、根据要克隆外源基因的序列设计引物，以含有外源基因AtRbcS(序列3所示)的DNA分子为模板，利用引物进行扩增获得包含外源基因AtRbcS的片段将AtRbcS基因克隆进pTetlinker载体

1、用引物(AtRbcS-Tetlinker for：taagaaggagatatacatatgatggtctggaccccggtcaa，AtRbcS-Tetlinker rev：tcactcattagggttatgTTAcacggagcgcttgttggcgg)PCR扩增拟南芥AtRbcS基因，获得得到含有序列3所示的外源基因AtRbcS的扩增片段E；

2、用引物(pTetRlinker For：CATAACCCTAATGAGTGAGCTAACTTACA，pTetRlinkerRev：CATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAATTTA)PCR扩增质粒pTetlinker，获得扩增片段F(序列1第419-3479位)。

3、将扩增片段E和扩增片段F无缝克隆连接。

4、转化大肠杆菌后，经过抗性筛选，挑选转化子验证并测序，确证外源基因被克隆到pTetlinker载体中，命名为pTetlinker-AtRbcS。

三、根据要克隆外源基因的序列设计引物，以含有外源基因AtRbcL(序列4所示)的DNA分子为模板，利用引物进行扩增获得包含外源基因AtRbcL的片段将AtRbcL基因克隆进pTetlinker载体：

1、用引物(AtRbcL-Tetlinker for：taagaaggagatatacatatggttccacaaacagaaactaaa，AtRbcL-Tetlinker rev：tcactcattagggttatgttaaagtttgtcaatagtatcaaa)PCR扩增拟南芥AtRbcL基因，获得得到含有序列3所示的外源基因AtRbcL的扩增片段G。

2、用引物(pTetRlinker For：CATAACCCTAATGAGTGAGCTAACTTACA，pTetRlinkerRev：CATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAATTTA)PCR扩增质粒pTetlinker，获得扩增片段F(序列1第419-3479位)。

3、将扩增片段G和扩增片段F无缝克隆连接。

4、转化大肠杆菌后，经过抗性筛选，挑选转化子验证并测序，确证外源基因被克隆到pTetlinker载体中，命名为pTetlinker-AtRbcL。

四、AtRbcS和AtRbc L的串联获载体pTetlinker-AtRbcS-AtRbcL

1、取pTetlinker-AtRbcS和pTetlinker-AtRbcL分别用PacI，SwaI配置如下反应体系，并在相应的酶活性最适温度下进行酶切反应，获得PacI酶切反应体系和SwaI酶切反应体系

2、将两个反应体系于65℃孵育20min使SwaI与PacI高温失活，得到SwaI酶切DNA产物和PacI酶切DNA产物；按如下体系加入相应组分(无需琼脂糖胶回收)，对于SwaI酶切DNA产物需加入dGTP，对于PacI酶切DNA产物需加入dCTP，体系混匀后于25℃孵育30min，得到经T4 DNA聚合酶处理过的两个反应体系。

3、将经T4 DNA聚合酶处理过的两个反应体系于65℃孵育20min使T4 DNA聚合酶失活，然后两个体系各取5uL，等体积混合，放入PCR仪中加热至65℃，并逐步降温至10℃，使两个片段通过退火连接在一起，得到终产物。

4、取终产物转化E.coli DH5α感受态细胞，隔日挑选单克隆菌斑进行PCR验证阳性的克隆，其中，使用Linker1和Linker 2序列两侧引物(pQTEV3U：5′-TATAAAAATAGGCGTATCACGAGG-3′和pQTEV3L：5′-CCAGTGATTT TTTTCTCCAT TTT-3′)，退火温度59℃。

验证阳性的克隆经测序确证后即为外源基因AtRbcL和AtRbcS串联表达载体，得质粒1：pTetlinker-AtRbcLS-AtRbcL。

实施例2质粒2：pT7linker1-Cpn60α1β1/Cpn20的构建

一、pT7linker1载体

1、人工合成序列5所示的T7启动子-lac操纵子-T7终止子序列(该序列元件包含T7启动子(序列5第1-19位)、lac操纵子(序列5第20-44位)和T7转录终止子(序列5第161-203位))替换载本pQlinkN(Scheich，C.，Kummel，D.，Soumailakakis，D.，Heinemann，U.，Bussow，K.，Vectors for co-expression of an unrestricted number of proteins，Nucleic Acids Research，2007，Vol.35，No.6，e43.)中的Tac promoter-λt0 ter序列(如序列6所示)得pT7linker1载体，具体步骤如下：

1、设计引物(T7 box for：gtcttgaggggttttttgagtaacaacaccatttaaatgga，T7box rev：ctatagtgagtcgtattaacaattgaatctattataattgttatccgc)PCR扩增载体pQlinkN，得到序列7所示扩增片段H，所述扩增片段H包括LacI阻遏蛋白基因(序列7第994-2076位)的表达盒、大肠杆菌Col1复制子(序列7第2672-3260位)、氨苄青霉素抗性基因(序列7第3434-4291位)的表达盒、Linker1(序列7第4505-4547位)和Linker2(序列7第1-51位)。

2、将扩增片段H与人工合成的序列5所示的T7启动子-lac操纵子-T7终止子序列无缝克隆连接，得到连接产物，体系同实施例1。

3、取2μL连接产物转化大肠杆菌后，经过抗性筛选，挑选转化子验证并测序，得到的质粒命名为pT7linker1，其包括T7启动子(序列5第1-19位)、lac操纵子(序列5第20-44位)和T7转录终止子(序列5第161-203位)、LacI阻遏蛋白基因(序列7第994-2076)的表达盒、大肠杆菌Col1复制子(序列7第2672-3260位)、氨苄青霉素抗性基因(序列7第3434-4291位)的表达盒、Linker1(序列7第4505-4547位)和Linker2(序列7第1-51位)。

二、根据要克隆外源基因的序列设计引物，构建质粒pT7linker1-Cpn60α1。具体如下：

1、用引物(AtCpn60α1_Nde for：ggaattccatatgggagctaagagaatactatacggt和AtCpn60α1_BamH rev：ggaattccatatgggagctaagagaatactatacggt)PCR扩增序列8所示的拟南芥负责Rubisco折叠的分子伴侣素蛋白基因AtCPN60α，得到含有序列8所示的拟南芥负责Rubisco折叠的分子伴侣素蛋白基因AtCPN60α1的扩增片段I。

2、将pT7linker1载体和扩增片段I均用NdeI和BamHI酶切：2μL 10×NEBuffer，1μLNdeI和1μL BamH，500ng DNA并用ddH₂O补足至20μL，最终于37℃孵育2小时，并用gel回收试剂盒回收酶切后的pT7linker1载体和扩增片段I。

3、用T4 DNA连接酶连接两个回收的酶切后的pT7linker1载体和扩增片段I，得到终产物。

4、取2μL终产物转化E.coli DH5α，隔日挑选单克隆菌斑进行PCR验证，使用使用Linker1和Linker 2序列两侧引物序列两侧引物(pQTEV3U：5′-TATAAAAATAGGCGTATCACGAGG-3′和pQTEV3L：5′-CCAGTGATTT TTTTCTCCAT TTT-3′)，退火温度59℃。

5、转化大肠杆菌后，经过抗性筛选，挑选转化子验证并测序，确证外源基因CrCPN60α被克隆到pT7linker1载体中，命名为pT7linker1-AtCPN60α。

三、根据要克隆外源基因的序列设计引物，构建质粒pT7linker1-AtCpn60β1。具体如下：

1、用引物(AtCpn60β1_Nde I：ggaattccatatggcagcaaaggaattacatttcaac；AtCpn60β1_BamH I：cgcggatccttagtatccatatcctgagttgt)PCR扩增序列9所示的拟南芥负责Rubisco折叠的分子伴侣素蛋白基因AtCPN60β1，得到含有序列9所示的拟南芥负责Rubisco折叠的分子伴侣素蛋白基因AtCPN60β1的扩增片段J。

2、将pT7linker1载体和扩增片段J均用NdeI和BamHI酶切：2μL 10×NEBuffer，1μLNdeI和1μL BamH，500ng DNA并用ddH₂O补足至20μL，最终于37℃孵育2小时。并用gel回收试剂盒回收酶切后的pT7linker1载体和扩增片段I。

3、用T4 DNA连接酶连接两个回收的酶切后的pT7linker1载体和扩增片段J，得到终产物，连接体系同上述步骤二的连接体系。

4、取2μL终产物转化E.coli DH5α，隔日挑选单克隆菌斑进行PCR验证，Linker1和Linker 2序列两侧引物序列两侧引物(pQTEV3U：5′-TATAAAAATAGGCGTATCACGAGG-3′和pQTEV3L：5′-CCAGTGATTT TTTTCTCCAT TTT-3′)，退火温度59℃。

5、转化大肠杆菌后，经过抗性筛选，挑选转化子验证并测序，确证外源基因AtCPN60β1被克隆到pT7linker1载体中，命名为pT7linker1-AtCPN60β1。

四、根据要克隆外源基因的序列设计引物，以含有外源基因Cpn20(序列10所示的核酸分子)的DNA分子为模板，用引物(Cpn20_Nde I：ggaattccatatggcttctgttgttgccccta，Cpn20_BamH I：cgcggatccctaagaaagtatagccatca)PCR扩增，获得PCR产物，Nde I和BamH I酶切PCR产物和pT7linker1载体，回收酶切后的产物，利用T4连接酶连接，得到的连接产物，转化后鉴定得质粒pT7linker1-Cpn20。

1、用引物(AtCpn20_Nde I：ggaattccatatggcttctgttgttgccccta；AtCpn20_BamHI：cgcggatccctaagaaagtatagccatca)PCR扩增序列10所示的拟南芥负责Rubisco折叠的分子伴侣素蛋白基因AtCPN20，得到含有序列10所示的拟南芥负责Rubisco折叠的分子伴侣素蛋白基因AtCPN20的扩增片段L。

2、将pT7linker1载体和扩增片段L均用NdeI和BamHI酶切：2μL 10×NEBuffer，1μLNdeI和1μL BamH，500ng DNA并用ddH₂O补足至20μL，最终于37℃孵育2小时，并用gel回收试剂盒回收酶切后的pT7linker1载体和扩增片段L。

3、用T4 DNA连接酶连接两个回收的酶切后的pT7linker1载体和扩增片段L，得到终产物，连接体系同上述步骤二的连接体系。

4、取2μL终产物转化E.coli DH5α，隔日挑选单克隆菌斑进行PCR验证，Linker1和Linker 2序列两侧引物序列两侧引物(pQTEV3U：5′-TATAAAAATAGGCGTATCACGAGG-3′和pQTEV3L：5′-CCAGTGATTT TTTTCTCCAT TTT-3′)，退火温度59℃。

5、转化大肠杆菌后，经过抗性筛选，挑选转化子验证并测序，确证外源基因AtCPN20被克隆到pT7linker1载体中，命名为pT7linker1-AtCPN20。

五、pT7linker1-Cpn60α1β1/Cpn20的构建

1、取pT7linker1-Cpn60α1和pT7linker1-Cpn60β1分别用PacI，SwaI配置如下反应体系，并在相应的酶活性最适温度下进行酶切反应，获得PacI酶切反应体系和SwaI酶切反应体系

2、将两个反应体系于65℃孵育20min使SwaI与PacI高温失活，得到SwaI酶切DNA产物和PacI酶切DNA产物；按如下体系加入相应组分(无需琼脂糖胶回收)，对于SwaI酶切DNA产物需加入dGTP，对于PacI酶切DNA产物需加入dCTP，体系混匀后于25℃孵育30min，得到经T4 DNA聚合酶处理过的两个反应体系。

3、将经T4 DNA聚合酶处理过的两个反应体系于65℃孵育20min使T4 DNA聚合酶失活，然后两个体系各取5 uL，等体积混合，放入PCR仪中加热至65℃，并逐步降温至10℃，使两个片段通过退火连接在一起，得到终产物。

4、取终产物转化E.coli DH5α感受态细胞，隔日挑选单克隆菌斑进行PCR验证阳性的克隆，其中，使用Linker1和Linker 2序列两侧引物(pQTEV3U：5′-TATAAAAATAGGCGTATCACGAGG-3′和pQTEV3L：5′-CCAGTGATTT TTTTCTCCAT TTT-3′)，退火温度59℃。

验证阳性的克隆经测序确证后即为外源基因Cpn60α1和Cpn60β1的串联载体，得质粒pT7linker1-Cpn60α1β1，重复以上4步将Cpn20再串联到外源基因CPN60α1、CPN60β1的串联载体pT7linker1-Cpn60α1β1上，得到外源基因CPN60α1、CPN60β1和Cpn20的串联载体，命名为pT7linker1-Cpn60α1β1/Cpn20。

实施例3质粒3：pT7linker2-AtBSD2-AtRaf1-AtRaf2-AtRbcX2的构建

一、构建pT7linker2载体

1、合成引物(chl-p15A for：agcggtatcagctcactcaaaggcacggtcacactgcttccg，chl-p15A rev：aatggtttcttagacgtcaggtggccacaggtgcggttgctggc)PCR扩增质粒pACYC184(购自addgene：http://www.addgene.org/)，得到序列12所示的扩增片段M，所述扩增片段M包含大肠杆菌p15A复制子(序列12第1215-2053位)和氯霉素抗性基因(序列12第194-853位)。

2、设计引物(pT7linker1 for：cacctgacgtctaagaaaccatt，pT7linker1 rev：Cctttgagtgagctgataccgct)扩增pT7linker1载体，得到去除pT7linker1载体上的大肠杆菌Col1复制子(序列7第2672-3260位)、氨苄青霉素抗性基因(序列7第3434-4291位)的表达盒的扩增片段N。

3、将扩增片段M和扩增片段N无缝克隆连接，得到连接产物，体系如实施例1中无缝克隆连接体系：

4、取2μL连接产物转化大肠杆菌后，经过抗性筛选，挑选转化子验证并测序，得到的质粒命名为pT7linker 2，其包括T7启动子(序列5第1-19位)、lac操纵子(序列5第20-44位)和T7转录终止子(序列5第161-203位)、LacI阻遏蛋白基因(序列7第994-2076位)的表达盒、大肠杆菌p15A复制子(序列12第1215-2053位)和氯霉素抗性基因(序列12第194-853位)、Linker1(序列7第4505-4547位)和Linker2(序列7第1-51位)。

二、根据要克隆外源基因的序列设计引物，以含有外源基因AtRaf1(序列11所示)的DNA分子为模板，利用引物进行扩增获得包含外源基因AtRaf1的片段将AtRaf1基因克隆进pT7linker2载体

1、用引物(AtRaf1-T7linker2 For：agaaggagatatacatatgatgcaacagctctaccaacc，AtRaf1-T7linker2 Rev：gctttgttagcagccgtcagtcccagttctgatgacttgt)PCR扩增AtRaf1，得到含有序列11所示AtRaf1的扩增片段O。

2、设计引物(pT7linker 2 for cggctgctaacaaagcccgaaagg，pT7linker2 rev：atgtatatctccttcttaaagtta)PCR扩增pT7linker2载体，得到扩增片段P。

3、扩增片段O和扩增片段P进行无缝克隆连接，得到连接产物，无缝克隆连接体系同实施例2。

4、取2μL连接产物转化大肠杆菌后，经过抗性筛选，挑选转化子验证并测序，得到的质粒命名为pT7linker2-AtRaf1。

三、根据要克隆外源基因的序列设计引物，以含有外源基因AtRaf2(序列13所示)的DNA分子为模板，利用引物进行扩增获得包含外源基因AtRaf2的片段将AtRaf2基因克隆进pT7linker2载体

1、用引物(AtRaf2-T7linker2 For：agaaggagatatacatatgatgtctaatctggcgcaggatt，AtRaf2-T7linker2 Rev：gctttgttagcagccgtcacgcccaagctcttttcctagg)PCR扩增基因AtRaf2，得到含有序列13所示AtRaf2的扩增片段Q。

2、设计引物(pT7linker 2 for cggctgctaacaaagcccgaaagg，pT7linker2 rev：atgtatatctccttcttaaagtta)PCR扩增pT7linker2载体，得到扩增片段P。

3、用T4 DNA连接酶连接两个回收的酶切后的pT7linker 2载体和扩增片段Q，得到终产物，连接体系同实施例2.

4、取2μL终产物转化E.coli DH5α，隔日挑选单克隆菌斑进行PCR验证，使用Linker1和Linker2序列两侧引物序列两侧引物(pQTEV3U：5′-TATAAAAATAGGCGTATCACGAGG-3′和pQTEV3L：5′-CCAGTGATTT TTTTCTCCAT TTT-3′)，退火温度59℃。

5、转化大肠杆菌后，经过抗性筛选，挑选转化子验证并测序，确证外源基因AtRaf2被克隆到pT7linker2载体中，命名为pT7linker2-A tRaf2。

四、根据要克隆外源基因的序列设计引物，以含有外源基因AtRbcX(序列14所示)的DNA分子为模板，利用引物进行扩增获得包含外源基因AtRbcX的片段将AtRbcX基因克隆进pT7linker2载体：

1、用引物(AtRbcX-T7linker2 for：tatacatatgcggatgcatatccctgcgga，AtRbcX-T7linker2 rev：agccggatcctcacgcggcacccttgccggggc)PCR扩增AtRbcX，得到含有序列14所示AtRbcX的扩增片段R。

2、将pT7linker 2载体和扩增片段R均用NdeI和BamHI酶切：2μL 10×NEBuffer，1μL NdeI和1μL BamH，500ng DNA并用ddH₂O补足至20μL，最终于37℃孵育2小时，并用gel回收试剂盒回收酶切后的pT7linker 2载体和扩增片段R。

3、用T4 DNA连接酶连接两个回收的酶切后的pT7linker 2载体和扩增片段R，得到终产物，连接体系同实施例2。

4、取2μL终产物转化E.coli DH5α，隔日挑选单克隆菌斑进行PCR验证，使用Linker1和Linker2序列两侧引物序列两侧引物(pQTEV3U：5′-TATAAAAATAGGCGTATCACGAGG-3′和pQTEV3L：5′-CCAGTGATTT TTTTCTCCAT TTT-3′)，退火温度59℃。

5、转化大肠杆菌后，经过抗性筛选，挑选转化子验证并测序，确证外源基因AtRbcX被克隆到pT7linker2载体中，命名为pT7linker2-AtRbcX。

五、根据要克隆外源基因的序列设计引物，以含有外源基因AtBSD2(序列15所示)的DNA分子为模板，利用引物进行扩增获得包含外源基因AtBSD2的片段将AtBSD2基因克隆进pT7linker2载体：

1、用引物(AtBSD2-T7linker2 for：atatacatatggcaatagctccggagaca，AtBSD2-T7linker2 rev：gccggatccttagaaagcgctctggaagcc)PCR扩增AtBSD2，得到序列15所示AtBSD2的扩增片段S。

2、将pT7linker 2载体和扩增片段S均用NdeI和BamHI酶切：2μL 10×NEBuffer，1μL NdeI和1μL BamH，500ng DNA并用ddH₂O补足至20μL，最终于37℃孵育2小时，并用gel回收试剂盒回收酶切后的pT7linker 2载体和扩增片段S。

3、用T4 DNA连接酶连接两个回收的酶切后的pT7linker 2载体和扩增片段S，得到终产物，连接体系同实施例2。

4、取2μL终产物转化E.coli DH5α，隔日挑选单克隆菌斑进行PCR验证，使用Linker1和Linker2序列两侧引物序列两侧引物(pQTEV3U：5′-TATAAAAATAGGCGTATCACGAGG-3′和pQTEV3L：5′-CCAGTGATTT TTTTCTCCAT TTT-3′)，退火温度59℃。

5、转化大肠杆菌后，经过抗性筛选，挑选转化子验证并测序，确证外源基因AtBSD2被克隆到pT7linker2载体中，命名为pT7linker2-AtBSD2。

六、多基因在pT7linker2载体中的串联，具体步骤如下：

1、取克隆有不同外源基因pT7linker2载体(pT7linker2-AtRaf1和pT7linker2-AtRaf2)各500ng，用10μL不同的限制性内切酶体系进行酶切，两个载体分别使用SwaI(25℃，1h)和PacI(37℃，1h)，获得SwaI酶切反应体系和PacI酶切反应体系。

2、将两个反应体系均于65℃孵育20分钟使SwaI或PacI失活，得到SwaI酶切DNA产物和PacI酶切DNA产物；各取5μL DNA产物，加入0.5μL T4 DNA聚合酶，2μL 10×NEBuffer2.1，对于SwaI酶切DNA产物加入100mM dGTP 0.5μL，对于PacI酶切DNA产物加入100mM dCTP0.5μL，并用ddH2O补足至20μL，最终于25℃孵育30分钟，得到经T4 DNA聚合酶处理过的两个反应体系。

3、将经T4 DNA聚合酶处理过的两个反应体系等体积混合，放入PCR仪中加热至65℃，并逐步降温至10℃，使SwaI酶切DNA产物和PacI酶切DNA产物通过退火连接在一起，得到终产物。

4、取2μL终产物转化E.coli DH5α，隔日挑选单克隆菌斑进行PCR验证，Linker1和Linker 2序列两侧引物序列两侧引物(pQTEV3U：5′-TATAAAAATAGGCGTATCACGAGG-3′和pQTEV3L：5′-CCAGTGATTT TTTTCTCCAT TTT-3′)，退火温度59℃。

验证阳性的克隆经测序确证后即为外源基因AtRaf1和AtRaf2的串联载体。重复以上4步将AtBSD2再串联到外源基因AtRaf1和AtRaf2的串联载体上，得到外源基因AtRaf1、AtRaf2和AtBSD2的串联载体。重复以上4步将AtRbcX再串联到外源基因AtRaf1、AtRaf2和AtBSD2的载体上，得到外源基因AtRaf1、AtRaf2、AtBSD2和AtRbcX的串联载体，得质粒3：pT7linker2-AtBSD2-AtRaf1-AtRaf2-AtRbcX2。

实施例4拟南芥Rubisco的合成

一、大肠杆菌MGM100

大肠杆菌MGM100购于The Coli Genetic Stock Centre(http:// cgsc2.biology.yale.edu/)，groES和groEL被整合到大肠杆菌基因组中，受到阿拉伯糖启动子pBAD的调控表达。大肠杆菌MGM100菌株为groE操纵子的启动子被阿拉伯糖诱导型的pBAD启动子所替代的一类菌株。groE操纵子上含有编码GroEL，GroES等细胞生长所必须的基因，因此在普通的LB培养基中，MGM100菌株无法生长。当培养基中存在阿拉伯糖时，MGM100可正常生长。

二、转化

1、将实施例1的质粒1：pTetlinker-AtRbcS-AtRbcL、实施例2的质粒2：pT7linker1-Cpn60α1β1/Cpn20和实施例3的质粒3：pT7linker2-AtBSD2-AtRaf1-AtRaf2-AtRbcX2通过电击转化法导入大肠杆菌MGM100中，涂布含相应的抗生素平板筛选，获取阳性单菌落，作为pCpn60/20组；将实施例1的质粒1：pTetlinker-AtRbcS-AtRbcL和实施例3的质粒3：pT7linker2-AtBSD2-AtRaf1-AtRaf2-AtRbcX2通过电击转化法导入大肠杆菌MGM100中，涂布含相应的抗生素平板筛选，获取阳性单菌落，作为eGroEL/ES组；

2、分别挑选上述两组的单菌落，接种至5ml LB液体培养基中(100mg/ml Kana⁺，100mg/ml Spe⁺，25mg/ml Chl⁺，0.02％阿拉伯糖)，37℃，200rpm培养至OD600约0.4；

3、分别加入阿拉伯糖至2.0％，加入1M IPTG至0.5mM的终浓度，37℃，200rpm，诱导3h；

4、分别取出菌液，1000g，室温离心10min，弃上清。并用新鲜的LB液体培养基悬浮菌液，1000g，室温离心10min，弃上清；

5、分别加入含相应抗生素的LB液体培养基，同时加入四环素至300ng/ul，23℃诱导20h；

6、分别收集菌液，用100μl的Rubisco assay buffer I(100mM Tris-Cl pH7.5，10mM KCl，2mM Mg(OAc)₂)悬浮菌液，超声取pCpn60/20组和eGroEL/ES组上清，进行后续酶活性测定和Western blot检测。其中，所述酶活性测定方法如下：

1、取15μl超声后菌液上清，同时15μl的Rubisco assay buffer I作为对照；

2.将上清加入Rubisco酶活测定反应体系Rubisco assay buffer II(Rubiscoassay buffer I 7.25μl，1M NaHCO₃ 0.75μl，1M MgCl₂ 1μl，NaH¹⁴CO₃ 1μl；其中，Rubiscoassay buffer I 20 mM MOPS-KOH(pH 7.5)，100mM KCL，5mM Mg(OAc)₂)：

3.加入5μl 25mM RuBP，混匀，室温反应5min；

4.加入10μl冰醋酸，终止反应；

5.打开离心管盖，移至预热到95℃的加热块，烘干1-2h；

6.加入100μl ddH₂O，涡旋，加入1ml闪烁液，液闪仪每个样品扫描1min。

所述Western blot检测：

1、取15μl菌液，加入5x SDS loading buffer，95℃变性失活5min。取10μl的样品装载在12％SDS-PAGE上电泳，200V，55min。

2、凝胶电泳结束后，将蛋白胶、硝化纤维膜、以及2张稍大于蛋白胶的滤纸浸泡在转膜缓冲液(50mM Tris，192mM Glycine，20％乙醇)5-10min。

3、按照滤纸、硝化纤维膜、胶、滤纸的顺序由下至上依次叠加起来，形成一个三明治结构。每次叠加用玻璃棒按一个方向滚动赶走残余的气泡，然后置于半干转膜仪中进行恒流转膜，电流大小为膜的长x宽x0.8mA，时间为1h，保护电压为20v。若有多张胶，其电流为各个电流和。

4、转膜结束后，将膜放入含有5％的脱脂奶粉的PBS缓冲液(137mM NaCl，2.68mMKCl，10mM Na₂HPO₄，1.47mM KH₂PO₄)中，室温慢速振荡封闭1h。

5、倒掉封闭液，加入新鲜的含有5％的脱脂奶粉的PBS缓冲液，再加入适量一抗拟南芥Rubisco抗体，置于摇床慢速振荡，室温孵育1h或者4℃过夜。

6、倒掉步骤4的反应液，用PBST缓冲液(137mM NaCl，2.68mM KCl，10mM Na₂HPO₄，1.47mM KH₂PO₄，0.1％Tween-20)冲洗3次，每次10min。

7、加入新鲜的含有5％的脱脂奶粉的PBS缓冲液和适量二抗，置于摇床慢速振荡，室温孵育1h。

8倒掉步骤6的反应液，用PBST缓冲液冲洗3次，每次10min。

9、打开LAS4000，待仪器稳定后，将ECL膜置于玻璃平板上，放入LAS4000内用白光调节焦距。设置好参数后，取1mL ECL显色液(100mM Tris-HCl pH 8.5，2.5mM Luminol)，加入7.5μL H₂O₂，混匀后用移液器均与涂布在硝化纤维膜上。选择合适程序进行曝光显影。

通过以上检测，结果显示：通过对诱导后产物中Rubisco活性测定及Western blot检测可获得Rubisco在产物中的相对含量，结果如图2所示：pCpn60/20组和eGroEL/ES组均能合成有活性的Rubisco，表明不仅分子伴侣系统Cpn60/20可合成有活性的Rubisco，GroEL/ES系统也同样可以，即在Rubisco合成系统中可无需额外导入携带GroEL/ES的载体，直接通过诱导MGM100菌株基因组上的GroEL/ES就可以有效合成拟南芥Rubisco，极大简化拟南芥Rubisco的体外合成体系，为后续改造Rubisco，获取高效Rubisco提供便利。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120> 大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES在协助合成植物Rubisco中的应用

<130> GNCFY192045

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3479

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gagtagggaa ctgccaggca tcaaataaaa cgaaaggctc agtcgaaaga ctgggccttt 60

cgttttatct gttgtttgtc ggtgaacgct ctcctgagta ggacaaatcc gccgggagcg 120

gatttgaacg ttgcgaagca acggcccgga gggtggcggg caggacgccc gccataaact 180

gccaggcatc aaattaagca gaaggccatc cgtcaggatg gcctttttgc gtttctacaa 240

actctgctag caagtaaggc cgacgagctt aattaacaac accatttgtc gaggttcgag 300

tccctatcag tgatagagat tgacatccct atcagtgata gagatactga gcacatcagc 360

aggacgcact gaccgaattc attaaattta actttaagaa ggagatatac atatgtagca 420

taaccctaat gagtgagcta acttacatta attgcgttgc gcccaataac tagcataacc 480

ccttggggcc tctaaacggg tcttgagggg ttttttgagt aacaacacca tttaaatgga 540

gtggttacaa atggagtggt taattaaggc tagcttggcg agacacagct aacaccacgt 600

cgtccctatc tgctgcccta ggtctatgag tggttgctgg ataactttac gggcatgcat 660

aaggctcgta ggctatattc agggagacca caacggtttc cctctacaaa taattttgtt 720

taactttgaa ataaggaggt aatacaaatg tctcgtttag ataaaagtaa agtgattaac 780

agcgcattag agctgcttaa tgaggtcgga atcgaaggtt taacaacccg taaactcgcc 840

cagaagctag gtgtagagca gcctacattg tattggcatg taaaaaataa gcgggctttg 900

ctcgacgcct tagccattga gatgttagat aggcaccata ctcacttttg ccctttagaa 960

ggggaaagct ggcaagattt tttacgtaat aacgctaaaa gttttagatg tgctttacta 1020

agtcatcgcg atggagcaaa agtacattta ggtacacggc ctacagaaaa acagtatgaa 1080

actctcgaaa atcaattagc ctttttatgc caacaaggtt tttcactaga gaatgcatta 1140

tatgcactca gcgctgtggg gcattttact ttaggttgcg tattggaaga tcaagagcat 1200

caagtcgcta aagaagaaag ggaaacacct actactgata gtatgccgcc attattacga 1260

caagctatcg aattatttga tcaccaaggt gcagagccag ccttcttatt cggccttgaa 1320

ttgatcatat gcggattaga aaaacaactt aaatgtgaaa gtgggtctta ataagcgact 1380

aaaaaattga atgtaggaaa ccaacatgcc agttcgagca ataactagca taaccccttg 1440

gggcctctaa acgggtcttg aggggttttt tgctgaacct caggcgagaa gcacacggca 1500

cggtcacact gcttccggta gtcaataaac cggtaaacca gcaatagaca taagcggcta 1560

tttaacgacc ctgccctgaa ccgacgaccg ggtcatcgtg gccggatctt gcggcccctc 1620

ggcttgaacg aattgttaga cattatttgc cgactacctt ggtgatctcg cctttcacgt 1680

agtggacaaa ttcttccaac tgatctgcgc gcgaggccaa gcgatcttct tcttgtccaa 1740

gataagcctg tctagcttca agtatgacgg gctgatactg ggccggcagg cgctccattg 1800

cccagtcggc agcgacatcc ttcggcgcga ttttgccggt tactgcgctg taccaaatgc 1860

gggacaacgt aagcactaca tttcgctcat cgccagccca gtcgggcggc gagttccata 1920

gcgttaaggt ttcatttagc gcctcaaata gatcctgttc aggaaccgga tcaaagagtt 1980

cctccgccgc tggacctacc aaggcaacgc tatgttctct tgcttttgtc agcaagatag 2040

ccagatcaat gtcgatcgtg gctggctcga agatacctgc aagaatgtca ttgcgctgcc 2100

attctccaaa ttgcagttcg cgcttagctg gataacgcca cggaatgatg tcgtcgtgca 2160

caacaatggt gacttctaca gcgcggagaa tctcgctctc tccaggggaa gccgaagttt 2220

ccaaaaggtc gttgatcaaa gctcgccgcg ttgtttcatc aagccttacg gtcaccgtaa 2280

ccagcaaatc aatatcactg tgtggcttca ggccgccatc cactgcggag ccgtacaaat 2340

gtacggccag caacgtcggt tcgagatggc gctcgatgac gccaactacc tctgatagtt 2400

gagtcgatac ttcggcgatc accgcttccc tcatactctt cctttttcaa tattattgaa 2460

gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata 2520

aacaaatagc tagctcactc ggtcgctacg ctccgggcgt gagactgcgg cgggcgctgc 2580

ggacacatac aaagttaccc acagattccg tggataagca ggggactaac atgtgaggca 2640

aaacagcagg gccgcgccgg tggcgttttt ccataggctc cgccctcctg ccagagttca 2700

cataaacaga cgcttttccg gtgcatctgt gggagccgtg aggctcaacc atgaatctga 2760

cagtacgggc gaaacccgac aggacttaaa gatccccacc gtttccggcg ggtcgctccc 2820

tcttgcgctc tcctgttccg accctgccgt ttaccggata cctgttccgc ctttctccct 2880

tacgggaagt gtggcgcttt ctcatagctc acacactggt atctcggctc ggtgtaggtc 2940

gttcgctcca agctgggctg taagcaagaa ctccccgttc agcccgactg ctgcgcctta 3000

tccggtaact gttcacttga gtccaacccg gaaaagcacg gtaaaacgcc actggcagca 3060

gccattggta actgggagtt cgcagaggat ttgtttagct aaacacgcgg ttgctcttga 3120

agtgtgcgcc aaagtccggc tacactggaa ggacagattt ggttgctgtg ctctgcgaaa 3180

gccagttacc acggttaagc agttccccaa ctgacttaac cttcgatcaa accacctccc 3240

caggtggttt tttcgtttac agggcaaaag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa 3300

gatcctttga tcttttctac tgaaccgctc tagatttcag tgcaatttat ctcttcaaat 3360

gtagcacctg aagtcagccc catacgatat aagttgtaat tctcatgtta gtcatgcccc 3420

gcgcccaccg gaaggagctg actgggttga aggctctcaa gggcatcggt cgagatccc 3479

<210> 2

<211> 2154

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gagtagggaa ctgccaggca tcaaataaaa cgaaaggctc agtcgaaaga ctgggccttt 60

cgttttatct gttgtttgtc ggtgaacgct ctcctgagta ggacaaatcc gccgggagcg 120

gatttgaacg ttgcgaagca acggcccgga gggtggcggg caggacgccc gccataaact 180

gccaggcatc aaattaagca gaaggccatc cgtcaggatg gcctttttgc gtttctacaa 240

actctgctag caagtaaggc cgactcgagt ccctatcagt gatagagatt gacatcccta 300

tcagtgatag agatactgag cacatcagca ggacgcactg accgaattca ttaaatttaa 360

ctttaagaag gagatataca tatgcgtaaa ggtgaagaac tgttcaccgg tgttgttccg 420

atcctggttg aactggacgg tgacgttaac ggtcacaaat tctctgttcg tggtgaaggt 480

gaaggtgacg ctaccaacgg taaactgacc ctgaaattca tctgcaccac cggtaaactg 540

ccggttccgt ggccgaccct ggttaccacc ctgacctacg gtgttcagtg cttcgctcgt 600

tacccggacc acatgaaaca gcacgacttc ttcaaatctg ctatgccgga aggttacgtt 660

caggaacgta ccatctcttt caaagacgac ggtacctaca aaacccgtgc tgaagttaaa 720

ttcgaaggtg acaccctggt taaccgtatc gaactgaaag gtatcgactt caaagaagac 780

ggtaacatcc tgggtcacaa actggaatac aacttcaact ctcacaacgt ttacatcacc 840

gctgacaaac agaaaaacgg tatcaaagct aacttcaaaa tccgtcacaa cgttgaagac 900

ggttctgttc agctggctga ccactaccag cagaacaccc cgatcggtga cggtccggtt 960

ctgttgccgg acaaccacta cctgtctacc cagtctgttc tgtctaaaga cccgaacgaa 1020

aaacgtgacc acatggttct gctggaattc gttaccgctg ctggtatcac ccacggtatg 1080

gacgaactgt acaaagatgc atgccagttc tagcataacc ctaatgagtg agctaactta 1140

cattaattgc gttgcgcctt aattaacggc actcctcagc aaatataatg accctcttga 1200

taacccaaga gggcattttt taatgcccat ggcgtttacc acagctaaca ccacgtcgtc 1260

cctatctgct gccctaggtc tatgagtggt tgctggataa ctttacgggc atgcataagg 1320

ctcgtaggct atattcaggg agaccacaac ggtttccctc tacaaataat tttgtttaac 1380

tttgaaataa ggaggtaata caaatgtctc gtttagataa aagtaaagtg attaacagcg 1440

cattagagct gcttaatgag gtcggaatcg aaggtttaac aacccgtaaa ctcgcccaga 1500

agctaggtgt agagcagcct acattgtatt ggcatgtaaa aaataagcgg gctttgctcg 1560

acgccttagc cattgagatg ttagataggc accatactca cttttgccct ttagaagggg 1620

aaagctggca agatttttta cgtaataacg ctaaaagttt tagatgtgct ttactaagtc 1680

atcgcgatgg agcaaaagta catttaggta cacggcctac agaaaaacag tatgaaactc 1740

tcgaaaatca attagccttt ttatgccaac aaggtttttc actagagaat gcattatatg 1800

cactcagcgc tgtggggcat tttactttag gttgcgtatt ggaagatcaa gagcatcaag 1860

tcgctaaaga agaaagggaa acacctacta ctgatagtat gccgccatta ttacgacaag 1920

ctatcgaatt atttgatcac caaggtgcag agccagcctt cttattcggc cttgaattga 1980

tcatatgcgg attagaaaaa caacttaaat gtgaaagtgg gtcttaataa gcgactaaaa 2040

aattgaatgt aggaaaccaa catgccagtt cgagcaataa ctagcataac cccttggggc 2100

ctctaaacgg gtcttgaggg gttttttgct gaacctcagg cgagaagcac acgg 2154

<210> 3

<211> 402

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgtgcatga aggtgtggcc accaattgga aagaagaagt ttgagactct atcttacctc 60

cctgacctta gtgacgtcga attggctaag gaagttgact accttctccg caacaagtgg 120

attccttgtg ttgaattcga gttagaggta ataaacacaa aacacggatt tgtgtaccgt 180

gagcacggaa acactcccgg atactacgat ggacggtact ggacaatgtg gaagcttcca 240

ttgttcggat gcaccgactc cgctcaagtg ttgaaggaag ttgaagaatg caagaaggag 300

tacccgggcg ccttcattag gatcatcgga ttcgacaaca cccgtcaagt ccaatgcatc 360

agtttcattg cctacaagcc cccaagcttc accgaagctt aa 402

<210> 4

<211> 1440

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgtcaccac aaacagagac taaagcaagt gttgggttca aagctggtgt taaagagtat 60

aaattgactt actatactcc tgaatatgaa accaaggata ctgatatctt ggcagcattc 120

cgagtaactc ctcaacctgg agttccacct gaagaagcag gggctgcggt agctgctgaa 180

tcttctactg gtacatggac aactgtgtgg accgatgggc ttaccagcct tgatcgttac 240

aaaggacgat gctaccacat cgagcccgtt ccaggagaag aaactcaatt tattgcgtat 300

gtagcttatc ccttagacct ttttgaagaa ggttcggtta ctaacatgtt tacctcgatt 360

gtgggtaatg tatttgggtt caaagccctg gctgctctac gtctagagga tctgcgaatc 420

cctcctgctt atactaaaac tttccaagga ccacctcatg gtatccaagt tgaaagagat 480

aaattgaaca agtatggacg tcccctatta ggatgtacta ttaaaccaaa attggggtta 540

tccgcgaaaa actatggtag agcagtttat gaatgtctac gtggtggact tgattttacc 600

aaagatgatg agaatgtgaa ctcccaacca tttatgcgtt ggagagaccg tttcttattt 660

tgtgccgaag ctatttataa atcacaggct gaaacaggtg aaatcaaagg gcattatttg 720

aatgctactg cgggtacatg cgaagaaatg atcaaaagag ctgtatttgc cagagaattg 780

ggagttccta tcgtaatgca tgactactta acagggggat tcaccgcaaa tactagtttg 840

tctcattatt gccgagataa tggcctactt cttcacatcc accgtgcaat gcacgctgtt 900

attgatagac agaagaatca tggtatgcac ttccgtgtac tagctaaagc tttacgtcta 960

tctggtggag atcatattca cgcgggtaca gtagtaggta aacttgaagg agacagggag 1020

tcaactttgg gctttgttga tttactgcgc gatgattatg ttgaaaaaga tcgaagccgc 1080

ggtatctttt tcactcaaga ttgggtctca ctacctggtg ttctgcctgt ggcttcaggg 1140

ggtattcacg tttggcatat gcctgctttg accgagatct ttggagatga ttctgtacta 1200

caattcggtg gaggaacttt aggccaccct tggggaaatg caccgggtgc cgtagccaac 1260

cgagtagctc tggaagcatg tgtacaagct cgtaatgagg gacgtgatct tgcagtcgag 1320

ggtaatgaaa ttatccgtga agcttgcaaa tggagtcctg aactagctgc tgcttgtgaa 1380

gtatggaaag agatcacatt taacttccca accatcgata aattagatgg ccaagagtag 1440

<210> 5

<211> 203

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa ttcccctcta gaaataattt 60

tgtttaactt taagaaggag atatacatat gggatccggc tgctaacaaa gcccgaaagg 120

aagctgagtt ggctgctgcc accgctgagc aataactagc ataacccctt ggggcctcta 180

aacgggtctt gaggggtttt ttg 203

<210> 6

<211> 230

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gagcggataa caatttcaca cagaattcat taaagaggag aaattaacta tgggatccca 60

tatggcggcg gtcgacgcgg ccgcctagga cccagctttc ttgtacaaag tggtaagctt 120

aattagctga gcttggactc ctgttgatag atccagtaat gacctcagaa ctccatctgg 180

atttgttcag aacgctcggt tgccgccggg cgttttttat tggtgagaat 230

<210> 7

<211> 4587

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agtaacaaca ccatttaaat ggagtggtta caaatggagt ggttaattaa ggctagcttg 60

gcgagatttt caggagctaa ggaagctaaa atggagaaaa aaatcactgg atataccacc 120

gttgatatat cccaatggca tcgtaaagaa cattttgagg catttcagtc agttgctcaa 180

tgtacctata accagaccgt tcagctggat attacggcct ttttaaagac cgtaaagaaa 240

aataagcaca agttttatcc ggcctttatt cacattcttg cccgcctgat gaatgctcat 300

ccggaatttc gtatggcaat gaaagacggt gagctggtga tatgggatag tgttcaccct 360

tgttacaccg ttttccatga gcaaactgaa acgttttcat cgctctggag tgaataccac 420

gacgatttcc ggcagtttct acacatatat tcgcaagatg tggcgtgtta cggtgaaaac 480

ctggcctatt tccctaaagg gtttattgag aatatgtttt tcgtctcagc caatccctgg 540

gtgagtttca ccagttttga tttaaacgtg gccaatatgg acaacttctt cgcccccgtt 600

ttcaccatgg gcaaatatta tacgcaaggc gacaaggtgc tgatgccgct ggcgattcag 660

gttcatcatg ccgtttgtga tggcttccat gtcggcagaa tgcttaatga attacaacag 720

tactgcgatg agtggcaggg cggggcgtaa tttttttaag gcagttattg gtgcccttaa 780

acgcctgggg taatgactct ctagcttgag gcatcaaata aaacgaaagg ctcagtcgaa 840

agactgggcc tttcgtttta tctgttgttt gtcggtgaac gctctcctga gtaggacaaa 900

tccgccctct agattacgtg cagtcgatga taagctgtca aacatgagaa ttgtgcctaa 960

tgagtgagct aacttacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac 1020

ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt 1080

gggcgccagg gtggtttttc ttttcaccag tgagacgggc aacagctgat tgcccttcac 1140

cgcctggccc tgagagagtt gcagcaagcg gtccacgctg gtttgcccca gcaggcgaaa 1200

atcctgtttg atggtggtta acggcgggat ataacatgag ctgtcttcgg tatcgtcgta 1260

tcccactacc gagatatccg caccaacgcg cagcccggac tcggtaatgg cgcgcattgc 1320

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catttgcatg gtttgttgaa aaccggacat ggcactccag tcgccttccc gttccgctat 1440

cggctgaatt tgattgcgag tgagatattt atgccagcca gccagacgca gacgcgccga 1500

gacagaactt aatgggcccg ctaacagcgc gatttgctgg tgacccaatg cgaccagatg 1560

ctccacgccc agtcgcgtac cgtcttcatg ggagaaaata atactgttga tgggtgtctg 1620

gtcagagaca tcaagaaata acgccggaac attagtgcag gcagcttcca cagcaatggc 1680

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cacgcggttg ggaatgtaat tcagctccgc catcgccgct tccacttttt cccgcgtttt 1980

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gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat 2580

ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca 2640

ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc 2700

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aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg 2820

gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta 2880

ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg 2940

ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac 3000

acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag 3060

gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat 3120

ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat 3180

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ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct 3360

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ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc 3480

gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac 3540

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tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa 3960

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gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt 4080

taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc 4140

tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta 4200

ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa 4260

taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca 4320

tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac 4380

aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgtctaa gaaaccatta 4440

ttatcatgac attaacctat aaaaataggc gtatcacgag gccctttcgt cttcacctcg 4500

agcttaatta acaacaccat ttgtcgagaa atcataaaaa atttatttgc tttgtgagcg 4560

gataacaatt ataatagatt caattgt 4587

<210> 8

<211> 1632

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgagagcta atgtaaagga aatagctttt gaccagcact ctagagctgc tctacaagct 60

ggtattgata agcttgctga ttgtgttggt ctcactcttg gccctagagg gaggaatgtt 120

gtgttggatg aatttggaag tcctaaggtt gtgaatgatg gagtcaccat tgctagagct 180

attgagttac ctaatgccat ggaaaatgct ggtgcagcgc ttattcgtga ggttgcgagt 240

aagactaatg actctgctgg tgatgggaca accactgcgt ctatccttgc tcgggagata 300

atcaaacatg gattgttgag cgtcacttct ggtgcgaatc ccgtttcact caagagggga 360

attgataaga ctgttcaagg tctgatcgaa gagcttcaga agaaagctag gcccgtgaaa 420

ggtcgtgatg acatcagagc tgtggcttct atctctgctg gaaatgatga ccttataggg 480

tcaatgattg ctgatgccat cgacaaagtt ggacctgatg gtgttttgtc cattgaatct 540

tcatcttctt ttgagaccac ggtcgaagtt gaagaaggga tggagattga cagaggttac 600

atctcgcctc agtttgttac aaaccctgag aaactactag ctgagtttga gaatgctagg 660

gtattgatca ctgatcagaa gatcactgcg atcaaagaca tcatccctat tttggagaag 720

accactcagc ttcgtgctcc gttgttgatt attgcagagg atgttactgg tgaagcctta 780

gctacccttg tcgtgaacaa gcttcgtggt gtcctcaatg ttgttgccgt taaagcgcca 840

ggatttggag aaagaagaaa agccatgctt caagatattg caatcttgac aggagctgag 900

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gcccgaaaag tcacgattag caaagattcg actaccctca ttgcagatgc agcttccaag 1020

gacgaattac aagctcggat tgctcagctg aagaaagaac tattcgagac tgattctgtg 1080

tatgactcag agaagctcgc tgagagaatt gcgaagctat ctggaggtgt tgctgtcatt 1140

aaagtcggag cagcaactga aactgagctt gaggaccgta agcttcgtat cgaggatgca 1200

aagaacgcaa catttgctgc tatcgaggaa ggcatagttc caggtggtgg tgctgctttg 1260

gtgcatctct ccactgttat tcccgccatt aaggagactt ttgaggatgc tgatgaacgt 1320

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caggccattg ttgttgacaa accgaaaccc aaggctcctg ctgctgctgc tcctgagggt 1620

ctcatggtgt aa 1632

<210> 9

<211> 1644

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atggcagcaa aggaattaca tttcaacaaa gatgggacta ccattaggag acttcaagct 60

ggtgtcaaca agctcgcaga tcttgttggt gttacacttg gacccaaagg acgaaatgtt 120

gttcttgaga gcaagtatgg atcaccacga attgttaatg atggtgtgac tgttgcaaga 180

gaggttgagt tggaagaccc ggttgagaac attggcgcta agcttgtgag gcaagcggct 240

gccaaaacca atgacttggc tggtgacggt acaacaacat ctgttgttct tgcacaaggt 300

tttatcgctg agggtgtcaa ggtggtagct gctggtgcaa accctgtttt gatcaccaga 360

ggtattgaga agacagcaaa ggctttggtt accgagctca agaaaatgtc taaggaggtt 420

gaagacagtg aacttgcaga tgttgcagct gttagtgcgg gtaacaacga cgaaattgga 480

aatatgattg ctgaagcaat gagcaaagtg ggcaggaaag gtgtggtgac ccttgaggag 540

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ttacttctcg ttgacaagaa aattaccaat gcaagggatc ttgttggtgt tttggaggat 720

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gggtttggag agcgcaagag ccaatacctt gatgatattg ccattctaac tggagcaact 900

gtgatccgtg aggaagttgg tctttcactt gacaaagctg gaaaagaggt tcttggtaat 960

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cttcgtcttg cttccaaggt tgatgccatt aaagccacgc ttgataatga tgaagaaaag 1320

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ggttacaatg ctgcaaccgg caagtacgag gatttgatgg ctgcaggaat catcgatcca 1500

acaaaggttg tgagatgttg cttggaacac gcagcttcgg ttgcaaagac tttcttgatg 1560

tcggactgcg ttgttgttga gatcaaggaa cctgaaccag ttcccgtcgg caacccaatg 1620

gacaactcag gatatggata ctaa 1644

<210> 10

<211> 612

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atggcttctg ttgttgcccc taagtatact tcaattaagc cattgggaga tcgagttttg 60

gtgaagatca aggaggcaga ggagaagact ttaggtggta tcttacttcc atccactgct 120

caatcaaaac ctcaaggagg tgaagtcgtt gccgtgggtg aaggaagaac tattgggaag 180

aacaaaattg atatcactgt ccctactgga gcacaaatta tctactccaa atacgcagga 240

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gttgctgagg cggaggagaa aacagctgga gggttgttgt taaccgagac taccaaagag 420

aagccttcta ttggcacggt gatagcagtt ggaccgggtt ccctagacga ggaaggtaaa 480

attacgcctc taccagtatc aaccggaagc acagtacttt actccaagta tgctggtaac 540

gacttcaagg gcaaagatgg ttccaactac attgccctca gagcttcaga tgtgatggct 600

atactttctt ag 612

<210> 11

<211> 1170

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atgcaacagc tctaccaacc gttccgacca ccgtcatctc ccattccaac ccaattccgt 60

tcactcgact ccgccggtaa aatcgaaatc ctcgccggtc gaatggctct ctggttcgaa 120

tacgcacctc ttatctcttc tctttacacc gatggtttca ctcctccaac catcgaagaa 180

ctcaccggaa tctcaagcat cgaacagaac cgtttaatcg tcggtgcgca agttcgtgac 240

tcaattcttc aatctatcca tgaaccggag ctcatttctg cgttcgacac cggtggtgca 300

gagcttctat acgaaattcg tctccttagc accacgcagc gtgttgcagc cgccacattc 360

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tatcctaacc gtcgtggaga cgttggatgg ttggattttg attacaactt accaggagat 480

tgtctttcat tcttgtatta caggcagagc agagagaata agaatccatc ggatcagaga 540

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aacacagagc tatacgggga caaggaagca gagaaggaga aggagaagaa gaagaaggaa 660

gaggaagtca aagctattcg gattccagtg gtgaggctta agtttggaga agtagcagaa 720

gcgacctcgg tggtagtttt accggtttgt aaagcagagg aaggggaaaa gaagattctt 780

gaagctccaa tggagatcat agccggaggg gattttaagg tggttgaggc ggagaaagga 840

tggaagagat gggtagtgct tccgtcgtgg aacccagtgg cagccattgg gaaaggcggt 900

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ttactggtag tggccgatag ggtgaggaat gttgtggagg ctgatgacgg gtattatctc 1020

gtggtggctg agaacggact taagctagag aaaggatcag atttgaaggc gagagaggtg 1080

aaggagagtt tagggatggt tgttttggtg gtgaggccgc caagagaaga tgatgatgat 1140

tggcagacaa gtcatcagaa ctgggactga 1170

<210> 12

<211> 2565

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cacggtcaca ctgcttccgg tagtcaataa accggtaaac cagcaataga cataagcggc 60

tatttaacga ccctgccctg aaccgacgac cgggtcgaat ttgctttcga atttctgcca 120

ttcatccgct tattatcact tattcaggcg tagcaccagg cgtttaaggg caccaataac 180

tgccttaaaa aaattacgcc ccgccctgcc actcatcgca gtactgttgt aattcattaa 240

gcattctgcc gacatggaag ccatcacaga cggcatgatg aacctgaatc gccagcggca 300

tcagcacctt gtcgccttgc gtataatatt tgcccatggt gaaaacgggg gcgaagaagt 360

tgtccatatt ggccacgttt aaatcaaaac tggtgaaact cacccaggga ttggctgaga 420

cgaaaaacat attctcaata aaccctttag ggaaataggc caggttttca ccgtaacacg 480

ccacatcttg cgaatatatg tgtagaaact gccggaaatc gtcgtggtat tcactccaga 540

gcgatgaaaa cgtttcagtt tgctcatgga aaacggtgta acaagggtga acactatccc 600

atatcaccag ctcaccgtct ttcattgcca tacggaattc cggatgagca ttcatcaggc 660

gggcaagaat gtgaataaag gccggataaa acttgtgctt atttttcttt acggtcttta 720

aaaaggccgt aatatccagc tgaacggtct ggttataggt acattgagca actgactgaa 780

atgcctcaaa atgttcttta cgatgccatt gggatatatc aacggtggta tatccagtga 840

tttttttctc cattttagct tccttagctc ctgaaaatct cgataactca aaaaatacgc 900

ccggtagtga tcttatttca ttatggtgaa agttggaacc tcttacgtgc cgatcaacgt 960

ctcattttcg ccaaaagttg gcccagggct tcccggtatc aacagggaca ccaggattta 1020

tttattctgc gaagtgatct tccgtcacag gtatttattc ggcgcaaagt gcgtcgggtg 1080

atgctgccaa cttactgatt tagtgtatga tggtgttttt gaggtgctcc agtggcttct 1140

gtttctatca gctgtccctc ctgttcagct actgacgggg tggtgcgtaa cggcaaaagc 1200

accgccggac atcagcgcta gcggagtgta tactggctta ctatgttggc actgatgagg 1260

gtgtcagtga agtgcttcat gtggcaggag aaaaaaggct gcaccggtgc gtcagcagaa 1320

tatgtgatac aggatatatt ccgcttcctc gctcactgac tcgctacgct cggtcgttcg 1380

actgcggcga gcggaaatgg cttacgaacg gggcggagat ttcctggaag atgccaggaa 1440

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taaagatacc aggcgtttcc ccctggcggc tccctcgtgc gctctcctgt tcctgccttt 1620

cggtttaccg gtgtcattcc gctgttatgg ccgcgtttgt ctcattccac gcctgacact 1680

cagttccggg taggcagttc gctccaagct ggactgtatg cacgaacccc ccgttcagtc 1740

cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggaaa gacatgcaaa 1800

agcaccactg gcagcagcca ctggtaattg atttagagga gttagtcttg aagtcatgcg 1860

ccggttaagg ctaaactgaa aggacaagtt ttggtgactg cgctcctcca agccagttac 1920

ctcggttcaa agagttggta gctcagagaa ccttcgaaaa accgccctgc aaggcggttt 1980

tttcgttttc agagcaagag attacgcgca gaccaaaacg atctcaagaa gatcatctta 2040

ttaatcagat aaaatatttc tagatttcag tgcaatttat ctcttcaaat gtagcacctg 2100

aagtcagccc catacgatat aagttgtaat tctcatgttt gacagcttat catcgataag 2160

ctttaatgcg gtagtttatc acagttaaat tgctaacgca gtcaggcacc gtgtatgaaa 2220

tctaacaatg cgctcatcgt catcctcggc accgtcaccc tggatgctgt aggcataggc 2280

ttggttatgc cggtactgcc gggcctcttg cgggatatcg tccattccga cagcatcgcc 2340

agtcactatg gcgtgctgct agcgctatat gcgttgatgc aatttctatg cgcacccgtt 2400

ctcggagcac tgtccgaccg ctttggccgc cgcccagtcc tgctcgcttc gctacttgga 2460

gccactatcg actacgcgat catggcgacc acacccgtcc tgtggatcct ctacgccgga 2520

cgcatcgtgg ccggcatcac cggcgccaca ggtgcggttg ctggc 2565

<210> 13

<211> 516

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atgtctaatc tggcgcagga ttttcttggt gacttcggag ctcgtgaccc ttacccggag 60

gagatagcga gtcaattcgg agataaagtg ttgggatgcc aaagcactga gcacaagatt 120

ttgataccaa acgcatctgt tttgtctctc tcccagcttc agtgttcccc tgtttcgtct 180

tcacagcctc ctttgtccgg cgatgatgcc agaactctcc tccacaaggt tttgggatgg 240

agtatagtgg ataatgaagc gggtggtctg aaaataaggt gtatgtggaa agtgagggat 300

tttgggtgcg gtgttgaact cataaacagg atccataagg ttgctgaagc ttctggtcat 360

tacccttctc ttcacttgga aagtcctacc caagttcgag ctgaactatt tacctcttct 420

atcggagggt tgagcatgaa tgatttcata atggcggcta aaatagatga tatcaagact 480

tctgatcttt cccctaggaa aagagcttgg gcgtga 516

<210> 14

<211> 429

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atggtatcga gaattgcgaa tcgaaagagc aaaaagctct tgattgtgaa tgaggatgtt 60

gctggtaatt acgacgatac cttcggtgat gtacaaaagc aaattgttaa ttattttaca 120

tacaaagctg tgaggacggt tcttcatcag ctgtacgaaa tgaatcctcc tcaatacact 180

tggttctata atcatatcat aacaaacaga ccgacggatg gcaaacgttt cctccgtgcc 240

ctcggcaagg agagtcagga gcttgcagaa agagtgatga tcacgcgtct tcacttgtat 300

ggcaaatgga tcaagaaatg cgaccatggg aagatatacc aggaaatatc ggatgaaaac 360

ttggcgttga tgcgtgaacg cctgatggag accgtgatat ggccttccga tgacacaaac 420

tcaaggtaa 429

<210> 15

<211> 246

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atggccgcaa acaataatcc tcagggcact aaaccaaaca gtttagtttg tgcaaattgt 60

gaaggggaag gttgtgtggc atgttctcaa tgcaaaggag gtggtgtgaa tttgattgat 120

catttcaatg gtcagtttaa agctggtgca ctctgttggc tttgcagagg taaaaaggag 180

gtgttgtgtg gggactgcaa tggagctggt ttcattggtg ggttcttgag caccttcgat 240

gagtag 246

<210> 16

<211> 1638

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

atggctgcca aggatattcg tttcggtgaa gacgcccgcg cccgcatggt ccgcggcgtg 60

aacgtgctcg ccaacgccgt caaggcgacc ctgggcccga agggccgcaa cgtcgtgctc 120

gagaagagct tcggcgcccc gacgatcacc aaggacggcg tgtccgtcgc caaggagatc 180

gaactggccg acaagttcga gaacatgggc gcgcagatgg tcaaggaagt cgcttccaag 240

acctccgaca acgccggcga cggcaccacc accgccaccg tgctggccca ggccctgatc 300

cgcgagggca tgaaggccgt ggccgccggc atgaacccga tggacctcaa gcgcggcatc 360

gacaaggccg tcacctcggc cgtcgaggag ctgaagaaga tctccaagcc ctgctcgacc 420

agcaaggaga tcgcccaggt cggttcgatc tcggccaact ccgacaccga catcggcgag 480

ctgatcgcca aggccatgga caaggtcggc aaggaaggcg tgatcaccgt cgaggagggc 540

tcgggcctgg agaacgagct cgacgtcgtc gagggcatgc agttcgaccg cggctacctg 600

tcgccgtact tcatcaacaa cccgcagtcg atgcaggccg agctggagga tccgttcatc 660

ctgctgcacg acaagaagat ctcgaacgtc cgcgacctgc tgccgatcct cgagggcgtg 720

gccaaggccg gcaagccgct gctgatcgtc gccgaggacg tcgagggcga ggcgctggcc 780

acgctggtgg tcaacaccat ccgcggcatc gtgaaggtct gcgcggtcaa ggccccgggc 840

ttcggcgacc gccgcaaggc gatgctggag gacatggcca tcctcaccgg tggcaccgtg 900

atctccgagg aagtcggcct ctcgctcgag aaggcgacca tcaacgacct cggccgcgcg 960

aagaaggtgc aggtctcgaa ggagaacacc accatcatcg acggcgccgg cgacaccgcg 1020

gacatcgaag cccgcatcaa gcagatcaag gcgcagatcg aggagaccac ctcggactac 1080

gaccgcgaga agctgcagga gcgcgtggcc aagctggccg ggggcgttgc ggtgatcaag 1140

gtcggcgccg ccaccgaagt cgagatgaag gaaaagaagg cgcgcgtcga agacgccctg 1200

catgccaccc gtgcggcggt cgaggaaggc atcgtcccgg gcggcggcgt cgccctgatc 1260

cgtgccaagg ccgcgatcgc cgagctgaag ggcgccaacg aggaccagaa ccacggcatc 1320

gcgatcgccc tgcgcgcgat ggaagccccg ctgcgcgaga tcgtcaccaa cgccggcgac 1380

gagccgagcg tggtgctgaa ccgcgtcgcc gaaggcaccg gcgcgttcgg ctacaacgcc 1440

gccaacggcg agttcggcga catgatcgag ttcggcatcc tggacccgac caaggtcacg 1500

cgctccgcgc tgcagaacgc ggcgtccatc gccggcctga tgatcaccac cgaagcgatg 1560

gtggccgaag cgccgaagaa ggaagagccg gccgctccgg gcggcggcat gggcggcatg 1620

ggcggcatgg atttctaa 1638

<210> 17

<211> 291

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

atgtccaata tcaagccgct gcacgaccgc gtggtcatca agcgcatgga agaagagaag 60

ctgtccgccg gcgggatcgt gatcccggat tcggccaccg agaagccgat caagggcgaa 120

gtcgtcgccg tcggcaccgg caaggtgctg gacaacggcc aggtccgcgc gccgcaggtc 180

aaggtcggcg acaaggtgct gttcggcaag tacagcggca ccgaagtgaa gctggacggc 240

gtcgagctgc tggtggtgaa ggaagacgac ctgttcgcga tcctcggctg a 291

Claims (10)

1.大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES的相关生物材料在生物合成植物Rubisco中的应用；所述大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES由GroEL蛋白和GroES蛋白组成，所述大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES的相关生物材料为如下任一所述：

A1)所述GroEL蛋白和所述GroES蛋白；所述GroEL蛋白为序列16所示的核酸分子编码的蛋白质，所述GroES蛋白为序列17所示的核酸分子编码的蛋白质；

A2)编码A1)所述蛋白质的核酸分子；

A3)含有A2)所述核酸分子的表达盒；

A4)含有A2)所述核酸分子的重组载体，或含有A3)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A2)所述核酸分子的重组微生物，或含有A3)所述表达盒的重组微生物；含有A4)所述重组载体的重组微生物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述A2)中编码所述GroEL蛋白的核酸分子为序列16所示，编码所述GroES蛋白的核酸分子为序列17所示。

3.权利要求1中所述的大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES相关生物材料和植物分子伴侣的相关生物材料在生物合成植物Rubisco中的应用，

所述植物分子伴侣由Raf1、Raf2、RbcX2和BSD2蛋白组成，所述植物分子伴侣的相关生物材料为如下任一所述：

B1)所述Raf1蛋白、所述Raf2蛋白、所述RbcX2蛋白和所述BSD2蛋白；所述Raf1蛋白为序列11所示的核酸分子编码的蛋白质，所述Raf2蛋白为序列13所示的核酸分子编码的蛋白质，所述RbcX2蛋白为序列14所示的核酸分子编码的蛋白质，所述BSD2蛋白为序列15所示的核酸分子编码的蛋白质；

B2)编码B1)所述蛋白质的核酸分子；

B3)含有B2)所述核酸分子的表达盒；

B4)含有B2)所述核酸分子的重组载体，或含有B3)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B2)所述核酸分子的重组微生物，或含有B3)所述表达盒的重组微生物；含有A4)所述重组载体的重组微生物。

4.含有编码权利要求1中所述的大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES的核酸分子的大肠杆菌在生物合成植物Rubisco中的应用。

5.含有编码权利要求1中所述的大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES的核酸分子的大肠杆菌和表达权利要求3中所述的植物分子伴侣的载体在生物合成植物Rubisco中的应用。

6.一种生物合成植物Rubisco的产品，其特征在于：所述产品为权利要求1中所述的大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES的相关生物材料。

7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于：所述产品还包括权利要求3中所述的植物分子伴侣的相关生物材料。

8.生物合成植物Rubisco的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将编码权利要求3中所述的植物分子伴侣的核酸分子和植物Rubisco的大亚基基因和小亚基基因导入到含有编码权利要求1中所述的大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES的核酸分子的大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌，对重组大肠杆菌进行诱导培养，完成植物Rubisco的生物合成。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述诱导培养为利用阿拉伯糖进行诱导培养。

10.根据权利要求4或5所述的应用，或，权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述含有编码权利要求1中所述的大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES的核酸分子的大肠杆菌为大肠杆菌MGM100。

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