CN1272550A - 天然折叠和分泌型蛋白质的制备方法 - Google Patents

天然折叠和分泌型蛋白质的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1272550A
CN1272550A CN00105974A CN00105974A CN1272550A CN 1272550 A CN1272550 A CN 1272550A CN 00105974 A CN00105974 A CN 00105974A CN 00105974 A CN00105974 A CN 00105974A CN 1272550 A CN1272550 A CN 1272550A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gly
ala
ser
leu
glu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN00105974A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1231594C (zh
Inventor
多萝特·安布罗修斯
赖纳·鲁道夫
约尔格·舍夫纳
伊丽莎白·施瓦茨
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=8237962&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN1272550(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of CN1272550A publication Critical patent/CN1272550A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1231594C publication Critical patent/CN1231594C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6456—Plasminogen activators
    • C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
    • C07K1/1133—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by redox-reactions involving cystein/cystin side chains
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/848—Escherichia
    • Y10S435/849—Escherichia coli
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/874—Pseudomonas
    • Y10S435/877—Pseudomonas putida

Abstract

一种通过培养原核生物的细胞生产一种通过二硫键连接二个或几个半胱氨酸的、水溶性的、天然折叠真核多肽的方法,a)其中所说的原核细胞含有编码所说的在N－末端含有原核生物的信号序列的多肽的一个表达载体,b)在多肽分泌到周质或培养基中的条件下,c)切除信号序列,并从周质或培养基中分离该多肽。其中该培养是在有精氨酸或通式(Ⅰ)的一种化合物存在下进行的R2－CO－NRR1(Ⅰ)其中R和R1代表氢或一种饱和的或不饱和的支链或直链C1－C4烷基链和R2代表氢、NHR1或饱和的或不饱和的支或直链C1－C3烷基链,该方法适于用原核生物以高产率重组生产多肽。

Description

天然折叠和分泌型蛋白质的制备方法
本发明涉及一种在原核细胞中表达之后生产水溶性、天然折叠和分泌型多肽的方法。
在原核生物中蛋白质的合成，也称之为转译，发生在细胞质中的核糖体上。当重组DNA在原核生物寄主中表达时，通常需要将这一过程中得到的重组基因产物或蛋白质从细胞质通过细菌内膜分泌到内、外膜之间的周质间隙中。例如，用渗透压休克的方法，分泌型蛋白质能够从周质释放到培养基中。这种方法的一个缺点是该外泌型多肽常常不能形成天然的、有生物学活性的结构(Hockney，TIBTECH 12(1994)456-463；Baynex，Curr.Opin.Biotechnol，10(1999)411-421)。
近来，分子伴侣和折叠催化剂，诸如肽基-脯氨酰基-顺/反式异构酶或蛋白质二硫化物异构酶(Glockshuber etal.，EP-A0510658)被用于提高在体内折叠时天然重组蛋白质的得率(Thomas et al.，Appl.Biochem.Biotechnol.66(1997)197-238)。在某些情况下，这可极大地改进蛋白质的表达，例如，核酮糖二磷酸羧化酶(RUBISCO；Goloubinoffet al.，Nature 337(1989)44-47)，人原胶原酶(Lee & olins，J.Biol.Chem.267(1992)2849-2852)或来自鼠的神经氮氧化物合成酶(Roman et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(1995)8428-8432)的表达。在这些例子中来自大肠杆菌(E.Coli)的GroEL/ES或Dnak系统在胞质中是共同过表达的。通常正效应是提高所需要的可溶形式的蛋白质的得率。
当重组蛋白质分泌到大肠杆菌周质时，对伴侣蛋白质(chaperones)的共表达进行了考察。然而，这种情况下仅仅是评价胞质伴侣蛋白质过表达，以选择最适分泌到周质的条件(Perez-Perez et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.210(1995)524-529；Sato et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.202(1994)258-264；Berges et al.，Appl.Environ.Microbiol.62(1996)55-60)。以前在大肠杆菌中对共分泌的尝试仅仅涉及折叠催化剂，比如，来自大肠杆菌的蛋白质二硫化物异构酶(PDI；Glockshuber etal.，EP-A 0510658)或肽基-脯氨酰基-顺/反式异构酶或来自大肠杆菌E.Coli的Dsb蛋白质(Knappik et al.，Bio/Technology 11(1993)77-83；Qiu et al.，Appl.Environm.Microbiol.64(1998)4891-4896 and Schmidtet al.，Prot.Engin，11(1998)601-607)。最近，周质的Skp蛋白质共过表达产生了更有效的折叠相显现，而且抗体片段分泌到周质的产率较高(Bothman and Pluckthun，Nat.Biotechnol.16(1998)376-380；Hayhurut andHarris，Prot.Expr.Purif.15(1999)336-343)。
为了使在原核细胞重组DNA在细胞质表达时所形成的不溶性聚集的蛋白质(包函体)在体外复性，在方法中使用了诸如脲素、脲素衍生物、甲酰胺、乙酰胺或者L-精氨酸-类化合物。L-精氨酸作为一种添加剂能够极大改进体外复性中天然折叠蛋白质的产率(Rudolph et al.，US-Patent No.5,593,865；Buchner & Rudolph，Bio/Technology 9(1991)157-162；Brinkmann et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA 89(1992)3075-3079；Lin& Traugh，Prot.Express.Purif.4(1993)256-264)。
本发明的目的是提供一种在原核生物表达后生产水溶性的、天然折叠的真核多肽的方法。该方法简便易行以及在体外后处理，诸如溶解、包函体的还原和复性、还原和复性时勿需费力。
采用原核生物细胞培养，生产含有通过二硫键连接的二个或几个半胱氨酸水溶性的、天然折叠的真核生物多肽的方法达到了本发明的目的，
a)其中所说的原核细胞含有编码所说的在N-末端含有原核生物的信号序列的多肽的一个表达载体，
b)在所说的多肽分泌到周质或培养基中的条件下，
c)切除信号序列，并从周质或培养基中分离这种多肽。
其中该培养是在有精氨酸或通式(I)的一种化合物存在下进行的。
R2-CO-NRR1                   (I)
其中R和R1代表氢或一种饱和的或不饱和的支链或直链C1-C4烷基链和R2代表氢、NHR1或饱和的或不饱和的支或直链C1-C3烷基链。精氨酸或通过(I)的化合物的浓度优选至少0.1mol/l，只要确保精氨酸和所说化合物溶解度，也可考虑多加。精氨酸或通式(I)的化合物优选使用的浓度范围是0.1-1.5mol/l。
作为通式(I)的化合物，甲酰胺、乙酰胺、脲素或诸如乙酰脲素或甲酰脲素的脲素衍生物被优选地加入培养原核生物细胞的培养基中。精氨酸为例，可作为盐酸盐的形式被使用或者作为另一种精氨酸碱基滴定的形式被使用。无论如何，L-精氨酸是被优选使用的，特别是L-精氨酸盐酸盐的形式。
在按本发明方法的一优选实施例方案中，含有SH的硫醇还原剂被额外加入到原核生物细胞培养的营养培养基(发酵培养基)中，用于进一步提高重组产生的蛋白质得率。硫醇试剂优选添加量是0.1-15mmol/l。按照本发明，术语“硫醇试剂”，可以是一种具有SH基团的还原剂(还原后的)，或者是具有SH基团的还原剂和具有二硫化物基团的氧化剂的混合物。优选的物质是还原的和氧化的谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸、胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、半胱胺、β-巯基乙醇和类似化合物。硫醇试剂可以单独或以混合物的形式使用。硫醇试剂，如每个分子含有一个SH基团的谷胱甘肽(GSH)是特别合适的。当重组DNA在原核生物细胞表达时，诸如谷胱甘肽的硫醇试剂已知能够改进天然折叠蛋白质的产率。(Glockshuber et al.，EPA0510658)。
在本发明的另外一个优选的实施方案中，分子伴侣蛋白额外地过表达和共分泌。按本发明，伴侣蛋白应被理解为一种蛋白质，它保护其它非天然蛋白质在体内避免聚集而且促进它们天然构型的形成。在已有技术中，伴侣蛋白被用于稳定蛋白质，这样可以保持蛋白质避免聚集和失活(Buchner et al.，EP-A0556726A1)。
优选使用依赖ATP的侣伴蛋白HSP40型(分子量大约40kDa)或一种小的热休克蛋白(sHSP)。DnaJ是在原核生物大肠杆菌中存在的一种40kDa热休克蛋白，而且是所谓的Hsp70侣伴蛋白系统的一部分(Bukau，B.& Horwich，A.，Cell 92(1998)351-366)。DnaK(Hsp70)和GrpE也属于这一系统。特定的一些蛋白质通过Dnak系统以依赖ATP的方式被折叠成天然的构型(Schroder et al.，.EMBO J.12(1993)4137-4144；Langer et al.，Nature 356(1992)683-689)。在缺少Dnak和ATP时DnaJ保护非天然的蛋白质避免蛋白的聚集并介导具有折叠能力的状态(Schroderet al.，EMBO J.12(1993)4137-4144)。
已有实验显示，在胞质中DnaJ的共表达可导致可溶性蛋白质产率提高(Yokoyama et al.，Microbial.Ferment.Technol.62(1998)1205-1210)。特别优选DnaJ的N-末端片段的共分泌，它含有第1-108位氨基酸，下文被称作J区域(kelley.TIBS23(1998)222-227)。该J区域和一个负责与DnaK相互作用的G/F富集区位于这一区段中(Wall et al.，J.Biol.Chem.270(1995)2139-2144)。
Hsp25(例如，来自于鼠)是小的热休克蛋白质的一个代表(Gaestel etal.，Eur.J.Biochem.179(1989)209-213)，它是一类普遍存在的蛋白质伴侣。这些蛋白质的分子量是在15和30KDa之间。在热休克期间，细胞中的sHsp有相当多的积累(占总细胞蛋白的1％-Arrigo & Landry(1994)，In Morimoto(Hrsg.)：The Biology of Heat Shock Proteins & MolecularChaperones，Cold Spring Harbour Press，335-373)。类似DnaJ蛋白质，sHsp具有防止非天然蛋白质聚集和保持这些蛋白质处于具有折叠能力的状态的性质(Jakob et al.，J.Biol.Chem.268(1993)1517-1520；Ehrsperger et al.，EMBO J.16(1997)221-229)。
本发明中的“过表达”是指分泌蛋白质，例如DnaJ和Hsp25，与在各自的野生型原核生物寄主中的表达相比提高(优选至少提高100％)。这种过表达可以是在，例如，当这些基因(蛋白质、侣伴蛋白质和/或信号肽的基因)是由一种强的原核生物的，优选可诱导的，表达信号(例如，lac或T7启动子或其衍生物)的控制下达到的。
用于多肽(蛋白质)过表达的分泌构建体包括重组DNA的调节区(启动子和终止子)，它最好被整合到一个额外编码在原核生物少有的精氨酸-tRNA AGA/AGG的一个载体上，或者它与编码这种tRNA的一个载体共表达(Brinkmann et al.，Gene 85(1989)109-114)。这样能够使表达的各个蛋白质进入细胞周质和使稀有的tRNA Arg AGA/AGG转录，这通常导致细菌寄主中所需要的蛋白质合成的提高。
在本发明的意义上的原核生物的信号序列应被理解是一种核酸片段，它来自原核生物，优选来自格兰氏阴性细菌，并保证连到信号肽的蛋白质能够穿过细菌的内膜。其结果，蛋白质位是在周质中或者是在细胞的上清液中。通常，这样的信号序列有18-30个氨基酸的长度，例如在Murphy & Beckwith：大肠杆菌的细胞包膜的蛋白质输出，Neidhardt等(编者)：大肠杆菌和沙门氏菌(Escherichia coli and Salmonella)，SecondEdition Vol.l，ASM Press，Washington，1996，第967-978页中的描述。细菌信号序列的切除可以，例如，发生在Ala-x-Ala序列之后(Von Heiineet al.，J.Mol.Biol.184(1985)99-105)。Paetzel在自然(Nature)396(1998)186-190)上描述了细菌信号肽酶的结构。被使用的信号序列优选由原核细胞周质中的蛋白酶从需要的蛋白质被再次切除。或者这些蛋白酶可被加入细胞上清或加入分离的蛋白质来切下信号序列。
本发明的方法能够改进许多真核蛋白质的异源表达，例如：蛋白酶，干扰素，蛋白质荷尔蒙，抗体或其片段。该方法特别适合在天然状态下至少有二个半胱氨酸通过二硫键连结的异源蛋白质的生产，尤其是当蛋白质没有原核信号序列融合在N-末端，而且在它们的原核表达时形成不溶性的包函体时。该方法特别适合在天然状态下含有五个以上的二硫键的蛋白质。这样一种蛋白质是，例如，一种重组的纤溶酶原激活物(下列称为rPA，Martin et al.，Cardiovasc.Drug Rev.11(1993)299-311，US-Patent Nr.5,223,256)。rPA有9个在大肠杆菌还原胞质中不能形成的二硫键。
蛋白质和任选的伴侣蛋白质在周质中的定位是通过与信号肽有效地连接来保证的，使其穿过细菌的内膜。
L-精氨酸浓度为0.4mol/l，谷胱甘肽为5mmol/l(在DnaJ，J区域，Hsp25和scFv的共分泌的情况下)或L-精氨酸为0.4mol/l，没有谷胱甘肽(没有DnaJ共分泌)的条件已被证实对这种纤溶酶原激活物的表达最为适合。
为了从大肠杆菌中分离功能形式的分泌rPA蛋白，通过基因工程的方法将来自质粒pA27fd7的这种蛋白基因(Kohnert et al.，蛋白质工程5(1992)93-100)融合到革兰氏阴性细菌的原核生物的信号序列上，例如，融合到来自Erwinia carotovora的果胶酸裂解酶B(PelB)的信号序列上。基因融合是通过克隆到pET20b(+)载体上构建成的(Novagen Inc.，Madison，USA)。结果，基因表达是在T7启动子的控制下进行。存在于融合蛋白上的信号序列介导蛋白质向周质中的分泌。在分泌期间或分泌后，信号肽被位于内膜的肽酶切除。然后这样分泌的蛋白质能够在周质中折叠。这一空间中的氧化条件能够使二硫键形成(Wuelting andPluckthun，Mol.Microbiol.12(1994)685-692)。创造性地在培养基中加入改善蛋白质折叠的低分子量的添加物和硫醇试剂以及在周质中同时共表达DnaJ，J区域或者Hsp25能使功能蛋白质的产量成百倍以上地提高。
本发明的另外一些多肽的例子是抗体或抗体片段，例如，单链Fv片段(scFv，例如抗促甲状腺激素，TSH)。ScFv是一种截短的抗体，它只有抗体的重链和轻链的可变区(Fv)组成，它通过一段短肽连接物(通常是Gly4Ser3)人工融合(Hudson，Curr.Opin Biotechnol.9(1998)395-402)。通常ScFv对抗原具有与亲本Fv链相同的亲合力，但可以在大肠杆菌中过表达。由于它们具有稳定性的内区二硫健，这对其稳定性是必需的，所以通常在胞质中表达导致包函体形成(Shibui et al.，Appl.Microbiol.Biotechnol.37(1992)352-257)。用随机诱变和随后的噬菌体显示选择可对用于结合所需抗原的ScFv进行特别的优化(Allen et al.，TIBS20(1995)511-516；Hoogenboom et al.，Immunotechnology 4(1998)1-20)。与不加添加物的培养相比，添加5mM GSH和0.4M L-精氨酸能使功能性ScFv-TSH在周质中的产量提高7倍，在培养基的上清液中提高43倍。
通过下列实施例、出版物、序列表和图进一步解释本发明，保护的范围由权利要求限定。所描述的方法应被理解为示例性的，即使进行一些变化后仍然描述本发明的主题。
序列描述：
SEQ ID NO：1和2表示编码由OmpA信号序列和DnaJ以及调节序列(启动子，终止子)组成的融合蛋白质的表达质粒pUBS520-pIN-dnaJ的部分的序列，它是从pIN III ompA3-dnaJ扩增到的。
SEQ ID NO：3和4表示编码由OmpA信号序列和J区域以及调节序列(启动子，终止子)组成的融合蛋白质的表达质粒pUBS520-pIN-J区域的部分的序列，它是从pIN III ompA3-dnaJ扩增到的。
SEQ ID NO：5和6表示编码由OmpA信号序列和Hsp25以及调节序列(启动子，终止子)组成的融合蛋白质的表达质粒pUBS520-pIN-Hsp25的部分的序列，它是从pIN III ompA3-hsp25扩增到的。
SEQ ID NO：7和8表示编码由PelB信号序列和scFvOxazolon以及调节序列(启动子，终止子)组成的融合蛋白质的表达质粒pUBS520-scFvOx的部分的序列，它是从pHEN-scFv或pIN III ompA3扩增到的。
SEQ ID NO：9和10表示编码由PelB信号序列和rPA组成的融合蛋白质的pET20b(+)-rPA表达质粒的部分的序列。
图的描述：
图1表示在含有5mM GSH的大肠杆菌周质中天然rPA的表达对L-精氨酸的浓度的依赖性，和各种共发泌构建体。
图2表示当与DnaJ共分泌和当培养基中加入5 mM GSH和改进折叠的各种低分子量物质时，rPA在大肠杆菌BL21(DE3)细胞周质中的表达的比较。
图3表示质粒pUBS520-pIN-dnaJ表达的示意图。
图4表示质粒pUBS520-pIN-J-区域表达的示意图。
图5表示质粒pUBS520-pIN-hsp25表达的示意图。
图6表示质粒pUBS520-scFvOx表达的示意图。
图7表示质粒pET20b(+)-rPA表达的示意图。
图8表示周质和培养基中含有5mM GSH的条件下，功能性scFv-TSH的表达对L-精氨酸浓度的依赖性。
为了在大肠杆菌周质中过表达DnaJ，J-区域和Hsp25，编码这些蛋白质的DNA通过基因工程方法被融合到大肠杆菌外膜蛋白质A(OmpA)的信号序列上，在lac-lpp启动子的控制下重组质粒在大肠杆菌中表达融合蛋白。结果DnaJ和Hsp25的多肽链被输送到原核生物寄主的周质，并在此自然折叠。通过胰蛋白酶有限水解和Western Blot测定它们的定位和天然折叠的状况。
实施例一
表达质粒pIN III ompA3-dnaJ的构建
分子遗传技术是根据Ausubel et al.，(ed.)，J.Wiley & Sons，1997，Curr，Protocols of Molecular Biology。寡核苷酸得自MWG Biotech，Ebersberg或GIBCO Life Science公司，Eggenstein，DE。
编码Dnaj，Gene Bank Accession No.M12565，的基因通过PCR进行扩增并借助由此产生的限制性切点EcoR1和BarmH1克隆到表达质粒pIN III ompA3(Ghayreb et al.，EMBOJ.3(1984)2437-2442)。通过双脱氧序列分析确证了克隆的PCR片段的序列(LiCor DNA-Sequencer 4000，MWG Biotech，Ebersberg)。产生的质粒定名为pIN III ompA3-dnaJ。在周质中表达的DnaJ序列不同于野生型蛋白的序列，该多肽序列上是以Gly-Ile-Pro而不是Met开始的，因此，在N-末端有二个氨基酸延伸。由此，DnaJ的表达是在lac-lpp启动子的控制下，它用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导。
实施例2
表达质粒pUBS520-pIN-dnaJ的构建
借助于PCR扩增了编码lac-lpp操纵子，信号序列，dnaJ基因和操纵子终止子的质拉pIN III ompA3-dnaJ的区域(SEQ ID NO：1)。PCR产物用限制性内切酶BgIII酶切，然后克隆到用限制性内切酶BamHI线性化的pUBS520载体上。产生的质粒定名为pUBS520-pIN-dnaJ(图3)。
实施例3
表达质粒pUBS520-pIN-J-区域的构建
通过QuikChange突变系统(promega，Mannheim，DE)处理，二个终止密码子被插入到质粒pUBS520-pIN-dnaJ的324核苷酸之后，以至于使仅仅开始的108个氨基酸被表达。通过双脱氧序列分析(LiCorDNA-Seguencer 4000，MWG Biotech，Ebersberg)测定了序列的突变区。用Westernblotting和抗-DnaJ抗体的方法检测了截短了的蛋白质片段的表达。所形成的质粒定名为pUBS520-pIN-J-区域(图4)。
实施例4
表达质粒pIN III ompA3-hsp25的构建
通过PCR扩增编码Hsp25基因(Gent Bank Accession No：L07577)以及通过由此产生的限制性酶切位点EcoR1和BamH1克隆到表达质粒pIN III ompA3(Ghayreb et al.，EMBO J.3(1984)2437-2442)。用双脱氧序列分析(LiCor DNA-Sequencer 4000，MWG Biotech，Ebersberg)核对克隆的PCR片段的序列。产生的质粒定名为pIN III ompA3-hsp25。在周质中表达的Hsp25序列不同于野生型蛋白质，该多肽序列是以Gly-Ile-Leu而不是met开始的，因此N-端有二个氨基酸延伸。因此，Hsp25是在lac-lpp的启动子控制下，它受IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导。
实施例5
表达质粒pUBS520-pIN-hsp25的构建
通过PCR的方法扩增编码lac-lpp操纵子，信号序列，hsp25基因和操纵子的终止子区域的来自质粒pIN III ompA3-hsp25的区域(序列No.5)。用限制性内切酶BglII切PCR产物然后克隆到用限制性内切酶BamH1处理为线性的pUBS520载体上。产生质粒定名为pUBS520-pIN-hsp25(图5)。
实施例6
表达质粒pUBS520-scFvOx的构建
针对半抗原恶唑酮(scFvOxazolon；Fiedler and Conrad，Bio/Technology 13(1995)1090-1093)(它没有侣伴蛋白的性质)的一种单链Fv片段抗体的共表达在检测中作为负对照。
通过PCR的方法扩增来自质粒pHEN-scFvOx的编码lac启动子，信号序列peIB和scfvox基因的区域。通过第二个PCR扩增编码lpp终止子的来自质粒pIN III ompA3的区域。通过下一个PCR中融合这二个片段。以这种方式形成的PCR产物(SEQ ID NO：7)用限制性内切酶BglII切开，而且将其克隆到用限制性内切酶BamH1处理成线性的载体pUBS520上。产生的质粒定名为pUBS520-scFvOx(图6)。
实施例7
表达质粒pET 20b(+)-rPA的构建
借助PCR的方法，扩增来自质粒载体pA27fd7(Kohnert et al.，proteinEngineering 5(1992)93-100)的血纤维蛋白溶酶原激活因子(rPA)的基因。用限制性内切酶NcoI和BamHI切开PCR产物，然后克隆到质粒载体pET20b(+)(Novagen Inc.，Madison，USA)上。质粒编码一种由PelB的信号序列(取自Erwinia Carotovova果胶酸裂解酶)和rPA组成的融合蛋白，用双脱氧测序法(LiCor DNA-Sequencer 4000，MWG Biotech.Ebersberg.DE)检查rPA向周质中的分泌。构建的质粒定名为pET20b(+)-rPA(图7)。rPA在T7启动子的控制下从质粒进行表达，在大肠杆菌BL21(DE3)中的T7-RNA聚合酶受LacUV5启动子调控。加入IPTG进行诱导。在周质中表达的rPA不同于Kohnert et al.描述过的血纤维蛋白溶酶原，其中第二个氨基酸丝氨酸(Ser)是被丙氨酸(Ala)取代。
实施例8
采用培养基添加剂谷胱甘肽和L-精氨酸，rPA在大肠杆菌的周质中的功能表达
对用pET20b(+)-rpA和pUBS520-pIN-dnaJ(DnaJ的共分泌)转化了的大肠杆菌BL21(DE3)(studier & Moffat，J.Mol.Biol.189(1986)113-130)进行静止过夜培养、对用pET20b(+)-rpA和pUBS520-pIN-J-区域(J-区域的共分泌)转化的大肠杆菌BL21(DE3)进行过夜培养、对用pET20b(+)-rpA和pUBS520-pIN-hsp25(Hsp25的共分泌)转化的大肠杆菌BL 21(DE3)进行过夜培养、对用pET20b(+)-rpA和pUBS520-scFvOx(scFvOx的共分泌)转化的大肠杆菌BL 21(DE3)进行过夜培养、对用pET20b(+)-rpA和pUBS520转化的大肠杆菌BL 21(DE3)进行过夜培养、或对用pET20b(+)和pUBS520(对照培养)转化的大肠杆菌BL21(DE3)进行过夜培养，将其按1∶50的比率稀释在100ml含有氨苄青霉素(100μg/ml)，卡那霉素(50μg/ml，Fluka Chemica，Neu-Ulm，DE)的LB-培养基中，在24℃摇动培养，转速为170rpm。培养3小时后，取5ml等份加到10ml的含有前述量的氨卞青霉素、卡那霉素和不同浓度的GSH(0-10mM，Fluka，DE)和L-精氨酸盐酸盐(0-0.4M，ICN)LB培养基中，而且每份都用1 mM IPIG(异丙基-β-D-硫醇半乳糖苷，AppliChem，Darmstadt，DE)诱导。细胞在24℃，170rpm进一步摇动培养21小时，取1ml样品在OD600下进行测定。这些1ml的细胞样品按照Jacoli et al.(J.Biol.Chem.272(1997)21692-21699)修改的方法在2ml Eppendorf反应管中分级。将详细地说，在细胞团中加入500μl分级缓冲液(150mM NaCl(Roth GmbH)，50mM Tris/HCl(Roth GmbH)，5mM EDTA(Biomol)和1mg/ml多粘菌素B硫酸盐(Sigma)，pH7.5)，用Eppendorf振荡器，在1400rpm，10℃振荡1小时，然后，在10℃用低温Eppendorf小型离心机，10℃，14000rpm离心15分，形成一个含有可溶的周质蛋白(上清)和一种残留的组分(沉淀)的分级。
rpA的活性是按照Verheijen et al.Thromb.Haemostasis 48(1982)266-269的方法测定的。
为了校准不同缓冲液测定发生的误差，所有细胞抽提液测定的rPA浓度被统一在细胞悬浮液OD600等于1。
实施例9
用甲酰胺、甲基甲酰胺、乙酰胺、甲基脲素和乙基脲素作为培养添加剂与谷胱甘肽形成的混合物，在大肠杆菌的周质中rPA的功能性表达
用pET20b(+)-rPA和pUBS520-pIN-dnaJ(DnaJ的共分泌)转化的大肠杆菌BL 21(DE3)的静止过夜培养是按实施例8所述的方法进行的。在培养基中还要加入式I化合物和每种情况都含5mM谷胱甘肽。在没有添加剂的LB中进行对照培养。表1中列出了式I化合物和使用的浓度。样品的制备，周质的分级分离和酶测定rPA活性是按照实施例8所述的方法进行的。
表1和表2以及图1和图2表示rPA表达的结果。表1 L-精氨酸在发酵培养基中对周质中的天然rPA产量的影响
共分泌的蛋白质      0ML-精氨酸     0.2M L-精氨酸       0.4M L-精氨酸
      rPAng/ml*OD600   刺激因子        rPAng/ml*OD600   刺激因子     rPAng/ml*OD600   刺激因子
-DnaJJ区域Hsp25ScFvOxazolon    0.030±0.0010.197±0.0190.339±0.0070.053±0.0020.041±0.003     2929162713    0.044±0.0900.730±0.1500.625±0.2130.140±0.0010.144±0.047     202717178   0.170±0.0053.978±1.0004.398±0.1652.850±0.2140.713±0.113     2318151710
培养是在含有5mM GSH条件下进行的。表2 各种低分子量添加物在培养基中对大肠杆菌周质有关天然rPA产量的影响
添加剂 培养基中浓度    rPA产量ng/ml*OD600在周质中 刺激因子 OD600细胞浓度 GSH在培养基中浓度
    无       -     0.153     24     4.52     0mM
精氨酸     0.2M0.4M     0.5603.880     2117     4.451.78     5mM5mM
甲酰胺     0.6M1.0M     0.2080.219     1710     4.964.71     5mM5mM
甲基甲酰胺     0.3M0.6M     0.1410.790     1517     4.571.04     5mM5mM
乙酰胺     0.6M1.0M     0.1501.321     2416     5.341.57     5mM5mM
甲基脲素     0.3M0.6M     0.1680.830     2422     4.674.59     5mM5mM
乙基脲素     0.3M0.6M     0.2661.209     2317     4.200.82     5mM5mM
实施例10
培养基加入还原谷胱甘肽和L-精氨酸后功能性单链Fv片段的表达
一种过夜培养的用编码抗TSH抗体(US-patent No.5,614,367)的单链Fv片段和pUBS520(Brinkmann et al.，Gene 85(1989)109-114)的质粒转化了的大肠杆菌培养液，在100ml含有氨卞青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml，Fluka Chemica，Neu-Ulm，DE)的LB培养基按1∶50比例稀释，然后在24℃，170rpm振动培养。生长3小时后，取5ml等分培养液加入含有前述含量的氨卞青霉素和卡那霉素和各种浓度的GSH(0-10mM，Fluka)和L-精氨酸HCl(0-0.4M，ICN)的LB培养基中，而且每一个用1mM IPTG(异丙基-β-D-硫醇半乳糖苷，AppliChem，Darmstadt))诱导。细胞还要在24℃，170rpm条件下摇动培养21小时，取1ml样品接着用OD600测定。这些1ml的样品按照Jacobi et al.，(J.Biol.Chem.272(1997)21692-21699)(见实施例8)修改的方法在2ml的Eppendorf反应管中分级。另外取1ml培养基上清样品。这些样品通过ELISA测定分析它们的功能抗体。
天然的scFv-TSH与TSH的结合是用scFv-TSH标准校验的，它是通过RPAS-系统纯化了的(pharmacia Biotech，Germany)，(一个单位相应于1μl标准结合到用TSH包被的微滴定板上)。培养基加入L-精氨酸对周质和大肠杆菌培养基上清中有关天然的scFv-TSH的产量也有正影响。加入0.4M L-精氨酸和5mM GSH与5mM GSH的培养相比能够使得通过ELISA检测的抗体片段在培养基上清液中的量增加7倍，在周质的部分增加43倍(图8)。参考文献Allen et al.，生物化学趋势(TIBS)20(1995)511-516Arrigo & Landry(1994)In Morimoto(Hrsg.)：热休克蛋白质和分子伴侣的生物学(TheBiology of Heat Shock Proteins and Molecular Chaperones)，Cold Spring Harbour Press，335-373Ausubel et al.(Hrsg.)现代分子生物学(Current Protocols in Molecular Biology)，J.Wiley& Sons.1997Baynex，生物技术新见(Curr.Opin.Biotechnol.)10(1999)411-421Berges et al.，应用环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)62(1996)55-60Bothman and Plückthun，自然生物技术(Nat.Biotechnol.)16(1998)376-380Brinkmann et al.，基因(Gene)85(1989)109-114Brinkmann et al.，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci)USA 89(1992)3075-3079Buchner & Rudolph，生物/工艺学(Bio/Technology)9(1991)157-162Bukau，13.& Horwich，A.，细胞(Cell)92(1998)351-366Ehrsperger et al.，欧洲分子生物学学会志(EMBOJ.)16(1997)221-229ER-A 0510 658ER-A 0 556 726Fiedler arid Conrad，生物/工艺学(Bio/Technology)13(1995)1090-1093Gaestel et al.，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)179(1989)209-213Ghayreb et al.，EMHO 1.3(1934)2437-2442Goloubinoffet al.，自然(Nature)337(1989)44-47Hayhurst and Harris，蛋白质表达与纯化(Prot.Expr.Purif.)15(1999)336-343Hockney，生物技术趋势(TIBTECH)12(1994)456-463Hoogenboom et al.，免疫工艺学(Immunotechnology)4(1998)1-20Hudson，生物技术新见(Curr.Opin Biotechnol.)9(1998)395-402Jacobi etal.生物化学杂志(J.Biol.Chem.)272(1997)21692-21699Jakob etal.，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)268(1993)1517-1520Kelley，生物化学趋势(TIBS)23(1998)222-227Knappik et al.，生物/工艺学(Bio/Technoogy)11(1993)77-83Kohnert et al.，蛋白质工程(Protein Engineering)5(1992)93-100Langer et al.，自然(Nature)356(1992)683-689Lee & Olins，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)267(1992)2849-2852Lin & Traugh，蛋白质表达与纯化(Prot.Express.Purif.)4(1993)256-264).Martin et al.，Cardiovasc.药物综述(Drug Rev.)11(1993)299-311Murphy & Beckwith：大肠杆菌中蛋白质胞外输出(Export of Proteins to the CellEnvelope in Escherichia coli inNeidhardt)et al.(Hrsg.)：大肠杆菌和沙的氏菌，第二版，卷1(Escherichia coli and Salmonella，Second Edition，Vol.l，)35 ASM Press，Washington，1996，5.967-978Paetzel et al.，自然(Nature)396(1998)186-190Perez-Perez et al.，生物化学、生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)210(1995)524-529Qiu et al.，应用环境微生物(Appl.Environm.Microbiol.)64(1998)4891-4896Roman et al.，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.)USA 92(1995)8428-8432Sato et al.，生物化学、生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)202(1994)258-264Schmidt et al.，蛋白质工程(Prot.Engin.)11(1998)601-607Schrder et al.，欧洲分子生物学学会志(EMBO J.)12(1993)4137-4144Shibui et al.，应用微生物学生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)37(1992)352-357Studier & Moffat，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)189(1986)113-130Thomas et al.，应用生物化学生物技术(Appl.Biochem.Biotechnol.)66(1997)197-238美国专利No.5,223,256(US-Patent No.5,223,256)美国专利No.5,593,865(US-Patent No.5,593,865)美国专利No.5,614,367(US-Patent No.5,614,367)Verheijen et al.血栓(Thromb.Haemostasis)48(1982)266-269Wall et al.，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)270(1995)2139-2 144Wuclting and Plückthun，分子微生物学(MoI.Microbiol.)12(1994)685-692Yokoyama et al.，微生物发酵工艺学(Microbiol.Ferment.Technol.)62(1998)1205-1210
                            序列表<110>      霍夫曼-拉罗奇有限公司<120>      生产天然折叠和分泌型蛋白的方法<130>      Case 20379<160>      10<210>      1<211>      1881<212>      脱氧核糖核酸<213>      大肠杆菌<220><221>      CDS<222>      (392)...(1591)<400>      序列1TAGGCGTATC ACGAGGCCCT TTGGATAACC AGAAGCAATA AAAAATCAAA TCGGATTTCA      60CTATATAATC TCACTTTATC TAAGATGAAT CCGATGGAAG CATCCTGTTT TCTCTCAATT     120TTTTTATCTA AAACCCAGCG TTCGATGCTT CTTTGAGCGA ACGATCAAAA ATAAGTGCCT     180TCCCATCAAA AAAATATTCT CAACATAAAA AACTTTGTGT AATACTTGTA ACGCTACATG     240GAGATTAACT CAATCTAGCT AGAGAGGCTT TACACTTTAT GCTTCCGGCT CGTATAATGT     300GTGGAATTGT GAGCGGATAA CAATTTCACA CAGGAAACAG CTATGACCAT GATTACGGAT     360TCACTGGAAC TCTAGATAAC GAGGGCAAAA A ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG        412
                               Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala
                                 1               5ATT GCA GTG GCA CTG GCT GGT TTC GCT ACC GTA GCG CAG GCC GGA ATT       460Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Gly Ile
     10                  15                  20CCA GCT AAG CAA GAT TAT TAC GAG ATT TTA GGC GTT TCC AAA ACA GCG       508Pro Ala Lys Gln Asp Tyr Tyr Glu Ile Leu Gly Val Ser Lys Thr Ala
 25                  30                  35GAA GAG CGT GAA ATC AGA AAG GCC TAC AAA CGC CTG GCC ATG AAA TAC       556Glu Glu Arg Glu Ile Arg Lys Ala Tyr Lys Arg Leu Ala Met Lys Tyr40                  45                  50                  55CAC CCG GAC CGT AAC CAG GGT GAC AAA GAG GCC GAG GCG AAA TTT AAA       604His Pro Asp Arg Asn Gln Gly Asp Lys Glu Ala Glu Ala Lys Phe Lys
             60                  65                  70GAG ATC AAG GAA GCT TAT GAA GTT CTG ACC GAC TCG CAA AAA CGT GCG      652Glu Ile Lys Glu Ala Tyr Glu Val Leu Thr Asp Ser Gln Lys Arg Ala
         75                  80                  85GCA TAC GAT CAG TAT GGT CAT GCT GCG TTT GAG CAA GGT GGC ATG GGC      700Ala Tyr Asp Gln Tyr Gly His Ala Ala Phe Glu Gln Gly Gly Met Gly
     90                  95                 100GGC GGC GGT TTT GGC GGC GGC GCA GAC TTC AGC GAT ATT TTT GGT GAC      748Gly Gly Gly Phe Gly Gly Gly Ala Asp Phe Ser Asp Ile Phe Gly Asp
105                 110                 115GTT TTC GGC GAT ATT TTT GGC GGC GGA CGT GGT CGT CAA CGT GCG GCG      796Val Phe Gly Asp Ile Phe Gly Gly Gly Arg Gly Arg Gln Arg Ala Ala120                 125                 130                 135CGC GGT GCT GAT TTA CGC TAT AAC ATG GAG CTC ACC CTC GAA GAA GCT      844Arg Gly Ala Asp Leu Arg Tyr Asn Met Glu Leu Thr Leu Glu Glu Ala
            140                 145                 150GTA CGT GGC GTG ACC AAA GAG ATC CGC ATT CCG ACT CTG GAA GAG TGT      892Val Arg Gly Val Thr Lys Glu Ile Arg Ile Pro Thr Leu Glu Glu Cys
        155                 160                 165GAC GTT TGC CAC GGT AGC GGT GCA AAA CCA GGT ACA CAG CCG CAG ACT      940Asp Val Cys His Gly Ser Gly Ala Lys Pro Gly Thr Gln Pro Gln Thr
    170                 175                 180TGT CCG ACC TGT CAT GGT TCT GGT CAG GTG CAG ATG CGC CAG GGA TTC      988Cys Pro Thr Cys His Gly Ser Gly Gln Val Gln Met Arg Gln Gly Phe
185                 190                 195TTC GCT GTA CAG CAG ACC TGT CCA CAC TGT CAG GGC CGC GGT ACG CTG     1036Phe Ala Val Gln Gln Thr Cys Pro His Cys Gln Gly Arg Gly Thr Leu200                 205                 210                 215ATC AAA GAT CCG TGC AAC AAA TGT CAT GGT CAT GGT CGT GTT GAG CGC     1034Ile Lys Asp Pro Cys Asn Lys Cys His Gly His Gly Arg Val Glu Arg
            220                 225                 230AGC AAA ACG CTG TCC GTT AAA ATC CCG GCA GGG GTG GAC ACT GGA GAC     1132Ser Lys Thr Leu Ser Val Lys Ile Pro Ala Gly Val Asp Thr Gly Asp
        235                 240                 245CGC ATC CGT CTT GCG GGC GAA GGT GAA GCG GGC GAG CAT GGC GCA CCG     1180Arg Ile Arg Leu Ala Gly Glu Gly Glu Ala Gly Glu His Gly Ala Pro
    250                 255                 260GCA GGC GAT CTG TAC GTT CAG GTT CAG GTT AAA CAG CAC CCG ATT TTC     1228Ala Gly Asp Leu Tyr Val Gln Val Gln Val Lys Gln His Pro Ile Phe
265                 270                 275GAG CGT GAA GGC AAC AAC CTG TAT TGC GAA GTC CCG ATC AAC TTC GCT     1276Glu Arg Glu Gly Asn Asn Leu Tyr Cys Glu Val Pro Ile Asn Phe Ala280                 285                 290                 295ATG GCG GCG CTG GGT GGC GAA ATC GAA GTA CCG ACC CTT GAT GGT CGC    1324Met Ala Ala Leu Gly Gly Glu Ile Glu Val Pro Thr Leu Asp Gly Arg
            300                 305                 310GTC AAA CTG AAA GTG CCT GGC GAA ACC CAG ACC GGT AAG CTA TTC CGT    1372Val Lys Leu Lys Val Pro Gly Glu Thr Gln Thr Gly Lys Leu Phe Arg
        315                 320                 325ATG CGC GGT AAA GGC GTC AAG TCT GTC CGC GGT GGC GCA CAG GGT GAT    1420Met Arg Gly Lys Gly Val Lys Ser Val Arg Gly Gly Ala Gln Gly Asp
    330                 335                 340TTG CTG TGC CGC GTT GTC GTC GAA ACA CCG GTA GGC CTG AAC GAA AGG    1468Leu Leu Cys Arg Val Val Val Glu Thr pro Val Gly Leu Asn Glu Arg
345                 350                 355CAG AAA CAG CTG CTG CAA GAG CTG CAA GAA AGC TTC GGT GGC CCA ACC    1516Gln Lys Gln Leu Leu Gln Glu Leu Gln Glu Ser Phe Gly Gly Pro Thr360                 365                 370                 375GGC GAG CAC AAC AGC CCG CGC TCA AAG AGC TTC TTT GAT GGT GTG AAG    1564Gly Glu His Asn Ser Pro Arg Ser Lys Ser Phe Phe Asp Gly Val Lys
            380                 385                 390AAG TTT TTT GAC GAC CTG ACC CGC TAA GGATCCGGCT GAGCAACGAC          1611Lys Phe Phe Asp Asp Leu Thr Arg
        395                 400GTGAACGCAA TGCGTTCCGA CGTTCAGGCT GCTAAAGATG ACGCAGCTCG TGCTAACCAG  1671CGTCTGGACA ACATGGCTAC TAAATACCGC AAGTAATAGT ACCTGTGAAG TGAAAAATGG  1731CGCACATTGT GCGACATTTT TTTTGTCTGC CGTTTACCGC TACTGCGTCA CGCGTAACAT  1791ATTCCCTTGC TCTGGTTCAC CATTCTGCGC TGACTCTACT GAAGGCGCAT TGCTGGCTGC  1851GGGAGTTGCT CCACTGCTCA CCGAAACCGG                                   1881<210>       2<211>       400<212>       蛋白质<213>       大肠杆菌<400>       序列2Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala1               5                  10                  15Thr Val Ala Gln Ala Gly Ile Pro Ala Lys Gln Asp Tyr Tyr Glu Ile
         20                  25                  30Leu Gly Val Ser Lys Thr Ala Glu Glu Arg Glu Ile Arg Lys Ala Tyr
     35                  40                  45Lys Arg Leu Ala Met Lys Tyr His Pro Asp Arg Asn Gln Gly Asp Lys
 50                  55                  60Glu Ala Glu Ala Lys Phe Lys Glu Ile Lys Glu Ala Tyr Glu Val Leu65                  70                  75                  80Thr Asp Ser Gln Lys Arg Ala Ala Tyr Asp Gln Tyr Gly His Ala Ala
             85                  90                  95Phe Glu Gln Gly Gly Met Gly Gly Gly Gly Phe Gly Gly Gly Ala Asp
        100                 105                 110Phe Ser Asp Ile Phe Gly Asp Val Phe Gly Asp Ile Phe Gly Gly Gly
    115                 120                 125Arg Gly Arg Gln Arg Ala Ala Arg Gly Ala Asp Leu Arg Tyr Asn Met
130                 135                 140Glu Leu Thr Leu Glu Glu Ala Val Arg Gly Val Thr Lys Glu Ile Arg145                 150                155                  160Ile Pro Thr Leu Glu Glu Cys Asp Val Cys His Gly Ser Gly Ala Lys
            165                 170                 175Pro Gly Thr Gln Pro Gln Thr Cys Pro Thr Cys His Gly Ser Gly Gln
        180                 185                 190Val Gln Met Arg Gln Gly Phe Phe Ala Val Gln Gln Thr Cys Pro His
    195                 200                 205Cys Gln Gly Arg Gly Thr Leu Ile Lys Asp Pro Cys Ash Lys Cys His
210                 215                 220Gly His Gly Arg Val Glu Arg Ser Lys Thr Leu Ser Val Lys Ile Pro225                 230                 235                 240Ala Gly Val Asp Thr Gly Asp Arg Ile Arg Leu Ala Gly Glu Gly Glu
            245                 250                 255Ala Gly Glu His Gly Ala Pro Ala Gly Asp Leu Tyr Val Gln Val Gln
        260                 265                 270Val Lys Gln His Pro Ile Phe Glu Arg Glu Gly Asn Asn Leu Tyr Cys
    275                 280                 285Glu Val Pro Ile Asn Phe Ala Met Ala Ala Leu Gly Gly Glu Ile Glu
290                 295                 300Val Pro Thr Leu Asp Gly Arg Val Lys Leu Lys Val Pro Gly Glu Thr305                 310                 315                 320Gln Thr Gly Lys Leu Phe Arg Met Arg Gly Lys Gly Val Lys Ser Val
            325                 330                 335Arg Gly Gly Ala Gln Gly Asp Leu Leu Cys Arg Val Val Val Glu Thr
        340                 345                 350Pro Val Gly Leu Asn Glu Arg Gln Lys Gln Leu Leu Gln Glu Leu Gln
    355                 360                 365Glu Ser Phe Gly Gly Pro Thr Gly Glu His Asn Ser Pro Arg Ser Lys
370                 375                 380Ser Phe Phe Asp Gly Val Lys Lys Phe Phe Asp Asp Leu Thr Arg  *385                 390                 395                 400<210>       3<211>       1881<212>       脱氧核糖核酸<213>       大肠杆菌<220><22l>       CDS<222>       (392)...(790)<400>       序列3TAGGCGTATC ACGAGGCCCT TTGGATAACC AGAAGCAATA AAAAATCAAA TCGGATTTCA      60CTATATAATC TCACTTTATC TAAGATGAAT CCGATGGAAG CATCCTGTTT TCTCTCAATT     120TTTTTATCTA AAACCCAGCG TTCGATGCTT CTTTGAGCGA ACGATCAAAA ATAAGTGCCT     180TCCCATCAAA AAAATATTCT CAACATAAAA AACTTTGTGT AATACTTGTA ACGCTACATG     240GAGATTAACT CAATCTAGCT AGAGAGGCTT TACACTTTAT GCTTCCGGCT CGTATAATGT     300GTGGAATTGT GAGCGGATAA CAATTTCACA CAGGAAACAG CTATGACCAT GATTACGGAT     360TCACTGGAAC TCTAGATAAC GAGGGCAAAA A ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG        412
                               Het Lys Lys Thr Ala Ile Ala
                                 1               5ATT GCA GTG GCA CTG GCT GGT TTC GCT ACC GTA GCG CAG GCC GGA ATT       460Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Gly Ile
     10                  15                  20CCA GCT AAG CAA GAT TAT TAC GAG ATT TTA GGC GTT TCC AAA ACA GCG       508Pro Ala Lys Gln Asp Tyr Tyr Glu Ile Leu Gly Val Ser Lys Thr Ala
 25                  30                  35GAA GAG CGT GAA ATC AGA AAG GCC TAC AAA CGC CTG GCC ATG AAA TAC       556Glu Glu Arg Glu Ile Arg Lys Ala Tyr Lys Arg Leu Ala Met Lys Tyr40                  45                  50                  55CAC CCG GAC CGT AAC CAG GGT GAC AAA GAG GCC GAG GCG AAA TTT AAA       604His Pro Asp Arg Asn Gln Gly Asp Lys Glu Ala Glu Ala Lys Phe Lys
             60                  65                  70GAG ATC AAG GAA GCT TAT GAA GTT CTG ACC GAC TCG CAA AAA CGT GCG       652Glu Ile Lys Glu Ala Tyr Glu Val Leu Thr Asp Ser Gln Lys Arg Ala
         75                  80                  85GCA TAC GAT CAG TAT GGT CAT GCT GCG TTT GAG CAA GGT GGC ATG GGC       700Ala Tyr Asp Gln Tyr Gly His Ala Ala Phe Glu Gln Gly Gly Met Gly
     90                  95                 100GGC GGC GGT TTT GGC GGC GGC GCA GAC TTC AGC GAT ATT TTT GGT GAC       748Gly Gly Gly Phe Gly Gly Gly Ala Asp Phe Ser Asp Ile Phe Gly Asp
105                 110                 115GTT TTC GGC GAT ATT TTT GGC GGC GGA CGT GGT CGT TAA TAG               790Val Phe Gly Asp Ile Phe Gly Gly Gly Arg Gly Arg  *   *120                 125                 130GCGGCGCGCG GTGCTGATTT ACGCTATAAC ATGGAGCTCA CCCTCGAAGA AGCTGTACGT     850GGCGTGACCA AAGAGATCCG CATTCCGACT CTGGAAGAGT GTGACGTTTG CCACGGTAGC     910GGTGCAAAAC CAGGTACACA GCCGCAGACT TGTCCGACCT GTCATGGTTC TGGTCAGGTG     970CAGATGCGCC AGGGATTCTT CGCTGTACAG CAGACCTGTC CACACTGTCA GGGCCGCGGT    1030ACGCTGATCA AAGATCCGTG CAACAAATGT CATGGTCATG GTCGTGTTGA GCGCAGCAAA    1090ACGCTGTCCG TTAAAATCCC GGCAGGGGTG GACACTGGAG ACCGCATCCG TCTTGCGGGC    1150GAAGGTGAAG CGGGCGAGCA TGGCGCACCG GCAGGCGATC TGTACGTTCA GCTTCAGGTT    1210AAACAGCACC CGATTTTCGA GCGTGAAGGC AACAACCTGT ATTGCGAAGT CCCGATCAAC    1270TTCGCTATGG CGGCGCTGGG TGGCGAAATC GAAGTACCGA CCCTTGATGG TCGCGTCAAA    1330CTGAAAGTGC CTGGCGAAAC CCAGACCGGT AAGCTATTCC GTATGCGCGG TAAAGGCGTC    1390AAGTCTGTCC GCGGTGGCGC ACAGGGTGAT TTGCTGTGCC GCGTTGTCGT CGAAACACCG    1450GTAGGCCTGA ACGAAAGGCA GAAACAGCTG CTGCAAGAGC TGCAAGAAAG CTTCGGTGGC    1510CCAACCGGCG AGCACAACAG CCCGCGCTCA AAGAGCTTCT TTGATGGTGT GAAGAAGTTT    1570TTTGACGACC TGACCCGCTA AGGATCCGGC TGAGCAACGA CGTGAACGCA ATGCGTTCCG    1630ACGTTCAGGC TGCTAAAGAT GACGCAGCTC GTGCTAACCA GCGTCTGGAC AACATGGCTA    1690CTAAATACCG CAAGTAATAG TACCTGTGAA GTGAAAAATG GCGCACATTG TGCGACATTT    1750TTTTTGTCTG CCGTTTACCG CTACTGCGTC ACGCGTAACA TATTCCCTTG CTCTGGTTCA    1810CCATTCTGCG CTGACTCTAC TGAAGGCCCA TTGCTGGCTG CGGGAGTTGC TCCACTGCTC    1870ACCGAAACCG G                                                         1881<210>      4<211>      133<212>      蛋白质<213>      大肠杆菌<400>      序列4Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala1               5                  10                  15Thr Val Ala Gln Ala Gly Ile Pro Ala Lys Gln Asp Tyr Tyr Glu Ile
         20                  25                  30Leu Gly Val Ser Lys Thr Ala Glu Glu Arg Glu Ile Arg Lys Ala Tyr
     35                  40                  45Lys Arg Leu Ala Met Lys Tyr His Pro Asp Arg Asn Gln Gly Asp Lys
 50                  55                  60Glu Ala Glu Ala Lys Phe Lys Glu Ile Lys Glu Ala Tyr Glu Val Leu65                  70                  75                  80Thr Asp Ser Gln Lys Arg Ala Ala Tyr Asp Gln Tyr Gly His Ala Ala
             85                  90                  95Phe Glu Gln Gly Gly Met Gly Gly Gly Gly Phe Gly Gly Gly Ala Asp
        100                 105                 110Phe Ser Asp Ile Phe Gly Asp Val Phe Gly Asp Ile Phe Gly Gly Gly
    115                 120                 125Arg Gly Arg  *   *
130<210>       5<211>       1379<212>       脱氧核糖核酸<213>       大肠杆菌<220><221>       CDS<222>       (392)...(1090)<400>       序列5TAGGCGTATC ACGAGGCCCT TTGGATAACC AGAAGCAATA AAAAATCAAA TCGGATTTCA     60CTATATAATC TCACTTTATC TAAGATGAAT CCGATGGAAG CATCCTGTTT TCTCTCAATT    120TTTTTATCTA AAACCCAGCG TTCGATGCTT CTTTGAGCGA ACGATCAAAA ATAAGTGCCT    180TCCCATCAAA AAAATATTCT CAACATAAAA AACTTTGTGT AATACTTGTA ACGCTACATG    240GAGATTAACT CAATCTAGCT AGAGAGGCTT TACACTTTAT GCTTCCGGCT CGTATAATGT    300GTGGAATTGT GAGCGGATAA CAATTTCACA CAGGAAACAG CTATGACCAT GATTACGGAT      360TCACTGGAAC TCTAGATAAC GAGGGCAAAA A ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG         412
                               Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala
                                 1               5ATT GCA GTG GCA CTG GCT GGT TTC GCT ACC GTA GCG CAG GCC GGA ATT        460Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Gly Ile
     10                  15                  20CTC ACC GAG CGC CGC GTG CCC TTC TCG CTG CTG CGG AGC CCG AGC TGG        508Leu Thr Glu Arg Arg Val Pro Phe Ser Leu Leu Arg Ser Pro Ser Trp
 25                  30                  35GAA CCA TTC CGG GAC TGG TAC CCT GCA CAC AGC CGC CTC TTC GAT CAA        556Glu Pro Phe Arg Asp Trp Tyr Pro Ala His Ser Arg Leu Phe Asp Gln40                  45                  50                  55GCT TTC GGG GTG CCC CGG TTG CCC GAT GAG TGG TCG CAG TGG TTC AGC        604Ala Phe Gly Val Pro Arg Leu Pro Asp Glu Trp Ser Gln Trp Phe Ser
             60                  65                  70GCC GCT GGG TGG CCC GGA TAC GTG CGC CCG CTG CCC GCC GCG ACC GCC        652Ala Ala Gly Trp Pro Gly Tyr Val Arg Pro Leu Pro Ala Ala Thr Ala
         75                  80                  85GAG GGC CCC GCG GCG GTG ACC CTG GCC GCA CCA GCC TTC AGC CGA GCG        700Glu Gly Pro Ala Ala Val Thr Leu Ala Ala Pro Ala Phe Ser Arg Ala
     90                  95                 100CTC AAC CGA CAG CTC AGC AGC GGG GTC TCG GAG ATC CGA CAG ACG GCT        748Leu Asn Arg Gln Leu Ser Ser Gly Val Ser Glu Ile Arg Gln Thr Ala
105                 110                 115GAT CGC TGG CGC GTG TCC CTG GAC GTC AAC CAC TTC GCT CCG GAG GAG        796Asp Arg Trp Arg Val Ser Leu Asp Val Asn His Phe Ala Pro Glu Glu120                 125                 130                 135CTC ACA GTG AAG ACC AAG GAA GGC GTG GTG GAG ATC ACT GGC AAG CAC        844Leu Thr Val Lys Thr Lys Glu Gly Val Val Glu Ile Thr Gly Lys His
            140                 145                 150GAA GAA AGG CAG GAC GAA CAT GGC TAC ATC TCT CGG TGC TTC ACC CGG        892Glu Glu Arg Gln Asp Glu His Gly Tyr Ile Ser Arg Cys Phe Thr Arg
        155                 160                 165AAA TAC ACG CTC CCT CCA GGT GTG GAC CCC ACC CTA GTG TCC TCT TCC        940Lys Tyr Thr Leu Pro Pro Gly Val Asp Pro Thr Leu Val Ser Ser Ser
    170                 175                 180CTA TCC CCT GAG GGC ACA CTT ACC GTG GAG GCT CCG TTG CCC AAA GCA        988Leu Ser Pro Glu Gly Thr Leu Thr Val Glu Ala Pro Leu Pro Lys Ala
185                 190                 195GTC ACG CAG TCA GCG GAG ATC ACC ATT CCG GTT ACT TTC GAG GCC CGC       1036Val Thr Gln Ser Ala Glu Ile Thr Ile Pro Val Thr Phe Glu Ala Arg200                 205                 210                 215GCC CAA ATT GGG GGC CCA GAA GCT GGG AAG TCT GAA CAG TCT GGA GCC       1084Ala Gln Ile Gly Gly Pro Glu Ala Gly Lys Ser Glu Gln Ser Gly Ala
        220                     225                 230AAG TAG GATCCGGCTG AGCAACGACG TGAACGCAAT GCGTTCCGAC GTTCAGGCTG        1140Lys  *CTAAAGATGA CGCAGCTCGT GCTAACCAGC GTCTGGACAA CATGGCTACT AAATACCGCA     1200AGTAATAGTA CCTGTGAAGT GAAAAATGGC GCACATTGTG CGACATTTTT TTTGTCTGCC     1260GTTTACCGCT ACTGCGTCAC GCGTAACATA TTCCCTTGCT CTGGTTCACC ATTCTGCGCT     1320GACTCTACTG AAGGCGCATT GCTGGCTGCG GGAGTTGCTC CACTGCTCAC CGAAAACCGG     1379<210>       6<211>       233<212>       蛋白质<213>       大肠杆菌<400>       序列6Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala1               5                  10                  15Thr Val Ala Gln Ala Gly Ile Leu Thr Glu Arg Arg Val Pro Phe Ser
         20                  25                  30Leu Leu Arg Ser Pro Ser Trp Glu Pro Phe Arg Asp Trp Tyr Pro Ala
     35                  40                  45His Ser Arg Leu Phe Asp Gln Ala Phe Gly Val Pro Arg Leu Pro Asp
 50                  55                  60Glu Trp Ser Gln Trp Phe Ser Ala Ala Gly Trp Pro Gly Tyr Val Arg65                  70                  75                  80Pro Leu Pro Ala Ala Thr Ala Glu Gly Pro Ala Ala Val Thr Leu Ala
             85                  90                  95Ala Pro Ala Phe Ser Arg Ala Leu Asn Arg Gln Leu Ser Ser Gly Val
        100                 105                 110Ser Glu Ile Arg Gln Thr Ala Asp Arg Trp Arg Val Ser Leu Asp Val
    115                 120                 125Asn His Phe Ala Pro Glu Glu Leu Thr Val Lys Thr Lys Glu Gly Val
130                 135                 140Val Glu Ile Thr Gly Lys His Glu Glu Arg Gln Asp Glu His Gly Tyr145                 150                 155                 160Ile Ser Arg Cys Phe Thr Arg Lys Tyr Thr Leu Pro Pro Gly Val Asp
            165                 170                 175Pro Thr Leu Val Ser Ser Ser Leu Ser Pro Glu Gly Thr Leu Thr Val
        180                 185                 190Glu Ala Pro Leu Pro Lys Ala Val Thr Gln Ser Ala Glu Ile Thr Ile
    195                 200                 205Pro Val Thr Phe Glu Ala Arg Ala Gln Ile Gly Gly Pro Glu Ala Gly
210                 215                 220Lys Ser Glu Gln Ser Gly Ala Lys  *225                 230<210>       7<211>       1256<212>       脱氧核糖核酸<213>       大肠杆菌<220><221>       CDS<222>       (199)...(969)<400>       序列7GATCTGGCTT TACACTTTAT GCTTCCGGCT CGTATGTTGT GTGGAATTGT GAGCGGATAA      60CAATTTCACA CAGGAAACAG CTATGACCAT GATTACGCCA AGCTTGCATG CAAATTCTAT     120TTCAAGGAGA CAGTCATAAT GAAATACCTA TTGCCTACGG CAGCCGCTGG ATTGTTATTA     180CTCGCGGCCC AGCCGGCC ATG GCC GAG GTC AAG CTG CAG GAG TCT GGG GGA       231
                Met Ala Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly
                  1               5                  10GGC TTA GTG GAG CCT GGA GGG TCC CGG AAA GTC TCC TGT GCA GCC TCT       279Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser
         15                  20                  25GGA TTC ACT TTC AGT AGC TTT GGA ATG CAC TGG GTT CGT CAG GCT CCA       327Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro
     30                  35                  40GAG AAG GGG CTG GAG TGG GTC GCA TAT ATT AGT AGT GGC AGT AGT ACC       375Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr
 45                  50                  55ATC TAC TAT GCA GAC ACA GTG AAG GGC CGA TTC ACC ATC TCC AGA GAC       423Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp60                  65                  70                  75AAT CCC AAG AAC ACC CTG TTC CTG CAA ATG ACC AGT CTA AGG TCT GAG        471Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu
             80                  85                  90GAC ACG GCC ATG TAT TAC TGC GCA AGA GAT TAC GGG GCT TAT TGG GGC        519Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Gly Ala Tyr Trp Gly
         95                 100                 105CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA        567Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
    110                 115                 120GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCG GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA        615Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro
125                 130                 135GCA ATC ATG TCT GCA TCT CCA GGG GAG AAG GTC ACC ATG ACC TGC AGT        663Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser140                 145                 150                 155GCC AGT TCA AGT GTA AGG TAC ATG AAC TGG TTC CAA CAG AAG TCA GGC        711Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Ser Gly
            160                 165                 170ACC TCC CCC AAA AGA TGG ATT TAT GAC ACA TCC AAA CTG TCT TCT GGA        759Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ser Ser Gly
        175                 180                 185GTC CCT GCT CGC TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC        807Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu
    190                 195                 200ACA ATC AGC AGC ATG GAG GCT GAA GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAG        855Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
205                 210                 215CAG TGG AGT AGT AAT CCA CTC ACT TTC GGT GCT GGG ACC AAG CTG GAG        903Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu220                 225                 230                 235CTG AAA CGG GCG GCC GCA GAA CAA AAA CTC ATC TCA GAA GAG GAT CTG        951Leu Lys Arg Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
            240                 245                 250AAT GGG GCC GCA TAG TAA CTGAGCAACG ACGTGAACGC AATGCGTTCC               999Asn Gly Ala Ala  *   *
        255GACGTTCAGG CTGCTAAAGA TGACGCAGCT CGTGCTAACC AGCGTCTGGA CAACATGGCT     1059ACTAAATACC GCAAGTAATA GTACCTGTGA AGTGAAAAAT GGCGCACATT GTGCGACATT     1119TTTTTTGTCT GCCGTTTACC GCTACTGCGT CACGCGTAAC ATATTCCCTT GCTCTGGTTC     1179ACCATTCTGC GCTGACTCTA CTGAAGGCGC ATTGCTGGCT GCGGGAGTTG CTCCACTGCT     1239CACCGAAACC GGAGATC                                                 1256<210>       8<211>       257<212>       蛋白质<213>       大肠杆菌<400>       序列8Met Ala Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro1               5                  10                  15Gly Gly Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
         20                  25                  30Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu
     35                  40                  45Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp
 50                  55                  60Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr65                  70                  75                  80Leu Phe Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr
             85                  90                  95Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
        100                 105                 110Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
    115                 120                 125Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala
130                 135                 140Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val145                 150                 155                 160Arg Tyr Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg
            165                 170                 175Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ser Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe
        180                 185                 190Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met
    195                 200                 205Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn
210                 215                 220Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Ala225                 230                 235                 240Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala  *
            245                 250                 255*<210>       9<211>       1137<212>       脱氧核糖核酸<213>       大肠杆菌<220><221>       CDS<222>       (1)...(1137)<400>       序列9ATG AAA TAC CTG CTG CCG ACC GCT GCT GCT GGT CTG CTG CTC CTC GCT        48Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala1               5                  10                  15GCC CAG CCG GCG ATG GCC ATG GCT TAC CAA GGA AAC AGT GAC TGC TAC        96Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Ala Tyr Gln Gly Asn Ser Asp Cys Tyr
         20                  25                  30TTT GGG AAT GGG TCA GCC TAC CGT GGC ACG CAC AGC CTC ACC GAG TCG       144Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser
     35                  40                  45GGT GCC TCC TGC CTC CCG TGG AAT TCC ATG ATC CTG ATA GGC AAG GTT       192Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser Mer Ile Leu Ile Gly Lys Val
 50                  55                  60TAC ACA GCA CAG AAC CCC AGT GCC CAG GCA CTG GGC CTG GGC AAA CAT       240Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys His65                   70                  75                  80AAT TAC TGC CGG AAT CCT GAT GGG GAT GCC AAG CCC TGG TGC CAC GTG       288Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Val
             85                  90                  95CTG ACG AAC CGC AGG CTG ACG TGG GAG TAC TGT GAT GTG CCC TCC TGC       336Leu Thr Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys
        100                 105                 110TCC ACC TGC GGC CTG AGA CAG TAC AGC CAG CCT CAG TTT CGC ATC AAA       384Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr Ser Gln Pro Gln Phe Arg Ile Lys
    115                 120                 125GGA GGG CTC TTC GCC GAC ATC GCC TCC CAC CCC TGG CAG GCT GCC ATC       432Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro Trp Gln Ala Ala Ile
130                 135                 140TTT GCC AAG CAC AGG AGG TCG CCC GGA GAG CGG TTC CTG TGC GGG GGC        480Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly145                 150                 155                 160ATA CTC ATC AGC TCC TGC TGG ATT CTC TCT GCC GCC CAC TGC TTC CAG        528Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gln
            165                 170                 175GAG AGG TTT CCG CCC CAC CAC CTG ACG GTG ATC TTG GGC AGA ACA TAC        576Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Val Ile Leu Gly Arg Thr Tyr
        180                 185                 190CGG GTG GTC CCT GGC GAG GAG GAG CAG AAA TTT GAA GTC GAA AAA TAC        624Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr
    195                 200                 205ATT GTC CAT AAG GAA TTC GAT GAT GAC ACT TAC GAC AAT GAC ATT GCG        672Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala
210                 215                 220CTG CTG CAG CTG AAA TCG GAT TCG TCC CGC TGT GCC CAG GAG AGC AGC        720Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys Ala Gln Glu Ser Ser225                 230                 235                 240GTG GTC CGC ACT GTG TGC CTT CCC CCG GCG GAC CTG CAG CTG CCG GAC        768Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gln Leu Pro Asp
            245                 250                 255TGG ACG GAG TGT GAG CTC TCC GGC TAC GGC AAG CAT GAG GCC TTG TCT        816Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser
        260                 265                 270CCT TTC TAT TCG GAG CGG CTG AAG GAG GCT CAT GTC AGA CTG TAC CCA        864Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro
    275                 280                 285TCC AGC CGC TGC ACA TCA CAA CAT TTA CTT AAC AGA ACA GTC ACC GAC        912Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp
290                 295                 300AAC ATG CTG TGT GCT GGA GAC ACT CGG AGC GGC GGG CCC CAG GCA AAC        960Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn305                 310                 315                 320TTG CAC GAC GCC TGC CAG GGC GAT TCG GGA GGC CCC CTG GTG TGT CTG       1008Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu
            325                 330                 335AAC GAT GGC CGC ATG ACT TTG GTG GGC ATC ATC AGC TGG GGC CTG GGC       1056Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly
        340                 345                 350TGT GGA CAG AAG GAT GTC CCG GGT GTG TAC ACC AAG GTT ACC AAC TAC       1104Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr
    355                 360                 365CTA GAC TGG ATT CGT GAC AAC ATG CGA CCG TGA                          1137Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro  *
370                 375<210>       10<211>       379<212>       蛋白质<213>       大肠杆菌<400>       序列10Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala1               5                  10                  15Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Ala Tyr Gln Gly Asn Ser Asp Cys Tyr
         20                  25                  30Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser
     35                  40                  45Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile Leu Ile Gly Lys Val
 50                  55                  60Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys His65                  70                 75                   80Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Val
             85                  90                  95Leu Thr Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys
        100                 105                 110Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr Ser Gln Pro Gln Phe Arg Ile Lys
    115                 120                 125Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro Trp Gln Ala Ala Ile
130                 135                 140Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly145                 150                 155                 160Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gln
            165                 170                 175Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Val Ile Leu Gly Arg Thr Tyr
        180                 185                 190Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr
    195                 200                 205Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala
210                 215                 220Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys Ala Gln Glu Ser Ser225                 230                 235                 240Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gln Leu Pro Asp
            245                 250                 255Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser
        260                 265                 270Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro
    275                 280                 285Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His Leu Leu Ash Arg Thr Val Thr Asp
290                 295                 300Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn305                 310                 315                 320Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu
            325                 330                 335Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly
        340                 345                 350Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr
    355                 360                 365Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro  *
370                 375

Claims (10)

1.通过培养原核生物的细胞生产一种通过二硫键连接二个或几个半胱氨酸的、水溶性的、天然折叠真核多肽的方法，
a)其中所说的原核细胞含有编码所说的在N-末端含有原核生物的信号序列的多肽的一个表达载体，
b)在多肽分泌到周质或培养基中的条件下，
c)切除信号序列，并从周质或培养基中分离该多肽。其中该培养是在有精氨酸或通式(I)的一种化合物存在下进行的
R2-CO-NRR1                       (I)
其中R和R1代表氢或一种饱和的或不饱和的支链或直链C1-C4烷基链和R2代表氢、NHR1或饱和的或不饱和的支或直链C1-C3烷基链。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所使用的精氨酸是其盐酸盐或其它的滴定形式。
3.根据权利要求1至2所述的方法，其中一种还原性硫醇试剂被加入到培养基中。
4.根据权利要求3所述的方法，其中使用的谷胱甘肽(GSH)作为还原性硫醇试剂。
5.根据权利要求1至4任意一项所述的方法，其中信号序列是由格兰氏阴性细菌得到的。
6.根据权利要求1至5中的任一项所述的方法，其中原核细胞还含有一个编码一种分子伴侣的表达载体。
7.根据权利要求6所述的方法，其中分子伴侣是来自大肠杆菌的DNAJ，或Hsp25。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中编码分子伴侣的重组DNA与一个编码能渗过细菌内膜的一个信号肽的DNA片段有效连接。
9.根据权利要求6至8其中之一所述的方法，其中编码分泌的分子伴侣和/或分泌的蛋白质的DNA是在一种可诱导的表达信号控制下。
10.根据权利要求1至9其中之一所述的方法，其中多肽是一种抗体，抗体片段，干扰素，蛋白质荷尔蒙或一种蛋白酶。
CNB001059742A 1999-04-26 2000-04-24 天然折叠和分泌型蛋白质的制备方法 Expired - Fee Related CN1231594C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP99107412.1 1999-04-26
EP99107412A EP1048732A1 (de) 1999-04-26 1999-04-26 Verfahren zur Herstellung von natürlich gefalteten und sekretierten Proteinen

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1272550A true CN1272550A (zh) 2000-11-08
CN1231594C CN1231594C (zh) 2005-12-14

Family

ID=8237962

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB001059742A Expired - Fee Related CN1231594C (zh) 1999-04-26 2000-04-24 天然折叠和分泌型蛋白质的制备方法

Country Status (12)

Country Link
US (1) US6309861B1 (zh)
EP (2) EP1048732A1 (zh)
JP (1) JP3691722B2 (zh)
KR (1) KR100361049B1 (zh)
CN (1) CN1231594C (zh)
AT (1) ATE276369T1 (zh)
CA (1) CA2304437C (zh)
DE (1) DE60013689T3 (zh)
DK (1) DK1054063T4 (zh)
ES (1) ES2228331T5 (zh)
JO (1) JO2253B1 (zh)
MX (1) MXPA00004007A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100457909C (zh) * 2000-11-14 2009-02-04 贝林格尔·英格海姆国际有限公司 于原核生物中制备大量蛋白的方法
CN110734480A (zh) * 2019-11-07 2020-01-31 中国科学院遗传与发育生物学研究所 大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES在协助合成植物Rubisco中的应用
CN111320700A (zh) * 2018-12-15 2020-06-23 上海渔霁生物技术有限公司 一种重组金黄色葡萄球菌a蛋白及其制备方法与应用
CN112480255A (zh) * 2007-07-09 2021-03-12 健泰科生物技术公司 在多肽的重组生产期间防止二硫键还原

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1077263A1 (de) 1999-07-29 2001-02-21 F.Hoffmann-La Roche Ag Verfahren zur Herstellung von natürlich gefalteten und sekretierten Proteinen durch Co-Sekretion von Chaperonen
GB0027779D0 (en) * 2000-11-14 2000-12-27 Boehringer Ingelheim Int Methods for large scale production of recombinant dna-derived tpa or k2s molecules
US6955910B2 (en) 2000-11-14 2005-10-18 Boehringer Ingelheim International Gmbh Method for large scale production of recombinant DNA-derived TPA or K2S molecules
US7087412B2 (en) 2000-11-14 2006-08-08 Boehringer Ingelheim International Gmbh Methods for large scale protein production in prokaryotes
JP2002306163A (ja) * 2001-04-11 2002-10-22 Chemo Sero Therapeut Res Inst 大腸菌を宿主とする遺伝子組換えヒトトロンビンの調製方法
WO2014054744A1 (ja) * 2012-10-03 2014-04-10 協和発酵キリン株式会社 培養液にアミノ酸を添加することによるポリペプチドの還元防止方法
MA45489A (fr) 2015-10-22 2018-08-29 Juno Therapeutics Gmbh Procédés de culture de cellules, kits et appareil associés
BR112019022356A2 (pt) 2017-04-27 2020-05-26 Juno Therapeutics Gmbh Reagentes de partícula oligoméricos e métodos de uso dos mesmos
US10973908B1 (en) 2020-05-14 2021-04-13 David Gordon Bermudes Expression of SARS-CoV-2 spike protein receptor binding domain in attenuated salmonella as a vaccine

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4757013A (en) * 1983-07-25 1988-07-12 The Research Foundation Of State University Of New York Cloning vehicles for polypeptide expression in microbial hosts
US5453363A (en) 1985-10-23 1995-09-26 Boehringer Mannheim Gmbh Process for the activation of t-PA or Ing after genetic expression in prokaryotes
DE3537708A1 (de) * 1985-10-23 1987-04-23 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur aktivierung von t-pa nach expression in prokaryonten
EP0396612B1 (en) * 1988-01-11 1996-07-24 Xoma Corporation Novel plasmid vector with pectate lyase signal sequence
DE4113750A1 (de) * 1991-04-26 1992-10-29 Boehringer Mannheim Gmbh Verbesserung der renaturierung bei der sekretion von disulfidverbrueckten proteinen
US5789199A (en) * 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5639635A (en) * 1994-11-03 1997-06-17 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
FR2729972B1 (fr) † 1995-01-31 1997-04-18 Sanofi Sa Procede d'extraction de proteines periplasmiques de microorganismes procaryotes en presence d'arginine
JPH09173078A (ja) * 1995-09-14 1997-07-08 Tadayuki Imanaka 分子シャペロンを用いる蛋白質の製造方法
AU2660397A (en) † 1996-04-05 1997-10-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing soluble, biologically-active disulfide bond-containing eukaryotic proteins in bacterial cells
JP3344618B2 (ja) * 1997-06-20 2002-11-11 株式会社エイチ・エス・ピー研究所 シャペロン発現プラスミド

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100457909C (zh) * 2000-11-14 2009-02-04 贝林格尔·英格海姆国际有限公司 于原核生物中制备大量蛋白的方法
CN112480255A (zh) * 2007-07-09 2021-03-12 健泰科生物技术公司 在多肽的重组生产期间防止二硫键还原
CN111320700A (zh) * 2018-12-15 2020-06-23 上海渔霁生物技术有限公司 一种重组金黄色葡萄球菌a蛋白及其制备方法与应用
CN111320700B (zh) * 2018-12-15 2022-12-06 上海渔霁生物技术有限公司 一种重组金黄色葡萄球菌a蛋白及其制备方法与应用
CN110734480A (zh) * 2019-11-07 2020-01-31 中国科学院遗传与发育生物学研究所 大肠杆菌分子伴侣GroEL/ES在协助合成植物Rubisco中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
DK1054063T4 (da) 2010-11-29
CN1231594C (zh) 2005-12-14
JP2000316591A (ja) 2000-11-21
EP1054063B2 (en) 2010-09-22
EP1054063A2 (en) 2000-11-22
DE60013689T2 (de) 2005-09-29
ES2228331T3 (es) 2005-04-16
DE60013689T3 (de) 2011-02-17
ATE276369T1 (de) 2004-10-15
DK1054063T3 (da) 2004-12-13
CA2304437A1 (en) 2000-10-26
CA2304437C (en) 2004-11-09
JO2253B1 (en) 2004-10-07
EP1054063B1 (en) 2004-09-15
KR20010029665A (ko) 2001-04-06
EP1054063A3 (en) 2001-01-10
KR100361049B1 (ko) 2002-11-18
US6309861B1 (en) 2001-10-30
EP1048732A1 (de) 2000-11-02
ES2228331T5 (es) 2011-01-27
MXPA00004007A (es) 2002-06-04
JP3691722B2 (ja) 2005-09-07
DE60013689D1 (de) 2004-10-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1283702A (zh) 通过分子伴侣的共分泌制备天然折叠的和分泌的蛋白质的方法
CN1272550A (zh) 天然折叠和分泌型蛋白质的制备方法
CN1529757A (zh) 用于向细菌培养物上清液中分泌目的蛋白质的融合蛋白质
Khushoo et al. Optimization of extracellular production of recombinant asparaginase in Escherichia coli in shake-flask and bioreactor
CN1759186A (zh) 多肽的纯化
CN1561394A (zh) 人嗜中性粒细胞明胶酶相关脂卡林及有关蛋白的突变蛋白
CN1149318A (zh) 虫荧光素酶
CN101054569A (zh) 一种基因工程菌、制备及其用途
CN1854294A (zh) 分泌表达重组人表皮生长因子的大肠杆菌表达系统
CN1310232A (zh) 生产蛋白酶的方法
US9347107B2 (en) Vector containing multiple nucleotide sequences for the expression of enzymes
CN1230543C (zh) 蛋白质生产
CN1334867A (zh) 转谷氨酰胺酶的制备方法
CN1242062C (zh) 生产等电点高于8或低于5的多肽的方法
CN1353762A (zh) 用于多肽的表达和分泌的果胶酸裂解酶融合体
Malik et al. Periplasmic production of native human proinsulin as a fusion to E. coli ecotin
CN1231259C (zh) 生产人胰岛素
CN1261581C (zh) 在原核细胞有控制地表达重组蛋白质的新构建体
Borjaliloo et al. Comparison of T7-and lac-based systems for the periplasmic expression of human granulocyte macrophage colony stimulating factor in Escherichia coli
CN1183246C (zh) 利用芽孢杆菌进行纤维素结合结构域(cbd)的细胞外表达
CN1240839C (zh) 一种大肠杆菌通用的高效可溶表达载体系统
CN1820023A (zh) 化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)半胱氨酸蛋白酶的重组表达及其免疫原性复合物
CN86102977A (zh) 蛋白质的生产
CN1234726C (zh) 节节麦高分子谷蛋白Dtx1.5亚基编码基因的核酸序列、表达载体和应用
CN1289780A (zh) 编码新的融合蛋白的dna和通过该dna的表达来制备有用的多肽的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C06 Publication
PB01 Publication
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20051214

Termination date: 20120424