CN100457909C

CN100457909C - 于原核生物中制备大量蛋白的方法

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Publication number: CN100457909C
Application number: CNB018188974A
Authority: CN
Inventors: 罗尔夫-冈瑟·沃纳; 弗雷德里克·戈茨; 查特蔡·塔亚皮瓦塔纳; 吉拉德杰·马诺斯罗伊; 阿兰亚·马诺斯罗伊
Original assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority date: 2000-11-14
Filing date: 2001-11-08
Publication date: 2009-02-04
Anticipated expiration: 2021-11-08
Also published as: WO2002040696A2; EP1343909A2; EP1343909B1; UY27021A1; PT1343909E; ATE440145T1; MXPA03004162A; CN1628176A; ES2332124T3; JP2004513648A; CA2428643A1; GB0027782D0; WO2002040696A3; HK1077848A1; KR20030051821A; CY1110546T1; DE60139635D1; AU2002221824A1; KR100857402B1; DK1343909T3

Abstract

本发明是属于在原核细胞内制备蛋白的领域。本发明是关于在原核细胞内制备重组DNA衍生性异源蛋白的方法，其中该异源性蛋白是可胞外分泌成有活性的且正确折叠的蛋白，且该原核细胞包含并可表达一载体，其包含编码该异源性蛋白的DNA，其可操作连接于编码信号肽OmpA的DNA。

Description

于原核生物中制备大量蛋白的方法

技术领域

背景技术

异源性蛋白的原核表达系统普遍地使用于不需哺乳类糖基化型式的蛋白，因其提供一种可大量制备该蛋白的廉价方法。高度聚集性蛋白或内含体(inclusion body)的生成普遍发现于大肠埃希氏菌内许多异源性蛋白的高度表达时。制备蛋白的一种方法是藉由细胞质内所产生的内含体。用于制备的原核细胞(例如：大肠埃希氏菌)的细胞壁及外膜成份通常于藉由低速离心制备该内含体时，会污染含有异源性蛋白的细胞溶解物。外膜成分可藉由清洁剂及低浓度的尿素或胍啶-HCl的选择性提取来消除。

此等异源性蛋白的一实例为tPA衍生物。

组织纤溶酶原激活物(tPA)是为一种含有527个氨基酸残基的多肽(27)，其分子量为72kDa。该分子分成五个构造性功能域。邻近N-端区域者为环状的手指功能域，其后接着生长因子功能域。其后接着两个相似的功能域，kringle 1与kringle 2。手指及kringle 2功能域均特异性结合于纤维蛋白凝块，因而加速结合的纤溶酶原的tPA蛋白活化。Kringle 2的下游为丝氨酸蛋白酶，其催化位置位于C-端。丝氨酸蛋白酶是负责将纤溶酶原转化成纤溶酶，此为纤维蛋白生成性止血与凝块溶解的体内平衡中的重要反应。tPA的正确折叠需要分子内17个二硫键的正确配对(1)。

临床上，tPA是被选用来治疗急性心肌梗塞的溶血栓剂。其优点为不引起系统性出血及纤维蛋白原耗竭的副作用(7)。Bowes黑色素瘤细胞是最先用于治疗用途的tPA的制备源(12)。因为临床使用上需要具有良好产率的高度纯化蛋白的有效生产的固定制程，故于哺乳类细胞中进行全长重组-tPA(r-tPA)的构筑。以tPA基因转染中国仓鼠卵巢细胞以合成r-tPA(8，22)。由培养基中回收藉由哺乳动物细胞发酵系统生产的重组产物。由于具简单及经济生产的吸引力，许多人致力于研究从细菌，特别是从大肠埃希氏菌(Escherichia coli)生产tPA(10，13，30)。关于其低产率及内含体的生成，其可导致错误折叠及没有活性的酶，有许多策略已被提出以克服此等问题。主要的原则是合成最小的分子，其可替代全长tPA而仍有活性。

数种的缺失突变变体，包括kringle 2加丝氨酸蛋白酶(K2S)是在考虑之列。然而，重组-K2S(r-K2S)的酶活性的获得仅可于得自细胞质成分的经纯化内含体的再折叠过程完成时(16，29)。为要避免繁复的再折叠过程及周质蛋白的运送，可使用特殊的细菌表达系统(6，31)。尽管tPA在周质表达，但过度表达也会导致没有活性的聚集物，纵使于周质的相对较高氧化状态下。

现有技术中，对于在大肠埃希氏菌中制备重组K2S的方法有一些说明。然而，并未揭示可大量制备生物活性K2S的具成本效益的方法。

Obukowicz等人(25)从壁膜间隙表达并纯化r-K2S。此方法的明显缺点为需额外的周质提取步骤，其并不适于大量制备。

Saito等人(29)揭示r-K2S的细胞质表达。该作者使用体内复性程序来表达r-K2S，其是以内含体的形式从大肠埃希氏菌的细胞质空间中纯化出来。Boehringer Mannheim使用类似的繁复变性/再折叠方法，其涉及消化细胞，于变性及还原状态下溶解并于GSH/GSSG存在之下于氧化状态下再有活性的的步骤，其并不具成本效益且需要氨基酸序列的突变(24)。

于1991年，Waldenstrom等人(34)构筑一种载体(pEZZK2P)，用以将kringle 2加丝氨酸蛋白酶功能域分泌至大肠埃希氏菌培养液中。使用羟胺由IgG-Sepharose纯化级分中移除ZZ融合肽。切割剂羟胺需要将kringle 2加丝氨酸蛋白酶的切割位点加以修饰(Asn¹⁷⁷→Ser及Asn¹⁸⁴→Gln)，以保护其不受羟胺的水解。然而，所得的非天然，非适当折叠的K2S分子并不适于治疗用途。该不寻常序列甚至可能活化人类免疫系统。因此本发明的所面临的问题是提供可商业化应用于异源蛋白，例如：K2S的大量制备方法，其中该异源性蛋白是以其生物活性形式分泌至培养上清液中。

发明内容

上述问题于本发明的权利要求书及说明书的范围内获得解决。

权利要求书及说明书的单一或多重使用并不受任何限制且亦包括其它型式。

本发明是关于在原核细胞内制备重组DNA衍生的异源蛋白的方法，其中该异源蛋白是可胞外分泌成有活性的且正确折叠的蛋白，其特征为该原核细胞包含并可表达一载体，该载体包含编码该异源性蛋白的DNA，所述DNA可操作连接于编码信号肽OmpA的DNA或其功能性衍生物。

出乎意料地，单独使用信号肽OmpA和/或并用N-端氨基酸SEGN/SEGNSD(SEQ ID NO：2/SEQ ID NO：3)，与现有技术中的任何其他方法相比，可有较大程度地将重组DNA-衍生的蛋白转移至外表面及促进功能性及活性分子释放至培养基中。穿越外膜之前，重组DNA-衍生的蛋白是先根据本发明的方法正确折叠。切下信号肽以制备成熟分子。出乎意料地，信号肽移除的效率极高且可导致重组DNA-衍生的蛋白的正确折叠。根据本发明的此方法，以实例1中的组织纤溶酶原激活物蛋白的kringle 2加丝氨酸蛋白酶功能域(K2S)为示例，其一般可应用以表达数种不同的蛋白及多肽，其于原核宿主细胞内不需哺乳类的糖基化。

根据本发明的方法具有超越本领域中已知方法的优点，其不仅因使用原核宿主细胞而为一种便宜的制备方法，更出人意料地，可将正确折叠的分子分泌至培养液中。

熟习此技艺者可容易藉由本发明的方法由适当的资料库中取得欲表达蛋白的DNA序列并加以克隆以使用于根据本发明的方法中。

该信号肽OmpA可与SesE交互作用并藉由SecA产生的能量而穿过内膜，其结合于Sec成分(SecE-SecY)。SecY生成分泌孔洞以递送根据本发明的重组DNA-衍生的蛋白。革兰氏阴性细菌的外膜及内膜间的空间，周质，有较细胞质空间为高的氧化状态。此可支持重组蛋白(例如：K2S)于周质中的双硫键的生成及适当折叠以产生活性分子。根据本发明，信号肽需切下以生产成熟分子。GspD分泌素(secretin)与GspS脂蛋白于外膜上的复合物提供将根据本发明的重组蛋白分泌至胞外基质的门径。此等分泌程序需要能量，其藉由GspE核苷酸结合蛋白于细胞质中产生再转移至内膜蛋白(GspG-J，F及K-N)。GspC藉由一组内膜蛋白(Gsp G-J，F及K-N)及GspD间生成交叉连接子而将能量转移至GspD。于成功穿越外膜之前，重组蛋白已先正确折叠。

根据本发明的可操作的连接是指将编码异源性蛋白的DNA(优选为于其N端部分包含编码SEGN或SEGNSD的核酸)克隆至载体内最靠近OmpADNA处，以便达成OmpA-异源蛋白融合蛋白的表达并使之直接分泌至原核宿主细胞外。典型地，大部分异源蛋白是可分泌且可再藉由适当的方法纯化，例如：以硫酸铵沉淀。本发明亦包括使用诱导剂，例如：IPTG或IPTG合并甘油，改良培养条件及收获期以使有活性的蛋白量达最高。

本发明者出乎意料地发现OmpA信号蛋白单独或可操作连接于氨基酸序列SEGN(SEQ ID NO：2)或SEGNSD(SEQ ID NO：3)导致异源蛋白分泌至培养基内而非聚积于壁膜间隙内。

于较优选的具体实施例中，该编码OmpA信号肽的DNA可融合至氨基酸序列为SEGN(SEQ ID NO：2)的短肽或编码核酸序列TCTGAGGGAAAC(SEQ ID NO：4)上并位于异源蛋白的N端部分内或N端部分处。因此，较优选者，该融合蛋白包含OmpA-SEGN-异源蛋白。再更优选者，该特征为SEGN(SEQ ID NO：2)的氨基酸可携有点突变或可由非天然氨基酸取代。再更优选者，OmpA与SEGN或SEGN与异源蛋白间有氨基酸或非氨基酸间隔子。

于较优选的具体实施例中，该编码OmpA信号肽的DNA可融合至氨基酸序列为SEGNSD(SEQ ID NO：3)的短肽或编码核酸序列TCTGAGGGAAACAGTGAC(SEQ ID NO：5)上并位于异源蛋白的N端部分内或N端部分处。因此，较优选者，该融合蛋白包含OmpA-SEGNSD-异源蛋白。再更优选者，该特征为SEGNSD(SEQ ID NO：2)的氨基酸可携有点突变或可由非天然氨基酸取代。再更优选者，OmpA与SEGNSD或SEGNSD与异源性蛋白间有氨基酸或非氨基酸间隔子。

因此，于根据本发明的较优选方法中，该原核细胞包含并可表达载体，其包含编码该异源蛋白的DNA可操作连接于编码信号肽OmpA的DNA，其是可操作连接于序列为TCTGAGGGAAACAGTGAC(SEQ ID NO：5)的核酸分子或其功能性衍生物。

此等异源蛋白包括，但不限于胰岛素，胰岛素样生长因子，hGH，tPA，细胞因子，例如：白介素(IL)，例如：IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，UIL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，IL-16，IL-17，IL-18，干扰素(IFN)α，IFNβ，IFNγ，IFNω，IFNτ，肿瘤坏死因子(TNF)，TNFα及TNFβ，TRAIL；G-CSF，GM-CSF，M-CSF，MCP-1及VEGF。

根据本发明的方法可有助于用以生产抗体或其片段。此等片段包括，例如：Fab片段(抗原结合片段＝Fab)。Fab片段是由两个链的可变区所组成，其藉由相邻的恒定区而绑在一起。其可藉由蛋白酶水解，例如：以木瓜蛋白酶而由传统抗体生成，但类似的Fab片段亦可于此时藉由基因工程制备之。

其他抗体片段包括F(ab′)2片段，其制备可藉由木瓜蛋白酶的蛋白分解性切割来制备。使用基因工程方法可生产缩短的抗体片段，其仅由重链(VH)及轻链(VL)的可变区所组成。此称之为Fv片段(可变片段＝可变部分的片段)。因为此等Fv-片段缺乏二链藉由恒定链的半胱氨酸形成的共价结合，故Fv片段常需稳定化。其藉由短肽片段，例如10至30个氨基酸，较优选为15个氨基酸连接重链及轻链的可变区是有利的。于此方法中，可取得由VH及VL所组成的单一肽链，其藉由肽连接子连接。此类的抗体蛋白称之为单链Fv(scFv)。此类由现有技术中得知的scFv-抗体蛋白的实例说明于Huston等人(1988，PNAS 16：5879-5883)中。

近年内，各种策略已被开发以制备scFv成为多聚体衍生物。此特别可生成具有改善的药物动力学及生物分布特性且具有提高的结合亲和力的抗体。为要达成scFv的多聚化，需将scFv制备成具有多聚化功能域的融合蛋白。该多聚化功能域可为，例如：IgG的CH3区或卷曲螺旋结构(螺旋结构)，例如：亮氨酸拉链功能域。然而，亦有策略中使用scFv的VH/VL区域间的交互作用以多聚化(例如：双-，三-及五体)。熟习此技艺者所谓的双倍体(diabody)为双价同二聚体scFv衍生物(Hu等人，1996，PNAS 16：5879-5883)。将scFv分子内的连接子缩短成5-10个氨基酸可导致同二聚体的形成，其中发生VH/VL的链间重叠。双倍体可额外藉由引入二硫键而稳定化。得自现有技术的双倍体抗体蛋白的实例可见于Perisic等人(1994，Structure2：1217-1226)中。

本领域技术人员所谓的微体(minibody)为双价的同二聚体scFv衍生物。其由融合蛋白所组成，所述融合蛋白含有免疫球蛋白，较优选为IgG，最优选为IgG1的CH3区作为二聚体区域，其经由绞链区(例如：亦来自IgG1者)及连接子区连接至scFv。铰链区内的二硫键主要生成于高等细胞中而非于原核生物内。现有技术中的微体抗体蛋白的实例可见于Hu等人(1996，Cancer Res.56：3055-61)。

本领域技术人员所谓的三倍体(triabody)是三价同三聚体scFv衍生物(Kortt等人，1997 Protein Engineering 10：423-433)。SvFv衍生物内的VH-VL不需藉由连接子序列而直接融合产生三聚体。

本领域技术人员亦知所谓的微抗体(miniantibodies)具有双-，三-或四价构造并衍生自scFv。多聚化的进行是藉由双，-三-，或四聚体的卷曲螺旋结构(Pack等人，1993 Biotechnology 11：1271-1277；Lovejoy等人，1993 Science259：1288-1293；Pack等人，1995 J.Mol.Biol.246：28-34)来完成的。

因此，于另一根据本发明的较优选方法中，可制备前述的抗体或抗体片段。

根据本发明的方法包含原核宿主细胞，例如，但不限于大肠埃希氏菌(E.coli)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，链霉菌属(Streptomyces)，假单胞菌属(Pseudomonas)，例如：恶臭假单胞菌(Pseudomonas putide)，奇异变形菌(Proteus mirabilis)或葡萄球菌属(Staphylococcus)，例如：肉葡萄球菌(Staphylococcus carnsous)。较优选者，该根据本发明的宿主为革兰氏阴性细菌。

较优选者，根据本发明的方法的特征亦为该原核性细胞是为大肠埃希氏菌。适当的菌株包括，但不限于大肠埃希氏菌XL-1blue，大肠埃希氏菌BL21(DE3)，大肠埃希氏菌JM109，大肠埃希氏菌DH系列，大肠埃希氏菌TOP10及大肠埃希氏菌HB101。

较优选者，根据本发明的方法的特征亦为进行下列步骤：

a)藉由PCR扩增编码异源蛋白的DNA；

b)纯化PCR产物；

c)将该PCR产物嵌入包含编码OmpA信号肽的DNA及编码gp III的DNA的载体内，其使用的方法可使该PCR产物上游可操作连接于该载体的编码OmpA信号肽的DNA，下游连接于编码gp III的DNA：

d)于该异源性蛋白与gp III之间嵌入终止密码子；

e)藉由原核细胞表达该载体；

f)纯化该异源性蛋白。

于根据本发明的步骤a)中，引物的选择/设计很重要，使其可克隆出位于表达载体的正确位置及方向上的DNA(参见实例1)。因此，实例1及图4中示例的引物包含本发明的重要方面。步骤c)的gp III是指基因蛋白III，其主要存在于噬菌粒载体中。嵌入终止密码子可避免gp III的转录，因而最后导致所欲异源蛋白的分泌。任何用以嵌入终止密码子的适当方法均可使用，例如：定点诱变(例如：Weiner MP，Costa GL(1994)PCR Methods Appl4(3)：S131-136；Weiner MP，Costa GL，Schiettlin W，Cline J，Mathur E，BauerJC(1994)Gene 151(1-2)：119-123；亦参见实例1)。

任何载体均可用于根据本发明的方法中，较优选者，该载体是为噬菌粒载体(参见下文)。

非翻译区可包含调控元件，例如：转录起始单元(启动子)或增强子。该启动子可，例如：为构成性，可诱导性或发育调控性启动子。较优选者，不排除其他已知的启动子，人类巨细胞病毒(Cytomegalovirus)(CMV)及劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)(RSV)的构成性启动子，及猴病毒40(Simianvirus 40)(SV 40)和单纯疱疹病毒启动子。根据本发明的可诱导性启动子包含抗生素抗性启动子，热休克启动子，激素诱导性“乳房肿瘤病毒启动子”及金属硫蛋白启动子。较优选的启动子包括T3启动子，T7启动子，Lac/aral及Ltet0-1。

更优选者，根据本发明的方法的特征亦为编码异源性蛋白的DNA位于lac启动子和/或核糖体结合位点，例如：Shine-Dalgarno序列之后(亦参见实例)。

根据本发明适当的载体包括，但不限于病毒性载体，例如：痘苗病毒(Vaccinia)，Semliki-Forest病毒及腺病毒属(Adenovirus)，噬菌粒载体及其类似者。较优选的载体为有益用于大肠埃希氏菌，但亦可用于任何其他原核性宿主，例如：pPROTet.E，pPROLar.A，pBAD家族，pSE家族及pQE家族成员及pCAL中。

本发明的另一较优选具体实施例是关于载体pComb3HSS，其含有根据本发明的DNA，其中该gp III蛋白的表达藉由缺失编码该gp III蛋白的DNA分子或藉由编码含异源性蛋白的多肽的基因及蛋白III基因间的终止密码子而受到抑制。

较优选者，根据本发明的方法的特征亦为该异源性蛋白是选自人类组织纤溶酶原激活物(tPA)或其片段、功能性变体、等位变体、亚单位、化学衍生物、融合蛋白或糖基化变体。此等片段、等位变体、功能性变体、基于简并的核酸密码子的变体，具有根据本发明的tPA蛋白的融合蛋白、根据本发明的tPA蛋白的糖基化变体或化学衍生物可包括一个、数个或所有的下列功能域或亚单位或其变体：

1.手指功能域(4-50)

2.生长因子功能域(50-87)

3.Kringle 1功能域(87-176)

4.kringle 2功能域(176-262)

5.蛋白酶功能域(276-527)

功能域的编号/命名是根据Genbank登录号码GI 137119或Nature 301(5897)，214-221(1983)。

较优选者，根据本发明的方法的特征亦为该异源性蛋白是选自人类组织纤溶酶原激活物(tPA)或其片段、功能性变体、等位变体、亚单位、化学衍生物、融合蛋白或糖基化变体的Kringle 2(4.)加丝氨酸蛋白酶(5.)K2S变体。

更优选者，根据本发明的方法的特征亦为该载体是为噬菌粒，其包含编码OmpA信号肽的DNA及编码gp III的DNA。

下列实例是欲用来帮助了解本发明且其不以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

材料及方法

引物设计。为要扩增tPA基因的特定部分，故合成引物对sK2/174[5′GAGGAGGAGGTGGCCCAGGCGGCCTCTGAGGGAAACAGTGAC 3′](SEQ ID NO：6)和ASSP[5′GAGGAGGAGCTGGCCGGCCTGGCCCGGTCGCATGTTGTCACG 3′](SEQ ID NO：7)(Life Technologies Grand，Island，NY)。此等引物的设计是根据撷取自NCBI资料库的人类tPA基因(g137119)。其利用Sfi I末端克隆位点(画线处)并以噬菌粒pComb3HSS内的gp III基因的自ATG的读框可遍布于整个嵌入序列的方式合成。

另一组用于定点诱变的引物是设计以与介于pComb3H-K2S的基因III和K2S基因间的序列退火。具有突变碱基(画线处)，其用以产生新的终止密码子的引物序列是为_MSTPA[5′ACATGCGACCGTGACAGGCCGGCCAG3′](SEQ ID NO：8)和_MASTPA[5′CTGGCCGGCCTGTCACGGTCGCATGT3′](SEQ ID NO：9)。

藉由PCR扩增K2S基因。将1μg sK2/174及_ASSP引物连同50ng的p51-3模板(得自Hiroshi Sasaki博士，Fujisawa Pharmaceutical，Japan)悬浮于100微升的PCR混合物中。最后于溶液中加入2.5U用量的Taq聚合酶(RocheMolecular Biochemicals，Indianapolis，IN)定量扩增条件是起始于突然开始于85℃，4分钟，再于95℃变性50秒，于42℃退火50秒，于72℃延续1.5分钟。重复进行35回合。将该混合物置于72℃下10分钟。将1110bp的扩增产物接着以QLAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN，Hilden，Gerany)纯化。以限制酶确认经纯化产物的正确性。

构筑可表达K2S的噬菌粒。将经纯化的K2S PCR产物及pComb3HSS噬菌粒(由美国Scripps Institute，Carlos F.Barbas博士赞助提供)以Sfi I(Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN)水解以制备特定的粘性克隆位点。将四微克的经纯化PCR产物以60U的Sfi I于50℃消化18小时。至于pComb3HSS，将20微克的噬菌体载体以100U Sfi I处理之。将经纯化的K2S PCR产物及pComb3HSS(～3300bp)的消化产物随后藉由QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN，Hilden，Germany)进行凝胶纯化。将5U的T4连接酶加至0.7微克的经纯化Sfi I消化的pComb3HSS及0.9微克的经纯化Sfi I消化的PCR产物的混合物中。置于30℃下进行接合反应18小时。该新构筑的噬菌粒命名为pComb3H-K2S。

XL-1Blue的转化。将200微升的CaCl₂所致的感受态大肠埃希氏菌XL-1Blue(Stratagene，La Jolla，CA)以70ng的经接合或经突变的产物进行转化。将经转化的细胞涂布于含100微克/毫升氨苄青霉素(ampicillin)及10微克/毫升四环素(Sigma，Saint Louis，MO)的LB琼脂上使之增殖。将琼脂于37℃培养18小时后，挑出数个抗生素抗性克隆以藉由碱溶解法用于噬菌粒的微量制备中。将各个经纯化的质粒进行Sfi I限制性酶切分析。将含有质粒(其中具有正确的Sfi I限制性酶切位点)的转化子随后于37℃，于含氨苄青霉素100微克/毫升及四环素10微克/毫升的100ml LB培养基中增殖18小时。质粒的大量制备是藉由使用QIAGEN质粒大量制备试剂盒(QIAGEN，Hilden，Gemany)进行的。将经纯化质粒藉由Sfi I再度检测特异的限制酶切位点并藉由AmpliTaq DNA聚合酶终止子循环测序试剂盒(Perkin-Elmer公司，Forster City，CA)测序。

pComb3H-K2S的定点诱变。将10ng的pComb3H-K2S模板与125ng的_MSTPA及_MASTPA引物混合。将2.5U的PfuTurbo DNA聚合酶(Stratagene，LAJolla，CA)加至混合物中以进行循环扩增。反应开始为一回合的95℃，30秒。再接着16回合的95℃，30秒；55℃，1分钟及68℃，9分钟。再随后将该反应管置于冰上2分钟。为要破坏模板链，故于扩增反应中加入10U的DpnI限制酶(Stratagene，LA Jolla，CA)并于37℃培养1小时。将此合成产物(MpComb3H-K2S)进一步用以转化大肠埃希氏菌XL-1Blue。

噬菌体-展示重组-K2S的制备。将pComb3H-K2S转化至大肠埃希氏菌XL-1Blue后，实行噬菌体展示技术。将经pComb3H-K2S转化的大肠埃希氏菌XL-1Blue克隆于10毫升的含氨苄青霉素100微克/毫升及四环素10微克/毫升的超培养液中，于37℃增殖至O.D.[600nm]达1.5为止。随后将该细菌培养液于100毫升的相同培养基内增殖并培养2小时。使用10¹²pfu的VCSM13辅助噬菌体(Stratagene，LA Jolla，CA)感染经转化的大肠埃希氏菌XL-1Blue。培养3小时后，将最终浓度为70微克/毫升的卡纳霉素(kanamycin)加至培养液中。使培养液于37℃下振荡(200RPM)18小时。再藉由添加4％w/v PEG MW 8000(Sigma，Saint Louis，MO)及3％w/v NaCl收获于gp3上具有K2S的噬菌体最后，将收获的噬菌体再悬浮于2毫升pH 7.4的PBS中。噬菌体数的测定是藉由感染大肠埃希氏菌XL-1Blue。如先前的说明(21)计算每毫升的菌落生成单位(cfu/ml)。

于振荡三角瓶中表达重组-K2S。将经MpComb3H-K2S转化的XL-1Blue于37℃，于pH 7.0及氨苄青霉素(100微克/毫升)存在下培养于100毫升的超培养液(3％w/v胰蛋白胨，2％w/v酵母提取物及1％w/v MOPS)中，直至O.D.[600nm]达0.8为止。随后，以1mM的IPTG(Promega，Madison，WI)诱发蛋白合成。将细菌进一步于30℃振荡培养(200RPM)6小时。收集培养上清液并以55％饱和硫酸铵沉淀(32)。将沉淀于pH 7.2的PBS中回溶并于4℃下，于相同的缓冲溶液中透析18小时。如先前由Ames等人说明者(2)，藉由利用氯仿冲击由细菌细胞提取周质蛋白。

重组-K2S的免疫分析定量。为要检测r-K2S，故于固相上包被抗-kringle2功能域单克隆抗体(16/B)(由Ute Zacharias博士慷慨提供，Central Institute ofMolecular Biology，Berlin-Buch，Germany)。进行标准的ELISA洗涤及封闭程序。将五十微升的10¹¹cfu/ml的或分泌性r-K2S加至各个抗-kringle2包被的孔中。抗原-抗体检测的进行如下。于洗涤步骤后，在各个反应孔加入绵羊抗-M13结合性HRP(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)或绵羊抗-tPA结合性HRP(Cedarlane，Ontario，Canada)。将底物TMB加至各孔中，反应30分钟后，最终以H₂SO₄溶液终止反应。使用标准黑色素瘤tPA 86/670(National Institute for Biological Standard and Control，Hertfordshine，UK)作为阳性对照。

酰胺水解活性分析。用以检测tPA酰胺水解活性的试验试剂盒是购自Chromogenix(Molndal，Sweden)。使用含有纤溶酶原及S-2251的底物混合物以测定丝氨酸蛋白酶酶活性。将各个铵沉淀样品的10^-2稀释液于具有或不具刺激剂-人类纤维蛋白原片段的情况下分析。分析步骤是根据COASETt-PA手册。

SDS-PAGE及免疫转印。将得自培养上清液的经透析的沉淀产物进一步以centricon 10(AMICON，Beverly，MA)浓缩10倍。藉由SDS-PAGE，15％分离凝胶，于还原缓冲液中将该浓缩样品进行蛋白分离，接着将之电转印至硝酸纤维素膜上。再将该硝酸纤维素膜以4％脱脂乳封闭2小时。为要检测r-K2S，故将经适当稀释的绵羊抗-tPA结合性HRP涂布于硝酸纤维素膜上。以灵敏的检测系统Amplified Opti-4CN试剂盒(BIORAD，Hercules，CA)显现免疫反应带。

共聚合的纤溶酶原聚丙烯酰胺凝胶电泳。将11％分离性丙烯酰胺凝胶与纤溶酶原及明胶共同聚合，如Heussen等人先前的说明(14)。浓缩胶为4％浓度且不含纤溶酶原及明胶。于4℃及8mA的固定电流下进行电泳。残留于凝胶片中的SDS可于室温，于2.5％Triton X-100中缓慢摇动1小时后移除。然后将该凝胶片于37℃，置于0.1M，pH 8.3的甘氨酸-NaOH中5小时。最后，藉由标准考马斯蓝(R-250)染色系统将该凝胶片染色并脱色。具有酶活性的肽位置不会被染剂染色，故与蓝色背景形成对比。

结果

K2S基因携带性载体的构筑。吾人利用引物_SK2/174和_ASSP从载体p51-3扩增tPA的kringle 2加丝氨酸蛋白酶部分(kringle 2功能域内的Ser¹⁷⁴至丝氨酸蛋白酶中的Pro⁵²⁷)。将经扩增的1110bp产物藉由琼脂凝胶电泳证实(图1，第2泳道)并藉由位于5′及3′末端上的双Sfi I切割位点将之嵌入pComb3HSS噬菌粒内的正确读框中。因而产生新载体，pComb3H-K2S，其含有K2S。于此载体中，K2S是上游侧接于OmpA信号序列及下游为gp3。K2S的正确嵌入的确认是藉由以Sfi I进行限制分析(图2，第3泳道)，PCR-分析(于1110bp处显示单一带)，及DNA测序。pComb3H-K2S模式图示于图3中。

噬菌体展示性r-K2S。使用VCSM13丝状噬菌体感染经pComb3H-K2S转化的大肠埃希氏菌XL-1Blue，X[K2S]。于病毒包装过程中，VCSM13会增殖并掺入K2S-gp3融合蛋白中。收获的重组噬菌体

以由PEG-沉淀的噬菌体再感染大肠埃希氏菌Xl-1Blue测得的，浓度为5.4×10¹¹cfu/ml。藉由三明治ELISA确认此等重组噬菌体颗粒的r-K2S表达。将噬菌体结合性异源K2S蛋白藉由单克隆抗-kringle 2抗体(16/B)，利用绵羊抗-tPA结合性HRP抗体检测系统辨识之。此分析的吸光值为1.12±0.03(表1)。于10¹²个噬菌体颗粒上可测得的K2S量相等于标准黑色素瘤tPA的蛋白336ng。为要证实K2S-gp3融合蛋白是连接于噬菌体颗粒，故以绵羊抗-M13抗体结合性HRP取代绵羊抗-tPA结合性HRP抗体。此免疫反应显示的吸光值为1.89±0.07(表1)。反之，倘若捕捉抗体为绵羊抗-M13抗体，则用绵羊抗-tPA抗体结合性HRP观察到极低的K2S；其吸光值仅为0.17±0.01(表1)。此暗示仅有少量的经纯化噬菌体颗粒携有K2S-gp3融合蛋白。使用自非转化性大肠埃希氏菌Xl-1Blue所制备的VCSM13作为阴性对照。

MpComb3H-K2S的构筑。吾人以突变引物(_MSTPA和_MASTPA)辅助，于pComb3H-K2S内的K2S与gp3间产生终止密码子(图4)。为要增加新合成及突变的MpComb3H-K2S，故将循环扩增混合物以Dpn I完全水解以降解旧dam甲基化的pComb3H-K2S模板(Dpn I较喜好dam甲基化DNA)。以pComb3H-K2S转化大肠埃希氏菌XL-1Blue后，筛选出XM[K2S]转化子进行进一步研究。bp取代的结果，有一接近K2S基因的3′端的Sfi I切割位点于定点诱变后丧失。以Sfi I切割的线形MpComb3H-K2S经观察其于4319bp处并无嵌入的K2S基因片段出现(图5，第3泳道)。因此，由MpComb3H-K2S编码的K2S基因于大肠埃希氏菌XM[K2S]内表达成非-gp3融合形式。

K2S的表达及纯化。K2S于大肠埃希氏菌XM[K2S]内的表达是由IPTG诱发。利用ELISA可于壁膜间隙及培养液内检测r-K2S。藉由三明治ELISA测定各个制品中的异源性蛋白量及与标准tPA的关系。由O.D.[600nm]为50的100毫升的振荡三角瓶培养菌液中，其周质级分产出1.38微克的r-K2S(约为32％)，然而2.96微克的r-K2S(约为68％)可得于经铵沉淀的培养上清液中。使用三明治ELISA确认得自经VCSM13感染的大肠埃希氏菌XM[K2S]的经PEG沉淀的噬菌体。以抗-M13结合性HRP并未测得由单克隆抗-kringle 2抗体捕捉的r-K2S，此表示倘若gp3遗失，则K2S不会存在于噬菌体颗粒上。

酰胺水解活性分析。倘若丝氨酸蛋白酶功能域存在于样品中，则纤溶酶原可转换成纤溶酶。所产的纤溶酶可进一步水解S-2251底物而产生有色产物，对-硝基苯胺，其于405nm处有最大的吸光值。重组产物的比活性与吸光值有一致性。评估并比较各个样品，即：

周质r-K2S或培养上清液r-K2S的纤维蛋白原依赖性酶活性。及周质r-K2S二者均显示特别低的酶活性，其低于测试的敏感度(0.25IU/毫升)。培养上清液的r-K2S具有7IU/毫升的纤维蛋白原依赖性酶活性。所以，自100毫升培养基中可获得共700IU的酶活性。若无纤维蛋白原，则无法观察到由培养上清液纯化的r-K2S的酶活性，然而，标准黑色素瘤tPA可显示出一些活性。

藉由免疫转印证实重组蛋白。得自大肠埃希氏菌XM[K2S]的培养上清液的部分纯化r-K2S以绵羊抗-tPA抗体测得的分子量为39kDa(图6)。阴性对照组，未经转化的大肠埃希氏菌XL-1Blue的部分纯化培养上清液于相似大小处并无反应带。

藉由PAGE对活性酶定位。于电泳前，先将纤溶酶原与明胶共同聚合并固定于聚丙烯酰胺凝胶中。分析大肠埃希氏菌XL-1Blue，经pComb3HSS转化的大肠埃希氏菌XL-1Blue及大肠埃希氏菌XM[K2S]的经硫酸胺沉淀后的培养上清液(图7)。将所有样品于非还原条件下处理以保留丝氨酸蛋白酶的正确构象和活性。仅可于大肠埃希氏菌XM[K2S]的经硫酸胺沉淀之的培养上清液中在34kDa及37kDa处看到经丝氨酸蛋白酶水解的纤溶酶原透明区域。其它样品均无透明区。标准黑色素瘤tPA的阳性对照泳道亦于66kDa及72kDa位置处显示出酶活性。

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附图说明

图1.藉由利用sK2/174及_ASSP引物确认来自p51-3载体的K2S基因的PCR扩增产物。第1泳道显示1kb标示物(Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN)。第2泳道是载入了1微升的扩增产物。其显示1110bp处的单一条带。电泳是于1％琼脂凝胶上进行。

图2.pComb3H-K2S经Sfi I水解后，于1110bp(^*)处的所插入的K2S基因的鉴定是显示于第3泳道。第1泳道显示1kb标示物。第2泳道是载入未切割的pComb3H-K2S。电泳是于1％琼脂凝胶上进行。

图3.pComb3H-K2S的模式图，其显示两个Sfi I克隆位点，其中嵌入K2S基因。亦显示信号序列(OmpA)，核糖体结合位点(RIBS)，lac启动子，及gp III基因。

图4.位于pComb3H-K2S上的K2S及gp III交接处的突变位置图示。pComb3H-K2S的退火位置是与一组含有经修饰的寡核苷酸(画线者)的突变引物(_MSTPA及_MASTPA)结合。进行循环扩增后，Sfi I位点1(粗体字)被修饰并于新合成链中丢失。

图5.以Sfi限制酶分析新合成的MpComb3H-K2S的特征。相关于MpComb3H-K2S的单一切割位置的位于4319bp处的单一条带可见于第3泳道。并不见位于1110bp处的K2S嵌入带。第1泳道显示1kb标示物。第2泳道是载入未切割的MpComb3H-K2S。电泳是于1％琼脂凝胶上进行。

图6.以用绵羊抗-tPA结合性HRP纯化的大肠埃希氏菌XM[K2S]培养上清液中的重组蛋白鉴定免疫反应带。第1泳道载入40ng的标准黑色素瘤tPA(86/670)，其于70kDa处显示反应带。将得自未转化大肠埃希氏菌XL1-Blue及大肠埃希氏菌XM[K2S]的部分纯化及浓缩的培养上清液分别注入第2及3泳道。清晰的反应带特别显示于第3泳道的39kDa处。

图7.藉由共聚合的纤溶酶原聚丙烯酰胺凝胶电泳测定内含活性丝氨酸蛋白酶功能域的胞外r-K2S的分子量。第1泳道含有指示性分子量标准品(×10^-3)，SDS-6H(Sigma，Saint Louis，MO)。将五十微克的经55％饱和硫酸铵沉淀的大肠埃希氏菌XL-1Blue，经pComb3HSS转化的大肠埃希氏菌Xl-1Blue，及大肠埃希氏菌XM[K2S]的培养上清液分别载入第2、3及4泳道中。

第5泳道含有50mIU的标准黑色素瘤tPA(86/670)。于聚丙烯酰胺凝胶内的水解纤溶酶原透明环仅可见于第4泳道的分子量为34kDa及37kDa处(B)及第5泳道的分子量为66kDa及72kDa处(A)。

图8.结构A

来自无修饰的氨基酸174-527的天然K2S分子(SEQ ID NO：10)。

图9.结构B-0

来自无修饰的氨基酸197-527的天然K2S分子(SEQ ID NO：11)。

图10.结构B-1

来自氨基酸193-527的K2S分子，其中于图9的结构B-0的N端部分加入氨基酸SEGN(SEQ ID NO：12)。

图11.结构B-2

来自氨基酸193-527的K2S分子，如图10，其中的Cys-261改变为Ser(SEQ ID NO：13)。

图12.结构B-3

来自氨基酸191-527的K2S分子，其中于图9的结构B-0的N端部分加入氨基酸SEGNSD(SEQ ID NO：14)。

图13.结构B-4

来自氨基酸191-527的K2S分子，如图12，其中的Cys-261改变为Ser(SEQ ID NO：15)。

图14.结构C

来自无修饰的氨基酸220-527的天然K2S分子。此分子可进一步以类似被揭示用于图10-13的结构B的方式修饰(SEQ ID NO：16)。

图15.结构D

来自无修饰的氨基酸260-527的天然K2S分子。此分子可进一步以类似被揭示用于图10-13的结构B的方式修饰(SEQ ID NO：17)。

图16.tPA分子(SEQ ID NO：18)

表1.藉由三明治ELISA测定噬菌体制剂中的r-K2S

a VCSM13是由经pComb3HSS转化的XL-1Blue获得。

b使用小鼠单克隆抗-kringle 2(16/B)。其他抗体是由绵羊免疫球蛋白制备而得。

c数值是为各样品的三重复分析而得的吸光度平均值。

序列表

<110>贝林格尔·英格海姆国际有限公司(Boehringer Ingelheim International GmBH)

<120>于原核生物中制备大量蛋白质的方法

<130>序列流程案号1 1169

<140>

<141>

<150>GB 0027782.2

<151>2000-11-14

<160>18

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>66

<212>DNA

<213>大肠杆菌(Eschericia coli)

<400>1

atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggctg gtttcgctac cgtggcccag 60

gcggcc 66

<210>2

<211>4

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：K2S分子的N-端部分

<400>2

Ser Glu Gly Asn

1

<210>3

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：K2S分子的N-端部分

<400>3

Ser Glu Gly Asn Ser Asp

1 5

<210>4

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：K2S分子的N-端部分编码序列

<400>4

tctgagggaa ac 12

<210>5

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：K2S分子的N-端部分编码序列

<400>5

tctgagggaa acagtgac 18

<210>6

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：寡核苷酸序列

<400>6

gaggaggagg tggcccaggc ggcctctgag ggaaacagtg ac 42

<210>7

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：寡核苷酸序列

<400>7

gaggaggagc tggccggcct ggcccggtcg catgttgtca cg 42

<210>8

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：寡核苷酸序列

<400>8

acatgcgacc gtgacaggcc ggccag 26

<210>9

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：寡核苷酸序列

<400>9

ctggccggcc tgtcacggtc gcatgt 26

<210>10

<211>354

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：重组K2S分子的一部分

<400>10

Ser Glu Gly Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg

1 5 10 15

Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn

20 25 30

Ser Met Ile Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala

35 40 45

Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly

50 55 60

Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp

65 70 75 80

Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr

85 90 95

Ser Gln Pro Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala

100 105 110

Ser His Pro Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro

115 120 125

Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile

130 135 140

Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu

145 150 155 160

Thr Val Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu

165 170 175

Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp

180 185 190

Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser

195 200 205

Ser Arg Cys Ala Gln Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro

210 215 220

Pro Ala Asp Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly

225 230 235 240

Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys

245 250 255

Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His

260 265 270

Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr

275 280 285

Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp

290 295 300

Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val

305 310 315 320

Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly

325 330 335

Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met

340 345 350

Arg Pro

<210>11

<211>331

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：重组K2S分子的一部分

<400>11

Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile Leu Ile Gly Lys

1 5 10 15

Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys

20 25 30

His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His

35 40 45

Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser

50 55 60

Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr Ser Gln Pro Gln Phe Arg Ile

65 70 75 80

Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro Trp Gln Ala Ala

85 90 95

Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly

100 105 110

Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala Ala His Cys Phe

115 120 125

Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Val Ile Leu Gly Arg Thr

130 135 140

Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys

145 150 155 160

Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile

165 170 175

Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys Ala Gln Glu Ser

180 185 190

Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gln Leu Pro

195 200 205

Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu

210 215 220

Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His Val Arg Leu Tyr

225 230 235 240

Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr

245 250 255

Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala

260 265 270

Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys

275 280 285

Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu

290 295 300

Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn

305 310 315 320

Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro

325 330

<210>12

<211>339

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：重组K2S分子的一部分(经修饰)

<400>12

Ser Glu Gly Asn Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp

1 5 10 15

Asn Ser Met Ile Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser

20 25 30

Ala Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp

35 40 45

Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr

50 55 60

Trp Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln

65 70 75 80

Tyr Ser Gln Pro Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile

85 90 95

Ala Ser His Pro Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser

100 105 110

Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp

115 120 125

Ile Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His

130 135 140

Leu Thr Val Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu

145 150 155 160

Glu Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp

165 170 175

Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp

180 185 190

Ser Ser Arg Cys Ala Gln Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu

195 200 205

Pro Pro Ala Asp Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser

210 215 220

Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu

225 230 235 240

Lys Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln

245 250 255

His Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp

260 265 270

Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly

275 280 285

Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu

290 295 300

Val Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro

305 310 315 320

Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn

325 330 335

Met Arg Pro

<210>13

<211>335

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：重组K2S分子的一部分(经修饰)

<400>13

Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile

1 5 10 15

Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala Gln Ala Leu

20 25 30

Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys

35 40 45

Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys

50 55 60

Asp Val Pro Ser Ser Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr Ser Gln Pro

65 70 75 80

Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro

85 90 95

Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg

100 105 110

Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala

115 120 125

Ala His Cys Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Val Ile

130 135 140

Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu Gln Lys Phe

145 150 155 160

Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr

165 170 175

Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys

180 185 190

Ala Gln Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp

195 200 205

Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys

210 215 220

His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His

225 230 235 240

Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His Leu Leu Asn

245 250 255

Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly

260 265 270

Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly

275 280 285

Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly Ile Ile

290 295 300

Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr

305 310 315 320

Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro

325 330 335

<210>14

<211>343

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：重组K2S分子的一部分(经修饰)

<400>14

Ser Glu Gly Asn Ser Asp Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser

1 5 10 15

Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala

20 25 30

Gln Asn Pro Ser Ala Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys

35 40 45

Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn

50 55 60

Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys

65 70 75 80

Gly Leu Arg Gln Tyr Ser Gln Pro Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu

85 90 95

Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Lys

100 105 110

His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile

115 120 125

Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gln Glu Arg Phe

130 135 140

Pro Pro His His Leu Thr Val Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val

145 150 155 160

Pro Gly Glu Glu Glu Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His

165 170 175

Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln

180 185 190

Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys Ala Gln Glu Ser Ser Val Val Arg

195 200 205

Thr Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu

210 215 220

Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr

225 230 235 240

Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg

245 250 255

Cys Thr Ser Gln His Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu

260 265 270

Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp

275 280 285

Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly

290 295 300

Arg Met Thr Leu Val Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln

305 310 315 320

Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp

325 330 335

Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro

340

<210>15

<211>343

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：重组K2S分子的一部分(经修饰)

<400>15

Ser Glu Gly Asn Ser Asp Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser

1 5 10 15

Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala

20 25 30

Gln Asn Pro Ser Ala Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys

35 40 45

Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn

50 55 60

Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Ser Ser Thr Cys

65 70 75 80

Gly Leu Arg Gln Tyr Ser Gln Pro Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu

85 90 95

Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Lys

100 105 110

His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile

115 120 125

Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gln Glu Arg Phe

130 135 140

Pro Pro His His Leu Thr Val Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val

145 150 155 160

Pro Gly Glu Glu Glu Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His

165 170 175

Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln

180 185 190

Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys Ala Gln Glu Ser Ser Val Val Arg

195 200 205

Thr Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu

210 215 220

Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr

225 230 235 240

Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg

245 250 255

Cys Thr Ser Gln His Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu

260 265 270

Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp

275 280 285

Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly

290 295 300

Arg Met Thr Leu Val Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln

305 310 315 320

Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp

325 330 335

Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro

340

<210>16

<211>308

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：重组K2S分子的一部分(经修饰)

<400>16

Ser Ala Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro

1 5 10 15

Asp Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu

20 25 30

Thr Trp Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg

35 40 45

Gln Tyr Ser Gln Pro Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp

50 55 60

Ile Ala Ser His Pro Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg

65 70 75 80

Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys

85 90 95

Trp Ile Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His

100 105 110

His Leu Thr Val Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu

115 120 125

Glu Glu Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe

130 135 140

Asp Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser

145 150 155 160

Asp Ser Ser Arg Cys Ala Gln Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys

165 170 175

Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu

180 185 190

Ser Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg

195 200 205

Leu Lys Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser

210 215 220

Gln His Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly

225 230 235 240

Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln

245 250 255

Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr

260 265 270

Leu Val Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val

275 280 285

Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp

290 295 300

Asn Met Arg Pro

305

<210>17

<211>268

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：重组K2S分子的一部分(经修饰)

<400>17

Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr Ser Gln Pro Gln Phe Arg

1 5 10 15

Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro Trp Gln Ala

20 25 30

Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys

35 40 45

Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala Ala His Cys

50 55 60

Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Val Ile Leu Gly Arg

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu Gln Lys Phe Glu Val Glu

85 90 95

Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp

100 105 110

Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys Ala Gln Glu

115 120 125

Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gln Leu

130 135 140

Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala

145 150 155 160

Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His Val Arg Leu

165 170 175

Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His Leu Leu Asn Arg Thr Val

180 185 190

Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gln

195 200 205

Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val

210 215 220

Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly Ile Ile Ser Trp Gly

225 230 235 240

Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr

245 250 255

Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro

260 265

<210>18

<211>527

<212>PRT

<213>人类(tPA)

<400>18

Ser Tyr Gln Val Ile Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gln Met Ile Tyr Gln

1 5 10 15

Gln His Gln Ser Trp Leu Arg Pro Val Leu Arg Ser Asn Arg Val Glu

20 25 30

Tyr Cys Trp Cys Asn Ser Gly Arg Ala Gln Cys His Ser Val Pro Val

35 40 45

Lys Ser Cys Ser Glu Pro Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Gln Gln

50 55 60

Ala Leu Tyr Phe Ser Asp Phe Val Cys Gln Cys Pro Glu Gly Phe Ala

65 70 75 80

Gly Lys Cys Cys Glu Ile Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr Glu Asp Gln

85 90 95

Gly Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ala Glu Ser Gly Ala Glu

100 105 110

Cys Thr Asn Trp Asn Ser Ser Ala Leu Ala Gln Lys Pro Tyr Ser Gly

115 120 125

Arg Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys

130 135 140

Arg Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val Phe Lys Ala

145 150 155 160

Gly Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro Ala Cys Ser Glu Gly

165 170 175

Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg Gly Thr His

180 185 190

Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile

195 200 205

Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala Gln Ala Leu

210 215 220

Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys

225 230 235 240

Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys

245 250 255

Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr Ser Gln Pro

260 265 270

Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro

275 280 285

Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg

290 295 300

Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala

305 310 315 320

Ala His Cys Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Val Ile

325 330 335

Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu Gln Lys Phe

340 345 350

Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr

355 360 365

Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys

370 375 380

Ala Gln Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp

385 390 395 400

Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys

405 410 415

His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His

420 425 430

Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His Leu Leu Asn

435 440 445

Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly

450 455 460

Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly

465 470 475 480

Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly Ile Ile

485 490 495

Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr

500 505 510

Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro

515 520 525

Claims

1.在革兰氏阴性细菌中制备重组DNA-衍生的异源蛋白的方法，其中所述异源蛋白是呈有活性的及正确折叠的蛋白形式分泌至细胞外，其特征为所述革兰氏阴性细胞含有并可表达这样的载体，该载体包含与编码信号肽OmpA或其功能性衍生物的DNA可操作连接的编码所述异源蛋白的DNA，并且其中编码OmpA信号肽或其功能性衍生物的DNA与编码特征在于氨基酸序列SEGNSD(SEQ ID NO：3)的短肽的DNA相融合。

2.权利要求1的方法，其特征为所述革兰氏阴性细胞是大肠埃希氏菌。

3.权利要求1或2的方法，其特征为实施下列步骤：

a)藉由PCR扩增编码所述异源蛋白的DNA；

b)纯化PCR产物；

c)将所述PCR产物嵌入含有编码OmpA信号肽的DNA及编码gpIII的DNA的载体内，在所述载体中使所述PCR产物上游可操作连接于编码OmpA信号肽的DNA，下游连接于编码gpIII的DNA；

d)于所述异源蛋白与gpIII之间嵌入终止密码子；

e)藉由革兰氏阴性细胞表达所述载体；

f)纯化所述异源蛋白。

4.权利要求1或2的方法，其特征为所述异源蛋白选自人类组织纤溶酶原激活物或其功能性变体。

5.权利要求1或2的方法，其特征在于，所述异源蛋白选自人类组织纤溶酶原激活物的K2S变体或其功能性变体。

6.权利要求3的方法，其特征在于，所述异源蛋白选自人类组织纤溶酶原激活物的K2S变体或其功能性变体。

7.权利要求4的方法，其特征在于，所述异源蛋白选自人类组织纤溶酶原激活物的K2S变体或其功能性变体。

8.权利要求1或2的方法，其特征在于，所述载体是噬菌粒，其包含编码OmpA信号肽的DNA及编码gpIII的DNA。

9.权利要求1或2的方法，其特征为所述载体是pComb3HSS噬菌粒。

10.权利要求1或2的方法，其特征在于，所述OmpA的DNA序列包含下列序列：ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTGGCCCAGGCGGCC(SEQ ID NO：1)。

11.权利要求1或2的方法，其特征为所述OmpA的DNA序列是由下列序列所组成：ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTGGCCCAGGCGGCC(SEQ ID NO：1)。

12.权利要求1或2的方法，其特征为所述异源蛋白的DNA是位于lac启动子和/或核糖体结合位点之后。