KR100857402B1

KR100857402B1 - 원핵세포에서의 단백질 대량 생산 방법

Info

Publication number: KR100857402B1
Application number: KR1020037006564A
Authority: KR
Inventors: 베르너롤프-귄터; 고에츠프리드리히; 타야피와타나샤차이; 마노스로이이라데이; 마노스로이아라니아
Original assignee: 베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하
Priority date: 2000-11-14
Filing date: 2001-11-08
Publication date: 2008-09-08
Also published as: WO2002040696A3; UY27021A1; JP2004513648A; EP1343909A2; DE60139635D1; CA2428643A1; HK1077848A1; MXPA03004162A; AR031336A1; EP1343909B1; GB0027782D0; PT1343909E; AU2002221824A1; DK1343909T3; CN1628176A; WO2002040696A2; ES2332124T3; CY1110546T1; ATE440145T1; KR20030051821A

Abstract

본 발명은 원핵세포에서 단백질을 생산하는 분야에 관한 것이다. 본 발명은 원핵세포에서 재조합 DNA 유도된 이종성 단백질을 생산하는 방법에 관한 것으로서, 당해 이종성 단백질은 정확하게 폴딩된 활성 단백질로서 세포외로 분비되고 원핵 세포는 시그날 펩타이드 OmpA를 암호화하는 DNA에 작동가능하게 연결된 이종성 단백질을 암호화하는 DNA를 포함하는 벡터를 함유하고 이를 발현한다.

원핵세포, 단백질 대량 생산, 조직 플라스미노겐 활성인자, 크링글 2 + 세린 프로테아제, tPA, K2S

Description

원핵세포에서의 단백질 대량 생산 방법{Methods for large scale protein production in prokaryotes}

본 발명은 원핵세포에서의 단백질 생산 분야에 관한 것이다. 본 발명은, 원핵세포에서 재조합 DNA-유도된 이종성 단백질의 생산 방법에 관한 것으로서, 상기 이종성 단백질은 정확하게 폴딩된 활성 단백질로서 세포외로 분비되며, 당해 원핵세포는 시그날 펩타이드 OmpA를 암호화하는 DNA에 작동가능하게 연결된 당해 이종성 단백질을 암호화하는 DNA를 포함하는 벡터를 함유하고 이를 발현한다.

이종성 단백질에 대한 원핵세포 발현 시스템은, 이들이 당해 단백질을 대량으로 생산하는데 저렴한 방법을 제공하기 때문에, 포유동물의 당화 패턴을 요구하지 않는 단백질에 대해 통상적으로 사용된다. 고도로 응집된 단백질 또는 봉입체의 형성은, 이. 콜라이 내에서 많은 이종성 단백질을 고 수준으로 발현시킬때, 일반적으로 발견될 수 있다. 단백질의 생산 방법 중 하나는 세포질내 형성되는 봉입체를 통해서 행해진다. 일반적으로 생산용으로 사용되는 원핵세포(예를 들어, 이. 콜라이)의 세포벽 및 세포외막 성분이, 봉입체가 저속의 원심분리에 의해 제조되는 경우, 이종성 단백질을 함유하는 세포 용해물을 오염시킨다. 상기 외막 성분은 세제 및 저농도의 우레아 또는 구아니딘·HCl를 사용한 선별 추출에 의해 제거될 수 있다.

이러한 이종성 단백질의 하나의 예는 tPA 유도체이다.

조직 플라스미노겐 활성인자(tPA)는, 527개 아미노산 잔기를 함유하는 분자량이 72kDa인 폴리펩타이드이다[참조 번호: 27]. 당해 분자는 5개의 구조 도메인으로 구분된다. N-말단 근처에 고리형 핑거(looped finger) 도메인이 존재함에 이어서 성장 인자 도메인이 존재한다. 2개의 유사한 도메인, 크링글 1 및 크링글 2이 이어서 존재한다. 핑거 및 크링글 2 도메인은 둘다 섬유소 응괴에 특이적으로 결합함으로써, 결합된 플라스미노겐의 tPA 단백질 활성화를 촉진한다. 크링글 2의 하류(downstream)에는 세린 프로테아제가 있으며, 이의 촉매 부위는 C-말단에 위치한다. 세린 프로테아제는, 섬유소 형성과 응괴 분해의 항상성에 중요한 플라스미노겐의 플라스민으로의 전환 반응에 관여한다. tPA의 정확한 폴딩은 당해 분자내에서 17개의 디설파이드 브릿지의 정확한 쌍형성을 요구한다[참조 번호: 1].

임상적으로, tPA는 급성 심근 경색의 치료를 위해 선택되는 혈전용해제이다. 이는 전신 출혈 및 피브리노겐 결핍에 대한 부작용을 일으키지 않는 장점을 갖는다[참조 번호: 7]. 바우(bow) 흑색종 세포를 처음으로 치료학적 목적으로 tPA 생산의 공급원으로서 사용하였다[참조 번호: 12]. 임상적으로 사용하기 위해서는 고도로 정제된 단백질을 우수한 수율로 효율적으로 생산하는 일관된 과정이 요구되기 때문에, 전체 길이의 재조합-tPA(r-tPA)의 작제가 포유동물 세포에까지 진행되었다. 중국산 햄스터 난소 세포를 tPA 유전자로 형질감염시켜 r-tPA를 합성하였다[참조 번호: 8 및 22]. 포유동물 발효 시스템에 의해 생산된 재조합 생성물을 배양 배지로 부터 수거한다. 생산의 단순성 및 경제성에 이끌려, 세균, 특히 에스케리치아 콜리(Escherichia coli)로 부터 r-tPA를 생산하고자 하는 수 많은 작업이 연구되었다[참조 번호: 10, 13 및 30]. 잘못된 폴딩과 불활성 효소를 초래하는 봉입체의 형성 및 낮은 수율에 관한 문제를 극복하기 위하여, 수 많은 방안이 제안되었다. 주요 기본 방안은 전장의 tPA 대신에 여전히 활성인 최소 분자를 합성하는 것이다.

크링글 2 + 세린 프로테아제(K2S)를 포함한 여러 결실-돌연변이 변이체가 고려되었다. 그러나, 세포질 구획으로 부터 정제된 봉입체의 재-폴딩 과정이 이루어진 경우에만, 재조합-K2S(r-K2S)의 효소 활성이 수득되었다[참조 번호: 16 및 29]. 성가신 재-폴딩 과정 및 주변세포질(periplasm)의 단백질 전달을 피하기 위하여, 특수한 세균 발현 시스템을 이용하였다[참조 번호: 6 및 31]. tPA의 주변세포질 발현에도 불구하고, 주변세포질의 비교적 높은 산화 조건하에서, 과발현이 불활성 응집체를 유도하였다.

종래의 기술에서, 이. 콜라이에서 재조합-K2S를 생산하는 방법에 관한 내용을 찾아 볼 수 있다. 그러나, 생물학적으로 활성인 K2S를 대량 생산하기 위한 비율-효과적인 방법을 이끄는 방법은 기재된 적이 없다.

오부코이츠(Obukowicz) 등[참조 번호: 25]은 주변세포질 공간으로 부터 r-K2S를 발현시키고 정제하였다. 이러한 방법의 명백한 단점은, 대량 생산에 적합하지 않은 부수적인 주변세포질 추출 단계에 있다.

사이토(Saito) 등[참조 번호: 29]은 r-K2S의 세포질 발현을 기술하고 있다. 당해 저자는, 봉입체로서 이. 콜라이의 세포질 공간으로 부터 정제된 발현된 r-K2S에 대해 생체내 재생(renaturation) 과정을 이용하였다. 베링거 만하임(Boehringer Mannheim)은, 세포 용해, 변성 및 환원 조건하에의 가용화, 및 GSH/GSSG가 존재하는 산화 조건하에서의 재활성화의 단계를 포함하는, 유사한 성가신 변성/재폴딩 과정을 이용하였으나, 이는 비용-효과적이지 않으며 아미노산 서열의 돌연변이를 요구한다[참조 번호: 24].

1991년에, 발덴스트롬(Waldenstrom) 등[참조 번호: 34]은 크링글 2 + 세린 프로테아제 도메인을 이.콜라이(E. coli) 배양 상등액에 분비시키기 위한 벡터(pEZZK2P)를 작제하였다. 하이드록실아민을 사용하여, IgG-세파로스(Sepharose) 정제된 분획으로 부터 ZZ 융합 펩타이드를 제거하였다. 절단제인 하이드록실아민은 크링글 2 + 세린 프로테아제의 절단 부위의 변형(Asn¹⁷⁷ →Ser 및 Asn¹⁸⁴ →Gln)을 요구하므로, 이를 하이드록실아민 분해로 부터 보호한다. 그러나, 생성된 비-천연적인, 적절히 폴딩되지 않은 K2S 분자는 치료 목적에 적합하지 않다. 통상적이지 않은 당해 서열은 사람 면역계를 활성화시킬 수도 있다.

따라서, 본 발명에 있어서의 문제는, 생물학적 활성 형태로 배양 상등액으로부터 분비되는 이종성 단백질(예를 들어, K2S)을 대량 생산하기 위한 상업적으로 이용할 수 있는 방법을 제공하는 것이었다.

상기 문제는 본 발명의 명세서 및 청구의 범위 내에서 해결되었다.

청구의 범위 또는 명세서에서의 단수 또는 복수를 사용함은 제한시키고자 하는 의도가 아니며 다른 형태를 포함한다.

본 발명은 재조합 DNA-유도된 이종성 단백질을 원핵세포에서 생산하는 방법에 관한 것으로서, 당해 이종성 단백질은 정확하게 폴딩된 활성 단백질로서 세포외로 분비되며, 당해 원핵세포는 시그날 펩타이드 OmpA 또는 이의 작용성 유도체를 암호화하는 DNA에 작동가능하게 연결된 이종성 단백질을 암호화하는 DNA를 포함하는 벡터를 함유하고 발현하는 것을 특징으로 한다.

놀랍게도, 시그날 펩타이드 OmpA를 단독으로 사용하고/하거나 N-말단 아미노산 SEGN/SEGNSD(서열 2/서열 3)과 배합하여 사용하는 경우, 재조합 DNA-유도된 이종 단백질을 세포외 표면으로 이동시켜 종래의 어떤 방법 보다도 월등히 기능적 활성 활성 분자를 배양 배지로 분비시킴을 촉진한다. 세포외막을 통과하기 전에, 재조합 DNA-유도된 단백질은 본 발명의 방법에 따라 정확하게 폴딩된다. 시그날 펩타이드가 절단되어 성숙한 분자가 생성된다. 놀랍게도, 시그날 펩타이드 제거의 효율은 매우 높고, 재조합 DNA-유도된 단백질의 정확한 폴딩을 유도한다. 실시예 1에서 조직 플라스미노겐 활성인자 단백질의 크링글 2 + 세린 프로테아제 도메인(K2S)에 대해 예시된 본 발명에 따른 당해 방법은, 일반적으로, 원핵 숙주 세포에서 포유동물 당화를 요구하지 않는 수개의 상이한 단백질 및 폴리펩타이드의 발현에 적용가능하다.

본 발명에 따른 방법은, 원핵 숙주 세포가 사용되기 때문에 저렴한 생산 방법이고, 놀랍게도 정확하게 폴딩된 분자가 상등액으로 분비된다는 점에서 선행 기술에 공지딘 방법 보다 우수한 장점을 갖는다.

당해 기술 분야의 기술자는 본 발명에 따른 방법에 의해 발현될 목적하는 단백질의 DNA 서열을 적합한 데이타베이스로부터 용이하게 수득할 수 있고 이를 클로닝하여 본 발명에 따른 방법에 사용할 수 있다.

상기 시그날 펩타이드 OmpA는 SecE와 상호작용하여, SecA에 의해 발생된 에너지에 의해 내막을 통해 전달되어, Sec 성분과 결합한다(SecE-SecY). SecY는 본 발명에 따른 재조합 DNA-유도된 단백질을 내보내기 위한 분비 세공을 형성한다. 그람-음성 세균의 외막과 내막 사이의 공간, 즉, 주변세포질은 세포질 공간에 비해 높은 산화 조건을 갖는다. 이러한 조건은, 주변세포질에서 재조합 단백질(예: K2S)의 디설파이드 브릿지의 형성 및 적절한 폴딩을 지원하여, 활성 분자를 수득케한다. 본 발명에 따르면, 시그날 펩타이드가 절단되어 성숙한 분자가 생성된다. 외막상의 GspD 세크레틴과 GspS 지단백질의 복합체는, 본 발명에 따른 재조합 단백질을 세포외 배지로 분비하기 위한 게이트 채널(gate channel)로서 작용한다. 이러한 분비 과정은, GspE 뉴클레오타이드-결합 단백질에 의해 세포질에서 발생되어 내막 단백질(Gsp G-J, F 및 K-N)로 전달되는 에너지를 요구한다. GspC는, 내막 단백질(Gsp G-J, F 및 K-N) 세트와 GspD 사이에 가교-링커를 형성함으로써 에너지를 GspD로 전달한다. 외막을 성공적으로 통과하기 전에, 재조합 단백질은 정확하게 폴딩된다.

본 발명에 따른 '작동가능하게 연결된'이란 이종성 단백질을 암호화하는 DNA (바람직하게는 이의 N-말단부에 SEGN 또는 SEGNSD를 암호화하는 핵산을 포함함)를 OmpA DNA에 근접시켜 벡터 속에 클로닝하여, OmpA-이종성 단백질 융합 단백질을 발현시키고, 원핵 숙주 세포 밖으로 분비되도록 하는 것이다. 전형적으로, 이종성 단백질의 대부분은 분비된 후 적당한 방법, 예를 들면 황산암모늄 침전법으로 정제할 수 있다. 또한, 본 발명은, 유도인자, 예를 들면 IPTG 또는 글리세롤와 배합된 IPTG의 사용, 및 항온처리 조건 및 수거 기간의 개선 등을 통해 활성 단백질의 양을 최대화한다.

놀랍게도, 본 발명자는 단독으로 또는 서열 SEGN(서열 2) 또는 SEGNSD(서열 3)을 특징으로 하는 아미노산에 작동가능하게 연결된 OmpA 시그날 펩타이드가, 이종성 단백질이 주변세포질 공간에 축적되기보다는 배지에 분비되도록 유도함을 밝혔다.

바람직한 태양에서, OmpA 시그날 펩타이드를 암호화하는 당해 DNA는, 아미노산 서열 SEGN(서열 2) 또는 암호화 핵산 서열 TCTGAGGGAAAC (서열 4)를 특징으로 하고 이종성 단백질의 N-말단부 내에 또는 N-말단부에 위치하는 단쇄 펩타이드에 융합될 수 있다. 따라서, 바람직하게 당해 융합 단백질은 OmpA-SEGN-이종성 단백질을 포함한다. 보다 바람직하게는, SEGN(서열 2)을 특징으로 하는 당해 아미노산은 점 돌연변이를 수반할 수 있거나, 비-천연 아미노산에 의해 치환될 수 있다. 보다 더욱 바람직하게는, OmpA와 SEGN 또는 SEGN과 이종성 단백질 사이에는 아미노산 또는 비-아미노산 스페이서(spacer)가 존재할 수 있다.

바람직한 양태에서, OmpA 시그날 펩타이드를 암호화하는 DNA는 아미노산 서열 SEGNSD(서열 3) 또는 암호화 핵산 서열 TCTGAGGGAAACAGTGAC(서열 5)를 특징으로 하고 이종성 단백질의 N 말단부 내에 또는 N-말단부에 위치한 단쇄 펩타이드에 융합될 수 있다. 따라서, 바람직하게 당해 융합 단백질은 OmpA-SEGNSD-이종성 단백질을 포함한다. 심지어 보다 바람직하게 SEGNSD를 특징으로 하는 당해 아미노산은 점돌연변이를 수반하거나 비천연 아미노산에 의해 치환될 수 있다. 심지어 보다 바람직하게는 OmpA와 SEGNSD 또는 SEGNSD와 이종성 단백질 사이에는 아미노산 또는 비-아미노산 스페이서가 존재할 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 바람직한 방법에서, 당해 원핵세포는, 서열 TCTGAGGGAAACAGTGAC(서열 5)로 정의되는 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 시그날 펩타이드 OmpA 또는 이의 작용성 유도체를 암호화하는 DNA에 작동가능하게 연결된 이종성 단백질을 암호화하는 DNA를 포함하는 벡터를 함유하고 발현한다.

당해 이종성 단백질은 인슐린, 인슐린형 성장 인자, hGH, tPA, 사이토킨, 예를 들어, 인터류킨(IL)(예를 들어, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, 인터페론(IFN) 알파, IFN 베타, IFN 감마 또는 IFN 오메가 또는 IFN 타우, 종양 괴사인자(TNF) TNF 알파 및 TNF 베타, TRAIL; G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 및 VEGF를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 방법은 항체 또는 이의 단편을 제조하는데 유리하게 사용될 수 있다. 당해 단편은 예를 들어, Fab 단편(단편 항원 결합 = Fab)을 포함한다. Fab 단편은 인접한 불변 영역에 의해 서로 유지되는 2개의 쇄의 가변 영역으로 이루어진다. 이들은 통상적인 항체로부터 프로테아제(예를 들어, 파파인) 분해에 의해 형성될 수 있지만 한편으로는 유사한 Fab 단편이 또한 유전자공학 기술에 의해 제조될 수 있다. 추가의 항체 단편은 펩신을 사용한 단백질 분해 절단에 의해 제조될 수 있는 F(ab')2 단편을 포함한다.

유전자공학 기술 방법을 사용하여 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변영역으로만 이루어진 단축된 항체 단편을 제조할 수 있다. 이들은 Fv 단편(가변 단편 = 가변부의 단편)으로 지칭된다. 이들 Fv 단편은 2개의 쇄가 불변 쇄의 시스테인에 의해 공유 결합되어 있지 않기 때문에 Fv 단편은 종종 안정화된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 예를 들어, 10 내지 30개의 아미노산, 바람직하게는 15개의 아미노산과 같은 단쇄 펩타이드 단편으로 연결시키는 것이 유리하다. 당해 방법에서, 수득되는 펩타이드 쇄는 펩타이드 링커에 의해 연결된 VH와 VL로 이루어진다. 이러한 종류의 항체 단백질은 단일 쇄-Fv(scFv)로서 공지되어있다. 선행 기술 분야로부터 공지된 이러한 종류의 scFv 항체 단백질의 예는 문헌[참조: Huston et al.(1988, PNAS 16:5879-5883)]에 기술되어 있다.

최근해에, 다량체 유도체로서 scFv를 제조하기 위한 다양한 전략이 개발되었다. 이는 특히 개선된 약동학적 및 생체분포 특성을 가질 뿐만 아니라 결합도가 증가된 재조합 항체를 유도하기 위한 것이다. scFv를 다량체화하기 위해, scFv는 다량체화 도메인을 갖는 융합 단백질로서 제조된다. 다량체화 도메인은 예를 들어, IgG의 CH3 영역 또는 류신-지퍼 도메인과 같은 감긴 코일(coiled coil) 구조(나선 구조)일 수 있다. 그러나, 다량체화[이량항체(diabody), 삼량항체(triabody) 및 오량항체(pentabody)]를 위해, scFv의 VH/VL 영역 사이의 상호 작용을 사용하는 전략이 있다. 당해 기술 분야의 기술자에게 있어서 이량항체란 2가의 동종이량체 scFv 유도체[문헌참조: Hu et al., 1996, PNAS 16:5879-5883]를 의미한다. scFv 분자에서 링커를 5 내지 10개의 아미노산으로 단축함으로써 VH/VL간의 쇄가 과도하게 겹쳐진 동종이량체의 형성을 유도한다. 이량항체는 디설파이드 브릿지의 도입으로 추가로 안정화될 수 있다. 선행 기술 분야의 이량항체-항체 단백질의 예는 문헌[참조: 1994, Structure 2: 1217-1226]에서 찾아 볼 수 있다.

당해 기술 분야의 기술자에게 있어서, 소체(minibody)란 2가의 동종이량체 scFv 유도체를 의미한다. 이것은 힌지(Hinge) 영역(예를 들어, 또한 IgG1 기원) 및 링커 영역을 통해 scFv에 연결된 이량체화 영역으로서 면역글로불린, 바람직하게는 IgG, 가장 바람직하게는 IgG1의 CH3 영역을 함유하는 융합 단백질로 이루어진다. 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지는 대부분 고등 세포에서 형성되지만 원핵 세포에서는 형성되지 않는다. 선행 기술 분야의 소체-항체 단백질의 예는 문헌[참조: Hu et al.(1996, Cancer Res. 56:3055-61)]에서 찾아 볼 수 있다.

당해 기술 분야의 기술자에게 있어서, 삼량항체란 3가의 동종삼량체 scFv 유도체[문헌참조: Kortt et al. 1997 Protein Engineering 10: 423-433]를 의미한다. VH-VL이 링커 서열 없이 직접 융합된 ScFv 유도체는 삼량체의 형성을 유도한다.

당해 분야의 기술자는 또한 2가, 3가 또는 4가 구조를 갖고 scFv로부터 유도되는 소위 소형항체(miniantibody)라는 것을 숙지하고 있다. 다량체화는 2가, 3가 또는 4가 감긴 코일 구조에 의해 수행된다[문헌참조: Pack et al., 1993 Biotechnology 11:, 1271-1277; Lovejoy et al. 1993 Science 259:1288-1293;Pack et al., 1995 J. Mol. Biol. 246:28-34].

따라서, 본 발명에 따른 또 다른 바람직한 양태에서, 상기된 항체 또는 항체 단편이 제조된다.

본 발명에 따른 방법은, 다음의 원핵 숙주 세포로 제한되는 것은 아니지만, 에스케리치아 콜리(이. 콜라이)(E. coli), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예: 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예: 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylococcus carnosus))와 같은 원핵 숙주 세포를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 숙주 세포는 그람-음성 세균이다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 방법은 또한 원핵세포가 이. 콜라이인 것을 특징으로 한다. 적합한 균주로는 이.콜라이 XL-1 블루, 이. 콜라이 BL21(DE3), 이. 콜라이 JM109, 이. 콜라이 DH 시리즈, 이. 콜라이 TOP10 및 이. 콜라이 HB101가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 방법은 또한 다음의 단계:

a) 이종성 단백질을 암호화하는 DNA를 PCR로 증폭하는 단계,

b) PCR 생성물을 정제하는 단계,

c) 당해 PCR 생성물이, 상류(upstream)에서 OmpA 시그날 서열을 암호화하는 DNA에 작동가능하게 연결되고 하류에서 gpIII를 암호화하는 DNA에 작동가능하게 연결되도록, OmpA 시그날 펩타이드를 암호화하는 DNA 및 gpIII를 암호화하는 DNA를 포함하는 벡터 속에 삽입하는 단계,

d) 정지 코돈을, 이종성 단백질과 gpIII 사이에 삽입하는 단계,

e) 당해 벡터를 원핵세포에 의해 발현시키는 단계; 및

f) 이종성 단백질을 정제하는 단계를 수행함을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 단계 a)의 경우, 프라이머의 선택/설계가 발현 벡터의 올바른 위치와 방향으로 당해 DNA를 클로닝하는데 중요하다(실시예 1 참조). 따라서, 실시예 1 및 도 4에 예시된 프라이머는 본 발명의 중요한 측면을 포함한다. 단계 c)의 gpIII는 유전자 단백질 III를 의미하며, 이는 주로 파아지미드(phagemid) 벡터에 존재한다. 정지 코돈은 gpIII의 전사를 피하도록 삽입되어, 결국 목적하는 이종성 단백질의 분비를 유도한다. 정지 코돈을 삽입하기 위한 임의의 적합한 방법, 예를 들면 부위-지시된 돌연변이유발이 사용될 수 있다[예: Weiner MP, Costa GL (1994) PCR Methods Appl 4(3):S131-136; Weiner MP, Costa GL, Schoettlin W, Cline J, Mathur E, Bauer JC (1994) Gene 151(1-2):119-123; 실시예 1 참조].

임의의 벡터가 본 발명에 따른 방법에 사용될 수 있으며, 바람직하게 당해 벡터는 파아지미드 벡터이다(하기 참조).

비해독 영역은 조절 요소, 예를 들어, 전사 개시 단위(프로모터) 또는 인핸서를 포함할 수 있다. 당해 프로모터는 예를 들어, 구성적(constitutive), 유도성 또는 발달-조절형 프로모터일 수 있다. 바람직하게, 또 다른 공지된 프로모터, 즉 사람 사이토메갈로바이러스(CMV) 및 라우스 사르코마 바이러스(RSV)의 구성적 프로모터 뿐만 아니라 원숭이(simian) 바이러스 40(SV 40) 및 헤르페스 심플렉스 프로모터를 배제하지 않는다. 본 발명에 따른 유도성 프로모터는 항생제 내성 프로모터, 열 쇼크 프로모터, 호르몬 유도성 포유동물 종양 바이러스 프로모터 및 메탈로티오네인 프로모터를 포함한다. 바람직한 프로모터는 T3 프로모터, T7 프로모터, Lac/aral 및 Ltet0-1을 포함한다. 보다 바람직하게, 본 발명에 따른 방법은 또한 이종성 단백질을 암호화하는 DNA가 lac 프로모터 및/또는 샤인-달가노 서열과 같은 리보솜 결합 부위 보다 뒤에 위치함을 특징으로 한다(실시예 참조).

본 발명에 따른 적합한 벡터는 이에 제한되지 않지만 백시니아, 셈리키-포레스트-바이러스 및 아데노바이러스, 파아지미드 벡터등과 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 이. 콜라이에서 뿐만 아니라 임의의 또 다른 원핵 숙주 세포에서 유리하게 사용될 수 있는 벡터, 예를 들면 pPROTet.E. pPROLar.A, pBAD 계열, pSE 계열, pQE 계열 및 pCAL의 일원이 바람직하다. 본 발명의 또 다른 바람직한 양태는 본 발명에 따른 DNA를 함유하는 벡터 pComb3HSS에 관한 것이고, 이때 gp III 단백질의 발현은 당해 gp III 단백질을 암호화하는 DNA 분자를 결실시키거나, 또는 이종성 단백질을 함유하는 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자와 상기 단백질 III 유전자 사이에 정지 코돈을 삽입함으로써 억제되거나 저해된다.

바람직하게, 본 발명에 따른 방법은 또한, 이종성 단백질이 사람 조직 플라스미노겐 활성인자(tPA), 또는 이의 단편, 작용성 변이체, 대립형질 변이체, 서브유니트, 화학적 유도체, 융합 단백질 또는 당화 변이체중에서 선택되는 것을 특징으로 한다. 이러한 본 발명에 따른 tPA 단백질의 단편, 대립형질 변이체, 작용성 변이체, 축퇴성(degenerative) 핵산 암호에 따른 변이체, 본 발명에 따른 tPA 단백질과의 융합 단백질, 화학적 유도체 또는 당화 변이체는 하기의 도메인이나 서브유니트, 또는 이의 변이체중 하나, 몇개 또는 전부를 포함할 수 있다:

1. 핑거(finger) 도메인(4-50)

2. 성장 인자 도메인(50-87)

3. 크링글 1 도메인(87-176)

4. 크링글 2 도메인(176-262)

5. 프로테아제 도메인(276-527).

도메인의 번호매김/명명은 Genbank 승인번호 GI 137119 또는 문헌[Nature 301 (5897), 214-221 (1983)]에 따른다.

보다 바람직하게는, 본 발명에 따른 방법은 또한, 이종성 단백질이 사람 조직 플라스미노겐 활성인자의 크링글 2(상기 4 항목) + 세린 프로테아제(상기 5 항목) K2S 변이체, 또는 이의 단편, 작용성 변이체, 대립형질 변이체, 서브유니트, 화학적 유도체, 융합 단백질 또는 당화 변이체중에서 선택되는 것을 특징으로 한다.

보다 바람직하게는, 본 발명에 따른 방법은 또한, 벡터가 OmpA 시그날 펩타이드를 암호화하는 DNA 및 gpIII를 암호화하는 DNA를 포함하는 파이지미드 벡터인 것을 특징으로 한다.

하기의 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것이고, 어떤 식으로도 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다.

실시예 1

재료 및 방법

프라이머 설계. tPA 유전자의 특정 부위를 증폭시키기 위해, 한쌍의 프라이머 _sK2/174[5' GAGGAGGAGGTGGCCCAGGCGGCCTCTGAGGGAAACAGTGAC 3'](서열 6) 및 ASSP[5' GAGGAGGAGCTGGCCGGCCTGGCCCGGTCGCATGTTGTCACG 3'](서열 7)을 합성하였다[제조원: Life Technologies, Grand Island, NY]. 이들 프라이머는 NCBI 데이타베이스로부터 입수한 사람 tPA 유전자(g137119)를 토대로 설계하였다. 이들 프라이머는, 파아지미드 벡터인 pComb3HSS내의 gpIII 유전자의 ATG로 부터의 판독 프레임이 삽입된 서열에서 유지되는 방식으로 SfiI 말단 클로닝 부위(밑줄침)를 갖도록 합성하였다.

부위 지시된 돌연변이유발을 위한 또 다른 프라이머 세트를, pComb3H-K2S 내의 K2S 유전자와 유전자 III사이에 위치한 서열에서 어닐링하도록 설계하였다. 새로운 정지 코돈을 생성시키는 돌연변이 염기(밑줄침)를 갖는 프라이머 서열은 _MSTPA[5' ACATGCGACCGTGACAGGCCGGCCAG 3'](서열 8) 및 _MASTPA [5' CTGGCCGGCCTGTCACGGTCGCATGT 3'](서열 9)이였다.

PCR에 의한 K2S 유전자의 증폭. p51-3 주형[공급원(Dr. Hiroshi Sasaki, Fujisawa Pharmaceutical, Japan)으로부터 구입] 50ng과 함께 1㎍의 _sK2/174 및 _ASSP 프라이머를 PCR 혼합물 100㎕에 현탁시켰다. Taq 폴리머라제[제조원: Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN] 2.5U의 양을 최종적으로 당해 용액에 첨가하였다. 적정 증폭 조건을 85℃에서 4분 동안 점프 스타트로 개시함에 이어서 95℃에서 50초 동안 변성시키고 42℃에서 50초 동안 어닐링하며 75℃에서 1.5분 동안 증폭시켰다. 35회를 반복 수행하였다. 혼합물을 추가로 72℃에서 10분 동안 항온처리하였다. 1110 bp로 증폭된 생성물을 이어서 QIAquick PCR 정제 키트(제조원: QIAGEN, Hilden, Germany)로 정제하였다. 정제된 생성물의 정확도를 제한 효소로 확인하였다.

K2S 발현 파아지미드의 작제. K2S의 정제된 PCR 생성물 및 pComb3HSS 파아지미드[공급원(Dr. Carlos F. Barbas, Scripps Institute, USA)으로부터 제공됨]를 Sfi I(제조원: Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN)로 분해하여 특정 점착성(cohesive) 클로닝 부위를 제조하였다. 정제된 PCR 생성물 4㎍을 50℃에서 18시간 동안 Sfi I의 60U로 분해하였다. pComb3HSS에 대해, 파아지미드 벡터 20㎍을 Sfi I의 100U로 처리하였다. K2S의 정제된 PCR 생성물 및 pComb3HSS(∼3300bp)의 분해 생성물을 이어서 QIAquick 겔 추출 키트(제조원: QIAGEN, Hilden, Germany)로 겔 정제하였다. 5U의 T4 리가제(제조원: Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN)을 정제된 Sfi I-분해 pComb3HSS 0.7㎍ 및 정제된 Sfi I 분해 PCR 생성물 0.9㎍의 혼합물에 도입하였다. 30℃에서 18시간 동안 연결 반응물을 항온처리하였다. 새롭게 작제된 파아지미드를 pComb3H-K2S로 명명한다.

XL-1 블루의 형질전환. CaCl₂ 컴피턴트(competent) 이. 콜라이 XL-1 블루(제조원: Stratagene, La Jolla, CA) 200㎕를 연결되거나 돌연변이된 생성물 70ng으로 형질전환시켰다. 형질전환된 세포를 암피실린 100㎍/ml 및 테트라사이클린(제조원: Sigma, Saint Louis, MO) 10㎍/ml을 함유하는 LB 한천상에 도말하여 증식시켰다. 18시간 동안 37℃에서 배양한 후에, 수개의 항생제 내성 콜로니를, 알칼린 용해 방법을 사용함에 의해 플라스미드 미니프렙용으로 선별하였다. 각각의 정제된 플라스미드에 대해 Sfi I 제한 부위를 분석하였다. 올바른 Sfi I 제한 부위를 갖는 플라스미드를 보유한 형질전환체를, 이어서 암피실린 100㎍/ml 및 테트라사이클린 10㎍/ml을 함유한 LB 브로쓰(broth) 100ml중에서 18시간 동안 37℃에서 증식시켰다. QIAGEN 플라스미드 맥시(Maxi) 키트(제조원: QIAGEN, HIlden, Germany)를 사용하여 플라스미드 맥시프렙을 수행하였다. 정제된 플라스미드를 Sfi I에 의한 특정 제한 부위에 대해 재조사하고 AmpliTaq DNA 폴리머라제 터미네이터 사이클 서열분석 키트(제조원: The Perkin-Elmer Corporation, Forster City, CA)로 서열 분석하였다.

pComb3H-K2S의 부위 지시된 돌연변이유발. pComb3H-K2S 주형 10ng을 _MSTPA 및 _MASTPA 프라이머 125ng과 혼합하였다. 2.5U의 PfuTurbo DNA 폴리머라제(제조원: Stratagene, LA Jolla, CA)를 사이클 증폭을 위해 혼합물에 첨가하였다. 95℃에서 30초 동안의 1회 반응을 개시하였다. 이어서, 95℃에서 30초 동안, 55℃에서 1분 동안 및 68℃에서 9분 동안으로 이루어진 16회 반응을 수행하였다. 이어서, 반응 튜브를 2분 동안 빙상위에 놓는다. 주형 쇄를 파괴하기 위해, 10U의 Dpn I 제한 효소(제조원: Stratagene, LA Jolla, CA)를 증폭 반응물에 첨가하고 1시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 이와같이 합성된 생성물(MpComb3H-K2S)를 추가로 사용하여 이. 콜라이 XL-1 블루를 형질전환시켰다.

파아지-디스플레이 재조합체-K2S의 제조. 이. 콜라이 XL-1 블루를 pComb3H-K2S로 형질전환시킨 후에, 파아지 디스플레이 기법을 수행하였다. pComb3H-K2S-형질전환된 이. 콜라이 XL-1 블루의 하나의 클론을, O.D.[600nm]값이 1.5에 도달할때까지 37℃에서 암피실린 100㎍/ml 및 테트라사이클린 10㎍/ml를 함유하는 슈퍼 브로쓰 10ml중에서 증식시켰다. 이어서 세균 배양물을 동일 배지 100ml중에서 2시간 동안 배양하여 증식시켰다. VCSM13 헬퍼 파아지(제조원: Stratagene, La Jolla, CA) 10¹² pfu의 양을 사용하여 형질전환된 이. 콜라이 XL-1 블루를 감염시켰다. 3시간 배양한 후에, 최종 농도가 70㎍/ml인 카나마이신을 배양물에 첨가하였다. 배양물을 37℃에서 18시간 동안 진탕(200RPM)시켰다. 이어서, 4% w/v의 PEG MW 8000(제조원: Sigma, Saint Louis, MO) 및 3% w/v NaCl을 첨가함에 의해 gp3(K2S-Ф)상에 K2S를 함유하는 박테리오파아지를 수거하였다. 최종적으로, 수거된 파아지를 PBS 2ml(pH 7.4)중에 재현탁시켰다. 이. 콜라이 XL-1 블루를 감염시켜 파아지 수를 측정하였다. 밀리미터당 콜로니 형성 유니트(cfu/ml)을 이전에 기술한 바와 같이 계산하였다(참조번호: 21).

진탕 플라스크에서 재조합체-K2S의 발현. MpComb3H-K2S 형질전환된 XL-1 블루를, OD값[600nm]이 0.8에 도달할때까지 37℃에서 암피실린(100㎍/ml)의 존재하에 pH 7.0에서 슈퍼 브로쓰(3% w/v 트립톤, 2% w/v 효모 추출물 및 1% w/v MOPS) 100ml중에서 배양하였다. 이어서, IPTG(제조원: Promega, Madison, WI) 1mM에 의해 단백질 합성을 유도하였다. 세균을 추가로 30℃에서 6시간 동안 진탕(200 RPM) 배양하였다. 배양 상등액을 수거하고 55% 포화 황산암모늄으로 침전시켰다(참조번호: 32). 침전물을 PBS(pH 7.2)로 재구성하고 동일 완충액에서 18시간 동안 4℃에서 투석하였다. 세균 세포로부터 주변세포질(periplasm) 단백질을 이전에 에임즈 등[참조번호: 2]에 기술된 바와 같이 클로로포름 쇼크를 사용하여 추출하였다.

재조합체-K2S의 면역분석 정량. r-K2S를 검출하기 위해, 고형상을 모노클로날 항-크링글(kringle) 2 도메인(16/B)[일반적으로 공급원(Dr. Ute Zacharias, Central Institute of Molecular Biology, Berlin-Buch, Germany)으로 부터 제공됨]으로 피복시켰다. 표준 ELISA 세척 및 차단 과정을 수행하였다. 10¹¹ cfu/ml의 K2S-φ 또는 분비성 r-K2S 50㎕를 각각의 항-크링글 2 피복된 웰에 첨가하였다. 다음과 같이 항원-항체 검출을 수행하였다. 양(羊)의 항-M13 접합된 HRP(제조원: Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) 또는 양의 항-tPA 접합된 HRP(제조원: Cedarlane, Ontario, Canada)중 하나를 세척 단계 후에 각각의 반응 웰에 첨가하였다. 기질 TMB를 각각의 웰에 처리하고 30분 항온처리 후에 H₂SO₄ 용액으로 최종적으로 반응을 중지시켰다. 표준 흑색종 tPA 86/670(제조원: National Institute for Biological Standards and Control, Hertfordshine, UK)을 포지티브 대조군으로서 사용하였다.

아미도용해(amidolytic) 활성 분석. tPA 아미도용해 활성을 검출하기 위한 시험 키트를 제조원[Chromogenix(Molndal, Sweden)]으로부터 구입하였다. 플라스미노겐 및 S-2251을 함유하는 기질 혼합물을 사용하여 세린 프로테아제 효소 활성을 측정하였다. 암모늄 침전된 샘플 각각의 10^-2의 희석액을 자극제인 사람 피브리노겐 단편의 존재 및 부재하에 분석하였다. 분석 과정은 COASET t-PA 매뉴얼에 따라 수행하였다.

SDS-PAGE 및 면역블롯팅. 배양 상등액으로부터 투석된 침전-생성물을 센트리콘 10(제조원: AMICON, Beverly, MA)을 사용하여 추가로 10배 농축시켰다. 농축된 샘플을, 환원 완충액중의 15% 분리 겔의 SDS-PAGE에 의해 단백질을 분리시킨 후 이어서 니트로셀룰로스로 전기블롯팅하였다. 이어서, 니트로셀룰로스를 2시간 동안 4% 탈지유로 차단시켰다. r-K2S를 검출하기 위해, 적당히 희석된 양의 항-tPA 접합된 HRP를 니트로셀룰로스에 적용하였다. 면역반응 밴드를 민감성 검출 시스템인 증폭 Opti-4CN 키트(제조원: BIORAD, Hercules, CA)를 사용하여 가시화하였다.

공중합된 플라스미노겐 폴리아크릴아미드 겔 전기영동. 11% 분리 폴리아크릴아미드 겔을 하우젠(Heussen et al)등(참조번호: 14)에 의해 이전에 기술된 바와 같은 플라스미노겐 및 젤라틴과 공중합시켰다. 스택킹 겔은 플라스미노겐 및 젤라틴 부재하에 4% 농도로서 제조하였다. 8mA의 일정 전류에서 4℃에서 전기영동하였다. 겔 슬랩 중의 잔여 SDS를, 2.5%의 트리톤 X-100중에서 1시간 동안 실온에서 약하게 진탕시킨 후에 제거하였다. 이어서, 겔 슬랩을 37℃에서 5시간 동안 pH 8.3의 0.1M 글라이신-NaOH 중에서 항온처리하였다. 최종적으로, 겔 슬랩을 표준 코마시 브릴리언트 블루(R-250) 염색 시스템으로 염색시키고 탈색시켰다. 효소 활성 함유 펩타이드의 위치는 블루 페인트 배경에 대조되는 염료로 염색되지 않았다.

결과

K2S 유전자 함유 벡터의 작제. 본 발명자는 벡터 p51-3으로부터 프라이머 _sK2/174 및 _ASSP를 사용하여 tPA의 크링글 2 및 세린 프로테아제 부분(크링글 2 도메인에서 Ser¹⁷⁴ 내지 세린 프로테아제에서 Pro⁵²⁷)을 증폭시켰다. 증폭된 1110 bp 생성물은 아가로스 겔 전기영동(도 1의 레인 2)으로 입증되었고 올바른 판독 프레임내에 5' 및 3' 말단상에 이중 Sfi I 절단 부위에서 pComb3HSS 파아지미드로 삽입되었다. 따라서, K2S를 함유하는 새로운 벡터인 pComb3H-K2S가 합성되었다. 당해 벡터에서, K2S의 상류에서는 OmpA 시그날 서열이, 하류에서는 gp3가 플랭킹되어 있다. 올바르게 K2S가 삽입되어 있음은 Sfi I(도 2의 레인 3), PCR-분석(1110 bp에서 단일 밴드의 입증) 및 DNA 서열 분석에 의해 입증되었다. pComb3H-K2S 맵의 구성은 도 3에 나타낸다.

파아지 디스플레이 r-K2S. VCSM 113 필라멘트형 파아지를 사용하여 pComb3H-K2S-형질전환된 이. 콜라이 XL-1 블루, X[K2S]를 감염시켰다. VCSM13을 증식시키고 바이러스 팩키징 과정동안에 K2S-gp3 융합 단백질을 혼입시켰다. 수거된 재조합 파아지(K2S-Φ)의 농도는, 이. 콜라이 XL-1 블루를 PEG-침전된 파아지로 재감염시킴에 의해 측정된 바, 5.4 x 10¹¹ cfu/ml이였다. 이들 재조합 파아지 입자가 r-K2S를 발현하는 것을 샌드위치 ELISA에 의해 확인하였다. 파아지-결합된 이종성 K2S 단백질은 양의 항-tPA 접합된 HRP 항체 검출 시스템을 사용함으로써 모노클로날 항-크링글 2 항체(16/B)에 의해 인지되었다. 당해 분석의 흡광도는 1.12 ±0.03이였다(표 1). 10¹²의 파아지 입자상에서 검출 가능한 K2S의 양은 표준 흑색종 tPA와 비교하여 단백질 336ng과 동일하다. K2S-gp3 융합 단백질이 파아지 입자와 연합되어 있음을 입증하기 위해, 양의 항-tPA 접합된 HRP 항체를 양의 항-M13 항체 접합된 HRP로 대체하였다. 당해 면역 반응은 1.89 ±0.07의 흡광도를 나타내었다(표 1). 대조적으로, 포획 항체가 양의 항-M13 항체인 경우, 양의 항-tPA 항체 접합된 HRP로 관찰된 K2S는 극소이였다. 흡광도는 단지 0.17 ±0.01이였다(표 1). 이것은 단지 소수의 정제된 파아지 입자가 K2S-gp3 융합 단백질을 포함하고 있음을 시사하였다. 비-형질전환된 이. 콜라이 XL-1 블루로부터 제조된 VCSM13은 네가티브 대조군으로서 사용하였다.

MpComb3H-K2S의 작제. 본 발명자는 돌연변이유발 프라이머(_MSTPA 및 _MASTPA)의 도움으로 pComb3H-K2S중의 K2S와 gp3 사이에 정지 코돈을 생성시켰다. 새롭게 합성되고 돌연변이된 MpComb3H-K2S를 집적시키기 위해, 사이클 증폭 혼합물을 Dpn I로 완전히 분해하여 오래된 댐(dam) 메틸화된 pComb3H-K2S 주형(DpnI는 댐 메틸화된 DNA를 선호한다)을 절단하였다. 이. 콜라이 XL-1 블루를 MpComb3H-K2S로 형질전환시킨 후에, 형질전환체 XM[K2S]을 추가의 연구를 위해 선별하였다. bp 치환의 결과로서, K2S 유전자의 3' 말단에 인접한 하나의 Sfi I 절단 부위가 부위 지시된 돌연변이유발된 후 소실되었다. 선형화된 Sfi I 절단된 MpComb3H-K2S는 4319 bp에서, 삽입된 K2S 유전자 단편이 나타나지 않는 상태로 관찰되었다(도 5의 레인 3). 따라서, MpComb3H-K2S를 암호화하는 K2S 유전자는 이. 콜라이 XM[K2S]에서 gp3 비융합 형태로 발현되었다.

K2S의 발현 및 정제. 이. 콜라이 XM[K2S]에서의 K2S 발현은 IPTG로 유도하였다. r-K2S는 주변세포질 공간 및 배양 상등액 둘다에서 ELISA를 사용하여 검출가능하다. 각각의 제제중에 이종성 단백질의 양은 샌드위치 ELISA로 결정하고 표준 tPA와 비교하였다. O.D[600nm]가 50인 진탕 플라스크내 세균 배양물 100ml로부터, 주변세포질 분획에서 r-K2S가 1.38㎍(약 32%) 수득된 반면에, 암모늄 침전된 배양 상등액에서 r-K2S가 2.96㎍(약 68%) 수득되었다. 샌드위치 ELISA를 사용하여 VCSM13 감염된 이. 콜라이 XM[K2S]로부터 PEG 침전된 파아지임을 확인하였다. 모노클로날 항-크링글 2 항체에 의해 포획된 어떠한 r-K2S도 항-M13 접합된 HRP에 의해 검출되지 않는 것으로 보아, gp3가 결실된 경우 K2S가 파아지 입자상에 나타나지 않음을 시사한다.

아미도용해 활성 측정. 세린 프로테아제 도메인이 샘플에 존재하는 경우, 플라스미노겐은 플라스민으로 전환되었다. 생성된 플라스민은 추가로 S-2251 기질을 발색 생성물인 p-니트로아닐린으로 분해하며, 이의 최대 흡광도는 405nm에서 나타난다. 재조합 생성물의 비활성은 흡광도와 일치하였다. 샘플, 즉 K2S-ф, 주변세포질 r-K2S 또는 배양 상등액 r-K2S 각각의 피브리노겐-의존성 효소 활성을 평가하고 비교하였다. K2S-ф와 주변세포질 r-K2S 둘다는 현저히 낮은 효소 활성을 나타내는데, 활성이 시험 민감도(0.25IU/ml)이하이였다. 배양 상등액 r-K2S의 피브리노겐 의존성 효소 활성은 7IU/ml이였다. 따라서, 100ml의 배양물로부터 총 700IU의 효소 활성을 수득하였다. 피브리노겐 없이는 배양 상등액으로부터 정제된 r-K2S의 효소 활성이 관찰되지 않는 반면에 표준 흑색종 tPA는 약간의 활성을 나타낸다.

면역블롯팅에 의한 재조합 단백질의 입증. 이. 콜라이 XM[K2S]의 배양 상등액으로부터 부분적으로 정제된 K2S는 양(羊)의 항-tPA 항체를 사용한 측정에서 분자량이 39kDa인 것으로 밝혀졌다(도 6). 네가티브 대조군인 비형질전환된 이. 콜라이 XL1-블루의 부분적으로 정제된 배양 상등액은 유사한 크기를 갖는 반응 밴드를 포함하고 있지 않다.

PAGE에 의한 활성 효소의 국부화. 플라스미노겐을 공중합하고 전기영동전에 폴리아크릴아미드 겔중에서 젤라틴으로 고정화하였다. 이. 콜라이 XL-1 블루의 황산암모늄 침전된 배양 상등액, pComb3HSS로 형질전환된 이. 콜라이 XL-1 블루 및 이. 콜라이 XM[K2S]를 분석하였다(도 7). 모든 샘플을 비환원 조건하에서 처리하여 세린 프로테아제 도메인의 올바른 형태와 활성을 보존하도록 하였다. 세린 프로테아제-분해된 플라스미노겐의 투명 영역은 34 및 37kDa 위치에서 이. 콜라이 XM[K2S]의 황산암모늄 침전된 배양 상등액에서만 관찰되었다. 또 다른 샘플은 어떠한 투명한 영역을 제공하지 않는다. 표준 흑색종 tPA의 포지티브 대조군 레인은 또한 66 및 72kDa 위치에서 효소의 활성을 입증하였다.

문헌 참조 번호

도 1은 _sK2/174 및 _ASSP 프라이머를 사용함에 의한 p51-3 벡터로부터 K2S 유전자의 PCR 증폭 생성물의 입증에 대한 것이다. 레인 1은 1kb 마커(제조원: Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN)을 나타낸다. 레인 2에 증폭 생성물 1㎕를 로딩한다. 1110bp에서 단일 밴드가 나타난다. 1% 아가로스 겔상에서 전기영동을 수행한다.

도 2는 Sfi I로 pComb3H-K2S를 분해시킨 후 1110 bp(^*)에 삽입된 K2S 유전자의 실체를 레인 3에서 입증한 것이다. 레인 1은 1kb 마커를 나타낸다. 레인 2에 절단되지 않은 pComb3H-K2S를 로딩한다. 1% 아가로스 겔 상에서 전기영동을 수행한다.

도 3은 K2S 유전자가 삽입된 2개의 Sfi I 클로닝 부위를 보여주는 pComb3H-K2S에 대한 도식이다. 시그날 서열(OmpA), 리보솜 결합 부위(RIBS), lac 프로모터 및 gpIII 유전자를 또한 나타낸다.

도 4는 pComb3H-K2S상의 K2S와 gpIII 유전자 사이의 접합점에서 돌연변이 부위에 대한 도식도이다. pComb3H-K2S의 어닐링 부위는 변형된 올리고뉴클레오타이드(밑줄침)를 포함하는 한 부류의 돌연변이 프라이머(_MSTPA 및 _MASTPA)와 결합한다. 사이클 증폭을 수행한 후에, Sfi I 부위(굵은 표시)가 새롭게 합성된 쇄에서 변형되고 상실된다.

도 5는 Sfi I 제한 효소에 의해 신규 합성된 MpComb3H-K2S의 특징을 나타낸다. MpComb3H-K2S의 절단 부위가 하나임을 나타내는 4319 bp에서의 단일 밴드가 레인 3에서 관찰된다. 1110 bp에서 어떠한 삽입된 K2S 밴드가 가시화될 수 없다. 레인 1은 1kb 마커를 나타낸다. 레인 2에 절단되지 않은 MpComb3H-K2S를 로딩한다. 1% 아가로스 겔상에서 전기영동을 수행한다.

도 6은 이. 콜라이 XM[K2S] 배양 상등액으로부터 정제된 재조합 단백질과 양 항-tPA 접합된 HRP와의 면역학적 반응 밴드를 동정한 것이다. 레인 1에 표준 흑색종 tPA 40ng(86/670)을 로딩하고 70kDa에서 반응 밴드가 나타난다. 비형질전환된 이. 콜라이 XL1-블루로부터 부분적으로 정제되고 농축된 배양 상등액을 각각 레인 2 및 3에 적용한다. 명백한 반응 밴드가 특히 레인 3의 39kDa에서 입증된다.

도 7은 공중합된 플라스미노겐 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 활성 세린 프로테아제 도메인을 포함하는 세포외 r-K2S의 분자량을 측정한 것이다. 레인 1은 밝혀진 분자량 표준물(x 10^-3)인 SDS-6H(제조원: Sigma, Saint Louis, MO)를 포함한다. 이. 콜라이 XL-1 블루, pComb3HSS로 형질전환된 이. 콜라이 Xl-1 블루 및 이. 콜라이 XM[K2S]의 55% 포화된 황산암모늄 침전된 배양 상등액 50㎍을 각각 2, 3 및 4에 로딩한다. 레인 5는 50mIU의 표준 흑색종 tPA(86/670)을 포함한다. 폴리아크릴아미드 겔중에서 분해된 플라스미노겐의 투명 영역은 레인 4의 분자량 34 및 37kDa(B) 및 레인 5의 분자량 66 및 77kDa(A)에서만 가시화된다.

도 8은 구조 A(서열 10)를 도시한다. 변형되지 않은, 아미노산 174-527로 부터의 천연 K2S 분자를 도시한다.

도 9는 구조 B-0(서열 11)를 도시한다. 변형되지 않은, 아미노산 197-527로 부터의 천연 K2S 분자를 도시한다.

도 10은 구조 B-1(서열 12)를 도시한다. 도 9의 구조 B-0의 N-말단부에 아미노산 SEGN이 첨가된, 아미노산 193-527로 부터의 K2S 분자를 도시한다.

도 11은 구조 B-2(서열 13)를 도시한다. Cys-261이 세린으로 치환된, 도 10에서와 같은, 아미노산 193-527로 부터의 K2S 분자를 도시한다.

도 12는 구조 B-3(서열 14)를 도시한다. 도 9의 구조 B-0의 N-말단부에 아미노산 SEGNSD이 첨가된, 아미노산 191-527로 부터의 K2S 분자를 도시한다.

도 13은 구조 B-4(서열 15)를 도시한다. Cys-261이 세린으로 치환된, 도 12에서와 같은, 아미노산 191-527로 부터의 K2S 분자를 도시한다.

도 14는 구조 C(서열 16)를 도시한다. 변형되지 않은, 아미노산 220-527로 부터의 천연 K2S 분자를 도시한다. 이 분자는 도 10 내지 13의 구조 B에 대해 기술된 바와 유사하게 추가로 변형될 수 있다.

도 15는 구조 D(서열 17)를 도시한다. 변형되지 않은, 아미노산 260-527로 부터의 천연 K2S 분자를 도시한다. 이 분자는 도 10 내지 13의 구조 B에 대해 기술된 바와 유사하게 추가로 변형될 수 있다.

도 16은 tPA 분자(서열 18)를 도시한다.

샌드위치 ELISA에 의한 파아지 제제에서의 r-K2S 분자의 검출

포획 항체	추적자 항체 (접합된 HRP)
	항-tPA		항-M13
	K2S-φ	VSCM13^a	K2S-φ	VCSM13
항-크링글2^b	1.12 ±0.04^c	0.12 ±0.03	1.89 ±0.02	0.16 ±0.02
항-M13	1.17 ±0.01	0.14 ±0.05	1.91 ±0.02	1.88 ±0.03

^a VCSM13은 pCom3HSS로 형질전환된 XL-1 블루로 부터 수거되었다.

^b 마우스 모노클로날 항-크링글 2(16/B)을 사용하였다. 다른 항체를 양(羊)의 면역글로불린으로부터 제조하였다.

^c 당해 값은 3회 분석된 각 샘플의 흡광도의 평균치이다.

<110> Boehringer Ingelheim International GmBH <120> Methods for Large Scale Protein Production in Prokaryotes <130> 5-1998-067137-5 <140> PCT/EP2001/12920 <141> 2001-11-08 <150> GB 0027782.2 <151> 2000-11-14 <160> 18 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 66 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 1 atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggctg gtttcgctac cgtggcccag 60 gcggcc 66 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: N-terminal part of K2S molecule <400> 2 Ser Glu Gly Asn 1 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: N-terminal part of K2S molecule <400> 3 Ser Glu Gly Asn Ser Asp 1 5 <210> 4 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: coding sequence of the N-terminal part of K2S molecule <400> 4 tctgagggaa ac 12 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: coding sequence 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165 170 175 Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His Leu Leu Asn Arg Thr Val 180 185 190 Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gln 195 200 205 Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val 210 215 220 Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly Ile Ile Ser Trp Gly 225 230 235 240 Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr 245 250 255 Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro 260 265 <210> 18 <211> 527 <212> PRT <213> Homo sapiens (tPA) <400> 18 Ser Tyr Gln Val Ile Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gln Met Ile Tyr Gln 1 5 10 15 Gln His Gln Ser Trp Leu Arg Pro Val Leu Arg Ser Asn Arg Val Glu 20 25 30 Tyr Cys Trp Cys Asn Ser Gly Arg Ala Gln Cys His Ser Val Pro Val 35 40 45 Lys Ser Cys Ser Glu Pro Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Gln Gln 50 55 60 Ala Leu Tyr Phe Ser Asp Phe Val Cys Gln Cys Pro Glu Gly Phe Ala 65 70 75 80 Gly Lys Cys Cys Glu Ile Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr Glu Asp Gln 85 90 95 Gly Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ala Glu Ser Gly Ala Glu 100 105 110 Cys Thr Asn Trp Asn Ser Ser Ala Leu Ala Gln Lys Pro Tyr Ser Gly 115 120 125 Arg Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys 130 135 140 Arg Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val Phe Lys Ala 145 150 155 160 Gly Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro Ala Cys Ser Glu Gly 165 170 175 Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg Gly Thr His 180 185 190 Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile 195 200 205 Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala Gln Ala Leu 210 215 220 Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys 225 230 235 240 Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys 245 250 255 Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr Ser Gln Pro 260 265 270 Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro 275 280 285 Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg 290 295 300 Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala 305 310 315 320 Ala His Cys Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Val Ile 325 330 335 Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu Gln Lys Phe 340 345 350 Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr 355 360 365 Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys 370 375 380 Ala Gln Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp 385 390 395 400 Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys 405 410 415 His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His 420 425 430 Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His Leu Leu Asn 435 440 445 Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly 450 455 460 Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly 465 470 475 480 Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly Ile Ile 485 490 495 Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr 500 505 510 Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro 515 520 525

Claims

a) OmpA 시그날 펩타이드를 암호화하는 DNA,

b) 사람 조직 플라스미노겐 활성인자의 K2S 변이체인 이종성 단백질을 암호화하는 DNA 및

c) SEGN (서열 2) 및 SEGNSD (서열 3)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 펩타이드를 암호화하는 DNA를 포함하고, 상기 a)의 DNA가 상기 c)의 DNA 상류 (upstream)에 위치되고 상기 c)의 DNA가 상기 b)의 DNA의 상류에 위치되며 상기 a), b) 및 c)의 DNA가 작동가능하게 연결되는 벡터를 원핵세포에서 발현시킴을 특징으로 하여,

정확하게 폴딩된 활성 단백질로서 세포외로 분비되는 상기 재조합 DNA-유도된 이종성 단백질을 원핵세포에서 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 원핵세포가 이. 콜라이(E. coli)임을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,

a) 사람 조직 플라스미노겐 활성인자의 K2S 변이체인 이종성 단백질을 암호화하는 DNA를 PCR로 증폭하고, PCR 생성물을 정제하는 단계,

b) 상기 PCR 생성물이 하류 (downstream)에서 gpIII를 암호화하는 DNA에 연결되도록, PCR 생성물을 OmpA 시그날 펩타이드를 암호화하는 DNA, SEGN (서열 2) 및 SEGNSD (서열 3)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 펩타이드를 암호화하는 DNA 및 gpIII을 암호화하는 DNA를 포함하는 벡터 속에 삽입하는 단계,

c) 정지 코돈을 이종성 단백질과 gpIII 사이에 삽입하는 단계,

d) 상기 벡터를 원핵세포에 의해 발현시키는 단계 및

e) 이종성 단백질을 정제하는 단계를 수행함을 특징으로 하는 방법.
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제1항 또는 제2항에 있어서, 벡터가, OmpA 시그날 펩타이드를 암호화하는 DNA 및 gpIII를 암호화하는 DNA를 포함하는 파아지미드 벡터임을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 벡터가 pComb3HSS 파아지미드임을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, OmpA의 DNA 서열이 서열 1의 서열을 가짐을 특징으로 하는 방법.
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제1항 또는 제2항에 있어서, 사람 조직 플라스미노겐 활성인자의 K2S 변이체인 이종성 단백질의 DNA 앞에 lac 프로모터 또는 리보솜 결합 부위가 존재함을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 사람 조직 플라스미노겐 활성인자의 K2S 변이체인 이종성 단백질이 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16 및 서열 17 중에서 선택되는 어느 하나의 서열에 의해 암호화되는 방법.
제1항 또는 제2항에 따른 방법으로 수득되는 단백질.